ES2253565T3 - Metodo para la sintesis in vitro de arns cortos de doble cadena. - Google Patents
Metodo para la sintesis in vitro de arns cortos de doble cadena.Info
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Abstract
Un método para la síntesis de ARNs cortos específicos diana de doble cadena de una longitud menor que 30 nucleótidos que comprende los pasos de: a) combinar un patrón de oligonucleótidos sentido específico diana, un oligonucleótido de secuencia promotora T7 y una ARN polimerasa T7 en una mezcla de reacción de manera que el producto, de oligoribonucleótidos sentido, extendido patrón sea formado; b) combinar un patrón de oligonucleótidos antisentido específico diana, un oligonucleótido de secuencia promotora T7 y una ARN polimerasa T7 en una mezcla de reacción de manera que el producto, de oligoribonucleótidos antisentido, extendido patrón sea formado; c) hibridar el producto de oligoribonucleotidos sentido obtenido en el paso a) con el producto de oligoribonucleotidos antisentido complementario obtenido en el paso b), caracterizado porque; los patrones de oligonucleótidos del paso a) y b) comprenden una secuencia promotora del ARN polimerasa que consiste de la secuencia promotora de la ARN polimerasa T7 truncada como es mostrado en la Figura 1, extendida en el terminal 5¿ de la cadena patrón con la secuencia patrón específica diana, donde dicha secuencia patrón específica diana comprende en el terminal 5¿ dos nucleótidos guanosina (g) y en el terminal 3¿ dos nucleótidos citosina (c), donde además el oligonucleótido de secuencia promotora T7 es complementario a la secuencia promotora de ARN polimerasa T7 truncada del patrón de oligonucleótidos como es mostrado en la Figura 1.
Description
Método para la síntesis in vitro de ARNs
cortos de doble cadena.
La presente invención se relaciona con el campo
de la síntesis de ARNs cortos específicos diana de doble cadena. Un
método de transcripción in vitro que usa ARN polimerasas y
oligonucleótidos de ADN de secuencias específicas diana como
patrones es descrito. La presente invención encuentra uso
particularmente ventajoso en la síntesis de ARNs cortos de
interferencia (siARNs) que han sido mostrados para funcionar como
intermediarios claves en activar la degradación de una secuencia
específica del ARN durante el silenciamiento del gen
postranscripcional en plantas y la interferencia por ARN en sistemas
vertebrados e invertebrados.
El silenciamiento por ARN es un tipo remarcable
de regulación de genes basado en la selección y la degradación de
secuencias específicas de ARN. El silenciamiento por ARN fue primero
descubierto en las plantas transgénicas, donde fue llamada
cosupresión o silenciamiento del gen postranscripcional (PTGS). Sólo
recientemente un proceso de degradación de la secuencia específica
del ARN, el ARN de interferencia (ARNi), en relación con el PTGS ha
sido encontrada en ciliares, hongos y una variedad de animales desde
C. elegans hasta células humanas y de ratones. Aunque ellos
pueden diferir en detalle, el ARNi y el PTGS resultan del mismo
mecanismo altamente conservado, indicando un origen antiguo. El
proceso básico incluye un ARN de doble cadena (dsARN) que es
escindido en ARNs pequeños de interferencia de doble cadena (siARN)
que guían el reconocimiento y la escisión seleccionada del mARN
homólogo. Estos dsARN pequeños semejan productos de rotura de una
digestión como la RNasa III. En particular, los siARNs son ARNs
cortos específicos diana de doble cadena donde cada cadena de
siARNs porta los terminales 5' monofosfato, 3' hidroxil y 3'
protuberantes con 2-3 nucleótidos (Caplen, N. y
otros, 2001, PNAS (98) 9742-9747).
El ARNi ha atraído considerable atención debido a
que éste es un medio de dislocar la actividad de los genes
específicos, siendo particularmente útil en especies que fueron
previamente consideradas como no corregibles a los análisis
genéticos. Estudios recientes demostraron que los siARNs sintéticos
pueden inducir la inhibición específica del gen de la expresión en
C. elegans y en líneas celulares de humanos y ratones (Caplen
N., y otros, 2001, PNAS (98) 9742-9747);
Elbashir S., y otros, 2001, Nature (411)
494-498). En dichas publicaciones fue además
demostrado que en las células de mamíferos los siARNs proporcionan
una respuesta de secuencia específica comparada con el uso de
dsARNs más largos los cuales inactivan el factor de traducción
eIF2\alpha, conduciendo a una supresión generalizada de la
síntesis de proteínas. También, en comparación con la inhibición de
la expresión del gen usando la tecnología antisentido, los siARNs
parecen ser muy estables y de esta forma pueden no requerir las
modificaciones químicas extensivas que requieren los
oligonucleótidos de ARN antisentido de cadena simple para mejorar
la vida media in vivo.
Es por lo tanto esperado que el silenciamiento
por ARN usando siARNs se convertirá en una herramienta importante
en el control de la expresión del gen así como en la genómica
funcional y en una variedad de aplicaciones biotecnológicas desde
el cultivo molecular hasta posiblemente incluso la terapia génica en
animales. Ya que los siARNs diferentes pueden trabajar con
diferente efectividad en sus dianas, la prueba de más de un siARN
para una diana particular será deseable. En adición, los programas
genéticos inversos a escala del genoma requerirán grandes números
de siARNs.
Sin embargo, la producción de oligos de ARN
específico diana de doble cadena por síntesis química tradicional
sigue siendo relativamente lenta y cara comparada con la síntesis de
oligos de ADN. Además, la síntesis química de oligos de ARN
requiere de sintetizadores especiales y de protocolos de
purificación complejos. La presente invención proporciona una
aproximación alternativa para producir ARNs cortos específicos diana
de doble cadena basada en la transcripción in vitro usando
un bacteriófago u otras polimerasas virales y patrones de
oligonucleótidos de secuencia específica diana. En comparación con
la síntesis química de los oligos de ARN la presente invención es
relativamente rápida y fácil de ejecutar.
Sin embargo, los siARNs transcritos in
vitro difieren de los oligos de ARN químicamente sintetizados en
dos formas. En primer lugar, los oligos de ARN químicamente
sintetizados, idénticos a los siARNs que existen en la naturaleza
tienen un grupo 5' monofosfato. Los siARNs transcritos in
vitro mantienen un grupo 5' trifosfato. Se desconocía si la
presencia de este grupo trifosfato hacía a los siARNs transcritos
in vitro incompetentes para inducir la interferencia de
ARN.
En segundo lugar, los oligos de ARN químicamente
sintetizados son altamente purificados usando entre otros el
Intercambio de Iones y la HPLC en Fase Inversa donde una pureza y
calidad de los compuestos sintetizados es adicionalmente evaluada
usando entre otros el NMR y el análisis de espectrometría en masa.
En la presente invención un protocolo de purificación crudo, simple
es usado comprendiendo la cromatografía por exclusión de tamaño, la
extracción por fenol:cloroformo y la precipitación por etanol. Fue
otra vez incierto si la omisión de un protocolo extensivo de
purificación afectaría la utilidad de los ARNs transcritos "in
vitro" en el silenciamiento mediado por el ARN.
De manera sorprendente, la presente invención
demuestra que el grupo 5' trifosfato y la purificación cruda no
afecta la actividad de silenciamiento por ARN de los ARNs
transcritos "in vitro" y proporciona una aproximación
alternativa a la síntesis de siARNs que la hace accesible como una
herramienta de búsqueda en un laboratorio de biología molecular
promedio.
Los métodos in vitro existentes para
sintetizar ARNs pequeños de cadena simple de longitud y secuencia
definidas (Milligan F. y otros, 1987, Nucleic Acid Res. (15)
8783-8798; Lehman K.A. y Bass, B.L., 1999, J. Mol.
Biol. (291) 1-13), no fueron directamente aplicables
para la síntesis de ARNs pequeños de interferencia. El problema
reside en el hecho de que las ARN polimerasas tienden a transcribir
algunos nucleótidos de la secuencia promotora en el transcrito.
Como consecuencia, los dsARNs específicos diana los cuales pueden
ser producidos por apareamiento de las moléculas de ARN de cadena
simple complementarias generadas usando los métodos antes
mencionados, deben comprender en el terminal 5' los nucleótidos
transcritos de la secuencia promotora y en el terminal 3' los
nucleótidos complementarios a los nucleótidos transcritos de la
secuencia promotora. Bien pudiera ser que el mARN de la secuencia
diana no estirada de una longitud de secuencia definida exista
cuando el terminal 5' consista de los nucleótidos transcritos de la
secuencia promotora y el terminal 3' de los nucleótidos
complementarios a los nucleótidos transcritos de la secuencia
promotora. La presente invención resuelve este problema
proporcionando secuencias promotoras de ARN polimerasas truncadas
donde uno o más nucleótidos en el terminal 5' de la cadena patrón de
la secuencia promotora son reemplazados por nucleótidos que son
parte de la secuencia específica diana. Estas sustituciones no
afectan los rendimientos de la transcripción in vitro, pero
aumentan la posibilidad de que al menos una secuencia específica
diana de una longitud de secuencia definida exista en el mARN de la
proteína diana, donde el terminal 5' consiste de los nucleótidos
transcritos de la secuencia promotora y el terminal 3' de los
nucleótidos complementarios a los nucleótidos transcritos de la
secuencia promotora.
Este y otros aspectos de la invención serán
descritos aquí a continuación.
La presente invención proporciona un método in
vitro para la síntesis de ARNs cortos específicos diana de
doble cadena que comprende los pasos de a) combinar un patrón de
oligonucleótidos sentido específicos diana y una enzima extendedora
de cadena en una mezcla de reacción de manera que el producto de
oligoribonucleotidos sentido extendido patrón sea formado; b)
combinar un patrón de oligonucleótidos antisentido específicos diana
y una enzima extendedora de cadena en una mezcla de reacción de
manera que el producto de oligoribonucleotidos antisentido extendido
patrón sea formado; y c) hibridar el producto de
oligoribonucleotidos sentido obtenido en el paso a) con el
producto de oligoribonucleotidos antisentido complementario obtenido
en el paso b).
En una realización adicional de la presente
invención la enzima extendedora de cadena es una ARN polimerasa y
los patrones de oligonucleótidos del paso a) y b) comprenden una
secuencia promotora de ARN polimerasa, preferiblemente consistiendo
de dsADN. En una realización más preferida la ARN polimerasa es la
polimerasa T7 y los patrones de los oligonucleótidos del paso a) y
b) comprenden una secuencia promotora de la ARN polimerasa T7
extendida en el terminal 5' de la cadena patrón con la secuencia
específica diana patrón, opcionalmente extendida con 2 o 3
nucleótidos adicionales. La presente invención encuentra uso
particular en la síntesis de los ARNs pequeños de interferencia. Es
por lo tanto, un objetivo adicional de la presente invención
proporcionar un método para la síntesis de ARNs cortos específicos
diana de doble cadena, donde dichos ARNs cortos específicos diana
de doble cadena son de longitud menor que 50 nucleótidos,
preferiblemente menores que 30 nucleótidos, aún más preferiblemente
de una longitud de 30-12 nucleótidos, caracterizado
además por comprender en el terminal 5' nucleótidos transcritos de
la secuencia promotora y en el terminal 3' nucleótidos
complementarios a los nucleótidos transcritos de la secuencia
promotora.
Por consiguiente, la presente invención
proporciona un método para la síntesis de ARNs pequeños de
interferencia que comprende los pasos de a) combinar un patrón de
siARNs sentido con una enzima extendedora de cadena en una mezcla
de reacción de manera que el producto de oligoribonucleótidos
sentido extendido patrón sea formado; b) combinar un patrón siARNs
antisentido con una enzima extendedora de cadena en una mezcla de
reacción de manera que el producto de oligoribonucleótidos
antisentido extendido patrón sea formado; y c) hibridar el producto
de oligoribonucleótidos sentido obtenido en el paso a) con el
producto de oligoribonucleótidos antisentido obtenido en el paso
b); donde los patrones de siARNs del paso a) y b) comprenden una
secuencia promotora de ARN polimerasa de doble cadena extendida en
el terminal 5' de la cadena patrón con la secuencia patrón
específica diana y 2 o 3 nucleótidos adicionales. En una
realización preferida la enzima extendedora de cadena es la ARN
polimerasa T7 y los patrones siARNs comprenden una secuencia
promotora de ARN polimerasa T7 de doble cadena, preferiblemente la
secuencia promotora de ARN polimerasa T7 truncada mostrada en la
Figura 1.
Es un objeto adicional de la presente invención
proporcionar kits para ejecutar los métodos de acuerdo a la
invención así como los compuestos para el uso en cualquiera de los
métodos descritos.
Figura 1: Esquema de producción de
oligonucleótidos. Un ejemplo es dado para el diseño de los patrones
de oligonucleótidos de siARNs para una secuencia diana de 19
nucleótidos dentro de la secuencia de codificación de mARN con
JNK2\alpha1.
Figura 2A: siARNs específicos diana de doble
cadena con GL3 usado en un ensayo reportero luciferasa. siARN GL3
1, siARN GL3 2 y siARN GL3 3 fueron hechos usando el método in
vitro de la invención. El oligo siARN GL3 fue químicamente
sintetizado (Vargeese, C. y otros, 1988, Nucleic Acid Res.
(26), 1046-1050.
Figura 2B: Efectos de siARNs específicos diana
con GL3 y de siARNs antisentido de cadena simple con GL3 en la
expresión de la luciferasa en células HeLa. Las células
transfectadas con luciferasa GL3-control +
construcciones reporteras fueron tomadas como 100%.
Figura 2C: Curva de respuesta a la dosis del
efecto inhibitorio de la siARN GL3 1 sobre la expresión de la
luciferasa en células HeLa transfectadas con
pGL3-control.
Figura 3A: siARNs específicos diana de doble
cadena con EGFP usados en un análisis FACS de las células HeLa
transfectadas con EGFP. ds siARN EGFP 2 fue hecho usando el método
in vitro de la invención. El oligo ds siARN EGFP fue
químicamente sintetizado (Vargeese, C. y otros, 1988, Nucleic
Acid Res. (26), 1046-1050).
Figura 3B: Efectos del siARNs específicos diana
con EGFP y de siARNs de cadena simple antisentido con EGFP en la
fluorescencia de GFP en células HeLa transfectadas con EGFP usando
el análisis FACScan (Beckton-Dickinson). Las células
transfectadas con ADN EGFP solamente fueron tomadas como 100%.
Figura 4A: siARNs específicos diana de doble
cadena JNK2\alpha1 usado en las células transfectadas con
JNK2\alpha1.
Figura 4B: siARNs específicos diana de doble
cadena CDS-1 usado en las células HeLa transfectadas
con CDS-1.
Esta invención se relaciona con el campo de la
síntesis de ARNs cortos específicos diana de doble cadena y está
basada en la transcripción in vitro de patrones de
oligonucleótidos que usan enzimas extendedoras de cadena.
ARNs cortos específicos diana de doble cadena
como es usado aquí se refiere a un ARN de doble cadena que une
parte de la secuencia que codifica para una proteína específica, es
decir la proteína diana. Estas secuencias son de longitud
preferiblemente menor que 50 nucleótidos, más preferiblemente
menores que 30 nucleótidos, aún más preferiblemente de longitud de
15-25 nucleótidos. En una realización particular los
ARNs cortos específicos diana de doble cadena son útiles en la
interferencia por ARN en sistemas de vertebrados e invertebrados
como ARNs pequeños de interferencia (siARNs). Los siARNs como son
usados aquí son moléculas de dsARNs cortas de 12-30
nucleótidos, con 2- o 3- nucleótidos protuberantes en el terminal
3'. En una realización preferida los siARNs son de longitud de
15-25 nucleótidos con 2 nucleótidos protuberantes en
los terminales 3'. Aún más preferido los siARNs son de longitud de
17-22 nucleótidos con 2 nucleótidos protuberantes en
los terminales 3'.
Para obtener dsARN ambos un patrón de
oligonucléotidos sentido y uno antisentido son requeridos. El
término "patrones de oligonucleótidos" como es usado aquí se
refiere a las estructuras que en algunos procesos físicos directos
pueden provocar la modelación de una segunda estructura, usualmente
complementaria a ésta en algún sentido. En la biología actual casi
exclusivamente usado para referirse a una secuencia de nucleótidos
que está dirigida a la síntesis de una secuencia complementaria a
ésta por las reglas de apareamiento de bases de
Watson-Crick (El Diccionario de Células y Biología
Molecular, 3ra. Edición, Academic Press, Londres, 1999 (ISBN
0-12-432565-3)).
Estas secuencias patrones tienen una longitud preferiblemente menor
que 50 nucleótidos, y pueden ser tanto patrones de oligos de ADN de
doble cadena, de cadena simple o parcialmente de cadena simple.
Los patrones de oligonucleótidos pudieran tanto
ser patrones de ADN sintéticos o patrones generados como ADN de
plásmidos linealizados a partir de una secuencia específica diana
clonada en un sitio de restricción de un vector tal como por
ejemplo un vector de clonación procariótico (pUC13, pUC19) o
sistemas de clonación PCR tales como el sistema de clonación TOPO
de Invitrogen. Los patrones de ADN sintéticos pueden ser producidos
de acuerdo a técnicas bien conocidas en el arte. En una realización
preferida de la presente invención los patrones de oligonucleótidos
consisten de patrones de oligo de ADN parcialmente de cadena simple
que comprenden una secuencia promotora de ARN polimerasa que
consiste de dsADN. En esta realización los ARNs cortos específicos
diana de doble cadena están además caracterizados porque comprenden
en el terminal 5' nucleótidos transcritos de la secuencia promotora
de ARN polimerasa y en el terminal 3' nucleótidos complementarios a
los nucleótidos transcritos de la secuencia promotora.
Una "Enzima extendedora de cadena" como es
definido aquí se refiere a una enzima capaz de formar un polímero
de ARN a partir del ribonucleósido 5'trifosfato; el ARN formado es
complementario al patrón de ADN. La enzima adiciona unidades de
nucleótidos a los terminales 3'-hidroxilo de la
cadena de ARN y así construye el ARN en la dirección 5'
\rightarrow 3', no paralela a la cadena de ADN usada como patrón.
Tales enzimas extendedoras de cadena podrían por ejemplo ser ADN
polimerasas dependientes tales como ADN polimerasas I, II y III; ADN
polimerasas dirigidas por ARN tales como RSV y
AMV-polimerasas; ARN polimerasas dirigidas por ADN
tales como ARN polimerasa de E. coli; ARN polimerasas
dirigidas por ARN tales como las ARN polimerasas del bacteriófago,
también conocido como ARN replicasas; o las polinucleótidos
fosforilasas bacterianas.
En una realización preferida la enzima
extendedora de cadena es una ARN polimerasa. Dichas ARN polimerasas
requieren la presencia de un sitio de iniciación específico dentro
del patrón de ADN. Este sitio de iniciación, en lo adelante
referido como "secuencia promotora de ARN polimerasa", es el
sitio donde la ARN polimerasa se une al patrón de ADN. Es también
el sitio reconocido por la ARN polimerasa como una señal de
iniciación, para indicar dónde comienza la transcripción para formar
el ARN.
Por consiguiente, la presente invención
proporciona patrones de oligonucleótidos que comprenden una
secuencia promotora de ARN polimerasa que consiste de dsADN donde
la secuencia promotora es reconocida por una ARN polimerasa. El
término "reconocida" como es usado aquí pretende incluir todas
las secuencias promotoras de ARN polimerasa truncadas cortadas por
uno o más nucleótidos en uno u otro sitio de la secuencia promotora
con poco o ningún efecto en el enlace de la ARN polimerasa al sitio
de iniciación y con poco o ningún efecto en la reacción de
transcripción. Por ejemplo, Milligan y otros (Milligan F.
y otros, 1987, Nature (15) 8783-8798)
demostraron para la ARN polimerasa T7 que su promotor no parece
requerir el ADN en la cadena no patrón en la región -17 a -14 y -3 a
+6, ya que eliminar estos nucleótidos tiene un pequeño efecto en la
reacción de transcripción. También, el truncado de la cadena patrón
más allá de la posición +2, es decir las posiciones +3 a +6, tiene
un pequeño efecto en el rendimiento de la reacción (Milligan F. y
otros, 1987, Nature (15) 8783-8798). Las
secuencias promotoras de ARN polimerasa truncadas así obtenidas
significa que están incluidas como "secuencias promotoras de ARN
polimerasa reconocidas por dicha ARN polimerasa". Así, en una
realización específica de la presente invención la secuencia
promotora de ARN polimerasa consiste de la secuencia promotora de
ARN polimerasa truncada donde uno o más nucleótidos son eliminados
en uno o ambos lados de la cadena patrón de la secuencia promotora.
Preferiblemente, el promotor de ARN polimerasa truncado consiste de
una secuencia promotora de ARN polimerasa T7 truncada en las
posiciones +3 a +6 en el terminal 5' de la cadena patrón como es
mostrado en la Fig. 1.
Por consiguiente, es un primer objeto de la
presente invención proporcionar un método para la síntesis de ARNs
cortos específicos diana de doble cadena. El método comprendiendo
los pasos de a) combinar un patrón de oligonucleótidos sentido
específico diana y una enzima extendedora de cadena en una mezcla de
reacción de manera que el producto de oligoribonucleotidos sentido
extendido patrón sea formado; b) combinar un patrón de
oligonucleótidos antisentido específico diana y una enzima
extendedora de cadena en una mezcla de reacción de manera que el
producto de oligoribonucleotidos antisentido extendido patrón sea
formado; y c) hibridar el producto de oligoribonucleotidos sentido
obtenido en el paso a) con el producto de oligoribonucleotidos
antisentido obtenido en el paso b).
La enzima extendedora de cadena de acuerdo al
método de la invención es preferiblemente una ARN polimerasa
seleccionada del grupo que consiste de ARN polimerasa T7, ARN
polimerasa T3 y ARN polimerasa SP6. En una realización más
preferida la ARN polimerasa consiste de ARN polimerasa T7.
Por consiguiente, los patrones de
oligonucleótidos usados en un método de acuerdo a la invención,
comprenden una secuencia promotora de ARN polimerasa que consiste de
dsADN, donde la secuencia promotora de ARN polimerasa es reconocida
por una ARN polimerasa seleccionada del grupo que consiste de ARN
polimerasa T7, ARN polimerasa T3 y ARN polimerasa SP6. En una
realización preferida la secuencia promotora de ARN polimerasa es
reconocida por la ARN polimerasa T7. En una realización más
preferida la secuencia promotora de ARN polimerasa consiste de una
secuencia promotora de ARN polimerasa T7 truncada como es mostrado
en la Figura 1.
En una realización adicional, los patrones de
oligonucleótidos usados en un método de acuerdo a la invención están
caracterizados por ser patrones de oligo de ADN parcialmente de
cadena doble que comprenden una secuencia promotora de ARN
polimerasa de doble cadena la cual es extendida en la terminal 5' de
la cadena patrón con la secuencia patrón específica diana,
opcionalmente extendida con 2 o 3 nucleótidos adicionales. En una
realización más preferida la secuencia patrón específica diana
comprende en el terminal 5'nucleótidos transcritos de la secuencia
promotora y en el terminal 3' nucleótidos complementarios a los
nucleótidos de la secuencia promotora. En una realización
específica donde los patrones de oligonucléotidos comprenden la
secuencia promotora de ARN polimerasa T7 truncada mostrada en la
Figura 1, la secuencia patrón específica diana comprende en el
terminal 5' dos nucleótidos (g) guanosina y en terminal 3' dos
nucleótidos (c) citosina.
Por consiguiente, en un segunda realización de la
presente invención se proporciona un método para la síntesis de
ARNs pequeños de interferencia (siARNs) que comprende los pasos de
a) combinar un patrón de siARNs sentido con una enzima extendedora
de cadena en una mezcla de reacción de manera que el producto de
oligoribonucleótidos sentido extendido patrón sea formado; b)
combinar un patrón siARNs antisentido con una enzima extendedora de
cadena en una mezcla de reacción de manera que el producto de
oligoribonucleótidos antisentido extendido patrón sea formado; y c)
hibridar el producto de oligoribonucleótidos sentido obtenido en el
paso a) con el producto de oligoribonucleótidos antisentido
obtenido en el paso b); donde los patrones de siARNs del paso a) y
b) comprenden una secuencia promotora de ARN polimerasa de doble
cadena extendida en el terminal 5' de la cadena patrón con la
secuencia patrón específica diana y 2 o 3 nucleótidos adicionales.
En una realización preferida la enzima extendedora de cadena usada
en la síntesis de siARNs consiste de una ARN polimerasa,
preferiblemente seleccionada de ARN polimerasa T7, ARN polimerasa
T3 o ARN polimerasa SP6. Por consiguiente los patrones de siARNs
usados en el método de acuerdo a la invención comprenden una
secuencia promotora de ARN polimerasa, la cual es reconocida por
una ARN polimerasa, seleccionada del grupo que consiste de ARN
polimerasa T7, ARN polimerasa T3 y ARN polimerasa SP6. En una
realización más preferida la enzima extendedora de cadena es la ARN
polimerasa T7. En consecuencia, en una realización preferida la
secuencia promotora de ARN polimerasa de los patrones de siARNs es
reconocida por la ARN polimerasa T7. En una realización adicional el
patrón de siARNs comprende la secuencia promotora de ARN polimerasa
T7 truncada de doble cadena como es mostrada en la Figura 1, donde
dicha secuencia promotora de ARN polimerasa T7 truncada es extendida
en el terminal 5' de la cadena patrón de acuerdo al método de la
invención y donde la secuencia patrón específica diana comprende en
el terminal 5' los nucleótidos transcritos de la secuencia promotora
y en el terminal 3' los nucleótidos complementarios a los
nucleótidos transcritos de la secuencia promotora. En una
realización específica los patrones de siARNs usados en un método
de la invención, comprenden la secuencia promotora de ARN polimerasa
T7 truncada de doble cadena como es mostrado en la Figura 1, donde
dicha secuencia promotora de ARN polimerasa T7 truncada es
extendida en el terminal 5' de la cadena patrón de acuerdo al método
de la invención y donde la secuencia patrón específica diana
comprende en el terminal 5' dos nucleótidos guanosina (g) y en el
terminal 3' dos nucleótidos citosina (c).
Las condiciones de reacción de los métodos
anteriormente mencionados para obtener un producto de
oligoribonucleotidos extendido patrón son generalmente conocidas en
el arte. En esencia, los materiales de partida para la transcripción
enzimática para producir ARN son un patrón de ADN, una enzima ARN
polimerasa y nucleósidos trifosfatos (NTPs) para las cuatro bases
de ribonucleótidos requeridas, adenina, citosina, guanina y uracilo,
en un buffer de reacción óptimo para la actividad enzimática de la
ARN polimerasa. Por ejemplo, la mezcla de reacción para una
transcripción in vitro usando la ARN polimerasa T7
típicamente contiene, ARN polimerasa T7 (0.05 mg/ml), patrones de
oligonucleótidos (1 \muM), cada NTP (4 mM), y MgCl_{2} (25 mM),
el cual suministra Mg^{2+}, un co-factor para la
polimerasa. Esta mezcla es incubada a 37ºC y pH 8.1 (en por ejemplo
10 mM de buffer Tris-HCl) por varias horas
(Milligan J. & Uhlenbeck O., 1989, Methods Enzymol (180)
51-62). Los kits que comprenden los antes
mencionados componentes son comercialmente disponibles como el kit
T7 MEGA shortscript^{TM}
(Ambion).
(Ambion).
Los protocolos de purificación para obtener los
productos de oligonucleótidos de alguno de los métodos antes
mencionados son generalmente conocidos en el arte y comprenden entre
otros la electroforesis en gel, la cromatografía por exclusión de
tamaño, la electroforesis capilar y la HPLC. La electroforesis en
gel es típicamente usada para purificar transcritos en su longitud
total a partir de la mezcla de reacción, pero esta técnica no es
adaptada para la producción en gran escala. En una realización
preferida de la presente invención el medio de purificación para
obtener los productos de oligoribonucleótidos consiste de la
cromatografía por exclusión de tamaño, tal como la resina Sephadex
G-25, opcionalmente combinada con una extracción por
fenol:cloroformo:isoamil y la precipitación por etanol.
Es un tercer objeto de la presente invención
proporcionar kits para ejecutar los métodos de acuerdo a la
invención. En una realización el kit comprende uno o más de los
siguientes componentes a) instrucciones para diseñar patrones de
oligonucleótidos sentido y antisentido específicos diana; b) una
enzima extendedora de cadena; c) buffers de transcripción; d) los
nucleósidos trifosfatos (NTPs) para las cuatro bases de
ribonucleótidos requeridas; e) medios de purificación para obtener
los productos de oligoribonucleótidos sentido y antisentido. En una
realización preferida de la presente invención la enzima extendedora
de cadena proporcionada en el kit consiste de ARN polimerasa,
preferiblemente una ARN polimerasa seleccionada del grupo que
consiste de ARN polimerasa T7, ARN polimerasa T3 y ARN polimerasa
SP6. Aún más preferido la enzima extendedora de cadena proporcionada
en el kit de acuerdo a la invención consiste de ARN polimerasa
T7.
El medio de separación proporcionado en un kit de
acuerdo a la invención generalmente se refiere a los protocolos de
purificación conocidos en el arte para obtener productos de
oligoribonucleótidos a partir de la mezcla de reacción y comprende
entre otros la electroforesis en gel, la cromatografía por exclusión
de tamaño, la electroforesis capilar y la HPLC. En una realización
preferida de la presente invención el medio de purificación
proporcionado en un kit de acuerdo a la invención consiste de
resinas o columnas de cromatografía por exclusión de tamaño, tal
como la resina Sephadex G-25.
Las instrucciones para diseñar patrones de
oligonucleótidos sentido y antisentido específicos diana deben
contemplar el método ejemplificado en la figura 1 de la presente
invención. En esencia el método comprende los siguientes pasos;
1) buscar una secuencia específica diana
localizada dentro de la secuencia de codificación del gen diana y
que tenga las secuencias siguientes
5'-xx(n_{12-30})yy-3'.
Donde, x se refiere a los nucléotidos transcritos del promotor, y
se refiere a los nucleótidos complementarios a los nucleótidos
transcritos de la secuencia promotora, y n_{12-30}
se refiere a cualquier oligonucleótido de 12 a 30 nucleótidos.
2) diseñar un patrón de oligonucleótidos sentido
que comprenda una secuencia promotora de ARN polimerasa de doble
cadena de acuerdo a la invención extendida en el terminal 5' de la
cadena patrón con la secuencia de oligonucleótidos complemento de la
secuencia específica diana localizada en el paso 1), opcionalmente
extendida con dos nucleótidos adicionales.
3) diseñar un patrón de oligonucleótidos
antisentido que comprenda una secuencia promotora de ARN polimerasa
de doble cadena de acuerdo a la invención extendida en el terminal
5' de la cadena patrón con la secuencia de oligonucleótidos inversa
de la secuencia específica diana localizada en el paso 1),
opcionalmente extendida con dos nucleótidos adicionales.
En una realización preferida los métodos de la
presente invención usan la ARN polimerasa T7 como enzima extendedora
de cadena. En dicha realización el método para diseñar patrones de
oligonucleótidos sentido y antisentido específicos diana
comprenderían los siguientes pasos;
1) buscar una secuencia específica diana
localizada dentro de la secuencia de codificación del gen diana y
que tiene la siguiente secuencia
5'-gg(n_{12-30})cc-3';
2) diseñar un patrón de oligonucleótidos sentido
que tiene la siguiente secuencia
- 5' TAATACGACTCACTATAGG
- 3' ATTATGCTGAGTGATATCC (n complemento)_{12-30} gg
opcionalmente extendida con dos nucleótidos
adicionales, donde (n complemento)_{12-30}
se refiere a la secuencia de oligonucleótidos complemento de la
secuencia específica diana localizada en el paso 1); y
3) diseñar un patrón de oligonucleótidos
antisentido que tiene la siguiente secuencia
- 5' TAATACGACTCACTATAGG
- 3' ATTATGCTGAGTGATATCC (n inversa)_{12-30} gg
opcionalmente extendida con dos nucleótidos
adicionales, donde (n inverso)_{12-30} se
refiere a la secuencia de oligonucleótidos inversa de la secuencia
específica diana localizada en el paso 1).
En una realización específica los métodos de la
presente invención son usados para la síntesis de ARNs pequeños de
interferencia (siARNs). En dicha realización el método para diseñar
patrones de siARNs sentido y antisentido específicos diana
comprenderían los siguientes pasos;
1) buscar una secuencia específica diana
localizada dentro de la secuencia de codificación del gen diana y
que tiene la siguiente secuencia
5'-xx(n_{15-30})yy-3'.
Donde, x se refiere a los nucleótidos transcritos del promotor, y
se refiere a los nucleótidos complementarios a los nucleótidos
transcritos de la secuencia promotora, y n_{15-30}
se refiere a cualquier oligonucleótido de 15 a 30 nucleótidos;
2) diseñar un patrón de siARNs de
oligonucleótidos sentido de que comprende la secuencia promotora de
ARN polimerasa de doble cadena de acuerdo a la invención extendida
en el terminal 5' de la cadena patrón con la secuencia de
oligonucleótidos complemento de la secuencia específica diana
localizada en el paso 1), extendida con dos nucleótidos
adicionales, preferiblemente dos residuos adenina;
3) diseñar un patrón de siARNs de
oligonucleótidos antisentido que comprende la secuencia promotora de
ARN polimerasa de doble cadena de acuerdo a la invención extendida
en el terminal 5' de la cadena patrón con la secuencia de
oligonucleótidos inversa de la secuencia específica diana localizada
en el paso 1), extendida con dos nucleótidos adicionales,
preferiblemente dos residuos adenina.
En la realización específica, donde los métodos
para sintetizar siARNs hacen uso de la ARN polimerasa T7 como
enzima extendedora de cadena, el método para diseñar los patrones de
siARNs sentido y antisentido específicos diana comprenderían los
siguientes pasos;
1) buscar una secuencia específica diana
localizada dentro de la secuencia de codificación del gen diana y
que tiene la siguiente secuencia
5'-gg(n_{15-30})cc-3';
2) diseñar un patrón de siARNs de
oligonucleótidos sentido que tiene la siguiente secuencia
- 5' TAATACGACTCACTATAGG
- 3' ATTATGCTGAGTGATATCC (n complemento)_{15-30} gg aa
donde (n
complemento)_{15-30} se refiere a la
secuencia de oligonucleótidos complemento de la secuencia
específica diana localizada en el paso 1); y
3) diseñar un patrón de siARNs de
oligonucleótidos antisentido que tiene la siguiente secuencia
- 5' TAATACGACTCACTATAGG
- 3' ATTATGCTGAGTGATATCC (n inversa)_{15-30} gg aa
donde (n
inversa)_{15-30} se refiere a la secuencia
de oligonucleótidos inversa de la secuencia específica diana
localizada en el paso 1).
Por consiguiente, la presente invención
proporciona un kit para la síntesis de ARNs cortos específicos diana
de doble cadena el kit comprendiendo al menos uno de los siguientes
componentes; a) instrucciones para diseñar patrones de
oligonucleótidos sentido y antisentido específicos diana; b) una
enzima extendedora de cadena; c) buffers de transcripción; d) los
nucleósidos trifosfatos (NTPs) para las cuatro bases de
ribonucleótidos requeridas; e) medios de purificación para obtener
los productos de oligoribonucleótidos sentido y antisentido.
Así en una realización adicional la presente
invención proporciona kits para la síntesis de ARNs pequeños de
interferencia el kit comprendiendo al menos uno de los siguientes
componentes; a) instrucciones para diseñar patrones de siARNs
sentido y antisentido específicos diana; b) una enzima extendedora
de cadena; c) buffers de transcripción; d) los nucleósidos
trifosfatos (NTPs) para las cuatro bases de ribonucleótidos
requeridas; e) medios de purificación para obtener los productos de
oligoribonucleótidos sentido y antisentido.
Es también un objeto de la presente invención
proporcionar los medios para cualquiera de los métodos descritos
para la síntesis in vitro de ARNs cortos de doble cadena. Por
consiguiente la presente invención proporciona;
- i)
- un método para diseñar patrones de oligonucleótidos sentido y antisentido específicos diana
- ii)
- una enzima extendedora de cadena de acuerdo a la invención para uso en un método para la síntesis in vitro de ARNs cortos de doble cadena
- iii)
- medios de purificación para obtener los productos oligoribonucleótidos sentido y antisentido
- iv)
- reactivos para la mezcla de reacción de manera que los productos de oligoribonucleótidos sentido y antisentido sean formados a partir de los patrones de oligonucleótidos sentido y antisentido específicos diana usando una enzima extendedora de cadena de acuerdo a la invención.
Es adicionalmente descrito usar los siARNs
obtenidos por un método de la presente invención en un proceso para
inhibir la expresión de un gen diana en una célula. El proceso
comprendiendo la introducción de siARNs obtenidos por un método de
la presente invención, en una célula.
El gen diana puede ser un gen derivado de la
célula (es decir, un gen celular), un gen endógeno (es decir, un
gen celular presente en el genoma), un transgen (es decir, una
construcción génica insertada en un sitio ectópico en el genoma de
la célula), o un gen de un patógeno el cual es capaz de infectar un
organismo a partir del cual la célula es derivada. Dependiendo del
gen diana particular y de la dosis de material de ARN de doble
cadena entregada, este proceso puede proporcionar una pérdida
parcial o completa de la función para el gen diana.
La célula con el gen diana puede ser derivada de
o contenida en cualquier organismo. El organismo puede ser una
planta, un animal, un protozoo, una bacteria, un virus, o un hongo.
La planta puede ser una monocot, dicot o gimnosperma; el animal
puede ser un vertebrado o invertebrado. La célula que tiene el gen
diana puede ser de la línea germinal o somática, totipotente o
pluripotente, de división o de no división, de parenquimia o
epitelio, inmortalizada o transformada, o similares. La célula puede
ser una célula madre o una célula diferenciada. Los tipos de
células que son diferenciadas incluyen adipositos, fibroblastos,
miocitos, cardiomicitos, endotelio, neuronas, neuroglía, células de
sangre, megakariocitos, linfocitos, macrófagos, neutrófilos,
eosinófilos, basófilos, mastocitos, leucocitos, granulocitos,
keratinocitos, condrocitos, osteoblastos, osteoclastos, hepatocitos,
y células de glándulas endocrinas o exocrinas.
El ARN aislado obtenido por un método de la
presente invención consiste de ARNs cortos específicos diana de
doble cadena, donde dichos ARNs cortos específicos diana de doble
cadena tienen una longitud menor que 50 nucleótidos,
preferiblemente menor que 30 nucleótidos, aún más preferiblemente
30-12 nucleótidos, caracterizado por comprender en
el terminal 5' nucleótidos transcritos de la secuencia promotora y
en el terminal 3' nucleótidos complementarios a los nucleótidos
transcritos de la secuencia promotora, preferiblemente el número de
nucleótidos transcritos de la secuencia promotora y el número de
nucleótidos complementarios a los nucleótidos transcritos de la
secuencia promotora consiste de 2, 3, o 4 nucleótidos, más
preferiblemente de 2 nucleótidos.
Los ARNs cortos de doble cadena obtenidos por un
método de la presente invención son opcionalmente extendidos en el
terminal 3' con 2 o 3 nucleótidos adicionales y en una realización
adicional de la presente invención pudieran estar representados
teniendo la siguiente secuencia sentido
5'-xx(n_{12-30})yy-3'
donde x se refiere a los nucleótidos transcritos de la secuencia
promotora, y se refiere a los nucleótidos complementarios a los
nucleótidos transcritos de la secuencia promotora, y
n_{12-30} se refiere a cualquier oligonucleótido
de 12 a 30 nucleótidos. En una realización específica los ARNs
cortos de doble cadena tienen una secuencia sentido
5'-gg(n_{15-30})cc-3'
donde g se refiere al nucleótido guanosina transcrito de la
secuencia promotora de ARN polimerasa T7 truncada (como es mostrado
en la Fig. 1), c se refiere al nucleótido citosina complementario a
los nucleótidos transcritos a partir de la secuencia promotora de
ARN polimerasa T7 truncada (como es mostrado en la Fig. 1), y
n_{15-30} se refiere a cualquier oligonucleótido
de 15 a 30 nucleótidos.
El ARN puede ser introducido directamente en la
célula (es decir, intracelularmente); o introducido
extracelularmente en una cavidad, espacio intersticial, en la
circulación de un organismo, introducido oralmente, o pueden ser
introducidos bañando un organismo en una solución que contiene el
ARN. Los métodos para la introducción oral incluyen el mezclado
directo del ARN con el alimento del organismo, así como
aproximaciones diseñadas en las cuales una especie que es usada
como alimento es diseñada para expresar el ARN, luego alimentada al
organismo a ser afectado. Por ejemplo, al ARN puede ser rociado
sobre una planta o una planta puede ser genéticamente diseñada para
expresar el ARN en una cantidad suficiente para matar algunos o
todos los patógenos conocidos que infectan la planta.
Los métodos físicos de introducir los ácidos
nucleicos, por ejemplo, la inyección directamente en la célula o la
inyección extracelular en el organismo, pueden también ser usados.
Hemos descrito aquí que en las células HeLa, el ARN de doble cadena
introducido fuera de la célula inhibe la expresión del gen.
La circulación vascular o extravascular, el
sistema sanguíneo o linfático, el floema, las raíces, y el fluido
cerebroespinal son sitios donde el ARN puede ser introducido. Un
organismo transgénico que expresa el ARN de la construcción
recombinante puede ser producido introduciendo la construcción en un
cigoto, una célula madre embriónica, u otra célula multipotente
derivada del organismo apropiado.
Los métodos físicos de introducir ácidos
nucleicos incluyen la inyección de una solución que contiene el ARN,
el bombardeo de partículas cubiertas por el ARN, remojar la célula
u organismo en una solución del ARN o la electroporación de las
membranas celulares en presencia del ARN. Una construcción viral
empacada en una partícula viral realizaría ambas la introducción
eficiente de una construcción de expresión en la célula y la
transcripción del ARN codificado por la construcción de expresión.
Otros métodos conocidos en el arte para introducir ácidos nucleicos
en las células pueden ser usados, tales como el transporte del
portador mediado por lípidos, transporte por mediación química, tal
como fosfato de calcio, y similares. Así el ARN puede ser
introducido junto con los componentes que ejecutan una o más de las
siguientes actividades: mejorar la absorción de ARN por la célula,
promover el apareamiento de las cadenas dobles, estabilizar las
cadenas apareadas o por otra parte incrementar la inhibición del gen
diana.
La presente invención puede ser usada para
introducir ARN en una célula para el tratamiento o la prevención de
enfermedades. Por ejemplo, el dsARN puede ser introducido en una
célula cancerosa o tumor e inhibir de esta forma la expresión de un
gen requerido para el mantenimiento del fenotipo
carcinogénico/oncógeno. Para prevenir una enfermedad u otra
patología, un gen diana puede ser seleccionado el cual es requerido
para la iniciación o el mantenimiento de la enfermedad/patología.
Por consiguiente, en una realización adicional la invención
proporciona una composición farmacéutica que comprende ARNs cortos
de doble cadena obtenidos por un método de la presente invención
para inhibir la expresión del gen de un gen diana y un portador
apropiado. La composición puede ser administrada por cualquier vía
apropiada, por ejemplo por inyección, por aplicación oral,
intra-ocular, tópica, nasal, rectal etc. El portador
puede ser cualquier portador farmacéutico apropiado,
preferiblemente, es usado un portador, el cual es capaz de aumentar
la eficacia de las moléculas de ARN para entrar en las células
diana, por ejemplo liposomas, cápsides virales naturales o por
cápsides artificiales producidas de manera química o enzimática o
estructuras derivadas de las mismas.
Otra utilidad de la presente invención podría ser
un método de identificar la función del gen en un organismo que
comprende el uso del ARN de doble cadena para inhibir la actividad
de un gen diana de función previamente desconocida. En vez del
aislamiento de mutantes laborioso y consumidor de tiempo por la
selección genética tradicional, los genomas funcionales concebirían
la determinación de la función de genes no caracterizados empleando
la invención para reducir la cantidad y/o alterar el ritmo de la
actividad del gen diana. La invención pudiera ser usada para
determinar dianas potenciales para productos farmacéuticos, entender
los eventos normales y patológicos asociados con el desarrollo,
determinar los caminos de señalización responsables del
desarrollo/envejecimiento postnatal, y similares. La velocidad
incrementada de adquirir información de secuencias de nucleótidos a
partir de fuentes génicas expresadas y genómicas, incluyendo las
secuencias totales para el ser humano, el ratón, la levadura, el D.
melanogaster, y los genomas de C. elegans, puede ser acoplada
con la invención para determinar la función del gen en un organismo
(por ejemplo, nematodo). La preferencia de diferentes organismos
para usar codones particulares, la búsqueda de bases de datos de
secuencias para productos génicos, la correlación del mapa de
eslabonamiento de los rasgos genéticos con el mapa físico a partir
del cual las secuencias de nucleótidos son derivadas, y métodos de
inteligencia artificial pueden ser usados para definir los marcos de
lectura abiertos putativos de las secuencias de nucleótidos
adquiridas en tales proyectos de secuenciación.
Un ensayo simple sería inhibir la expresión del
gen de acuerdo a la secuencia parcial disponible a partir de una
secuencia tag expresada (EST). Alteraciones funcionales en el
crecimiento, desarrollo, metabolismo, resistencia a la enfermedad,
u otros procesos biológicos serían indicativos del papel normal del
producto génico de la EST.
Es por lo tanto un objeto de la presente
invención proporcionar un método para inhibir la expresión de un
gen diana en una célula que comprende la introducción del ARN en una
célula donde dicho ARN comprende ARN corto específico diana de
doble cadena, donde dicho ARN corto específico diana de doble cadena
tiene una longitud menor que 50 nucleótidos, preferiblemente menor
que 30 nucleótidos, aún más preferiblemente una longitud de
30-12 nucleótidos, caracterizado porque comprende en
el terminal 5' nucleótidos transcritos de la secuencia promotora y
en el terminal 3' nucleótidos complementarios a los nucleótidos
transcritos de la secuencia promotora donde dicha secuencia
promotora es reconocida por una ARN polimerasa. En una realización
adicional la secuencia promotora es reconocida por una ARN
polimerasa seleccionada del grupo que consiste de ARN polimerasa T7,
ARN polimerasa T3 o ARN polimerasa SP6.
Esta invención será mejor entendida con
referencia a los Detalles Experimentales que siguen, pero aquellos
expertos en el arte apreciarán rápidamente que estos son solamente
ilustrativos de la invención como será descrito más completamente en
las reivindicaciones que siguen posteriormente.
La lucifersa+ fue expresada a partir del plásmido
pGL3- control (Promega). El EGFP fue expresado a partir del
EGFP/pcADN5-FRT, el cual contiene el gen EGFP del
pEGFP (Clontech) direccionalmente ligado en los sitios HindIII y
NotI del vector de expresión pcADN5/FRT de los mamíferos
(Invitrogen).
Las cadenas patrones de oligo fueron hibridadas a
una secuencia promotora T7 sentido (5'TAATACGACTCACTATAGG) en 10 mM
de Tris-HCl pH 9.0, 100 mM de NaCl, 1 mM de EDTA por
ebullición durante 2' y enfriando lentamente a temperatura ambiente
durante 2-3 hrs.
La transcripción fue llevada a cabo usando el kit
MEGAshortscript^{TM} T7 (Ambion) de acuerdo a las instrucciones
del fabricante. Las cadenas de siARNs fueron purificadas sobre
columnas spin G-25, el alcohol
fenol:cloroformo:iso-
amil (25:24:1) extraído usando los Heavy Phase-Lock Gels (Eppendorf), y el etanol precipitado toda la noche a -80ºC. Las cadenas de siARNs complementarias fueron hibridadas en 1 mM de Tris-HCl pH 8.0, 1 mM de EDTA pH 8.0 por ebullición durante 2' y enfriando lentamente a temperatura ambiente durante 2-3 hrs. La hibridación fue evaluada corriendo los ds y los ss-siARNs en geles TBE de poliacrilamida al 20% no desnaturalizados.
amil (25:24:1) extraído usando los Heavy Phase-Lock Gels (Eppendorf), y el etanol precipitado toda la noche a -80ºC. Las cadenas de siARNs complementarias fueron hibridadas en 1 mM de Tris-HCl pH 8.0, 1 mM de EDTA pH 8.0 por ebullición durante 2' y enfriando lentamente a temperatura ambiente durante 2-3 hrs. La hibridación fue evaluada corriendo los ds y los ss-siARNs en geles TBE de poliacrilamida al 20% no desnaturalizados.
Células HeLa fueron cultivadas en DMEM con alta
glucosa y 1-glutamina (Invitrogen) suplementadas con
1.8 mM de 1-glutamina, 9% de FBS, y 4 5 U/l
pen/strp. Las células fueron transfectadas de manera similar a la
descrita en Elbashir y otros (2001). 24 hrs antes de la
transfección, las células fueron tripsinizadas y diluidas con el
medio de crecimiento carente de antibióticos a 3 x 10^{5}
células/ml. 0.5 ml de células fueron sembradas en cada cavidad de
una placa de 24 cavidades. Las células fueron transfectadas con 1
\mug de construcciones reporteras GL3-control o
EGFP/pcADN5-FRT y 50 pmol de siARNs de cadena simple
o 25 pmol de siARNs de cadena doble, excepto donde se diga otra
cosa, usando Lipofectamine^{TM} 2000 (LF2000; Invitrogen) de
acuerdo a las instrucciones del fabricante. Específicamente, se
usaron 2 \mul de LF2000 por cavidad en 48 \mul del medio libre
de suero carente de antibióticos. La LF2000 diluida fue
pre-incubada a temperatura ambiente durante 1' antes
de mezclarla con el siARN y/o el reportero diluido en el mismo
medio a un volumen total de 50 \mul. Los complejos fueron entonces
incubados a temperatura ambiente durante 20' antes de ser
adicionados a las células. Ensayos del gen reportero GL3 y EGFP
fueron ejecutados después de 24 hrs. Para el experimento de siARN
JNK2\alpha1 y el experimento de respuesta a la dosis de siARN
GL3, placas de 6 cavidades fueron usadas. Los números de células
fueron aumentados 4 veces y las cantidades de los reactivos 5
veces. Para los experimentos de siARN JNK2\alpha1, las células que
fueron cosechadas para el aislamiento del ARN y para la extracción
de la proteína fueron aquellas de aproximadamente 48 hr de
post-transfección.
post-transfección.
El análisis FACS de las células transfectadas con
EGFP fue ejecutado usando un FACScan
(Beckton-Dickinson). Las células fueron
tripsinizadas y lavadas con PBS antes de la resuspensión en la
solución de fijación FACS (PBS + 1% formaldehído). Las eficiencias
de la transfección fueron estimadas comparando muestras
transfectadas con agua con aquellas transfectadas con
EGFP/pcADN5-FRT y fueron típicamente
75-90%. La extensión del ARNi inducido por los
siARNs sintéticos o transcritos fue estimada desde el cambio en el
medio GFP fluorescente en muestras con o sin siARNs
cotransfectadas.
Para los ensayos de luciferasa, las células
fueron tripsinizadas y alícuotas de 100 \mul fueron transferidas
a cavidades triplicadas en placas de cultivo de tejidos de 96
cavidades blancas. Ensayos fueron llevados a cabo usando el Sistema
Luc-Screen^{TM} (Applied Biosystems) y un Contador
de Luminiscencia y Centelleo de Microplato
TopCount-NXT^{TM} (Packard) de acuerdo a las
instrucciones del fabricante.
El ARN total fue preparado a partir de muestras
de aproximadamente 10^{6} células HeLa usando el Mini kit RNeasy
(Qiagen) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las muestras
fueron corridas sobre geles de agarosa para ARN MOPS Latitude
pre-establecidos (BioWhittaker Molecular
Applications) y transferidas a membranas de nylon
Hybond-XL (AP Biotech) de acuerdo a las
instrucciones del fabricante. Sondas de ADN fueron hechas usando el
sistema Rediprime II (AP Biotech) de acuerdo a las instrucciones del
fabricante. La hibridación fue llevada a cabo en solución
Rapid-Hyb (AP Biotech) de acuerdo a las
instrucciones del fabricante.
Extractos de proteína nuclear y citoplasmática
fueron hechos por el método descrito en Gordon (1991), sustituyendo
el Cocktail Inhibidor de Proteasa Completo (Roche) por leupeptina,
aprotinina, y pepstatina y omitiendo el deoxicolato de sodio.
Los extractos fueron corridos en minigeles de
poliacrilamida SDS al 4-20% (Invitrogen) con el
marcador de proteína Rainbow (AP Biotech) y electrotransferido
sobre membranas de nitrocelulosa de 0.2 \mum Transblot (BioRad).
Los blots fueron enjuagados en PBS + 0.05% de
Tween-20 e incubados durante toda la noche a 4ºC con
el anticuerpo monoclonal de ratón JNK2 D2 (Santa Cruz Biotech)
diluido 1:150 en PBS/Tween-20 con 5% de leche en
polvo. Los blots fueron entonces lavados tres veces en
PBS/Tween-20 antes de una incubación de 45min con
anticuerpos de cabra anti-ratón HRP conjugados
1:3000 (BioRad). Tres lavados más y una incubación de 30 min en
PBS/Tween-20 fueron llevados a cabo antes de la
detección por el sistema ECL (AP Biotech).
El ARNi ha sido previamente demostrado que usa
siARNs que son de doble cadena excepto para los dos nucleótidos
protuberantes en 3' (Elbashir y otros 2001; Caplen y otros 2001).
Para crear relativamente rápido y de manera menos costosa una
variedad de siARNs para dianas celulares múltiples, hemos diseñado
un esquema para generar las moléculas usando las técnicas de
transcripción in vitro.
Milligan y otros (1987) describen el uso de
patrones de oligo de ADN parcialmente de cadena simple por
transcripción de ADN polimerasa T7. El promotor mínimo T7 estándar
incluye tres nucleótidos guanosina en el terminal 3' los cuales son
incorporados como las tres primeras bases del transcrito. Sin
embargo, la tercera guanosina puede usualmente ser reemplazada con
otro nucleótido sin reducción significativa de los rendimientos de
la transcripción in vitro (Milligan y otros 1987). Por lo
tanto, los siARNs producidos por este método deben incluir dos
nucleótidos guanosina en 5'. Dos nucleótidos citosina
complementarios son necesarios cerca del terminal 3' de cada cadena
de siARNs para basar el par con las 5' guanosinas en la otra cadena.
Las siARNs de una longitud dada producidas de esta forma deben ser
capaces de seleccionar secuencias que aparecen aproximadamente una
vez cada 250 nucleótidos como promedio en un mARN.
Hemos diseñado patrones de oligo de ADN con las
limitaciones anteriores en mente (Figura 1). Cada patrón es usado
para transcribir una cadena de un siARN. Las cadenas son crudamente
purificadas mediante el paso sobre una columna de exclusión de
tamaño Sephadex G-25, extracción por
fenol:cloroformo, y precipitación por etanol. Las cadenas son luego
resuspendidas en buffer de apareamiento e hibridadas por ebullición
y enfriamiento lento.
Nuestros siARNs transcritos in vitro
difieren de la variedad químicamente sintetizada usada previamente
en dos aspectos. Primero, todos los otros siARNs reportados han sido
altamente purificados. Segundo, los siARNs transcritos in
vitro retienen un grupo 5' trifosfato. Al igual que las especies
siARNs producidas in vivo como parte del mecanismo del ARN
natural, los oligonucleótidos de ARN químicamente sintetizados
usados para hacer siARNs han portado 5'monofosfatos. Para
determinar si estas diferencias hacen nuestros siARNs incompetentes
para inducir el ARNi, primero probamos los siARNs de doble cadena
diseñados para marcar dos genes reporteros - EGFP y GL3 (Figuras 2 y
3). Los resultados promedios y los errores estándares de al menos
tres experimentos independientes son mostrados (Figura 2B, Figura
3B).
El ds siARN GL3 1 transcrito redujo la actividad
de la luciferasa del plásmido reportero
pGL3-control cotransfectado aproximadamente 5 veces
mientras que la cadena antisentido sola en doble concentración molar
no tuvo efecto. Un resultado similar fue observado con un ds siARN
GL3 químicamente sintetizado (oligos ds1 ARN). El segundo siARN
transcrito tuvo un efecto más modesto. Mientras que el tercer siARN
transcrito tuvo un efecto fuerte, la actividad significativa fue
también observada de la cadena antisentido sola. La fortaleza del
efecto de las especies de doble cadena es dependiente de la dosis
(Figura 2C) y modifica los niveles de ARN de estado estable. El ds
siARN EGFP 2 también tuvo un modesto efecto en la actividad de la
luciferasa (Figura 2B). Sin embargo, este efecto no parece ser
específico y muestra una respuesta limitada a dosis
incrementadas.
El mismo ds siARN EGFP 2 transcrito redujo
fuertemente la fluorescencia GFP en las células cotransfectadas con
el reportero EGFP/pcADN5-FRT (Figura 3B). Efectos
mucho más modestos fueron evidentes de las cadenas sentido o
antisentido solas o de un siARN químicamente sintetizado (oligos de
ds1 ARN EGFP) o sus partes componentes. La fluorescencia GFP no fue
afectada por el ds siARN GL3 3 no específico.
La antes mencionada ds siARN luciferasa
transcrita in vitro (IVT) produjo una inhibición de la
actividad de la luciferasa de una extensión diferente. Como un
control positivo para la actividad de la ARNi, usamos una ds siARN
luciferasa químicamente sintetizada. En nuestras manos, la actividad
de la luciferasa del plásmido reportero
pGL3-control cotransfectado fue reducida
aproximadamente 5 veces por los ds siARN sintéticos. Las
eficiencias de transfección para todos los experimentos variaron
entre 91 y 95%. Una ds siARN luciferasa IVT (ds siARN GL3 1) redujo
la actividad de la luciferasa 78%, mientras que la cadena de ARN
antisentido sola a dos veces la concentración molar de la ds siARN
no tuvo efecto. La segunda siARN-IVT (ds siARN GL3
2) probamos que tuvo un efecto más modesto (36% de inhibición).
Mientras que la tercera siARN IVT tuvo un efecto fuerte (82% de
inhibición), una actividad significativa fue también observada de la
cadena de ARN antisentido sola (55% de inhibición), confundiendo el
resultado. Una mezcla de las tres siARNs IVT, cada una a un tercio
de la concentración molar usada para ellas individualmente, tuvo un
efecto intermedio (70% de inhibición) en vez de uno sinérgico,
sugiriendo que puede no haber ventaja con el uso de siARN múltiple
para seleccionar el mismo gen. Pudimos mostrar el efecto inhibitorio
de las especies ds como dependientes de la dosis. Mientras que un
siARN GFP no específico (ds siARN GFP 2) también tuvo un modesto
efecto (46% de inhibición) en la actividad de la luciferasa, esto
parece ser no específico y muestra una respuesta limitada a dosis
incrementadas (datos no mostrados).
El mismo ds siARN GFP IVT (ds siARN GFP 2) redujo
fuertemente la fluorescencia GFP en las células cotransfectadas con
el reportero GFP/pcADN5-FRT (87% de inhibición).
Efectos mucho más modestos fueron evidentes de las cadenas sentido
(41%) o antisentido (19%) solas o del siARN químicamente sintetizado
(oligo de des1 ARN GFP) o sus partes componentes. La fluorescencia
GFP fue, como se esperaba, no afectada por la ds siARN 3 luciferasa
no específica.
Para demostrar que la expresión del gen endógeno
puede también ser afectada por los siARNs transcritos, seleccionamos
los productos de los genes JNK2\alpha1 (Fig. 4A) y
CDS-1 (Fig. 4B). Los análisis por transferencia de
Western y Northern revelaron una reducción específica de la
proteína JNK2\alpha1 y de los niveles de ARN en muestras en
extractos nucleares de células HeLa transfectadas con un siARN
transcrito (ds siARN JNK2\alpha1 1 - reducción estimada 87%) o
con un siARN químicamente sintetizado (oligos de ds1 ARN
JNK2\alpha1 - reducción estimada 76%) cuando se compara con las
células transfectadas con agua (de simulación), con el plásmido
EGFP/pcADN5-FRT como un control de transfección
(ADN EGFP solamente), con cadenas simples de siARNs, o con un siARN
no específico (ds siARN EGFP 2).
El análisis de transferencia de Western reveló
una modesta reducción (hasta 67%) de los niveles de la proteína CDS1
en los extractos citoplasmáticos de células HeLa transfectadas con
siARNs IVT específico CDS1 (Fig.4) pero no en células transfectadas
con un siARN no específico cuando se comparó con las células
transfectadas de simulación.
Ratones Balb/C machos (aproximadamente 25 g)
(condiciones estándar de alojamiento, acceso libre a la comida/agua)
recibieron una inyección en la vena de la cola de solución salina,
2.3 ml, o solución salina que contiene 40 microgramos de siARN
dirigido contra el receptor de insulina murino (NCBI número de
acceso NM_010568; bases 2536-2556) preparadas por
el método del promotor T7 truncado de la transcripción in
vitro, con 800 U del inhibidor de RNase.
Las inyecciones fueron administradas tan rápido
como fue posible (8-10 segundos). Dos ratones
tratados con siARN y dos de control fueron sacrificados a las 24, a
las 48 y a las 72 horas; el hígado fue rápidamente extraído,
pesado, y congelado en hielo seco/isopropanol. El ARN total fue
extraído usando tejido congelado pulverizado y Maxi kits RNEasy
(Qiagen).
Después de la primera síntesis de la cadena cADN,
el mARN para el receptor de insulina fue ensayado por
Q-PCR usando el Ciclador Smart (cebadores: F
3526-3548, R 3744-3768) y los
resultados fueron normalizados a la expresión ciclofilina A también
por Q-PCR (bases 157-182 y
496-521 de NCBI número de acceso NM_017101).
Claims (5)
1. Un método para la síntesis de ARNs cortos
específicos diana de doble cadena de una longitud menor que 30
nucleótidos que comprende los pasos de:
a) combinar un patrón de oligonucleótidos sentido
específico diana, un oligonucleótido de secuencia promotora T7 y
una ARN polimerasa T7 en una mezcla de reacción de manera que el
producto, de oligoribonucleótidos sentido, extendido patrón sea
formado;
b) combinar un patrón de oligonucleótidos
antisentido específico diana, un oligonucleótido de secuencia
promotora T7 y una ARN polimerasa T7 en una mezcla de reacción de
manera que el producto, de oligoribonucleótidos antisentido,
extendido patrón sea formado;
c) hibridar el producto de oligoribonucleotidos
sentido obtenido en el paso a) con el producto de
oligoribonucleotidos antisentido complementario obtenido en el paso
b), caracterizado porque;
los patrones de oligonucleótidos del paso a) y b)
comprenden una secuencia promotora del ARN polimerasa que consiste
de la secuencia promotora de la ARN polimerasa T7 truncada como es
mostrado en la Figura 1, extendida en el terminal 5' de la cadena
patrón con la secuencia patrón específica diana, donde dicha
secuencia patrón específica diana comprende en el terminal 5' dos
nucleótidos guanosina (g) y en el terminal 3' dos nucleótidos
citosina (c), donde además el oligonucleótido de secuencia promotora
T7 es complementario a la secuencia promotora de ARN polimerasa T7
truncada del patrón de oligonucleótidos como es mostrado en la
Figura 1.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1
donde los patrones de oligonucleótidos del paso a) y b) están
adicionalmente caracterizados por ser patrones de oligo de
ADN parcialmente de doble cadena que comprenden una secuencia de ARN
polimerasa T7 truncada de doble cadena como es mostrado en la Figura
1.
3. Un método para la síntesis de ARNs pequeños de
interferencia (siARNs) de 12-30 nucleótidos que
comprende los pasos de:
a) combinar un patrón de siARN y una secuencia
promotora T7 con una ARN polimerasa T7 en una mezcla de reacción de
manera que el producto de oligoribonucleótidos sentido extendido
patrón sea formado; b) combinar un patrón de siARN antisentido y
una secuencia promotora T7 con una ARN polimerasa T7 en una mezcla
de reacción de manera que el producto de oligoribonucleótidos
antisentido extendido patrón sea formado; y
c) hibridar el producto de oligoribonucleotidos
sentido obtenido en el paso a) con el producto de
oligoribonucleotidos antisentido complementario obtenido en el paso
b);
donde los patrones de siARN del paso a) y b)
comprenden una secuencia promotora de ARN polimerasa de doble cadena
que consiste de la secuencia de ARN polimerasa T7 truncada como es
mostrado en la Figura 1, extendida en el terminal 5' de la cadena
patrón con la secuencia patrón específica diana como se definió en
la reivindicación 1 y 2 o 3 nucleótidos adicionales.
4. Una mezcla de reacción para el uso en un
método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que
comprende;
Un patrón de oligonucleótidos sentido específico
diana caracterizado porque;
dicho patrón comprende una secuencia promotora de
ARN polimerasa que consiste de la secuencia promotora de ARN
polimerasa T7 truncada como es mostrado en la Figura 1, extendida en
el terminal 5' de la cadena patrón con la secuencia patrón
específica diana, donde dicha secuencia patrón específica diana
comprende en el terminal 5' dos nucleótidos guanosina (g) y en
terminal 3' dos nucleótidos citosina (c); y
Un patrón de oligonucleótidos antisentido
específico diana caracterizado porque;
dicho patrón comprende una secuencia promotora de
ARN polimerasa que consiste de la secuencia promotora de ARN
polimerasa T7 truncada como es mostrado en la Figura 1, extendida en
el terminal 5' de la cadena patrón con la secuencia patrón
específica diana, donde dicha secuencia patrón específica diana
comprende en el terminal 5' dos nucleótidos guanosina (g) y en
terminal 3' dos nucleótidos citosina (c).
5. Un método para diseñar los patrones de
oligonucleótidos sentido y antisentido específicos diana dicho
método comprendiendo los siguientes pasos:
1) buscar una secuencia específica diana
localizada dentro de la secuencia de codificación del gen diana y
que tiene la siguiente secuencia
5'-gg(n_{12-30})cc-3';
donde n_{12-30} se refiere a
cualquier oligonucleótido de 12 a 30 nucleótidos;
2) diseñar un patrón de oligonucleótidos sentido
que comprenda una secuencia promotora de ARN polimerasa que consiste
de la secuencia promotora de ARN polimerasa T7 truncada como es
mostrado en la Figura 1, extendida en el terminal 5' de la cadena
patrón con la secuencia de oligonucleótidos complemento de la
secuencia específica diana localizada en el paso 1), opcionalmente
extendida con dos nucleótidos adicionales;
3) diseñar un patrón de oligonucleótidos
antisentido que comprenda una secuencia promotora de ARN polimerasa
de doble cadena que consiste de la secuencia promotora de ARN
polimerasa T7 truncada como es mostrado en la Figura 1, extendida
en el terminal 5' de la cadena patrón con la secuencia de
oligonucleótidos inversa de la secuencia específica diana localizada
en el paso 1), opcionalmente extendida con dos nucleótidos
adicionales.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060009409A1 (en) * | 2002-02-01 | 2006-01-12 | Woolf Tod M | Double-stranded oligonucleotides |
| US20030166282A1 (en) | 2002-02-01 | 2003-09-04 | David Brown | High potency siRNAS for reducing the expression of target genes |
| EP2213292B2 (en) | 2002-02-01 | 2016-06-22 | Life Technologies Corporation | Double-stranded oligonucleotides |
| US20040248094A1 (en) * | 2002-06-12 | 2004-12-09 | Ford Lance P. | Methods and compositions relating to labeled RNA molecules that reduce gene expression |
| US20040029275A1 (en) * | 2002-08-10 | 2004-02-12 | David Brown | Methods and compositions for reducing target gene expression using cocktails of siRNAs or constructs expressing siRNAs |
| GB0315401D0 (en) * | 2003-07-01 | 2003-08-06 | Roslin Inst Edinburgh | Disease resistant transgenic non-human animals |
| NL1026335C2 (nl) * | 2004-06-04 | 2005-12-06 | Univ Delft Tech | Werkwijze voor het maken van een dubbelstrengs polyribonucleotidenvolgorde met overhangend uiteinde, alsmede een werkwijze voor het vormen van een dubbelstrengs polynucleotidenconstruct en een toepassing. |
| AU2005313883B2 (en) * | 2004-12-09 | 2011-03-31 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inducing an immune response in a mammal and methods of avoiding an immune response to oligonucleotide agents such as short interfering RNAs |
| US20060142228A1 (en) | 2004-12-23 | 2006-06-29 | Ambion, Inc. | Methods and compositions concerning siRNA's as mediators of RNA interference |
| US20090286696A1 (en) * | 2005-02-04 | 2009-11-19 | University Of Wollongong | Double-Stranded Olidonucleotides and Uses Therefor |
| US8999943B2 (en) * | 2005-03-14 | 2015-04-07 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Antigene oligomers inhibit transcription |
| US7320965B2 (en) * | 2005-10-28 | 2008-01-22 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of Huntingtin gene |
| EP2431467A3 (en) | 2005-11-17 | 2012-05-02 | Board Of Regents, The University Of Texas | Modulation of gene expression by oligomers targeted to chromosomal DNA |
| DE102007000226A1 (de) * | 2007-04-13 | 2008-10-16 | Hilti Aktiengesellschaft | Handgeführtes Eintreibgerät |
| CN101914540A (zh) * | 2010-08-09 | 2010-12-15 | 大连大学 | 一种将rna干扰引入植物的方法 |
| JP2014511687A (ja) | 2011-03-31 | 2014-05-19 | モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッド | 工学操作された核酸の送達および製剤 |
| AU2013243951A1 (en) | 2012-04-02 | 2014-10-30 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for the production of secreted proteins |
| US9283287B2 (en) | 2012-04-02 | 2016-03-15 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins |
| WO2014152030A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Moderna Therapeutics, Inc. | Removal of dna fragments in mrna production process |
| EP2983804A4 (en) | 2013-03-15 | 2017-03-01 | Moderna Therapeutics, Inc. | Ion exchange purification of mrna |
| EP3578663A1 (en) * | 2013-03-15 | 2019-12-11 | ModernaTX, Inc. | Manufacturing methods for production of rna transcripts |
| EP2971161B1 (en) | 2013-03-15 | 2018-12-26 | ModernaTX, Inc. | Ribonucleic acid purification |
| EP3971287A1 (en) | 2013-07-11 | 2022-03-23 | ModernaTX, Inc. | Compositions comprising synthetic polynucleotides encoding crispr related proteins and synthetic sgrnas and methods of use |
| US10385088B2 (en) | 2013-10-02 | 2019-08-20 | Modernatx, Inc. | Polynucleotide molecules and uses thereof |
| US10286086B2 (en) | 2014-06-19 | 2019-05-14 | Modernatx, Inc. | Alternative nucleic acid molecules and uses thereof |
| WO2016011222A2 (en) | 2014-07-16 | 2016-01-21 | Moderna Therapeutics, Inc. | Circular polynucleotides |
| US11434486B2 (en) | 2015-09-17 | 2022-09-06 | Modernatx, Inc. | Polynucleotides containing a morpholino linker |
| JP2020510426A (ja) | 2017-02-28 | 2020-04-09 | アークトゥラス・セラピューティクス・インコーポレイテッドＡｒｃｔｕｒｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． | 翻訳可能分子およびその合成 |
| AU2020328511A1 (en) | 2019-08-09 | 2022-03-03 | Nutcracker Therapeutics, Inc. | Methods and apparatuses for manufacturing for removing material from a therapeutic composition |
| CN112626152A (zh) * | 2020-12-18 | 2021-04-09 | 深圳大学 | siRNA的制备方法 |
| CN113943764B (zh) * | 2021-12-20 | 2022-03-04 | 中国海洋大学 | 一种制备双链rna的方法 |
| CN115807048B (zh) * | 2022-07-19 | 2024-03-22 | 中国海洋大学 | 一种制备双链rna的方法 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5614403A (en) * | 1994-06-01 | 1997-03-25 | Baylor College Of Medicine | In vitro replication system capable of rescuing cloned and manipulated rotavirus genes |
| US6214546B1 (en) * | 1995-02-27 | 2001-04-10 | Intelligene Ltd. | Detection of biomolecules |
| US6506559B1 (en) * | 1997-12-23 | 2003-01-14 | Carnegie Institute Of Washington | Genetic inhibition by double-stranded RNA |
| AU781598B2 (en) * | 1999-04-21 | 2005-06-02 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for inhibiting the function of polynucleotide sequences |
| CA2386270A1 (en) * | 1999-10-15 | 2001-04-26 | University Of Massachusetts | Rna interference pathway genes as tools for targeted genetic interference |
| EP2345742B1 (en) * | 2000-03-30 | 2014-06-11 | The Whitehead Institute for Biomedical Research | RNA sequence-specific mediators of RNA interference |
| US6958217B2 (en) * | 2001-01-24 | 2005-10-25 | Genomic Expression Aps | Single-stranded polynucleotide tags |
| US20030166282A1 (en) * | 2002-02-01 | 2003-09-04 | David Brown | High potency siRNAS for reducing the expression of target genes |
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