ES2643576T3 - Dúplex oligonucleotídicos que comprenden nucleótidos de tipo ADN y de tipo ARN y usos de los mismos - Google Patents

Description

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DESCRIPCION

Duplex oligonucleotfdicos que comprenden nucleotidos de tipo ADN y de tipo ARN y usos de los mismos Campo tecnico

La invencion se refiere a oligonucleotidos, metodos para su preparacion y usos de los mismos, tal como para disminuir el nivel de un acido nucleico diana en una celula y/o silenciar la expresion de un acido nucleico o gen de interes usando tecnologfas de ARN interferente pequeno (ARNip).

Antecedentes tecnicos

El silenciamiento genico, es decir, bloquear selectivamente la expresion de un gen de interes, se puede efectuar a traves de la introduccion de un oligonucleotido antisentido (ONA) o ARN interferente pequeno (ARNip) en un organismo (Uhlmann, E. y Peyman, A. Chem. Rev. 1990, 90: 543-84; Braasch, D. A. y Corey, D. R. Biochemistry 2002, 41: 4503-4510; Opalinska, J. B. y Gewirtz, A. M. Nat. Rev. Drug Discov. 2002, 1: 503-14; Dorsett, Y. y Tuschl, T. Nat. Rev. Drug Discov. 2004, 3: 318-329). Desafortunadamente, como con otros farmacos basados en acido nucleico, los ARNip tienen mala estabilidad en suero, mala absorcion celular, y pueden provocar efectos secundarios inespedficos e inmunoestimuladores. Los esfuerzos para remediar estas deficiencias se han enfocado en el desarrollo de vedculos de administracion para los ARNip, y en el desarrollo de oligonucleotidos qmmicamente modificados con perfiles de farmaco mejorados.

Mucho del trabajo reciente se ha enfocado en la modificacion qmmica del ARNip. Dowler y col. (Dowler, T. et al. Nucl. Acids Res. 2006, 34: 1669-1675) fueron los primeros en mostrar que acidos 2'-desoxi-2'F-arabinonucleicos (2'F-AAN) se podnan incorporar a lo largo de la hebra sentido, incluyendo una hebra sentido completamente modificada. La modificacion la extension 3' de la hebra antisentido con 2<1>F-AAN produjo un aumento significativo en potencia y varios de los duplex modificados con 2'F-AAN tambien han sido capaces de superar al ARNip nativo en potencia. Ademas, se encontro que los duplex de ARNip con modificacion 2'F-AAN extensa teman una semivida en suero significativamente mas larga que los ARNip no modificados. Los duplex de ARNip modificados que conteman unidades de 2'-fluoro-4'-tioarabinonucleotido (4<1>S-FAAN tambien eran capaces de entrar en la ruta de iARN (Watts, J. K. et al. Nucl. Acids Res 2007, 35: 1441-1451). Uno o dos insertos internamente en cualquier hebra dio duplex de potencia comparable a la del control. La modificacion 4'-S-FAAN tambien fue capaz de funcionar con buena eficacia en un duplex con una hebra sentido de ARN modificada con 2'F-AAN, demostrando que 2<1>F-AAN (con su preferencia para conformaciones sur y este) puede lograr sinergia con 4'S-2'F-AAN (con su preferencia para conformaciones norte), en silenciamiento de genes por iARN.

2'F-ARN es otra modificacion de ARNip (Blidner, RA. et al. Chem. Biol. Drug Des. 2007, 70: 113-122), y la modificacion 2'F-ARN parcial es tolerada a lo largo de las hebras tanto sentido como antisentido, y algunos ARNip completamente modificados con 2'F-ARN tambien son activos. Los duplex de ARNip modificados con 2'F-ARN tienen estabilidad en suero significativamente aumentada (Layzer, J. M. et al. RNA, 2004, 10: 766-771). 2'F-ARN tambien aumenta la afinidad de union del duplex.

Se observo un ejemplo de un aumento en potencia para un ARNip completamente modificado hecho de una combinacion de nucleotidos modificados con 2'-O-Me y 2'F-ARN, que era 500 veces mas potente que un ARN sin modificar (Allerson, CR. et al. J. Med. Chem. 2005, 48: 901-904; Koller, E. et al. Nucl. Acids Res. 2006 34: 44674476). Sin embargo, tal alto grado de mejora no se observo para otras secuencias.

Estas tecnicas presentan desaffos significativos, y hay una necesidad para mejoras en, por ejemplo, eficacia, estabilidad in vivo y reduccion de efectos “inespedficos” {por ejemplo, el silenciamiento de un gen diferente de la diana pretendida). Por tanto, hay una necesidad continuada para enfoques basados en nucleotidos mejorados.

Compendio de la invencion

La invencion se refiere a oligonucleotidos, metodos para su preparacion y usos de los mismos, tal como para disminuir el nivel de un acido nucleico diana en una celula, y/o silenciar la expresion de un acido nucleico o gen de interes usando tecnologfas de ARN interferente pequeno (ARNip).

La presente invencion proporciona un ARNip qmmicamente modificado que comprende un duplex oligonucleotfdico que comprende una hebra sentido y una hebra antisentido, cada una comprende respectivamente:

(i) Sentido: [(2'F-AAN)3(2'F-ARN)3]2 [(2'F-AAN)(2'F-ARN)]3 (2'F-AAN)

Antisentido: (ARN)19;

(ii) Sentido: [(2'F-AAN)3(2'F-ARN)3]2 [(2'F-AAN)(2'F-ARN)]3 (2'F-AAN)

Antisentido: (2'F-ARN)19;

(iii) Sentido: [(2'F-AAN) (2'F-ARN)]9 (2'F-AAN)

Antisentido: (ARN)19;

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(iv) Sentido: [(2'F-AAN) (2'F-ARN)]9 (2'F-AAN)

Antisentido: (2'F-ARN)19;

(v) Sentido: [(2'F-AAN)3(2'F-ARN)3]3 (2'F-AAN)

Antisentido: (ARN)19; o

(vi) Sentido: [(2'F-AAN)3(2'F-ARN)3]3 (2'F-AAN)

Antisentido: (2'F-ARN)19,

en donde el ARNip tiene actividad ARNip.

La invencion proporciona ademas una composicion farmaceutica que comprende el ARNip qmmicamente modificado segun la invencion, junto con un excipiente o soporte farmaceuticamente aceptable.

La invencion proporciona ademas el uso del ARNip qmmicamente modificado segun la invencion o la composicion farmaceutica de la invencion para degradar o disminuir el nivel de un acido nucleico diana, o para disminuir la produccion de un polipeptido codificado por dicho acido nucleico diana, en una celula, en donde la hebra sentido del ARNip qmmicamente modificado comprende una secuencia de nucleobases sustancialmente identica a una secuencia de nucleobases del acido nucleico diana.

La invencion proporciona ademas ARNip qmmicamente modificado segun la invencion o la composicion farmaceutica de la invencion para uso en prevenir o tratar una enfermedad o afeccion asociada con la expresion de un acido nucleico diana, o de un polipeptido codificado por dicho acido nucleico diana, en un sujeto, en donde la hebra sentido del ARNip qmmicamente modificado comprende una secuencia de nucleobases sustancialmente identica a una secuencia de nucleobases del acido nucleico diana.

Ademas, la invencion proporciona un metodo in vitro para degradar o disminuir la expresion de un acido nucleico diana, o de disminuir el nivel de un polipeptido codificado por dicho acido nucleico diana, en una celula, el metodo comprende poner en contacto la celula con el ARNip qmmicamente modificado segun la invencion o la composicion farmaceutica de la invencion, en donde la hebra sentido del ARNip qmmicamente modificado comprende una secuencia de nucleobases sustancialmente identica a una secuencia de nucleobases del acido nucleico diana.

En un aspecto adicional, la presente divulgacion proporciona un par de oligonucleotidos que puede formar un duplex, que comprende una hebra sentido y una hebra antisentido complementaria a la hebra sentido, en donde el par de oligonucleotidos comprende: (a) uno o mas arabinonucleotidos (AAN) sustituidos en 2'; y (b) (i) uno o mas ribonucleotidos (ARN) sustituidos en 2', (ii) uno o mas nucleotidos de acido nucleico bloqueado (ANB), o (iii) una combinacion de (i) y (ii).

En una forma de realizacion, el par de oligonucleotidos mencionado anteriormente comprende uno o mas AAN sustituidos en 2' y uno o mas ARN sustituidos en 2'. En otra forma de realizacion, el par de oligonucleotidos mencionado anteriormente comprende uno o mas AAN sustituidos en 2' y uno o mas ANB. En otra forma de realizacion, el par de oligonucleotidos mencionado anteriormente comprende uno o mas AAN sustituidos en 2', uno o mas ARN sustituidos en 2' y uno o mas ANB.

En una forma de realizacion, el sustituyente en 2' anteriormente mencionado es un halogeno. En una forma de realizacion adicional, el halogeno anteriormente mencionado es fluor (F).

En una forma de realizacion, la hebra sentido anteriormente mencionada comprende: (i) 2'F-AAN solo; (ii) 2'F-ARN solo; (iii) una combinacion de 2'F-ARN y 2'F-AAN; (iv) ARN solo; (v) una combinacion de 2'F-AAN y ARN; (vi) una combinacion de 2'F-AAN, ARN y ANB; o (vii) una combinacion de 2'F-AAN, 2'F-ARN y ARN.

En otra forma de realizacion, la hebra antisentido anteriormente mencionada comprende: (i) 2'F-ARN solo; (ii) ARN solo; (iii) 2'F-AAN solo; (iv) una combinacion de 2'F-ARN y 2'F-AAN; (v) una combinacion de 2'F-AAN y ARN; (vi) una combinacion de 2'F-AAN, ARN y ANB; o (vii) una combinacion de 2'F-AAN, 2'F-ARN y ARN

En una forma de realizacion, la hebra sentido y la hebra antisentido anteriormente mencionadas tienen una longitud de 19 a 23 residuos. En una forma de realizacion adicional, hebra sentido y la hebra antisentido anteriormente mencionadas tienen una longitud de 21 residuos.

En otra forma de realizacion, la hebra sentido anteriormente mencionada, la hebra antisentido, o ambas, comprende una extension en el extremo 3'. En una forma de realizacion adicional, la extension anteriormente mencionada tiene de 1 a 5 residuos, en una forma de realizacion adicional 2 residuos.

En una forma de realizacion, la extension anteriormente mencionada comprende desoxirribonucleotidos (ADN), 2'F- AAN, o una combinacion de los mismos.

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En una forma de realizacion, la hebra sentido anteriormente mencionada, la hebra antisentido, o ambas, esta(n) fosforilada(s) en el extremo 5'. En una forma de realizacion adicional, la hebra antisentido anteriormente mencionada esta fosforilada en el extremo 5'.

En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona una molecula de tipo ARNip bicatenaria que comprende el par de oligonucleotidos anteriormente mencionado.

En una forma de realizacion, las hebras sentido y antisentido anteriormente mencionadas estan en un oligonucleotido de 15 a 80 nucleotidos de longitud y de tal manera que el oligonucleotido o una parte del mismo es capaz de adoptar una estructura en horquilla de tipo ARNip en la que las hebras sentido y antisentido forman el tallo de la estructura en horquilla.

En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona una composicion que comprende el par de oligonucleotidos anteriormente mencionado o la molecula de tipo ARNip bicatenaria anteriormente mencionada, y un soporte farmaceuticamente aceptable.

En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona el par de oligonucleotidos anteriormente mencionado, la molecula de tipo ARNip bicatenaria anteriormente mencionada o la composicion anteriormente mencionada, para disminuir el nivel de un acido nucleico diana, o de un polipeptido codificado por dicho acido nucleico diana, en una celula, en donde la hebra sentido del par de oligonucleotidos comprende una secuencia de nucleobases sustancialmente identica a una secuencia de nucleobases del acido nucleico diana.

En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona el par de oligonucleotidos anteriormente mencionado, la molecula de tipo ARNip bicatenaria anteriormente mencionada o la composicion anteriormente mencionada, para prevenir o tratar una enfermedad o afeccion asociada con la expresion de un acido nucleico diana, o de un polipeptido codificado por dicho acido nucleico diana, en un sujeto, en donde la hebra sentido del par de oligonucleotidos comprende una secuencia de nucleobases sustancialmente identica a una secuencia de nucleobases del acido nucleico diana.

En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona un metodo de degradar o disminuir el nivel de un acido nucleico diana, o de disminuir la produccion o el nivel de un polipeptido codificado por dicho acido nucleico diana, en una celula, el metodo comprende poner en contacto la celula con el par de oligonucleotidos mencionado anteriormente, la molecula de tipo ARNip bicatenaria mencionada anteriormente, o la composicion mencionada anteriormente, en donde la hebra sentido del par de oligonucleotidos comprende una secuencia de nucleobases sustancialmente identica a una secuencia de nucleobases del acido nucleico diana.

En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona un metodo de prevenir o tratar una enfermedad o afeccion asociada con la expresion de un acido nucleico diana, o de un polipeptido codificado por dicho acido nucleico diana, en un sujeto, el metodo comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz del par de oligonucleotidos mencionado anteriormente, la molecula de tipo ARNip bicatenaria mencionada anteriormente, o la composicion mencionada anteriormente, en donde la hebra sentido del par de oligonucleotidos comprende una secuencia de nucleobases sustancialmente identica a una secuencia de nucleobases del acido nucleico diana.

En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona un uso del par de oligonucleotidos mencionado anteriormente, la molecula de tipo ARNip bicatenaria mencionada anteriormente, o la composicion mencionada anteriormente, para degradar o disminuir el nivel de un acido nucleico diana, o para disminuir la produccion o el nivel de un polipeptido codificado por dicho acido nucleico diana, en una celula, en donde la hebra sentido del par de oligonucleotidos comprende una secuencia de nucleobases sustancialmente identica a una secuencia de nucleobases del acido nucleico diana.

En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona un uso del par de oligonucleotidos mencionado anteriormente, la molecula de tipo ARNip bicatenaria mencionada anteriormente, o la composicion mencionada anteriormente, para la preparacion de un medicamento, en donde la hebra sentido del par de oligonucleotidos comprende una secuencia de nucleobases sustancialmente identica a una secuencia de nucleobases del acido nucleico diana.

En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona un uso del par de oligonucleotidos mencionado anteriormente, la molecula de tipo ARNip bicatenaria mencionada anteriormente, o la composicion mencionada anteriormente, para prevenir o tratar una enfermedad o afeccion asociada con la expresion de un acido nucleico diana, o de un polipeptido codificado por dicho acido nucleico diana, en un sujeto, en donde la hebra sentido del par de oligonucleotidos comprende una secuencia de nucleobases sustancialmente identica a una secuencia de nucleobases del acido nucleico diana.

En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona un uso del par de oligonucleotidos mencionado anteriormente, la molecula de tipo ARNip bicatenaria mencionada anteriormente, o la composicion mencionada anteriormente, para la preparacion de un medicamento para prevenir o tratar una enfermedad o afeccion asociada con la expresion de un acido nucleico diana, o de un polipeptido codificado por dicho acido nucleico diana, en un sujeto, en donde la

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hebra sentido del par de oligonucleotidos comprende una secuencia de nucleobases sustancialmente identica a una secuencia de nucleobases del acido nucleico diana.

En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona un uso del par de oligonucleotidos mencionado anteriormente, la molecula de tipo ARNip bicatenaria mencionada anteriormente, o la composicion mencionada anteriormente, como medicamento.

En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona un kit que comprende el par de oligonucleotidos mencionado anteriormente, la molecula de tipo ARNip bicatenaria mencionada anteriormente, o la composicion mencionada anteriormente. En una forma de realizacion, el kit mencionado anteriormente comprende ademas instrucciones para inhibir la expresion de un acido nucleico diana en una celula, desgradar o disminuir el nivel del acido nucleico diana, o para disminuir la produccion o el nivel de un polipeptido codificado por el acido nucleico diana.

Breve descripcion de las figuras

En las figuras adjuntas:

La figura 1 muestra la actividad ARNip de duplex 2'-fluorados que se dirigen a los nucleotidos 1818-1836 de la luciferasa de luciernaga. (A) Resultados iniciales (media de dos transfecciones); (B) Actividad confirmada de los duplex mas potentes de (A), a concentraciones menores (media de dos transfecciones). En (A): barras negras = 2 nM, barras grises = 10 nM y barras blancas = 40 nM. En (B) barras negras = 0,4 nM, barras grises = 2 nM y barras blancas = 10 nM;

La figura 2 muestra espectros de dicrofsmo circular (CD) de los duplex oligonucleotidicos jg1-gj15. (A) jg1-jg5, en los que ambas hebras tienen la misma qmmica; (B) jg6-jg9, en los que una de las dos hebras es una hebra quimerica completamente modificada; (C) jg10-jg13, en los que una de las dos hebras es una hebra completamente modificada de una qmmica unica; y (D) heteroduplex completamente modificados jg14-jg15. El duplex control jg-1 (ARN bicatenario) se incluye en todos los espectros para comparacion. En (A) lmea negra = jg-1, lmea discontinua = jg-2, lmea gris fina = jg-3, lmea gris gruesa = jg-4, lmea de puntos = jg-5. En (B) lmea negra = jg-1, lmea gris gruesa = jg-6, lmea gris fina = jg-7, lmea de puntos = jg-8, lmea discontinua = jg-9. En (C) lmea negra = jg-1, lmea discontinua = jg-10, lmea negra fina = jg-11, lmea gris gruesa = jg-12, lmea de puntos = jg-13. En (D) lmea negra = jg-1, lmea de puntos = jg-14, lmea discontinua = jg-15;

La figura 3 muestra actividad ARNip de duplex 2'-fluorados que se dirigen a los nucleotidos 515 a 533 de luciferasa de luciernaga. Barras negras = 40 nM, barras grises = 10 nM y barras blancas = 2 nM;

La figura 4 muestra el efecto de transfecciones de ARN interferente pequeno (ARNip) en la expresion de la protema de union a eIF4E (4E-BP) 1 o 4E-BP2. (A) Las transfecciones de ARNip se realizaron en celulas HEK293T usando el reactivo Lipofectamine Plus™ en celulas sembradas al 70-80% de confluencia en una placa de 24 pocillos. Para cada pocillo, se mezclaron o bien 2,5 pl (1) o 5 pl de duplex de ARNip (duplex hibridado 20 pM) con 50 pl de OPTI- MEM™ y 1 pl del reactivo Plus™ y se incubo durante 5 min a temperatura ambiente (RT). Una mezcla de 4 pl de reactivo Lipofectamine™ y 50 pl de OPTI-MEM™ se anadio despues a la mezcla de ARN en precomplejo y se incubo durante 20 min a temperatura ambiente antes de anadirla a las celulas. Cinco horas despues, el medio de transfeccion se sustituyo por medio completo. Las celulas se recogieron 48 horas despues de la transfeccion y las protemas se extrajeron para analisis por inmunotransferencia usando anticuerpos contra 4E-BP1 y 4E-BP2 o p- actina. (B) Secuencias de los ARNip usados en (A) (tambien mostradas en la tabla X posteriormente);

La figura 5 muestra el efecto de transfecciones de ARNip sobre la produccion de IFN por celulas HEK293T despues de estimulacion con poli(I:C). Las transfecciones con ARNip se realizaron en celulas HEK293T usando el reactivo Lipofectamine Plus™ en celulas sembradas al 70-80% de confluencia en una placa de 24 pocillos. Para cada pocillo, se mezclaron 5 pl de duplex de ARNip tanto de 4E-BP1 como 4E-BP2 (modificados H-611 o sin modificar) (duplex hibridado 20 pM) con 75 pl de OPTI-MEM™ y 1 pl del reactivo Plus™ y se incubo durante 5 min a temperatura ambiente (RT). Una mezcla de 5 pl de reactivo Lipofectamine™ y 75 pl de OPTI-MEM™ se anadio despues a la mezcla de ARN en precomplejo y se incubo durante 20 min a temperatura ambiente antes de anadirla a las celulas. Cinco horas despues, el medio de transfeccion se sustituyo por medio completo. 48 horas despues de la transfeccion, las celulas o bien se dejaron sin tratar o se trataron con 1 pg/ml de poli(I:C) durante 24 horas. Los sobrenadantes de las celulas sin tratar y tratadas se recogieron y la cantidad de IFN se cuantifico usando HEK- Blue™ IFN-a/p Cells (InvivoGen, San Diego, EE UU) segun el protocolo del fabricante;

La figura 6 muestra experimentos de reduccion de luciferasa usando duplex oligonucleotidicos que comprenden hebras sentido de 2'F-AAN y hebras antisentido que contienen salientes de 2'F-AAN e insectos de ANB;

La figura 7 muestra experimentos de reduccion de luciferasa usando duplex oligonucleotfdicos que comprenden una hebra sentido que contiene tanto 2'F-AAN como ANB;

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La figura 8 muestra experimented de reduccion de luciferasa usando duplex oligonucleotidicos que comprenden una hebra sentido que contiene tanto 2'F-AAN como ANB hibridada con una hebra antisentido de 2'F-ARN por completo;

La figura 9 muestra experimented de reduccion de c-myb usando ARNip 2'F-AAN/2'F-ARN/ANB. (A) % de expresion genica relativa a tratamiento control despues de tratamiento con las dosis indicadas de varios ARNip. (B) fndice de supervivencia de celulas de leucemia despues de tratamiento con ARNip (el eje y representa el numero de celulas de leucemia que aun viven despues de los periodos de tiempo indicados despues del tratamiento con el ARNip indicado.

Divulgacion de la invencion

La invencion se refiere a oligonucleotidos y sus usos, por ejemplo, en varios tipos de enfoques de silenciamiento de genes. En los estudios descritos en el presente documento, los inventores han mostrado que ARNip qmmicamente modificado, y mas particularmente duplex oligonucleotidicos que comprenden uno o mas nucleotidos de tipo ADN y/o de tipo ARN son capaces de mediar silenciamiento de genes.

“Residuo de tipo ADN” como se usa en el presente documento en referencia a la conformacion se refiere a una conformacion de, por ejemplo, un nucleosido o nucleotido modificado que es similar a la conformacion de una unidad de ADN sin modificar correspondiente. La conformacion de tipo ADN se puede expresar, por ejemplo, como que tiene un valor de pseudorrotacion (P) sur o este. Los nucleotidos de tipo aDn incluyen, por ejemplo, 2'- desoxirribonucleotidos, arabinonucleotidos 2'-desoxi-2'-sustituidos tal como 2'-desoxi-2'fluoroarabinonucleotidos (2'F-AAN o FAAN), y analogos de fosforotioato correspondientes. “Residuo de tipo ARN” como se usa en el presente documento en referencia a la conformacion se refiere a una conformacion de, por ejemplo, un nucleosido o nucleotido modificado que es similar a la conformacion de una unidad de ARN sin modificar correspondiente. La conformacion de tipo aRn se puede expresar, por ejemplo, como que tiene un valor P norte. Ademas, las moleculas de tipo ARN tienden a adoptar una helice de forma A mientras que las moleculas de tipo ADN tienden a adoptar una helice de forma B. Los nucleotidos de tipo ARN incluyen, por ejemplo, nucleotidos de ARN, nucleotidos de ARN 2'- sustituidos tal como nucleotidos de 2' fluoro-ARN (2'F-ARN), nucleotidos de acido nucleico bloqueado (ANB) (tambien definidos como acidos nucleicos en puente o nucleotidos biciclicos), 2'-fluoro-4'-tioarabinonucleotido (nucleotidos 4'S-FAAN), 2'-O-alquil-ARN y analogos de fosforotiorato correspondientes.

La estructura de un residuo de tipo ADN representativo (2'F-AAN) se ilustra a continuacion:

imagen1

Las estructuras de ejemplos de residuos de tipo ARN (ARN, ANB y 2'F-ARN) se ilustran a continuacion:

imagen2

2'F-ARN ANB ARN

En un aspecto adicional de la divulgacion, se proporciona un par de oligonucleotidos que pueden formar un duplex bicatenario, por ejemplo:

Sentido:

nucleotido(s) de tipo ADN

Antisentido:

nucleotido(s) de tipo ADN

Sentido:

nucleotido(s) de tipo ADN

Antisentido:

nucleotido(s) de tipo ARN

Sentido:

nucleotido(s) de tipo ADN

Antisentido:

nucleotido(s) de tipo ADN

nucleotido(s) de tipo ARN, o ambos nucleotido(s) de tipo ARN, o ambos

nucleotido(s) de tipo ARN, o ambos nucleotido(s) de tipo ARN, o ambos

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Sentido: nucleotido(s) de tipo ARN

Antisentido: nucleotido(s) de tipo ADN, nucleotido(s) de tipo ARN, o ambos

Sentido: nucleotido(s) de tipo ADN

Antisentido: nucleotido(s) de tipo ARN

En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona un par de oligonucleotidos que pueden formar un duplex que comprende una hebra sentido (por ejemplo, una primera) y una hebra antisentido (por ejemplo, una segunda) complementaria a la hebra sentido (o primera), en donde el duplex oligonucleotfdico comprende:

(a) uno o mas arabinonucleotidos sustituidos en 2' (AAN); y

(b) (i) uno o mas ribonucleotidos (ARN) sustituidos en 2', (ii) uno o mas nucleotidos de acido nucleico bloqueado (ANB), o (iii) una combinacion de (i) y (ii).

En una forma de realizacion, el duplex oligonucleotidico anteriormente mencionado comprende ademas cualquier combinacion de residuos de tipo ADN y/o de tipo ARN.

Los oligonucleotidos de la invencion pueden incluir los que contienen enlaces de esqueleto interazucar tal como fosfotriesteres, metilfosfonatos, enlaces interazucar alquilo o cicloalquilo de cadena corta o enlaces interazucar heteroatomicos o heterodclicos de cadena corta, fosforotioatos y esos con formacetal (O-CH2-O), esqueletos CH2-- NH--O--CH2, CH2--N(CH3)--O--CH2 (conocido como esqueleto metilen(metilimino) o MMI), CH2--O--N(CH3)--CH2, CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2 y O--N(CH3)--CH2 (donde fosfodiester es O--PO2--O--CH2). Tambien se pueden usar oligonucleotidos que tienen estructuras de esqueleto de morfolino (patente en EE UU No. 5.034.506). En formas de realizacion alternativas, los oligonucleotidos antisentido pueden tener un esqueleto de acido peptidonucleico (APN, algunas veces denominado “acido protemo nucleico”), en el que el esqueleto fosfodiester del oligonucleotido se puede sustituir con un esqueleto de poliamida en donde las bases nucleosfdicas se unen directa o indirectamente a atomos de nitrogeno aza o grupos metileno en el esqueleto de poliamida (Nielsen et al., Science 1991 254(5037): 1497-1500 y patente en EE UU No. 5.539.082). Los enlaces fosfodiester se pueden sustituir con estructuras que son quirales y enantiomericamente espedficas. Los expertos en la materia seran capaces de seleccionar otros enlaces para uso en la practica de la invencion.

“Nucleosido” se refiere a una combinacion base-azucar, la base esta unida al azucar a traves de un enlace N- glucosfdico. “Nucleotido” se refiere a un nucleosido que ademas comprende un grupo fosfato unido a la parte azucar del nucleosido. “Base”, “base de acido nucleico” o “nucleobase” se refiere a una fraccion de base heterodclica, que en un nucleosido o nucleotido esta unida a la porcion azucar del mismo, generalmente en la posicion 1' de la fraccion azucar, tambien conocida como posicion anomerica. Este termino incluye bases tanto naturales como modificadas. Las dos clases mas comunes de bases naturales son purinas y pirimidinas, y comprenden, por ejemplo, guanina, citosina, timina, adenina y uracilo. Se conocen en la tecnica un numero de otras bases naturales, asf como bases modificadas, por ejemplo, inosina, 5-metilcitosina, 2-tiotimina, 4-tiotimina, 7-deazaadenina, 9- deazaadenina, 3-deazaadenina, 7-deazaguanina, 9-deazaguanina, 6-tioguanina, isoguanina, 2,6-diaminopurina, hipoxantina, y 6-tiohipoxantina.

Los oligonucleotidos de la invencion tambien pueden incluir especies que incluyen al menos una base de nucleotido modificada. Por tanto, se pueden usar purinas y pirimidinas diferentes de las normalmente encontradas en la naturaleza. De forma similar, tambien se pueden efectuar modificaciones en la porcion pentofuranosilo de las subunidades de nucleotido. Los ejemplos de tales modificaciones incluyen 2'-sustitucion/modificacion, tal como nucleotidos 2'-O-alquil y 2'halogeno sustituidos. Algunos ejemplos espedficos de modificaciones en la posicion 2' de las fracciones de azucar que son utiles en la presente invencion son Oh, SH, SCH3, F, OCN, O(CH2)n NH2 o O(CH2)n CH3 donde n es desde 1 hasta aproximadamente 10; alquilo inferior de C1 a C10, alquilo inferior sustituido, alcarilo o aralquilo; CI; Br; CN; CF3; OCF3; O-, S-, o N-alquilo; O-, S-, o N-alquenilo; SOCH3; SO2CH3; ONO2; NO2; N3; NH2; heterocicloalquilo; heterocicloalcarilo; aminoalquilamino; polialqulamino; sililo sustituido; un grupo que corta ARN; un grupo indicador; un intercalador; un grupo para mejorar las propiedades farmacocineticas de un oligonucleotido; o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinamicas de un oligonucleotido y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. Se pueden sustituir uno o mas grupos pentafuranosilo por otro azucar, por un azucar adclico, por un imitador de azucar tal como ciclobutilo o por otra fraccion que toma el lugar del azucar tal como la hexosa de seis carbonos o el oxapano de siete carbonos.

ANB generalmente se refiere a biciclonucleotidos e incluye, por ejemplo, p-D y a-L biciclo nucleotidos, biciclonucleotidos tal como acidos nucleicos xilo-bloqueados (patente en EE UU No. 7.084.125), acidos nucleicos L- ribo-bloqueados (patente en EE UU No. 7.053.207), acidos nucleicos 1'-2' bloqueados (patentes en EE UU No. 6.734.291 y 6.639.059), acidos nucleicos 3'-5' bloqueados (patente en EE UU No. 6.083.482), asf como acidos nucleicos 2'-4' bloqueados.

En algunas formas de realizacion, los oligonucleotidos segun esta invencion pueden comprender desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 100 unidades de nucleotidos, en formas de realizacion adicionales

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desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 100, desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 30, desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 30, desde aproximadamente 18 hasta aproximadamente 27, desde aproximadamente 19 hasta aproximadamente 27, desde aproximadamente 18 hasta aproximadamente 25, desde aproximadamente 19 hasta aproximadamente 25, o desde aproximadamente 19 hasta aproximadamente 23 unidades de nucleotidos, tal como 19, 21 o 23 unidades de nucleotidos. Como se apreciara, una unidad de nucleotido es una combinacion base-azucar (o una combinacion de estructuras analogas) adecuadamente unidas a una unidad de nucleotido adyacente a traves de enlaces fosfodiester u otros formando una estructura esqueleto.

La fraccion de base heterodclica de cualquier nucleotido descrito en el presente documento puede ser una de las bases canonicas de ADN o ARN, por ejemplo, adenina, citosina, guanina, timina o uracilo. En otras formas de realizacion de la invencion, algunas de las fracciones de bases heterodclicas pueden estar hechas de bases modificadas o no canonicas, por ejemplo, inosina, 5-metilcitosina, 2-tiotimina, 4-tiotimina, 7-deazaadenina, 9- deazaadenina, 3-deazaadenina, 7-deazaguanina, 9-deazaguanina, 6-tioguanina, isoguanina, 2,6-diaminopurina, hipoxantina, y 6-tiohipoxantina.

En otras formas de realizacion de la invencion, el oligonucleotido comprende uno o mas de los siguientes enlaces internucleotfdicos: a) enlaces fosfodiester; b) enlaces fosfotriester; c) enlaces fosforotioato; d) enlaces metilfosfonato; e) enlaces boranofosfato; o f) enlaces 2'-5'-fosfodiester. En formas de realizacion, los enlaces internucleotfdicos son enlaces fosfodiester, enlaces fosforotioato o una combinacion de los mismos.

En otra forma de realizacion, el par o duplex de oligonucleotidos anteriormente mencionado comprende uno o mas AAN sustituidos en 2' y uno o mas ARN sustituidos en 2' (en una o ambas hebras).

En una forma de realizacion el par o duplex de oligonucleotidos anteriormente mencionado comprende uno o mas AAN sustituidos en 2' y uno o mas ANB (en una o ambas hebras).

En otra forma de realizacion, el par o duplex de oligonucleotidos anteriormente mencionado comprende uno o mas AAN sustituidos en 2', uno o mas ARN sustituidos en 2' y uno o mas ANB (en una o ambas hebras).

En formas de realizacion, los residuos de tipo ADN y de tipo ARN estan en segmentos alternantes en una hebra, tal como de una manera irregular (por lo cual puede haber diferencias en el numero de residuos por segmento) o una manera regular (por lo cual cada segmento tiene el mismo numero de residuos), o combinaciones de las mismas. En una forma de realizacion, cada segmento alternante comprende un residuo (denominado diseno o configuracion altfmero 1-1). En otra forma de realizacion, cada segmento alternante comprende dos residuos (denominado diseno altfmero 2-2). En otra forma de realizacion, cada segmento alternante comprende tres residuos (denominado diseno altfmero 3-3). En aun otra forma de realizacion, los segmentos alternantes anteriormente mencionados estan en la hebra sentido.

En una forma de realizacion, el duplex de oligonucleotidos anteriormente mencionado comprende (en una o ambas hebras) al menos un residuo 2'F-ARN. En una forma de realizacion adicional, el residuo 2'F-ARN anteriormente mencionado es una 2'F-ARN pirimidina. En otra forma de realizacion, el anteriormente mencionado al menos un residuo 2'F-ARN esta en la hebra antisentido.

En una forma de realizacion adicional, el par o duplex de oligonucleotidos anteriormente mencionado esta completamente modificado con uno o mas residuos 2'F-ARN o 2'F-AAN. En otra forma de realizacion, el duplex de oligonucleotidos anteriormente mencionado comprende (en una o ambas hebras) una combinacion de una o mas 2'F-ARN pirimidinas y 2'F-AAN purinas. En otra forma de realizacion, el duplex de oligonucleotidos anteriormente mencionado comprende (en una o ambas hebras) uno o mas segmentos alternantes de residuos de 2'F-ARN y residuos de 2'F-AAN (altfmeros), de una manera regular o irregular. En una forma de realizacion adicional, cada segmento comprende de 1 a 5 residuos. En una forma de realizacion adicional, cada segmento comprende un residuo (diseno de altfmero 1-1). En otra forma de realizacion, cada segmento comprende tres residuos (diseno de altfmero 3-3). En otra forma de realizacion, el duplex de oligonucleotidos anteriormente mencionado comprende una mezcla de disenos de altfmero 1-1 y 3-3. En otra forma de realizacion, los segmentos alternantes anteriormente mencionados de residuos 2'F-ARN y residuos 2'F-AAN (altfmeros) estan en la hebra sentido.

En otra forma de realizacion, el par o duplex de oligonucleotidos anteriormente mencionado esta completamente modificado con uno o mas residuos de 2'F-ARN, residuos de 2'F-AAN y residuos de ANB. En una forma de realizacion, el uno o mas residuos de ANB estan tanto en la hebra sentido como en la hebra antisentido. En otra forma de realizacion, el uno o mas residuos de ANB estan en la hebra antisentido. En otra forma de realizacion, el uno o mas residuos de ANB estan en la hebra sentido.

En una forma de realizacion, la hebra sentido anteriormente mencionada comprende (i) 2'F-AAN; (ii) 2'F-ARN; (iii) ARN; (iv) ANB; (v) ADN; o (vi) cualquier combinacion de (i) a (v).

En una forma de realizacion, la hebra antisentido anteriormente mencionada comprende (i) 2'F-AAN; (ii) 2'F-ARN;

(iii) ARN; (iv) ANB; (v) ADN; o (vi) cualquier combinacion de (i) a (v).

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En una forma de realizacion, la hebra sentido anteriormente mencionada comprende:

(i) 2'F-AAN solo;

(ii) 2'F-ARN solo;

(iii) una combinacion de 2'F-ARN y 2'F-AAN;

(iv) ARN solo;

(v) una combinacion de 2'F-AAN y ARN;

(vi) una combinacion de 2'F-AAN, 2'F-ARN y ARN;

(vii) una combinacion de 2'F-AAN, ARN y aNb.

En una forma de realizacion adicional, la hebra sentido anteriormente mencionada consiste en:

(i) 2'F-AAN solo;

(ii) 2'F-ARN solo;

(iii) una combinacion de 2'F-ARN y 2'F-AAN;

(iv) ARN solo;

(v) una combinacion de 2'F-AAN y ARN;

(vi) una combinacion de 2'F-AAN, 2'F-ARN y ARN; o

(vii) una combinacion de 2'F-AAN, ARN y aNb.

En otra forma de realizacion, la hebra antisentido anteriormente mencionada comprende:

(i) 2'F-ARN solo;

(ii) ARN solo;

(iii) 2'F-AAN solo;

(iv) una combinacion de 2'F-ARN y 2'F-AAN;

(v) una combinacion de ARN y aNb; o

(vi) una combinacion de 2'F-aAn, ARN y ANB.

En una forma de realizacion adicional, la hebra antisentido anteriormente mencionada consiste en:

(i) 2'F-ARN solo;

(ii) ARN solo;

(iii) 2'F-AAN solo;

(iv) una combinacion de 2'F-ARN y 2'F-AAN;

(v) una combinacion de ARN y aNb; o

(vi) una combinacion de 2'F-aAn, ARN y ANB.

En otra forma de realizacion, el par o duplex de oligonucleotidos anteriormente mencionado comprende:

(a)

Sentido: una combinacion de 2'F-ARN y 2'F-AAN

Antisentido: ARN solo;

(b)

Sentido: una combinacion de 2'F-ARN pirimidinas y 2'F-AAN purinas

Antisentido: ARN solo;

(c)

Sentido: una combinacion de 2'F-ARN y 2'F-AAN en diseno de altfmero 1-1

Antisentido: ARN solo;

(d)

Sentido: 2'F-AAN solo

Antisentido: 2'F-ARN solo;

(e)

Sentido: una combinacion de 2'F-ARN y 2'F-AAN en diseno de altfmero 3-3

Antisentido: ARN solo;

(f)

Sentido: una combinacion de 2'F-ARN + 2'F-AAN en disenos de altfmero 3-3 y 1-1

Antisentido: ARN solo;

(g)

Sentido: una combinacion de 2'F-AAN y ARN

Antisentido: 2'F-ARN solo;

(h)

Sentido: una combinacion de 2'F-ARN y 2'F-AAN en diseno de altfmero 3-3

Antisentido: 2'F-ARN solo;

(i)

Sentido: una combinacion de 2'F-ARN y 2'F-AAN en disenos de altfmero 3-3 y 1-1

Antisentido: 2'F-ARN solo;

(j)

Sentido: una combinacion de 2'F-ARN y 2'F-AAN en diseno de altfmero 1-1

Antisentido: 2'F-ARN solo;

(k)

Sentido: 2'F-AAN solo

Antisentido: una combinacion de ARN y ANB;

(l)

Sentido: una combinacion de 2'F-AAN y ARN

Antisentido: una combinacion de ARN y ANB;

(m)

Sentido: una combinacion de 2'F-AAN, ARN y ANB

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Antisentido: ARN solo;

(n)

Sentido: una combinacion de 2'F-AAN, ARN y ANB

Antisentido: una combinacion de ARN y ANB; o

(o)

Sentido: una combinacion de 2'F-AAN, ARN y ANB

Antisentido: 2'F-ARN solo.

En una forma de realizacion adicional, en el caso de una hebra sentido que comprende un nucleo de 19 residuos (con o sin extension adicional), la hebra sentido comprende residuos de ANB en las posiciones 3, 11, 16 y/o 17. En una forma de realizacion adicional, en el caso de una hebra antisentido que comprende un nucleo de 19 residuos (con o sin extension adicional), la hebra antisentido comprende residuos de ANB en la posicion 19 (lefdo de 5' a 3').

En una forma de realizacion adicional, el par o duplex de oligonucleotidos anteriormente mencionados comprende:

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

(h)

(i)

(j)

(k)

(l)

(m)

(n)

(o)

(p)

(q)

(r)

(s)

(t)

(u)

Sentido: (2'F-ARN pirimidinas)x(2'F-AAN purinas)y

Antisentido: (ARN)z

en donde x es el numero de pirimidinas e y es el numero de purinas en la hebra sentido, y en donde x + y = z. En una forma de realizacion z = 19.

Sentido:

Antisentido:

Sentido:

Antisentido:

Sentido:

Antisentido:

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Antisentido:

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Antisentido:

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Antisentido:

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Antisentido:

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Antisentido:

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Antisentido:

Sentido:

Antisentido:

Sentido:

Antisentido:

Sentido:

AAN)2

[(2'F-AAN)(2'F-ARN)]g (2'F-AAN)

(ARN)19

(2'F-AAN)19

(2'F-ARN)19

[(2'F-AAN)3(2'F-ARN)s]3 (2'F-AAN)

(ARN)19

[(2'F-AAN)3(2'F-ARN)3]2 [(2'F-AAN)(2'F-ARN)]3 (2'F-AAN)

(ARN)19

(2'F-AAN)14(ARN)5

(2'F-ARN)19

[(2'F-AAN)3(2'F-ARN)3]3 (2'F-AAN)

(2'F-ARN)19

[(2'F-AAN)3(2'F-ARN)3]2 [(2'F-AAN)(2'F-ARN)]3 (2'F-AAN)

(2'F-ARN)19

[(2'F-AAN)(2'F-ARN)]9 (2'F-AAN)

(2'F-ARN)19 (2'F-AAN)19 (ANB) (ARN)18 (2'F-AAN)19

(ANB) (ARN) (ANB) (ARN)-,6 (2'F-AAN)19

(ARN)n (ANB)2 (ARN)16

(2'F-AAN)(ARN)(ANB)(ARN)(2'F-AAN)4(ARN)2(ANB)(ARN)2(2'F-AAN)2(ANB)(ARN)(2'F-

Antisentido:

Sentido:

AAN)(ANB)(2'F-

Antisentido:

Sentido:

Antisentido:

Sentido:

ANN)2

Antisentido:

Sentido:

AAN)(ANB)(2'F-

Antisentido:

Sentido:

Antisentido:

Sentido:

AAN)(ARN)(2'F

Antisentido:

Sentido:

Antisentido:

Sentido:

AAN)2

Antisentido:

Sentido:

AAN)(ANB)(2'F-

Antisentido:

(ARN)19

(2'F-AAN)(ARN)(ANB)(ARN)(2'F-AAN)4(ARN)2(ANB)(ARN)2(2'F-AAN)(ARN)(2'F

AAN)(ARN)

(ARN)19

(2'F-AAN)(ARN)(ANB)(ARN)(2 (ARN)19

(2'F-AAN)(ARN)(ANB)(ARN)(2

F-AAN)4(ARN)2(ANB)(ARN)2(2'F-AAN)(ARN)5

F-AAN)4(ARN)2(ANB)(ARN)2(2'F-AAN)2(ANB)(ARN)(2'F-

(ANB) (ARN)18

(2'F-AAN)(ARN)(ANB)(ARN)(2'F-AAN)4(ARN)2(ANB)(ARN)2(2'F-AAN)(ARN)(2'F

AAN)(ARN)

(ANB) (ARN)18

(2'F-AAN)(ARN)(ANB)(ARN)(2 (ANB) (ARN)18

(2'F-AAN)(ARN)(ANB)(ARN)(2 AAN)(ARN)

(ANB) (ARN)18

(2'F-AAN)(ARN)(ANB)(ARN)(2 (ANB) (ARN)18

(2'F-AAN)(ARN)(ANB)(ARN)(2

F-AAN)4(ARN)2(ANB)(ARN)2(2'F-AAN)2(ARN)2(2'F-ANN)2

F-AAN)4(ARN)2(ANB)(ARN)2(2'F-AAN)(ARN)(2'F-

F-AAN)4(ARN)2(ANB)(ARN)2(2'F-AAN)(ARN)5

F-AAN)4(ARN)2(ANB)(ARN)2(2'F-AAN)2(ANB)(ARN)(2'F-

(2'F-ARN)19

(2'F-AAN)(ARN)(ANB)(ARN)(2'F-AAN)4(ARN)2(ANB)(ARN)2(2'F-AAN)(ARN)(2'F-

AAN)(ARN)

(2'F-ARN)19

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(w)

Sentido: (2'F-AAN)(ARN)(ANB)(ARN)(2'F-AAN)4(ARN)2(ANB)(ARN)2(2'F-AAN)2(ARN)2(2'F-AAN)2

Antisentido: (2'F-ARN)19

(x)

Sentido: (2'F-AAN)(ARN)(ANB)(ARN)(2'F-AAN)4(ARN)2(ANB)(ARN)2(2'F-AAN)(ARN)(2'F-

AAN)(ARN)(2'F-AAN)(ARN)

Antisentido: (2'F-ARN)19 o

(y)

Sentido: (2'F-AAN)(ARN)(ANB)(ARN)(2'F-AAN)4(ARN)2(ANB)(ARN)2(2'F-AAN)(ARN)5

Antisentido: (2'F-ARN)19.

En una forma de realizacion, el duplex de oligonucleotidos anteriormente mencionado comprende una extension (por ejemplo, extension 5' y/o 3', en una hebra o en ambas hebras). En una forma de realizacion adicional, la extension anteriormente mencionada es una extension de 1 a 5 residuos (por ejemplo, nucleotidos o nucleotidos modificados). En una forma de realizacion adicional, la extension anteriormente mencionada es una extension de 2 residuos (por ejemplo, nucleotidos o nucleotidos modificados). Por ejemplo, una hebra sentido y/o hebra antisentido de 19 residuos puede comprender una extension de 1 a 5 residuos adicionales. En tal ejemplo, una extension de 2 residuos en ambas hebras producina hebras sentido y antisentido de 21 residuos cada una, 19 de los cuales participan en emparejamiento de bases para formar el duplex (los restantes 2 residuos en cada caso representan las extensiones).

En otra forma de realizacion, la extension anteriormente mencionada comprende residuos de ADN, 2'F-AAN y/o 2'F- ARN. En una forma de realizacion adicional, la extension anteriormente mencionada comprende dos residuos de 2'F-AAN. En una forma de realizacion adicional, la extension anteriormente mencionada que comprende dos residuos de 2'F-AAN esta en la hebra sentido.

En otra forma de realizacion, la extension anteriormente mencionada comprende dos residuos de 2'F-ARN. En una forma de realizacion adicional, la extension anteriormente mencionada que comprende dos residuos de 2'F-ARN esta en la hebra antisentido.

En otra forma de realizacion, la extension anteriormente mencionada es una extension 3'.

En otra forma de realizacion, el par o duplex de oligonucleotidos anteriormente mencionado esta fosforilado en 5' en una o ambas hebras. En una forma de realizacion adicional, el par o duplex de oligonucleotidos anteriormente mencionado esta fosforilado en 5' en la hebra antisentido.

En formas de realizacion, la complementariedad de secuencia (por ejemplo, nucleobases) entre la hebra sentido y la hebra antisentido, o la identidad de secuencia (por ejemplo, nucleobases) entre la hebra sentido y un acido nucleico diana (por ejemplo, ARNm), o una parte del mismo, puede ser “perfecta” o “completa” (100% de complementariedad o identidad).

En formas de realizacion, la complementariedad entre la hebra sentido y la hebra antisentido, o la identidad entre la hebra sentido y un acido nucleico diana (por ejemplo, ARNm), o una parte del mismo, es sustancial, por ejemplo, mayor de aproximadamente el 70%. Por ejemplo, para una region duplex que consiste en 19 pares de bases, un mal emparejamiento produce el 94,7% de complementariedad, dos malos emparejamientos producen aproximadamente el 89,5% de complementariedad, 3 malos emparejamientos producen aproximadamente el 84,2% de complementariedad, 4 malos emparejamientos producen aproximadamente el 79% de complementariedad y 5 malos emparejamientos producen aproximadamente el 74% de complementariedad. Segun esto, como se usa en el presente documento, “complementariedad” se refiere tanto a complementariedad perfecta como complementariedad sustancial entre dos secuencias, por ejemplo, a complementariedad mayor de aproximadamente el 70% entre las secuencias. En una forma de realizacion, la hebra sentido tiene un identidad de al menos 12 nucleotidos, en una forma de realizacion adicional de al menos 12 nucleotidos contiguos, a al menos una parte de un acido nucleico diana (por ejemplo, ARNm). En una forma de realizacion, la hebra sentido tiene una identidad de al menos 13 nucleotidos, en formas de realizacion adicionales de al menos 14, 15, 16, 17 o 18 nucleotidos (contiguos o no), a al menos una parte de un acido nucleico diana. En otra forma de realizacion, la hebra sentido tiene identidad completa a una parte del ARNm diana, con la excepcion de los nucleotidos que sobresalen (extension 3').

Ademas, complementariedad e identidad como se usan en el presente documento se refiere a complementariedad e identidad de las fracciones de nucleobases (por ejemplo, A, C, G, T o U), comunmente denominados “emparejamiento de bases”, y es independiente de, por ejemplo, modificaciones de la fraccion azucar, tal como las descritas en el presente documento. Por ejemplo, un residuo de nucleosido de guanina que tiene cualquier fraccion de azucar (es decir, modificado o no) puede emparejarse con un residuo de nucleosido de citosina que tiene similarmente cualquier fraccion de azucar.

“Identidad” se refiere a similitud de secuencia entre dos peptidos o dos moleculas de acido nucleico. La identidad se puede determinar comparando cada posicion en las secuencias alineadas. Un grado de identidad entre secuencias de acidos nucleicos o aminoacidos es una funcion del numero de nucleotidos o aminoacidos identicos o coincidentes en posiciones compartidas por las secuencias. Como se usa el termino en el presente documento, una secuencia de acido nucleico es “sustancialmente identica” a otra secuencia si la actividad funcional de las secuencias se conserva.

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Dos secuencias de acido nucleico se consideran sustancialmente identicas si, cuando se alinean de forma optima (con huecos permitidos), comparten al menos aproximadamente el 70% de similitud o identidad de secuencia, o si las secuencias comparten motivos funcionales definidos. En formas de realizacion alternativas, la similitud de secuencia en secuencias sustancialmente identicas optimamente alineadas puede ser al menos el 75%, 80%, 85%, 90% o 95%. Una secuencia “no relacionada” comparte menos del 40% de identidad, aunque referiblemente menos de aproximadamente el 25% de identidad, con una secuencia de referencia determinada (por ejemplo, un acido nucleico diana).

Los acidos nucleicos sustancialmente complementarios son acidos nucleicos en los que el complemento de una molecula es sustancialmente identico a la otra molecula. Dos secuencias de acido nucleico o protema se consideran sustancialmente identicas si, cuando se alinean de forma optima, comparten al menos aproximadamente el 70% de identidad de secuencia. En formas de realizacion alternativas, la identidad de secuencia puede ser, por ejemplo, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, o al menos el 95%. El alineamiento optimo de secuencias para comparaciones de identidad se puede realizar usando una variedad de algoritmos, tal como el algoritmo de homologfa local de Smith y Waterman, 1981, Adv. Appl. Math 2: 482, el algoritmo de alineamiento de homologfa de Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443, el metodo de busqueda para similitud Pearson y Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, e implementaciones computarizadas de estos algoritmos (tal como GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de Wisconsin Genetics Software, Genetics Computer Group, Madison, WI, EE UU.). La identidad de secuencia tambien se puede determinar usando el algoritmo BLAST, descrito en Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-10 (usando los ajustes por defecto publicados). El software para realizar analisis por BLAST puede estar disponible a traves del Centro Nacional para Informacion en Biotecnologfa. El algoritmo BLAST implica primero identificar pares de secuencia de alta puntuacion (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia problema que o bien coinciden o satisfacen alguna puntuacion umbral valorada positivamente T cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se denomina el umbral de puntuacion de palabra vecina. Los aciertos de palabras vecinas iniciales actuan como semillas para iniciar busquedas para encontrar HSP mas largos. Los aciertos de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia durante tanto como la puntuacion acumulada de alineamiento se pueda aumentar. La extension de los aciertos de palabras en cada direccion se para cuando se cumplen los siguientes parametros: la puntuacion de alineamiento acumulada disminuye en la cantidad X de su valor alcanzado maximo; la puntuacion acumulada va a cero o por debajo, debido a la acumulacion de uno o mas alineamientos de residuos que puntuan negativo; o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parametros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLAST puede usar por defecto una longitud de palabra (W) de 11, la matriz de puntuacion BLOSUM62 (Henikoff y Henikoff, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919) alineamiento (B) de 50, expectativa (E) de 10 (o 1, o 0,1 o 0,01 o 0,001 o 0,0001), M=5, N=4, y una comparacion en ambas hebras. Una medida de la similitud estadfstica entre dos secuencias usando el algoritmo BLAST es la menor probabilidad de suma (P(N)), que proporciona una indicacion de la probabilidad por la que una coincidencia entre dos secuencias de nucleotidos o aminoacidos se producina al azar. En formas de realizacion alternativas de la invencion, secuencias de nucleotidos o aminoacidos se consideran sustancialmente identicas si la menor probabilidad de suma en una comparacion de las secuencias de prueba es menor que aproximadamente 1, preferiblemente menor que aproximadamente 0,1, mas preferiblemente menor que aproximadamente 0,01, y lo mas preferiblemente menor que aproximadamente 0,001.

Una indicacion alternativa de que dos secuencias de acido nucleico son sustancialmente complementarias es que las dos secuencias hibriden entre sf en condiciones moderadamente rigurosas, o preferiblemente, rigurosas. La hibridacion a secuencias unidas a filtro en condiciones moderadamente rigurosas se puede, por ejemplo, realizar, en NaHPO4 0,5 M, dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, EDTA 1 mM a 65°C y lavar en SSC 0,2x/SDS al 1% a 42°C (vease Ausubel, et al. (eds), 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, Green Publishing Associates, Inc., y John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, en p. 2.10.3). Alternativamente, la hibridacion a secuencias unidas a filtro en condiciones rigurosas se puede, por ejemplo, realizar en NaHPO4 0,5 M, SDS al 7%, EDTA 1 mM a 65°C y lavar en SSC 0,1x/SDS al 0,1% a 68°C (vease Ausubel, et al. (eds), 1989, anteriormente). Las condiciones de hibridacion se pueden modificar segun metodos conocidos dependiendo de la secuencia de interes (vease Tijssen, 1993, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology -- Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capftulo 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, Nueva York). Generalmente, se seleccionan condiciones rigurosas que sean aproximadamente 5°C menos que el punto de fusion termico para la secuencia espedfica a una fuerza ionica y pH definidos.

La hebra sentido y la hebra antisentido pueden estar unidas por una estructura en bucle, que puede estar compuesta de un polfmero no de acido nucleico como, entre otros, polietilenglicol. Alternativamente, la estructura en bucle puede estar compuesta de un acido nucleico, incluyendo ribonucleotidos modificados y sin modificar y desoxirribonucleotidos modificados y sin modificar.

En una forma de realizacion, el extremo 5' de la hebra sentido de duplex de oligonucleotidos puede estar unido al extremo 3' de la hebra antisentido, o el extremo 3' de la hebra sentido puede estar unido al extremo 5' de la hebra sentido, dicha union es a traves de un enlazador de acido nucleico que tipicamente tiene una longitud entre 2 a 100 nucleotidos (o nucleotidos modificados), preferiblemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 30 nucleobases.

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En una forma de realizacion, el duplex de oligonucleotidos anteriormente mencionado es un duplex en horquilla, que es una hebra unica que comprende las hebras sentido y antisentido que es autocomplementaria y se pliega sobre si misma.

La invencion proporciona ademas una sal, tal como una sal farmaceuticamente aceptable, de cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente (por ejemplo, nucleotido, duplex de oligonucleotidos, ARNip, o molecula de tipo ARNip) donde sea aplicable.

La presente invencion tambien se refiere a compuestos que reducen la expresion de varios genes, es decir, disminuyen la produccion de un polipeptido codificado. La invencion proporciona oligonucleotidos/duplex de oligonucleotidos de la invencion y usos de los mismos en aplicaciones de ARNip/iARN, por lo cual la expresion de un acido nucleico que codifica un polipeptido de interes, o un fragmento del mismo, se puede inhibir o prevenir usando tecnologfa de interferencia de ARN (iARN), un tipo de silenciamiento genico postranscripcional. Se puede usar iARN para crear un pseudo “knockout”, es decir, un sistema en el que la expresion del producto codificado por un gen o region codificante de interes se reduce, produciendo una reduccion global de la actividad del producto codificado en un sistema. Como tal, se puede realizar iARN para atacar un acido nucleico de interes o fragmento o variante del mismo, para a su vez reducir su expresion y el nivel de actividad del producto que codifica. Tal sistema se puede usar para estudios funcionales del producto, asf como para tratar trastornos relacionados con la actividad de tal producto. Se describe la iARN en, por ejemplo, las publicaciones de patentes en EE UU No. 2002/0173478 (Gewirtz; publicada el 21 de noviembre, 2O02) y 2002/0132788 (Lewis et al.; publicada el 7 de noviembre, 2002). Estan comercialmente disponibles reactivos y kits para realizar iARN de, por ejemplo, Ambion Inc. (Austin, TX, EE UU), New England Biolabs Inc. (Beverly, MA, EE UU) e Invitrogen (Carlsbad, cA, EE UU).

Se piensa que el agente inicial para iARN en algunos sistemas es ARNbc o moleculas de ARNbc modificado correspondientes a un acido nucleico diana. Se piensa que despues el ARNbc se corta a ARN interferentes pequenos (ARNip) que tienen, por ejemplo, 21-23 nucleotidos de longitud (duplex de 19-21 pb, cada uno con extensiones 3' de 2 nucleotidos). La enzima que se piensa efectua esta primera etapa de corte (la version de Drosophila se denomina “Dicer”) se categoriza como miembro de la familia de RNasa III de ribonucleasas espedficas de ARNbc. Alternativamente, se puede efectuar iARN introduciendo directamente en la celula, o generando en la celula introduciendo en la celula, un ARNip o molecula de tipo ARNip o un precursor adecuado (por ejemplo, vector que codifica precursor(es), etc.), de la misma. Un ARNip se puede asociar despues con otros componentes intracelulares para formar un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC). Por tanto, el RISC formado puede posteriormente dirigirse a un transcrito de interes a traves de interacciones de emparejamiento de bases entre su componente ARNip y el transcrito diana en virtud de homologfa, produciendo el corte del transcrito diana aproximadamente 12 nucleotidos desde el extremo 3' del ARNip. Por tanto, el ARNm diana se corta y el nivel del producto protema que codifica se reduce.

Se puede efectuar iARN mediante la introduccion de moleculas de ARNip o de tipo ARNip sintetizadas in vitro en celulas. Se puede realizar iARN, por ejemplo, usando ARN qmmicamente sintetizado o moleculas de ARN modificado. Alternativamente, se pueden usar vectores de expresion adecuados para transcribir tal ARN ya sea in vitro o in vivo. La transcripcion in vitro de las hebras sentido y antisentido (codificadas por secuencias presentes en el mismo vector o en vectores separados) se puede efectuar usando, por ejemplo, ARN polimerasa de T7, en cuyo caso el vector puede comprender una secuencia codificante adecuada operativamente unida a un promotor T7. El ARN transcrito in vitro se puede, en formas de realizacion, procesar (por ejemplo, usando RNasa III de E. coli) in vitro hasta un tamano que conduzca a iARN. Los transcritos sentido y antisentido se combinan para formar un duplex de ARN que se introduce en una celula diana de interes. Se pueden usar otros vectores, que expresan ARN horquillados cortos (ARNhc) que se pueden procesar a moleculas de tipo ARNip. Se han descrito varios metodos basados en vectores (vease, por ejemplo, Brummelkamp et al. [2002] Science 296: 550). En la tecnica se conocen varios metodos para introducir tales vectores en celulas, sea in vitro o in vivo (por ejemplo, terapia genica).

Segun esto, en una forma de realizacion de la invencion, un acido nucleico, sea un ARN no codificante (ARNnc), asf como un ARN que codifica un polipeptido de interes (por ejemplo, un ARNm), o un fragmento del mismo, se puede inhibir introduciendo en o generando en una celula un ARNip o molecula de tipo ARNip basada en un oligonucleotido de la invencion, correspondiente a un acido nucleico de interes, o un fragmento del mismo, o a un acido nucleico homologo al mismo (algunas veces colectivamente denominados en el presente documento un “acido nucleico diana”). “Acido nucleico diana” como se usa en el presente documento se refiere a un acido nucleico que codifica un polipeptido (por ejemplo, un ARN codificante tal como un ARNm), asf como a un acido nucleico no codificante, tal como un ARN no codificante (ARNnc), es decir, un ARN que no se traduce a una protema y que esta implicado en varias funciones celulares incluyendo modificaciones postranscripcionales, regulacion genica y propagacion (virus). Los ejemplos de ARNnc incluyen ARN de transferencia (ARNt), ARN ribosomico (ARNr) y ARN nuclear pequeno (ARNnp). Como tal, la degradacion y un descenso en el nivel del acido nucleico diana se puede efectuar, y en el caso de un nucleico diana que codifica un polipeptido, se puede efectuar una disminucion en la produccion o nivel del polipeptido.

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“Molecula de tipo ARNip” se refiere a una molecula de acido nucleico similar a un ARNip (por ejemplo, en tamano y estructura) y capaz de provocar actividad ARNip, es decir, para efectuar la inhibicion mediada por iARN de la produccion del polipeptido. En varias formas de realizacion tal metodo puede implicar la administracion directa del ARNip o la molecula de tipo ARNip en una celula. En una forma de realizacion, el ARNip o molecula de tipo ARNip es menor de aproximadamente 30 nucleotidos de longitud. En una forma de realizacion adicional, el ARNip o molecula de tipo ARNip tiene aproximadamente 19-23 nucleotidos de longitud. En una forma de realizacion, el ARNip o molecula de tipo ARNip comprende una parte de duplex de 19-21 pb, cada hebra tiene una extension 3' de 2 nucleotidos. En otras formas de realizacion, una o ambas hebras pueden tener extremos romos. En formas de realizacion, el ARNip o molecula de tipo ARNip es sustancialmente identica a un acido nucleico que codifica un polipeptido de interes, o un fragmento o variante (o un fragmento de una variante) del mismo. Tal variante es capaz de codificar una protema que tiene actividad similar al polipeptido de interes.

Segun esto, la presente invencion proporciona ademas un ARNip bicatenario o molecula de tipo ARNip (o ARNip modificado) que comprende un duplex de oligonucleotidos de la invencion.

Se debe entender que, en el contexto de la presente invencion, cualquiera de los duplex de oligonucleotidos o ARNip/moleculas de tipo ARNip divulgadas en el presente documento, o cualquier molecula de ARN bicatenario larga (tfpicamente de 25-500 nucleotidos de longitud) que se procesan por complejos celulares endogenos (tal como Dicer o un homologo del mismo - vease anteriormente) para formar las moleculas de ARNip divulgadas en el presente documento, o moleculas que comprenden los duplex de oligonucleotidos o moleculas de ARNip divulgadas en el presente documento, estan dentro del ambito de la presente invencion. Por ejemplo, se preve que un oligonucleotido largo (por ejemplo, de aproximadamente 80 a 500 nucleotidos de longitud) que comprende una o mas estructuras de tallo y bucle, donde las regiones de tallo comprenden los oligonucleotidos de la invencion, se puedan administrar en un soporte, preferiblemente un soporte farmaceuticamente aceptable, y se puedan procesar intracelularmente por complejos celulares endogenos para producir uno o mas oligonucleotidos bicatenarios mas pequenos (ARNip/moleculas de tipo ARNip) de la presente invencion. Este oligonucleotido tfpicamente se denomina construccion de ARNhc en tandem.

En una forma de realizacion, el ARNip anteriormente mencionado tiene de 25 a 30 nucleotidos, que puede ser sustrato para la endonucleasa Dicer (Kim D.-M. et al. Nature Biotechnology, vol. 23, pp. 222-226 (2005)).

La presente invencion tambien proporciona una composicion (por ejemplo, una composicion farmaceutica) que comprende un oligonucleotido, duplex de oligonucleotidos o molecula de tipo ARNip de la invencion, y un excipiente o soporte, tal como un soporte o excipiente biologica o farmaceuticamente aceptable. En una forma de realizacion, tales composiciones incluyen un oligonucleotido, duplex de oligonucleotidos o molecula de tipo ARNip de la invencion en una cantidad terapeutica o profilacticamente eficaz suficiente para tratar una afeccion/enfermedad asociada con la expresion (por ejemplo, sobreexpresion) de un acido nucleico diana, y/o de un polipeptido codificado por un acido nucleico diana. La composicion terapeutica puede ser soluble en una solucion acuosa a un pH fisiologicamente aceptable.

Como se usa en el presente documento “soporte farmaceuticamente aceptable” o “excipiente” incluye cualquier solvente, medio de dispersion, recubrimiento, agente antibacteriano y antifungico, agente isotonico y retrasador de absorcion, y similares, que son fisiologicamente compatibles. En una forma de realizacion, el soporte es adecuado para administracion parenteral. Alternativamente, el soporte puede ser adecuado para administracion intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, topica, sublingual u oral, o para administracion por inhalacion. Los soportes farmaceuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas esteriles y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de soluciones o dispersiones inyectables esteriles. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmaceuticamente activas se conoce bien en la tecnica. Excepto en tanto que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso del mismo en las composiciones farmaceuticas de la invencion. Tambien se pueden incorporar compuestos activos suplementarios en las composiciones.

Las composiciones terapeuticas tipicamente deben ser esteriles y estables en las condiciones de fabricacion y almacenamiento. La composicion se puede formular como una solucion, microemulsion, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para alta concentracion de farmaco. El soporte puede ser un solvente o medio de dispersion que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol lfquido, y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. Se puede mantener la fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamano de partfcula requerido en el caso de dispersion y por el uso de tensioactivos. En muchos casos, sera preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes tal como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio en la composicion. Se puede producir la absorcion prolongada de las composiciones inyectables incluyendo en la composicion un agente que retrasa la absorcion, por ejemplo, sales monoestearato y gelatina. Ademas, se puede administrar un oligonucleotido de la invencion en una formulacion de liberacion en el tiempo, por ejemplo, en una composicion que incluya un polfmero de liberacion lenta. Se pueden preparar los compuestos activos con soportes que protegeran el compuesto contra la liberacion rapida, tal como una formulacion de liberacion controlada, incluyendo implantes y sistemas de administracion microencapsulados. Se pueden usar polfmeros biodegradables, biocompatibles, tal como acetato de

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etilenvinilo, polianhudridos, acido poliglicolico, colageno, poliortoesteres, acido polilactico y copoKmeros polilactico poliglicolico (PLG). Muchos metodos para la preparacion de tales formulaciones estan patentados o los conocen en general los expertos en la materia.

Se pueden preparar soluciones inyectables esteriles incorporando el compuesto activo (por ejemplo, un oligonucleotido, duplex de oligonucleotido, ARNip o molecula de tipo ARNip de la invencion) en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinacion de ingredientes enumerados anteriormente, segun se requiera, seguido por esterilizacion por filtracion. En general, se preparan dispersiones incorporando el compuesto activo en un vehroulo esteril que contiene un medio de dispersion basico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de soluciones inyectables esteriles, los metodos preferidos de preparacion son secado al vacro y liofilizacion que da un polvo del ingrediente activo mas cualquier ingrediente adicional deseado de una solucion previamente filtrada por esterilizacion del mismo. Segun un aspecto alternativo de la divulgacion, un oligonucleotido de la invencion se puede formular con uno o mas compuestos adicionales que aumentan su solubilidad.

Los metodos adecuados para la administracion de ARNip para efectuar iARN segun formas de realizacion incluyen cualquier metodo por el que se puede introducir un ARNip en un organulo, una celula, un tejido o un organismo, como se describe en el presente documento o como conocena un experto en la materia. Tales metodos incluyen, pero no estan limitados a, administracion directa de ARNip tal como por inyeccion incluyendo microinyeccion, electroporacion, precipitacion con fosfato de calcio, usar DEAE-dextrano seguido por polietilenglicol, carga sonica directa, transfeccion mediada por liposomas, bombardeo con microproyectiles, agitacion con fibras de carburo de silicio, transformacion mediada por Agrobacterium, transformacion mediada por PEG, desecacion/absorcion mediada por inhibicion, y similares. Mediante el uso de tecnicas tales como estas, un organulo, celula, tejido u organismo se puede transformar estable o transitoriamente. El oligonucleotido, molecula bicatenaria/duplex, molecula de ARNip o composicion de la invencion se puede administrar en formulaciones de liposomas o lipofectina y similares y se preparan por metodos que conocen bien los expertos en la materia. Tales metodos se describen, por ejemplo, en las patentes en EE UU No. 5.593.972, 5.589.466 y 5.580.859.

Se han desarrollado sistemas de administracion dirigidos espedficamente a la administracion aumentada y mejorada de ARNip en celulas de mairnfero (vease, por ejemplo, Shen et al. FEBS Let. 2003, 539: 111-114; Xia et al., Nat. Biotech. 2002, 20: 1006-1010; Sorensen et al., J. Mol. Biol. 2003. 327: 761-766; Lewis et al., Nat. Gen. 2002, 32: 107-108 y Simeoni et al., Nucleic Acids Research 2003, 31(11): 2717-2724).

Segun otro aspecto de la divulgacion, composiciones terapeuticas de la invencion, que comprenden un duplex de oligonucleotidos, ARNip, o molecula de tipo ARNip de la invencion, se pueden proporcionar en un kit o paquete comercial. El kit puede comprender ademas instrucciones para el uso del duplex de oligonucleotidos, ARNip, o molecula de tipo ARNip para la inhibicion de la expresion de un gen diana, y/o prevencion y/o tratamiento de una enfermedad/afeccion asociada con la expresion (por ejemplo, sobreexpresion) de un acido nucleico o gen diana. El kit puede comprender ademas un ARNip control positivo validado que se dirige a un gen de mantenimiento y/o un ARNip control negativo validado que no tiene diana. El kit puede comprender ademas uno o mas reactivos, tal como reactivos para introducir el duplex de oligonucleotidos, ARNip, o molecula de tipo ARNip de la invencion en una celula (por ejemplo, reactivos de transfeccion/transformacion) y/o reactivos para evaluar reduccion de gen diana pretendido tal como anticuerpos para seguir la reduccion a nivel de protema por inmunofluorescencia o analisis de inmunotransferencia, reactivos para evaluar la actividad enzimatica o presencia de una protema indicadora, o reactivos para evaluar la viabilidad celular. Pueden estar incluidos cebadores de RT-PCR y sondas para la deteccion de ARNm diana o indicador. El kit puede comprender ademas un envase (por ejemplo, vial, tubo de ensayo, frasco, botella, jeringa u otro medio de embalaje) en el que se puede colocar/alicuotar el duplex de oligonucleotidos, ARNip, o molecula de tipo ARNip, asf como dispositivos para administrar el duplex de oligonucleotidos, ARNip, o molecula de tipo ARNip a un sujeto (por ejemplo, jeringa).

La invencion proporciona ademas un metodo de inhibir la expresion de un gen/acido nucleico diana, o de degradar o disminuir el nivel de un gen/acido nucleico diana, en un sistema biologico (por ejemplo, una celula, un tejido, un organo, un sujeto), por ejemplo, para inhibir la produccion de un polipeptido codificado por el gen/acido nucleico diana, que comprende introducir en el sistema el duplex de oligonucleotidos, ARNip, o molecula de tipo ARNip anteriormente mencionado.

Segun otro aspecto de la divulgacion, se proporciona un metodo de inhibir la produccion del producto de un gen (“silenciamiento genico”; por ejemplo, de un gen perjudicial) en un paciente en necesidad de ello. “Silenciamiento genico” como se usa en el presente documento se refiere a una inhibicion o reduccion de la expresion de la protema codificada por una secuencia de acido nucleico o gen particular (por ejemplo, un gen perjudicial). El metodo comprende administrar al paciente una cantidad terapeuticamente eficaz de oligonucleotido, una molecula bicatenaria/duplex, una molecula de ARNip p una composicion de la invencion. En formas de realizacion, el gen o acido nucleico diana es un gen vmco, bacteriano o de mai^ero (por ejemplo, humano).

La invencion proporciona ademas un metodo de tratar una afeccion asociada con la expresion de un gen/acido nucleico en un sujeto, por ejemplo, asociada con la produccion de un polipeptido codificado por el gen/acido nucleico

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diana, el metodo comprende administrar el duplex de oligonucleotidos, ARNip o molecula de tipo ARNip al sujeto (o a una celula, tejido, organo del sujeto), en donde el ARNip o molecula de tipo ARNip se dirige a (o es espedfica para) el gen/acido nucleico.

La invencion proporciona ademas el uso del ARNip o molecula de tipo ARNip para la preparacion de un medicamento.

La invencion proporciona ademas el uso del ARNip o molecula de tipo ARNip anteriormente mencionado para un metodo seleccionado de: (a) silenciamiento genico; (b) inhibir la expresion genica/produccion de polipeptido en un sistema biologico; (c) inhibir la expresion genica/produccion de polipeptido en un sujeto; (d) degradar o disminuir el nivel de un gen/acido nucleico diana en un sistema biologico o un sujeto; (d) tratar una enfermedad/afeccion asociada con la produccion de un polipeptido codificado por un gen/acido nucleico en un sujeto; y (e) preparacion de un medicamento, por ejemplo, un medicamento para tratar una enfermedad o afeccion asociada con la expresion (por ejemplo, sobreexpresion) de un acido nucleico/gen en un sujeto.

En varias formas de realizacion, un par de oligonucleotidos, duplex, ARNip y/o molecula de tipo ARNip de la invencion se puede usar profilactica y/o terapeuticamente en formulaciones o medicamentos para prevenir o tratar una enfermedad/afeccion asociada con la expresion de un acido nucleico o gen diana. La invencion proporciona metodos correspondientes de tratamiento medico, en los que una dosis terapeutica de un oligonucleotido de la invencion se administra en una formulacion farmacologicamente aceptable, por ejemplo, a un paciente o sujeto en necesidad de ello.

Una “cantidad terapeuticamente eficaz” se refiere a una cantidad eficaz, a dosis y durante periodos de tiempo necesarios para alcanzar el resultado terapeutico deseado, tal como una reduccion o inversion en la evolucion de una enfermedad asociada con la produccion de un polipeptido codificado por un acido nucleico o gen diana. Una cantidad terapeuticamente eficaz de un par de oligonucleotidos, duplex, ARNip y/o molecula de tipo ARNip de la invencion puede variar segun factores tal como el estado de enfermedad, edad, sexo, y peso del individuo, y la capacidad del compuesto de provocar una respuesta deseada en el individuo. Se pueden ajustar las pautas de dosis para proporcionar la respuesta terapeutica optima. Una cantidad terapeuticamente eficaz tambien es una en la que cualquier efecto toxico o nocivo del compuesto esta sobrepasado por los efectos terapeuticamente beneficiosos. Una “cantidad profilacticamente eficaz” se refiere a una cantidad eficaz, a dosis y durante periodos de tiempo necesarios, para alcanzar el resultado profilactico deseado, tal como prevenir o inhibir la velocidad de inicio o evolucion de una enfermedad asociada con la produccion de un polipeptido codificado por un acido nucleico o gen diana. Se puede determinar una cantidad profilacticamente eficaz como se ha descrito anteriormente para la cantidad terapeuticamente eficaz. Para cualquier sujeto particular, se pueden ajustar pautas de dosis espedficas a lo largo del tiempo segun la necesidad individual y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administracion de las composiciones.

La invencion proporciona ademas un uso de un oligonucleotido, par o duplex de la invencion o la composicion anteriormente mencionada para degradar o disminuir el nivel de un acido nucleico diana, o de disminuir la produccion o el nivel de un polipeptido codificado por un acido nucleico o gen diana o para la prevencion y/o tratamiento de una enfermedad/afeccion asociada con la produccion de un polipeptido codificado por un acido nucleico o gen diana. La invencion proporciona ademas un uso de un oligonucleotido de la invencion para la preparacion de un medicamento. En una forma de realizacion, el medicamento es para la prevencion y/o tratamiento de una enfermedad o afeccion asociada con la expresion (por ejemplo, sobreexpresion) de acido nucleico o gen diana.

El gen/acido nucleico diana puede ser un gen/acido nucleico derivado de una celula, un gen endogeno, un transgen, o genes exogenos tal como genes de un patogeno, por ejemplo, un virus, que esta presente en la celula despues de la infeccion de la misma. La celula que tiene el gen diana puede ser de la lmea germinal o somatica, totipotente o pluripotente, en division o que no se divide, de parenquima o epitelio, inmortalizada o transformada, o similar. La celula puede ser un gameto o un embrion; si es un embrion, puede ser un embrion de celula unica o una celula o celulas constituyentes de un embrion multicelular. El termino “embrion”, por tanto, abarca tejido fetal. La celula que tiene el gen diana puede ser una celula no diferenciada, tal como una celula madre, o una celula diferenciada, tal como de una celula de un organo o tejido, incluyendo tejido fetal, o cualquier otra celula presente en un organismo. Los tipos celulares que estan diferenciados incluyen adipocitos, fibroblastos, miocitos, cardiomiocitos, endotelio, neuronas, glfa, celulas sangumeas, megacariocitos, linfocitos, macrofagos, neutrofilos, eosinofilos, basofilos, celulas cebadas, leucocitos, granulocitos, queratinocitos, condrocitos, osteoblastos, osteoclastos, hepatocitos, y celulas de las glandulas endocrinas o exocrinas.

El par de oligonucleotidos, duplex, ARNip o molecula de tipo ARNip de la invencion se puede asociar con, por ejemplo, un ligando de direccionamiento celular. Como se usa en el presente documento, un “ligando de direccionamiento celular” es una molecula que se dirige a una celula que tiene especificidad para sitios diana tal como receptores de superficie celular. Esto permite, por ejemplo, una administracion mas espedfica del par de oligonucleotidos, duplex, ARNip o molecula de tipo ARNip a una celula/tipo celular, tejido u organo particular.

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En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona un metodo para aumentar/mejorar la eficacia, potencia y/o estabilidad (por ejemplo, estabilidad in vivo) de un duplex de oligonucleotidos, que comprende incorporar en dicho duplex (a) uno o mas arabinonucleotidos (AAN) 2'-sustituidos; y (b) (i) uno o mas ribonucleotidos (ARN) 2'- sustituidos, (ii) uno o mas nucleotidos de acido nucleico bloqueado (ANB), o (iii) una combinacion de (i) y (ii).

En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona un metodo para reducir los efectos inespedficos de un duplex de oligonucleotidos, que comprende incorporar en dicho duplex (a) uno o mas arabinonucleotidos (AAN) 2'- sustituidos; y (b) (i) uno o mas ribonucleotidos (ARN) 2'-sustituidos, (ii) uno o mas nucleotidos de acido nucleico bloqueado (ANB), o (iii) una combinacion de (i) y (ii).

La invencion proporciona ademas un metodo de sintetizar un oligonucleotido de la invencion, el metodo comprende:

(a) desbloqueo 5'; (b) acoplamiento; (c) proteccion; y (d) oxidacion; en donde (a), (b), (c) y (d) se repiten en condiciones adecuadas para la smtesis del oligonucleotido, en donde la smtesis se lleva a cabo en presencia de un monomero de nucleotido adecuado descrito en el presente documento (por ejemplo, ARN, ADN, 2'F-AAN, 2'F-ARN, ANB).

La invencion proporciona ademas un metodo para preparar un duplex de oligonucleotidos de la invencion que comprende combinar una primera hebra (por ejemplo, sentido) que comprende un oligonucleotido de la invencion y una segunda hebra (por ejemplo, antisentido) sustancialmente complementaria a la primera hebra en condiciones que permiten la formacion de un duplex mediante emparejamiento de bases entre la primera y segunda hebras.

En formas de realizacion, la smtesis se lleva a cabo en una fase solida, tal como en un soporte solido seleccionado del grupo que consiste en vidrio de poro controlado, poliestireno, polietilenglicol, polivinilo, gel de sflice, chips basados en silicio, papel de celulosa, poliamida/diatomita y poliacrioilmofolida. En formas de realizacion adicionales, los monomeros se pueden usar para smtesis en fase solucion o smtesis basada en lfquido ionico de oligonucleotidos.

“Desbloqueo 5'” como se usa en el presente documento se refiere a una etapa en la smtesis de oligonucleotidos en donde un grupo protector se elimina de un nucleosido previamente anadido (o un grupo qrnmico unido a un soporte solido), para producir un hidroxilo reactivo que es capaz de reaccionar con una molecula de nucleosido, tal como un nucleosido fosfaoramidita o H-fosfonato.

“Grupo protector” como se usa en el presente documento se refiere a una fraccion que se une temporalmente a un grupo qrnmico reactivo para prevenir la smtesis de productos indeseados durante una o mas fases de smtesis. Tal grupo protector se puede eliminar despues para permitir que la etapa de la smtesis deseada prosiga, o para generar el producto sintetico deseado. Los ejemplos de grupos protectores son grupos tritilo (por ejemplo, monometoxitritilo, dimetoxitritilo), sililo, levulinilo y acetilo.

“Acoplamiento” como se usa en el presente documento se refiere a una etapa en la smtesis de oligonucleotidos en donde un nucleosido se une covalentemente al residuo de nucleosido terminal del oligonucleotido (o al soporte solido a traves, por ejemplo, de un enlazador adecuado), por ejemplo, a traves de un ataque nucleofflico de un nucleosido fosforamidita, H-fosfonato, fosfotriester, pirofosfato o fosfato activado en solucion por un grupo 5'- hidroxilo terminal de un nucleotido u oligonucleotido unido a un soporte. Tal activacion se puede efectuar por un reactivo activante tal como tetrazol, 5-etiltiotetrazol, 4,5-dicianoimidazol (DCI), y/o cloruro de pivaloilo.

“Proteccion” como se usa en el presente documento se refiere a una etapa en la smtesis de oligonucleotidos en donde una fraccion qrnmica se une covalentemente a cualquier grupo hidroxilo libre o sin reaccionar en el acido nucleico u oligonucleotido unido al soporte (o en un enlazador qrnmico unido al soporte). Tal proteccion se usa para prevenir la formacion de, por ejemplo, secuencias de longitud mas corta que la secuencia deseada (por ejemplo, que contienen deleciones). Un ejemplo de un reactivo que se puede usar para tal proteccion es anhudrido acetico. Ademas, la etapa de proteccion se puede realizar antes o despues de la oxidacion (vease a continuacion) del enlace fosfito.

“Oxidacion” como se usa en el presente documento se refiere a una etapa en la smtesis de oligonucleotidos en donde el enlace fosfito triester o H-fosfonato diester recien sintetizado se convierte en un enlace fosfato triester o diester pentavalente. En el caso donde se desea un enlace internucleotfdico fosforotioato, “oxidacion” tambien se refiere a la adicion de un atomo de azufre para generar un enlace fosforotioato.

Los siguientes ejemplos son ilustrativos de varios aspectos de la invencion, y no limitan los aspectos amplios de la invencion como se divulga en el presente documento.

Modo(s) para llevar a cabo la invencion

La presente invencion se ilustra en mas detalle mediante los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1: Materiales y metodos

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Sntesis de oligonucleotidos. Se usaron condiciones estandar para smtesis de oligonucleotidos en fase solida para la smtesis de todos los oligonucleotidos, a una escala de 0,8 a 1,0 jmol. Se usaron 4,5-dicianoimidazol (0,50 M en acetonitrilo) o 5-etiltiotetrazol (0,25 M en acetonitrilo) como activadores, y se uso yodo 0,10 M en piridina:agua:TFH 1:2:10 como oxidante (el tiempo de espera durante la etapa de oxidacion fue 24 segundos). Se prepararon fosforoamiditas como soluciones 0,15 M (amiditas de ARN) o soluciones 0,08-0,10 M (ADN, 2'-fluoro amiditas). Los tiempos de acoplamiento se extendieron a 10-30 minutos para nucleotidos modificados. Los oligonucleotidos se trataron con hidroxido de amonio:etanol 3:1 durante 16 h a 55°C para cortarlos del soporte solido y desproteger los fosfatos y bases. Las secuencias que conteman ribonucleotidos se concentraron y desililaron con EtaN^3HF (100 jl) durante 48 h a temperatura ambiente. La purificacion de secuencia se logro por HPLC de intercambio anionico usando solucion de LiClO4 0-0,2 M como eluyente, o por PAGE desnaturalizante preparativa. El desalado se efectuo en columnas Sephadex G-25 o NAP-25. La pureza de secuencia se verifico usando PAGE desnaturalizante.

La fosforilacion en 5' de los oligonucleotidos se alcanzo en general en el soporte solido CPG, tratando el oligonucleotido recien sintetizado con bis(2-cianoetil)-diisopropilaminofosfaoramidita y etiltiotetrazol, seguido por condiciones de desproteccion normales. Se uso ESI-MS para conformar el exito de la reaccion de fosforilacion.

Desnaturalizacion termica y estudios de CD. Se combinaron cantidades equimolares de secuencias complementarias, se secaron y rediluyeron en tampon de pH 7,2 que contema KCl 140 mM, MgCh 1 mM y NaHPO4 5 mM (1 ml). Despues de calentar a 90°C, las muestras se enfriaron lentamente a temperatura ambiente y se refrigeraron durante la noche. Despues se transfirieron a cubetas fnas en un espectrofotometro de UV Cary™ 300. El cambio en absorbancia a 260 nm se siguio despues calentando desde 15°C a 90°C. Se determinaron las temperaturas de fusion como el maximo de los primeros derivados o usando el metodo de la lmea basal, implementado en el software de Varian™.

Se obtuvieron espectros de CD en un espectropolanmetro Jasco™ J-720 a 20°C usando muestras hibridadas en el mismo tampon y en las mismas condiciones que para los estudios de desnaturalizacion termica. Los espectros se corrigieron para lmea basal con respecto a un blanco que contema el tampon, pero sin duplex. Se efectuaron alisado y ajuste para la concentracion de duplex usando el programa Spectra-Manager (Jasco).

Ensayos de ARNip (inhibicion de luciferasa). Se hicieron crecer celulas HeLa X1/5 que expresan establemente luciferasa de luciernaga como se ha descrito previamente (Wu, H. et al. J. Biol. Chem. 1999, 274: 28270-28278). El dfa antes de la transfeccion, se sembraron 0,5 x 105 celulas en cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Al dfa siguiente, las celulas se incubaron con cantidades crecientes de los ARNip premezclados con el reactivo lipofectamine-plus™ (Invitrogen) usando 1 jl de lipofectamine y 4 jl del reactivo plus por 20 pmol de ARNip (para la mayor concentracion ensayada). Para las titulaciones de ARNip, cada ARNip se diluyo en tampon de dilucion (HEPES-KOH 30 mM, pH 7,4, KoAc 100 mM, MgOAC2 2 mM) y la cantidad del reactivo lipofectamine-plus usado relativo a los ARNip permanecio constante. 24 horas despues de la transfeccion, las celulas se lisaron en tampon de lisis hipotonico (K3PO4 15 mM, EDTA 1 mM, Triton al 1%, NaF 2 mM, BSA 1 mg/ml, DTT 1 mM, NaCl 100 mM, aprotinina 4 jg/ml, leupeptina 2 jg/ml y pepstatina 2 jg/ml) y se determinaron la unidades de luz de luciernaga usando un lector de bioluminiscencia de placa de 96 pocillos Fluostar Optima (BMG Labtech) usando sustrato de luciernaga como se describe (Novac, O. et al. J. Nucl. Acids Res. 2004, 32: 902-915). Las cuentas de luciferasa se normalizaron respecto a la concentracion de protema del lisado celular determinada por el ensayo de protema DC (BioRad). Las barras de error representan la desviacion estandar de al menos cuatro transfecciones. Cotransfectar los ARNip y el plasmido pCI-hRL-con que expresa el ARNm de la luciferasa de Renilla (Pillai, R.S. et al. Science 2005, 309: 1573-1576) en la misma lmea celular no mostro diferencia en la expresion de este indicador, lo que demuestra la especificidad de los efectos de iARN.

Evaluacion de la produccion de IFN usando el ensayo de deteccion de IFN HEK-Blue™. 48 horas despues de la transfeccion de ARNip, las celulas se dejaron sin tratar o se trataron con 1 ug/ml de poli(I:C) durante 24 horas. La cantidad de IFN en el sobrenadante se midio segun las instrucciones del fabricante (InvivoGen). Brevemente, los sobrenadantes se mezclaron con celulas HEK-Blue™ que llevan un gen indicador que expresa una fosfatasa alcalina secretada bajo el control de promotor del elemento 9 de respuesta estimulado por interferon (ISRE9). En respuesta a la exposicion a IFN, las celulas HEK-Blue™ liberan fosfatasa alcalina soluble que se cuantifica mezclando el sobrenadante con reactivo Quanti Blue™ (InvivoGen) y midiendo la absorbancia a 650 nm.

Ejemplo 2: Duplex de ARNip que contienen combinaciones de 2'F-AAN y 2'F-ARN

Se hizo una serie de duplex que conteman hebras completamente modificadas con 2'F-AAN y 2'F-ARN (Tabla I). Estos duplex se dirigen a las posiciones 1818-1836 del gen de la luciferasa de luciernaga (numero de acceso de RefSeq M15077). Tambien se disenaron una serie de hebras quimericas que contienen ambos 2'-fluoro epfmeros. Una quimera consistfa en 2'F-ARN pirimidinas y 2'F-AAN purinas. Otro para de hebras era una estructura de “altimero 1-1”, con residuos de 2'F-AAn y 2'F-ARn alternantes. Para todas estas hebras quimericas 2'F-AAN/2'F- ARN, la extension 3' siempre se hizo de 2'F-AAN.

5

10

15

20

25

30

Tabla I: Secuencias de los ARNip que se dirigen a las posiciones 1818-1836 de la luciferasa de luciernaga

que contienen mezclas de 2'F-AAN y 2'F-ARN

Nombre

Descripcion Secuencia Tm SEQ ID NO:

jg-1

ARN 5'-GCUUGAAGUCUUUAAUUAAtt-3' 61,8 19

ARN 5'-UUAAUUAAAGACUUCAAGCgg-3' 20

jg-2

pur/pir 5-GCTTGAAGTCTTTAA7TAATT-3' 65,6 21

pur/pir 5-TTAA7TAAAGAC7TCAAGCGG-3' 22

jg-3

altfmero 1-1 5-GCTTGAAGTCTTTAATTAATT-3' 36,8 23

altfmero 1-1 5 - TTAATTAAAGACTTCAAGCGG-3' 24

jg-4

2'F-ARN 5-GCTTGAAGTCTTTAATTAA TT-3' 5-pTTAATTAAAGACTTCAAGCGG-3' >90 25 26

jg-5

2'F-AAN 5-GCTTGAAGTCTTTAATTAATT-3' 5'-pTTAATTAAAGACTTCAAGCGG-3' 72,8 27 28

jg-6

pur/pir 5-GCTTGAAGTCTTTAA7TAATT-3' 62,5 21

ARN 5'-UUAAUUAAAGACUUCAAGCgg-3' 20

jg-7

ARN 5'-GCUUGAAGUCUUUAAUUAAtt-3' 56,7 19

pur/pir 5'-TTAATTAAAGACTTCAAGCGG-3' 22

jg-8

altfmero 1-1 5-GCTTGAAGTCTTTAATTAATT-3' 48,2 23

ARN 5'-UUAAUUAAAGACUUCAAGCgg-3' 20

jg-9

ARN 5'-GCUUGAAGUCUUUAAUUAAtt-3' 45,8 19

altfmero 1-1 5 - TTAATTAAAGACTTCAAGCGG-3' 24

jg-10

2'F-ARN 5-gcttgaagtcTttaattaa TT-3' 76,5 25

ARN 5'-UUAAUUAAAGACUUCAAGCgg-3' 20

jg-11

ARN 5'-GCUUGAAGUCUUUAAUUAAtt-3' 76,2 19

2'F-ARN 5'-pTTAATTAAAGACTTCAAGCGG-3' 26

jg-12

2'F-AAN 5-GCTTGAAGTCTTTAATTAATT -3' 64,7 27

ARN 5'-UUAAUUAAAGACUUCAAGCgg-3' 20

jg-13

ARN 5'-GCUUGAAGUCUUUAAUUAAtt-3' 62,8 19

2'F-AAN 5'-pTTAATTAAAGACTTCAAGCGG-3' 28

jg-14

2'F-AAN 5-GCTTGAAGTCTTTAATTAATT -3' 80,1 27

2'F-ARN 5'-pTTAATTAAAGACTTCAAGCGG-3' 26

jg-15

2'F-ARN 5-GCTTGAAGTCTTTAATTAA TT-3' 77,5 25

2'F-AAN 5'-pTTAATTAAAGACTTCAAGCGG-3' 28

Mayuscula = ARN Minuscula = adn

Mayuscula negrita subrayada = 2'F-AAN (FAAN)

Mayuscula negrita cursiva = 2’F-ARN p = 5'-fosfato

La actividad iARN de todos los duplex se probo en las mismas condiciones descritas anteriormente. Los resultados se muestran en la figura 1.

Cuatro de los duplex (jg-6, jg-8, jg-10 y jg-12) conteman una hebra sentido modificada emparejada con una hebra antisentido de ARN. El mejor de estos cuatro duplex es jg-6, que contiene una hebra sentido quimerica purina/primidina. El segundo mejor duplex es el duplex jg-8, que contiene la configuracion altfmero 1-1 en la hebra sentido. Por tanto, combinar los epfmeros 2'F en la hebra sentido da mejores resultados que usar cualquier qmmica sola, y sorprendentemente, con mejores resultados relativos al ARN natural (jg-1).

La comparacion de la actividad iARN de los duplex jg-6-jg-13 permite evaluar la idoneidad de cada tipo de arquitectura de hebra modificada (2'F-AAN, 2'F-ARN, purina/pirimidina y altimero 1-1) en las hebras sentido o antisentido. Se observan preferencias sentido/antisentido para los cuatro tipos de hebras modificadas. Los duplex jg- 6, jg-8 y jg-12 son mas activos que jg-7, jg-9 y jg-13, respectivamente, revelando que ambas construcciones quimericas y la hebra 2'F-AAN son mejor toleradas en la hebra sentido que en la hebra antisentido. La diferencia es particularmente sorprendente entre los duplex jg-8 y jg-9 que contienen una hebra de altfmero 1-1; jg-8 (altimero 1-1 en la hebra sentido) fue uno de los duplex mas activos probados, mientras que jg-9 (altimero 1-1 en la hebra antisentido) era inactivo.

La figura 1 muestra que jg-11 es mas activo que jg-10, sugiriendo de esta manera que 2'F-AAN es mejor tolerado en la hebra antisentido que en la sentido. Se cree que esta es la primera vez que se ha observado que una hebra completamente modificada o muy modificada es mejor tolerada en la hebra antisentido que en la sentido.

Una hebra sentido de 2'F-AAN y una hebra antisentido de 2'F-ARN formaron un duplex que se encontro que era activo tambien. En efecto, la sinergia entre estas dos modificaciones se observa en el caso del duplex jg-14, que es

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55

mas activo que cualquiera de los duplex jg-11 o jg-12 de los que deriva. Por otra parte, invertir la combinacion sentido/antisentido dio jg-15, uno de los ARNip menos potentes probados en este estudio.

Las estabilidades termicas de los duplex se probaron calentando los duplex hibridados, en tampon fisiologico, y midiendo el cambio en la absorbancia a 260 nm (A260). Las afinidades de union de los duplex modificados vanan mucho. No ha^a correlacion entre actividad iARN y afinidad de union. Por ejemplo, dos de los duplex mas activos probados fueron jg-4 y jg-8, con valores de Tm de > 90°c y 48,2°C, respectivamente. El duplex mas potente, el heteroduplex completamente fluorado jg-14, tema una Tm de aproximadamente 20°C mayor que la del duplex de ARN nativo (80,1°C frente a 61,8°C).

Los espectros de CD de los duplex modificados se examinaron para explorar posibles conexiones entre estructura helicoidal y actividad ARNip. Los resultados se presentan en la figura 2. Los cambios en los efectos de Cotton a 210220 nm son notables. Empezando con los duplex jg-2-jg-5, que tienen la misma qmmica en ambas hebras, es notable que para el duplex de 2'F-ARN jg-4, esta banda es de maxima intensidad a 227 nm, que esta ligeramente desplazada al rojo respecto al duplex control jg-1 (224 nm). Por otra parte, para los tres duplex que contienen 2'F- AAN, incluyendo dos arquitecturas quimericas jg-2 y jg-3 y el duplex todo 2'F-AAN jg-5, esta banda esta desplazada al azul y alcanza intensidad maxima a aproximadamente 220 nm. Ademas, los duplex jg-1 y jg-4 muestran una banda mas fuertemente negativa a 210 nm. Esto es consistente con el grado de hecilidad de forma A de los duplex (Ratmeyer, L. et al. Biochemistry 1994, 33: 5298-5304). El duplex de 2'F-ARN jg-4 tambien la mayor intensidad para su banda de 270 nm, seguido por el duplex de ARN nativo jg-1, despues las hebras que contienen 2'F-AAN. El duplex de 2'F-AAN al completo jg-5 tiene bastante forma B de caracter, como evidencia el hecho de que su banda a 270 nm es de la menor intensidad y contiene un hombro por encima de 280 nm, y su banda negativa a 245 nm es significativamente mas negativa que los otros duplex (Ratmeyer, L. et al. 1994, anteriormente).

Para los duplex jg-6-jg-13, una hebra sentido modificada correspondfa a mayor elipticidad molar a 220 nm que la observada para los duplex nativos y antisentido modificados. Por tanto, la intensidad de la banda de 220 nm para varios pares sentido antisentido jg-6/jg-7, jg-8/jg-9, jg-10/jg-11 y jg12/jg-13 era siempre mayor para el primer miembro de cada par. Puesto que la modificacion sentido produda siempre mayor potencia para 3 de las 4 arquitecturas de hebra modificadas, esta mayor intensidad tambien correspondfa con mayor potencia, con la excepcion de los duplex jg-10 y jg-11, para los que la hebra modificada con 2'F-ARN era mejor aceptada en la antisentido que la sentido. Tambien es interesante que modificar la hebra sentido, pero no la hebra antisentido, con 2'F-ARN, produda un aumento notable en la intensidad de los efectos de Cotton a 270 nm.

Para los duplex jg-14 y jg-15, en los que ambas hebras estaban modificadas, el duplex mas potente jg-14 mostraba mayor intensidad para su banda a 220 nm, y de hecho, en el intervalo entero de 205-250 nm. No esta claro por que se observa tan gran diferencia entre estos dos duplex a longitudes de onda menores. El duplex jg-15 debe tener mas caracter de forma A ya que tiene picos mas fuertemente negativos a 210 nm, pero la mayor Tm de jg-14 implica que tiene mas caracter de forma A que jg-15 Ratmeyer, L. et al. 1994, anteriormente).

Para investigar si la potencia y sinergia obtenidas para combinaciones 2'F-AAN-2'F-ARN era aplicable a otras secuencias de ARNip, otros duplex se dirigieron contra el mismo gen y lmea celular, esta vez dirigiendose a las posiciones 515-533 (Hoshika, S. et al. FEBS Left. 2005, 579: 3115-3118; Elbashir, S.M. et al. Nature 2001, 411: 494498). Se diseno una serie de duplex 2'fluorados por completo o fuertemente, con los siguientes principios en mente:

(a) La preferencia de 2'F-AAN y quimeras 2'F-AAN-2'F-ARN para la hebra sentido y de 2'F-ARN para la hebra antisentido;

(b) La baja afinidad de union de altfmeros 1-1 de 2'F-AAN y 2'F-ARN (los duplex jg-8 y jg-9 teman valores de Tm 13-16°C menores que la secuencia control, vease la tabla I;

(c) la actividad de una hebra sentido 2'F-AAN completamente modificada se comparo con la una secuencia sentido 2'F-AAN “de tipo fr”, que incluye cinco insertos de ARN cerca de su extremo 3', cuando se empareja con una hebra antisentido de 2'F-ARN.

Los duplex resultantes se presentan en la tabla II. Cada una de dos hebras antisentido (ARN o 2'F-ARN) se emparejo con cada una de seis hebras sentido modificadas (2'F-AAN o una quimera 2'F-AAN-2'F-ARN). la potencia de estas hebras para inducir iARN se evaluo y los resultados se presentan en la figura 3.

Tabla II: Secuencias de ARNip que se dirigen a las posiciones 515-533 de luciferasa de luciernaga con

combinaciones de 2'F-AAN y 2'F-ARN

Nombre

Descripcion Secuencia SEQ ID NO:

kl-ctl

ARN 5'-CGUACGCGGAAUACUUCGAtt-3' 29

ARN 5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGtt-3' 30

kl-1

2'F-ARN 5-CGUACGCGGAAUACUUCGAUU-3' 31

ARN 5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGtt-3' 30

kl-2

2'F-AAN 5-CGTACGCGGAATACTTCGATT-3' 32

ARN 5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGtt-3' 30

5

10

15

20

25

30

35

40

kl-3

tipo “fr” 5'-CGTACGCGGAATACUUCGATT-3' 33

ARN 5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGtt-3' 30

kl-4

altfmero 3-3 5-CGTACGCGGAAUACTUCGATT-3' 34

ARN 5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGtt-3' 30

kl-5

alt 3-3/1-1 5-CGTACGCGGAAUACTUCGATT-3' 35

ARN 5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGtt-3' 30

kl-6

altfmero 1-1 5-CGTACGCGGAAUACTUCGATT-3' 36

ARN 5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGtt-3' 30

kl-7

2'F-ARN 5-CGUACGCGGAAUACUUCGAUU-3' 31

2'F-ARN 5'-pUCGAAGUAUUCCGCGUACGUU-3' 37

kl-8

2'F-AAN 5-CGTACGCGGAATACTTCGATT-3' 32

2'F-ARN 5-pUCGAAGUAUUCCGCGUACGUU-3' 37

kl-9

tipo “fr” 5'-CGTACGCGGAATACUUCGATT-3' 33

2'F-ARN 5-pUCGAAGUAUUCCGCGUACGUU-3' 37

kl-10

altfmero 3-3 5-CGTACGCGGAAUACTUCGATT-3' 34

2'F-ARN 5-pUCGAAGUAUUCCGCGUACGUU-3' 37

kl-11

alt 3-3/1-1 5-CGTACGCGGAAUACTUCGATT-3' 35

2'F-ARN 5-pUCGAAGUAUUCCGCGUACGUU-3' 37

kl-12

altfmero 1-1 5-CGTACGCGGAAUACTUCGATT-3' 36

2'F-ARN 5-pUCGAAGUAUUCCGCGUACGUU-3' 37

Mayuscula = ARN Minuscula = adn

Mayuscula negrita subrayada = 2’F-AAN (FAAN)

Mayuscula negrita cursiva = 2’F-ARN p = 5'-fosfato

Varios resultados estan claros de este conjunto de duplex. Como se muestra en la figura 3, casi todos los duplex son mas eficaces que el ARNip control. Cuatro duplex modificados por completo (kl-7, kl-9, kl-10, kl-11) y cinco otros duplex muy modificados (kl-4, kl-5, kl-6, kl-8, kl-12) tienen mayor potencia que el control para esta segunda secuencia de la luciferasa de luciernaga.

Ademas, la sinergia entre 2'F-ARN y 2'F-AAN es de nuevo visible. Se puede pensar que estos duplex como perteneciente a dos subseries, la primera con una hebra antisentido de ARN (kl-1 a kl-6) y la segunda con una hebra antisentido de 2'F-ARN (kl-7 a kl-12). Comparando los miembros correspondientes de cada serie (kl-1 a kl-7, kl-2 a kl-8, etc.), esta claro que todas las hebras sentido modificadas muestran mejor potencia cuando se emparejan a una hebra antisentido de 2'F-ARN que a una hebra antisentido de ARN.

Tomando cada subserie por separado, y clasificando los duplex en orden de potencia, se puede observar un patron: las hebras sentido siguen el mismo orden, con cualquier hebra antisentido. Por tanto, la “peor” hebra sentido es todo 2'F-AAN (kl-2 y kl-8), seguida por la hebra antisentido de “tipo fr” que contiene cinco insertos de ARN (kl-3 y kl-9). Se debe indicar, sin embargo, que tanto kl-8 como kl-9 son, no obstante, mas potentes que el control.

El uso de hebras sentido quimericas 2'F-AAN-2'F-ARN produjo mejor potencia, de nuevo independientemente de la hebra antisentido usada. La mejor hebra sentido fue la hebra de altfmero 3-3/1-1 (kl-5 y kl-11), lo que sugiere que el diseno racional para controlar sesgos termodinamicos no mejora de hecho la potencia. El duplex kl-11 no fue superado ni en potencia ni en eficacia. No es posible siquiera estimar un valor de CI50 para este duplex, ya que, a 2 nM, la menor concentracion usada para estas transfecciones, el silenciamiento esta todavfa a su maximo nivel.

Por ultimo, es digno de mencionar que tanto los duplex kl-7 como kl-11 parecen estar silenciando a su maxima eficacia, ya que la respuesta a la dosis es esencialmente plana. La hebra sentido quimerica de kl-11, por tanto, permite silenciamiento de mayor eficacia (nivel relativo de luciferasa de 0,12-0,15 en lugar de 0,21-0,24).

Como se describe en el presente documento, por ejemplo, 2'F-AAN y 2'F-ARN se pueden combinar de varias maneras en duplex de ARNip. Por ejemplo, dos tipos de combinaciones de estas dos modificaciones producen potencia aumentada: combinar ambas qmmicas en la hebra sentido, y combinar una hebra antisentido 2'F-ARN con una hebra sentido 2'F-AAN o quimerica. Ejemplos de ambos de estos tipos de combinaciones sinergicas producen potencia aumentada.

Ejemplo 3: Disminucion de 4E-BP1/2 usando duplex de ARNip espeaficos que contienen combinaciones de 2’F-aAn y 2’F-ARN y efectos en la produccion de IFN de tipo I

Las secuencias de los ARNip usados en los estudios de inhibicion de 4E-BP descritos en el presente documento se proporcionan en la tabla III.

5

10

15

20

25

30

35

40

Tabla III: Secuencias de los ARNip usados en los estudios de inhibicion de 4E-BP descritos en el presente

documento

Secuencia

ID de oligo ID de duplex de ARNip SEQ ID NO:

5' AACUCACCUGUGACCAAAAca

4EBP-1 HS Control sin modificar 4EBP-1 humano 1

5' UUUUGGUCACAGGUGAGUUcc

4EBP-1 HAS 2

5' AAGACUCCAAAGUAGAAGUaa

4EBP-2 HS Control sin modificar 4EBP-2 humano y murino 3

5' ACUUCUACUUUGGAGUCUUca

4EBP-2 HAS 4

5' AACUCACCUGUGGCCAAAAca

4EBP-1 MS Control sin modificar 4EBP-1 murino 5

5' UUUUGGCCACAGGUGAGUUcc

4EBP-1 MAS 6

5'AACTCACCTGTGGCCAAAACA

4EBP-1 MS JG14 4EBP-1 murino_14 7

5' pUUUUGGCCACAGGUGAGUUCC

4EBP-1 MAS JG14 8

5' AACTCACCTGTGACCAAAACA

4EBP-1 HS JG14 4EBP-1 humano_14 9

5' pUUUUGGUCACAGGUGAGUUCC

4EBP-1 HAS JG14 10

5' AAGACTCCAAAGTAGAAGTAA

4EBP-2 MS JG14 4EBP-2 raton 14 o 4EBP-2 humano_14 11

5' pACUUCUACUUUGGAGUCUUCA

4EBP-2 MAS JG14 12

5' AACUCACCTGUGGCCAAAACA

4EBP-1 MS 611 4EBP-1 raton_611 13

5' pUUUUGGCCACAGGUGAGUUCC

4EBP-1 MAS 611 14

5' AACUCACCTGUGACCAAAACA

4EBP-1 HS 611 4EBP-1 humano_611 15

5' pUUUUGGUCACAGGUGAGUUCC

4EBP-1 HAS 611 16

5' AAGACUCCAAAGTAGAAGTAA

4EBP-2 MS 611 4EBP-2 raton_611 o 4EBP-2 humano_611 17

5' pACUUCUACUUUGGAGUCUUCA

4EBP-2 MAS 611 18

Mayuscula = ARN Minuscula = adn

Mayuscula negrita subrayada = 2’F-AAN (FAAN)

Mayuscula negrita cursiva = 2’F-ARN p = 5'-fosfato

Los resultados presentados en la figura 4A indican que los ARNip sin modificar que se dirigen a 4E-PB1 y 4E-BP2 humanas provocan silenciamiento genico potente (carriles mas a la derecha en los dos geles). Asimismo, ninguno de los ARNip mezclados (sin diana) afectan los niveles de expresion de 4E-PB1 o 4E-BP2. Puesto que los controles modificados mezclados 1 y 2 se modifican qmmicamente con 2'F-AAN y 2'F-ARN, estos datos indican que las modificaciones qmmicas solas no son responsables de cambios en la expresion de 4E-BP1 o 2. Observando la reduccion de 4E-BP1 y 2 con la arquitectura de modificacion _14 (hebra sentido 2'F-AAN por completo, hebra antisentido 2'F-ARN por completo), se muestra que los ARNip que comprenden esta modificacion son capaces de silenciar tanto 4E-BP1 como 2, aunque no de forma tan potente como el control sin modificar despues de 24 horas, especialmente en el caso de 4E-BP1. La arquitectura de modificacion _611 (hebra sentido 2'F-AAN/2'F-ARN alternantes, hebra antisentido 2'F-ARN por completo) parece ser mas potente que _14 en ambos casos, posiblemente incluso superando la potencia del control sin modificar para 4E-BP2.

La capacidad de ARNip qmmicamente modificados para reproducir el fenotipo de falta doble de 4E-PB1/2 se determino a continuacion usando el sistema HEK-Blue™ segun el protocolo del fabricante (InvivoGen). Los resultados de los experimentos realizados para seguir los niveles relativos de interferon 3 dfas tras la transfeccion de ARNip y en presencia o ausencia de poli(I:C) se presentan en la figura 5. Cuando las celulas se tratan con ARNip mezclado modificado y poli(I:C), los niveles relativos de IFN son similares a los de celulas tratadas con secuencias mezclada sin modificar, mostrando que la modificacion no desencadena una respuesta inmunoestimuladora significativa. En el caso de tratamiento de celulas con ARNip sin modificar que se dirigen tanto a 4E-BP1 como 2 a la vez, los niveles relativos de IFN en las celulas aumentan a aproximadamente 5 unidades en ausencia de poli(I:C). Cuando las celulas se trataron con poli(I:C) (un desencadenante de la produccion de IFN a traves de los receptores RIG-I y MDA5), los niveles relativos de IFN estan alrededor de 18, frente a aproximadamente 11 en celulas tratadas con ARNip mezclado, lo que demuestra que silenciar 4E-BP1 y 2 aumenta la respuesta de IFN, similar a nuestras observaciones en ratones que carecen de 4E-PB1/2. Por ultimo, el tratamiento con ARNip modificado por completo (correspondiente a la arquitectura _611) frente a 4E-BP1 y 2 en presencia de poli(I:C) produce niveles de interferon relativos de aproximadamente 42 unidades, que es un aumento de 4 veces comparado con las celulas tratadas con mezclados, y un aumento de 2 veces comparado con celulas tratadas con ARNIP de 4E-BP1 y 2 sin modificar regular.

Ejemplo 4: Reduccion de luciferasa usando duplex de ARNip que contienen 2’F-AAN y ANB

A continuacion se probo si 2'F-AAN podna actuar sinergicamente con otro analogo de ARN que adopta una conformacion del azucar norte, es decir, acido nucleico bloqueado (ANB). El ANB esta bloqueado en una conformacion de azucar norte ngida mediante un puente metileno.

La primera serie, denominada “L-FL”, se diseno combinando hebras sentido 2'F-AAN con hebras antisentido que conteman extensiones de 2'F-AAN e insertos de ANB en posiciones previamente observadas que teman actividad iARN. Las secuencias de los duplex de la serie L-FL se proporcionan en la tabla IV.

5 Tabla IV: Secuencias de los ARNip de la serie L-FL usados en los experimentos descritos en el presente documento

Secuencia

Marcador hebra Marcador ARNip SEQ ID NO:

5-GCTTGAAGTCTTTAATTAATT-3'

303g L-LF1 27

5'-pUUAAUUAAAGACUUCAAGcGG-3'

GD2 38

5-GCTTGAAGTCTTTAATTAATT-3'

303g L-LF2 27

5'-pUUAAUUAAAGACUUCAaGcGG-3'

GD3 39

5-GCTTGAAGTCTTTAATTAATT-3'

303g L-LF3 27

5'-pUUAAUUaaAAGACUUCAAGcGG-3'

GD4 40

5-GCTTGAAGTCTTTAATTAATT-3'

303g L-LF4 27

5'-pUUAAUUAAAGACUUCAAGCgg-3'

56

5-GCTTGAAGTCTTTAATTAATT-3'

303g L-LF5 27

5'-pUUAAUUAAAGACUUCAAGCGG-3'

GDI 42

5-GCTTGAAGTCTTTAAUUAATT -3'

L-S-RF L-LF6 41

5'-pUUAAUUAAAGACUUCAAGcGG-3'

GD2 38

5'-GCTTGAAGTCTTTAAUUAATT -3'

L-S-RF L-LF7 41

5'-pUUAAUUAAAGACUUCAaGcGG-3'

GD3 39

5'-GCTTGAAGTCTTTAAUUAATT -3'

L-S-RF L-LF8 41

5'-pUUAAUUaaAAGACUUCAAGcGG-3'

GD4 40

5'-GCTTGAAGTCTTTAAUUAATT -3'

L-S-RF L-LF9 41

5'-pUUAAUUAAAGACUUCAAGCgg-3'

56

5'-GCTTGAAGTCTTTAAUUAATT -3'

L-S-RF L-LF10 41

5'-pUUAAUUAAAGACUUCAAGCGG-3'

GDI 42

5'-GCUUGAAGUCUUUAAUUAAtt-3'

G1A L-LF11 19

5'-pUUAAUUAAAGACUUCAAGCgg-3'

56

5'-GCUUGAAGUCUUUAAUUAAtt-3'

G1A L-LF12 19

5'-pUUAAUUAAAGACUUCAAGCGG-3'

GDI 42

5'-GCUUGAAGUCUUUAAUUAAtt-3'

G1A L-LF13 19

5'-pUUAAUUaaAAGACUUCAAGcGG-3'

GD4 40

5'-GCUUGAAGUCUUUAAUUAAtt-3'

G1A L-LF18 19

5'-UUAAUUAAAGACUUCAAGCgg-3'

G1B 20

5'-GCUUGAUUUCUGAAAUUAAtt-3'

178H Control sc 54

5'-UUAAUUUCAGAAAUCAAGCgg-3'

178I 55

Mayuscula = ARN Minuscula = adn Minuscula subrayada = anb

10 Mayuscula negrita subrayada = 2’F-AAN (FAAN)

Mayuscula negrita cursiva = 2’F-ARN p = 5'-fosfato

La segunda serie, denominada “L-FL2”, se diseno basada en arquitecturas 2'F-AAN/2'F-ARN mostradas tener 15 sinergia que mejora la potencia significativa (veanse los ejemplos 2 y 3 anteriormente). Las secuencias de los duplex en la serie L-FL2 se proporcionan en la tabla V.

20

Tabla V: Secuencias de los ARNip de la serie L-FL2 usados en los experimentos descritos en el presente

documento

Hebras

Marcador hebra Marcador ARNip SEQ ID NO:

5'-GCuUGAAGUCuUUAAuUAATT-3'

GD-21 L-LF2-1 43

5'-UUAAUUAAAGACUUCAAGCgg-3'

G1B 20

5'-GCuUGAAGUCuUUAATuAATT-3'

GD-22 L-LF2-2 44

5'-UUAAUUAAAGACUUCAAGCgg-3'

G1B 20

5'-GCuUGAAGUCuUUAAUUAATT-3'

GD-23 L-LF2-3 45

5'-UUAAUUAAAGACUUCAAGCgg-3'

G1B 20

5'-GCuUGAAGUCuUUAATUAATT-3'

GD-24 L-LF2-4 46

5'-UUAAUUAAAGACUUCAAGCgg-3'

G1B 20

5'-GCuUGAAGUCuUUAAUUAATT-3'

GD-25 L-LF2-5 47

5'-UUAAUUAAAGACUUCAAGCgg-3'

G1B 20

5'-GCuUGAAGUCuUUAAuUAATT-3'

GD-21 L-LF2-6 43

5'-pUUAAUUAAAGACUUCAAGcGG-3'

GD2 38

5'-GCuUGAAGUCuUUAATuAATT-3'

GD-22 L-LF2-7 44

5

10

15

20

25

5'-pUUAAUUAAAGACUUCAAGcGG-3'

GD2 38

5'-GCuUGAAGUCuUUAAUUAATT-3'

GD-23 L-LF2-8 45

5'-pUUAAUUAAAGACUUCAAGcGG-3'

GD2 38

5'-GCuUGAAGUCuUUAATUAATT-3'

GD-24 L-LF2-9 46

5'-pUUAAUUAAAGACUUCAAGcGG-3'

GD2 38

5'-GCuUGAAGUCuUUAAUUAATT-3'

GD-25 L-LF2-10 47

5'-pUUAAUUAAAGACUUCAAGcGG-3'

GD2 38

5'-GCUUGAAGUCUUUAAUUAAtt-3'

G1A Control 19

5'-UUAAUUAAAGACUUCAAGCgg-3'

G1B 20

5'-GCUUGAUUUCUGAAAUUAAtt-3'

178H Control sc 54

5'-UUAAUUUCAGAAAUCAAGCgg-3'

178I 55

Mayuscula = ARN

Minuscula = adn

Minuscula subrayada = anb

Mayuscula negrita subrayada = 2’F-AAN (FAAN)

Mayuscula negrita cursiva = 2’F-ARN p = 5'-fosfato

La tercera serie, denominada “L-FL3”, utiliza las mismas hebras sentido de L-FL2 hibridadas con hebras antisentido todo 2'F-ARN. Las secuencias de los duplex de la serie L-FL3 se proporcionan en la tabla VI.

Tabla VI: Secuencias de los ARNip de la serie L-FL3 usados en los experimentos descritos en el presente

documento

Secuencia

Marcadorhebra Marcador ARNip SEQ ID NO:

5'-GCuUGAAGUCuUUAAuUAATT-3'

GD-21 L-LF3-1 43

5'-p7TAA7TAAAGAC7TCAAGCGG-3'

303f 26

5'-GCuUGAAGUCuUUAATuAATT-3'

GD-22 L-LF3-2 44

5'-p7TAA7TAAAGAC7TCAAGCGG-3'

303f 26

5'-GCuUGAAGUCuUUAAUUAATT-3'

GD-23 L-LF3-3 45

5'-p7TAA7TAAAGAC7TCAAGCGG-3'

303f 26

5'-GCuUGAAGUCuUUAATUAATT-3'

GD-24 L-LF3-4 46

5-p7TAA7TAAAGAC7TCAAGCGG-3'

303f 26

5'-GCuUGAAGUCuUUAAUUAATT-3'

GD-25 L-LF3-5 47

5'-p7TAA7TAAAGAC7TCAAGCGG-3'

303f 26

Mayuscula = ARN

Minuscula = adn

Minuscula subrayada = anb

Mayuscula negrita subrayada = 2’F-AAN (FAAN)

Mayuscula negrita cursiva = 2’F-ARN p = 5'-fosfato

Cada oligonucleotido se caracterizo por espectrometna de masas ESI-TOF (tabla VII) y para algunos de los oligonucleotidos por PAGE analftica desnaturalizante seguido por tratamiento con Stains-all.

Tabla VIII: Datos de espectroscopia de masas para los oligonucleotidos de las series L-FL, L-FL2 y L-FL3

Secuencia

Masa esperada (M-H)- Masa experimental

GD2

6814 6814,3

GD3

6826 6826,7

GD4

6814 6812,5

L-S-RF

n.d. n.d.

G1A

6618 6616,5

G1B

6674 6672,2

178H

6618 6616,4

178I

6674 6671,9

GD21

6707 6705,3

GD22

6720 6718

GD23

6696 6693

GD24

6708 6705,8

GD25

6690 6687,4

303g

6804 6802

303f

6911 6911

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

El analisis de los datos presentados en la figura 6 indica que la hebra antisentido GD2, que contiene dos extensiones 3' FAAN (2'F-AAN) seguido por un unico residuo de ANB es compatible con la maquinaria de iARN, y en algunos casos puede mejorar la potencia de iARN relativa a una hebra antisentido de ARN regular (comparese L- FL1 y L-FL4). Considerando que los ARN modificados en 3' son en general mas estables a la degradacion por nucleasas, esta arquitectura antisentido se eligio para avanzar en estudios adicionales, ahora enfocados en probar la sinergia 2'F-AAN/ANB interhebra en la hebra sentido.

Como se ha mostrado anteriormente (ejemplos 2 y 3), se puede alcanzar silenciamiento genico potente usando ARNip quimeras de 2'F-AAN/2'F-ARN. Las arquitecturas de ARNip 2'F-AAN/2'F-ARN quimericos que comprenden la serie L-FL2 de ARNip se disenaron y estudiaron entonces. Se disenaron las hebras sentido con regiones alternantes 2'F-AAN y ANB moviendose de 5' a 3'. La incorporacion de ANB se mantuvo a un mmimo rodeando insertos de ANB con configuracion fuertemente norte con ARN. Las modificaciones qmmicas en los extremos 3' de las hebras sentido se variaron en intentos de capitalizar en el sesgo termodinamico observado de RISC para carga de la hebra de ARNip con la afinidad de union mas debil en el extremo 5'. 7 hebras sentido GD21-GD25 son identicas hasta el nucleotido 14, despues de lo cual se emplearon varios patrones de modificacion qmmica. Las hebras GD21 y 22 muestran regiones ANB-2'-F-AAN alternantes disenadas para explorar los efectos de colocar configuraciones de azucar contrarias (norte frente a sureste) una al lado de otra en una hebra sentido. GD23-25 muestra varios patrones de modificacion 2'F-AAN combinada con ARN sin modificar, incluyendo disenos de altfmeros 1-1, disenos de altfmeros 2-2, y regiones 3' totalmente ARN seguidas por extensiones 2'F-AAN. La Tm de los duplex de oligonucleotidos de la serie L-FL2 se proporciona en la tabla VIII a continuacion.

Tabla VIII: Tm de los duplex de oligonucleotidos de la serie L-FL2

ARNip

Tm (°C)

L-FL2-1

62,9

L-FL2-2

59,2

L-FL2-3

58,4

L-FL2-4

55,0

L-FL2-5

58,6

L-FL2-6

65,7

L-FL2-7

62,2

L-FL2-8

n.d.

L-FL2-9

60,5

L-FL2-10

61,9

Control

60,5

Segun los datos de Tm obtenidos, las modificaciones qmmicas en 3' no crearon cambios significativos en la afinidad de union de duplex, lo que sugiere que no se introdujo sesgo de hebra para carga de la hebra antisentido apropiada. Sin embargo, la secuencia de ARNip tiene alto contenido A:U en el extremo 5' de la hebra antisentido, favoreciendo la carga apropiada de RISC, y tal vez sea innecesario sesgo de hebra adicional. Para examinar la actividad de silenciamiento genico de estas hebras sentido ANB/2'F-AAN, se prepararon ARNip hibridando GD21-GD25 con una hebra antisentido de ARN regular, o con GD2, la potente hebra antisentido de ANB/2'F-AAN de la serie L-FL. En efecto, a pesar del fracaso para introducir sesgo de hebra significativo, varias de estas arquitecturas modificadas fueron capaces de provocar silenciamiento genico potente, comparable a o mejor que el sustrato de RISC nativo, ARNbc.

Los ensayos iniciales de ARNip con la serie L-FL2 indicaban aumentos de potencia varias veces mejor que los controles sin modificar. De hecho, se observo reduccion del 70-90% a intervalos subnanomolares para L-FL2-9 y L- FL2-10, reduccion mas fuerte que incluso tratamientos 2 nM con ARNip sin modificar. Ensayos posteriores de reduccion de luciferasa de luciernaga indican disminucion potente de la serie L-FL2. En la figura 7 se muestran los resultados de la reduccion para los mejores ARNip en la serie L-FL2. Varias de las arquitecturas son bien toleradas por la maquinaria de RISC. Algunas de las arquitecturas probadas aqm son silenciadores genicos mucho mas potentes que ARNip sin modificar, especialmente a dosis menores. Ademas, los disenos que contienen ANB parecen ser mas potentes que uno de los disenos de ARNip 2'F-AAN/2'F-ARN potentes descritos anteriormente (jg- 14). Por tanto, estos datos muestran que los disenos de ARNip muy modificados aparentemente no tienen efectos nocivos en el silenciamiento genico.

La serie L-FL2 demuestra planes de modificacion de la hebra sentido que son muy compatibles con el silenciamiento genico. Sin embargo, en estos casos la hebra antisentido permanece sin modificar, o solo modificada en 3'. Se probo despues si era posible combinar estas arquitecturas de hebra sentido potentes con modificaciones de hebra antisentido compatibles con RISC, tal como hebras antisentido 2'F-ARN.

Basado en la eficacia de las hebras sentido ANB/2'F-AAN de la serie L-FL2, y en la eficacia observada de hebras antisentido de 2'F-ARN por completo, se disenaron ARNip muy modificados que conteman solo 7-11 insertos de ARN (serie L-FL3). Estas arquitecturas de modificacion qmmica representan la combinacion de disenos mostrados

5

10

15

20

25

30

35

40

en el presente documento que son compatibles con silenciamiento basados en ARNip (ejemplos 2 y 3, series L-FL1 y L-FL2). Como se muestra en la figura 8, estos imitadores de ARNip muy modificados muestran capacidades de silenciamiento genico potentes. Algunos de estos ARNip modificados son significativamente mas potentes que el ARNip control, incluso en a la dosis de intervalo medio 0,08 nM donde la potencia de los ARNip modificados de la serie L-FL2 era aproximadamente igual que la del ARNip sin modificar.

Ejemplo 5: Disminucion de C-myb usando duplex de ARNip basados en las arquitecturas 2'F-AAN/2'F-ARN y 2'F-AAN/2'F-ARN/ANB

C-myb es un protooncogen implicado en leucemia. Codifica protemas esenciales para la proliferacion de celulas hematopoyeticas. Se probaron arquitecturas 2'F-AAN/2'F-aRn y 2'F-AAN/2'F-ARN/ANB mostradas que tienen actividades de silenciamiento genicos de luciferasa y/o 4E-BP contra otra diana, es decir, c-myb. Las secuencias de los duplex de la serie C-myb se proporcionan en la tabla IX.

Tabla IX: Secuencias de los ARNip de la serie C-myb usadas en los estudios descritos en el presente

documento

Hebras

Marcadores de ARNip SEQ ID NO:

5'-UGUUAUUGCCAAGCACUUAAA-3'

Cmyb-1 48

5-UAAGUGCUUGGCAAUAACAGA-3'

49

5-TGTUAUTGCCAAGCACTUAAA-3'

Cmyb-2 50

5-pUAAGUGCUUGGCAAUAACAGA-3'

51

5'-TGuUATTGCCaAGCAcUTAAA-3'

Cmyb-3 52

5'-pUAAGUGCUUGGCAAUAACAGA-3'

51

5-TGTUAUTGCCAAGCACTUAAA-3'

Cmyb-4 50

5-UAAGUGCUUGGCAAUAACAGA-3'

49

5'-TGuUATTGCCaAGCAcUTAAA-3'

Cmyb-5 52

5'-UAAGUGCUUGGCAAUAACAGA-3'

49

5'-UGUUAUUGCCAAGCACUUAAA-3'

Cmyb-6 48

5-pUAAGUGCUUGGCAAUAACAGA-3'

51

5'-GCUUGAAGUCUUUAAUUAAtt-3'

Mezclado 19

5'-UUAAUUAAAGACUUCAAGCgg-3'

20

5-CGTACGCGGAAUACTUCGATT-3'

Mezclado 35

5-pUCGAAGUAUUCCGCGUACGUU-3'

Mod.1 37

5'-GCuUGAAGUCuUUAAuUAATT-3'

Mezclado 43

5'-p7TAA7TAAAGAC7TCAAGCGG-3'

Mod.2 26

Mayuscula = ARN

Minuscula = adn

Minuscula subrayada = anb

Mayuscula negrita subrayada = 2’F-AAN (FAAN)

Mayuscula negrita cursiva = 2’F-ARN p = 5'-fosfato

Como se muestra en la figura 9A, los ARNip modificados con 2'F-AAN/2'F-ARN y 2'F-AAN/2'F-ARN/ANB son capaces de silenciar la expresion genica en otra diana, y son mejores silenciando c-myb que ARNip sin modificar a las dosis menores. La arquitectura 2'F-AAN/2'F-ARN parece ser mas potente en las condiciones experimentales ensayadas.

La figura 9B muestra la tasa de supervivencia (el eje y representa el numero de celulas de leucemia aun vivas despues de los periodos de tiempo indicados despues del tratamiento con ARNip disenado para dirigirse a c-myb y prevenir la proliferacion de celulas de leucemia) despues del tratamiento con ARNip. De forma interesante, las celulas de leucemia tratadas con ARNip sin modificar se recuperan 6 dfas despues del tratamiento y empiezan a proliferar otra vez, mientras que varios de los ARNip modificados, aun previenen la proliferacion despues de 6 dfas. Esto sugiere que los ARNip modificados no se degradan tanto como los ARNip sin modificar despues de estos periodos de tiempo.

Las novedosas arquitecturas de ARNip quimericos descritas en el presente documento representan mimeticos de ARNip no explorados previamente capaces de potencias equivalentes o mejoradas comparados con ARNip sin modificar.

Tabla X: Resumen de los ARNip usados en los estudios descritos en el presente documento

Secuencia

ID de duplex de ARNip

SEQ ID NO:

ARNip de la tabla III

5' AACUCACCUGUGACCAAAAca

Control sin modificar

1

5' UUUUGGUCACAGGUGAGUUcc

4EBP-1 humano 2

5' AAGACUCCAAAGUAGAAGUaa

Control sin modificar 4EBP-2 humano y murino 3

5' ACUUCUACUUUGGAGUCUUca

4

5' AACUCACCUGUGGCCAAAAca

Control sin modificar 4EBP-1 murino 5

5' UUUUGGCCACAGGUGAGUUcc

6

5'AACTCACCTGTGGCCAAAACA

4EBP-1 murino_14 7

5' pUUUUGGCCACAGGUGAGUUCC

8

5' AACTCACCTGTGACCAAAACA

4EBP-1 humano_14 9

5' pUUUUGGUCACAGGUGAGUUCC

10

5' AAGACTCCAAAGTAGAAGTAA

4EBP-2 raton_14 o 4EBP-2 humano_14 11

5' pACUUCUACUUUGGAGUCUUCA

12

5' AACUCACCTGUGGCCAAAACA

4EBP-1 raton_611 13

5' pUUUUGGCCACAGGUGAGUUCC

14

5' AACUCACCTGUGACCAAAACA

4EBP-1 humano_611 15

5' pUUUUGGUCACAGGUGAGUUCC

16

5' AAGACUCCAAAGTAGAAGTAA

4EBP-2 raton 611 o 4EBP-2 humano_611 17

5' pACUUCUACUUUGGAGUCUUCA

18

ARNip de la tabla I

5'-GCUUGAAGUCUUUAAUUAAtt-3'

jg-i 19

5'-UUAAUUAAAGACUUCAAGCgg-3'

20

5'-GC7TGAAG7'C7TTAATTAATT-3'

jg-2 21

5-TTAATTAAAGACTTCAAGCGG-3'

22

5-GCTTGAAGTCTTTAATTAATT-3'

jg-3 23

5-TTAATTAAAGACTTCAAGCGG-3'

24

5-GCTTGAAGTCTTTaAtTAA TT-3’

jg-4 25

5-pTTAATTAAAGACTTCAAGCGG-3'

26

5-GCTTGAAGTCTTTAATTAATT-3'

jg-5 27

5'-pTTAATTAAAGACTTCAAGCGG-3'

28

5-GCTTGAAGTCTTTAATTAATT-3'

jg-6 21

5'-UUAAUUAAAGACUUCAAGCgg-3'

20

5'-GCUUGAAGUCUUUAAUUAAtt-3'

jg-7 19

5-TTAATTAAAGACTTCAAGCGG-3'

22

5-GCTTGAAGTCTTTAATTAATT-3'

jg-8 23

5'-UUAAUUAAAGACUUCAAGCgg-3'

20

5'-GCUUGAAGUCUUUAAUUAAtt-3'

jg-9 19

5-TTAATTAAAGACTTCAAGCGG-3'

24

5-gcttgaagtctttaAttaa TT-3'

jg-io 25

5'-UUAAU UAAAGACUUCAAGCgg-3'

20

5'-GCUUGAAGUCUUUAAUUAAtt-3'

jg-ii 19

5'-pTTAATTAAAGACTTCAAGCGG-3'

26

5-GCTTGAAGTCTTTAATTAATT-3'

jg-12 27

5'-UUAAUUAAAGACUUCAAGCgg-3'

20

5'-GCUUGAAGUCUUUAAUUAAtt-3'

jg-i3 19

5'-pTTAATTAAAGACTTCAAGCGG-3'

28

5-GCTTGAAGTCTTTAATTAATT-3'

jg-i4 27

5'-pTTAATTAAAGACTTCAAGCGG-3'

26

5-GCTTGAAGTCTTTAATTAA TT-3'

jg-i5 25

5'-pTTAATTAAAGACTTCAAGCGG-3'

28

ARNip de la tabla II

5'-CGUACGCGGAAUACUUCGAtt-3'

kl-ctl 29

5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGtt-3'

30

5-CGUACGCGGAAUACUUCGAUU-3'

kl-1 31

5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGtt-3'

30

5-CGTACGCGGAATACTTCGATT-3'

kl-2 32

5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGtt-3'

30

5'-CGTACGCGGAATACUUCGATT-3'

kl-3 33

5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGtt-3'

30

5-CGTACGCGGAAUACTUCGATT-3'

kl-4 34

5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGtt-3'

30

5-CGTACGCGGAAUACTUCGATT-3'

kl-5 35

5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGtt-3'

30

5-CGTACGCGGAAUACTUCGATT-3'

kl-6 36

5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGtt-3'

30

61.

9H1-1 ,9-Hwnnwnnnonowonnoo-,s

ZV

2H1-1 ,9-oooowonnovovwnnwnn-,s

61

,9-Hwnnwnnnonowonnoo-,s

9S

Udl-1 ,9-BBoowonnovovwnnwnnd-g

61.

,9-Hwnnwnnnonowonnoo-,9

ZV

0H1-1 ,9-ooqo won n ovovwn n wn nd-,g

IV

,9-iiwn n wiiioio woiioo-,9

9S

6dl-l ,9-BBoowonnovowvnnwnnd-,g

IV

,9-iiwn n wiiioio woiioo-,g

OV

8dl-l ,9-oo50wonnovoweennwnnd-,g

IV

,9-iiwn n wiiioio woiioo-,g

69

Zdl-1 ,9-ooooevonnovowvnnwnnd-g

IV

,9-iiwn n wiiioio woiioo-,g

89

9dl-l ,9-oooowonnovowvnnwnnd-,g

l.fr

,9-iiwn n wiiioio woiioo-,g

2fr

Sdl-1 ,9-0000 won n ovo wvn n wn nd-,g

Z2

,9-llWllW111010W01100-,9

9S

frdl-l ,9-BBoowonnovowvnnwnnd-g

Z2

,9-llWllW111010W01100-,9

Ofr

9dl-l ,9-oo5owonnov0WBennwnnd-,g

Z2

,9-llWllW111010W01100-,9

69

2dl-l ,9-ooo0Bvonnovowvnnwnnd-,g

Z2

,9-llWllW111010W01100-,9

89

l.dl-1 ,9-ooo0wonnovowvnnwnnd-,g

LZ

,9-llWllW111010W01100-,9

AB|qei B| apdiNav

ss

OS lOJJUOQ ,9-BBoowonwvovonnnwnn-,9

*9

,9-Hwnnwvononnnv0nnoo-,9

02

IOJ1UOQ ,9-BBoowonnovowvnnwnn-,9

61.

,9-Hwnnwnnnonow0nnoo-,9

2fr

2-ld-l ,9-0000 won n ovo wvn n wn nd-,g

61.

,9-Hwnnwnnnonow0nnoo-,9

Ofr

snd-i ,9-ooo0wonnovowBBnnwnnd-,g

61.

,9-Hwnnwnnnonow0nnoo-,9

69

H1d-~l ,9-ooo0Bvonnovowvnnwnnd-,g

61.

,9-Hwnnwnnnonow0nnoo-,9

89

9Hd-l ,9-ooo0wonnov0wvnnwnnd-,g

61.

,9-Hwnnwnnnonow0nnoo-,9

Ofr

81d-l ,9-ooo0wonnovowBBnnwnnd-g

I.fr

,9-iiwn n wiiioio woiioo-,g

69

Zld-1 ,9- ooo0Bvonnovowvnnwnnd-,g

l.fr

,9-iiwn n wiiioio woiioo-,9

89

91d-l ,9-ooo0wonnovowvnnwnnd-,g

l.fr

,9-nwn n wiiioio woiioo-,9

Ofr

91d-l ,9-ooo0wonnovowBBnnwnnd-,g

LZ

,9-llWllW111010W01100-,9

69

21d-l ,9-ooo0Bvonnovowvnnwnnd-,g

LZ

,9-llWllW111010W01100-,9

89

Hd-1 ,9-oo50wonnovowvnnwnnd-,g

LZ

,9-llWllW111010W01100-,9

Al eiqeiB| apdiNav

LZ

2H>I .z-nnoovnooooonnvnovvoond-.g

99

,9-iivooniovnwooooovioo-,9

LZ

u u-ia ,z-nnoovn ooooonn vnovvoond-q

S9

,9-iivooniovnwooooovioo-,9

LZ

0M>1 ,z-nnoovnooooonnvnovvoond-s

VZ

,9-iivooniovnwooooovioo-,9

LZ

6-|>l ,z-nnoovnooooonnvnovvoond-s

99

,9-iivoonnoviwooooovioo-,9

LZ

8-|>l ,z-nnoovnooooonnvnovvoond-s

29

,9-llVOOilOVlWOOOOOV100-,9

LZ

z-ia ,z-nnoovnooooonnvnovvoond-s

iZ

£-nnvoonnovnvvooooovnoo-,9

Z 1.02-0 kOl. 8I.0Z9Z603

5'-pUUAAUUaaAAGACUUCAAGcGG-3'

40

5'-GCUUGAAGUCUUUAAUUAAtt-3'

L-LF18 19

5'-UUAAUUAAAGACUUCAAGCgg-3'

20

5'-GCUUGAUUUCUGAAAUUAAtt-3'

Control sc 54

5'-UUAAUUUCAGAAAUCAAGCgg-3'

55

ARNip de la tabla VI

5'-GCuUGAAGUCuUUAAuUAATT-3'

L-LF3-1 43

5'-pTTAATTAAAGACTTCAAGCGG-3'

26

5'-GCuUGAAGUCuUUAATuAATT-3'

L-LF3-2 44

5-pTTAATTAAAGACTTCAAGCGG-3'

26

5'-GCuUGAAGUCuUUAAUUAATT-3'

L-LF3-3 45

5-pTTAATTAAAGACTTCAAGCGG-3'

26

5'-GCuUGAAGUCuUUAATUAATT-3'

L-LF3-4 46

5-pTTAATTAAAGACTTCAAGCGG-3'

26

5'-GCuUGAAGUCuUUAAUUAATT-3'

L-LF3-5 47

5'-pTTAATTAAAGACTTCAAGCGG-3'

26

ARNip de la tabla IX

5'-UGUUAUUGCCAAGCACUUAAA-3'

Cmyb-1 48

5-UAAGUGCUUGGCAAUAACAGA-3'

49

5-TGTUAUTGCCAAGCACTUAAA-3'

Cmyb-2 50

5'-pUAAGUGCUUGGCAAUAACAGA-3'

51

5'-TGuUATTGCCaAGCAcUTAAA-3'

Cmyb-3 52

5'-pUAAGUGCUUGGCAAUAACAGA-3'

51

5-TGTUAUTGCCAAGCACTUAAA-3'

Cmyb-4 50

5-UAAGUGCUUGGCAAUAACAGA-3'

49

5'-TGuUATTGCCaAGCAcUTAAA-3'

Cmyb-5 52

5-UAAGUGCUUGGCAAUAACAGA-3'

49

5'-UGUUAUUGCCAAGCACUUAAA-3'

Cmyb-6 48

5'-pUAAGUGCUUGGCAAUAACAGA-3'

51

5'-GCUUGAAGUCUUUAAUUAAtt-3'

sc 19

5'-UUAAUUAAAGACUUCAAGCgg-3'

20

5-CGTACGCGGAAUACTUCGATT-3'

sc Mod. 1 35

5-pUCGAAGUAUUCCGCGUACGUU-3'

37

5'-GCuUGAAGUCuUUAAuUAATT-3'

sc Mod.2 43

5'-p7TAA7TAAAGAC7TCAAGCGG-3'

26

ARNip de la figura 4

5' AACUCACCUGUGACCAAAAca

Control sin modificar 4EBP-1 humano (ARNip control 1) 1

5' UUUUGGUCACAGGUGAGUUcc

2

5' AACTCACCTGTGACCAAAACA

4EBP-1 humano_14 9

5' pUUUUGGUCACAGGUGAGUUCC

10

5' AACUCACCTGUGACCAAAACA

4EBP-1 humano_611 15

5' pUUUUGGUCACAGGUGAGUUCC

16

5' AAGACUCCAAAGUAGAAGUaa

Control sin modificar 4EBP-2 humano (ARNip control 2) 3

5' ACUUCUACUUUGGAGUCUUca

4

5' AAGACTCCAAAGTAGAAGTAA

4EBP-2 humano_14 11

5' pACUUCUACUUUGGAGUCUUCA

12

5' AAGACUCCAAAGTAGAAGTAA

4EBP-2 humano_611 17

5' pACUUCUACUUUGGAGUCUUCA

18

5'-GCUUGAAGUCUUUAAUUAAtt-3'

Control Mezclado (sc) 19

5'-UUAAUUAAAGACUUCAAGCgg-3'

20

5-GCTTGAAGTCTTTAATTAATT-3'

Control Mezclado (sc) Modificado 1 27

5'-pUUAAUUAAAGACUUCAAGCGG-3'

53

5-CGTACGCGGAAUACTUCGATT-3'

Control Mezclado (sc) Modificado 2 35

5-pUCGAAGUAUUCCGCGUACGUU-3

37

Mayuscula = ARN Minuscula = adn Minuscula subrayada = anb Mayuscula negrita subrayada = 2’F-AAN (FAAN) 5 Mayuscula negrita cursiva = 2’F-ARN p = 5'-fosfato

Claims (14)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   1. Un ARNip qmmicamente modificado que comprende un duplex oligonucleotfdico que comprende una hebra sentido y una hebra antisentido, cada una comprende respectivamente:

   (i) Sentido: [(2'F-AAN)a(2'F-ARN)a]2 [(2'F-AAN)(2'F-ARN)]3 (2'F-AAN)

   Antisentido: (ARN)ig;

   (ii) Sentido: [(2'F-AAN)3(2'F-ARN)3]2 [(2'F-AAN)(2'F-ARN)]3 (2'F-AAN)

   Antisentido: (2'F-ARN)ig;

   (iii) Sentido: [(2'F-AAN)(2'F-ARN)]g (2'F-AAN)

   Antisentido: (ARN)ig;

   (iv) Sentido: [(2'F-AAN)(2'F-ARN)]g (2'F-AAN)

   Antisentido: (2'F-ARN)ig;

   (v) Sentido: [(2'F-AAN)3(2'F-ARN)3]3 (2'F-AAN)

   Antisentido: (ARN)ig; o

   (vi) Sentido: [(2'F-AAN)3(2'F-ARN)3]3 (2'F-AAN)

   Antisentido: (2'F-ARN)ig,

   en donde el ARNip tiene actividad ARNip.
2. 2. El ARNip qmmicamente modificado de la reivindicacion i, en donde el duplex esta completamente modificado con uno o mas residuos de 2'F-ARN y 2'F-AAN.
3. 3. El ARNip qmmicamente modificado de la reivindicacion i, en donde el duplex comprende una extension.
4. 4. El ARNip qmmicamente modificado de la reivindicacion 3, en donde la extension es una extension de i a 5 residuos.
5. 5. El ARNip qmmicamente modificado de la reivindicacion 4, en donde la extension es una extension de 2 residuos.
6. 6. El ARNip qmmicamente modificado de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en donde la extension comprende residuos de ADN, 2'F-AAN y/o 2'F-ARN.
7. 7. El ARNip qmmicamente modificado de la reivindicacion 6, en donde la extension comprende dos residuos de 2'F-AAN.
8. 8. El ARNip qmmicamente modificado de la reivindicacion 7, en donde la extension comprende dos residuos de 2'F-AAN en la hebra sentido.
9. 9. El ARNip qmmicamente modificado de la reivindicacion 7, en donde la extension comprende dos residuos de 2'F-AAN en la hebra antisentido.
10. 10. El ARNip qmmicamente modificado de cualquiera de las reivindicaciones i a 9, en donde la hebra sentido y la hebra antisentido tienen una longitud de i9 a 23 residuos de nucleotidos.
11. 11. Una composicion farmaceutica que comprende el ARNip qmmicamente modificado de cualquiera de las reivindicaciones i a i0, junto con un excipiente o soporte farmaceuticamente aceptable.
12. 12. Uso del ARNip qmmicamente modificado de cualquiera de las reivindicaciones i a i0 o la composicion farmaceutica de la reivindicacion ii para degradar o disminuir el nivel de un acido nucleico diana, o para disminuir la produccion de un polipeptido codificado por dicho acido nucleico diana, en una celula, en donde la hebra sentido del ARNip qmmicamente modificado comprende una secuencia de nucleobases sustancialmente identica a la secuencia de nucleobases del acido nucleico diana.
13. 13. El ARNip qmmicamente modificado de cualquiera de las reivindicaciones i a i0 o la composicion farmaceutica de la reivindicacion ii para uso en prevenir o tratar una enfermedad o afeccion asociada con la expresion de un acido nucleico diana, o de un polipeptido codificado por dicho acido nucleico diana, en un sujeto, en donde la hebra sentido del ARNip qmmicamente modificado comprende una secuencia de nucleobases sustancialmente identica a la secuencia de nucleobases del acido nucleico diana.
14. 14. Un metodo in vitro de degradar o disminuir la expresion de un acido nucleico diana, o de disminuir el nivel de un polipeptido codificado por dicho acido nucleico diana, en una celula, el metodo comprende poner en contacto la celula con el ARNip qmmicamente modificado de cualquiera de las reivindicaciones i a i0 o la composicion farmaceutica de la reivindicacion ii, en donde la hebra sentido del ARNip qmmicamente

    modificado comprende una secuencia de nucleobases sustancialmente identica a la secuencia de nucleobases del acido nucleico diana.