CN112626152A - siRNA的制备方法 - Google Patents
siRNA的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112626152A CN112626152A CN202011508174.0A CN202011508174A CN112626152A CN 112626152 A CN112626152 A CN 112626152A CN 202011508174 A CN202011508174 A CN 202011508174A CN 112626152 A CN112626152 A CN 112626152A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sirna
- target gene
- dsrna
- preparing
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 title claims abstract description 180
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 51
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 94
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims abstract description 37
- 108010057163 Ribonuclease III Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 102000003661 Ribonuclease III Human genes 0.000 claims abstract description 35
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims abstract description 31
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 21
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 19
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims abstract description 16
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 14
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims abstract description 14
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims abstract description 14
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims abstract description 13
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims abstract description 13
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 25
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 21
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 19
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 19
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 10
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 9
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 claims description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 claims description 3
- 238000003801 milling Methods 0.000 claims 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 abstract description 17
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 7
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 6
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 abstract 1
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 145
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 47
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 40
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 34
- 230000001743 silencing effect Effects 0.000 description 28
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 26
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 21
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 21
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 16
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 13
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 13
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 13
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 9
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 7
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 5
- 241000252233 Cyprinus carpio Species 0.000 description 5
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 5
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 5
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282806 Rhinoceros Species 0.000 description 4
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 4
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 4
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 4
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- SIIZPVYVXNXXQG-KGXOGWRBSA-N [(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-4-[[(3s,4r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-3-hydroxyoxolan-2-yl]methyl [(2r,4r,5r)-2-(6-aminopurin-9-yl)-4-hydroxy-5-(phosphonooxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers C1=NC2=C(N)N=CN=C2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OC2[C@@H](O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@H]2O)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)[C@@H](O)[C@H]1OP(O)(=O)OCC([C@@H](O)[C@H]1O)OC1N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 SIIZPVYVXNXXQG-KGXOGWRBSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 208000037828 epithelial carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 2
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 108010000834 2-5A-dependent ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102100027962 2-5A-dependent ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 101150044182 8 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700039538 Aminopeptidase N-like Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000008014 Eukaryotic Initiation Factor-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010089791 Eukaryotic Initiation Factor-2 Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 210000004460 N cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 108091030066 RNAIII Proteins 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000010242 baoji Substances 0.000 description 1
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005360 mashing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/30—Nucleotides
- C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本申请涉及核酸提取技术领域，尤其涉及一种siRNA的制备方法，该制备方法包括如下步骤：体外转录获得目的基因的dsRNA；用RNase Ⅲ对所述目的基因的dsRNA进行消化处理，得到消化产物；将所述消化产物凝胶电泳后，切割核酸片段＜30bp的胶块；将所述胶块研磨冻融后，获得siRNA。该制备方法具有准确有效、操作简便、成本低廉的特点，为纯化siRNA以及RNAi研究带来极大的方便，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本申请属于核酸提取技术领域，尤其涉及一种siRNA的制备方法。
背景技术
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是近年发展起来的一种阻抑基因表达的新方法，该技术可以通过双链RNA的介导，降解靶基因的mRNA，在转录后水平上特异性地阻断或降低靶基因的表达，达到类似基因敲除的效果，而操作比基因敲除简单，有着投入少、实验周期短等优势，是一种可以大量进行基因功能检测的高效且经济的研究方法，已经被广泛用于研究特定基因的功能。
在RNAi实验中，获得小干扰RNA(Small interfering RNA，siRNA)是沉默靶基因的首要步骤。目前有多种方法制备siRNA，其中较为常用的有化学合成法、体外转录法、体内载体表达法、siRNA表达框架法、RNaseⅢ体外消化dsRNA(Double-stranded RNA，双链RNA)法等。
一个基因的不同siRNA对其可能会有显著不同的抑制效果，化学合成法、体外转录法、体内载体表达法、siRNA表达框架法等均需要寻找和验证最有效的siRNA，因而可能会消耗更多时间。而使用RNaseⅢ消化长dsRNA制备法无需验证和寻找有效地特定siRNA，可以很好地解决这个问题，为研究者节省不少经费及时间。该方法主要步骤为：先通过PCR制备DNA模板(在PCR引物地5’端加上T7启动子序列，以启动转录)，使用加上T7启动子序列的DNA模板体外转录制备dsRNA，然后使用大肠杆菌RNaseⅢ消化dsRNA，形成siRNA片段，去除未消化的dsRNA即可纯化得到siRNA混合物。该方法得到的产物含有多种不同序列的siRNA，不同siRNA可能存在序列的重叠，几乎可以覆盖整个靶区段，不必筛选有效片段即可保证可有效降解靶mRNA，适合快速经济地研究某一基因功能缺失的表型。然而RNaseⅢ消化长dsRNA除了产生12-30bp的短的dsRNA，也产生一些＞30bp的dsRNA。在哺乳动物细胞中，长度超过30bp的长dsRNA不仅无法触发细胞中的RNAi，而且会激活通常由IFN诱导的dsRNA依赖的激酶PKR和2'-5'-寡腺苷酸合成酶。激活的PKR通过磷酸化翻译因子真核起始因子2α来抑制翻译过程，而2'-5'-寡腺苷酸合成酶则通过激活RNase L引起非特异性mRNA降解，从而对细胞会产生毒性作用。因此，需要对RNaseⅢ消化后的产物进行纯化，以获得较纯的12-30bp的siRNA。
dsRNA的分子量＝碱基数(bp)x 680Da/bp，那么30bp dsRNA对应的分子量即为20.4kDa。因此，目前普遍采用30kDa的超滤管纯化RNaseⅢ消化后的dsRNA混合物。然而，超滤管价格昂贵，不适用于需要研究多个基因的大量制备siRNA；而且超滤管纯化在上样前需要将RNaseⅢ消化的混合物稀释，导致纯化的siRNA浓度较低，需要再次进行siRNA浓缩步骤，操作较繁琐。
因此，相关技术有待改进。
发明内容
本申请的目的在于提供一种siRNA的制备方法，旨在解决现有RNaseⅢ体外消化dsRNA制备siRNA成本高、步骤繁琐的技术问题。
为实现上述申请目的，本申请采用的技术方案如下：
本申请提供一种siRNA的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
体外转录获得目的基因的dsRNA；
用RNaseⅢ对所述目的基因的dsRNA进行消化处理，得到消化产物；
将所述消化产物凝胶电泳后，切割核酸片段＜30bp的胶块；
将所述胶块研磨冻融后，获得siRNA。
本申请构建一种简单的siRNA的制备方法，该制备方法是对现有RNaseⅢ体外消化dsRNA法进行改进，具体地，该制备方法基于RNaseⅢ消化体外转录获得目的基因的dsRNA，然后对消化产物凝胶电泳以切割核酸片段＜30bp的胶块，通过对该胶块研磨冻融后，释放出siRNA。该制备方法可以有效去除RNaseⅢ消化产物中＞30bp的dsRNA片段，具有准确有效、操作简便、成本低廉的特点，为纯化siRNA以及RNAi研究带来极大的方便，具有很好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本申请实施例提供的以含T7启动子序列的完整引物扩增Unigene7122含T7启动子序列DNA的琼脂糖凝胶电泳图；其中：M.DL15000DNA Marker，1.含T7启动子序列的Unigene7122扩增结果，2.阴性对照；
图2是本申请实施例提供的以含T7启动子序列的完整引物扩增Unigene12835、Unigene19308含T7启动子序列DNA的琼脂糖凝胶电泳图；其中，M.DL2000 DNA Marker；1.阴性对照(T7-U12835F1、T7-U12835R1)，2.含T7启动子序列的Unigene12835(T7-U12835F1、T7-U12835R1)扩增结果，3.阴性对照(T7-U12835F2、T7-U12835R2)，4.含T7启动子序列的Unigene12835(T7-U12835F2、T7-U12835R2)扩增结果，5.阴性对照(T7-U19308F1、T7-U9308R1)，6.含T7启动子序列的Unigene19308(T7-U19308F1、T7-U9308R1)扩增结果，7.阴性对照(T7-U19308F2、T7-U9308R2)，8.含T7启动子序列的Unigene19308(T7-U19308F2、T7-U9308R2)扩增结果；两个基因后续实验分别使用引物T7-U12835F1、T7-U12835R1和T7-U19308F1、T7-U9308R1；
图3是本申请实施例提供的以含T7启动子序列的完整引物扩增Unigene13423等5个基因含T7启动子序列DNA的琼脂糖凝胶电泳图；其中：M.DL2000 DNA Marker，1.含T7启动子序列的Unigene13423扩增结果，2.含T7启动子序列的CL1989.Contig1扩增结果，3.含T7启动子序列的CL3290.Contig2扩增结果，4.含T7启动子序列的CL3871.Contig2扩增结果，5.含T7启动子序列的CL51.Contig2扩增结果；
图4是本申请实施例提供的Unigene12835等8个基因的dsRNA及酶切后siRNA产物的琼脂糖凝胶电泳图；其中：M1.DL2000 DNA Marker，M2.20bp DNA ladder Marker，1.Unigene12835 dsRNA，2.Unigene12835 siRNA mix，3.Unigene13423 dsRNA，4.Unigene13423 siRNA mix，5.Unigene19308 dsRNA，6.Unigene19308 siRNA mix，7.Unigene7122 dsRNA，8.Unigene7122 siRNA mix，9.CL1989.Contig1 dsRNA，10.CL1989.Contig1 siRNA mix，11.CL3290.Contig2 dsRNA，12.CL3290.Contig2 siRNAmix，13.CL3871.Contig1dsRNA，14.CL3871.Contig1 siRNA mix，15.CL51.Contig3 dsRNA，16.CL51.Contig3 siRNA mix；
图5是本申请实施例提供的Unigene12835、Unigene19308基因的siRNA纯化产物的琼脂糖凝胶电泳图；其中，M.DL5000 DNA Marker，1.Unigene12835未纯化的siRNA mix，2.Unigene12835纯化含goldview的siRNA，3.Unigene12835纯化不含goldview的siRNA，4.Unigene19308未纯化的siRNA mix，5.Unigene19308纯化含goldview的siRNA，6.Unigene19308纯化不含goldview的siRNA；
图6是本申请实施例提供的CL3290.Contig2、CL51.Contig2基因的siRNA纯化产物的琼脂糖凝胶电泳图；其中，M.20bp DNA ladder Marker，1.CL3290.Contig2未纯化的siRNA mix，2.CL3290.Contig2纯化含goldview的siRNA，3.CL3290.Contig2纯化不含goldview的siRNA，4.CL51.Contig3未纯化的siRNA mix，5.CL51.Contig3纯化含goldview的siRNA，6.CL51.Contig3纯化不含goldview的siRNA；
图7是本申请实施例提供的Unigene13423基因的siRNA纯化产物的琼脂糖凝胶电泳图；其中，M.20bp DNA ladder Marker，1.Unigene13423未纯化的siRNA mix，2.Unigene13423纯化含goldview的siRNA，3.Unigene13423纯化不含goldview的siRNA；
图8是本申请实施例提供的Unigene12835经过靶向干扰后的基因相对表达量(以β-actin为内参基因)；其中，(a)以NC组为对照的相对表达量，(b)以Mock组为对照的相对表达量；
图9是本申请实施例提供的Unigene19308经过靶向干扰后的基因相对表达量(以β-actin为内参基因)；其中，(a)以NC组为对照的相对表达量，(b)以Mock组为对照的相对表达量；
图10是本申请实施例提供的CL51.Contig3经过靶向干扰后的基因相对表达量(以β-actin为内参基因)；其中，(a)以NC组为对照的相对表达量，(b)以Mock组为对照的相对表达量；
图11是本申请实施例提供的Unigene13423经过靶向干扰后的基因相对表达量(以β-actin为内参基因)；其中，(a)以NC组为对照的相对表达量，(b)以Mock组为对照的相对表达量；
图12是本申请实施例提供的CL3290.Contig2经过靶向干扰后的基因相对表达量(以β-actin为内参基因)；其中，(a)以NC组为对照的相对表达量，(b)以Mock组为对照的相对表达量；
图13是用RNaseⅢ对CL3290.Contig2 dsRNA消化后未纯化的CL3290.Contig2siRNA mix与本申请实施例提供的经纯化后的CL3290.Contig2 siRNA对目的基因CL3290.Contig2经过靶向干扰后的基因相对表达量(以β-actin为内参基因)对比图；其中，(a)以NC组为对照的相对表达量，(b)以Mock组为对照的相对表达量；
图14是对比例1用30K超滤管纯化siRNA的琼脂糖凝胶电泳图；其中，M.20bp DNAladder Marker，1.Unigene13423 dsRNA，2.Unigene13423未纯化的siRNA mix，3.Unigene13423 siRNA mix经30K超滤管流出样，4.Unigene13423 siRNA mix经30K超滤管截留样，5.Unigene7122 dsRNA，6.Unigene7122未纯化的siRNA mix，7.Unigene7122 siRNAmix经30K超滤管流出样，8.Unigene7122 siRNA mix经30K超滤管截留样。
具体实施方式
为了使本申请要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
本申请实施例提供一种siRNA的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
S01：体外转录获得目的基因的dsRNA；
S02：用RNaseⅢ对所述目的基因的dsRNA进行消化处理，得到消化产物；
S03：将所述消化产物凝胶电泳后，切割核酸片段＜30bp的胶块；
S04：将所述胶块研磨冻融后，获得siRNA。
本申请构建一种简单的siRNA的制备方法，该制备方法是对现有RNaseⅢ体外消化dsRNA法进行改进，具体地，该制备方法基于RNaseⅢ消化体外转录获得目的基因的dsRNA，然后对消化产物凝胶电泳以切割核酸片段＜30bp的胶块，通过对该胶块研磨冻融后，释放出siRNA。该制备方法可以有效去除RNaseⅢ消化产物中＞30bp的dsRNA片段，具有准确有效、操作简便、成本低廉的特点，为纯化siRNA以及RNAi研究带来极大的方便，具有很好的应用前景。
步骤S01中，所述体外转录获得目的基因的dsRNA的步骤包括：将总RNA反转录得到cDNA，用含有T7启动子的引物扩增所述cDNA，然后进行体外转录，并用核酸酶消化。通过不同的含有T7启动子的引物设计，可以扩增所述cDNA中不同目的基因，从而最终可以制备得到针对该目的基因的siRNA。总RNA的提取可以使用Takara公司的RNAiso Plus试剂盒进行；反转录可以通过Takara公司的试剂盒PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit进行；含有T7启动子的引物可以自行设计，可以先使用软件Primer Premier5设计各基因的引物，然后在正反向引物的5’端分别加上T7启动子序列，作为完整的引物扩增所研究的目的基因部分长度片段。本实施例中添加的T7启动子序列为：5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3'。在本申请实施例中，目的基因选用了Unigene12835，Unigene13423，Unigene19308，Unigene7122，CL1989.Contig1，CL3290.Contig2，CL3871.Contig1，CL51.Contig3等。
本申请中，为验证该siRNA的提取效果，对鲤鱼上皮瘤细胞(EPC)进行转录组测序，从中获得基因转录本(mRNA)的部分序列编号以及功能注释：具体地，编号Unigene12835预测为4F2 cell-surface antigen heavy chain-like[Sinocyclocheilus rhinocerous]，编号Unigene19308预测为lysosome membrane protein 2-like[Sinocyclocheilusrhinocerous]，编号Unigene13423预测为Niemann-Pick C1 protein-like[Sinocyclocheilus rhinocerous]，编号Unigene7122预测为aminopeptidase N-like[Sinocyclocheilus rhinocerous]，编号CL1989.Contig1为neural cell adhesionmolecule 1a precursor[Danio rerio]，编号CL3290.Contig2为erythrocyte band7integral membrane protein isoform X2[Danio rerio]，编号CL3871.Contig1为sourceof immunodominant MHC-associated peptides[Ctenopharyngodon idella]，编号CL51.Contig3预测为PREDICTED:transferrin receptor protein 1-like[Sinocyclocheilus anshuiensis]，以上述为目的基因进行对应的siRNA的提取。
在步骤S02中的所述消化处理中，RNaseⅢ浓度为0.5-1.5U/μl，优选0.5-1.5U/μl，这样浓度的消化反应体系消化效果更好。并通过RNaseⅢ消化dsRNA获得片段较小的，包括12-30bp siRNA的dsRNA混合物。
在步骤S03中，所述凝胶电泳是浓度为3％的琼脂糖凝胶电泳。紫外下切下核酸片段＜30bp的siRNA的胶块，从而可以有效去除RNaseⅢ消化产物中＞30bp的dsRNA片段，然后经过研磨冻融即可释放出针对目的基因的siRNA。
进一步地，所述研磨冻融的步骤包括：将所述胶块切碎后，依次冰冻和解冻融化，然后加水研磨。其中，所述冰冻的温度为-80℃～0℃，所述解冻融化的温度为20℃-27℃，上述温度范围可以更好地进行冰冻和解冻融化。而研磨可以使用电动研磨枪彻底研磨。所述研磨冻融的步骤重复2-4次，这样可以彻底释放目的基因的siRNA，以提高提取的浓度。
进一步地，所述加水研磨后，还包括离心取上清。反复冻融融化胶块，释放出siRNA，离心取上清获得纯化的siRNA。在一实施例中，所述目的基因为Unigene12835，得到的所述siRNA为Unigene12835 siRNA；或者，所述目的基因为Unigene13423，得到的所述siRNA为Unigene13423 siRNA；所述目的基因为Unigene19308，得到的所述siRNA为Unigene19308 siRNA；所述目的基因为Unigene7122，得到的所述siRNA为Unigene7122siRNA；所述目的基因为CL1989.Contig1，得到的所述siRNA为CL1989.Contig1 siRNA；所述目的基因为CL3290.Contig2，得到的所述siRNA为CL3290.Contig2 siRNA；所述目的基因为CL3871.Contig1，得到的所述siRNA为CL3871.Contig1 siRNA；所述目的基因为CL51.Contig3，得到的所述siRNA为CL51.Contig3 siRNA。
通过上述制备方法，可以获得高纯度的siRNA，后续可以将得到的siRNA用于转染鲤鱼上皮瘤细胞以检测靶基因沉默效果；在一实施例中，上述制备方法所述获得siRNA之后，还包括配制成浓度为0.1nmol/L-0.5nmol/L的所述siRNA用于转染。本申请实施例将制备的siRNA转染至鲤鱼上皮瘤细胞(EPC)，具体地，提取细胞RNA，反转录成cDNA，以cDNA作为模板进行qRT-PCR反应，以β-actin作为内参，采用2-△△Ct法计算目的基因相对表达量，结果发现siRNA终浓度为0.5nmol/L时靶基因相对表达量下调50％左右。通过将终浓度为0.5nmol/L未纯化的CL3290.Contig2 siRNA mix与纯化的CL3290.Contig2 siRNA分别转染EPC细胞，比较未纯化的CL3290.Contig2 siRNA mix与纯化的CL3290.Contig2 siRNA对靶基因沉默效果的差异，发现通过搅碎冻融法纯化的CL3290.Contig2 siRNA对靶基因沉默效果明显高于未纯化的CL3290.Contig2 siRNA mix，验证了搅碎冻融法纯化siRNA的有效性。
本申请通过体外转录获得靶基因的dsRNA，经RNAⅢ消化获得小片段的dsRNA，通过切胶回收、搅碎冻融法纯化了RNaseⅢ消化的siRNA混合物，得到较纯的siRNA，并用纯化的siRNA转染EPC细胞检测靶基因沉默效果，发现siRNA终浓度为0.5nmol/L时对靶基因表达下调50％左右。因此，本申请可以实现简便、低成本并且高效纯化siRNA的目的，在RNAi研究中具有重要的应用价值。
下面结合具体实施例进行说明。
实验材料与试剂
主要材料：鲤鱼上皮瘤细胞(EPC)；
主要试剂：siRNA NC由广州锐博生物公司提供，转染试剂
RNAiMAX Reagent购自invitrogen公司，10％FBS无双抗的MEM培养基，不含双抗和FBS的MEM培养基、OPTI-MEM培养基购自Gibco公司，
RNAi Kit购自Thermo公司，RNaseⅢ(E.coli)购自Ambio公司，RNA提取试剂盒RNAiso Plus、反转录试剂盒PrimeScriptTM 1stStrand cDNA Synthesis Kit、实时荧光定量PCR试剂盒TBGreenTM Premix Ex TaqTM II(Tli RNaseH Plus)购自宝生物工程(大连)有限公司(大连Takara公司)。
实施例1
一、提取EPC细胞的总RNA
使用Takara公司的RNAiso Plus试剂盒进行EPC的总RNA提取，具体操作步骤如下：
(1)收集细胞：吸出细胞培养基，用PBS清洗细胞一次；
(2)每10cm2生长的培养细胞加入1-2mL的RNAiso Plus试剂，轻轻晃动，确保裂解液均匀分布于细胞表面；
(3)将内含细胞的裂解液转移至离心管中，用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀；
(4)室温静置5min，然后从核蛋白中分离RNA；
(5)向上述步骤(4)的匀浆裂解液中加入氯仿(RNAiso Plus的1/5体积量)，盖紧离心管盖，混合至溶液乳化呈乳白色；
(6)室温静置5min；；
(7)12,000g，4℃离心15min。从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液(含RNA)、中间的白色蛋白层(大部分为DNA)及带有颜色的下层有机相；
(8)吸取上清液转移至另一新的离心管中(切勿吸出白色中间层)；
(9)向上清中加入0.5-1倍RNAiso Plus体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，置于室温下静置10分钟；
(10)12,000g，4℃离心10min。一般在离心后，试管底部会出现RNA沉淀；
(11)小心弃去上清,切勿触及沉淀，残留少量异丙醇没有关系。加入与RNAisoPlus等量的75％乙醇，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，7,500g，4℃离心5min后小心弃去上清，切勿触及沉淀；
(12)打开离心管盖，室温干燥沉淀几分钟。沉淀干燥后，加入适量的RNase-free水溶解沉淀即为EPC的总RNA；
(13)Nanodrop检测所提取RNA的浓度及质量，并提供琼脂糖凝胶电泳检测所提取RNA的完整性。
二、RNA的反转录
以上一步骤所提取的总RNA为模板，使用Takara公司的试剂盒PrimeScriptTM 1stStrand cDNA Synthesis Kit进行反转录，具体流程如下：
(1)按表1(变性反应液配制表)的比例成分在冰上配制反应液的预混液，分装到各反应管中，最后再分别加入模板，将模板与反应液混匀。65℃保温5min后，冰上迅速冷却；
表1
(2)按表2(反转录反应液配置表)的比例成分在冰上配制反转录反应液的预混液，然后取10μL分别添加到上述的各管变性后反应液中；
表2
轻轻混匀后，按照以下条件进行反转录反应：
30℃10min，42℃30min，95℃5min；
然后置于冰上放置，得到EPC细胞的cDNA，若暂时不用于下一步骤可以存放于-20℃。
三、制备DNA模板
(1)使用软件Primer Premier5设计各基因的引物，然后在正反向引物的5’端分别加上T7启动子序列，作为完整的引物扩增所研究的基因部分长度片段。本实验添加的T7启动子序列为：5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3'；
(2)以EPC细胞的cDNA为模板，用上述所设计的引物，按照表3(制备DNA模板反应体系)配制反应液，制备dsRNA的DNA模板；
表3
(3)先使用基因特异引物(不包含T7启动子序列)的Tm值加5℃作为退火温度反应五个循环，再使用完整引物(即基因特异引物加上T7启动子序列)的Tm值加5℃作为退火温度循环35个循环进行PCR反应；
(4)琼脂糖凝胶电泳验证产物特异性其目的条带大小，并将扩增产物送公司测序验证其序列。
四、制备目的基因dsRNA
(1)第一次使用MEGAscript RNAi Kit之前，往2×Wash Solution加入12mL ACS或者更高级别的无水乙醇，即为washing solution混合均匀后室温保存；
(2)从冰箱取出T7 Enzyme Mix直接置于冰上，因为它储存在甘油中，-20℃下不会结冰；
(3)将10×T7 Reaction Buffer和4种脱氧核苷酸溶液(ATP,CTP,GTP,和UTP)进行涡旋，一旦解冻立马将4种脱氧核苷酸溶液置于冰上，而10×T7Reaction Buffer继续放在室温；
(4)按照表4(体外转录反应体系)在室温下配置反转录反应液，充分混匀反应液，轻弹反应管或者上下吹打然后短暂离心至管子底部，37℃孵育2.5h；
表4
(5)75℃孵育5min，然后自然冷却至室温退火形成dsRNA，切勿放在冰上冷却；注：对于≤800nt的dsRNA合成反应来说，可不进行退火反应；而对于≥800nt的dsRNA合成，则需进行退火反应；
(6)使用TE(10mmol/L Tris，1mmol/L EDTA)或者loading buffer按1:100比例稀释dsRNA，取5μL进行1％琼脂糖凝胶电泳，检测双链形成的完整性及形成效率；
(7)按照表5(核酸酶消化反应体系)在冰上制备RNase消化反应液，然后37℃孵育1h，以除去DNA及ssRNA。
表5
五、纯化dsRNA
(1)按照表6(dsRNA binding mix配方)的配方配制dsRNA binding mix，轻柔地上下吹打混匀；
表6
(2)将上述500μL dsRNA binding mix加到超滤管的过滤器上，13,000rpm离心2min，弃滤液，将滤芯放到收集管中；
(3)取500μL Washing Solution到过滤器上，离心弃滤液，重复两次；弃滤液后再空管离心10-30s，以除去残留的液体；
(4)往过滤器加入50μL预热的Elution Solution(≥95℃)，然后13,000rpm离心2min；
(5)重复步骤(4)，再使用50μL Elution Solution洗脱dsRNA到同一收集管中。
(7)测上述产物的RNA浓度，然后保存于-20℃；
(7)使用TE(10mmol/L Tris，1mmol/L EDTA)或者loading buffer按1:5比例稀释dsRNA，取5μL进行1％琼脂糖凝胶电泳，检测纯化的dsRNA的完整性及双链形成效率。
六、RNaseⅢ消化dsRNA
(1)按照表7(RNaseⅢ消化反应体系)配制反应液，混合均匀；
表7
(2)37℃孵育1.5h。
七、搅碎冻融法纯化siRNA
将上述dsRNA的RNaseⅢ消化产物即siRNA mix进行纯化，具体步骤如下。
(1)同时配制大小一致且浓度均为3％的琼脂糖核酸胶，其中一块加入goldview，另外一块不加；
(2)将dsRNA的RNaseⅢ消化产物平均分为两份，一份上样于含goldview的核酸胶，另一份上样于不含goldview的核酸胶。注意上样的孔保持一致，两块胶置于同一电泳槽中同时进行电泳；
(3)紫外照射下，含goldview的核酸胶在20bp左右可以看到有明显的条带，此为siRNA的目的条带，而不含goldview的核酸胶理论上在同一位置也有相同条带；
(4)将两块胶完全重叠在一起，在紫外灯下切下20bp的目的条带，分别回收到干净的EP管中；
(5)将胶块尽可能切碎，然后置于-80℃冰冻；
(6)将冻结后的胶块取至室温(25℃)解冻融化，加入适量ddH2O，然后使用电动研磨枪进行研磨；
(7)重复步骤(5)、(6)三次，确保胶块完全捣碎；
(8)4℃，12,000rpm离心10min；
(9)用移液枪小心吸取上清转移至干净的离心管中，即为纯化好的siRNA。使用Nanodrop检测所纯化siRNA的浓度，然后计算其摩尔浓度；
(10)琼脂糖凝胶电泳检测纯化效果。
实验结果：
将制备得到的cDNA为模板，分别使用设计的含T7启动子序列的完整引物扩增各靶基因含T7启动子序列的DNA，用作后续制备dsRNA的DNA模板，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，验证扩增片段的大小及特异性。如图1、图2、图3所示，各基因均扩增出单一明亮的条带，扩增片段大小与预测大小相符，扩增产物测序正确。
RNaseⅢ充分消化dsRNA，最终产生的小片段dsRNA的介于12-30bp之间。从图4可以看到，8个研究基因的dsRNA经RNaseⅢ消化后，片段大小主要为20bp左右，没有看到明显的大片段条带，可见RNaseⅢ消化较为充分，初步获得了各基因的siRNA混合物。但是从图中可以看到，RNaseⅢ消化产物中仍有一些dsRNA混合物处于20-100bp之间。
为避免酶切后得到的siRNA mix中含有的长片段对细胞会产生毒性作用，从中挑取5个siRNA mix进行琼脂糖凝胶电泳，然后将20bp左右的条带进行切胶回收，捣碎并且反复冻融，以期siRNA从中释放出来，得到不含＞30bp片段的siRNA。将纯化产物进行琼脂糖凝胶电泳，从图5、图6、图7中可见，未纯化的siRNA mix确实存在一定较长片段，而经过纯化后，电泳条带单一而且大小为20bp左右，说明基本上去除了这些大片段，得到纯度较高的siRNA。
实施例2
一、siRNA转染EPC
(1)前一日接种EPC细胞：使用含10％FBS不含双抗的MEM培养基将EPC接种至24孔板，使得次日细胞贴壁后覆盖率为60％-80％。每个实验组设置3个重复孔；
(2)制备siRNA-lipid复合体：
①首先使用OPTI-MEM分别稀释RNAi MAX Reagent和上述制备的siRNA，按照适当倍数稀释siRNA，脂质体的稀释按照每孔1.5μL RNAi MAX Reagent+23.5μL OPTI-MEM的比例进行稀释；
②将稀释好的siRNA与脂质体按照体积比1:1的比例混合，室温孵5min。因RNaseⅢ消化得到的siRNA只要较低的浓度就可以达到化学合成siRNA较高浓度得到的效果，结合实验前期探索高浓度25nmol/L、10nmol/L、5nmol/L甚至1nmol/L时基因表达下降率不高，故本研究设置转染时设置较低浓度，每个基因siRNA终浓度分别设置0.1nmol/L与0.5nmol/L两个浓度；
实验对照组设置如下：
a)正常细胞对照组(Blank组)：未经任何转染处理的细胞，用于观测整个实验过程细胞的生长状态及分析的参考；
b)转染试剂对照组(Mock组)：使用转染试剂进行转染，但是不加入siRNA，用于排除转染试剂对细胞可能的影响及分析参考；
c)阴性对照组(NC组)：使用锐博生物公司提供的通用型阴性对照siRNA进行转染，用于分析目的基因siRNA作用的参照；
(3)每个孔加入50μL siRNA-lipid复合体，最终转染体系为500μL，将细胞置于25℃、5％CO2培养；
(4)收集样品：转染24h后，收集各个孔的细胞及培养液至新的EP管中。
二、RNA反转录
将上述收集的样品反复冻融三次，作为反转录的模板，再使用Takara公司的试剂盒PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit进行反转录，步骤与前面的RNA反转录相同。
三、检测各基因沉默效果
使用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)的方法检测所研究的八个基因的mRNA转录水平的变化。
(1)上述反转录得到的cDNA分别稀释100倍，作为qRT-PCR模板，以靶基因设计引物，使用Takara公司的TB GreenTM premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)试剂盒进行qRT-PCR。实验时按照表8(qRT-PCR反应体系)的反应体系，冰上配制好试剂预混液，依次分装到384反应板中，最后加cDNA模板，每个样品设置三个重复孔。
表8
(2)使用以下反应程序进行荧光定量PCR:
95℃1min
(3)各个反应体系均以β-actin的荧光定量PCR产物为内参照，计算各个目的基因的基因表达相对量，釆用2-△△Ct法计算目的基因相对表达量。
实验结果：
将各基因经搅碎冻融法纯化的siRNA转染至EPC细胞后，以鲤鱼的β-actin基因的表达量作为对照，分析各基因的相对表达量，以检测各siRNA对其靶基因的沉默效果。
(1)Unigene12835的沉默结果
如图8(a)所示，分别使用搅碎冻融法纯化的终浓度0.1nmol/L和0.5nmol/L的Unigene12835 siRNA转染EPC 24h后，与NC组相比，两个浓度处理的细胞的Unigene12835均出现显著性下调(P＜0.05)，0.1nmol/L和0.5nmol/L两个浓度的沉默效果无显著差异；
如图8(b)所示，分别使用搅碎冻融法纯化的终浓度0.1nmol/L和0.5nmol/L的Unigene12835 siRNA转染EPC24 h后，与Mock组相比，两个浓度处理的细胞的Unigene12835均出现显著性下调(P＜0.05)，0.1nmol/L和0.5nmol/L两个浓度的沉默效果无显著差异；
综上，与NC和Mock组相比，Unigene12835在RNA干扰后表达水平均出现显著下调，其中0.5nmol/L的沉默效果更好，但0.1nmol/L和0.5nmol/L两个浓度的沉默效果无显著差异。
(2)Unigene19308的沉默结果
如图9(a)所示，分别使用搅碎冻融法纯化的终浓度0.1nmol/L和0.5nmol/L的Unigene19308 siRNA转染EPC 24h后，与NC组相比，两个浓度处理的细胞的Unigene19308均出现显著性下调(P＜0.05)，0.1nmol/L和0.5nmol/L两个浓度的沉默效果无显著差异；
如图9(b)所示，分别使用搅碎冻融法纯化的终浓度0.1nmol/L和0.5nmol/L的Unigene19308 siRNA转染EPC24 h后，与Mock组相比，两个浓度处理的细胞的Unigene19308均出现显著性下调(P＜0.05)，0.1nmol/L和0.5nmol/L两个浓度的沉默效果无显著差异；
综上，与NC和Mock组相比，Unigene19308在RNA干扰后表达水平均出现显著下调，但0.1nmol/L和0.5nmol/L两个浓度的沉默效果无显著差异。
(3)CL51.Contig3的沉默结果
如图10(a)所示，分别使用搅碎冻融法纯化的终浓度0.1nmol/L和0.5nmol/L的CL51.Contig3 siRNA转染EPC 24h后，与NC组相比，两个浓度处理的细胞的CL51.Contig3均出现显著性下调(P＜0.05)，0.1nmol/L和0.5nmol/L两个浓度的沉默效果无显著差异；
如图10(b)所示，分别使用搅碎冻融法纯化的终浓度0.1nmol/L和0.5nmol/L的CL51.Contig3 siRNA转染EPC 24h后，与Mock组相比，两个浓度处理的细胞的CL51.Contig3均出现显著性下调(P＜0.05)，0.1nmol/L和0.5nmol/L两个浓度的沉默效果无显著差异；
综上，与NC和Mock组相比，CL51.Contig3在RNA干扰后表达水平均出现显著下调，但0.1nmol/L和0.5nmol/L两个浓度的沉默效果无显著差异。
(4)Unigene13423的沉默效果
如图11(a)所示，分别使用搅碎冻融法纯化的终浓度0.1nmol/L和0.5nmol/L的Unigene13423 siRNA转染EPC 24h后，与NC组相比，两个浓度处理的细胞的Unigene13423均出现显著性下调(P＜0.05)，0.1nmol/L和0.5nmol/L两个浓度的沉默效果无显著差异；
如图11(b)所示，分别使用搅碎冻融法纯化的终浓度0.1nmol/L和0.5nmol/L的Unigene13423 siRNA转染EPC 24h后，与Mock组相比，两个浓度处理的细胞的Unigene13423均出现显著性下调(P＜0.05)，0.1nmol/L和0.5nmol/L两个浓度的沉默效果无显著差异；
综上，与NC和Mock组相比，Unigene13423在RNA干扰后表达水平均出现显著下调，但0.1nmol/L和0.5nmol/L两个浓度的沉默效果无显著差异。
(5)CL3290.Contig2的沉默效果
如图12(a)所示，分别使用搅碎冻融法纯化的终浓度0.1nmol/L和0.5nmol/L的CL3290.Contig2 siRNA转染EPC 24h后，与NC组相比，两个浓度处理的细胞的CL3290.Contig2均出现显著性下调(P＜0.05)，0.1nmol/L和0.5nmol/L两个浓度的沉默效果无显著差异；
如图12(b)所示，分别使用搅碎冻融法纯化的终浓度0.1nmol/L和0.5nmol/L的CL3290.Contig2 siRNA转染EPC 24h后，与Mock组相比，两个浓度处理的细胞的CL3290.Contig2均出现显著性下调(P＜0.05)，0.1nmol/L和0.5nmol/L两个浓度的沉默效果无显著差异；
综上，与NC和Mock组相比，CL3290.Contig2在RNA干扰后表达水平均出现显著下调，其中0.5nmol/L的沉默效果更好，但0.1nmol/L和0.5nmol/L两个浓度的沉默效果无显著差异。
(6)比较未纯化与纯化的siRNA引起的靶基因沉默效果差异
使用终浓度为0.5nmol/L未纯化的CL3290.Contig2 siRNA mix与本申请上述实施例提供的经纯化的CL3290.Contig2 siRNA分别转染EPC 24h后，如图13(a)所示，与NC组相比，纯化的CL3290.Contig2 siRNA对靶基因沉默效果明显高于未纯化的CL3290.Contig2siRNA mix；如图13(b)所示，与Mock组相比，纯化的CL3290.Contig2 siRNA对靶基因沉默效果也明显高于未纯化的CL3290.Contig2 siRNA mix。
对比例1
将RNaseⅢ消化后的dsRNA混合物(步骤参见实施例1)使用30kDa的超滤管进行纯化，即：将RNaseⅢ消化后的混合物稀释5倍加载到30kDa超滤管中，将超滤管插入配套的微量EP管中，14000g离心20min，收集流出液，理论上即为＜30bp的siRNA，将超滤管倒扣在一个干净的1.5ml EP管中，1000g离心两分钟，收集截留液，理论上即为＞30bp的长dsRNA。
结果如图14所示，经过30K超滤管纯化，收集的流出液与截留液中均含有＜30bp的siRNA，截留液中＜30bp的siRNA反而比流出液中多。并且，从图14可知：Unigene13423siRNA mix和Unigene7122 siRNA mix经30K超滤管流出样中含有大部分＞30bp的siRNA，可见30K超滤管截留效果不明显，因此不宜适用于siRNA纯化。
综上，本申请实施例在RNaseⅢ消化dsRNA获得片段大小不一的混合物的基础上，通过琼脂糖凝胶电泳、切胶后搅碎冻融纯化siRNA，与30K超滤管纯化siRNA相比，具有以下优点：①操作简便。纯化siRNA仅需经过琼脂糖凝胶电泳，胶块研磨冻融等简单步骤，只要具备电泳仪和超低温冰箱的普通分子实验室均可进行，并且无需经过复杂siRNA mix稀释以及乙醇浓缩等步骤。②成本低廉。搅碎冻融纯化siRNA只需要购买琼脂糖，市售价格约为150元/100g，按照一块琼脂糖凝胶需要0.5g琼脂糖配制，可以上样11个孔进行电泳，则每纯化11个siRNA成本为7.5元。30K超滤管市售价格约为1423元/24个，不考虑额外的乙醇浓缩等步骤，通过30K超滤管同样纯化11个siRNA成本约为652元，远远高于搅碎冻融纯化siRNA。③纯化效果好。搅碎冻融法纯化siRNA通过琼脂糖凝胶电泳之后，准确切下＜30bp的siRNA进行纯化，纯化的siRNA绝对不含＞30bp的RNaseⅢ消化产物，纯化效果好。而经过30K超滤管纯化siRNA，收集的流出液与截留液中均含有＜30bp的siRNA，并且流出样中含有大部分＞30bp的siRNA，纯化效果不明显。
以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种siRNA的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
体外转录获得目的基因的dsRNA；
用RNaseⅢ对所述目的基因的dsRNA进行消化处理，得到消化产物；
将所述消化产物凝胶电泳后，切割核酸片段＜30bp的胶块；
将所述胶块研磨冻融后，获得siRNA。
2.如权利要求1所述的siRNA的制备方法，其特征在于，所述消化处理中，RNaseⅢ浓度为0.5-1.5U/μl。
3.如权利要求1所述的siRNA的制备方法，其特征在于，所述凝胶电泳是浓度为3％的琼脂糖凝胶电泳。
4.如权利要求1所述的siRNA的制备方法，其特征在于，所述研磨冻融的步骤包括：将所述胶块切碎后，依次冰冻和解冻融化，然后加水研磨。
5.如权利要求4所述的siRNA的制备方法，其特征在于，所述冰冻的温度为-80℃～0℃；和/或，
所述解冻融化的温度为20℃-27℃。
6.如权利要求4所述的siRNA的制备方法，其特征在于，所述研磨冻融的步骤重复2-4次。
7.如权利要求4所述的siRNA的制备方法，其特征在于，所述加水研磨后，还包括离心取上清。
8.如权利要求1所述的siRNA的制备方法，其特征在于，所述体外转录获得目的基因的dsRNA的步骤包括：将总RNA反转录得到cDNA，用含有T7启动子的引物扩增所述cDNA，然后进行体外转录，并用核酸酶消化。
9.如权利要求1-8任一项所述的siRNA的制备方法，其特征在于，所述目的基因为Unigene12835，得到的所述siRNA为Unigene12835 siRNA；或者，
所述目的基因为Unigene13423，得到的所述siRNA为Unigene13423siRNA；或者，
所述目的基因为Unigene19308，得到的所述siRNA为Unigene19308siRNA；或者，
所述目的基因为Unigene7122，得到的所述siRNA为Unigene7122 siRNA；或者，
所述目的基因为CL1989.Contig1，得到的所述siRNA为CL1989.Contig1siRNA；或者，
所述目的基因为CL3290.Contig2，得到的所述siRNA为CL3290.Contig2siRNA；或者，
所述目的基因为CL3871.Contig1，得到的所述siRNA为CL3871.Contig1siRNA；或者，
所述目的基因为CL51.Contig3，得到的所述siRNA为CL51.Contig3 siRNA。
10.如权利要求1-8任一项所述的siRNA的制备方法，其特征在于，所述获得siRNA之后，还包括配制成浓度为0.1nmol/L-0.5nmol/L的所述siRNA用于转染。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011508174.0A CN112626152A (zh) | 2020-12-18 | 2020-12-18 | siRNA的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011508174.0A CN112626152A (zh) | 2020-12-18 | 2020-12-18 | siRNA的制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112626152A true CN112626152A (zh) | 2021-04-09 |
Family
ID=75317342
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011508174.0A Pending CN112626152A (zh) | 2020-12-18 | 2020-12-18 | siRNA的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112626152A (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040038278A1 (en) * | 2002-08-12 | 2004-02-26 | George Tzertzinis | Methods and compositions relating to gene silencing |
| US20040259097A1 (en) * | 2001-11-05 | 2004-12-23 | De Backer Marianne Denise | Method for the in vitro synthesis of short double stranded rnas |
| US20070155684A1 (en) * | 2004-01-23 | 2007-07-05 | New England Biolabs, Inc. | Compositions and methods for generating short double-stranded rna using mutated rnase III |
| AU2007214287A1 (en) * | 2000-03-30 | 2007-09-20 | Massachusetts Institute Of Technology | RNA sequence-specific mediators of RNA interference |
| CN101125874A (zh) * | 2007-09-18 | 2008-02-20 | 浙江大学 | 利用研磨法从凝胶中纯化小片段dna的方法和用途 |
| CN102766684A (zh) * | 2012-05-29 | 2012-11-07 | 南昌大学 | 构象差异凝胶电泳检测单核苷酸多态性的方法 |
-
2020
- 2020-12-18 CN CN202011508174.0A patent/CN112626152A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2007214287A1 (en) * | 2000-03-30 | 2007-09-20 | Massachusetts Institute Of Technology | RNA sequence-specific mediators of RNA interference |
| US20040259097A1 (en) * | 2001-11-05 | 2004-12-23 | De Backer Marianne Denise | Method for the in vitro synthesis of short double stranded rnas |
| US20040038278A1 (en) * | 2002-08-12 | 2004-02-26 | George Tzertzinis | Methods and compositions relating to gene silencing |
| US20070155684A1 (en) * | 2004-01-23 | 2007-07-05 | New England Biolabs, Inc. | Compositions and methods for generating short double-stranded rna using mutated rnase III |
| CN101125874A (zh) * | 2007-09-18 | 2008-02-20 | 浙江大学 | 利用研磨法从凝胶中纯化小片段dna的方法和用途 |
| CN102766684A (zh) * | 2012-05-29 | 2012-11-07 | 南昌大学 | 构象差异凝胶电泳检测单核苷酸多态性的方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| DUN YANG: "Short RNA duplexes produced by hydrolysis with Escherichia coli RNase III mediate effective RNA interference in mammalian cells", 《PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA》 * |
| 张赟: "《细胞和分子免疫学实用实验技术》", 30 April 2013, 第四军医大学出版社 * |
| 杨瑾: "《环境、肿瘤和表观遗传学》", 31 May 2014, 军事医学科学出版社 * |
| 郑芳: "《临床分子诊断学》", 3 July 2014, 华中科技大学出版社 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Grimaldi et al. | Non-coding RNAs as a new dawn in tumor diagnosis | |
| Hirota et al. | Genome-wide gene expression profiles of clear cell renal cell carcinoma: identification of molecular targets for treatment of renal cell carcinoma | |
| Bai et al. | Small RNA expression and deep sequencing analyses of the nucleolus reveal the presence of nucleolus-associated microRNAs | |
| CN104673883B (zh) | 用于预测早期非转移性结直肠癌预后的微rna生物标记物及检测方法 | |
| de Felippes et al. | Identification of a transferrable terminator element that inhibits small RNA production and improves transgene expression levels | |
| Ma et al. | Profiling and discovery of novel miRNAs from formalin-fixed, paraffin-embedded melanoma and nodal specimens | |
| Jabandziev et al. | The emerging role of noncoding RNAs in pediatric inflammatory bowel disease | |
| CN105734053B (zh) | 一种高通量测序分析Poly(A)尾长度文库的构建方法 | |
| JP2010519899A (ja) | 肺扁平上皮癌とその他の非小細胞肺癌とを見分けるための方法 | |
| CN109402118B (zh) | 与蛋鸭卵泡发育相关的miRNA apla-mir-145-4及其检测引物、抑制物和应用 | |
| CN111197070A (zh) | 鉴定rna分子中2`-o-甲基化修饰的方法及其应用 | |
| CN103555848B (zh) | 小RNA的3’-5’-qPCR定量检测技术 | |
| CN112626152A (zh) | siRNA的制备方法 | |
| CN111705119A (zh) | 一种检测毛竹环状rna表观遗传修饰的方法 | |
| CN1844403A (zh) | 正反向双启动子植物RNAi双元表达载体 | |
| CN101932708A (zh) | 改进的基因沉默方法 | |
| CN103194441B (zh) | 获取miRNA候选靶基因的方法及其专用反转录引物 | |
| Carbonell | Immunoprecipitation and high-throughput sequencing of ARGONAUTE-bound target RNAs from plants | |
| CN105986020A (zh) | 构建测序文库的方法及装置 | |
| CA2663812A1 (en) | Mir-143 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention | |
| Sun et al. | Cloning and detecting signature microRNAs from mammalian cells | |
| CN112501304A (zh) | miRNA-424作为脑垂体瘤诊断标志物的应用 | |
| CN111206034B (zh) | 猪GADD45a基因的新用途及高表达细胞系的构建和应用 | |
| Shi et al. | Validation of artificial microRNA expression by poly (A) tailing-based RT-PCR | |
| CN117467664B (zh) | 一种靶向鸡mbnl1基因的反义寡核苷酸及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210409 |