NL1026335C2

NL1026335C2 - Werkwijze voor het maken van een dubbelstrengs polyribonucleotidenvolgorde met overhangend uiteinde, alsmede een werkwijze voor het vormen van een dubbelstrengs polynucleotidenconstruct en een toepassing.

Info

Publication number: NL1026335C2
Application number: NL1026335A
Authority: NL
Inventors: Nynke Hester Dekker; Peter Veenhuizen
Original assignee: Univ Delft Tech
Priority date: 2004-06-04
Filing date: 2004-06-04
Publication date: 2005-12-06
Also published as: WO2005118807A1

Description

i 1

Werkwijze voor het maken van een dubbelstrengs polyribonucle-otidenvolgorde met overhangend uiteinde, alsmede een werkwijze voor het vormen van een dubbelstrengs polynucleotiden-construct en een toepassing

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het maken van een dubbelstrengs polyribonucle-otidevolgorde met een overhangend uiteinde.

De laatste jaren wordt steeds meer het belang van 5 dubbelstrengs RNA ingezien, zowel voor wat betreft de rol ervan in de natuur als bij onderzoek en voor de ontwikkeling van geneeskundige behandelingen. Voor diverse toepassingen, zoals RNA-interferentie-experimenten en voor het bouwen van polynucleinezuurconstructen zijn dergelijke dubbelstrengs RNA 10 moleculen van belang. Bij DNA kunnen overlappende, en complementaire, overhangende uiteinden worden gevormd met behulp van restrictie-enzymen, welke in de natuur overvloedig en in een veelvoud van typen worden geleverd. Voor RNA bestaat die luxe niet.

15 Er bestaat derhalve een sterke behoefte aan een techniek waarmee dubbelstrengs RNA met ten minste 1 overhangend uiteinde kan worden gevormd.

De onderhavige uitvinding beoogt een werkwij ze te verschaffen waarmee dergelijk RNA op eenvoudige wijze en on-20 der gebruikmaking van op zich welbekende technieken kan worden gevormd.

Hiertoe wordt de werkwijze volgens de uitvinding gekenmerkt doordat wordt uitgegaan van twee complementaire en-kelstrengs DNA volgorden welke worden aangeduid met eerste 25 DNA volgorde en tweede DNA volgorde - waarbij van een eerste primerpaar dat een eerste primer en een tweede primer omvat de eerste primer met de eerste DNA volgorde met elkaar in contact worden gebracht en de tweede primer in contact wordt gebracht met de met de eerste DNA 30 volgorde complementaire tweede DNA volgorde, waarbij de eerste primer van het eerste primerpaar in staat is om met de eerste DNA volgorde te hybridiseren op een eerste bin-dingslocatie en de tweede primer van het eerste primerpaar 1026335 < » 2 in staat is om met de tweede DNA volgorde te hybridiseren op een tweede bindingslocatie en de tweede primer van het eerste primerpaar homoloog is met een deel van de eerste j. DNA volgorde, welk homologe deel van de eerste DNA volgorde i i 5 5' van de plaats waar de eerste primer van het eerste pri- ί ! merpaar aan de eerste DNA volgorde kan binden is gelegen;

' I I

- waarbij van een tweede primerpaar dat een eerste primer en een tweede primer omvat de eerste primer van het tweede primerpaar en de met de eerste DNA volgorde complementaire 10 tweede DNA volgorde met elkaar in contact worden gebracht, en de tweede primer van het tweede primerpaar in contact wordt gebracht met de eerste DNA volgorde, waarbij de eerste primer van het tweede primerpaar in staat is om met de tweede DNA volgorde te hybridiseren op een derde bin- 15 dingslocatie en de tweede primer van het tweede primerpaar in staat is om met de eerste DNA volgorde te hybridiseren op een vierde bindingslocatie en de eerste primer van het tweede primerpaar homoloog is met een deel van de eerste DNA volgorde, welk homologe deel van de eerste DNA volgorde 20 5' van de plaats waar de tweede primer van het tweede pri merpaar aan de eerste DNA volgorde kan binden is gelegen; waarbij een primer gekozen uit de eerste en tweede primers een primer is welke een primervolgorde en een aan de 5'-zijde daarvan overhangend-uiteindevolgorde omvat; en 25 waarbij de tweede primer van elk primerpaar, indien nodig, aan het 5'-uiteinde ervan is voorzien van een RNA-polymerasevolgorde, - in een eerste amplificatiereactie (I) een DNA polymerase wordt gebruikt voor het onder gebruikmaking van het eerste 30 primerpaar in aanwezigheid van geschikte nucleotideverbin-dingen uitvoeren van een amplificatiereactie; - in een tweede amplificatiereactie (I) een DNA polymerase wordt gebruikt voor het onder gebruikmaking van het tweede primerpaar in aanwezigheid van geschikte nucleotideverbin- 35 dingen uitvoeren van een amplificatiereactie; de reactieproducten van de eerste en tweede amplificatiereactie in contact worden gebracht met een RNA polymerase voor het door transcriptie vormen van een eerste en een tweede ri- 1026335 ' C ι 3 bonucleotidenvolgorde, welke ribonucleotidenvolgorden met elkaar worden gehybridiseerd onder oplevering van de dubbel-strengs polyribonucleotidenvolgorde met overhangend uiteinde.

; : Aangezien de overhangende nucleotidevolgorde vrij 1 15 kan worden gekozen, zowel voor wat betreft de lengte als voor , t ; ; wat betreft de nucleotidensamenstelling, verschaft de onder-' havige uitvinding een uitermate flexibele wijze voor het verschaffen van RNA moleculen van de genoemde soort. De beide amplificatiereacties zullen in separate houders worden uitge-10 voerd.

Teneinde de omschrijving van de uitvinding in de bijgaande conclusies niet nodeloos te compliceren, dient te worden begrepen dat de navolgende situaties integraal deel uitmaken van dè onderhavige uitvinding.

15 Het is niet uitgesloten dat de eerste en tweede volgorde niet volledig complementair zijn, en het volstaat wanneer de geamplificeerde delen toereikend complementair zijn om hybridisatie van de polyribonucleotide-reactieproducten onder de door de gebruiker gewenste omstan-20 digheden mogelijk te maken en/of in stand te houden. In de praktijk zullen de eerste en tweede DNA volgorden volledig identiek zijn, en wordt eenvoudigweg het DNA materiaal waarvan wordt uitgegaan in twee afzonderlijke houders voor het uitvoeren van de amplificatiereacties gebracht. Aan elke hou-25 der wordt een ander primerpaar toegevoegd. Hierbij kan het deel van de primers dat met de eerste DNA volgorde hybridi-seert voor de eerste en tweede houder identiek of verschillend worden gekozen. Hetzelfde geldt voor het deel van de primers die met de tweede DNA volgorde hybridiseren.

30 In de praktijk zal de werkwijze volgens de uitvin ding het meest gebruikt worden voor het maken van een polyri-bonucleinezuur met twee overhangende uiteinden die al dan niet complementair met elkaar zijn. Ook maakt de uitvinding het mogelijk dat een, en slechts een, van de overhangende 35 uiteinden een lengte van nul ribonucleotiden heeft, en er dus sprake is van een dubbelstrengs RNA molecuul met slechts aan een uiteinde een overhangend uiteinde. De omschrijving van de hoofdconclusie zou nodeloos gecompliceerd worden wanneer het 1026335 * · 4 gebruik van de term "overhangend uiteinde" in de onderhavige aanvrage niet ook de mogelijkheid zou omvatten dat van 1 van de twee RNA volgorden de lengte van het overhangende uiteinde nul mag zijn, dus feitelijk niet overhangt.

5 De RNA polymerasevolgorde van de tweede primer is optioneel in die zin dat deze niet nodig is wanneer de betreffende DNA volgorde deze reeds op de gewenste plaats bevat. In de praktijk zal in de meeste gevallen de tweede primer de RNA polymerasevolgorde moeten bevatten.

10 Onder de term "primervolgorde" wordt de volgorde van een primer verstaan die de eerste of tweede DNA volgorden herkent, dat wil zeggen in staat is om daarmee te hybridise-ren voor het uitvoeren van een DNA polymerisatie.

De verschillende stappen van de werkwijze volgens de 15 uitvinding kunnen op verschillende locaties worden uitgevoerd.

Ofschoon in de onderhavige aanvrage wordt gesproken over polyribonucleinezuur, dient aan de term "poly" geen specifiek belang toegekend, in die zin dat het eveneens "oligo" 20 kan betekenen. Elke dubbelstrengs ribonucleinezuurproduct wordt omvat dat onder de door de gebruiker gewenste omstandigheden uitgaande van de enkelstrengs reactieproducten kan hybridiseren of gehybridiseerd blijft.

De dubbelstrengs polyribonucleotidenvolgorde wordt 25 bij voorkeur onderworpen aan een zuiveringsstap. Dit kan zeer geschikt door uitvoeren van elektroforese over een gel. Volgens een voorkeursuitvoering wordt na het uitvoeren van de de transcriptie, bij voorkeur na de hybridisatie, een digestie-behandeling uitgevoerd voor het digesteren van DNA.

30 Dit maakt het verwijderen van DNA eenvoudiger.

Zoals reeds aangegeven heeft de dubbelstrengs poly-ribonucleotidevolgorde volgens de uitvinding bij voorkeur niet 1 maar 2 overhangende uiteinden. Een voorkeursuitvoeringsvorm wordt hierdoor gekenmerkt dat de overhangend-35 uiteindevolgorde van het eerste primerpaar niet complementair is met de overhangend-uiteindevolgorde van het tweede primerpaar .

Aldus kan worden voorkomen dat de uiteinden van 1 1026335 * · 5 dubbelstrengs RNA molecuul, dat volgens de uitvinding is gevormd, met elkaar hybridiseren en het aldus minder beschikbaar maken voor ligateren aan andere polynucleotidenmolecu-len. Verder kan, door gebruik van niet-complementaire uitein-5 den, een precieze oriëntatie van het dubbelstrengs RNA molecuul aan een ander dubbelstrengs polynucleotidenmolecuul worden verzekerd.

De onderhavige uitvinding maakt het mogelijk om een dubbelstrengs polyribonucleotidenvolgorde te maken waarvan 10 een streng aan zowel de 3' zijde als aan de 5' zijde overhangende uiteinden bezit. Deze interessante uitvoeringsvorm wordt hierdoor gekenmerkt dat van één primerpaar beide primers van een, identieke of verschillende, overhangenduitein-devolgorde bevatten.

15 De onderhavige uitvinding heeft tevens betrekking op een werkwijze voor het maken van een dubbelstrengs polynucle-otiden-construct.

Deze werkwijze wordt gekenmerkt dat de dubbelstrengs polyribonucleotidenvolgorde volgens de uitvinding met een 20 overhangend uiteinde wordt geligateerd aan een dubbelstrengs polynucleotidenvolgorde, welke dubbelstrengs polynucleotiden-volgorde een complementair overhangend uiteinde bezit.

Aldus kunnen naar believen RNA-RNA en RNA-DNA constructen worden gevormd. In dit verband moet worden opgemerkt 25 dat het complementaire overhangende uiteinde van de dubbelstrengs polynucleotidenvolgorde niet volledig complementair hoeft te zijn, zolang als voldoende hybridisatie mogelijk is om ligatie mogelijk te maken.

Tenslotte heeft de uitvinding betrekking op een toe-30 passing van een dubbelstrengs polyribonucleotidenvolgorde gemaakt volgens de uitvinding voor het transformeren van een cel.

De cel kan, zoals duidelijk zal zijn, een prokaryote of eukaryote cel zijn. De cel kan tevens deeluitmaken van een 35 meercellig organisme, zoals een zoogdier.

De onderhavige uitvinding zal thans worden toegelicht aan de hand van een uitvoeringsvoorbeeld en de tekening, waarin 1026335 4 · 6

Fig. 1 een schematisch toont hoe een dubbelstrengs RNA molecuul kan worden gevormd met twee 3' -overhangende uiteinden;

Fig. 2 in hoofdzaak overeenkomt met Fig. 1 en be-, 5 schrijft hoe een dubbelstrengs RNA molecuul kan worden ge- ; vormd met twee 5'-overhangende uiteinden.

' ' Fig. 1 toont schematisch hoe met behulp van de werk wijze een dubbelstrengs RNA molecuul 16 kan worden gevormd.

In het hier beschreven voorbeeld heeft het dubbelstrengs RNA 10 molecuul twee overhangende uiteinden, meer specifiek twee 3' overhangende uiteinden.

Bij dit voorbeeld wordt uitgegaan van dubbelstrengs DNA 17 dat in twee porties wordt gesplitst (stap I). Elke portie wordt op in 'hoofdzaak dezelfde wijze behandeld, en el-15 ke portie levert een enkelstrengs RNA molecuul 15', 15'' op, welke enkelstrengs RNA moleculen 15', 15'' met elkaar worden gehybridseerd onder oplevering van het gewenste dubbelstrengs RNA molecuul 16.

Het dubbelstrengs DNA 17 bezit een eerste DNA volg-20 orde (of streng) 1, en een tweede DNA volgorde 2. Deze strengen worden, afhankelijk van welke portie zij uitmaken, aangeduid met een enkel of een dubbel accent. Bij dit voorbeeld zijn de eerste DNA volgorden 1' en 1'' dus identiek. Hetzelfde geldt voor de tweede DNA volgorden 2' en 2''.

25 Om enkelstrengs RNA moleculen 15 te maken wordt, in het hier beschreven uitvoeringsvoorbeeld, eerst een PCR reactie uitgevoerd (stap II; PCR 1 en PCR 2). Deze wordt bijvoorbeeld uitgevoerd onder gebruikmaking van een Mastercycler (Eppendorf, Hamburg, Duitsland). Hierbij wordt gebruik ge-30 maakt van een eerste primerpaar (met primers 3, 4) en een tweede primerpaar (met primers 8, 9). Voor een goed begrip van de term primer zoals gebruikt binnen de onderhavige aanvrage wordt het volgende opgemerkt. Voor een DNA amplificatie is een oligonucleotidenvolgorde nodig die met DNA hybridi-35 seert, en welke een DNA polymerase kan gebruiken voor ketenverlenging. Deze oligonucleotidenvolgorde kan worden aangeduid als de feitelijke primer. Voor het maken van een RNA molecuul met 3' overhangende uiteinden moet de feitelijke pri- 1026335 4 · 7 mer (weergegeven als een zwart blok van primers 3, 4, 8, 9) zijn voorzien van een extra volgorde 18 respectievelijk 19 voor de primers 3, 8, en van een volgorde voor het mogelijk i maken van transcriptie (horizontaal gestreepte rechthoek aan-' 'S gegeven met T7) . Deze laatste volgorde is voor het maken van , ; 3' overhangende uiteinden optioneel mits de DNA nucleotiden- volgorden de benodigde RNA promotorvolgorde verschaffen. Als dat niet het geval is, zijn de primers 4, 9 van de RNA promo-torvolgorden 13 voorzien.

10 Om te voorkomen dat de twee G nucleotiden die in de T7 promotor (aangegeven met een horizontaal-gestreepte rechthoek) aanwezig zijn deel gaan uitmaken van de overhang, wordt er zorg voor gedragen dat zich aan de 3' zijde van RNA molecuul 15' twee C nucleotiden bevinden. Hiertoe zijn er bij PCR 15 1 in primer 3 twee G nucleotiden aanwezig. Aldus kan het 5' uiteinde van RNA molecuul 15" (dat voor T7 RNA polymerase (stap III) altijd begint met twee G's) hybridiseren met de twee C nucleotiden van RNA molecuul 15', en maken zij dus geen deel uit van de overhang. De tweede primers 4, 9 zijn 20 voorzien van een herkenningsvolgorde 13 voor T7 RNA polymerase. Vanzelfsprekend kunnen voor de porties verschillende RNA polymerasen en dus ook verschillende herkenningsvolgorden 13 worden toegepast.

De volgorden 18, 19 kunnen complementair zijn, zoals 25 dat bij dubbelstrengs DNA verkregen met restrictie-enzymen gebruikelijk het geval is, maar met de werkwijze volgens de uitvinding heeft de vakman vrije keuze voor wat betreft lengte en nucleotidensamenstelling van deze volgorden 18 en 19. Zoals eerder aangegeven omvat de onderhavige uitvinding ook 30 het geval waarbij 1 (en slechts 1) van deze lengten 0 nucleotiden lang is.

Na de PCR reacties, onder gebruikmaking van een geschikte DNA polymerase zoals Pfu DNA polymerase en nucleotiden, wordt een DNA reactieproduct 14', 14" verkregen. Onder 35 gebruikmaking van T7 RNA polymerase en nucleotiden worden en-kelstrengs RNA strengen 15', 15" verkregen. De transcriptie-richting is met pijlen aangegeven.

Voor het vormen van het gewenste dubbelstrengs RNA

1026335 i * 8 16 (stap IV) kan eenvoudig worden verwarmd tot een denaturerende temperatuur, van bijvoorbeeld 65°C. Afkoelen levert dan het gewenste dubbelstrengs RNA product op.

Het is in de praktijk gunstig om het aanwezige DNA 5 te verwijderen. Dit gaat gemakkelijk met een DNase, zoals DNase I. Daarenboven of in plaats daarvan kan een zuivering worden uitgevoerd door middel van gel-elektroforese.

Van transcriptie is bekend dat dit proces niet 100% betrouwbaar is. Het geniet dan ook de voorkeur gebruik te ma-10 ken van in het vak bekende technieken om deze betrouwbaarheid te vergroten. Hierbij kan in het bijzonder worden verwezen naar Kao et al, RNA 5, blz. 1268-1272 (1999).

In Fig. 2 is het maken van een dubbelstrengs RNA product 16 weergegeven, waarbij het resulterende RNA product 15 16 twee 5' overhangende uiteinden heeft. De werkwijze komt in wezen overeen met de werkwijze zoals beschreven voor Fig. 1. Echter, nu bevinden de overhangenduiteindevolgorden 18, 19 zich tussen de feitelijk met de DNA strengen hybridiserende primerdelen en de voor T7 RNA polymerase benodigde volgorde 20 13.

De werkwijze kan op diverse wijzen binnen het kader van de uitvinding worden gevarieerd. Zo kan bijvoorbeeld een dubbelstrengs RNA molecuul worden gevormd waarvan 1 streng aan zowel de 3' zijde als de 5' zijde een overhangend uitein-25 de bezit. Het is voor de gewone terzake kundige duidelijk dat voor het inbouwen van de met behulp van de werkwijze volgens de uitvinding gevormde RNA moleculen in andere dubbelstrengs polynucleotidenmoleculen aanvullende behandelingen nodig kunnen zijn, zoals fosforylering en defosforylering. Een oc-30 trooipublicatie is immers slechts bedoeld voor het beschrijven van een uitvinding en niet als algemene opleiding tot vakman, om welke reden degenen die niet deze kennis en kunde van de gewone terzake kundige bezitten wordt verwezen naar handboeken (zoals Molecular Cloning van Sambrook et al., Cold 35 Spring Harbor Laboratory Press) en een relevante universi-teit.

De dubbelstrengs RNA moleculen volgens de onderhavige uitvinding zijn voor diverse toepassingen bruikbaar. Juist 1026335 * » 9 met de werkwijze volgens de uitvinding gemaakte dubbelstrengs RNA volgorden zijn, beter dan RNA volgorden gemaakt met andere technieken, bruikbaar voor digestie met een Dicer enzym [ I voor gebruik bij RNA interferentie-experimenten, alsmede de 1 ‘5 bereiding van op RNA interferentie gebaseerde farmaceutische I , I ’ ,; : preparaten en therapieën. Voor RNA interferentie genieten dubbelstrengs RNA nucleotidenvolgorden met een 3' overhangend uiteinde de voorkeur.

1026335

Claims

1. Werkwijze voor het maken van een dubbelstrengs polyribonucleotidenvolgorde met overhangend uiteinde, met het kenmerk, dat hiertoe wordt uitgegaan van twee complementaire 5 enkelstrengs DNA volgorden (1, 2), welke worden aangeduid met eerste DNA volgorde (1', 1") en tweede DNA volgorde (2', 2·' ) - waarbij van een eerste primerpaar dat een eerste primer (3) en een tweede primer (4) omvat de eerste primer (3) met de 10 eerste DNA volgorde (1') in contact worden gebracht en de tweede primer (4) in contact wordt gebracht met de met de eerste DNA volgorde (1') complementaire tweede DNA volgorde (2), waarbij de eerste primer (3) van het eerste primerpaar in staat is om met de eerste DNA volgorde (1') te hybridi-15 seren op een eerste bindingslocatie (5) en de tweede primer (4) van het eerste primerpaar in staat is om met de tweede DNA volgorde (2') te hybridiseren op een tweede bindingslocatie (6) en de tweede primer (4) van het eerste primerpaar homoloog is met een deel (7) van de eerste DNA volgorde 20 (1'), welk homologe deel (7) van de eerste DNA volgorde (1) 5' van de plaats (5) waar de eerste primer (3) van het eerste primerpaar aan de eerste DNA volgorde (1') kan binden is gelegen; - waarbij van een tweede primerpaar dat een eerste primer (8) 25 en een tweede primer (9) omvat de eerste primer (8) van het tweede primerpaar en de met de eerste DNA volgorde (1'') complementaire tweede DNA volgorde (2'') met elkaar in contact worden gebracht, en de tweede primer (9) van het tweede primerpaar in contact wordt gebracht met de eerste DNA 30 volgorde (1''), waarbij de eerste primer (8) van het tweede primerpaar in staat is om met de tweede DNA volgorde (2'') te hybridiseren op een derde bindingslocatie (10) en de tweede primer (9) van het tweede primerpaar in staat is om met de eerste DNA volgorde (1") te hybridiseren op een 35 vierde bindingslocatie (11) en de eerste primer (8) van het tweede primerpaar homoloog is met een deel (12) van de eer- Ί026335 4. · ste DNA volgorde (1"), welk homologe deel (12) van de eerste DNA volgorde (1'') 5' van de plaats (11) waar de tweede primer (9) van het tweede primerpaar aan de eerste DNA volgorde (1'') kan binden is gelegen; 5 waarbij een primer gekozen uit de eerste en tweede primerpa-ren (3, 4, 8, 9), een primer is welke een primervolgorde en een aan de 5'-zijde daarvan overhangend-uiteindevolgorde omvat; en waarbij de tweede primer van elk primerpaar, indien nodig, 10 aan het 5'-uiteinde ervan is voorzien van een RNA-polymerasevolgorde (13), - in een eerste amplificatiereactie (I) een DNA polymerase wordt gebruikt voor het onder gebruikmaking van het eerste primerpaar in aanwezigheid van geschikte nucleotideverbin- 15 dingen uitvoeren van een amplificatiereactie; - in een tweede amplificatiereactie (I) een DNA polymerase wordt gebruikt voor het onder gebruikmaking van het tweede primerpaar in aanwezigheid van geschikte nucleotideverbin-dingen uitvoeren van een amplificatiereactie; 20 de reactieproducten (14', 14'') van de eerste en tweede amplificatiereactie in contact worden gebracht met een RNA polymerase voor het door transcriptie vormen van een eerste (15') en een tweede (15"-) ribonucleotidenvolgorde, welke ri-bonucleotidenvolgorden (15', 15") met elkaar worden gehybri-25 diseerd onder oplevering van de dubbelstrengs polyribonucleo-tidenvolgorde (16) met overhangend uiteinde.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat na de transcriptie met RNA polymerase een digestiebehan-deling wordt uitgevoerd voor het digesteren van DNA.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het ken merk, dat de overhangend-uiteindevolgorde van het eerste primerpaar niet complementair is met de overhangend-uiteindevolgorde van het tweede primerpaar.

4. Werkwijze volgens een der voorgaande conclusies, 35 met het kenmerk, dat van één primerpaar beide primers van een, identieke of verschillende, overhangenduiteindevolgorde bevatten.

5. Werkwijze voor het maken van een dubbelstrengs 1026335 I * polynucleotiden-construct, met het kenmerk/ dat de dubbel-strengs polyribonucleotidenvolgorde (16) met een overhangend uiteinde bereid volgens een van de conclusies 1 tot 4 wordt geligateerd aan een dubbelstrengs polynucleotidenvolgorde/ , ' £ welke dubbelstrengs polynucleotidenvolgorde een complementair : ; overhangend uiteinde bezit.

6. Toepassing van een dubbelstrengs polyribonucleotidenvolgorde gemaakt volgens een van de conclusies 1 tot 5 voor het transformeren van een cel.