JP2022543423A - 治療用組成物から材料を除去するための製造方法および装置 - Google Patents

治療用組成物から材料を除去するための製造方法および装置 Download PDF

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Abstract

二本鎖RNAを一本鎖RNAから連続した流れの一部として分離する、特にmRNA治療薬を含む治療薬の製造および使用のための方法および装置である。これらの方法および装置は、マイクロ流路デバイスに統合された透過性インサートを使用したRNA治療薬の製剤化を含むことができる。特に、これらの方法及び装置は、セルロース材料を含むマイクロ流路デバイス内によってRNAの溶液から二本鎖RNAを除去することによるRNA治療薬の製剤化を含んでもよい。

Description

関連出願との相互参照
本特許出願は、2019年8月9日に出願され、「MICROFLUIDIC APPARATUS AND METHODS OF USE THEREOF」と題された米国仮特許出願第62／885、159、および2019年8月9日に出願され、「METHODS AND APPARATUS FOR MANUFACTURING THERAPEUTIC COMPOSITIONS」と題された米国仮特許出願第62／885、170、また、2019年10月11日に出願され、「METHODS AND APPARATUSES FOR MANUFACTURING FOR REMOVING MATERIAL FROM A THERAPEUTIC COMPOSITION」と題された米国仮特許出願第62／914，374号に対する優先権を主張しており、これらの各々はその全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
[参照による組み込み]
本明細書で言及されているすべての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されている場合と同じ程度に、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示は、一般に、ポリヌクレオチドベースの治療薬を迅速かつ高収率で製造するための方法およびシステムに関するものである。本開示は、特に、ワクチンを含む治療用mRNAの自動製造に関連し、迅速かつ効率的に実施され得る。このような治療薬は、患者固有の情報を考慮してもよく、オンデマンドで、ポイントオブケア（例えば、病院、診療所など）で完全にまたは部分的に製造されてもよい。
現在、ポリヌクレオチド治療薬、特にmRNA治療薬の製造・製剤化技術は、しばしば製品が汚染や劣化にさらされることがある。現在利用可能な集中生産は、複数のポリヌクレオチド種を含む可能性のある治療用製剤に使用するには、コストがかかりすぎ、時間がかかりすぎ、汚染の影響を受けやすい可能性がある。スケーラブルなポリヌクレオチド製造、単一患者への投与量の製造、汚染を防ぐためのタッチポイントの排除、臨床製造要件を満たすための入力とプロセスの追跡、Point-of-Careオペレーションでの使用などの開発により、これらの有望な治療法の利用を促進することが可能である。マイクロ流体工学の装置とプロセスは、これらの目標に対して大きな利点を提供することができる。
本明細書に記載されるのは、上記のニーズに対処し得る様々な治療薬を製造するための方法および装置（例えば、システム）である。
本明細書では、多種多様なワクチンおよび治療薬を製造するのに有用な装置および方法を説明する。例えば、本明細書に記載されるのは、ワクチンを含む個人化治療薬を製造するための方法および装置（例えば、システム、デバイスなど）である。1つの非限定的な例では、本明細書に記載される方法および装置は、皮膚T細胞リンパ腫において活性な癌特異的抗原に対する治療用mRNAワクチンを製造するために使用され得る。
したがって、一般に、本明細書に記載されているのは、mRNA治療薬の自動化された高収率製造方法であり、任意にポイントオブケアで展開されるものである。
例えば、本明細書に記載されるのは、形成する方法（例えば、製造する、作る、合成する、など)であって、1つまたは複数のマイクロ流体経路デバイスと密封流体連通するように固定されるように構成された複数の流体デポを含むシステムを使用する治療用ポリヌクレオチドであり、該方法は、合成鋳型を形成するステップ、鋳型からin vitro転写を行って治療用ポリヌクレオチドを生成するステップ、および治療用ポリヌクレオチドを精製するステップを行うために、大気との接触から保護されている密閉された閉鎖流路で複数の流体デポと1以上のマイクロ流路デバイス上の複数のリアクターとの間で試薬を輸送するステップを含む。
1つ以上のマイクロ流路プレート装置と密封流体連通するように固定されるように構成された複数の流体デポを含むシステムを用いて治療用mRNAを製造する方法であって、1つ以上のマイクロ流路プレート装置が複数の反応器を含んでいる、1つ以上の流体デポから鋳型前駆体材料を複数の反応器の第1の1つ以上の反応器領域に送達し、鋳型前駆体材料を処理して鋳型前駆体材料から鋳型を調製すること、鋳型を複数の反応器の第2の1つ以上の反応器に移送し、インビトロ転写によって鋳型を処理して治療用mRNAを形成すること、治療用mRNAを複数のリアクターの第3の1つ以上のリアクター領域に移送し、第3の1つ以上のリアクター領域内で2次元（2D）精製によって治療用mRNAを精製することを含み得、ここで、全ての方法ステップが、鋳型および治療用mRNAを大気接触に曝すことなく実施される方法を含むことができる。
1つ以上のマイクロ流路プレート装置と密閉流体連通している複数の流体デポを含むシステムを用いて治療用mRNAを製造する方法であって、1つ以上のマイクロ流路プレート装置が複数の反応器を含む、流体動力を用いて、1つまたは複数の流体デポから鋳型前駆体材料を複数の反応器の第1の1つまたは複数の反応器領域に送達し、鋳型前駆体材料を処理して、鋳型前駆体材料から鋳型を調製すること、流体動力を用いて、鋳型を複数の反応器の第2の1つまたは複数の反応器に移し、インビトロ転写によって鋳型を処理して治療mRNAを形成させること、流体力を用いて、治療用mRNAを複数のリアクターのうちの第3の1つ以上のリアクター領域に移送し、第3の1つ以上のリアクター領域内で2次元（2D）精製によって治療用mRNAを精製すること、流体力を用いて、治療用mRNAを複数の反応器のうちの第4の1つ以上の反応器領域に移送し、治療用mRNAを送達ビヒクルでカプセル化して治療用mRNA組成物を形成すること、流体力を用いて、治療用mRNA組成物を第5の1つ以上の液体デポに濃縮し、ここで、全ての方法ステップが鋳型及び治療用mRNAを大気接触に曝すことなく実行される、方法が含まれ得る。
治療用ポリヌクレオチドの精製は、典型的には、複数の反応器のうちの1つまたは複数内で治療用ポリヌクレオチドを2次元（2D）精製することを含む。2D精製は、本明細書に記載の実質的に平坦なマイクロ流路デバイス（例えば、マイクロ流路プレートデバイス）内で行われてもよく、治療用ポリヌクレオチドから材料（例えば、二本鎖RNAなど）を除去するための材料を使用することを含んでもよい。マイクロ流路デバイスにおけるポリヌクレオチドの2D精製は、カラムの使用を必要とする場合があり、本明細書に記載の閉経環境及び／又は少量で行うことが困難又は不可能なステップを含む場合がある先行技術の技術と比較して、特に有利であり得る。いくつかの変形例では、治療用ポリヌクレオチドを精製することは、1つまたは複数の反応器内でセルロース材料を用いて二本鎖のmRNAを除去することを含んでいる。
これらの方法のいずれも、治療用ポリヌクレオチドを、1つ以上のマイクロ流路デバイス上の1つ以上の反応器において送達ビヒクルと共に処方して、治療用ポリヌクレオチド組成物を形成することを含んでもよい。治療用ポリヌクレオチド（例えば、mRNA）は、本明細書に記載されるように送達ビヒクルでカプセル化されてもよく、いくつかの変形例では、アジュバントmRNA（例えば、免疫応答を増強するタンパク質を封入したmRNA）を含む治療用mRNAに加えてさらなるmRNAを含んでいてもよい。送達ビヒクルは、両親媒性ナノ粒子、例えば、アミノ脂質化ペプトイドを含んでいてもよい。
いくつかの変形例では、治療用組成物は、後に送達ビヒクルと組み合わせるために保管されてもよい（例えば、4℃で、密閉された筐体、容器またはバイアルに保管される）。治療用組成物は、マイクロ流体経路装置からマイクロ流体制御装置内の流体デポに移動させ、同じマイクロ流体制御装置で使用するか、または送達ビヒクルと組み合わせるために別の（例えば、使用されるべき病院または診療所に近接することを含む地理的に離れた）マイクロ流体制御装置に提供してもよい。治療用ポリヌクレオチド（例えば、治療用mRNA）を送達ビヒクルと結合させると、治療用組成物が形成される。治療用組成物は、使用（例えば、患者への注射）前にさらに修飾されることがある。
例えば、これらの方法のいずれかが、1つまたは複数のマイクロ流路デバイスにおい治療用ポリヌクレオチド組成物を透析および／または濃縮することを含んでもよい。本明細書で使用される透析は、粒子が膜（透析膜）を通過する能力の差に基づいて、液体中の粒子を分離することを指す場合がある。いくつかの変形例では、透析は向流交換を含む。
システムは、合成鋳型の形成、鋳型からのin vitro転写の実行、および治療用ポリヌクレオチドの精製のステップを、システムの1つまたは複数のセンサーからの光フィードバックによって自動的にかつ連続的に実行することができる。
一般に、治療用ポリヌクレオチドは、mRNAであってもよい。例えば、治療用ポリヌクレオチドは、mRNA、環状RNA、または自己複製RNAなどであってもよい。
一般に、システムは、1つ以上の流体デポと複数の反応器との間で試薬を流体動力によって、例えば、1つ以上の流体回路を使用して輸送することができる。流体動力とは、一般に、空気圧と油圧の両方を指す。流体動力回路は、複数の要素（例えば、流体ライン、バルブなど）を含んでもよく、異なる流体動力回路（本明細書では流体回路ともいう）の構成要素は、複数の流体動力回路によって共有されてもよく、コントローラの制御下で、一つ以上のバルブを介して切り替えてもよい。例えば、システムは、1つ以上の流体デポと複数の反応器との間で試薬を空気圧で輸送してもよい。制御装置によって制御される流体動力の使用は、有利には、鋳型、治療用mRNA及び／又は治療用組成物を形成するために用いられる処理の非接触制御を可能にし得る。例えば、システムは、1つ以上のマイクロ流体経路デバイス内の1つ以上の弾性層を偏向させることによって、1つ以上の流体デポと複数のリアクターとの間で試薬を輸送してもよい。
本明細書に記載される方法は、上記のように、完全にまたは部分的に局所的に（例えば、医療現場で）実施され得る。有利には、本明細書に記載の方法は、有効性を低下させ、及び／又は合併症を引き起こす危険性がある治療用mRNAへの保存料又は添加物の使用なしに、治療用mRNAのオンデマンド製造を可能にし得る。治療用mRNA及び送達ビヒクルを含む治療用組成物が時間の経過とともに凝集及びクラスター化する可能性があるので、送達ビヒクルを治療用ポリヌクレオチド（例えば、治療用mRNA）で局所的に処方することは特に有益であり得る。さらに、これらの方法は、既存の方法と比較して、迅速に実行され得る。例えば、本明細書に記載のシステムは、合成鋳型を形成するステップ、鋳型からインビトロ転写を実行して治療用ポリヌクレオチドを生成するステップ、及び治療用ポリヌクレオチドを精製するステップを5日未満（例えば、4日未満、3日未満など）で自動的に連続実行し得る。
これらの方法のいずれもが、流体デポを1つ以上のマイクロ流体経路デバイスに密封することと、流体デポと1つ以上のマイクロ流体経路デバイス上の複数の反応器との間で試薬を搬送する前に流体デポを加圧することとを含んでもよい。コントローラは、流体デポを加圧することを制御してもよい。
一般に、これらの方法及び装置は、製造の一部又は全部を記録してもよく、この記録は、光学的（例えば、映画、ビデオ等を含む、マイクロ流路デバイス内の流体の動きを示す）及び／又は非光学的センサデータ（圧力測定値、温度測定値等）であってもよい。この製造データは、品質管理及び試験のためを含む、後の検討のために保存、保管及び／又は送信されてもよい。したがって、これらの方法のいずれも、製造される治療用ポリヌクレオチドに関連するファイルにおいて、ステップの実行中に1つまたは複数のマイクロ流体パスデバイス内の流体の動きを記録することを含んでもよい。
本明細書に記載された方法のいずれも、これらの方法の全てまたは一部を実行するように構成されたソフトウェアを実行するコンピュータ（例えばプロセッサ）を含むシステム（例えば、これらの命令をコード化した非一過性のコンピュータ可読媒体）によって、自動的にまたは半自動的に実行することができる。例えば、治療用ポリヌクレオチドを製造するための命令を具体化した非一過性のコンピュータ可読媒体は、1つまたは複数のマイクロ流体経路デバイスと密封流体連通して固定されるように構成された複数の液体デポを含むシステムのコントローラによって実行すると、コントローラが、複数の流体デポを1つ以上のマイクロ流体経路デバイスと流体連通して加圧するステップと、複数の流体デポの1つ以上の流体デポと1つ以上のマイクロ流体経路デバイス上の複数の反応器との間で試薬を大気接触から保護されている密閉された閉鎖流路で輸送して、合成鋳型を形成し、鋳型からインビトロ転写を行って治療ポリヌクレオチドを生成し、治療ポリヌクレオチドを精製する（例えば、1つまたは複数のマイクロ流体パスデバイス内）工程を含む方法を実行するようにさせる。
命令は、さらに、合成鋳型を形成するステップ、鋳型からin vitro転写を行うステップ、およびシステムの1つまたは複数の光学センサーからの光学フィードバックに基づいて治療用ポリヌクレオチドを精製するステップを自動的にかつ連続的に行うように、コントローラに命じてもよい。命令は、さらに、コントローラに、複数の反応器のうちの1つまたは複数の反応器内で2次元（2D）精製によって治療用ポリヌクレオチドの精製を制御し、および／または1つまたは複数のマイクロ流体経路デバイス上の1つまたは複数の反応器で送達ビークルと治療用ポリヌクレオチドを処方して治療用ポリヌクレオチド組成物を形成し、および／または1つまたは複数のマイクロ流体経路デバイスにおいて治療用ポリヌクレオチド組成物を透析および／または濃縮するなどさせることがある。
また、本明細書に記載されたクローズドパスシステムのいずれかを使用して、mRNA合成用の合成二本鎖DNA鋳型を自動製造する方法についても説明する。例えば、1つ以上のマイクロ流路デバイスと密封流体連通するように固定されるように構成された複数の流体デポを含むクローズドパスシステムを使用してmRNA合成のための合成二本鎖DNA鋳型を製造する方法は、複数の流体デポのうちの1つまたは複数の流体デポと、1つまたは複数のマイクロ流体経路デバイス上の複数の反応器との間で試薬を、大気との接触から保護された閉じた流体経路で輸送して試薬を結合すること、および治療mRNAのインビトロ転写のための合成二本鎖DNA鋳型を形成すること、を含むことができる。
形成された合成鋳型（合成二本鎖DNA鋳型）は、細菌DNAを含まず、エンドトキシンを含まないものであってもよい。
これらの方法は、閉経システムのコントローラにおいて、閉経システムの1つ以上のセンサから光センサデータを受信することを含み得、コントローラは、光センサデータに基づいて、閉経システムの動作を制御する。
方法は、流体デポを加圧すること、及び／又は試薬を輸送することが、対象の合成遺伝子及び合成体外転写促進剤カセットを複数の流体デポのうちの1つ又は複数の流体デポからマイクロ流体パスデバイス内の第1の1つ又は複数の反応器に輸送し、対象の合成遺伝子を合成体外転写促進剤カセットと接合して合成生成物を作り、合成生成物から未反応物質を取り除き、合成生成物を増幅させて合成二本鎖DNA鋳型を生成することからなることを含むことがある。前記1つ以上のマイクロ流路デバイスは、前記クローズドパスシステムに着座したマイクロ流路プレートデバイスからなる。
有利なことに、これらの方法は、他のシステム（典型的にはフェムトモル量しか生成しない）と比較して、かなりの量の鋳型（mM量）を作ることを含むことができる。本明細書に記載される方法及び装置は、大量の鋳型を製造することができる。
マイクロ流路デバイスと密閉流体連通している複数の流体デポを含むクローズドパスシステムを使用してin vitro転写のための合成二本鎖DNA鋳型を製造する自動化方法は、目的の合成遺伝子および合成体外転写促進剤カセットを含む試薬を、複数の流体デポのうちの1つまたは複数の流体デポから、大気との接触から保護されている閉鎖流体経路においてマイクロ流体経路装置内の第1の1つまたは複数の反応器へ輸送すること、目的の合成遺伝子を合成体外転写促進剤カセットと接合して合成生成物を生成させること、合成産物をマイクロ流路装置内で搬送して、未反応の目的の合成遺伝子および未反応の合成体外転写促進剤カセットを合成産物から遠ざけること、および合成産物をマイクロ流路装置内で搬送して合成産物を増幅して二本鎖DNA鋳型を作製することを含むことができる。前述のように、合成産物を増幅することは、1mMを超える増幅されたDNA鋳型を生成することを含んでもよい。
また、本明細書では、マイクロ流体経路装置と密閉流体連通している複数の流体デポを含むクローズドパスシステムを使用してin vitro転写用の合成二本鎖DNA鋳型を作製する自動化方法であって、目的の合成遺伝子および合成体外転写（IVT）促進剤カセットを含む試薬を、複数の流体デポのうちの1つまたは複数の流体デポから、大気との接触から保護されている閉鎖流体経路においてマイクロ流体経路デバイス内の第1の1つまたは複数のリアクターに輸送し、目的の合成遺伝子を第1の1つまたは複数のリアクター内の合成体外転写促進剤カセットに接合して合成生成物を生成させ、この合成生成物は、合成遺伝子および合成体外転写促進剤を含む合成産物を微小流体経路装置内の第2の1つ以上の反応器に輸送し、合成産物から未反応の目的の合成遺伝子および未反応の合成IVT促進剤カセットを除去し、および合成産物を微小流体経路装置内の第3の1つ以上の反応器に輸送して合成産物を増幅して1mM以上の増幅したDNA鋳型を生成するステップ閉経路システムのコントローラにおいて、閉経路システムの1つ以上のセンサから光センサデータを受信するステップであって、コントローラが光センサデータに基づいて閉経路システムの動作を制御するステップを含む、方法を説明する。
例えば、マイクロ流路デバイスと密閉流体連通する複数の流体デポを含むクローズドパスシステムを使用してin vitro転写用の合成二本鎖DNA鋳型を製造する自動化方法は、第1の流体電源回路を使用して、対象の合成遺伝子および合成体外転写（IVT）促進剤カセットを、複数の流体デポのうちの1つまたは複数の流体デポから、大気接触から保護されている閉じた流体経路のマイクロ流体経路プレートデバイスの1つまたは複数の接合反応器へ輸送し、対象の合成遺伝子をIVT促進剤カセットに接合して合成生成物を作製するステップと第2の流体電源回路を用いて、未反応の合成目的遺伝子および未反応の合成体外転写促進剤カセットを、マイクロ流路プレート装置内の合成産物から離して除去すること、第3の流体電源回路を用いて、合成産物をマイクロ流路デバイスの1つ以上の増幅リアクターに移送し、合成産物を増幅して、1mMを超える増幅DNA鋳型を生成すること、および閉経システムのコントローラにおいて、閉経システムの1つ以上の光学センサーから光学センサーデータを受信し、コントローラが光学センサーデータに基づいて第1、第2および第3流体電源回路を制御して、複数の液体デポおよびマイクロ流路デバイスを閉経かつ密封環境に保つことを含む、閉経システム用の制御装置を含むことができる。
これらの方法のいずれにおいても、合成二本鎖DNA鋳型は、細菌DNAを含まず、エンドトキシンを含まないものである。
これらの方法のいずれもが、閉経システムのコントローラにおいて、閉経システムの1つ以上のセンサから光センサデータを受信することを含み得、コントローラが、光センサデータに基づいて閉経システムの動作を制御することを特徴とする。光学センサデータは、カメラまたは他の撮像センサからのデータであってもよい。本明細書に記載の方法は、複数の流体デポとマイクロ流体経路デバイスとの間又はマイクロ流体経路デバイス内で物質を移動させるために、1つ以上の流体動力回路を使用してもよい。コントローラは、光学情報を用いて調整することを含む、流体動力回路の動作を調整してもよい。例えば、コントローラは、流体が閉経路システムの1つ以上の部分（例えば、デポ、流体ライン、及び／又はマイクロ流路センサーの領域（複数可））内にあると判断してもよい。
これらの方法のいずれもが、増幅されたDNA鋳型をマイクロ流路デバイスの1つ以上の消化リアクターに移送し、増幅された合成産物を酵素的に修飾して、二本鎖DNA鋳型を生成することを含んでもよい。
本明細書で使用されるように、合成目的遺伝子と合成in vitro転写促進剤カセットとを接合して合成産物を作成することは、合成線形または環状ライゲーション産物を作成することを含み得る。接合は、ライゲーションを介して、及び／又はハイブリダイゼーション及び／又はアニーリング及び／又はプライマー伸長によるものであってもよい。いくつかの変形例では、合成産物を増幅することは、線状、分枝状または円形の増幅DNA産物を生成することを含み、増幅DNA産物を線形化して二本鎖DNA鋳型を生成することをさらに含む。直鎖化には、DNAリガーゼによるライゲーションまたはプライマー伸長によるライゲーションが含まれ得る。いくつかの変形例では、増幅は、多重置換増幅（MDA）を含む。あるいは、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅を含んでいてもよい。
いくつかの変形例では、合成in vitro転写促進剤カセットは、プロモーター、5'UTR、切断可能リンカー、3'UTR、および少なくとも200個のアデニン残基または200個のチミジン残基が並んでなるポリA領域をコードする部分を含む二鎖DNA鋳型からなる場合がある。二本鎖DNA鋳型は、目的の合成遺伝子の3'末端に少なくとも300bpsの長さのpolyA領域を含んでいてもよい。一般に、体外転写促進因子カセットは、1kb未満の長さであってよい。いくつかの変形例では、合成インビトロ転写促進剤カセットは、抗生物質耐性遺伝子をコードせず、及び／又は複製起点（ORI）を有さない。
また、本明細書では、鋳型物質（上記の鋳型物質を含むが、これに限定されない）を用いて体外転写（IVT）を行い、治療用mRNAを形成する自動化方法および装置についても説明する。例えば、本明細書に記載されるのは、1つ以上のマイクロ流体経路デバイスと密封流体連通して固定されるように構成された複数の流体デポを含むシステムを用いて、インビトロ転写（IVT）反応を自動的に実行する方法及び装置であり、この方法は、複数の流体デポのうちの1つまたは複数の流体デポと、1つまたは複数のマイクロ流体デバイス上の複数の反応器との間で試薬を、大気との接触から保護された閉鎖流体路で輸送し、1つまたは複数のマイクロ流体パスデバイスにおいて鋳型から治療mRNAのインビトロ転写を行い、治療ポリヌクレオチドを精製するステップを包含する。
例えば、マイクロ流体経路デバイスと密封流体連通するように固定されるように構成された複数の流体デポを含むシステムを用いて体外転写（IVT）反応を行う自動化方法であって、該方法は、DNA鋳型、ポリメラーゼ、およびヌクレオチドを1以上からマイクロ流体経路デバイスの1以上のIVTリアクターに送達すること、複数の流体貯蔵所のうちの1つの流体貯蔵所と、マイクロ流体経路デバイス上の部位と、1つ以上のIVTリアクターにおいて、DNA鋳型とヌクレオチドを処理して、治療用mRNAを形成すること、治療用mRNAをマイクロ流体経路デバイスの1つ以上の精製リアクター領域に移送し、1つ以上の精製リアクター領域内で2次元（2D）精製により治療用mRNAを精製するステップであって、マイクロ流体経路デバイスと複数の流体デポが大気への曝露を防ぐ閉経および密封環境を形成する、ステップを含む、方法である。
一般に、システムは、例えば、マイクロ流路デバイス内で1つ以上の弾性層を偏向させることによって試薬を輸送するステップを実行することを含む、これらの方法を実行するためのコントローラを含んでもよい。これらの方法は、システムのコントローラにおいて、システムの1つ以上のセンサから光学センサデータを受信することを含んでもよく、コントローラは、光学センサデータに基づいて、システムの動作を制御する。コントローラはまた、流体デポの加圧を制御してもよい。本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、システムは、システムに着座するマイクロ流体経路デバイスを含んでもよい。
一般に、DNA鋳型は、目的の合成遺伝子の二本鎖DNA鋳型と合成体外転写促進剤カセットから構成されることができる。
これらの方法のいずれもが、コントローラによって制御される1つ以上の流体動力回路を使用して、DNA鋳型、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、および治療用mRNA材料を複数の流体デポとマイクロ流体経路デバイスとの間またはマイクロ流体経路デバイス内で移動させる送達および輸送を含むことができる。例えば、送達ステップ及び運搬ステップは、コントローラの制御下で、方法中に大気接触を避けるために、マイクロ流体経路デバイス内の1つ又は複数の弾性層を偏向させることによって実行されてもよい。
いくつかの変形例では、IVTリアクターが使用され、このIVTリアクターは、それぞれが液体受容部分および圧力受容部分を有する一対の連結したチャンバーを含んでよく、液体受容部分は、圧力受容部分から弾性層によって分離されており、この弾性層は、液体受容部分の容積を調節するために圧力受容部分によって偏向され得る。DNA鋳型は、目的の合成遺伝子の二本鎖DNA鋳型と、合成体外転写促進剤カセットとから構成されていてもよい。
これらの方法のいずれもが、マイクロ流体経路デバイス上の複数の受入ポートと流体連通している複数の流体デポを密封することを含んでもよい。
例えば、マイクロ流体経路デバイスと密封流体連通するように固定されるように構成された複数の流体デポを含むシステムを用いて体外転写（IVT）反応を行う自動化方法は、複数の流体デポを加圧すること、1以上の第1の流体動力回路を用いて、DNA鋳型、ポリメラーゼおよびヌクレオチドの1以上からマイクロリットル未満の精度で計量された量をマイクロ流体経路デバイスの1以上のIVTリアクターに送達すること、複数の流体貯蔵所のうちの1つの流体貯蔵所と、マイクロ流体経路デバイス上の部位と、1つ以上のIVT反応器において、鋳型物質とヌクレオチドを処理して、治療用mRNAを形成すること、1つ以上のIVT反応器において、鋳型物質を処理すること、第2の流体電源回路を用いて、治療用mRNAをマイクロ流体経路デバイスの1つ以上の精製リアクター領域に移送し、1つ以上の精製リアクター領域内で2次元（2D）精製によって治療用mRNAを精製することであり、マイクロ流体経路デバイスおよび複数の流体デポが、大気への曝露を防止する閉経および密封環境を形成していることを含み得る。
前述のように、本明細書には、本明細書に記載されたこれらの方法のいずれかを実行するように構成されたソフトウェア及び／又はファームウェアも記載されている。例えば本明細書に記載されるのは、体外転写（IVT）反応を行うための命令を具体化した非一時的コンピュータ可読媒体であって、1つまたは複数のマイクロ流体経路デバイスと密封流体連通して固定されるように構成された複数の流体デポを含むシステムのコントローラによって実行されると、コントローラが鋳型物質、ポリメラーゼおよびヌクレオチドを、反応中の任意の時間にサブマイクロリットルの精度で計量された量で複数の流体デポからマイクロ流体経路デバイスの第1の反応器に空気圧で供給し、第1の反応器で鋳型物質およびヌクレオチドを処理して治療mRNAを形成させるステップとをコントローラに実行させ、治療用mRNAを空気圧でマイクロ流体経路装置を通して第1の反応器から遠ざけ、ここで、第1のマイクロ流体経路装置および複数の流体デポは、大気暴露を防ぐためにクローズドパスおよび密封環境を形成する方法を行うようにする、ものである。
上述のように、いくつかの変形例において、本明細書に記載の方法及び装置は、治療用ポリヌクレオチド（例えば、治療用mRNA）を送達ビヒクルと自動的に組み合わせることによって、例えば、治療用mRNAを送達ビヒクルでカプセル化するために、治療用組成物を配合（例えば、化合）するために使用されてもよい。これは、本明細書に記載されるような装置内で行われてもよく、いくつかの変形例では、鋳型、および／または治療用ポリヌクレオチドを形成することを含んでもよい。例えば、1つ以上のマイクロ流体経路プレート装置と密封流体連通する複数の流体デポを含むシステムを使用して治療用mRNA組成物を製造する方法であって、1つ以上のマイクロ流体経路プレート装置が複数の反応器を含む方法は、複数の流体デポのうちの1つまたは複数の流体デポから鋳型前駆体材料を複数の反応器のうちの第1の反応器に送達し、鋳型前駆体材料を処理して、鋳型前駆体材料からDNA鋳型を形成すること、DNA鋳型を複数の反応器のうちの第2の反応器に移し、インビトロ転写によってDNA鋳型を処理して治療mRNAを形成することを含むことができ、治療用mRNAを複数の反応器のうちの第3の反応器に移送し、治療用mRNAを処理して送達媒体と結合させて治療用mRNA組成物を形成し、治療用mRNA組成物を第3の反応器と流体連通している濃縮器に移送することを含むことができる。治療用mRNAを第3の反応器に移送することは、複数の異なる治療用mRNAを送達ビヒクルと共に移送し、mRNA組成物を形成することを含んでもよい。送達ステップ及び移送ステップは、コントローラによって制御される、システム内の1つ又は複数の流体動力回路によって実行されてもよい。例えば、コントローラは、1つ又は複数のマイクロ流体経路プレートデバイス内の1つ又は複数の弾性層を偏向させることによって流体動力回路を制御してもよい。本方法は、診療部位で実施されてもよい。
これらの方法（およびそれらを実行するシステム）のいずれも、自動的に、同じマイクロ流路デバイス内で、治療用組成物（例えば、送達ビヒクルでカプセル化されたmRNAの）を透析し、物質を除去し、および／または治療用組成物を濃縮するように構成することができる。例えば、これらの方法のいずれかは、mRNA治療用組成物を精製するために、1つまたは複数のマイクロ流体経路プレート装置内でmRNA治療用組成物を透析することを含んでもよい。任意の適切なナノ粒子を使用してもよい（例えば、アミノ脂質化ペプトイドのような両親媒性ナノ粒子）。
さらに、これらの方法のいずれかが、第2の反応器と流体連通している複数の反応器のうちの1つまたは複数の反応器内での2次元（2D）精製を含んでもよい。
治療用mRNA組成物の製造方法は、特に、既知の技術及び手法と比較して、高速であってもよい。例えば、本明細書に記載の方法は、合成鋳型の形成（例えば、細菌前駆体を使用しないデノボ合成）を含む治療用組成物（治療用mRNA及び送達ビークル）を形成するのに5日以下（例えば、4日以下、72時間以下等）かかる場合がある。
例えば、1つ以上のマイクロ流路プレート装置と密閉流体連通している複数の流体デポを含むシステムを用いて治療用mRNA組成物を製造する方法であって、1つ以上のマイクロ流路プレート装置が複数の反応器を含む、方法は、複数の流体デポを加圧すること、第1の流体電源回路を制御して、複数の流体デポの1つまたは複数の流体デポから鋳型前駆体材料を、サブマイクロリットルの精度で、大気接触なしに、複数のリアクターの第1のリアクターに送ること、鋳型前駆体材料を処理して鋳型前駆体材料からDNA鋳型を形成すること、第2の流体電源回路を制御してDNA鋳型をサブマイクロリットの精度および大気接触なしに複数のリアクターの第2のリアクターへ移動させること、インビトロ転写によりDNA鋳型を処理して治療用mRNAを形成すること、第3の流体電源回路を制御して、治療用mRNAを複数のリアクターのうちの第3のリアクターにサブマイクロリットルの精度で、かつ大気と接触することなく移送すること、治療用mRNAを処理して送達媒体と組み合わせ、治療用mRNA組成物を形成すること、第3の流体電源回路を制御して治療用mRNA組成物を第3のリアクターと流体連通している濃縮器に移送し、治療用mRNA組成物を濃縮することを含むことができる。
本明細書に記載される方法及び装置は、治療用ポリヌクレオチド組成物のオンデマンド合成を提供するために使用され得る。いくつかの変形例では、これらの方法は、成分の一部を遠隔で合成すること、および装置を使用して、次に患者に送達され得る治療用ポリヌクレオチド組成物を局所的に合成することを含み得る。例えば、治療用ポリヌクレオチド組成物をオンデマンドで製造する方法であって、この方法は、ローカル施設で、遠隔施設で合成された治療用ポリヌクレオチドを受け取るステップと、大気との接触から保護されている自動化システムで、治療用ポリヌクレオチドと送達手段とをシステム内に保持されたマイクロ流路装置内で結合させて治療用ポリヌクレオチド組成物を形成する工程、マイクロ流路装置内で治療用ポリヌクレオチド組成物を透析する工程、および治療用ポリヌクレオチド組成物を提供する工程を行うことによりローカル施設で治療用ポリヌクレオチド組成物を製剤化するステップと、を含む。
治療用ポリヌクレオチドの合成は、大気との接触から保護された閉鎖流路装置において、合成鋳型の形成、合成鋳型からのインビトロ転写の実行、および治療用ポリヌクレオチドの精製を行うことにより、遠隔施設のマイクロ流体システムを使用して治療用ポリヌクレオチドを合成することを含み得る。
例えば、治療用mRNA組成物をオンデマンドで製造する方法であって、該方法は、遠隔施設で治療用mRNAを合成するステップと、治療用mRNAを現地施設に輸送するステップと、大気との接触から保護されている自動閉鎖流路装置で、治療用mRNAと送達ビヒクルとをマイクロ流体経路装置内で結合させて治療用mRNA組成物を形成するステップ、治療用mRNA組成物をマイクロ流体経路装置内で透析するステップ、および治療用mRNA組成物を提供するステップを行うことである。ローカル施設は、病院又は診療所であり、典型的には、本明細書に記載されるような1つ又は複数のマイクロ流体制御システムを含むステップを行うことにより現地施設で治療用mRNA組成物を調合するステップとを含む、治療用mRNA組成物を製造する方法である。いくつかの変形例では、遠隔施設は、1つ以上の（例えば、本明細書に記載されるような複数の）マイクロ流体制御システムを含む製造施設であってもよい。
本明細書に記載の方法は、治療用ポリヌクレオチド組成物を濃縮することをさらに含んでもよい。
これらの方法のいずれもが、本明細書に記載のシステムを使用して治療用ポリヌクレオチドを合成し、次いで、低温で保存しながら（例えば、低温および／または冷凍）それらを遠隔施設から現地施設に移送し（例えば、出荷）、現地施設において治療用ポリヌクレオチド（例えば、mRNA）を受領することを含み得る。例えば、治療用ポリヌクレオチド組成物は、mRNAワクチンから構成されてもよい。これらの方法のいずれも、システムを用いて治療用ポリヌクレオチドを製剤化することを含んでもよく、システムは、マイクロ流体経路デバイスと密封流体連通して固定されるように構成された複数の流体デポを含む。
第1の流体動力回路は、治療用ポリヌクレオチドと送達ビヒクルとを結合させるために、複数の流体デポからマイクロ流路デバイスの1つまたは複数の反応器へサブマイクロリットルの精度で、大気接触なしに送達するために使用され得る。
前述のように、これらの治療用組成物のいずれも、同じ（または異なる）送達ビヒクルでカプセル化された複数のmRNA（複数の治療用mRNAを含むがこれに限定されない）を含んでもよい。例えば、局所施設において治療用ポリヌクレオチド組成物を形成することは、1つ以上の追加の治療用ポリヌクレオチドを治療用ポリヌクレオチド及び送達ビヒクルと組み合わせることをさらに含んでもよい。本明細書に記載されるものを含む、任意の適切な送達ビークルが使用されてもよい。治療用ポリヌクレオチドは、線状mRNA、円形RNA、または自己複製RNAなどのmRNAであってもよい。
治療用ポリヌクレオチドは、低温（例えば、4度、0度、-10度など）で方法月（例えば、1ヶ月以上、2ヶ月以上、3ヶ月以上6ヶ月以上8ヶ月以上、9ヶ月以上、1年以上など）安定していてもよく、遠隔またはローカルで保存されてもよい。例えば、これらの方法は、治療用組成物を製剤化する前に、治療用ポリヌクレオチドを局所的な施設で保存することを含んでもよい。
例えば、1つ以上のマイクロ流体経路デバイスと密封流体連通するように固定されるように構成された複数の貯蔵デポを含むクローズドパスシステムを用いてmRNA治療組成物を製造する方法であって、該方法は、複数の貯蔵デポのうちの1つまたは複数の貯蔵デポと、1つまたは複数のマイクロ流体経路デバイス上の複数の反応器との間で試薬を、大気接触から保護された閉じた流体経路で輸送し、1つまたは複数のマイクロ流体経路デバイスにおいて、DNA鋳型の形成、鋳型からの治療mRNAのインビトロ転写、治療mRNAの精製およびmRNAと送達ビークルとを組み合わせる各段階を実行するステップが含まれる方法を包含する。
1つ以上のマイクロ流体経路装置と密封流体連通するように固定されるように構成された複数の貯蔵デポを含むクローズドパスシステム（ここで、1つ以上のマイクロ流体経路装置は、複数の反応器を含む）を用いてmRNA治療組成物を製造する方法は、鋳型前駆体材料を1つ以上の貯蔵デポから複数の反応器の第1の反応器領域に送達し、鋳型前駆体材料を処理して鋳型前駆体材料から鋳型を調製すること、鋳型を複数の反応器の第2の反応器領域に移送し、インビトロ転写によって鋳型を処理して治療用mRNAを形成することを含むことができ、および、治療用mRNAを複数の反応器の第3の反応器領域に移送し、治療用mRNAを処理して送達ビヒクルと組み合わせ、mRNA治療用組成物を形成することであり、鋳型前駆体材料および送達ビヒクルを含む材料が、保管庫から複数の反応器内に大気接触なしに送達されることを含むことができる。
1つ以上のマイクロ流体パスデバイスと密閉流体連通している複数の貯蔵デポを含むクローズドパスシステムを用いたmRNA治療用組成物の製造方法（例えば、ここで、1つ以上のマイクロ流体経路デバイスは、複数のリアクターを含む）は、鋳型前駆体材料を1つまたは複数の貯蔵デポから複数の反応器の第1の反応器領域に送達し、鋳型前駆体材料を処理して鋳型前駆体材料から鋳型を調製するための流体流れの誘導、鋳型を複数の反応器の第2の反応器に移送し、鋳型をインビトロ転写によって処理してmRNAを形成することを含み得、mRNAを複数の反応器の第3の反応器領域に移送し、mRNAを処理して送達ビヒクルと結合させてmRNA治療組成物を形成すること、および1つまたは複数の貯蔵デポのmRNA生成物デポを移送することであって、材料が貯蔵デポからマイクロ流路デバイスの反応器内にサブマイクロリットル精度で、大気接触なく送達されることを含み得る。本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、ステップのいずれかが空気圧で実行されてもよく、例えば、流体流れが空気圧で誘導されてもよく、流体が空気圧で移送されてもよい。代替的に又は追加的に、流体は、機械的、油圧的等によって駆動されてもよい。
これらの方法（及びそれを実行するための装置）のいずれにおいても、クローズドパスシステムは、鋳型を形成するステップ、鋳型から治療用mRNAのin vitro転写を行うステップ、治療用mRNAを精製するステップ、及びmRNAを送達媒体と組み合わせるステップを自動的にかつ連続的に実行することができる。クローズドパスシステムは、鋳型を形成するステップ、鋳型から治療用mRNAのin vitro転写を行うステップ、治療用mRNAを精製するステップ、およびmRNAを送達用ビヒクルと組み合わせるステップの性能を空気圧で制御することができる。いくつかの変形例では、クローズドパスシステムは、1つ以上のマイクロ流路デバイス内の1つ以上の膜を偏向させることによって、鋳型を形成するステップ、鋳型から治療用mRNAのインビトロ転写を行うステップ、治療用mRNAを精製するステップ、及びmRNAを送達ビークルと結合させるステップの性能を空気圧的に制御する。
本明細書に記載される方法及び装置のいずれも、病院、診療所などの医療の現場で設定及び動作するように構成されてもよい。これにより、即時／オンデマンドの患者特異的治療薬を、特定の患者に対してカスタム製造することができる場合がある。代替的または追加的に、特定の患者に特異的でない治療分子は、「患者個別化」の方法で送達ビヒクルと共に製剤化されてもよい。本明細書に記載された方法および装置のため、これらの方法のいずれかを非常に迅速に実行することができる。例えば、クローズドパスシステムは、鋳型を形成するステップ、鋳型から治療用mRNAのin vitro転写を行うステップ、治療用mRNAを精製するステップ、及びmRNAを送達ビヒクルと結合するステップを5日未満で自動的に連続的に実行することができる。あるいは、システムはあらかじめ作られた鋳型を入力として使用し、残りのステップをより短時間で実行することも可能である。
mRNAを送達ビヒクルと組み合わせること（治療薬を製剤化すること）は、mRNA治療用組成物を精製するために1つ以上のマイクロ流路デバイス中で透析することをさらに含んでもよい。
これらの方法のいずれかが、1つ以上のマイクロ流路デバイス上でmRNA治療組成物を濃縮すること、及び／又は治療薬を透析することをさらに含んでもよい。
任意の適切な送達ビークルが使用されてもよく、例えば、両親媒性ナノ粒子が含まれる。例えば、両親媒性ナノ粒子は、アミノ脂質化ペプトイドから構成されてもよい。
代替的または追加的に、本明細書に記載の方法および装置のいずれかにおいて、mRNAは予め作成され、しばらくの間（例えば、10℃、4℃、0℃、-10℃など）保存されてもよい。例えば、これらの方法及びそれを実行するための装置のいずれかが、個別に又は集合的に（例えば、2、3、4、5、6等又はそれ以上の個別の治療用mRNAが組み合わされて、）配合されてmRNA治療組成物を形成してもよい治療用mRNAのライブラリーを含んでもよい。本明細書に記載されるように、mRNA治療用組成物は、したがって、オンデマンドで製造されてもよく、単一または複数のmRNA治療用組成物「カクテル」においてジャストインタイムで配合されてもよい。
また、本明細書では、鋳型（例えば、DNA鋳型）を形成するための方法も記載されている。例えば、マイクロ流路デバイスと密封流体連通している複数の貯蔵デポを含むクローズドパスシステムを使用してin vitro転写のための合成二本鎖DNA鋳型を製造する方法は、目的の合成遺伝子と合成体外転写促進剤カセットとを結合させて合成直鎖状または環状結紮物を作成すること、未反応の目的の合成遺伝子および未反応の合成体外転写促進剤カセットを合成直鎖状または環状結紮物から離すことを含むことができ、円形の結紮産物を増幅して、直線状、分岐状または円形の増幅DNAを生成すること、および増幅DNA結紮産物を線形化して二本鎖DNA鋳型を生成することであり、接合、除去、増幅および線形化の各ステップが、閉経システムによってマイクロ流路デバイス内で実行されることを含むことができる。
例えば、in vitro転写のための合成二本鎖DNA鋳型を作成する高効率で自動化された方法は、空気圧で各々を送達すること、目的の合成遺伝子と合成体外転写促進剤カセットを、マイクロ流体経路デバイスと流体連通している複数の貯蔵デポのうちの1つまたは複数の貯蔵デポから、マイクロ流体経路デバイスのライゲーション反応器に送り、目的の合成遺伝子を合成体外転写促進剤カセットと結合させて合成線形または環状のライゲート生成物を作製するステップと複数の貯蔵所のうちの1つまたは複数の貯蔵所から1つまたは複数のエキソヌクレアーゼ剤をライゲーションリアクターに空気圧で導入し、未反応の合成遺伝子および未反応の合成体外転写促進剤カセットを合成線形または環状のライゲート生成物から遠ざけることにより未反応物を除去するステップと合成線状または環状結紮産物をマイクロ流路デバイスの増幅リアクターに空気圧で送り、線状または環状結紮産物を増幅するための1つまたは複数の増幅剤と組み合わせて、線状、分岐状または環状の増幅DNAを生成すること、増幅されたDNAライゲーション生成物をマイクロ流路デバイスの消化リアクターに空気圧で移送し、増幅されたDNAライゲーション生成物を線形化することにより、未反応の入力材料を含まない完全合成二本鎖DNA鋳型を生成し、ここで、ライゲーションリアクター、増幅リアクターおよび消化リアクターならびに複数の貯蔵デポが、閉経と密封の環境を形成していることを含むことができる。
mRNA治療用組成物のための合成二本鎖DNA鋳型を製造する方法（1つ以上のマイクロ流体経路デバイスと密封流体連通して固定されるように構成された複数の貯蔵デポを含む閉経路システムを使用）は、複数の貯蔵デポのうちの1つまたは複数の貯蔵デポと、1つまたは複数のマイクロ流体経路デバイス上の複数の反応器との間で試薬を、大気との接触から保護された閉じた流体経路で輸送し、1つまたは複数のマイクロ流体経路デバイスにおいて、治療mRNAのインビトロ転写用の鋳型を形成するステップとを含むことができる。
一般に、本明細書に記載される方法及び装置は、細菌DNAを含まない及び／又はエンドトキシンを含まない二本鎖DNA鋳型を生成し得る。本明細書に記載される鋳型生成方法及び装置は、細菌培養を伴わない場合がある。さらに、本明細書に記載されるように製造された治療用mRNAは、細菌ポリヌクレオチドを使用せずに、鋳型から合成されてもよい。したがって、本明細書に記載される方法のいずれかは、細菌DNAを使用せずに、及び／又はエンドトキシンから分離された治療用mRNAを製造するための方法であってもよい。特に、本明細書に記載されるのは、細菌DNA及び／又はエンドトキシンを含まない二本鎖DNA鋳型を製造する方法である。本明細書に記載される方法のいずれもが、無菌製造方法であってもよい。
これらの方法のいずれもが、合成体外転写鋳型をタイプIIS制限酵素およびまたはメチル化感受性制限酵素で消化することを含むことができる。結合は、DNAリガーゼによるライゲーション、DNA合成によるライゲーション、プライマー伸長によるライゲーションを含んでもよい。除去は、線状DNAをエキソヌクレアーゼで消化すること、またはメチル化感受性制限酵素で消化することを含んでいてもよい。増幅は、多重置換増幅（MDA）を含んでもよい。増幅は、Φ29DNAポリメラーゼで増幅することを含んでいてもよい。増幅することは、分岐した増幅DNAを生成することを含んでいてもよい。増幅は、ポリメラーゼ連鎖増幅（PCR）を含んでもよい。増幅は、耐熱性DNAポリメラーゼで増幅することを含んでもよい。
線状化は、タイプIIs制限酵素で消化することを含んでいてもよい。直鎖化は、BsaI制限酵素で消化することを含んでもよい。合成体外転写鋳型の消化は、DpnIなどのメチル化感受性制限酵素で消化することを含んでもよい。目的の合成遺伝子は、直鎖状であってもよい。いくつかの変形例では、合成in vitro転写促進剤カセットは、プロモーター、5'UTR、切断可能なリンカー、3'UTR、および少なくとも200個のアデニン残基または200個のチミジン残基が並んでなるポリA領域をコードする部分を含む二鎖DNA鋳型で構成される。合成in vitro転写促進剤カセットは、単一ユニットとして、または2つ以上のユニットとして送達され得る。ポリA領域をコードする部分は、少なくとも300bpsの長さであってよい。いくつかの変形例では、polyA領域をコードする部分は、少なくとも350bpsの長さであってもよい。
目的の合成遺伝子は、T細胞受容体の少なくとも一部を含むものであってもよい。目的の合成遺伝子は、相補性決定領域（CDR）を含んでいてもよい。
in vitro転写促進剤カセットは、2kb以下の長さであってもよい。in vitro転写ファシリテーターカセットは、長さが1kb未満であるかもしれない。インビトロ転写促進因子カセットは、長さが700塩基対未満であってもよい。合成体外転写促進因子カセットは、抗生物質耐性遺伝子をコードしていない可能性がある。
合成直鎖状または環状のライゲーション生成物は、複製起点（ORI）を有していない場合がある。in vitro転写促進カセットは、複製起点（ORI）を持たない場合がある。
前述のように、本明細書に記載される方法のいずれかのステップは、閉じたマイクロ流体経路デバイスにおいて実行されてもよい。ステップは、閉じたマイクロ流路デバイスにおいて実行されてもよく、接合ステップは、増幅ステップとは異なるモジュール（例えば、異なるマイクロ流路デバイス）において実行されてもよく、増幅ステップは、線形化ステップとは異なるモジュールにおいて実行される。
これらの方法のいずれもが、1つまたは複数のマイクロ流路デバイスの閉じた経路において、鋳型を精製することを含み得る。
また、本明細書では、本明細書に記載のクローズドパス法及び装置を用いてin vitro転写を行う方法について説明する。例えば、クローズドパスシステムを使用してインビトロ転写（IVT）反応を実行する方法（例えば、1つ以上のマイクロ流体経路デバイスと密閉流体連通して固定されるように構成された複数の貯蔵デポを含む）は、1つ以上のマイクロ流体経路デバイス内の鋳型から治療用mRNAのインビトロ転写を行うために、複数の貯蔵デポのうちの1つ以上の貯蔵デポと、大気接触から保護されている閉鎖流路の1つ以上のマイクロ流体デバイス上の複数のリアクタの間で試薬を搬送することを含み得る。
体外転写（IVT）反応を実行する方法は、DNA鋳型、ポリメラーゼ、およびヌクレオチドを、マイクロ流体経路デバイスの第1の反応器に、マイクロリットル以下の精度で計量された量で複数の貯蔵デポから自動的に供給すること、第1の反応器で鋳型材料およびヌクレオチドを処理して治療mRNAを形成すること、および治療mRNAをマイクロ流体経路デバイスを通して第1の反応器から空気圧で移送し、ここで第1のマイクロ流体経路デバイスおよび複数の貯蔵デポが閉経した環境を形成し、大気への曝露を防止することを含み得る。
クローズドパスシステムは、自動的かつ連続的に動作することができる。クローズドパスシステムは、鋳型からの治療用mRNAのin vitro転写の性能を空気圧で制御してもよい。
これらの方法のいずれもが、1つ以上のマイクロ流体デバイスにおいて治療用mRNAを精製することを含むこともできる。試薬を輸送することは、試薬を複数の貯蔵デポからマイクロ流体経路デバイスの第1のリアクターに輸送することを含んでもよい。
また、本明細書には、治療用mRNAを製剤化する（例えば、送達ビヒクルと組み合わせる）方法が記載されている。例えば、mRNA治療用組成物を製造する方法（例えば、1つ以上のマイクロ流体経路デバイスと密封流体連通するように固定されるように構成された複数の貯蔵デポを含む閉経路システムを用いて）は、1つ以上のマイクロ流体経路デバイスにおいて治療用mRNAを送達ビークルと組み合わせることによってmRNA治療用組成物を処方するために、大気との接触から保護された閉経路で複数の貯蔵デポの1つ以上の貯蔵デポと1つ以上のマイクロ流体デバイス上の複数のリアクタの間に試薬を搬送することを含む場合がある。閉経路システムは、mRNAを送達ビヒクルと自動的に連続的に結合させることができる。クローズドパスシステムは、mRNAを送達媒体と結合させることを空気圧で制御してもよい。例えば、クローズドパスシステムは、1つ以上のマイクロ流路デバイス内の1つ以上の膜を偏向させることによって、mRNAを送達ビークルに結合させることを空気圧的に制御してもよい。
mRNAと送達ビヒクルとを組み合わせることは、mRNA治療用組成物を精製するために1つ以上のマイクロ流路装置内で透析すること、及び／又は1つ以上のマイクロ流路装置上でmRNA治療用組成物を濃縮することを更に含んでいてもよい。
例えば、本明細書では、1つ以上のマイクロ流路デバイスと密封流体連通するように固定された複数の貯蔵デポを含むシステムを用いてmRNAを製造する方法について説明する。これらの方法のいずれかが、1つ以上のマイクロ流体経路デバイスにおいて、鋳型を形成するステップ、鋳型からmRNAのインビトロ転写を行うステップ、及びmRNAを精製するステップのうちの1つ以上を実行するために、複数の貯蔵デポのうちの1つ以上の貯蔵デポと1つ以上のマイクロ流体デバイス上の複数のリアクターとを大気接触から保護されている閉鎖流路で試薬を輸送することを含むことができる。
1つ以上のマイクロ流体経路デバイスと密封流体連通するように固定されるように構成された複数の貯蔵デポを含むシステムを用いて治療用mRNA組成物を製造する方法は、複数の貯蔵デポのうちの1つまたは複数の貯蔵デポと、1つまたは複数のマイクロ流体経路デバイス上の複数の反応器との間で試薬を、大気接触から保護された閉鎖流体経路で輸送し、1つまたは複数のマイクロ流体経路デバイスにおいて、鋳型を形成し、鋳型から治療用mRNAのインビトロ転写を行い、治療用mRNAを浄化し、mRNAを送達手段で製剤化する工程のうちの1つまたは複数を実行することを含むことができる。
1つ以上のマイクロ流体経路デバイスと密閉流体連通して固定されるように構成された複数の貯蔵デポを含むシステムを用いて治療用mRNA組成物を製造する方法は、1つ以上のマイクロ流体経路デバイスで、鋳型の形成、鋳型からの治療用mRNAのin vitro転写、治療用mRNAの精製、送達ビヒクルによるmRNAの調合、および調合された治療用mRNAの透析と濃縮を行うステップのうちの1つ以上を1つ以上のマイクロ流体経路デバイスで行うことを実行するために、複数の貯蔵デポの1つ以上の貯蔵デポと、1つ以上のマイクロ流体デバイス上の複数のリアクターとを大気接触から保護されている閉鎖流路で試薬類を輸送すること、を含んでもよい。
1つ以上のマイクロ流体経路装置と密封流体連通するように固定されるように構成された複数の貯蔵デポを含むシステムを用いて治療用mRNA組成物を製造する方法は、非一過性のコンピュータ可読媒体にコード化されている治療用mRNA組成物を形成するための一連のステップに従うことを含み、該ステップは複数の貯蔵デポのうちの1つまたは複数の貯蔵デポと、1つまたは複数のマイクロ流体経路デバイス上の複数の反応器との間で試薬を、大気接触から保護された閉鎖流体経路で輸送し、1つまたは複数のマイクロ流体経路デバイスにおいて、以下のステップのうちの1つまたは複数を実行すること、鋳型の形成、鋳型からの治療mRNAのインビトロ転写の実行、治療mRNAの精製、およびmRNAと送達ビークルとを結合するステップを含むことができる。
また、本明細書では、マイクロ流体経路装置と密封流体連通して固定されるように構成された複数の貯蔵デポを含むシステムを用いて治療用mRNA組成物を製造する方法であって、マイクロ流体経路装置上で鋳型から治療用mRNAのインビトロ転写を行い、マイクロ流体経路装置上の一つ以上の流動的に接続されたリアクターで治療用mRNAを精製することを含む、方法が記載されている。
また、本明細書では、これらの方法のいずれかによって製造された治療薬、特にmRNA治療薬について説明する。例えば、本明細書に記載されるのは、1つ以上のマイクロ流体経路デバイスと密封流体連通して固定されるように構成された複数の貯蔵デポを含むシステムを使用して作られた治療用mRNAであり、mRNAは複数の貯蔵デポのうちの1つまたは複数の貯蔵デポと、1つまたは複数のマイクロ流体経路デバイス上の複数の反応器との間で試薬を、大気との接触から保護された閉鎖流体経路で輸送し、1つまたは複数のマイクロ流体経路デバイスにおいて、鋳型を形成するステップ、鋳型からmRNAのインビトロ転写を行うステップ、およびmRNAを精製するステップ、のうちの1つまたは複数を実行するようにして作られる。
例えば、本明細書に記載されるのは、1つ以上のマイクロ流体経路デバイスと密封流体連通するように固定されるように構成された複数の貯蔵デポを含むシステムを使用して作られた治療用mRNAであり、mRNAは複数の貯蔵デポのうちの1つまたは複数の貯蔵デポと、1つまたは複数のマイクロ流体経路デバイス上の複数の反応器との間で試薬を、大気との接触から保護された閉鎖流体経路で輸送し、1つまたは複数のマイクロ流体経路デバイスにおいて、鋳型を形成するステップ、鋳型から治療mRNAのインビトロ転写を行うステップ、治療mRNAを浄化するステップ、およびmRNAを送達手段で製剤するステップ、のうちの1つまたは複数を実行するようにして作られる。
例えば、本明細書に記載されるのは、1つ以上のマイクロ流体経路デバイスと密閉流体連通して固定されるように構成された複数の貯蔵デポを含むシステムを使用して製造される治療用mRNAであり、1つ以上のマイクロ流体経路デバイスにおいて、鋳型の形成、鋳型からの治療用mRNAのin vitro転写、治療用mRNAの精製、送達ビヒクルによるmRNAの調合、および調合された治療用mRNAの透析および濃縮を行うステップのうちの1つまたは複数を、1つまたは複数のマイクロ流体経路デバイスで行うことのうちの1つ以上を実行するために、複数の貯蔵デポの1つ以上と、大気接触から保護されている閉鎖流路における1つ以上のマイクロ流体デバイスの複数のリアクターとを試薬を輸送して行われる、mRNAである。
本明細書では、1つまたは複数のマイクロ流体経路デバイスと密封流体連通して固定されるように構成された複数の貯蔵デポを含むシステムを使用して形成される治療用mRNA組成物であって、非一過性のコンピュータ読み取り可能媒体にコード化されている治療用mRNA組成物を形成するための一連のステップに従い、該ステップは複数の貯蔵デポのうちの1つまたは複数の貯蔵デポと、1つまたは複数のマイクロ流体経路デバイス上の複数の反応器との間で試薬を、大気接触から保護された閉鎖流体経路で輸送し、1つまたは複数のマイクロ流体経路デバイスにおいて、鋳型の形成、鋳型からの治療mRNAのインビトロ転写の実行、治療mRNAの浄化、およびmRNAと送達ビークルの結合のステップのうちの1つまたは複数を実行することを含む、方法によって、説明する。例えば、治療用mRNAは、マイクロ流体経路デバイスと密封流体連通するように固定されるように構成された複数の貯蔵デポを含むシステムを用いて形成された治療用mRNA組成物であってもよく、この方法は、マイクロ流体経路デバイス上で鋳型から治療用mRNAのin vitro転写を行うことと、マイクロ流体経路デバイス上の1つまたは複数の流体連通するリアクターで治療用mRNAを精製することとを含む。
本明細書に記載されたシステムのいずれもが、これらの方法のいずれかを実行するように構成されたコントローラを含むことができる。したがって、本明細書に記載される方法のいずれかを実行するように構成されたソフトウェア、ファームウェア、またはハードウェアもまた、本明細書に記載される。例えば、本明細書に記載されるのは、mRNAを製造するための命令を具現化した非一時的コンピュータ可読媒体であって、1つ以上のマイクロ流体経路デバイスと密封流体連通して固定されるように構成された複数の貯蔵デポを含むシステムのコントローラによって実行されると、コントローラに複数の貯蔵デポのうちの1つまたは複数の貯蔵デポと、1つまたは複数のマイクロ流体経路デバイス上の複数の反応器との間で試薬を、大気との接触から保護された閉鎖流体経路で輸送し、1つまたは複数のマイクロ流体経路デバイスにおいて、鋳型を形成するステップ、鋳型からmRNAのインビトロ転写を行うステップ、およびmRNAを精製するステップ、のうちの1つまたは複数を実行させるステップを実行させるものである。
例えば、本明細書に記載されるのは、治療用mRNA組成物を含むmRNAを製造するための命令を具体化した非一時的コンピュータ可読媒体であって、1つ以上のマイクロ流体経路デバイスと密封流体連通して固定されるように構成された複数の貯蔵デポを含むシステムのコントローラによって実行されると、コントローラに本明細書に記載の方法のいずれかを実施させるものである。
また、本明細書では、1つ以上のマイクロ流体経路デバイスと密閉流体連通して固定されるように構成された複数の貯蔵デポを含む閉経路システムを用いてmRNAの合成二本鎖DNA鋳型を作成する方法であって、大気接触から保護されている閉経路で複数の貯蔵デポの1つ以上の貯蔵デポと1つ以上のマイクロ流体デバイス上の複数のリアクター間で試薬を輸送して試薬を結合し、治療mRNAの体外転写用鋳型を形成することを含み得る方法が記載されている。
例えば、クローズドパスシステムを使用してmRNAのin vitro転写反応への入力として使用するための合成二本鎖DNA鋳型を製造する方法は、1つ以上のマイクロ流体経路デバイスと密封流体連通して固定されるように構成された複数の貯蔵デポを含み得、この方法は、複数の貯蔵デポのうちの1つまたは複数の貯蔵デポと、1つまたは複数のマイクロ流体デバイス上の複数の反応器との間で試薬を、大気との接触から保護された閉じた流体路で輸送し、治療用mRNAのインビトロ転写のための鋳型を形成するステップとを含む。
1つ以上のマイクロ流路デバイスと密封流体連通するように固定されるように構成された複数の貯蔵デポを含むシステムを用いてmRNA組成物を製造する方法であって、1つ以上のマイクロ流路デバイスが複数のリアクターを含む、鋳型前駆体材料を1つ以上の貯蔵デポから複数の反応器の第1の反応器領域に送達し、鋳型前駆体材料を処理して鋳型前駆体材料から鋳型を調製すること、鋳型を複数の反応器の第2の反応器領域に移送し、鋳型をインビトロ転写によって処理してmRNAを形成させること、およびmRNAを複数の反応器の第3の反応器領域に移送し、mRNAを処理して送達ビヒクルと結合させてmRNA組成物を形成し、鋳型材料および送達ビヒクルを含む材料が、保管庫から複数の反応器内に大気圧接触なしで送達される方法が含まれ得る。
1つ以上のマイクロ流路デバイスと密閉流体連通している複数の貯蔵デポを含むシステムを用いてmRNA組成物を製造する方法であって、1つ以上のマイクロ流路デバイスが複数の反応器を含み、鋳型前駆体材料を1つまたは複数の貯蔵デポから複数の反応器の第1の反応器領域に空気圧で送達し、鋳型前駆体材料を処理して鋳型前駆体材料から鋳型を調製すること、鋳型を複数の反応器の第2の反応器に空気圧で移送し、鋳型をインビトロ転写によって処理してmRNAを形成すること、およびmRNAを複数のリアクターの第3のリアクター領域に空気圧で移送し、mRNAを処理して送達媒体と結合させて治療用mRNA組成物を形成し、およびmRNA生成物を1つまたは複数の保管庫に移送し、材料が保管庫からマイクロ流路デバイスのリアクターにマイクロリットル以下の精度で、大気接触なく送達される、方法を含むことができる。
マイクロ流路デバイスと密閉流体連通している複数の貯蔵デポを含むクローズドパスシステムを使用してin vitro転写用の合成二本鎖DNA鋳型を製造する方法であって、目的の合成遺伝子と合成体外転写促進剤カセットとを結合させて合成直鎖状または環状結紮物を作成すること、未反応の目的の合成遺伝子および未反応の合成体外転写促進剤カセットを合成直鎖状または環状結紮物から除去すること、線状または環状の結紮産物を増幅して、線状、分岐状または環状の増幅DNAを生成すること、および増幅DNA結紮産物を線形化して二本鎖DNA鋳型を生成することであり、接合、除去、増幅および線形化の各ステップが、クローズパス系によってマイクロ流路デバイス内で実行されることを含むことができる。
これらの方法はいずれも、in vitro転写用の合成二本鎖DNA鋳型を作成するための高効率で自動化された方法を含む、高能率な方法であってよい。例えば、方法は、空気圧で各々を送達すること、目的の合成遺伝子と合成体外転写促進剤カセットを、マイクロ流体経路デバイスと流体連通している複数の貯蔵デポのうちの1つまたは複数の貯蔵デポから、マイクロ流体経路デバイスのライゲーション反応器に送り、目的の合成遺伝子を合成体外転写促進剤カセットと結合させて合成線形または環状ライゲート生成物を作製するステップ、複数の貯蔵所のうちの1つまたは複数の貯蔵所から1つまたは複数のエキソヌクレアーゼ剤をライゲーションリアクターに空気圧で導入し、未反応の合成遺伝子および未反応の合成体外転写促進剤カセットを合成線形または環状のライゲート生成物から遠ざけることによって未反応物を除去するステップと合成線状または環状結紮産物を、マイクロ流路デバイスの多重置換増幅（MDA）またはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）反応器に空気圧で送り、線状または環状結紮産物を増幅するための1つまたは複数の増幅剤と結合して、線状、分岐状または環状の増幅DNAを生成し、増幅されたDNAライゲーション生成物をマイクロ流路デバイスの消化リアクターに空気圧で移送し、増幅されたDNAライゲーション生成物を線形化して二本鎖DNA鋳型を生成し、ライゲーションリアクター、MDAまたはPCRリアクターおよび消化リアクターならびに複数の保管庫が閉経した密閉環境を形成し、ここで、ライゲーションリアクターは、マイクロ流路デバイスの消化リアクターに空気圧で移送されることを含むことができる。
インビトロ転写のための合成二本鎖DNA鋳型の製造方法であって、非一過性のコンピュータ可読媒体にコード化されている一連のステップに従うことを含む方法であって、各々を送達すること、目的の合成遺伝子および合成体外転写促進剤カセットを、マイクロ流体経路装置と流体連通している複数の貯蔵デポのうちの1つまたは複数の貯蔵デポから、マイクロ流体経路装置のライゲーションリアクターに送り、目的の合成遺伝子を合成体外転写促進剤カセットに接合することによって合成線形または環状のライゲーション生成物を作製するステップと複数の貯蔵所のうちの1つまたは複数の貯蔵所から1つまたは複数のエキソヌクレアーゼ剤をライゲーションリアクターに導入し、未反応の合成遺伝子および未反応の合成体外転写促進剤カセットを合成線形または環状のライゲート生成物から遠ざけて未反応物を除去するステップと合成線状または環状結紮産物をマイクロ流路デバイスの多重置換増幅（MDA）またはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）リアクターに送り、線状または環状結紮産物を増幅するための1つまたは複数の増幅剤と組み合わせて、線状、分岐状または環状の増幅DNAを生成するステップである。増幅されたDNAライゲーション生成物をマイクロ流路デバイスの消化リアクターに移送し、増幅されたDNAライゲーション生成物を線形化することによって二本鎖DNA鋳型を生成し、ここで、ライゲーションリアクター、MDAリアクターおよび消化リアクターならびに複数の貯蔵デポが、クローズパスおよび密閉環境を形成していることを含み得る。
1つ以上のマイクロ流体経路デバイスと密閉流体連通して固定されるように構成された複数の貯蔵デポを含むシステムを用いて体外転写（IVT）反応を行う方法は、1つ以上のマイクロ流体経路デバイス内の鋳型から治療mRNAの体外転写を行うために、大気接触から保護されている閉鎖流路で複数の貯蔵デポの1つ以上の貯蔵デポと1つ以上のマイクロ流体デバイス上の複数のリアクター間で試薬を輸送することを含み得る。
また、本明細書では、体外転写（IVT）反応を行う方法であって、非一過性のコンピュータ可読媒体にコード化されている一連のステップに従うことを含み、鋳型物質、ポリメラーゼおよびヌクレオチドを、反応中の任意の時間にサブマイクロリットルの精度で計量された量で複数の貯蔵デポからマイクロ流体経路デバイスの第1の反応器に空気圧で供給し、第1の反応器で鋳型物質およびヌクレオチドを処理して治療mRNAを形成し、この治療mRNAは治療用mRNAを空気圧でマイクロ流体経路装置を通して第1の反応器から遠ざける。ここで、第1のマイクロ流体経路装置および複数の保管庫は、大気暴露を防ぐためにクローズドパスおよび密閉された環境を形成するステップを含む方法が記載されている。
また、本明細書では、in vitro転写（IVT）反応を行う方法であって、非一過性のコンピュータ可読媒体にコード化されている一連のステップに従うことを含み、誘導流体流によって、鋳型材料、ポリメラーゼ、およびヌクレオチドを、ステップのシーケンスに従ってコントローラによって制御される量の複数の貯蔵デポからマイクロ流体経路デバイスに送達し、鋳型材料およびヌクレオチドを1以上のリアクターで処理して治療mRNAを形成し、治療mRNAを1以上のリアクターから離れてマイクロ流体経路デバイスを介して移送し、第1のマイクロ流体経路デバイスおよび複数の貯蔵デポが閉経および密封環境を形成して大気への曝露を防止する、ことを含む方法が記載されている。
また、本明細書では、体外転写（IVT）反応を行う方法であって、該方法は、鋳型物質、ポリメラーゼ、およびヌクレオチドを、予めプログラムされたソフトウェアコマンドによって制御される量の複数の貯蔵デポからマイクロ流体経路デバイスに誘導流体流によって送達し、鋳型物質およびヌクレオチドをマイクロ流体経路デバイスの第1の1以上のリアクターで処理して、治療mRNAを形成すること治療用mRNAを、マイクロ流路デバイスを通して、第1の1つ以上の反応器から離れ、mRNAの精製に適合した第2の1つ以上の反応器に移送することであり、マイクロ流路デバイスおよび複数の貯蔵デポが、大気暴露を防ぐために閉経および密封環境を形成する、方法を含む。
また、本明細書では、in vitro転写（IVT）反応を行う方法であって、非一過性のコンピュータ可読媒体にコード化されている一連のステップに従うことを含み、鋳型材料、ポリメラーゼ、およびヌクレオチドを、ステップのシーケンスによって制御される量で、複数の貯蔵デポから第1のマイクロ流体経路デバイスの第1の1つまたは複数のリアクターに誘導流体流によって送達し、第1の1つまたは複数のリアクターで鋳型材料およびヌクレオチドを処理して治療mRNAを形成し、さらに、第1のマイクロ流体経路デバイスの複数のリアクターに、ステップのシーケンスに基づいて鋳型材料、ポリメラーゼ、およびヌクレオチドを送達するステップ治療用mRNAを、第1のマイクロ流路デバイスを通して、第1の1つ以上の反応器から離れ、mRNAの精製に適合した第2の1つ以上の反応器に移送すること、およびmRNA治療薬の処方を完了するために、このように精製されたmRNAを移送すること、第1のマイクロ流路デバイスおよび複数の貯蔵デポが、大気暴露を防ぐために閉経と密封環境を形成している方法が記載されている。
また、本明細書では、in vitro転写（IVT）反応を行う方法であって、非一過性のコンピュータ可読媒体にコード化されている一連のステップに従うことを含み、鋳型物質、ポリメラーゼおよびヌクレオチドを、複数の貯蔵デポから第1のマイクロ流体経路装置の第1の1つまたは複数のリアクターに空気圧で送達し、第1の1つまたは複数のリアクターで鋳型物質およびヌクレオチドを処理して治療mRNAを形成し、治療mRNAを第1の1つまたは複数のリアクターから離れ、mRNAの精製に適応した第2の1つまたは複数のリアクターに第1のマイクロ流体経路装置を通じて移動させるステップとを含み、精製されたmRNAを第3の1つ以上の反応器に移送して、精製されたmRNAを1つ以上の送達媒体と組み合わせてmRNA治療薬を形成するステップであって、第1のマイクロ流路デバイスおよび複数の貯蔵デポが、大気暴露を防ぐために閉経および密封環境を形成する、ステップとが含まれる方法が記載されている。
例えば、本明細書では、in vitro転写（IVT）反応を行う方法も記載されており、この方法は、非一過性のコンピュータ可読媒体にコード化されている一連のステップに従うことを含み、このステップは、鋳型材料、ポリメラーゼ、およびヌクレオチドを、複数の貯蔵デポから第1のマイクロ流体経路デバイスの第1の1つ以上の反応器に空気圧で送達するステップ、第1の1つ以上の反応器において鋳型材料およびヌクレオチドを処理して治療mRNAを形成するステップ、および治療mRNAを第1のマイクロ流体経路デバイスを通して第1の1つ以上の反応器から離れ、セルロースからなりmRNAの精製に適応した第2の1つ以上の反応器に移動させるステップ、精製されたmRNAを第3の1つ以上の反応器に移送して、精製されたmRNAを1つ以上の送達媒体と結合させてmRNA治療薬を形成するステップであって、第1のマイクロ流路デバイスおよび複数の貯蔵デポが、大気への曝露を防止するために閉経および密封環境を形成するステップとが含まれる。
また、本明細書では、1つ以上のマイクロ流体経路デバイスと密閉流体連通して固定されるように構成された複数の貯蔵デポを含むシステムを用いて治療用mRNA組成物を製造する方法であって、1つ以上の治療用mRNAを1つ以上のマイクロ流体経路デバイス内の送達ビークルと組み合わせることにより治療用mRNA組成物を形成するために、大気接触から保護されている閉鎖流路で複数の貯蔵デポの1つ以上と1つ以上のマイクロ流体デバイス上の複数のリアクター間で試薬を搬送する工程を含む方法について記載されている。
1つ以上のマイクロ流体経路デバイスと密封流体連通するように固定されるように構成された複数の貯蔵デポを含むシステムを使用して、オンデマンドで治療用mRNA組成物を製造する方法は、複数の貯蔵デポのうちの1つまたは複数の貯蔵デポと、1つまたは複数のマイクロ流体経路デバイス上の複数の反応器との間で試薬を、大気との接触から保護された閉鎖流体経路で輸送し、1つまたは複数のマイクロ流体経路デバイスにおいて、鋳型を形成するステップ、鋳型から治療用mRNAのインビトロ転写を行うステップ、治療用mRNAを浄化するステップ、およびmRNAを送達手段で製剤するステップのうち1つまたは複数を実行するステップを含むことができる。
これらの方法及び装置のいずれもが、医療現場で操作（例えば、治療用mRNAの製造）されてもよい。これらの方法および装置のいずれもが、迅速かつ連続的に実行されてもよく、例えば、治療薬は72時間未満で製造される。
前述のように、これらの方法および装置のいずれかにおいて、形成された（例えば、IVTによって）ポリヌクレオチドは、マイクロ流体制御装置の自動制御下で、マイクロ流路装置内において、送達ビークルと結合される前および後に精製されてもよい。
特に、本明細書に記載されるのは、作製プロセスの一部として、1つ以上の標的物質（例えば、二本鎖RNAなど）を除去してもよく、かつ／または1つ以上の追加物質（例えば、凍結乾燥物質）を治療材料に追加してもよい浸透性挿入材料との使用に適合した1つ以上のマイクロ流路装置を含み得る方法及び装置である。透過性インサート材料は、マイクロ流体経路デバイスの1つ又は複数の流体接触チャンバ内に保持されるように構成されてもよく、現像治療溶液が透過性インサート材料を通過するように適合されてもよい。透過性インサート材料は、チャンバ内の弾性膜によって操作され得るように、圧縮性、及び／又は変形性、及び／又は弾性であってよい。透過性インサートは、透過性であり、固体、粒状、ゲルなどである改質材料を含むカバー（例えば、外カバー）を含んでもよい。いくつかの変形例では、透過性インサート材料は、溶液からdsRNAを選択的に除去するように構成されたセルロース材料である。
透過性材料は、多孔質であってもよい（例えば、細孔を含んでもよい）。いくつかの変形例では、透過性材料は、繊維状であってもよいし、層状であってもよい。例えば、透過性材料は、繊維状であってもよく、流体が移動できるチャネルを含んでもよい。いくつかの変形例では、流体に対して透過性であることを可能にするために、透過性材料を介してチャネルが形成されてもよい。例えば、透過性材料は、レーザーによって形成されたチャネル、又は内部容積が流体に対してアクセス可能にされ得る他の任意の手段を有してもよい。いくつかの変形例では、透過性材料は、層間または層間を流体が通過できるように配置された複数の層から形成されてもよい。表面のみがアクセス可能な材料の複数の薄層を一緒に積み重ねてもよい。例えば、機能化グラフェンは、（例えば、極端に言えば、単原子層まで）積層されていてもよい。別の例として、エアロゲルのスライスを処理するなどして吸収性を持たせ、積層してインサートの透過性材料を形成することもできる。
本明細書に記載されるいずれの透過性材料においても、材料は、場合によっては予め定められた流量及び／又は流動抵抗で流体の通過を可能にするように構成された予備成形材料であってよい。材料の透過性は、本明細書に記載される処理流量及び流体圧力で装置チャンバ又はチャネル内に保持されたときに、透過性インサートを通る流れを可能にするように選択されてもよい。上述したように、予め形成された透過性材料は、多孔質、繊維質であってもよく、層の積み重ねであってもよく、これらの材料のいずれかは、材料を結合するために官能化されてもよい。本明細書で使用されるように、機能化された材料は、材料の表面が、標的材料を特異的に結合する化合物、薬剤、または官能基の添加によって修飾された任意の材料を含み得る。材料はまた、またはその代わりに、材料の特定の特性を変えるために特定の原子分子基を付着させる表面処理によって官能化されることもある。機能化は、望ましい材料を表面に結合させるために表面化学を利用する技術を含む、湿式化学、または蒸気、ガス、および／またはプラズマ化学、および／またはマイクロ波アシスト化学技術などの様々な表面改質技術によって実施することができる。同様の技術は、材料を修飾するため、例えば、材料を「活性化」するために使用することができる。
浸透性材料は、装置内の挿入物の総表面積を最大にし、不要な不純物、及び／又は標的生成物の選択的結合を可能にするように構成されてもよい。これらの透過性材料はいずれも、溶液中の物質との効果的な結合のために、予備成形材料の内部への溶液の十分な浸透を提供するように構成されてもよい。いくつかの変形例では、透過性材料は、複数のプリフォームからなり、各プリフォームは、マイクロ流路デバイス内のチャネル又はキャンバーよりも大きく、これらのプリフォームの各々は、機能的活性物質への溶液の曝露を最大化するために、依然として内部への溶液の浸透を可能にすることができる。
上述のように、本明細書に記載の透過性インプラントインサートは、溶液から不純物（例えば、不要な材料）を除去するように構成されてもよく、代替的または付加的に、透過性インプラントは、（例えば、洗浄後などに）溶出され得るように、所望の材料に解放可能に結合するように構成されてもよい。
上述のように、本明細書に記載の方法及び装置は、治療薬を形成する溶液を改変するように構成された1つ以上の透過性インサートを含むマイクロ流体経路デバイスの使用を含んでもよい。透過性インサートは、本明細書に記載されるマイクロ流体経路デバイス内で使用するように適合されてもよい。
例えば、本明細書で説明するのは、チャンバーの流体接触側内に適合するように構成された透過性インサートである。したがって、透過性インサートは、チャンバの流体接触側の全部又は一部（例えば、断面領域）内の容積に実質的に適合するような大きさ及び／又は形状であってよい。上述のように、透過性材料は、単一の予備成形インプラントであってもよいし、透過性インプラントを形成する多数の予備成形材料の組合せであってもよい。透過性インプラントは、一般に、材料内への、および材料を通しての溶液の流れを許容してもよい。いくつかの変形例では、透過性インプラントはまた、圧縮可能（例えば、「スクイーズ可能」）であって、マイクロ流路装置が透過性インプラントを挿入したチャンバを圧縮するときに透過性インプラント内からの流体の除去を可能にするものであってもよい。いくつかの変形例では、透過性インプラントは、圧縮された後に拡張された形状を戻すのに十分な弾性を有する。
透過性インサート及びマイクロ流路デバイスは、流体、特に治療用組成物を生成するために使用されている材料が、処理中に必然的に透過性インサートを通過するように構成されてもよい。いくつかの変形例では、透過性インサートは、圧縮可能な材料及び／又は弾性的に変形可能な材料（例えば、弾性）であり、チャンバの流体接触側をチャンバの圧力受容側から分離する弾性材料（例えば、弾性層）を偏向させることによって流体接触チャンバの容積が変化すると変形する可能性のあるものである。いくつかの変形例では、透過性インサートは圧縮可能であるが、必ずしも弾性的に変形可能である必要はない。いくつかの変形例では、透過性インサートは、活性化されると（例えば、緩衝剤、水などの流体の添加によって）、チャンバの流体接触側内で膨潤し得る膨潤性材料である。透過性インサートは、チャンバの受圧側とチャンバの流体接触側との間で弾性材料（層）を偏向させることによって圧縮されることがある。いくつかの変形例では、治療薬を処理することは、治療薬を配合するために使用される溶液を、透過性インサート材料を含む複数（例えば、2、3、4など）のチャンバ間で透過させることを含んでもよい。いくつかの変形例では、本方法は、透過性インサート材料を含むチャンバに溶液を出し入れすることを含んでもよい。
本明細書に記載された方法及び装置のいずれにおいても、治療用インサート材料は、治療用材料を含む溶液（又は治療用材料が形成されている溶液）をチャンバの流体接触側から追い出すために、例えばチャンバの受圧側の圧力を調節してチャンバを流体接触側と受圧側に分離する弾性膜を偏向させて圧縮することができる。
浸透性インサートは、治療材料を修飾し、さらに加工および／または修正するために使用され得る任意の適切な材料であってもよい。例えば、いくつかの変形例では、透過性インサートは、透過性材料を通過する際に溶液からdsRNAを除去するために、dsRNAを保持するように構成されたセルロース材料を含んでもよい。代替的又は追加的に、透過性インサートは、透過性インサートから溶液に添加され得る1つ又は複数の材料を含んでもよい。
例えば、本明細書に記載された透過性インサートのいずれかは、透過性インサートに吸着された又は透過性インサート上に吸着された1つ以上の追加の材料を含むことができる。これらの変形例のいずれにおいても、透過性インサートは、放出用材料を含んでもよい。いくつかの変形例では、例えば、透過性インサートは、セルロース中にDNAseを封入するためにDNAseで前処理されてもよいセルロースインサートを含んでもよい。これにより、インサートは、dsRNA（本明細書に記載されるように）を除去し、in vitro転写ステップからのDNA鋳型などのDNA材料を消化することを同時に可能にすることができる。
本明細書に記載された透過性インサートのいずれも、透過性インサート上又は中に付着、吸着又はその他の方法で含まれる1つ以上の追加の薬剤を含む表面機能化インサートとして構成されてもよい。例えば、いくつかの変形例では、透過性インサート中又は上に含まれるような追加の材料は、共有結合された材料（例えば、抗体又はアプタマー）、静電結合された材料、吸着された酵素（例えば、上述のDNAseのような不純物を選択的に分解し得る）、共有結合または非共有結合で取り付けられたセンサー（例えば、二本鎖RNA、不純物などの除去されるべき材料を検出するため）などがある。いくつかの変形例では、追加の材料または材料は、例えば、透過性インプラントの表面（複数可）に結合したポリアデニル化RNA分子を捕捉するためのポリ（dT）配列を含んでよい（例えば、ポリ（dT）配列は、mRNAを分離するために透過性インプラント内で使用されてよい）。いくつかの変形例では、追加の材料または材料は、結合特性を高めるために小分子を含んでもよい（例えば、臭化エチジウムなどのdsRNAインターカレーターは、ssRNAを結合せずにdsRNA材料を選択的に結合する場合がある）。いくつかの変形例では、透過性インサートは、材料で少なくとも部分的にコーティングされてもよい。例えば、いくつかの変形例では、コーティングはカルボキシレートコーティングであってもよい。
いくつかの変形例では、浸透性インサートは、溶液中に直ちに又は時限的に放出され得る凍結乾燥材料を含んでもよい。例えば、いくつかの変形例では、溶液が透過性インサートに接触すると、溶液中に凍結乾燥材料を溶解させてもよい。凍結乾燥材料の例には、1つ以上の緩衝材料（例えば、塩、キレート剤、洗剤、ポリヌクレオチド、酵素、タンパク質など）が含まれてもよい。いくつかの変形例では、透過性インサートは、溶液中の1つ又は複数の材料に結合するための結合剤などの薬剤を含んでもよい。例えば、透過性インサートは、結合した免疫剤、例えば、抗体、又はFAB断片等を含むその一部を含んでもよい。例えば、透過性インサートは、結合した免疫剤、例えば抗体、またはFAB断片などを含むその一部を含んでいてもよく、それは溶液から物質を選択的に除去し得る。
一般に、透過性インサートは、流体が透過性インサートの上および／または中を通過するように、チャンバの流体接触側をまたぐように構成されてもよい。透過性インサートは、紙、例えば、シート状の材料であってもよい。透過性インサートは、チャンバの流体接触側をまたぐように、及び／又は少なくとも部分的に満たすように折り畳まれてもよい。折り畳まれた形状は、したがって、偏向するように（弾性的に偏向することを含む）構成されながら、チャンバの流体接触部分にまたがることができる。ひだは、単純なひだ（例えば、扇形のひだ）又はより複雑なひだを含んでもよく、一般に、ひだは、ヒンジ（例えば、リビングヒンジ）領域として動作し得る1つ又は複数の曲がった、領域及び／又はチャンバを流体接触チャンバ及び圧力受容チャンバに仕切る弾性膜の移動によって圧縮又は他の形で偏向した後拡張形状に戻るようバイアスされてもよいものを含んでもよい。いくつかの変形例では、透過性インサートはスポンジを形成してもよい。透過性インサートは、発泡または膨張した材料として形成されてもよい。
本明細書に記載される透過性インサートのいずれの変形例においても、透過性インサート内の通路（例えば、孔、チャネル、チャンバーなど）のサイズは、サイズに基づいて物質を通過または排除するように構成されてもよい。したがって、本明細書に記載される透過性インサートは、サイズ排除（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー）を実行するように構成されてもよい。例えば、未反応のモノヌクレオチドを有する大きなmRNA分子を、ナノ多孔性インサートを含むチャンバに通過させてもよく、未反応のdNTPはインサートに拡散してそこに物理的に封じ込められ、一方で通路のサイズ（例えば、孔）は大きな分子を排除し得る。
例えば、透過性インサートがセルロースを含む変形例（例えば、dsRNA除去用）では、セルロースは紙（例えば、ろ紙）の形態であってよく、これは、チャンバの流体接触部分内に保持されるように構成された折り目を含む、折り畳まれるか層状であってよい。いくつかの変形例では、セルロースは、膨張していてもよく、又は発泡していてもよい。いくつかの変形例では、セルロースは、スポンジの形態であってよい。
透過性インサートは、一般に、任意の適切なサイズである細孔を有していてもよい。細孔サイズは均一であっても非均一であってもよく、いくつかの変形例では、細孔サイズはサイズ範囲内に分布していてもよい。例えば、細孔サイズは、約1μmと約200μmとの間（例えば、1μmから3μm、1μmから5μm、2μmから4μm、2μmから5μm、3μmから6μm、5μmから10μm、6μmから8μm、6μmから10μm、7μmから10μm、8μmから10μm、9μmから11μm、9μmから12μm、10μmから12μm、10μmから15μm、12μmから15μm、14μmから16μm、15μmから18μm、17μmから19μm）、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、22μm、25μm、27μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、110μm、120μm等の下限サイズからを上限として、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、22μm、25μm、27μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、110μm、120μm、等とした場合、ここで、下部の細孔径は上部の細孔径よりも小さい。サイズ範囲は分布であってもよく、例えば、孔の90％超がサイズ分布内にある（例えば、90％超、92％超、93％超、94％超、95％超、96％超、97％超、98％超、99％超、99.5％超、99.9％超など）。
本明細書に記載の方法及び装置のいずれかにおいて、本明細書に記載のように、マイクロ流路デバイスの温度が制御されてもよい。特に、透過性インサートを含むチャンバの温度が制御されてもよい。例えば、治療材料を含む溶液（又は治療材料が形成されている溶液）が透過性インサートに接触するとき、マイクロ流路デバイスの透過性インサートを含むチャンバは、目標温度に維持されてもよい。温度は、例えば、2度と20度の間、2℃と5℃の間、2℃と10℃の間、2℃と15℃の間、5℃と10℃の間、5℃と15℃の間、5℃と20℃の間、10℃と15℃の間、10℃と20℃の間、10℃と30℃の間、10℃と25℃の間、15℃と20℃の間、15℃と25℃の間、15℃と30℃の間、20℃と25℃の間、20℃と30℃の間、25℃と30℃の間、25℃と40℃の間、25℃と35℃の間、30℃と35℃の間、30℃と40℃の間、35℃と40℃の間、30℃と50℃の間、30℃と45℃の間、35℃と40℃の間、35℃と45℃の間、35℃と50℃の間、40℃と45℃の間、40℃と50℃の間、45℃と50℃の間、40℃と60℃の間、40℃と55℃の間、45℃と55℃の間、45℃と60℃の間、50℃と55℃の間、50℃と60℃の間、55℃と60℃の間、50℃と70℃の間、50℃と65℃の間、55℃と65℃の間、55℃と70℃の間、60℃と70℃の間、60℃と75℃の間、65℃と70℃の間、65℃と75℃の間、65℃と80℃の間、75℃と80℃の間、70℃と90℃の間、75℃と90℃の間、80℃と90℃の間、85℃と85℃の間、85℃と90℃の間等に維持されてもよい。温度は一定であってもよいし、透過性インサートの曝露前、曝露中、及び／又は曝露後に変化させてもよい（例えば、増加、減少など）。
いくつかの変形例では、透過性インサートは固体透過性インサートと呼ばれることがあり、透過性（例えば、固体透過性）インサートは、チャンバの流体接触側内に完全に含まれたままであるように構成されることがある。上述のように、いくつかの変形例では、透過性インサートは、材料を囲み、材料を透過性カバー内に閉じ込める外側に含まれ、例えば、透過性カバーによって囲まれる透過性パッケージとして構成されてもよい。例えば、透過性カバーは、粒状材料、又はゲル（例えば、ヒドロゲル）等を封入していてもよい。透過性カバーは、流体がカバーを通過してカバーが含む容積に入ることを可能にするために十分な透過性を有する膜材料などの材料で形成されてもよい。従って、透過性インサートは、圧縮可能及び／又は弾性的に変形可能な枕状の形状を形成してもよい。
一般に、透過性インサートは、マイクロ流路デバイスの流体連通チャンバに挿入されてもよく、上述のように流体連通チャンバ内に適合するように構成されてもよい。いくつかの変形例では、透過性インサートは、チャンバの流体接触側にぴったりと収まるように構成され、例えば、透過性インサートは、チャンバの流体接触側の形状と相補的な形状（例えば、楕円、丸、四角、丸みのある四角など）を有していてもよい。前述のように、透過性インサートは、体積をスパン及び／又は充填するように構成されてもよく、特に、流体が透過性インサートを通過するように、流体接触側の体積を通る流れの方向に対して垂直な方向に体積をスパンするように構成されてもよい。
例えば、本明細書に記載されるのは、マイクロ流体経路デバイス内に溶液の流体流れを誘導するための手段、複数のチャンバ、及び複数のチャンバの第1のチャンバ内の透過性インサートであって、インサートが圧縮されるように構成されている、透過性インサートを含み得るマイクロ流体経路デバイスである。溶液の流体流を誘導するための手段は、任意の適切な手段、特に、マイクロ流体経路デバイス内の膜を偏向させるための正又は負の圧力を受けるように構成されたマイクロ流体経路デバイス上の複数の圧力ポートを含んでもよい。例えば、本明細書に記載されるのは、第1プレートと第2プレートとの間に挟まれた弾性材料と、第1プレートと第2プレートとの間に形成された複数のチャンバーであって、弾性材料の一部が各チャンバーを流体接触側と圧力受容側とに分割しているものとを含むマイクロ流体経路デバイスである。これらのマイクロ流体経路デバイスのいずれかが、第1のチャンバの流体接触側内に固体で透過性のインサートを含んでもよい。
例えば、本明細書に記載されるマイクロ流路デバイスは、第1のプレートと第2のプレートとの間に挟まれた弾性材料と、第1のプレートと第2のプレートとの間に形成された複数のチャンバーであって、弾性材料の一部が各チャンバーを流体接触側と圧力受容側とに分割しているものと、複数のチャンバーのうち第1のチャンバーの流体接触側内の固体で透過性の挿入物とであって、第1のチャンバーの圧力受容側へ圧力をかけると弾性材料の偏向により挿入物が圧縮されるよう構成されたものとで構成される。
いくつかの変形例では、マイクロ流路デバイスは、第1のプレートと第2のプレートとの間に挟まれた弾性材料、第1のプレートと第2のプレートとの間に形成された複数のチャンバーであって、弾性材料の一部が各チャンバーを流体接触側と圧力受容側とに分割している、複数のチャンバー、複数のチャンバの第1のチャンバの流体接触側内の固体で透過性のインサートであって、インサートがRNAを浄化するように構成されたセルロース材料からなり、第1のチャンバを潜る弾性材料が、受圧側への圧力適用によってたわみ、流体を第1のチャンバの中または外に移動するように構成される、固体で透過性のインサートのように構成される。
マイクロ流路デバイスは、第1のプレートと第2のプレートとの間に挟まれた弾性材料、第1のプレートと第2のプレートとの間に形成された複数のチャンバーであって、弾性材料の一部が各チャンバーを流体接触側と圧力受容側とに分割する、複数のチャンバー、複数のチャンバーの流体接触側と流体連絡するように構成された複数の流体ポート、複数のチャンバの受圧側と流体連通している複数の圧力ポート、および複数のチャンバの第1のチャンバの流体連通側内の固体で透過性のインサートであって、1つ以上の圧力ポートから第1のチャンバの受圧側に圧力が加えられると弾性材料のたわみによって圧縮されるように構成されているインサートが含まれるように構成されてもよい。
いくつかのバリエーション、特に、透過性インサートが、セルロースを含むバリエーションなど、望ましくない物質（例えば、dsRNA）を溶液から除去するように構成されているバリエーションでは、チャンバーは、分離チャンバーと呼ばれることがある。
前述のように、これらの装置（例えば、システム、デバイスなど）のいずれかにおいて、固体及び透過性インサートは、RNAを精製するように構成されたセルロース材料を含んでもよい。例えば、固体及び透過性インサートは、セルロース材料のシートから構成されてもよい。代替的に又は追加的に、固体及び透過性インサートは、凍結乾燥材料から構成されてもよい。
固体および透過性インサートは、第1のチャンバのプロファイルに一致するプロファイルを有していてもよい。前述のように、固体及び透過性インサートは、弾性であってもよい。
固体および透過性インサートは、粒状材料を含む透過性外被で構成されてもよい。いくつかの変形例では、固体及び透過性インサートは、折り畳まれた構造からなる。
いくつかの変形例では、マイクロ流路デバイスは、第1のチャンバに流体的に接続される第2のチャンバを含んでもよい。デバイスは、弾性材料を偏向させることによって、第1のチャンバと第2のチャンバとの間で流体を移送するように構成されてもよい。いくつかの変形例では、流体は、第1のチャンバと第2のチャンバとの間で往復してもよい。
マイクロ流体経路デバイスは、第1のプレートを通って延び、複数のチャンバの受圧側に圧力を供給して流体受圧側の流体を移動させるように構成された、複数の個別にアドレス指定可能な圧力ポートを含んでもよい。
また、本明細書に記載された装置のいずれかを使用する方法についても説明する。例えば、流体中の治療材料（例えば、RNAサンプル）を処理する方法は、マイクロ流路デバイスを圧力源に結合すること、圧力を加えて、サンプルをマイクロ流路デバイスの分離チャンバの流体接触側に輸送すること、サンプルを分離チャンバの流体接触側内の固体及び透過性インサートに通過させ、サンプルが固体及び透過性インサートによって修正されること、及び圧力を加えてサンプルを分離チャンバの流体接触側外に輸送することを含むことができる。
例えば、dsRNAと一本鎖RNA（ssRNA）の両方を含むRNA試料から二本鎖RNA（dsRNA）を除去する方法は、マイクロ流路デバイスを圧力源に連結すること、RNAサンプルをマイクロ流路デバイスの分離チャンバの流体接触側に輸送するために圧力をかけること、RNAサンプルを分離チャンバの流体接触側内の固体および透過性インサートに通過させることであって、固体および透過性インサートがセルロースからなり、dsRNAがそのインサートによって保持されること、ならびにRNAサンプルを分離チャンバの流体接触側から輸送するために圧力をかけることを含むことができる。
dsRNAと一本鎖RNA（ssRNA）の両方を含むRNA試料から二本鎖RNA（dsRNA）を除去する方法は、マイクロ流路デバイスを圧力源に連結すること、RNAサンプルをマイクロ流路デバイスの分離チャンバの流体接触側に輸送するために圧力をかけ、RNAサンプルが分離チャンバの流体接触側内のセルロースからなる固体で透過性のインサートを通過し、dsRNAがインサートによって保持されるようにすること、および分離チャンバの圧力受容側に圧力をかけてRNAサンプルを分離チャンバの流体接触側の外に輸送することを含むことができる。
本方法は、マイクロ流路デバイス内でin vitro転写によりRNA試料を合成することを含んでもよい。いくつかの変形例では、方法は、マイクロ流路デバイスをRNAサンプルの供給源に結合させることを含むことができる。
RNA試料を流体接触側から輸送するために圧力を加えることは、分離チャンバの受圧側に圧力を加えて、分離チャンバの受圧側を流体接触側から分離する弾性材料を偏向させることを含んでもよい。分離チャンバーの受圧側に圧力を加えることは、RNA試料を分離チャンバーの流体接触側から混合チャンバーの流体接触側へ輸送することと、混合チャンバーの受圧側に圧力を加えてRNA試料を分離チャンバーの流体接触側へ輸送し戻すことをさらに含んでもよい。RNA試料を分離チャンバの流体接触側から輸送するために圧力を加えることは、分離チャンバの受圧側を分離チャンバの流体接触側から分離する弾性材料によって固体及び透過性インサートを圧縮することを含んでもよい。
これらの方法のいずれかが、固体および透過性挿入物を予め湿らせることを含んでもよい。
特許ファイルまたは出願ファイルには、少なくとも1枚のカラー図面が含まれている。この特許又は特許出願公開のカラー図面の写しは、請求と必要な手数料の支払によって、国内官庁から提供される。
本発明の新規な特徴は、以下の特許請求の範囲に具体的に記載されている。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明、およびその添付図面を参照することによって得られるであろう。
mRNA治療薬の製造方法の一変形例を模式的に示す図である。 患者特異的T細胞リンパ腫ワクチン製剤を製造するための例示的なプロセスの1つのバリエーションを概略的に示す図である。 本明細書に記載されるマイクロ流路デバイス制御システムの一例を示す図である。 本明細書に記載されるように使用され得るマイクロ流体経路デバイス制御システムの1つの変形例を概略的に示す図である。 図3A～3Cは、本明細書に記載されるマイクロ流路デバイスの変形例を示す図である。 本明細書に記載のマイクロ流路デバイスの一変形例の一部を通る断面図である。 本明細書に記載されるような方法のいずれかに使用され得るペプトイド送達ビヒクルの一例を示す図である。 二本鎖DNA鋳型の作製に有用なin vitro転写促進剤カセットの一例を示す図である。 本明細書に記載されるように生成された二本鎖DNA鋳型の例を示す図である。 ワクチンまたは治療に用いる二本鎖DNAの作製に有用なT細胞受容体の一例の領域を示す図である。 二本鎖DNAを生成するためのマイクロ流路デバイスリアクターのアーキテクチャの一変形例の概要を示す図である。 本明細書に記載の方法及び装置のいずれかにおいて使用され得るコドン最適化プロセスの一例を概略的に示す図である。 本明細書に記載のIVTを行うように構成されたマイクロ流路デバイスの機能図の一例を模式的に示す図である。 本明細書に記載の製剤用マイクロ流路デバイスとして構成されたマイクロ流路デバイスの機能図の一例を模式的に示す図である。 本明細書に記載の製剤用マイクロ流路デバイスとして構成されたマイクロ流路デバイスの機能図の他の例を模式的に示す図である。 本明細書に記載の製剤用マイクロ流路デバイスの機能図の他の例を模式的に示す図である。 本明細書に記載されるようなmRNA治療薬の例示的なモデルを用いて、インビボmRNA発現及び生体内分布を調べる実験の一例を説明する図である。 図16A～16Dは、本明細書に記載される例示的な治療用mRNAワクチンの治療効果を示すグラフである。 本明細書に記載されるように製造された保存モデルmRNA治療薬を注射した後の全身ルシフェラーゼ発現を示す図である。 図17AからのモデルmRNA治療薬の発現の定量例を示す図である。 本明細書に記載される方法及び装置において濾過が適用され得る様々な時間を模式的に示す図である。 チャンバの流体接触面内に透過性インサートを含むマイクロ流体経路デバイスの一例を示す上面図である。 チャンバの片側に透過性インサートを含むマイクロ流体経路デバイスの一例の一領域を通る断面の一例を示す図である。 気泡除去用の真空キャップを模式的に示すマイクロ流路デバイスの一部の一例を示す図である。 本明細書に記載の透過性インサートを含むマイクロ流体経路デバイスを使用して流体中の治療材料（例えば、RNAサンプル）を処理する1つの方法を概略的に示す図である。 本明細書に記載の透過性インサートを含むマイクロ流体経路装置を用いて治療材料からdsRNAを除去する方法を模式的に示す図である。 クラス7の空間内のクラス5の隔離キャビネット内にあるマイクロ流体装置を含むシステムの一例を示す図である。本システムは、ミニ工場として構成されてもよい。 クラス5キャビネット内のマイクロ流体装置を示す図である。
本明細書では、完全自動化されたソフトウェア制御のマイクロ流体装置の使用を含み得る、治療薬の製造方法および装置について説明する。これらの方法および装置は、個別化治療または個別化療法に使用され得る。また、本明細書では、鋳型の形成、インビトロ転写、治療用mRNAの精製、mRNAの濃縮、及びmRNA（複数可）と1つ以上の送達ビヒクルとの複合化を含む、本明細書に記載の製造工程のいずれかのソフトウェア制御を含む装置（例えば、システム、デバイス等）及び方法が記載される。ソフトウェア制御は、1つ以上の治療用mRNAを製造するためのこれらのステップのいずれか、いくつか、またはすべてが正確かつ精密に迅速に実行されるように、これらの方法を自動化することを可能にし得る。ソフトウェア制御と反応成分のマイクロ流体による正確な送達および移送は、プロセス制御、効率および再現性を高める一方で、手動操作を大幅に削減または排除し、設備の必要性を低減し、生産サイクル時間を短縮する機会を提供し、最終的には必要に応じてジャストインタイムで生産される低コストの治療法につながるものである。
本明細書に記載される装置（例えば、システム、デバイスなど）のいくつかでは、治療材料の各バッチは、専用の、単一使用の、使い捨てのマイクロ流体経路デバイス（本明細書ではバイオチップとも呼ばれる）において製造されてよく、それはマイクロ流体経路デバイス制御システム（本明細書では制御システムとも呼ばれる）内に収容されてもよい。生産全体は、大気と接触しない無菌設計のクローズドパスプロセスとして進行してもよい。生産工程はすべて自動化され、制御システムによって制御され、システムを収容する施設の属性に関係なく、コピーエクスタクトプロセスを達成することができる。生産パラメータ、原材料、および環境データ（完全な視覚的記録を含む）は、クラウドで保護され、各生産ランに関連付けられた広範で暗号化された電子ファイルの一部となる可能性がある。さらに、精製工程や多くのQCアッセイを生産工程中にインラインで単一の流体フローで行うことができ、半導体産業で開発されたプロセス制御概念により、異常を早期に検出することができる。全自動でソフトウェア制御された製造方法を活用することで、患者のために費用対効果の高い方法でパーソナライズド・個別化されたmRNA治療薬を製造することができる。
特に、これらの方法および装置は、体外転写（IVT）として知られる合成技術により、人体外で合成的にmRNA治療薬を製造することができる。典型的には、裸のmRNA分子は、細胞膜を通過しない大きなポリアニオン性分子であり、生体内で細胞外のヌクレアーゼによって急速に分解される。本明細書に記載の方法および装置は、mRNAを標的（組織、身体、組織の領域など）に輸送するように設計された、1つまたは複数の送達ビヒクルを有するmRNA分子の製剤を製造し得る。例えば、いくつかの変形例では、送達ビヒクルは、循環中にmRNAカーゴのパッケージング及び保護を提供し、免疫認識を回避し、細胞の取り込み及び放出を促進し得る、脂質含有両親媒性送達ビヒクルであってよい。
一般に、本明細書でより詳細に説明するように、いくつかの変形例では、鋳型合成、IVT、精製、および送達ビヒクルによる製剤化を含む製造工程のすべてまたは一部を、1つまたは複数のマイクロ流路デバイスの高度制御環境で実施し、堅牢で高品質かつ再現性の高い製造工程の最適化を可能にすることができる。
定義
本明細書で使用される場合、送達ビヒクルは、任意の適切なナノ粒子を指すことができる。そのようなナノ粒子の例には、アミノ脂質化ペプトイドなどの両親媒性ナノ粒子が含まれ得るが、これらに限定されるわけではない。
本明細書で使用される「増幅」は、ポリヌクレオチド（例えば、DNA）増幅を指す場合がある。例えば、増幅は、本明細書に記載されるマイクロ流体パスプレートデバイス内で完全に行われてもよい。増幅は、多重置換増幅（MDA）、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅、ループ媒介等温増幅、LAMP、核酸配列に基づく増幅、ストランドディスプレイスメント増幅、ローリングサークル増幅、リガーゼ連鎖反応などを含んでもよいが、これらに限定されるものではない。
本明細書で使用する自動化および半自動化とは、主に人間の介入なしに実行される方法およびプロセスを指し、1つ以上のコンピュータプロセスの制御下にある場合がある。自動化された方法は、人間の入力によって監督及び／又は指導される場合がある。
本明細書で使用する場合、「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」という用語は互換的に使用でき、デオキシリボヌクレオチド（DNA）、リボヌクレオチド（RNA）、およびその機能アナログ、例えば、線状または環状のコンフォメーションの補完DNA（cDNA）を指すものとする。本明細書で提供される核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得る。核酸分子は、アデニン（A）、グアニン（G）、チミン（T）、シトシン（C）のヌクレオチド塩基から構成される。RNA分子ではチミンの代わりにウラシル（U）が存在する。天然のヌクレオチド塩基の類似体、および塩基、糖、および/またはリン酸部分が修飾されたヌクレオチド塩基も本明細書に提供される。記号「N」は、任意のヌクレオチド塩基（例えば、A、G、C、T、またはU）を表すために使用することができる。
本明細書で使用する「カセット」（例えば、合成in vitro転写促進剤カセット）は、エンハンサー、プロモーター、リーダー、イントロン、5´非翻訳領域（UTR）、3´UTR、または転写終結配列などの一つ以上の発現要素を含むかまたはそれに作動可能に連結され得るポリヌクレオチド配列を意味する。いくつかの実施形態では、カセットは、作動可能に連結された第2のポリヌクレオチド配列の転写を開始することができる少なくとも第1のポリヌクレオチド配列、および任意に第2のポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された転写終結配列から構成される。カセットは、単一の要素として、または2つ以上の連結していない要素として提供されるかもしれない。
本明細書で使用する「ポリヌクレオチド」は、複数のヌクレオチドを含む核酸分子を指し、一般に「オリゴヌクレオチド」（長さが18～25ヌクレオチドのポリヌクレオチド分子）と26ヌクレオチド以上のポリヌクレオチドの双方を指す。本開示の態様は、18～25ヌクレオチド（例えば、18マー、19マー、20マー、21マー、22マー、23マー、24マー、または25マー）の長さを有するオリゴヌクレオチド、または26以上のヌクレオチドの長さを有する中長ポリヌクレオチド（例えば、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、約65、約70、約75、約80、約85、約90、約95、約100、約110、約120、約130、約140、約150、約160、約170、約180、約190、約200、約210、約220、約230、約240、約250、約260、約270、約280、約290、または約300ヌクレオチドのポリヌクレオチド）、または約300ヌクレオチドより大きい長さを有する長いポリヌクレオチド（例えば、約300～約400ヌクレオチドの間、約400～約500ヌクレオチドの間、約500～約600ヌクレオチドの間、約600～約700ヌクレオチドの間、約700～約800ヌクレオチドの間、約800～約900ヌクレオチドの間、約900～約1000ヌクレオチドの間、約300～約500ヌクレオチドの間、約300～約600ヌクレオチドの間、約300～約700ヌクレオチドの間、約300～約800ヌクレオチドの間、約300～約900ヌクレオチドの間、または約1000ヌクレオチドの長さ、あるいはさらに約1000ヌクレオチドより大きい長さの間）のポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドが二本鎖である場合、その長さは同様に塩基対の用語で記述することができる。
本明細書において、「in vitro 転写」または「IVT」とは、非細胞系で転写を行い、被験者への治療用送達を含む様々な用途に使用する合成RNA 分子（合成 mRNA）を生産するプロセスを指す。生成された合成RNA分子（転写産物）は、送達媒体と組み合わせることができる。合成転写産物には、mRNA、アンチセンスRNA分子、shRNA、環状RNA分子、リボザイムなどが含まれる。IVT反応には、プロモーター配列と目的のオープンリーディングフレームの配列を含む精製直鎖DNA鋳型、リボヌクレオチド三リン酸または修飾リボヌクレオチド三リン酸、DTTとマグネシウムイオンを含むバッファシステム、および適切なファージRNAポリメラーゼを使用することができる。
「鋳型」または「二本鎖DNA鋳型」とは、挿入された目的のオープンリーディングフレームのin vitro転写に必要な最小構成配列からなる単離された核酸配列のことである。
本明細書で使用する場合、「流体デポ」は、流体を保持するための貯蔵空間を指す場合があり、バイアル、ボトル、バッグ、チューブなどを含む場合がある。流体デポは、流体ラインを一体として含んでもよい（例えば、流体デポ内の本体又はチャンバから出る通路又は流路）。
本書で使用する流体動力には、空圧式と油圧式の両方が含まれる。便宜上、空気圧という用語は油圧を含むことがあり、これらの用語は互換的に使用されることがある。
本明細書で使用される「治療用ポリヌクレオチド」は、被験者の健康を治療、予防、改善またはその他の方法で修正するために被験者に送達するための治療用ポリヌクレオチド組成物の一部であり得るポリヌクレオチド（例えば、治療用mRNA）を意味する。
本明細書で使用される「治療用ポリヌクレオチド組成物」は、被験者に投与され得る送達ビヒクルによってカプセル化された1つまたは複数のポリヌクレオチド（例えば、mRNA）を含む組成物を指す場合がある。mRNAワクチンは、治療用ポリヌクレオチド組成物の一例に過ぎない。
本明細書で使用される場合、「細菌DNAを含まない」または細菌DNAの非存在を意味する。細菌DNAを実質的に含まない材料は、0.1％未満、0.01％未満、0.001％未満等の細菌DNAを含んでもよい。本明細書で使用される「エンドトキシンを含まない」は、エンドトキシンがないことを指す。「エンドトキシンを実質的に含まない」とは、エンドトキシンが0.1％未満、0.01％未満、0.001％未満等であることを指す。
本明細書において「接合」とは、ライゲーション、合成、プライマー伸長、アニーリング、組換え、またはハイブリダイゼーションなど、ある成分を別の成分に結合するための方法をいう。
本明細書で使用するマイクロ流路デバイスまたはマイクロ流路プレートデバイスは、等価的にチップ、カートリッジ、バイオチップ、マイクロ流路プレート等と呼ばれ、流体的に相互接続された複数のチャンバーを含むことができる。これらのチャンバは、流体に接触する側と圧力を受ける側とに分割されてもよい。受圧側は流体動力回路の一部であってもよく、流体接触側は外部雰囲気から隔離され、マイクロ流体パスデバイス内の材料を処理するために使用されてもよい。本明細書に記載されるマイクロ流体経路デバイスは、概して平坦であってもよく（例えば、約4cm未満、約2cm未満、約1.5cm未満、約1cm未満等の厚さを有する）、マイクロ流体経路プレートデバイス内の流体動力回路を駆動及び／又は制御するための1以上の圧力ラインと連通するための複数の圧力ポートを含んでもよい。
本書で使用される「オンデマンド」は、方法またはサービスが実行される時を定義することを意図しており、事前に保存、予定、注文または準備されることと対比して使用される。
本明細書で使用する光センサーは、通常、光感知装置を指し、1つ以上の撮像装置を含むことができる。光センサーは、単レンズ、カメラ、ステレオカメラ、マルチレンズカメラ、デジタルスチルカメラ、サーモグラフィーカメラ、CCD、光ファイバーなどを含んでもよい。
本明細書で使用する「精製」とは、成分（例えば、粒子）を他の不要な成分（例えば、汚染物質、断片など）から物理的及び／又は化学的に分離することを指す。
本明細書で使用される「密閉された流体連絡」及び「密閉された閉じた流体経路」は、いずれも、材料（例えば、鋳型、治療用ポリヌクレオチド及び／又は治療用ポリヌクレオチド組成物の溶液などの材料を含む流体）を周囲の大気から隔離することを指す場合がある。
本明細書において、「鋳型前駆物質」とは、鋳型（例えば、DNA二本鎖鋳型）を形成するために必要な物質を指し、目的の合成遺伝子、および1つまたは複数の独立した要素として提供される体外転写促進剤カセットが含まれ得る。
本明細書において、2D精製とは、本明細書に記載されるような実質的に平坦なマイクロ流路デバイス（例えば、マイクロ流路プレートデバイス）内で行われる精製を指し、物質（例えば、二本鎖RNA、未反応ヌクレオチド、未反応キャッピング試薬、緩衝成分等）等を除去するために2種以上の吸着材を用いることも含まれる。
mRNA治療薬などの治療薬は、ワクチン接種、免疫療法、タンパク質補充療法、組織の再形成・再生、遺伝子編集による遺伝性疾患の治療など、複数の治療様式に使用することができる。また、mRNA治療薬は、その高い効力に加え、迅速な開発サイクル、標準化された製造、一過性の発現、ゲノム統合のリスクの低さといった重要な利点も有している。
いくつかの変形例では、本明細書に記載のmRNA治療薬は、最終医薬品中の有効成分として、対象の抗原またはタンパク質をコードするmRNAを含むことができる。mRNAの頑健な翻訳には、機能的な5'キャップ構造が必要である。5'キャップ（または7-メチルグアノシンキャップ）は、最初の転写ヌクレオチドに5'-5'-トリリン酸結合を介して連結された末端の7-メチルグアノシン残基からなる。このキャップは、リボソームによるmRNAの認識とRNAsからの保護に重要である。ポリ（A）テールは、ポリ（A）結合タンパク質（PABP）と結合し、真核生物の翻訳開始因子eIF4Gと相互作用し、さらにeIF4Eと複合体を形成して、mRNAの安定性と翻訳開始をm7Gキャップと相乗的に制御する。ポリ（A）テールの長さは、mRNAからタンパク質への翻訳プロセスの効率に影響すると考えられる。
mRNA治療薬は、少なくとも5つのカテゴリーに大別され、(i）タンパク質代替、（ii）ワクチン、（iii）エフェクタータンパク質の発現、（iv）ドミナントネガティブタンパク質の発現による機能喪失の誘導、（v）遺伝子／ゲノム編集に使用される。本明細書に記載の方法および装置は、これらのカテゴリーのいずれか（または1つ以上）のためのmRNA治療薬を提供し得る。
本明細書に記載の方法および装置は、反復投与を制限し得る毒性または免疫原性の懸念を回避しつつ、循環中のmRNAカーゴのパッケージングおよび保護を提供し、免疫認識を回避し、所望の組織に薬剤製品を局在化し、細胞への取り込みおよび放出を促進するようにmRNA治療薬を製剤化し得る。
一般に、mRNA治療薬（患者特異的T細胞リンパ腫ワクチン製剤を含むが、これに限定されない）の製造方法は、図1Aに模式的に示されるステップのいずれかまたはすべてを含むことができ、標的タンパク質の同定およびmRNA配列の設計101、標的配列のための二本鎖DNA鋳型の準備103が含まれる。この配列を使用して、mRNAを合成するための体外転写（IVT）反応105を行うためにmRNAを生成してもよい。この治療用mRNAは、その後、精製してプロセス不純物を除去し、ろ過して薬物物質を生成してもよい107。治療用mRNAは、その後、送達ビークル（両親媒性ナノ粒子を形成するためのアジュバントおよび送達ビークル成分とのいくつかのバリエーションを含む）とともに製剤化されてもよい109。次いで、製剤は、患者への送達に使用され得る薬物生成物を生成するために処理及び精製され得る111。上述したように、いくつかの変形例では、これらのステップのいくつかは遠隔で（例えば、101～107）、いくつかは局所的に（例えば、109、111）実行されてもよく、いくつかの変形例では、それらすべて（例えば、103、105、107、109、111）が局所的に実行されてもよい。
一変形例の具体例として、図1Bは、患者特異的T細胞リンパ腫ワクチン製剤を製造するための例示的な工程を示す。図1Bにおいて、プロセスは、リンパ腫細胞によって発現されるクローン拡大TCR配列（イディオタイプ）の同定121を含んでもよい。また、本工程は、mRNAワクチン配列を設計すること123、及びIVT反応に用いる二本鎖DNA鋳型を調製することを含んでもよい。この鋳型をIVT反応に用いてmRNAを合成し127、この治療用mRNAを精製して工程不純物を除去し、ろ過して治療用mRNAを薬剤物質として調製してもよい129。その後、治療用mRNAをアジュバントおよび送達ビークル成分とともに処方して両親媒性ナノ粒子を形成してもよい131。 次に処方後処理133を行って治療用mRNAワクチンなどの薬剤製品135を生成してもよい。
これらの製造工程のいずれもが、本明細書に記載されるような自動化されたマイクロ流路デバイス制御システムを用いて実行されるように最適化され得る。例えば、DNA鋳型の製造は、1つ以上のマイクロ流路デバイスで行われてもよく、図1Bに示す例では、鋳型マイクロ流路デバイス（例えば、鋳型バイオチップ）が使用されてもよい。この同じ例において、mRNAを体外転写するステップと、その材料を精製して原薬を生成するステップは、IVTマイクロ流路デバイス（例えば、IVTバイオチップ）で行われてもよく、製剤化ステップは、製剤マイクロ流路デバイス（例えば、製剤バイオチップ）で行われてもよい。これらのマイクロ流路デバイスは、製造プロセスの各ステップを実行するために必要な入力ポート、計量バルブ、反応チャンバー、および精製構造を含むことができる。
装置
本明細書に記載される方法は、一般に、1つ以上のマイクロ流路デバイス（例えば、バイオチップ）とともに使用され得る、及び／又は含み得る装置、並びにマイクロ流路デバイスにおける動作を制御するように構成されるシステム（例えば、マイクロ流路制御システム）を用いて実施され得る。これらの装置は、本明細書において、マイクロ流体装置、マイクロ流体制御装置、マイクロ流路デバイス制御システム、マイクロ流体制御システム、又はマイクロ流体システムと称されることがある。マイクロ流体パス装置（マイクロ流体パスプレート装置とも呼ばれる）は、マイクロ流体制御システム内に配置されてもよく、システム内の製造部品の一部、より好ましくはほぼ全てまたは全ての構成部品の大気への曝露を防止する閉路方式で作動してもよい。特に、システム内の流体（複数可）に接触する装置の部分は、大気への露出を防止される。図2Aはマイクロ流体経路装置管理システム203（マイクロ流体経路装置を保持するためのハードウェア、マイクロ流体経路装置内のマイクロ流体操作を操作するための正／負圧の適用、マイクロ流体経路装置の全て又は領域の加熱／冷却、マイクロ流体経路装置からの1つ又は複数の特徴の検出及び／又は1つ又は複数のマイクロ流体経路装置に行われる操作の記録）、コントローラ（図示しない）及び冷蔵容器205（例えば、ISOクラス5キャビネット）を含むマイクロ流体経路装置制御システムの一例を示す。このシステムは、1つ以上のマイクロ流体パスデバイス201を使用してもよいし、含んでもよい。
マイクロ流体装置は、治療用ポリヌクレオチド（例えば、mRNA治療薬）を形成するためのマイクロ流体装置であってもよい。本装置は、マイクロ流体経路プレート装置を取り外し可能に保持するための着座マウントと、複数の圧力線と、複数の流体バイアルであって、各流体バイアルは、流体線を含むか、または流体線と結合するように構成されており、各流体線および圧力線の少なくともサブセットは、着座マウントに保持されたマイクロ流体経路プレート装置に対してバイアスされて閉流体経路を形成するよう構成されている、複数の流体バイアルと、マイクロ流体経路プレートデバイスが着座マウントに保持されているときに、マイクロ流体経路プレートデバイス内の流体運動を駆動するために圧力ラインを通しての圧力の適用を制御するように構成されたコントローラであって、コントローラが、合成鋳型の合成を指示し、鋳型を用いて体外転写（IVT）反応を指示して治療ポリヌクレオチドを形成し、着座マウントに保持された1以上のマイクロ流体経路プレートデバイスにおける治療ポリヌクレオチドの精製を指示するように構成されるもの、を含んでもよい。
マイクロ流体装置（例えば、治療用mRNAなどの治療用ポリヌクレオチドを形成するためのマイクロ流体装置）は、マイクロ流体経路プレート装置を取り外し可能に保持するための着座マウント、複数の圧力ライン、複数の流体バイアルであって、各流体バイアルは、流体ラインを含んでいるか、または流体ラインと結合するように構成されており、各流体ラインおよび圧力ラインの少なくともサブセットは、着座マウントに保持されたマイクロ流体経路プレート装置に対してバイアスされて閉流体経路を形成するように構成されている、複数の流体バイアル、マイクロ流体経路プレートデバイスが着座マウントに保持されているときに、マイクロ流体経路プレートデバイス内の流体運動を駆動するために圧力ラインを通しての圧力の適用を制御するように構成されたコントローラであって、コントローラが流体バイアルの内容物を決定するように構成されている、コントローラと、マイクロリットル以下の量の物質をバイアルから、座面に保持されたマイクロ流体経路プレート装置内の1つ以上の反応器に移送し、合成鋳型の合成を指示し、鋳型を用いて体外転写（IVT）反応を指示して治療用ポリヌクレオチドを形成し、座面に保持された1つ以上のマイクロ流体経路装置において治療用ポリヌクレオチドの精製を指示するものを含み得る。
コントローラは、本明細書に記載の方法のいずれかを実行するように構成されてもよく、特に、入力（例えば、光学入力、圧力入力、温度／熱入力など）を受け取り、入力を処理して、マイクロ流路デバイス内の流体の移動、マイクロ流路デバイスの種々の領域の温度（熱サイクル含む）、洗浄／結合、マイクロ流路デバイスのバルブの開／閉、マイクロ流路デバイスの検出などを制御するように構成されてもよい。コントローラは、1つ以上のマイクロプロセッサ、通信回路、メモリ等を含んでもよい。コントローラは、ファームウェア、ハードウェア及び／又はソフトウェアで構成されてもよい。
これらの装置のいずれもが、試薬収納枠内の流体レベル及びマイクロ流路デバイスが着座マウントに着座しているときのマイクロ流路デバイス内の流体移動を監視するために、着座マウント及び試薬収納枠の周囲に配置された1又は複数（例えば、複数）の光学センサを含むことができる。代替的または追加的に、光学センサー（複数可）は装置の底面（例えば、着座マウントの下）に存在し、流体量、移動などを検出するために上方に向けられていてもよい）。
説明した方法および装置は、一般に、マイクロ流路デバイスの流体チャンバ（デポ、流体接触側、反応器など）とチャネルとの間、またはマイクロ流路デバイス内、場合によってはマイクロ流路デバイスと装置内の流体デポ（ベール、ボトル、容器など）の間で物質（液体物質）を移動させる1つまたはそれ以上の流体動力回路を含んでいる。流体動力回路は、マイクロ流体デバイス、特にマイクロ流体デバイス内の1つ以上の圧力チャネルとチャンバーの受圧側を含むことができる油圧回路または空気圧回路であってよい。流体動力回路は、マイクロ流体動力回路と呼ばれることもある。単一のマイクロ流体チップは、複数の流体動力回路を含んでもよく、流体動力回路は、1つ以上の圧力ラインと、マイクロ流体制御装置の圧力ラインとマイクロ流路デバイス内の1つ以上のマイクロ流体チップとの間のインターフェイスも含んでもよい。一つ以上の流体動力回路は、他の重複する流体動力回路と部品（バルブ、圧力ライン、真空キャップなど）を共有してもよい。さらに、便宜上、「空気圧」という用語が使用される場合、一般的な流体動力回路（例えば、油圧および／または空気圧）が代わりにまたは追加的に使用されてもよいことを理解されたい。流体動力線によって駆動される流体材料は、任意の適切な流体（例えば、空気、水、油などの気体または液体）であってもよい。
また、本明細書では、治療用ポリヌクレオチドを閉経路で処理するためのマイクロ流路デバイス（例えば、閉経路マイクロ流路デバイス）を説明する。前述のように、これらのマイクロ流体パスデバイスは、本明細書において、マイクロ流体チップ、マイクロ流体パスプレート、プロセスチップ、バイオチップ、プロセスプレート等と呼ばれることがある。一般に、マイクロ流体パスデバイスは、マイクロ流体パスプレートデバイスであってもよく、これは、実質的に平坦なプレート状構造であってもよく、これらの構造は、比較的薄い（例えば、数mm未満の厚さ、例えば、0.5～20mmの厚さ、0.5～15mmの厚さ、0.5～10mmの厚さ等）ものであってもよい。本明細書に記載のマイクロ流体経路デバイスは、一般に、少なくとも部分的に透明であってよく、特に、マイクロ流体経路デバイスの上部が透明であってよく、それにより、1つ以上の光学センサ（カメラ、CCD、光ファイバ等）が、本明細書に記載のマイクロ流体装置によって用いられるように、マイクロ流体経路デバイスを用いて、流体移動および／または弾性層の移動を含む作用を感知、検出、監視、記録等するために使用されうる。
図2Bは、本明細書に記載されるように使用され得るマイクロ流体経路デバイス制御システムの1つの変形例を示す概略図である。この例では、装置は、単回使用装置であってもよい1つ以上のマイクロ流体経路装置211を保持することができる着座マウント215を囲むハウジング233を含む。ハウジングは、蓋又は開口部を含んでもよいチャンバー、筐体等であってもよく、閉じられると密閉されてもよい。ハウジングは、熱調整器を囲んでいてもよく、及び／又は、熱的に調整された環境（冷蔵装置等）に囲われるように構成されていてもよい。ハウジングは、無菌バリアを形成してもよい。いくつかの変形例では、ハウジングは、加湿または湿度制御された環境を形成してもよい。
着座マウント215は、マイクロ流体経路デバイスを固定された所定の向きに保持するように構成された1つ以上のピン又は他の構成要素を用いて、マイクロ流体経路デバイスを固定するように構成されてもよい。
いくつかの変形例では、熱制御213は、1つ以上のマイクロ流体経路デバイス211に対する温度を調節するために、座面マウント215に隣接して配置されてもよい。熱制御は、マイクロ流体経路デバイスの全て又は一部の温度を制御するための熱電部品（例えばペルチェデバイス）及び／又は1つ以上のヒートシンクを含んでもよい。いくつかの変形例では、マイクロ流体経路デバイスの1つ以上の領域の温度を別々に調節するために、1つ以上の熱制御が含まれてもよい。熱制御は、マイクロ流体経路デバイス及び／又は熱制御のフィードバック制御に使用され得る1つ又は複数の熱センサ（例えば、熱電対など）を含んでもよい。
図2Bにおいて、流体インターフェースアセンブリ209は、液体試薬及び／又は圧力（例えば、ガス）を、着座マウント215に保持されたマイクロ流体経路デバイス211と結合し、圧力源217からマイクロ流体経路デバイス211の内部への、正／負のガス状圧力と同様に、流動物質の送達を支援しうる。流体インターフェースアセンブリは、以下でより詳細に説明するように、任意選択で、マイクロ流体経路デバイス（複数可）の固定を支援してもよい。流体インターフェースアセンブリは、使用間の滅菌のために、装置に取り外し可能に結合されてもよい（そして、取り外されてもよいし、一部を取り外してもよい）。
試薬保管フレーム207は、複数の流体サンプルホルダを含むように構成されてもよく、その各々は、マイクロ流体デバイス211に送達するための試薬（例えば、ヌクレオチド、溶媒、水など）を保持するように構成された流体バイアルを保持してもよく、あるいは、流体バイアルはマイクロ流路デバイス211の内部から製品を受けるように構成されてもよい。試薬収納枠は、試薬ラックと称されてもよい。いくつかの変形例では、試薬ラックは、1つ又は複数の圧力源217を、マイクロ流体経路デバイスanに適用され得る複数の圧力ラインに分割するように構成された複数の圧力ライン及び／又はマニホールドを含み、独立して又は（サブコンビネーションで）集合的に制御されても良い。あるいは、流体デポ（バイアルなど）は、マイクロ流体経路デバイス（複数可）に対して直接固定及び密封するように構成されてもよい。
流体インターフェースアセンブリは、複数の流体ライン及び／又は圧力ラインを含んでもよく、着座マウント215に保持されたときに各流体及び／又は圧力ラインを個別かつ独立してマイクロ流体経路デバイスに駆動するバイアス（例えば、ばね式）ホルダー又はチップを含んでもよい（あるいは、前述のように、代替的にデバイスは直接ばね式マウントであってもよい）。チューブ、例えば、流体ライン及び／又は圧力ラインは、流体インターフェースアセンブリの一部であってもよく、又は流体インターフェースアセンブリに接続されてもよい。いくつかの変形例では、流体ラインは、バイアルをチューブにロック係合（例えば、フェルール）で結合するコネクタを介して試薬貯蔵フレームと、マイクロ流体経路デバイスとの間に接続する柔軟なチューブから構成される。流体経路の端部、いくつかの変形例では流体ライン／圧力ラインの端部は、本明細書に記載されるように、マイクロ流体経路デバイスに対して、例えば、マイクロ流体経路デバイスに形成されたシーリングポートでシールするように構成されてもよい。例えば、流体ラインの端部は、平坦（側面視で垂直）になるように切断又は形成されてもよい。バイアルは、圧力源に接続することもできるコネクタを介して、加圧（例えば、2気圧、3気圧、5気圧などの1気圧を超える圧力）されてもよい。例えば、流体バイアルは、1～20psig（例えば、5psig／20psia、10spigなど）の間まで加圧されてもよい。負圧または正圧が適用されてもよく、例えば、真空（例えば、-7psigまたは7psia）が、プロセスの終了時にバイアル（例えば、デポ）に流体を引き戻すために適用されてもよい。一般に、流体バイアルは、空気圧バルブよりも低い圧力で駆動されてもよく、これにより漏れを防止又は低減することができる。いくつかの変形例では、流体バルブと空気圧バルブとの間の圧力の差は、約5psi（例えば、約7psi、10psi、12psi、15psi、20psiなど）の間であってよい。
各バイアルは、コード化されてもよい（例えば、後述するように、1つ以上のセンサによって読み取られ得る識別子によって）。コントローラは、流体レベル、したがって、流体インターフェースアセンブリ内の各材料の量を監視してもよい。
また、装置は、磁場アプリケータ219を含んでもよく、この磁場アプリケータは、マイクロ流路デバイス211の領域において磁場を形成するように構成されてもよい。光学センサであってもよい1つ以上のセンサ205は、装置の一部であってもよく、バーコード、試薬収納フレーム内に保持された流体バイアル内の流体レベル、及び装置が取付座215内に取り付けられたときのマイクロ流体経路装置211内の流体移動の1つ以上を感知してよい。
センサーは、例えば、光学的な指標を測定することによって、装置上のプロセスの測定を行うことができる。いくつかの変形例では、歩留まりを推定するために視覚的／光学的マーカーが使用されてもよい。例えば、蛍光は、フルオロフォアでタグ付けすることにより、プロセスの歩留まりまたは残留材料を検出するために使用されてもよい。代替的に又は追加的に、動的光散乱を使用して、マイクロ流路デバイスの一部（例えば、混合部分など）内の粒度分布を測定してもよい。いくつかの変形例では、センサーの測定は、光（例えば、レーザー光）を中に伝え、出てくる光信号を検出するために、1つまたは2つの光ファイバーを用いて行われてもよい。装置から離れた場所に計測器パッケージを搭載してもよい。このような非接触のセンシングが好ましい場合もある。
本明細書に記載される方法及び装置のいずれかにおいて、センサ（例えば、ビデオセンサ）は、マイクロ流体経路デバイス（例えば、チップ又はカートリッジ）上の全ての活動を記録してもよい。例えば、材料（治療用RNAなど）を合成及び／又は処理するためのラン全体は、例えば上からマイクロ流体パスデバイスを視覚化し得るビデオセンサーを含む1つ以上のビデオセンサーによって記録されてもよい。マイクロ流体経路デバイス上の処理は、視覚的に追跡されてもよく、この記録は、後の品質管理及び／又は処理のために保持されてもよい。したがって、処理のビデオ記録は、その後のレビュー及び／又は分析のために保存、保管及び／又は送信されてもよい。
器具の内部部分、例えばハウジング233内は、さらに滅菌可能に構成されてもよい。特に、器具の一部は、取り外されて個別に滅菌されてもよい。滅菌は、例えば、UV照射、または汚染を制限するため、または規制要件を満たすために必要とされ得る他の任意の滅菌方法によって実行されてもよい。ハウジングを含む装置は、高効率粒子状空気（HEPA）濾過環境内に収容されてもよい。ハウジングを含む装置は、温度制御されたエンクロージャ内に収容されてもよい。さらに、装置自体が、温度制御される1つ以上の領域を含んでいてもよい。本明細書に記載の装置のいずれかにおいて、装置は、試薬を保存するため、及び／又はmRNA（例えば、治療用mRNA）を保存するための、例えば、保存温度（例えば、-10℃～20℃の温度、例えば、10℃、4℃、-10℃など）で温度制御された領域を（例えば、ハウジング内に）含んでもよい。これらの装置のいずれかは、個別にまたは1つ以上の追加のmRNAおよび送達ビークルと組み合わせて配合され得る製造されたmRNAのライブラリーを含んでもよい。
上述したように、マイクロ流体経路デバイスコントローラシステムは、マイクロ流体経路デバイス211を介して圧力を加え、少なくとも流体移動を駆動することを含め、コントローラ221によって制御されてもよい。コントローラは、ハウジングの完全に又は部分的に外側にあってもよい。コントローラは、ユーザ入力／出力を含むように構成されてもよい。例えば、システムのユーザーインターフェース223は、装置及びマイクロ流体経路デバイス（複数可）の容易な操作及び指示を可能にしてもよい。
本明細書で説明する装置のいずれもが、図2Bに示す構成要素のすべてまたは一部を含んでいてもよく、すべての構成要素が必要であるとは限らない。図2Bでは、構成要素間の接続の一部のみが示されており、追加の（または代替の）接続が使用されてもよい。
マイクロ流路デバイス制御システムは、試薬の供給、流体制御、温度制御、混合、精製、プロセスモニタリングなど、マイクロ流路デバイス内のすべての生産活動をサポートすることができる。マイクロ流路デバイス制御システム上の製造活動は、アプリケーションソフトウェアを通じてアクセスし、制御することができる。
マイクロ流路デバイスは、治療用（例えば、治療用mRNA）材料を精密に調製するために行われる製造ステップのための1つ以上の反応器を含むように構成されてもよい。同じマイクロ流体経路デバイスが、直列及び／又は並列に、マイクロ流体経路デバイス制御システムの連続経路の性質を中断することなく、1つ又は複数のマイクロ流体経路デバイス上で動作してもよい。例えば、複数のマイクロ流体経路デバイスを使用して複数のリアクターで行われる複数の処理工程を使用して治療薬を製造する場合、1つのマイクロ流体経路デバイスからの部分生成物を含む流体生成物（複数可）は、マイクロ流体経路デバイス制御装置の貯蔵デポ部分へマイクロ流体経路デバイス生成物を含む流体を動かすことを含む装置によって閉経法で1又は複数の追加のマイクロ流体経路デバイスに転送されても良い。
各マイクロ流路デバイスは、製造プロセス中に処理するための1つ以上のリアクターを含むように構成されてもよい。例えば、図3A～3Cは、マイクロ流体パスデバイスの3つの例を示している。これらの例は、鋳型マイクロ流体経路デバイス（図3A）、インビトロ転写（IVT）マイクロ流体経路デバイス（図3B）、及び製剤マイクロ流体経路デバイス（図3C）という3つの異なるタイプのマイクロ流体経路デバイスを例証している。これらのマイクロ流体パスデバイスの例の各々は、制御された高度に再現可能な方法で一連の単位操作を実行するための機能を含むように構成されてもよい。
いくつかの変形例では、マイクロ流路デバイスは、2つの畝のある層の間に柔軟な膜を挟んだ、さらに2つの硬い層からなる多層構造として構成されてもよい。図4は、本明細書に記載されるように治療薬を処理するための反応器を形成する複数の層を有するマイクロ流路デバイスの一例を通る断面図（マイクロ流路デバイスの平面に対して横向き）である。反応器は、複数の層から形成されるポンピングチャンバーを含む、シール、チャネル、バルブ、及びチャンバーを含んでもよい。例えば、マイクロ流路デバイスは、2つ以上の剛性又は半剛性プレート403、405及び少なくとも1つの弾性層407から形成されてもよい。弾性層407は、液体不透過性の弾性材料のシートであってもよい。弾性層は、多分、幾分ガス透過性であり、又は、様々な領域を含めて、多かれ少なかれガス透過性になるように処理されてもよい。弾性材料の単一の連続したシートが使用されてもよいが、いくつかの変形例では、複数の弾性材料シートが使用されてもよく、または「シート」は複数のシートの部分から形成されてもよい。また、層と弾性体シートとが積層されていてもよい。一般に、弾性層が液体を含む側と圧力（例えば、気体）を加える側とにチャンバを二分するように、弾性層の両側のプレートに、流体を保持、バルブ化および／または圧送するためのチャンバが形成されてもよい。チャンバー（複数可）の全体容積は一定で、第1（例えば、上）プレートと第2（例えば、下）プレートの両方に形成されてもよいが、この容積は圧力側と液体側に分割されてもよい。圧力側に正圧または負圧を加えることにより、弾性シートを変形させて、液体を含む側の容積を小さく（ゼロにし、チャンバーを閉鎖）したり、液体を含む側の容積を大きく（所定の最大値まで）したりしてもよい。また、1つ以上のチャンバーの受圧側419に負圧または正圧を加えるために、圧力流路447に接続する上板403の圧力ポート443を介して、例えば、圧力印加側を接続してもよい。各チャンバの圧力印加側と反対側の液体含有側417は、流体チャネル421を介して流体ポート423に接続されてもよい。流体ポートおよび圧力ポートの両方が、上部プレート403および弾性層407への開口部によって形成されてもよく、圧力ラインが、反対側の剛性または半剛性層（複数）、405、409によってポートの下側に支持されている弾性層407に押し込まれるので、複数の異なる入力ラインがある場合でも大気から隔離された密閉接続が可能である。
図4において、マイクロ流路デバイス400は、第1（例えば、上または上部）表面411と第2（底または下部）表面429と両者の間の厚さを有する第1（例えば、上部）プレート403を含む。第1の表面411は、露出した外面を形成してもよい。マイクロ流体経路デバイスは、第1（例えば、上面又は上部）表面431と第2（例えば、下部又は底部）表面433とその間の厚さを有する第2プレート405も含む。弾性層407は、第1プレート403の第2表面429と第2プレート405の第1表面431との間に挟まれる。第3の板409は、第2の板の第2の面433上で、直接的または間接的に第2の板に結合される。第3のプレート409も、第1（例えば、上または上部）表面と第2（下部または底部）表面とその間の厚さを有する。第3のプレートの第2の表面は、マイクロ流体経路デバイスの底面を形成してもよい。いずれのプレートも、複数の層で形成されてもよく、これらの層は、積層されるか、または他の方法で連結されてもよい。例えば、図4において、第3のプレート409は、第3のプレートを第2のプレートに結合するのを助けることができる任意の第2の弾性層413を含み、この例における第2の弾性層413は、第3のプレート409の第1の表面435を形成する。図4に示される層及びプレートは、縮尺通りでない場合がある（例えば、弾性層407は、プレートに対してより薄い場合がある）。
また、図4に示すマイクロ流路デバイス400は、それぞれが一定の容積を有する複数のチャンバー415、416、418、420を含んでもよい。これらのチャンバーは、第1プレート403の第2（下）面429及び第2プレート405の第1（上）面431への切り込み領域（例えば、丸み／曲線状の切り込み）によって形成され、弾性層407は、それぞれが液体含有側417及び圧力（例えば、ガス含有）側419を含むようにこれらのチャンバー415を分岐させる。また、マイクロ流路デバイス400は、複数の液体（例えば、流体）チャンネルを含んでもよい。図4では、単一の液体チャネル421が、第1プレート403の厚さを通過する液体ポート423から、弾性層407を通り、第2プレート405の厚さの多くを通って、第2プレートの底面433に至る液体チャネル421の長さが第3プレートの底面433と平行に形成されて、第3プレート409の上面によって境界が定められる液体チャネル開口425まで延びていることが示されている。
流体ポート423に関して、流体ポート423を形成する第1のプレート403への開口部のうち、第1のプレートの厚さを通って延びる直径は、弾性層407を通って液体（例えば、流体）チャネル421に延びる流体チャネル開口部425の直径より大きくてもよい。流体チャネル開口部425は、流体ポート開口部の底部に対して中央に配置されてもよく、流体ポートに接続することになる流体ライン又は流体ライン結合インターフェースの予想壁厚さ以上だけ流体ポート開口部の壁からオフセットされてもよい。
流体路421は、第1のチャンバー415の液体含有側417に接続する。この第1のチャンバーは、比較的低い保持容積（固定容積）を有するが、弾性層407の移動によって完全に開閉可能なバルブとして構成されてもよい。
マイクロ流路デバイス400はまた、正圧および／または負圧をかけるために独立して制御され得る複数の圧力チャネルを含む。図4では、第4のチャンバー420に接続された単一の圧力ポート443が示されているが、チャンバー415、416、418の各々は、これらのチャンバーを分岐する弾性層407の部分の動きを独立して操作及び制御し、各チャンバーを独立してバルブ、及び／又はポンプするための別々の圧力ポート及び圧力チャネルに接続してもよい。いくつかの変形例では、圧力ポートを複数のチャンバー間で共有してもよい。図4において、圧力（例えば、気体）ポート443は、流体（例えば、液体）ポート425と同様であり、第1のプレート403を完全に通り、露出した弾性層407に至る開口を含み、圧力（例えば、気体）チャネル開口445を形成する弾性層を通る開口に至る。圧力チャネル開口部445は、圧力ポート443から延び、第1のプレート403の厚さの多くを通り、第2のプレートの底部に沿った切り出しチャネルで（または代替的に第3のプレートの頂部の切り出し領域へ）、第2のプレートおよび弾性層407を通って戻り、第1のプレート内の圧力チャネルの領域であって、第4の室420の圧力（例えば、ガス）含有部分419に連なる圧力チャネル447と連続的である。同様の流体（例えば、液体）ポートについて説明したように、第1プレート403の厚さを通過する圧力ポート443の直径は、弾性層407を通過する圧力チャネル開口445の直径より大きくてもよく、圧力ポートに接続する圧力ラインまたは圧力ライン結合インターフェースの壁厚より大きく中央に配置またはオフセットされてもよい。
図4に示すマイクロ流路デバイス400を通る断面では、他の流体（例えば、液体）ライン、流体ポート、圧力ライン、圧力ポートへの複数の接続があるが、それらは示された平面から外れている場合があるので、図示されていない。例えば、図4において、第4のチャンバの液体含有側417又は部分は、例えば、液体含有側417から延びる出口チャネルを含む追加のバルブ（チャンバ）及び／又はチャネルに接続されてもよい。図示しない追加のチャンバ（例えば、弁として構成されたもの）は、上述したように形成されてもよい。いくつかの変形例では、出口チャネルは、1つ以上のチャンバから別の流体ポート（図示せず）を介して流体受容デポ、例えばバイアル、チューブなどに流体を送達してもよい。この受取デポは、試薬収納フレームに保持されてもよい。
一般に、このようなマイクロ流路デバイスとマイクロ流体装置の構成は、複数の複雑なステップを、マイクロ流路デバイス上の装置によって、完全密閉（密閉して大気から保護）した状態で、人手を必要とせずに実行できるように構成されている。流体は、固定容量チャンバーを使用して計量され、弾性層の領域をたわませるために空気圧を適用することによって、移動、混合、ろ過などが行われるかもしれない。
いくつかの変形例では、マイクロ流体経路デバイス内のチャンバーは、マイクロ流体経路デバイス内の流体を混合するための混合チャンバーとして構成されてもよい。いくつかの変形例では、チャンバ（複数可）は、透析チャンバとして構成されてもよく、これは、流体内の物質を透析するための透析物質及び1つ又は複数の向流チャネルを含んでもよい。いくつかのバリエーションでは、1つまたは複数のチャンバーは、治療材料を濃縮するための濃縮器として構成されることがある。
様々なマイクロ流路デバイスは、チャネル、ポート、およびチャンバーの配置が異なる場合があるが、それらはまた、同様の基本アーキテクチャと、異なるプロトコルを実行するために異なる構成で使用できる多くの機能要素を共有する場合がある。機能的要素には、上述したように、入力ポート、計量バルブ、ポンプ、反応チャンバー、混合構造、精製構造などがある。
これらのマイクロ流路装置のいずれかが、1つ以上の気泡除去チャンバを含んでいてもよく、あるいは、チャンバの流体接触側のチャンバのいずれかが気泡除去チャンバとして構成され、流体含有側の流体内の気泡が除去されていてもよい。気泡除去チャンバーは、真空キャップと呼ばれてもよく、一般に、流体がチャンバーの流体接触側内に保持されている間、メンブレンの反対側に負圧を加えるように構成されてもよい。膜は、前述のように、少なくとも部分的にガス透過性であってもよい。図19は、気泡除去チャンバの一例を示す。チャンバを仕切る膜の全て、又はより好ましくは一部1988（例えば、キャップ領域だけ）は、図19Cに示すように、例えば、装置の上面又は上板の真空ライン1987を介して真空と接触していてもよい。動作において、真空キャップ1938は、チャンバの流体接触側内に流体を保持し、チャンバの上側（受圧側）に負圧を加えることによって、ライン内の気泡を除去又は減少させてもよい。チャンバを流体接触側と受圧側とに仕切る膜は、ガス透過性であってもよく、負圧が流体経路の上にある膜を通してガス（例えば、空気、窒素など）を引き込むことによって、液体（流体）側からガスを除去することができるようにする。例えば、膜（または真空キャップ内の膜の領域）は、膜の液体側からガスを除去できるように十分にガス透過性である、例えば、ポリジメチルシリコーン（PDMS）エラストマーフィルムであってよい。本明細書に記載されるような一定の容積を有する流体チャンバ（例えば、第1のプレートと第2のプレートとの間に形成される）は、1つ以上の気泡除去チャンバ（真空キャップ）を含むか又はそれに結合されてもよく、及び／又は気泡除去チャンバとして構成されることができる。いくつかの変形例では、チャンバを形成する第1面と第2面の間に配置された弾性層の部分であって、例えば第2面（及び／又は第2プレート）における流体接触側と第1面（及び／又は第1プレート）における圧力受入側とを分ける部分は、最小限の偏向のみ（又は全く）されてもよい。例えば、上部の、圧力を受ける側は、最小限の間隔、及び／又は緩和された膜とほぼ同一平面（例えば、平坦）であってもよく、一方、流体と接触する側は、凹状で、第2の表面（第2のプレート）内に延在している。コントローラは、例えば、真空キャップのいずれか一方又は両方の側（入口及び出口）の弁を塞ぐことによって、真空キャップ領域内に流体を保持してもよく、例えば、弁の受圧側に正圧を印加してもよく、真空キャップの受圧側に負圧を印加してもよい。印加される負圧の絶対量（例えば、負圧の大きさ）は、膜を偏向させるために印加されるものよりも小さくてもよい（例えば、弁を閉じるために印加される正圧の絶対値よりも小さい、及び／又はポンプ）。あるいは、いくつかの変形例では、膜は、例えば、チャンバの拡大された流体接触側に流体を引き込むために、第1の表面及び／又はプレートに対して、偏向される（例えば、上に偏向される）ように構成されてもよい。膜は、第1の上面に対して印加された負圧によって保持され、ガスバブル（例えば、気泡）が除去されることを可能にしてもよい。コントローラは、全て又は一部のガスを除去するのに十分な期間（例えば、1秒以上、5秒以上、10秒以上、20秒以上、30秒以上、1分以上、1分半以上、2分以上、5分以上、1秒以上5分以下、2秒以上5分以下、5秒以上5分以下、等）真空チャンバ内に流体を保持してもよい。図9Cでは、装置の第1面と第2面（例えば、第1プレートと第2プレート）の間に形成されたチャンバの受圧面と連通する圧力ライン987を介して圧力を印加してもよい。真空キャップ938は、1つ又は複数のバルブ992によってバルブ化されてもよい。流体は、真空キャップの反対側にある流体ライン989から流体接触側を出てもよい。
圧力キャップのチャンバの流体接触側は、（本明細書に記載の弁及び反応器と同様に）1つ以上の流体チャネルを介して各チャンバの流体接触側と流体連通していてもよく、この流体ポートは第2の表面及び／又はプレートに存在することができる。真空キャップの受圧側は、本明細書に記載されているように、第2のプレートを通って第1のプレートに沿って延びる圧力チャネルを介して受圧ポート又は側と流体連通するように、第1の表面／プレートを通って（例えば、表面／プレート内に）延びる圧力ポートに流体連通していてもよい。
本明細書に記載されるマイクロ流路デバイスはいずれも、上述したように、デバイスが実質的に薄いマイクロ流路プレートデバイスであってよい。したがって、プレート内／プレート上での処理は、任意のポリヌクレオチド（例えば、mRNA）の精製を含む、実質的に2次元（2D）で実行されてもよい。ポリヌクレオチドの2Dでの精製は、カラムの使用を必要とし、本明細書に記載のように閉経環境及び／又は少量で行うことが困難又は不可能なステップを含む可能性のある先行技術に比べ、特に有利である。
さらに、図4に示されるように、各チャンバの流体接触側（および／または圧力受容側）は、圧力受容側の正圧が弾性層を流体接触側に対して駆動したときに、弾性層が第2の表面における流体接触側と面一で隙間なく着座するように構成されてもよい。いくつかの変形例では、流体接触側面および／または圧力受容側面は、凹面であってもよい。この凹みは、弾性層が流体接触側（および／または圧力受容側）の壁に対して容易に同一平面に着座することを可能にするために、幾分浅い楕円形の断面を有していてもよい。弾性層は、チャンバー（例えば、流体接触側の）のデッドリテンション部分がないように、チャンバーの壁に対して押す（例えば、座る）ことができる。
マイクロ流体パスデバイスは、試薬、および流体の動きとバルブ制御を管理するために使用される空気圧ラインの両方のための一連のバネ式接続を介して、マイクロ流体パスデバイス制御システムとインターフェースすることができる。試薬及びガスラインは、試薬バイアルからマイクロ流体経路デバイスへ、及びマイクロ流体経路デバイスから輸出バイアルへの完全に密封された経路を形成するマイクロ流体経路デバイスに埋め込まれたエラストマー層に対する圧力によって密封されてもよい。密閉された経路は、マイクロ流路デバイス内のすべての反応を通じて維持され、大気との接触を効果的に排除し、汚染のリスクを最小限に抑えることができる。
本明細書に記載されたマイクロ流路デバイス制御システムは、無菌制御環境を提供してもよく、試薬をロードし、出力を取り出すためのインタフェースを含んでもよい。本明細書に記載される装置（例えば、システム）のいずれかにおいて、装置は、制御された環境を提供する筐体を含んでもよく、この筐体はまた、制御された環境内に配置されてもよい。例えば、封入された装置は、クラス7環境内に配置されてもよいクラス5環境であってもよい。
マイクロ流体経路デバイスの制御システムで、すべてのアクチュエータにワンステップで接続できるようにしてもよい。これらの制御システムはまた、すべての試薬およびマイクロ流路デバイスの識別子（例えば、バーコード）をスキャンしてもよく、流体レベルを監視してもよい。一般に、これらのマイクロ流路デバイス制御システムは、マイクロ流路デバイスの機能の全てまたは一部を自動化してもよく、（例えば、中間プロセス出力の光学的品質管理分析などのために）監視、保存、送信、または後でレビューされ得る全てのプロセスステップの視覚的記録を生成してもよい。
上述のように、マイクロ流体パスデバイス管理システムは、マイクロ流体パスデバイスが正しく整列されるように設計され得るネスト（マイクロ流体パスデバイスホルダー）等のハードウェアを含むマイクロ流体パスデバイス管理システムを含み得るが、単一の方向においてのみ挿入され得る。これは、例えば、2つのピンおよび／またはマイクロ流体パスデバイスの形状によって一致するネストの切り欠きを介して管理されてもよい(エラー! 参照元が見つからない。)マイクロ流体パスデバイス管理システム（制御システム）には、試薬とエクスポートバイアルを保持するバイアルラック、液体とバルブの動きをすべて記録する下向きカメラ、製品のエクスポートも含まれる。バーコードを撮影し、液面を検出するためのレール上の側面カメラ、ビーズ操作のための磁石付きロボットアーム。マイクロ流路デバイスは真空チャックで固定され、温度管理のためのペルチェデバイスと良好に接触するようになっている。マイクロ流路デバイスを設置した後、マイクロ流路デバイス管理システムの上部をダボピンガイドシステムで下げることにより、すべてのコネクタとの嵌合がワンステップで実現する。
前述のように、マイクロ流路デバイス制御システムは、すべての電子デバイス（CPU、イーサネットRIOデバイスコントローラなど）のインターフェースとなるコントロールパネルや、空気圧制御用のバルブやマニホールド、圧力レギュレータなどを含むことができる。これらのシステムのいずれもが、HEPAエアフィルターと気流管理によって微生物学的に安全なエンクロージャーを提供するバイオセーフティフードのように動作する冷蔵キャビネットまたはチャンバー（例えば、ISOクラス5安全キャビネット）を含むこともできる。さらに、このキャビネットは、すべての試薬が製造工程を通じて適切な温度に保たれるようにすることもできる。また、キャビネットには、マイクロ流路デバイスおよび内部のマイクロ流路デバイス管理システムコンポーネントを滅菌するためのUVランプが装備されている場合がある。マイクロ流体パスデバイス管理システムは、それ自体がISOクラス7の部屋にある環境（例えば、6フィート×6フィートのISOクラス5のミニ環境）内に存在してもよい。試薬バイアル及びマイクロ流体経路デバイスの装填を含むオペレーター及びシステムの相互作用は、全て無菌ベストプラクティスに従って実行されてもよい。
送達ビヒクル
本明細書に記載された方法および装置は、広範なmRNA送達ビヒクルと互換性がある。例えば、送達ビヒクルは、エレクトロポレーション及び遺伝子銃、アデノウイルス（AV）又はアデノ随伴ウイルス（AAV）によるウイルス送達、エクソソーム及びリポソーム、カチオン性ポリマーによるカプセル化、及び脂質ナノ粒子（LNP）による製剤と適合し得る。
治療薬の製造
本明細書では、治療薬を製造するための方法、および装置（例えば、デバイス、およびシステム）を説明する。これらの方法および装置は、患者特異的な治療薬を、非常に迅速な期間で製造するために使用され得る。特に、これらの方法および装置は、上記のように、mRNAなどのポリヌクレオチドに基づく治療薬を製造するために使用されてもよい。このプロセスの一部として、方法及び装置は、IVT DNA鋳型の製造、治療用mRNAを生成するためのIVT反応の実行、治療用mRNAの精製、治療用組成物を形成するための送達ビヒクルとのmRNAの製剤化、及び最終薬物の製剤後の処理など、上述のステップの一部又は全部を実行してもよい。
IVT鋳型の作成
本明細書に記載されたDNA鋳型の製造方法、特に合成DNA鋳型の製造方法は、より優れた、より拡張性のある、より迅速で安全なワクチンおよび治療薬を製造するために特に有用であると考えられる。IVTによるmRNA合成のための合成鋳型の使用は、潜在的な微生物汚染を防止することを含め、多数の点で有益である。合成DNA鋳型を含む溶液は、一般に、汚染する細胞、細胞抽出物、および細胞からのエンドトキシンを含まない。これらの溶液は、汚染細胞、細胞抽出物、またはエンドトキシンに起因する毒性のリスクが実質的にない、患者に注射するためのワクチンの一部となることに特に適している可能性がある。
いくつかの変形例では、本明細書に記載されるようなインビトロ転写促進剤カセット（IFC）は、インビトロ転写可能な二本鎖DNAである。図6には、二本鎖DNA鋳型の作製に有用なインビトロ転写ファシリテーターカセットの一例が示されている。in vitro転写促進剤カセットは、プロモーター、5'非翻訳領域、（5'UTR）をコードする部分、3'非翻訳領域（3'UTR）をコードする部分、およびポリAテールをコードする部分など、（例えば、目的の挿入遺伝子から）効果的にin vitro転写を促すように構成された機能要素を含んでいる。また、in vitro転写促進剤カセットは、目的の遺伝子の発現のために目的の遺伝子をin vitro転写促進剤カセットにクローニングするために有用な1つ以上のリンカーと、鋳型の直線化を確実にするための制限部位とを含む。
In vitro転写促進剤カセットは、合成的または非合成的に製造することができるが、一般的には合成的に製造されるであろう。いくつかの変形例では、合成in vitro転写促進剤カセットの製造方法は、Twist Bioscience（カリフォルニア州サンフランシスコ）またはThermoFisher Scientific（マサチューセッツ州ウォルサム）から入手できるものなどの市販のDNA合成機を使用することを含む。さらに、in vitro転写促進剤カセットは、DNAの別々の部分から組み立てることができ、またはそれは1つの部分として合成されることができる。いくつかの実施形態では、インビトロ転写促進因子カセットは線形であり、一緒にライゲーションすることができる互換性のある末端を含むことができる。いくつかの実施形態では、インビトロ転写促進因子カセットは、環状である。いくつかの実施形態では、環状のインビトロ転写促進剤カセットは、適切な制限エンドヌクレアーゼの適用により、プロモーター、5'UTR、リンカー領域、3'UTR、及びポリA領域をコードする部分を順に含む線形DNAを生成するように構成されたポリA領域をコードする部分とプロモーターとの間の部位（例えば、制限エンドヌクレアーゼ部位）を含んでいる。一般に、in vitro転写促進剤カセットは、抗生物質耐性遺伝子をコードしていない。例えば、合成的に合成されたin vitro転写促進剤カセットは、生物（例えば、細菌）細胞内で増殖しないため、抗生物質耐性遺伝子を必要とせず、抗生物質による選択を必要としない。一般に、in vitro転写促進剤カセットは、DNA複製を促進するための複製起点（ori）または関連する制御エレメントを有しない。例えば、合成的に合成されたin vitro転写促進因子カセットは、生物（例えば、細菌）細胞内で増殖しておらず、複製のためのoriが必要ないため、oriが不要である。in vitro転写ファシリテーターカセットの全長は、多くのプラスミドよりも小さくすることができる。in vitro転写促進剤カセットは、長さ2kb未満、長さ1.5kb未満、長さ1.0kb未満、長さ900bps未満、長さ800bps未満、長さ700bps未満、または長さ600bps未満とすることができる。
上記に示したように、in vitro転写促進カセットはプロモーターを含んでいる。酵素RNAポリメラーゼはプロモーターに結合し、目的の遺伝子からのRNAの転写を開始する（例えば、二本鎖DNA鋳型がカセットと目的の遺伝子から組み立てられた後）。カセット内の転写に有用なプロモーターの例としては、天然もしくは改変T7プロモーター、天然もしくは改変T3プロモーター、または天然もしくは改変SP6プロモーターが挙げられる。
また、in vitro転写促進カセットは、交換可能な5'非翻訳領域（5'UTR）をコードする部分と交換可能な3'非翻訳領域（3'UTR）をコードする部分を含んでいる。これらの領域は、それ自身はタンパク質やペプチドに翻訳されないが、mRNAからタンパク質やペプチドへの翻訳を制御するのに役立つ。また、in vitro転写促進因子カセットは、ポリAテールをコードする部分を含む。mRNAにおけるポリAテールは、数十から数百のアデニン残基が繰り返し結合した長鎖である。mRNA上のポリAテールは、細胞質におけるmRNAの安定性を高め、mRNAからタンパク質への翻訳を助けるなど、いくつかの機能を果たすと考えられている。mRNAにおける鋳型のDNAによって直接コードされているmRNAの残りの配列とは異なり、ポリAテールは通常（例えば、自然界では）DNAによって直接コードされていない。むしろ、自然界に存在するDNAは、ポリアデニレーションシグナル（例えば、AATAAA）と呼ばれる略号を含んでおり、他のDNA配列とともに、細胞内の転写機構に、合成中のmRNAにポリAテールを付加するようにシグナルを送る。つまり、天然に存在するmRNAのポリAテールの長さは、mRNAを作る細胞によって決定されるのである。図6に見られるように、本明細書に記載のin vitro転写促進剤カセットは、ポリAテールを直接コードするDNAの領域（例えば、テール全体）を含む。ポリAテールの長さは、ポリAテールを直接コードするDNAの領域における長さ（例えば、アデニンまたはポリAの数またはチミジンの数またはポリTの数）によって決定される。ポリAテールを直接コードするDNAの領域は、少なくとも100bp長、少なくとも200bp長、少なくとも300bp長、少なくとも400bp長、または少なくとも500bp長であり得、これらのサイズ（例えば350塩基対長）の間のものであり得る。カセットを鋳型として作成したmRNAに、残りのmRNAの作成に用いたのと同じ工程で、ポリAテールを付加することができる。そのため、polyA tailを含むmRNA全体の作製工程が大幅に簡略化されるという利点がある。mRNAの生成には、生細胞や、細胞DNA、細胞RNA、細胞膜タンパク質などを含む細胞からの複雑な抽出物が不要である。その代わりに、本明細書に記載されているように、二本鎖DNA鋳型からポリAテールを含むmRNA全体を生成するために、十分に定義された転写混合物を用いることができ、細胞または細胞抽出物を用いて作られる転写混合物に見られるような毒性のある副産物を一般的に含まない転写混合物を作ることができる。このようによく定義された混合物は、最小限の後始末だけで患者に安全に提供することができる。二本鎖DNA鋳型もまた、実質的に有毒な副産物を含まない十分に定義された混合物から生成される場合、二本鎖DNA鋳型から作られた転写産物は、必要な最小限の洗浄のみで患者への直接注入に好適である。本明細書に記載されているのは、実質的に毒性のある副産物を含まない、よく定義された混合物から生成される二本鎖DNA鋳型である。
また、in vitro転写促進剤カセットは、1つ以上のリンカー領域を含む。リンカー領域は、5'UTRと3'UTRの間にある。リンカー領域は、少なくとも1つの開裂可能な部位、一般的には2つの開裂可能な部位を含む。2つ以上の切断可能部位が存在する場合、それらは同じ配列を有していてもよいし、異なる配列を有していてもよい。1つ以上の切断可能な制限部位は、目的の遺伝子（GOI）をin vitro転写促進剤カセットに挿入して、合成の直鎖状または環状のリゲーション産物を生成するのに有用である。対象の遺伝子は、一般に、in vitro転写促進剤カセットの5'UTRと3'UTRの間に挿入されるが、場合によっては、5'UTRまたは3'UTR配列が対象の遺伝子と共に含まれて、対象の遺伝子と共にin vitro転写促進剤カセットに挿入される可能性がある。切断可能部位（複数可）は、制限エンドヌクレアーゼ部位、例えば、タイプII（タイプIIG、タイプIIS）制限エンドヌクレアーゼ、例えば、BsaI、BbsI、AarI、HhaI、HindIII、NotI、BbvCI、EcoRI、BglII、FokI、AlwI、AcuIまたはBcgIがNew England Biolabs（NEB、Ipswich、 MA）、Promega Corporation（Madison、 WI）、またはThermoFisher Scientific（Waltham、 MA）から入手可能である。
本明細書に記載される対象の遺伝子（GOI）は、一般に機能的産物分子（RNAまたはタンパク質）をコードするDNAの短い断片である。目的の遺伝子は、特定のタンパク質、タンパク質の一部、または特定の機能をコードすることができる。場合によっては、特定のタンパク質またはタンパク質の一部をコードしないRNAを生成するための指示を含むこともある（例えば、翻訳されない機能性RNAをコードすることもある）。
in vitro転写促進剤カセットに挿入するのに有用な目的の遺伝子は、合成的または非合成的に製造することができるが、一般的には合成的に製造されるであろう。目的の合成遺伝子を製造する方法としては、Twist Bioscience社（San Francisco、CA）またはThermoFisher Scientific社（Waltham、MA）から入手できるような市販のDNA合成機および方法を使用することにより、製造することができる。さらに、目的の遺伝子は別々のDNAから組み立てることもできるが、一般的には1つのピースとして合成される。目的の遺伝子は、DNAの線状片として製造されてもよいし、円状片として製造されてもよい。円形の目的遺伝子は、制限酵素で消化され、直鎖状の目的遺伝子となる場合がある。製造された目的遺伝子は、精製（例えば、カラム、電気泳動分離など）されてもよい。
一般に目的の遺伝子は、in vitro転写促進剤カセットと結合する前に切断される。特に、目的の遺伝子は、in vitro転写促進剤カセットを切断するために使用されるのと同じ制限エンドヌクレアーゼ（複数可）で切断されてもよいが、酵素増幅によって生成されてもよい。一般に、目的の遺伝子は抗生物質耐性遺伝子をコードしていない。例えば、合成的に合成された目的の遺伝子は、生物（例えば、細菌）細胞内で増殖しておらず、抗生物質選択を必要としないので、抗生物質耐性遺伝子を必要としない。一般に、目的の遺伝子は、DNA複製を促進するための複製起点（ori）または関連する制御エレメントを有していない。例えば、合成的に合成された目的の遺伝子は、生物学的（例えば、細菌）細胞内で増殖しておらず、複製のためにオリを必要としないので、oriを必要としない。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子の全長は、多くのプラスミドよりも小さくすることができる。目的の遺伝子は、長さ2kb未満、長さ1.5kb未満、長さ1.0kb未満、長さ900bps未満、長さ800bps未満、長さ700bps未満、または長さ600bps未満、長さ500bps未満、長さ400bps未満、または長さ300bps未満、長さ200bps未満、長さ100bps未満であってよい。
いくつかの例では、対象の遺伝子は、T細胞受容体（TCR）またはT細胞受容体の一部であり、例えば、CTCLまたはT細胞受容体（TCR）またはT細胞受容体の一部によって媒介される他の疾患または状態を治療するためのものである。例えば、T細胞の発生において、細胞はT細胞受容体（TCR）遺伝子を再配列し、新規TCR分子を作成し発現させなければならない。TCRの再配列はT細胞の発生初期に起こり、CTCLのような成熟T細胞リンパ腫が発生する前に起こるため、すべての悪性CTCL細胞は、固有のTCRαおよびTCRβサブユニットからなる、同一のクローンTCRを発現している。このTCRはリンパ腫細胞に特有であり、免疫系にとって異物であるため、治療の優れたターゲットとなる。
対象となる遺伝子は、相補性決定領域（CDR）領域の一部または全部であってもよい。CDRは、TCR配列の高度に可変な部分であり、T細胞の抗原-主要組織適合性複合体（MHC）への結合を媒介する。図8には、ワクチンまたは治療に使用するための二本鎖DNAを作るのに有用なT細胞受容体の1つの領域が示されている。特に、V（D）J領域とC領域の接合部にまたがるCDR3領域は、最も高い変動性を有し、リンパ腫細胞においてのみ見出されるべき、真にユニークなタンパク質断片を表している。したがって、C末端とN末端の両方で10アミノ酸延長されたCDR3領域がワクチンペプチド断片を構成する。いくつかの方法では、T細胞受容体（TCR）またはT細胞受容体の一部のような遺伝子の固有配列が個体から決定され、目的の遺伝子は個体からのT細胞受容体（TCR）またはT細胞受容体の一部と同一であるように製造される。場合によっては、コドン最適化または最適化されたRNA安定性もしくは発現のためなど、特定の既知の方法で配列が制御可能に改変されることもあるが、それでも対象の遺伝子の配列は、個体から得られた配列に基づくものである。いくつかの実施形態では、目的の遺伝子の配列は、患者からのDNA配列と同一のDNA配列、または患者からのDNA配列に対して既知の方法で制御可能に改変されたDNA配列を有するT細胞受容体を含んでいる。
本明細書では、二本鎖DNA鋳型の作製方法、特に合成二本鎖DNA鋳型の作製方法について説明する。二本鎖DNA鋳型は、ワクチンまたは患者への注射または別の様式の送達のための他の治療薬に用いるようなmRNAを生成するためのin vitro転写を行うために特に有用であり得る。
体外転写を行うための既存のDNA鋳型および体外転写を行うための混合物は、一般的に粗製または半精製の細胞抽出物（例えば、細菌、他の微生物、または他の抽出物）を含み、複雑かつ未定義である場合がある。そのような抽出物は、細菌、他の微生物、または他のDNA、エンドトキシン、および／または他の望ましくない成分を含む場合がある。ワクチンまたは治療用のプロセスの一部として、DNA鋳型の生成またはin vitro転写の実行のために使用される場合、望ましくない成分は、重大な副作用のリスクを増加させる可能性がある。例えば、エンドトキシンはグラム陰性菌の外壁に含まれるリポ多糖の大きな分子であり、体外転写反応に用いる細胞抽出物の生成源として一般的に使用されている。注射などで血流に乗ったエンドトキシンは、ヒトや他の動物に炎症や敗血症など様々な問題を引き起こし、大きな健康リスクをもたらす。本明細書に記載の方法は、生物学的汚染物質（細菌、他の微生物または他の汚染物質）を含まない、細菌（または他の微生物または不要な）DNAを含まない、および／またはエンドトキシンを含まない二本鎖DNA鋳型を作るのに特に有用であり得る。本明細書に記載の方法は、目的の遺伝子を作るため、in vitro転写促進剤カセットを作るため、及び／又は二本鎖DNA鋳型を作るため（又はこれらの材料を作るために用いられる任意の中間体を作るため）に、定義された又は合成成分を使用することを含み得る。定義された又は合成された成分は、DNA合成剤、精製ヌクレオチド、精製酵素などの定義された又は合成された成分から作製されてもよい。定義された又は合成された成分は、細菌、他の微生物、又は他のDNA、エンドトキシン、及び／又は他の望ましくない成分を本質的に含まないものであってよい。生物学的成分の使用を避けることにより、DNAやエンドトキシンなどの生物学的汚染物質が、そもそもDNA鋳型（または他の成分）を汚染することがない。二本鎖DNA鋳型および下流材料は、困難または厄介な精製ステップを必要とせず、より安全である。本明細書におけるこの方法および他の方法は、目的の合成遺伝子と合成体外転写促進剤カセットとを接合して合成線形または環状結紮産物を生成するステップ、目的の未反応合成遺伝子および未反応合成体外転写促進剤カセットを除去するステップ、環状結紮産物を増幅して線形、環状または分岐増幅DNAを生成するステップ、および増幅DNA結紮産物を線形化して二本鎖DNA鋳型を生成するステップを含み得る。
上記に示したように、目的の遺伝子とin vitro転写促進剤カセットとを接合して合成直鎖状または環状リゲーション産物を作製することは、目的の遺伝子をin vitro転写促進剤カセットに挿入することを含むことができる。図7には、本明細書に記載されるように生成された二本鎖DNA鋳型が示されている。対象の遺伝子及びin vitro転写促進剤カセットは、本明細書の他の場所に記載されるような同じ制限エンドヌクレアーゼ部位（複数可）を有してよく、方法は、対象の遺伝子及びin vitro転写促進剤カセットを制限エンドヌクレアーゼ部位に対する制限エンドヌクレアーゼで消化し、適合する末端を作り、対象の遺伝子をカセットにライゲートすることを含んでもよい。本方法は、目的の遺伝子、in vitro転写促進剤カセット、制限酵素緩衝液、エネルギー源、1つ以上の制限酵素、リガーゼ緩衝液、及びリガーゼを組み合わせ、混合物を適切な時間インキュベートすることを含み得る。緩衝液（複数可）は、特定の制限エンドヌクレアーゼ及び／又はリガーゼに適したものであってもよく、1つの緩衝液であってもよく、2つ（又はそれ以上）の緩衝液であってもよい。エンドヌクレアーゼ及び／又はリガーゼバッファーは、市販のバッファ（例えば、NEB、Promega）であってもよく、及び／又は約 7.4 から約 9.0 のpHでトリス、カリウム、マグネシウム、塩化ナトリウム、及びジチオスレイトールを含む、例えばトリス-アセテート（例えば、6mM - 90mM）、酢酸カリウム（50mM - 100mM）、酢酸マグネシウム（5mM - 10mM）、ウシ血清アルブミン（BSA、50 ug/ml -200 ug/ml）ジチオスレイトール（1mM）である。リガーゼは、市販のもの（例えば、NEB、Promega、Thermo Fisher Scientific）、あるいはT3 DNAリガーゼ、T4 DNAリガーゼ、T7 DNAリガーゼなどのリガーゼであってもよい。ダイジェストは、10分～4時間、またはその間の任意の時間（例えば、30分、1時間、2時間など）行われ得る。 リゲーションステップは、10分～4時間、またはその間の任意の時間（例えば、30分、1時間、2時間など）行われ得る。消化ステップとライゲーションステップは、同時に行ってもよいし、順次行ってもよい。エネルギー源は、アデノシン5' - 三リン酸（ATP）（例えば、0.1 mMから5 mM）であってもよい。制限酵素やリガーゼなどの成分のいずれかを経時的に追加し、インキュベーションを継続してもよい。いくつかの実施形態では、動物由来でない（AOF）ことが証明された材料のみが、感染性物質を伝播するリスクを低減するために、治療用製造に使用されることになる。インビトロ転写促進剤カセットが円形でないこれらの方法のいくつかは、インビトロ転写促進剤カセットの末端をライゲーションし、円形のインビトロ転写促進剤カセットを生成するステップを含む。あるいは、チューバック法などの目的の遺伝子とin vitro転写促進剤カセットとをライゲーションする他の方法を用いることもできる。代替的または追加的に、指数関数的増幅法の前に、プライマー伸長法を用いて、in vitro転写促進因子カセットと目的の遺伝子との間のライゲーションを行い、線状分子を生成することができる。
本明細書に記載のこの方法または他の方法は、合成直鎖状または環状リゲーション生成物から離れた未反応の合成興味遺伝子および未反応の合成体外転写促進剤カセットを除去するステップ、または未反応の合成興味遺伝子および未反応の合成体外転写促進剤から離れた二本鎖DNAを精製するステップを含んでもよい。合成循環型結紮産物から離れた未反応の合成興味遺伝子及び未反応の合成体外転写促進剤カセットを除去することは、適切なエキソヌクレアーゼバッファ（NEB、プロメガ、サーモフィッシャー）中のエキソヌクレアーゼ（エキソヌクレアーゼV等）などの酵素を用いて行うことができる。本方法は、対象の合成遺伝子及び未反応の合成体外転写促進剤を消化することを含んでもよい。本方法は、消化された混合物をイオン交換樹脂又はサイズ排除樹脂等の樹脂又はカラムに通し、未反応の目的の合成遺伝子及び未反応の体外転写促進剤カセットのいずれかをカラムに保持し、又は二本鎖DNA鋳型をカラムに保持し、二本鎖DNA鋳型又は目的の合成遺伝子及び未反応の体外転写促進剤カセットを樹脂又はカラムに通らせることを含んでもよい。いくつかの実施形態は、消化されたヌクレオチドを樹脂又はカラム内に保持すること、又は消化されたヌクレオチドを樹脂又はカラムを通過させることも含み得る。いくつかの実施形態は、樹脂またはカラムを洗浄および／または溶出することを含む。いくつかの実施形態はまた、樹脂またはカラム内に消化されたヌクレオチドを保持することを含み得る。いくつかの実施形態は、未反応の目的の合成遺伝子及び未反応の合成体外転写促進剤カセットをビーズに結合すること、又は二本鎖DNAをビーズに結合し、ビーズを磁石で保持し、二本鎖DNA又は未反応の目的の合成遺伝子及び未反応の合成体外転写促進剤カセットのいずれかを二本鎖DNAから除去することを含む。樹脂、カラム、および磁気ビーズは、Bangs Laboratories, Inc.、(Fishers、IN)、Beckman Coulter (Brea、CA)、Millipore (Burlington MA), Thermo Fisher、VWR (Radnor、 PA) などから入手することが可能である。いくつかの実施形態は、メチル化感受性制限酵素の使用を含み得る。
本明細書に記載されるこの方法及び他の方法は、線形又は環状のライゲーション産物を増幅して増幅DNAを生成することを含むことができる。いくつかの方法は、線状または環状のライゲーション生成物を増幅して、線状増幅DNAを生成することを含む。いくつかの方法は、線状又は環状の結紮産物を増幅して、線状、分枝状又は環状の増幅DNAを生成することを含む。増幅産物は、ヘリカーゼ依存増幅（HAD）、ループ媒介等温増幅（LAMP）、多重置換増幅（MDA）、核酸配列ベース増幅（NASBA）、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、ローリングサークル増幅（RCA）、自己持続配列複製（3SR）、または鎖置換増幅（SDA）により増幅されることができる。反応に適したバッファー、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（dNTPs）、酵素（DNAポリメラーゼ）、プライマーを必要に応じて添加する。増幅の温度とタイミングを制御する。本方法は、直鎖状または環状のライゲーション産物を加熱（例えば、70℃以上100℃以下）してDNAを変性させ、次いで冷却するステップを含んでもよい。本方法は、DNAを変性させるように構成された変性バッファーを直鎖状又は環状の結紮生成物に添加してDNAを変性させ、次いで変性したDNA混合物に中和バッファーを添加して変性バッファーを中和し変性したDNAを残すステップを含んでもよい。この方法は、変性したDNAを増幅または伸長するためのDNAポリメラーゼ酵素などの酵素（例えば、Bst DNAポリメラーゼ、Φ29 DNA（Phi29）ポリメラーゼ、Taq DNAポリメラーゼ）を加え、酵素でDNAを増幅または伸長して増幅DNA（例えば、分岐、循環、または直鎖増幅DNA）を生成するステップを含んでもよい。
いくつかの方法は、増幅または伸長されたDNAを、緩衝液、酵素、ヌクレオチド、および他の不要な成分から離して精製するステップを含む。この方法は、イオン交換樹脂、磁気ビーズ、またはサイズ排除樹脂などのビーズ、樹脂またはカラムを使用して増幅または伸長したDNAを通過させ、増幅または伸長したDNAを保持するか、増幅または伸長したDNAをビーズ、樹脂またはカラムを通過させて不要な酵素および他の成分をビーズ、樹脂またはカラムに保持するかのいずれかを含むことができる。いくつかの実施形態は、樹脂又はカラムを洗浄及び／又は溶出及び／又は乾燥及び／又は再水和させることを含む。いくつかの実施形態は、これらのステップの1つ又は複数を繰り返すことを含む。いくつかの実施形態は、ビーズ、樹脂、又はカラムの2つ以上（複数）のデポと、洗浄／溶出／乾燥／及び／又は再水和ステップのうちの1つ以上を繰り返すことを含む。いくつかの実施形態は、DNAをビーズに結合させ、ビーズを磁石で保持し、DNAおよびビーズから不要な成分および汚染物を除去する（洗浄する）ことを含む。使用に適した樹脂、カラム、及び磁気ビーズは、Bangs Laboratories, Inc.、(Fishers, IN)、Beckman Coulter (Brea, CA)、Millipore (Burlington MA)、Thermo Fisher、及びVWR (Radnor, PA) から入手可能である。
いくつかの実施形態では、増幅されたDNAは直鎖状ではなく、分岐状または環状であってもよい。いくつかの方法は、DNAを線形化し、線形化された鋳型DNAを生成するステップを含む。いくつかの方法は、精製された増幅DNA又は伸長DNAに制限エンドヌクレアーゼ（適切な緩衝液中）を添加し、DNAを制限エンドヌクレアーゼとインキュベートし、DNAを線状化するステップを含み得る。制限酵素は、5'UTR、目的の遺伝子、3'UTR、およびpolyA領域をコードする部分の外側を切断するように選択される。いくつかの実施形態では、制限酵素は、1つの拡張または増幅されたDNAの3'UTRと、隣接する（および下流の）拡張または増幅されたDNAの5'UTRとの間で切断する。制限酵素は、任意の制限酵素、例えば、合成線状または環状のライゲーション産物を作成するために、対象の合成遺伝子を合成インビトロ転写促進剤カセットと接合するための制限酵素消化に関して上記に示したようなタイプIIs制限酵素であり得る。いくつかの例では、制限酵素は、New England Biolabs (NEB; Ipswich, MA)、Promega Corporation (Madison, WI)、またはThermoFisher Scientific (Waltham, MA) から入手可能なBsaI、BbsI、AarI、HhaI、HindIII、NotI、BbvCI、BglII、FokI、AlwI、AcuIまたはBcgI、の少なくとも1つである。いくつかの実施形態では、制限エンドヌクレアーゼは、目的の合成遺伝子をインビトロ転写促進剤カセットに挿入するために使用されるのと同じ制限エンドヌクレアーゼ（複数可）である。いくつかの実施形態では、制限エンドヌクレアーゼは、目的の合成遺伝子をインビトロ転写促進剤カセットに挿入するために使用される制限エンドヌクレアーゼ（複数可）とは異なるものである。また、本明細書に記載される二本鎖DNAを作製するためのマイクロ流路デバイスリアクターが記載される。
図9には、二本鎖DNAを生成するためのマイクロ流体バイオチップリアクターのアーキテクチャの一変形例が示されている。本明細書に記載されるこの方法及び他の方法は、生成中に全ての構成要素が無菌的に維持される無菌閉鎖バイオチップ内で、関心遺伝子及びインビトロ転写促進剤カセットから二本鎖DNAを生成することを含み得る。無菌閉鎖型バイオチップは、大気に対して閉鎖されている。図9には、二本鎖DNA鋳型になるまでの経路に沿った異なる段階にあるDNA前駆体が移動する4つの相互接続リアクター（例えば、モジュールまたはチャンバー）を有するマイクロ流体バイオチップリアクターが示されている。例えば、図9では、ライゲーション反応器（ライゲーション反応室901）、プレ混合室903、増幅反応器（増幅反応室905）及び消化反応器（消化反応室）907が含まれ得る（この例ではコネクタ及びバルブは図示されていない。本明細書に記載の方法の異なるステップは、異なるモジュール又はチャンバーで実施される。目的の遺伝子とin vitro転写促進剤カセットは、プレミキシングチャンバーで一緒に混合される。ライゲーション反応チャンバーにおいて、目的の遺伝子と体外転写促進剤カセットを結合し、ライゲーション産物を作製する。ライゲーション産物が増幅され、増幅チャンバー内で増幅されたDNAが生成される。増幅されたDNAはさらに処理される。例えば、消化反応室で消化され、不要なDNAが除去されたり、増幅された目的遺伝子の異なるコピーが分離されたりする。
IVT反応
次の工程として、mRNAを生成するIVT反応を行ってもよい。この工程は、先に説明したようなマイクロ流路デバイス制御システムに収容され得る同一または異なるマイクロ流路デバイス（例えば、IVTマイクロ流路デバイスにおけるいくつかの変形例）内部で実施されてもよい。IVTマイクロ流体パスデバイス内の主要ステップ及びサブコンパートメントを示す高レベルのmRNA製造プロセスは、図11に記載されている。
IVT反応は、DNA鋳型とT7ポリメラーゼ酵素、ヌクレオチドおよびキャッピング試薬を組み合わせ、制御された条件下で反応をインキュベートして、キャッピングされたmRNA分子を生成することを含む場合がある。IVT反応は、マイクロ流路デバイス（例えば、IVTマイクロ流路デバイス）の反応チャンバー内で行われてもよく、温度、混合及び試薬添加（反応の開始時及び反応中の両方）などのプロセスパラメータは、最適化レベルに制御されてもよい。プロセスは、上述したように、コントローラによって駆動されてもよい。緩衝液および溶液は、マイクロバルブのアレイを介して供給されてもよく、容量は、各mRNA原薬に最適化されたプロトコルに固有であってもよい、予め設定されたプログラムを使用して制御されてもよい。
IVT 反応の後、鋳型DNA を分解するために DNAse 処理を行う場合がある。このステップは、IVT 反応チャンバー（IVT リアクターの一部）内で行ってもよく、希釈率、酵素/バッファ濃度、温度、混合などのパラメータを最適なレベルに制御してもよい。この手順は、自律的に実行され、モニタリングカメラによって記録されてもよい。
IVTの精製
DNAse処理したmRNAは、不純物や副産物を除去するために精製してもよい。特に、分解された鋳型、未反応のヌクレオチド、酵素（T7ポリメラーゼやDNAse）、二本鎖RNAは、原薬の品質や免疫原性に影響を及ぼす。精製には、表面化学の異なる担体を用いた2段階の固相可逆的固定化法を用いることができる。第一段階では、セルロース膜を使用して、正確に制御された結合条件下でdsRNAを選択的に捕捉し、非結合画分を第二精製チャンバーに溶出させることができる。第2精製工程では、500bp以上の長さのmRNAを選択的に捕捉する1～2mのカルボキシル被覆常磁性ビーズを使用してもよい。その後、ヌクレオチド、酵素、分解された鋳型を含む未結合物質を除去するために、何回か洗浄を行うことができる。その後、USPグレードの水で純粋なmRNAを溶出することができる。インラインマイクロフルイディクスベースの精製は、材料を大気にさらすことなく、完全に統合されたワークフローを可能にし、従来のHPLCベースのメソッドで使用されていた毒性のある移動相の使用を避け、手作業を大幅に削減することができる。
上述したように、一般に、これらの方法および装置は、治療用mRNA、または治療用mRNAを製造するための成分のいずれかまたはすべてを、外部の雰囲気に曝すことなく、および／または他の方法で必要となり得るRNAseおよび／または汚染成分の供給源に曝すことなく製造できる無菌的方法および装置である。例えば、本明細書に記載されるように、これらの方法は、ポリヌクレオチドの細菌源（例えば、鋳型DNA中）を加えることなく、及び／又はHPLC又は他の従来の技術を介して精製する際に存在し得る可塑剤のような成分を加えることなく実施することができる。本明細書に記載されるのは、マイクロ流路デバイス内で精製するための装置及び方法である（例えば、純粋なセルロースを使用する）。
精製されたmRNAは、A260nmのUV吸収、またはmRNA特異的蛍光色素を用いた蛍光により定量することができる。純度および同一性を確認するために、追加のmRNA QCステップを実施してもよい。mRNAの製造工程全体は、マイクロ流路デバイス制御システムの内部で行われてもよく、試薬の添加およびエクスポートは、例えば無菌技術を使用して、上記のクローズドパス型マイクロ流路デバイス制御システムを介して行われてもよい。最後に、例えば0.22mのフィルターを通した濾過を行ってもよい。最終生成物は、収量（例えば、UV vis／フルオロメトリーにより、出発IVTの1ul当たり＞6.5 ug mRNA）、同一性（例えば、配列決定により、標的に対する100％のコンセンサス相同性）、完全性（例えば、配列決定により、＜1％の突然変異率）、純度（例えば、CE、シングルバンドの生成物の95%以上）、キャッピング効率（HPLC、95%以上キャッピングされたmRNA）、残留dsRNA（例えば、FRET/Immunoblot、< 0.02%（1 ng））、細菌成分（例えば、HCP ELISA (for DNA & protein)、< X）、細菌成分（例えば、HC-DNA、< X）、エンドトキシン（例えば、LAL test、< 0.2 EU/ml）、バイオバーデン（例えば、微生物限度試験（MLT））等の受け入れ基準を満たす場合、低生物負荷薬物物質とみなされ、医薬品製剤用に放出されてもよい。
mRNAのANPへの封入
精製されたmRNAは、送達成分と組み合わせてナノ粒子製剤を形成することができる。このプロセスは、図12に描かれている。例えば、mRNAカーゴ（治療用mRNA、本明細書では薬物物質とも呼ばれる）の水溶液は、製剤用マイクロ流路デバイス内のマイクロ流路混合構造において送達ビヒクルのエタノール溶液と組み合わされてもよい。次に、この物質は、まず製剤化された製品中の緩衝成分を交換するためのオンチップ透析工程、次いで製剤の容量を仕様に合うように減少させるための濃縮工程を含む2つの製剤化後の処理工程を受けることができる。これらのプロセスをマイクロ流路デバイスベースの製造装置に実装することで、人為的な介入を必要とせず、ヒューマンエラーの可能性を最小限に抑えた高度な製剤化プロセスの制御を実現することができる。
一般に、例えば、鋳型を合成すること、mRNAを生成するためにIVTを行うこと、mRNAを精製すること、mRNAを送達ビークルと結合して治療組成物を形成すること、治療組成物を透析すること、及び／又は治療組成物を濃縮することを含む、本明細書に記載の製造方法の構成部分は、上述の図3A～3Cに示すように単一のマイクロ流路装置及び／又は複数のマイクロ流路装置で行われてもよい。したがって、流体経路は、連続的または部分的に連続的であってもよい（例えば、鋳型形成、IVT、mRNAの精製、治療用組成物を形成するためにmRNAを送達ビークルと結合、治療用組成物の透析、および／または治療用組成物の濃縮、の1つ以上などの製造プロセスの構成部分にわたって連続的である）。すべての場合において、同じコントローラ装置を使用してもよいし、異なるコントローラ装置を使用してもよい。これらの構成部分のそれぞれの生成物は、コントローラ装置内の流体バイアル（例えば、デポ）に貯蔵され、新しいまたは後続のマイクロ流体経路デバイスに移されてもよい。したがって、これらの方法および装置のいずれにおいても、生成物は、大気への曝露から保護されてもよい。
いくつかのバリエーションで上述したように、ペプトイドベースの脂質製剤を薬物ビヒクルとして使用してもよく、これはN-置換ペプチド（すなわちペプトイド）骨格にカチオン基と脂質部分の両方を組み込んでいてもよい。送達ビヒクル成分は、従来の手段によって調達することができる単分散で完全に特性化可能な化学物質であってよい。
mRNA ANP製剤において小さく均一な粒子径を維持するためには、制御された一貫した製剤工程が重要となる場合がある。送達ビヒクル成分は、本明細書に記載の方法および装置により、制御された比率でmRNAと急速に混合される。DV成分の水溶液への曝露、およびカチオン性（＋）脂質とアニオン性（-）mRNAの間の相互作用が、粒子形成の引き金となる可能性がある。このプロセスは、本明細書に記載されるマイクロ流路デバイスを使用することによって実施することができる（粒子サイズ及び均一性を制御するために）。mRNAは、そのカチオン電荷の原因である送達ビヒクル上の塩基性官能基（アミンなど）の完全なプロトン化を確保するのに役立ち得る酸性緩衝液（pH3～5）に溶解されてもよい。送達ビヒクルは、水混和性有機溶媒（典型的にはエタノール）に溶解してもよく、これにより、水性カーゴ溶液にさらされたときにナノサイズの粒子の形成が促進される。混合直後、溶液のpHは、中性緩衝液によって安定化されてもよい。得られた製剤は、4℃で数週間保存しても、明らかな機能低下は見られない。あるいは、製剤化工程は、ジャストインタイムで、ポイントオブケアで実施することができる。
本明細書に記載されるような製剤用マイクロ流路デバイスは、これらの製剤作業を達成するように設計されてもよい。図13には、使用され得るそのようなマイクロ流体パスデバイスの一般的なアーキテクチャの概略図が示されている。製剤用マイクロ流体経路デバイスの第1の部分は、mRNA及びDV成分の両方を別々のステージングチャンバーに予め希釈することを含んでもよい。入力材料は、滅菌されたバーコード付きバイアルからこれらの事前混合チャンバーに進められる場合がある。mRNA材料は酸性製剤バッファーで予備希釈され、送達ビヒクル成分はエタノールで希釈される。この段階で、両材料の濃度を調整して、標的DV/mRNA比の要求仕様と、例えば、良好な混合挙動を達成することが以前に示された3：1の水性：エタノール比に一致する体積比とすることができる。
混合構造を含むマイクロ流路デバイスは、材料の混合速度を精密に制御することができる。より速いまたはより遅い混合が提供され、（例えば、コントローラによって）制御されてもよい。例えば、混合構造を含むマイクロ流路デバイスは、著しく増加したDV／mRNAの混合速度を提供してもよい。混合プロセスの開始時に、等しい圧力が両方の混合チャンバーに適用されてもよく、これにより流体がマイクロ流体構造を通して例えば0.5mL/minで強制的に押し出される。この構造の形状は、およそ3msの急速な混合時間によって決定されるかもしれない。この条件下では、ペプトイド分子上の水に不溶な脂質ドメインがmRNA水溶液にさらされるため、両親媒性ナノ粒子（ANP）が形成される可能性がある。
混合後すぐに、1:1の中性PBSをインラインで加えてANPを希釈することができる。これにより、酸性の製剤バッファーが中和され、製剤の透析および濃縮の準備が整う場合がある。これらのプロセスはすべて、マイクロ流路デバイス制御システムにより制御され、再現性の高い粒子径および製剤特性を維持することができる。
このマイクロ流体デバイスを用いることで、ポイントオブケアでパーソナライズされた治療薬を製剤化することが可能になる。いくつかの例では、治療薬は、T細胞受容体（TCR）またはT細胞受容体の一部によって媒介されるCTCLまたは他の疾患もしくは状態を治療するためのものなどである。個別化治療薬は、患者自身の配列に基づいて特定のmRNA組成物を生成することを含む、特定の患者の遺伝学（例えば、遺伝子型）に治療組成物を基づかせることができる。本明細書に記載される方法及び装置はまた、個別化された治療法を可能にし得るか、又は代替的に可能である。個別化された治療薬は、患者の表現型、例えば、危険因子カテゴリーなどの患者が該当するカテゴリーに基づくものであってよい。したがって、個別化治療薬は、患者のカテゴリーに基づいて、特定の治療薬を患者に適応させてもよい。例えば、マイクロ流体製剤デバイスは、例えば、複数のmRNAを混合して、より大きなライブラリからのmRNAのサブセットから、患者の表現型データから決定され得る各成分の成分および配分（量）に基づき、患者に個別化された治療組成物を生成することを可能にし得る。これらの組成物のいずれかをポイントオブケアで配合し、個人に最適化された治療薬を生成することができる。
製剤化後、医薬品を生成するための処理
製剤化プロセスでANPが形成されると、製剤用マイクロ流路デバイスでいくつかの後処理が完了する場合がある。これらには、緩衝液交換及びエタノール除去のための透析、次いで、投薬のために体積を減少させるための蒸発濃縮が含まれ得る。例えば、図14を参照されたい。
得られたナノ粒子は、マイクロ流路デバイス上で（例えば、マイクロ流路デバイス制御システムによって）、例えば動的光散乱（DLS）を用いたサイズ分布および蛍光を用いた% mRNAカプセル化について分析することができる。分析は、主流体経路から光学的に透明なサンプリングチャンバーに流される最終製剤化材料の少量で完了することができる。このチャンバー内では、光ファイバー光源を使用して光散乱測定を行い、粒子径と分散度を決定することができる。次に、蛍光性mRNA特異的プローブを使用して、洗浄剤の添加による粒子破砕の前後でRNA濃度を測定する。このアッセイにより、投与情報のためのmRNA濃度、およびANPにカプセル化されたmRNAと溶液中の遊離のmRNAの割合が解明される可能性がある。例えば、製剤化されたmRNA医薬品を試験するために使用され得る分析方法には、光学的透明度（例えば、目視検査により、可視、凝集物なし、透明溶液）、脂質組成の特徴付け（例えば、HPLCによる）、サイズ（例えば、DLS、80～300nm）、％カプセル化（例えば、蛍光測定による、＞95％カプセル化）、分散性（例えば、DLS、PDI＜0.25）、エンドトキシン（例えば、LAL試験、＜0.2EU/ml）、無菌性（例えば、培養（USP）、＜X cfu）、pH（例えば、USP 、pH 7.4 +/-0.2 ）、効力（例えば、生物検定/ELISA、X EC50）が含まれ得る。
上述したように、本明細書に記載の方法および装置は、例えば、皮膚T細胞リンパ腫（CTCL）の治療法を含むmRNA治療法の製造に使用することができる。成熟T細胞は、2つのタンパク質、T細胞ではアルファ鎖とベータ鎖、またはT細胞ではデルタ鎖とガンマ鎖の組み合わせによって形成される固有のTCRを発現する。各TCR鎖は、遺伝子のV、（D）、J領域をコードする多数のエキソンのいずれかが、V（D）J組み換えと呼ばれるプロセスによって結合されることにより、固有の組み換えイベントによって形成される。このV(D)J組換え事象は準ランダムであり、多数の組合せを生み出すことができるため、TCRの多様性を生み出すことになる。さらに、V(D)J組み換えの過程で、エキソン接合部にヌクレオチドのランダムな付加や欠失が起こり、その結果、さらなるTCRの多様性が生まれ、それが個人のTCRレパートリーを形成することになる。次世代技術によって深く配列決定された健常者は、任意の時点で末梢血中に1～5×106種類のTCRを保有していると推定されており、感染がなければ、単一のTCRが全人口の5％以上を占めることは通常ない。T細胞リンパ腫は、単一の悪性T細胞のクローン拡大から発生し、リンパ組織（脾臓やリンパ節）または皮膚、肝臓、胃腸などの他の組織で腫瘍を形成する。
T細胞リンパ腫患者のクローン拡大したTCRを診断し同定するために、個人のTCRレパートリーを配列する別の方法が開発された。一般的に使用されている方法の一つは、増幅バイアスを制御するために慎重に開発されたPCRプライマーのパネルを使用して、TCRまたはゲノムの再配置を配列することである。このように、マルチプレックスPCRは、ターゲットの濃縮と次世代シーケンシングのために実行することができる。このような方法は、例えばAdaptive biotechnologies社のImmunoseqアッセイなどで検証されており、診断ツールとして、また最小残存疾患の定量化として臨床で使用されている。もう一つの方法は、ターゲット濃縮を行わずに直接cDNAを深く配列し、有意に過剰発現しているTCR鎖を同定する方法である。リンパ腫TCRの同定は、通常、リンパ腫イディオタイプまたはクロノタイプと呼ばれる。
イディオタイプの判定には、生検を行い、サンプルの配列を決定して、リンパ腫のイディオタイプを特定することができる。患者特異的イディオタイプに関するデジタルデータは、患者特異的なワクチン設計のために使用されてもよい。
mRNAワクチンの設計
mRNAベースの患者特異的がんワクチンの製造は、抗原提示細胞（APC）による特異的かつ免疫学的に有効なエピトープ提示を生成することができるパーソナライズされた標的ペプチドに対応するDNA配列の設計から始まる場合がある。これを達成するために、最初のステップでは、イディオタイプTCR鎖（または）から相補性決定領域（CDR）を抽出することが含まれ得る。CDR3領域は、カノニカルTCRに対する配列アライメントを行うことで抽出することができる。CDRは、抗原-MHC複合体への結合を媒介するTCR配列の高度に可変な部分である。特に、V(D)J領域とC領域の接合部にまたがるCDR3領域は最も可変性が高く、リンパ腫細胞にのみ存在するはずの真にユニークなタンパク質断片を表している。したがって、例えば、C末端とN末端の両方で10アミノ酸ずつ拡張されたCDR3領域は、図8について上述したように、ワクチンペプチド断片を構成する。
TCRは2本の鎖（α＆β）を持っているので、1人の患者につき2つのCDR3が存在するが、少数例では1つのCDR3しか特定されないこともある。一例として、CDR3とCDR3が利用可能であると仮定すると、ワクチンペプチドは以下の構造で設計することができる。CDR3リンカー-CDR3ここで、リンカーは、単鎖可変フラグメント（ScFv）分子の設計に一般的に用いられる標準的なGSGGGSGGGGS配列である。
最終的なワクチンペプチドのアミノ酸配列が特定されると、設計プロセスには、コドンの最適化が含まれる場合があり、この最適化により、可能なDNA配列が導き出される。(i)高転写、高翻訳され、良好なタンパク質発現につながり、(ii)DNA合成に適し、(iii)鋳型生成工程に必要なアダプター配列を含み、(iv)制限酵素のように、鋳型生成工程に干渉する配列モチーフを除外することが可能である。コドン最適化は、例えば、配列GCのバランスをとり、配列の繰り返し、内部プロモーター配列、終止配列、スプライス配列、組換え配列、および内部リボソーム進入部位（IRES）を除去するために行われてもよい。さらに、コドン使用法は、高発現のヒト遺伝子で観察されるものに適合させることができる。使用され得るコドン最適化プロセスの一例の概略図を、図10に示す。
配列設計が完了したら、最適化された配列を直鎖状DNA分子として合成することができる。IVTのための鋳型は、上記のように調製されてもよい。例えば、IVTによるmRNA合成に先立ち、IVT可能な二本鎖DNA鋳型を生成しておいてもよい。DNA鋳型は、（i）産生されるべき標的患者特異的ペプチドに対応するコドンのセットとして定義されるタンパク質コード配列（又はCDS）、（ii）5'非翻訳領域（5'UTR）及び3'UTRを含む非コード配列、（iii）エキソヌクレアーゼ活性からmRNAを保護するポリA配列及び（iv）DNA鋳型をmRNAに転写するRNAポリメラーゼ酵素を勧誘するプロモータ配列からなる場合がある、上記図6において述べたとおりである。
したがって、鋳型生成プロセスとして、合成線状DNA（例えば、DNA合成業者からの）である患者特異的ペプチドコード配列とIVTに必要な汎用機能要素とを対にすることも可能である。
マイクロ流路デバイスに基づく方法及び本明細書に記載される方法は、鋳型生成を含み、～4日又はそれ以上かかり、可変長のポリAテールをもたらし（細菌の組み換えプロセスによる）、細菌タンパク質、細菌DNA及びエンドトキシンのキャリーオーバーのリスクを有する可能性のある現在実施されている細菌培養に基づく方法よりもはるかに迅速かつ効率的であり得る。対照的に、本明細書に記載の方法及び装置は、1日（～12時間）で実施することができ、一貫したポリAテール（300bpより大きい）をもたらし、宿主核酸又は宿主細胞タンパク質とのいかなる接触も伴わない可能性がある。最終的な二本鎖DNAは、化学的に製造されたヌクレオチドから作られてもよく、したがって、合成起源であると考えることができる。
上述したように、これらの方法は、(i) sGOIとTIFCのライゲーション、およびエキソヌクレアーゼ処理による非ライゲーション物質の除去、(ii) Multiple displacement amplification (MDA) という技術によるライゲーション生成物の円形増幅、(iii) IIs制限酵素での消化による増幅生成物の線形化、(iv) 不純物除去によるチップ上の精製手順の4つのステップを含むことができる。最終段階として、精製した鋳型を0.22 mフィルターでろ過してもよい。IVT 反応に使用する前に得られた物質の品質を保証するために、収量（例えば、1ug/ul で 50 ug 以上、 260/280 nm 比 1.8 以上）、同一性（例えば、100%のコンセンサス相同性）、完全性（例えば、1%未満の突然変異率）、純度（例えば、CEによる単一バンド内の生成物の95%以上）、及びエンドトキシン（例えば、0.2EU/ml未満）についての試験を含む、多くの分析試験が実施され得る。
したがって、医薬品は、患者特異的TCRペプチドをコードするmRNAとアジュバントとしてのCpGを1：1の割合で混合したものを含むことができる。核酸ミックスは、RNaseによる分解からmRNAを保護し、また細胞への取り込みと細胞質への放出を促進する役割を果たす200 nmのANPに封入することができる。翻訳プロセスが行われる細胞質でmRNAをそのまま利用できることが、有効成分の作用機序に必要である可能性がある。ANPは、核酸成分、カチオン性アミン官能基化ペプトイドNTX-DV-0024および2wt%のPEG-脂質からなり、全体の比率はmRNA：DV＝5：1w/wである。ANPのサイズ分布は、約200nmのZ平均粒子径を有する単峰性であってもよい。ANPは、リン酸緩衝生理食塩水（0.144 mg/mL リン酸カリウム一塩基、9.0 mg/mL 塩化ナトリウム、0.795 mg/mL リン酸ナトリウム二塩基）中に懸濁し、目標pHを7.4とすることができる。すべての製剤用賦形剤は、一般に安全と認められているものでよい。最終製品は無菌で生理学的に等張であり、浸透圧は 295 ± 20 mOsm/kg である。
mRNA自体は魅力的な安全性プロファイルを有しているが、例えば、可視光以下の粒子、宿主細胞タンパク質（HCP）、宿主細胞DNA、プロセス関連の不純物、バイオバーデン、細菌内毒素レベル、無菌、溶出物および抽出物のレベルは、主に安全性に関連しており、確立した安全プロファイルおよび業界標準に従って最小限に抑え制御しなければならないものである。さらに、IVT mRNAの製造に使用される残存鋳型DNA、二本鎖RNA、酵素の存在を排除または最小化することにより、安全かつ有効な製品を確保することができる。
前述のように、本明細書に記載される方法及び装置は、例えば、光オブスキュレーション粒子計数試験、及び／又は顕微鏡的粒子計数試験などの1つ又は複数の手順による粒子状物質の定量分析を含むことができる。要件への適合に関する最終結論に達するために、一部の調剤を光オブスキュレーション粒子計数試験と顕微鏡的粒子計数試験とで試験することが必要である場合がある。ナノ粒子製剤は、噴射剤中に存在する液滴及び／又は粒子集合体による光散乱により本質的に不透明であるため、粒子状物質分析にはろ過とその後のフィルターの顕微鏡分析が使用されることがある。約1μmと小さい粒子の視覚化を可能にする100±10倍率に調整した光学顕微鏡を使用してもよく、本方法で使用するフィルターの公称孔径は最大1.0μmであり、100nm～250nm範囲の医薬品ナノ粒子は粒子状物質検出に干渉しないであろう。
本明細書に記載された鋳型生成方法は、バクテリアなどの生きた微生物を使用せず、酵素反応と化学的に製造されたヌクレオチドの使用に依存しているため、鋳型およびmRNA生成物は完全に合成されたものである。
最終製剤中の残留宿主細胞DNAに関して、本明細書に記載の方法及び装置は、最終製剤の用量において10ng／用量未満及び200塩基対未満であってもよい。プロセス関連不純物の存在を最小化することに加えて、製品関連不純物は、製造プロセス、製剤開発及び最適化、並びに本明細書に記載の適切な保存条件の特定を通じて制御され得る。IVT mRNA製品は、できるだけ早く製造され、投与されることが意図されているが、安定性プロファイルは、少なくとも投与まで定義された許容基準を満たし得る。本明細書に記載される治療薬の適切な安定性を維持するための期間は、冷蔵条件下で少なくとも30日であってよい。
IVT mRNAが細胞質内に入ると、その薬理作用はネイティブmRNAの安定性と翻訳を制御するのと同じ細胞メカニズムに支配される。従って、IVT mRNAの効力は、細胞質でのバイオアベイラビリティに大きく依存し、細胞への取り込みを最大化するような製品の開発に焦点を当てる必要がある。
本明細書に記載される保管容器（例えば、デポ）は、一般に、外部環境から製品を保護し（酸素の侵入及び該当する場合には光分解からの保護を含む）、滅菌可能であり、貯蔵期間を通じて無菌状態が維持されることを保証し、製品の処方と適合し、貯蔵中に製品に浸出性化学物質をほとんど、または全く寄与しないものであってよい。例えば、ハロブチルゴム栓を備えたタイプIのホウケイ酸ガラスバイアルは、製品を適切に保護し、製品の貯蔵期間を通じて無菌性、安全性、有効性が維持されることを保証するものである。
mRNAの発現量を最大化し、細胞生存率への影響を最小化し、良好な生体内分布プロファイルを得るための予備的スクリーニングを行った結果、mRNAの発現量が最大化し、細胞生存率への影響を最小化し、良好な生体内分布プロファイルを得ることができた。この実験では、ホタル・ルシフェラーゼ（Fluc）発現に基づく生物発光アッセイを選択した。このアッセイは、各送達ビヒクル候補のmRNAの取り込みによる遺伝子発現をハイスループットで定量的に測定することが可能である。初期評価のために、36種類のアミノ脂質化ペプトイドを固相ペプトイド合成により合成し、凍結乾燥およびまたは沈殿により単離した。これらの候補材料は、カチオン性ドメインと脂質ドメインの両方に構造的なバリエーションがあった。これらの36の材料をFluc mRNAと異なる比率で、脂質固定化PEG（1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000）2%（w/w）と共に結合させた。HeLa、HepG2、JAWSII樹状細胞など、いくつかの細胞株を処理した結果、6つのリード候補を絞り込むことができた。
送達ビヒクル候補のin vivoでのmRNA発現と生体内分布は、Balb/cマウスに静脈内、皮下、筋肉内に注射した際のFluc発現により定量化した。発現量（in vitro、in vivo）、生体内分布（in vivo）からNTX-DV-0024を候補として選定し、オバルブミンをコードするmRNAを合成し、モデルワクチンとして評価した。オバルブミンはワクチン接種の観点から非常によく研究されており、エピトープの提示やT細胞反応を追跡する試薬が市販されているため、概念実証のための研究には理想的な候補である。本明細書に記載されるように産生されたOVA mRNAの初期評価は、JAWSIIマウス（C57BL/6）樹状細胞を用いたin vitroモデルで実施された。簡単に言うと、JAWSII細胞を、市販のトランスフェクション試薬（例えば、Lipofectamine（商標）2000）を用いてOVA mRNA候補で24時間トランスフェクトし、その後、SIINFEKLエピトープに結合したMHC-I用の蛍光抗体を用いて細胞を染色した。染色された集団の平均蛍光強度（MFI）は、全体的な抗原提示の指標を表す。これは、図15に模式的に記載されている。
このアッセイを用いて、本明細書に記載された方法で製造されたmRNAを、市販の材料と比較評価した。この場合、生産されたmRNAは、市販のコントロールと比較して、MHC-I上のSIINFEKL提示レベルが42％高いという結果を得た。また、デバイス上でのmRNA合成の再現性も実証され、5バッチのOVA mRNA（NTX-RNA-0184）により、同レベルのSIINFEKL+ JAWSII細胞が得られた。
mRNA候補は、マウスin vivo実験でも同様にワクチン候補として評価された。C57BL/6マウスに、市販または製造されたmRNA（本明細書に記載のマイクロ流体パスデバイスにより製造）および送達ビークルを注射（IV）した。注射後7日目に末梢血を分離し、OVAエピトープを認識するT細胞に特異的な蛍光MHC-Iテトラマーを用いて染色した。その後、OVA特異的CD8+ T-cellの割合をフローサイトメトリーにより定量化した。この実験では、前回と同様に、生産されたmRNAによって、末梢血中のOVA特異的T細胞の割合が市販のコントロールに比べて50%増加し、これらの分子のワクチン候補としての強さが示された。
mRNAベースのワクチン（本明細書に記載された方法で製造）のin vivoでの有効性を初めて実証したのは、マウス、OVA発現、EG.7、シンジェニックT細胞リンパ腫モデルであった。このモデルは、適応リンパ腫の生理学的に関連した動物モデルであり、NTX-0565の免疫療法作用機序に関連している。同系マウスモデルは、不死化したマウスのがん細胞株を、同じ近交系背景系統のマウス宿主に移植したものである（ホモグラフト）。同系統の宿主であるマウスは、免疫療法の研究に必要な宿主の抗腫瘍免疫反応を機能的に誘導することが可能である。同系統モデルは、完全なマウス免疫能、腫瘍への免疫細胞の浸潤の多様性、包括的なマウス腫瘍、免疫細胞および間質インターフェース、および遺伝子とタンパク質発現履歴を含む薬理学の研究のための腫瘍同調が容易であることを特徴とする。
マウスE.G7-OVAリンパ腫腫瘍モデルを使用した。E.G7-OVA腫瘍細胞株は、安定かつ強固に発現するOVA抗原を1ゲノムコピー保有するように操作されたEL-4リンパ腫誘導体株である。この方法により、外来性のOVA系抗原に対する特異性の高い免疫反応が可能となり、この腫瘍細胞はがんワクチンの研究に理想的なものとなっている。DNAワクチン、細胞ベースワクチン、siRNAワクチンを用いて、腫瘍の成長抑制が文献上実証されている。最初の有効性試験では、ワクチン成分はOVA抗原をコードするmRNAで、試験デザインはmRNAベースのワクチンを用いたこの動物モデルに関する過去の文献に倣った。無作為化同時陰性対照は、被験物質の送達媒体であるリン酸緩衝生理食塩水を用いて並行して実施された。動物は年齢と性別を一致させ、腫瘍の大きさと体重の平均的な分布を確保するためにグループ割付けを無作為化した。試験薬は、in vivo 試験の責任者がバイアスを受けないように盲検化された。サンプル分析は、分析者のバイアスを排除するために再度盲検化された。試験への受け入れのための包含基準および除外基準は、開始前に提案書で事前に定義された。エンドポイント、観察頻度、スケジュールは、試験開始前に試験計画書で事前に定義された。安楽死基準および動物看護介入は、事前に定義された。
この最初の研究では、本明細書に記載されたmRNAワクチンが統計的に非常に有意な治療効果を有することが示された（図16A-D）。OVA mRNAワクチンをグループ2に静脈内投与したとき、このグループは、腫瘍移植後14日目に統計的に極めて有意な結果を示し始めた（***、p<0.0005、Neg.Controlに対して、14日目のMultiple Dunnett's Comparison Testで比較）。21日目の腫瘍体積は、グループ2の797mm3に対してグループ1のコントロールでは2000mm3であった（**、21日目のMultiple Dunnett's Comparisons Testによる測定でp<0.005)。これは、本明細書に記載されるように製造されたmRNAワクチン接種を動物が受けた場合、61.42％の腫瘍成長阻害に換算される（IV）。腫瘍成長阻害（TGI％）は、陰性対照群（群1）が所定のエンドポイント腫瘍体積（2000mm3）に達した移植後21日目に計算された。腫瘍増殖抑制率（％）は、以下の式で定義した。TGI (%) = (TVcontrol group - TVtreated group)/TVcontrol x 100 であり、全てのコントロール動物が終末腫瘍量に達した腫瘍移植後21日目のネガティブコントロールとの相対値である。この腫瘍成長の抑制は、mRNAワクチン接種群の生存率において非常に統計的に有意な増加をもたらし、グループ2、mRNAワクチン接種動物のエンドポイントまでの期間は25日、グループ1、ビークル治療動物のエンドポイントまでの期間の中央値は23日であった（* p <0.01 対コントロールに対するログランク検定による測定値）。与えられた用量において、体重および実験室試験結果に基づく観察可能な毒性は観察されなかった。図16A-16Cにおいて、製造されたmRNAベースのワクチンは、マウスリンパ腫E.G7同胞モデルにおいてin vivoでの有効性を示す。個々の動物曲線（図16A、16B）および各グループの平均腫瘍体積（図16C）に見られるように、腫瘍の成長は61.4％阻害された（*p<0.01）。この腫瘍成長の阻害は、mRNA-ワクチン接種群（図16D）（＊＊、p＜0.01）についての生存の統計的に有意な増加に結びついた。
また、上記の物理的な測定を補足するために、レポーター遺伝子の発現を用いた保存薬物製剤のin vivo試験も1週間にわたって実施された。この実験では、ホタルルシフェラーゼmRNAとNTX-DV-0028の製剤を、1）注射の7日前、2）注射の3日前、3）注射の1時間前に調製した。製剤化後、投与まで4℃で保存した。その後、Balb/cマウスに0.25 mg/kgの用量で尾静脈注射を行い、3種類の材料を投与した。注射後8時間、全身の生物発光を測定し、得られた画像を図17Aに示し、図17Bに定量化した（保存したmRNA製剤を注射した後の全身ルシフェラーゼ発現の定量化した光束を示す）。この1週間の保存実験の間、測定された生物発光の実質的な損失はなかった。3日間および7日間の保存材料はいずれも、注入直前に調合した材料と誤差の範囲内であった。この機能的安定性データは、上記の粒子サイズ安定性データを支持して、本明細書に記載のmRNA製剤が4℃での少なくとも1週間の保存に安定であることを強く示している。
一般に、本明細書に記載されるように送達ビヒクル分子とともにANPに配合されたmRNA薬物物質は、約200nmのサイズを有することがあり、損失を防ぐために最終配合工程の終了時に0.2ミクロンの無菌フィルタを使用することを排除することが可能である。したがって、最終的なANP医薬品の崩壊を回避しながら無菌リスクを軽減するために、複数の方法的な濾過工程を製造工程を通して組み入れることができる。図18は、濾過が適用され得る様々な時間を概略的に示している。IVT反応の前に、精製された鋳型及び個々のIVT試薬（dNTPs、酵素等を含む）の両方を、0.22 umフィルターを通して濾過してもよい（図18A、B）。mRNA の生産が IVT マイクロ流路デバイスで完了した後、すべての入力材料は最終製剤化工程（ANP が形成される）の前に濾過されることになる。これらには、薬物物質（mRNA、例えば、図18、C）、アジュバント（CpG）、両親媒性ペプトイド送達ビークル成分および緩衝液（図18、D）、DMG-PEG2000送達ビークル成分（図18、D）、および透析緩衝液（図18、E）などが含まれる。入力材料の0.22ミクロン濾過に加えて、最終的な両親媒性ナノ粒子薬剤製品を0.45ミクロンフィルターで濾過して、粒子状または凝集材料を除去してもよい（図18、F）。この大きな濾過ステップは、ANPの破壊を防ぎ、最終的な薬物製品の有効性を維持するのに役立つ可能性がある。
上述の目立たない濾過ステップを補足するために、本明細書に記載のマイクロ流路デバイス制御システムは、例えば本明細書に記載のように、鋳型調製、体外転写（IVT）、両親媒性ナノ粒子（ANP）への送達ビヒクルとの配合、及びバッファ交換と濃度ステップなどの医薬品製造に必要な操作を行う1以上の密封されたマイクロ流路デバイスを用いて最終医薬品の安全性と滅菌性を確保できるよう動作するように設計することができる。これらのマイクロ流体パスデバイスは、温度制御されたクラス5ラミナーフード内に存在し、さらに、例えば、6×6クラス7クリーンルームに収容されることがある。mRNAリアクター（複数可）は、人および外部環境から保護された自動化された装置であってもよい。試薬および製品の流体経路は、単回使用の滅菌ヌクレアーゼフリーチューブを使用して、加圧された滅菌容器から反応器のコアに送達されてもよい。最終製品製剤および医薬品は、完全閉鎖系で上記のような多層マイクロ流路デバイス（複数可）内で製造することができる。
透過型インサート
本明細書に記載されるマイクロ流体経路デバイスのいずれも、治療材料の溶液（又は治療材料が形成されている溶液）を処理するための1つ又は複数の透過性インサートを含んでもよい。透過性インサートは、マイクロ流体経路デバイス内のチャンバの流体接触側に挿入されてもよい。そして、チャンバーの流体接触側に入る又は通過する流体が、透過性インサートを通過しなければならず、したがって、透過性インサートによって改質されるように構成されてもよい。任意の適切な透過性インサートが使用されてもよい。例えば、透過性インサートは、望ましくない物質を除去するように構成された材料を含んでもよく、いくつかの例では、透過性インサートは、一本鎖RNA（ssRNA）の治療溶液から二本鎖RNA（dsRNA）を除去するように構成されたセルロース材を含む。
図19Aは、チャンバ1957の流体接触面内に透過性インサート1969を含むマイクロ流体経路デバイス1900の一例を示す図である。図19Aにおいて、マイクロ流体経路デバイス1900は、少なくとも1対のチャンバ1953、1957、1957'を含んでもよく、これらの各々は、マイクロ流体経路デバイスの厚さに形成されてもよい流体接触側1917、圧力（例えば、ガス）側1919、流体接続、圧力接続及び流体／圧力線を含んでもよい。いくつかの変形例では、チャンバは対になっており、一対のチャンバの各チャンバは、流体コネクタ1955によって互いに接続されてもよい。流体コネクタ1955は、チャンバ（複数可）の圧力側に加えられる正圧及び／又は負圧と連携して、2つのチャンバ間の液体側で液体を駆動し、この液体をチャンバのそれぞれ内で混合するために使用されてもよい。チャンバは、弾性材料（例えば、弾性層又は膜）によって分岐されてもよく、チャンバの固定体積内で弾性材料を偏向させると、チャンバの液体接触側（例えば、2つのチャンバの間）の中に／外に液体内の任意の液体を駆動させることができる。
マイクロ流路デバイス1900は、複数の対のチャンバを含んでもよく、そのうちのいずれかが透過性インサートを含んでもよい。各対のチャンバは、異なる処理に使用されてもよい。例えば、第1の対のチャンバー1953は、RNAの合成のために使用されてもよい。第2の対のチャンバー1957、1957'は、合成されたポリヌクレオチドの精製に使用されてもよい。第1の対のチャンバー1953からの流体は、それぞれのチャンバーの受圧面1919に圧力を加え、第1の対のチャンバー1953と第2の対のチャンバー1957との間にバルブ1959を開くことにより、第2の対のチャンバーに駆動されてもよい。弁室1959は、2つの対の室の間のコネクタチャネル内に弾性層1907によって形成されてもよい。
図19A及び図19Bに示すようなマイクロ流路デバイス1900は、複数の圧力ポート1943及び流体ポート1923を有してもよい。複数の圧力ポート及び流体ポートは、マイクロ流体経路デバイスの周縁部に隣接して配置されてもよく、上述したように流体インターフェースアセンブリ109に接続されるように構成される。
流体ポート1923から駆動される試薬の送達のタイミングを制御し得るが、1つ以上の同様に構成されたバルブと直列に配置された場合、装置のチャンバへの計量も可能にし得るバルブ1961について、図19Aに示されるような接続チャネル1939（圧力チャネルまたは流体チャネルのいずれか）の長さに沿って、ポート（例えばシールバルブ）を弾性層から形成することも可能である。例えば、図19Aでは、3つのバルブチャンバが示され（以下でより詳細に説明する）、これらの3つのバルブのうちの最初のバルブは、蠕動ポンプとして作用してもよく、一方、真ん中のバルブは、小さい（例えば、約10nL、20nL、25nL、50nL、75nL、100nL等の計量体積を有する）計量チャンバであってもよい。チャネルのサイズ、特にチャネルに接続されたチャンバーのサイズ）は、流体接続チャネル1939、1921に沿って分注され、流体接続チャネル1939、1921に接続されているチャンバー1953に送達される体積を計量することが可能である。いくつかの変形例では、計量された体積は、50nL程度であってよい。約100nL、1マイクロリットル、5マイクロリットルまたはそれ以上の計量された容積が輸入されてもよい。様々なバルブサイズが、マイクロ流体経路デバイス1900内と組み込むために予め選択されてもよく、試薬は、ユーザの選択によって適切な計量サイズに接続されてもよい。
さらに、複数の弁体1961が流体接続路1939に沿って一列に含まれていてもよい。一連の弁体1961は、粘性流体（これらに限定されない）を含む流体を移動させるための蠕動ポンプとして作用してもよい。一般に流体に対して蠕動ポンプとして機能する能力は、粘性であるか、又は精製若しくは捕獲ビーズなどの浮遊粒子を含む可能性のある流体を移動させるために特に有利である場合がある。
前述のように、マイクロ流体経路デバイス1900はまた、送達または輸出リザーバまたはデポ1963を含んでもよい。図19Aにおいて、予め選択された容積は、上述したチャンバー構造と同様に形成されてもよく、または所望により計量側のみを含んでもよい。いずれの場合においても、弁は、リザーバ1963への所望の体積を計量するために使用されてもよい。バルブ1965は、リザーバ1963からの流体の送達を制御し得る。より大きな体積が所望される場合、送出が繰り返され得る。代替的に、リザーバ1963が輸出リザーバであるように予め選択されていた場合、バルブ1965は開き、チャンバ1957から流体を送り出し、一方、バルブ1967は閉じたままであり、これは、リザーバ1963に輸出される流体の測定体積のみを許容する。この流体は、その後、さらなる処理または試験のために試薬貯蔵枠上の流体バイアルにエクスポートされるかもしれない。いくつかの変形例では、チャンバ、リザーバ又はデポ（例えば、1963）は、例えば、3つのバルブ構造（1967、1965、1967）により形成される1μLポンプの計量部として構成されてもよい。チャンバは、例えば、混合チャンバ1957からの廃棄物の輸出のために構成されてもよい。
マイクロ流路デバイス1900は、密閉された経路構造であってもよい。流体バイアル、流体ラインおよびマイクロ流路デバイスが接続されている間、装置の動作は、システムの内外、特にポリヌクレオチド（RNA）の合成および生物学的送達（薬剤、ワクチンなどの治療として）の準備を含む処理のためのマイクロ流路デバイスの流路の内外での物質の交換なしに実行することができる。したがって、システム全体が閉じた経路として動作してもよく、および／または個々のマイクロ流体経路デバイスが閉じた経路としてシステム内で動作してもよい（大気から保護される）。
一般に、これらのマイクロ流路デバイスは、チャンバまたはチャネルの流体側1917内に1つまたは複数の透過性インサート1969を組み込むことを含むことができる。透過性インサートは、チャンバ又はチャネル内の流体混合物から選択された部位（例えば、選択された材料）を吸収するように構成されることができる。吸収された材料は、溶液から精製される不要な材料であってもよいし、溶液から除去されて後に溶出され、さらに処理される所望の材料であってもよい。一変形例では、インサートの透過性材料は、混合物から二本鎖mRNAを選択的に吸収することができるセルロース材料を含んでもよい。セルロース材料は、一対のチャンバのうちの1つのチャンバのみに挿入されてもよく、このように、第1のチャンバの透過性インサートに流体を混合又は通過させると、dsRNAが流体混合物から効果的に除去され、その後、さらに下流の別の一対のチャンバに移送して、さらに処理又は輸出することができるようにしてもよい。
マイクロ流体デバイス1900のいくつかの変形例は、チャンバ内に濃縮器をさらに含んでもよく、このチャンバは、第2のプレートの厚さ内に配置されてもよく、1949などの出口チャネルと流体連通することができる。ポリヌクレオチドは、過剰な流体媒体を追い出すことによって濃縮されてもよく、濃縮されたポリヌクレオチド混合物は、さらなる取り扱い又は使用のためにマイクロ流路デバイス1900の外にエクスポートされる。いくつかの変形例では、濃縮器は、透析チャンバであってもよい。例えば、透析膜は、マイクロ流体経路デバイスのプレート内またはプレート間に存在してもよい。
マイクロ流路デバイス1900は、可視光及び／又は紫外線に対して少なくとも実質的に半透明である材料で形成されてもよい。実質的に半透明とは、半透明な材料と比較して、少なくとも90％の光が透過することを意味する。いくつかの変形例では、マイクロ流路デバイス1900は、可視光及び／又は紫外線に対して実質的に半透明である材料で形成されてもよい。実質的に半透明であるとは、完全に透明な材料と比較して、少なくとも90％の光が材料を透過することを意味する。
マイクロ流路デバイスは、チャンバーおよび／またはチャネルがプレート間に形成されるように互いに重ねられた2つ以上のプレートで形成されてもよく、第1プレートと第2プレートとの間に弾性材料が挟まれてもよい。第1のプレート及び／又は第2のプレートは、剛性のある材料から形成されてもよい。プレートは、同じ材料で形成されてもよいし、異なる材料（複数可）で形成されてもよい。例えば、剛性材料は、ポリマーまたはガラスであってもよい。ポリマーまたはガラスは、生体適合性であってよく、例えば、生体細胞に対して有毒なモノマーまたは可溶性小分子を溶出しない。医療グレードのポリカーボネートウレタン、シリコーンポリカーボネートウレタン、ポリエーテルウレタンなどを含む、任意の適切な生体適合性ポリマーが使用されてもよい。いくつかの変形例では、ポリマーは、シクロオレフィンコポリマーであってもよい。
図19Bは、マイクロ流体経路デバイスの一部を通る断面を示し、弾性材料1907によって流体接触側と圧力受容側1919に分岐されたチャンバ1920の流体接触側1917内の透過性インサート1969を示す。このように、マイクロ流路デバイスは、より剛性の高い2つの層1903、1905に、柔軟な膜1907を挟み込んだ多層構造として構成することができる。図19Bは、本明細書に記載されるように、治療薬を処理するためのリアクターを形成する複数の層を有するマイクロ流体経路デバイスの一例を通る断面図（マイクロ流体経路デバイスの平面に対して横向き）の一部を示している。反応器は、複数の層から形成されるポンピングチャンバーを含む、シール、チャネル、バルブ、及びチャンバーを含んでもよい。例えば、マイクロ流路デバイスは、2つ以上の剛性又は半剛性プレート1903、1905及び少なくとも1つの弾性層1907から形成されてもよい。弾性層1907は、液体不透過性である弾性材料のシートであってよい。弾性層は、多分、幾分ガス透過性であり、又は、様々な領域を含めて、多かれ少なかれガス透過性になるように処理されてもよい。弾性材料の単一の連続したシートを使用してもよいが、いくつかの変形例では、複数の弾性材料シートを使用してもよく、または「シート」は複数のシートの部分から形成されてもよい。また、層と弾性体シートとが積層されていてもよい。一般に、弾性層が液体を含む側と圧力（例えば、気体）を加える側とにチャンバを二分するように、弾性層の両側のプレートに、流体を保持、バルブ化および／または圧送するためのチャンバが形成されてもよい。チャンバー（複数可）の全体容積は一定で、第1（例えば、上）プレートと第2（例えば、下）プレートの両方に形成されてもよいが、この容積は圧力側と液体側に分割されてもよい。圧力側に正圧または負圧を加えることにより、弾性シートを変形させて、液体を含む側の容積を小さく（ゼロにし、チャンバーを閉鎖）したり、液体を含む側の容積を大きく（所定の最大値まで）したりしてもよい。また、1つ以上のチャンバーの受圧側1919に負圧または正圧を加えるために、例えば、上板1903に設けられた圧力ポート1943を介して、圧力流路1947に接続してもよい。また、各チャンバの圧力印加側と反対側の液体含有側1917は、流体流路1921を介して流体ポート1923に接続されていてもよい。流体ポートおよび圧力ポートの両方が、上部プレート1903および弾性層1907への開口部によって形成されてもよく、圧力ラインが、反対側の剛性または半剛性層（複数）、1905、1909によってポートの下側で支持されている弾性層1907に押し込まれるため、複数の異なる入力ラインがある場合でも大気から隔離された密閉接続が可能である。
図19Bにおいて、マイクロ流体経路デバイス1900は、第1（例えば、上または上部）表面1911と第2（底または下部）表面1929と両者の間の厚さを有する第1（例えば、上部）プレート1903を含む。第1の表面1911は、露出した外面を形成してもよい。マイクロ流体経路デバイスは、第1（例えば、上面又は上部）表面1931と第2（例えば、下部又は底部）表面1933とその間の厚さを有する第2プレート1905も含む。弾性層1907は、第1のプレート1903の第2の表面1929と第2のプレート1905の第1の表面1931との間に挟まれる。この例では、第3のプレート1909が、第2のプレートの第2の表面1933上で、直接的または間接的に第2のプレートに結合される。第3のプレート1909も、第1（例えば、上または上）表面と第2（下または下）表面とその間の厚さを有する。第3のプレートの第2の表面は、マイクロ流体経路デバイスの底面を形成してもよい。いずれのプレートも、複数の層で形成されてもよく、これらの層は、積層されるか、または他の方法で連結されてもよい。例えば、図19Bにおいて、第3のプレート1909は、第3のプレートを第2のプレートに結合するのを助け得るオプションの第2の弾性層1913を含み、この例における第2の弾性層1913は、第3のプレート1909の第1の表面1935を形成する。図19Bに示される層及びプレートは、縮尺通りでなくてもよい（例えば、弾性層1907は、プレートに対してより薄くてもよい）。
また、図19Bに示すマイクロ流路デバイス1900は、それぞれが一定の容積を有する複数のチャンバ1915、1916、1918、1920を含んでもよい。これらのチャンバは、第1プレート1903の第2（下）面1929及び第2プレート1905の第1（上）面1931への切り込み領域（例えば、丸み／曲線カット）により形成され、弾性層1907は、それぞれが液体含有側1917及び圧力受容（例えば、ガス含有）側1919を含むようにこれらのチャンバ1915を分岐して形成する。マイクロ流路デバイス1900はまた、複数の液体（例えば、流体）チャンネルを含んでもよい。図19Bでは、単一の液体チャネル1921が、第1のプレート1903の厚さを通過する液体ポート1923から、弾性層1907を通り、第2のプレート1905の厚さの多くを通って第2のプレートの底面1933に至る液体チャネル開口1925まで延び、ここで第3プレートの底面1933に平行に走る液体チャネル1921の長さが形成されて、第3プレート1909の上面により境界が付けられていることが示されている。
流体ポート1923に関して、流体ポート1923を形成する第1のプレート1903への開口のうち、第1のプレートの厚さを通って延びる直径は、弾性層1907を通って液体（例えば、流体）チャネル1921に延びる流体チャネル開口1925の直径より大きくても良い。流体チャネル開口部1925は、流体ポート開口部の底部に対して中央に配置されてもよく、流体ポートに接続される流体ライン又は流体ライン結合インターフェースの予想壁厚さ以上だけ流体ポート開口部の壁からオフセットされてもよい。
流体路1921は、第1のチャンバー1915の液体含有側1917に接続する。この第1のチャンバーは、比較的低い保持容積（固定容積）を有するが、弾性層1907の移動によって完全に開閉することができるバルブとして構成されてもよい。
マイクロ流路デバイス1900はまた、正圧及び／又は負圧をかけるために独立して制御され得る複数の圧力チャネルを含む。図19Bでは、第4のチャンバー1920に接続された単一の圧力ポート1943が示されているが、チャンバー1915、1916、1918の各々は、これらのチャンバーを分岐する弾性層1907の部分の動きを独立して操作及び制御し、各チャンバーを独立してバルブ、及び／又はポンプするための別々の圧力ポート及び圧力チャネルに接続してもよい。いくつかの変形例では、圧力ポートを複数のチャンバ間で共有してもよい。図19Bにおいて、圧力（例えば、気体）ポート1943は、流体（例えば、液体）ポート1925と同様であり、第1のプレート1903を完全に通り、露出した弾性層1907に至るまで、圧力（例えば、気体）チャネル開口1945を形成する弾性層を通り抜ける開口部を含んでいる。圧力チャネル開口部1945は、圧力ポート1943から延び、第1のプレート1903の厚さの多くを通り、第2のプレートの底部に沿った切り出しチャネルで（または代替的に第3のプレートの頂部の切り出し領域へ）、第2のプレートおよび弾性層1907を通って戻り、第1のプレート内の圧力チャネルの領域であって、第4の室1920の圧力（例えば、ガス）含有部分1919に接続する圧力チャネル1947と連続している。同様の流体（例えば、液体）ポートについて説明したように、第1プレート1903の厚さを通過する圧力ポート1943の直径は、弾性層1907を通過する圧力チャネル開口1945の直径より大きくてもよく、圧力ポートに接続する圧力ラインまたは圧力ライン結合インターフェースの壁厚より大きく中央に配置またはオフセットされてもよい。
図19Bに示すマイクロ流路デバイス1900を通る断面では、他の流体（例えば、液体）ライン、流体ポート、圧力ライン及び圧力ポートへの複数の接続があるが、それらは示された平面から外れている場合があるので、示されていない。例えば、図19Bにおいて、第4のチャンバの液体含有側1917又は部分は、例えば、液体含有側1917から延びる出口チャネルを含む追加のバルブ（チャンバ）及び／又はチャネルに接続されてもよい。図示しない追加のチャンバ（例えば、弁として構成されたもの）は、上述したように形成されてもよい。いくつかの変形例では、出口チャネルは、1つ以上のチャンバから別の流体ポート（図示せず）を介して流体受容デポ、例えばバイアル、チューブなどに流体を送達してもよい。この受取デポは、試薬収納フレームに保持されてもよい。
上述のように、透過性インサート1969は、分離チャンバの流体接触側に挿入され、チャンバの圧力受容側から流体接触チャンバを分離する弾性材料によって圧縮されるように構成されてもよい。この例では、（例えば、このチャンバに宛てられた圧力ポートを介して）受圧側に加えられる正または負の圧力は、弾性材料を偏向させて流体接触側の容積を変化させることができる。流体は、透過性インサート1969を有するチャンバ1920内に駆動されてもよく、流体は、インサートを通過して溶液を修正してもよい。透過性インサートが圧縮可能である変形例では、圧縮してチャンバから流体を除去し、排出してもよい。いくつかの変形例では、透過性インサートはその後、拡張した構成に戻して拡張してもよく（または拡張を許容してもよく）、その後流体を再び通過させてもよく、またはさらなる処理を行なってもよい。
本明細書に記載の透過性インサートは、一般に、治療材料を含む（または治療材料が形成されている）溶液を改質するために使用され得る。図20Aは、本明細書に記載される装置のいずれかを用いて、流体（例えば、RNAサンプル）中の治療材料を処理する方法の一例を模式的に示す図である。例えば、本方法は、最初に、マイクロ流路デバイス（又は1つ以上のマイクロ流路デバイス）をマイクロ流路デバイス制御システム2001に取り付けることを含んでもよい。このステップは、マイクロ流体パスデバイスを圧力源に結合することを含んでもよい。いくつかの変形例では、このステップ（または追加のステップ）は、マイクロ流体経路デバイスをRNAなどの治療材料の供給源に結合させることを含んでもよい。任意選択的に、いくつかの変形例では、方法は、in vitro転写2003によって治療用RNAを生成するなど、マイクロ流体経路デバイスにおいて、治療用材料を合成することを含んでもよい。
この方法は、治療材料（例えば、RNA）を有する試料を、透過性インサート2005を含む処理チャンバの流体接触部分まで搬送することをさらに含んでもよい。例えば、これは、試料をマイクロ流路デバイスの分離チャンバの流体接触部に搬送するために圧力を加えることを含んでもよい。いくつかの変形例では、治療物質（又は推定治療物質）を含む流体をチャンバの流体接触側に駆動するために、マイクロ流体経路デバイス内の弾性材料（例えば、弾性膜）を偏向させることによって圧力を適用することができる。このステップの一部として、流体（治療用／推定治療用を含む）試料を分離チャンバの流体接触側内の透過性インサートに通過させて、試料2007を修飾することができる。例えば、治療薬／仮治療薬の物質が、透過性インサートと相互作用することによって添加されたり除去されたりすることがある。
最後に、チャンバーの流体接触側をチャンバー2009の圧力受容側から分離する弾性膜などの弾性材料をたわませることによって、分離チャンバーの流体接触側からサンプルを運び出すために圧力をかけることができる。
図20Bは、本明細書に記載の装置のいずれかを用いて、流体中の治療用物質（例えば、RNAサンプル）を処理する方法の具体例を示す図である。例えば、図20Bにおいて、方法は、dsRNA及び一本鎖RNA（ssRNA）の両方を含むRNA試料から二本鎖RNA（dsRNA）を除去する方法であってよい。この変形例では、方法は、マイクロ流路デバイスを圧力源2011に結合することを含んでもよい。前述2013のように、いくつかの変形例では、これは、治療用RNAの供給源にマイクロ流路デバイスを結合すること、及び／又はマイクロ流路デバイスにおいて治療用RNAのインビトロ転写を実行することを含んでもよい。次いで、本方法は、圧力をかけてRNA試料をマイクロ流体経路デバイス2015の分離チャンバの流体接触側に搬送することを含んでもよい。次いで、RNAサンプルは、分離チャンバ2017の流体接触側内の、コラーゲンからなる固体で透過性のインサートを通過させ／その中に入れてもよく、セルロースはdsRNAを結合し、dsRNAがインサートによって保持されるようにする。その後、圧力をかけて、RNAサンプルを分離チャンバの流体接触側から運び出し、ssRNAを治療溶液2019内に残すことができる。このステップは、すべて又は実質的にすべてのdsRNAを除去するために、必要に応じて繰り返されてもよい。
前述したように、その後、さらなる処理（送達ビヒクルとの結合、透析、濃縮など）が行われてもよい。
本明細書に記載される装置は、1つ以上の隔離室を含むことができ、及び／又は1つ以上の隔離室と共に使用することができる。例えば、いくつかの変形例では、本明細書に記載の装置は、例えば、対象への送達のために治療用ポリヌクレオチドを製造し得る治療用ポリヌクレオチド製造「工場」の一部であってよい。治療用ポリヌクレオチドは、例えば、治療用mRNAであってもよい。図21A～21Bは、工場装置としてそれ自体で使用されてもよいし、並行製造装置の一部として使用されてもよい装置の一例を示す。図21Aにおいて、装置（複数可）2101、2101'は、クラス5の隔離キャビネット2103を含んでもよいし、その中に保持されてもよく、隔離キャビネットは、それ自体、クラス7の隔離空間内に保持されてもよい。図21Aにおいて、キャビネットは、2つのマイクロ流体制御装置2101、2101'を含む。この装置は、患者の使用のために治療用mRNAなどの治療用ポリヌクレオチドを迅速に自動製造しうるコピーエグザクトGMPユニットを提供する組立工場の一部であってよい。これらの装置は、高度に再構成可能であり、迅速な展開と低コストの生産を可能にすることができる。いくつかのバリエーションでは、オンデマンド製造「工場」ユニットとして配備される場合がある。いくつかのバリエーションでは、これらの装置は、遠隔地に一時的または長期的に配備される移動ユニットの一部として設定される場合がある。
本明細書において、ある特徴または要素が他の特徴または要素「上」にあると言及される場合、それは他の特徴または要素上に直接存在することができ、または介在する特徴および／または要素も存在することができる。対照的に、特徴又は要素が他の特徴又は要素上に「直接」存在すると言及される場合、介在する特徴又は要素が存在しない。また、特徴又は要素が他の特徴又は要素に「接続されている」、「取り付けられている」又は「結合されている」と言及される場合、他の特徴又は要素に直接接続、取り付け又は結合されることができ、又は介在する特徴又は要素が存在してもよいことが理解されるであろう。対照的に、特徴又は要素が別の特徴又は要素に「直接接続されている」、「直接取り付けられている」又は「直接結合されている」と言及される場合、介在する特徴又は要素が存在しない。一実施形態に関して説明又は図示したが、そのように説明又は図示した特徴及び要素は、他の実施形態に適用することができる。また、別の特徴に「隣接して」配置される構造又は特徴への言及は、隣接する特徴に重なる部分又は下敷きになる部分を有し得ることも、当業者には理解されよう。
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためのものであり、本発明を限定することを意図するものではない。例えば、本明細書で使用される場合、単数形「a」、「an」及び「the」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数形も含むことを意図している。本明細書で使用される場合、用語「comprises」及び／又は「comprising」は、述べられた特徴、ステップ、操作、要素、及び／又は成分の存在を規定するが、1つ以上の他の特徴、ステップ、操作、要素、成分、及び／又はそれらの群の存在又は追加を排除しないことがさらに理解されるであろう。本明細書で使用される場合、用語「及び／又は」は、関連する記載項目の1つ以上の任意の及び全ての組み合わせを含み、「／」と略記されることがある。
本明細書では、説明を容易にするために、「下」、「以下の」、「下部の」、「上」、「上部の」などの空間的に相対的な用語を使用して、図に示されるように、ある要素または特徴の別の要素（複数可）または特徴に対する関係を説明することができる。空間的に相対的な用語は、図に描かれた向きに加えて、使用又は動作中の装置の異なる向きを包含することを意図していることが理解されよう。例えば、図中のデバイスが反転されている場合、他の要素又は特徴の「下」又は「真下」として説明される要素は、その後、他の要素又は特徴の「上」に配向されるであろう。したがって、例示的な用語「下」は、オーバーとアンダーの両方の配向を包含することができる。装置は、他の向き（90度回転した、又は他の向き）であってもよく、本明細書で使用される空間的に相対的な記述子は、それに応じて解釈される。同様に、用語「上向き」、「下向き」、「垂直」、「水平」などは、特に指示しない限り、説明の目的でのみ本明細書で使用されている。
本明細書では、様々な特徴／要素（ステップを含む）を説明するために「第1」及び「第2」という用語を用いることがあるが、文脈から別段の指示がない限り、これらの特徴／要素はこれらの用語によって限定されるべきではない。これらの用語は、ある特徴／要素を別の特徴／要素から区別するために使用されてもよい。したがって、後述する第1の特徴／要素は、第2の特徴／要素と称され得、同様に、後述する第2の特徴／要素は、本発明の教示から逸脱することなく第1の特徴／要素と称され得る。
本明細書およびそれに続く特許請求の範囲を通じて、文脈上他に必要とされない限り、単語「comprise」、および「comprises」「comprising」などの変形は、方法および物品（例えば、装置および方法を含む組成物および装置）において、種々の構成要素が共働的に採用され得ることを意味している。例えば、用語「comprising」は、任意の記載された要素またはステップを含むが、他の要素またはステップを排除しないことを意味すると理解されるであろう。
一般に、本明細書に記載される装置及び方法のいずれも包括的であると理解されるべきであるが、構成要素及び／又はステップの全て又はサブセットは代替的に排他的であってもよく、種々の構成要素、ステップ、サブコンポーネント又はサブステップ「からなる」又は代替的に「から本質的になる」として表現されてもよい。
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、実施例で使用される場合を含め、他に明示的に指定されない限り、すべての数値は、その用語が明示的に現れない場合でも、「約」または「およそ」という単語が前置きされているかのように読み取ることができる。語句「約」又は「およそ」は、大きさ及び／又は位置を説明するときに使用され、説明された値及び／又は位置が、値及び／又は位置の妥当な予想範囲内にあることを示すことができる。例えば、数値は、記載された値（又は値の範囲）の±0.1%、記載された値（又は値の範囲）の±1%、記載された値（又は値の範囲）の±2%、記載された値（又は値の範囲）の±5%、記載された値（又は値の範囲）の±10%、等の値を有することができる。また、本明細書で示されるいかなる数値も、文脈がそうでないことを示していない限り、その値について、またはおよそその値を含むと理解されるべきである。例えば、値「10」が開示されている場合、「約10」もまた開示される。本明細書で言及される任意の数値範囲は、そこに包含されるすべての下位範囲を含むことが意図される。また、値が開示されている場合、当業者によって適切に理解されるように、「その値以下」、「その値以上」、および値の間の可能な範囲もまた開示されていることが理解される。例えば、値「X」が開示されている場合、「X以下」だけでなく、「X以上」（例えば、Xは数値である）も開示されている。また、本願を通じて、データは、多くの異なるフォーマットで提供され、このデータは、データポイントの任意の組み合わせの終点と始点、および範囲を表すことが理解される。例えば、特定のデータ点「10」と特定のデータ点「15」が開示されている場合、10と15の間だけでなく、10より大きい、10と同等以上、10より小さい、10と同等以下、および10と15の間が開示されていると見なされることが理解される。また、2つの特定の単位の間の各単位も開示されていると理解される。例えば、10と15が開示されている場合、11、12、13、および14も開示されている。
以上、様々な例示的な実施形態を説明したが、特許請求の範囲によって説明される本発明の範囲から逸脱することなく、様々な実施形態に対して多数の変更のうちのいずれかを行うことができる。例えば、様々な説明された方法ステップが実行される順序は、代替の実施形態においてしばしば変更されてもよく、他の代替の実施形態において、1つまたは複数の方法ステップが完全にスキップされてもよい。様々なデバイス及びシステムの実施形態のオプションの特徴は、いくつかの実施形態に含まれ、他の実施形態には含まれないことがある。したがって、前述の説明は、主に例示的な目的のために提供され、特許請求の範囲に規定される本発明の範囲を制限するように解釈されるべきではない。
本明細書に含まれる例および図解は、例示であって限定ではなく、主題が実施され得る具体的な実施形態を示す。言及したように、他の実施形態が利用され、そこから派生して、本開示の範囲から逸脱することなく、構造的及び論理的置換及び変更がなされ得るようにすることができる。本発明主題のそのような実施形態は、本明細書において、単に便宜上、「発明」という用語で個別にまたは集合的に参照されることがあり、複数の発明が実際に開示されている場合、本願の範囲を任意の単一の発明または発明概念に自発的に限定する意図はない。したがって、本明細書では特定の実施形態が図示され、説明されているが、同じ目的を達成するように計算された任意の配置が、示された特定の実施形態に置き換えられ得る。本開示は、様々な実施形態の任意の及び全ての適応又は変形をカバーすることを意図している。上記の実施形態の組み合わせ、及び本明細書に特に記載されていない他の実施形態は、上記の説明を検討すれば、当業者には明らかであろう。
関連出願との相互参照
本特許出願は、2019年8月9日に出願され、「MICROFLUIDIC APPARATUS AND METHODS OF USE THEREOF」と題された米国仮特許出願第62／885、159、および2019年8月9日に出願され、「METHODS AND APPARATUS FOR MANUFACTURING THERAPEUTIC COMPOSITIONS」と題された米国仮特許出願第62／885、170、また、2019年10月11日に出願され、「METHODS AND APPARATUSES FOR MANUFACTURING FOR REMOVING MATERIAL FROM A THERAPEUTIC COMPOSITION」と題された米国仮特許出願第62／914，374号に対する優先権を主張しており、これらの各々はその全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
[参照による組み込み]
本明細書で言及されているすべての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されている場合と同じ程度に、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示は、一般に、ポリヌクレオチドベースの治療薬を迅速かつ高収率で製造するための方法およびシステムに関するものである。本開示は、特に、ワクチンを含む治療用mRNAの自動製造に関連し、迅速かつ効率的に実施され得る。このような治療薬は、患者固有の情報を考慮してもよく、オンデマンドで、完全にまたは部分的に医療現場（例えば、病院、診療所など）で製造されてもよい。
現在、ポリヌクレオチド治療薬、特にmRNA治療薬の製造・製剤化技術では、しばしば製品が汚染や劣化にさらされることがある。現在利用可能な集中生産は、複数のポリヌクレオチド種を含む可能性のある治療用製剤に使用するには、コストがかかりすぎ、時間がかかりすぎ、汚染の影響を受けやすい可能性がある。スケーラブルなポリヌクレオチド製造の開発、単一患者への投与量の生成、汚染を防ぐためのタッチポイントの排除、臨床製造要件を満たすための入力と工程追跡、および医療現場オペレーションでの使用により、これらの有望な治療手段の利用を促進することができる。マイクロ流体工学の装置と工程は、これらの目標に対して大きなアドバンテージをもたらすことができる。
本明細書に記載されるのは、上記のニーズに対処し得る様々な治療薬を製造するための方法および装置（例えば、システム）である。
本明細書では、多種多様なワクチンおよび治療薬を製造するのに有用な装置および方法を説明する。例えば、本明細書に記載されるのは、ワクチンを含む個人化治療薬を製造するための方法および装置（例えば、システム、デバイスなど）である。1つの非限定的な例では、本明細書に記載される方法および装置は、皮膚T細胞リンパ腫において活性な癌特異的抗原に対する治療用mRNAワクチンを製造するために使用され得る。
したがって、一般に、本明細書に記載されているのは、mRNA治療薬の自動化高収率製造方法であり、任意に医療現場で展開されるものである。
例えば、本明細書に記載されるのは、1つ以上のマイクロ流路デバイス（マイクロ流体デバイス）との密封流体連通を確保するように構成された複数の流体デポを含むシステムを用いて治療用ポリヌクレオチドを形成（例えば、製造、作成、合成）する方法であって、該方法は、合成鋳型を形成するステップと、鋳型からin vitro転写を行って治療用ポリヌクレオチドを生成するステップと、治療用ポリヌクレオチドを精製するステップとを行うために、大気との接触から保護された密封閉流路において、複数の流体デポのうちの1つ以上の流体デポと1つ以上のマイクロ流路デバイス上の複数のリアクタとの間で試薬を輸送することを含む。
1つ以上のマイクロ流路プレートデバイスとの密封流体連通を確保するように構成された複数の流体デポを含むシステムを用いて治療用mRNAを製造する方法であって、1つ以上のマイクロ流路プレートデバイスは複数のリアクタを含み、方法は、1つ以上の流体デポから複数のリアクタのうちの1つ以上の第1リアクタ領域に鋳型前駆体材料を送達し、鋳型前駆体材料を処理して鋳型前駆体材料から鋳型を調製するステップ、該鋳型を複数のリアクタのうちの1つ以上の第2リアクタ領域に移送し、鋳型をin vitro転写によって処理して治療用mRNAを形成するステップ、および治療用mRNAを複数のリアクタのうちの1つ以上の第3リアクタ領域に移送し、1つ以上の第3リアクタ領域内で2次元（2D）精製によって治療用mRNAを精製するステップを含んでもよく、すべてのステップが、鋳型および治療用mRNAを大気の接触にさらすことなく行われる。
1つ以上のマイクロ流路プレートデバイスと密封流体連通している複数の流体デポを含むシステムを用いて治療用mRNAを製造する方法であって、1つ以上のマイクロ流路プレートデバイスは複数のリアクタを含み、方法は、流体動力を用いて、1つ以上の流体デポから複数のリアクタのうちの1つ以上の第1リアクタ領域に鋳型前駆体材料を送達し、鋳型前駆体材料を処理して鋳型前駆体材料から鋳型を調製するステップ、流体動力を用いて、鋳型を複数のリアクタのうちの1つ以上の第2リアクタ領域に移送し、鋳型をin vitro転写で処理して治療用mRNAを形成するステップ、流体動力を用いて、治療用mRNAを複数のリアクタのうちの1つ以上の第3リアクタ領域に移送し、1つ以上の第3リアクタ領域内で2次元（2D）精製によって治療用mRNAを精製するステップ、流体動力を用いて、治療用mRNAを複数のリアクタのうちの1つ以上の第4リアクタ領域に移送し、治療用mRNAを送達ビヒクルでカプセル化して治療用mRNA組成物を形成するステップ、および流体動力を用いて、治療用mRNA組成物を1つ以上の第5流体デポで濃縮するステップを含んでもよく、すべてのステップが、鋳型および治療用mRNAを大気の接触にさらすことなく行われる。
治療用ポリヌクレオチドの精製は、典型的には、複数のリアクタのうちの1つ以上のリアクタ内で治療用ポリヌクレオチドを2次元（2D）精製することを含む。2D精製は、本明細書に記載の実質的に平坦なマイクロ流路デバイス（例えば、マイクロ流路プレートデバイス）内で行われてもよく、治療用ポリヌクレオチドから材料（例えば、二本鎖RNAなど）を除去するための材料を使用することを含んでもよい。マイクロ流路デバイスにおけるポリヌクレオチドの2D精製は、カラムの使用を必要とする場合があり、本明細書に記載のように、閉路環境及び／又は少量で行うことが困難又は不可能なステップを含む場合がある先行技術の技術と比較して、特に有利であり得る。ある変形例では、治療用ポリヌクレオチドを精製することは、1つまたは複数のリアクタ内で、セルロース材料を用いて二本鎖mRNAを除去することを含んでいる。
これらの方法のいずれも、1つ以上のマイクロ流路デバイス上の1つ以上のリアクタにおいて、治療用ポリヌクレオチドを送達ビヒクルとともに製剤化して治療用ポリヌクレオチド組成物を形成することをさらに含んでもよい。治療用ポリヌクレオチド（例えば、mRNA）は、本明細書に記載されるように、送達ビヒクルでカプセル化されてもよく、ある変形例では、アジュバントmRNA（例えば、免疫応答を増強するタンパク質を封入したmRNA）を含む治療用mRNAに加えてさらなるmRNAを含んでいてもよい。送達ビヒクルは、両親媒性ナノ粒子、例えば、アミノ脂質化ペプトイドを含んでいてもよい。
ある変形例では、治療用組成物は、後に送達ビヒクルと結合させるために保存されてもよい（例えば、4℃で、密閉された筐体、容器またはバイアルに保存される）。治療用組成物は、マイクロ流路デバイスからマイクロ流体制御装置内の流体デポに移動され、同じマイクロ流体制御装置で使用されるか、または送達ビヒクルと結合させるために別の（例えば、使用されるべき病院または診療所に近接することを含む地理的に離れた）マイクロ流体制御装置に提供されてもよい。治療用ポリヌクレオチド（例えば、治療用mRNA）を送達ビヒクルと結合させると、治療用組成物が形成される。治療用組成物は、使用（例えば、患者への注射）前にさらに修飾されることがある。
例えば、これらの方法のいずれかが、1つまたは複数のマイクロ流路デバイスにおいて治療用ポリヌクレオチド組成物を透析および／または濃縮することを含んでもよい。本明細書で使用される透析は、粒子が膜（透析膜）を通過する能力の差に基づいて、液体中の粒子を分離することを指す場合がある。ある変形例では、透析は向流交換を含む。
システムは、システムの1つ以上のセンサからの光フィードバックによって、合成鋳型を形成するステップと、鋳型からin vitro転写を行うステップと、治療用ポリヌクレオチドを精製するステップとを自動的にかつ連続的に実行してもよい。
一般に、治療用ポリヌクレオチドは、mRNAであってもよい。例えば、治療用ポリヌクレオチドは、mRNA、環状RNA、または自己複製RNAなどであってもよい。
一般に、システムは、流体動力によって、例えば、1つ以上の流体回路を使用して、1つ以上の流体デポと複数のリアクタとの間で試薬を輸送してもよい。流体動力とは、一般に、空気圧と油圧の両方を指す。流体動力回路は、複数の要素（例えば、流体ライン、バルブなど）を含んでもよく、異なる流体動力回路（本明細書では流体回路ともいう）の構成要素は、複数の流体動力回路によって共有されてもよく、コントローラの制御下で、一つ以上のバルブを介して切り替えてもよい。例えば、システムは、1つ以上の流体デポと複数のリアクタとの間で試薬を空気圧で輸送してもよい。コントローラによって制御される流体動力の使用は、有利には、鋳型、治療用mRNA及び／又は治療用組成物を形成するために用いられる処理の非接触制御を可能にし得る。例えば、システムは、1つ以上のマイクロ流路デバイス内の1つ以上の弾性層を偏向させることによって、1つ以上の流体デポと複数のリアクタとの間で試薬を輸送してもよい。
本明細書に記載される方法は、上記のように、完全にまたは部分的に現地で（例えば、医療現場で）実施され得る。有利には、本明細書に記載の方法は、有効性を低下させ、及び／又は合併症を引き起こす危険性がある治療用mRNAへの保存料又は添加物の使用なしに、治療用mRNAのオンデマンド製造を可能にし得る。治療用mRNA及び送達ビヒクルを含む治療用組成物が時間の経過とともに凝集及びクラスター化する可能性があるので、送達ビヒクルを治療用ポリヌクレオチド（例えば、治療用mRNA）に現地で製剤化することは特に有益であり得る。さらに、これらの方法は、既存の方法と比較して、迅速に実行され得る。例えば、本明細書に記載のシステムは、合成鋳型を形成するステップと、鋳型からin vitro転写を行って治療用ポリヌクレオチドを生成するステップと、および治療用ポリヌクレオチドを精製するステップとを5日未満（例えば、4日未満、3日未満など）で自動的にかつ連続的に行ってもよい。
これらの方法のいずれもが、流体デポと1つ以上のマイクロ流路デバイス上の複数のリアクタとの間で試薬を輸送する前に、流体デポを1つ以上のマイクロ流路デバイスに密封し、流体デポを加圧することをさらに含んでもよい。コントローラは、流体デポの加圧を制御してもよい。
一般に、これらの方法及び装置は、製造の一部又は全部を記録してもよく、この記録は、光学的（例えば、動画、ビデオ等を含む、マイクロ流路デバイス内の流体の動きを示す）及び／又は非光学的センサデータ（圧力測定値、温度測定値等）であってもよい。この製造データは、品質管理及び試験を含む、後の検討のために保管、保存、及び／又は送信されてもよい。したがって、これらの方法のいずれも、ステップの実行中に、1つ以上のマイクロ流路デバイス内の流体の動きを、製造される治療用ポリヌクレオチドに関連するファイルに、記録することを含んでもよい。
本明細書に記載された方法のいずれも、これらの方法の全てまたは一部を実行するように構成されたソフトウェアを実行するコンピュータ（例えばプロセッサ）を含むシステム（例えば、これらの命令をコード化した非一時的コンピュータ可読媒体）によって、自動的にまたは半自動的に実行することができる。例えば、治療用ポリヌクレオチドを製造するための命令を具現化した非一時的コンピュータ可読媒体は、1つ以上のマイクロ流路デバイスとの密封流体連通を確保するように構成された複数の流体デポを含むシステムのコントローラによって実行されると、1つ以上のマイクロ流路デバイスと流体連通している複数の流体デポを加圧すること、および合成鋳型を形成するステップと、鋳型からin vitro転写を行って治療用ポリヌクレオチドを生成するステップと、治療用ポリヌクレオチドを精製するステップとを（例えば、1つまたは複数のマイクロ流路デバイス内で全て）実行するために、大気との接触から保護された密封閉流路において、複数の流体デポのうちの1つ以上の流体デポと1つ以上のマイクロ流路デバイス上の複数のリアクタとの間で試薬を輸送すること、を含む方法をコントローラに実行させる。
命令は、さらに、コントローラに、システムの1つ以上の光センサからの光フィードバックに基づいて、合成鋳型を形成するステップと、鋳型からin vitro転写を行うステップと、治療用ポリヌクレオチドを精製するステップとを自動的にかつ連続的に実行させてもよい。命令は、さらに、コントローラに、複数のリアクタのうちの1つ以上のリアクタ内で、二次元（2D）精製によって治療用ポリヌクレオチドを精製するように制御させてもよく、および／または、1つ以上のマイクロ流路デバイス上の1つ以上のリアクタにおいて、治療用ポリヌクレオチドを送達ビヒクルとともに製剤化させて治療用ポリヌクレオチド組成物を形成させてもよく、および／または、治療用ポリヌクレオチド組成物を1つ以上のマイクロ流路デバイスで透析および／または濃縮させてもよい。
また、本明細書に記載されるのは、本明細書に記載の閉路システムのいずれかを使用してmRNA合成用の合成二本鎖DNA鋳型を作成する自動化方法である。例えば、1つ以上のマイクロ流路デバイスとの密封流体連通を確保するように構成された複数の流体デポを含む閉路システムを使用してmRNA合成用の合成二本鎖DNA鋳型を作成する自動化方法であって、該方法は、大気との接触から保護された閉流路において、試薬を結合するために、複数の流体デポのうちの1つ以上の流体デポと1つ以上のマイクロ流路デバイス上の複数のリアクタとの間で試薬を輸送すること、および治療用mRNAをin vitro転写するための合成二本鎖DNA鋳型を形成することを含んでもよい。
形成された合成鋳型（合成二本鎖DNA鋳型）は、細菌DNAを含まず、かつエンドトキシンを含まないものであってもよい。
これらの方法は、閉路システムのコントローラにおいて、閉路システムの1つ以上のセンサから光センサデータを受信することを含んでもよく、コントローラは、光センサデータに基づいて、閉路システムの動作を制御する。
方法は、流体デポを加圧することを含んでもよく、及び／又は、試薬を輸送することは、目的の合成遺伝子および合成in vitro転写促進剤カセットを複数の流体デポのうちの1つ以上の流体デポからマイクロ流路デバイス内の1つ以上の第1リアクタに輸送するステップと、目的の合成遺伝子を合成in vitro転写促進剤カセットと結合させて合成産物を作成するステップと、合成産物から未反応物を除去するステップと、合成産物を増幅して合成二本鎖DNA鋳型を生成するステップとを含む。1つ以上のマイクロ流路デバイスは、閉路システムに着座したマイクロ流路プレートデバイスを含む。
有利なことに、これらの方法は、他のシステム（典型的にはフェムトモル量しか生成しない）と比較して、かなりの量の鋳型（mM量）を作成することが含まれる。本明細書に記載される方法及び装置は、大量の鋳型を製造することができる。
マイクロ流路デバイスと密封流体連通している複数の流体デポを含む閉路システムを使用して、in vitro転写用の合成二本鎖DNA鋳型を作成する自動化方法は、大気との接触から保護された閉流路で、目的の合成遺伝子および合成in vitro転写促進剤カセットを含む試薬を、複数の流体デポのうちの1つ以上の流体デポから、マイクロ流路デバイスの1つ以上の第1リアクタへ輸送するステップ、目的の合成遺伝子と合成in vitro転写促進剤カセットとを結合して合成産物を生成するステップ、マイクロ流路デバイス内で合成産物を輸送して未反応の目的の合成遺伝子および未反応の合成in vitro転写促進剤カセットを合成産物から除去するステップ、およびマイクロ流路デバイス内で合成産物を輸送し、合成産物を増幅して二本鎖DNA鋳型を生成するステップを含んでもよい。前述のように、合成産物を増幅するステップは、1mMを超える増幅DNA鋳型を生成することを含んでもよい。
また、本明細書に記載されるのは、マイクロ流路デバイスと密封流体連通している複数の流体デポを含む閉路システムを使用して、in vitro転写用の合成二本鎖DNA鋳型を作成する自動化方法であって、該方法は、大気との接触から保護された閉流路で、目的の合成遺伝子および合成in vitro転写（IVT）促進剤カセットを含む試薬を、複数の流体デポのうちの1つ以上の流体デポから、マイクロ流路デバイスの1つ以上の第1リアクタへ輸送するステップ、目的の合成遺伝子と合成IVT促進剤カセットとを1つ以上の第1リアクタ内で結合させて合成産物を生成するステップ、合成産物をマイクロ流路デバイスの1つ以上の第2リアクタに輸送して未反応の目的の合成遺伝子および未反応の合成IVT促進剤カセットを合成産物から除去するステップ、合成産物をマイクロ流路デバイスの1つ以上の第3リアクタに輸送し、合成産物を増幅して1mMを超える増幅DNA鋳型を生成するステップ、および閉路システムのコントローラにおいて、閉路システムの1つ以上のセンサから光センサデータを受信するステップ、を含み、コントローラが、光センサデータに基づいて、閉路システムの動作を制御する。
例えば、マイクロ流路デバイスと密封流体連通している複数の流体デポを含む閉路システムを使用して、in vitro転写用の合成二本鎖DNA鋳型を作成する自動化方法は、大気との接触から保護された閉流路において、第1流体動力回路を用いて、目的の合成遺伝子および合成in vitro転写（IVT）促進剤カセットを、複数の流体デポのうちの1つ以上の流体デポから、マイクロ流路デバイスの1つまたは複数の結合リアクタへと輸送し、目的の合成遺伝子をIVT促進剤カセットに結合させて合成産物を生成するステップ、マイクロ流路デバイスにおいて、第2流体動力回路を用いて、未反応の目的の合成遺伝子および未反応の合成in vitro転写促進剤カセットを、合成産物から除去するステップ、第3の流体動力回路を用いて、合成産物をマイクロ流路デバイスの1つ以上の増幅リアクタに移送し、合成産物を増幅して、1mMを超える増幅DNA鋳型を生成するステップ、および閉路システムのコントローラにおいて、閉路システムの1つ以上の光センサから光センサデータを受信するステップ、を含んでもよく、コントローラは、光センサデータに基づいて、第1、第2、および第3流体動力回路を制御し、複数の流体デポおよびマイクロ流路デバイスを閉路密封環境に維持する。
これらの方法のいずれにおいても、合成二本鎖DNA鋳型は、細菌DNAを含まず、かつエンドトキシンを含まない。
これらの方法のいずれもが、閉路システムのコントローラにおいて、閉路システムの1つ以上のセンサから光センサデータを受信するステップを含んでもよく、コントローラが、光センサデータに基づいて閉路システムの動作を制御する。光センサデータは、カメラまたは他の撮像センサからのデータであってもよい。本明細書に記載の方法は、複数の流体デポとマイクロ流路デバイスとの間、又はマイクロ流路デバイス内で材料を移動させるための1つ以上の流体動力回路を使用してもよい。コントローラは、流体動力回路の動作を調整してもよく、光学情報を用いて調整してもよい。例えば、コントローラは、流体が閉路システムの1つ以上の部分（例えば、デポ、流体ライン、及び／又はマイクロ流路センサの領域（複数可））内にあると判断してもよい。
これらの方法のいずれもが、増幅DNA鋳型をマイクロ流路デバイスの1つ以上の消化リアクタに移送し、増幅された合成産物を酵素的に修飾して二本鎖DNA鋳型を生成するステップを含んでもよい。
本明細書で使用されるように、目的の合成遺伝子と合成in vitro転写促進剤カセットとを結合させて合成産物を作成するステップは、合成直鎖状または環状ライゲーション産物を作成することを含んでもよい。結合ステップは、ライゲーションを介して、及び／又はハイブリダイゼーション及び／又はアニーリング及び／又はプライマー伸長によるものであってもよい。ある変形例では、合成産物を増幅するステップは、直鎖状、分枝状または環状の増幅DNA産物を生成することを含み、さらに、増幅DNA産物を直鎖状化して二本鎖DNA鋳型を生成することを含む。ライゲーションには、DNAリガーゼによるライゲーションまたはプライマー伸長によるライゲーションが含まれ得る。ある変形例では、増幅ステップは、多重置換増幅（MDA）を含む。あるいは、増幅ステップは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅を含んでもよい。
ある変形例では、合成in vitro転写促進剤カセットが、プロモータと、5'UTRと、開裂可能なリンカーと、3'UTRと、少なくとも200個のアデニン残基または200個のチミジン残基が並んでなるポリA領域をコードする部分とを含む二本鎖DNA鋳型から成ってもよい。二本鎖DNA鋳型は、目的の合成遺伝子の3'末端に、少なくとも300bpsの長さのポリA領域を含んでもよい。一般に、in vitro転写促進剤カセットは、1kb未満の長さであってよい。ある変形例では、合成in vitro転写促進剤カセットは、抗生物質耐性遺伝子をコードせず、及び／又は複製起点（ORI）を有さない。
また、本明細書に記載されるのは、鋳型材料（上記の鋳型材料を含むが、これに限定されない）を用いてin vitro転写（IVT）を行い、治療用mRNAを形成する自動化方法および装置である。例えば、本明細書に記載されるのは、1つ以上のマイクロ流路デバイスとの密封流体連通を確保するように構成された複数の流体デポを含むシステムを用いて、in vitro転写（IVT）反応を自動的に行う方法および装置であって、該方法は、1つ以上のマイクロ流路デバイスにおいて鋳型から治療用mRNAのin vitro転写を行うステップと、治療ポリヌクレオチドを精製するステップとを実行するために、大気との接触から保護された閉流路において、複数の流体デポのうちの1つ以上の流体デポと1つ以上のマイクロ流路デバイス上の複数のリアクタとの間で試薬を輸送することを含む。
例えば、マイクロ流路デバイスとの密封流体連通を確保するように構成された複数の流体デポを含むシステムを用いてin vitro転写（IVT）反応を行う自動化方法であって、該方法は、複数の流体デポのうちの1つの流体デポ及び／又はマイクロ流路デバイスの一部位から、マイクロ流路デバイスの1つ以上のIVTリアクタに、DNA鋳型と、ポリメラーゼと、ヌクレオチドとを送達するステップ、1つ以上のIVTリアクタにおいて、DNA鋳型およびヌクレオチドを処理して、治療用mRNAを形成するステップ、および治療用mRNAをマイクロ流路デバイスの1つ以上の精製リアクタ領域に移送し、1つ以上の精製リアクタ領域内で、2次元（2D）精製によって治療用mRNAを精製するステップを含み、マイクロ流路デバイスおよび複数の流体デポは、大気への露出を防止する閉路密封環境を形成する。
一般に、システムは、これらの方法、例えば、マイクロ流路デバイス内で1つ以上の弾性層を偏向させることによって試薬を輸送するステップを実行するためのコントローラを含んでもよい。これらの方法は、システムのコントローラにおいて、システムの1つ以上のセンサから光センサデータを受信することを含んでもよく、コントローラは、光学センサデータに基づいて、システムの動作を制御する。コントローラはまた、流体デポの加圧を制御してもよい。本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、システムは、システムに着座するマイクロ流路デバイスを含んでもよい。
一般に、DNA鋳型は、目的の合成遺伝子の二本鎖DNA鋳型と合成in vitro転写促進剤カセットから成ってもよい。
これらの方法のいずれもが、コントローラによって制御される1つ以上の流体動力回路を使用して、DNA鋳型、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、および治療用mRNA材料を複数の流体デポとマイクロ流路デバイスとの間、またはマイクロ流路デバイス内で移動させる送達ステップおよび輸送ステップを含んでもよい。例えば、送達ステップおよび輸送ステップは、コントローラの制御下で、マイクロ流路デバイス内の1つ以上の弾性層を偏向させることによって、方法中に大気との接触を避けて実行されてもよい。
ある変形例では、IVTリアクタが使用され、このIVTリアクタは、それぞれが液体受容部分と圧力受容部分とを有する一対の接続されたチャンバを備えてもよく、液体受容部分は、液体受容部分の容積を調節するために圧力受容部分によって偏向され得る弾性層によって、圧力受容部分から分離されている。DNA鋳型は、目的の合成遺伝子の二本鎖DNA鋳型と、合成in vitro転写促進剤カセットとから成ってもよい。
これらの方法のいずれもが、複数の流体デポを、マイクロ流路デバイス上の複数の受容ポートと流体連通して密封するステップを含んでもよい。
例えば、マイクロ流路デバイスとの密封流体連通を確保するように構成された複数の流体デポを含むシステムを用いて、in vitro転写（IVT）反応を行う自動化方法は、複数の流体デポを加圧するステップ、1つ以上の第1流体動力回路を使用して、複数の流体デポのうちの1つの流体デポ及び／又はマイクロ流路デバイスの一部位から、マイクロ流路デバイスの1つ以上のIVTリアクタに、サブマイクロリットルの精度で計量された量のDNA鋳型と、ポリメラーゼと、ヌクレオチドとを送達するステップ、1つ以上のIVTリアクタにおいて、DNA鋳型およびヌクレオチドを処理して、治療用mRNAを形成するステップ、および第2流体動力回路を用いて、治療用mRNAをマイクロ流路デバイスの1つ以上の精製リアクタ領域に移送し、1つ以上の精製リアクタ領域内で、2次元（2D）精製によって治療用mRNAを精製するステップを含んでもよく、マイクロ流路デバイスおよび複数の流体デポは、大気への露出を防止する閉路密封環境を形成する。
前述のように、本明細書に記載されるのは、本明細書に記載されたこれらの方法のいずれかを実行するように構成されたソフトウェア及び／又はファームウェアである。例えば本明細書に記載されるのは、in vitro転写（IVT）反応を行うための命令を具現化した非一時的コンピュータ可読媒体であって、1つ以上のマイクロ流路デバイスとの密封流体連通を確保するように構成された複数の流体デポを含むシステムのコントローラによって実行されると、反応中の任意の時間に、空気圧によって、サブマイクロリットルの精度で計量された量の鋳型材料と、ポリメラーゼと、ヌクレオチドとを複数の流体デポからマイクロ流路デバイスの第1リアクタに送達するステップ、第1リアクタにおいて、鋳型材料およびヌクレオチドを処理して、治療用mRNAを形成するステップ、および空気圧で、第1リアクタからマイクロ流路デバイスを通して治療用mRNAを移送するステップを含む方法をコントローラに実行させ、マイクロ流路デバイスおよび複数の流体デポは、大気への露出を防止する閉路密封環境を形成する。
上述のように、ある変形例において、本明細書に記載の方法及び装置は、治療用ポリヌクレオチド（例えば、治療用mRNA）を送達ビヒクルと自動的に結合させることによって、例えば、治療用mRNAを送達ビヒクルでカプセル化するために、治療用組成物を配合（例えば、化合）するために使用されてもよい。これは、本明細書に記載されるような装置内で行われてもよく、ある変形例では、鋳型、および／または治療用ポリヌクレオチドを形成することを含んでもよい。例えば、1つ以上のマイクロ流路プレートデバイスと密封流体連通している複数の流体デポを含むシステムを用いて、治療用mRNA組成物を製造する方法であって、1つ以上のマイクロ流路プレートデバイスが複数のリアクタを含み、該方法は、複数の流体デポうちの1つ以上の流体デポから、複数のリアクタのうちの第1リアクタに、鋳型前駆体材料を送達し、鋳型前駆体材料を処理して、鋳型前駆体材料からDNA鋳型を形成するステップ、DNA鋳型を複数のリアクタのうちの第2リアクタに移送し、DNA鋳型をin vitro転写によって処理して、治療用mRNAを形成するステップ、治療用mRNAを複数のリアクタのうちの第3リアクタに移送し、治療用mRNAを送達ビヒクルと結合させる処理を行って、治療用mRNA組成物を形成するステップ、および治療用mRNA組成物を第3リアクタと流体連通している濃縮器に移送するステップを含んでもよい。治療用mRNAを第3リアクタに移送するステップは、複数の異なる治療用mRNAを送達ビヒクルとともに移送して、治療用mRNA組成物を形成することを含んでもよい。送達ステップおよび移送ステップは、コントローラによって制御されるシステム内の1つ以上の流体動力回路によって実行されてもよい。例えば、コントローラは、1つ以上のマイクロ流路プレートデバイス内の1つ以上の弾性層を偏向させることによって、流体動力回路を制御してもよい。方法は、医療現場で実行されてもよい。
これらの方法（およびそれらを実行するシステム）のいずれも、自動的に、かつ同じマイクロ流路デバイス内で、（例えば、送達ビヒクルでカプセル化されたmRNAの）治療用組成物を透析し、材料を除去して、および／または治療用組成物を濃縮するように構成することができる。例えば、これらの方法のいずれかは、1つ以上のマイクロ流体経路プレートデバイス内で治療用mRNA組成物を透析して治療用mRNA組成物を精製することを含んでもよい。任意の適切なナノ粒子を使用してもよい（例えば、アミノ脂質化ペプトイドのような両親媒性ナノ粒子）。
さらに、これらの方法のいずれかが、第2リアクタと流体連通している複数のリアクタのうちの1つ以上のリアクタ内での二次元（2D）精製を含んでもよい。
治療用mRNA組成物の製造方法は、特に、既知の技術及び手法と比較して、高速であってもよい。例えば、本明細書に記載の方法では、合成鋳型の形成（例えば、細菌前駆体を使用しないデノボ合成）を含む治療用組成物（治療用mRNA及び送達ビヒクル）の形成が5日以下（例えば、4日以下、72時間以下等）で行われてもよい。
例えば、1つ以上のマイクロ流路プレートデバイスと密封流体連通している複数の流体デポを含むシステムを用いて、治療用mRNA組成物を製造する方法であって、1つ以上のマイクロ流路プレートデバイスは複数のリアクタを含み、該方法は、複数の流体デポを加圧するステップ、第1流体動力回路を制御して、複数の流体デポのうちの1つ以上の流体デポから、複数のリアクタのうちの第1リアクタに、サブマイクロリットルの精度で、かつ大気との接触なしに、鋳型前駆体材料を送達するステップ、鋳型前駆体材料を処理して、鋳型前駆体材料からDNA鋳型を形成するステップ、第2流体動力回路を制御して、複数のリアクタのうちの第2リアクタに、サブマイクロリットルの精度で、かつ大気との接触なしに、DNA鋳型を移送するステップ、in vitro転写によってDNA鋳型を処理して、治療用mRNAを形成するステップ、第3流体動力回路を制御して、複数のリアクタのうちの第3リアクタに、サブマイクロリットルの精度で、かつ大気との接触なしに、治療用mRNAを移送するステップ、治療用mRNAを送達ビヒクルと結合させる処理を行って、治療用mRNA組成物を形成するステップ、第3流体動力回路を制御して、治療用mRNA組成物を第3リアクタと流体連通している濃縮器に移送するステップ、および治療用mRNA組成物を濃縮するステップを含んでもよい。
本明細書に記載される方法及び装置は、治療用ポリヌクレオチド組成物のオンデマンド合成を提供するために使用され得る。ある変形例では、これらの方法は、成分の一部を遠隔で合成すること、および装置を使用して、次に患者に送達され得る治療用ポリヌクレオチド組成物を現地で合成することを含んでもよい。例えば、治療用ポリヌクレオチド組成物をオンデマンドで製造する方法であって、該方法は、遠隔施設で合成された治療用ポリヌクレオチドを現地施設で受け取ること、大気との接触から保護された自動化システムにおいて、システム内に保持されたマイクロ流路デバイスで、治療用ポリヌクレオチドを送達ビヒクルと結合させて治療用ポリヌクレオチド組成物を形成するステップと、マイクロ流路デバイス内で治療用ポリヌクレオチド組成物を透析するステップとを行うことによって、現地施設で治療用ポリヌクレオチド組成物を製剤化すること、および治療用ポリヌクレオチド組成物を提供することを含む。
治療用ポリヌクレオチドを合成することは、大気との接触から保護された閉流路装置で、合成鋳型を形成するステップと、合成鋳型からin vitro転写を行って治療用ポリヌクレオチドを形成するステップと、治療用ポリヌクレオチドを精製するステップとを行うことによって、遠隔施設のマイクロ流体システムを用いて治療用ポリヌクレオチドを合成することから成ってもよい。
例えば、治療用mRNA組成物をオンデマンドで製造する方法であって、該方法は、治療用mRNAを遠隔施設で合成すること、治療用mRNAを現地施設に輸送すること、大気との接触から保護された自動化閉流路装置において、マイクロ流路デバイスで治療用mRNAを送達ビヒクルと結合させて治療用mRNA組成物を形成するステップと、マイクロ流路デバイス内で治療用mRNA組成物を透析するステップとを行うことによって、現地施設で治療用mRNA組成物を製剤化すること、および治療用mRNA組成物を提供することを含む。現地施設は、病院または診療所であり、典型的には、本明細書に記載されるような1つ以上のマイクロ流体制御システムを含む。ある変形例では、遠隔施設は、1つ以上の（例えば、本明細書に記載されるような複数の）マイクロ流体制御システムを含む製造施設であってもよい。
本明細書に記載の方法は、治療用ポリヌクレオチド組成物を濃縮することをさらに含んでもよい。
これらの方法のいずれもが、本明細書に記載のシステムを使用して治療用ポリヌクレオチドを合成し、次いで、低温で保存しながら（例えば、低温および／または冷凍）それらを遠隔施設から現地施設に移送し（例えば、出荷）、現地施設において治療用ポリヌクレオチド（例えば、mRNA）を受け取ることを含み得る。例えば、治療用ポリヌクレオチド組成物は、mRNAワクチンから構成されてもよい。これらの方法のいずれも、システムを用いて治療用ポリヌクレオチドを製剤化することを含んでもよく、システムは、マイクロ流路デバイスとの密封流体連通が確保されるように構成された複数の流体デポを含む。
第1流体動力回路は、治療用ポリヌクレオチドと送達ビヒクルとを結合させるために、複数の流体デポから、マイクロ流路デバイスの1つ以上のリアクタに、サブマイクロリットルの精度で、かつ大気との接触なしに、治療用ポリヌクレオチドと送達ビヒクルとを送達するために使用されてもよい。
前述のように、これらの治療用組成物のいずれも、同じ（または異なる）送達ビヒクルでカプセル化された複数のmRNA（複数の治療用mRNAを含むがこれに限定されない）を含んでもよい。例えば、現地施設において治療用ポリヌクレオチド組成物を形成することは、1つ以上の追加の治療用ポリヌクレオチドを治療用ポリヌクレオチド及び送達ビヒクルと結合させることをさらに含んでもよい。本明細書に記載されるものを含む、任意の適切な送達ビヒクルが使用され得る。治療用ポリヌクレオチドは、直鎖状mRNA、環状RNA、または自己複製RNAなどのmRNAであってもよい。
治療用ポリヌクレオチドは、低温（例えば、4度、0度、-10度など）で方法月（例えば、1ヶ月以上、2ヶ月以上、3ヶ月以上、6ヶ月以上、8ヶ月以上、9ヶ月以上、1年以上など）安定していてもよく、遠隔または現地で保存されてもよい。例えば、これらの方法は、治療用組成物を製剤化する前に、治療用ポリヌクレオチドを現地施設で保存することを含んでもよい。
例えば、1つ以上のマイクロ流路デバイスとの密封流体連通を確保するように構成された複数の貯蔵デポを含む閉路システムを用いて治療用mRNA組成物を製造する方法であって、該方法は、1つ以上のマイクロ流路デバイスにおいて、DNA鋳型を形成するステップと、鋳型から治療用mRNAのin vitro転写を行うステップと、治療用mRNAを精製するステップと、mRNAを送達ビヒクルと結合させるステップとをそれぞれ行うため、大気との接触から保護された閉流路において、複数の貯蔵デポのうちの1つ以上の貯蔵デポと1つ以上のマイクロ流路デバイス上の複数のリアクタとの間で試薬を輸送することを含む。
1つ以上のマイクロ流路デバイス（ここで、1つ以上のマイクロ流路デバイスは、複数のリアクタを含む）との密封流体連通を確保するように構成された複数の貯蔵デポを含む閉路システムを用いて治療mRNA組成物を製造する方法は、鋳型前駆体材料を1つ以上の貯蔵デポから複数のリアクタの第1リアクタ領域に送達し、鋳型前駆体材料を処理して鋳型前駆体材料から鋳型を調製するステップ、鋳型を複数のリアクタのうちの第2リアクタ領域に移送し、鋳型をin vitro転写によって処理して治療用mRNAを形成するステップ、および治療用mRNAを複数のリアクタのうちの第3リアクタ領域に移送し、治療用mRNAを送達ビヒクルと結合させる処理を行って治療用mRNA組成物を形成するステップを含んでもよく、鋳型前駆体材料と送達ビヒクルとを含む材料は、大気と接触することなく、貯蔵デポから複数のリアクタに送達される。
1つ以上のマイクロ流路デバイス（例えば、ここで、1つ以上のマイクロ流路デバイスは、複数のリアクタを含む）と密封流体連通している複数の貯蔵デポを含む閉路システムを用いた治療用mRNA組成物の製造方法は、流体フローを誘導し、鋳型前駆体材料を1つ以上の貯蔵デポから複数のリアクタの第1リアクタ領域に送達し、鋳型前駆体材料を処理して鋳型前駆体材料から鋳型を調製するステップ、鋳型を複数のリアクタのうちの第2リアクタに移送し、鋳型をin vitro転写によって処理してmRNAを形成するステップ、mRNAを複数のリアクタのうちの第3リアクタ領域に移送し、mRNAを送達ビヒクルと結合させる処理を行って治療用mRNA組成物を形成するステップ、および1つ以上の貯蔵デポのうちのmRNA生成物デポを移送するステップを含んでもよく、材料は、貯蔵デポからマイクロ流路デバイスのリアクタ内に、サブマイクロリットルの精度で、大気との接触なく送達される。本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、ステップのいずれかが空気圧で実行されてもよく、例えば、流体フローが空気圧で誘導されてもよく、流体が空気圧で移送されてもよい。代替的に又は追加的に、流体は、機械的、油圧的等によって駆動されてもよい。
これらの方法（及びそれを実行するための装置）のいずれにおいても、閉路システムは、鋳型を形成するステップと、鋳型から治療用mRNAのin vitro転写を行うステップと、治療用mRNAを精製するステップと、mRNAを送達ビヒクルと結合させるステップとを自動的にかつ連続的に実行してもよい。閉路システムは、鋳型を形成するステップと、鋳型から治療用mRNAのin vitro転写を行うステップと、治療用mRNAを精製するステップと、およびmRNAを送達ビヒクルと結合させるステップとの性能を空気圧で制御してもよい。ある変形例では、閉路システムは、1つ以上のマイクロ流路デバイス内の1つ以上の膜を偏向させることによって、鋳型を形成するステップと、鋳型から治療用mRNAのin vitro転写を行うステップと、治療用mRNAを精製するステップと、mRNAを送達ビヒクルと結合させるステップとの性能を空気圧的に制御する。
本明細書に記載される方法及び装置のいずれも、病院、診療所などの医療現場で設定及び動作するように構成されてもよい。これにより、即時／オンデマンドの患者特異的治療薬を、特定の患者に対してカスタム製造することができる。代替的または追加的に、特定の患者に特異的でない治療分子は、「患者個別化」の方法で送達ビヒクルと共に製剤化されてもよい。本明細書に記載された方法および装置のため、これらの方法のいずれかを非常に迅速に実行することができる。例えば、閉路システムは、鋳型を形成するステップと、鋳型から治療用mRNAのin vitro転写を行うステップと、治療用mRNAを精製するステップと、mRNAを送達ビヒクルと結合するステップとを5日未満で自動的に、かつ連続的に実行してもよい。あるいは、システムはあらかじめ作られた鋳型を入力として使用し、残りのステップをより短時間で実行してもよい。
mRNAを送達ビヒクルと結合させるステップ（治療薬を製剤化するステップ）は、1つ以上のマイクロ流路デバイスで治療用mRNA組成物を透析し、治療用mRNA組成物を精製することをさらに含んでもよい。
これらの方法のいずれかが、1つ以上のマイクロ流路デバイス上で治療用mRNA組成物を濃縮するステップ、及び／又は治療薬を透析するステップをさらに含んでもよい。
例えば、両親媒性ナノ粒子が含まれる任意の適切な送達ビヒクルが使用されてもよい。例えば、両親媒性ナノ粒子は、アミノ脂質化ペプトイドから構成されてもよい。
代替的または追加的に、本明細書に記載の方法および装置のいずれかにおいて、mRNAは予め作成され、しばらくの間（例えば、10℃、4℃、0℃、-10℃などで）保存されてもよい。例えば、これらの方法及びそれを実行するための装置のいずれかが、治療用mRNAのライブラリを含んでもよく、治療用mRNAが個別的または集合的に（例えば、2、3、4、5、6等又はそれ以上の個別の治療用mRNAが結合されて）配合されて治療用mRNA組成物を形成してもよい。本明細書に記載されるように、治療用mRNA組成物は、したがって、オンデマンドで製造されてもよく、単一または複数の治療用mRNA組成物「カクテル」にジャストインタイムで配合されてもよい。
また、本明細書に記載されるのは、鋳型（例えば、DNA鋳型）を形成するための方法である。例えば、マイクロ流路デバイスと密封流体連通している複数の貯蔵デポを含む閉路システムを使用してin vitro転写のための合成二本鎖DNA鋳型を作成する方法は、目的の合成遺伝子と合成in vitro転写促進剤カセットとを結合させて合成直鎖状または環状ライゲーション産物を生成するステップ、合成直鎖状または環状ライゲーション産物から、未反応の目的の合成遺伝子および未反応の合成in vitro転写促進剤カセットを取り除くステップ、環状のライゲーション産物を増幅して、直鎖状、分枝状または環状の増幅DNAを生成するステップ、および増幅DNAライゲーション産物を直鎖状化して二本鎖DNA鋳型を生成するステップを含んでもよく、結合、除去、増幅および直鎖状化の各ステップが、閉路システムによってマイクロ流路デバイス内で実行される。
例えば、in vitro転写のための合成二本鎖DNA鋳型を作成する高効率自動化方法は、マイクロ流路デバイスと流体連通している複数の貯蔵デポのうちの1つ以上の貯蔵デポから、マイクロ流路デバイスのライゲーションリアクタに、目的の合成遺伝子と合成in vitro転写促進剤カセットとの各々を空気圧で送達し、目的の合成遺伝子を合成in vitro転写促進剤カセットと結合させることにより合成直鎖状または環状ライゲート産物を作成するステップ、複数の貯蔵デポのうちの1つ以上の貯蔵デポからライゲーションリアクタに1つ以上のエキソヌクレアーゼ剤を空気圧で導入し、未反応の合成遺伝子および未反応の合成in vitro転写促進剤カセットを合成直鎖状または環状のライゲート産物から遠ざけることにより未反応材料を除去するステップ、合成直鎖状または環状ライゲーション産物をマイクロ流路デバイスの増幅リアクタに空気圧で送り、直鎖状または環状ライゲーション産物を増幅するための1つ以上の増幅剤と結合させて、直鎖状、分枝状、または環状の増幅DNAを生成するステップ、および増幅されたDNAライゲーション産物をマイクロ流路デバイスの消化リアクタに空気圧で移送し、増幅されたDNAライゲーション産物を直鎖状化することにより、未反応の入力材料を含まない完全合成二本鎖DNA鋳型を生成するステップを含んでもよく、ライゲーションリアクタ、増幅リアクタ、消化リアクタ、および複数の貯蔵デポが、閉路密封環境を形成している。
（1つ以上のマイクロ流路デバイスとの密封流体連通を確保するように構成された複数の貯蔵デポを含む閉路システムを使用して）治療用mRNA組成物のための合成二本鎖DNA鋳型を作成する方法は、大気との接触から保護された閉じた流路で、複数の貯蔵デポのうちの1つ以上の貯蔵デポと1つ以上のマイクロ流路デバイス上の複数のリアクタとの間で試薬を輸送し、1つ以上のマイクロ流路デバイスにおいて、治療mRNAのin vitro転写用の鋳型を形成するステップを含むことができる。
一般に、本明細書に記載される方法及び装置は、細菌DNAを含まない及び／又はエンドトキシンを含まない二本鎖DNA鋳型を生成し得る。本明細書に記載される鋳型生成方法及び装置は、細菌培養を伴わなくてもよい。さらに、本明細書に記載されるように製造された治療用mRNAは、細菌ポリヌクレオチドを使用せずに、鋳型から合成されてもよい。したがって、本明細書に記載される方法のいずれかは、細菌DNAを使用せず、かつ／又はエンドトキシンから分離された治療用mRNAを生成するための方法であってもよい。特に、本明細書に記載されるのは、細菌DNA及び／又はエンドトキシンを含まない二本鎖DNA鋳型を製造する方法である。本明細書に記載される方法のいずれもが、無菌製造方法であってもよい。
これらの方法のいずれもが、合成in vitro転写鋳型をタイプIIS制限酵素および／またはメチル化感受性制限酵素で消化するステップを含んでもよい。結合ステップは、DNAリガーゼによるライゲーション、DNA合成によるライゲーション、プライマー伸長によるライゲーションを含んでもよい。除去ステップは、直鎖状DNAをエキソヌクレアーゼで消化すること、またはメチル化感受性制限酵素で消化することを含んでいてもよい。エキソヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼVを含んでもよい。増幅ステップは、多重置換増幅（MDA）を含んでもよい。増幅ステップは、Φ29DNAポリメラーゼで増幅することを含んでいてもよい。増幅ステップは、分枝した増幅DNAを生成することを含んでもよい。増幅ステップは、ポリメラーゼ連鎖増幅（PCR）を含んでもよい。増幅ステップは、耐熱性DNAポリメラーゼで増幅することを含んでもよい。
直鎖状化ステップは、タイプIIs制限酵素で消化することを含んでもよい。直鎖化ステップは、BsaI制限酵素で消化することを含んでもよい。合成in vitro転写鋳型の消化ステップは、DpnIなどのメチル化感受性制限酵素で消化することを含んでもよい。目的の合成遺伝子は、直鎖状であってもよい。ある変形例では、合成in vitro転写促進剤カセットは、プロモータ、5'UTR、開裂可能なリンカー、3'UTR、および少なくとも200個のアデニン残基または200個のチミジン残基が並んでなるポリA領域をコードする部分を含む二本鎖DNA鋳型で構成される。合成in vitro転写促進剤カセットは、単一ユニットとして、または2つ以上のユニットとして送達されてもよい。ポリA領域をコードする部分は、少なくとも300bpsの長さであってよい。ある変形例では、ポリA領域をコードする部分は、少なくとも350bpsの長さであってもよい。
目的の合成遺伝子は、T細胞受容体の少なくとも一部を含むものであってもよい。目的の合成遺伝子は、相補性決定領域（CDR）を含んでいてもよい。
in vitro転写促進剤カセットは、2kb未満の長さであってもよい。in vitro転写促進剤カセットは、長さが1kb未満であってもよい。in vitro転写促進剤カセットは、長さが700塩基対未満であってもよい。合成in vitro転写促進剤カセットは、抗生物質耐性遺伝子をコードしていなくてもよい。
合成直鎖状または環状ライゲーション産物は、複製起点（ORI）を有していなくてもよい。in vitro転写促進剤カセットは、複製起点（ORI）を持たなくてもよい。
前述のように、本明細書に記載される方法のいずれかのステップは、閉じたマイクロ流路デバイスにおいて実行されてもよい。ステップは、閉じたマイクロ流路デバイスにおいて実行されてもよく、結合ステップは、増幅ステップとは異なるモジュール（例えば、異なるマイクロ流路デバイス）において実行されてもよく、増幅ステップは、直鎖状化ステップとは異なるモジュールにおいて実行される。
これらの方法のいずれもが、1つ以上のマイクロ流路デバイスの閉路において、鋳型を精製するステップを含んでもよい。
また、本明細書では、本明細書に記載の閉路法及び装置を用いてin vitro転写を行う方法について説明する。例えば、（例えば、1つ以上のマイクロ流路デバイスとの密封流体連通を確保するように構成された複数の貯蔵デポを含む）閉路システムを使用してin vitro転写（IVT）反応を実行する方法は、1つ以上のマイクロ流路デバイスにおいて、鋳型から治療用mRNAのin vitro転写を行うために、大気との接触から保護されている閉流路において、複数の貯蔵デポのうちの1つ以上の貯蔵デポと1つ以上のマイクロ流路デバイス上の複数のリアクタとの間で試薬を輸送することを含んでもよい。
in vitro転写（IVT）反応を実行する方法は、複数の貯蔵デポからマイクロ流路デバイスの第1リアクタに、直接流体フローによってDNA鋳型と、ポリメラーゼと、ヌクレオチドとを、サブマイクロリットルの精度で計量された量で自動的に送達するステップ、第1リアクタで鋳型材料およびヌクレオチドを処理して治療mRNAを形成するステップ、および第1リアクタからマイクロ流路デバイスを通して治療mRNAを空気圧で移送するステップを含んでもよく、第1マイクロ流路デバイスおよび複数の貯蔵デポが、閉路密封環境を形成して、大気への露出を防止してもよい。
閉路システムは、自動的かつ連続的に動作してもよい。閉路システムは、鋳型からの治療用mRNAのin vitro転写の性能を空気圧で制御してもよい。
これらの方法のいずれもが、1つ以上のマイクロ流路デバイスにおいて、治療用mRNAを精製するステップを含むこともできる。試薬を輸送するステップは、複数の貯蔵デポからマイクロ流路デバイスの第1リアクタに試薬を輸送することを含んでもよい。
また、本明細書には、治療用mRNAを製剤化する（例えば、送達ビヒクルと結合させる）方法が記載されている。例えば、（例えば、1つ以上のマイクロ流路デバイスとの密封流体連通を確保するように構成された複数の貯蔵デポを含む閉路システムを用いて）治療用mRNA組成物を製造する方法は、1つ以上のマイクロ流路デバイスにおいて、治療用mRNAを送達ビヒクルと結合させることによって治療用mRNA組成物を製剤化するために、大気との接触から保護された閉流路において、複数の貯蔵デポのうちの1つ以上の貯蔵デポと1つ以上のマイクロ流路デバイス上の複数のリアクタとの間に試薬を輸送することを含んでもよい。閉路システムは、mRNAを送達ビヒクルと自動的に連続的に結合させることができる。閉路システムは、mRNAと送達ビヒクルとの結合を空気圧で制御してもよい。例えば、閉路システムは、1つ以上のマイクロ流路デバイス内の1つ以上の膜を偏向させることによって、mRNAを送達ビヒクルに結合させることを空気圧で制御してもよい。
mRNAと送達ビヒクルとの結合ステップは、さらに、治療用mRNA組成物を精製するために1つ以上のマイクロ流路デバイス内で治療用mRNA組成物を透析すること、及び／又は1つ以上のマイクロ流路デバイス上で治療用mRNA組成物を濃縮することを含んでもよい。
例えば、本明細書では、1つ以上のマイクロ流路デバイスとの密封流体連通を確保するように構成された複数の貯蔵デポを含むシステムを用いてmRNAを製造する方法について説明する。これらの方法のいずれかが、1つ以上のマイクロ流路デバイスにおいて、鋳型を形成するステップと、鋳型からmRNAのin vitro転写を行うステップと、mRNAを精製するステップとのうちの1つ以上を行うために、大気との接触から保護されている閉流路において、複数の貯蔵デポのうちの1つ以上の貯蔵デポと1つ以上のマイクロ流路デバイス上の複数のリアクタとの間で試薬を輸送することを含んでもよい。
1つ以上のマイクロ流路デバイスとの密封流体連通を確保するように構成された複数の貯蔵デポを含むシステムを用いて治療用mRNA組成物を製造する方法は、1つ以上のマイクロ流路デバイスにおいて、鋳型を形成するステップと、鋳型からmRNAのin vitro転写を行うステップと、mRNAを精製するステップと、mRNAを送達ビヒクルで製剤化するステップとのうちの1つ以上を行うために、大気との接触から保護されている閉流路において、複数の貯蔵デポのうちの1つ以上の貯蔵デポと1つ以上のマイクロ流路デバイス上の複数のリアクタとの間で試薬を輸送することを含んでもよい。
1つ以上のマイクロ流路デバイスとの密封流体連通を確保するように構成された複数の貯蔵デポを含むシステムを用いて治療用mRNA組成物を製造する方法は、1つ以上のマイクロ流路デバイスにおいて、鋳型を形成するステップと、鋳型から治療用mRNAのin vitro転写を行うステップと、治療用mRNAを精製するステップと、mRNAを送達ビヒクルで製剤化するステップと、製剤化された治療用mRNAの透析と濃縮を行うステップとのうちの1つ以上を行うために、大気との接触から保護されている閉流路において、複数の貯蔵デポのうちの1つ以上の貯蔵デポと1つ以上のマイクロ流路デバイス上の複数のリアクタとの間で試薬を輸送することを含んでもよい。
1つ以上のマイクロ流路デバイスとの密封流体連通を確保するように構成された複数の貯蔵デポを含むシステムを用いて治療用mRNA組成物を製造する方法は、非一時的コンピュータ可読媒体にコード化されている一連の治療用mRNA組成物形成ステップに従うことを含み、該ステップは、1つ以上のマイクロ流路デバイスにおいて、鋳型を形成するステップと、鋳型から治療用mRNAのin vitro転写を行うステップと、治療用mRNAを精製するステップと、mRNAを送達ビヒクルと結合するステップとのうちの1つ以上を行うために、大気との接触から保護されている閉流路において、複数の貯蔵デポのうちの1つ以上の貯蔵デポと1つ以上のマイクロ流路デバイス上の複数のリアクタとの間で試薬を輸送することを含んでもよい。
また、本明細書に記載されるのは、マイクロ流路デバイスとの密封流体連通を確保するように構成された複数の貯蔵デポを含むシステムを用いて治療用mRNA組成物を製造する方法であって、該方法は、マイクロ流路デバイス上で鋳型から治療用mRNAのin vitro転写を行うステップと、マイクロ流路デバイス上の流体的に接続された1つ以上のリアクタにおいて治療用mRNAを精製するステップとを含む。
また、本明細書に記載されるのは、これらの方法のいずれかによって作成された治療薬、特にmRNA治療薬を含む治療薬である。例えば、本明細書に記載されるのは、1つ以上のマイクロ流路デバイスとの密封流体連通を確保するように構成された複数の貯蔵デポを含むシステムを使用して作られた治療用mRNAであって、mRNAは、1つ以上のマイクロ流路デバイスにおいて、鋳型を形成するステップと、鋳型からmRNAのin vitro転写を行うステップと、mRNAを精製するステップとのうちの1つ以上を行うために、大気との接触から保護されている閉流路において、複数の貯蔵デポのうちの1つ以上の貯蔵デポと1つ以上のマイクロ流路デバイス上の複数のリアクタとの間で試薬を輸送することによって作成される。
例えば、本明細書に記載されるのは、1つ以上のマイクロ流路デバイスとの密封流体連通を確保するように構成された複数の貯蔵デポを含むシステムを使用して作成された治療用mRNAであり、mRNAは、1つ以上のマイクロ流路デバイスにおいて、鋳型を形成するステップと、鋳型から治療用mRNAのin vitro転写を行うステップと、治療用mRNAを精製するステップと、mRNAを送達ビヒクルで製剤化するステップとのうちの1つ以上を行うために、大気との接触から保護されている閉流路において、複数の貯蔵デポのうちの1つ以上の貯蔵デポと1つ以上のマイクロ流路デバイス上の複数のリアクタとの間で試薬を輸送することによって作成される。
例えば、本明細書に記載されるのは、1つ以上のマイクロ流路デバイスとの密封流体連通を確保するように構成された複数の貯蔵デポを含むシステムを使用して作成された治療用mRNAであり、mRNAは、1つ以上のマイクロ流路デバイスにおいて、鋳型を形成するステップと、鋳型から治療用mRNAのin vitro転写を行うステップと、治療用mRNAを精製するステップと、mRNAを送達ビヒクルで製剤化するステップと、製剤化された治療用mRNAの透析と濃縮を行うステップとのうちの1つ以上を行うために、大気との接触から保護されている閉流路において、複数の貯蔵デポのうちの1つ以上の貯蔵デポと1つ以上のマイクロ流路デバイス上の複数のリアクタとの間で試薬を輸送することによって作成される。
本明細書に記載されるのは、1つ以上のマイクロ流路デバイスとの密封流体連通を確保するように構成された複数の貯蔵デポを含むシステムを使用して、非一時的コンピュータ可読媒体にコード化されている治療用mRNA組成物を形成するための一連のステップに従って形成される治療用mRNA組成物であって、該ステップは、1つ以上のマイクロ流路デバイスにおいて、鋳型を形成するステップと、鋳型から治療用mRNAのin vitro転写を行うステップと、治療用mRNAを精製するステップと、mRNAを送達ビヒクルと結合するステップとのうちの1つ以上を行うために、大気との接触から保護されている閉流路において、複数の貯蔵デポのうちの1つ以上の貯蔵デポと1つ以上のマイクロ流路デバイス上の複数のリアクタとの間で試薬を輸送することを含む。例えば、治療用mRNAは、1つ以上のマイクロ流路デバイスとの密封流体連通を確保するように構成された複数の貯蔵デポを含むシステムを使用して形成された治療用mRNA組成物であってもよく、その方法は、マイクロ流路デバイス上で鋳型から治療用mRNAのin vitro転写を行うステップと、マイクロ流路デバイス上の流体的に接続された1つ以上のリアクタにおいて治療用mRNAを精製するステップとを含む。
本明細書に記載されたシステムのいずれもが、これらの方法のいずれかを実行するように構成されたコントローラを含むことができる。したがって、本明細書に記載される方法のいずれかを実行するように構成されたソフトウェア、ファームウェア、またはハードウェアもまた、本明細書に記載される。例えば、本明細書に記載されるのは、mRNAを製造するための命令を具現化した非一時的コンピュータ可読媒体であって、1つ以上のマイクロ流路デバイスとの密封流体連通を確保するように構成された複数の貯蔵デポを含むシステムのコントローラによって実行されると、1つ以上のマイクロ流路デバイスにおいて、鋳型を形成するステップと、鋳型からmRNAのin vitro転写を行うステップと、mRNAを精製するステップとのうち1つ以上を行うために、大気との接触から保護された閉流路において、複数の貯蔵デポのうちの1つ以上の貯蔵デポと1つ以上のマイクロ流路デバイス上の複数のリアクタとの間で試薬を輸送することを含む方法をコントローラに実行させるものである。
例えば、本明細書に記載されるのは、治療用mRNA組成物を含むmRNAを製造するための命令を具体化した非一時的コンピュータ可読媒体であって、1つ以上のマイクロ流路デバイスとの密封流体連通を確保するように構成された複数の貯蔵デポを含むシステムのコントローラによって実行されると、コントローラに本明細書に記載の方法のいずれかを実施させるものである。
また、本明細書に記載されるのは、1つ以上のマイクロ流路デバイスとの密封流体連通を確保するように構成された複数の貯蔵デポを含む閉路システムを用いてmRNAの合成二本鎖DNA鋳型を作成する方法であって、該方法は、大気との接触から保護された密封閉流路において、試薬を結合するために、複数の貯蔵デポのうちの1つ以上の貯蔵デポと1つ以上のマイクロ流路デバイス上の複数のリアクタとの間で試薬を輸送すること、および治療用mRNAのin vitro転写用鋳型を形成することを含んでもよい。
例えば、閉路システムを使用して、in vitro転写反応におけるmRNAのへの入力として使用するための合成二本鎖DNA鋳型を作成する方法は、1つ以上のマイクロ流路デバイスとの密封流体連通を確保するように構成された複数の貯蔵デポを含んでもよく、該方法は、大気との接触から保護された閉流路において、複数の貯蔵デポのうちの1つ以上の貯蔵デポと1つ以上のマイクロ流体デバイス上の複数のリアクタとの間で試薬を輸送すること、および治療用mRNAのin vitro転写用鋳型を形成することを含む。
1つ以上のマイクロ流路デバイスとの密封流体連通を確保するように構成された複数の貯蔵デポを含むシステムを用いてmRNA組成物を製造する方法であって、1つ以上のマイクロ流路デバイスは複数のリアクタを含み、方法は、1つ以上の貯蔵デポから複数のリアクタのうちの第1リアクタ領域に鋳型前駆体材料を送達し、鋳型前駆体材料を処理して鋳型前駆体材料から鋳型を調製するステップ、鋳型を複数のリアクタのうちの第2リアクタ領域に移送し、鋳型をin vitro転写によって処理してmRNAを形成するステップ、およびmRNAを複数のリアクタのうちの第3リアクタ領域に移送し、mRNAを送達ビヒクルと結合させる処理を行って、mRNA組成物を形成するステップを含んでもよく、鋳型材料および送達ビヒクルを含む材料は、大気と接触することなく貯蔵デポから複数のリアクタに送達される。
1つ以上のマイクロ流路デバイスと密封流体連通している複数の貯蔵デポを含むシステムを用いてmRNA組成物を製造する方法であって、1つ以上のマイクロ流路デバイスは複数のリアクタを含み、該方法は、1つ以上の貯蔵デポから複数のリアクタのうちの第1リアクタ領域に鋳型前駆体材料を空気圧によって送達し、鋳型前駆体材料を処理して鋳型前駆体材料から鋳型を調製するステップ、鋳型を複数のリアクタのうちの第2リアクタ領域に空気圧によって移送し、鋳型をin vitro転写によって処理してmRNAを形成するステップ、mRNAを複数のリアクタのうちの第3リアクタ領域に空気圧によって移送し、mRNAを送達ビヒクルと結合させる処理を行って、治療用mRNA組成物を形成するステップ、およびmRNA生成物を1つ以上の貯蔵デポに移送するステップを含んでもよく、材料は、サブマイクロリットルの精度で、かつ大気との接触なしに、貯蔵デポからマイクロ流路デバイスのリアクタに送達される。
マイクロ流路デバイスと密封流体連通している複数の貯蔵デポを含む閉路システムを用いて、in vitro転写用の合成二本鎖DNA鋳型を作成する方法であって、1つ以上のマイクロ流路プレートデバイスは複数のリアクタを含み、方法は、目的の合成遺伝子と合成in vitro転写促進剤カセットとを結合させて、合成直鎖状または環状ライゲーション産物を生成するステップ、未反応の目的の合成遺伝子および未反応の合成in vitro転写促進剤カセットを合成直鎖状または環状ライゲーション産物から除去するステップ、直鎖状または環状ライゲーション産物を増幅して直鎖状、分枝状、または環状の増幅DNAを生成するステップ、および増幅DNA産物を直鎖化して二本鎖DNA鋳型を生成するステップを含んでもよく、結合、除去、増幅および直鎖化の各ステップは、閉路システムによってマイクロ流路デバイス内で実行される。
これらの方法はいずれも、高能率な自動化方法であってよく、in vitro転写用の合成二本鎖DNA鋳型を作成するための高効率な自動化方法であってもよい。例えば、方法は、マイクロ流路デバイスと流体連通している複数の貯蔵デポのうちの1つ以上の貯蔵デポからマイクロ流路デバイスのライゲーションリアクタに、目的の合成遺伝子と合成in vitro転写促進剤カセットとの各々を空気圧によって送達し、目的の合成遺伝子を合成in vitro転写促進剤カセットと結合させることによって、合成直鎖状または環状ライゲーション産物を生成するステップ、複数の貯蔵デポのうちの1つ以上の貯蔵デポからライゲーションリアクタに1つ以上のエキソヌクレアーゼ剤を空気圧で導入し、未反応の合成遺伝子および未反応の合成in vitro転写促進剤カセットを合成直鎖状または環状のライゲーション産物から除去することによって、未反応材料を除去するステップ、合成直鎖状または環状ライゲーション産物を、マイクロ流路デバイスの多重置換増幅（MDA）またはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）リアクタに空気圧で送達し、直鎖状または環状ライゲーション産物を増幅するための1つ以上の増幅剤と結合させて、直鎖状、分枝状または環状の増幅DNAを生成するステップ、および増幅DNAライゲーション産物をマイクロ流路デバイスの消化リアクタに空気圧で移送し、増幅DNAライゲーション産物を直鎖状化して二本鎖DNA鋳型を生成するステップを含んでもよく、ライゲーションリアクタ、MDAまたはPCRリアクタおよび消化リアクタ、ならびに複数の貯蔵デポが閉路密封環境を形成する。
in vitro転写のための合成二本鎖DNA鋳型の作成方法であって、非一時的コンピュータ可読媒体にコード化されている一連のステップに従うことを含む方法であって、該方法は、マイクロ流路デバイスと流体連通している複数の貯蔵デポのうちの1つ以上の貯蔵デポからマイクロ流路デバイスのライゲーションリアクタに、目的の合成遺伝子と合成in vitro転写促進剤カセットとの各々を送達して、目的の合成遺伝子を合成in vitro転写促進剤カセットに結合させることによって、合成直鎖状または環状ライゲーション産物を作成するステップ、複数の貯蔵デポのうちの1つ以上の貯蔵デポからライゲーションリアクタに1つ以上のエキソヌクレアーゼ剤を導入し、未反応の合成遺伝子および未反応の合成in vitro転写促進剤カセットを合成直鎖状または環状のライゲーション産物から遠ざけて未反応材料を除去するステップ、合成直鎖状または環状ライゲーション産物をマイクロ流路デバイスの多重置換増幅（MDA）またはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）リアクタに送り、直鎖状または環状ライゲーション産物を増幅するための1つ以上の増幅剤と組み合わせて、直鎖状、分枝状、または環状の増幅DNAを生成するステップ、および増幅されたDNAライゲーション産物をマイクロ流路デバイスの消化リアクタに移送し、増幅されたDNAライゲーション産物を直鎖状化することによって二本鎖DNA鋳型を生成するステップを含み、ライゲーションリアクタ、MDAリアクタおよび消化リアクタ、ならびに複数の貯蔵デポが、閉路密封環境を形成している。
1つ以上のマイクロ流路デバイスとの密封流体連通を確保するように構成された複数の貯蔵デポを含むシステムを用いてin vitro転写（IVT）反応を行う方法は、1つ以上のマイクロ流路デバイスにおいて、鋳型から治療用mRNAのin vitro転写を行うために、大気との接触から保護された閉流路において、複数の貯蔵デポのうちの1つ以上の貯蔵デポと1つ以上のマイクロ流路デバイス上の複数のリアクタとの間で試薬を輸送することを含んでもよい。
また、本明細書で記載されるのは、in vitro転写（IVT）反応を行う方法であって、該方法は、非一時的コンピュータ可読媒体にコード化されている一連のステップに従うことを含み、該ステップは、反応中の任意の時間に、空気圧によって、サブマイクロリットルの精度で計量された量の鋳型材料と、ポリメラーゼと、ヌクレオチドとを複数の貯蔵デポからマイクロ流路デバイスの第1リアクタに送達するステップ、第1リアクタにおいて、鋳型材料およびヌクレオチドを処理して、治療用mRNAを形成するステップ、および空気圧で、第1リアクタからマイクロ流路デバイスを通して治療用mRNAを移送するステップを含み、マイクロ流路デバイスおよび複数の貯蔵デポは、大気への露出を防止する閉路密封環境を形成する。
また、本明細書で記載されるのは、in vitro転写（IVT）反応を行う方法であって、該方法は、非一時的コンピュータ可読媒体にコード化されている一連のステップに従うことを含み、該ステップは、コントローラで制御される量の鋳型材料と、ポリメラーゼと、ヌクレオチドとを、誘導された流体フローによって、複数の貯蔵デポからマイクロ流路デバイスに送達するステップを含み、コントローラは、鋳型材料およびヌクレオチドを1つ以上のリアクタで処理して治療用mRNAを形成するステップと、1つ以上のリアクタからマイクロ流路デバイスを通して治療用mRNAを移送するステップとを含む一連のステップに従い、マイクロ流路デバイスおよび複数の貯蔵デポは、大気への露出を防止する閉路密封環境を形成する。
また、本明細書で記載されるのは、in vitro転写（IVT）反応を行う方法であって、該方法は、予めプログラムされたソフトウェアコマンドによって制御される量の鋳型材料と、ポリメラーゼと、ヌクレオチドとを、誘導された流体フローによって、複数の貯蔵デポからマイクロ流路デバイスに送達するステップ、鋳型材料およびヌクレオチドをマイクロ流路デバイス内の1つ以上の第1リアクタで処理して治療用mRNAを形成するステップ、および1つ以上の第1リアクタから、mRNAの精製に適した1つ以上の第2リアクタに、マイクロ流路デバイスを通して治療用mRNAを移送するステップを含み、マイクロ流路デバイスおよび複数の貯蔵デポは、大気への露出を防止する閉路密封環境を形成する。
また、本明細書で記載されるのは、in vitro転写（IVT）反応を行う方法であって、該方法は、非一時的コンピュータ可読媒体にコード化されている一連のステップに従うことを含み、該ステップは、以下に示す一連のステップによって制御される量の鋳型材料と、ポリメラーゼと、ヌクレオチドとを、誘導された流体フローによって、複数の貯蔵デポから第1マイクロ流路デバイスの1つ以上の第1リアクタに送達するステップを含み、一連のステップは、鋳型材料およびヌクレオチドを1つ以上の第1リアクタで処理して治療用mRNAを形成するステップと、1つ以上の第1リアクタから、mRNAの精製に適した1つ以上の第2リアクタに、第1マイクロ流路デバイスを通して治療用mRNAを移送するステップと、mRNA治療薬の製剤化を完了するために、このように精製されたmRNAを移送するステップとを含み、第1のマイクロ流路デバイスおよび複数の貯蔵デポは、大気への露出を防止するために閉路密封環境を形成している。
また、本明細書に記載されるのは、in vitro転写（IVT）反応を行う方法であって、該方法は、非一時的コンピュータ可読媒体にコード化されている一連のステップに従うことを含み、該ステップは、鋳型材料、ポリメラーゼ、およびヌクレオチドを、複数の貯蔵デポから第1のマイクロ流路デバイスの1つ以上の第1リアクタに空気圧で送達するステップ、1つ以上の第1リアクタで鋳型材料およびヌクレオチドを処理して治療用mRNAを形成するステップ、1つ以上の第1リアクタからmRNAの精製に適した1つ以上の第2リアクタに、第1マイクロ流路デバイスを通じて治療用mRNAを移送するステップ、および精製されたmRNAを1つ以上の第3リアクタに移送して、精製されたmRNAを1つ以上の送達ビヒクルと結合させてmRNA治療薬を形成するステップを含み、第1マイクロ流路デバイスおよび複数の貯蔵デポは、大気への露出を防止するために閉路密封環境を形成する。
例えば、本明細書で記載されるのは、in vitro転写（IVT）反応を行う方法であって、該方法は、非一時的コンピュータ可読媒体にコード化されている一連のステップに従うことを含み、該ステップは、鋳型材料、ポリメラーゼ、およびヌクレオチドを、複数の貯蔵デポから第1マイクロ流路デバイスの1つ以上の第1リアクタに空気圧で送達するステップ、1つ以上の第1リアクタにおいて鋳型材料およびヌクレオチドを処理して治療mRNAを形成するステップ、治療mRNAを第1マイクロ流路デバイスを通して1つ以上の第1リアクタから、セルロースから成りmRNAの精製に適した1つ以上の第2リアクタに移送するステップ、および精製されたmRNAを1つ以上の第3リアクタに移送し、精製されたmRNAを1つ以上の送達ビヒクルと結合させてmRNA治療薬を形成するステップを含み、第1マイクロ流路デバイスおよび複数の貯蔵デポが、大気への露出を防止するために閉路密封環境を形成する。
また、本明細書で記載されるのは、1つ以上のマイクロ流路デバイスとの密封流体連通を確保するように構成された複数の貯蔵デポを含むシステムを用いて治療用mRNA組成物を製造する方法であって、該方法は、1つ以上の治療用mRNAを1つ以上のマイクロ流路デバイス内の送達ビヒクルと結合させることによって治療用mRNA組成物を製剤化するために、大気との接触から保護された閉流路において、複数の貯蔵デポのうちの1つ以上の貯蔵デポと1つ以上のマイクロ流体デバイス上の複数のリアクタとの間で試薬を輸送することを含む。
1つ以上のマイクロ流路デバイスとの密封流体連通を確保するように構成された複数の貯蔵デポを含むシステムを使用して、オンデマンドで治療用mRNA組成物を製造する方法であって、該方法は、1つ以上のマイクロ流路デバイスで、鋳型を形成するステップと、鋳型から治療用mRNAのin vitro転写を行うステップと、治療用mRNAを精製するステップと、mRNAを送達ビヒクルで製剤化するステップとのうちの1つ以上を実行するために、大気との接触から保護された閉流路において、複数の貯蔵デポのうちの1つ以上の貯蔵デポと1つ以上のマイクロ流路デバイス上の複数のリアクタとの間で試薬を輸送することを含んでもよい。
これらの方法及び装置のいずれもが、医療現場で操作（例えば、治療用mRNAが製造）されてもよい。これらの方法および装置のいずれもが、迅速かつ連続的に実行されてもよく、例えば、治療薬は72時間未満で製造される。
前述のように、これらの方法および装置のいずれかにおいて、マイクロ流路デバイス内において、（例えば、IVTによって）形成されたポリヌクレオチドは、マイクロ流体制御装置の自動制御下で、送達ビヒクルと結合される前および後に精製されてもよい。
特に、本明細書に記載されるのは、作製工程の一部として、1つ以上の標的材料（例えば、二本鎖RNAなど）を除去してもよく、かつ／または1つ以上の追加材料（例えば、凍結乾燥材料）を治療材料に追加してもよい透過性インサート材料との使用に適合した1つ以上のマイクロ流路デバイスを含み得る方法及び装置である。透過性インサート材料は、マイクロ流路デバイスの1つ以上の流体接触チャンバ内に保持されるように構成されてもよく、現像治療溶液が透過性インサート材料を通過するように適合されてもよい。透過性インサート材料は、チャンバ内の弾性膜によって操作され得るように、圧縮性、及び／又は変形性、及び／又は弾性であってよい。透過性インサートは、透過性であり、かつ固体、粒状、ゲルなどの改質材料を含むカバー（例えば、外カバー）を含んでもよい。ある変形例では、透過性インサート材料は、溶液から二本鎖RNAを選択的に除去するように構成されたセルロース材料である。
透過性材料は、多孔質であってもよい（例えば、細孔を含んでもよい）。ある変形例では、透過性材料は、繊維状であってもよいし、層状であってもよい。例えば、透過性材料は、繊維状であってもよく、流体が移動できるチャネルを含んでもよい。ある変形例では、流体に対して透過性であることを可能にするために、透過性材料にチャネルが形成されてもよい。例えば、透過性材料は、レーザーによって形成されたチャネル、又は内部容積が流体に対してアクセス可能にされ得る他の任意の手段を有してもよい。ある変形例では、透過性材料は、層間を流体が通過できるように配置された複数の層から形成されてもよい。表面のみがアクセス可能な材料の複数の薄層を一緒に積み重ねてもよい。例えば、機能化グラフェンは、（例えば、極端に言えば、単原子層まで）積層されていてもよい。別の例として、エアロゲルのスライスを処理するなどして吸収性を持たせ、積層してインサートの透過性材料を形成することもできる。
本明細書に記載されるいずれの透過性材料においても、材料は、場合によっては予め定められた流量及び／又は流動抵抗で流体の通過を可能にするように構成された予備成形材料であってよい。材料の透過性は、本明細書に記載される処理流量及び流体圧力で装置チャンバ又はチャネル内に保持されたときに、透過性インサートを通る流れを可能にするように選択されてもよい。上述したように、予め形成された透過性材料は、多孔質、繊維質であってもよく、層の積み重ねであってもよく、これらの材料のいずれかは、材料を結合するために機能化されてもよい。本明細書で使用されるように、機能化された材料は、材料の表面が、標的材料を特異的に結合する化合物、薬剤、または官能基の添加によって修飾された任意の材料を含み得る。材料はまた、またはその代わりに、材料の特定の特性を変えるために特定の原子分子基を付着させる表面処理によって機能化されることもある。機能化は、望ましい材料を表面に結合させるために表面化学を利用する技術を含む、湿式化学、または蒸気、ガス、および／またはプラズマ化学、および／またはマイクロ波アシスト化学技術などの様々な表面改質技術によって実施することができる。同様の技術は、材料を修飾するため、例えば、材料を「活性化」するために使用することができる。
透過性材料は、装置内の挿入物の総表面積を最大にし、不要な不純物、及び／又は標的生成物の選択的結合を可能にするように構成されてもよい。これらの透過性材料はいずれも、溶液中の物質との効果的な結合のために、予備成形材料の内部への溶液の十分な透過を提供するように構成されてもよい。ある変形例では、透過性材料は、複数の予備成形材料からなり、各予備成形材料は、マイクロ流路デバイス内のチャネル又はチャンバよりも大きく、これらの予備成形材料の各々は、機能的活性物質への溶液の露出を最大化するために、依然として内部への溶液の透過を可能にすることができる。
上述のように、本明細書に記載の透過性インプラントインサートは、溶液から不純物（例えば、不要な材料）を除去するように構成されてもよく、代替的または付加的に、透過性インプラントは、（例えば、洗浄後などに）溶出され得るように、所望の材料に解放可能に結合するように構成されてもよい。
上述のように、本明細書に記載の方法及び装置は、治療薬を形成する溶液を改変するように構成された1つ以上の透過性インサートを含むマイクロ流路デバイスの使用を含んでもよい。透過性インサートは、本明細書に記載されるマイクロ流路デバイス内で使用するように適合されてもよい。
例えば、本明細書で説明するのは、チャンバの流体接触側内に適合するように構成された透過性インサートである。したがって、透過性インサートは、チャンバの流体接触側の全部又は一部（例えば、断面領域）内の容積に実質的に適合するような大きさ及び／又は形状であってよい。上述のように、透過性材料は、単一の予備成形インプラントであってもよいし、透過性インプラントを形成する多数の予備成形材料の組合せであってもよい。透過性インプラントは、一般に、材料内への、および材料を通しての溶液の流れを許容してもよい。ある変形例では、透過性インプラントはまた、圧縮可能（例えば、「絞り出し可能」）であって、マイクロ流路デバイスが透過性インプラントを挿入したチャンバを圧縮するときに透過性インプラント内からの流体の除去を可能にするものであってもよい。ある変形例では、透過性インプラントは、圧縮された後、拡張された形状に戻るのに十分な弾性を有する。
透過性インサート及びマイクロ流路デバイスは、流体、特に治療用組成物を生成するために使用されている材料が、処理中に必然的に透過性インサートを通過するように構成されてもよい。ある変形例では、透過性インサートは、圧縮可能な材料及び／又は弾性的に変形可能な材料（例えば、伸縮素材）であり、チャンバの流体接触側をチャンバの圧力受容側から分離する弾性材料（例えば、弾性層）を偏向させることによって流体接触チャンバの容積が変化すると変形する可能性のあるものである。ある変形例では、透過性インサートは圧縮可能であるが、必ずしも弾性的に変形可能である必要はない。ある変形例では、透過性インサートは、（例えば、緩衝剤、水などの流体の添加によって）活性化されると、チャンバの流体接触側内で膨潤し得る膨潤性材料である。透過性インサートは、チャンバの圧力受容側とチャンバの流体接触側との間で弾性材料（層）を偏向させることによって圧縮されることがある。ある変形例では、治療薬を処理することは、治療材料を配合するために使用される溶液を、透過性インサート材料を含む複数（例えば、2、3、4など）のチャンバ間で透過させることを含んでもよい。ある変形例では、本方法は、透過性インサート材料を含むチャンバに溶液を出し入れすることを含んでもよい。
本明細書に記載された方法及び装置のいずれにおいても、治療用インサート材料は、治療材料を含む溶液（又は治療材料が形成されている溶液）をチャンバの流体接触側から追い出すために、例えばチャンバの圧力受容側の圧力を調節してチャンバを流体接触側と圧力受容側に分離する弾性膜を偏向させて圧縮することができる。
透過性インサートは、治療材料を修飾し、さらに加工および／または修正するために使用され得る任意の適切な材料であってもよい。例えば、ある変形例では、透過性インサートは、透過性材料を通過する際に溶液から二本鎖RNAを除去するために、二本鎖RNAを保持するように構成されたセルロース材料を含んでもよい。代替的又は追加的に、透過性インサートは、透過性インサートから溶液に添加され得る1つ又は複数の材料を含んでもよい。
例えば、本明細書に記載された透過性インサートのいずれかは、透過性インサートに吸着された又は透過性インサート上に吸着された1つ以上の追加の材料を含むことができる。これらの変形例のいずれにおいても、透過性インサートは、放出用材料を含んでもよい。ある変形例では、例えば、透過性インサートは、セルロース中にDNAseを封入するためにDNAseで前処理されてもよいセルロースインサートを含んでもよい。これにより、インサートは、（本明細書に記載されるように）二本鎖RNAの除去と、in vitro転写ステップからのDNA鋳型などのDNA材料の消化とを同時に可能にすることができる。
本明細書に記載された透過性インサートのいずれも、透過性インサート上又は中に付着、吸着又はその他の方法で含まれる1つ以上の追加の薬剤を含む表面機能化インサートとして構成されてもよい。例えば、ある変形例では、透過性インサート中又は上に含まれるような追加の材料は、共有結合された材料（例えば、抗体又はアプタマー）、静電結合された材料、吸着された酵素（例えば、上述のDNAseのような不純物を選択的に分解し得る）、共有結合または非共有結合で取り付けられたセンサ（例えば、二本鎖RNA、不純物などの除去されるべき材料を検出するため）などがある。ある変形例では、追加の材料または材料は、例えば、透過性インプラントの表面（複数可）に結合したポリアデニル化RNA分子を捕捉するためのポリ（dT）配列を含んでよい（例えば、ポリ（dT）配列は、mRNAを分離するために透過性インプラント内で使用されてよい）。ある変形例では、追加の1つまたは複数の材料は、結合特性を高めるために小分子を含んでもよい（例えば、臭化エチジウムなどの二本鎖RNAインターカレーターは、一本鎖RNAを結合せずに二本鎖RNA材料を選択的に結合する場合がある）。ある変形例では、透過性インサートは、材料で少なくとも部分的にコーティングされてもよい。例えば、ある変形例では、コーティングはカルボキシレートコーティングであってもよい。
ある変形例では、透過性インサートは、溶液中に直ちに又は時限的に放出され得る凍結乾燥材料を含んでもよい。例えば、ある変形例では、溶液が透過性インサートに接触すると、溶液中に凍結乾燥材料を溶解させてもよい。凍結乾燥材料の例には、1つ以上の緩衝材料（例えば、塩、キレート剤、洗剤、ポリヌクレオチド、酵素、タンパク質など）が含まれてもよい。ある変形例では、透過性インサートは、溶液中の1つ又は複数の材料に結合するための結合剤などの薬剤を含んでもよい。例えば、透過性インサートは、結合した免疫剤、例えば、抗体、又はFAB断片等を含むその一部を含んでもよい。例えば、透過性インサートは、結合した免疫剤、例えば抗体、またはFAB断片などを含むその一部を含んでいてもよく、それは溶液から物質を選択的に除去し得る。
一般に、透過性インサートは、流体が透過性インサートの上および／または中を通過するように、チャンバの流体接触側をまたぐように構成されてもよい。透過性インサートは、紙、例えば、シート状の材料であってもよい。透過性インサートは、チャンバの流体接触側をまたぐように、及び／又は少なくとも部分的に満たすように折り畳まれてもよい。折り畳まれた形状は、したがって、偏向するように（弾性的に偏向することを含む）構成されながら、チャンバの流体接触部分にまたがることができる。ひだは、単純なひだ（例えば、扇形のひだ）又はより複雑なひだを含んでもよく、一般に、ひだは、ヒンジ（例えば、リビングヒンジ）領域として動作し得る1つ又は複数の曲がった領域及び／又はチャンバを流体接触チャンバ及び圧力受容チャンバに仕切る弾性膜の移動によって圧縮又は他の形で偏向した後、拡張形状に戻るようバイアスされてもよいものを含んでもよい。ある変形例では、透過性インサートはスポンジを形成してもよい。透過性インサートは、発泡または膨張した材料として形成されてもよい。
本明細書に記載される透過性インサートのいずれの変形例においても、透過性インサート内の通路（例えば、孔、チャネル、チャンバなど）のサイズは、サイズに基づいて物質を通過または排除するように構成されてもよい。したがって、本明細書に記載される透過性インサートは、サイズ排除（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー）を実行するように構成されてもよい。例えば、未反応のモノヌクレオチドを有する大きなmRNA分子を、ナノ多孔性インサートを含むチャンバに通過させてもよく、未反応のdNTPはインサートに拡散してそこに物理的に封じ込められ、一方で通路のサイズ（例えば、孔）は大きな分子を排除し得る。
例えば、透過性インサートがセルロースを含む（例えば、二本鎖RNA除去用）変形例では、セルロースは紙（例えば、ろ紙）の形態であってよく、折り畳まれるか層状であって、これは、チャンバの流体接触部分内に保持されるように構成された折り目を含む。ある変形例では、セルロースは、膨張していてもよく、又は発泡していてもよい。ある変形例では、セルロースは、スポンジの形態であってよい。
透過性インサートは、一般に、任意の適切なサイズである細孔を有していてもよい。細孔サイズは均一であっても非均一であってもよく、ある変形例では、細孔サイズはサイズ範囲内に分布していてもよい。例えば、細孔サイズは、約1μmと約200μmとの間（例えば、1μmから3μm、1μmから5μm、2μmから4μm、2μmから5μm、3μmから6μm、5μmから10μm、6μmから8μm、6μmから10μm、7μmから10μm、8μmから10μm、9μmから11μm、9μmから12μm、10μmから12μm、10μmから15μm、12μmから15μm、14μmから16μm、15μmから18μm、17μmから19μm）であり、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、22μm、25μm、27μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、110μm、120μm等の下限サイズから、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、22μm、25μm、27μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、110μm、120μm等の上限サイズまでの間であり、細孔サイズの下限は上限よりも小さい。サイズ範囲は分布であってもよく、例えば、孔の90％超（例えば、90％超、92％超、93％超、94％超、95％超、96％超、97％超、98％超、99％超、99.5％超、99.9％超など）がサイズ分布内にある。
本明細書に記載の方法及び装置のいずれかにおいて、本明細書に記載のように、マイクロ流路デバイスの温度が制御されてもよい。特に、透過性インサートを含むチャンバの温度が制御されてもよい。例えば、治療材料を含む溶液（又は治療材料が形成されている溶液）が透過性インサートに接触するとき、マイクロ流路デバイスの透過性インサートを含むチャンバは、目標温度に維持されてもよい。温度は、例えば、2℃と20℃の間、2℃と5℃の間、2℃と10℃の間、2℃と15℃の間、5℃と10℃の間、5℃と15℃の間、5℃と20℃の間、10℃と15℃の間、10℃と20℃の間、10℃と30℃の間、10℃と25℃の間、15℃と20℃の間、15℃と25℃の間、15℃と30℃の間、20℃と25℃の間、20℃と30℃の間、25℃と30℃の間、25℃と40℃の間、25℃と35℃の間、30℃と35℃の間、30℃と40℃の間、35℃と40℃の間、30℃と50℃の間、30℃と45℃の間、35℃と45℃の間、35℃と50℃の間、40℃と45℃の間、40℃と50℃の間、45℃と50℃の間、40℃と60℃の間、40℃と55℃の間、45℃と55℃の間、45℃と60℃の間、50℃と55℃の間、50℃と60℃の間、55℃と60℃の間、50℃と70℃の間、50℃と65℃の間、55℃と65℃の間、55℃と70℃の間、60℃と70℃の間、60℃と75℃の間、65℃と70℃の間、65℃と75℃の間、65℃と80℃の間、70℃と80℃の間、75℃と80℃の間、60℃と80℃の間、70℃と90℃の間、75℃と90℃の間、80℃と90℃の間、85℃と85℃の間、85℃と90℃の間等に維持されてもよい。温度は一定であってもよいし、透過性インサートへの曝露前、曝露中、及び／又は曝露後に変化（例えば、増加、減少など）させてもよい。
ある変形例では、透過性インサートは固体透過性インサートと呼ばれることがあり、透過性（例えば、固体透過性）インサートは、チャンバの流体接触側内に完全に含まれたままであるように構成されてもよい。上述のように、ある変形例では、透過性インサートは、材料を囲み、材料を透過性カバー内に閉じ込める外側、例えば、透過性カバーによって囲まれる透過性パッケージとして構成されてもよい。例えば、透過性カバーは、粒状材料又はゲル（例えば、ヒドロゲル）等を封入していてもよい。透過性カバーは、流体がカバーを通過してカバーが含む容積に入ることを可能にするために十分な透過性を有する膜材料などの材料で形成されてもよい。従って、透過性インサートは、圧縮可能及び／又は弾性的に変形可能な枕状の形状をしていてもよい。
一般に、透過性インサートは、マイクロ流路デバイスの流体接触チャンバに挿入されてもよく、上述のように流体接触チャンバ内に適合するように構成されてもよい。ある変形例では、透過性インサートは、チャンバの流体接触側にぴったりと収まるように構成され、例えば、透過性インサートは、チャンバの流体接触側の形状と相補的な形状（例えば、楕円、丸、正方形、角を丸めた正方形など）を有していてもよい。前述のように、透過性インサートは、体積をスパン及び／又は充填するように構成されてもよく、特に、流体が透過性インサートを通過するように、流体接触側の体積を通る流れの方向に対して垂直な方向に体積をスパンするように構成されてもよい。
例えば、本明細書に記載されるのは、マイクロ流路デバイスであって、該マイクロ流路デバイスは、マイクロ流路デバイス内に溶液の流体フローを誘導するための手段、複数のチャンバ、及び複数のチャンバのうちの第1チャンバ内にある透過性インサートを含んでもよく、インサートが圧縮されるように構成されている。溶液の流体フローを誘導するための手段は、任意の適切な手段、特に、マイクロ流路デバイス内の膜を偏向させるための正又は負の圧力を受容するように構成されたマイクロ流路デバイス上の複数の圧力ポートを含んでもよい。例えば、本明細書に記載されるのは、マイクロ流路デバイスであって、該マイクロ流路デバイスは、第1プレートと第2プレートとの間に挟まれた弾性材料、および第1プレートと第2プレートとの間に形成された複数のチャンバを含み、弾性材料の一部が各チャンバを流体接触側と圧力受容側とに分割する。これらのマイクロ流路デバイスのいずれかが、第1チャンバの流体接触側内に固体透過性インサートを含んでもよい。
例えば、本明細書に記載されるのは、マイクロ流路デバイスであって、該マイクロ流路デバイスは、第1プレートと第2プレートとの間に挟まれた弾性材料、第1プレートと第2プレートとの間に形成された複数のチャンバであって、弾性材料の一部が各チャンバを流体接触側と圧力受容側とに分割する複数のチャンバ、および複数のチャンバのうちの第1チャンバの流体接触側内の固体透過性インサートを含み、第1チャンバの圧力受容側へ圧力をかけると、弾性材料の偏向によりインサートが圧縮されるよう構成される。
ある変形例では、マイクロ流路デバイスは、第1プレートと第2プレートとの間に挟まれた弾性材料、第1プレートと第2プレートとの間に形成された複数のチャンバであって、弾性材料の一部が各チャンバを流体接触側と圧力受容側とに分割する複数のチャンバ、および複数のチャンバのうちの第1チャンバの流体接触側内の固体透過性インサートを含み、インサートはRNAを精製するように構成されたセルロース材料からなり、圧力受容側に圧力をかけることによって、第1チャンバを分割する弾性材料がたわみ、流体を第1のチャンバの中または外に移動するように構成される。
マイクロ流路デバイスは、第1プレートと第2プレートとの間に挟まれた弾性材料、第1プレートと第2プレートとの間に形成された複数のチャンバであって、弾性材料の一部が各チャンバを流体接触側と圧力受容側とに分割する複数のチャンバ、複数のチャンバの流体接触側と流体連通するように構成された複数の流体ポート、複数のチャンバの圧力受容側と流体連通している複数の圧力ポート、および複数のチャンバのうちの第1チャンバの流体接触側内の固体透過性インサートを含んでもよく、1つ以上の圧力ポートから第1チャンバの圧力受容側に圧力が加えられると、弾性材料のたわみによって、インサートが圧縮されるように構成される。
ある変形例、特に、透過性インサートが、セルロースを含む変形例など、望ましくない物質（例えば、二本鎖RNA）を溶液から除去するように構成されている変形例では、チャンバは、分離チャンバと呼ばれることがある。
前述のように、これらの装置（例えば、システム、デバイスなど）のいずれかにおいて、固体透過性インサートは、RNAを精製するように構成されたセルロース材料を含んでもよい。例えば、固体透過性インサートは、セルロース材料のシートから構成されてもよい。代替的に又は追加的に、固体透過性インサートは、凍結乾燥材料から構成されてもよい。
固体透過性インサートは、第1チャンバのプロファイルに一致するプロファイルを有していてもよい。前述のように、固体透過性インサートは、弾性であってもよい。
固体透過性インサートは、粒状材料を含む透過性外カバーで構成されてもよい。ある変形例では、固体透過性インサートは、折り畳まれた構造を含む。
ある変形例では、マイクロ流路デバイスは、第1チャンバに流体的に接続される第2チャンバを含んでもよい。デバイスは、弾性材料を偏向させることによって、第1チャンバと第2チャンバとの間で流体を移送するように構成されてもよい。ある変形例では、流体は、第1チャンバと第2チャンバとの間で往復してもよい。
マイクロ流路デバイスは、第1プレートを通って延び、複数のチャンバの圧力受容側に圧力を供給して流体受容側で流体を移動させるように構成された、複数の個別にアドレス指定可能な圧力ポートを含んでもよい。
また、本明細書では、本明細書に記載された装置のいずれかを使用する方法についても説明する。例えば、流体（例えば、RNAサンプル）中の治療材料を処理する方法は、マイクロ流路デバイスを圧力源に接続するステップ、圧力を加えて、サンプルをマイクロ流路デバイスの分離チャンバの流体接触側に輸送するステップ、サンプルを分離チャンバの流体接触側内の固体透過性インサートに通過させるステップであって、サンプルが固体透過性インサートによって修正されるステップ、及び圧力を加えてサンプルを分離チャンバの流体接触側から外に輸送するステップを含むことができる。
例えば、二本鎖RNA（dsRNA）と一本鎖RNA（ssRNA）の両方を含むRNA試料からdsRNAを除去する方法は、マイクロ流路デバイスを圧力源に接続するステップ、圧力を加えて、RNAサンプルをマイクロ流路デバイスの分離チャンバの流体接触側に移送するステップ、RNAサンプルを分離チャンバの流体接触側内の固体透過性インサートに通過させるステップであって、固体透過性インサートがセルロースからなり、dsRNAがそのインサートによって保持されるステップ、および圧力を加えて、RNAサンプルを分離チャンバの流体接触側から外に移送するステップを含むことができる。
二本鎖RNA（dsRNA）と一本鎖RNA（ssRNA）の両方を含むRNA試料からdsRNAを除去する方法は、マイクロ流路デバイスを圧力源に接続するステップ、圧力を加えて、RNAサンプルをマイクロ流路デバイスの分離チャンバの流体接触側に輸送するステップであって、RNAサンプルが分離チャンバの流体接触側内のセルロースを含む固体透過性インサートを通過し、dsRNAがインサートによって保持されるようにするステップ、および分離チャンバの圧力受容側に圧力を加えて、RNAサンプルを分離チャンバの流体接触側から外に輸送するステップを含むことができる。
本方法は、マイクロ流路デバイス内で、in vitro転写によりRNA試料を合成するステップを含んでもよい。ある変形例では、方法は、マイクロ流路デバイスをRNAサンプルの供給源に接続するステップを含むことができる。
圧力を加えてRNA試料を流体接触側から外に輸送するステップは、分離チャンバの圧力受容側に圧力を加えて、分離チャンバの圧力受容側を分離チャンバの流体接触側から分離する弾性材料を偏向させることを含んでもよい。分離チャンバの圧力受容側に圧力を加えることは、RNA試料を分離チャンバの流体接触側から混合チャンバの流体接触側へ輸送することと、さらに、混合チャンバの圧力受容側に圧力を加えてRNA試料を分離チャンバの流体接触側へ輸送し戻すことを含んでもよい。圧力を加えてRNA試料を分離チャンバの流体接触側から輸送することは、分離チャンバの圧力受容側を分離チャンバの流体接触側から分離する弾性材料によって、固体透過性インサートを圧縮することを含んでもよい。
これらの方法のいずれかが、固体透過性インサートを予め湿らせるステップを含んでもよい。
特許ファイルまたは出願ファイルには、少なくとも1枚のカラー図面が含まれている。この特許又は特許出願公開のカラー図面の写しは、請求と必要な手数料の支払によって、特許庁から提供される。
本発明の新規な特徴は、以下の特許請求の範囲に具体的に記載されている。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明、およびその添付図面を参照することによって得られるであろう。
図１Ａは、mRNA治療薬の製造方法の一変形例を概略的に示す図である。図１Ｂは、患者特異的T細胞リンパ腫ワクチン製剤を製造するための例示的な工程の一変形例を概略的に示す図である。 本明細書に記載されるマイクロ流路デバイス制御システムの一例を示す図である。 本明細書に記載されるように使用され得るマイクロ流路デバイス制御システムの一変形例を概略的に示す図である。 図3A～3Cは、本明細書に記載されるマイクロ流路デバイスの変形例を示す図である。 本明細書に記載のマイクロ流路デバイスの一変形例の一部を通る断面図である。 本明細書に記載される方法のいずれかに使用され得るペプトイド送達ビヒクルの一例を示す図である。 二本鎖DNA鋳型の作成に有用なin vitro転写促進剤カセットの一例を示す図である。 本明細書に記載されるように生成された二本鎖DNA鋳型の例を示す図である。 ワクチンまたは治療に用いる二本鎖DNAの作成に有用なT細胞受容体の一例の一領域を示す図である。 二本鎖DNAを生成するためのマイクロ流路デバイスリアクタのアーキテクチャの一変形例の概要を示す図である。 本明細書に記載の方法及び装置のいずれかにおいて使用され得るコドン最適化工程の一例を概略的に示す図である。 本明細書に記載のIVTを行うように構成されたマイクロ流路デバイスの機能図の一例を模式的に示す図である。 本明細書に記載の製剤用マイクロ流路デバイスとして構成されたマイクロ流路デバイスの機能図の一例を模式的に示す図である。 本明細書に記載の製剤用マイクロ流路デバイスとして構成されたマイクロ流路デバイスの機能図の他の一例を模式的に示す図である。 本明細書に記載の製剤用マイクロ流路デバイスの機能図の他の一例を模式的に示す図である。 本明細書に記載されるようなmRNA治療薬の例示的なモデルを用いて、in vivo mRNA発現及び生体内分布を調べる実験の一例を説明する図である。 図１６Ａは、本明細書に記載される例示的な治療用mRNAワクチンの治療効果を示すグラフである。図１６Ｂは、本明細書に記載される例示的な治療用mRNAワクチンの治療効果を示すグラフである。図１６Ｃは、明細書に記載される例示的な治療用mRNAワクチンの治療効果を示すグラフである。図１６Ｄは、本明細書に記載される例示的な治療用mRNAワクチンの治療効果を示すグラフである。 図１７Ａは、本明細書に記載されるように製造された保存モデルmRNA治療薬を注射した後の全身ルシフェラーゼ発現を示す図である。図１７Ｂは、図１７ＡからのモデルmRNA治療薬の発現の定量例を示す図である。 本明細書に記載される方法及び装置において、濾過が適用され得る様々な時間を模式的に示す図である。 チャンバの流体接触側内に透過性インサートを含むマイクロ流路デバイスの一例を示す上面図である。 チャンバの片側に透過性インサートを含むマイクロ流路デバイスの一例の一領域を通る断面の一例を示す図である。 気泡除去用の真空キャップを模式的に示すマイクロ流路デバイスの一部の一例を示す図である。 本明細書に記載の透過性インサートを含むマイクロ流路デバイスを使用して、流体（例えば、RNAサンプル）中の治療材料を処理する方法を概略的に示す図である。 本明細書に記載の透過性インサートを含むマイクロ流路デバイスを用いて、治療材料から二本鎖RNAを除去する方法を概略的に示す図である。 図２１Ａは、クラス7の空間内のクラス5の隔離キャビネット内にあるマイクロ流体装置を含むシステムの一例を示す図である。本システムは、ミニ工場として構成されてもよい。図２１Ｂは、クラス5のキャビネット内のマイクロ流体装置を示す図である。
本明細書では、完全自動化されたソフトウェア制御のマイクロ流体装置の使用を含み得る、治療薬の製造方法および装置について説明する。これらの方法および装置は、個人化または個別化治療に使用され得る。また、本明細書では、鋳型の形成、in vitro転写、治療用mRNAの精製、mRNAの濃縮、及びmRNA（複数可）と1つ以上の送達ビヒクルとの複合化を含む、本明細書に記載の製造工程のいずれかのソフトウェア制御を含む装置（例えば、システム、デバイス等）及び方法が記載される。ソフトウェア制御は、1つ以上の治療用mRNAを製造するためのこれらのステップのいずれか、いくつか、またはすべてが正確かつ精密に迅速に実行されるように、これらの方法を自動化することを可能にし得る。ソフトウェア制御と反応成分のマイクロ流体による正確な送達および移送は、プロセス制御、効率および再現性を高める一方で、手動操作を大幅に削減または排除し、設備の必要性を低減し、生産サイクル時間を短縮する機会を提供し、最終的には必要に応じてジャストインタイムで生産される低コストの治療法につながるものである。
本明細書に記載される装置（例えば、システム、デバイスなど）のいくつかでは、治療材料の各バッチは、専用かつ単回使用の使い捨てマイクロ流路デバイス（本明細書ではバイオチップとも呼ばれる）において製造されてよく、それはマイクロ流路デバイス制御システム（本明細書では制御システムとも呼ばれる）内に収容されてもよい。生産全体は、大気と接触しない無菌設計の閉路閉路工程として進行してもよい。生産工程はすべて自動化され、制御システムによって制御され、システムを収容する施設の属性に関係なく、コピーエグザクトプロセスを達成することができる。生産パラメータ、原材料、および環境データ（完全な視覚的記録を含む）は、クラウドで保護され、各生産運転に関連付けられた広範で暗号化された電子ファイルの一部となる可能性がある。さらに、精製工程や多くのQCアッセイを生産工程中にインラインで単一の流体フローで行うことができ、半導体産業で開発された工程制御概念により、異常を早期に検出することができる。全自動でソフトウェア制御された製造方法を活用することで、患者のために費用対効果の高い方法で個人化かつ個別化されたmRNA治療薬を製造することができる。
特に、これらの方法および装置は、in vitro転写（IVT）として知られる合成技術により、人体外で合成的にmRNA治療薬を製造することができる。典型的には、裸のmRNA分子は、細胞膜を通過しない大きなポリアニオン性分子であり、in vivoでの細胞外のヌクレアーゼによって急速に分解される。本明細書に記載の方法および装置は、mRNAを標的（組織、身体、組織の領域など）に輸送するように設計された、1つまたは複数の送達ビヒクルを有するmRNA分子の製剤を製造し得る。例えば、ある変形例では、送達ビヒクルは、循環中にmRNAカーゴのパッケージング及び保護を提供し、免疫認識を回避し、細胞の取り込み及び放出を促進し得る、脂質含有両親媒性送達ビヒクルであってよい。
一般に、本明細書でより詳細に説明するように、ある変形例では、鋳型合成、IVT、精製、および送達ビヒクルによる製剤化を含む製造工程のすべてまたは一部を、1つまたは複数のマイクロ流路デバイスの高度制御環境で実施し、堅牢で高品質かつ再現性の高い製造工程の最適化を可能にすることができる。
定義
本明細書で使用される場合、送達ビヒクルは、任意の適切なナノ粒子を指すことができる。そのようなナノ粒子の例には、アミノ脂質化ペプトイドなどの両親媒性ナノ粒子が含まれ得るが、これらに限定されるわけではない。
本明細書で使用される「増幅」は、ポリヌクレオチド（例えば、DNA）増幅を指す場合がある。例えば、増幅は、本明細書に記載されるマイクロ流路プレートデバイス内で完全に行われてもよい。増幅は、多重置換増幅（MDA）、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅、ループ媒介等温増幅、LAMP、核酸配列に基づく増幅、ストランドディスプレイスメント増幅、ローリングサークル増幅、リガーゼ連鎖反応などを含んでもよいが、これらに限定されるものではない。
本明細書で使用する自動化および半自動化とは、主に人間の介入なしに実行される方法および工程を指し、1つ以上のコンピュータプロセスの制御下にあってもよい。自動化方法は、人間の入力によって監督及び／又は指導されてもよい。
本明細書で使用する場合、「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」という用語は互換的に使用でき、デオキシリボヌクレオチド（DNA）、リボヌクレオチド（RNA）、およびその機能アナログ、例えば、直鎖状または環状のコンフォメーションの補完DNA（cDNA）を指すものとする。本明細書で提供される核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得る。核酸分子は、アデニン（A）、グアニン（G）、チミン（T）、シトシン（C）のヌクレオチド塩基から構成される。RNA分子ではチミンの代わりにウラシル（U）が存在する。天然のヌクレオチド塩基の類似体、および塩基、糖、および/またはリン酸部分が修飾されたヌクレオチド塩基も本明細書に提供される。記号「N」は、任意のヌクレオチド塩基（例えば、A、G、C、T、またはU）を表すために使用することができる。
本明細書で使用する「カセット」（例えば、合成in vitro転写促進剤カセット）は、エンハンサー、プロモータ、リーダー、イントロン、5´非翻訳領域（UTR）、3´UTR、または転写終結配列などの一つ以上の発現要素を含むか、またはそれに作動可能に連結され得るポリヌクレオチド配列を意味する。ある実施形態では、カセットは、作動可能に連結された第2のポリヌクレオチド配列の転写を開始することができる少なくとも第1のポリヌクレオチド配列、および任意に第2のポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された転写終結配列から構成される。カセットは、単一の要素として、または2つ以上の連結していない要素として提供されてもよい。
本明細書で使用する「ポリヌクレオチド」は、複数のヌクレオチドを含む核酸分子を指し、一般に「オリゴヌクレオチド」（長さが18～25ヌクレオチドのポリヌクレオチド分子）と26ヌクレオチド以上のポリヌクレオチドの双方を指す。本開示の態様は、18～25ヌクレオチド（例えば、18マー、19マー、20マー、21マー、22マー、23マー、24マー、または25マー）の長さを有するオリゴヌクレオチド、または26以上のヌクレオチドの長さを有する中長ポリヌクレオチド（例えば、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、約65、約70、約75、約80、約85、約90、約95、約100、約110、約120、約130、約140、約150、約160、約170、約180、約190、約200、約210、約220、約230、約240、約250、約260、約270、約280、約290、または約300ヌクレオチドのポリヌクレオチド）、または約300ヌクレオチドより大きい長さを有する長いポリヌクレオチド（例えば、約300～約400ヌクレオチドの間、約400～約500ヌクレオチドの間、約500～約600ヌクレオチドの間、約600～約700ヌクレオチドの間、約700～約800ヌクレオチドの間、約800～約900ヌクレオチドの間、約900～約1000ヌクレオチドの間、約300～約500ヌクレオチドの間、約300～約600ヌクレオチドの間、約300～約700ヌクレオチドの間、約300～約800ヌクレオチドの間、約300～約900ヌクレオチドの間、または約1000ヌクレオチドの長さ、あるいはさらに約1000ヌクレオチドより大きい長さの間）のポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドが二本鎖である場合、その長さは同様に塩基対の用語で記述することができる。
本明細書において、「in vitro 転写」または「IVT」とは、非細胞系で転写を行い、被験者への治療用送達を含む様々な用途に使用する合成RNA分子（合成 mRNA）を生産する工程を指す。生成された合成RNA分子（転写産物）は、送達ビヒクルと組み合わせることができる。合成転写産物には、mRNA、アンチセンスRNA分子、shRNA、環状RNA分子、リボザイムなどが含まれる。IVT反応には、プロモータ配列と目的のオープンリーディングフレームの配列を含む精製直鎖状DNA鋳型、リボヌクレオチド三リン酸または修飾リボヌクレオチド三リン酸、DTTとマグネシウムイオンを含む緩衝液システム、および適切なファージRNAポリメラーゼを使用することができる。
「鋳型」または「二本鎖DNA鋳型」とは、挿入された目的のオープンリーディングフレームのin vitro転写に必要な最小構成配列を含む単離された核酸配列のことである。
本明細書で使用する場合、「流体デポ」は、流体を保持するための貯蔵空間を指す場合があり、バイアル、ボトル、バッグ、チューブなどを含む場合がある。流体デポは、流体ラインを一体として含んでもよい（例えば、流体デポ内の本体又はチャンバから出る通路又は流路）。
本書で使用する流体動力には、空圧式と油圧式の両方が含まれる。便宜上、空気圧という用語は油圧を含むことがあり、これらの用語は互換的に使用されてもよい。
本明細書で使用される「治療用ポリヌクレオチド」は、被験者の健康を治療、予防、改善またはその他の方法で修正するために被験者に送達するための治療用ポリヌクレオチド組成物の一部であり得るポリヌクレオチド（例えば、治療用mRNA）を意味する。
本明細書で使用される「治療用ポリヌクレオチド組成物」は、被験者に投与される送達ビヒクルによってカプセル化された1つまたは複数のポリヌクレオチド（例えば、mRNA）を含む組成物を指してもよい。mRNAワクチンは、治療用ポリヌクレオチド組成物の一例に過ぎない。
本明細書で使用される場合、「細菌DNAを含まない」または細菌DNAの非存在を意味する。細菌DNAを実質的に含まない材料は、0.1％未満、0.01％未満、0.001％未満等の細菌DNAを含んでもよい。本明細書で使用される「エンドトキシンを含まない」は、エンドトキシンの非存在を意味する。「エンドトキシンを実質的に含まない」とは、エンドトキシンが0.1％未満、0.01％未満、0.001％未満等であることを指す。
本明細書において「結合」とは、ライゲーション、合成、プライマー伸長、アニーリング、組換え、またはハイブリダイゼーションなど、ある成分を別の成分に結合するための方法をいう。
本明細書で使用するマイクロ流路デバイスまたはマイクロ流路プレートデバイスは、等価的にチップ、カートリッジ、バイオチップ、マイクロ流路プレート等と呼ばれ、流体的に相互接続された複数のチャンバを含むことができる。これらのチャンバは、流体接触側と圧力受容側とに分割されてもよい。圧力受容側は流体動力回路の一部であってもよく、流体接触側は外部雰囲気から隔離され、マイクロ流路デバイス内の材料を処理するために使用されてもよい。本明細書に記載されるマイクロ流路デバイスは、概して平坦であってもよく（例えば、約4cm未満、約2cm未満、約1.5cm未満、約1cm未満等の厚さを有する）、マイクロ流路プレートデバイス内の流体動力回路を駆動及び／又は制御するための1つ以上の圧力ラインと連通するための複数の圧力ポートを含んでもよい。
本書で使用される「オンデマンド」は、方法またはサービスが実行される時を定義することを意図しており、事前に保存、予定、注文、または準備されることと対比して使用される。
本明細書で使用する光センサは、通常、光感知装置を指し、1つ以上の撮像装置を含むことができる。光センサは、単レンズ、カメラ、ステレオカメラ、マルチレンズカメラ、デジタルスチルカメラ、サーモグラフィーカメラ、CCD、光ファイバーなどを含んでもよい。
本明細書で使用する「精製」とは、成分（例えば、粒子）を他の不要な成分（例えば、汚染物質、断片など）から物理的及び／又は化学的に分離することを指す。
本明細書で使用される「密封流体連通」及び「密封閉流路」は、いずれも、材料（例えば、鋳型、治療用ポリヌクレオチド及び／又は治療用ポリヌクレオチド組成物の溶液であるが、これに限られるわけではない材料を含む流体）を周囲の大気から隔離することを指してもよい。
本明細書において、「鋳型前駆体材料」とは、鋳型（例えば、DNA二本鎖鋳型）を形成するために必要な材料を指し、目的の合成遺伝子、および1つ以上の独立した要素として提供されるin vitro転写促進剤カセットが含まれてもよい。
本明細書において、2D精製とは、本明細書に記載されるような実質的に平坦なマイクロ流路デバイス（例えば、マイクロ流路プレートデバイス）内で行われる精製を指し、材料（例えば、二本鎖RNA、未反応ヌクレオチド、未反応キャッピング試薬、緩衝成分）等を除去するために2種以上の吸着材を用いることも含まれる。
mRNA治療薬などの治療薬は、ワクチン接種、免疫療法、タンパク質補充療法、組織の再形成・再生、遺伝子編集による遺伝性疾患の治療など、複数の治療様式に使用することができる。また、mRNA治療薬は、その高い効力に加え、迅速な開発サイクル、標準化された製造、一過性の発現、ゲノム統合のリスクの低さといった重要な利点も有している。
ある変形例では、本明細書に記載のmRNA治療薬は、最終医薬品中の有効成分として、対象の抗原またはタンパク質をコードするmRNAを含むことができる。mRNAの頑健な翻訳には、機能的な5'キャップ構造が必要である。5'キャップ（または7-メチルグアノシンキャップ）は、最初の転写ヌクレオチドに5'-5'-トリリン酸結合を介して連結された末端の7-メチルグアノシン残基からなる。このキャップは、リボソームによるmRNAの認識とRNAsからの保護に重要である。ポリ（A）テールは、ポリ（A）結合タンパク質（PABP）と結合し、真核生物の翻訳開始因子eIF4Gと相互作用し、さらにeIF4Eと複合体を形成して、mRNAの安定性と翻訳開始をm7Gキャップと相乗的に制御する。ポリ（A）テールの長さは、mRNAからタンパク質への翻訳工程の効率に影響すると考えられる。
mRNA治療薬は、少なくとも5つのカテゴリーに大別され、(i）タンパク質代替、（ii）ワクチン、（iii）エフェクタータンパク質の発現、（iv）ドミナントネガティブタンパク質の発現による機能喪失の誘導、（v）遺伝子／ゲノム編集に使用される。本明細書に記載の方法および装置は、これらのカテゴリーのいずれか（または1つ以上）のためのmRNA治療薬を提供し得る。
本明細書に記載の方法および装置は、反復投与を制限し得る毒性または免疫原性の懸念を回避しつつ、循環中のmRNAカーゴのパッケージングおよび保護を提供し、免疫認識を回避し、所望の組織に医薬品を局在化し、細胞への取り込み及び放出を促進するようにmRNA治療薬を製剤化し得る。
一般に、mRNA治療薬（患者特異的T細胞リンパ腫ワクチン製剤を含むが、これに限定されない）の製造方法は、図1Aに模式的に示されるステップのいずれか又はすべてを含むことができ、標的タンパク質の同定およびmRNA配列の設計101、標的配列のための二本鎖DNA鋳型の調製103が含まれる。この配列を使用して、in vitro転写（IVT）反応105を行うためのmRNAを生成し、mRNAを合成してもよい。この治療用mRNAは、その後、精製してプロセス不純物を除去し、ろ過して医薬物質を生成してもよい107。治療用mRNAは、その後、送達ビヒクル（変形例として、両親媒性ナノ粒子を形成するためのアジュバントおよび送達ビヒクル成分を含む）とともに製剤化されてもよい109。次いで、製剤は、患者へ送達される医薬品を生成するために処理及び精製されてもよい111。上述したように、ある変形例では、これらのステップのいくつかは遠隔で（例えば、101～107）、いくつかは現地で（例えば、109、111）実行されてもよく、ある変形例では、それらすべて（例えば、103、105、107、109、111）が現地で実行されてもよい。
一変形例の具体例として、図1Bは、患者特異的T細胞リンパ腫ワクチン製剤を製造するための例示的な工程を示す。図1Bにおいて、工程は、リンパ腫細胞によって発現されるクローン拡大TCR配列（イディオタイプ）の同定121を含んでもよい。また、本工程は、mRNAワクチン配列を設計すること123、及びIVT反応に用いる二本鎖DNA鋳型を調製すること125を含んでもよい。この鋳型をIVT反応に用いてmRNAを合成し127、この治療用mRNAを精製して工程不純物を除去し、ろ過して治療用mRNAを医薬物質として調製してもよい129。その後、治療用mRNAをアジュバントおよび送達ビヒクル成分とともに製剤化して両親媒性ナノ粒子を形成してもよい131。次に製剤化後処理133を行って治療用mRNAワクチンなどの医薬品を生成してもよい135。
これらの製造工程のいずれもが、本明細書に記載されるような自動化マイクロ流路デバイス制御システムを用いて実行されるように最適化され得る。例えば、DNA鋳型の製造は、1つ以上のマイクロ流路デバイスで行われてもよく、図1Bに示す例では、鋳型マイクロ流路デバイス（例えば、鋳型バイオチップ）が使用されてもよい。この同じ例において、mRNAをin vitro転写するステップと、その材料を精製して医薬物質を生成するステップは、IVTマイクロ流路デバイス（例えば、IVTバイオチップ）で行われてもよく、医薬品製剤化ステップは、製剤用マイクロ流路デバイス（例えば、製剤バイオチップ）で行われてもよい。これらのマイクロ流路デバイスは、製造工程の各ステップを実行するために必要な入力ポート、計量バルブ、反応チャンバ、および精製構造を含むことができる。
装置
本明細書に記載される方法は、一般に、1つ以上のマイクロ流路デバイス（例えば、バイオチップ）とともに使用され得る、及び／又は含み得る装置、並びにマイクロ流路デバイスにおける動作を制御するように構成されるシステム（例えば、マイクロ流体制御システム）を用いて実施され得る。これらの装置は、本明細書において、マイクロ流体装置、マイクロ流体制御装置、マイクロ流路デバイス制御システム、マイクロ流体制御システム、又はマイクロ流体システムと称されることがある。マイクロ流路デバイス（マイクロ流路プレートデバイスとも呼ばれる）は、マイクロ流体制御システム内に配置されてもよく、システム内の製造部品の一部、より好ましくは、ほぼ全てまたは全ての構成部品の大気への曝露を防止する閉路方式で作動してもよい。特に、システム内の流体（複数可）に接触する装置の部分は、大気への露出を防止される。図2Aはマイクロ流路デバイス管理システム203（マイクロ流路デバイスの保持、マイクロ流路デバイス内のマイクロ流体操作を操作するための正／負圧の適用、マイクロ流路デバイスの全て又はある領域の加熱／冷却、マイクロ流路デバイスからの1つ又は複数の特徴の検出及び／又は1つ又は複数のマイクロ流路デバイスに行われる操作の記録をするためのハードウェア）、コントローラ（図示しない）及び冷蔵容器205（例えば、ISOクラス5のキャビネット）を含むマイクロ流路デバイス制御システムの一例を示す。このシステムは、1つ以上のマイクロ流路デバイス201を使用してもよいし、含んでもよい。
マイクロ流体装置は、治療用ポリヌクレオチド（例えば、mRNA治療薬）を形成するためのマイクロ流体装置であってもよい。本装置は、マイクロ流路プレートデバイスを取り外し可能に保持するための着座マウントと、複数の圧力ラインと、複数の流体バイアルと、コントローラと、を含んでもよい。各流体バイアルは、流体ラインを含むか、または流体ラインと結合するように構成されており、各流体ラインおよび圧力ラインの少なくともサブセットは、着座マウントに保持されたマイクロ流路プレートデバイスに対してバイアスされて閉流路を形成するよう構成されてもよい。コントローラは、マイクロ流路プレートデバイスが着座マウントに保持されているときに、マイクロ流路プレートデバイス内の流体運動を駆動するために圧力ラインを通しての圧力の適用を制御するように構成されてもよい。コントローラが、合成鋳型の合成を指示し、鋳型を用いたin vitro転写（IVT）反応を指示して治療ポリヌクレオチドを形成し、着座マウントに保持された1つ以上のマイクロ流路プレートデバイスにおける治療ポリヌクレオチドの精製を指示するように構成されてもよい。
マイクロ流体装置（例えば、治療用mRNAなどの治療用ポリヌクレオチドを形成するためのマイクロ流体装置）は、マイクロ流路プレートデバイスを取り外し可能に保持するための着座マウントと、複数の圧力ラインと、複数の流体バイアルと、コントローラと、を含んでもよい。各流体バイアルは、流体ラインを含んでいるか、または流体ラインと結合するように構成されており、各流体ラインおよび圧力ラインの少なくともサブセットは、着座マウントに保持されたマイクロ流路プレートデバイスに対してバイアスされて閉流路を形成するように構成されてもよい。コントローラは、マイクロ流路プレートデバイスが着座マウントに保持されているときに、マイクロ流路プレートデバイス内の流体運動を駆動するために、圧力ラインを通しての圧力の適用を制御するように構成されてもよい。コントローラは、流体バイアルの内容物を決定し、マイクロリットル以下の量の材料をバイアルから、着座マウントに保持されたマイクロ流路プレートデバイス内の1つ以上のリアクタに移送し、合成鋳型の合成を指示し、鋳型を用いてin vitro転写（IVT）反応を指示して治療用ポリヌクレオチドを形成し、着座マウントに保持された1つ以上のマイクロ流路デバイスにおいて治療用ポリヌクレオチドの精製を指示するように構成されてもよい。
コントローラは、本明細書に記載の方法のいずれかを実行するように構成されてもよく、特に、入力（例えば、光学入力、圧力入力、温度／熱入力など）を受け取り、入力を処理して、マイクロ流路デバイス内の流体の移動、マイクロ流路デバイスの種々の領域の温度（熱サイクル含む）、洗浄／結合、マイクロ流路デバイスのバルブの開／閉、マイクロ流路デバイスの検出などを制御するように構成されてもよい。コントローラは、1つ以上のマイクロプロセッサ、通信回路、メモリ等を含んでもよい。コントローラは、ファームウェア、ハードウェア及び／又はソフトウェアで構成されてもよい。
これらの装置のいずれもが、試薬収納フレーム内の流体レベル及びマイクロ流路デバイスが着座マウントに着座しているときのマイクロ流路デバイス内の流体移動を監視するために、着座マウント及び試薬収納フレームの周囲に配置された1つ以上（例えば、複数）の光学センサを含むことができる。代替的または追加的に、光学センサ（複数可）は装置の底面（例えば、着座マウントの下）に配置され、流体量、移動などを検出するために上方に向けられていてもよい。
説明した方法および装置は、一般に、マイクロ流路デバイスの流体チャンバ（デポ、流体接触側、リアクタなど）とチャネルとの間、またはマイクロ流路デバイス内、場合によってはマイクロ流路デバイスと装置内の流体デポ（ベール、ボトル、容器など）の間で材料（液体材料）を移動させる1つ以上の流体動力回路を含んでいる。流体動力回路は、マイクロ流路デバイス、特にマイクロ流路デバイス内の1つ以上の圧力チャネルとチャンバの圧力受容側を含むことができる油圧回路または空気圧回路であってもよい。流体動力回路は、マイクロ流体動力回路と呼ばれることもある。単一のマイクロ流体チップは、複数の流体動力回路を含んでもよく、流体動力回路は、1つ以上の圧力ラインと、マイクロ流体制御装置の圧力ラインとマイクロ流路デバイス内の1つ以上のマイクロ流体チップとの間のインタフェースも含んでもよい。一つ以上の流体動力回路は、他の重複する流体動力回路と部品（バルブ、圧力ライン、真空キャップなど）を共有してもよい。さらに、便宜上、「空気圧」という用語が使用される場合、一般的な流体動力回路（例えば、油圧および／または空気圧）が代わりにまたは追加的に使用されてもよいことを理解されたい。流体動力ラインによって駆動される流体材料は、任意の適切な流体（例えば、空気、水、油などの気体または液体）であってもよい。
また、本明細書では、治療用ポリヌクレオチドを閉路で処理するためのマイクロ流路デバイス（例えば、閉路マイクロ流路デバイス）を説明する。前述のように、これらのマイクロ流路デバイスは、本明細書において、マイクロ流体チップ、マイクロ流路プレート、プロセスチップ、バイオチップ、プロセスプレート等と呼ばれることがある。一般に、マイクロ流路デバイスは、マイクロ流路プレートデバイスであってもよく、これは、実質的に平坦なプレート状構造であってもよく、これらの構造は、比較的薄い（例えば、数mm未満の厚さ、例えば、0.5～20mmの厚さ、0.5～15mmの厚さ、0.5～10mmの厚さ等）ものであってもよい。本明細書に記載のマイクロ流路デバイスは、一般に、少なくとも部分的に透明であってよく、特に、マイクロ流路デバイスの上部が透明であってよく、それにより、1つ以上の光学センサ（カメラ、CCD、光ファイバ等）が、本明細書に記載のマイクロ流体装置によって用いられるように、マイクロ流路デバイスとともに、流体移動および／または弾性層の移動を含む作用を感知、検出、監視、記録等するために使用され得る。
図2Bは、本明細書に記載されるように使用され得るマイクロ流路デバイス制御システムの一変形例を示す概略図である。この例では、装置は、単回使用デバイスであってもよい1つ以上のマイクロ流路デバイス211を保持することができる着座マウント215を囲むハウジング233を含む。ハウジングは、蓋又は開口部を含んでもよいチャンバ、筐体等であってもよく、閉じられると密閉されてもよい。ハウジングは、熱調整器を囲んでいてもよく、及び／又は、熱的に調整された環境（冷蔵装置等）に囲われるように構成されていてもよい。ハウジングは、無菌バリアを形成してもよい。ある変形例では、ハウジングは、加湿または湿度制御された環境を形成してもよい。
着座マウント215は、マイクロ流路デバイスを予め定められた所定の向きに保持するように構成された1つ以上のピン又は他の構成要素を用いて、マイクロ流路デバイスを固定するように構成されてもよい。
ある変形例では、熱制御部213は、1つ以上のマイクロ流路デバイス211に対する温度を調節するために、着座マウントマウント215に隣接して配置されてもよい。熱制御部は、マイクロ流路デバイスの全て又は一部の温度を制御するための熱電部品（例えばペルチェデバイス）及び／又は1つ以上のヒートシンクを含んでもよい。ある変形例では、マイクロ流路デバイスの1つ以上の領域の温度を別々に調節するために、1つ以上の熱制御部が含まれてもよい。熱制御部は、マイクロ流路デバイス及び／又は熱制御部のフィードバック制御に使用され得る1つ又は複数の熱センサ（例えば、熱電対など）を含んでもよい。
図2Bにおいて、流体インタフェースアセンブリ209は、液体試薬及び／又は圧力（例えば、ガス）を着座マウント215に保持されたマイクロ流路デバイス211と結合し、圧力源217からマイクロ流路デバイス211内部への正／負のガス状圧力に従って流体材料の送達を支援してもよい。流体インタフェースアセンブリは、以下でより詳細に説明するように、任意選択で、マイクロ流路デバイス（複数可）の固定を支援してもよい。流体インタフェースアセンブリは、使用間の滅菌のために、装置に取り外し可能に結合されてもよい（そして、取り外されてもよいし、一部を取り外してもよい）。
試薬収納フレーム207は、複数の流体サンプルホルダを含むように構成されてもよく、その各々は、マイクロ流路デバイス211に送達するための試薬（例えば、ヌクレオチド、溶媒、水など）を保持するように構成された流体バイアルを保持してもよく、あるいは、流体バイアルはマイクロ流路デバイス211の内部から製品を受けるように構成されてもよい。試薬収納フレームは、試薬ラックと称されてもよい。ある変形例では、試薬ラックは、1つ又は複数の圧力源217を、マイクロ流路デバイスに適用され得る複数の圧力ラインに分割するように構成された複数の圧力ライン及び／又はマニホールドを含み、独立して又は（サブコンビネーションで）集合的に制御されても良い。あるいは、流体デポ（バイアルなど）は、マイクロ流路デバイス（複数可）に対して直接固定及び密封するように構成されてもよい。
流体インタフェースアセンブリは、複数の流体ライン及び／又は圧力ラインを含んでもよく、着座マウント215に保持されたときに各流体及び／又は圧力ラインを個別かつ独立してマイクロ流路デバイスに駆動するバイアス（例えば、ばね式）ホルダ又はチップを含んでもよい（あるいは、前述のように、代替的にデバイスは直接ばね式マウントであってもよい）。チューブ、例えば、流体ライン及び／又は圧力ラインは、流体インタフェースアセンブリの一部であってもよく、又は流体インタフェースアセンブリに接続されてもよい。ある変形例では、流体ラインは、バイアルをチューブにロック係合（例えば、フェルール）で結合するコネクタを介して試薬収納フレームと、マイクロ流路デバイスとの間に接続する柔軟なチューブから構成される。流路の端部、ある変形例では流体ライン／圧力ラインの端部は、本明細書に記載されるように、マイクロ流路デバイスに対して、例えば、マイクロ流路デバイスに形成されたシーリングポートで密封されるように構成されてもよい。例えば、流体ラインの端部は、平坦（側面視で垂直）になるように切断又は形成されてもよい。バイアルは、圧力源に接続することもできるコネクタを介して、加圧（例えば、2気圧、3気圧、5気圧などの1気圧を超える圧力）されてもよい。例えば、流体バイアルは、1～20psig（例えば、5psig／20psia、10spigなど）の間まで加圧されてもよい。負圧または正圧が適用されてもよく、例えば、真空（例えば、-7psigまたは7psia）が、工程の終了時にバイアル（例えば、デポ）に流体を引き戻すために適用されてもよい。一般に、流体バイアルは、空気圧バルブよりも低い圧力で駆動されてもよく、これにより漏れを防止又は低減することができる。ある変形例では、流体バルブと空気圧バルブとの間の圧力の差は、約5psi（例えば、約7psi、10psi、12psi、15psi、20psiなど）であってよい。
各バイアルは、（例えば、後述するように、1つ以上のセンサによって読み取られ得る識別子によって）コード化されてもよい。コントローラは、流体レベル、すなわち、流体インタフェースアセンブリ内の各材料の量を監視してもよい。
また、装置は、磁場アプリケータ219を含んでもよく、この磁場アプリケータは、マイクロ流路デバイス211の領域において磁場を形成するように構成されてもよい。光学センサであってもよい1つ以上のセンサ205は、装置の一部であってもよく、バーコード、試薬収納フレーム内に保持された流体バイアル内の流体レベル、及びデバイスが着座マウント215内に取り付けられたときのマイクロ流路デバイス211内の流体移動の1つ以上を感知してもよい。
センサは、例えば、光学的な指標を測定することによって、デバイス上の工程の測定を行うことができる。ある変形例では、歩留まりを推定するために視覚的／光学的マーカーが使用されてもよい。例えば、蛍光は、蛍光物質でタグ付けすることにより、工程歩留まりまたは残留材料を検出するために使用されてもよい。代替的に又は追加的に、動的光散乱を使用して、マイクロ流路デバイスの一部（例えば、混合部分など）内の粒度分布を測定してもよい。ある変形例では、センサの測定は、光（例えば、レーザー光）を中に伝える1つまたは2つの光ファイバーを用いて、出てくる光信号を検出することで行われてもよい。デバイスから離れた場所に計測器パッケージを搭載してもよい。このような非接触のセンシングが好ましい場合もある。
本明細書に記載される方法及び装置のいずれかにおいて、センサ（例えば、ビデオセンサ）は、マイクロ流路デバイス（例えば、チップ又はカートリッジ）上の全ての活動を記録してもよい。例えば、材料（治療用RNAなど）を合成及び／又は処理するための運転全体は、例えば上からマイクロ流路デバイスを視覚化し得るビデオセンサを含む1つ以上のビデオセンサによって記録されてもよい。マイクロ流路デバイス上の処理は、視覚的に追跡されてもよく、この記録は、後の品質管理及び／又は処理のために保持されてもよい。したがって、処理のビデオ記録は、その後のレビュー及び／又は分析のために保存、保管及び／又は送信されてもよい。
器具の内部部分、例えばハウジング233内は、さらに滅菌可能に構成されてもよい。特に、器具の一部は、取り外されて個別に滅菌されてもよい。滅菌は、例えば、UV照射、または汚染を制限するため、または規制要件を満たすために必要とされ得る他の任意の滅菌方法によって実行されてもよい。ハウジングを含む装置は、高効率粒子状空気（HEPA）濾過環境内に収容されてもよい。ハウジングを含む装置は、温度制御された筐体内に収容されてもよい。さらに、装置自体が、温度制御される1つ以上の領域を含んでいてもよい。本明細書に記載の装置のいずれかにおいて、装置は、試薬を保存するため、及び／又はmRNA（例えば、治療用mRNA）を保存するための、例えば、保存温度（例えば、-10℃～20℃の温度、例えば、10℃、4℃、-10℃など）で温度制御された領域を（例えば、ハウジング内に）含んでもよい。これらの装置のいずれかは、個別にまたは1つ以上の追加のmRNAおよび送達ビヒクルと組み合わせて配合され得る製造されたmRNAのライブラリを含んでもよい。
上述したように、マイクロ流路デバイス制御システムは、マイクロ流路デバイス211を介して圧力を加え、少なくとも流体移動を駆動することを含め、コントローラ221によって制御されてもよい。コントローラは、完全に又は部分的にハウジングの外側にあってもよい。コントローラは、ユーザ入力／出力を含むように構成されてもよい。例えば、システムのユーザインタフェース223は、装置及びマイクロ流路デバイス（複数可）の容易な操作及び指示を可能にしてもよい。
本明細書で説明する装置のいずれもが、図2Bに示す構成要素のすべてまたは一部を含んでいてもよく、すべての構成要素が必要であるとは限らない。図2Bでは、構成要素間の接続の一部のみが示されており、追加の（または代替の）接続が使用されてもよい。
マイクロ流路デバイス制御システムは、試薬の供給、流体制御、温度制御、混合、精製、工程の監視など、マイクロ流路デバイス内のすべての生産活動をサポートすることができる。マイクロ流路デバイス制御システム上の製造活動は、アプリケーションソフトウェアを通じてアクセスし、制御することができる。
マイクロ流路デバイスは、治療用（例えば、治療用mRNA）材料を精密に調製するために行われる製造ステップのための1つ以上のリアクタを含むように構成されてもよい。同じマイクロ流路デバイスが、直列及び／又は並列に、マイクロ流路デバイス制御システムの連続性を中断することなく、1つ以上のマイクロ流路デバイス上で動作してもよい。例えば、複数のマイクロ流路デバイスを使用して複数のリアクタで行われる複数の処理工程を使用して治療薬を製造する場合、1つのマイクロ流路デバイスからの部分生成物を含む流体生成物（複数可）は、装置によって、閉路法で、1つ又は複数の追加のマイクロ流路デバイスに転送され、それは、マイクロ流路デバイス制御装置の貯蔵デポへマイクロ流路デバイス生成物を含む流体を動かすことを含んでもよい。
各マイクロ流路デバイスは、製造工程中に処理するための1つ以上のリアクタを含むように構成されてもよい。例えば、図3A～3Cは、マイクロ流路デバイスの3つの例を示している。これらの例は、鋳型マイクロ流路デバイス（図3A）、in vitro転写（IVT）マイクロ流路デバイス（図3B）、及び製剤マイクロ流路デバイス（図3C）という3つの異なるタイプのマイクロ流路デバイスを例証している。これらのマイクロ流路デバイスの例の各々は、高度に再現可能な制御方法で一連の単位操作を実行するための機能を含むように構成されてもよい。
ある変形例では、マイクロ流路デバイスは、2つの畝のある層の間に柔軟な膜を挟んだ、さらに2つの硬い層を含む多層構造として構成されてもよい。図4は、本明細書に記載されるように治療薬を処理するためのリアクタを形成する複数の層を有するマイクロ流路デバイスの一例を通る断面図（マイクロ流路デバイスの平面に対して横向き）である。リアクタは、シール、チャネル、バルブ、及び複数の層から形成されるポンピングチャンバを含むチャンバを含んでもよい。例えば、マイクロ流路デバイスは、2つ以上の剛性又は半剛性プレート403、405、及び少なくとも1つの弾性層407から形成されてもよい。弾性層407は、液体不透過性の弾性材料のシートであってもよい。弾性層は、ガス透過性であるか、又は、様々な領域を含めて、ガス透過性になるように処理されてもよい。弾性材料の単一の連続したシートが使用されてもよいが、ある変形例では、複数の弾性材料シートが使用されてもよく、または「シート」は複数のシートの部分から形成されてもよい。また、層と弾性体シートとが積層されていてもよい。一般に、弾性層が液体を含む側と圧力（例えば、気体）を加える側とにチャンバを二分するように、弾性層の両側のプレートに、流体を保持、バルブ化および／または圧送するためのチャンバが形成されてもよい。チャンバ（複数可）の全体容積は一定で、第1（例えば、上部）プレートと第2（例えば、下部）プレートの両方に形成されてもよいが、この容積は圧力側と液体側に分割されてもよい。圧力側に正圧または負圧を加えることにより、弾性シートを変形させて、液体を含む側の容積を小さく（ゼロにし、チャンバを閉鎖）したり、液体を含む側の容積を大きく（所定の最大値まで）したりしてもよい。また、1つ以上のチャンバの圧力受容側419に負圧または正圧を加えるために、圧力印加側が、例えば、圧力流路447に接続する上部プレート403の圧力ポート443に接続してもよい。各チャンバの圧力印加側と反対側の液体含有側417は、流体チャネル421を介して流体ポート423に接続されてもよい。流体ポートおよび圧力ポートの両方が、上部プレート403および弾性層407への開口によって形成されてもよく、圧力ラインが、反対側の剛性または半剛性層（複数）、405、409によってポートの下側に支持されている弾性層407に押し込まれるので、複数の異なる入力ラインがある場合でも大気から隔離された密閉接続が可能である。
図4において、マイクロ流路デバイス400は、第1（例えば、上または上部）面411と、第2（底または下部）面429と、両者の間の厚さとを有する第1（例えば、上部）プレート403を含む。第1面411は、露出した外面を形成してもよい。マイクロ流路デバイスは、第1（例えば、上部又は上）面431と、第2（例えば、下部又は下）面433と、その間の厚さとを有する第2プレート405も含む。弾性層407は、第1プレート403の第2面429と第2プレート405の第1面431との間に挟まれる。第3プレート409は、第2プレートの第2面433上で、直接的または間接的に第2プレートに結合される。第3プレート409も、第1（例えば、上部または上）面と第2（下部または下）面とその間の厚さとを有する。第3プレートの第2面は、マイクロ流路デバイスの底面を形成してもよい。いずれのプレートも、複数の層で形成されてもよく、これらの層は、積層されるか又は他の方法で連結されてもよい。例えば、図4において、第3プレート409は、第3プレートを第2プレートに結合するのを助けることができる任意の第2弾性層413を含み、この例における第2弾性層413は、第3プレート409の第1面435を形成する。図4に示される層及びプレートは、縮尺通りでない場合がある（例えば、弾性層407は、プレートに対してより薄い場合がある）。
また、図4に示すマイクロ流路デバイス400は、それぞれが一定の容積を有する複数のチャンバ415、416、418、420を含んでもよい。これらのチャンバは、第1プレート403の第2（下）面429及び第2プレート405の第1（上）面431への切り込み領域（例えば、丸み／曲線状の切り込み）によって形成され、弾性層407は、それぞれが液体含有側417及び圧力（例えば、ガス含有）側419を含むようにこれらのチャンバを分枝させる。また、マイクロ流路デバイス400は、複数の液体（例えば、流体）チャネルを含んでもよい。図4では、単一の流体チャネル421が、第1プレート403の厚さを貫通する流体ポート423から、弾性層407を通る液体チャネル開口部425に延び、第2プレート405の厚さをほぼ貫通して、第2プレートの下面433に至る。第3プレートの下面と平行に延びる液体チャネル421は、第3プレート409の上面を境として、第2プレートの下面433に、その長さが形成される。
流体ポート423に関して、流体ポート423を形成する第1プレート403への開口部のうち、第1プレートの厚さを貫通して延びる直径は、弾性層407を貫通して液体（例えば、流体）チャネル421に延びる流体チャネル開口部425の直径より大きくてもよい。流体チャネル開口部425は、流体ポート開口部の底部に対して中央に配置されてもよく、少なくとも、流体ポートに接続することになる流体ライン又は流体ライン結合インタフェースの予想壁厚だけ流体ポート開口部の壁からオフセットされてもよい。
流体チャネル421は、第1チャンバ415の液体含有側417に接続する。この第1チャンバは、比較的低い保持容積（固定容積）を有するが、弾性層407の移動によって完全に開閉可能なバルブとして構成されてもよい。
マイクロ流路デバイス400はまた、正圧および／または負圧をかけるために独立して制御され得る複数の圧力チャネルを含む。図4では、第4チャンバ420に接続された単一の圧力ポート443が示されているが、チャンバ415、416、418の各々は、これらのチャンバを分枝する弾性層407の部分の動きを独立して操作及び制御し、各チャンバを独立してバルブ、及び／又はポンプするための別々の圧力ポート及び圧力チャネルに接続してもよい。ある変形例では、圧力ポートを複数のチャンバ間で共有してもよい。図4において、圧力（例えば、気体）ポート443は、流体（例えば、液体）ポート423と同様であり、第1プレート403を完全に貫通して露出した弾性層407に至る開口部を含み、圧力（例えば、気体）チャネル開口部445を形成する弾性層を通って開口部に至る。圧力チャネル開口部445は、第1プレート403の厚さをほぼ貫通する圧力ポート443から延び、第2プレートの底部に沿った（または代替的に第3プレートの上部の切り出し領域である）切り出しチャネルであり、第2プレートおよび弾性層407を通って、第4チャンバ420の圧力（例えば、ガス）含有部419に連なる第1プレート内の圧力チャネルの領域に戻る圧力チャネル447と連続している。同様の流体（例えば、液体）ポートについて説明したように、第1プレート403の厚さを貫通する圧力ポート443の直径は、弾性層407を貫通する圧力チャネル開口部445の直径より大きくてもよく、中央に配置されてもよいし、圧力ポートに接続することになる圧力ラインまたは圧力ライン結合インタフェースの壁厚よりも大きくオフセットされて配置されてもよい。
図4に示すマイクロ流路デバイス400を通る断面では、他の流体（例えば、液体）ライン、流体ポート、圧力ライン、圧力ポートへの複数の接続があるが、それらは示された平面から外れているので、図示されていない。例えば、図4において、第4チャンバの液体含有側／部417は、例えば、液体含有側417から延びる出口チャネルを含む追加のバルブ（チャンバ）及び／又はチャネルに接続されてもよい。図示しない追加のチャンバ（例えば、バルブとして構成されたもの）は、上述したように形成されてもよい。ある変形例では、出口チャネルは、1つ以上のチャンバから別の流体ポート（図示せず）を介して流体受容デポ、例えばバイアル、チューブなどに流体を送達してもよい。この受容デポは、試薬収納フレームに保持されてもよい。
一般に、このようなマイクロ流路デバイスとマイクロ流体装置の構成は、複数の複雑なステップを、マイクロ流路デバイス上の装置によって、完全密閉（密閉して大気から保護）した状態で、人手を必要とせずに実行できるように構成されている。流体は、固定容量チャンバを使用して計量され、弾性層の領域をたわませるために空気圧を適用することによって、移動、混合、ろ過などが行われてもよい。
ある変形例では、マイクロ流路デバイス内のチャンバは、マイクロ流路デバイス内の流体を混合するための混合チャンバとして構成されてもよい。ある変形例では、チャンバ（複数可）は、透析チャンバとして構成されてもよく、これは、流体内の物質を透析するための透析物質及び1つ又は複数の向流チャネルを含んでもよい。ある変形例では、1つまたは複数のチャンバは、治療材料を濃縮するための濃縮器として構成されることがある。
様々なマイクロ流路デバイスは、チャネル、ポート、およびチャンバの配置が異なる場合があるが、基本アーキテクチャは同じであり、異なるプロトコルを実行するために異なる構成で使用できる多くの機能的要素は共有される。機能的要素には、上述したように、入力ポート、計量バルブ、ポンプ、反応チャンバ、混合構造、精製構造などがある。
これらのマイクロ流路デバイスのいずれかが、1つ以上の気泡除去チャンバを含んでいてもよく、あるいは、流体接触側のチャンバのいずれかが気泡除去チャンバとして構成され、流体含有側の流体内の気泡が除去されてもよい。気泡除去チャンバは、真空キャップと呼ばれてもよく、一般に、流体がチャンバの流体接触側内に保持されている間、膜の反対側に負圧を加えるように構成されてもよい。膜は、前述のように、少なくとも部分的にガス透過性であってもよい。図19A～19Cは、気泡除去チャンバの一例を示す。チャンバを仕切る膜の全て、又はより好ましくは、一部1988（例えば、キャップ領域だけ）は、図19Cに示すように、例えば、装置の上面又は上板の真空ライン1987を介して真空と接触していてもよい。動作において、真空キャップ1938は、チャンバの流体接触側内に流体を保持し、チャンバの上側（圧力受容側）に負圧を加えることによって、ライン内の気泡を除去又は減少させてもよい。チャンバを流体接触側と圧力受容側とに仕切る膜は、ガス透過性であってもよく、負圧が流路の上にある膜を通してガス（例えば、空気、窒素など）を引き込むことによって、液体（流体）側からガスを除去することができるようにする。例えば、膜（または真空キャップ内の膜の領域）は、膜の液体側からガスを除去できるほどに十分にガス透過性である、例えば、ポリジメチルシリコーン（PDMS）エラストマーフィルムであってよい。本明細書に記載されるような一定の容積を有する流体チャンバ（例えば、第1プレートと第2プレートとの間に形成される）は、1つ以上の気泡除去チャンバ（真空キャップ）を含むか又はそれに結合されてもよく、及び／又は気泡除去チャンバとして構成されることができる。ある変形例では、チャンバを形成する第1面と第2面の間に配置された弾性層の部分であって、例えば第2面（及び／又は第2プレート）における流体接触側と第1面（及び／又は第1プレート）における圧力受容側とを分ける部分は、最小限の偏向のみされてもよい（又は、全く偏向されない）。例えば、上部の、圧力受容側は、最小限の間隔、及び／又は弛緩した膜とほぼ同一平面（例えば、平坦）であってもよく、一方、流体接触側は、凹状で、第2面（第2プレート）内に延在している。コントローラは、例えば、バルブの圧力受容側に正圧を印加して、例えば、真空キャップのいずれか一方又は両方の側（入口及び出口）のバルブを塞ぐことによって、真空キャップ領域内に流体を保持してもよく、圧力受容真空キャップの圧力受容側に負圧を印加してもよい。印加される負圧の絶対量（例えば、負圧の大きさ）は、膜を偏向させるために印加されるものよりも小さくてもよい（例えば、バルブ及び／又はポンプを閉じるために印加される正圧の絶対値よりも小さい）。あるいは、ある変形例では、膜は、例えば、チャンバの拡大された流体接触側に流体を引き込むために、第1面及び／又はプレートに対して、偏向される（例えば、上に偏向される）ように構成されてもよい。膜は、第1の上面に対して印加された負圧によって保持され、気泡（例えば、空気泡）が除去されることを可能にしてもよい。コントローラは、全て又は一部のガスを除去するのに十分な期間（例えば、1秒以上、5秒以上、10秒以上、20秒以上、30秒以上、1分以上、1分半以上、2分以上、5分以上、1秒～5分、2秒～5分、5秒～5分、等）真空チャンバ内に流体を保持してもよい。図19Cでは、装置の第1面と第2面（例えば、第1プレートと第2プレート）の間に形成されたチャンバの圧力受容面と連通する圧力ライン1987を介して圧力を印加してもよい。真空キャップ1938は、1つ又は複数のバルブ1992によってバルブ化されてもよい。流体は、真空キャップの反対側にある流体ライン1989から流体接触側を出てもよい。
圧力キャップのチャンバの流体接触側は、（本明細書に記載のバルブ及びリアクタと同様に）1つ以上の流体チャネルを介して各チャンバの流体接触側と流体接続している流体ポートと流体連通していてもよく、この流体ポートは第2表面及び／又はプレートに存在することができる。真空キャップの圧力受容側は、本明細書に記載されているように、第2プレートを通って第1プレートに沿って延びる圧力チャネルを介して圧力受容ポート／側と流体連通するように、第1面／プレートを通って（例えば、面／プレート内に）延びる圧力ポートに流体連通していてもよい。
本明細書に記載されるマイクロ流路デバイスはいずれも、上述したように、デバイスが実質的に薄いマイクロ流路プレートデバイスであってよい。したがって、プレート内／プレート上での処理は、任意のポリヌクレオチド（例えば、mRNA）の精製を含む、実質的に2次元（2D）で実行されてもよい。ポリヌクレオチドの2Dでの精製は、本明細書に記載のように、カラムの使用を必要とし、閉路環境及び／又は少量で行うことが困難又は不可能なステップを含む可能性のある先行技術に比べ、特に有利である。
さらに、図4に示されるように、各チャンバの流体接触側（および／または圧力受容側）は、圧力受容側の正圧が弾性層を流体接触側に対して駆動したときに、弾性層が第2面における流体接触側と面一で隙間なく着座するように構成されてもよい。ある変形例では、流体接触側および／または圧力受容側面は、凹面であってもよい。この凹みは、弾性層が流体接触側（および／または圧力受容側）の壁に対して容易に同一平面に着座することを可能にするために、浅い楕円状の断面を有していてもよい。弾性層は、チャンバ（例えば、流体接触側の）のデッドリテンション部分がないように、チャンバの壁に対して押しつけられる（例えば、着座される）。
マイクロ流路デバイスは、試薬、および流体の動きとバルブ制御を管理するために使用される空気圧ラインの両方のための一連のバネ式接続を介して、マイクロ流路デバイス制御システムと接続することができる。試薬及びガスラインは、試薬バイアルからマイクロ流路デバイスへ、及びマイクロ流路デバイスから移送バイアルへの完全に密閉された経路を形成するマイクロ流路デバイスに埋め込まれたエラストマー層に対する圧力によって密閉されてもよい。経路の密閉は、マイクロ流路デバイス内のすべての反応に対して維持され、大気との接触を効果的に排除し、汚染のリスクを最小限に抑えることができる。
本明細書に記載されたマイクロ流路デバイス制御システムは、無菌制御環境を提供してもよく、試薬をロードし、出力を取り出すためのインタフェースを含んでもよい。本明細書に記載される装置（例えば、システム）のいずれかにおいて、装置は、制御された環境を提供する筐体を含んでもよく、この筐体はまた、制御された環境内に配置されてもよい。例えば、封入された装置は、クラス7の環境内に配置されたクラス5の環境であってもよい。
マイクロ流路デバイス制御システムは、すべてのアクチュエータにワンステップで接続できるようにしてもよい。これらの制御システムはまた、すべての試薬およびマイクロ流路デバイスの識別子（例えば、バーコード）をスキャンしてもよく、流体レベルを監視してもよい。一般に、これらのマイクロ流路デバイス制御システムは、マイクロ流路デバイスの機能の全てまたは一部を自動化してもよく、（例えば、中間工程出力の光学的品質管理分析などのために）監視、保存、送信、または後でレビューされ得る全ての工程ステップの視覚的記録を生成してもよい。
上述のように、マイクロ流路デバイス管理システムは、マイクロ流路デバイスが正しく整列されるように設計され得るネスト（マイクロ流路デバイスホルダ）等のハードウェアを含むマイクロ流路デバイス管理システムを含んでもよく、単一の方向においてのみ挿入され得る。これは、例えば、マイクロ流路デバイスの形状に合致するネストの2つのピンおよび／または切り欠きを介して管理されてもよい。マイクロ流路デバイス管理システム（制御システム）には、試薬と移送バイアルを保持するバイアルラック、液体とバルブの動き及び製品の移送をすべて記録する下向きカメラ、バーコードを撮影し、液面を検出するためのレール上の側面カメラ、およびビーズ操作のための磁石付きロボットアームも含まれる。マイクロ流路デバイスは真空チャックで固定され、温度管理のためのペルチェ素子と良好に接触するようになっている。マイクロ流路デバイスを設置した後、マイクロ流路デバイス管理システムの上部をダボピンガイドシステムで下げることにより、すべてのコネクタとの嵌合がワンステップで実現する。
前述のように、マイクロ流路デバイス制御システムは、すべての電子デバイス（CPU、イーサネットRIOデバイスコントローラなど）のインタフェースとなるコントロールパネルや、空気圧制御用のバルブやマニホールド、圧力レギュレータなどを含むことができる。これらのシステムのいずれもが、HEPAエアフィルタと気流管理によって微生物学的に安全な筐体を提供するバイオセーフティフードのように動作する冷蔵キャビネットまたはチャンバ（例えば、ISOクラス5の安全キャビネット）を含むこともできる。さらに、このキャビネットは、すべての試薬が製造工程を通じて適切な温度に保たれるようにすることもできる。また、キャビネットには、マイクロ流路デバイスおよび内部のマイクロ流路デバイス管理システム要素の全てを滅菌するためのUVランプが装備されていてもよい。マイクロ流路デバイス管理システムは、それ自体がISOクラス7の部屋にある環境（例えば、6フィート×6フィートのISOクラス5の小環境）内に存在してもよい。試薬バイアル及びマイクロ流路デバイスの装填を含むオペレータとシステムとの相互接触は、全て最良の無菌技法に従って実行されてもよい。
送達ビヒクル
本明細書に記載された方法および装置は、広範なmRNA送達ビヒクルと適合し得る。例えば、送達ビヒクルは、電気穿孔法及び遺伝子銃、アデノウイルス（AV）又はアデノ随伴ウイルス（AAV）によるウイルス送達、エクソソーム及びリポソーム、カチオン性ポリマーによるカプセル化、及び脂質ナノ粒子（LNP）による製剤と適合し得る。
治療薬の製造
本明細書では、治療薬を製造するための方法、および装置（例えば、デバイス、およびシステム）を説明する。これらの方法および装置は、患者特異的治療薬を、非常に迅速な期間で製造するために使用され得る。特に、これらの方法および装置は、上記のように、mRNAなどのポリヌクレオチドに基づく治療薬を製造するために使用されてもよい。この工程の一部として、方法及び装置は、IVT DNA鋳型の製造、治療用mRNAを生成するためのIVT反応の実行、治療用mRNAの精製、治療用組成物を形成するための送達ビヒクルとのmRNAの製剤化、及び最終医薬品の製剤後の処理を含む上述のステップのうちの一部又は全部を実行してもよい。
IVT鋳型の作成
本明細書に記載されたDNA鋳型の製造方法、特に合成DNA鋳型の製造方法は、より優れた、よりスケーラブルな、より迅速で安全なワクチンおよび治療薬を製造するために特に有用であると考えられる。IVTによるmRNA合成のための合成鋳型の使用は、潜在的な微生物汚染を防止することを含め、多数の点で有益である。合成DNA鋳型を含む溶液は、一般に、汚染する細胞、細胞抽出物、および細胞からのエンドトキシンを含まない。これらの溶液は、汚染細胞、細胞抽出物、またはエンドトキシンに起因する毒性のリスクが実質的にない、患者に注射するためのワクチンの一部となることに特に適している可能性がある。
ある変形例では、本明細書に記載されるようなin vitro転写促進剤カセット（IFC）は、in vitro転写可能な二本鎖DNAである。図6には、二本鎖DNA鋳型の作製に有用なin vitro転写促進剤カセットの一例が示されている。in vitro転写促進剤カセットは、プロモータ、5'非翻訳領域（5'UTR）をコードする部分、3'非翻訳領域（3'UTR）をコードする部分、およびポリAテールをコードする部分など、（例えば、目的の挿入遺伝子から）効果的にin vitro転写を促すように構成された機能要素を含んでいる。また、in vitro転写促進剤カセットは、目的の遺伝子の発現のために目的の遺伝子をin vitro転写促進剤カセットにクローニングするために有用な1つ以上のリンカーと、鋳型の直線化を確実にするための制限部位とを含む。
In vitro転写促進剤カセットは、合成的または非合成的に製造することができるが、一般的には合成的に製造されるであろう。ある変形例では、合成in vitro転写促進剤カセットの製造方法は、Twist Bioscience社（カリフォルニア州サンフランシスコ）またはThermo Fisher Scientific社（マサチューセッツ州ウォルサム）から入手できるものなどの市販のDNA合成機を使用することを含む。さらに、in vitro転写促進剤カセットは、DNAの別々の部分から組み立てることができ、またはそれは1つの部分として合成されることができる。ある実施形態では、in vitro転写促進剤カセットは直鎖状であり、一緒にライゲーションすることができる互換性のある末端を含む。ある実施形態では、in vitro転写促進剤カセットが環状である。ある実施形態では、環状のin vitro転写促進剤カセットは、適切な制限エンドヌクレアーゼの適用により、プロモータ、5'UTR、リンカー領域、3'UTR、及びポリA領域をコードする部分を順に含む直鎖状DNAを生成するように構成されたポリA領域をコードする部分とプロモータとの間の部位（例えば、制限エンドヌクレアーゼ部位）を含んでいる。一般に、in vitro転写促進剤カセットは、抗生物質耐性遺伝子をコードしていない。例えば、合成された合成in vitro転写促進剤カセットは、生物（例えば、細菌）細胞内で増殖しないため、抗生物質耐性遺伝子を必要とせず、抗生物質の選択を必要としない。一般に、in vitro転写促進剤カセットは、DNA複製を促進するための複製起点（ori）または関連する制御エレメントを有しない。例えば、合成された合成in vitro転写促進剤カセットは、生物（例えば、細菌）細胞内で増殖せず、複製のためのoriが必要ないため、oriが不要である。in vitro転写促進剤カセットの全長は、多くのプラスミドよりも小さくすることができる。in vitro転写促進剤カセットは、長さ2kb未満、長さ1.5kb未満、長さ1.0kb未満、長さ900bps未満、長さ800bps未満、長さ700bps未満、または長さ600bps未満とすることができる。
上記に示したように、in vitro転写促進剤カセットはプロモータを含んでいる。酵素RNAポリメラーゼはプロモータに結合し、（例えば、二本鎖DNA鋳型がカセットと目的の遺伝子から組み立てられた後）目的の遺伝子からのRNAの転写を開始する。カセット内の転写に有用なプロモータの例としては、天然もしくは改変T7プロモータ、天然もしくは改変T3プロモータ、または天然もしくは改変SP6プロモータが挙げられる。
また、in vitro転写促進剤カセットは、交換可能な5'非翻訳領域（5'UTR）をコードする部分と交換可能な3'非翻訳領域（3'UTR）をコードする部分を含んでいる。これらの領域は、それ自身はタンパク質やペプチドに翻訳されないが、mRNAからタンパク質やペプチドへの翻訳を制御するのに役立つ。また、in vitro転写促進剤カセットは、ポリAテールをコードする部分を含む。mRNAにおけるポリAテールは、数十から数百のアデニン残基が繰り返し結合した長鎖である。mRNA上のポリAテールは、細胞質におけるmRNAの安定性を高め、mRNAからタンパク質への翻訳を助けるなど、いくつかの機能を果たすと考えられている。mRNAにおける鋳型のDNAによって直接コードされているmRNAの残りの配列とは異なり、ポリAテールは通常（例えば、自然界では）DNAによって直接コードされていない。むしろ、自然界に存在するDNAは、ポリアデニレーションシグナル（例えば、AATAAA）と呼ばれる略号を含んでおり、他のDNA配列とともに、細胞内の転写機構に、合成中のmRNAにポリAテールを付加するようにシグナルを送る。つまり、天然に存在するmRNAのポリAテールの長さは、mRNAを作る細胞によって決定される。図6に見られるように、本明細書に記載のin vitro転写促進剤カセットは、ポリAテールを直接コードするDNAの領域（例えば、テール全体）を含む。ポリAテールの長さは、ポリAテールを直接コードするDNAの領域における長さ（例えば、アデニンまたはポリAの数またはチミジンの数またはポリTの数）によって決定される。ポリAテールを直接コードするDNAの領域は、少なくとも100bp長、少なくとも200bp長、少なくとも300bp長、少なくとも400bp長、または少なくとも500bp長であってもよく、これらのサイズ（例えば350塩基対長）の間のものであってもよい。カセットを鋳型として作成したmRNAに、残りのmRNAの作成に用いたのと同じ工程でポリAテールを付加することができる。そのため、ポリAテールを含むmRNA全体の作製工程が大幅に簡略化されるという利点がある。mRNAの生成には、生細胞や、細胞DNA、細胞RNA、細胞膜タンパク質などを含む細胞からの複雑な抽出物が不要である。その代わりに、本明細書に記載されているように、二本鎖DNA鋳型からポリAテールを含むmRNA全体を生成するために、十分に定義された転写混合物を用いることができ、細胞または細胞抽出物を用いて作られる転写混合物に見られるような毒性のある副産物を一般的に含まない転写混合物を作ることができる。このようによく定義された混合物は、最小限の後始末だけで患者に安全に提供することができる。二本鎖DNA鋳型もまた、実質的に有毒な副産物を含まない十分に定義された混合物から生成される場合、二本鎖DNA鋳型から作られた転写産物は、必要な最小限の洗浄のみで患者への直接注入に好適である。本明細書に記載されているのは、実質的に毒性のある副産物を含まない、よく定義された混合物から生成される二本鎖DNA鋳型である。
また、in vitro転写促進剤カセットは、1つ以上のリンカー領域を含む。リンカー領域は、5'UTRと3'UTRの間にある。リンカー領域は、少なくとも1つの開裂可能な部位、一般的には2つの開裂可能な部位を含む。2つ以上の切断可能部位が存在する場合、それらは同じ配列を有していてもよいし、異なる配列を有していてもよい。1つ以上の開裂可能な制限部位は、目的の遺伝子（GOI）をin vitro転写促進剤カセットに挿入して、合成の直鎖状または環状ライゲーション産物を生成するのに有用である。目的の遺伝子は、一般に、in vitro転写促進剤カセットの5'UTRと3'UTRの間に挿入されるが、場合によっては、5'UTRまたは3'UTR配列が目的の遺伝子と共に含まれて、目的の遺伝子と共にin vitro転写促進剤カセットに挿入される可能性がある。切断可能部位（複数可）は、制限エンドヌクレアーゼ部位、例えば、タイプII（タイプIIG、タイプIIS）制限エンドヌクレアーゼ、例えば、BsaI、BbsI、AarI、HhaI、HindIII、NotI、BbvCI、EcoRI、BglII、FokI、AlwI、AcuIまたはBcgIがNew England Biolabs社（NEB、マサチューセッツ州イプスウィッチ）、Promega Corporation社（ウィスコンシン州マディソン）、またはThermo Fisher Scientific社（マサチューセッツ州ウォルサム）から入手可能である。
本明細書に記載される目的の遺伝子（GOI）は、一般に機能的産物分子（RNAまたはタンパク質）をコードするDNAの短い断片である。目的の遺伝子は、特定のタンパク質、タンパク質の一部、または特定の機能をコードすることができる。場合によっては、特定のタンパク質またはタンパク質の一部をコードしないRNAを生成するための指示を含むこともある（例えば、翻訳されない機能性RNAをコードすることもある）。
in vitro転写促進剤カセットに挿入するのに有用な目的の遺伝子は、合成的または非合成的に製造することができるが、一般的には合成的に製造されるであろう。目的の合成遺伝子を製造する方法としては、Twist Bioscience社（カリフォルニア州サンフランシスコ）またはThermo Fisher Scientific社（マサチューセッツ州ウォルサム）から入手できるような市販のDNA合成機および方法を使用することにより、製造することができる。さらに、目的の遺伝子は別々のDNAから組み立てることもできるが、一般的には1つのピースとして合成される。目的の遺伝子は、DNAの直鎖状片として製造されてもよいし、環状片として製造されてもよい。環状の目的の遺伝子は、制限酵素で消化され、直鎖状の目的の遺伝子となる場合がある。製造された目的の遺伝子は、精製（例えば、カラム、電気泳動分離など）されてもよい。
一般に目的の遺伝子は、in vitro転写促進剤カセットと結合する前に開裂される。特に、目的の遺伝子は、in vitro転写促進剤カセットを開裂するために使用されるのと同じ制限エンドヌクレアーゼ（複数可）で開裂されてもよいが、酵素増幅によって生成されてもよい。一般に、目的の遺伝子は抗生物質耐性遺伝子をコードしていない。例えば、合成された目的合成遺伝子は、生物（例えば、細菌）細胞内で増殖しておらず、抗生物質の選択を必要としないので、抗生物質耐性遺伝子を必要としない。一般に、目的の遺伝子は、DNA複製を促進するための複製起点（ori）または関連する制御エレメントを有していない。例えば、合成された目的合成遺伝子はoriを必要としないが、これは、生物学的（例えば、細菌）細胞内で増殖しておらず、複製のためにoriを必要としないためである。ある実施形態において、目的の遺伝子の全長を多くのプラスミドよりも小さくすることができる。目的の遺伝子は、長さ2kb未満、長さ1.5kb未満、長さ1.0kb未満、長さ900bps未満、長さ800bps未満、長さ700bps未満、または長さ600bps未満、長さ500bps未満、長さ400bps未満、または長さ300bps未満、長さ200bps未満、長さ100bps未満であってよい。
ある例では、目的の遺伝子は、T細胞受容体（TCR）またはT細胞受容体の一部であり、例えば、CTCLまたはT細胞受容体（TCR）またはT細胞受容体の一部によって媒介される他の疾患または状態を治療するためのものである。例えば、T細胞の発生において、細胞はT細胞受容体（TCR）遺伝子を再配列し、新規TCR分子を作成し発現させなければならない。TCRの再配列はT細胞の発生初期に起こり、CTCLのような成熟T細胞リンパ腫が発生する前に起こるため、すべての悪性CTCL細胞は、固有のTCRαおよびTCRβサブユニットを含む同一のクローンTCRを発現している。このTCRはリンパ腫細胞に特有であり、免疫系にとって異物であるため、治療の優れたターゲットとなる。
目的の遺伝子は、相補性決定領域（CDR）の一部または全部であってもよい。CDRは、TCR配列の高度に可変な部分であり、T細胞の抗原-主要組織適合性複合体（MHC）への結合を媒介する。図8には、ワクチンまたは治療に使用するための二本鎖DNAを作るのに有用なT細胞受容体の1つの領域が示されている。特に、V（D）J領域とC領域の接合部にまたがるCDR3領域は、最も高い可変性を有し、リンパ腫細胞においてのみ見出されるべき、真にユニークなタンパク質断片を表している。したがって、C末端とN末端の両方で10アミノ酸延長されたCDR3領域がワクチンペプチド断片を構成する。ある方法では、T細胞受容体（TCR）またはT細胞受容体の一部のような遺伝子の固有配列が個体から決定され、目的の遺伝子は個体からのT細胞受容体（TCR）またはT細胞受容体の一部と同一であるように製造される。場合によっては、コドン最適化または最適化されたRNA安定性もしくは発現のためなど、特定の既知の方法で配列が制御可能に改変されることもあるが、それでも目的の遺伝子の配列は、個体から得られた配列に基づくものである。ある実施形態では、目的の遺伝子の配列は、患者からのDNA配列と同一のDNA配列、または患者からのDNA配列に対して既知の方法で制御可能に改変されたDNA配列を有するT細胞受容体を含んでいる。
本明細書では、二本鎖DNA鋳型の作製方法、特に合成二本鎖DNA鋳型の作製方法について説明する。二本鎖DNA鋳型は、ワクチン、または患者への注射または別の送達様式による他の治療薬に用いるようなmRNAを生成するためのin vitro転写を行うために特に有用であり得る。
in vitro転写を行うための既存のDNA鋳型およびin vitro転写を行うための混合物は、一般的に粗精製または半精製の細胞抽出物（例えば、細菌、他の微生物、または他の抽出物）を含み、複雑かつ未定義であってもよい。そのような抽出物は、細菌、他の微生物、または他のDNA、エンドトキシン、および／または他の望ましくない成分を含む場合がある。ワクチンまたは治療用のプロセスの一部として、DNA鋳型の生成またはin vitro転写の実行のために使用される場合、望ましくない成分は、重大な副作用のリスクを増加させる可能性がある。例えば、エンドトキシンはグラム陰性菌の外壁に含まれるリポ多糖の大きな分子であり、in vitro転写反応に用いる細胞抽出物の生成源として一般的に使用されている。注射などで血流に乗ったエンドトキシンは、ヒトや他の動物に炎症や敗血症など様々な問題を引き起こし、大きな健康リスクをもたらす。本明細書に記載の方法は、生物学的汚染物質（細菌、他の微生物または他の汚染物質）を含まない、細菌（または他の微生物または不要な）DNAを含まない、および／またはエンドトキシンを含まない二本鎖DNA鋳型を作るのに特に有用であり得る。本明細書に記載の方法は、目的の遺伝子を作るため、in vitro転写促進剤カセットを作るため、及び／又は二本鎖DNA鋳型を作るため（又はこれらの材料を作るために用いられる任意の中間体を作るため）に、定義又は合成された成分を使用することを含んでもよい。定義又は合成された成分は、DNA合成剤、精製ヌクレオチド、精製酵素などの定義又は合成された成分から作製されてもよい。定義又は合成された成分は、細菌、他の微生物、又は他のDNA、エンドトキシン、及び／又は他の望ましくない成分を本質的に含まないものであってよい。生物学的成分の使用を避けることにより、DNAやエンドトキシンなどの生物学的汚染物質が、そもそもDNA鋳型（または他の成分）を汚染することがない。二本鎖DNA鋳型および下流材料は、困難または厄介な精製ステップを必要とせず、より安全である。本明細書におけるこの方法および他の方法は、目的の合成遺伝子と合成in vitro転写促進剤カセットとを結合させて合成直鎖状または環状ライゲーション産物を生成するステップ、未反応の目的の合成遺伝子および未反応の合成in vitro転写促進剤カセットを除去するステップ、環状ライゲーション産物を増幅して直鎖状、環状または分枝増幅DNAを生成するステップ、および増幅DNAライゲーション産物を直鎖状化して二本鎖DNA鋳型を生成するステップを含み得る。
上記に示したように、目的の遺伝子とin vitro転写促進剤カセットとを結合させて合成直鎖状または環状ライゲーション産物を作製することは、目的の遺伝子をin vitro転写促進剤カセットに挿入することを含むことができる。図7には、本明細書に記載されるように生成された二本鎖DNA鋳型が示されている。目的の遺伝子及びin vitro転写促進剤カセットは、本明細書の他の場所に記載されるような同じ制限エンドヌクレアーゼ部位（複数可）を有してよく、方法は、目的の遺伝子及びin vitro転写促進剤カセットを制限エンドヌクレアーゼ部位に対する制限エンドヌクレアーゼで消化し、適合する末端を作り、目的の遺伝子をカセットにライゲートすることを含んでもよい。本方法は、目的の遺伝子、in vitro転写促進剤カセット、制限酵素緩衝液、エネルギー源、1つ以上の制限酵素、リガーゼ緩衝液、及びリガーゼを組み合わせ、混合物を適切な時間インキュベートすることを含み得る。緩衝液（複数可）は、特定の制限エンドヌクレアーゼ及び／又はリガーゼに適したものであってもよく、1つの緩衝液であってもよく、2つ（又はそれ以上）の緩衝液であってもよい。エンドヌクレアーゼ及び／又はリガーゼ緩衝液は、市販の緩衝液（例えば、NEB、Promega）であってもよく、及び／又は約7.4から約9.0のpHでトリス、カリウム、マグネシウム、塩化ナトリウム、及びジチオスレイトールを含む、例えばトリスアセテート（例えば、6mM～90mM）、酢酸カリウム（50mM～100mM）、酢酸マグネシウム（5mM～10mM）、ウシ血清アルブミン（BSA、50ug/ml～200ug/ml）ジチオスレイトール（1mM）である。リガーゼは、市販のもの（例えば、NEB、Promega、Thermo Fisher Scientific）、あるいはT3 DNAリガーゼ、T4 DNAリガーゼ、T7 DNAリガーゼなどのリガーゼであってもよい。ダイジェストは、10分～4時間、またはその間の任意の時間（例えば、30分、1時間、2時間など）行われてもよい。ライゲーションステップは、10分～4時間、またはその間の任意の時間（例えば、30分、1時間、2時間など）行われてもよい。消化ステップとライゲーションステップは同時に行ってもよいし、順次行ってもよい。エネルギー源は、アデノシン5'三リン酸（ATP）（例えば、0.1mM～5mM）であってもよい。制限酵素やリガーゼなどの成分のいずれかを経時的に追加し、インキュベーションを継続してもよい。ある実施形態では、動物由来でない（AOF）ことが証明された材料のみが、感染性物質を伝播するリスクを低減するために、治療用製造に使用されることになる。in vitro転写促進剤カセットが環状でないこれらの方法のいくつかは、in vitro転写促進剤カセットの末端をライゲーションし、環状のin vitro転写促進剤カセットを生成するステップを含む。あるいは、チューバック法などの目的の遺伝子とin vitro転写促進剤カセットとをライゲーションする他の方法を用いることもできる。代替的または追加的に、指数関数的増幅法の前に、プライマー伸長法を用いて、in vitro転写促進剤カセットと目的の遺伝子との間のライゲーションを行い、直鎖状分子を生成することができる。
本明細書に記載のこの方法または他の方法は、合成直鎖状または環状ライゲーション産物から離れた未反応の目的の合成遺伝子および未反応の合成in vitro転写促進剤カセットを除去するステップ、または未反応の目的の合成遺伝子および未反応の合成in vitro転写促進剤から離れた二本鎖DNAを精製するステップを含んでもよい。合成循環型ライゲーション産物から離れた未反応の目的の合成遺伝子及び未反応の合成in vitro転写促進剤カセットを除去することは、適切なエキソヌクレアーゼ緩衝液（NEB、プロメガ、サーモフィッシャー）中のエキソヌクレアーゼ（エキソヌクレアーゼV等）などの酵素を用いて行うことができる。本方法は、目的の合成遺伝子及び未反応の合成in vitro転写促進剤を消化することを含んでもよい。本方法は、消化された混合物をイオン交換樹脂又はサイズ排除樹脂等の樹脂又はカラムに通し、未反応の目的の合成遺伝子及び未反応のin vitro転写促進剤カセットのいずれかをカラムに保持し、又は二本鎖DNA鋳型をカラムに保持し、二本鎖DNA鋳型又は目的の合成遺伝子及び未反応のin vitro転写促進剤カセットを樹脂又はカラムに通過させることを含んでもよい。ある実施形態は、消化されたヌクレオチドを樹脂又はカラム内に保持すること、又は消化されたヌクレオチドに樹脂又はカラムを通過させることも含み得る。ある実施形態は、樹脂またはカラムを洗浄および／または溶出することを含む。ある実施形態はまた、樹脂またはカラム内に消化されたヌクレオチドを保持することを含み得る。ある実施形態は、未反応の目的の合成遺伝子及び未反応の合成in vitro転写促進剤カセットをビーズに結合すること、又は二本鎖DNAをビーズに結合し、ビーズを磁石で保持し、二本鎖DNA又は未反応の目的の合成遺伝子及び未反応の合成in vitro転写促進剤カセットのいずれかを二本鎖DNAから除去することを含む。樹脂、カラム、および磁気ビーズは、Bangs Laboratories社（インディアナ州フィッシャーズ)、Beckman Coulter社（カリフォルニア州ブレア）、Millipore社（マサチューセッツ州バーリントン）、およびThermo Fisher, VWR社（フィラデルフィア州ラドノール）などから入手することが可能である。ある実施形態は、メチル化感受性制限酵素の使用を含んでもよい。
本明細書に記載されるこの方法及び他の方法は、直鎖状又は環状のライゲーション産物を増幅して増幅DNAを生成することを含むことができる。ある方法は、直鎖状または環状のライゲーション産物を増幅して、直鎖状増幅DNAを生成することを含む。ある方法は、直鎖状又は環状のライゲーション産物を増幅して、直鎖状、分枝状又は環状の増幅DNAを生成することを含む。増幅産物は、ヘリカーゼ依存増幅（HAD）、ループ媒介等温増幅（LAMP）、多重置換増幅（MDA）、核酸配列ベース増幅（NASBA）、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、ローリングサークル増幅（RCA）、自己持続配列複製（3SR）、または鎖置換増幅（SDA）により増幅されることができる。反応に適した緩衝液、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（dNTP）、酵素（DNAポリメラーゼ）、プライマーを必要に応じて添加する。増幅の温度とタイミングを制御する。本方法は、直鎖状または環状のライゲーション産物を加熱（例えば、70℃以上100℃以下）してDNAを変性させ、次いで冷却するステップを含んでもよい。本方法は、DNAを変性させるように構成された変性緩衝液を直鎖状又は環状のライゲーション産物に添加してDNAを変性させ、次いで変性したDNA混合物に中和緩衝液を添加して変性緩衝液を中和し、変性したDNAを残すステップを含んでもよい。この方法は、変性したDNAを増幅または伸長するためのDNAポリメラーゼ酵素などの酵素（例えば、Bst DNAポリメラーゼ、Φ29 DNA（Phi29）ポリメラーゼ、Taq DNAポリメラーゼ）を加え、酵素でDNAを増幅または伸長して増幅DNA（例えば、分枝、循環、または直鎖増幅DNA）を生成するステップを含んでもよい。
ある方法は、増幅または伸長されたDNAを、緩衝液、酵素、ヌクレオチド、および他の不要な成分から離して精製するステップを含む。この方法は、イオン交換樹脂、磁気ビーズ、またはサイズ排除樹脂などのビーズ、樹脂またはカラムを使用して増幅または伸長したDNAを通過させ、増幅または伸長したDNAを保持するか、増幅または伸長したDNAをビーズ、樹脂またはカラムを通過させて不要な酵素および他の成分をビーズ、樹脂またはカラムに保持するかのいずれかを含むことができる。ある実施形態は、樹脂又はカラムを洗浄及び／又は溶出及び／又は乾燥及び／又は再水和させることを含む。ある実施形態は、これらのステップの1つ又は複数を繰り返すことを含む。ある実施形態は、ビーズ、樹脂、又はカラムの2つ以上（複数）のデポと、洗浄／溶出／乾燥／及び／又は再水和ステップのうちの1つ以上を繰り返すことを含む。ある実施形態は、DNAをビーズに結合させ、ビーズを磁石で保持し、DNAおよびビーズから不要な成分および汚染物を除去する（洗浄する）ことを含む。使用に適した樹脂、カラム、及び磁気ビーズは、Bangs Laboratories社（インディアナ州フィッシャーズ）、Beckman Coulter社（カリフォルニア州ブレア）、Millipore社（マサチューセッツ州バーリントン）、Thermo Fisher, VWR社（フィラデルフィア州ランドール）から入手可能である。
ある実施形態では、増幅されたDNAは直鎖状ではなく、分枝状または環状であってもよい。ある方法は、DNAを直鎖状化し、直鎖状化された鋳型DNAを生成するステップを含む。ある方法は、精製された増幅DNA又は伸長DNAに制限エンドヌクレアーゼ（適切な緩衝液中）を添加し、DNAを制限エンドヌクレアーゼとインキュベートし、DNAを直鎖状化するステップを含み得る。制限酵素は、5'UTR、目的の遺伝子、3'UTR、およびポリA領域をコードする部分の外側を切断するように選択される。ある実施形態では、制限酵素は、1つの拡張または増幅されたDNAの3'UTRと、隣接する（および下流の）拡張または増幅されたDNAの5'UTRとの間を切断する。制限酵素は、任意の制限酵素、例えば、直鎖状または環状の合成ライゲーション産物を作成するために、目的の合成遺伝子を合成in vitro転写促進剤カセットと結合させるための制限酵素消化に関して上記に示したようなタイプIIs制限酵素であり得る。ある例では、制限酵素は、New England Biolabs社（NEB; マサチューセッツ州イプスウィッチ)、Promega Corporation社（ウィスコンシン州マディソン）、またはThermoFisher Scientific社（マサチューセッツ州ウォルサム）から入手可能なBsaI、BbsI、AarI、HhaI、HindIII、NotI、BbvCI、BglII、FokI、AlwI、AcuIまたはBcgI、の少なくとも1つである。ある実施形態では、制限エンドヌクレアーゼは、目的の合成遺伝子をin vitro転写促進剤カセットに挿入するために使用されるのと同じ制限エンドヌクレアーゼ（複数可）である。ある実施形態では、制限エンドヌクレアーゼは、目的の合成遺伝子をin vitro転写促進剤カセットに挿入するために使用される制限エンドヌクレアーゼ（複数可）とは異なるものである。また、本明細書に記載される二本鎖DNAを作製するためのマイクロ流路デバイスリアクタが記載される。
図9には、二本鎖DNAを生成するためのマイクロ流体バイオチップリアクタのアーキテクチャの一変形例が示されている。本明細書に記載されるこの方法及び他の方法は、生成中に全ての構成要素が無菌的に維持される無菌閉鎖バイオチップ内で、目的の遺伝子及びin vitro転写促進剤カセットから二本鎖DNAを生成することを含み得る。無菌閉鎖型バイオチップは、大気に対して閉鎖されている。図9には、二本鎖DNA鋳型になるまでの経路に沿った異なる段階にあるDNA前駆体が移動する4つの相互接続リアクタ（例えば、モジュールまたはチャンバ）を有するマイクロ流体バイオチップリアクタが示されている。例えば、図9では、ライゲーションリアクタ（ライゲーション反応チャンバ901）、プレ混合チャンバ903、増幅リアクタ（増幅反応チャンバ905）及び消化リアクタ（消化反応チャンバ）907が含まれ得る（この例ではコネクタ及びバルブは図示されていない）。本明細書に記載の方法の異なるステップは、異なるモジュール又はチャンバで実施される。目的の遺伝子とin vitro転写促進剤カセットは、プレ混合チャンバで一緒に混合される。ライゲーション反応チャンバにおいて、目的の遺伝子とin vitro転写促進剤カセットを結合し、ライゲーション産物を作製する。増幅反応チャンバにおいて、ライゲーション産物が増幅され、増幅されたDNAが生成される。増幅されたDNAはさらに処理される。例えば、消化反応チャンバで消化され、不要なDNAが除去されたり、増幅された目的の遺伝子の異なるコピーが分離されたりする。
IVT反応
次の工程として、mRNAを生成するIVT反応を行ってもよい。この工程は、先に説明したようなマイクロ流路デバイス制御システムに収容され得る同一または異なるマイクロ流路デバイス（例えば、IVTマイクロ流路デバイスにおけるある変形例）内部で実施されてもよい。IVTマイクロ流路デバイス内の主要ステップ及びサブコンパートメントを示す高レベルのmRNA製造プロセスは、図11に記載されている。
IVT反応は、DNA鋳型とT7ポリメラーゼ酵素、ヌクレオチドおよびキャッピング試薬を組み合わせ、制御された条件下で反応をインキュベートして、キャッピングされたmRNA分子を生成することを含む場合がある。IVT反応は、マイクロ流路デバイス（例えば、IVTマイクロ流路デバイス）の反応チャンバ内で行われてもよく、温度、混合及び試薬添加（反応の開始時及び反応中の両方）などの工程パラメータは、最適化レベルに制御されてもよい。工程は、上述したように、コントローラによって駆動されてもよい。緩衝液および溶液は、マイクロバルブのアレイを介して供給されてもよく、容量は、各mRNA原薬に最適化されたプロトコルに固有な予め設定されたプログラムを使用して制御されてもよい。
IVT反応の後、鋳型DNAを分解するためにDNAse処理を行う場合がある。このステップは、IVT反応チャンバ（IVTリアクタの一部）内で行ってもよく、希釈率、酵素/緩衝液濃度、温度、混合などのパラメータを最適なレベルに制御してもよい。この手順は、自律的に実行され、モニタリングカメラによって記録されてもよい。
IVTの精製
DNAse処理したmRNAは、不純物や副産物を除去するために精製してもよい。特に、分解された鋳型、未反応のヌクレオチド、酵素（T7ポリメラーゼやDNAse）、二本鎖RNAは、原薬の品質や免疫原性に影響を及ぼす。精製には、表面化学の異なる担体を用いた2段階の固相可逆的固定化法を用いることができる。第一段階では、セルロース膜を使用して、正確に制御された結合条件下で二本鎖RNAを選択的に捕捉し、非結合画分を第二精製チャンバに溶出させることができる。第2精製工程では、500bp以上の長さのmRNAを選択的に捕捉する1～2mのカルボキシル被覆常磁性ビーズを使用してもよい。その後、ヌクレオチド、酵素、分解された鋳型を含む未結合物質を除去するために、何回か洗浄を行うことができる。その後、USPグレードの水で純粋なmRNAを溶出することができる。インラインマイクロフルイディクスベースの精製は、材料を大気にさらすことなく、完全に統合されたワークフローを可能にし、従来のHPLCベースのメソッドで使用されていた毒性のある移動相の使用を避け、手作業を大幅に削減することができる。
上述したように、一般に、これらの方法および装置は、治療用mRNA、または治療用mRNAを製造するための成分のいずれかまたはすべてを、外部の雰囲気に曝すことなく、および／または他の方法で必要となり得るRNAseおよび／または汚染成分の供給源に曝すことなく製造できる無菌的方法および装置である。例えば、本明細書に記載されるように、これらの方法は、ポリヌクレオチドの細菌源（例えば、鋳型DNA中）を加えることなく、及び／又はHPLC又は他の従来の技術を介して精製する際に存在し得る可塑剤のような成分を加えることなく実施することができる。本明細書に記載されるのは、マイクロ流路デバイス内で精製するための装置及び方法である（例えば、純粋なセルロースを使用する）。
精製されたmRNAは、A260nmのUV吸収、またはmRNA特異的蛍光色素を用いた蛍光により定量することができる。純度および同一性を確認するために、追加のmRNA QCステップを実施してもよい。mRNAの製造工程全体は、マイクロ流路デバイス制御システムの内部で行われてもよく、試薬の添加および移送は、例えば無菌技術を使用して、上記の閉路閉路型マイクロ流路デバイス制御システムを介して行われてもよい。最後に、例えば0.22mのフィルタを通した濾過を行ってもよい。最終生成物は、収量（例えば、UV vis／フルオロメトリーにより、出発IVTの1ul当たり6.5ug超のmRNA）、同一性（例えば、配列決定により、標的に対する100％のコンセンサス相同性）、完全性（例えば、配列決定により、1％未満の突然変異率）、純度（例えば、CE、シングルバンドの生成物の95％超）、キャッピング効率（HPLC、95％超キャッピングされたmRNA）、残留二本鎖RNA（例えば、FRET/Immunoblot、0.02％未満（1ng））、細菌成分（例えば、HCP ELISA(DNAおよびタンパク質用)、X未満）、細菌成分（例えば、HC-DNA、X未満）、エンドトキシン（例えば、LAL test、0.2EU/ml未満）、バイオバーデン（例えば、微生物限度試験（MLT））等の受け入れ基準を満たす場合、低生物負荷医薬物質とみなされ、医薬品製剤用にリリースされてもよい。
mRNAのANPへの精製
精製されたmRNAは、送達成分と組み合わせてナノ粒子製剤を形成することができる。このプロセスは、図12に描かれている。例えば、mRNAカーゴ（治療用mRNA、本明細書では医薬物質とも呼ばれる）の水溶液は、製剤用マイクロ流路デバイス内のマイクロ流路混合構造において送達ビヒクルのエタノール溶液と組み合わされてもよい。次に、この物質は、まず製剤化された製品中の緩衝成分を交換するためのオンチップ透析工程、次いで医薬品の容量を仕様に合うように減少させるための濃縮工程を含む2つの製剤化後の処理工程を受けることができる。これらの工程をマイクロ流路デバイスベースの製造装置に実装することで、人為的な介入を必要とせず、ヒューマンエラーの可能性を最小限に抑えた高度な製剤化工程の制御を実現することができる。
一般に、例えば、鋳型を合成すること、mRNAを生成するためにIVTを行うこと、mRNAを精製すること、mRNAを送達ビヒクルと結合して治療組成物を形成すること、治療組成物を透析すること、及び／又は治療組成物を濃縮することを含む本明細書に記載の製造方法の構成部分は、上述の図3A～3Cに示すように単一のマイクロ流路デバイス及び／又は複数のマイクロ流路デバイスで行われてもよい。したがって、流路は、連続的または部分的に連続的であってもよい（例えば、鋳型形成、IVT、mRNAの精製、治療用組成物を形成するためのmRNAと送達ビヒクルとの結合、治療用組成物の透析、および／または治療用組成物の濃縮のうちの1つ以上など、製造プロセスの構成部分にわたって連続的である）。すべての場合において、同じコントローラ装置を使用してもよいし、異なるコントローラ装置を使用してもよい。これらの構成部分のそれぞれの生成物は、コントローラ装置内の流体バイアル（例えば、デポ）に貯蔵され、新しいまたは後続のマイクロ流路デバイスに移されてもよい。したがって、これらの方法および装置のいずれにおいても、生成物は大気への露出から保護されてもよい。
ある変形例で上述したように、ペプトイドベースの脂質製剤を薬物ビヒクルとして使用してもよく、これはN-置換ペプチド（すなわちペプトイド）骨格にカチオン基と脂質部分の両方を組み込んでいてもよい。送達ビヒクル成分は、従来の手段によって調達することができる単分散で完全に特性化可能な化学物質であってよい。
mRNA ANP製剤において小さく均一な粒子径を維持するためには、制御された一貫した製剤工程が重要となる場合がある。送達ビヒクル成分は、本明細書に記載の方法および装置により、制御された比率でmRNAと急速に混合される。DV成分の水溶液への曝露、およびカチオン性（＋）脂質とアニオン性（-）mRNAの間の相互作用が、粒子形成の引き金となる可能性がある。この工程は、（粒子サイズ及び均一性を制御するために）本明細書に記載されるマイクロ流路デバイスを使用することによって実施することができる。mRNAは、そのカチオン電荷の原因である送達ビヒクル上の塩基性官能基（アミンなど）の完全なプロトン化を確保するのに役立ち得る酸性緩衝液（pH3～5）に溶解されてもよい。送達ビヒクルは、水混和性有機溶媒（典型的にはエタノール）に溶解してもよく、これにより、水性カーゴ溶液にさらされたときにナノサイズの粒子の形成が促進される。混合直後、溶液のpHは、中性緩衝液によって安定化されてもよい。得られた製剤は、4℃で数週間保存しても、明らかな機能低下は見られない。あるいは、製剤化工程は、ジャストインタイムで、医療現場で実施することができる。
本明細書に記載されるような製剤用マイクロ流路デバイスは、これらの製剤作業を達成するように設計されてもよい。図13には、使用され得るそのようなマイクロ流路デバイスの一般的なアーキテクチャの概略図が示されている。製剤用マイクロ流路デバイスの第1部分は、mRNA及びDV成分の両方を別々のステージングチャンバに予め希釈することを含んでもよい。入力材料は、滅菌されたバーコード付きバイアルからこれらの事前混合チャンバに進められてもよい。mRNA材料は酸性製剤緩衝液で予備希釈され、送達ビヒクル成分はエタノールで希釈される。この段階で、両材料の濃度を調整して、標的DV/mRNA比の要求仕様と、例えば、良好な混合挙動を達成することが以前に示された3：1の水性：エタノール比に一致する体積比とすることができる。
混合構造を含むマイクロ流路デバイスは、材料の混合速度を精密に制御することができる。より速い又はより遅い混合が提供され、（例えば、コントローラによって）制御されてもよい。例えば、混合構造を含むマイクロ流路デバイスは、著しく増加したDV／mRNAの混合速度を提供してもよい。混合プロセスの開始時に、等しい圧力が両方の混合チャンバに適用されてもよく、これにより流体がマイクロ流体構造を通して例えば0.5mL/minで強制的に押し出される。この構造の形状は、およそ3msの急速な混合時間によって決定されてもよい。この条件下では、ペプトイド分子上の水に不溶な脂質ドメインがmRNA水溶液にさらされるため、両親媒性ナノ粒子（ANP）が形成される可能性がある。
混合後すぐに、1:1の中性PBSをインラインで加えてANPを希釈することができる。これにより、酸性製剤緩衝液が中和され、製剤の透析および濃縮の調製が整う場合がある。これらの工程はすべて、マイクロ流路デバイス制御システムにより制御され、再現性の高い粒子径および製剤特性を維持することができる。
このマイクロ流路デバイスを用いることで、医療現場で個人化された治療薬を製剤化することが可能になる。ある例では、治療薬は、T細胞受容体（TCR）またはT細胞受容体の一部によって媒介されるCTCLまたは他の疾患もしくは状態を治療するためのものなどである。個人化治療薬は、患者自身の配列に基づいて特定のmRNA組成物を生成することを含む特定の患者の遺伝的特徴（例えば、遺伝子型）に治療組成物を基づかせることができる。本明細書に記載される方法及び装置はまた、個別化された治療法をも可能にし得るか、又は代替的に可能にし得る。個別化された治療薬は、患者の表現型、例えば、危険因子カテゴリーなどの患者が該当するカテゴリーに基づくものであってよい。したがって、個別化治療薬は、患者のカテゴリーに基づいて、特定の治療薬を患者に適応させてもよい。例えば、マイクロ流体製剤デバイスは、例えば、複数のmRNAを混合して、より大きなライブラリからのmRNAのサブセットから、患者の表現型データから決定され得る各成分の成分および配分（量）に基づき、患者に個別化された治療組成物を生成することを可能にし得る。これらの組成物のいずれかを医療現場で配合し、個人に最適化された治療薬を生成することができる。
製剤化後、医薬品を生成するための処理
製剤化工程でANPが形成されると、製剤用マイクロ流路デバイスでいくつかの後処理が完了することができる。これらには、緩衝液交換及びエタノール除去のための透析、次いで、投薬のために体積を減少させるための蒸発濃縮が含まれ得る。例えば、図14を参照されたい。
得られたナノ粒子は、マイクロ流路デバイス上で（例えば、マイクロ流路デバイス制御システムによって）、例えば動的光散乱（DLS）を用いたサイズ分布、および蛍光を用いた％mRNAカプセル化について分析されてもよい。分析は、主流路から光学的に透明なサンプリングチャンバに流される少量の最終製剤化材料で完了することができる。このチャンバ内では、光ファイバー光源を使用して光散乱測定を行い、粒子径と分散度を決定してもよい。次に、蛍光性mRNA特異的プローブを使用して、洗浄剤の添加による粒子破砕の前後でRNA濃度を測定する。このアッセイにより、投与情報のためのmRNA濃度、およびANPにカプセル化されたmRNAと溶液中の遊離のmRNAの割合が解明されてもよい。例えば、製剤化されたmRNA医薬品を試験するために使用され得る分析方法には、光学的透明度（例えば、目視検査により、可視、凝集物なし、透明溶液）、脂質組成の特徴付け（例えば、HPLCによる）、サイズ（例えば、DLS、80～300nm）、％カプセル化（例えば、蛍光測定による95％超のカプセル化）、分散性（例えば、DLS、PDI＜0.25）、エンドトキシン（例えば、LAL試験、0.2EU/ml未満）、無菌性（例えば、培養（USP）、X cfu未満）、pH（例えば、USP、pH 7.4+/-0.2）、効力（例えば、生物検定/ELISA、X EC50）が含まれ得る。
実施例
上述したように、本明細書に記載の方法および装置は、例えば、皮膚T細胞リンパ腫（CTCL）の治療法を含むmRNA治療法の製造に使用することができる。成熟T細胞は、2つのタンパク質、αβT細胞ではアルファ鎖とベータ鎖、またはδγT細胞ではデルタ鎖とガンマ鎖の組み合わせによって形成される固有のTCRを発現する。各TCR鎖は、遺伝子のV、(D)、J領域をコードする多数のエキソンのいずれかが、V(D)J組換えと呼ばれるプロセスによって結合されることにより、固有の組換え事象によって形成される。このV(D)J組換え事象は準ランダムであり、多数の組合せを生み出すことができるため、TCRの多様性を生み出すことになる。さらに、V(D)J組換えの過程で、エキソン接合部にヌクレオチドのランダムな付加や欠失が起こり、その結果、さらなるTCRの多様性が生まれ、それが個人のTCRレパートリーを形成することになる。次世代技術によって深く配列決定された健常者は、任意の時点で末梢血中に1～5×106種類のTCRを保有していると推定されており、感染がなければ、単一のTCRが全人口の5％以上を占めることは通常ない。T細胞リンパ腫は、単一の悪性T細胞のクローン拡大から発生し、リンパ組織（脾臓やリンパ節）または皮膚、肝臓、胃腸などの他の組織で腫瘍を形成する。
個人のTCRレパートリーを配列し、さらに、T細胞リンパ腫患者のクローン拡大したTCRを診断し同定する別の方法が開発された。一般的に使用されている方法の一つは、増幅バイアスを制御するように慎重に開発されたPCRプライマーのパネルを使用して、TCRβまたはγゲノムの再配置を配列することである。このように、多重PCRは、ターゲットの濃縮と、それに続く次世代シーケンシングとを実行することができる。このような方法は、例えばAdaptive biotechnologies社のImmunoseqアッセイなどで検証されており、診断ツールとして、また最小残存疾患の定量化として臨床で使用されている。もう一つの方法は、ターゲット濃縮を行わずに直接cDNAを深く配列し、有意に過剰発現しているTCR鎖を同定する方法である。リンパ腫TCRの同定は、通常、リンパ腫イディオタイプまたはクロノタイプと呼ばれる。
イディオタイプの判定には、生検を行い、サンプルの配列を決定して、リンパ腫のイディオタイプを特定することができる。患者特異的イディオタイプに関するデジタルデータは、患者特異的なワクチン設計のために使用されてもよい。
mRNAワクチンの設計
mRNAベースの患者特異的がんワクチンの製造は、抗原提示細胞（APC）による特異的かつ免疫学的に有効なエピトープ提示を生成することができる個人化された標的ペプチドに対応するDNA配列の設計から始まってもよい。これを達成するために、最初のステップでは、イディオタイプTCR鎖（αβまたはγδ）から相補性決定領域（CDR）を抽出することが含まれ得る。CDR3領域は、カノニカルTCRに対する配列アライメントを行うことで抽出することができる。CDRは、抗原-MHC複合体への結合を媒介するTCR配列の高度に可変な部分である。特に、V(D)J領域とC領域の接合部にまたがるCDR3領域は最も可変性が高く、リンパ腫細胞にのみ存在するはずの真に固有なタンパク質断片を表している。したがって、例えば、C末端とN末端の両方で10アミノ酸ずつ拡張されたCDR3領域は、図8について上述したように、ワクチンペプチド断片を構成する。
TCRは2本の鎖（αとβ）を持っているので、1人の患者につき2つのCDR3が存在するが、少数例では1つのCDR3しか特定されないこともある。一例として、CDR3αとCDR3βがあると仮定すると、ワクチンペプチドは以下の構造で設計することができる。CDR3α－リンカー―CDR3β、ここで、リンカーは、単鎖可変フラグメント（ScFv）分子の設計に一般的に用いられる標準的なGSGGGSGGGSGGGS配列である。
最終的なワクチンペプチドのアミノ酸配列が特定されると、設計プロセスには、コドンの最適化が含まれる場合があり、この最適化により、（i）高転写、高翻訳され、良好なタンパク質発現につながり、（ii）DNA合成に適し、（iii）鋳型生成ステップに必要なアダプター配列を含み、（iv）制限酵素のように、鋳型生成工程に干渉する配列モチーフを除外することが可能なDNA配列が導き出される。コドン最適化は、例えば、配列GCのバランスをとり、配列の繰り返し、内部プロモータ配列、終止配列、スプライス配列、組換え配列、および内部リボソーム進入部位（IRES）を除去するために行われてもよい。さらに、コドン使用法は、高発現のヒト遺伝子で観察されるものに適合させることができる。使用され得るコドン最適化工程の一例の概略図を、図10に示す。
配列設計が完了したら、最適化された配列を直鎖状DNA分子として合成することができる。IVTのための鋳型は、上記のように調製されてもよい。例えば、IVTによるmRNA合成に先立ち、IVT可能な二本鎖DNA鋳型を生成しておいてもよい。DNA鋳型は、上記図6において述べたように、（i）生産されるべき標的患者特異的ペプチドに対応するコドンのセットとして定義されるタンパク質コード配列（又はCDS）、（ii）5'非翻訳領域（5'UTR）及び3'UTRを含む非コード配列、（iii）エキソヌクレアーゼ活性からmRNAを保護するポリA配列、及び（iv）DNA鋳型をmRNAに転写するRNAポリメラーゼ酵素を勧誘するプロモータ配列からなってもよい。
したがって、鋳型生成プロセスとして、合成直鎖状DNA（例えば、DNA合成業者からの）である患者特異的ペプチドコード配列とIVTに必要な汎用機能要素とを対にすることも可能である。
マイクロ流路デバイスに基づく方法及び本明細書に記載される方法は、鋳型生成を含み、～4日又はそれ以上かかり、（細菌の組換えプロセスによる）可変長のポリAテールをもたらし、細菌タンパク質、細菌DNA及びエンドトキシンのキャリーオーバーのリスクを有する可能性のある現在実施されている細菌培養に基づく方法よりも、はるかに迅速かつ効率的であり得る。対照的に、本明細書に記載の方法及び装置は、1日（～12時間）で実施することができ、一貫したポリAテール（300bpより大きい）をもたらし、宿主核酸又は宿主細胞タンパク質とのいかなる接触も伴わない可能性がある。最終的な二本鎖DNAは、化学的に製造されたヌクレオチドから作られてもよく、したがって、合成起源であると考えることができる。
上述したように、これらの方法は、（i）sGOIとTIFCのライゲーション、およびエキソヌクレアーゼ処理による非ライゲーション物質の除去、（ii）多置換増幅（MDA）という技術によるライゲーション産物の環状増幅、（iii）IIs制限酵素での消化による増幅生成物の直鎖状化、（iv）不純物除去によるチップ上の精製手順の4つのステップを含むことができる。最終ステップとして、精製した鋳型を0.22μmフィルタでろ過してもよい。IVT反応に使用する前に得られた物質の品質を保証するために、収量（例えば、1ug/ulで50ug超、260/280 nm 比＞1.8）、同一性（例えば、100％のコンセンサス相同性）、完全性（例えば、1％未満の突然変異率）、純度（例えば、CEによる単一バンド内の生成物＞95％）、及びエンドトキシン（例えば、＜0.2EU/ml）についての試験を含む、多くの分析試験が実施され得る。
したがって、医薬品は、患者特異的TCRペプチドをコードするmRNAとアジュバントとしてのCpGを1：1の割合で混合したものを含むことができる。核酸ミックスは、RNaseによる分解からmRNAを保護し、また細胞への取り込みと細胞質への放出を促進する役割を果たす200nmのANPに封入することができる。翻訳プロセスが行われる細胞質でmRNAをそのまま利用できることが、有効成分の作用機序に必要である可能性がある。ANPは、核酸成分、カチオン性アミン官能基化ペプトイドNTX-DV-0024および2wt％のPEG-脂質からなり、全体の比率はmRNA：DV＝5：1 w/wである。ANPのサイズ分布は、約200nmのZ平均粒子径を有する単峰性であってもよい。ANPは、リン酸緩衝生理食塩水（0.144mg/mLリン酸カリウム一塩基、9.0mg/mL塩化ナトリウム、0.795mg/mLリン酸ナトリウム二塩基）中に懸濁し、目標pHを7.4とすることができる。すべての製剤用賦形剤は、一般に安全と認められているものでよい。最終製品は無菌で生理学的に等張であり、透過圧は295±20mOsm/kgである。
mRNA自体は魅力的な安全性プロファイルを有しているが、例えば、可視光以下の粒子、宿主細胞タンパク質（HCP）、宿主細胞DNA、プロセス関連の不純物、バイオバーデン、細菌内毒素レベル、無菌、溶出物および抽出物のレベルは、主に安全性に関連しており、確立した安全プロファイルおよび業界標準に従って最小限に抑え制御しなければならないものである。さらに、IVT mRNAの製造に使用される残存鋳型DNA、二本鎖RNA、酵素の存在を排除または最小化することにより、安全かつ有効な製品を確保することができる。
前述のように、本明細書に記載される方法及び装置は、例えば、光オブスキュレーション粒子計数試験、及び／又は顕微鏡的粒子計数試験などの1つ又は複数の手順による粒子状物質の定量分析を含むことができる。要件への適合に関する最終結論に達するために、一部の調剤を光オブスキュレーション粒子計数試験と顕微鏡的粒子計数試験とで試験することが必要である場合がある。ナノ粒子調剤は、噴射剤中に存在する液滴及び／又は粒子集合体による光散乱により本質的に不透明であるため、粒子状物質分析には、ろ過とその後のフィルタの顕微鏡分析が使用されることがある。約1μmと小さい粒子の視覚化を可能にする100±10倍率に調整した光学顕微鏡を使用してもよく、本方法で使用するフィルタの公称孔径は最大1.0μmであり、100nm～250nm範囲の医薬品ナノ粒子は粒子状物質検出に干渉しないであろう。
本明細書に記載された鋳型生成方法は、バクテリアなどの生きた微生物を使用せず、酵素反応と化学的に製造されたヌクレオチドの使用に依存しているため、鋳型およびmRNA生成物は完全に合成されたものである。
最終医薬品中の残留宿主細胞DNAに関して、本明細書に記載の方法及び装置は、最終製剤の用量において10ng／用量未満及び200塩基対未満であってもよい。プロセス関連不純物の存在を最小化することに加えて、製品関連不純物は、製造プロセス、製剤開発及び最適化、並びに本明細書に記載の適切な保存条件の特定を通じて制御され得る。IVT mRNA生成物は、できるだけ早く製造され、投与されることが意図されているが、安定性プロファイルは、少なくとも投与まで定義された許容基準を満たし得る。本明細書に記載される治療薬の適切な安定性を維持するための期間は、冷蔵条件下で少なくとも30日であってよい。
IVT mRNAが細胞質内に入ると、その薬理作用はネイティブmRNAの安定性と翻訳を制御するのと同じ細胞メカニズムに支配される。従って、IVT mRNAの効力は、細胞質でのバイオアベイラビリティに大きく依存し、細胞への取り込みを最大化するような製品の開発に焦点を当てる必要がある。
本明細書に記載される貯蔵容器（例えば、デポ）は、一般に、外部環境から製品を保護し（酸素の侵入及び該当する場合には光分解からの保護を含む）、滅菌可能であり、貯蔵期間を通じて無菌状態が維持されることを保証し、製品の処方と適合し、貯蔵中に製品に浸出性化学物質をほとんど、または全く寄与しないものであってよい。例えば、ハロブチルゴム栓を備えたタイプIのホウケイ酸ガラスバイアルは、製品を適切に保護し、製品の貯蔵期間を通じて無菌性、安全性、有効性が維持されることを保証するものである。
mRNAの発現量を最大化し、細胞生存率への影響を最小化し、良好な生体内分布プロファイルを得るための予備的スクリーニングを行った結果、mRNAの発現量が最大化し、細胞生存率への影響を最小化し、良好な生体内分布プロファイルを得ることができた。この実験では、ホタル・ルシフェラーゼ（Fluc）発現に基づく生物発光アッセイを選択した。このアッセイは、各送達ビヒクル候補のmRNAの取り込みによる遺伝子発現をハイスループットで定量的に測定することが可能である。初期評価のために、36種類のアミノ脂質化ペプトイドを固相ペプトイド合成により合成し、凍結乾燥およびまたは沈殿により単離した。これらの候補材料は、カチオン性ドメインと脂質ドメインの両方に構造的なバリエーションがあった。これらの36の材料をFluc mRNAと異なる比率で、脂質固定化PEG（1,2-ジミリストイル-rac-グリセロ-3-メトキシポリエチレングリコール-2000）2％（w/w）と共に結合させた。HeLa、HepG2、JAWSII樹状細胞など、いくつかの細胞株を処理した結果、6つのリード候補を絞り込むことができた。
送達ビヒクル候補のin vivoでのmRNA発現と生体内分布は、Balb/cマウスに静脈内、皮下、筋肉内に注射した際のFluc発現により定量化した。発現量（in vitro及びin vivo）、生体内分布（in vivo）からNTX-DV-0024を候補として選定し、オバルブミンをコードするmRNAを合成し、モデルワクチンとして評価した。オバルブミンはワクチン接種の観点から非常によく研究されており、エピトープの提示やT細胞反応を追跡する試薬が市販されているため、概念実証のための研究には理想的な候補である。本明細書に記載されるように産生されたOVA mRNAの初期評価は、JAWSIIマウス（C57BL/6）樹状細胞を用いたin vitroモデルで実施された。簡単に言うと、JAWSII細胞を、市販のトランスフェクション試薬（例えば、Lipofectamine2000（商標））を用いてOVA mRNA候補で24時間トランスフェクトし、その後、SIINFEKLエピトープに結合したMHC-I用の蛍光抗体を用いて細胞を染色した。染色された集団の平均蛍光強度（MFI）は、全体的な抗原提示の指標を表す。これは、図15に模式的に記載されている。
このアッセイを用いて、本明細書に記載された方法で製造されたmRNAを、市販の材料と比較評価した。この場合、生産されたmRNAは、市販のコントロールと比較して、MHC-I上のSIINFEKL提示レベルが42％高いという結果を得た。また、デバイス上でのmRNA合成の再現性も実証され、5バッチのOVA mRNA（NTX-RNA-0184）により、同レベルのSIINFEKL+ JAWSII細胞が得られた。
mRNA候補は、マウスin vivo実験でも同様にワクチン候補として評価された。C57BL/6マウスに、市販または製造されたmRNA（本明細書に記載のマイクロ流路デバイスにより製造）および送達ビヒクルを注射（IV）した。注射後7日目に末梢血を分離し、OVAエピトープを認識するT細胞に特異的な蛍光MHC-Iテトラマーを用いて染色した。その後、OVA特異的CD8+ T細胞の割合をフローサイトメトリーにより定量化した。この実験では、前回と同様に、生産されたmRNAによって、末梢血中のOVA特異的T細胞の割合が市販のコントロールに比べて50％増加し、これらの分子のワクチン候補としての強さが示された。
mRNAベースのワクチン（本明細書に記載された方法で製造）のin vivoでの有効性を初めて実証したのは、マウス、OVA発現、EG.7、シンジェニックT細胞リンパ腫モデルであった。このモデルは、適応リンパ腫の生理学的に関連した動物モデルであり、NTX-0565の免疫療法作用機序に関連している。同系マウスモデルは、不死化したマウスのがん細胞株を、同じ近交系背景系統のマウス宿主に移植したものである（ホモグラフト）。同系統の宿主であるマウスは、免疫療法の研究に必要な宿主の抗腫瘍免疫反応を機能的に誘導することが可能である。同系統モデルは、完全なマウス免疫能、腫瘍への免疫細胞の浸潤の多様性、包括的なマウス腫瘍、免疫細胞および間質インタフェース、および遺伝子とタンパク質発現履歴を含む薬理学の研究のための腫瘍同調が容易であることを特徴とする。
マウスE.G7-OVAリンパ腫腫瘍モデルを使用した。E.G7-OVA腫瘍細胞株は、安定かつ強固に発現するOVA抗原を1ゲノムコピー保有するように操作されたEL-4リンパ腫誘導体株である。この方法により、外来性のOVA系抗原に対する特異性の高い免疫反応が可能となり、この腫瘍細胞はがんワクチンの研究に理想的なものとなっている。DNAワクチン、細胞ベースワクチン、siRNAワクチンを用いて、腫瘍の成長抑制が文献上実証されている。最初の有効性試験では、ワクチン成分はOVA抗原をコードするmRNAで、試験デザインはmRNAベースのワクチンを用いたこの動物モデルに関する過去の文献に倣った。無作為化同時陰性対照は、被験物質の送達ビヒクルであるリン酸緩衝生理食塩水を用いて並行して実施された。動物は年齢と性別を一致させ、腫瘍の大きさと体重の平均的な分布を確保するためにグループ割付けを無作為化した。試験薬は、in vivo 試験の責任者がバイアスを受けないように盲検化された。サンプル分析は、分析者のバイアスを排除するために再度盲検化された。試験への受け入れのための包含基準および除外基準は、開始前に提案書で事前に定義された。エンドポイント、観察頻度、スケジュールは、試験開始前に試験計画書で事前に定義された。安楽死基準および動物看護介入は、事前に定義された。
この最初の研究では、本明細書に記載されたmRNAワクチンが統計的に非常に有意な治療効果を有することが示された（図16A～D）。OVA mRNAワクチンをグループ2に静脈内投与したとき、このグループは、腫瘍移植後14日目に統計的に極めて有意な結果を示し始めた（***、p＜0.0005、Neg.Controlに対して、14日目のMultiple Dunnett's Comparison Testで比較）。21日目の腫瘍体積は、グループ2の797mm3に対してグループ1のコントロールでは2000mm3であった（**、21日目のMultiple Dunnett's Comparisons Testによる測定でp＜0.005)。これは、本明細書に記載されるように製造されたmRNAワクチン接種を動物が受けた場合、61.42％の腫瘍成長阻害に換算される（IV）。腫瘍成長阻害（TGI％）は、陰性対照群（群1）が所定のエンドポイント腫瘍体積（2000mm3）に達した移植後21日目に計算された。腫瘍増殖抑制率（％）は、以下の式で定義した。TGI (%) ＝ (TVcontrol group － TVtreated group)/TVcontrol × 100 であり、全てのコントロール動物が終末腫瘍量に達した腫瘍移植後21日目のネガティブコントロールとの相対値である。この腫瘍成長の抑制は、mRNAワクチン接種群の生存率において非常に統計的に有意な増加をもたらし、グループ2、mRNAワクチン接種動物のエンドポイントまでの期間は25日、グループ1、ビヒクル治療動物のエンドポイントまでの期間の中央値は23日であった（*p＜0.01対コントロールに対するログランク検定による測定値）。与えられた用量において、体重および実験室試験結果に基づく観察可能な毒性は観察されなかった。図16A～16Cにおいて、製造されたmRNAベースのワクチンは、マウスリンパ腫E.G7同胞モデルにおいてin vivoでの有効性を示す。個々の動物曲線（図16A、16B）および各グループの平均腫瘍体積（図16C）に見られるように、腫瘍の成長は61.4％阻害された（*p＜0.01）。この腫瘍成長の阻害は、mRNA-ワクチン接種群（図16D）（**、p＜0.01）についての生存の統計的に有意な増加に結びついた。
また、上記の物理的な測定を補足するために、レポーター遺伝子の発現を用いた保存医薬品のin vivo試験も1週間にわたって実施された。この実験では、ホタル・ルシフェラーゼmRNAとNTX-DV-0028の製剤を、1）注射の7日前、2）注射の3日前、3）注射の1時間前に調製した。製剤化後、投与まで4℃で保存した。その後、Balb/cマウスに0.25 mg/kgの用量で尾静脈注射を行い、3種類の材料を投与した。注射後8時間、全身の生物発光を測定し、得られた画像を図17Aに示し、図17Bに定量化した（保存したmRNA製剤を注射した後の全身ルシフェラーゼ発現の定量化した光束を示す）。この1週間の保存実験の間、測定された生物発光の実質的な損失はなかった。3日間および7日間の保存材料はいずれも、注入直前に調合した材料と誤差の範囲内であった。この機能的安定性データは、上記の粒子サイズ安定性データを支持して、本明細書に記載のmRNA製剤が4℃での少なくとも1週間の保存に安定であることを強く示している。
一般に、本明細書に記載されるように送達ビヒクル分子とともにANPに配合されたmRNA医薬物質は、約200nmのサイズを有することがあり、損失を防ぐために最終配合ステップの終了時に0.2ミクロンの無菌フィルタを使用することを排除することが可能である。したがって、最終的なANP医薬品の崩壊を回避しながら無菌リスクを軽減するために、複数の方法的な濾過ステップを製造工程を通して組み入れることができる。図18は、濾過が適用され得る様々な時間を概略的に示している。IVT反応の前に、精製された鋳型及び個々のIVT試薬（dNTP、酵素等を含む）の両方を、0.22umフィルタを通して濾過してもよい（図18のAおよびB）。mRNAの生産がIVTマイクロ流路デバイスで完了した後、すべての入力材料は最終製剤化ステップ（ANPが形成される）の前に濾過されることになる。これらには、医薬薬物物質（mRNA、例えば、図18のC）、アジュバント（CpG）、両親媒性ペプトイド送達ビヒクル成分および緩衝液（図18のD）、DMG-PEG2000送達ビヒクル成分（図18のD）、および透析緩衝液（図18のE）などが含まれる。入力材料の0.22ミクロン濾過に加えて、最終的な両親媒性ナノ粒子医薬品を0.45ミクロンフィルタで濾過して、粒子状または凝集材料を除去してもよい（図18のF）。この大きな濾過ステップは、ANPの破壊を防ぎ、最終的な医薬品の有効性を維持するのに役立つ可能性がある。
上述の目立たない濾過ステップを補足するために、本明細書に記載のマイクロ流路デバイス制御システムは、例えば本明細書に記載のように、鋳型調製、in vitro転写（IVT）、両親媒性ナノ粒子（ANP）への送達ビヒクルとの配合、及び緩衝液交換と濃度ステップなどの医薬品製造に必要な操作を行う1以上の密封されたマイクロ流路デバイスを用いて最終医薬品の安全性と滅菌性を確保できるよう動作するように設計することができる。これらのマイクロ流路デバイスは、温度制御されたクラス5のラミナーフード内に存在し、さらに、例えば、クラス7の6×6クリーンルームに収容されてもよい。mRNAリアクタ（複数可）は、人および外部環境から保護された自動化装置であってもよい。試薬および製品の流路は、単回使用の滅菌ヌクレアーゼフリーチューブを使用して、加圧された滅菌容器からリアクタのコアに送達されてもよい。最終製品製剤および医薬品は、完全閉鎖系で上記のような多層マイクロ流路デバイス（複数可）内で製造することができる。
透過型インサート
本明細書に記載されるマイクロ流路デバイスのいずれも、治療材料の溶液（又は治療材料が形成されている溶液）を処理するための1つ又は複数の透過性インサートを含んでもよい。透過性インサートは、マイクロ流路デバイス内のチャンバの流体接触側に挿入されてもよい。そして、チャンバの流体接触側に入る又は通過する流体が、透過性インサートを通過しなければならず、これによって、透過性インサートによって改質されるように構成されてもよい。任意の適切な透過性インサートが使用されてもよい。例えば、透過性インサートは、望ましくない物質を除去するように構成された材料を含んでもよく、ある例では、透過性インサートは、一本鎖RNA（ssRNA）の治療溶液から二本鎖RNA（dsRNA）を除去するように構成されたセルロース材を含む。
図19Aは、チャンバ1957の流体接触面内に透過性インサート1969を含むマイクロ流路デバイス1900の一例を示す図である。図19Aにおいて、マイクロ流路デバイス1900は、少なくとも1対のチャンバ1953、1957、1957'を含んでもよく、これらの各々は、マイクロ流路デバイスの厚さに形成されてもよい流体接触側1917、圧力（例えば、ガス）側1919、流体接続、圧力接続及び流体／圧力ラインを含んでもよい。ある変形例では、チャンバは対になっており、一対のチャンバの各チャンバは、流体コネクタ1955によって互いに接続されてもよい。流体コネクタ1955は、チャンバ（複数可）の圧力側に加えられる正圧及び／又は負圧と連携して、2つのチャンバ間の液体側で液体を駆動し、この液体をチャンバのそれぞれ内で混合するために使用されてもよい。チャンバは、弾性材料（例えば、弾性層又は膜）によって分枝されてもよく、チャンバの固定体積内で弾性材料を偏向させると、チャンバの液体接触側（例えば、2つのチャンバの間）の中に／外に液体内の任意の液体を駆動させることができる。
マイクロ流路デバイス1900は、複数の対のチャンバを含んでもよく、そのうちのいずれかが透過性インサートを含んでもよい。各対のチャンバは、異なる処理に使用されてもよい。例えば、第1の対のチャンバ1953は、RNAの合成のために使用されてもよい。第2の対のチャンバ1957、1957'は、合成されたポリヌクレオチドの精製に使用されてもよい。それぞれのチャンバの圧力受容側1919に圧力を加え、第1の対のチャンバ1953と第2の対のチャンバ1957との間のバルブ1959を開くことにより、第1の対のチャンバ1953からの流体は、第2の対のチャンバに駆動されてもよい。バルブチャンバ1959は、2対のチャンバの間のコネクタチャネル内の弾性層1907によって形成されてもよい。
図19A及び図19Bに示すようなマイクロ流路デバイス1900は、複数の圧力ポート1943及び複数の流体ポート1923を有してもよい。複数の圧力ポート及び複数の流体ポートは、マイクロ流路デバイスの周縁部に隣接して配置されてもよく、上述したように流体インタフェースアセンブリ209に接続されるように構成される。
流体ポート1923から駆動される試薬の送達のタイミングを制御し得るが、1つ以上の同様に構成されたバルブと直列に配置された場合、装置のチャンバへの計量も可能にし得るバルブ1961について、図19Aに示されるような接続チャネル1939（圧力チャネルまたは流体チャネルのいずれか）の長さに沿って、ポート（例えばシールバルブ）を弾性層から形成することも可能である。例えば、図19Aでは、3つのバルブチャンバが示され（以下でより詳細に説明する）、これらの3つのバルブのうちの最初のバルブは、蠕動ポンプとして作用してもよく、一方、真ん中のバルブは、小さい（例えば、約10nL、20nL、25nL、50nL、75nL、100nL等の計量体積を有する）計量チャンバであってもよい。チャネルのサイズ、特にチャネルに接続されたチャンバのサイズ）は、流体接続チャネル1939、1921に沿って分注され、流体接続チャネル1939、1921に接続されているチャンバ1953に送達される体積を計量することが可能である。ある変形例では、計量された体積は、50nL程度であってよい。約100nL、1マイクロリットル、5マイクロリットルまたはそれ以上の計量された容積が移入されてもよい。様々なバルブサイズが、マイクロ流路デバイス1900内に組み込むために予め選択されてもよく、試薬は、ユーザの選択によって適切な計量サイズに接続されてもよい。
さらに、複数のバルブ体1961が流体接続チャネル1939に沿って一列に含まれていてもよい。一連のバルブ体1961は、粘性流体（これらに限定されない）を含む流体を移動させるための蠕動ポンプとして作用してもよい。一般に流体に対して蠕動ポンプとして機能する能力は、粘性であるか、又は精製若しくは捕獲ビーズなどの浮遊粒子を含む可能性のある流体を移動させるために特に有利である場合がある。
前述のように、マイクロ流路デバイス1900はまた、送達または移送リザーバまたはデポ1963を含んでもよい。図19Aにおいて、予め選択された容積は、上述したチャンバ構造と同様に形成されてもよく、または所望により計量側のみを含んでもよい。いずれの場合においても、バルブは、リザーバ1963への所望の体積を計量するために使用されてもよい。バルブ1965は、リザーバ1963からの流体の送達を制御し得る。より大きな体積が所望される場合、送出が繰り返されてもよい。代替的に、リザーバ1963が移送リザーバであるように予め選択されていた場合、バルブ1965は開き、チャンバ1957から流体を送り出し、一方、バルブ1967は閉じたままであり、これは、リザーバ1963に移送される流体の測定体積のみを許容する。この流体は、その後、さらなる処理または試験のために試薬収納フレーム上の流体バイアルに移送されてもよい。ある変形例では、チャンバ、リザーバ又はデポ（例えば、1963）は、例えば、3つのバルブ構造（1967、1965、1967）により形成される1μLポンプの計量部として構成されてもよい。チャンバは、例えば、混合チャンバ1957からの廃棄物の移送のために構成されてもよい。
マイクロ流路デバイス1900は、密閉された経路構造であってもよい。流体バイアル、流体ラインおよびマイクロ流路デバイスが接続されている間、装置の動作は、システムの内外、特にポリヌクレオチド（RNA）の合成および生物学的送達（薬剤、ワクチンなどの治療として）の調製を含む処理のためのマイクロ流路デバイスの流路の内外での物質の交換なしに実行することができる。したがって、システム全体が閉じた経路として動作してもよく、および／または個々のマイクロ流路デバイスが閉じた（大気から保護された）経路としてシステム内で動作してもよい。
一般に、これらのマイクロ流路デバイスは、チャンバまたはチャネルの流体側1917内に1つまたは複数の透過性インサート1969を組み込むことを含むことができる。透過性インサートは、チャンバ又はチャネル内の流体混合物から選択された部位（例えば、選択された材料）を吸収するように構成されることができる。吸収された材料は、溶液から精製される不要な材料であってもよいし、溶液から除去されて後に溶出され、さらに処理される所望の材料であってもよい。一変形例では、インサートの透過性材料は、混合物から二本鎖mRNAを選択的に吸収することができるセルロース材料を含んでもよい。セルロース材料は、一対のチャンバのうちの1つのチャンバのみに挿入されてもよく、このように、第1のチャンバの透過性インサートに流体を混合又は通過させると、二本鎖RNAが流体混合物から効果的に除去され、その後、さらに下流の別の一対のチャンバに移送して、さらに処理又は移送することができるようにしてもよい。
マイクロ流路デバイス1900のある変形例は、チャンバ内に濃縮器をさらに含んでもよく、このチャンバは、第2プレートの厚さ内に配置されてもよく、1949などの出口チャネルと流体連通することができる。ポリヌクレオチドは、過剰な流体媒体を追い出すことによって濃縮されてもよく、濃縮されたポリヌクレオチド混合物は、さらなる取り扱い又は使用のためにマイクロ流路デバイス1900の外に移送される。ある変形例では、濃縮器は、透析チャンバであってもよい。例えば、透析膜は、マイクロ流路デバイスのプレート内またはプレート間に存在してもよい。
マイクロ流路デバイス1900は、可視光及び／又は紫外線に対して少なくとも実質的に半透明である材料で形成されてもよい。実質的に半透明とは、半透明な材料と比較して、少なくとも90％の光が透過することを意味する。ある変形例では、マイクロ流路デバイス1900は、可視光及び／又は紫外線に対して実質的に半透明である材料で形成されてもよい。実質的に半透明であるとは、完全に透明な材料と比較して、少なくとも90％の光が材料を透過することを意味する。
マイクロ流路デバイスは、チャンバおよび／またはチャネルがプレート間に形成されるように互いに重ねられた2つ以上のプレートで形成されてもよく、第1プレートと第2プレートとの間に弾性材料が挟まれてもよい。第1プレート及び／又は第2プレートは、剛性のある材料から形成されてもよい。プレートは、同じ材料で形成されてもよいし、異なる材料（複数可）で形成されてもよい。例えば、剛性材料は、ポリマーまたはガラスであってもよい。ポリマーまたはガラスは、生体適合性であってよく、例えば、生体細胞に対して有毒なモノマーまたは可溶性小分子を溶出しない。医療グレードのポリカーボネートウレタン、シリコーンポリカーボネートウレタン、ポリエーテルウレタンなどを含む、任意の適切な生体適合性ポリマーが使用されてもよい。ある変形例では、ポリマーは、シクロオレフィンコポリマーであってもよい。
図19Bは、マイクロ流路デバイスの一部を通る断面を示し、弾性材料1907によって流体接触側と圧力受容側1919に分枝されたチャンバ1920の流体接触側1917内の透過性インサート1969を示す。このように、マイクロ流路デバイスは、より剛性の高い2つの層1903、1905に、柔軟な膜1907を挟み込んだ多層構造として構成することができる。図19Bは、本明細書に記載されるように、治療薬を処理するためのリアクタを形成する複数の層を有するマイクロ流路デバイスの一例を通る断面図（マイクロ流路デバイスの平面に対して横向き）の一部を示している。リアクタは、シール、チャネル、バルブ、及び複数の層から形成されるポンピングチャンバを含むチャンバを含んでもよい。例えば、マイクロ流路デバイスは、2つ以上の剛性又は半剛性プレート1903、1905及び少なくとも1つの弾性層1907から形成されてもよい。弾性層1907は、液体不透過性である弾性材料のシートであってよい。弾性層は、ガス透過性であり、又は、様々な領域を含めて、ガス透過性になるように処理されてもよい。弾性材料として単一の連続したシートを使用してもよいが、ある変形例では、複数の弾性材料シートを使用してもよく、または「シート」は複数のシートの部分から形成されてもよい。また、層と弾性体シートとが積層されていてもよい。一般に、弾性層が液体を含む側と圧力（例えば、気体）を加える側とにチャンバを二分するように、弾性層の両側のプレートに、流体を保持、バルブ化および／または圧送するためのチャンバが形成されてもよい。チャンバ（複数可）の全体容積は一定で、第1（例えば、上）プレートと第2（例えば、下）プレートの両方に形成されてもよいが、この容積は圧力側と液体側に分割されてもよい。圧力側に正圧または負圧を加えることにより、弾性シートを変形させて、液体を含む側の容積を小さく（ゼロにし、チャンバを閉鎖）したり、液体を含む側の容積を（所定の最大値まで）大きくしたりしてもよい。また、1つ以上のチャンバの圧力受容側1919に負圧または正圧を加えるために、例えば、上プレート1903に設けられた圧力ポート1943を介して、圧力チャネル1947に接続してもよい。また、各チャンバの圧力印加側と反対側の液体含有側1917は、流体流路1921を介して流体ポート1923に接続されていてもよい。流体ポートおよび圧力ポートの両方が、上部プレート1903および弾性層1907への開口部によって形成されてもよく、圧力ラインが、反対側の剛性または半剛性層（複数）1905、1909によってポートの下側で支持されている弾性層1907に押し込まれるため、複数の異なる入力ラインがある場合でも大気から隔離された密封接続が可能である。
図19Bにおいて、マイクロ流路デバイス1900は、第1（例えば、上または上部）面1911と、第2（下または下部）面1929と、両者の間の厚さとを有する第1（例えば、上部）プレート1903を含む。第1面1911は、露出した外面を形成してもよい。マイクロ流路デバイスは、第1（例えば、上部又は上）面1931と、第2（例えば、下部又は下）面1933と、その間の厚さとを有する第2プレート1905も含む。弾性層1907は、第1プレート1903の第2面1929と第2プレート1905の第1面1931との間に挟まれる。この例では、第3プレート1909が、第2プレートの第2面1933上で、直接的または間接的に第2プレートに結合される。第3プレート1909も、第1（例えば、上部または上）面と、第2（下部または下）面と、その間の厚さとを有する。第3プレートの第2面は、マイクロ流路デバイスの底面を形成してもよい。いずれのプレートも、複数の層で形成されてもよく、これらの層は、積層されるか、または他の方法で連結されてもよい。例えば、図19Bにおいて、第3プレート1909は、第3プレートを第2プレートに結合するのを助け得るオプションの第2弾性層1913を含み、この例における第2弾性層1913は、第3プレート1909の第1面1935を形成する。図19Bに示される層及びプレートは、縮尺通りでなくてもよい（例えば、弾性層1907は、プレートに対してより薄くてもよい）。
また、図19Bに示すマイクロ流路デバイス1900は、それぞれが一定の容積を有する複数のチャンバ1915、1916、1918、1920を含んでもよい。これらのチャンバは、第1プレート1903の第2（下）面1929及び第2プレート1905の第1（上）面1931への切り込み領域（例えば、丸み／曲線カット）により形成され、弾性層1907は、それぞれが液体含有側1917及び圧力受容（例えば、ガス含有）側1919を含むようにこれらのチャンバ1915を分枝させる。マイクロ流路デバイス1900はまた、複数の液体（例えば、流体）チャネルを含んでもよい。図19Bでは、単一の流体チャネル1921が、第1プレート1903の厚さを貫通する液体ポート1923から、弾性層1907を通る液体チャネル開口部1925に延び、第2プレート1905の厚さをほぼ貫通して、第2プレートの下面1933に至る。第3プレートの下面と平行に延びる液体チャネル1921は、第3プレートの上面を境として、第2プレートの下面1933にその長さが形成される。
流体ポート1923に関して、流体ポート1923を形成する第1プレート1903への開口部のうち、第1プレートの厚さを貫通して延びる直径は、弾性層1907を貫通して液体（例えば、流体）チャネル1921に延びる流体チャネル開口部1925の直径より大きくてもよい。流体チャネル開口部1925は、流体ポート開口部の底部に対して中央に配置されてもよく、少なくとも、流体ポートに接続することになる流体ライン又は流体ライン結合インタフェースの予想壁厚だけ流体ポート開口部の壁からオフセットされてもよい。
流体チャネル1921は、第1チャンバ1915の液体含有側1917に接続する。この第1チャンバは、比較的低い保持容積（固定容積）を有するが、弾性層1907の移動によって完全に開閉することができるバルブとして構成されてもよい。
マイクロ流路デバイス1900はまた、正圧及び／又は負圧をかけるために独立して制御され得る複数の圧力チャネルを含む。図19Bでは、第4チャンバ1920に接続された単一の圧力ポート1943が示されているが、チャンバ1915、1916、1918の各々は、これらのチャンバを分枝する弾性層1907の部分の動きを独立して操作及び制御し、各チャンバを独立してバルブ、及び／又はポンプするための別々の圧力ポート及び圧力チャネルに接続してもよい。ある変形例では、圧力ポートを複数のチャンバ間で共有してもよい。図19Bにおいて、圧力（例えば、気体）ポート1943は、流体（例えば、液体）ポート1923と同様であり、第1プレート1903を完全に貫通して露出した弾性層1907に至る開口部を含み、圧力（例えば、気体）チャネル開口部1945を形成する弾性層を通って開口部に至る。圧力チャネル開口部1945は、第1プレート1903の厚さをほぼ貫通する圧力ポート1943から延び、第2プレートの底部に沿った（または代替的に第3プレートの上部の切り出し領域である）切り出しチャネルであり、第2プレートおよび弾性層1907を通って、第4チャンバ1920の圧力（例えば、ガス）含有部1919に連なる第1プレート内の圧力チャネルの領域に戻る圧力チャネル1947と連続している。同様の流体（例えば、液体）ポートについて説明したように、第1プレート1903の厚さを貫通する圧力ポート1943の直径は、弾性層1907を貫通する圧力チャネル開口部1945の直径より大きくてもよく、中央に配置されてもよいし、圧力ポートに接続することになる圧力ラインまたは圧力ライン結合インタフェースの壁厚よりも大きくオフセットされて配置されてもよい。
図19Bに示すマイクロ流路デバイス1900を通る断面では、他の流体（例えば、液体）ライン、流体ポート、圧力ライン及び圧力ポートへの複数の接続があるが、それらは示された平面から外れているので図示されていない。例えば、図19Bにおいて、第4チャンバの液体含有側／部1917は、例えば、液体含有側1917から延びる出口チャネルを含む追加のバルブ（チャンバ）及び／又はチャネルに接続されてもよい。図示しない追加のチャンバ（例えば、バルブとして構成されたもの）は、上述したように形成されてもよい。ある変形例では、出口チャネルは、1つ以上のチャンバから別の流体ポート（図示せず）を介して流体受容デポ、例えばバイアル、チューブなどに流体を送達してもよい。この受容デポは、試薬収納フレームに保持されてもよい。
上述のように、透過性インサート1969は、分離チャンバの流体接触側に挿入され、チャンバの圧力受容側から流体接触チャンバを分離する弾性材料によって圧縮されるように構成されてもよい。この例では、（例えば、このチャンバに宛てられた圧力ポートを介して）圧力受容側に加えられる正圧または負圧は、弾性材料を偏向させて流体接触側の容積を変化させることができる。流体は、透過性インサート1969を有するチャンバ1920内に駆動されてもよく、流体は、インサートを通過して溶液を改質してもよい。透過性インサートが圧縮可能である変形例では、圧縮してチャンバから流体を除去し、排出してもよい。ある変形例では、透過性インサートはその後、拡張して（または拡張を許容して）拡張した構成に戻り、流体を再び通過させてもよく、またはさらなる処理を行なってもよい。
本明細書に記載の透過性インサートは、一般に、治療材料を含む（または治療材料が形成されている）溶液を改質するために使用され得る。図20Aは、本明細書に記載される装置のいずれかを用いて、流体（例えば、RNAサンプル）中の治療材料を処理する方法の一例を模式的に示す図である。例えば、本方法は、最初に、マイクロ流路デバイス（又は1つ以上のマイクロ流路デバイス）をマイクロ流路デバイス制御システムに取り付けること2001を含んでもよい。このステップは、マイクロ流路デバイスを圧力源に結合することを含んでもよい。ある変形例では、このステップ（または追加のステップ）は、マイクロ流路デバイスをRNAなどの治療材料の供給源に結合させることを含んでもよい。任意選択的に、ある変形例では、方法は、in vitro転写によって治療用RNAを生成するなど、マイクロ流路デバイスにおいて、治療材料を合成すること2003を含んでもよい。
この方法は、治療材料（例えば、RNA）を有する試料を、透過性インサートを含む処理チャンバの流体接触部分まで搬送することをさらに含んでもよい。例えば、これは、試料をマイクロ流路デバイスの分離チャンバの流体接触側に移送するために圧力を加えること2005を含んでもよい。ある変形例では、治療物質（又は推定治療材料）を含む流体をチャンバの流体接触側に駆動するために、マイクロ流路デバイス内の弾性材料（例えば、弾性膜）を偏向させることによって圧力を加えることができる。このステップの一部として、流体（治療用／仮治療用を含む）試料を分離チャンバの流体接触側内の透過性インサートに通過させて、試料を改質すること2007ができる。例えば、治療薬／仮治療薬の物質が、透過性インサートと相互作用することによって添加されたり除去されたりすることがある。
最後に、例えば、チャンバの流体接触側をチャンバの圧力受容側から分離する弾性膜などの弾性材料をたわませることによって、分離チャンバの流体接触側からサンプルを移送するために圧力を加えてもよい2009。
図20Bは、本明細書に記載の装置のいずれかを用いて、流体中の治療材料（例えば、RNAサンプル）を処理する方法の具体例を示す図である。例えば、図20Bにおいて、方法は、二本鎖RNA（dsRNA）及び一本鎖RNA（ssRNA）の両方を含むRNA試料からdsRNAを除去する方法であってよい。この変形例では、方法は、マイクロ流路デバイスを圧力源に結合すること2011を含んでもよい。ある変形例では、これは、治療用RNAの供給源にマイクロ流路デバイスを結合すること、及び／又は、前述2013のように、マイクロ流路デバイスにおいて治療用RNAのin vitro転写を実行することを含んでもよい。次いで、本方法は、圧力をかけてRNA試料をマイクロ流路デバイスの分離チャンバの流体接触側に移送すること2015を含んでもよい。次いで、RNAサンプルは、分離チャンバの流体接触側内にあるコラーゲンを含む固体で透過性のインサートを通過してもよく2017、これによって、セルロースはdsRNAを結合し、dsRNAがインサートによって保持される。その後、圧力をかけて、RNAサンプルを分離チャンバの流体接触側から移送し、ssRNAを治療溶液内に残すことができる2019。このステップは、すべて又は実質的にすべてのdsRNAを除去するために、必要に応じて繰り返されてもよい。
前述したように、その後、さらなる処理（送達ビヒクルとの結合、透析、濃縮など）が行われてもよい。
本明細書に記載される装置は、1つ以上の隔離室を含むことができ、及び／又は1つ以上の隔離室と共に使用することができる。例えば、ある変形例では、本明細書に記載の装置は、例えば、対象への送達のために治療用ポリヌクレオチドを製造し得る治療用ポリヌクレオチド製造「工場」の一部であってよい。治療用ポリヌクレオチドは、例えば、治療用mRNAであってもよい。図21A～21Bは、工場装置としてそれ自体で使用されてもよいし、並行製造装置の一部として使用されてもよい装置の一例を示す。図21Aにおいて、装置（複数可）2101、2101'は、クラス5の隔離キャビネット2103を含んでもよいし、その中に保持されてもよく、隔離キャビネットは、それ自体、クラス7の隔離空間内に保持されてもよい。図21Aにおいて、キャビネットは、2つのマイクロ流体制御装置2101、2101'を含む。この装置は、患者による使用のために治療用mRNAなどの治療用ポリヌクレオチドを迅速に自動製造しうるコピーエグザクトGMPユニットを提供する組立工場の一部であってよい。これらの装置は、高度に再構成可能であり、迅速な展開と低コストの生産を可能にすることができる。ある変形例では、オンデマンド製造「工場」ユニットとして配備される場合がある。ある変形例では、これらの装置は、遠隔地に一時的または長期的に配備される移動ユニットの一部として設定される場合がある。
本明細書において、ある特徴または要素が他の特徴または要素「上」にあると言及される場合、それは他の特徴または要素上に直接存在することができ、または介在する特徴および／または要素も存在することができる。対照的に、特徴又は要素が他の特徴又は要素上に「直接」存在すると言及される場合、介在する特徴又は要素が存在しない。また、特徴又は要素が他の特徴又は要素に「接続されている」、「取り付けられている」又は「結合されている」と言及される場合、他の特徴又は要素に直接接続、取り付け、又は結合されることができ、又は介在する特徴又は要素が存在してもよいことが理解されるであろう。対照的に、特徴又は要素が別の特徴又は要素に「直接接続されている」、「直接取り付けられている」又は「直接結合されている」と言及される場合、介在する特徴又は要素が存在しない。一実施形態に関して説明又は図示したが、そのように説明又は図示した特徴及び要素は、他の実施形態に適用することができる。また、別の特徴に「隣接して」配置される構造又は特徴への言及は、隣接する特徴に重なる部分又は下敷きになる部分を有し得ることも、当業者には理解されよう。
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するだけのためのものであり、本発明を限定することを意図するものではない。例えば、本明細書で使用される場合、各構成要素は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数でもよい。本明細書で使用される場合、用語「含む」及び／又は「含んで」は、述べられた特徴、ステップ、操作、要素、及び／又は成分の存在を規定するが、1つ以上の他の特徴、ステップ、操作、要素、成分、及び／又はそれらの群の存在又は追加を排除しないことがさらに理解されるであろう。本明細書で使用される場合、用語「及び／又は」は、関連する記載項目の1つ以上の任意の及び全ての組み合わせを含み、「／」と略記されることがある。
本明細書では、説明を容易にするために、「下に」、「より低い所に」、「下部に」、「上に」、「上部に」などの空間的に相対的な用語を使用して、図に示されるように、ある要素または特徴の別の要素（複数可）または特徴に対する関係を説明することができる。空間的に相対的な用語は、図に描かれた向きに加えて、使用又は動作中の装置の異なる向きを包含することを意図していることが理解されよう。例えば、図中のデバイスが反転されている場合、他の要素又は特徴の「下」又は「下方」として説明される要素は、その後、他の要素又は特徴の「上」に配向されるであろう。したがって、例示的な用語「下」は、上と下の両方の配向を包含することができる。装置は、他の向き（90度回転した、又は他の向き）であってもよく、本明細書で使用される空間的に相対的な記述子は、それに応じて解釈される。同様に、用語「上向き」、「下向き」、「垂直」、「水平」などは、特に指示しない限り、説明の目的でのみ本明細書で使用されている。
本明細書では、様々な特徴／要素（ステップを含む）を説明するために「第1」及び「第2」という用語を用いることがあるが、文脈から別段の指示がない限り、これらの特徴／要素はこれらの用語によって限定されるべきではない。これらの用語は、ある特徴／要素を別の特徴／要素から区別するために使用されてもよい。したがって、後述する第1の特徴／要素は、第2の特徴／要素と称され得、同様に、後述する第2の特徴／要素は、本発明の教示から逸脱することなく第1の特徴／要素と称され得る。
本明細書およびそれに続く特許請求の範囲を通じて、文脈上他に必要とされない限り、単語「含む」は、方法および物品（例えば、デバイスおよび方法を含む組成物および装置）において、種々の構成要素が共働的に採用され得ることを意味している。例えば、用語「含む」は、任意の記載された要素またはステップを含むが、他の要素またはステップを排除しないことを意味すると理解されるであろう。
一般に、本明細書に記載される装置及び方法のいずれも包括的であると理解されるべきであるが、構成要素及び／又はステップの全て又はサブセットは代替的に排他的であってもよく、種々の構成要素、ステップ、サブコンポーネント又はサブステップ「のみからなる」又は代替的に「のみから本質的になる」として表現されてもよい。
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、実施例で使用される場合を含め、他に明示的に指定されない限り、すべての数値は、その用語が明示的に現れない場合でも、「約」または「およそ」という単語が前置きされているかのように読み取ることができる。語句「約」又は「およそ」は、大きさ及び／又は位置を説明するときに使用され、説明された値及び／又は位置が、値及び／又は位置の妥当な予想範囲内にあることを示すことができる。例えば、数値は、記載された値（又は値の範囲）の±0.1％、記載された値（又は値の範囲）の±1％、記載された値（又は値の範囲）の±2％、記載された値（又は値の範囲）の±5％、記載された値（又は値の範囲）の±10％等の値を有することができる。また、本明細書で示されるいかなる数値も、文脈がそうでないことを示していない限り、その値について、約又はおよそその値を含むと理解されるべきである。例えば、値「10」が開示されている場合、「約10」もまた開示される。本明細書で言及される任意の数値範囲は、そこに包含されるすべてのサブ範囲を含むことが意図される。また、値が開示されている場合、当業者によって適切に理解されるように、「その値以下」、「その値以上」、および値の間の可能な範囲もまた開示されていることが理解される。例えば、値「X」が開示されている場合、「X以下」だけでなく、「X以上」（例えば、Xは数値である）も開示されている。また、本願を通じて、データは、多くの異なるフォーマットで提供され、このデータは、データポイントの任意の組み合わせの終点と始点、および範囲を表すことが理解される。例えば、特定のデータ点「10」と特定のデータ点「15」が開示されている場合、10と15の間だけでなく、10より大きい、10以上、10より小さい、10以下、および10及び15と同等が開示されていると見なされることが理解される。また、2つの特定の単位の間の各単位も開示されていると理解される。例えば、10と15が開示されている場合、11、12、13、および14も開示されている。
以上、様々な例示的な実施形態を説明したが、特許請求の範囲によって説明される本発明の範囲から逸脱することなく、様々な実施形態に対して多数の変更のうちのいずれかを行うことができる。例えば、様々な説明された方法ステップが実行される順序は、代替の実施形態においてしばしば変更されてもよく、他の代替の実施形態において、1つまたは複数の方法ステップが完全にスキップされてもよい。様々なデバイス及びシステムの実施形態のオプションの特徴は、ある実施形態に含まれ、他の実施形態には含まれないことがある。したがって、前述の説明は、主に例示的な目的のために提供され、特許請求の範囲に規定される本発明の範囲を制限するように解釈されるべきではない。
本明細書に含まれる例および図解は、例示であって限定ではなく、主題が実施され得る具体的な実施形態を示す。言及したように、他の実施形態が利用され、そこから派生して、本開示の範囲から逸脱することなく、構造的及び論理的置換及び変更がなされ得るようにすることができる。本発明主題のそのような実施形態は、本明細書において、単に便宜上、「発明」という用語で個別にまたは集合的に参照されることがあり、複数の発明が実際に開示されている場合、本願の範囲を任意の単一の発明または発明概念に自発的に限定する意図はない。したがって、本明細書では特定の実施形態が図示され、説明されているが、同じ目的を達成するように計算された任意の配置が、示された特定の実施形態に置き換えられ得る。本開示は、様々な実施形態の任意の及び全ての適応又は変形をカバーすることを意図している。上記の実施形態の組み合わせ、及び本明細書に特に記載されていない他の実施形態は、上記の説明を検討すれば、当業者には明らかであろう。

Claims (99)

1つ以上のマイクロ流体経路デバイスと密封流体連通するように固定されるように構成された複数の流体デポを含むシステムを用いて治療用ポリヌクレオチドを製造する方法であって、該方法は、合成鋳型を形成するステップ、鋳型からin vitro転写を行って治療用ポリヌクレオチドを生成するステップ、および治療用ポリヌクレオチドを精製するステップを行うために、大気との接触から保護された密閉された閉鎖流路で複数の流体デポの1つまたは複数のリアクターの間で試薬を移送するステップを含む、方法。
治療用ポリヌクレオチドを精製することが、複数の反応器のうちの1つまたは複数の反応器内で治療用ポリヌクレオチドを二次元（2D）精製することを含む、請求項1に記載の方法。
治療用ポリヌクレオチドを、1つまたは複数のマイクロ流路デバイス上の1つまたは複数のリアクターにおいて送達ビヒクルとともに処方して、治療用ポリヌクレオチド組成物を形成することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
治療用ポリヌクレオチド組成物を1つまたは複数のマイクロ流路デバイスに濃縮することをさらに含む、請求項3に記載の方法。
送達ビークルが両親媒性ナノ粒子を含む、請求項3に記載の方法。
両親媒性ナノ粒子が、アミノ脂質化ペプトイドを含む、請求項5に記載の方法。
治療用ポリヌクレオチドを精製することが、1つまたは複数の反応器内でセルロース材料を用いて二本鎖mRNAを除去することを含む、請求項1に記載の方法。
システムが、合成鋳型の形成、鋳型からのin vitro転写の実行、および治療用ポリヌクレオチドの精製のステップを、システムの1つまたは複数のセンサーからの光フィードバックによって自動的にかつ連続的に実行する、請求項1に記載の方法。
治療用ポリヌクレオチドがmRNAである、請求項1に記載の方法。
治療用ポリヌクレオチドが、mRNA、環状RNA、または自己複製RNAである、請求項1に記載の方法。
システムが、1つ以上の流体デポと複数の反応器との間で流体動力によって試薬を輸送する、請求項1に記載の方法。
システムが、1つ以上の流体デポと複数の反応器との間で試薬を空気圧で輸送する、請求項11に記載の方法。
システムが、1つ以上のマイクロ流体経路デバイス内の1つ以上の弾性層を偏向させることによって、1つ以上の流体デポと複数の反応器との間で試薬を輸送する、請求項1に記載の方法。
請求項1に記載の方法であって、本方法が医療現場で実施されることを特徴とする方法。
合成鋳型を形成するステップ、鋳型からin vitro転写を行って治療用ポリヌクレオチドを生成するステップ、および治療用ポリヌクレオチドを精製するステップを3日以内に自動的にかつ連続的に行う、請求項1に記載の方法。
流体デポを1つ以上のマイクロ流体経路デバイスに密封し、流体デポと1つ以上のマイクロ流体経路デバイス上の複数の反応器との間で試薬を輸送する前に流体デポを加圧することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
ステップの実行中に1つまたは複数のマイクロ流路デバイス内の流体の動きを、製造される治療用ポリヌクレオチドに関連するファイルに記録することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
請求項1に記載の方法を用いて製造された治療用ポリヌクレオチド。
1つ以上のマイクロ流体経路プレート装置と密封流体連通して固定されるように構成された複数の流体デポを含むシステムを用いて治療用mRNAを製造する方法であって、1つ以上のマイクロ流体経路プレート装置が複数のリアクターを含み、
鋳型前駆体材料を1つまたは複数の流体貯蔵所から複数の反応器のうちの第1の1つまたは複数の反応器領域に供給し、鋳型前駆体材料を処理して鋳型前駆体材料から鋳型を調製するステップと
該鋳型を複数のリアクターのうちの第2の1つ以上のリアクター領域に移送し、該鋳型をインビトロ転写によって処理して、治療用mRNAを形成することステップ、および
治療用mRNAを複数の反応器のうちの第3の1つ以上の反応器領域に移送し、第3の1つ以上の反応器領域内で2次元（2D）精製によって治療用mRNAを精製するステップを含み、
ここで、すべての方法ステップが、鋳型および治療用mRNAを大気中の接触にさらすことなく行われる方法。
1つ以上のマイクロ流体経路プレート装置と密閉流体連通している複数の流体デポを含むシステムを用いて治療用mRNAを製造する方法であって、1つ以上のマイクロ流体経路プレート装置が複数の反応器を含み、
流体動力を用いて、1つまたは複数の流体デポから複数のリアクターの第1の1つまたは複数のリアクター領域に鋳型前駆体材料を供給し、鋳型前駆体材料を処理して、鋳型前駆体材料から鋳型を調製し、
流体力を用いて、鋳型を複数のリアクターのうちの第2の1つまたは複数のリアクター領域に移送し、インビトロ転写によって鋳型を処理して治療用mRNAを形成し、
治療用mRNAを、流体力を用いて、複数の反応器のうちの第3の1つ以上の反応器領域に移送し、第3の1つ以上の反応器領域内で2次元（2D）精製によって治療用mRNAを精製し、
流体力を用いて、治療用mRNAを複数のリアクターのうちの第4の1つ以上のリアクター領域に移送し、治療用mRNAを送達ビヒクルでカプセル化して、治療用mRNA組成物を形成し、および
流体力を用いて、治療用mRNA組成物を第5の1つまたは複数の流体デポに濃縮し、
ここで、すべての方法ステップが、鋳型および治療用mRNAを大気中の接触にさらすことなく実施される、方法。
治療用ポリヌクレオチドを製造するための命令を具現化した非一時的コンピュータ可読媒体であって、1つまたは複数のマイクロ流体経路デバイスと密封流体連通して固定されるように構成された複数の液体デポを含むシステムのコントローラによって実行すると、
1つまたは複数のマイクロ流体経路デバイスと流体連通している複数の流体デポを加圧し、
複数の流体デポのうちの1つまたは複数の流体デポと、1つまたは複数のマイクロ流体経路デバイス上の複数の反応器との間で試薬を、大気との接触から保護される密閉された閉鎖流体経路で輸送し、
合成鋳型を形成するステップと、
該鋳型からインビトロ転写を行い、治療用ポリヌクレオチドを生成するステップと
治療用ポリヌクレオチドを精製するステップを実行するステップとをコントローラに実行させることを特徴とする、非一時的コンピュータ可読媒体。
前記命令が、前記システムの1つまたは複数の光センサーからの光フィードバックに基づいて、前記合成鋳型を形成するステップ、前記鋳型からin vitro転写を行うステップ、および前記治療用ポリヌクレオチドを精製するステップを自動的にかつ継続的に行うように、コントローラにさらに行わせることを特徴とする、請求項21に記載のコンピュータ可読媒体。
前記命令が、前記コントローラに、前記複数の反応器のうちの1つまたは複数内での二次元（2D）精製による前記治療用ポリヌクレオチドの精製を制御させる、請求項21に記載のコンピュータ可読媒体。
前記命令が、さらに、コントローラに、1つまたは複数のマイクロ流路デバイス上の1つまたは複数の反応器において、送達ビークルとともに治療用ポリヌクレオチドを処方して治療用ポリヌクレオチド組成物を形成させる、請求項21に記載のコンピュータ読取可能媒体。
前記命令が、前記コントローラに、前記治療用ポリヌクレオチド組成物を前記1つまたは複数のマイクロ流体経路デバイスに濃縮させることをさらに特徴とする、請求項21に記載のコンピュータ可読媒体。
請求項21記載のコンピュータ可読媒体において、前記命令は、前記コントローラに、前記1つ以上の流体デポと前記複数の反応器との間で試薬を流体動力によって輸送することをさらに行わせることを特徴とするコンピュータ可読媒体。
前記命令は、前記コントローラに、前記1つまたは複数のマイクロ流体経路デバイス内の1つまたは複数の弾性層を偏向させることによって、前記1つまたは複数の流体デポと前記複数の反応器との間で試薬を輸送することをさらに行わせる、請求項21に記載のコンピュータ可読媒体。
前記命令が、合成鋳型を形成するステップ、鋳型からin vitro転写を行って治療用ポリヌクレオチドを生成するステップ、および治療用ポリヌクレオチドを5日未満で精製するステップを自動的にかつ連続的に行うように、コントローラにさらに命令する、請求項21に記載のコンピュータ可読媒体。
前記命令が、前記コントローラに、前記ステップの実行中の前記1つまたは複数のマイクロ流路デバイス内の流体の動きを、製造される前記治療用ポリヌクレオチドに関連するファイルに記録させることをさらに特徴とする、請求項21に記載のコンピュータ可読媒体。
1つ以上のマイクロ流体パスデバイスと密封流体連通するように固定されるように構成された複数の流体デポを含むクローズドパスシステムを使用してmRNA合成用の合成二本鎖DNA鋳型を作成する自動化方法であって、
複数の流体デポのうちの1つまたは複数の流体デポと、1つまたは複数のマイクロ流体経路デバイス上の複数の反応器との間で試薬を、大気との接触から保護される閉じた流体経路で輸送し、試薬を結合するステップ、および
治療用mRNAをin vitroで転写するための合成二本鎖DNA鋳型を形成するステップを含む方法。
合成二本鎖DNA鋳型が、細菌DNAを含まず、かつエンドトキシンを含まない、請求項30に記載の方法。
閉経システムのコントローラにおいて、閉経システムの1つ以上のセンサから光センサデータを受信することをさらに含み、コントローラが、光センサデータに基づいて閉経システムの動作を制御する、請求項30に記載の方法。
流体デポを加圧することをさらに含む、請求項30に記載の方法。
試薬を輸送することが、対象の合成遺伝子および合成体外転写促進剤カセットを複数の流体デポのうちの1つまたは複数の流体デポからマイクロ流体経路装置内の第1の1つまたは複数の反応器に輸送し、対象の合成遺伝子を合成体外転写促進剤カセットと接合して合成産物を作成し、合成産物から未反応物を取り除き、合成産物を増幅して合成二本鎖DNA鋳型を発生することを備える、請求項30に記載の方法。
前記1つ以上のマイクロ流体パスデバイスが、前記クローズドパスシステムに着座したマイクロ流体パスプレートデバイスからなる、請求項30に記載の方法。
マイクロ流路デバイスと密閉流体連通している複数の流体デポを含むクローズドパスシステムを使用して、in vitro転写用の合成二本鎖DNA鋳型を製造する自動化方法であって、
目的の合成遺伝子および合成体外転写促進剤カセットを含む試薬を、複数の流体デポのうちの1つまたは複数の流体デポから、大気との接触から保護された閉鎖流体経路でマイクロ流体経路デバイスの第1の1つまたは複数の反応器へ輸送すること、
目的の合成遺伝子と合成体外転写促進剤カセットとを結合して合成物を作成すること、
合成産物をマイクロ流路装置内で搬送して、未反応の合成目的遺伝子および未反応の合成体外転写促進剤カセットを合成産物から遠ざけること、および
合成産物をマイクロ流路デバイスで搬送し、合成産物を増幅して二本鎖DNA鋳型を生成すること、を含むことを特徴とする方法。
合成産物を増幅することにより、1mM以上の増幅DNA鋳型を生成する、請求項36に記載の方法。
合成二本鎖DNA鋳型が、細菌DNAを含まず、かつエンドトキシンを含まない、請求項36に記載の方法。
閉経システムのコントローラにおいて、閉経システムの1つ以上のセンサから光学センサデータを受信することをさらに含み、コントローラが、光学センサデータに基づいて閉経システムの動作を制御する、請求項36に記載の方法。
流体デポを加圧することをさらに含む、請求項36に記載の方法。
搬送ステップはそれぞれ、複数の流体デポとマイクロ流体経路デバイスとの間、またはマイクロ流体経路デバイス内で材料を移動させるために1つ以上の流体動力回路を使用することを含む、請求項36に記載の方法。
増幅されたDNA鋳型をマイクロ流路デバイスの1つ以上の消化リアクターに移し、増幅された合成産物を酵素的に修飾して二本鎖DNA鋳型を生成することをさらに含む、請求項36に記載の方法。
合成目的遺伝子と合成体外転写促進剤カセットとを接合して合成産物を作成することが、合成直鎖状または環状の結紮産物を作成することを含む、請求項36に記載の方法。
合成産物を増幅することが、直鎖状、分岐状または円形の増幅DNA産物を生成することを含み、増幅DNA産物を直鎖化して二本鎖DNA鋳型を生成することをさらに含む、請求項36に記載の方法。
接合することが、DNAリガーゼでライゲーションすることを含む、請求項36に記載の方法。
接合は、アニーリングまたはプライマー伸長からなる、請求項36に記載の方法。
増幅することが、多重置換増幅（MDA）を含む、請求項36に記載の方法。
増幅することが、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅を含む、請求項36に記載の方法。
合成in vitro転写促進剤カセットが、プロモーター、5'UTR、切断可能なリンカー、3'UTR、および少なくとも200個のアデニン残基または200個のチミジン残基が並んでなるポリA領域をコードする部分を含む二本鎖DNA鋳型からなる、請求項36に記載の方法。
二本鎖DNA鋳型が、目的の合成遺伝子の3'末端に少なくとも300bpsの長さのポリA領域を含む、請求項36に記載の方法。
前記in vitro転写促進剤カセットの長さが1kb未満である、請求項36に記載の方法。
合成体外転写促進剤カセットが抗生物質耐性遺伝子をコードしていない、請求項36に記載の方法。
前記in vitro転写促進剤カセットが、複製起点（ORI）を有さない、請求項36に記載の方法。
マイクロ流路デバイスと密閉流体連通している複数の流体デポを含むクローズドパスシステムを使用して、in vitro転写用の合成二本鎖DNA鋳型を製造する自動化方法であって、
目的の合成遺伝子および合成体外転写（IVT）促進剤カセットを含む試薬を、複数の流体デポのうちの1つまたは複数の流体デポから、大気との接触から保護された閉鎖流体経路でマイクロ流体経路デバイスの第1の1つまたは複数の反応器へ輸送すること、
目的の合成遺伝子と合成IVT促進剤カセットを最初の1つ以上の反応器内で結合させ、合成産物を生成すること、
合成産物をマイクロ流体経路装置内の第2の1つ以上の反応器に搬送し、未反応の合成目的遺伝子および未反応の合成IVT促進剤カセットを合成産物から離すこと、
合成産物をマイクロ流路デバイスの第3の1つ以上の反応器に輸送し、合成産物を増幅して、1mMを超える増幅DNA鋳型を生成すること、および
閉経システムのコントローラにおいて、閉経システムの1つ以上のセンサからの光センサデータを受信し、コントローラが、光センサデータに基づいて閉経システムの動作を制御することを含むことを特徴とする方法。
マイクロ流路デバイスと密閉流体連通している複数の流体デポを含むクローズドパスシステムを使用して、in vitro転写用の合成二本鎖DNA鋳型を製造する自動化方法であって、
第1の流体動力回路を用いて、目的の合成遺伝子と合成体外転写（IVT）促進剤カセットを、複数の流体デポのうちの1つまたは複数の流体デポから、大気との接触から保護されている閉鎖流路のマイクロ流路プレートデバイスの1つまたは複数の接合反応器へと輸送し、目的の合成遺伝子をIVT促進剤カセットに接合して合成生成物を生成すること、
第2の流体動力回路を用いて、未反応の合成目的遺伝子および未反応の合成体外転写促進剤カセットを、マイクロ流路プレート装置内の合成産物から除去すること、
第3の流体動力回路を用いて、合成産物をマイクロ流路デバイスの1つ以上の増幅リアクターに移送し、合成産物を増幅して、1mMを超える増幅DNA鋳型を生成すること、および
閉経システムのコントローラにおいて、閉経システムの1つ以上の光学センサから光学センサデータを受信し、コントローラが、光学センサデータに基づいて第1、第2および第3の流体動力回路を制御し、複数の流体デポおよびマイクロ流路デバイスを閉経および密閉環境に維持することを含む請求項1に記載の方法。
1つ以上のマイクロ流体経路デバイスと密閉流体連通するように固定されるように構成された複数の流体デポを含むシステムを用いて、体外転写（IVT）反応を行う自動化方法であって、前記複数の流体デポのうちの1つ以上の流体デポと、前記1つ以上のマイクロ流体デバイス上の複数の反応器との間で試薬を、大気との接触から保護された閉鎖流路で輸送し、前記1つ以上のマイクロ流体パスデバイスにおいて鋳型から治療用mRNAの体外転写を行い、治療ポリヌクレオチドを精製することを含む方法。
システムが、マイクロ流体経路デバイス内の1つ以上の弾性層を偏向させることによって試薬を輸送するステップを実行する、請求項56に記載の方法。
システムのコントローラにおいて、システムの1つ以上のセンサから光学センサデータを受信することをさらに含み、コントローラが、光学センサデータに基づいてシステムの動作を制御することを特徴とする、請求項56に記載の方法。
流体デポを加圧することをさらに含む、請求項56に記載の方法。
マイクロ流体経路デバイスが、システムに着座したマイクロ流体経路プレートデバイスを含む、請求項56に記載の方法。
ケアの現場で実行される、請求項56に記載の方法。
DNA鋳型が、目的の合成遺伝子の二本鎖DNA鋳型と合成in vitro転写促進剤カセットからなる、請求項56に記載の方法。
マイクロ流体経路デバイスと密封流体連通するように固定されるように構成された複数の流体デポを含むシステムを用いて体外転写（IVT）反応を行う自動化方法であって、
DNA鋳型、ポリメラーゼ、およびヌクレオチドを、複数の流体デポのうちの1つまたは複数から、マイクロ流体経路デバイスの1つまたは複数のIVTリアクターに供給すること、
1つまたは複数のIVTリアクターにおいて、DNA鋳型およびヌクレオチドを処理して、治療用mRNAを形成すること、および
治療用mRNAをマイクロ流路デバイスの1つ以上の精製リアクター領域に移送し、1つ以上の精製リアクター領域内で2次元（2D）精製によって治療用mRNAを精製すること、
前記マイクロ流路デバイスと前記複数の流体デポは、大気暴露を防止する閉路・密閉環境を形成することを特徴とする方法。
閉経システムのコントローラにおいて、閉経システムの1つ以上のセンサから光学センサデータを受信することをさらに含み、コントローラが、光学センサデータに基づいて閉経システムの動作を制御する、請求項63に記載の方法。
流体デポを加圧することをさらに含む、請求項63に記載の方法。
送達ステップおよび輸送ステップがそれぞれ、コントローラによって制御される1つまたは複数の流体動力回路を使用して、DNA鋳型、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、および治療用mRNA材料を複数の流体デポとマイクロ流体経路デバイスとの間またはマイクロ流体経路デバイス内で移動することを含む、請求項63に記載の方法。
送達ステップおよび搬送ステップが、コントローラの制御下で、方法中に大気接触を避けるためにマイクロ流体経路デバイス内の1つ以上の弾性層を偏向させることによって実行される、請求項63記載の方法。
マイクロ流体経路デバイスが、システムに着座したマイクロ流体経路プレートデバイスを含む、請求項56に記載の方法。
ケアの現場で実行される、請求項63に記載の方法。
IVT反応器が、それぞれが液体受容部分と圧力受容部分とを有する一対の接続されたチャンバを備え、液体受容部分が圧力受容部分から弾性層によって分離されており、液体受容部分の容積を調節するために圧力受容部分によって偏向され得る、請求項63に記載の方法。
DNA鋳型が、目的の合成遺伝子の二本鎖DNA鋳型と合成in vitro転写促進剤カセットからなる、請求項63に記載の方法。
前記複数の流体デポを、前記マイクロ流体経路デバイス上の複数の受入ポートと流体連通して密封することをさらに含む、請求項63に記載の方法。
マイクロ流体経路デバイスと密封流体連通するように固定されるように構成された複数の流体デポを含むシステムを用いて体外転写（IVT）反応を行う自動化方法であって、
前記複数の流体デポを加圧すること
1つまたは複数の第1の流体電源回路を使用して、DNA鋳型、ポリメラーゼ、およびヌクレオチドを、複数の流体デポのうちの1つまたは複数からマイクロリットル以下の精度で計量された量でマイクロ流体経路デバイスの1つまたは複数のIVTリアクターに供給すること、
1つ以上のIVTリアクターにおいて、鋳型材料およびヌクレオチドを処理して、治療用mRNAを形成すること、および
第2の流体動力回路を用いて、治療用mRNAをマイクロ流体経路デバイスの1つ以上の精製リアクター領域に移送し、1つ以上の精製リアクター領域内で2次元（2D）精製によって治療用mRNAを精製すること、
前記マイクロ流路デバイスと前記複数の流体デポは、大気暴露を防止する閉路・密閉環境を形成することを含む、方法。
体外転写（IVT）反応を行うための命令を具現化した非一過性のコンピュータ可読媒体であって、1つ以上のマイクロ流体経路デバイスと密封流体連通するように固定されるように構成された複数の流体デポを含むシステムのコントローラによって実行されると、コントローラに
鋳型物質、ポリメラーゼ、およびヌクレオチドを、複数の流体貯蔵庫からマイクロ流路デバイスの第1の反応器に、反応中の任意の時間にサブマイクロリットルの精度で計量して空気圧で供給すること、
第1の反応器において鋳型材料およびヌクレオチドを処理して、治療用mRNAを形成すること、および
治療用mRNAをマイクロ流体経路装置を通して第1の反応器から離れるように空気圧で移送すること、を実行させることを特徴とし、
前記第1のマイクロ流路デバイスと前記複数の流体デポは、大気暴露を防ぐためにクローズドパスと密閉された環境を形成する、非一過性のコンピュータ可読媒体。
1つ以上のマイクロ流体経路プレート装置と密封流体連通している複数の流体デポを含むシステムを用いて治療用mRNA組成物を製造する方法であって、1つ以上のマイクロ流体経路プレート装置が複数の反応器を含み、
鋳型前駆体材料を複数の流体貯蔵所の1つまたは複数の流体貯蔵所から複数の反応器のうちの第1の反応器に供給し、鋳型前駆体材料を処理して、鋳型前駆体材料からDNA鋳型を形成し、
DNA鋳型を複数の反応器のうちの第2の反応器に移送し、インビトロ転写によってDNA鋳型を処理して治療用mRNAを形成し、
治療用mRNAを複数の反応器のうちの第3の反応器に移送し、治療用mRNAを処理して送達ビヒクルと組み合わせ、治療用mRNA組成物を形成し、および
治療用mRNA組成物を、第3の反応器と流体連通している濃縮器に移送する方法。
治療用mRNAを第3の反応器に移送することが、複数の異なる治療用mRNAを送達ビヒクルと共に移送してmRNA組成物を形成することを含む、請求項75に記載の方法。
送達ステップおよび移送ステップが、コントローラによって制御される、システム内の1つまたは複数の流体動力回路によって実行される、請求項75に記載の方法。
コントローラが、1つ以上のマイクロ流体経路プレートデバイス内の1つ以上の弾性層を偏向させることによって流体動力回路を制御する、請求項77に記載の方法。
ケアの現場で実行される、請求項75に記載の方法。
治療用mRNAを送達ビヒクルと組み合わせることが、mRNA治療用組成物を精製するために1つ以上のマイクロ流体経路プレート装置内で透析することをさらに含む、請求項75に記載の方法。
送達ビークルが両親媒性ナノ粒子を含む、請求項75に記載の方法。
両親媒性ナノ粒子が、アミノ脂質化ペプトイドを含む、請求項81に記載の方法。
前記第2の反応器と流体連通している前記複数の反応器のうちの1つ以上の反応器内で、二次元（2D）精製によって治療用mRNAを精製することをさらに含む、請求項75に記載の方法。
治療用mRNA組成物の製造方法が72時間以下である、請求項75に記載の方法。
複数の反応器の第1の反応器は、複数のマイクロ流体経路プレートデバイスの第1のマイクロ流体経路プレートデバイス上にあり、複数の反応器の第3の反応器は、第2のマイクロ流体経路プレートデバイス上にある、請求項75に記載の方法。
システムのコントローラにおいて、システムの1つ以上のセンサから光学センサデータを受信することをさらに含み、コントローラが、光学センサデータに少なくとも部分的に基づいて閉経路システムの動作を制御することを特徴とする、請求項75に記載の方法。
1つ以上のマイクロ流体経路プレート装置と密封流体連通している複数の流体デポを含むシステムを用いて治療用mRNA組成物を製造する方法であって、1つ以上のマイクロ流体経路プレート装置が複数の反応器を含み、
前記複数の流体デポを加圧すること、
鋳型前駆体材料を複数の流体貯蔵所の1つまたは複数の流体貯蔵所から複数の反応器のうちの第1の反応器にマイクロリットル以下の精度で、かつ大気との接触なしに供給するために、第1の流体電源回路を制御すること、
鋳型前駆体材料を処理して、鋳型前駆体材料からDNA鋳型を形成すること、
第2の流体動力回路を制御して、DNA鋳型を複数のリアクターのうちの第2のリアクターに、マイクロリットル以下の精度で、大気と接触することなく移動させること、
治療用mRNAを形成するために、in vitro転写によってDNA鋳型を処理すること、
第3の流体動力回路を制御して、治療用mRNAを複数の反応器のうちの第3の反応器に、マイクロリットル以下の精度で、大気と接触することなく移送すること、
治療用mRNAを処理し、それを送達媒体と結合させて治療用mRNA組成物を形成すること、
治療用mRNA組成物を第3の反応器と流体連通している濃縮器に移送するために、第3の流体動力回路を制御すること、および
治療用mRNA組成物を濃縮することを含む方法。
治療用ポリヌクレオチド組成物をオンデマンドで製造する方法であって、
ローカル施設で、リモート施設で合成された治療用ポリヌクレオチドを受け取ること、
大気との接触から保護された自動化システムにおいて、
治療用ポリヌクレオチドを、システム内に保持されたマイクロ流路デバイスにおいて送達媒体と結合させ、治療用ポリヌクレオチド組成物を形成させること、
マイクロ流路装置内で治療用ポリヌクレオチド組成物を透析することを行うことにより、該ローカル施設において治療用ポリヌクレオチド組成物を製剤化すること、および
治療用ポリヌクレオチド組成物を提供することを含む、方法。
治療用ポリヌクレオチドを合成することが、大気との接触から保護された閉鎖流路装置において、合成鋳型を形成する工程、合成鋳型からインビトロ転写を行って治療用ポリヌクレオチドを形成する工程、および治療用ポリヌクレオチドを精製する工程を行うことにより遠隔施設のマイクロ流体システムを用いて治療用ポリヌクレオチドを合成することからなる、請求項88に記載の方法。
現地の施設が病院または診療所である、請求項88に記載の方法。
治療用ポリヌクレオチド組成物を濃縮することをさらに含む、請求項88に記載の方法。
前記ローカル施設において前記配達物を受け取ることをさらに含む、請求項88に記載の方法。
治療用ポリヌクレオチド組成物が、mRNAワクチンを含む、請求項88に記載の方法。
治療用ポリヌクレオチドを処方することが、システムを使用することを含み、システムが、マイクロ流体経路デバイスと密封流体連通して固定されるように構成された複数の流体デポを含む、請求項88に記載の方法。
治療用ポリヌクレオチドと送達ビヒクルとを組み合わせるステップが、治療用ポリヌクレオチドおよび送達ビヒクルを複数の流体デポからマイクロ流体経路デバイスの1つまたは複数の反応器にサブマイクロリットルの精度で、大気接触なしに送達するために第1の流体動力回路を用いることを含む、請求項92に記載の方法。
局所施設において治療用ポリヌクレオチド組成物を製剤化することが、1つまたは複数の追加の治療用ポリヌクレオチドを治療用ポリヌクレオチドおよび送達ビークルと組み合わせることをさらに含む、請求項88に記載の方法。
治療用ポリヌクレオチドが、mRNA、環状RNA、または自己複製RNAである、請求項88に記載の方法。
治療用組成物を製剤化する前に、治療用ポリヌクレオチドを現地施設に保管することをさらに含む、請求項88に記載の方法。
治療用mRNA組成物をオンデマンドで製造する方法であって、
治療用mRNAを遠隔地で合成すること、
治療用mRNAを現地の施設に輸送すること、
大気との接触から保護された自動閉鎖型流体経路装置において、
治療用mRNAと送達媒体をマイクロ流路装置で結合して、治療用mRNA組成物を形成すること、
治療用mRNA組成物をマイクロ流体経路装置内で透析することを行うことにより、該ローカル施設において治療用mRNA組成物を調合すること、および
治療用mRNA組成物を提供することを含む方法。
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