KR20050041999A - 짧은 이중 나선 ｒｎａ의 인비트로 합성을 위한 방법 - Google Patents

짧은 이중 나선 ｒｎａ의 인비트로 합성을 위한 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 짧은 이중-나선 RNA의 합성 분야에 관한 것이다. 박테리오파지 중합효소 및 주형으로서 표적 서열-특이적 단일-나선 DNA 올리고뉴클레오티드를 사용한 인비트로 전사 방법을 개시한다. 본 발명은 환자에서 전사후 유전자 사이런싱 및 무척추 및 척추동물계에서 RNA 간섭동안에 서열-특이적 RNA 분해를 유발하는 주요 중간체로서 기능을 나타내는 짧은 간섭 RNA(siRNA)의 합성에 특히 유용한 용도를 확인하였다.

Description

짧은 이중 나선 ＲＮＡ의 인비트로 합성을 위한 방법{METHOD FOR THE IN VITRO SYNTHESIS OF SHORT DOUBLE STRANDED RNAs}
본 발명은 짧은 이중 나선 표적-특이적 RNA의 합성 분야에 관한 것이다. RNA 중합효소와 주형으로서의 표적 서열-특이적 DNA 올리고뉴클레오티드를 사용한 인비트로(in vitro) 전사 방법이 개시되어 있다. 본 발명은 식물에서의 전사후 유전자 사일런싱(silencing)과 무척추와 척추동물계에서 RNA 간섭 동안의 서열-특이적 RNA 분해를 유도하는 중요한 중간체로서의 기능을 나타내는 짧은 간섭 RNA(short interfering RNA: siRNA)의 합성에서 특히 이로운 용도를 발견하였다.
RNA 사이런싱은 서열특이적 표적화와 RNA의 분해에 기초한 주목할만한 형태의 유전자 조절이다. RNA 사이런싱은 형질전환 식물에서 최초로 발견되었으며, 공억제 또는 전사후 유전자사이런싱(PTGS)이라고 명명되었다. 최근에 PTGS와 관련된 서열-특이적 RNA 분해 과정, RNA 간섭(RNAi)이 섬모충, 균류 및 선충(C. elegans)에서 쥐 및 인간세포에까지 이르는 다양한 동물에서 발견되었다. 그들은 세부적으로 다를 수 있음에도 불구하고, RNAi와 PTGS는 원시적 기원을 나타내는 같은 고도로 보존된 메커니즘에 의해 생긴다. 기본적 과정은 인식을 안내하고 상동 mRNA의 표적화된 절단을 하는 작은 이중 나선 간섭 RNA(small double stranded interfering RNAs: siRNAs)로 절단되는 이중 나선 RNA(dsRNA)를 포함한다. 이 작은 dsRNA는 RNAe Ⅲ-유사 소화의 분해 산물과 닮았다. 특히, siRNA 는 표적-특이적 짧은 이중 나선 RNA이며, 여기서 siRNA의 각각의 나선은 5'일인산, 3'수산기 말단과 2-3개의 뉴클레오티드의 3'돌출부(overhang)을 운반한다 (Caplen, N. 등, 2001, PNAS (98) 9742-9747).
RNAi는 유전자 분석을 위해 이전에는 보정할 수 없었던 종에서 특히 유용한, 특이적 유전자 활성의 녹아웃 수단이기 때문에, 상당한 관심을 끌고 있다. 최근 연구에서 합성 siRNA는 선충 및 인간 및 마우스의 셀라인에서 발현의 유전자-특이적 저해를 유도할 수 있음이 증명되었다(Caplen N., 등, 2001, PNAS (98) 9742-9747; Elbashir S., 등, 2001, Nature (411) 494-498). 상기 문헌에서, 포유동물 세포에서 일반적으로 단백질 합성의 억제를 유도하는, 번역인자 eIF2α를 불활성화 하는 긴 dsRNA의 사용에 비하여, siRNA가 서열 특이적 해답을 제공하는 것을 추가적으로 증명하였다. 또한 안티센스 기술을 사용한 유전자 발현의 저해와 비교하여, siRNA는 매우 안전하고, 따라서 인비보 반감기를 증가시키는데 필요한 단일 나선 RNA 안티센스 올리고뉴클레오티드의 광범위한 기술적 변경이 필요하지 않을 수 있다.
따라서, siRNA를 사용한 RNA 사이런싱은 유전자 발현의 유전공학적 조절 뿐만 아니라 기능적 게놈학(genomics) 및 분자 파밍(farming) 에서 동물에서 유전자 치료에서도 가능한 중요한 도구가 될 수 있다고 기대된다. 다른 siRNA들이 그의 표적에 다른 유효성으로 작용함에 따라, 특정 표적에 대한 하나 이상의 siRNA의 테스팅이 필요할 수 있다. 또한 게놈-규모 반전 유전학 프로그램이 다수의 siRNA를 필요로 할 수 있다.
그러나, 전통적인 화학 합성에 의한 이중 나선 표적-특이적 RNA 올리고의 생산은 DNA 올리고 합성에 비하여 상대적으로 느리고 고가이다. 또한 RNA 올리고의 화학 합성은 특정 합성기 및 복잡한 정제 프로토콜이 필요하다. 본 발명은 박테이로파지 또는 다른 바이러스 중합효소 및 표적 서열-특이적 올리고뉴클레오티드 주형을 사용하여 인비트로 전사에 기초한 짧은 이중 나선 표적-특이적 RNA를 생산하는 대안적인 접근을 제공한다. RNA 올리고의 화학적 합성에 비하여, 본 발명은 상대적으로 작동하기에 빠르고 쉽다.
그러나, 인비트로 전사된 siRNA는 화학적으로 합성된 RNA 올리고와 두가지 면에서 다르다. 우선, 천연적으로 발생하는 siRNA와 동일하게, 화학적으로 합성된 RNA 올리는 5'모노포스페이트기를 갖는다. 인비트로 전사된 siRNA는 5'트리포스페이트기를 보유한다. 이 트리포스페이트기의 존재가 RNA 간섭을 유도하기위해 인비트로 전사된 siRNA가 부적격함을 부여하는지 여부는 알려지지 않았다.
둘째로, 화학적으로 합성된 RNA 올리고(oligos)는 다른 이온 교환 및 역상 HPLC를 사용하여 고도로 정제하며, 합성된 화합물의 순도 및 품질은 다른 NMR 및 메스 스펙트로메트리 분석을 사용하여 더 평가된다. 본 발명에서, 간단하고, 숙련되지 않은 프로토콜이 크기 제외 크로마토그라피, 페놀: 클로로포름 추출 및 에탄올 침전을 포함하여 사용된다. 또한 광범위의 정제 프로토콜의 생약이 RNA-매개된 사일런싱에서 "인비트로" 전사된 RNA의 유용성에 어떠한 영향을 미치는지는 명확하지 않다.
놀랍게도, 본 발명은 5'트리포스페이트기 및 조잡한 정제가 "인비트로" 전사된 RNA의 RNA 사일런싱 활성에 영향을 미치지 않고, 평균 분자 생물학 실험실에서 연구 도구로서 사용할 수 있는 siRNA 합성의 대안적 접근을 제공할 수 있음을 증명하였다.
한정된 길이 및 서열의 합성된 작은 단일 나선 RNA를 합성하기 위한 존재하는 인비트로 방법(MilliganF. 등, 1987, Nucleic Acid Res. (15)8783- 8798)은 작은 간섭 RNA의 합성에 직접 적용할 수 없다. 문제점은 RNA 중합효소가 프로모터 서열로부터 전사물(transcript)내로 수개의 뉴클레오타이드를 전사하는 경향이 있다는 사실에 존재한다. 그 결과, 상기한 방법을 사용하여 생성된 상보적 단일 나선 RNA 분자를 어닐링에 의해 생산될 수 있는 표적-특이적 dsRNA는 프로모터 서열로부터 전사된 5'말단 뉴클레오타이드 및 프로모터 서열로부터 전사된 뉴클레오타이드에 상보적인 3'말단 뉴클레오타이드를 포함하야만 한다. 표적 서열의 mRNA내에 한정된 서열 길이의 신장이 아마 존재하지 않을 수도 있고, 여기서, 5'-말단은 프로모터 서열로부터 전사된 뉴클레오타이드로 구성되고, 3'-말단은 프로모터 서열로부터 전사된 뉴클레오타이드에 상보적인 뉴클레오타이드로 구성된다. 본 발명은 프로모터 서열의 주형 나선의 5'말단에서 하나 이상 뉴클레오타이드를 표적-특이적 서열의 일부인 뉴클레오타이드에 의해 대체된, 절단된 RNA 중합효소 프로모터 서열을 제공함에 의해 상기 문제점을 해결하였다. 상기 대체는 인비트로 전사 수율에 어떠한 영향을 미치지 않고, 한정된 서열 길이의 적어도 하나의 표적-특이적 서열이 표적 단백질의 mRNA내에 존재할 가능성을 증가시키고, 여기서, 5'-말단은 프로모터 서열로부터 전사된 뉴클레오타이드로 구성되고, 3'-말단은 프로모터 서열로부터 전사된 뉴클레오타이드에 상보적인 뉴클레오타이드로 구성된다.
본 발명의 상기 및 다른 면을 이하 기술한다.
도 1은 올리고뉴클레오타이드 생산도이다. JNK2α1 mRNA의 코팅 서열내의 19개의 뉴클레오타이드 표적 서열에 대한 siRNA 올리고뉴클레오타이드 주형의 디자인의 예시이다.
도 2A는 루시퍼라제 리포터 어세이에서 사용된 이다. GL3 siRNA 1, GL3 siRNA 2 및 GL3 siRNA 3을 본 발명의 인비트로 방법을 사용하여 제조하였다. GL3 siRNA 올리고는 화학적으로 합성되었다(Vargeese, C. 등, 1988, Nucleic Acid Res. (26), 1046-1050)
도 2B는 HeLa 세포에서 루시퍼라제 발현에 대한 GL3 표적-특이적 siRNA 및 GL3 안티센스 단일 나선 siRNA의 효과를 나타낸다. GL3-콘트롤 루시퍼라제 + 리포터 작체물로 형질감염된 세포가 100%로 취해졌다.
도 2C는 pGL3-콘트롤 형질감염된 HeLa 세포내의 루시퍼라제 발현에 대한 GL3-siRNA 1의 저해 효과의 용량 의존성 커브를 나타낸다.
도 3A는 EGFP-형질감염된 HeLa 세포의 FACS 분석에서 사용된 EGFP 표적-특이적 이중 나선 siRNA를 나타낸다. EGFP ds siRNA 2는 본 발명의 인비트로 방법을 사용하여 제조하였다. EGFP ds siRNA 올리고는 화학적으로 합성되었다(Vargeese, C. 등, 1988, Nucleic Acid Res. (26), 1046-1050)
도 3B는 FACScan 분석(Beckton-Dickinson)을 사용한 EGFP-형질감염된 HeLa 세포내의 GFP 형광에 대한 EGFP 표적-특이적 siRNA 및 EGFP 안티센스 단일 나선 siRNA의 효과를 나타낸다. EGFP DNA 만으로 형질감염된 세포를 100%로 취한다.
도 4A는 JNK2α1 형질감염된 HeLa 세포에서 사용된 JNK2α1 표적-특이적 이중 나선 siRNA를 나타낸다.
도 4B는 CDS-1 형질감염된 HeLa 세포에서 사용된 CDS-1 표적-특이적 이중 나선 siRNA를 나타낸다.
본 발명은 짧은 이중-나선 표적-특이적 RNA의 합성분야에 관한 것이며, 체인 신장 효소를 사용한 올리고뉴클레오타이드 주형의 인비트로 전사에 기초한다.
본 명세서에서 사용된 표적-특이적 짧은 이중 나선 RNA는 특이적 단백질, 즉 표적 단백질을 암호화하는 서열과 부분적으로 일치하는 이중- 나선 RNA를 말한다. 이 서열은 바람직하게는 50개 미만의 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 30개 미만의 뉴클레오타이드 길이, 특히 보다 바람직하게는 15-25개의 뉴클레오타이드 길이이다. 특정 구체예에서, 표적-특이적 짧은 이중 나선 RNA는 작은 간섭 RNA(siRNA)로서 척추 및 무척추동물계에서 RNA 간섭에서 유용하다. 본 명세서에 사용된 siRNA는 2- 또는 3- 뉴클레오타이드 돌출부(overhanging) 3'-말단을 갖는 12-30개의 뉴클레오타이드의 dsRNA 분자를 말한다. 바람직한 구체예에서, siRNA는 2개의 뉴클레오타이드 3'말단을 갖는 15-25개의 뉴클레오타이드 길이이다. 보다 바람직하게는, siRNA는 2개의 뉴클레오타이드 돌출부 3'말단을 갖는 17-22개의 뉴클레오타이드 길이이다.
dsRNA를 얻기 위해서는, 센스 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드 주형 양자가 필요하다. 본 명세서에서 사용된 용어 "올리고뉴클레오타이드 주형"은 어떤 직접적 물리적 반응에서 통상 약간의 센스에서 그것에 상보적인 2차 구조의 패턴화를 일으킬수 있는 구조를 말한다. 현재 생물학에서, Watson-Crick 염기쌍 규칙에 의해 그것에 상보적 서열의 합성을 지도하는 뉴클레오타이드 서열을 말한다(The Dictionary of Cell and Molecular Biology,3d. Edition, Academic Press, London, 1999 (ISBN 0-12-432565-3)). 이 주형 서열은 바람직하게는 50개 미만의 뉴클레오타이드 길이이고, 이중 나선화, 단일 나선화 또는 부분적으로 단일 나선화 DNA 올리고 주형일 수 있다.
올리고뉴클레오타이드 주형은 합성 DNA 주형 또는 예컨대, 원핵생물 클로닝 벡터(pUC13, pUC19) 또는 Invitrogen의 TOPO 클로닝 시스템과 같은 PCR 클로닝 시스템과 같은 벡터의 제한 부위내로 클론된 표적-특이적 서열로부터 선형화 플라스미드 DNA로 생산된 주형일 수 있다. 합성 DNA 주형은 공지의 기술에 따라 생산될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드 주형은 dsDNA로 구성된 RNA 중합효소 프로모터 서열을 포함하는 부분적 단일-나선 DNA 올리고 주형으로 구성된다. 상기 구체예에서, 표적-특이적 짧은 이중 나선 RNA는 RNA 중합효소 프로모터 서열로부터 전사된 5'말단 뉴클레오타이드 및 3'말단 프로모터 서열로부터 전사된 뉴클레오타이드에 상보적인 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 추가적인 특징으로 한다.
본 발명에서 정의된 "체인 신장 효소"는 리보뉴클레오사이드 5'트리포스페이트로부터 RNA 폴리머를 형성할 수 있는 효소를 말한다; 형성된 RNA는 DNA 주형에 상보적이다. 상기 효소는 RNA 체인의 3'-하이드록실 말단에 모노뉴클레오타이드 유니트를 첨가하고, 이와 같이 5'-> 3'방향으로, 주형으로 사용된 DNA 나선에 역평형하게 RNA를 제조한다. 이같은 체인 신장 효소는 예컨대, DNA 중합효소 I, II 및 III ; RSV 및 AMV-중합효소와 같은 RNA-직접적 DNA 중합효소 ; 대장균 RNA 중합효소와 같은 DNA-직접적 RNA 중합효소 ; RNA 리플리케이즈라고도 알려진 박테리오파지 RNA 중합효소와 같은 RNA-직접적 RNA 중합효소 ; 또는 박테리아 폴리뉴클레오타이드 포스포릴레이즈와 같은 DNA 의존성 중합효소일 수 있다.
바람직한 구체예에서, 체인 신장 효소는 RNA 중합효소이다. 상기 RNA 중합효소는 DNA 주형내의 특이적 개시 부위의 존재가 필요하다. "RNA 중합효소 프로모터 서열"로서 본 명에서에 언급되는 이 개시 부위는 RNA 중합효소가 DNA 주형에 결합하는 부위이다. RNA 형성을 위한 전사가 시작되는 개시 신호로서 RNA 중합효소에 의해 또한 인식되는 부위이다.
따라서, 본 발명은 중합효소 프로모터 서열이 RNA 중합효소에 의해 인식되는 dsDNA로 구성된 RNA 중합효소 프로모터 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 주형을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 용어 "인식되는(recognized)"은 전사 반응에 대해 전혀 영향이 없거나 거의 영향이 없고, 개시 부위로 RNA 중합효소의 결합에 대해 전혀 영향이 없거나 거의 영향이 없는 하나 또는 양 쪽의 프로모터 서열에서 하나 이상 뉴클레오타이드에 의해 짧게 되는 모든 절단된 RNA 중합효소 프로모터 서열을 포함함이 의도된다. 예컨대, Milligan 등 (Milligan F. 등, 1987, Nature (15)8783-8798)은 이들 뉴클레오타이드의 제거가 전사 반응에 거의 영향이 없기 때문에, 그의 프로모터가 -17 내지 -14 및 -3 내지 +6 영역에서 비-주형 나선내의 DNA를 필요로 하는 것으로 보이지 않음을 T7 RNA 중합효소에 대해 증명하였다. 또한, +2 이상, 즉 +3 내지 +6의 위치의 주형 나선의 절단은 반응의 수율에 미치는 영향이 적다(Milligan F. 등, 1987, Nature (15)8783-8798). 이와 같이 얻은 절단된(truncated) RNA 중합효소 프로모터 서열은 "상기 RNA 중합효소에 의해 인식된 RNA 중합효소 프로모터 서열"을 포함하는 것으로 의도된다. 이와같이, 본 발명의 특정 구체예에서, RNA 중합효소 프로모터 서열은 하나 이상 뉴클레오타이드이 프로모터 서열의 주형 나선의 일면 또는 양면에서 결손된 절단된 RNA 중합효소 프로모터 서열로 구성된다. 바람직하게는 절단된 RNA 중합효소 프로모터는 도 1에서 나타난 주형 나선의 5'말단에의 +3 내지 +6 위치에서 절단된 T7 RNA 중합효소 프로모터 서열로 구성된다.
따라서, 본 발명의 제1 목적은 짧은 이중 나선 표적-특이적 RNA의 합성 방법을 제공하는 것이다. 상기 방법은 a) 주형 신장된 센스 올리고리보뉴클레오티드 생성물을 형성시키기 위해 반응 혼합물내에서 센스 표적-특이적 올리고뉴클레오티드 주형 및 체인 신장 효소를 결합하는 단계; b) 주형 신장된 안티센스 올리고리보뉴클레오티드 생성물을 형성시키기 위해 반응 혼합물내에서 표적 특이적 안티센스 올리고뉴클레오티드 주형 및 체인 신장 효소를 결합하는 단계; 및 c) 단계 a)에서 얻어진 센스 올리고리보뉴클레오티드 생성물을 단계 b)에서 얻어진 상보적 안티센스 올리고리보뉴클레오티드 생성물과 혼성화하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법에 따른 체인-신장 효소는 바람직하게는 T7 RNA 중합효소, T3 RNA 중합효소 및 SP6 RNA 중합효소로 구성된 군에서 선택되는 RNA 중합효소이다. 보다 바람직한 구체예에서, RNA 중합효소는 T7 RNA 중합효소로 구성된다.
따라서, 본 발명에 따른 방법에 사용된 올리고뉴클레오타이드 주형은 T7 RNA 중합효소, T3 RNA 중합효소 및 SP6 RNA 중합효소로 구성된 군에서 선택된 RNA 중합효소에 의해 인식되는, dsDNA로 구성된 RNA 중합효소 프로모터 서열을 포함한다. 바림직한 구체예에서, RNA 중합효소 프로모터 서열은 T7 RNA 중합효소에 의해 인식된다. 보다 바람직한 구체예에서 T7 RNA 중합효소 프로모터 서열은 도 1에 나타난 T7 RNA 중합효소 프로모터 서열로 구성된다.
다른 구체예에서, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 올리고뉴클레오타이드 주형은 임의로 2 또는 3개의 추가적인 뉴클레오타이드로 신장된, 표적 특이적 주형 서열로 주형의 5'말단에서 신장된 이중 나선 RNA 중합효소 프로모터 서열을 포함하는 부분적 이중 나선 DNA 올리고 주형인 것을 추가적인 특징한다. 보다 바람직한 구체예에서, 표적-특이적 주형 서열은 5'말단 프로모터 서열로부터 전사된 뉴클레오타이드 및 프로모터 서열로부터 뉴클레오타이드에 상보적인 3'말단 뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드 주형은 절단된 T7 RNA 중합효소 프로모터를 포함한다. 도 1에 나타난 서열에서, 표적-특이적 주형 서열은 5'말단에서 2개의 구아노신(g) 뉴클레오타이드 및 3'말단에서 2개의 시토신(c) 뉴클레오타이드를 포함한다.
따라서, 본 발명의 제2 구체예는 a) 주형 신장된 센스 올리고리보뉴클레오티드 생성물을 형성시키기 위해 반응 혼합물내에서 체인 신장 효소와 센스 siRNA 주형을 결합하는 단계; b) 주형 신장된 안티센스 올리고리보뉴클레오티드 생성물을 형성시키기 위해 반응 혼합물내에서 체인 신장 효소와 안티센스 siRNA 주형을 결합하는 단계; 및 c) 단계 a)에서 얻은 센스 올리고리보뉴클레오티드 생성물을 단계 b)에서 얻은 안티센스 올리고리보뉴클레오티드 생성물과 혼성화하는 단계를 포함하며, 단계 a) 및 b)의 siRNA 주형은 표적-특이적 주형 서열로 주형 나선의 5'-말단에서 신장된 이중 나선 RNA 중합효소 프로모터 서열 및 2 또는 3개의 추가적인 뉴클레오티드를 포함하는 작은 간섭 RNA(siRNA)의 합성 방법을 제공한다. 바람직한 구체예에서, siRNA의 합성에 사용된 체인-신장 효소는 RNA 중합효소, 바람직하게는 T7 RNA 중합효소, T3 RNA 중합효소 또는 SP6 RNA 중합효소에서 선택된 것으로 구성된다. 따라서 본 발명의 방법에 사용된 siRNA 주형은 T7 RNA 중합효소, T3 RNA 중합효소 및 SP6 RNA 중합효소로 구성된 군에서 선택되는, RNA 중합효소에 의해 인식된 RNA 중합효소 프로모터 서열을 포함한다. 보다 바람직한 구체예에서, 체인-신장 효소는 T7 RNA 중합효소이다. 따라서, 바람직한 구체예에서, siRNA 주형의 RNA 중합효소 프로모터 서열은 T7 RNA 중합효소에 의해 인식된다. 다른 구체예에서, siRNA 주형은 도시된 이중 나선 절단된 T7 RNA 중합효소 프로모터 서열을 포함하고, 여기서, 상기 절단된 T7 RNA 중합효소 프로모터 서열은 본 발명의 방법에 따른 주형 나선의 5'말단에서 신장되고, 표적-특이적 주형 서열은 5'말단에서 프로모터 서열로부터 전사된 뉴클레오타이드 및 3'말단에서 프로모터 서열로부터 전사된 뉴클레오타이드에 상보적인 뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용된 siRNA 주형은 도 1에 나타난 이중 나선 절단된 T7 RNA 중합효소 프로모터 서열을 포함하고, 상기 절단된 T7 RNA 중합효소 프로모터 서열은 본 발명의 방법에 따른 주형 나선의 5'말단으로 신장되고, 표적-특이적 주형 서열은 5'말단에서 2개의 구아노신(g) 뉴클레오타이드 및 3'말단에서 2개의 시토신 (c) 뉴클레오타이드를 포함한다.
주형 신장된 올리고리보뉴클레오타이드 생산물을 얻기 위한 상기 방법의 반응 조건은 일반적으로 통상 알려진 기술이다. 본질적으로, RNA 생산을 위한 효소 전사를 위한 출발물질은 RNA 중합효소 효소 활성에 대한 최적의 반응 버퍼에서 DNA 주형, RNA 중합효소 효소 및 4개의 필요한 리보뉴클레오타이드 염기, 아데닌, 시토신, 구아닌 및 우라실을 위한 뉴클레오사이드 트리포스페이트(NTP)이다. 예컨대, T7 RNA 중합효소를 사용하는 인비트로 전사를 위한 반응 혼합물은 일반적으로 T7 RNA 중합효소 (0.05mg/ml), 올리고뉴클레오타이드 주형(1μM), 각각의 NTP (4mM), 및 Mg2+를를 첨가한 MgCl2(25mM), 중합효소에 대한 코-펙터를 포함한다. 상기 혼합물은 37℃, pH 8.1(예컨대, 10 mM Tris-HCl 버퍼에서)에서 수시간 배양한다 (Milligan J. & Uhlenbeck O., 1989, Methods Enzymol (180) 51-62). 키트는 MEGA shortscriptTM T7 키트 (Ambion)와 같은 상업적으로 구입가능한 상기 성분을 포함한다.
상기한 방법들로부터 올리고리보뉴클레오타이드 생산물을 얻기위한 정제 프로토콜은 일반적으로 공지기술로서 알려졌고, 다른 겔 전기영동, 크기 배제 크로마토그라피, 모세관 전기영동 및 HPLC를 포함한다. 겔 전기영동은 일반적으로 반응 혼합물로부터 전장 전사체를 정제하기 위해 사용되지만, 상기 기술은 보다 큰 스케일의 생산을 위해 수정가능하지 않다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 올리고리보뉴클레오타이드 생산물을 얻기 위한 정제 수단은 임의로 페놀 : 클로로포름 : 이소아밀 추출 및 에탄올 침전과 결합된 Sephadex G-25 수지와 같은 크기 배제 크로마토그라피로 구성된다.
본 발명의 제3 목적은 본 발명에 따른 방법을 수행하기 위한 키트를 제공하는 것이다. 일 구체예에서, 키트는 a) 표적-특이적 센스 및 안티센스 올리고뉴클레오티드 주형을 디자인하기 위한 지침; b) 체인 신장 효소; c) 전사버퍼; d) 4가지 필요한 리보뉴클레오티드 염기를 위한 뉴클레오사이드 트리포스페이트(NTP); e) 센스 및 안티센스 올리고리보뉴클레오티드 생성물을 얻기 위한 정제 수단을 적어도 하나를 포함한다.
본 발명에 따른 키트에 제공되는 분리 수단은 일반적으로 반응 혼합물로부터 올리고리보뉴클레오타이드 생산물을 얻기 위한 공지의 정제 프로토콜을 말하며, 겔 전기영동, 크기 배제 크로마토그라피, 모세관 전기영동 및 HPLC를 포함한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 키트에 제공되는 정제 수단은 크기 배제 크로마토그라피 컬럼 또는 Sephadex G-25 수지와 같은 수지로 구성된다.
표적-특이적 센스 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드 주형을 디자인하기 위한 지침은 본 발명의 도 1에서 예시된 방법으로 예시할 수 있다.
본질적으로 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
1) 하기 서열 5'-xx(n12-30)yy-3'(여기서, x는 프로모터로부터 전사된 뉴클레오티드이고, y는 프로모터 서열로부터 전사된 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드이고, n12-30은 12 내지 30개의 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드이다)를 갖고, 표적 유전자의 코팅 서열내에 존재하는 표적-특이적 서열을 찾는 단계;
2) 임의로 2개의 추가적인 뉴클레오티드로 신장된, 단계 1)에서 존재하는 표적-특이적 서열의 보충적 올리고뉴클레오티드 서열로 주형 나선의 5'말단에서 신장된, 본 발명에 따른 이중 나선 RNA 중합효소 프로모터 서열을 포함하는 센스 올리고뉴클레오티드 주형을 디자인하는 단계;
3) 임의로 2개의 추가적인 뉴클레오티드로 신장된, 단계 1)에서 존재하는 표적-특이적 서열의 반전 올리고뉴클레오티드 서열로 주형 나선의 5'말단에서 신장된, 본 발명에 따른 이중 나선 RNA 중합효소 프로모터 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 주형을 디자인하는 단계.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법은 체인 신장 효소로 T7 RNA 중합효소를 사용한다. 상기 구체예에서, 표적-특이적 센스 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드 주형을 디자인하기 위한 방법은 하기 단계를 포함한다;
1) 하기 서열 5'-gg(nl2-30)cc-3'을 갖고, 표적 유전자의 코팅 서열내에 존재하는 표적-특이적 서열을 찾는 단계 ;
2) 하기 서열을 갖는 센스 올리고뉴클레오타이드 주형을 디자인하는 단계;
5'TAATACGACTCACTATAGG
임의로 2개의 추가적인 뉴클레오타이드로 신장된, 3'ATTATGCTGAGTGATATcc (n 보충)l2-30 gg(여기서, (n 보충)l2-30은 단계 1)에서 존재하는 표적-특이적 서열의 보충적 올리고뉴클레오타이드 서열을 말한다)
3) 하기 서열을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 주형을 디자인하는 단계;
5'TAATACGACTCACTATAGG
임의로 2개의 추가적인 뉴클레오타이드로 신장된, 3'ATTATGCTGAGTGATATcc (n 반전)l2-30 gg(여기서, (n 반전)l2-30은 단계 1)에서 존재하는 표적-특이적 서열의 반전 올리고뉴클레오타이드 서열이다).
특정 구체예에서, 본 발명의 방법은 작은 간섭 RNA(siRNA)의 합성에 사용된다. 상기 구체예에서, 표적-특이적 센스 및 안티센스 siRNA 주형을 디자인 하기 위한 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다;
1) 하기 서열 5'-xx(nl5-30) yy-3'(여기서, x는 프로모터로부터 전사된 뉴클레오티드이고, y는 프로모터 서열로부터 전사된 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드이고, n15-30은 15 내지 30개의 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드이다)을 갖고, 표적 유전자의 코팅 서열내에 존재하는 표적-특이적 서열을 찾는 단계;
2) 2개의 추가적인 뉴클레오티드, 바람직하게는 2개의 아데닌 잔기로 신장된, 단계 1)에서 존재하는 표적-특이적 서열의 보충적 올리고뉴클레오티드 서열로 주형 나선의 5'말단에서 신장된, 본 발명에 따른 이중 나선 RNA 중합효소 프로모터 서열을 포함하는 센스 올리고뉴클레오티드 주형을 디자인하는 단계;
3) 2개의 추가적인 뉴클레오티드, 바람직하게는 2개의 아데닌 잔기로 신장된, 단계 1)에서 존재하는 표적-특이적 서열의 반전 올리고뉴클레오티드 서열로 주형 나선의 5'말단에 신장된, 본 발명에 따른 이중 나선 RNA 중합효소 프로모터 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 siRNA 주형을 디자인하는 단계.
특정 구체예에서, siRNA을 합성하기 위한 방법은 체인 신장 효소로서 T7 RNA 중합효소를 사용하고, 표적-특이적 센스 및 안티센스 siRNA 주형을 디자인 하기 위한 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다:
1) 하기 서열 5'-gg(n15-30)cc-3'을 갖고, 표적 유전자의 코팅 서열내에 존재하는 표적-특이적 서열을 찾는 단계 ;
2) 하기 서열을 갖는 센스 올리고뉴클레오타이드 siRNA 주형을 디자인하는 단계;
5'TAATACGACTCACTATAGG
3'ATTATGCTGAGTGATATcc (n 보충)l5-30 gg aa (여기서, (n 보충)l5-30은 단계 1)에서 존재하는 표적-특이적 서열의 보충적 올리고뉴클레오타이드 서열을 말한다)
3) 하기 서열을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 siRNA 주형을 디자인하는 단계;
5'TAATACGACTCACTATAGG
3'ATTATGCTGAGTGATATcc (n 반전) l530 gg aa (여기서, (n 반전)l5-30은 단계 1)에서 존재하는 표적-특이적 서열의 반전 올리고뉴클레오타이드 서열을 말한다)
따라서, 본 발명은 a) 표적-특이적 센스 및 안티센스 올리고뉴클레오티드 주형을 디자인하기 위한 지침; b) 체인 신장 효소; c) 전사버퍼; d) 4가지 필요한 리보뉴클레오티드 염기를 위한 뉴클레오사이드 트리포스페이트(NTP); e) 센스 및 안티센스 올리고리보뉴클레오티드 생성물을 얻기 위한 정제 수단을 적어도 하나를 포함하는 짧은 이중 나선 표적-특이적 RNA의 합성을 위한 키트를 제공한다.
이와 같이, 다른 구체예에서, 본 발명은 a) 표적-특이적 센스 및 안티센스 siRNA 주형을 디자인하기 위한 지침; b) 체인 신장 효소; c) 전사버퍼; d) 4가지 필요한 리보뉴클레오티드 염기를 위한 뉴클레오사이드 트리포스페이트(NTP); e) 센스 및 안티센스 올리고리보뉴클레오티드 생성물을 얻기 위한 정제 수단을 적어도 하나를 포함하는 작은 간섭 RNA의 합성을 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 목적은 또한 짧은 이중 나선 RNA의 인비트로 합성을 위한 모든 개시된 방법을 위한 수단을 제공한다. 따라서 본 발명은,
i) 표적-특이적 센스 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드 주형을 디자인하기 위한 방법,
ii) 짧은 이중 나선 RNA의 인비트로 합성을 위한 벙법에서 사용되기 위한 본 발명에 따른 체인 신장 효소,
iii) 센스 및 안티센스 올리고리보뉴클레오타이드 생산물을 얻기 위한 정제 수단
iv) 본 발명에 따른 체인 신장 효소를 사용하여 표적-특이적 센스 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드 주형으로부터 센스 및 안티센스 올리고리보뉴클레오타이드 생산물을 형성하기 위한 본응 혼합물에 대한 시약을 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 세포내의 표적 유전자의 발현을 억제하기 위한 방법에서 본 발명의 방법으로 얻을 수 있는 siRNA의 용도이다. 상기 방법은 세포내에 본 발명의 방법에 의해 얻을 수 있는 siRNA의 도입을 포함한다.
표적 유전자는 세포(즉, 세포성 유전자), 내인성 유전자 (즉, 게놈내에 존재하는 세포성 유전자), 트랜스진(즉, 세포의 게놈내에서 딴곳(ectopic site)에서 삽입된 유전자 작제물), 또는 세포에서 유래된, 유기체를 감염할 수 있는 병원체로부터의 유전자 로부터 유래된 유전자일 수 있다. 특정 표적 유전자 및 운반되는 이중 나선 RNA 물질의 용량에 의존하여, 상기 방법은 표적 유전자에 대한 부분적 또는 완전 기능의 상실을 제공할 수 있다.
표적 유전자를 갖는 세포는 모든 유기체로부터 유래되거나 포함될 수 있다. 상기 유기체는 식물, 동물, 원생 동물, 세균, 바이러스 또는 곰팡이일 수 있다. 식물은 외떡잎 또는 쌍떡잎 식물 또는 겉씨식물일 수 있다; 동물은 척추 또는 무척추 동물일 수 있다. 표적 유전자를 갖는 세포는 점 라인(germ line) 또는 체세포성 또는 분화 전능성(totipotent), 분열 또는 비분열, 유연조직 또는 상피조직, 불멸화되거나 형질전환 등이 된 것들에서 유래할 수 있다. 세포는 간세포(stem cell) 또는 분화된 세포일 수 있다. 분화된 세포 형태는 지방세포, 섬유모세포, 근세포, 심근세포, 내피, 뉴론, 신경교, 혈액 세포, 거핵세포, 림프구, 대식세포, 호중구, 호산구, 호염기성구, 마스트 세포, 백혈구, 과립구, 각질 세포, 연골세포, 골모세포, 파골세포, 간세포, 내분비 또는 외분비샘의 세포를 포함한다,
본 발명의 방법에 의해 얻을 수 있는 단리된 RNA는 50개 미만의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 30개 미만의 뉴클레오타이드 길이, 보다 바람직하게는 30-12개 미만의 뉴클레오타이드인 표적-특이적 짧은 이중 나선 RNA으로 구성되고, 5'말단 프로모터 서열로부터 전사된 뉴클레오타이드 및 3'말단에서 프로모터 서열로부터 전사된 뉴클레오타이드에 상보적인 뉴클레오타이드를 포함하고, 바람직하게는 프로모터 서열로부터 전사된 뉴클레오타이드의 수 및 프로모터 서열로부터 전사된 뉴클레오타이드에 상보적인 뉴클레오타이드의 수가 2, 3 또는 4개의 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 2개의 뉴클레오타이드로 구성된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 방법으로 얻을 수 있는 짧은 이중 나선 RNA는 임의로 3'말단에서 2 또는 3개의 추가적인 뉴클레오타이드로 신장되고, 본 발명의 다른 구체예에서는 하기 센스 서열 5'-xx(n12-30)yy-3'(여기서, x는 프로모터 서열로부터 전사된 뉴클레오티드이고, y는 프로모터 서열로부터 전사된 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드이고, n12-30은 12 내지 30개의 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드이다)로 나타낼 수 있다. 특정 구체예에서, 짧은 이중 나선 RNA는 센스 서열 5'-gg(n15-30)cc-3'(여기서, g는 절단된 T7 RNA 중합효소 프로모터 서열로부터 전사된 뉴클레오티드 구아노신이고(도 1에 나타난 것과 같음), c 는 절단된 T7 RNA 중합효소 프로모터로부터 전사된 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드 시토신(도 1에 나타난 것과 같음) 서열이고 n15-30은 15 내지 30개의 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드이다)을 갖는다.
RNA는 세포내에(즉, 세포내로) 직접적으로 도입될 수 있거나; 공, 간질성 공간내로 세포외적으로 도입되거나, 유기체의 순환내로 도입되거나, 경구적으로 도입되거나, RNA를 포함하는 욕액내로 유기체를 담궈서 도입시킬 수 있다. 경구 도입을 위한 방법은 유기체의 음식에 RNA를 직접 혼합 뿐만 아니라 음식으로 사용될 수 있는 종에 공학적 접근으로 RNA를 발현하기 위해 가공한 후, 영향을 끼칠 유기체에 먹게하는 것을 포함한다. 예컨대, RNA는 식물상에 스프레이하거나, 식물을 감염시킨다고 알려진 일부 또는 모든 병원체를 죽이기에 충분한 양의 RNA를 발현하기 위해 유전공학적으로 처리할 수 있다.
핵산의 도입의 물리적 방법, 예컨대, 세포내 직접 주사 또는 유기체내로 세포외 주사를 사용할 수 있다. 본 발명자들은 본 명세서에서 HeLa 세포에서 세포외부로부터 도입된 이중-나선 RNA은 유전자 발현을 억제함을 개시한다.
혈관 또는 혈관외 순환, 혈액 또는 림프계, 사부(phloem), 루트 및 뇌척수액은 RNA가 도입될 수 있는 부위다. 재조합 작제물에서 RNA를 발현하는 형질전환 유기체는 작제물을 접합체, 태아의 간세포, 또는 적당한 생물로부터 유래된 다른 다기능세포에 의해 생산될 수 있다.
핵산을 도입하는 물리적 방법은 RNA를 포함하는 용액의 주사, RNA에 의해 커버되는 입자에 의한 충격, RNA의 용액내로 세포나 유기체의 담금 또는 RNA의 존재하에 세포막의 전기영동을 포함한다. 바이러스 입자 내로 포장되는 바이러스 작제물은 세포내로 발현 작제물의 도입 및 발현 작제물에 의해 암호화되는 RNA의 전사를 효율적으로 달성한다. 세포로 핵산을 도입하는 공지의 다른 방법, 예컨대, 지질을 매개하는 담체 수송, 칼슘 포스페이트 화학적 매개 수송 등을 사용할 수 있다. 이와 같이, RNA는 하나 이상의 하기 활성을 수행하는 구성을 같이 도입할 수 있다: 세포에 의한 RNA 흡수의 증가, 이중 나선의 어닐링의 촉진, 어닐링된 나선의 안정화 또는 표적 유전자의 저해의 다른 증가.
본 발명은 질환의 치료 또는 예방을 위해 세포내 RNA를 도입하기 위해 사용할 수 있다. 예컨대, dsRNA는 암세포 또는 종양내로 도입될 수 있고, 이것에 의해 발암성/암유발성 표현형의 유지에 필요한 유전자의 유전자 발현을 억제할 수 있다. 질환 또는 다른 병리현상을 예방하기 위해, 표적 유전자는 질환/병리현상을 개시 또는 유지하기에 필요한 것을 선택할 수 있다. 따라서, 다른 구체예에서, 본 발명은 표적 유전자의 유전자 발현을 억제하기 위해 본 발명의 방법에 의해 얻을 수 있는 짧은 이중 나선 RNA 및 적합한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 적합한 방법, 예컨대, 주사, 경구, 안구내, 국소, 비강내, 직장 적용 등으로 투여할 수 있다. 담체는 모든 적합한 약제학적 담체, 바람직하게는, 표적 세포에 도입하기 위한 RNA 분자의 효능을 증가시킬 수 있는 것을 사용할 수 있고, 예컨대, 리포좀, 천연 바이러스 캡시드(capsid) 또는 화학적으로 또는 효소적으로 생산된 인공 캡시드 또는 이들로 부터 유래된 구조물을 들 수 있다.
본 발명의 다른 유용성은 이전에 기능이 불명확한 표적 유전자의 활성을 저해하는 나선 RNA의 용도를 포함하는 유기체내의 유전자 기능을 동정하는 방법을 제공한다. 시간을 소비하고 노동집약적인 전통적인 유전적 스크리닝에 의한 돌연변이의 분리 대신에, 기능성 게노믹스는 표적 유전자 활성의 양의 감소 및/또는 시간의 변경을 위한 본 발명을 적용함에 의한 불특정성 유전자의 기능의 결정하기에 구상할 수 있다. 본 발명은 약학에서 잠재적 대상의 결정, 발생에 관련된 정상 및 병리적 현상의 이해, 출생후 발육/노화에 관련된 신호 경로의 결정 등에 사용될 수 있다. 인간, 마우스, 이스트, 노랑초파리(D. melanogaster), 선충 게놈에 대한 총 서열을 포함하는 게놈 소스 및 발현된 유전자 소스로부터의 빠른 속도로 얻은 뉴클레오타이드 서열 정보는 유기체(예컨대, 선충)내의 유전자 기능을 결정하기에 본 발명과 연결될 수 있다. 특정 코동으로 사용하기 위한 다른 유기체의 선택, 관련된 유전자 생산물을 위한 서열 데이타베이스의 서치, 뉴클레오타이드서열이 유도되는 것으로부터 생체 지도로 유전성 특징의 연관 지도의 상관관계, 및 인공적 정보 방법은 이와 같은 시퀀싱 프로젝트에서 얻어진 뉴클레오타이드 서열로부터 추정적 어픈 리딩 프레임을 명확하게 하기에 사용될 수 있다.
단순한 어세이는 발현된 서열 tag (EST)로부터 사용가능한 부분 서열에 따른 유전자 발현을 저해할 수 있다. 성장, 발달, 대사, 질환 저항성 또는 다른 생물학적 과정의 기능성 변경을 EST의 유전자 생산물의 정상 역활의 표시가 될 수 있다.
이와 같이, 본 발명의 목적은 50개 미만의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 30개 미만의 뉴클레오타이드 길이, 보다 바람직하게는 30-12개의 뉴클레오타이드 길이이고, 5'말단 프로모터 서열로부터 전사된 뉴클레오타이드 및 3'말단에서 프로모터 서열로부터 전사된 뉴클레오타이드에 상보적인 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 프로모터 서열이 RNA 중합효소에 의해 인식되는 것을 특징으로 하는 표적-특이적 짧은 이중 나선 RNA를 포함하는, 세포내로 RNA의 도입을 포함하는 세포내로 표적 유전자의 발현을 저해하는 방법을 제공한다. 다른 구체예에서, 상기 프로모터 서열은 T7 RNA 중합효소, T3 RNA 중합효소 및 SP6 RNA 중합효소로 구성된 군에서 선택되는 RNA 중합효소에 의해 인식된다.
본 발명은 하기 실험예를 참고로 보다 잘 이해될 수 있을 것이나, 이는 첨부되는 청구범위를 보다 충분히 기술하기 위해 발명의 예시인 것으로 당업자에게 쉽게 이해될 수 있다. 또한 본 출원서를 통해 다양한 출판물이 언급된다. 상기 출판물의 개시는 본 발명의 속하는 기술의 상태를 충분히 기술하기 위해 본 출원 명세서에 참조로서 삽입된다.
실시예 1: EGFP 및 인비트로 전사된 GL3 특이적 짧은 dsRNA의 인간 세포에서 RNA 간섭의 유도
물질 및 방법
플라스미드 작제물
루시퍼라제+는 플라스미드 pGL3-콘트롤(Promega)로부터 발현되었다. EGFP는 EGFP/pcDNA5-FRT로부터 발현되었고, 이것은 포유동물 발현 벡터 pcDNA5/FRT (Invitrogen)의 HindIII 및 NotI 내로 직접적으로 결합된 pEGFP(Clontech)로부터 EGFP 유전자를 포함한다.
인비트로 전사 및 siRNA의 혼성화
올리고 주형 나선을 2시간동안 가열하고, 2-3 시간동안 상온으로 천천히 냉각하여 10mM Tris-HCl pH 9.0, 100mM NaCl, 1mM EDTA에서 센스 T7 프로모터 서열 (5'TAATACGACTCACTATAGG)로 혼성화하였다.
전사는 제작자의 지침에 따라 MEGAshortscript T7 키트 (Ambion)를 사용하여 수행하였다. siRNA 나선을 G-25 스핀 컬럼상에서 정제하고, Heavy Phase-Lock Gels(Eppendorf)을 사용하여 페놀: 클로로포름: 이소아밀 알콜(25: 24: 1)로 추출하고, -80℃에서 밤새 에탄올 침전하였다. 상보적 siRNA 나선을 2시간동안 가열하고, 2-3 시간동안 상온으로 천천히 냉각하여 1mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA pH 8.0에서 혼성화하였다. 혼성화를 비변성 20% 폴리아크릴아미드 TBE 겔 상에서 ds- 및 ss-siRNA를 전개함에 의해 평가하였다.
셀라인 및 형질감염
HeLa 세포를 1.8mM 1-글루타민, 9% FBS, 및 45U/1 pen/strep이 첨가된 고농도 글루코스 및 1-글루타민(Invitrogen)으로 DMEM에서 키웠다. 세포를 Elbashir 등 (2001)에 기술된 방법과 유사한 방법으로 형질감염하였다. 형질 전환 24시간전, 세포를 트립신화하고, 3 x 105 세포/ml로 항생제가 결핍된 성장 배지로 희석하였다. 0.5ml의 세포를 24-웰 플레이트의 각각의 웰내로 심었다. 세포를 제조자 지침에 따라 LipofectamineTM 2000 (LF2000; Invitrogen)을 사용하여 다르게 언급한 것은 제외하고, 1μg의 GL3-콘트롤 또는 EGFP/pcDNA5-FRT 리포터 작제물 및 50pmol의 단일-나선 또는 25pmol 이중-나선 siRNA로 형질감염하였다. 특히 본 발명자들은 48μl의 항생제 결핍 혈청 없는 배지내의 웰당 2μl의 LF2000을 사용하였다. 희석된 LF2000을 50μl 총 용량으로 동일한 배지에서 희석한 수용체 및/또는 siRNA와 혼합하기 1시간 전에 상온에서 전배양하였다. 복합체를 그후 세포에 첨가하기 전에 20시간동안 상온에서 배양하였다. EGFP 및 GL3 리포터 유전자 어세이를 24시간 후에 수행하였다. JNK2α1 siRNA 실험 및 GL3 siRNA 용량 의존 실험에 대해서, 6-웰 플레이트를 사용하였다. 세포수가 4배 증가하였고, 시약(reagent) 양은 5배 증가하였다. JNK2α1 siRNA 실험에 대해, 세포를 RNA 분리를 위해 배양하고, 단백질 추출을 약 48시간 형질감염후 하였다.
리포터 유전자 어세이
EGFP-형질감염된 세포의 FACS 분석을 FACScan (Beckton-Dickinson)을 사용하여 수행하였다. 세포를 트립신 처리하고, FACS 고정 용액(PBS + 1% 포름알데히드)에 재현탁하기 전에 PBS로 세척하였다. 형질감염 효율을 EGFP/pcDNA5-FRT로 형질감염된 것과 물로 형질감염된 샘플과 비교하여 측정하였고, 전형적으로 75-90%였다. 전사된 또는 합성 siRNA에 의해 유도된 RNAi의 양을 공동형질감염된 siRNA로 또는 이것 없이 샘플내의 평균 GFP 형광의 변화로부터 측정하였다.
루시퍼라제 어세이에서, 세포를 트립신 처리하고, 10Oμl 분할량을 흰 96-웰 조직 배양 플레이트내에 3번 충분히 이전하였다. 제조자의 지침에 따라 Luc-ScreenTM 시스템(Applied Biosystems) 및 TopCount-NXTTM 마이크로플레이트 신틸레이션 및 발광 계수지(Packard)를 사용하여 어세이를 수행하였다.
노던 및 웨스텐 블롯팅
총 RNA는 제조자의 지침에 따라 RNeasy Mini 키트(Qiagen)를 사용하여 약 106 HeLa 세포의 샘플로부터 제조하였다. 샘플을 pre-cast MOPS Latitude RNA 아가로스 겔 (BioWhittaker Molecular Applications)상에서 전개하고, 제조자의 지침에 따라 Hybond-XL 나일론 막(AP Biotech)에 이전하였다. DNA 프로브를 제조자의 지침에 따라 Rediprime II 시스템(AP Biotech)을 사용하여 제조하였다. 혼성화를 제조자의 지침에 따라 Rapid-Hyb 용액(AP Biotech)에서 수행하였다.
핵 및 세포질 단백질 추출물을 루펩틴(leupeptin), 아프로티틴(aprotinin), 및 펩스타틴(pepstatin)에 대해 Complete Protease Inhibitor Cocktail (Roche)로 대체하고, 소듐 데옥시콜레이트(deoxycholate)를 생략하면서 Gordon (1991)의 방법에 따라 제조하였다.
추출물을 Rainbow 단백질 마커(AP Biotech)로 4-20% SDS 폴리아크릴아미드 미니겔(Invitrogen)상에서 전개하고, 0.2μm Transblot 니트로셀룰로스 막(BioRad)상에서 일렉트로볼트하였다. 블롯을 PBS + 0.05% Tween-20으로 세척하고, 5% 우유 분말을 포함하는 PBS/Tween-20에서 1: 150 희석된 JNK2 D2 마우스 모노클로날 항체(Santa Cruz Biotech)를 사용하여 4℃에서 밤새 배양하였다. 블롯을 1: 3000 HRP-컨쥬게이트된 염소 항-마우스 항체(BioRad)로 45분간 배양 전에 PBS/Tween-20 으로 다시 세척하였다. 3번 더 세척하고, PBS/Tween-20내의 30분 배양을 ECL 시스템(AP Biotech)에 의해 측정하기 전에 수행하였다.
결과
2개의 3'돌출부 뉴클레오타이드를 제외한 이중-나선된 siRNA를 사용하여 RNAi를 이미 증명하였다 (Elbashir 등 2001; Caplen 등 2001). 다중 세포 표적에 대해 상대적으로 빠르고 저가인 다양한 siRNA를 제조하기 위해, 본 발명자들은 인비트로 전사 기술을 사용하여 분자를 생성하는 도식을 디자인 하였다.
Milligan 등 (1987)은 T7 DNA 중합효소에 의한 전사를 위한 부분적으로 단일-나선 DNA 올리고 주형의 용도를 개시한다. 표준 T7 최소 프로모터는 전사체의 처음 3개의 염기로서 삽입되는 3'말단에서의 3개의 구아노신 뉴클레오타이드를 포함한다. 그러나, 3개의 구아노신은 일반적으로 인비트로 전사 수율의 상당한 감소 없이 다른 뉴클레오타이드로 치환될 수 있다(Milligan 등 1987). 그러나, 상기 방법에 의해 제조된 siRNA는 2개의 5'구아노신 뉴클레오타이드를 포함해야만 한다. 2개의 상보적 시토신 뉴클레오타이드가 다른 나선상의 5'구아노신과 염기 쌍을 위해 각 siRNA 나선 3'말단의 근처가 필요하다. 이 방법으로 제조된 주어진 길이의 siRNA는 mRNA의 평균치에 대한 모든 250개의 뉴클레오타이드를 나타내는 표적 서열일 수 있어야 한다.
본 발명자는 이를 염두하면서상기 작제물과 함께 DNA 올리고 주형을 디자인했다(도 1). 각 주형은 siRNA의 하나의 나선을 전사하기 위해 사용된다. 상기 나선은 Sephadex G-25 크기 배제 컬럼상에서 초벌 정제하고, 페놀: 클로로포름 추출 및 에탄올 침전하였다. 상기 나선을 그후 어닐링 버퍼에서 재현탁하고, 가열에 의해 혼성화하고, 천천히 냉각하였다.
본 발명자들의 인비트로 전사된 siRNA는 이전의 방법에서 사용된 화학적으로 합성된 변형물과 2가지 면에서 다르다. 우선 모든 다른 보고된 siRNA를 고 정제하였다. 둘째, 인비트로 전사된 siRNA는 5'트리포스페이트기를 보유한다. 천연 RNAi 메카니즘의 일부로서 인비보에서 생산된 siRNA 종과 유사하게, siRNA를 만들기 위해 사용된 화학적으로 합성된 RNA 올리고뉴클레오타이드는 5' 모노포스페이트를 운반하기 위해 사용되었다. 이러한 차이가 RNAi를 유도하기위해 본 발명의 siRNA가 부적합한 여부를 결정기 위해, 본 발명자들은 표적 2개의 리포터 유전자-EGFP 및 GL3 (도 2 및 3)를 위해 디자인된 이중-나선 siRNA를 처음으로 테스트하였다. 적어도 3개의 독립된 실험으로부터 평균 결과 및 표준 에러를 나타내었다 (도 2B, 도 3B).
안티센스 나선 단독으로 2배 몰 농도에서 효과가 없는 반면에, 전사된 GL3 ds siRNA 1은 약 5배로 공형질감염된 pGL3-콘트롤 리포터 플라스미드로부터 루시퍼라제 활성을 감소시킨다. 유사한 결과가 화학적으로 합성된 GL3 ds siRNA (ds 1 RNA 올리고)에서 관찰되었다. 2번째 전사된 siRNA는 보다 적당한 효과를 갖는다. 3번째 전사된 siRNA는 강한 효과를 갖는 반면, 유의적 활성은 또한 안티센스 나선 단독으로부터 나타났다. 이중-나선 종으로부터 효과의 강도는 용량 의존적이고(도 2C), 일정상태의 RNA 수치를 변경한다. EGFP ds siRNA 2는 또한 루시퍼라제 활성에 대해 적당한 효과를 갖는다(도 2B). 그러나 이 효과는 용량 증가에 대해 제한적 반응을 보였다.
동일하게 전사된 EGFP ds siRNA 2는 EGFP/pcDNA5-FRT 리포터로 공형질감염된 세포에서 GFP 형광을 강하게 감소시켰다(도 3B). 보다 적당한(modest) 효과가 센스 또는 안티센스 나선 단독 또는 화학적으로 합성된 siRNA (EGFP ds1 RNA 올리고) 또는 이들의 구성부분에서 증명되었다. GFP 형광은 비특이적 GL3 ds siRNA 3에 의해 영향받지 않는다.
상기 언급된 인비트로 전사된 (IVT) 루시퍼라제 ds siRNA은 다른 정도로 루시퍼라제 활성의 억제를 얻을 수 있다. RNAi 활성을 위한 양성 콘트롤로서, 본 발명자들은 화학적으로 합성된 루시퍼라제 ds siRNA를 사용하였다. 본 발명자들의 손에서, 공형질감염된 pGL3-콘트롤 리포터 플라스미드로부터 합성 ds siRNA에 의해 루시퍼라제 활성이 약 5배 감소되었다. 모든 실험에서 형질감염 효능은 91 및 95 %사이로 변화하였다. 안티센스 RNA 나선 단독으로 ds siRNA의 2배의 몰 농도에서 효과가 없는 반면, 하나의 IVT-루시퍼라제 ds siRNA (GL3 ds siRNA 1)는 루시퍼라제 활성을 78% 감소시켰다. 2번째 IVT-siRNA (GL3 ds siRNA 2)에서 본 발명자는 보다 온호한 효과는 갖는 것을 테스트하였다(36 % 저해). 3째 IVT-siRNA가 강한 효과를 갖는 반면(82 % 저해), 상당한 활성이 안티센스 RNA 나선 단독으로부터 또한 나타났다(55 % 저해), 결과를 혼란하게 하다. 각각의 이들에 대해 1/3 몰 농도를 사용한, 3개의 IVT-siRNA 혼합물은 상승적 효과 보다는 중간적 효과를 갖고, 동일한 유전자를 표적화하기 위해 다중 siRNA를 사용하기에 이점이 없을 것 같다. 본 발명자들은 ds 종으로부터 용량의존적 저해 효과를 나타낼 수 있었다. 비-특이적 GFP siRNA (GFP ds siRNA2)가 또한 루시퍼라제 활성에 대해 온화한 효과를 갖는 반면(46 % 저해), 이들은 비-특이성을 나타내고, 증가된 용량에서 제한된 반응을 나타낸다(데이타 미도시).
동일한 IVT-GFP ds siRNA (GFP ds siRNA 2)는 GFP/pcDNA5-FRT 리포터를 사용하여 공형질감염된 세포에서 GFP 형광을 강하게 감소시켰다(87% 저해). 센스(41%) 또는 안티센스 (19%) 나선 단독 또는 화학적으로 합성된 siRNA (GFP ds1 RNA 올리고) 또는 그의 구성 부분으로부터 보다 온화한 효과가 증명되었다. 기대와 같이 GFP 형광은 비-특이적 루시퍼라제 ds siRNA 3에 의해 영향받지 않았다.
내인성 유전자 발현이 전사된 siRNA에 의해 또한 영향 받는 것을 증명하기 위해, 본 발명자는 JNK2α1 (도 4A) 및 CDS-1 (도 4B) 유전자의 생산물을 표적으로 하였다. 물(모조), 형질감염n 콘트롤 (EGFP DNA 만)로서 EGFP/pcDNA5-FRT 플라스미드, siRNA, 또는 비-특이적 siRNA (EGFP ds siRNA 2)의 단일 나선로 형질감염된 세포와 비교할 때에, 전사된 siRNA (JNK2α1 ds siRNA 1- 87% 감소 측정됨) 또는 화학적으로 합성된 siRNA(JNK2α1 ds1 RNA 올리고-76% 감소 측정됨)로 형질감염된HeLa 세포의 핵 추출물에서 샘플내의 JNK2α1 단백질 및 RNA 수치가 특히 감소함이 웨스턴 및 노던 블롯 분석에서 나타났다.
모조-형질감염된 세포와 비교할 때, 비특이적 siRNA로 형질감염된 세포가 아닌, CDS 1-특이적 IVT-siRNA로 형질감염된 HeLa 세포의 세포질 추출물에서 CDS1 단백질 수지의 온화한 감소(67% 까지)가 웨스턴 블롯 분석에서 나타났다(도 4).
실시예 2: 인비트로 전사된 마우스 Insr 특이적 짧은 dsRNA , Balb/C 마우스의 간내의 녹다운 Insr
800 U RNAe 저해제와 함께, 인비트로 전사의 절단된 T7 프로모터 방법에 의해 제조된 마우스 인슐린 수용체(NCBI accession number NM_010568 ; 염기 2536-2556)에 대해 직접적으로 siRNA의 40 마이크로그램을 포함하는 2.3 ml 식염수, 또는 식염수를 수컷 Balb/C 마우스 (약 25 g) (표준 수용, 식사/물의 접근 자유)의 꼬리 정맥에 주시하였다.
주사를 가능한 한 빠르게 투여하였다(8-10 초). 2개의 콘트롤 및 2개의 siRNA 처리된 마우스를 24, 48 및 72시간에 치사시키고, 간을 빨리 제거하고, 무게를 달고, 드라이 아이스/이소프로판올에서 동결하였다. 총 RNA를 분쇄된 동결 조직 및 RNEasy Maxi 키트(Qiagen)를 사용하여 추출하였다.
최소 나선 cDNA 합성 후에, 인슐린 수용체에 대한 mRNA를 (프라이머: F 3526-3548, R 3744-3768)를 사용하여 어세이하였고, 결과는 또한 Q-PCR에 의한 사이클로필린 A 발현에 표준화하게 되었다(염기 157-182 및 496-521, NCBI accession number NM_017101).
발명의 요약
본 발명은 a) 주형 신장된 센스 올리고리보뉴클레오티드 생성물을 형성시키기 위해 반응 혼합물내에서 센스 표적-특이적 올리고뉴클레오티드 주형 및 체인 신장 효소를 결합하는 단계; b) 주형 신장된 안티센스 올리고리보뉴클레오티드 생성물을 형성시키기 위해 반응 혼합물내에서 표적 특이적 안티센스 올리고뉴클레오티드 주형 및 체인 신장 효소를 결합하는 단계; 및 c) 단계 a)에서 얻어진 센스 올리고리보뉴클레오티드 생성물을 단계 b)에서 얻어진 상보적 안티센스 올리고리보뉴클레오티드 생성물과 혼성화하는 단계를 포함하는 짧은 이중 나선 표적-특이적 RNA 합성을 위한 인비트로 방법을 제공한다.
본 발명의 추가적인 구체예에서, 체인 신장 효소는 RNA 중합효소이고, 단계 a) 및 b)의 올리고뉴클레오티드 주형은 RNA 중합효소 프로모터 서열, 바람직하게는 dsDNA를 구성하는 RNA 중합효소 프로모터 서열을 포함한다. 다른 바람직한 구체예에서, RNA 중합효소는 T7 RNA 중합효소이고, 단계 a) 및 b)의 siRNA 주형은 임의로 2 또는 3개의 추가적인 뉴클레오티드가 신장된, 표적-특이적 주형 서열로 주형 나선의 5'-말단이 신장된 이중 나선 RNA 중합효소 프로모터 서열을 포함한다.
본 발명은 작은 간섭 RNA의 합성에 특정 용도를 발견하였다. 따라서, 본 발명의 추가적인 목적은 표적-특이적 짧은 이중 나선 RNA가 50개 미만의 뉴클레오티드, 바람직하게는 30개 미만의 뉴클레오티드 길이이고, 5'말단에서 프로모터 서열로부터 전사된 뉴클레오티드 및 3'말단에서 상기 프로모터 서열로부터 전사된 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드를 포함하는, 표적-특이적 짧은 이중 나선 RNA의 합성 방법을 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명은 a) 주형 신장된 센스 올리고리보뉴클레오티드 생성물을 형성시키기 위해 반응 혼합물내에서 체인 신장 효소와 센스 siRNA 주형을 결합하는 단계; b) 주형 신장된 안티센스 올리고리보뉴클레오티드 생성물을 형성시키기 위해 반응 혼합물내에서 체인 신장 효소와 안티센스 siRNA 주형을 결합하는 단계; 및 c) 단계 a)에서 얻은 센스 올리고리보뉴클레오티드 생성물을 단계 b)에서 얻은 안티센스 올리고리보뉴클레오티드 생성물과 혼성화하는 단계를 포함하며, 단계 a) 및 b)의 siRNA 주형은 표적-특이적 주형 서열로 주형 나선의 5'-말단에서 신장된 이중 나선 RNA 중합효소 프로모터 서열 및 2 또는 3개의 추가적인 뉴클레오티드를 포함하는 작은 간섭 RNA의 합성 방법을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 체인 신장 효소는 T7 RNA 중합효소이고, siRNA 주형은 이중 나선 T7 RNA 중합효소 서열, 바람직하게는 도 1에 나타난 절단된 T7 RNA 중합효소 프로모터 서열을 포함한다.
본 발명의 추가적인 목적은 본 발명에 따른 방법을 수행하기 위한 키트 및 개시된 모든 방법에 사용하기 위한 구성을 제공한다.

Claims (40)

  1. a) 주형 신장된 센스 올리고리보뉴클레오티드 생성물을 형성시키기 위해 반응 혼합물내에서 표적-특이적 센스 올리고뉴클레오티드 주형 및 체인 신장 효소를 결합하는 단계;
    b) 주형 신장된 안티센스 올리고리보뉴클레오티드 생성물을 형성시키기 위해 반응 혼합물내에서 표적 특이적 안티센스 올리고뉴클레오티드 주형 및 체인 신장 효소를 결합하는 단계; 및
    c) 단계 a)에서 얻어진 센스 올리고리보뉴클레오티드 생성물을 단계 b)에서 얻어진 상보적 안티센스 올리고리보뉴클레오티드 생성물과 혼성화하는 단계를 포함하는 표적-특이적 짧은 이중 나선 RNA 합성 방법.
  2. 제1항에 있어서, 체인 신장 효소가 RNA 중합효소인 방법.
  3. 제2항에 있어서, RNA 중합효소가 T7 RNA 중합효소, T3 RNA 중합효소 및 SP6 중합효소로 구성된 군에서 선택된 방법.
  4. 제1항에 있어서, 단계 a) 및 b)의 올리고뉴클레오티드 주형은 dsDNA로 구성된 RNA 중합효소 프로모터 서열을 포함하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, RNA 중합효소 프로모터 서열은 T7 RNA 중합효소, T3 RNA 중합효소 및 SP6 중합효소로 구성된 군에서 선택된 RNA 중합효소에 의해 인식되는 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, RNA 중합효소 프로모터 서열은 T7 RNA 중합효소에 의해 인식되는 방법.
  7. 제4항 내지 제6항중 어느 한 항에 있어서, 단계 a) 및 b)의 올리고뉴클레오티드 주형은 표적 특이적 주형 서열로 주형 나선의 5'말단에서 신장된 이중 나선 RNA 중합효소 프로모터 서열을 포함하는 부분적 이중 나선 DNA 올리고 주형인 것을 추가적인 특징으로 하는 방법.
  8. 제4항 내지 제7항중 어느 한 항에 있어서, RNA 중합효소 프로모터 서열은 도 1에 나타난 T7 RNA 중합효소 프로모터 서열로 구성된 방법.
  9. 제1항 내지 제8항중 어느 한 항에 있어서, 표적-특이적 짧은 이중 나선 RNA는 30개 미만의 뉴클레오티드 길이인 방법.
  10. 제1항 내지 제8항중 어느 한 항에 있어서, 표적-특이적 짧은 이중 나선 RNA는 5'-말단에서 프로모터 서열로부터 전사된 뉴클레오티드 및 3'-말단에서 프로모터 서열로부터 전사된 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. a) 주형 신장된 센스 올리고리보뉴클레오티드 생성물을 형성시키기 위해 반응 혼합물내에서 체인 신장 효소와 센스 siRNA 주형을 결합하는 단계;
    b) 주형 신장된 안티센스 올리고리보뉴클레오티드 생성물을 형성시키기 위해 반응 혼합물내에서 체인 신장 효소와 안티센스 siRNA 주형을 결합하는 단계; 및
    c) 단계 a)에서 얻은 센스 올리고리보뉴클레오티드 생성물을 단계 b)에서 얻은 안티센스 올리고리보뉴클레오티드 생성물과 혼성화하는 단계를 포함하며, 단계 a) 및 b)의 siRNA 주형은 표적-특이적 주형 서열로 주형 나선의 5'-말단에서 신장된 이중 나선 RNA 중합효소 프로모터 서열 및 2 또는 3개의 추가적인 뉴클레오티드를 포함하는 작은 간섭 RNA(siRNA)의 합성 방법.
  12. 제11항에 있어서, 체인-신장 효소는 RNA 중합효소인 방법.
  13. 제12항에 있어서, RNA 중합효소는 T7 RNA 중합효소, T3 RNA 중합효소 및 SP6 중합효소로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  14. 제12항에 있어서, RNA 중합효소는 T7 RNA 중합효소로 구성된 방법.
  15. 제11항에 있어서, RNA 중합효소 프로모터 서열은 T7 RNA 중합효소, T3 RNA 중합효소 및 SP6 중합효소로 구성된 군에서 선택된 RNA 중합효소에 의해 인식되는 방법.
  16. 제15항에 있어서, RNA 중합효소 프로모터 서열은 T7 RNA 중합효소에 의해 인식되는 방법.
  17. 제16항에 있어서, RNA 중합효소 프로모터 서열은 도 1에 나타난 절단된(truncated) T7 RNA 중합효소 프로모터 서열로 구성된 방법.
  18. 제11항에 있어서, 표적-특이적 주형 서열은 5'말단에 2개의 구아노신(g) 뉴클레오티드 및 3'말단에 2개의 시토신(c) 뉴클레오티드를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 5'말단에서 RNA 중합효소 프로모터 서열로부터 전사된 뉴클레오티드 및 3'말단에서 상기 RNA 중합효소 프로모터 서열로부터 전사된 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는, 50개 미만의 뉴클레오티드의 표적-특이적 짧은 이중 나선 RNA를 포함하는 RNA를 세포내로 도입하는 것을 포함하는 세포내의 표적 유전자의 발현을 억제하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 프로모터 서열로부터 전사된 뉴클레오티드의 수 및 프로모터 서열로부터 전사된 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드의 수가 2, 3 또는 4개의 뉴클레오티드로 구성된 방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 표적-특이적 짧은 이중 나선 RNA는 2 또는 3개의 추가적인 뉴클레오티드로 3'말단에서 신장된 방법.
  22. 제19항 내지 제21항중 어느 한 항에 있어서, RNA 중합효소 프로모터 서열은 T7 RNA 중합효소, T3 RNA 중합효소 및 SP6 중합효소로 구성된 군에서 선택된 RNA 중합효소에 의해 인식되는 방법.
  23. 제19항 내지 제22항중 어느 한 항에 있어서, RNA 중합효소 프로모터 서열은 도 1에 나타난 절단된 T7 RNA 중합효소 프로모터 서열로 구성된 방법.
  24. 제19항 내지 제23항중 어느 한 항에 있어서, 표적 유전자는 세포 유전자, 내인성 유전자, 트랜스진, 또는 병원체로부터의 유전자인 방법.
  25. 제1항 내지 제18항중 어느 한 방법에 의해 얻어질 수 있는 분리된 RNA.
  26. 제25항에 있어서, RNA가 5'말단에서 RNA 중합효소 프로모터 서열로부터 전사된 뉴클레오티드 및 3'말단에서 상기 RNA 중합효소 프로모터 서열로부터 전사된 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는, 50개 미만의 뉴클레오티드의 표적-특이적 짧은 이중 나선 RNA로 구성된 분리된 RNA.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 프로모터 서열로부터 전사된 뉴클레오티드의 수 및 프로모터 서열로부터 전사된 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드의 수가 2, 3 또는 4개의 뉴클레오티드로 구성된 분리된 RNA.
  28. 제25항 내지 제27항중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA 분자의 센스 서열은 5'-xx(n12-30)yy-3'(여기서, x는 프로모터 서열로부터 전사된 뉴클레오티드이고, y는 프로모터 서열로부터 전사된 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드이고, n은 12 내지 30개의 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드이다)으로 나타낼 수 있는 분리된 RNA.
  29. 제25항 내지 제28항중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA 분자의 센스 서열은 5'-gg(n15-30)cc-3'(여기서, g는 절단된 T7 RNA 중합효소 프로모터 서열(도 1에 나타난 것과 같음)로부터 전사된 뉴클레오티드 구아노신이고, c는 절단된 T7 RNA 중합효소 프로모터 서열(도 1에 나타난 것과 같음)로부터 전사된 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드 시토신이고, n15-30은 15 내지 30개의 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드이다)으로 나타낼 수 있는 분리된 RNA.
  30. 표적-특이적 짧은 이중 나선 RNA가 3'말단에서 2 또는 3개의 추가적인 뉴클레오티드로 신장된 분리된 RNA.
  31. 제1항 내지 제18항중 어느 한 항에 따른 방법에 사용하기 위한 표적-특이적 센스 올리고뉴클레오티드 주형.
  32. 제1항 내지 제18항중 어느 한 항에 따른 방법에 사용하기 위한 표적-특이적 안티센스 올리고뉴클레오티드 주형.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 주형은 표적-특이적 주형 서열로 주형 나선의 5'말단에서 신장된, dsRNA로 구성된 RNA 중합효소 프로모터 서열를 포함하는 표적-특이적 올리고뉴클레오티드 주형.
  34. 제31항 내지 제33항중 어느 한 항에 있어서, RNA 중합효소 프로모터 서열은 도 1에 나타난 절단된 T7 RNA 중합효소 프로모터 서열로 구성된 표적-특이적 올리고뉴클레오티드 주형.
  35. 제31항 내지 제34항중 어느 한 항에 있어서, 표적-특이적 짧은 이중 나선 RNA가 30개 미만의 뉴클레오티드 길이인 표적-특이적 올리고뉴클레오티드 주형.
  36. 제31항 내지 제35항중 어느 한 항에 있어서, 표적-특이적 짧은 이중 나선 RNA가 5'-말단에서 프로모터 서열로부터 전사된 뉴클레오티드 및 3'-말단에서 프로모터 서열로부터 전사된 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적-특이적 올리고뉴클레오티드 주형.
  37. a) 표적-특이적 센스 및 안티센스 올리고뉴클레오티드 주형을 디자인하기 위한 지침; b) 체인 신장 효소; c) 전사버퍼; d) 4가지 필요한 리보뉴클레오티드 염기를 위한 뉴클레오사이드 트리포스페이트(NTP); 및 e) 센스 및 안티센스 올리고리보뉴클레오티드 생성물을 얻기 위한 정제 수단을 적어도 하나 포함하는 짧은 이중 나선 표적-특이적 RNA의 합성을 위한 키트.
  38. 제37항에 있어서, 표적-특이적 센스 및 안티센스 올리고뉴클레오티드 주형을 디자인하기 위한 지침이 하기 단계를 포함하는 방법으로 구성된 키트:
    1) 하기 서열 5'-xx (n12-30)yy-3'(여기서, x는 프로모터로부터 전사된 뉴클레오티드이고, y는 프로모터 서열로부터 전사된 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드이고, n12-30은 12 내지 30개의 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드이다)를 갖고, 표적 유전자의 코팅 서열내에 존재하는 표적-특이적 서열을 찾는 단계;
    2) 임의로 2개의 추가적인 뉴클레오티드로 신장된, 단계 1)에서 존재하는 표적-특이적 서열의 보충적 올리고뉴클레오티드 서열로 주형 나선의 5'말단에서 신장된, 본 발명에 따른 이중 나선 RNA 중합효소 프로모터 서열을 포함하는 센스 올리고뉴클레오티드 주형을 디자인하는 단계; 및
    3) 임의로 2개의 추가적인 뉴클레오티드로 신장된, 단계 1)에서 존재하는 표적-특이적 서열의 반전 올리고뉴클레오티드 서열로 주형 나선의 5'말단에서 신장된, 본 발명에 따른 이중 나선 RNA 중합효소 프로모터 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 주형을 디자인하는 단계.
  39. 제37항에 있어서, 체인 신장 효소는 RNA 중합효소, 바람직하게 T7 RNA 중합효소, T3 RNA 중합효소 및 SP6 RNA 중합효소로 구성된 군에서 선택된 RNA 중합효소로 구성된 키트
  40. 제37항 내지 제39항중 어느 한 항에 있어서, 정제 수단은 크기 배제 크로마토그라피 컬럼으로 구성된 키트.
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