JP2003523407A - カスパーゼ活性化プロドラック療法 - Google Patents

カスパーゼ活性化プロドラック療法

Info

Publication number
JP2003523407A
JP2003523407A JP2001561363A JP2001561363A JP2003523407A JP 2003523407 A JP2003523407 A JP 2003523407A JP 2001561363 A JP2001561363 A JP 2001561363A JP 2001561363 A JP2001561363 A JP 2001561363A JP 2003523407 A JP2003523407 A JP 2003523407A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
caspase
antibody
prodrug
cell
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2001561363A
Other languages
English (en)
Inventor
カーター，ポール，ジェイ．
ギャザード，ルイス
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Genentech Inc
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of JP2003523407A publication Critical patent/JP2003523407A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6891—Pre-targeting systems involving an antibody for targeting specific cells
    • A61K47/6899—Antibody-Directed Enzyme Prodrug Therapy [ADEPT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明は、対象の細胞型を標的とするカスパーゼ複合体の投与、並びにカスパーゼの存在の下で局所的に活性剤へ変換されるプロドラッグの付加的投与による製薬的薬剤の局所的送達に関する新規方法を提供する。本発明は、さらに、カスパーゼ切断可能プロドラッグ部分を含んでなる新規プロドラッグと同様に、カスパーゼを含んでなる新規標的化剤を提供する。また、本発明は、カスパーゼ複合体と本発明のプロドラッグを含んでなる治療の方法と同様に、製薬的組成物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の背景） （発明の分野） 本発明は、対象である細胞型を標的にするカスパーゼ複合体の投与、及びカス
パーゼの存在の下で局所的に活性剤へ変換されるプロドラックの付加的な投与に
よる、局所的な製薬的剤の送達に関する新規な方法に関する。特別な実施態様で
は、本発明は、例えば癌療法に有用なプロドラッグの、腫瘍性細胞などの種々の
細胞型で特徴付けられる領域への標的投与、そして特定の細胞型の領域でのカス
パーゼによるプロドラッグの活性薬剤への変換に関する。本発明は、カスパーゼ
開裂可能プロドラッグ部分を含んでなる新規プロドラッグだけでなく、カスパー
ゼを含んでなる新規の標的化薬剤を提供する。また、本発明は、カスパーゼ抱合
体と本発明のプロドラッグを含んでなる治療の方法だけでなく、製薬的な組成物
に関する。
【０００２】 関連する開示内容の説明 癌の治療における、腫瘍細胞への細胞障害性剤の局所送達のための抗体抱合体
の使用に関して示されきた（Syrigo及びEpenetos(1999) Anticancer Research 1
9: 605-614；Niculescu-Duvaz及びSpringer(1997) Adv. Drg. Del. Rev. 26: 15
1-172；米国特許第４，９７５，２７８号）。腫瘍への細胞障害性剤の局所送達
は、腫瘍細胞が取り除かれることが求められる場合だけでなく、これら薬剤の全
身投与が正常な細胞の死滅を引き起こす場合に望まれる。一つの抗腫瘍剤の送達
システムによると、細胞障害性剤は腫瘍特異性抗体と結合して腫瘍細胞と結合す
る免疫複合体を形成し、腫瘍部位へ細胞障害性剤を「送達」する。これら標的化
システムで使用されている免疫複合体には、抗体-薬剤複合体（Baldwinら., (19
86) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05）、及び抗体-毒素複合体（Thorpe, An
tibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review, in Mono
clonal Antibodies '84: Biology And Clinical Applications, A. Pincheraら.
(ed.s), pp. 475-506(1985)）が含まれる。ポリクローナル抗体及びモノクロー
ナル抗体の双方が、これら方法で有用であると報告されている（Rowland ら.,
(1986)Cancer Immmunol. Immunother., 21: 183-87）。これらの方法で使用され
た薬剤には、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキサート及びビンデシ
ンが含まれる（Rowlandら., (1986)上掲）。抗体-毒素複合体で使用される毒素
には、マヤタノシノイド（maytansinoid）（Liuら., (1996) Proc. Nalt. Acad.
Sci. USA 93:8618-8623）及びカリケアミシン（calicheamicin）（Lodeら.,(19
98)Cancer Res. 58: 2928；Hinmanら., (1993) Cancer Res. 53: 3336-3342）の
ような小分子毒素だけでなく、ジフテリア毒素などの細菌毒素、リシンなどの植
物毒素が含まれる。
【０００３】 ＡＤＥＰＴは、プロドラッグに続いて、抗体-酵素融合タンパク質又は複合体
を被検者へ投与する薬剤送達への二段階法である（Syrigo及びEpenetos(1999)上
掲；Niculescu-Duvaz及びSpringer(1997)上掲）。この抗体複合体は、腫瘍標的
に局在することが可能となる。不活性なプロドラッグがいったん投与されると、
非結合融合タンパク質が血液の循環から除かれた。プロドラッグは、局在してい
る酵素複合体によって、腫瘍内及び周辺で酵素学的に活性化される。 ＡＤＥＰＴは、マウス異種移植モデルにおいて、効果的な抗-腫瘍法であるこ
とが証明されている（Syrigo及びEpenetos(1999)上掲）。しかしながら、初期臨
床試験で使用されるげっ歯類由来の抗体と同様に、ＡＤＥＰＴモデルで共通に用
いられる細菌酵素は、哺乳動物システムでは免疫原性がある（Sharma(1992)Cell
Biophysics 21: 109-120）。ヒト化抗体-ヒトβ-グルクロニダーゼ融合タンパ
ク質を使用するＡＤＥＰＴは、マウスで効果的である（Bossletら., (1994)Canc
er Res. 54: 2151-2159）。しかしながら、その非常に大きなサイズのために（
１５０ｋＤａ）、ヒトβ-グルクロニダーゼはＡＤＥＰＴにとっては好ましい酵
素ではない。同様に、ヒトのシステムでヒトの酵素を使用することは、内在性の
酵素によるプロドラッグの望ましくない活性化の危険、並びに内在性基質又はイ
ンヒビターの障害を引き起こす。野生型酵素の基質ではないプロドラッグを活性
化するように、ヒトカルボキシペプチダーゼＡ１を設計した（Smithら., (1997)
J. Biol. Chem. 272: 15804-15816）。それは、インビボでは効果的ではなかっ
た（Wolfeら., (1999) Bioconjugate Chemistry 10:38-48）。
【０００４】 カスパーゼは、サイトカイン成熟及びアポトーシスにおける役割を有する細胞
内システインプロテアーゼのファミリーである（Talamian,ら., (1997) J. Biol
. Chem. 272: 9677-9682）。カスパーゼは、活性化のためにタンパク質分解を必
要とする一本鎖のチモーゲンである（Stennick及びSalvesen(1998) Biochimica
et Biophysica Acta 1378: 17-31）。カスパーゼ３（以前、Yama、apopain及びC
PP32として知られていた）は、比較的に小さな（５７ｋＤａ）哺乳動物プロテア
ーゼである。それは、配列Asp-Glu-Val-Asp（配列番号：３）及びAsp-Glu-Ile-A
sp(配列番号：４）の後を切断し、この基質特異性は、カスパーゼ７のような他
のカスパーゼによってのみ共有されている（Thornberryら., (1997) J. Biol. C
hem. 272: 17907-17911）。内在性カスパーゼ３及び７は、非常に厳密に制御さ
れており、アポトーシスを起こしている細胞においてのみ活性があると考えられ
ている。 ＨＥＲ２／ｎｅｕプロトオンコジーン（c-erbB2としても知られている）は、
原発性ヒト乳及び卵巣癌の２０−３０％で増幅及び／又は過剰発現し、減少した
全生存者及び再発までの時間の強力な予測指標である（Slamonら., (1987) Scie
nce 235: 177-182；Slamonら., (1989) Science 244: 707-712）。多くの抗体を
基礎とする方法が、ＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子のｐ１８５ＨＥＲ２産物を過剰発現
する癌のための強力な薬物療法として発展してきた（Shalabyら., (1992) J. Ex
p. Med. 175: 217-225；Baselgaら., (1996) J. Clin. Onc. 14: 737-744；Pegr
amら., J. Clin. Onc. (1998) 16: 2659-2671）。
【０００５】 ヒトＡｂ４Ｄ５-８（Herceptin）（Carterら., (1992a)Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 89: 4285-4289）であるヒト化抗-ｐ１８５ＨＥＲ２抗体は、転移性乳癌
の治療に関するフェーズII臨床試験において、単品の薬剤（Baseglaら., (1996)
J. Clin. Onc. 14: 737-744）としても、そして細胞障害性化学療法剤との組み
合わせ(Pegramら., J. Clin. Onc. 16: 2659-71)としても抗腫瘍活性を示した。
ハーセプチンは、二つの重要なフェーズIII試験の後に、転移性乳癌の治療に関
して１９９８年９月に連邦食品医薬品局 (FDA) による認可を受けた（Cobleigh
ら., (1999）J. Clin. Onc. 17: 2639-2648）。 ハーセプチンは、他の可能性を秘めたより強力な免疫療法を設計するための基
礎として使用されてきた。これらには、細胞障害性Ｔ細胞の再標的化のためのヒ
ト化二重特異性Ｆ（ａｂ’）２、及びダイアボディー断片（Shalabyら., (199
2) J. Exp. Med. 172: 217-225；Zhuら., (1995) Intern. J. Cancer 62:319-32
4；Zhuら., (1996) Bio/Technology 14:192-196）、標的化薬剤送達のためのス
テルス免疫リポソーム（Parkら., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 132
7-1331）、並びにプロドラッグ活性化のためのジスルフィド安定化Ｆｖ-β-ラク
タマーゼ融合タンパク質が含まれる（Rodriguesら., (1995) Chemistry and Bio
logy 2: 223-227; Kirpotin(1997) Biochemistry 36: 66-75）。
【０００６】 （発明の概要） 本発明は、種々の疾患又は疾病の診断、予後及び治療にとって有用な新規方法
及び組成物を提供する。本発明には、対象の細胞型を標的とするカスパーゼ複合
体の投与、並びにカスパーゼによって活性薬剤へ局在的に変換されるプロ薬剤の
付加的な投与による、製薬剤の局所的な送達方法が含まれる。特定の実施態様で
は、本発明は、対象である細胞型への細胞障害性剤の送達方法を示し、これには
、カスパーゼで変換可能な細胞障害性プロドラッグを活性のある細胞障害性剤へ
変換する細胞標的カスパーゼ複合体の有効量を投与すること、並びにカスパーゼ
で変換可能なプロドラッグの投与の段階を含んで成る。 本発明は、組成物、特にカスパーゼを含んでなる製薬的組成物を提供する。好
ましい実施態様では、このカスパーゼは、標的カスパーゼ複合体として提供され
る。本発明に記載のカスパーゼ複合体には、カスパーゼ／標的化薬剤複合体、特
にカスパーゼ-抗体複合体が含まれ、その構成的に活性なカスパーゼは、化学的
クロスリンク又は組み換え融合のいずれかを通して抗体のような標的薬剤と結合
する。
【０００７】 本発明によると、カスパーゼ複合体は、対象である細胞型を標的とするか、又
は対象である細胞型に存在する。好ましい標的薬剤には、天然発生及び設計され
たレセプターリガンド、ペプチド及びペプチドメティック（peptidometic）リガ
ンド、抗体、特にモノクローナル抗体が含まれており、それにはＦａｂ、Ｆａｂ
’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、ダイアボディー、構造非依存性抗体、一本
鎖抗体分子、抗体断片、並びにそれの類似物から形成された多特異性抗体が含ま
れる。標的薬剤の中で好まれるものは、抗体である。 本発明に記載の好ましいカスパーゼは、哺乳動物カスパーゼであり、ヒトカス
パーゼ１-１０のいずれか、特にリバースカスパーゼのような構成的に活性なカ
スパーゼを含む。好ましい実施態様では、方法及び組成物にプロアポトーシス性
の構成的活性カスパーゼを用いる。本発明のこの側面による好ましいものは、カ
スパーゼ２、カスパーゼ３、及びカスパーゼ７から構成されている群から選択さ
れるカスパーゼであり、好ましくはカスパーゼ３である。
【０００８】 本発明は、さらに種々の疾患又は疾病、特に特定の細胞型の出現又は存在を特
徴とする疾患又は疾病を治療する方法を提供する。そのような細胞には、感染に
特徴的である細胞表層エピトープを発現している細菌及びウイルス感染細胞、腫
瘍細胞のような腫瘍性及び悪性細胞、炎症部分で存在又は出現することを特徴と
する細胞が含まれる。本発明は、被検者へ必要としている本発明のカスパーゼ複
合体を投与する段階を含んでなる、疾患又は疾病を治療する方法を提供する。あ
る特定の実施態様では、本発明は、腫瘍性又は悪性細胞型の発現を特徴とする疾
患又は疾病の治療法で、腫瘍性又は悪性細胞型を標的とする抗体を使用する治療
法を提供する。好ましい実施態様では、本発明は、例えばＡｐｏ２、ＣＤ２０、
ＣＤ４０、ｍｕｃ-１、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺幹細胞抗原（
ＰＳＣＡ）、上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）、ＣＤ３３、ＣＤ１９、 解
離促進因子（ＤＡＦ）、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ５２、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＴＡ
Ｇ７２抗原、ｃ-ＭＥＴ、前立腺の６膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）又はＥｒｂ
Ｂ２を発現する細胞型の存在を特徴とする疾患又は疾病を治療する方法を提供す
る。特定の側面によると、この方法は、抗体が抗-ＣＤ２０、抗-ＣＤ４０、抗-
ＥｒｂＢ２又は抗-Ａｐｏ２抗体、特にモノクローナル抗体又は抗体断片である
、カスパーゼ-抗体複合体の投与を含む。
【０００９】 本発明は、さらに、カスパーゼの存在の下で活性薬剤へ変換されるプロエイジ
ェントを投与する段階を含んでなる細胞障害性剤のような活性剤を、特定の細胞
型へ送達する方法を提供する。適切なプロエイジェントは、Asp-Xaa-Xaa-Asp、A
sp-Glu-Xaa-Asp、Asp-Glu-Val-Asp（配列番号：３）又はAsp-Glu-Ile-Asp(配列
番号：４）ポリペプチド配列のようなカスパーゼ切断可能プロドラッグ部分を含
む。本発明の内容における好ましいプロエイジェントには、マヤタノシノイド（
maytansinoid）、カリケアミシン（calicheamicin）、ドキソルビシン、ダウノ
マイシン、エピルビシン、タキソール、タキソテール、ビンクリスチン、ビンブ
ラスチン、マイトマイシンＣ、エトポシド、メトトレキサート、シスプラチン、
シクロホスファミド、メルファラン、ハロテスティン、チオ-ＴＥＰＡ、クロラ
ムブシル、５-ＦＵ、及びサイトキサンから成る群から選択される細胞障害性プ
ロエイジェントが含まれ、そのプロエイジェントにはカスパーゼ切断可能プロド
ラッグ部分が含まれる。
【００１０】 この発明には、キット及び製造品とともに、プロエイジェント、並びに種々の
疾患又は疾病の治療のためのカスパーゼ-抗体融合タンパク質のような標的化カ
スパーゼ複合体を含んでなる製薬的組成物を含んでなる組成物が含まれる。キッ
ト及び製造品は、好ましくは： （ａ）容器； （ｂ）前記容器上の標識；及び （ｃ）前記容器に含有される標識化カスパーゼ複合体を含んでなる組成物；を
含み、その組成物は疾患又は疾病を治療すること関して効果的であり、前記容器
上の任意の標識は組成物が特定の疾患又は疾病を治療するために使用できること
を示す。キットには、製薬的に許容可能なバッファーと、疾患疾病の治療へ組成
物を使用することに関する指示書を含んでなる容器のような付帯構成分とととも
に、他の成分、例えばカスパーゼ活性化可能プロドラッグ又は薬剤が含まれる。
【００１１】 好ましい実施態様の詳細な説明 定義 本発明の範囲内における「アミノ酸」という用語は、広い範囲内で用いられ、
天然発生Ｌ-アミノ酸又は残基を含むことを意味する。天然発生アミノ酸のため
に広く用いられている一文字及び三文字略語は、ここで利用されている（Lehnin
ger, A.L., Biochemistry,第２版, ｐ．７１−９２, （Worth Publishers, New
York, New York, (1975））。この用語は、アミノ酸類似体のような化学修飾ア
ミノ酸と同じく、D−アミノ酸、ノルロイシンのように通常はタンパク質に取り
込まれない天然発生アミノ酸、及び当該分野でアミノ酸の特徴を有することが知
られている化学合成化合物を含む。例えば、天然Ｐｈｅ又はＰｒｏのような、ペ
プチド化合物の同じコンホメーション上の制約を与えるフェニルアラニン又はプ
ロリンの類似体又は模倣体がこのアミノ酸の定義に含まれる。このような類似体
及び模倣体は、ここでは、アミノ酸の「機能的同等物」と呼ばれている。アミノ
酸の他の例は、Roberts及びVellaccio, The Peptides: Analysis, Synthesis, B
iology, Gross and Meiehofer, Eds., 第5巻, ｐ．３４１（Academic Press, In
c., New York, New York, 1983）で列挙されており、ここでは参考文献に取り入
れている。
【００１２】 抗体及び免疫グロブリンという用語は交換可能に用いられ、免疫グロブリンに
ついて上述した構造的特徴を持つ糖タンパク質を示すのに用いられる。「抗体」
という用語は最も広い意味において使用され、特に単一のモノクローナル抗体(
アゴニスト及びアンタゴニスト抗体を含む)、及び多エピトープ特異性を持つ抗
体組成物を包含している。「抗体」という用語は、特にモノクローナル抗体（全
長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば
二重特異性抗体)、及び抗体断片を包含する。
【００１３】 抗体又は免疫グロブリンの定義においては、一般的な免疫グロブリン、特にKa
bat E.A. (1978) Adv. Protein Chem. 32: 1-75によってヒトＩｇＧ１に適用し
たような免疫グロブリンのドメイン構造を参照する。従って、免疫グロブリンは
、一般的には約１５０，０００ダルトンで、２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの
同一の重（Ｈ）鎖からなる異種四量体糖タンパク質である。各軽鎖は１つの共有
ジスルフィド結合で重鎖に結合されているが、ジスルフィド結合の数は異なる免
疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変化する。各重鎖及び軽鎖は、規則的に離
間した鎖間ジスルフィド架橋も有している。また各重鎖は、カルボキシ末端定常
ドメインに続く末端可変ドメイン（ＶＨ）も有している。各軽鎖は可変Ｎ−末端
ドメイン（ＶＬ）及びＣ末端定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメインは重鎖の
最初の定常ドメイン（ＣＨ１）と整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメ
インと整列している。免疫グロブリンポリペプチド鎖のドメイン定義に従って、
軽（Ｌ）鎖は２つのコンホメーション的に類似したドメインＶＬ及びＣＬを有し
；重鎖は４つのドメイン（ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を有し、これら
各々は１つの鎖間ジスルフィド架橋を持つ。
【００１４】 重鎖の定常（Ｃ）ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは異なる
分類に分けることができる。免疫グロブリンの５つの主要な分類：ＩｇＡ、Ｉｇ
Ｄ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがある。免疫グロブリンの異なる分類に対応する
重鎖定常ドメインは、各々α、δ、ε、γ、及びμドメインと呼ばれる。配列研
究により、ＩｇＭのμ鎖が５つのドメインＶＨ、ＣＨμ１、ＣＨμ２、ＣＨμ３
、及びＣＨμ４を含む。ＩｇＥ（ε）の重鎖も５つのドメインを含むが、ＩｇＡ
（α）の重鎖は４つのドメインを有する。免疫グロブリンの分類は、サブクラス
（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１
、及びＩｇＡ２にさらに分けることができる。
【００１５】 異なる分類の免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元的立体配置は良く
知られている。これらのＩｇＡ及びＩｇＭはポリマーであり、各サブユニットは
２つの軽鎖と２つの重鎖を含む。ＩｇＧ（γ）の重鎖はヒンジ領域として知られ
るＣＨ１及びＣＨ２ドメイン間にあるポリペプチド鎖の長さを含む。ＩｇＡのα
鎖はＯ-結合グリコシル化部位を含むヒンジ領域を有し、μ及びε鎖はγ及びα
鎖のヒンジ領域に類似する配列は持たないが、それらは他のものが持たない第４
の定常ドメインを含む。免疫グロブリン鎖のドメイン組成は次のように要約する
ことができる。 軽鎖 λ＝ＶλＣλ κ＝ＶκＣκ 重鎖ＩｇＧ（γ）＝ＶＨ ＣＨγ１ヒンジＣＨγ２ＣＨγ ＩｇＭ（μ）＝ＶＨ ＣＨμ１ＣＨμ２ＣＨμ３ＣＨμ４ ＩｇＡ（α）＝ＶＨ ＣＨα１ヒンジＣＨα２ＣＨα３ ＩｇＥ（ε）＝ＶＨ ＣＨε１ＣＨε２ＣＨε３ＣＨε４ ＩｇＤ（δ）＝ＶＨ ＣＨδ１ヒンジＣＨδ２ＣＨδ３
【００１６】 「ヒンジ領域」は、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６から約Ｐｒｏ２３０の伸展と
して一般に定義されている(Burton, Molec. Immunol. 22:161-206 (1985))。他
のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間Ｓ-Ｓ結合を形成する最初と最後
のシステイン残基を同じ位置に配することにより、ＩｇＧ１と並べることができ
る。 抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれ、各々単一の抗原結合部位を
持つ２つの同一な抗原結合断片、及び、その名称が容易に結晶化する能力を反映
している残りの「Ｆｃ」断片を生成する。ペプシン処理により、２つの抗原結合
部位を有するが、交差結合抗原であり得るＦ(ａｂ')２断片が生成される。 また、Ｆａｂ断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（Ｃ
Ｈ１）も含む。Ｆａｂ' 断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ又は複数のシステイ
ンを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端における数個の残基の付加によ
りＦａｂ断片と相違する。Ｆａｂ'-ＳＨは、ここにおいて、定常ドメインのシス
テイン残基が遊離のチオール基を持つＦａｂ'の記号である。Ｆ(ａｂ')２抗体断
片は、元々、それらの間にヒンジシステインを持つＦａｂ' 断片の対として生成
された。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
【００１７】 「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小抗体断片である。この領
域は、緊密に非共有的に結合した１つの重鎖と１つの軽鎖の可変ドメインの二量
体からなる。 「抗体断片」は全長抗体の一部、一般にはその抗原結合又は可変領域を含む。
抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２及びＦｖ断片；構造非依存性
抗体；単鎖抗体分子；及び抗体断片から生じた多重特異性抗体が含まれる。 「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含
み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。一般的に，Ｆｖポリ
ペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それは
ｓＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓＦｖの概説につ
いては、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及
びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参
照のこと。
【００１８】 「ダイアボディー」なる用語は、二つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片を
指し、その断片は同一のポリペプチド鎖(ＶＨ−ＶＬ)内で軽鎖可変ドメイン(Ｖ
Ｌ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)が結合している。非常に短いために同一鎖上で二
つのドメインの対形成をなし得ないリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相
補ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を形成する。ダイアボデ
ィーは、例えば、ＥＰ４０４０９７；ＷＯ９３／１１１６１；及びHollingerら.
, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)に更に詳細に記載されてい
る。 本出願において使用する場合、「構造非依存性抗体」なる表現は、Zapataら., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)に記載された抗体を指す。要約すると、
これらの抗体は一対の抗原結合部位を形成する一対のタンデムＦｄセグメント(
ＶＨ-ＣＨ１-ＶＨ-ＣＨ１)を含む。構造非依存性抗体は、二重特異性又は単一特
異性となれる。
【００１９】 「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴と
する、哺乳動物における生理学的状態を指すか又は表す。癌の例には、これらに
限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含
まれる。このような癌のより特定な例としては、乳癌、前立腺癌、大腸癌、扁平
上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子
宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液
腺癌、腎臓癌、肝臓癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝癌及び様々な種類の頭部及び頸
部の癌が含まれる。
【００２０】 本発明に記載の「カスパーゼ」は、Ａｓｐ残基の後のペプチド結合を切断する
ことに関して抜きんでた特異性を共有する、構造的に関連するシステインプロテ
アーゼのグループの任意のメンバーであり（Stennicke, H. 及びSalvesen, G. (
1998) Biochimica et Biophysica Acta 1387: 17-31）、ここでさらに完全に記
載されているように、カスパーゼの変異体のみならず天然発生カスパーゼを含む
。天然発生カスパーゼのシリーズは、生産されることが知られている（Stennick
e及びSalvesen(1998)上掲）。このシリーズのメンバーのアミノ酸配列は、完全
に相同的ではない。しかしながら、このシリーズのカスパーゼは、同じか類似の
タイプのタンパク質分解活性を示す。一般的には、カスパーゼは、以下の特徴を
共有する：ｉ）Barrett及びRawlings分類（Barrett, A. J., (1997)Eur. J. Bio
chem. 250: 1-6)のＣ１４ファミリーに属する相同的なシステインプロテアーゼ
に属する；ペプチド基質のＡｓｐ残基の後を好んで切断する；動物細胞の細胞基
質に存在する；ＸがＡｒｇ、Ｇｌｎ又はＣｌｙであり、ペンタペプチド活性モチ
ーフである、保存ＱＡＣＸＧ（配列番号：５）を含有する。
【００２１】 カスパーゼは、一般的に、Schecter, I., 及びBerger, A., (1967) Biochem.
Biophys. Res. Commun. 27: 157-162によって定義されている用語である「Ｐ１
」基質位置にＡｓｐを必要とする。カスパーゼは、ペプチド基質に対する特異性
を有し、基質の一次配列は、カスパーゼ酵素切断にとってなくてはならない。カ
スパーゼは、三つのグループへ分けることができる。グループIカスパーゼ（カ
スパーゼ１，４及び５）のすべては、Ｐ４位置に疎水性アミノ酸を好み、その最
適配列はTrp-Glu-His-Asp（配列番号：６）（Ｐ４-Ｐ３-Ｐ２-Ｐ１）である。グ
ループIIカスパーゼ（カスパーゼ２，３，７及びＣＥＤ-３）は、Ｐ４のＡｓｐ
に関して厳密な必要要件を有し、配列Ａｓｐ-Ｇｌｕ-Ｘ-Ａｓｐを好む。グルー
プIIIカスパーゼ（カスパーゼ６，８，９及び１０）は、Ｐ４に多くのアミノ酸
を許容するが、分岐脂肪族側鎖を有するアミノ酸、及びＶａｌ／Ｌｅｕ-Ｇｌｕ-
Ｘ-Ａｓｐの最適配列を好む。Ｐ３グループＩカスパーゼが、盛んに炎症のメデ
ィーエーター、グループIカスパーゼ、アポトーシスのエフェクター及びグルー
プIIIアクチベーター又はアポトーシスと称されるように、すべてのカスパーゼ
はＧｌｕを好む。
【００２２】 表１ 参考文献としては、以下と同様に、Thronberryら., (1997) J. Biol. Chem. 2
72: 17907-17911がある。 カスパーゼグループ 最適配列 グループＩ カスパーゼ１ ＷＥＨＤ（配列番号：６） カスパーゼ４ Ｗ／ＬＥＨＤ カスパーゼ５ Ｗ／ＬＥＨＤ グループII カスパーゼ３ ＤＥＶＤ（配列番号：３） カスパーゼ７ ＤＥＶＤ（配列番号：３） カスパーゼ２ ＤＥＨＤ（配列番号：８） ＣＥＤ-３ ＤＥＴＤ（配列番号：９） グループIII カスパーゼ６ ＶＥＨＤ（配列番号：１０） カスパーゼ８ ＬＥＴＤ（配列番号：１１） カスパーゼ９ ＬＥＴＤ（配列番号：７） カスパーゼ１０ ＬＥ（Ｎｌｅ）Ｄ（配列番号：１２）
【００２３】 本発明によると、グループII及びIIIのカスパーゼは、「プロ-アポトーシス性
カスパーゼ」と呼ばれる。 「カスパーゼ」及び「野生型カスパーゼ」という用語は、天然発生カスパーゼ
、又は天然発生カスパーゼのアミノ酸配列を有する、組み換え的に生産されたカ
スパーゼと一致するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指すために使用される
。天然発生カスパーゼには、ウサギ、ラット、豚、非ヒト霊長類、馬、マウス、
及び羊のような他の動物種と同様に、ヒト種の天然発生カスパーゼが含まれる。
哺乳動物カスパーゼタンパク質のアミノ酸配列は、一般的に、常套的な技術によ
って知ることができるか得ることができる（Stennicke及びSalvesen(1998)上掲
）。アミノ酸に対して与えられている番号と同様に、カスパーゼ１−１０に関す
るカスパーゼアミノ酸配列は、Cohen, (1997) Biochem. J. 326: 1-16に記載さ
れている。
【００２４】 「カスパーゼ変異体」及びその類似体は、天然には見出されないが、前駆体野
生型カスパーゼから誘導される又は誘導することが可能な配列を有するカスパー
ゼ型プロテアーゼを指す。このカスパーゼ変異体は、前駆体カスパーゼと同じ基
質特異性を有するが、野生型カスパーゼアミノ酸配列内でのアミノ酸置換によっ
て異なっている。従って、即発明に記載のカスパーゼとは、カスパーゼ変異体を
含むことを意味し、前駆体カスパーゼをコードするその変異体のＤＮＡ配列は、
カスパーゼが活性とここに記載の構造上の制限を満たす限り、天然配列カスパー
ゼアミノ酸の一つ又は複数のアミノ酸置換をコードする変異体ＤＮＡ配列を生産
するように修飾されている。
【００２５】 本発明の文脈における「カスパーゼ変換可能プロエイジェント」又は「プロエ
イジェント」或いは「プロドラッグ」とは、最適活性のためにカスパーゼによる
酵素的切断を必要とする化学療法剤のような薬剤を指し、そしてカスパーゼ基質
として上記に列挙されているペプチド成分のような「カスパーゼ切断可能プロド
ラック成分」又は「プロドラッグ成分」を含む。プロエイジェントは、一般的に
、もとの薬剤に比べて１０倍活性が低い。好ましい実施態様では、プロエイジェ
ントは、もとの薬剤よりも１０−１００倍活性が低い。更なる好ましい実施態様
では、プロエイジェントは、もとの薬剤よりも１００倍低い活性よりも高く、よ
り好ましくはもとの薬剤より１０００倍低い活性よりも高い。
【００２６】 インビトロ及び好ましくはインビボで、標的分子が、特定の細胞型と十分な親
和性、そして「ホルモン」へ特異性で結合し、特定の細胞型と「結合」、又は特
定の細胞型を「標的」とする場合、本発明のカスパーゼ複合体は、特定の細胞型
を「標的」とする（例えば、「ホルモンへ」、「ホーミング」、及び「標的」と
いう用語の使用は、Pasqualini及びRuoslahti(1996) Nature, 380: 364-366及び
Araqpら., (1998) Science 279: 377-380）。一般的には、標的分子は特定細胞
型又はその上の表層分子と約１μＭより低い、好ましくは約１００ｎＭより低い
、そしてより好ましくは約１０ｎＭより低い親和性で結合する。しかしながら、
約１ｎＭより低い、そして好ましくは約１ｐＭから１ｎＭの間の細胞エピトープ
に対する親和性を有する標的分子は、本発明の文脈内での標的化分子にほぼ等し
い。
【００２７】 本発明の文脈内で使用される「標的化分子」又は「薬剤」という用語には、タ
ンパク質、ペプチド、抗体のような糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖、
オリゴ糖、核酸、特定の細胞エピトープと結合する、又はそれに対するリガンド
である類似体が含まれる。本発明に記載の標的化薬剤には、特定の細胞型上に発
現する細胞表面（ＣＤ）抗原又は細胞レセプターのような細胞関連分子に対する
抗体のようなリガンドが含まれ。例えば： ｉ）内皮細胞表層上の臓器選択性アドレス分子に対するリガンド、例えば種々
のリンパ系臓器及び炎症を起こしている組織へのリンパ球ホーミングに関して同
定されたもの（Belivaqua, ら., (1989）Science, 243: 1160-1165; Siegelman
ら., (1989) Science 243: 1165-1171；Cepekら., (1994) Nature 372: 190-193
及びRosen及びBertozzi(1994) Curr. Opin. Cell Biol. 6:663-673）。 ｉｉ）内皮細胞マーカーに対するリガンド、例えば種々の臓器への腫瘍ホーミ
ングの原因であるＥｒｂ２（Johnsonら., (1993)J. Cell. Biol. 121: 1423-143
2）で、米国特許第５，６４１，８６９号又はMarchionniら., Nature, 362: 312
-318(1993)に開示のようなヘレグリン遺伝子産物によってコードされているポリ
ペプチドを指す、ここで使用される「ヘレグリン」（ＨＲＧ）を含む。ヘレグリ
ンの例としては、ヘレグリン-α、ヘレグリン-β１、ヘレグリン-β２及びヘレ
グリン-β３（Holmesら., Science, 256: 1205-1210(1992)；及び米国特許第５
，６４１，８６９号）；neu分化因子（ＮＤＦ）（Pelesら., Cell 69: 205-216(
1992)）；アセチルコリンレセプター誘導活性（ＡＲＩＡ）（Fallsら., Cell 72
: 801-815(1993)）；グリア成長因子（ＧＧＦｓ）（Marchionniら., Nature, 36
2: 312-318(1993)）；感覚及び運動ニューロン由来因子（ＳＭＤＦ）（Hoら., J
. Biol. Chem. 270: 14523-14532(1995)）；-ヘレグリン（Schaeferら., Oncoge
ne 15: 1385-1394(1997)）が含まれる。用語には、生物学的に活性な断片及び／
又は天然配列ＨＲＧポリペプチドのアミノ酸配列変異体、例えばそのＥＧＦ様ド
メイン断片（例えば、ＨＲＧ１１７７−２４４）が含まれる。 ｉｉｉ）新生物発生前、又は腫瘍性細胞の存在のためのマーカーとして機能を
果たす「腫瘍抗原」又は腫瘍細胞抗原が含まれる。
【００２８】 ペプチド型標的化分子薬剤又はリガンドの例には、例えば： ｉ）脳及び腎臓などの種々の臓器への選択的局在化を媒介することができるペ
プチド（Pasqualini及びRuoslohti(1996) Nature 380: 364-366）。しばしば、
これらペプチドは、脳に局在化するペプチドに見出されるSer-Arg-Leuモチーフ
のような、主要なアミノ酸モチーフを含んでいる（Pasqualiini及びRuoslahti(1
996)上掲）。 ｉｉ）インテグリンなどの構造的に関連するレセプターを認識するアミノ酸配
列を含むペプチド。例えば、アミノ酸配列Arg-Gly-Asp(RGD)は、血小板、内皮細
胞白血球、リンパ球、単球、及び顆粒球に見出される種々のインテグリンと結合
することが知られているフィブリノーゲン、フィブロネクチン、フォン・ヴィレ
ブランド因子、及びトロンボスポンジンに見出される。ＲＧＤモチーフを含むペ
プチドは、ＲＧＤ認識インテグリンの活性を調節するのに使用できる（Gurrath
ら., (1992)Eur. J. Biochem. 210: 911-921；Koivunenら., (1995) Bio/Techno
logy 13: 265-270; O'Neilら., (1992) Proteins 14: 509-515）。例えば、イン
ビボファージ選択によって同定された、腫瘍血管へ特異的にホーミングすること
が可能なペプチドは、ペプチド構造に埋め込まれているArg-Gly-Asp(RGD)モチー
フを含み、ｖ３及びｖ５インテグリンと選択的に結合する（Arapら., (1998) Sc
ience 279: 377-380）。 ｉｉｉ）ペプチドライブラリのファージディスプレイは、例えばインシュリン
様成長因子結合タンパク質-１と結合できる、よく定義された溶液構造の短いペ
プチドを産し、インシュリン成長因子様活性を産する（Lowmanら., (1998) Bioc
hemistry 37:8870-8878）。 ｉｖ）ＥＰＯのレセプター等の細胞レセプターと結合及びそれを活性化し、例
えばWrightonら., (1996)Science 273: 458-463によって記載されているエリス
ロポリチンを刺激するもの、又はＴＰＯ応答細胞の増殖を刺激、及びCwirlaら.,
(1997)Science 276: 1696-1699によって記載もののような完全なアゴニストペ
プチドを随意的に含む、ペプチドライブラリのランダムファージディスプレイに
よって単離された小ペプチド。
【００２９】 「ＥｒｂＢリガンド」により、ＥｒｂＢレセプターと結合及び／又はそれを活
性するポリペプチドが意味される。ここでの特に対象となるＥｒｂＢリガンドと
は、天然配列ヒトＥｒｂＢリガンド、例えば上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）（Sava
geら., J.Biol. Chem. 247: 7612-7621(1972)）；トランスフォーミング成長因
子（ＴＧＦ-α）（Marquardtら., Science 223: 1079-1082(1984)）；シュワン
細胞腫又はケラチノサイト自己分泌成長因子として知られているアンフィレグリ
ン（Amphiregulin）（Shoyabら., Science 243: 1074-1076(1989)；Kimuraら.,
Nature 348: 257-260(1990)；及びCookら., Mol. Cell. Biol. 11: 2547-2557(1
991)；ベーターセルリン（betacellulin）（Shingら., Science 259: 1604-1607
(1993)；及びSasadaら., Biochem. Biophys. Res. Commun. 190: 1173(1993)）
；ヘパリン-結合上皮細胞成長因子（ＨＢ-ＥＧＦ）（Higashiyamaら., Science
251: 936-939(1991)）；エピレグリン（epiregulin）（Toyodaら., J. Biol. Ch
em. 270: 7495-7500(1995)；及びKomurasakiら., Oncogene 15: 2841-2848(1997
)）；ヘレグリン（下記を参照）；ニューレグリン-２（neuregulin-2）（ＮＲＧ
-２)（Carrawayら., Nature 387: 512-516(1997)）、ニューレグリン-３（neure
gulin-3）（ＮＲＧ-３)（Zhangら., Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 9562-9567(19
97)）；又はcripto（ＣＲ-１）（Kannanら. J. Biol. Chem. 272(6): 3330-3335
(1997)である。ＥＧＦＲに結合するＥｒｂＢリガンドには、ＥＧＦ、ＴＧＦ-α
、アンフィレグリン、ベーターセルリン、ＨＢ-ＥＧＦ及びエピレグリンが含ま
れる。ＥｒｂＢ３に結合するＥｒｂＢリガンドには、ヘレグリンが含まれる。Ｅ
ｒｂＢ４との結合が可能なＥｒｂＢリガンドには、ベーターセルリン、エピレグ
リン、ＨＢ-ＥＧＦ、ＮＲＧ-２、ＮＲＧ-３及びヘレグリンが含まれる。
【００３０】 好ましい標的化薬剤には、天然発生及び加工したレセプターリガンド、ペプチ
ド、及びペプチドメティックリガンド、抗体、特にＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ
’）２、及びＦｖ断片、ダイアボディ、構造非依存性抗体、一本鎖抗体分子、抗
体断片から形成された多重特異性抗体及び類似体をのような抗体断片を含むモノ
クローナル抗体が含まれる。標的化薬剤の中で好ましいものは抗体である。
【００３１】 「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤の例には、メ
イタンシノイド（Maytansinoids）合成類似体のみならずメイタンシン（Maytans
ine）及びアンサミトシン（Ansamitocins）のようなメイタンシノイド（Maytans
inoids）、カリケアミシン（Calicheamicins）、特にカリケアミシンγ１ Ｉ 及
びカリケアミシンθ１ Ｉ（Angew, (1994)Chem. Int. Ed. Engl., 33: 183-186を
参照）、ダイネミックシン（Dynemicins）、特にダイネミックシンＡ、及びその
合成類似体、及びネオカルチノスタチン（neocarzinostatin）発色団、及び関連
色素タンパク質エネジエン（enediyen）抗生物質発色団、エスペラミシン（Espe
ramicins)（米国特許第４，６７５，１８７号を参照）例えばエスペラミシンＡ
１を含むエネジエン抗生物質；アドリアマイシン（ドキソルビシン）及びモルホ
リノ-ドキソルビシン（モルホリノ-ＡＤＲ）、シアノモルホリノ-ドキソルビシ
ン（シアノモルホリノ-ＡＤＲ）、ＡＮ-２０１として知られているピロリノ２-
（Pyrrolino)-ドキソルビシン、デオキシドキソルビシン、チコテネセン（Ticho
thecenes）、特にＴ-２トキシン、ベラクリンＡ（Verracurin A）、ロリジン（R
oridin A）及びアングイジン（Anguidine）、エポシロン（epothilone）、リゾ
キシン（Rhizoxin）、アセトゲニン(Acetogenins )、特にブラタシン(Bullataci
n）及びブラタシノオン（Bullatacinone）、クリプトフィシン（Cryptophycin）
、特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８、ドラスタチン（dolastatin
）、カリスタチン（Callystatin ）、ＣＣ-１０６５及び合成類似体、特にアド
ゼリシン（Adozelesin）、カルゼリシン（Carzelesin）及びバイゼリシン（Bize
lesin）、ドカルマイシン（Doucarmycins)及び合成類似体、特にＫＷ-２１８９
及びＣＢＩ-ＴＭＩ、サルコジシチン（Sarcodictyin ）、エレトロビン（Eleuth
erobin）、スポンジスタチン（Spongistatin）、ブリオスタチン（Bryostatin
）、パンクラチスタチン（Pancratistatin）、カンプトテシン（Camptothecin）
及び合成類似体、特にトポテカン（Topotecan)、エピルビシン（Epirubicin)、
５-フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（「Ａｒａ-Ｃ」）、サイクロフォ
スファマイド（Cyclophosphamide）、チオテパ（thiotepa）、ブスルファン(Bus
ulfan)、タキソイド（Taxoid）、例えばパクリタキセル（Taxol（登録商標）, B
ristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ）及びドキセタキセル（Taxoter
e, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Rance）、メトトレキセート、シスプラチン
、メルファラン及び他の関連窒素マスタード、ビンブラスチン、ブレオマイシン
、エトポシド、イフォスファミド、マイトマイシン例えばマイトマイシンＣ、マ
イトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシ
ド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシンが
含まれる。また、この定義に含まれるのは、タモキシフェン及びオナプリストン
などのホルモン作用を調節又は阻害するように作用するホルモン様薬剤である。
【００３２】 「ＣＤ２０」抗原は、前Ｂ細胞発生の間に発現され、細胞周期開始及び分化に
必要とされる細胞活性化の過程を調節し得る。ＣＤ２０抗原は、腫瘍性Ｂ細胞上
において高レベルで発現されるが、正常Ｂ細胞上にも同様に存在する。ＣＤ２０
表面抗原を認識する抗−ＣＤ２０抗体は、腫瘍性Ｂ細胞の標的化及び破壊を導く
ために臨床的に用いられてきた（Maloneyら., (1994) Blood 84: 2457-2466；Pr
essら., (1993) NEJM 329: 1219-1224；Kaminskiら., (1993) NEJM 329: 459-46
5 McLaughlinら., (1996) Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 15: 417 ）。キメラ又
はヒト化抗-ＣＤ２０抗体は、標的Ｂ細胞の補体依存性溶解を媒介する（Maloney
ら., 上掲）。モノクローナル抗体Ｃ２Ｂ８は、ヒトＢ細胞制限分化抗原Ｂｐ３
５を認識する（Liuら., (1987) J. Immunol. 139: 3521；Maloneyら., (1994) B
lood 84: 2457）。「Ｃ２Ｂ８」は、国際公開WO94/11026に記載された抗-ＣＤ２
０モノクローナル抗体と定義される。
【００３３】 「疾病」または「疾患」とは、本発明のカスパーゼ複合体及びプロエイジェン
トを含んでなる組成物による治療が有益であるあらゆる症状である。これには、
哺乳動物を問題となっている疾患に罹りやすくする病理的症状を含む、慢性及び
急性疾病又は疾患が含まれる。ここで治療される疾患の制限なき例には、良性及
び悪性腫瘍；白血病、リンパ系悪性腫瘍；神経性、グリア、星状性細胞性、視床
下部、及び腺性、マクロファージ性、上皮性、間質性及び胞胚腔性疾患；及び炎
症性、血管形成及び免疫性疾患が含まれる。
【００３４】 「ＨＥＲ２」、「ＥｒｂＢ２」、「ｃ-Ｅｒｂ-Ｂ２」という用語は互換的に使
用される。別に示さない限り、ここで使用される「ＥｒｂＢ２」、「ｃ-Ｅｒｂ-
Ｂ２」及び「ＨＥＲ２」という用語はヒトタンパク質を指し、「ｅｒｂＢ２」、
「ｃ-ｅｒｂ-Ｂ２」及び「ｈｅｒ２」はヒト遺伝子を指す。ヒトｅｒｂＢ２遺伝
子及びＥｒｂＢ２タンパク質は、例えばSembaら., PNAS(USA)82:6497-6501(1985
)及びYamamotoら., Nature 319:230-234(1986)(ジーンバンク受託番号 X03363)
に記載されている。ＥｒｂＢ２は、４つのドメインを有する(ドメイン１-４)。
【００３５】 薬学科学においていくらかの有用性を有する化合物を指すために、「薬剤」、
「製薬剤」、「薬」、「薬物」及びその類似物は、ここでは「もとの薬剤」又は
「もとの薬」という用語と相互転換できるように使用される。製薬剤は、本発明
のカスパーゼ切断プロドラッグ成分が存在しない下で、細胞障害性のような生物
学的活性を有することにより製薬的に活性又は「生物活性」である。このような
分子には、小生物有機分子、例えばペプチド模倣物、抗体、イムノアドヘシン、
タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖、オリゴ糖、
核酸、生物有機分子、薬学的薬剤、そしてその代謝物、転写及び翻訳制御配列、
及びその類似物が含まれる。
【００３６】 「プロカスパーゼ」とは、プロカスパーゼの内部分の切断によって、実質的に
より高い活性を有するカスパーゼの「成熟」型が生じる、不活性又は最小限度に
活性チモーゲンのカスパーゼ配列を指す。カスパーゼは、タンパク質分解切断に
よって前駆体から遊離された大（〜１７−２０ｋＤａ）及び小（９−１２ｋＤａ
）サブユニットから成る活性型のチモーゲンとして合成される。多くのタンパク
質分解性酵素が、翻訳プロ酵素産物として自然界に見出され、翻訳後プロセシン
グを欠いて、この様式で発現される。 ここで使用される「プロドラッグ」という用語は、製薬的に望ましい特徴又は
特性（例えば、相対的な不活性、輸送、生物学的利用能、薬力学等）を随意的に
増強し、「生物変換」、すなわち活性なもとの薬を遊離するために、カスパーゼ
による酵素的な「プロドラッグ成分」の切断を必要する、もとの薬の誘導体を指
す。
【００３７】 基質は、Ｐｎ．．．Ｐ２-Ｐ１-Ｐ１’-Ｐ２’．．．Ｐｎ’のようにトリプレ
ット又は一文字で記載される。「Ｐ１」残基は、Schechter及びBergerによって
定義されたように、基質の切れやすいペプチド結合（すなわちＰ１とＰ１’残基
の間）の先の位置（すなわち、Ｎ-末端から）を指す（Schechter, I. 及びBerge
r, A., Biochem. Biophys. Res. Commun. 27: 157-162(1967)）。同様に、用語
Ｐ１’は、基質の切れやすいペプチド結合の後の位置（すなわち、Ｃ-末端から
）を指すのに使用される。増加する番号は、切れやすい結合の先（例えば，Ｐ２
及びＰ３）及び後（例えば、Ｐ２’及びＰ３’）の次の連続した位置を指す。本
発明によると、切れやすいペプチド結合は、即発明のカスパーゼによって切断さ
れやすい結合である。
【００３８】 「治療的有効量」という用語は、哺乳類の疾病や疾患の治療のために有効な薬
剤の量に相当する。癌の場合は、治療的有効量の薬剤は、癌細胞の数を減少させ
；腫瘍の大きさを小さくし；癌細胞の周辺器官への浸潤を阻害(すなわち、ある
程度に遅く、好ましくは止める）し；腫瘍の転移を阻害(すなわち、ある程度に
遅く、好ましくは止める）し；腫瘍の成長をある程度阻害し；及び／又は疾患に
関連する一つ或いはそれ以上の症状をある程度和らげることが可能である。ある
程度、薬剤は、成長を妨げ及び／又は現存の癌細胞を殺すことが可能で、細胞分
裂停止性及び／又は細胞障害性である。癌治療に対しては、効力は、例えば病状
の進行時間(ＴＴＰ)の評価、又は応答速度(ＲＲ)の決定及び／又は全生存を評価
することにより測定される。 ここで使用される「治療する」、「治療」及び「治療法」とは、治癒的療法、
予防的療法及び防護的療法を称する。 ここで使用される「哺乳動物」という用語は、ヒト、ウシ、ヒツジ、ウマ、イ
ヌ及びネコを含む哺乳動物として分類されるあらゆる動物を指す。本発明の好ま
しい実施態様においては、哺乳動物はヒトである。
【００３９】 本発明を実行する方法 本発明は、カスパーゼで切断可能なプロドラッグの切断に関するカスパーゼの
標的投与、並びに対象の細胞型を標的とするカスパーゼ複合体の投与による製薬
剤の局在化送達に関する方法、そしてカスパーゼの存在の下で局所的に活性剤へ
変換されるプロエイジェントの付加的投与に関する。ＡＤＥＰＴ法に関しては、
Syrigos及びEpenetos(1999)上掲が一般的な参考文献となる。特定の実施態様で
は、本発明は、腫瘍性細胞のような種々の細胞型を特徴とする部位への例えば癌
治療に有用なプロドラッグの標的投与、特定の細胞型の部位でのカスパーゼによ
るプロドラッグの活性薬への局所的変換に関する。本発明は、カスパーゼ切断可
能プロドラッグ部分を含む新規プロドラッグと同時に、カスパーゼを含む新規標
的化薬剤を提供する。
【００４０】 本発明のカスパーゼ成分には、ここで定義されたような任意のカスパーゼが含
まれる。好ましくは、任意のヒトカスパーゼ１−１０又はグランザイムＢ。好ま
しいカスパーゼは、プロ-アポトーシス性カスパーゼ２，３，６，７，８，９，
１０である。最も好ましいカスパーゼは、カスパーゼ２，３，７である。 グランザイムＢは別として、他の既知のプロテアーゼとは異なる最高の基質特
異性（Xaa-Glu-Xaa-Asp）を有することから、カスパーゼはプロドラッグ活性化
にとって魅力がある。プロ-アポトーシス性カスパーゼは、不活性又は最小活性
チモーゲンとして広く分布しているが、活性酵素は、アポトーシスを起こしてい
る細胞内成分に限定される。カスパーゼ２，３及び７にとって最も好ましい基質
は、それぞれＤＥＨＤ（配列番号：８）、ＤＥＶＤ（配列番号：３）、及びＤＥ
ＶＤ（配列番号：３）である。これら配列は、好ましい基質としてＩＥＰＤ（配
列番号：１３）を有するグランザイムＢ（Thornberryら., (1997)上掲）、並び
にＳ４（カスパーゼ１ ＷＥＨＤ（配列番号：６）、カスパーゼ４（Ｗ／Ｌ）Ｅ
ＨＤ、カスパーゼ５（Ｗ／Ｌ）ＥＨＤ）に大きな疎水残基の優先度を有する炎症
誘発性のカスパーゼ（カスパーゼ１，４，５，１１，１２，１３）にとって非常
に貧弱な基質である。例えば、Ａｃ-ＤＥＶＤ-ｐｎａは、組み換え体の商業用カ
スパーゼ３によって容易に加水分解されることが見出されていたが、グランザイ
ムＢによる検出可能な切断はなかった。
【００４１】 従って、本発明によると、カスパーゼは、特定の標的化分子、すなわち対象の
細胞型に帰巣する、又は結合する分子と結合するように選択される。薬剤の不活
性又はプロドラッグ形態が、ここに記載のペプチジルプロドラッグ部分のような
カスパーゼ切断可能部分を含むように、対応するプロドラッグは構築される。 カスパーゼがチモーゲンとして天然に発生するので、構成的に活性なカスパー
ゼを生成することが必要である。構成的に活性なカスパーゼを生産させる簡便な
方法は、Srinivasulaら., (1998) J. Biolgical Chem. 273(17): 10107-10111に
記載されている。この方法によると、操作された分子が、加工された野生型活性
分子によって表示される構造を模倣するように、大きなサブユニットと小さいサ
ブユニットの順序を転換することにより、「リバースカスパーゼ」と命名される
カスパーゼが生成される。前述で活性カスパーゼを生産する簡便な方法が示され
ているが、その方法は例示及び制限せずに示されている。
【００４２】 標的化成分 標的化成分を、対象の細胞型へ結合又は帰巣する、ここに記載の任意の分子で
あるとすることができる。抗体とペプチド型分子は、好ましい標的化分子である
。 好ましい実施態様では、標的化分子は抗体である。本発明の複合体の抗体成分
には、特定の細胞型と特異的に結合する任意の抗体を含む。例えば、この抗体は
腫瘍関連抗原と結合し得る。そのような抗体の例としては、限定されるものでは
ないが、癌腫、メラノーマ、リンパ種、並びに骨及び軟組織肉腫と並んで他の腫
瘍に見出される抗原と特異的に結合するものが含まれる。長期間にわたって細胞
表層に結合してとどまる、或いは非常にゆっくりと内在化する抗体が好まれる。
これらの抗体は、ポリクローナル、又はモノクローナルであってよく、無傷の抗
体分子、或いは例えばＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２である抗体の活性結合領域を含
有する断片であってよく、そして当該分野において確立された技術を使用して生
産することができる。
【００４３】 本発明の範囲内での好ましい抗体は、限定されるものではないが、抗-ＩＬ-８
, St Johnら., (1993) Chest 103: 932及び国際公開番号WO95/23865；抗-ＣＤ１
１ａ, Filcherら., Blood, 77: 249-256, Steppeら., (1991) Transplant Intl.
4: 3-7, 及びHourmantら., (1994), Transplantation 58: 377-380；抗-ＩｇＥ
, Prestaら., (1993), J. Immunol. 151: 2623-2632, 及び国際公開番号WO95/19
181；抗-ＨＥＲ２, Carterら., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285-
4289, 及び国際公開番号WO92/20798；抗-ＶＥＧＦ（Jin Kimら.,(1992) Groeth
Factors, 7: 53-64, 及び国際公開番号WO96/30046；及び抗-ＣＤ２０, Maloney
ら., (1994) Blood , 84: 2457-2466, 及びLiuら., (1987) J. Immunol., 139:
3521-3526を含む。さらに、以下の腫瘍細胞抗原を標的とする抗体又は他の分子
は、本発明に記載の適切な標的化薬剤として機能を果たす：Ａｐｏ２、ＣＤ２０
、ＣＤ４０、ｍｕｃ-１、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺幹細胞抗原
（ＰＳＣＡ）、上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）、ＣＤ３３、ＣＤ１９、解
離促進因子（ＤＡＦ）、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ５２、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＴＡ
Ｇ７２抗原、ｃ-ＭＥＴ、又は前立腺の六つの膜貫通上皮性抗原（ＳＴＥＡＰ）
。
【００４４】 本発明のカスパーゼ複合体を生産するために、本発明のカスパーゼを、当該分
野で知られた方法によって標的化分子と結合させることができる。 例えば、こ
のカスパーゼは、共有結合によって標的化分子と結合させることができる。共有
結合を作る方法は、当該分野で知られており、例えば、ヘテロ二官能性架橋剤、
ＳＰＤＰ（Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオネート）
又はＳＭＣＣ（スクシンイミジル ４-（Ｎ-マレイミドメチル）シクロヘキサン-
１-カルボキシレートの使用が含まれる［P.E. Thorpeら., The Preparation And
Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates, Immunological Rev.,
62, pp. 119-58(1982)；J. M. Lambert ら., 上掲, 12038ページ；G. F. Rowlan
dら., 上掲, 183-84ページ、及びJ. Gallegoら., 上掲, 737-38ページ］。 より選択的な結合は、マレイミド-ヒドロキシスクシ二ミドエステルのような
ヘテロ二官能性リンカーを使用することで達成できる。酵素での後者の反応は、
酵素上にアミン基を誘導体化し、この誘導体は、次いで、例えばメルカプト基が
フリーである抗体Ｆａｂ断片と反応することができる（又はより大きな断片、又
は例えばトラウト試薬によってメルカプト基がさらに付加された無傷の免疫グロ
ブリン）。
【００４５】 好ましいジスルフィド結合は、Arpiccoら., (1997) Bioconj. Chem. 8: 327-3
37及びDosioら., (1998）Bioconj. Chem. 9: 372-381。 抗原結合部位から離れている、抗体のような標的化分子上の部位へ酵素を結合
させることは有益である。これは、例えば、上記で示したような鎖間メルカプト
基を切断する結合によって完遂できる。その他の方法には、炭水化物部分が酸化
されている抗体を、少なくとも一つのフリーのアミン官能基を有する酵素と反応
させることが含まれる。この結果は最初のシッフ塩基（イミン）結合を生じ、こ
れは好ましくは、例えばホウ化水素還元による、最終複合体を形成する第二アミ
ンへの還元によって安定化される。
【００４６】 抗体分子及び類似体について、本発明のカスパーゼの機能的に活性な部分と少
なくとも結合した抗体の少なくとも抗原結合領域を含む複合体は、当該分野で知
られている組み換えＤＮＡ技術を使用して構築することができる。結合の型によ
って、カスパーゼは、Ｎ-又はＣ-末端を通して標的化分子のＮ-又はＣ-末端と結
合し得る。例えば、カスパーゼをコードする核酸は、随意的にリッカードメイン
を通して標的化分子配列をコードする核酸と作用可能に結合し得る。概して、こ
の構築物は、カスパーゼのＮ又はＣ末端が抗体又は抗体断片のＮ末端と結合して
いる、抗体又は抗体断片のような標的化ドメインを含む融合タンパク質をコード
する。しかしながら、例えば、カスパーゼのＣ又はＮ末端が標的化ドメインのＮ
又はＣ末端と結合している融合物も可能である。
【００４７】 好ましい標的化ドメインは、抗体及び抗体断片である。概して、そのような形
態では、融合タンパク質は少なくともＣＨ１及びヒンジ領域を保持し、そして特
定の実施態様では、免疫グロブリン重鎖の定常領域のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン
である。また、融合物は、例えば、定常領域のＦｃ部分のＣ末端、又は重鎖のＣ
Ｈ１又は軽鎖の対応する領域に対して直ぐにＮ末端に作製された。 カスパーゼの免疫グロブリンドメインへの融合がなされた正確なアミノ酸部位
は、重要ではない；特定部位は、良く知られており、生物学的活性、分泌、又は
結合特徴を最適化するめに選択されてよい。
【００４８】 複合体の大きさのために、通常は、好ましくは、一つの抗体を一つの酵素分子
へ結合させる。しかしながら、多数の抗体断片、例えばＦａｂ又はＦ（ａｂ’）
２断片を単一の酵素へ結合させ、その結合親和性又は抗原標的への効率を高める
ことは有益である。あるいは、酵素がそれほど大きくなければ、複合体のターン
オーバー数を増加させ、標的部位での診断又は治療剤の沈着速度を増すために、
多数の酵素分子を単一の抗体又は抗体断片と結合させることは有用である。複合
体が標的部位に達して直ぐに消滅しない場合、一つのカスパーゼ及び抗体より多
い複合体も使用することができる。異なる大きさの複合体の混合物、或いは凝集
体を含有する複合体を、ちょうど記した同じ注意によって再び使用することがで
きる。
【００４９】 プロドラッグの投与の前に、哺乳動物の循環器系からの標的化分子-カスパー
ゼ複合体のクリアランスをモニターし、標的化分子-カスパーゼ複合体がしっか
りと標的部位に局在化していることを確かめるために、標的化分子-カスパーゼ
複合体を、ラジオアイソトープ又は磁気共鳴映像造影剤で更に標識し、又はそれ
に結合、或いはそれへの結合のために改造できる。あるいは、例えば血液及び尿
などの体液中での標的化分子-カスパーゼ複合体の検出及び定量が可能となるよ
うに、複合体を、標識、例えば放射線標識、蛍光標識又はその類似体で札付けで
き、それ故に標的化及び／又はクリアランスが測定及び／又は推定できる。
【００５０】 下記に記すように、インビボでの使用のために、タンパク質を標識する適切な
放射標識の任意の便宜的な方法は、一般的に、標的化薬剤／カスパーゼを標識す
るために適切であり、そしてしばしば基質-薬剤複合体の標識のためにも適切で
ある。これは、例えばＩ-１３１、Ｉ-１２３例えばＴｃ-９９ｍ又はＣｕイオン
又は類似物とのメタレーションで直接に標識することによって、常套的技術によ
って、或いは放射性金属又は常磁性イオンのためのキレート剤を付着させること
によって達成される。そのようなキレート剤及びそれら抗体への付着の方法は、
当業者には良く知られており、特に、例えば前述のGoldenbergの特許、及びChil
dsら., J. Nuc. Med., 26: 293(1985)に開示されている。
【００５１】 薬剤成分 本発明の文脈中で使用される適切な薬剤には、特定の疾病又は疾患の治療の過
程で示される任意のものが含まれる。当該分野に熟練した者は、一つ又は複数の
常套手法を使用することで、どの分子が所定の応用にとって適切であるかを容易
に確かめられる。例えば、細胞障害性又は化学療法剤は、種々の癌治療プロトコ
ールにおいて適切であり、特定部位にてより活性のある薬剤へ変換するプロエイ
ジェントとして投与される場合にのみ有用であり得る。化学療法剤の例には、メ
イタンシノイド（Maytansinoids）合成類似体のみならずメイタンシン（Maytans
ine）及びアンサミトシン（Ansamitocins）のようなメイタンシノイド（Maytans
inoids）、カリケアミシン（Calicheamicins）、特にカリケアミシンγ１ Ｉ 及
びカリケアミシンθ１ Ｉ（Angew, (1994)Chem. Int. Ed. Engl., 33: 183-186を
参照）、ダイネミックシン（Dynemicins）、特にダイネミックシンＡ、及びその
合成類似体、及びネオカルチノスタチン（neocarzinostatin）発色団、及び関連
色素タンパク質エネジエン（enediyen）抗生物質発色団、エスペラミシン（Espe
ramicins)（米国特許第４，６７５，１８７号を参照）例えばエスペラミシンＡ
１を含むエネジエン抗生物質；アドリアマイシン（ドキソルビシン）及びモルホ
リノ-ドキソルビシン（モルホリノ-ＡＤＲ）、シアノモルホリノ-ドキソルビシ
ン（シアノモルホリノ-ＡＤＲ）、ＡＮ-２０１として知られている２-ピロリノ
（Pyrrolino)-ドキソルビシン、デオキシドキソルビシン、チコテネセン（Ticho
thecenes）、特にＴ-２トキシン、ベラクリンＡ（Verracurin A）、ロリジンＡ
（Roridin A）及びAnguidine（アングイジン）、エポシロン（Epothilone）、リ
ゾキシン（Rhizoxin）、アセトゲニン(Acetogenins )、特にブラタシン(Bullata
cin）及びブラタシノオン（Bullatacinone）、クリプトフィシン（Cryptophycin
s）、特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８、ドラスタチン（dolasta
tin）、カリスタチン（Callystatin）、ＣＣ-１０６５及び合成類似体、特にア
ドゼリシン（Adozelesin）、カルゼリシン（Carzelesin）及びバイゼリシン（Bi
zelesin）、ドカルマイシン（Doucarmycins)及び合成類似体、特にＫＷ-２１８
９及びＣＢＩ-ＴＭＩ、サルコジシチン（Sarcodictyin）、エレトロビン（Eleut
herobin）、スポンジスタチン（Spongistatin）、ブリオスタチン（Bryostatin
）、パンクラチスタチン（Pancratistatin）、カンプトテシン（Camptothecin）
及び合成類似体、特にトポテカン（Topotecan)、エピルビシン（Epirubicin)、
５-フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（「Ａｒａ-Ｃ」）、サイクロフォ
スファマイド（Cyclophosphamide）、チオテパ（thiotepa）、ブスルファン(Bus
ulfan)、タキソイド（Taxoid）、例えばパクリタキセル（Taxol（登録商標）, B
ristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ）及びドキセタキセル（Taxoter
e, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Rance）、メトトレキセート、シスプラチン
、メルファラン及び他の関連窒素マスタード、ビンブラスチン、ブレオマイシン
、エトポシド、イフォスファミド、マイトマイシン例えばマイトマイシンＣ、マ
イトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシ
ド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシンが
含まれる。また、この定義に含まれるのは、タモキシフェン及びオナプリストン
などのホルモン作用を調節又は阻害するように作用するホルモン様薬剤である。
【００５２】 プロドラッグ部分の設計 本発明には、カスパーゼ切断可能プロドラッグ部分を含む新規プロドラッグが
含まれる。従って、本発明によると、活性薬剤は、最適活性のために、本発明の
カスパーゼの作用を必要とするプロドラッグの形態で投与される。一般的には、
薬は、治療されるべき疾病又は疾患に基づいて選択される。カスパーゼ切断可能
プロドラッグ部分は、薬に付着している。その付着部位は薬によって変わるが、
典型的には、高機能性の効能にとって必要な位置にある。プロドラッグ部分の付
着は、より低い活性又は最小活性薬を生じる。 プロドラッグ部分は、一般的には、少なくとも四つのアミノ酸を含み、Ｐ１の
位置にＡｓｐを有する。従って、一般式Ｐ４-Ｐ３-Ｐ２-Ａｓｐのプロドラッグ
部分は、本発明の文文脈中では好まれる。使用されている特定のカスパーゼに関
して、プロドラッグ部分が選ばれる。１０の既知のヒトカスパーゼの特異性が記
載されている。熟練者は、適切なプロドラッグ部分の設計及び構築において、Th
ornberryら., (1997)上掲を参照する。例えば、一般式Ａｓｐ-Ｘａａ-Ｘａａ-Ａ
ｓｐのプロドラッグ部分は、カスパーゼ３，７及び２に好まれ、Ａｓｐ-Ｇｌｕ-
Ｖａｌ-Ａｓｐ（配列番号：３）はカスパーゼ３及び７、そしてＡｓｐ-Ｇｌｕ-
Ｈｉｓ-Ａｓｐ（配列番号：４）はカスパーゼ２に好まれる。 好ましいプロドラッグは： Ｘ-Ｓ４-Ｓ３-Ｓ２-Ａｓｐ-薬、又はＳ４-Ｓ３-Ｓ２-Ａｓｐ-リンカー-薬の一
般式を有し、Ｘは、随意的に欠いている、或いは例えばアセチル基のようなアシ
ル基であり、リンカーは、ここでより完全に記載されているような選択的リンカ
ードメインである。
【００５３】 リンカードメイン 本発明によると、リンカードメインは、下記にてより詳細に記載されているよ
うに、二つ又はそれより多い活性ドメインの間の空間架橋を提供する任意の分子
のグループである。本発明のこの側面によると、化学療法剤のような活性ドメイ
ンとカスパーゼ切断可能プロドラッグ部分は、例えば化学共役によって結合され
る。本発明のハイブリッド分子のリンカー成分は、必ずしも関与しないものの、
ハイブリッド分子の機能に貢献し得る。従って、本発明によると、リンカードメ
インは、プロドラッグ部分、例えばペプチドドメインと薬のドメインの間の空間
架橋を提供する任意の分子のグループである。 リンカードメインは、長さ及び構造を変えられることが可能である。熟練技術
者は、リンカー分子の長さ、及びプラズマ安定性を含むその構造、カスパーゼ活
性部位との適合性、自己撤去される能力（Carl, Chakravarty及びKatzenellenbo
gen(1981) J. Medicinal Chem. 24(5): 479-480）；細胞によって取り込まれる
改良薬の能力及びその溶解性を考慮する。リンカードメインは、好ましくはハイ
ブリッド分子のペプチドドメインが、実質的に空間的／構造的制限がなく調和し
たカスパーゼ分子と相互作用することを許容する。従って、リンカードメインの
長さは、二つの機能的ドメインの特徴、例えばハイブリッド分子の薬のドメイン
及びペプチドに依存する。好ましいリンカードメインが、もとの薬に対するカス
パーゼ切断可能プロドラッグ部分が存在しない下で不安定な結合を提供し、それ
故にプロドラッグの切断の際には、リンカーが急速に失われてフリーの活性親薬
を遊離することに留意して、適切なリンカードメインは構築される。好ましいリ
ンカードメインは、従って「自壊型」である。好ましいリンカードメインは、Du
bowchikら., (1998) Bioorg. Med. Chem. Letts. 8:3341-3346及びDubowchikら.
, (1998) Bioorg. Med. Chem. Letts. 8: 3347-3352に記載されている。
【００５４】 化学合成 本発明の化合物を生産する一つの方法には、化学合成が含まれる。これは、当
該分野で知られている方法論を使用して完遂することができる（Kelley, R. F.
& Winkler, M. E. in Genetic Engineering Principles and Methods, Setlow,
J. K, 編., Plenum Press, N. Y., 12巻, 1-19ページ(1990), Stewart, J. M. Y
oung, J. D., Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockfor
d, IL(1984)を参照；米国特許第4,105,603号；3,972,859号；3,842,067号；及び
3,862,925号も参照）。 本発明のプロエイジェントは、固相ペプチド合成（Merrifield, (1964)J. Am.
Chem. Soc., 85: 2149 ; Houghten,(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5
132）、有機化学又は組み換え合成のコンビネーションを用いて都合よく作成さ
れる。固相合成は、保護されたアミノ酸を不活性個体支持体に結合させることに
より推定ペプチドのカルボキシ末端において開始される。不活性な固体支持体は
、開始アミノ酸のＣ末端のアンカーとして働くことのできる任意の高分子であり
得る。典型的には、高分子支持体は、上掲のStewart及びYoungの２及び４ページ
の図１-１及び１-２に示されるような架橋高分子樹脂（例えば、ポリアミド又は
ポリスチレン樹脂）である。一実施態様では、Ｃ末端アミノ酸はベンジルエステ
ルを形成するポリスチレン樹脂と連結している。高分子支持体は、例えば、ペプ
チド合成の阻害アミノ酸のαアミノ基を解放するのに使用される条件下でペプチ
ドアンカー結合が安定であるものが選択される。塩基不安定α保護基が使用され
、次いでペプチドと固体支持体の間の酸不安定結合を使用するのが好ましい。例
えば、酸不安定エーテル樹脂は、上掲のStewart及びYoungの１６ページに記載さ
れるような塩基不安定Ｆｍｏｃアミノ酸ペプチド合成に効果的である。あるいは
、アシドリシスに対して差次的に変化しやすいペプチドアンカー結合及びα保護
基が使用できる。例えば、フェニルアセトアミドメチル(Ｐａｍ)樹脂のようなア
ミノメチル樹脂は、上掲のStewart及びYoungの１１-１２ページに記載されるよ
うにＢｏｃ-アミノ酸ペプチド合成に関連してうまく働く。
【００５５】 開始アミノ酸が不活性固体支持体に連結した後、開始アミノ酸のα-アミノ酸
保護基を例えば塩化メチレンのトリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)で除去し、例えばトリ
エチルアミン(ＴＥＡ)で中和する。開始アミノ酸のα-アミノ基の脱保護に続い
て、合成における次のα-アミノ及び側鎖保護したアミノ酸を添加する。次に残
りのα-アミノ、必要ならば側鎖保護されたアミノ酸を縮合により所定の順序で
続けて結合させ、個体支持体に結合した中間体化合物を得る。あるいは、ペプチ
ド断片を伸長している固相ペプチド鎖に付加する前に、幾つかのアミ酸を互いに
結合させて所望のペプチド断片を形成してもよい。 ２つのアミノ酸、又はアミノ酸とペプチド、又はペプチドとペプチドの間の縮
合反応は、通常の縮合方法、例えばアジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ（Ｎ,Ｎ'
-ジシクロヘキシルカルボジイミド）又はＤＩＣ（Ｎ,Ｎ'-ジイソプロピルカルボ
ジイミド）法、活性エステル法、ｐ-ニトロフェニルエステル法、ＢＯＰ(ベンゾ
トリアゾール-1-イル-オキシ-トリス[ジメチルアミノ]ホスホニウムヘキサフル
オロホスフェート)法、Ｎ-ヒドロキシコハク酸イミドエステル法など、及びウッ
ドワード試薬Ｋ法、ＨＢＴＵ（Ｏ-［ベンゾトリアゾール-１-イル］-１,１,３,
３-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート）法、ＨＡＴＵ（Ｏ-
［７-アザベンゾトリアゾール-１-イル］-１，１，３，３-テトラメチルウロニ
ウム ヘキサフルオロホスフェート）法、及びＰｙＢＯＰ（(ベンゾトリアゾール
-1-イル-オキシ-トリスピロリジノホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート）
法によって実行できる。
【００５６】 ペプチドの化学合成に共通なのは、アミノ酸の任意の反応性側鎖基を適切な保
護基で保護することである。最終的には、これらの保護基は、所望のポリペプチ
ド鎖が連続的に組み立てられた後に除去される。さらに共通なのは、アミノ酸又
はペプチド断片上のαアミノ基を保護するが、アミノ酸又はペプチド断片のＣ末
端カルボキシル基が成長固体支持体ポリペプチド鎖の遊離Ｎ末端のアミノ基と反
応し、続いてα-アミノ基を選択的に除去し、次のアミノ酸又はペプチド断片を
固体ペプチド鎖に付加させる。従って、ペプチド合成において一般的には、中間
体化合物が生成され、それはペプチド鎖の所望の配列に局在化した各アミノ酸残
基を含み、その個々の残基は側鎖保護基を有することである。これらの保護基は
、実質的に同時に除去され、固相から取り外した後に所望のポリペプチド生成物
が生成される。
【００５７】 α-及びε-アミノ側鎖基を、ベンジルオキシカルボニル（省略して、Ｚ）、イ
ソニコチニルオキシカルボニル（ｉＮＯＣ）、ｏ-クロロベンジルオキシカルボ
ニル[Ｚ(２Ｃｌ)]、ｐ-ニトロベンジルオキシカルボニル［Ｚ(ＮＯ２)］、ｐ-メ
トキシベンジルオキシカルボニル［Ｚ(ＯＭｅ)］、t-ブトキシカルボニル（Ｂｏ
ｃ）、t-アミルオキシカルボニル（Ａｏｃ）、イソボルニルオキシカルボニル、
アダマンチルオキシカルボニル、２-(４-ビフェニル)-２-プロピルオキシカルボ
ニル（Ｂｐｏｃ）、９-フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、メチル
スルホニエトキシカルボニル（Ｍｓｃ）、トリフルオロアセチル、フタリル、ホ
ルミル、２-ニトロフェニルスルフェニル（ＮＰＳ）、ジフェニルホスフィノチ
オイル（Ｐｐｔ）、及びジメチロホスフィノチオイル（Ｍｐｔ）基などで保護で
きる。 カルボキシ官能基の保護基としては、ベンジルエステル（ＯＢｚｌ）、シクロ
ヘキシルエステル（ＯＣｈｘ）、４-ニトロベンジルエステル（ＯＮｂ）、t-ブ
チルエステル（Ｏｔ-ｂｕ）、４-ピリジルメチルエステル（Ｏｐｉｃ）、アリル
エステル（ＯＡｌｌ）等が例示される。アミノ及びカルボキシル基以外の官能基
を有するアルギニン、システイン、及びセリンなどの特定のアミノ酸は、適当な
保護基で保護するのが望ましいことが多い。例えば、アルギニンのグアニジノ基
は、ニトロ、ｐ-トルエンスルホニル、ベンジルオキシカルボニル、アダマンチ
ルオキシカルボニル、ｐ-メトキシベンゼスルホニル、４-メトキシ-２,６-ジメ
チルベンゼンスルホニル（Ｎｄｓ）、１,３,５-トリメチルフェニルスルホニル
（Ｍｔｓ）等で保護される。システインのチオール基は、ｐ-メトキシベンジル
、トリチルなどで保護することができる。
【００５８】 前記されるような多くの阻害アミノ酸は、Novabiochem(サンディエゴ, カリフ
ォルニア)、Bachem CA（トレンス, カリフォルニア)又はPeninsula Labs(ベルモ
ント, カリフォルニア)のように商業的に入手できる。 上掲のStewart及びYoungは、ペプチド調製のための方法に関して詳細な情報を
提供する。α-アミノ基の保護は１４−１８ページに記載され、側鎖ブロックは
１８−２８ページに記載されている。アミン、ヒドロキシル及びスルフヒドリル
官能基の保護基の表が１４９−１５１ページに提供されている。 所望のアミノ酸配列が完成した後、ペプチドは固体支持体から離され、回収さ
れ、精製されうる。ペプチドは、ペプチド固相結合を崩壊することのできる試薬
により固体支持体から取り除かれ、場合によっては、ペプチドの阻害側鎖官能基
を脱保護する。一実施態様では、ペプチドは、液体フッ化水素酸(ＨＦ)を有する
アシドリシスにより固相から取り外すが、残っている側鎖保護基も取り除く。好
ましくは、ポリペプチド中の残基のアルキル化（例えば、メチオニン、システイ
ン、及びチロシン残基のアルキル化）を回避するために、アシドリシス反応混合
物はチオ-クレゾール及びクレゾール捕捉剤を含む。ＦＨ離脱の後、樹脂はエー
テルで洗浄され、遊離ペプチドは酢酸溶液の連続洗浄で固相から抽出される。混
合した洗浄液は凍結乾燥され、ペプチドが精製される。
【００５９】 組み換え合成 本発明は、単離された核酸、好ましくはここに記載のカスパーゼ複合体をコー
ドするＤＮＡを含む物質の組成物を包含する。本発明の複合体をコードするＤＮ
Ａは、当該分野で知られている様々な方法によって調製することができる。これ
らの方法は、限定されるものではないが、出典明示により開示の全体がここに取
り込まれるEngelsら., (1989), Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., 28:716-734に記
載された任意の方法、例えばトリエステル、亜リン酸、ホスホラミダイト及びＨ
-ホスホネート法による化学合成を含む。一実施態様では、発現宿主細胞により
好まれるコドンはコード化ＤＮＡの設計に使用される。あるいは、複合体をコー
ドしているＤＮＡを、組換えＤＮＡ法、例えば部位特異的突然変異誘発（Kunkel
ら., (1991) Methods Enzymol., 204:125-139; Carter P.ら., (1986） Nucl. A
cids Res. 13:4331; Zoller M.J.ら., (1982) Nucl. Acids Res. 10:6487）、カ
セット突然変異誘発（Wellsら., (1985) Gene 34:315）、制限選択突然変異誘発
（Wells, J.A., ら., (1986) Philos. Trans, R. Soc. London SerA 317, 415）
等々を使用して一又は複数の変異体をコードするように変更させることができる
。
【００６０】 この態様において、本発明は更に、本発明の複合体をコードするＤＮＡ分子に
作用可能に結合した発現コントロール配列、ベクターで形質転換した宿主細胞に
よりコントロール配列が認識されるＤＮＡ分子を含むプラスミド等の発現ベクタ
ーを含む。一般的には、プラスミドベクターは宿主細胞と適合性がある種から取
り出された複製及びコントロール配列を含む。ベクターは通常、複製部位並びに
形質転換細胞において表現型の選択を提供することができるタンパク質をコード
する配列を有する。 ＤＮＡを発現するのに適切な宿主細胞には、原核生物、酵母、又は高等真核細
胞が含まれる。適切な原核生物には、真正細菌に限定されるものではないが、例
えばグラム陰性、又はグラム陽性生物、例えば大腸菌のような腸内細菌が含まれ
る。大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４(ＡＴＣＣ３１，４４６)；大腸菌株Ｘ１７７６（
ＡＴＣＣ３１，５３７）；大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）及びＫ
５７７２（ＡＴＣＣ５３，６３５）のような種々の大腸菌株が公的に入手可能で
ある。
【００６１】 原核生物に加えて、真核生物体、例えば酵母菌、あるいは多細胞生物体由来の
細胞を宿主細胞として使用することができる。一般的なパン酵母又はサッカロミ
セス・セレヴィシアのような酵母宿主細胞中での発現に関しては、好適なベクタ
ーには、２ミクロンプラスミドに基づくエピソーム的に複製するベクター、組込
み型ベクター、及び酵母人工染色体（ＹＡＣ）ベクターが含まれる。また、発現
に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物の例としては、植
物細胞と同様に、ドゥロソフィラＳ２及びSpodoptera Ｓｆ９のような昆虫細胞
が含まれる。Ｓｆ９細胞のような昆虫宿主細胞での発現に関しては、好適なベク
ターにはバキュロウイルスベクターが含まれる。植物宿主細胞、特にタバコのよ
うな双子葉植物宿主における発現に対しては、好適な発現ベクターにはアグロバ
クテリウムツメファシエンスのＴｉプラスミドに由来するベクターが含まれる。
【００６２】 有用な哺乳動物宿主細胞の例には、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓
ＣＶ１株 (COS-7, ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓株（293又は懸濁培養での増殖の
ためにサブクローン化された293細胞、Graham等 (1997), J. Gen Virol., 36:59
）；ハムスター乳児腎細胞(BHK, ATCC CCL 10)；チャイニーズハムスター卵巣細
胞／-ＤＨＦＲ(CHO, Urlaub及びChasin (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
77:4216)；マウスのセルトリ細胞（TM4, Mather (1980), Biol. Reprod., 23:24
3-251）；サルの腎細胞 (CV1 ATCC CCL 70)；アフリカミドリザルの腎細胞(VERO
-76, ATCC CRL-1587)；ヒト子宮頸癌細胞 (HELA, ATCC CCL 2)； イヌ腎細胞 (M
DCK, ATCC CCL 34)；バッファローラット肝細胞 (BRL 3A, ATCC CRL 1442)；ヒ
ト肺細胞 (W138, ATCC CCL 75)；ヒト肝細胞 (Hep G2, HB 8065)；マウス乳房腫
瘍(MMT 060562, ATTC CCL51)；ＴＲＩ細胞（Mother等 (1982), Annals N.Y. Aca
d. Sci. 383:44-68）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌細胞株(Ｈｅｐ
Ｇ２)が含まれる。
【００６３】 原核生物宿主中での発現に関しては、好適なベクターにはｐＢＲ３２２（ＡＴ
ＣＣ第３７，０１７）、ｐｈＧＨ１０７（ＡＴＣＣ第４０，０１１）、ｐＢＯ４
７５、ｐＳ０１３２、ｐＲＩＴ５、ｐＲＩＴ２０又はｐＲＩＴ３０シリーズの任
意のベクター（Nilsson及びAbrahmsen (1990), Meth. Enzymol., 185:144-161）
、ｐＲＩＴ２Ｔ、ｐＫＫ２３３-２、ｐＤＲ５４０及びｐＰＬ-ラムダが含まれる
。本発明の発現ベクターを含む原核生物宿主細胞には、大腸菌Ｋ１２株２９４(
ＡＴＣＣ第３１４４６)、大腸菌株ＪＭ１０１（Messingら., (1981) Nucl. Ac
id Res., 9:309）、大腸菌株Ｂ、大腸菌株１７７６(ＡＴＣＣ第３１５３７)、大
腸菌ｃ６００（Appleyard, Genetics, 39:440(1954)）、大腸菌Ｗ３１１０(Ｆ-
、ガンマ-、原栄養菌株、ＡＴＣＣ第２７３２５)、大腸菌株２７Ｃ７（Ｗ３１１
０、ｔｏｎＡ、ｐｈｏＡ、Ｅ１５、（ａｒｇＦ-ｌａｃ）１６９、ｐｔｒ３、ｄ
ｅｇＰ４１、ｏｍｐＴ、ｋａｎｒ）（米国特許第5,288,931号、ＡＴＣＣ第５５
，２４４）、バチルス・サブチルス、サルモネラ・ティフィムリウム、セラチア
・マルセッセンス、及びシュードモナス種が含まれる。
【００６４】 哺乳動物宿主細胞における発現に関しては、適切なベクターには、ＳＶ４０由
来のベクター、サイトメガロウイルス由来のベクター、例えばｐＲＫ５及びｐＲ
Ｋ７を含むｐＲＫベクター（Suva等 (1987), Science, 237:893-896; EP307,247
(3/15/89)、EP278,776(8/17/88))、ワクシニアウイルス又は他のポックスウイル
ス由来のベクター、及びモロニーのマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）由来の
ベクターのようなレトロウイルスベクターが含まれる。 場合によっては、対象の複合体をコードしているＤＮＡは宿主細胞によって培
地中への発現産物の分泌を生じさせる分泌リーダー配列に作用可能に結合される
。分泌リーダー配列の例には、ｓｔＩＩ、エコチン（ecotin）、ｌａｍＢ、ヘル
ペスＧＤ、ｌｐｐ、アルカリホスファターゼ、インベルターゼ、及びアルファ因
子が含まれる。また、ここでの使用に適しているのはプロテインＡの３６アミノ
酸リーダー配列である（Abrahmsenら., (1985) EMBO J., 4:3901）。
【００６５】 この発明の上述の発現又はクローニングベクターで形質移入し、好ましくは形
質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、そして所望の配列をコ
ードする遺伝子を増幅するのに適するように改良した従来型の培養液中で、宿主
細胞を培養する。 形質移入は、如何なるコード配列が実際に発現されるか否かにかかわらず、宿
主細胞による発現ベクターの取り込みを意味する。多数の形質移入の方法が当業
者に知られている。例えば、ＣａＰＯ４沈降及びエレクトロポレーションである
。このベクターの操作のあらゆる徴候が宿主細胞内で生じたときに、成功した形
質移入が広く認められる。
【００６６】 形質転換は、染色体外の成分としてであろうと染色体成分によってであろうと
、ＤＮＡが複製可能であるように生物体中にＤＮＡを導入することを意味する。
用いられる宿主細胞に応じて、そのような細胞に対して適した標準的な方法を用
いて形質転換はなされる。Sambrook等., Molecular Cloning(第２版), Cold Spr
ing Harbor Laboratory, NY(1989)の１．８２項に記載のような塩化カルシウム
を用いるカルシウム処理法が、原核生物又は実質的な細胞壁障壁を含む他の細胞
に対して用いられる。Shawら., Gene, 23:315 (1983)及び1989年6月29日公開の
国際特許出願公開番号第WO89/05859に記載されているように、アグロバクテリウ
ム・トゥメファシエンスによる感染が、ある種の植物細胞の形質転換に用いられ
る。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Sambrookら., 上掲,の
16.30-16.37項に記載のリン酸カルシウム沈殿法が好ましい。哺乳動物細胞の宿
主系形質転換の一般的な側面は、Axelによって1983年8月16日に公開の米国特許
第4,399,216号に記載されている。酵母中の形質転換は、典型的には、Van Solin
genら., J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiaoら., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
, 76:3829 (1979)の方法によって実施する。しかしながら、DNAを細胞中に導入
する他の方法、例えば、核インジェクション、エレクトロポレーション、又はプ
ロトプラスト融合もまた用いることもできる。
【００６７】 治療的プロトコール 本発明の方法は、通常は非経口的注入によっておこなわれる。非経口的注入の
種々の型は、限定されるものではないが、腔内（例えば腹腔内）、静脈内、動脈
内、胸膜内、筋肉内、リンパ腺内及び局地的動脈内、病巣内、皮下、カテーテル
灌流等々とすることができる。 癌画像化及び／又は治療に関しては、静脈内、動脈内、又は胸膜内投与が、肺
、乳、及び白血性腫瘍に対して通常は使用される。腹膜内投与は、卵巣腫瘍に対
して有利である。胸膜内投与は、脳腫瘍及び白血病に対して有利である。皮下投
与は、ホジキン病、リンパ腫及び乳癌腫に対して有利である。カテーテル灌流は
、転移性の肺、乳又は肝臓の胚細胞癌腫に対して有用である。病巣内投与は、肺
及び乳病変に対して有用である。
【００６８】 上記は、本発明による、標的化薬剤-カスパーゼ複合体の病巣内投与の一般的
方法を例示する。クリアランスの経路と複合体の体内分布が広く異なるために、
二つの異なる複合体、すなわちカスパーゼ複合体及びプロドラッグの投与の方法
が同じでなくてよいことが理解できる。例えば、沈殿の速度のより良いコントロ
ールとクリアランス速度のモニタリングの容易さのために、プロエイジェント複
合体の静脈投与が望ましい可能性があるが、抗体-酵素複合体の腹膜内投与は、
卵巣腫瘍を標的化するのに有利である。
【００６９】 標的化薬剤-カスパーゼ複合体は、インビボ投与に適した無菌媒体の水溶液と
して広く投与される。有利には、特定のケースでより少ない又は多い投与量が示
され得るが、単一投与又は分割投与によって、標的化薬剤-カスパーゼ複合体の
約５０マイクログラムから約５ｍｇが投与される。特に治療のために患者の感受
性を減じるため、そして治療コース又はさらなる診断方法にとって繰り返し投与
が望ましいならば、例えば、断片又はハイブリッドヒト、又は霊長類抗体など、
他の種の抗体及び／又は低刺激性抗体の投与及び／又は使用を減じることは必須
である得る。 ＩｇＧ抗体が、標的に局在化し、そしてプロエイジェント複合体の投与の前に
哺乳動物の循環系から実質的に消滅するのに、通常は約２から１４日かかる。Ｆ
（ａｂ’）２抗体についての相当する局在化及びクリアランス時間は、約２から
７日であり、Ｆａｂ及びＦａｂ’抗体断片については、約１から３日である。他
の抗体は、標的部位に局在化するのに異なるタイムフレームを必要とし、上記の
タイムフレームは、複合体酵素の存在によって影響される。再び、抗体-酵素複
合体を標識することは、局在化及びクリアランスのモニタリングを可能にする。
【００７０】 ＩｇＧは、通常は肝臓で、より少ない程度が消化系で代謝される。Ｆ（ａｂ’
）２は、通常は、主に腎臓で代謝されるが、肝臓及び消化系でも代謝される。Ｆ
ａｂ及びＦａｂ’は、通常は、主に腎臓で代謝されるが、肝臓と消化系でも代謝
される。 通常は、少なくとも約０．０００１％の抗体-酵素複合体の注射量が、基質-薬
剤複合体の投与の前に標的部位に局在化することが必要である。この複合体に関
するより高い標的化効率が達成されるまで、この百分率はより大きくなれるし、
減少した投与量を投与することができる。
【００７１】 抗体-酵素複合体の有効量は、標的部位で複合体に抗原を標的にし、それによ
って、標的部位で、診断又は治療的に有効量の薬剤の促進を引き起こすのに十分
な可溶性基質-薬剤複合体を生産物へ変換するために十分な酵素の量と結合する
のに十分な量である。 基質-治療的、又は診断薬剤複合体は、広くＰＢＳの水溶液として投与される
。再び、ヒト使用を意図するならば、これは無菌溶液である。基質-薬剤複合体
は、抗体-酵素複合体が標的部位に局在化し、哺乳動物の循環系から実質的に消
滅するのに十分な時間の後に、基質-薬剤複合体は投与される。
【００７２】 製薬的組成物 本発明の化合物の製薬的組成物は、所望される程度の純度を持つ活性成分を、
凍結乾燥製剤又は水性溶液の形態で、最適な製薬上許容される担体、賦形剤又は
安定化剤と混合することにより調製され保存される（Remington's Pharmaceutic
al Science 16th edition, Osol, A. Ed. [1980]）。許容される担体、賦形剤、
又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性であり、リン酸、ク
エン酸、及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸
化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ヘ
キサメトニウムクロライド；ベンズアルコニウムクロライド；ベンズエトニウム
クロライド；フェノール，ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピル
パラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノ
ール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満
）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク
質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパ
ラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マン
ノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ
等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールな
どの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ-タンパク
質錯体）及び／又はトゥイーン(TWEEN)（商品名）、プルロニクス(PLURONICS)（
商品名）、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を
含む。 以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を
決して限定することを意図するものではない。 本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに
取り込む。
【００７３】 実施例 実施例１：Ａｃ-ＤＥＶＤ-ドキソルビシンの調製（Ｆｉｇ８） 方法： （ｉ）０℃の無水ＤＭＦ中のペプチド［１］（３８μｍｏｌ）、１，３-ジシク
ロヘキサンカルボジイミド（４０μｍｏｌ）及びＮ-ヒドロキシスクシニミド（
５７μｍｏｌ）の溶液を、エチルジイソプロピルアミン（９８μｍｏｌ）で１０
分間処理した。無水ＤＭＦ（３．０ｍｌ）中のドキソルビシン塩酸塩（３２μｍ
ｏｌ）及びエチルジイソプロピルアミン（９８μｍｏｌ）の溶液を水滴形態で添
加し、この混合液を、光を遮断して２３℃で７２時間暖めた。真空での濃縮と分
離用ＨＰＬＣによる残留物の精製で、［２］がオレンジ-赤非結晶固体として得
られた（８．９μｍｏｌ，２８％）。 ［ＨＰＬＣ：Ｃ-１８逆相２１ｍｍｉ．ｄｘ２５０ｍｍ カラム；流速１０ｍｌ／
ｍｉｎ；６０分にわたる４０−６０％（アセトニトリル＋０．１％ＴＦＡ）の（
水＋０．１％ＴＦＡ）リニアグラジエント溶出；保持時間は２８分。］ （ｉｉ）２３℃の脱気した無水ＤＭＦ（１．５ｍｌ）中の［２］（４．７μｍｏ
ｌ）及び四リン酸エステル（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（０．
３μｍｏｌ）溶液を、酢酸（７０μｍｏｌ）及びトリブチルスズ水素化物（４１
μｍｏｌ）で処理し、光を遮断している間に撹拌した。この混合物を、更なる分
量の酢酸（８７μｍｏｌ）及びトリブチルスズ水素化物４５μｍｏｌ）で１．５
時間目、そして四リン酸エステル（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）
（０．３μｍｏｌ）で３４時間及び７２時間目（０．６μｍｏｌ）に処理した。
９１時間後の真空での濃縮、及び分離用ＨＰＬＣによる残留物の精製で、［３］
がオレンジ-赤非結晶固体として得られた（２．１μｍｏｌ，４４％）。 ［ＨＰＬＣ：６０分にわたる、０−６０％リニアグラジエント，他の条件は、前
出の通り；保持時間は４３分。］
【００７４】 実施例２： Ａｃ-ＤＥＶＤ-ＰＡＢＣプロドラッグ部分の調製（Ｆｉｇ９） 方法： （ｉｉｉ）無水ＤＭＦ（１．０ｍｌ）中のペプチド［１］（８８μｍｏｌ）、４
-アミノベンジルアルコール（１７９μｍｏｌ）及び２-エトキシ-１-エトキシカ
ルボニル-１，２-ジヒドロキノン（１７８μｍｏｌ）を２３℃で２４時間反応さ
せた。真空での濃縮及び分離用ＨＰＬＣによる残留物の精製で、［４］が無色非
結晶性固体として得られた（６３μｍｏｌ，７２％）。 ［ＨＰＬＣ：６０分にわたる、０−６０％リニアグラジエント，他の条件は、前
出の通り；保持時間は４８分。］ （ｉｖ）２３℃の無水ジクロロメタン（６．０ｍｌ）中のペプチド［４］（１８
１μｍｏｌ）及び４-ニトロフェニルクロロ蟻酸塩（２１６μｍｏｌ）溶液へ２
，６-ルチジン（５４１μｍｏｌ）を添加した。２時間後、この混合物を無水Ｄ
ＭＦ（２．０ｍｌ）で希釈し、２，６-ルチジン（３６０μｍｏｌ）の二番目の
割り当て分で処理した。さらなる分量の２，６-ルチジン（８６０μｍｏｌ）及
び４-ニトロフェニルクロロ蟻酸塩（１７５μｍｏｌ）を、２４時間、２７時間
及び４６時間目に添加した。８４時間後、この混合物を飽和水性重炭酸ナトリウ
ムで処理し、エチル酢酸で３回抽出した（計１５０ｍｌ）。混合有機を、水性ク
エン酸（８０ｍｌ，０．５Ｍ）、飽和水性重炭酸ナトリウム及び食塩水で洗浄し
、無水硫酸塩で乾燥させ、真空で濃縮した。分離用ＨＰＬＣによる残基の精製で
、［５］が無色非結晶固体として得られた（１３１μｍｏｌ，７２％）。 ［ＨＰＬＣ：溶出は、０−４０％が１５分、４０−６０％が４５分、他の条件は
前出の通り；保持時間は４６分］
【００７５】 実施例３： Ａｃ-ＤＥＶＤ-ＰＡＢＣ-ドキソルビシンの調製（Ｆｉｇ１０） 方法： （ｖ）２３℃の無水ＤＭＦ（１０ｍｌ）中の炭酸塩［５］（７４μｍｏｌ）及び
ドキソルビシン塩酸塩（８６μｍｏｌ）の溶液を、エチルジイソプロピルアミン
（４０２μｍｏｌ）の水滴添加で処理し、光を遮断して１６時間撹拌した。真空
での濃縮、及び分離用ＨＰＬＣによる残留物の精製で、［６］がオレンジ-赤非
結晶固体として得られた（４５μｍｏｌ，６１％）。 ［ＨＰＬＣ：溶出は、０−４０％が１５分，４０−６０％が４５分，他の条件は
前の通り；保持時間は４５分］ （ｖｉ）２３℃の脱気した無水ＤＭＦ（２．０ｍｌ）中の［６］（１２μｍｏｌ
）及び四リン酸エステル（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（１．５
μｍｏｌ）溶液へ、酢酸（２４５μｍｏｌ）及びトリブチルスズ水素化物（１２
３μｍｏｌ）を添加した。この混合物を、光を遮断して１６時間撹拌し、次いで
真空で濃縮した。分離用ＨＰＬＣによる残留物の精製で、［７］が深オレンジ-
赤非結晶固体として得られた（５．７μｍｏｌ，４７％）。 ［ＨＰＬＣ：０−５０％リニアグラジエントが６０分、他の条件は前出の通り；
保持時間は５２分；３０％の定組成溶離を用いて再精製；保持時間は３５分］
【００７６】 実施例４：Ａｃ-ＤＥＶＤ-ＰＡＢＣ-パクリタキセルの調製（Ｆｉｇ１０） 方法： （ｖｉｉ）無水アセトニトリル（１０ｍｌ）中の炭酸塩［５］（５７μｌ）、パ
クリタキセル（５８μｌ）及び４-ジメチルアミノピリジン（１７６μｍｏｌ）
の溶液を、２３℃で２０時間反応させた。真空での濃縮、及び分離用ＨＰＬＣに
よる残留物の精製で、無色非結晶固体としての［８］が得られた（４７μｍｏｌ
，８３％）。 ［ＨＰＬＣ：溶出は０−５０％で１５分、５０−７０％で４５分、その他の条件
は、前出の通り；保持時間は３８分］ （ｖｉｉｉ）２３℃の脱気した無水ＤＭＦ（６．０ｍｌ）中の［８］（４６μｍ
ｏｌ）及び四リン酸エステル（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（５
．１μｍｏｌ）へ、酢酸（９２６μｍｏｌ）及びトリブチルスズ水素化物（４５
７μｍｏｌ）を添加した。この混合物を光から遮断して１８時間撹拌し、次いで
真空で濃縮した。分離用ＨＰＬＣによる精製で、［９］が深オレンジ-赤非結晶
固体として得られた（３１μｍｏｌ，６８％）。 ［ＨＰＬＣ：溶出は０−４０％で１５分、４０−６０％で４５分、その他の条件
は、前出の通り；保持時間は３４分］ 省略形： Ａｃ ＝アセチル Ａｌｌ ＝アリル（２-プロペン-１-イル） Ｂｕ ＝ｎ-ブチル ＤＣＣ ＝１，３-ジシクロヘキシルカルボジイミド ＤＣＭ ＝ジクロロメタン ＤＩＰＥＡ＝ジイソプロピルエチルアミン ＤＭＡＰ ＝４-（ジメチルアミノ）ピリジン ＤＭＦ ＝Ｎ，Ｎ-ジメチルホルムアミド ＥＥＤＱ ＝２-エトキシ-１-エトキシカルボニル-１，２-ジヒドロキノリン ＨＰＬＣ ＝高性能液体クロマトグラフィー Ｍｅ ＝メチル Ｐｈ ＝フェニル Ｓｕ ＝Ｎ-スクシニイミジル ＴＦＡ ＝トリフルオロ酢酸
【００７７】 実施例５： ドキソルビシン及びＡｃ-ＤＥＶＤ-ＰＡＢＣ-ドキソルビシンの細
胞蓄積 ＳＫ-ＢＲ-３及びＭＣＦ７乳癌腫細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション（ＡＴＣＣ）、ロックビル、メリーランド）を、ダルベッコ改良イー
グル培地で培養した：３７℃、５％ＣＯ２で、２μＭ グルタミン、１００ユニ
ット／ｍＬ ペニシリン、１００ μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（Gibco BRL,
グランドアイランド，ニューヨーク）、及び１０％（ｗ／ｖ）ウシ胎児血清（hy
clone, ローガン，ユタ）を補充したハムの栄養Ｆ-１２（５０：５０）。接着し
て成長する細胞を、０．０５％トリプシン、０．６ｍＭ ＥＤＴＡを含有するリ
ン酸緩衝生理食塩水で処理することで脱着させ、次いで新鮮細胞培地へ１ｍＬ当
たり１０６細胞で懸濁した。細胞は、直接使用する（未処理）、或いは最終濃度
が１０μＭとなるようにドキソルビシン又はＡｃ-ＤＥＶＤ-ＰＡＢＣ-ドキソル
ビシンで補充した。細胞を０−２時間にわたって３７℃でインキュベートし、次
いで遠心分離（５分、５００ｇ、４℃）によってペレットにした。その上澄みを
捨て、細胞を次いで１０ｍＬ 氷冷リン酸緩衝生理食塩水に緩やかに再懸濁した
。細胞をペレット化し、再懸濁する段階を、続いて繰り返した。標準曲線を調製
するために、ドキソルビシン（１２．５ｎｍｏｌ、１．２５ｎｍｏｌ又は０．１
２５ｎｍｏｌ）を、その前の未処理の細胞へ添加した。細胞ペレットは、２００
μＬ ０．３Ｍ ＨＣｌの５０％（ｖ／ｖ）エタノールへ溶解させ、１．５ｍＬ
エッペンドルフチューブへ移した。細片は、微量遠心分離（５分、１４０００ｒ
ｐｍ、２５℃）でペレットにした。１５０μＬの上澄みを、次いで９６ウェルプ
レートのウェルへ移した。次いで、蛍光プレートリーダー（Fluoroskan, ヘルシ
ンキ、フィンランド）を使用して、それぞれ４８５ｎｍと５９０ｎｍの吸収及び
発光波長で蛍光測定をおこなった。ドキソルビシンの取り込みは、前出の未処理
細胞へ添加したドキソルビシンの既知量を使用して調整した標準曲線から見積も
った。ドキソルビシンが、ＭＣＦ７及びＳＫＢＲ３細胞の中に有意に蓄積したも
のの、Ａｃ-ＤＥＶＤ-ＰＡＢＣ-ドキソルビシンは蓄積しなかったことが見出さ
れた（Ｆｉｇ１）。
【００７８】 実施例６：プロドラッグ細胞障害性アッセイ１ ＳＫ-ＢＲ-３及びＭＣＦ７乳癌種細胞（ＡＴＣＣ）を、ダルベッコ改良イーグ
ル培地で培養した：３７℃、５％ＣＯ２で、２μＭ グルタミン、１００ユニッ
ト／ｍＬ ペニシリン、１００ μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（Gibco BRL）、
及び１０％（ｗ／ｖ）ウシ胎児血清（hyclone）を補充したハムの栄養Ｆ-１２（
５０：５０）。細胞を、９６-ウェル組織プレート（Falcon, Becton-Dickinson,
フランクリン レイク、ニュージャージー）で、１０，０００細胞／ウェル（Ｓ
Ｋ-ＢＲ-３）、或いは３，０００細胞／ウェル（ＭＣＦ７）となるよう播種し、
２４時間で接着するようにした。細胞培地を吸引し、２ｍＭ ＰＩＰＥＳ、１ｍ
Ｍ ＤＴＴ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％ ＣＨＡＰＳ、１０ｍＭ ＮａＣｌ
、そして０から１０−４Ｍ Ａｃ-ＤＥＶＤ-ＰＡＢＣ-ドキソルビシン又はドキソ
ルビシンが存在する、並びに１３ｎｇ組み換えヒトカスパーゼ３（Calbiochem、
サンディエゴ、カリフォルニア）が存在する又は存在しない１％スクロースを含
有する新鮮細胞培地（１００μＬ／ウェル）で置き換えた。３時間のインキュベ
ーションの後、プレートを細胞培地（３７℃）で二回洗浄し、そして１２０時間
の全アッセイ長でさらにインキュベートした。このアッセイは、５０％（ｖ／ｖ
）エタノールの０．２５％（ｗ／ｖ）クリスタルバイレットで染色することによ
って停止させた。次いで、このプレートを水ですすぎ洗い、残りのクリスタルバ
イオレットを、５０％（ｖ／ｖ）エタノールの５０ｍMクエン酸ナトリウム（ｐ
Ｈ４．５）を使用して可溶化した。マイクロプレートリーダー（SpectraMax 340
, Molecular Devices, サニーベール、カリフォルニア）を使用して５４０ｎｍ
で吸光度を測定した。
【００７９】 実施例７：カスパーゼ３によるＡｃ-ＤＥＶＤ-ＰＡＢＣ-ドキソルビシンの活性
化 Ａｃ-ＤＥＶＤ-ＰＡＢＣ-ドキソルビシン（６０μＭ）を、５％（ｖ／ｖ）ジ
メチルスルホキシド及び４５ｍＭ ＤＤＴを含有する全反応容量が７００ｍLのリ
ン酸緩衝生理食塩水中の、カスパーゼ３インヒビター、Ｚ-ＤＥＶＤ-ＦＭＫ（４
００μＭ）（Calbiochem）が存在する又は存在しない下での１ｎｇ組み換えヒト
カスパーゼ３でインキュベートした。コントロール反応は、カスパーゼ３及びイ
ンヒビターを除いておこなわれた。反応を、３７℃で０−２時間にわたってイン
キュベートし、次いでドライアイスで凍結した。反応は、次いで定組成条件の下
で、Microsorb-MV C18逆相カラム（４．６ｍｍ内径ｘ２５０ｍｍ長、５μｍ粒子
サイズ、１００Å孔径）（Rainin、エメリービル，カリフォルニア）を使用して
逆相ＨＰＬＣによって分析した：１．５ｍＬ／分の流速で０．１％（ｖ／ｖ）ト
リフルオロ酢酸、３５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、２５４ｎｍにて吸光度をモ
ニター。Ａｃ-ＤＥＶＥ-ＰＡＢＣ-ドキソルビン及びドキソルビンの保持時間は
、それぞれ７．７分及び５．１分であった。Ａｃ-ＤＥＶＤ-ＰＡＢＣ-ドキソル
ビシンは、ＭＣＦ７及びＳＫ-ＢＲ-３細胞に対する毒性において、ドキソルビシ
ンよりも１００倍より大きく毒性が低いことが見出された。カスパーゼ３による
治療の後は、Ａｃ-ＤＥＶＤ-ＰＡＢＣ-ドキソルビシンは、ドキソルビシンと同
じくらいに毒性を獲得した（Ｆｉｇ２）。Ａｃ-ＤＥＶＤ-ドキソルビシンへの変
換によって示されているように、ＰＡＢＣ-ドキソルビシンは、カスパーゼ３に
よって効率的に活性化される（表２）。
【００８０】 実施例８：カスパーゼ３によるＡｃ-ＤＥＶＤ-ＰＡＢＣ-タキソールの活性化 Ａｃ-ＤＥＶＤ-ＰＡＢＣ-タキソール（３５μＭ）を、５％（ｖ／ｖ）ジメチ
ルスルホキシド及び４５ｍＭ ＤＤＴを含有する全反応容量が７００ｍLのリン酸
緩衝生理食塩水中の、カスパーゼ３インヒビター、Ｚ-ＤＥＶＤ-ＦＭＫ（４００
μＭ）（Calbiochem）が存在する又は存在しない下での１ｎｇ組み換えヒトカス
パーゼ３でインキュベートした。コントロール反応は、カスパーゼ３及びインヒ
ビターを除いておこなわれた。反応を、３７℃で０−２時間にわたってインキュ
ベートし、次いでドライアイスで凍結した。反応を、次いで定組成条件の下で、
Microsorb-MV C18逆相カラム（４．６ｍｍ内径ｘ２５０ｍｍ長、５μｍ粒子サイ
ズ、１００Å孔径）（Rainin）を使用して逆相ＨＰＬＣによって分析した：１．
５ｍＬ／分の流速で０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸、４６％（ｖ／ｖ）ア
セトニトリル、２５４ｎｍにて吸光度をモニター。タキソール及びＡｃ-ＤＥＶ
Ｄ-ＰＡＢＣ-タキソールの保持時間は、それぞれ１３．３分及び１０．４分であ
った。タキソールへの変換によって示されているように、Ａｃ-ＤＥＶＤ-ＰＡＢ
Ｃ-タキソールは、カスパーゼ３によって効率的に活性化される（表３）。
【００８１】 実施例９：プロドラッグ細胞毒性アッセイ２ ヒト肺癌腫細胞（Ｈ４６０、ＳＫ-ＭＥＳ-１）、結腸癌腫細胞（ＨＣＴ１１６
）、乳癌腫細胞株（ＢＴ-４７４、ＭＣＦ７、ＳＫ-ＢＲ-３）及び正常肺繊維芽
細胞（ＷＩ-３８）をＡＴＣＣから購入し、高グルコースＤＭＥＭで維持した：
１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ＦＢＳ（Giboco BRL）及び２ｍＭ Ｌ-グルタミンを
補充したハムＦ-１２（５０：５０）。正常ヒト乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ）をClo
netics/Biowhittaker（ウォーカーズビル, メリーランド）から購入し、乳腺上
皮成長培地（MEGM, Clonetics）で維持した。細胞を、０．０５％（ｗ／ｖ）ト
リプシン及び０．６ｍＭ ＥＤＴＡを含有するリン酸緩衝生理食塩水で処理（５
分）することで培養フラスコから脱着させ、ウェル当たり１０４細胞（ＷＩ-３
８及びＨＭＥＣ）、ウェル当たり１．５ｘ１０４（Ｈ４６０、ＳＫ-ＭＥＳ-１及
びＨＣＴ１１６）又はウェル当たり２ｘ１０４細胞（ＭＣＦ７、ＢＴ-４７４、
ＳＫ-ＢＲ-３）の密度で９６ウェルマイクロタイタープレートに播種した。終夜
にわたって細胞を接着させ、次の通りの最終濃度で薬又はプロドラッグを添加し
た：ドキソルビシン又はＡｃ-ＤＥＶＤ-ＰＡＢＣ-ドキソルビシン、０から１μ
Ｍ；タキソール又はＡｃ-ＤＥＶＤ-ＰＡＢＣ-タキソール、０から０．０４μＭ
。７２時間の処理後、培地を緩やかにウェルから取り除き、細胞単層を２０％（
ｖ／ｖ）メタノールの０．５％（ｗ／ｖ）クリスタルバイオレット染料で染色し
た。プレートは、水で十分にすすぎ洗い、乾燥させた。次いで、染料を５０％（
ｖ／ｖ）エタノール（ウェル当たり２００μＬ）の５０ｍＭ クエン酸ナトリウ
ムバッファー、ｐＨ４．２に可溶化し、２５℃で３０分間にわたってプレートを
撹拌し、そして３４０ＡＴＣマイクロタイタープレートリーダー（SLT LabInstr
uments, ザルツブルグ、オーストリア）を使用して５４０ｎｍにて吸光度を測
定した。
【００８２】 実施例１０：カスパーゼ３の血漿安定性 新鮮ヘパリン処理血液をペレット細胞及び血小板に遠心分離した（５分、１５
００ｇ、４℃）。その上澄み（血漿）を、微量遠心分離（５分、１４０００ｒｐ
ｍ、２５℃）で再スピンした。組み換えカスパーゼ３（５００ｎｇ）を、２００
μＬ血漿又は２００μＬ リン酸緩衝生理食塩水のいずれかに添加した。３７℃
で０から２４時間のインキュベーションの後、アリコートを取り除き、液体窒素
で瞬間凍結し、−７０℃で貯蔵した。血漿試料を解凍し、７５μｇ／ｍＬの発色
体基質であるアセチル-Ｌ-Ａｓｐ-Ｌ-Ｇｌｕ-Ｌ-Ｖａｌ-Ａｓｐ-ｐ-ニトロアニ
リド（Calbiochem）を含有するカスパーゼバッファー（２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ、
１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＣＨＡＰＳ、１０％スクロース、
１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で、５−２５倍希釈した。マイクロタイタ
ープレートリーダー（SpectraMax 340, Molecular Devices）で２５℃、４１０
ｎｍの吸光度の変化を追うことによって、基質の加水分解をモニターした。
【００８３】 実施例１１：リバースカスパーゼ３との抗体断片融合タンパク質をコードするプ
ラスミドの作成 １）プラスミドの概要 プラスミドｐＬＣｒＣ３は、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３をコードするリンカーを介
して、リバースカスパーゼ３（Srinivasulaら., 1998上掲）として知られている
カスパーゼ３の構成的活性型をコードする遺伝子と融合しているＨｕＭａｂ４Ｄ
５-８Ｆａｂの軽鎖（Carterら., 1992a 上掲；Carterら., 1992b, Bio/Technolo
gy 10:163-167）をコードする（Ｆｉｇ７に図解されている）。 プラスミドｐＨＣｒＣ３は、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３をコードするリンカーを介
して、リバースカスパーゼ３（Srinivasulaら., 1998上掲）をコードする遺伝子
と融合しているＨｕＭａｂ４Ｄ５-８Ｆａｂの軽鎖（Carterら., 1992a,b 上掲）
をコードする（Ｆｉｇ７に図解されている）。 プラスミド（ｐＬＣｒＣ３．ＨＣｒＣ３）は、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３をコード
するリンカーを介して、リバースカスパーゼ３（Srinivasulaら., 1998上掲）と
して知られているカスパーゼ３の構成的な活性型をコードする遺伝子とそれぞれ
が融合しているＨｕＭａｂ４Ｄ５-８Ｆａｂ（Carterら., 1992a,b 上掲）の軽鎖
及び重鎖Ｆｄ断片をコードする遺伝子含む。ＨｕＭａｂ４Ｄ５-８Ｆａｂ-リバー
スカスパーゼ３をコードするｐＬＣｒＣ３．ＨＣｒＣ３のビスシストロン性オペ
ロンは、Ｆｉｇ７に図解形式で、Ｆｉｇ６で注釈付きのＤＮＡ及びタンパク質配
列として示されている。このオペロンは、リン酸飢餓によって誘導されるｐｈｏ
Ａプロモーター（C.W. Changら.(1986) Gene 44:121-125）の転写制御下にある
。ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８の可変領域（ＶＬ及びＶＨ）は、熱安定性エンテロトキ
シンII（stII）シグナル配列（RN Pickenら. (1983) Infect. Immun. 42: 269-2
75）をコードする遺伝子区分の５’末端上に正確に融合し、大腸菌の細胞膜周辺
腔へのポリペプチドの分泌を方向づけている。リバースカスパーゼ３の各コピー
には、８ヒスチジンをコードする配列が続き、、固定化金属アフィニティクロマ
トグラフィーによる合成融合タンパク質の精製を容易にしている。 プラスミドｐＬＣｒＣ３．ＨＣｒＣ３は、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８軽鎖及び重鎖
Ｆｄ断片のコドン２１４及び２２３が、それぞれがシステイン残基よりもセリン
残基をコードするという点において、ｐＬＣｒＣ３．ＨＣｒＣ３と異なる。 プラスミドｐＥＴ２１ｂ．ｒＣ３は、ｐＥＴ２１ｂ（Novagen, マディソン,
ウィスコンシン）のリバースカスパーゼ３をコードする遺伝子を含む（Srinivas
aluら., (1998)上掲）。
【００８４】 プラスミドｐＬＣｒＣ３の作成 プラスミドｐＬＣｒＣ３を、ＨｕＭａｂ４Ｄ５-８のＦａｂ’断片をコードす
るプラスミドｐＡＫ１９（Carterら. (1992a,b)上掲）とｐＥＴ２１ｂ（Novagen
, マディソン, ウィスコンシン）のリバースカスパーゼ３をコードするプラスミ
ドｐＥＴ２１ｂ．ｒＣ３から開始する組み換え体ＰＣＲによって構築した（Rash
tenian(1995) Curr. Opin. Biotech. 6: 30-36）。ＨｕＭａｂ４Ｄ５-８の軽鎖
をコードする遺伝子を、最初に、次のプライマーを使用して、プラスミドｐＡＫ
１９からＰＣＲ-増幅した： P1: 5' GCTACAAACGCGTACGCTGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCT 3' （配列番号：１４） P2: 5'CCCCCACCTCCGCTACCTCCCCCGCCACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTGACG3' (配列番号：１５） 同様に、リバースカスパーゼ３をコードする遺伝子を、次のプライマーを使用
してｐＥＴ２１ｂ．ｒＣ３からＰＣＲ増幅した： P3: 5'CGGGGGAGGTAGCGGAGGTGGGGGCTCTGGTGGAGGCGGTTCAAGTGGTGTTGATG3' （配列番号：１６） P4: 5'GCCGTCGCATGCTTAGTGATGGTGATGGTGATGGTGATGTGTCTCAATGCCACAGTC3' （配列番号：１７） ＰＣＲ反応条件（「ＰＣＲ１条件」）は、次の通りである：全容量５０μＬの
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ８．８）中の５０−１００ｎｇＤＮＡテンプレ
ート、１０ｍＭ ＨＣｌ、１０ｍＭ （ＮＨ４）ＳＯ４、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０
．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ-１００、０．１ｍｇ／ｍＬ ウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）、２００μＭの各ｄＮＴＰ、２５ｐｍｏｌの各プライマー、２．５Ｕ Ｐｆ
ｕ Ｔｕｒｂｏ（Stratagene, ラ・ホーヤ、カリフォルニア）。サーモサイクリ
ング条件（「サーモサイクリング１条件」）は、次の通りである：２０秒にわた
る９５℃の３０サイクルが後に続く５分間にわたる９５℃、５５℃が２０秒、７
２℃が９０秒、次いで最後に１０分にわたる７２℃が１サイクル。 これらＰＣＲ産物を、１％アガロースゲル（Gibco BRL）上で精製した。適切
な分子量のハンド（それぞれ〜６９０ｂｐ及び〜８４０ｂｐ）を切り取り、QIAq
uick Gel抽出キット（Qiagen, バレンシア、カリフォルニア）を使用してＤＮＡ
を抽出した。二番目に、これら二つのＤＮＡ断片を、次に１：１の割合で混合し
、プライマーＰ１及びＰ４を使用したＰＣＲ１条件を用いた二巡目のＰＣＲ、そ
して続くサーモサイクリング条件（「サーモサイクリング２条件」）に供した：
２０秒にわたる９５℃の３０サイクルが後に続く、９５℃が５分、５０℃が２０
秒、７２℃が９０秒、次いで最後に１０分にわたる７２℃が１サイクル。このＰ
ＣＲ産物を、ＭｌｕＩ及びＳｐｈＩ部位を使用してｐＡＫ１９へクローニングし
てｐＬＣｒＣ３を作成し、次いでジデオキシヌクレオチド配列決定法によって確
かめた。
【００８５】 プラスミドｐＨＣｒＣ３の作成 プラスミドｐＨＣｒＣ３を、ＨｕＭａｂ４Ｄ５-８のＦａｂ’断片とプラスミ
ドｐＥＴ２１ｂ．ｒＣ３をコードするプラスミドｐＡＫ１９から開始する組み換
え体ＰＣＲ（A. Rashtchian(1995)上掲）によって構築した。ＨｕＭａｂ４Ｄ５-
８の重鎖をコードする遺伝子を、最初に、次のプライマーを使用してプラスミド
ｐＡＫ１９からＰＣＲ増幅した： P5 5' TGCTACAAACGCGTACGCTGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTG 3' （配列番号：１８） P6 5' CCCCACCTCCGCTACCTCCCCCGCCTGTGTGAGTTTTGTCACAAGATTTGGGC 3' （配列番号：１９） 同様に、リバースカスパーゼ３をコードする遺伝子を、次のプライマーを使用
してｐＥＴ２１ｂ．ｒＣ３からＰＣＲ増幅した： P3: 5'CGGGGGAGGTAGCGGAGGTGGGGGCTCTGGTGGAGGCGGTTCAAGTGGTGTTGATG3' （配列番号：１６） P4: 5'GCCGTCGCATGCTTAGTGATGGTGATGGTGATGGTGATGTGTCTCAATGCCACAGTC 3' （配列番号：１７）
【００８６】 ＰＣＲ１条件及びサーモサイクリング１条件 これらＰＣＲ産物を、１％アガロースゲル（Gibco BRL）上で精製した。適切
な分子量のハンド（それぞれ〜７３０ｂｐ及び〜８４０ｂｐ）を切り取り、QIAq
uick Gel抽出キット（Qiagen, バレンシア、カリフォルニア）を使用してＤＮＡ
を抽出した。次に、これら二つのＤＮＡ断片を１：１の割合で混合し、ＰＣＲ１
条件及びサーモサイクリング２条件の下でプライマーＰ５及びＰ４を用いた二巡
目のＰＣＲに供した。このＰＣＲ産物を、ＭｌｕＩ及びＳｐｈＩ部位を使用して
ｐＡＫ１９へクローニングしてｐＬＣｒＣ３を作成し、次いでジデオキシヌクレ
オチド配列決定法によって確かめた。
【００８７】 プラスミドｐＬＣｒＣ３．ＨＣｒＣ３の作成 プラスミドｐＬＣｒＣ３．ＨＣｒＣ３を、三つのＤＮＡ断片のライゲーション
によって作成した：ｐＡＫ１９の〜４９１４ｂｐ ＭｌｕＩ／ＳｐｈＩ断片、ｐ
ＬＣｒＣ３の〜１４８９ｂｐ ＭｌｕＩ／ＡｆIII ＰＣＲ断片、及びｐＨＣｒＣ
３の〜１６２３ｂｐ ＡｆIII／ＳｐｈＩ ＰＣＲ断片。 ｐＬＣｒＣ３のＭｌｕＩ／ＡｆIII 断片をプライマー： P7: 5' GCTACAAACGCGTACGCTGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTG 3' （配列番号：１４） 及び、ＰＣＲ１条件とサーモサイクリング１条件の下でＰ１を使用してＰＣＲ増
幅し、続くＭｌｕＩ及びＡｆIIIによる消化によって作成した。同様に、ｐＨＣ
ｒＣ３のＡｆIII／ＳｐｈＩ断片を、ＰＣＲ１条件及びサーモサイクリング１条
件の下で、プライマーＰ４及びＰ８、5' TAAGCGGCCTTAAGGCTAAGGGATCCTCTAGAGGT
TGAGGTGATTTTATG 3'（配列番号：２０）を使用してＰＣＲ増幅し、続いてＡｆII
I及びＳｐｈＩによる消化によって作成した。プラスミドｐＬＣｒＣ３．ＨＣｒ
Ｃ３は、ジデオキシヌクレオチド配列決定法によって確かめた。
【００８８】 プラスミドｐＬＣｒＣ３．ＨＣｒＣ３ｓの作成 プラスミドｐＬＣｒＣ３．ＨＣｒＣ３ｓを、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-軽鎖及び重鎖
Ｆｄ断片のコドン２１４及び２２３のそれぞれがシステイン残基よりもセリン残
基をコードするように変異させることによって、ｐＬＣｒＣ３．ＨＣｒＣ３から
作成した。軽鎖と重鎖の配列突然変異誘発は、QuikChange部位特異的突然変異誘
発キット（Stratagene）を使用して完成させた。Ｃ２１４Ｓをコードする軽鎖突
然変異は、二つの合成ＤＮＡ断片： P9 5' CTTCAACAGGGGAGAGTCTGGCGGG 3'（配列番号：２１）及びP10 5' CCCGCCAGA
CTCTCCCCTGTTGAAG 3'（配列番号：２２）を使用して完成させ、その一方で、Ｃ
２２３Ｓをコードする重鎖変異を、二つの合成ＤＮＡ断片、 P115' CCCGCCAGACTCTCCCCTGTTGAAG 3' （配列番号：２３）、及び P12 5' GTGAGTTTTGTCAGAAGATTTGGGC 3' （配列番号：２４）を 使用して完成さ
せた。
【００８９】 実施例１２： ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８Ｆａｂ-リバースカスパーゼ３融合タンパク
質の振とうフラスコ発現 プラスミドｐＬＣｒＣ３．ＨＣｒＣ３及びｐＬＣｒＣ３．ＨＣｒＣ３ｓを大腸
菌株２５Ｆ２（Carterら., (1992b)上掲）へ形質転換し、５０μｇ／ｍＬカルベ
ニシリンを含有する５ｍＬのルリア-ベルターニ（ＬＢ）培地によって３７℃で
一晩成育させた。これら一晩成育させた培養液の１ｍＬを５０μｇ／ｍＬカルベ
ニシリンを含有する２５０ｍＬ完全ＣＲＡＰ培地へ播種し、３０℃で振とうさせ
て一晩成育させた（完全ＣＲＡＰ培地を次のように調製した：３．５７ｇ（ＮＨ ４ ）ＳＯ４、０．７１ｇ クエン酸ナトリウム-２Ｈ２Ｏ、１．０７ｇＫＣｌ、５
．３６ｇ酵母エキス、５．３６ｇ ヘイカーゼ ＳＦ-シェフィールド（Hycase SF
-Sheffield）をＫＯＨで７．３、脱イオン水で８７２ｍＬの容量にに調製する。
オートクレーブし、次いで５５℃へ冷やす。１１０ｍＬの１Ｍ ＭＯＰＳ ｐＨ７
．３、１１ｍＬの５０％グルコース、７．０ｍＬの１Ｍ ＭｇＳＯ４を添加する
）。細胞を遠心分離（３０００ｇ、１５分、４℃）でペレットにし、次いで２５
ｍLの１０ｍM Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ ｐＨ７．６、１ｍＭ ＥＤＴＡへ懸濁させた。試
料を４℃で３０分にわたって緩やかに撹拌し、次いで遠心分離する（２７０００
ｇ、２０分、４℃）。次いで、その上澄み（「ショックエイト（schockates）」
）を１００ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０
ｍＭ イミダゾール、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２及び１０ｍＭ β-メルカプトエタノー
ルに調製した。次いで、融合タンパク質を、Ｎｉ-ＮＴＡスーパーフローアガロ
ース（Qiagen）を使用した固定化金属アフィニティクロマトグラフィ（ＩＭＡＣ
）によって精製した。結合タンパク質を、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭ イ
ミダゾール及び１０ｍＭ β-メルカプトエタノールを含有する１ｍＬの１００ｍ
Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）で溶出した。「「ショックエイト」及びＩ
ＭＡＣ精製試料を、定量抗-ＨＥＲ２ Ｆａｂ ＥＬＩＳＡ、抗-ポリヒスチジンＥ
ＬＩＳＡによって分析し、発色体基質を使用してリバースカスパーゼ３活性につ
いてアッセイした。アセチル-Ｌ-Ａｓｐ-Ｌ-Ｖａｌ-Ｌ-Ａｓｐ-Ｐ-ニトロアニリ
ド。
【００９０】 実施例１３：定量的抗-ＨＥＲ２ＦａｂＥＬＩＳＡ ９６-ウェルＥＬＩＳＡプレート（Maxisorp, Nunc）を、ウェル当たり１００
μＬのＮａ２ＣＯ３（ｐＨ９．６）の１μｇ／ｍＬ ＨＥＲ２細胞外ドメインで
コートした（１６時間、４℃）。このプレートを、プレートウオッシャー（Skan
washer 300, Skatron Instruments）を使用してＰＢＳＴ（リン酸緩衝生理食塩
水の０．０５％ Tween20）で洗浄し、次いで３％脱脂粉乳（Carnation）（PBST-
SM）（１時間、２５℃）を含有する２８０μＬ ＰＢＳＴでブロックした。この
プレートをＰＢＳＴで二度洗浄し、一連の試料と標準物のＰＢＳＴ-ＳＭでの希
釈でインキュベートした（１時間、２５℃）。使用した標準物は、１−４００ｎ
ｇ／ｍＬの範囲で連続２倍希釈したｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８Ｆａｂ（Carterら.(199
2a,b)上掲）、（R.F. Kelleyら. Biochemistry 31: 5434-5441）であった。プ
レートをＰＢＳＴで洗浄し、次いで抗-ヒトκ軽鎖-西洋わさびペルオキシダーゼ
複合体でインキュベートした（カタログ＃55233、ICN Pharmaceuticals, オーロ
ラ、オハイオ）：ウェル当たり１００μＬのＰＢＳＴ-ＳＭ中の１：５０００希
釈の複合体。このプレートを洗浄し、次いでウェル当たり１００μＬの新鮮混合
ＴＭＢ基質でインキュベートした（Kirkegaard and Perry Laboratories, ゲー
サーズバーグ，メリーランド）（２−１５分、２５℃）。この反応は、ウェル当
たり１００μＬの１Ｍ リン酸の添加によって止めた。４５０ｎｍの吸光度から
６５０ｎｍの吸光度を引いた値を、マイクロタイタープレートリーダー（Spectr
aMax 340, Molecular Devices）を使用して測定した。このデータをバックグラ
ウンドに対して修正し、次いで非線形最小二乗に供した：Ａ４５０−Ａ６５０＝
（ｃ＊Ａ）／（ｃ＋Ｂ）で、ｃは標準物の濃度であり、Ａ及びＢは定数である。
計算して適合したものは、試料中のｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８ Ｆａｂ-リバースカス
パーゼ３融合タンパク質の濃度を見積もるために使用した。
【００９１】 実施例１４：抗ポリヒスチジンＥＬＩＳＡ ９６-ウェルＥＬＩＳＡプレート（Maxisorp, Nunc）を、ウェル当たり１００
μＬのＮａ２ＣＯ３（ｐＨ９．６）の１μｇ／ｍＬ ＨＥＲ２細胞外ドメインで
コートした（１６時間、４℃）。このプレートを、プレートウオッシャー（Skan
washer 300, Skatron Instruments）を使用してＰＢＳＴ（リン酸緩衝生理食塩
水の０．０５％ Tween20）で洗浄し、次いで３％脱脂粉乳（Carnation）（PBST-
SM）（１時間、２５℃）を含有する２８０μＬ ＰＢＳＴでブロックした。この
プレートをＰＢＳＴで二度洗浄し、次いでＥＬＩＳＡアッセイバッファー（０．
５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含有するリン酸緩衝生理食塩水、及び０．
０１％チメロサール）中での一連のポジティブコントロールと試料の希釈でイン
キュベートした（１時間、２５℃）。ポジティブコントロールとして使用したの
は、１−４００ｎｇ／ｍＬの範囲で連続２倍希釈した、Ｈｉｓ６タッグを有する
ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８Ｆａｂ（Carterら.(1992a,b)上掲）ｓｃＦｖ断片である。
プレートをＰＢＳＴで洗浄し、次いでビオチン-標識ペンタ-Ｈｉｓ抗体（Qiagen
）でインキュベートした：ウェル当たり１００μＬのＥＬＩＳＡアッセイバッフ
ァー中の１：５０００希釈の抗体（１時間、２５℃）。このプレートを洗浄し、
次いでストレプトアビジン-西洋わさびペルオキシダーゼ複合体でインキュベー
トした：ウェル当たり１００μＬのＥＬＩＳＡアッセイバッファー中の１：５０
００希釈の複合体。このプレートを洗浄し、次いでウェル当たり１００μＬの新
鮮混合ＴＭＢ基質でインキュベートした（Kirkegaard and Perry Laboratories,
ゲーサーズバーグ，メリーランド）（２−１５分、２５℃）。この反応は、ウ
ェル当たり１００μＬの１Ｍ リン酸の添加によって止めた。４５０ｎｍの吸光
度から６５０ｎｍの吸光度を引いた値を、マイクロタイタープレートリーダー（
SpectraMax 340, Molecular Devices）を使用して測定した。
【００９２】 実施例１５：リバースカスパーゼ３活性アッセイ 試料、そして別々に組み換え体カスパーゼ３（Calbiochem）を、９６ウェルＥ
ＬＩＳＡプレート中のカスパーゼバッファー（２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ、１０ｍＭ
ＤＴＴ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＣＨＡＰＳ、１０％スクロース、１００
ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で連続２倍希釈した。使用したカスパーゼ３標準
の最も高い濃度は、ウェル当たり１２５ｎｇである。最終アッセイ容量は、２５
０μＭ 発色体基質、アセチル-Ｌ-Ａｓｐ-Ｌ-Ｇｌｕ-Ｌ-Ｖａｌ-Ｌ-Ａｓｐ-ｐ-
ニトロアニリド（Calbiochem）を含有する２５０μｌカスパーゼバッファーであ
った。マイクロプレートレーダー（SpectraMax 340, Molecular Devices）を使
用して、３０分間にわたって、３０秒毎に４０５ｎｍの吸光度を測定した。
【００９３】 Ａｃ-ＤＥＶＤ-ＰＡＢＣ-ドキソルビシン切断の分析 （ドキソルビシンピーク区域＋Ａｃ-ＤＥＶＤ-ＰＡＢＣ-ドキソルビシンピー
ク区域）。ピーク区域は、標準化されていない。
【００９４】 Ａｃ-ＤＥＶＤ-ＰＡＢＣ-タキソール切断 （タキソールピーク区域＋Ａｃ-ＤＥＶＤ-ＰＡＢＣ-タキソールピーク区域
） ピーク区域は、標準化されていない。
【００９５】 ｈｕＭＡｂＤ-８Ｆａｂ-リバースカスパーゼ融合タンパク質 大腸菌２５Ｆ２でのｐＬＣｒＣ３．ＨＣｒＣ３及びｐＬＣｒＣ３．ＨＣｒＣ３
ｓの増殖に続くｈｕＭＡｂＤ-８Ｆａｂ-リバースカスパーゼ融合タンパク質の発
現力価は、対応するショックエイトによって見積もられ、定量的抗-ＨＥＲ２Ｆ
ａｂＥＬＩＳＡ〜２００ｎｇ／ｍＬ及び〜０．６ｎｇ／ｍＬであった。これら二
つのＥＬＩＳＡアッセイは、また、ＨＥＲ２との結合に関してＦａｂ断片が機能
的であることを確かにする。リバースカスパーゼ３の機能は、発色体基質アセチ
ル-Ｌ-Ａｓｐ-Ｌ-Ｇｌｕ-Ｌ-Ｖａｌ-Ｌ-Ａｓｐ-ｐ-ニトロアニリドを加水分解す
ることが可能であることを示すことで確かめられた。
【００９６】 １．Carter. P., ら., 二価ヒト化抗体断片の高レベル大腸菌発現及び生産．Bio
/Technology, 1992. 10(2): p. 163-7． ２．Srinivasula, S. M., ら., サブユニットの再構成による、構成的に活性な
組み換え体カスパーゼ-３及び-６の生成．Journal of Biological Chemistry, 1
998. 273(17): p. 10107-11． ３．Carter. P., ら., ヒト癌治療のための抗-ｐ１８５ＨＥＲ２抗体のヒト化．
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America, 1992. 89(10): p.4285-9． ４．Kelley, R.F., ら., キメラ及びヒト化抗-ｐ１８５ＨＥＲ２抗体 Ｆａｂ断
片の抗原結合化学熱力学と抗増殖効果．Biochemistry, 1992. 31(24): p. 5434-
41
【図面の簡単な説明】
【Ｆｉｇ１】 ＳＫ-ＢＲ-３及びＭＣＦ７細胞でのカスパーゼ切断可能プロド
ラッグＡｃ-ＤＥＶＤ-ＰＡＢＣ-ドキソルビシンの細胞内蓄積。ドキソルビシン
の取り込みを、未処理である細胞へ添加したドキソルビシンの既知量を使用する
ことで調製した標準曲線から見積もった。
【Ｆｉｇ２】 カスパーゼ３プラス又はマイナスのＳＫ-ＢＲ-３及びＭＣＦ７
乳癌細胞に対する、カスパーゼ切断可能プロドラッグＡｃ-ＤＥＶＤ-ＰＡＢＣ-
ドキソルビシンのインビトロ細胞障害性。
【Ｆｉｇ３】 ヒト肺癌細胞（Ｈ４６０）及び結腸癌細胞（ＨＣＴ１１６）に
おける、Ａｃ-ＤＥＶＤ-ＰＡＢＣ-ドキソルビシンのインビトロ細胞障害性。
【 Ｆｉｇ４】 ヒト肺癌細胞（Ｈ４６０）及び結腸癌細胞（ＨＣＴ１１６）
における、Ａｃ-ＤＥＶＤ-ＰＡＢＣ-タキソールのインビトロ細胞障害性。
【Ｆｉｇ５】 ヒト血漿におけるカスパーゼ３の安定性。
【Ｆｉｇ６】 プラスミドｐＬＣｒＣ３．ＨＣｒＣ３の抗-ＨＥＲ２ Ｆａｂリ
バースカスパーゼ３複合体の核酸（配列番号：１）及びアミノ酸（配列番号：２
及び２５）配列。配列番号：２は、配列番号：１のヌクレオチド４３９から１９
７７によってコードされている。配列番号：２５は、配列番号：１のヌクレオチ
ド２０２５から３６０５によってコードされている。
【Ｆｉｇ７】 構築に使用したプラスミドｐＬＣｒ３及びｐＨＣｒＣ３と、抗
-ＨＥＲ２ Ｆａｂリバースカスパーゼ３複合体ｐＬＣｒＣ３．ＨＣｒＣ３の略図
。
【Ｆｉｇ８】 Ａｃ-ＤＥＶＤ-ドキソルビシンプロドラッグの調製：(i)ドキ
ソルビシン塩酸塩、ＤＣＣ、ＨＯＳｕ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦ、０−２３℃、及び
(ii)Ｐｄ（ＰＰｈ３）４ 、ＳｎＨ、ＡｃＯＨ、ＤＭＦ、２３℃。
【Ｆｉｇ９】 Ａｃ-ＤＥＶＤ-ＰＡＢＣ（Asp-Glu-Val-Asp-パラ アミノベン
ジルオキシカルボニル）プロドラッグ部分の調製。この例では、ＤＥＶＤはカス
パーゼ切断可能プロドラッグ部分であり、ＰＡＢＣは自壊型リンカー：(iii)４-
アミノベンジルアルコール、ＥＥＤＱ、ＤＭＦ、２３℃、及び(iv)４-ニトロフ
ェニルクロロ蟻酸塩、２，６-ルチジン、ＤＣＭ、ＤＭＦ、２３℃。
【Ｆｉｇ１０】 Ａｃ-ＤＥＶＤ-ＰＡＢＣ-ドキソルビシンプロドラッグの調
製：(v)ドキソルビシン塩酸塩、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦ、２３℃、及び(vi)Ｐｄ（
ＰＰｈ３）４、Ｂｕ３ＳｎＨ、ＡｃＯＨ、ＤＭＦ、２３℃。
【Ｆｉｇ１１】 Ａｃ-ＤＥＶＤ-ＰＡＢＣ-パクリタキセルプロドラッグの調
製：(vii)パクリテキセル、ＤＭＡＰ、ＭｅＣＮ、２３℃、及び(viii)Ｐｄ（Ｐ
Ｐｈ３）４、Ｂｕ３ＳｎＨ、ＡｃＯＨ、ＤＭＦ、２３℃。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｔ 45/08 45/08 Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 35/00 43/00 １０５ 43/00 １０５ １２１ １２１ １２３ １２３ Ａ６１Ｋ 37/54 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ギャザード，ルイス イギリス国，ノースヨークシャー ＢＤ23 １ＱＲ，スキプトン，ハーウッド ロー ド，クレーブン トア Ｆターム(参考） 4C076 AA95 CC26 CC27 CC42 4C084 AA02 AA18 AA27 DC02 DC07 MA01 NA15 ZB21 ZB26 4C085 AA13 AA14 BB11 BB17 CC23 CC31 4C086 AA01 AA02 BA02 EA10 NA15 ZB21 ZB26

Claims (26)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ａ）カスパーゼ変換可能プロドラッグを活性剤へ変換するカス
    パーゼを含んでなる、細胞型標的複合体の有効量を投与すること、並びに ｂ）カスパーゼ変換可能プロドラッグを投与することの段階を含んでなる、対象
    である細胞型への活性剤の送達に関する方法。
  2. 【請求項２】 カスパーゼが哺乳動物カスパーゼである、請求項１の方法。
  3. 【請求項３】 カスパーゼがヒトカスパーゼである、請求項２の方法。
  4. 【請求項４】 カスパーゼがプロ-アポトーシス性カスパーゼである、請求項
    ３の方法。
  5. 【請求項５】 カスパーゼが、カスパーゼ２、カスパーゼ３及びカスパーゼ７
    から構成されている群から選択される、請求項４の方法。
  6. 【請求項６】 カスパーゼがカスパーゼ３である、請求項５の方法。
  7. 【請求項７】 対象である細胞型が腫瘍細胞である、請求項１の方法。
  8. 【請求項８】 細胞型標的複合体が抗体複合体である、請求項１の方法。
  9. 【請求項９】 抗体がポリクローナル抗体である、請求項８の方法。
  10. 【請求項１０】 抗体がモノクローナル抗体である、請求項８の方法。
  11. 【請求項１１】 抗体が抗体断片である、請求項８の方法。
  12. 【請求項１２】 抗体断片がＦ（ａｂ’）２である、請求項１１の方法。
  13. 【請求項１３】 活性剤が細胞障害性剤である、請求項１の方法。
  14. 【請求項１４】 細胞障害性剤が、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピル
    ビシン、タキソール、タキソテール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、マイト
    マイシンＣ、エトポシド、メトトレキサート、シスプラチン、サイクロホスファ
    ミド、メファラン、ハロテスティン、チオ-ＴＥＰＡ、クロラムブシル、５-ＦＵ
    、及びサイトキサンで構成される群から選択される、請求項１３の方法。
  15. 【請求項１５】 細胞障害性剤がドキソルビシンである、請求項１４の方法。
  16. 【請求項１６】 カスパーゼの細胞型標的複合体を含む、製薬的組成物。
  17. 【請求項１７】 抗体複合体カスパーゼを含む、製薬的組成物。
  18. 【請求項１８】 カスパーゼ切断可能プロドラッグ部分を含んでなるプロドラ
    ッグ。
  19. 【請求項１９】 プロドラッグ部分が配列Ａｓｐ-Ｘａａ-Ｘａａ-Ａｓｐを有
    する、請求項１８のプロドラッグ。
  20. 【請求項２０】 プロドラッグ部分が配列Ａｓｐ-Ｇｌｕ-Ｖａｌ-Ａｓｐを有
    する、請求項１９のプロドラッグ。
  21. 【請求項２１】 ドキソルビシンを含んでなる、請求項２０のプロドラッグ。
  22. 【請求項２２】 パクリタキセルを含んでなる、請求項２０のプロドラッグ。
  23. 【請求項２３】 抗体結合カスパーゼを含んでなるキット。
  24. 【請求項２４】 抗体結合カスパーゼによって、より活性ある薬剤へ変換され
    るプロドラッグをさらに含んでなる、請求項２３のキット。
  25. 【請求項２５】 カスパーゼによって活性のある薬剤へ変換されるプロドラッ
    グの治療的有効量を哺乳動物へ投与する段階を含んでなる、哺乳動物を治療する
    方法。
  26. 【請求項２６】 カスパーゼ及び細胞型標的カスパーゼによって、活性のある
    薬剤へ変換されるプロエイジェントの治療的有効量を哺乳動物へ投与する段階を
    含んでなる、哺乳動物を治療する方法。
JP2001561363A 2000-02-24 2001-02-22 カスパーゼ活性化プロドラック療法 Pending JP2003523407A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US18477900P 2000-02-24 2000-02-24
US60/184,779 2000-02-24
PCT/US2001/005709 WO2001062300A2 (en) 2000-02-24 2001-02-22 Caspase activated prodrugs therapy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2003523407A true JP2003523407A (ja) 2003-08-05

Family

ID=22678303

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2001561363A Pending JP2003523407A (ja) 2000-02-24 2001-02-22 カスパーゼ活性化プロドラック療法

Country Status (15)

Country Link
US (1) US20070104719A1 (ja)
EP (1) EP1257296A2 (ja)
JP (1) JP2003523407A (ja)
KR (1) KR20020082227A (ja)
CN (1) CN1406137A (ja)
AU (1) AU783679B2 (ja)
BR (1) BR0108930A (ja)
CA (1) CA2399255A1 (ja)
HU (1) HUP0300024A2 (ja)
IL (1) IL150992A0 (ja)
MX (1) MXPA02007939A (ja)
NZ (1) NZ520458A (ja)
PL (1) PL358187A1 (ja)
WO (1) WO2001062300A2 (ja)
ZA (1) ZA200206105B (ja)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7097840B2 (en) * 2000-03-16 2006-08-29 Genentech, Inc. Methods of treatment using anti-ErbB antibody-maytansinoid conjugates
US7468354B2 (en) 2000-12-01 2008-12-23 Genspera, Inc. Tissue specific prodrugs
AU2003219730A1 (en) 2002-02-07 2003-09-02 Massachusetts Institute Of Technology Anti-pathogen treatements
US8088387B2 (en) 2003-10-10 2012-01-03 Immunogen Inc. Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates
EP1635858A4 (en) 2003-05-29 2009-08-26 Scripps Research Inst TARGETED RELEASE ON CELLS EXPRESSING LEGUMINUM
WO2008109997A1 (en) * 2007-03-09 2008-09-18 The University Of British Columbia Procaspase 8-mediated disease targeting
EP2282769A4 (en) 2008-04-29 2012-04-25 Abbott Lab DUAL VARIABLE DOMAIN IMMUNOGLOBULINS AND ITS USES
WO2009141826A2 (en) 2008-05-22 2009-11-26 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Novel conjugates of polymers having a therapeutically active agent and an angiogenesis targeting moiety attached thereto and uses thereof in the treatment of angiogenesis related diseases
WO2009141823A2 (en) 2008-05-22 2009-11-26 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Conjugates of a polymer, a bisphosphonate and an anti-angiogenesis agent and uses thereof in the treatment and monitoring of bone related diseases
WO2009141827A2 (en) * 2008-05-22 2009-11-26 Ramot At Tel Aviv University Ltd. A conjugate of a polymer, an anti-angiogenesis agent and a targeting moiety, and uses thereof in the treatment of bone related angiogenesis conditions
JP5723769B2 (ja) 2008-06-03 2015-05-27 アッヴィ・インコーポレイテッド 二重可変ドメイン免疫グロブリン及びその使用
EP2297209A4 (en) 2008-06-03 2012-08-01 Abbott Lab IMMUNOGLOBULINS WITH TWO VARIABLE DOMAINS AND USES THEREOF
EP2321422A4 (en) 2008-07-08 2013-06-19 Abbvie Inc PROSTAGLANDINE E2 VARIABLE DOUBLE DOMAIN IMMUNOGLOBULINS AND USES THEREOF
SG178602A1 (en) 2009-09-01 2012-04-27 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
EP2483687A4 (en) * 2009-09-28 2013-02-20 Quest Diagnostics Invest Inc DIAGNOSTIC METHOD FOR LEUKEMIA USING CASPASE-3
WO2011047262A2 (en) 2009-10-15 2011-04-21 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
UY32979A (es) 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
JP2013537415A (ja) 2010-08-03 2013-10-03 アッヴィ・インコーポレイテッド 二重可変ドメイン免疫グロブリンおよびその使用
CA2809433A1 (en) 2010-08-26 2012-03-01 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
BR112013014115A2 (pt) * 2010-12-29 2019-09-24 Arrowhead Res Corporation conjugados de fornecimento de polinucleotídeos in vivo apresentando ligações enzimáticas sensíveis
KR101713888B1 (ko) 2011-03-02 2017-03-09 한국과학기술연구원 방사선 또는 자외선 조사에 의해 활성화되는 항암제 전구체 및 이의 용도
US9120870B2 (en) 2011-12-30 2015-09-01 Abbvie Inc. Dual specific binding proteins directed against IL-13 and IL-17
CN104244988A (zh) 2012-03-05 2014-12-24 雷蒙特亚特特拉维夫大学有限公司 结合治疗活性剂的聚合物、其制备方法以及其用途
BR112015009961B1 (pt) 2012-11-01 2020-10-20 Abbvie Inc. proteína de ligação capaz de se ligar a dll4 e vegf, bem como composição que a compreende como composição que a compreende
WO2014144280A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Abbvie Inc. DUAL SPECIFIC BINDING PROTEINS DIRECTED AGAINST IL-1β AND / OR IL-17
JP6539729B2 (ja) * 2014-06-03 2019-07-03 ジアリー・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＪｉａｒａｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． ペプチド−薬物複合体
US10047061B2 (en) 2014-06-11 2018-08-14 Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Water-soluble triazabutadienes
US10125105B2 (en) 2014-06-11 2018-11-13 Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Triazabutadienes as cleavable cross-linkers
US9593080B1 (en) 2014-06-11 2017-03-14 The Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Triazabutadienes as cleavable cross-linkers
US9775914B2 (en) * 2014-11-20 2017-10-03 Pharosgen Co., Ltd. Prodrugs activated by caspase
WO2016094881A2 (en) 2014-12-11 2016-06-16 Abbvie Inc. Lrp-8 binding proteins
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
US10954195B2 (en) 2015-08-11 2021-03-23 Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Substituted triazenes protected from degradation by carboxylation of N1
CN109310780A (zh) * 2016-05-04 2019-02-05 纳维格蛋白质有限公司 包含肽接头的用于化学部分位点-特异性偶联的靶向化合物
WO2018023130A1 (en) 2016-07-29 2018-02-01 The Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Triazabutadienes as cleavable cross-linkers
CA3081539A1 (en) * 2017-11-08 2019-05-16 Yafei Shanghai Biolog Medicine Science & Technology Co., Ltd. Conjugates of biomolecule and use thereof
EP4031186A1 (en) * 2019-09-19 2022-07-27 Seagen Inc. Selective drug release from internalized conjugates of biologically active compounds
US12036286B2 (en) 2021-03-18 2024-07-16 Seagen Inc. Selective drug release from internalized conjugates of biologically active compounds

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4675187A (en) * 1983-05-16 1987-06-23 Bristol-Myers Company BBM-1675, a new antibiotic complex
US4975278A (en) * 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
DE3920358A1 (de) * 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
IL101943A0 (en) * 1991-05-24 1992-12-30 Genentech Inc Structure,production and use of heregulin
US5288931A (en) * 1991-12-06 1994-02-22 Genentech, Inc. Method for refolding insoluble, misfolded insulin-like growth factor-I into an active conformation
WO1999006072A1 (en) * 1997-07-30 1999-02-11 Boehringer Mannheim Corporation Cyclized prodrugs
WO1999029721A1 (en) * 1997-12-10 1999-06-17 Washington University Anti-pathogen system and methods of use thereof
US6379950B1 (en) * 1998-01-09 2002-04-30 Thomas Jefferson University Recombinant, active caspases and uses thereof
US6645490B2 (en) * 1998-03-02 2003-11-11 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Chimeric proteins with cell-targeting specificity and apoptosis-inducing activities
US6833373B1 (en) * 1998-12-23 2004-12-21 G.D. Searle & Co. Method of using an integrin antagonist and one or more antineoplastic agents as a combination therapy in the treatment of neoplasia
GB2360771A (en) * 2000-03-28 2001-10-03 Antisoma Res Ltd Compounds for targeting
EP1286700A2 (en) * 2000-06-01 2003-03-05 Universite Catholique De Louvain Tumor activated prodrug compounds

Also Published As

Publication number Publication date
AU783679B2 (en) 2005-11-24
BR0108930A (pt) 2002-12-10
NZ520458A (en) 2005-02-25
WO2001062300A2 (en) 2001-08-30
AU4166701A (en) 2001-09-03
CN1406137A (zh) 2003-03-26
ZA200206105B (en) 2003-07-31
KR20020082227A (ko) 2002-10-30
IL150992A0 (en) 2003-02-12
CA2399255A1 (en) 2001-08-30
WO2001062300A3 (en) 2002-04-25
PL358187A1 (en) 2004-08-09
US20070104719A1 (en) 2007-05-10
MXPA02007939A (es) 2003-02-10
HUP0300024A2 (en) 2003-05-28
EP1257296A2 (en) 2002-11-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU783679B2 (en) Caspase activated prodrugs therapy
US20040052793A1 (en) Caspase activivated prodrugs therapy
US11911434B2 (en) Stable antibody-drug conjugate, preparation method therefor, and use thereof
JP6392427B2 (ja) ｐ９７−抗体結合体および使用方法
CN104105711B (zh) 单链抗体及其他异多聚体
CN105979971B (zh) 抗体-药物缀合物和免疫毒素
US11826432B2 (en) Linkers, conjugates and applications thereof
US20230256108A1 (en) A drug conjugate and applications thereof
US20110142756A1 (en) Method And Composition For The Treatment Of Cancer By The Enzymatic Conversion Of Soluble Radioactive Toxic Precipitates In The Cancer
US20220133903A1 (en) Methods of using a bispecific antigen-binding construct targeting her2 for the treatment of biliary tract cancers
JP2006504630A (ja) ムチンポリペプチドに特異的な抗体
CA2572825A1 (en) Compositions for multi-step delivery of hot-spots radiation to cancer cells
WO2024078612A1 (en) Linker-payload compound, conjugates and applications thereof
RU2814164C2 (ru) Антитело против клаудина 18.2 и его конъюгат антитело-лекарственное средство
WO2024207177A1 (en) Antibody, linkers, payload, conjugates and applications thereof
WO2024012566A9 (en) Anti-trop2 antibody and conjugate thereof
KR20230135653A (ko) 항-클라우딘 18.2 항체 및 이의 항체-약물 접합체