JP2004532030A - 疾病用酵素とｓｎｐマーカー - Google Patents

疾病用酵素とｓｎｐマーカー Download PDF

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Abstract

【課題】
【解決手段】本発明は、新規タンパク質をコードする単離された核酸配列であって、前記タンパク質がペプチダーゼ活性を有する酵素のファミリーの新規構成員である核酸配列に関する。医療や研究における核酸配列及び／又はタンパク質の使用、疾病に対する素因を診断し又は決定する方法、疾病を予防又は治療する方法、前記方法で使用するためのキット、炎症性疾患の治療又は予防における及び新規阻害剤を同定するためのスクリーニングにおけるそれらの核酸配列、タンパク質、及び阻害剤の使用も提供される。核酸発現ベクター、宿主細胞、スクリーニング、及びヒト以外のトランスジェニック動物も提供される。

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規タンパク質をコードする単離された核酸配列であって、前記タンパク質が、ペプチダーゼ活性を有する酵素ファミリーの新規構成員である核酸配列に関する。前記核酸配列及び／又はタンパク質の医療及び研究における使用、疾病に対する素因を診断又は決定する方法、疾病を予防又は治療する方法、前記方法で使用するためのキット、並びに炎症性疾患の治療又は予防における及び新規阻害剤を同定するためのスクリーニングにおける前記核酸配列、タンパク質、及びそれらの阻害剤の使用も提供する。核酸発現ベクター、宿主細胞、スクリーニング、及びヒト以外のトランスジェニック動物も提供する。
【背景技術】
【０００２】
喘息、湿疹、及び花粉症等の疾病では、ありふれたアレルゲンに対してＩｇＥを介した反応が起こるのが通例である。これらの疾病は、「アトピー（ａｔｏｐｉｃ）」として知られている。これらの病気は患者数が増加しており、現在、全ての先進国で主要な障害の原因となっている。これらの疾病は、遺伝的な機序と環境的な機序が複雑に作用し合うことによって発症する。吸入された一般的なタンパク質（アレルゲンと呼ばれる）に対して、激しいＩｇＥ反応が長期にわたって起こることが、アトピー状態の特徴である。アトピーには、血清総ＩｇＥ濃度の上昇とアレルギーに対して特異的なＩｇＥの存在とが伴う。この特異的なＩｇＥは、ＥＬＩＳＡその他の技術によって、血清中で直接測定することができる。また、皮膚表面への穿刺から微量のアレルゲンを導入する穿刺皮膚試験によって検出することも可能であり、アトピーの個体は検査に対して反応し、皮膚表面上に膨疹が現れる。
【０００３】
喘息は、児童及び青年の主たる病因であって、その数は増加している。喘息は、小児の病気の中で最も多い病気であり、強い環境要因と遺伝的要因との相互作用によって生じる。喘息は、断続的な粘膜の炎症、喘鳴、及び息切れによって確認できる。
【０００４】
喘息は、標準的な問診票や医師の診断によって、疫学的に確認されるのが通常である。医師が診断し、問診票によって確定された喘息は、６０−７０％が遺伝性のものである。喘息への連鎖及びこれに関連する表現型が、２番染色体上のＩＬ１クラスターの近傍に存在することが実証されている。アトピーへの連鎖と喘息に関連する表現型とをゲノム全体にわたってスキャンすることによって、「喘鳴」と関連するＩＬ−１複合体の近くに、染色体２ｑ１４上のマーカーＤ２Ｓ１６０が同定された（ｐ−０．００１）。この領域はＩＬ１とその相同体を含有しているので、喘息とＩＬ１クラスター遺伝子中に存在する公知のＳＮＰとの関連について、この領域が調べられた。予測に反して、１１２２人の個体と３８１人の喘息患者を含む計２４６の家族で、これらの公知の多型に対して関連は見出されなかった。しかしながら、喘息とＤ２Ｓ３０８マイクロサテライトの対立遺伝子（ＩＬ１遺伝子からおよそ１Ｍｂの距離にある）との間には、再現性のある関連が存在することが明らかとなった。
【０００５】
喘息に対する個体の素因を決定する遺伝的因子は、遺伝子の発現レベルや機能を変化させるＤＮＡ構造のバリアント（多型）であると考えられる。特定の部位「座位（ｌｏｃｕｓ）」に位置するＤＮＡ配列のバリアントは、「対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）」として知られている。
【０００６】
疾病を引き起こす対立遺伝子は、同じ染色体のセグメントに由来する非機能的な多型と連鎖不均衡にあるものと思われる。従って、病状の基礎を成す正確な多型と遺伝子を同定することなく、ある染色体セグメントから、疾病との対立遺伝子関連を検出することが可能となる。
【０００７】
従って、対立遺伝子関連の検出によって、ある個体の疾病に対する感受性についての情報が得られる可能性がある。さらに、対立遺伝子関連は、当該対立遺伝子の何れかの方向の、限られたＤＮＡの距離（５０−５００Ｋｂ）の中に発病遺伝子のエキソンが存在することを示すものである。
【０００８】
喘息、又はアトピーとの連鎖不均衡に遺伝的多型を同定することによって、かかる疾病が発症する前（例えば、出生直後）に、このような疾病に対して子供がリスクを有していることを明らかにし、疾病を予防することができるであろう。ある多型又は多型の組み合わせが存在することによって、病気の臨床的経過（例えば、軽症ではなく重症であるなど）又はある治療に対する反応が予測されよう。この診断情報は、ヘルスケア、医薬、及び保険業界にとって有用であると思われる。
【０００９】
オリゴペプチダーゼは、小さなポリペプチド又はオリゴペプチドのみに作用するエンドペプチダーゼである。これらの酵素は、ペプチドメッセンジャー分子の修飾又は破壊等の特化した重要な生物機能を遂行する。オリゴペプチダーゼには天然の阻害剤がほとんど存在せず、その顕著な特異性のために、大多数のエンドペプチダーゼとは異なり、α２−マクログロブリンとは相互作用しない。プロリル−オリゴペプチダーゼファミリーＳ９（酵素命名委員会ＥＣ３．４．１４．５）、サブファミリーＳ９Ｂに属するものとしては、ＤＰＰ４、ＤＰＰ６、ＤＰＰ８、及びＤＰＰ９などがある。Ｓ９ファミリーには、比較的厳格な多岐にわたる基質特異性を有するセリンプロテアーゼが含まれる。Ｓ９ペプチダーゼは、可溶性タンパク質、細胞質タンパク質、又はＩＩ型膜結合膜内タンパク質の何れかであって、プロ酵素として存在するのではなく、活性な型として合成される。ＤＰＰ４、ＤＰＰ６、ＤＰＰ８、及びＤＰＰ９には、活性部位三連構造Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｈｉｓが同定されているが、触媒活性を有すると考えられているセリン残基が、ＤＰＰ６ではアスパラギン酸に、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ＣＧ９０５９ではグリシンに置換されている。このファミリーに属することが知られているものは全て、これらの残基が、カルボキシル末端の１３０残基以内にある。プロリル−オリゴペプチダーゼファミリーの構成員は全て、保存された７アミノ酸のモチーフＤＷ（Ｖ／Ｉ／Ｌ）ＹＥＥＥを予想されるβ−プロペラドメインの中に含有している。この保存されたモチーフの中に存在するグルタミン酸残基のうちの二つは、セリンプロテアーゼ酵素活性に不可欠であることが示されている。Ｓ９ファミリーのうち膜結合型のものは、アミノ末端の近傍に膜貫通ドメインを含有している。プロリルオリゴペプチダーゼは、ジペプチド配列Ａｌａ−Ｐｒｏ又はＧｌｙ−Ｐｒｏに隣接したＣ末端ペプチド結合を切断するために必要とされる。これらの酵素の基質には、ケモカイン、成長因子、並びに神経及び血管作用性ペプチドがある。ある種の細胞表面ペプチダーゼは、免疫細胞の特異抗原として同定されている。これらには、ＤＰＰ４（ＣＤ２６）、中性エンドペプチダーゼ（ＣＤ１０）、及びアミノペプチダーゼＮ（ＣＤ１３）が含まれる。これらの細胞表面抗原は、免疫細胞の分化において重要な役割を果たしている。プロリル−オリゴペプチダーゼは、炎症プロセスの間に、Ｔｈ１／Ｔｈ２（Ｔ−ヘルパー細胞）のバランスを変化させる上でも役割を果たしていると推測されている。ＤＰＰ４（ＣＤ２６）は、ペプチダーゼ活性に加えて、多機能の特性を有していることが示されている。
【００１０】
提案されている構造に基づいて、ＤＰＰ４（ＣＤ２６）は、多機能タンパク質であると予測されており、その触媒ドメインの外側で、幾つかのタンパク質と相互作用することが示されている。ＤＰＰ４（ＣＤ２６）は、コラーゲンとフィブロネクチンの両方に対する接着受容体であり、ラットモデルにおいて、乳癌細胞の肺への定着（主にフィブロネクチンの結合を通じて媒介される効果）を仲介することが示されている。ＤＰＰ４（ＣＤ２６）は、アデノシンデアミナーゼ（アデノシンをイノシンに代謝する酵素）も結合することができる。ＤＰＰ４／ＡＤＡ複合体が細胞表面に位置することが、その受容体に近接するアデノシンの有効濃度を制御する重要な機序である。アデノシンは、Ａ２ａＧタンパク質に共役した受容体との相互作用を介してＴ細胞の活性化を抑制する。従って、アデノシンは、ＡＤＡ欠損によって引き起こされる抑制において重要な役割を果たしている。
【００１１】
ＤＰＰ４（ＣＤ２６）は、ＣＤ４５（タンパク質チロシンホスファターゼ）との相互作用を介したＴ細胞シグナル伝達においても重要な役割を果たしている。ＤＰＰ４（ＣＤ２６）の相手となる受容体は未だ同定されていないが、ＤＰＰ４（ＣＤ２６）の抗体との架橋により、Ｔ細胞の活性化に重要であることが知られている数多くの分子（Ｐ５６Ｉｃｋ、Ｐ５９ｆｙｎ、及びＺＡＰ−７０等）のチロシンリン酸化を誘導する。
【００１２】
Ｓ９Ｂプロリルオリゴペプチダーゼのうち、ＤＰＰ６の相同体がＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、及びＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓからクローニングされている。ＤＰＰ６は、選択的ｍＲＮＡスプライシングと、おそらくは異なる（組織特異的）プロモーターの使用の結果、二つの異なるイソフォーム（ＤＰＰＸ−ＳとＤＰＰ−Ｌ）として存在することが報告されている。ＤＰＰＸ−ＳとＤＰＰＸ−Ｌは、異なる組織発現を示す。二つの型の細胞質ドメインが異なるものであると仮定すれば、このことが、膜間シグナル伝達システムが相違する原因となっている可能性がある。ＤＰＰ６は検出可能な触媒活性を有していないが、これは触媒活性を有する三連構造中のセリンがアスパラギン酸に置換されているためである可能性が最も高い。インビトロでの変異導入によってアスパラギン酸をセリンに置き換えても、触媒活性は復活しなかった。
【００１３】
現在まで、喘息やアトピー等の炎症性疾患に対する様々なマーカーが同定されており、このような疾病にリスクを有する人々を明らかにするために使用されてきた。しかしながら、その活性が炎症性疾患の根幹を成す可能性がある遺伝子とこのようなマーカーとを関連付けることには成功していない。この遺伝子の同定により、価値のある診断、治療、及び研究ツールを与えることが可能となるであろう。
【００１４】
本発明の第一の側面によれば、図４に示された配列を含む単離された核酸配列、若しくは図１０及び／又は図４に記載された一以上のエキソン配列が除去された図４に示された配列であって一以上の前記エキソン配列が一以上の代替的エキソン配列（ａｌｔｅｒｎａｔｅ ｅｘｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）若しくは図９から得られる一以上の肝臓クローン配列で置換された配列、若しくはこれらに相補的な配列、若しくはこれらに実質的に相同な配列、又はそれらの断片が提供される。図４の配列は、ヒトＤＰＰ１０ ｍＲＮＡ配列である。図４には、図１０に示されているエキソンが一つにまとめられている。代替的エキソンは図９に示されている。選択的エキソン（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｅｘｏｎ）は異なる文字で表されており、例えば、エキソン１ａ、１ｂ等は、エキソン１の代替的配列である（エキソン２Ａ、２Ｂ等も同様）。エキソンの大文字と小文字の表記には、さしたる意味はない。図４の代替的転写物（ａｌｔｅｒｎａｔｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）は、図６に模式的に描かれている。さらに、図５ａに示されている配列、及び又は一以上のエキソンが欠落した図５ａに示されている配列、又は一以上のエキソンが図８の代替的エキソンで置換されている図５ａに示されている配列を含む単離された核酸配列が提供される。図７には、マウス転写物、若しくはこれと相補的な配列若しくはこれと実質的に相同な配列、又はそれらの断片の模式図が示されている。図５ａの配列は、マウスＤＰＰ１０ ｃＤＮＡ配列である。マウスＤＰＰ１０ ｍＲＮＡ配列は、図５に示されている。
【００１５】
ＤＰＰ１０核酸配列は、１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ、１ｆ、１ｇ、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅ、２ｆ、２ｇ、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５から得られる一以上のエキソン、若しくは肝臓クローン１、２、若しくは３の配列、若しくは実質的にこれらに相同な配列、又はそれらの断片を任意の組み合わせで含むことができる。これらの組み合わせは、ヒト及びマウスを含む全てのＤＰＰ１０配列（但し、マウスのエキソンは、１ｆ又は１ｇを含まない）に対するものである。
【００１６】
以下の単離された核酸配列は、第一の側面の一部である。
【００１７】
ＤＰＰ１０のエキソン（例えば、図６、７、８、９、１０、又は１５に示されたエキソン）を一以上含む単離された核酸、又は図２Ｃに示されている配列、これらと相補的な配列若しくはこれらと実質的に相同な配列、又はそれらの断片が提供される。
【００１８】
図２ａのエキソン配列を含む単離された核酸配列、又はこれらと相補的な配列若しくはこれらと実質的に相同な配列が提供される。
【００１９】
エキソン１ａ及びエキソン２乃至２５を含む単離された核酸配列、これらと相補的な配列若しくはこれらと実質的に相同な配列、又はそれらの断片（転写物１）が提供される、図１０。
【００２０】
エキソン１ｂ、１ｃ、及びエキソン２乃至２５を含む単離された核酸配列、これらと相補的な配列若しくはこれらと実質的に相同な配列、又はそれらの断片（転写物２）が提供される、図９及び１０。
【００２１】
エキソン１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ及びエキソン２乃至２５を含む単離された核酸配列、これらと相補的な配列若しくはこれらと実質的に相同な配列、又はそれらの断片（転写物３）が提供される、図９及び１０。
【００２２】
エキソン１ｆ及びエキソン２乃至２５を含む単離された核酸配列、若しくはこれらと相補的な配列若しくはこれらと実質的に相同な配列、又はそれらの断片（転写物４）が提供される、図９及び１０。
【００２３】
エキソン１ｇ及びエキソン２乃至２５を含む単離された核酸配列、若しくはこれらと相補的な配列若しくはこれらと実質的に相同な配列、又はそれらの断片（転写物５）が提供される、図９及び１０。
【００２４】
エキソン１ａ及び２Ａを含む単離された核酸配列、若しくはこれらと相補的な配列若しくはこれらと実質的に相同な配列、又はそれらの断片（転写物６）が提供される、図９及び１０。
【００２５】
エキソン１ｂ、１ｃ、２Ｂを含む単離された核酸配列、若しくはこれらと相補的な配列若しくはこれらと実質的に相同な配列、又はそれらの断片が提供される、図９及び１５。
【００２６】
エキソン１ｂ、１ｃ、２Ｃを含む単離された核酸配列、若しくはこれらと相補的な配列若しくはこれらと実質的に相同な配列、又はそれらの断片が提供される、図９及び１５。
【００２７】
エキソン１ｂ、１ｃ、２Ｄを含む単離された核酸配列、若しくはこれらと相補的な配列若しくはこれらと実質的に相同な配列、又はそれらの断片が提供される、図９及び１５。
【００２８】
エキソン１ｂ、１ｃ、２Ｅを含む単離された核酸配列、若しくはこれらと相補的な配列若しくはこれらと実質的に相同な配列、又はそれらの断片が提供される、図９及び１５。
【００２９】
エキソン１ｂ、１ｃ、２Ｆを含む単離された核酸配列、若しくはこれらと相補的な配列若しくはこれらと実質的に相同な配列、又はそれらの断片が提供される、図９及び１５。
【００３０】
ＤＰＰ１０のマウスのエキソン（例えば、図５、５ａ、７、又は８に示されているエキソン）を一以上含む単離された核酸配列、若しくはこれらと相補的な配列若しくはこれらと実質的に相同な配列、又はそれらの断片が提供される。
【００３１】
マウスエキソン１ａ及びエキソン２乃至２５を含む単離された核酸配列、若しくはこれらと相補的な配列若しくはこれらと実質的に相同な配列、又はそれらの断片（マウス転写物１）が提供される、図５ａ、７、及び８。
【００３２】
マウスエキソン１ｃ、１ｄ、及びエキソン２乃至２５を含む単離された核酸配列、若しくはこれらと相補的な配列若しくはこれらと実質的に相同な配列、又はそれらの断片（マウス転写物２）が提供される、図７、及び８。
【００３３】
マウスエキソン１ｅ及びエキソン２乃至２５を含む単離された核酸配列、又はこれらと相補的な配列若しくはこれらと実質的に相同な配列、又はそれらの断片（マウス転写物３）が提供される、図７、及び８。
【００３４】
マウスエキソン１ｂ、１ｃ、１ｄ、及びエキソン２乃至２５を含む単離された核酸配列、若しくはこれらと相補的な配列若しくはこれらと実質的に相同な配列、又はそれらの断片（マウス転写物４）が提供される、図７及び８。
【００３５】
ＤＰＰ１０のプロモーター配列：コンセンサスパリンドロームのＩＦＮ−γ活性化部位（ＧＡＳ）エレメントは、エキソン１ｂの上流にある１８１８１の塩基対と同定された。ＧＡＳ部位には、下線が施されている。イタリック体で表されているのは、他の重要なプロモーターモチーフ（ＣＡＴＴボックスとＴＡＴＡボックス）である。
【００３６】
ＣＣＡＴＴＣＴＣＴＴＴＧＴＴＴＴＴＡＴＴＣＧＧＧＡＴＧＣＴＣＴＴＡＴＴＴＣＣＡＡＧＡＡＧＧＣＴＴＡＴＡＡＡ
このモチーフは、ＣＤ２６／ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ４）遺伝子（プロリルオリゴペプチダーゼＳ９Ｂサブファミリーの一員）のプロモーター中にも存在する。インターフェロン（ＩＦＮｓ、α、β、及びγ）とトランスレチノイン酸（ＲＡ）は、ＧＡＳ部位を有する遺伝子を活性化する能力を有している。
【００３７】
本発明の全ての配列は単離するか、あるいは組換えることができる。単離される（ｉｓｏｌａｔｅｄ）とは、精製された核酸又はポリペプチド配列であって、他のタンパク質や核酸が実質的に存在しない核酸又はポリペプチドを意味する。このような配列は、ＰＣＲ増幅、クローニング技術、又は合成機による合成によって取得することができる。「組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）」とは、ヒトの手によって組換えられた核酸配列を意味する。
【００３８】
本発明のポリヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ、又はＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡ若しくはＰＮＡであり得る。本発明において、遺伝子産物には、ポリヌクレオチド配列とタンパク質が含まれる。ポリペプチド配列という場合、タンパク質とペプチドが含まれる。
【００３９】
本出願において、相補的又は実質的に相同な配列とは、ストリンジェントな条件下で、所定の配列又はその遺伝子産物にハイブリダイズする配列である。従って、例えば、基本となる核酸に対して実質的に相同な核酸配列は、ストリンジェントな条件下で、前記基本となる核酸の遺伝子産物（すなわち、ｍＲＮＡ）にハイブリダイズすることが可能であろう。相補的な配列とは、ストリンジェントな条件下で、前記核酸配列自体にハイブリダイズすることができる配列である。本発明では、実質的に相同な配列の相補物（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）も提供される。実質的に相同な配列は、好ましくは、所定の配列と少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は１００％の配列同一性を有する。実質的に相同（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）という定義は、核酸とポリペプチド配列の両者に当てはまる。このため、構造又は機能に影響を与えない保存的なアミノ酸置換を有するポリペプチド配列も含まれる。全てのＤＮＡ配列について、相補的配列という場合、対応するｍＲＮＡ配列及びこのようなＲＮＡ配列に基づいて得られたあらゆるｃＤＮＡ配列が含まれる。
【００４０】
「％同一性」とは、二つの核酸又はポリペプチド配列を比較することによって決定される、二つの核酸又はポリペプチド配列間の関係の指標である。一般的には、配列間で最大の相関が得られるように、比較すべき二つの配列を並列する。二つの配列のアラインメントを調べ、アミノ酸又はヌクレオチドが正確に対応する位置の数を求めて、アラインメントの全長で除し、結果に１００を乗じて％同一性を得る。％同一性は、比較すべき配列の全長にわたって測定してもよいし（長さが同一又は類似した配列の場合や相同性が高度な場合に特に適する）、これより短い所定の長さに対して測定してもよい（長さが等しくない配列や相同性が低い配列の場合に適する）。
【００４１】
二以上の配列の同一性を比較する方法は、本分野において公知である。例えば、Wisconsin Sequence Analysis Package version 9.1(Devereux J et al., Nucl Acid Res 12 387-395 (1984), available from Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin, USA)で入手できるＢＥＳＴＦＩＴやＧＡＰなどのプログラムを用いることができる。
【００４２】
ＢＥＳＴＦＩＴは、ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎの「局所的相同性」アルゴリズム（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ、２：４８２−４８９、１９８１）を用いており、２つの配列の間で最も類似性の高い領域を一つ見出す。ＢＥＳＴＦＩＴは、長さが異なる２つのポリヌクレオチド又は２つのポリペプチド配列を比較するのにより適している（本プログラムは、長さが短い方の配列が、長い方の配列の一部を成していると仮定している）。これに比べて、ＧＡＰは、２つの配列を並列させて、ＮｅｄｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−３５４、１９７０）のアルゴリズムに従って、「最大の類似性」を見出す。ＧＡＰは、概ね長さが同じ配列を比較するのに適しており、全長にわたってアライメントを行うことを想定している。各プログラムで使用するパラメータ「Ｇａｐ Ｗｅｉｇｈｔ」と「Ｌｅｎｇｔｈ Ｗｅｉｇｈｔ」は、ポリヌクレオチド配列の場合、それぞれ５０と３、ポリペプチド配列の場合１２と４であることが好ましい。好ましくは、％同一性と類似性は、比較する二つの配列を最適に並列して決定する。
【００４３】
配列間の同一性及び／又は類似性を決定するためのその他のプログラム、例えば、ＢＬＡＳＴ類のプログラム(Altschul et al, J.Mol.Biol.,215:403-410、(1990)、Altschul et al, Nuc Acids Res.,25:289-3402(1997)、National Center for Biotechnology Information(NCB)、Bethesda、Maryland、USAから入手可能、ＮＣＢＩのホームページ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）からアクセスできる）やＦＡＳＴＡ(Pearson W.R. and Lipman D.J., Proc. Nat. Acac. Sci.,USA,85:2444-2448(1988)、Wisconsin Sequence Analysis Packageの一部として入手可能)も本分野において公知である。好ましくは、BLOSUM62アミノ酸置換マトリックス(Henikoff S. and Henikoff J.G.,Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,89:10915-10919,(1992))は、ポリペプチド配列の比較（比較の前に、ヌクレオチド配列をまずアミノ酸配列に翻訳する場合を含む）で使用される。
【００４４】
好ましくは、プログラムＢＥＳＴＦＩＴは、本発明のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列配列に対する被検ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の％同一性を決定するために使用し、被検配列と基準配列を最適に並列して、プログラムのパラメータは初期値に設定する。
【００４５】
本発明において、「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのプロトコールで用いられる洗浄条件を意味する。一般に、洗浄条件は、研究対象たる核酸のＴｍの計算値を変性温度が約５−２０℃下回るように、温度と塩濃度を組み合わせなければならない。２０塩基以下の核酸プローブのＴｍは、短いオリゴヌクレオチドについてのＷａｌｌａｃｅ則に従って、標準条件（１Ｍ ＮａＣｌ）下で、［４℃ｘ（Ｇ＋Ｃ）＋２℃ｘ（Ａ＋Ｔ）］と計算される。これより長いＤＮＡ断片の場合、Ｂｒｅｓｌａｕｅｒら、ＰＮＡＳ ８３：３７４６−３７５０（１９８６）に記載されている法則に従って、固体熱力学と実験データを組み合わせた直近隣接法（ｎｅａｒｅｓｔ ｎｅｉｇｈｂｏｒ ｍｅｔｈｏｄ）を用いることができる。ハイブリダイゼーション用の最適な塩及び温度条件は、フィルター上に固定化されたＤＮＡ試料を目的のプローブにハイブリダイズさせた後に、様々なストリンジェンシーの条件下で洗浄する予備実験で容易に決定することができる。ＰＣＲ用の条件は標準条件と異なってもよく、プライマーの予測相対安定度の指標としてＴｍを使用し得る。約１４ヌクレオチドの短いプライマーの場合、４４℃−５０℃前後の低いアニーリング温度が用いられる。前記温度は、使用するプライマー配列の塩基組成に応じてさらに高くしてもよい。好適には、ストリンジェントな条件は、（例えば、ＤＰＰ１０コード配列でない配列への）非特異的ハイブリダイゼーションが回避される条件である。２１マーのオリゴヌクレオチドプローブの場合、好適なストリンジェント条件は、０．５×ＳＳＣ／１％ＳＤＳ／５８℃／３０分である。
【００４６】
本発明の前記相補的配列（本明細書では、「アンチセンス」と表記することもある）は、プローブ若しくはプライマー、又はＤＰＰ１０発現の制御において有用であり得る。好ましくは、前記プライマー配列は、ＤＰＰ１０遺伝子の全部又は一部を増幅することができる。好ましいプライマー配列は、実施例に開示されている。遺伝子、又はその対立遺伝子、又はそれらのバリアントの全部又は一部を増幅するためのプライマー対は、本発明の別の側面を構成する。同様に、ＤＰＰ１０プローブは、被験体（ｓｕｂｊｅｃｔ）から得た試料内での、ＤＰＰ１０、又はそのバリアント形態の存在又は発現レベルを検出するのに有用であろう。前記プローブは、被験体におけるＤＰＰ１０の発現パターンを解析するのにも有用であろう。
【００４７】
本出願において、断片とは、連続する任意の１０残基の配列、又はこれより大きな２０、３０、４０、若しくは５０残基等の配列である。好ましくは、核酸又はポリペプチド配列の断片は、ＤＰＰ１０若しくはその遺伝子と一以上の機能的特徴を共有するか、又はこのような機能的特徴をモジュレート（すなわち、阻害又は増強）することができる。本実施態様に係る断片の新規性は、該断片のヌクレオチド又はポリペプチド配列を、優先日にＧｅｎｅｂａｎｋ等のデータベースに掲載されている配列と比較することによって、又はＤＮＡＳＩＳ（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｉｎｃ）若しくはＧｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＵＳＡ）のＷｏｒｄ Ｓｅａｒｃｈ若しくはＦＡＳＴＡ等のコンピュータプログラムを使用することによって容易に確認することができる。
【００４８】
前記断片は、様々な診断法、予後診断法、又は治療法において使用することができ、又は（例えば、スクリーニングにおける）研究用のツールとして有用であり得る。前記第一の側面の配列又はそれらの相補配列の断片は、上述のようなプライマー配列として使用することができる。
【００４９】
本発明の第二の側面では、本発明の前記単離された核酸配列は、ＤＰＰ１０のインビトロ又はインビボでの発現を可能とするベクターの形態で与えることができる。ベクターには、プラスミド、染色体、人工染色体、及びウイルスが含まれ、核酸配列をインビトロ又はインビボで発現させることができる発現ベクター、核酸配列をある環境から別の環境へ移行させることができる形質転換ベクターであり得る。本発明の前記核酸分子は、プロモーターを含む一以上の制御要素に作用可能に連結させてもよい。
【００５０】
制御要素（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）という用語には、反応要素、コンセンサス部位、メチル化部位、座制御領域、翻訳後修飾、スプライスバリアント、ホメオボックス、誘導性因子、ＤＮＡ結合ドメイン、エンハンサー配列、開始コドン、分泌シグナル、及びポリＡ配列が含まれる。プロモーターの活性を制御する、プロモーターの上流又は下流の領域（エンハンサーなど）も制御要素である。
【００５１】
前記ベクターは、複製起点、ポリヌクレオチド分子に隣接してインサートをクローニングできるようにするための適切な制限部位、マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライシング部位と転写終結領域、ポリメライゼーション部位、又は前記ポリヌクレオチド分子のクローニング及び／又は発現を促進することができる分泌シグナル等の他のあらゆる要素も備えることができる。
【００５２】
ベクターの中で、前記遺伝子は、ヒスチジンタグ、Ｖ５エピトープタグ、緑色蛍光タンパク質タグ、ＭＨＣタグ、又は当業者に公知である他のこのようなタグ等の発現タンパク質タグの上流又は下流に発現させ得る。このようなタグの使用により、タグ部分に対する抗体を用いて、融合タンパク質の容易な位置決定、アフィニティー精製、及び検出が可能となる。
【００５３】
本発明の核酸分子を２つ以上同一のベクターに導入する場合には、固有の制御配列によって各々を制御してもよいし、同一の制御配列によって全ての分子を制御してもよい。同様に、各分子が３’ポリアデニル化部位を備えてもよい。適切なベクターの例は、当業者に公知であり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ、ｌａｍｂｄａＺａｐ、及びｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＵＳＡ）が含まれるであろう。
【００５４】
適切な制御要素、とりわけプロモーターは、通常、発現ベクターを挿入すべき宿主細胞に応じて変わるであろう。微生物の宿主細胞を使用する場合には、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（Ｔｒｐ）プロモーター系、β−ラクタマーゼプロモーター系、又はファージλプロモーター系等のプロモーターが適切である。酵母細胞を使用する場合には、好ましいプロモーターにはアルコール脱水素酵素Ｉ又は解糖プロモーターが含まれる。哺乳類の宿主細胞では、好ましいプロモーターは、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス等に由来するプロモーターである。様々な宿主細胞での使用に適したプロモーターは、当業者であれば自明であろう（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｗｉｌｅｙ刊、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙを参照）。さらに、所望の発現パターンを実現するために、前記制御要素は、例えば、制御要素をさらに加えることによって改変してもよい。
【００５５】
作用可能に連結（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）とは、ベクター又は配列の成分が、所期の機能を発揮する関係にあることを意味する。
【００５６】
これらのベクターは、宿主細胞（例えば、原核細胞又は真核細胞）を形質転換するために使用できる。これらの細胞は、組換えＤＰＰ１０遺伝子産物の生成、又はＤＰＰ１０の制御若しくは解析に使用することができる。形質転換された宿主細胞は、本発明の一部を成す。好ましい細胞には、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母、糸状菌、昆虫細胞、哺乳類細胞、好ましくは、不死化したマウス、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ミエローマ、又はジャーカット細胞株、ヒト及びサル等の細胞株、及びそれらの誘導物が含まれる。
【００５７】
本発明の第三の側面によれば、本発明の前記第一の側面に係る核酸配列によってコードされるポリペプチド配列を含むポリペプチド配列が提供される。好ましくは、前記ポリペプチド配列は、図２ａ、４、５、５ａ、６、９、又は１０の核酸配列によってコードされる。
【００５８】
本発明の第三の側面には、図２ａ、２ｃ、４、５、５ａ、８、９、１１、１２、又は２１の何れか一つに示されているポリペプチド配列、若しくはこれらに相同な配列、又はこれらの断片を含むポリペプチドが含まれる。図２ｃ、４、９、１１、及び１２の配列は、予測されるヒトＤＰＰ１０ポリペプチド配列である。図５、５ａ、及び８の配列は、予測されたマウスＤＰＰ１０ポリペプチド配列である。図２１は、マウスとヒトのポリペプチド配列の両者を示している。
【００５９】
第三の側面の好ましい実施態様では、膜結合型のＤＰＰ１０タンパク質（図６、転写物４；図４、図１１）が提供される。特に、膜結合型のＤＰＰ１０は、膜貫通ドメインを形成する図１１のアミノ酸３５乃至５６を含む（図１６も）。マウスにおける均等物は、転写物１、２、及び３である（図７）。
【００６０】
第三の側面の好ましい実施態様では、膜貫通ドメイン又は触媒ドメイン（図１４）、又はβ−プロペラドメイン（図１７）を欠く可溶型のＤＰＰ１０タンパク質が提供される（図６の転写物２、３、５、及び６）。特に、可溶性ＤＰＰ１０タンパク質は、膜貫通ドメインを形成する図１１のアミノ酸３５乃至５６を欠く。最も好ましい実施態様では、可溶性ＤＰＰ１０タンパク質は、図１１のアミノ酸５７乃至７５１又は７９６を含む。マウスの均等物は、転写物４である（図７）。
【００６１】
ゴルジ装置から細胞の別の部分への分泌を補助するために、可溶性ＤＰＰ１０タンパク質を分泌シグナルに作用可能に連結してもよい。適切な分泌シグナルは、ｐＳｅｃＴａｇ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）等の組換えベクターによって供与することができる。このようなベクターから発現されたタンパク質は、マウスＩｇκ鎖リーダー配列のＮ末端に融合される。前記分泌シグナルは、組換えＤＮＡ技術を含む本分野で利用可能な技術を用いて、可溶性ＤＰＰ１０ポリペプチド配列に連結してもよい。
【００６２】
前記ＤＰＰ１０タンパク質若しくはこれと実質的に相同な配列、又はそれらの断片には、翻訳後修飾を加えることもできる。本明細書において、翻訳後修飾（ＰＴＭ）は、タンパク分解による切断（シグナル配列の除去又はチモーゲンの活性化によるプレタンパク質、プロタンパク質、又はプレプロタンパク質の切断）によって翻訳後にタンパク質を修飾することを含むものとして定義される。ＰＴＭには、炭水化物をタンパク質に付着させることも含まれ、付着させる主な糖には、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、ＧａｌＮＡＣ、ＧｌｃＮＡＣ、及びＮＡＮＡが含まれる。前記炭水化物は、Ｏ−グリコシド結合又はＮ−グリコシド結合の何れかによってタンパク質に連結させることができる。アシル化、メチル化、リン酸化、硫酸化、及びプレニル化も含まれる。プロリンやリジン（ｌｙｓｉｖｅ）の水酸化等のビタミンＣ依存性修飾、カルボキシ末端のアミド化、グルタミン残基のカルボキシル化等のビタミンＫ依存性修飾や、セレノシステイン（ｓｅｌｅｎｏｃｙｓｔｅｒｉｎｅ）としてタンパク質中にセレンを添加することも含まれる。
【００６３】
第三の側面のポリペプチド配列は機能を有していることが好ましく、薬物のスクリーニング、診断、又は治療において有用であり得る。ＤＰＰ１０の機能的断片は、完全長の膜結合又は可溶型のＤＰＰ１０と共通の免疫学的又は機能的な特徴を有している断片である。断片は少なくとも１０アミノ酸長であり、好ましくは１５、２０、２５、３０、３５、４０又は５０アミノ酸長であり得る。好ましくは、前記ポリペプチド配列は単離される。
【００６４】
本発明の第四の側面では、前記第三の側面に係るポリペプチド配列の抗原若しくは前記第一の側面に係る単離された核酸の抗原、若しくは何れかの側面の断片に対して特異的である抗体、又は前記第三の側面に係るポリペプチド配列若しくは前記第一の側面に係る単離された核酸の抗原、若しくは何れかの側面の断片と反応する抗体が提供される。本明細書において、「反応する」という用語は、抗体がポリペプチド又は単離された核酸と相互作用することができることを意味する。「に対して特異的である」という用語は、抗体がポリペプチド又は単離された核酸と特異的に反応することを意味する。
【００６５】
抗体は、標準的な操作(Harlow and Lane,“Antibodies;A Laboratory manual” Cold Spring Harbour Laboratory,Cold Spring Harbour,New York,1998)に記されている操作によって作製することができる。要約すると、免疫反応を惹起するのに十分な量と間隔で、精製された抗原を動物に注入することができる。抗体は直接精製することができ、あるいは、脾臓細胞を動物から取得することもできる。次いで、前記細胞を不死化した細胞株と融合し、抗体の分泌をスクリーニングする。抗体は、抗原を分泌する細胞をＤＮＡクローンライブラリーからスクリーニングするために使用することができる。次いで、例えば、Ｋｅｌｌｙら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３／１６７（１９９２）及びＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６９／１７５（１９９２）に記載されているように、これらの陽性クローンを配列決定することができる。好ましくは、検出される抗原及び／又はある抗体を得るために使用される抗原は、第三の側面に記載のポリペプチド配列又は第一の側面に記載の単離された核酸配列を含むであろう。抗体は、ポリクローナル若しくはモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体若しくは二種特異性抗体、又は上述した全てのものの断片であり得る。二種特異性抗体（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）とは、二つの異なる抗原に結合することができる抗体であり、これらの抗原はＤＰＰ１０ポリペプチド若しくは単離された核酸中に存在する、異なる抗原であってもよいし、あるいは、例えば、細胞の抗原と組み合わせたＤＰＰ１０の抗原であってもよい。
【００６６】
とりわけ、前記抗体は、サイトゾルの可溶型、β−プロペラドメイン、又は外部ドメイン等のＤＰＰ１０のドメインに対して生じさせることができる。このような抗体は、本発明の診断及び治療的な側面において有用であろう。とりわけ、該抗体は、被験体から得た試料中のＤＰＰ１０を検出又は測定するためのアッセイを開発する上で有用であろう。
【００６７】
好ましい実施態様では、前記抗体は、被験体から取得した血清試料中に存在する、サイトゾルの可溶性ＤＰＰ１０タンパク質のレベルをアッセイするために使用し得る（図２７）。
【００６８】
本発明の第五の側面では、上述した核酸配列を調製する方法であって、連続するヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチド残基を互いに連結することを備えた方法が提供される。このような方法は、化学的な合成法を用いて、又は酵素的な触媒を用いることによって実施することができる。あるいは、適切なＤＮＡ又はＲＮＡ配列を適切な宿主細胞にトランスフェクトして、宿主細胞中に所望の配列を産生させてもよい。
【００６９】
本発明の第六の側面では、上述したポリペプチドを調製する方法であって、連続するアミノ酸及び／又はオリゴヌクレオチドを互いに連結することを備えた方法が提供される。このような方法は、化学的な合成法を用いて、又は酵素的な触媒を用いることによって実施することができる。あるいは、適切なＤＮＡ又はＲＮＡ配列を適切な宿主細胞にトランスフェクトして、宿主細胞中に所望の配列を産生させてもよい。
【００７０】
本発明において、ＤＰＰ１０という表記には、可溶性、膜結合型又は不溶型のＤＰＰ１０が含まれ、エキソン２乃至２５によってコードされるポリペプチド配列を少なくとも備える。このため、ＤＰＰ１０という表記には、エキソン１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ、１ｆ、又は１ｇを一以上有する転写物によってコードされるタンパク質が含まれる。
【００７１】
本発明の第七の側面では、以下のもの、すなわち、本発明の上述した側面の核酸配列を含む細胞、又は本発明の上述した側面の核酸配列を含むヒト以外のトランスジェニック動物が提供される。このような細胞（単独で、懸濁液中、培養液中、又は臓器を構成する細胞群の一部として）及びヒト以外のトランスジェニック動物は、一塩基多型及びそれらの表現型効果の解析に有用であり、従って、ＤＰＰ１０とその表現型効果の解析に有用である。ヒト以外のトランスジェニック動物での本発明のポリヌクレオチド配列の発現は、通常、前記ポリヌクレオチドをプロモーター及び／又はエンハンサー配列に作用可能に連結して、好ましくは、上述した側面のベクターを作製し、マイクロインジェクション技術により宿主動物の胚性幹細胞中にこれを導入することによって行う(Hogan et a.,A Laboratory Manual,Cold Spring harbour and Capecchi Science (1989) 244:1288-1292)。次いで、導入遺伝子構築物は、宿主の内在性遺伝子との相同的組換えを行うことになるはずである。所望の核酸配列を含んだ胚性幹細胞は、通常、マーカー遺伝子の発現をモニターすることによって選択することができ、ヒト以外のトランスジェニック動物を作製するために使用し得る。好ましい宿主動物には、マウス、ウサギ、及びその他の齧歯類が含まれる。
【００７２】
導入される核酸配列は、宿主動物にとって本来存在するものでなくてもよい（すなわち、外来のものであってもよい）。このようなトランスジェニック動物は、本分野で公知の方法を用いてトランスジェニック動物ではない固有の動物と区別することができる。例えば、トランスジェニック動物から得た核酸試料を固有の動物から得た核酸試料と比較すればよく、トランスジェニック動物は、外来プロモーター、マーカー遺伝子等の核酸配列を有しているであろう。あるいは、動物の表現型を比較することもできる。
【００７３】
疾病を研究するために前記第七の側面に係るヒト以外のトランスジェニック動物を使用することが望ましい場合には、動物に導入される核酸は、アレルギー、アトピー、喘息又は慢性関節リウマチ、強直性脊椎炎、炎症性腸疾患、クローン病、多発性硬化症、又はＩＩ型糖尿病を含む炎症性疾患をもたらすＤＰＰ１０のバリアントをコードすることが望ましいであろう。疾病が人工的に導入されるこのような実施態様では、ヒト以外のトランスジェニック動物は、固有のＤＰＰ１０遺伝子を発現しないように改変されるであろう。これらの動物は、「ノックアウト」と称されることがある(Manipulating The Mouse Embryo-A Laboratory Manual,Hogan et al 1986)。ある場合には、外来核酸及び／又は固有の遺伝子の発現を時間又は空間的にモジュレートすることが望ましいであろう。固有の遺伝子の発現が全組織で停止されれば、このアプローチによって、生存性（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）の問題は取り除かれる。
【００７４】
最も好ましい実施態様では、アレルギー、アトピー、喘息又は慢性関節リウマチ、強直性脊椎炎、炎症性腸疾患、クローン病、多発性硬化症、又はＩＩ型糖尿病を含む炎症性疾患を引き起こすバリアント型のＤＰＰ１０をコードする核酸を具備するトランスジェニックマウスが提供される。もっとも好ましくは、前記核酸分子は、図１の位置２５９００７（塩基アデニンがシトシンに変化している箇所）、位置２６７９０１（塩基アデニンがグアニンに変化している箇所）、及び／又は位置３１８５２４（塩基チミンがシトシンに変化している箇所）に対応する位置にＳＮＰを有する。好ましくは、相同的組換え技術を用いて時間及び／又は空間的に適切な態様でＤＰＰ１０を発現しないか、あるいは、トランスジェニック操作の結果、ＤＰＰ１０タンパク質を過剰発現するように、前記マウスをモジュレートする。
【００７５】
機能的な多型（すなわち、「突然変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）」）が同定されれば、この多型を含有するＤＰＰ１０構築物をマウスの生殖系列に導入して（すなわち、ノックイン）、ＤＰＰ１０タンパク質をノックアウトするのではなく、ＤＰＰ１０タンパク質の病理的バリアントを作製することができる。あるいは、ＤＰＰ１０遺伝子の病理的バリアントは、過剰発現させてもよい。
【００７６】
本発明において、炎症性疾患には、ＤＰＰ１０の過剰発現、又はバリアント型のＤＰＰ１０の存在に起因するものが含まれる。具体的には、このような疾病には、アレルギー、及び喘息等のアトピー性疾患、又は炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎やクローン病）、及び慢性関節リウマチや強直性脊椎炎等の炎症性関節疾患、又は乾癬、多発性硬化症、又はＩＩ型糖尿病が含まれる。
【００７７】
本発明の第八の側面では、炎症性疾患に対する被験体の感受性を診断又は決定する方法が提供される。該方法は、病状に関連することが知られているバリアント型のＤＰＰ１０の存在を決定すること、又はＤＰＰ１０のレベルを測定することを備え得る。バリアント型のＤＰＰ１０には、核酸バリアントとアミノ酸バリアントが含まれる。バリアントには、（例えば、ヒトの）野生型から生じた任意のＳＮＰ（図１）又は野生型から生じたその他の突然変異若しくは変化が含まれる。
【００７８】
例えば、上述したプローブ又はプライマーは、ＤＰＰ１０又はそのバリアントをコードする核酸を検出する際に有用であろう。存在するＤＰＰ１０の発現パターン又は型に関する情報は、おそらくは、サイトゾル型のＤＰＰ１０タンパク質に対する膜結合型のＤＰＰ１０タンパク質の比率に影響を与えることによって、ＤＰＰ１０発現の変化に起因する炎症性疾患に対して個体が感受性を有しているかどうかを決定する上で有用であると思われる。
【００７９】
好ましい実施態様では、前記方法は、これに加えて又はこれに代えて、表１ａ、１ｂ、及び１ｃ、又は表３のＳＮＰを一以上有するリスク対立遺伝子の有無を測定することを備えることができ、リスク対立遺伝子が存在すれば、疾病に罹患していること又は疾病に対して素因があることを示している。前記方法は、公知の多型の遺伝子型を一以上決定することを備えてもよい。このような多型の任意の組み合わせについて遺伝子型を決定してもよい。
【００８０】
本発明のＳＮＰは、表１ａ、１ｂ、及び１ｃ、又は表３に列記されており、多型の性質が野生型対立遺伝子／バリアント対立遺伝子の形式で記載されている。例えば、２１８１８位のＳＮＰ（６９ＷＴＣ５０Ｗと表記する）は、野生型配列中にアデノシン残基を有しており、バリアント配列ではこれがグアニン残基に置き換わっている。ＳＮＰは図１に基づいて位置が決められており、ヌクレオチド位置１が図１では一番目のヌクレオチドである。
【００８１】
好ましくは、ＳＮＰ多型の対立遺伝子は以下のとおりである。図１の２５９００７位にアデニン以外のヌクレオチド残基、２６７９０１位にアデニン以外のヌクレオチド残基、及び３１８５２４位にチミン以外のヌクレオチド残基。より具体的には、前記リスク対立遺伝子は、図１の２５９００７位のシトシン残基、２６７９０１位のグアニン残基、３１８５２４位のシトシン残基である。
【００８２】
本発明において同定された残りのＳＮＰに対する対立遺伝子は、表１ａ、１ｂ、及び１ｃ、又は表３に記載されている。
【００８３】
上記方法では、当業者に公知の技術を含む任意の技術を使用することができる。これらには、例えばＥＬＩＳＡアッセイ又は免疫局在性における、上述したプローブ若しくはプライマーの使用又は第四の側面に係る抗体の使用が含まれ得る。好ましくは、前記方法は、まず被験体から試料を採取することを備える。より好ましくは、前記方法は、試料から核酸又はポリペプチド配列を単離することを備える。
【００８４】
とりわけ、この側面で使用する方法には、核酸配列間の相違を同定するための当業者に公知の方法、例えば、直接のプロービング、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション、パイロシークエンシング法(Ahmadian A,Gharizadeh B,Gustafsson AC,Sterky F,Nyren P,Uhlen M,Lundeberg J.Single-nucleotide polymorphism analysis by pyrosequencing, Anal Biochem.2000 Apr 10;280(1):103-10;Nordstrom T,Ronaghi M,Forsberg L,de Faire U,Morgenstern R,Nyren P. Direct analysis of single-nucleotide polymorhpism on double-stranded DNA by pyrosequencing.Biotechnol Appl Biochem.2000 Apr;31(Pt 2):107-12)、対立遺伝子特異的増幅（ＡＳＡ、Ａｌｌｅｌｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＷＯ９３／２２４５６）、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション、一塩基伸長法（米国特許第４，６５６，１２７号）、ＡＲＭＳ−ＰＣＲ、ＴａｑｍａｎＴＭ（米国４６８３２０２号、４６８３１９５号、及び４９６５１８８号）、オリゴライゲーションアッセイ、一本鎖ＤＮＡ高次構造解析（（ＳＳＣＰ）Ｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ ＰＮＡＳ ８６ ２７６６−２７７０（１９８９））、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｂｉｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＷＯ ９２／１５７１２）、及びＲＦＬＰによる直接配列決定を含むＰＣＲ手法、質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、及びＤＮＡアレイが含まれる。適切な制限酵素は、もちろん、多型と制限部位に依存し、当業者に公知のものが含まれるであろう。消化された断片の分析は、本分野における任意の方法（例えば、ゲル分析、又はサザンブロット）を用いて行うことができる。
【００８５】
疾病に対する素因を診断又は判定する方法であって、図１の２５９００７位にＳＮＰを有するリスク対立遺伝子の有無を決定することを備え、リスク対立遺伝子が存在すれば、疾病に罹患しているか又は疾病に対して素因があると診断される方法が提供される。
【００８６】
さらに、疾病に対する素因を診断又は判定する方法であって、図１の２６７９０１位及び／又は３１８５２４位にＳＮＰを有するリスク対立遺伝子の有無を決定することを備え、リスク対立遺伝子が存在すれば、疾病に罹患しているか又は疾病に対して素因があると診断される方法が提供される。
【００８７】
本発明は、疾病の正確な診断、又は疾病に対する素因の判定を容易にする点で有利である。このように、遺伝子型を決定することによって、個体が疾病を有しているか又は疾病に対して素因を有しているかを明らかにすることができる。これは、ある治療又は予防策が奏功する可能性が高い個体を同定するのに役立つ。このようにして、より効果的な治療又は予防策を与えることが可能となる。
【００８８】
本発明の多型と関連する疾病には、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎やクローン病）、及び慢性関節リウマチや強直性脊椎炎等の炎症性関節疾患、又は多発性硬化症、又はＩＩ型糖尿病等の炎症性疾患が含まれる。本発明において疾病に対する素因とは、これらの個体が疾病を発症するリスクが高いこと、又はより重篤な型の疾病を発症すること、又は特定の形式の疾病を発症することを意味する。
【００８９】
本発明において、リスク対立遺伝子とは、疾病と関連する又は疾病への素因と関連する多型を有する対立遺伝子である。リスク対立遺伝子は、以下に記載されているように、野生型であってもよいし、バリアント対立遺伝子であってもよい。
【００９０】
「多型」という用語は、複数の形態の配列が共存することを意味する。このため、多型部位とは、配列の相違が生じる位置のことである。多型の存在によって生じる、異なった型の配列は、「対立遺伝子」と称される。多型部位を包含する領域は、多型領域と称されることがある。
【００９１】
多型を明らかとする手段の例には、制限断片長多型（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ３２ ３１４−３３１（１９８０））、タンデムリピート数、超可変領域、ミニサテライト、二又は多ヌクレオチドリピート、挿入要素の数の変動、及びヌクレオチド又はアミノ酸の欠失、付加、又は置換が含まれる。多型部位の大きさは、一塩基対にすぎないこともあり、これによって、コドンが変化して、コードされるアミノ酸配列に変化が生じ得る。
【００９２】
一塩基多型は、多型部位におけるヌクレオチド残基の置換、欠失、又は挿入によって生じる。このような変化（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）をＳＮＰと称している。ＳＮＰは、プロテインコーディング領域に生じる場合があり、この場合には、異なる多型形態の配列はバリアントタンパク質配列をもたらすことがある。他のＳＮＰは、非コード領域に生じ得る。いずれの場合でも、ＳＮＰによって、タンパク質の欠陥又は遺伝子制御の欠陥がもたらされて、病気を引き起こすことがある。他のＳＮＰは、表現型効果を有していないが、病状に連鎖していることがあり、このため、疾病のマーカーとしての役割を果たし得る。ＳＮＰは、典型的には、前述した他の形態の多型に比べて、ゲノム全体に高い頻度で発生し、従って、ある病状と関連するＳＮＰを見出す確率が高くなる。
【００９３】
連鎖不均衡とは、二つの対立遺伝子が同時に遺伝する頻度が、各対立遺伝子の個別の頻度から予想される頻度より大きいことをいう。逆に、対立遺伝子が同時に現れるのであれば、対立遺伝子は連鎖均衡にあるといわれる。二つの対立遺伝子が同時に遺伝する予想頻度は、各対立遺伝子の頻度の積である。
【００９４】
二以上の多型の遺伝子型が決定されている場合には、前記方法によって、疾病の指標又は疾病に対する素因の指標となるハプロタイプの有無を判定することが好ましい。本明細書においてハプロタイプとは、ある配列中の集団で受け継がれる、ある配列中に存在する多型部位の集合体（すなわち、互いに連鎖不均衡である）と定義される。疾病の診断でハプロタイプを同定することは、偽陽性の確率を減らすのに役立つ。前記ハプロタイプは、表１ａ、１ｂ、及び１ｃ又は表３の多型を任意に組み合わせたものであり得、必要に応じて一以上の公知の多型と組み合わせてもよい。好ましいハプロタイプは、図１の２５９００７、２６７９０１、及び３１８５２４位のＳＮＰの組み合わせである。
【００９５】
前記第八の側面の方法は、好ましくは、被験体から採取した試料に対して実施される。この目的に関しては、核酸、好ましくは図１の核酸を含有する細胞を含む任煮の生物試料が適している。適切な試料の例には、全血、白血球、精液、唾液、涙、口腔（ｂｕｃｃａｌ）、皮膚、又は毛が含まれる。ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はタンパク質を分析するためには、前記試料は、目的の配列が発現している組織に由来するものでなければならない。血液は、直ちに入手できる試料である。このように、前記第八の側面の方法は、好ましくは、被験体から試料を取得する工程と、該試料から核酸を調製する工程とを含む。
【００９６】
前記被験体は、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトである。前記被験体は、乳幼児、子供、又は成体であり得る。あるいは、前記試料は、例えば、羊水穿刺によって、分娩前の被験体から取得してもよい。
【００９７】
疾病に対する被験体のリスク因子は、他の公知の遺伝因子、及び／又は臨床、生理、又は食事因子を参照することによっても決定することができる。
【００９８】
上記の方法には、被験体から得たＤＮＡ試料の増幅が必要とされることがあり、これは、ＰＣＲ等の本分野において公知の技術によって行うことができる(PCR Technology:Principles and Applications for DNA Amplification(ed.H.A.Erlich,Freeman Press,NY 1992;PCR Protocols:A Guide to methods and Applications(eds. Innis et al.,Academic press,San Diego,CA 1990);Mattila et al.,Nucleic Acids Res. 19 4967(1991);Eckert et al.,PCR Methods and Applications 117(1991)、及び米国特許第４，６８３，２０２号を参照）。他の適切な増幅法には、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）(Wu et al.,Genomics 4 560(1989);Landegran et al.,Science 241 1077(1988))、転写増幅(Kwoh et al.,Proc Natl Acad Sci USA 86 1173(1989))持続的自己配列複製(self sustained sequence replication)(Guatelli et al., Proc Natl Acad Sci USA 87 1874(1990))、及び核酸ベース配列増幅（ＮＡＳＢＡ）が含まれる。後の二つの方法では、増幅産物として一本鎖ＲＮＡと二本鎖ＤＮＡの両者を、それぞれ３０又は１００対１の比率で生成する等温性転写に基づく等温反応が用いられる。
【００９９】
複数の試料を同時に分析することが望ましい場合には、ＷＯ９５／１１９９５号に記載されているようなアレイを用いることが好ましいかもしれない。アレイは、多数のプローブを含有することができ、各プローブは、試料由来のＤＰＰ１０のバリアントを同定するようにデザインされている。
【０１００】
制限酵素が必要とされる場合には、多型と制限部位の性質に従って制限酵素を選択することができる。適切な酵素は、当業者に公知であろう。消化された断片の分析は、本分野のあらゆる方法、例えば、ゲル分析、又はサザンブロットを用いて実施することができる。
【０１０１】
上記方法を用いた多型を有する対立遺伝子の判定では、通例、アンチセンス配列、すなわち目的の核酸配列に相補的である配列（図１の配列の一部を含むものでもよい）が用いられる。このような配列は、本発明の第三の側面に記載されている。
【０１０２】
被験体から得た試料中に複数の一塩基多型、すなわちハプロタイプの存在を同定することが望ましい場合には、ＷＯ９５／１１９９５に記載されているアレイを使用することが好ましいかもしれない。アレイは、多数のプローブを含有することができ、各プローブは、本発明の上記一塩基多型を一以上同定するようにデザインされる。
【０１０３】
前記第八の側面の方法では、先述したＤＰＰ１０に対する抗体を用いてもよい。試料中の抗原への抗体の結合の検出は、一次抗体に結合する二次抗体、又はリガンドの使用等の本分野において公知の方法によって容易となるであろう。免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）や酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）やイムノブロッティングを含むイムノアッセイを用いて、抗原の存在を検出することもできる。例えば、ＥＬＩＳＡを使用する場合、前記方法は、前記抗体を基質に結合させることと、抗原を含有する試料に前記結合した抗体を接触させることと、検出可能部分（典型的には、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ等の酵素）に結合された二次抗体にこれを接触させることと、前記酵素の基質にこれを接触させることと、最後に、前記試料中に前記抗原が存在することの指標となる色の変化を観察することとを備え得る。
【０１０４】
核酸又はタンパク質を含有する細胞を含むあらゆる生物試料が、この用途に適している。適切な試料の例には、全血、精液、唾液、涙、口腔、皮膚、又は毛が含まれる。ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はタンパク質を分析する場合、前記試料は、ＤＰＰ１０が発現されている組織に由来するものでなければならない。末梢血の白血球は、直ちに入手できる試料である。
【０１０５】
本発明の第九の側面によれば、被験体の疾病を予防又は治療する方法であって、前記被験体におけるＤＰＰ１０の活性、発現、半減期、又は翻訳後修飾をモジュレートすることを備えた方法が提供される。
【０１０６】
前記方法は、アレルギー、喘息等のアトピー性疾患、又は炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎やクローン病）、及び慢性関節リウマチや強直性脊椎炎等の炎症性関節疾患、又は乾癬、多発性硬化症、又はＩＩ型糖尿病に罹患している、又は感受性があると診断されたことがある被験体に実施するのが好ましい。
【０１０７】
好ましくは、前記方法は、ＳＮＰを有する対立遺伝子（例えば、図１の２５９００７、２６７９０１、及び／又は３１８５２４に位置する、アレルギー、アトピー、喘息、又は炎症性疾患と関連を有するもの等）の有無を判定することと、リスク対立遺伝子が存在すれば、疾病を予防、遅延、又は軽減するために治療を施すこととを備える。
【０１０８】
好ましくは、リスク対立遺伝子の有無を判定することを備えた前記工程は、前記第八の側面に従って実施され、従って、表１ａ、１ｂ、及び１ｃ又は表３のＳＮＰ、又は上述したような、これらの任意の組み合わせを有するリスク対立遺伝子の有無を判定することも備える。
【０１０９】
前記第九の側面による疾病の予防又は治療には、ＤＰＰ１０又は発病対立遺伝子の効果をモジュレートすることができる任意の物質を投与することが含まれ得る。好ましくは、前記物質は、前記リスク対立遺伝子の有害な効果を和らげることができるものである。前期方法には、遺伝子治療技術が含まれるが、これに限定されるものではない。遺伝子治療技術では、通例、リスク対立遺伝子を包含する核酸配列を置換するか、あるいは、リスク対立遺伝子の効果をダウンレギュレートする。前記第二の側面の核酸配列又はこれにアンチセンスな配列が、遺伝子治療において有用であろう。
【０１１０】
モジュレートするとは、酵素の活性を阻害又は増加させることを意味する。活性は阻害されることが好ましい。酵素の活性には、核酸配列の転写と翻訳、タンパク質の集合、他の因子との下流での相互作用を含むその産生又は機能に関する全ての側面が含まれる。
【０１１１】
ＤＰＰ１０活性は、多数の方法でモジュレートすることができる。例えば、本発明の第一の側面に係るアンチセンス配列等のアンチセンス配列の使用を通じて、又はアンチセンスＲＮＡの産生によって、遺伝子の発現を阻害することができる。このような配列は、遺伝子治療によって被験体に導入されると、ＤＰＰ１０遺伝子又はＲＮＡにハイブリダイズし、その転写又は翻訳を阻害するであろう。他のバリアントに影響を与えることなく、ＤＰＰ１０のあるスプライスバリアントの機能又は発現をモジュレートすることが望ましい場合に、この方法は特に有用であり得る。
【０１１２】
核酸配列の導入には、本分野で公知の方法を含む遺伝子治療法を用いることができる。一般的に、核酸配列は、通常はベクターの形態で、好ましくは薬学的に許容される担体の形態で被験体の標的細胞中に導入されるであろう。組換えゲノムをパッケージングすることができるレトロウイルスベクター系等のウイルスベクターを含む任意の適切な送達媒体を使用し得る。レトロウイルスは、次いで、標的細胞に前記ポリヌクレオチドを感染させ、送達するために使用することもできる。アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、レンチウイルスベクター、偽型レトロウイルスベクター、及びポックス又はワクシニアウイルスベクターの使用を含む、他の送達技術も広く使用できる。Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（Ｒ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｒ）、（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ、Ｉｎｃ．Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ、ＭＤ）、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｒ）（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、及びＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（Ｒ）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）等の市販のリポソーム調製物を含むリポソームを用いてもよい。
【０１１３】
ＤＰＰ１０の生物活性をモジュレートするための他の手段には、ＤＰＰ１０が相互作用する下流の因子とＤＰＰ１０との相互作用に影響を与え得る物質も含まれる。例えば、ＤＰＰ１０の活性は、ケモカインやサイトカイン等のＸＰＸＳモチーフを含有する分子（例えば、図１９に示されているもの）とＤＤＰ１０との相互作用を阻害することによって影響を受け得る。とりわけ、ＤＰＰ１０の活性は、これらのケモカイン又はサイトカインのうち任意の一又は複数に対する競合的阻害剤又は非競合的阻害剤を使用することによって、又はＤＰＰ１０の活性三連構造を阻害することによって機能し得る小分子阻害剤によって阻害し得る。その他の阻害法も、当業者には公知であろう。
【０１１４】
上述した被験体の炎症性疾患の予防又は治療に使用するための物質も提供される。物質には、第一又は第二の側面の核酸配列、第三の側面のポリペプチド配列、第四の側面の抗体、及び本明細書に記載されている他のあらゆる物質、好ましくは、ＤＰＰ１０の活性をモジュレートすることができる物質が含まれる。
【０１１５】
前記被験体は、任意の動物であり得、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトであり得る。
【０１１６】
被験体の上述した炎症性疾患の予防又は治療に使用するための医薬の製造における上述した物質の使用も提供される。
【０１１７】
本発明の第十の側面では、図１の配列の一部を含み、且つ表１ａ、１ｂ、１ｃ、又は３のうちの何れか一つ又は複数に列記されている図１の位置に対応する位置に一以上のＳＮＰを含む単離された核酸分子が提供される。
【０１１８】
具体的な単離された核酸分子には、
図１の２５９００７位に対応する位置にＳＮＰを含み、この位置でアデニンがシトシンに変化しているもの、
図１の２６７９０１位に対応する位置にＳＮＰを含み、この位置でアデニンがグアニンに変化しているもの、
図１の３１８５２４位に対応する位置にＳＮＰを含み、この位置でチミンがシトシンに変化しているもの
が含まれる。
【０１１９】
本発明の前記核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び一本鎖又は二本鎖の配列であり得る。本発明の全ての分子は単離され、あるいは、組換えることもできる。単離されたとは、精製されており、タンパク質及び他の核酸を実質的に含まない核酸分子を意味する。このような分子は、ＰＣＲ増幅、クローニング技術、又は合成装置による合成によって取得することができる。組換えとは、人為的に組みかえられた核酸分子を意味する。
【０１２０】
本発明の単離された核酸分子は、図１の「野生型」又は「基準」配列とは異なる。図１の配列（Ｄ２Ｓ３０８マーカーを取り囲む４６５Ｋｂの領域、喘息と関連するとＷＯ９９／５０４５１に記載されている）は、ＢＡＣ／ＰＡＣコンティグ（本発明の一部ではない）に由来する。該コンティグ中のＢＡＣは、４１６Ｌ５、５４３Ｌ９、及び３１７Ｌ１８である。ＰＡＣは、６９ＣＥ４である（本発明の一部ではない）。表１ａ、１ｂ、１ｃ、又は３に詳述されている一以上の位置の何れかが図１の配列と異なる本発明の核酸配列は、図１の配列の多型バリアントと称され、本発明の一部を構成する。
【０１２１】
本発明の該側面は、アンチセンス配列も提供する。このような配列は、通例、一本鎖であり、本発明の上述した核酸配列に又は図１の配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる。好ましいアンチセンス配列は、本発明の多型を有する対立遺伝子にハイブリダイズすることができるアンチセンス配列であり、最も好ましくは、（表１ａ、１ｂ、１ｃ、又は３の）多型を有する対立遺伝子を区別することができるアンチセンス配列である。ストリンジェントな条件は、以下に定義されている。前記アンチセンス配列は、合成によって調製してもよいし、あるいはニック翻訳によって調製してもよく、好ましくは単離されるか又は組換えられる。
【０１２２】
前記アンチセンス配列には、例えば、本発明の前記方法に使用するためのプライマー及びプローブが含まれる。プライマー配列は、当業者に公知であると思われる適切な条件下において、テンプレートで誘導される核酸合成用の開始部位として作用することができる。プローブは、ある核酸配列の検出、同定、及び単離において有用である。プローブとプライマーの長さは、好ましくは１５乃至３０ヌクレオチドである。
【０１２３】
増幅を行う場合には、ペアとプライマーを準備する。これらには、増幅すべき核酸配列の５’末端にハイブリダイズする５’プライマーと、増幅すべき核酸の３’末端の相補鎖にハイブリダイズする３’プライマーとが含まれる。好ましいプライマーは、表２に列記されている。
【０１２４】
例えば、検出を可能にするために、プローブとプライマーには、標識を施してもよい。適切な標識には、例えば、引き続きサザンブロット操作において可視化するための、例えば、放射標識、酵素標識、フルオロ標識、ビオチン−アビジン標識が含まれる。標識されたプローブ又はプライマーは、試料のＤＮＡ又はＲＮＡと反応して、相補的な配列を有するＤＮＡ又はＲＮＡの領域がプローブとハイブリダイズして、ＤＮＡ又はＲＮＡ自体が標識されることになるであろう。標識された領域は、例えば、オートラジオグラフィーによって可視化することができる。
【０１２５】
前記プローブ及び／又はプライマーは、「ストリンジェントな条件」下でハイブリダイズするのが好ましく、ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーションのプロトコールで用いられる洗浄条件を意味する。プローブ用のハイブリダイゼーション条件は、プローブの結合時に、多型を有する別の対立遺伝子を識別できるように十分ストリンジェントであることが好ましい。一般に、洗浄条件は、研究対象となっている核酸のＴｍの計算値を変性温度が約５−２０℃下回るように、温度と塩濃度を組み合わせなければならない。２０塩基以下の核酸プローブのＴｍは、短いオリゴヌクレオチドに関するＷａｌｌａｃｅ則に従って、標準条件（１Ｍ ＮａＣｌ）下で、［４℃ｘ（Ｇ＋Ｃ）＋２℃ｘ（Ａ＋Ｔ）］と計算される。これより長いＤＮＡ断片の場合、Ｂｒｅｓｌａｕｅｒら、ＰＮＡＳ ８３：３７４６−３７５０（１９８６）に記載されている法則に従って、固体熱力学と実験データを組み合わせた直近隣接法を用いることができる。ハイブリダイゼーション用の最適な塩及び温度条件は、フィルター上に固定化されたＤＮＡ試料を目的のプローブにハイブリダイズさせた後に、様々なストリンジェンシーの条件下で洗浄する予備実験で容易に決定することができる。ＰＣＲ用の条件は標準条件と異なってもよく、プライマーの予測相対安定度の指標としてＴｍを使用し得る。約１４ヌクレオチドの短いプライマーの場合、４４℃−５０℃前後の低いアニーリング温度が用いられる。前記温度は、使用するプライマー配列の塩基組成に応じてさらに高くしてもよい。典型的には、塩濃度は１Ｍにすぎず、温度は少なくとも２５℃である。適切な条件は、５×ＳＳＰＥ（７５０ｍＭ ＮａＣＩ、５０ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７．４、２５−３０℃の温度）である。
【０１２６】
第十一の側面では、先述した側面に記載のベクター又は単離された核酸分子を含む宿主細胞が提供される。該宿主細胞は、発現ベクター、又は本発明の核酸分子をコードする裸のＤＮＡを含み得る。種々の適切な宿主細胞（真核細胞と原核細胞の両者）を使用することができる。例としては、Ｅ．Ｃｏｌｉなどの細菌、酵母、糸状菌、昆虫細胞、（マウス、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ミエローマ、又はジャーカット細胞株、ヒト及びサルの細胞株、及びそれらの誘導物等の）哺乳動物細胞、好ましくは不死化した細胞等が含まれる。前記宿主細胞は、好ましくは、前記核酸配列を発現させて遺伝子産物（すなわち、ＲＮＡ又はタンパク質）を与えることが可能である。このような宿主細胞は、上述した炎症性疾患を有する個体又は上述した炎症性疾患に感受性がある個体の診断又は治療に使用するための物質を同定するための薬物スクリーニング系において有用である。
【０１２７】
前記核酸分子を宿主細胞中に導入する方法は、ベクター／ＤＮＡと標的細胞の両方の性質に依存するのが通常であり、当業者に公知の方法が含まれるであろう。適切な公知の方法には、Ｓａｍｂｒｏｏｋらに記載されているような、融合、抱合、リポソーム、イムノリポソーム、リポフェクチン、トランスフェクション、トランスダクション、電気穿孔、又は注入などが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１２８】
本発明の第十二の側面では、疾病又は疾病に対する素因を診断するためのキットであって、表１ａ、１ｂ、１ｃ、又は表３のＳＮＰを有するリスク対立遺伝子の有無を判定するための手段を備え、前記リスク対立遺伝子が疾病又は疾病に対する素因の診断指標となるキットを提供する。
【０１２９】
好ましい実施態様では、前記キットは、第八の側面に記載した多型を有するリスク対立遺伝子が一以上存在するか否かを判定するための手段を備える。特に、前記キットは、図１の２５９００７位、２６７９０１位、及び／又は３１８５２４位のＳＮＰを有するリスク対立遺伝子の有無を判定する手段を備える。
【０１３０】
好ましくは、前記キットは、本発明の第八の側面に記載のリスク対立遺伝子の有無を判定するために必要な成分を備えるであろう。このような成分には、ＰＣＲプライマー及び／又はプローブ（例えば、上述したもの）、ＰＣＲ酵素、制限酵素、及びＤＮＡ又はＲＮＡ精製手段が含まれる。好ましくは、前記キットは、少なくとも一対のプライマー、又はプローブ、好ましくは、本発明の第十の側面に上記したものを含有するであろう。前記プライマーは、好ましくは、対立遺伝子特異的なプライマーである。他の成分には、標識手段、反応用の緩衝液が含まれる。さらに、野生型又は上述のバリアント核酸配列、又はそのＰＣＲ産物を含む対照核酸試料を含めてもよい。前記キットは、通常、前記診断法を実施するための指示書と、前記結果と疾病の可能性の相関を詳細に示した手がかり（ｋｅｙ）とを備えるであろう。前記キットは、疾病の予防又は治療用物質を備えてもよい。
【０１３１】
本発明の第十三の側面では、疾病を治療するための化合物を同定する方法であって、（ａ）表１ａ、１ｂ、１ｃ又は３に列記された図１の位置に対応する位置にＳＮＰを有する単離された核酸分子を含む組織に化合物を投与することと、（ｂ）前記物質が前記ＳＮＰの効果をモジュレートするかどうかを測定することとを備えた方法が提供される。
【０１３２】
好ましい実施態様では、前記単離された核酸分子は、本発明の前記第十の側面に記載したものであり、最も好ましくは、図１の２５９００７位、２６７９０１位、及び／又は３１８５２４位に対応する位置にＳＮＰを有する。
【０１３３】
この側面では、ＳＮＰの効果をモジュレートすることができる物質をスクリーニングするために、本発明の核酸分子及び／又は前述した側面に係る細胞株を使用し得る。
【０１３４】
このような物質としては、リスク対立遺伝子と非リスク対立遺伝子との反応が異なる物質が考えられる。物質の候補としては、当業者に公知であるものが含まれ、化学若しくは生物的化合物、例えば上述したようなセンス又はアンチセンス核酸配列、結合タンパク質、キナーゼ、及び他のあらゆる遺伝子又は遺伝子産物アゴニスト若しくはアンタゴニストが含まれる。前記物質は、疾病を引き起こす対立遺伝子の効果をモジュレートすることができるものであることが好ましいであろう。もっとも好ましくは、前記物質は、リスク対立遺伝子の有害な効果を軽減することができる物質である。
【０１３５】
このような物質は、予防的な投与にも、又は疾病であると診断された後の投与にも適しているかもしれない。投与経路は、治療すべき疾病又は症状に応じて適切に選択されるが、本発明の物質を投与する典型的な経路には、経口、直腸、静脈内、非経口、筋肉内、皮内経路が含まれる（これらに限定されるものではない）。本発明は、ＤＮＡ又はＲＮＡの何れかとして（従って、遺伝子治療の形態として）投与すべき物質も提供する。前記物質は、リポソーム、ウイルスベクター、及び被覆粒子（遺伝子銃）等の手段によって直接細胞中に送達することができるが、これらに限定されるものではない。
【０１３６】
本発明の第十四の側面では、上記した本発明の物質若しくは抗体、又はアレルギー、及び喘息等のアトピー性疾患、又は炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎やクローン病）、及び慢性関節リウマチや強直性脊椎炎等の炎症性関節疾患、又は乾癬、多発性硬化症、又はＩＩ型糖尿病の予防又は治療における使用が提供される。
【０１３７】
アレルギー、及び喘息等のアトピー性疾患、又は炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎やクローン病）、及び慢性関節リウマチや強直性脊椎炎等の炎症性関節疾患、又は乾癬、多発性硬化症、又はＩＩ型糖尿病の予防又は治療に使用するための医薬の製造における上述した物質又は抗体の使用も提供される。
【０１３８】
本発明の第十五の側面によれば、上述したような本発明の核酸又はポリペプチド配列を含む薬学的組成物が提供される。あるいは、該薬学的組成物は、上記側面に関連して説明した物質又は本発明の第四の側面に係る抗体を含んでもよい。
【０１３９】
薬学的組成物の投与は、任意の効果的な経路（例えば、経口又は非経口）によって行われる。非経口送達法には、局所、動脈内、皮下、髄内、静脈内、又は鼻腔内投与が含まれる。投与は、羊水穿刺関連技術によっても実施することができる。皮下注射に引き続いて経口投与するのが、好ましい取り込みの経路であろう。長期作用する固定化も使用されるであろう。活性成分に加えて、これらの薬学的組成物は、活性な化合物を薬学的に使用可能な調製物に加工することを容易にする賦形剤やその他の化合物を具備する薬学的に許容される適切な担体を含有してもよい。調剤と投与のための技術についてさらに詳しく知るには、「ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ‘Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ，Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ）」の最新版を参照されたい。
【０１４０】
経口投与用の薬学的組成物は、本分野において周知の薬学的に許容される担体を用いて、経口投与に適した製剤に調合することができる。このような担体によって、前記薬学的組成物は、患者の摂取に適した錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として調合することが可能となる。
【０１４１】
本発明での使用に適した薬学的組成物には、前記活性成分が意図する目的を達するのに有効な量で含有される組成物が含まれる。このように、治療的有効量とは、治療されている疾病の症状を改善又は根絶するのに十分な量のことである。実際に投与される量は、治療を施すべき個体に応じて変動し、重大な副作用を生じずに所望の効果が実現される最適化された量であることが好ましいであろう。治療的有効量の決定は、明らかに当業者の能力の範疇に属する。もちろん、当業者であれば、分割投与や部分投与も本発明の範囲に属することは理解できるであろう。
【０１４２】
何れの化合物の場合でも、治療的有効量は、まず、細胞培養アッセイ又は任意の適切な動物モデルの何れかで推定することができる。これらのアッセイは、下流のプロセシング活性の他に、受容体活性を考慮に入れなければならない。動物モデルは、望ましい濃度範囲や投与経路を達成するためにも使用される。次いで、このような情報は、ヒトでの投与に有用な用量と経路を決定するために使用することができる。
【０１４３】
治療的有効量とは、症候又は症状を改善する物質の量を指す。このような化合物の治療的な有効性と毒性は、細胞培養又は実験動物での標準的な薬学的手技によって決定することができる（例えば、ＥＤ５０、集団の５０％で治療的に有効な用量、ＬＤ５０、集団の５０％に対して致死的な用量）。治療効果と毒性効果の用量比が治療指数であり、比率ＥＤ５０／ＬＤ５０で表すことができる。大きな治療指数を示す薬学的組成物が好ましい。細胞培養アッセイと動物実験から得られたデータは、ヒトに使用するための投薬量の範囲を策定する際に使用される。このような化合物の投薬量は、毒性をほとんど又は全く示さずにＥＤ５０を包含される循環濃度域中に収まることが好ましい。投薬量は、用いる投薬形態、患者の感受性、及び投与経路に応じてこの範囲内を変動する。
【０１４４】
正確な投薬量は、治療を受ける患者を顧慮して、各医師が選択する。投薬量と投与は、十分なレベルの活性部分を与えるように、又は所望の効果を維持するように調節される。考慮に入れなければならないことがあるその他の要素には、病状の重さが含まれる。長期にわたって作用する薬学的組成物は、当該剤形の半減期やクリアランス速度に応じて、３乃至４日毎、一週間毎、又は二週間毎に一度の投与でもよい。投薬量や送達法についての手引きは、文献に記載されている（米国特許第４，６５７，７６０号、５，２０６，３４４号、及び５，２２５，２１２号を参照、本明細書に参考文献として援用される）。
【０１４５】
本発明の第十六の側面によれば、数多くのスクリーニングが提供される。第一のスクリーニングは、
請求項８乃至１３の何れか１項に記載のポリペプチド配列を準備することと、
ＤＰＰ１０の基質を準備することと、
検査すべき物質を準備することと、
前記ＤＰＰ１０の基質の加工（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）を測定することによって、前記検査すべき物質がＤＰＰ１０をモジュレートするかどうかを測定することと、
を備えたＤＰＰ１０活性をモジュレートする物質の同定を提供する。
【０１４６】
前記スクリーニングの成分は、任意の自由な順序で混合される。
【０１４７】
前記スクリーニングアッセイにおいて、ＤＰＰ１０は、請求項８乃至１３の何れか１項に記載されている任意のＤＰＰ１０であり得る。β−プロペラドメイン、フィブロネクチン結合ドメイン、又は別の細胞外マトリックス結合ドメインのようなＤＰＰ１０分子の断片を使用してもよい。また、本発明のＳＮＰ核酸配列を一以上備えたＤＰＰ１０ポリペプチド（請求項３７乃至４１の何れか一項に記載されているもの等）も使用し得る。前記ＤＰＰ１０ポリペプチドは、精製されていてもよいし、精製されていなくてもよい。前記ＤＰＰ１０ポリペプチドは、可溶性であり得る。ＤＰＰポリペプチドは、前記ドメインを一以上備え得る。
【０１４８】
検査される物質は、ＤＰＰ１０が関連する又はＤＰＰが媒介する疾病又は疾患の予防又は治療に使用するために同定されている。このような疾病又は疾患には、喘息、湿疹、花粉症（アトピー性疾患として知られる）、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎又はクローン病）、炎症性関節疾患（慢性関節リウマチや強直性脊椎炎等）、乾癬、多発性硬化症等の炎症性の要素を伴う脳疾患、又はＩＩ型糖尿病又は高血圧が含まれる。
【０１４９】
ＤＰＰ１０の基質は、本発明のＤＰＰ１０ポリペプチドによって加工される任意のものであり得る。加工される（ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ）とは、測定可能なあらゆる変化を意味する。基質には、式ＸＰＸＳ、より具体的には式ＮＨ２Ｘ−Ｐ（Ｘ）ｙＳ−（Ｘ）ｎを備え得る（ここで、ＮＨ２はアミノ末端であり、Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｐはプロリンであり、Ｓはセリンであり、７は１乃至４であり、ｎは任意の数である）。前記基質は、図１９中のもの等のＸＰＸＳモチーフを含有するサイトカイン、すなわち、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ−１，ＥＯＴＡＸＩＮ、ＩＰ１０、ＭＣＰ２、ＩＬ１７β、ＩＬ２、ＧＣＰ−２、ＩＬ１８ｂｐ、ケモカインＣＣ−１／ＣＣ−３、インターロイキン−８、ＣＴＡＫ／ＡＬＰ／ＬＩＣ、又はこのようなモチーフを有する小ペプチドであり得る。これらの基質は、加工を容易に検出できるようにするために、蛍光標識又は蛍光修飾し得る。このような標識又は修飾は、当業者に公知である。
【０１５０】
典型的には、基質の加工は、プロテアーゼ活性を測定することを具備するものと思われ、例えば、このようなプロテアーゼ活性は、基質の切断によって検出し得る。モジュレーションとは、酵素の活性の増加又は減少の何れかを意味するものとする。このような活性は、ＤＰＰ１０の発現の変化又はＤＰＰ１０の半減期の変化又はＤＰＰ１０の翻訳後修飾の変化によって影響を受け得る。
【０１５１】
本発明は、さらに、ＤＰＰ１０活性をモジュレートする物質を同定するためのスクリーニングであって、
請求項８乃至１３の何れか一項に記載されているＤＰＰ１０ポリペプチドを準備することと、
検査すべき物質を準備することと、
細胞を準備することと、
前記細胞の表面への接着を測定することによって、検査すべき前記物質がＤＰＰ１０をモジュレートするかどうかを測定することと、
を備えたスクリーニングを提供する。
【０１５２】
このようなスクリーニングは、細胞接着スクリーニング（又はアッセイ）と称することができる。前記スクリーニングの成分は、任意の自由な順序で混合される。
【０１５３】
典型的には、細胞接着アッセイで使用される細胞は、懸濁液中に維持することができ、懸濁液の中で、細胞間接着分子の相互作用に起因する細胞の凝集により接着が測定される。あるいは、表面への接着を測定してもよい。表面は、非生物分子（例えば、組織培養プラスチック）であってもよく、あるいは、細胞性又は非細胞性である生物分子であってもよい。非細胞性分子の例には、フィブロネクチン、コラーゲン等の細胞外マトリックス成分が含まれる。一以上の細胞又はその他の非細胞生物分子を組織培養表面又は細胞外マトリックス成分被覆表面等の表面に接着させてもよい。接着は、表面への細胞の接着を測定することによって判定される。細胞接着のモジュレーションは、細胞接着の増加又は細胞接着の減少の何れかであり得る。ＤＰＰ１０活性に影響を及ぼせば、ある物質はＤＰＰ１０活性のモジュレーターであると考えられ、これは、ＤＰＰ１０分子の発現のレベルであるか、又はＤＰＰ１０分子の半減期を変化させることによるか、又はＤＰＰ１０分子の翻訳後修飾状態に影響を及ぼすことによるものであり得る。
【０１５４】
本発明のさらなる側面は、ＤＰＰ１０活性をモジュレートする物質を同定するためのスクリーニングであって、
請求項８乃至１３の何れか一項に記載されているＤＰＰ１０ポリペプチドを準備することと、
検査すべき物質を準備することと、
細胞を準備することと、
前記細胞の分化又は増殖の変化を測定することと、
を備えたスクリーニングを提供する。
【０１５５】
前記スクリーニングの成分は、任意の自由な順序で混合される。
【０１５６】
典型的には、分化は、当業者に公知の任意の手段によって測定することができ、例えば、Ｔリンパ球の場合、分化の変化はＴ細胞活性化であり得る。他の細胞種の場合には、免疫調節物質（例えば、サイトカイン又は増殖因子）等の分泌可能な細胞シグナル伝達因子の産生の誘導又は抑制であり得る。免疫調節物質はペプチドであり得るし、あるいは、ＤＰＰ１０をモジュレートする物質によって発現が変化を受ける他の任意の生物物質でもあり得る。典型的には、このアッセイは、インビトロで、例えば組織又は臓器培養中で行われる。
【０１５７】
表現型の変化は任意の変化であり得る。これには、Ｔ細胞及び／又はＢ細胞表現型の変化が含まれ得る。
【０１５８】
このようなスクリーニングは、ＤＰＰ１０活性をモジュレートする物質を同定するためのインビトロモデルを提供する。
【０１５９】
本発明のさらなる側面は、ＤＰＰ１０活性をモジュレートする物質を同定するためのスクリーニングであって、
請求項２３乃至２５又は５９の何れか一項に記載のトランスジェニック動物を準備することと、
検査すべき物質を準備することと、
前記トランスジェニック動物を検査すべき前記物質に接触させることと、
前記トランスジェニック動物の表現型の変化を検出することと、
を備えたスクリーニングが提供される。
【０１６０】
前記スクリーニングの成分は、任意の自由な順序で混合される。
【０１６１】
前記物質を検査すべき細胞は、懸濁液中に、組織培養中に、臓器の一部として、又は動物の一部として存在することができる。好ましくは、前記動物は、ラット、ウサギ、マウス、又はその他の齧歯類等の実験動物である。
【０１６２】
本発明のさらなる側面は、ＤＰＰ１０をモジュレートする物質の使用に伴う副作用を検出するためのスクリーニングであって、
ＤＰＰ１０を実質的に発現しない細胞を準備することと、
検査すべき物質を準備することと、
検査すべき前記物質を前記細胞に接触させることと、
前記物質によって前記細胞に生じた何らかの副作用を測定することと、
を備えたスクリーニングを提供する。
【０１６３】
前記スクリーニングの成分は、任意の自由な順序で混合される。
【０１６４】
測定すべき副作用は任意の副作用であり得、細胞がこれより大きな組織又は動物の一部であるかどうかに依存するかもしれない。これには、細胞の分化、又は細胞の増殖の変化が含まれ得る。前記副作用は、臓器又は動物の表現型の変化の指標であり得る。
【０１６５】
本発明のさらなる側面は、ＤＰＰ１０活性をモジュレートする物質を同定するスクリーニングであって、
請求項１乃至４の何れか一項に記載されているＤＰＰ１０核酸を準備することと、
検査すべき物質を準備することと、
前記核酸の試料との前記物質の相互作用を測定することによって、前記検査すべき物質がＤＰＰ１０をモジュレートするかどうかを測定することと、
を備えたスクリーニングを提供する。
【０１６６】
好ましくは、このスクリーニングは、ＤＰＰ１０の転写を測定するインビトロ転写アッセイである。
【０１６７】
あるいは、ＤＰＰ１０の理論的又はモデル特性を使用することによって、物質を同定してもよい。ＤＰＰ１０の機能的又は構造的特性は、タンパク質自体の特性であってもよいし、あるいはコンピュータで作製したモデル、物理的二次元若しくは三次元モデル、又は電気的（例えばコンピュータ）に作製した一次構造、二次構造、若しくは三次構造の特性、並びにファルマコフォア（三次元電子密度マップ）若しくはそのＸ線結晶構造の特性であり得る。
【０１６８】
物質の候補としては、当業者に公知のもの又は新規物質が含まれ、アンチセンスヌクレオチド配列、前記第二の側面のポリペプチド配列に結合するポリクローナル又はモノクローナル抗体等の化学的又は生物的化合物が含まれる。
【０１６９】
本発明の第十七の側面によれば、ＤＰＰ１０の活性をモジュレートする物質のスクリーニングにおける、上述した核酸配列又はポリペプチド配列の使用が提供される。
【０１７０】
前記方法は、好ましくは、本発明の先述した側面に記載の核酸又はポリペプチド配列に物質の候補を接触させることと、前記ヌクレオチド又はポリペプチド配列の発現及び／又は活性をモニタリングすることとを備える。物質の候補は、該物質の不存在下での活性又は発現に比べて、ＤＰＰ１０ヌクレオチド又はポリペプチド配列の活性又は発現を変化させる物質である。本方法は、本発明のヌクレオチド又はポリペプチドを供えた宿主細胞、組織培養、又はヒト以外のトランスジェニック動物に物質の候補を接触させることと、炎症性疾患を呈示する（ｄｉｓｐｌａｙ）こととによって実施し得る。
【０１７１】
前記第十六又は第十七の側面の方法によって同定された物質も提供される。
【０１７２】
本発明の第二の側面と以降の側面の好ましい特徴は、第一の側面と同様である。
【０１７３】
ここで、以下の図面と実施例を参照しながら本発明を説明するが、以下の図面と実施例は例示の目的で記載したものにすぎず、本発明を限定するものと解釈してはならない。
【実施例】
【０１７４】
実験例
実施した実験の概要：
喘息及び対照個体から得たＤＮＡ中のマーカーＤ２Ｓ３０８の周囲に存在する約４６２ｋｂのコンティグのセクションを再度配列決定することによって、新規なＳＮＰを同定した。３つの集団の喘息家族群全体にわたって、これらのＳＮＰの遺伝子型を特定した。伝達不均衡テスト（ＴＤＴ）によって、関連解析を実施して、喘息と正の関連を示すいくつかのＳＮＰを同定した。全てのＳＮＰから得た遺伝子型データを用いて、マイクロサテライトマーカーＤ２Ｓ３０８周囲の連鎖不均衡（ＬＤ）の程度、及び関連するＳＮＰを絞り込んだ。１１３，７９２ｂｐの領域の配列（関連マーカー及びＳＮＰを含み、ＬＤの島（Ｉｓｌａｎｄ）と名付けられた）を、転写物同定のために選択した。
【０１７５】
公的な配列データベースをコンピュータシミュレーションで解析することによって、ＬＤの島内には既知の遺伝子はマッピングされないことが示された。この領域内にマッピングされる発現配列タグ（ＥＳＴ）は、ＡＡ４２４２２６，Ｈ１０８２５、及びＡＡ４２６３７のみであった。従って、広範囲のＤＮＡ配列解析を実施して、１１３７９２ｂｐのＬＤの島の中に、コードＤＮＡ配列を同定した。エキソン予測アルゴリズムを用いて、６０ｂｐのコード配列の候補（ＭＥＸ４と命名された）を同定した。ＭＥＸ４を含むＤＮＡプローブを用いたｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによって、１３０１ｂｐのｃＤＮＡクローン（ＭＥＸ４ＦＢ−１）を同定した。Ｇｅｎｂａｎｋヌクレオチド（ｎｒ）データベースに対するＢＬＡＳＴＮ解析によって、２つの配列（ＡＢ０４０９２５、及びＡＫ０２５０７５）に対して１００％のヌクレオチド相同性を確認した。この情報を用いて、２３９１ｂｐの予想オープンリーディングフレームを有する複合性の全長ｃＤＮＡクローンを構築することが可能であった。続いて、ＭＥＸ４ＦＢ−１クローンの末端からの３’ＲＡＣＥ実験によって、この予想配列は、この遺伝子のＣ末端部分と３’ＵＴＲであることが確認された。さらにエキソン３から５’ＲＡＣＥ実験を実施して、５種の転写物中に整列された他の代替的Ｎ末端エキソンを６つ同定した。さらにＭｅｘ４／エキソン１ａからの３’ＲＡＣＥによって、Ｍｅｘ４／エキソン１ａとともに短いｃＤＮＡの一部を形成する１つのＣ末端エキソン（２ａ）がさらに同定された。ゲノム構造解析によって、この遺伝子が、２５のエキソンを含有し、且つ約１ＭＢの巨大な領域のゲノムＤＮＡにまたがることが示された。この構造に基づけば、マーカーＤ２Ｓ３０８はイントロン１の中に存在する。クローンＡＢ０４０９２５の配列は、エキソン３〜エキソン２５の一部をコードするが、イントロン１は数百ｋｂの長さなので、コンピュータシミュレーションによる予測プログラムは何れも、スプライシグングされたエキソン１ａの下流であることを予測しなかった。
【０１７６】
ＲＴ−ＰＣＲとノーザンブロット分析を実施して、ＤＰＰ１０発現を解析した。ＤＰＰ１０は、神経内分泌様式で強力に発現することが明らかになり、複数の転写物が存在する形跡が見られた。ＤＰＰ１０は、ＰＢＬ中でも発現されることが示され、全血ＲＮＡのＴａｑｍａｎ解析によって、喘息患者と対照での発現レベルを評価した。
【０１７７】
前記５つの転写物のうち２つから予想されるペプチド中には、膜貫通ドメインが存在する。続いて、Ｈｅｌａ細胞中にトランスフェクトされた構築物であって、転写物１及び２についてのエピトープタグ化ＤＰＰ１０構築物を用いた細胞局在化研究を行うことによって、これらの２つの転写物について予想されていた膜および細胞質への局在化が確認された。Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔタンパク質データベースに対するＢＬＡＳＴＸ解析によって、ジペプチジルペプチダーゼ（プロリル−オリゴペプチダーゼ）として知られている一群のタンパク質との有意な相同性が検出されたが、ＤＰＰ６との相同性が最大であった。染色体２ｑ１４に位置する該遺伝子は、新規ジペプチジルペプチダーゼであるＤＰＰ１０に相当する。
【０１７８】
実施例１
ＳＮＰの発見及び関連試験
被験体及び遺伝子型検査
被験体に対して、改変英国ＭＲＣ呼吸アンケート（ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｂｒｉｔｉｓｈ ＭＲＣ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ）を実施した。「あなたは今までに喘息の発作を経験したことがありますか？」という問い、及び「イエスであれば、その発作は２回以上発生しましたか？」という問いに対して肯定した場合を「喘息」とした。「あなたの胸は、今までに喘鳴又は笛声音（ｗｈｉｓｔｌｉｎｇ）を生じたことがありますか？」という問い、及び「イエスであれば、その症状は２回以上発生しましたか？」という問いに対して肯定した場合を「喘鳴」とした。総血清ＩｇＥは、全ての小児で測定した。イエダニ及び花粉に対する皮膚試験を実行した。
【０１７９】
３つのグループの被験体を研究した。
【０１８０】
パネルＡ パネルＡは、２３０の家族からなるオーストラリア人の標本から二次的に選択した８０の核家族からなった。このグループには、１７２の同胞対（ｓｉｂ−ｐａｉｒ）を形成する合計２０３の子孫が含まれていた。小児のうち１２％が喘息であった。
【０１８１】
パネルＢ 連合王国（イギリス）の喘息及びアレルギーの診療所から募集した７７の核家族及び大家族からなる。これらの家族は、２１５の子孫（２６８の同胞対）を含み、その５６％が喘息であった。
【０１８２】
パネルＣ オックスフォード地方の喘息診療所に訪れた小児から募集した８７の核家族からなる。この家族は、２１６の子孫（１４８同胞対）を含み、その４４％が喘息患者であった。
【０１８３】
ポジショナルクローニング及びＳＮＰの発見
本発明者らは、１．５Ｍｂの遺伝子座をカバーする広域ＢＡＣ／ＰＡＣコンティグを構築し、Ｄ２Ｓ３０８を囲む４つの連続するクローンから約４６５ｋｂを配列決定した。喘息を有する及び有しない、無関係な５人の被験体と５人の対照、並びに無関係な３２の個体から得たＤＮＡのプールを配列決定することによって、リピートが存在しないＤＮＡの領域に対してＳＮＰ検出を系統的に実行した。
【０１８４】
小さな対立遺伝子の頻度が２０％より大きい１００個のＳＮＰを同定し、そのうちの６７を、本発明者らの被験体上で遺伝子型決定した。ＳＮＰのタイピングは、ＰＣＲと制限消化によって行った。天然の制限配列の非存在下において、ある部位を生成するようにプライマーを改変した（プライマー対を、表２に示す）。ＭＥＲＬＩＮコンピュータプログラム（Ａｂｅｃａｓｉｓ ２００１）によって、誤差の検討とハプロタイプの作製を実行した。親のハプロタイプから得たＤ’を評価することによって（Ａｂｅｃａｓｉｓら、Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ５９ ３２３−３６（１９９５））、マーカー間の連鎖不均衡（ＬＤ）を評価し、ＧＯＬＤプログラム（Ａｂｅｃａｓｉｓら、Ｂｉｏｉｎｆａｒｍａｔｉｃｓ １６ １８２−３（２０００））によって描出した。ＬＤは、４つの異なる島（Ａ、Ｂ、Ｂｉｉ、及びＣ）に分散していた（図２２ａ）。島部Ａと島部Ｂとの間の境界は、５４３ＷＴＣ９１Ｐ、及び５４３ＷＴＣ１２２ＰのＳＮＰが隣接していた（表１ａ、１ｂ、及び１ｃ）。
【０１８５】
関連試験
伝達不均衡試験によって、喘息とＳＮＰとの間の関連を探求した（Ｓｐｉｅｌｍａｎら、Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ５９ ９８３−９（１９９６））（表３）（図１）。正の関連は、ＬＤの島部Ｂに限定していた（図２２ｂ）。最高の関連は、５４３ＷＴＣ１２２Ｐ ＳＮＰ（Ｄ２Ｓ３０８に対して約１Ｋｂ近位）で観察され、これより弱い関連が、５４３ＷＴＣ１１０Ｐと３１７ＷＴＣ５９Ｐとの間に（９Ｋｂ及び５９ｋＢ離れている）、より遠位で観察された（表３）。
【０１８６】
分散成分解析によって、Ｌｏｇｅ（ＩｇＥ濃度）（ＬｎＩｇＥ）とＳＮＰとの関連を探求した（Ａｂｅｃａｓｉｓら、Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ６６ ２７９〜１２９２（２００１）（表３）。ＬＤの島部Ａの中に、約６０Ｋｂの領域にわたって、関連についてのさほど強固でない証拠が検出された。島部Ａと島部Ｂ間のＬＤが完全に分離していることは、このＱＴＬが、喘息状態に影響を与える島部Ｂ由来の多型とは異なることを示唆していた。Ｄ２Ｓ３０８の対立遺伝子は、ＷＯ９９／５０４５１に記載されている。
【０１８７】
ＤＰＰ１０遺伝子の３’ＵＴＲに位置する、ＳＮＰ ＤＰ１００７（表１ｃ）は、Ｒａｓｔｉ（ｐ＝０．００２）、Ｐｓｔｉ（ｐ＝０．００７３）、及びｌｏｇｅ（ｐ＝０．０２６３）に対して正の関連を示した。
【０１８８】
実施例２
新規ジペプチジルペプチダーゼ様遺伝子ＤＰＰ１０の完全長配列の決定
遺伝子の同定
前記関連した配列領域内の遺伝子を同定するために、公的な配列データベース（Ａｌｔｈｓｃｈｕｌら、１９９７）に対するＢＬＡＳＴ解析を用いて、配列類似性の検索を実施した。報告されている遺伝子に対する有意な配列同一性又は類似性は確認されなかった。この領域中に存在する何れかのコード配列に関する証拠は、２つのＥＳＴ；Ｈ１０８２５（ＩＭＡＧＥクローン４６９８２）及びＡＡ４２６３７７（ＩＭＡＧＥクローン７５７４９５）に対する、ＤＮＡ配列のマッチングのみであった。
【０１８９】
保存されたエキソンの同定
解析の次の段階は、エキソン推定ソフトウェアを用いることによって、１１３，７９２ｂｐのＤＮＡ配列中にコード領域の候補を同定することであった。ＬＤの細密領域由来の配列を、ヒトゲノムマッピングプロジェクトリソースセンター(Human Genome Mapping Project(HGMP)Resource Centre)のＮＩＸサイト(http://www.hgmp.mrc.ac.uk/homepage.html)に登録することによって、エキソン予測解析に供した。このサイトは、以下のエキソン予測プログラムを組み込んでいる；Ｇｒａｉｌ／ｅｘｏｎ、Ｇｒａｉｌ／ｇａｇ２、ＭＺＥＦ、ＧＥＮＳＣＡＮ、Ｇｅｎｅｍａｒｋ、ｈｍｍ ｇｅｎｅ、ＦＧＥＮＥ、ＦＥＸ、Ｇｅｎｅｆｉｎｄｅｒ、及びＦＧＥＮＥＳ。全てのＤＮＡ配列解析について、デフォールトセッティングを用いた。
【０１９０】
１００を超えるエキソンがこの領域中に予測され、そのうち６６は２つ以上のプログラムによって予測された。重複して予測されたエキソンの群には、ＭＥＸ４と命名された６０ｂｐのエキソンが含まれていた。この予測されたエキソン配列の配列は、図２ａに詳述されている。ＦＧＥＮＥ／ＦＥＸソフトウェアによって、ＭＥＸ４を同定したところ、それぞれ０．６５、及び０．７の有意なスコアであった。前記連鎖不均衡の細密領域内でのＭＥＸ４の位置と、ＤＮＡマーカーＤ２Ｓ３０８に対するＭＥＸ４の配置が図２ｂに示されている。
【０１９１】
２つ以上のアルゴリズムによって予測されたエキソン配列の候補に対して、ＰＣＲプライマーを設計した。これらのオリゴヌクレオチドプライマー対から生成したＰＣＲ産物を、「ズーストリップ（ｚｏｏ ｓｔｒｉｐｓ）」（ヒト及びマウスのゲノムＤＮＡに由来する、制限酵素で消化ＤしたＮＡを含有するサザンブロット）に対して低ストリンジェンシーなハイブリダイゼーションで用いた。ＭＥＸ４は、マウスＤＮＡのレーンに弱いハイブリダイゼーションを示した（データ示さず）ので、前記２つの種の間で保存された配列を保有していると考えられ、機能的なコードＤＮＡ配列の存在を示唆している。
【０１９２】
ライブラリーのスクリーニング
ＭＥＸ４配列を含有するプローブを用いて、λ三重ファージベクター（ｌａｍｂｄａ−ｔｒｉｐｌｅｘ ｐｈａｇｅ ｖｅｃｔｏｒ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中に調製された市販の胎児脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。約百万個のファージクローンを、２０個の１５ｃｍのＬｕｒｉａアガープレート上に播種して、１３２ｍｍの円形ナイロン転写膜（Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋，Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて、複製コロニーリフトを実施した。、全ての手順は、ライブラリーメーカーの公開プロトコールに従って実施した(http://www.clontech.com/libraries/#techinfo,protocol PT3003-1,ハ゛ーシ゛ョンPR09529)。
【０１９３】
製造業者の指示に従って、無作為標識化キット（「Ｐｒｉｍｅ−ｉｔ ＲｍＴ ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ」を用いて、α３２Ｐ−ｄＣＴＰでＭＥＸ４プローブを標識して、Ｇ５０ Ｓｐｉｎカラム（Ｑｕｉｃｋ ＳｐｉｎＴＭカラム、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を通して精製した。このライブラリーフィルターセットを、リン酸／ＳＤＳ緩衝液（０．５Ｍ ＮａＰＯ４，７％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を用いて、６５℃で１６時間ハイブリダイズした。６５℃で３０分間、２Ｌの２×ＳＳＣ／０．０１％ＳＤＳを用いて２回、６５℃で３０分間、１×ＳＳＣ／０．０１％ＳＤＳを用いて１回フィルターを洗浄し、次いで、シグナル増感スクリーン（Ｈｙｐｅｒｓｃｒｅｅｎ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて、２日間、オートラジオグラフィーのフィルム（Ｋｏｄａｋ Ｘ−ＯＭＡＴ）に曝した。
【０１９４】
重複する陽性プラークがこのフィルター上に３つ同定された。切断した１ｍｌピペットの先端を用いて、各プールの陽性ファージプラークの「中心を抜き出し」た。１ｍｌのλファージ希釈緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、３５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．０１％ゼラチン）を含有する、２ｍｌのスクリューキャップ微量遠心管に、アガーのプラグ及びプラークを加えた。１：１００、１：１０００、及び１：１０，０００のファージ希釈物を調製して、一連の二次プレート上に播種した。上記のようにコロニーリフトを行い、上記のようにＭＥＸ４プローブを用いてフィルターをハイブリダイズさせた。
【０１９５】
この段階で、１つの陽性クローンを選択してさらなる検討に進めた。これをＭＥＸ４ＦＢ−１と命名した。このクローンでは、ハイブリダイズしている単一のプラークが利用可能であった。切断した１ｍｌピペットの先端を用いて１つのプラークの中心を抜き出し、３５０μｌのλファージ希釈緩衝液を用いて希釈した。ライブラリー製造業者の指示に従って、ＢＭ２５．８細胞の１０ｍｌのＬｕｒｉａブロス培養物を、３１℃で一晩（Ｏ／Ｎ）増殖させて、回収したファージプラーク１５０μｌを接種し、プラスミド抽出を実施した。５０μｇ／μｌのアンピシリンを含有するＬｕｒｉａアガープレート上に、２０μｌの最終プラスミドブロスを播種して、３７℃で一晩インキュベートした。
【０１９６】
プラスミドＤＮＡの調製
ＭＥＸ４ＦＢ−１の２つのコロニーを前記プレートから拾い上げて、５０μｇ／μｌのアンピシリンを補充した１０ｍｌのｌｕｒｉａブロス中において、３７℃で一晩、振盪増殖させた。製造業者の指示に従って、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、プラスミドＤＮＡを単離した。ＤＮＡ蛍光光度計（Ｈｏｅｆｆｅｒ Ｌｔｄ）を用いて、配列決定のために、ＤＮＡ収率を定量した。
【０１９７】
配列決定
ｄｙｎａｍｉｃ ＥＴ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）のプロトコールに従って、プラスミドを配列決定した。最初に、フォワード及びリバースのベクター配列決定プライマー：ｃＤＮＡｌｉｂｓｅｑ．Ｒ［ｄＴＣＣＧＡＧＡＴＣＴＧＧＡＣＧＡＧＣ］及びｃＤＮＡｌｉｂｓｅｑ．Ｒ［ｄＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ］を用いた。２つのプラスミド末端の読み取りから得られたＤＮＡ配列は、重複していなかったため、２つの内部ウォーキングプライマー（ＭＥＸ４−６ＦＢ２１．ＦＷ［ｄＴＴＴＧＴＧＣＴＴＣＡＣＧＡＴＣＣＡＧＡＧＧ］及びＭＥＸ４−６ＦＢ２１．ＲＷ［ｄＧＡＴＧＴＣＡＧＴＣＧＣＡＡＴＧＡＡＣＴＧＣ］）を用いた配列決定も行って、完全長の挿入配列を得た。この１，３０１ｂｐの配列を図２ｃに示す。プラスミド調製段階で拾い上げたＭＥＸ４ＦＢ−１の２つのコロニーの両方から、同一の配列が得られた。
【０１９８】
各ＤＮＡ配列決定反応には、４００ｎｇのテンプレートＤＮＡ、０．２５ｐｍｏｌのプライマー、８μｌのＥＴ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ混合液、及び最終反応容積２０μｌにするための蒸留されたＨ２Ｏを用いた。用いたサイクル条件は、９６℃３０秒間、５０℃２０秒間、６０℃１分を２５サイクル、さらにＤＮＡ精製の前に４℃で最終保持サイクルであった。ゲル濾過（ｐ１０ゲル）、続いて、エタノール沈殿によって、配列決定産物を精製した。乾燥したＤＮＡペレットを、２μｌの脱イオンホルムアミドに再懸濁して、９６℃で２．５分間変性させ、続いて氷上で急速冷却させた。各々反応物１μｌを４８ｃｍの配列決定ゲル上にロードして、ＡＢＩ ３７７シーケンサーで１０時間泳動させて、フィルターセットＡを用いてデータを収集した。ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲＴＭ配列解析ソフトウェア、バージョン４．０．５ｂ５（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｉｎｃ．）を用いて、配列のトレースを解析した。
【０１９９】
重複するクローンを決定するためのＢＬＡＳＴＮによる配列解析
ＧｅｎｂａｎｋヌクレオチドＮＲデータベース（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７）に対するＢＬＡＳＴＮ解析では、何らかの配列マッチングを同定するために、ＭＥＸ４ＦＢ−１クローン配列を用いた。ＭＥＸ４ＦＢ−１ヌクレオチド４０９−１３０１から、部分ｃＤＮＡクローンＫＩＡＡ１４９２（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＢ０４０９２５）の５’末端に対して１００％のヌクレオチドマッチングが見出された（Ｎａｇａｓｅら、２０００）。このクローンは、ＭＥＸ４ＦＢ−１の末端から３’の方向に３，３４９ｂｐ伸長している。ＡＢ０４０９２５の完全長配列は、Ｅｎｔｒｅｚヌクレオチド研究施設を用いて、National Center for Biotechnology Information(NCBI)のウェブサイト(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)から読み取った。この全長ＡＢ０４０９２５の配列も、ＮＲデータベースに対するＢＬＡＳＴＮ解析に供した。これによって、第二のｃＤＮＡクローンであるＡＫ０２５０７５（２，２２５ｂｐ長であり、２，２１０ｂｐにわたってＡＢ０４０９２５と９９％のマッチングを有する）が、同定された。唯一のミスマッチは、このクローンの３’末端であり、ＡＫ０２５０７５にはポリＡテールが存在するが、ＡＢ０４０９２５には存在しない。従って、２つのｃＤＮＡ ＡＢ０４０９２５とＡＫ０２５０７５の長さは異なるので、この遺伝子には、２つの異なる３’末端が存在し得ると考えられる。これらのアラインメントの模式図を図３に示す。
【０２００】
ＡＢ０４０９２５配列中に存在する最初の利用可能なメチオニン残基は、＋２リーディングフレーム中に存在し、クローンの５’末端から５０９ｂｐ離れている。この位置からの予想オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、１，６２９ｂｐの大きさである。このメチオニンの上流は、１６９コード残基であり、全長ＯＲＦに当る。このことは、報告されたＡＢ０４０９２５配列が、完全長ではないことを意味している。ＭＥＸ４ＦＢ−１クローンを、重複するＡＢ０４０９２５配列と合わせることによって、ヌクレオチド位置１６５に、開始メチオニンを同定した。このメチオニンの上流には、単一のコード残基が存在し、終止コドンがこれに先行する。従って、ＭＥＸ４ＦＢ−１配列の付加によって、この遺伝子の正確な５’末端と開始コドンが提供され、７９６アミノ酸残基をコードする２，３９１ｂｐの予想ＯＲＦがもたらされる。クローンＡＫ０２５０７５の配列によって与えられる短い方の３’末端を利用して、これら３つのクローンから得られた配列をつなぎ合わせた配列が図４に示されている。
【０２０１】
ゲノム構造を決定するためのＢＬＡＳＴＮによる配列解析
ＨＴＧＳデータベース（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７）に対するＢＬＡＳＴＮ解析では、前記混合したｃＤＮＡクローンから得られる複合ＤＮＡ配列（図４）を用いた。これによって、前記遺伝子配列の一部を含有する複数のＢＡＣクローンが同定された。このｃＤＮＡ配列内に合計計２４個のエキソンが同定された（図９、及び１０）。２番染色体２上におけるこれらのＢＡＣクローンの相対的位置を比較することによって、ＤＰＰ１０遺伝子は、ゲノムＤＮＡの巨大な領域にまたがることが明らかである。（http://genome.ucsc.edu/goldenPath/septTracks.html、及びhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/Entrez/hum_srch?chr=hum_chr.inf&query）。表１ａ〜１ｃに詳細に記載したほとんどのＢＡＣは、作業の途上にあり、未完成の状態なので、現在の評価は変化することもあり得るが、この遺伝子は、染色体２ｑ１４に位置約１．２ＭｂのＤＮＡにまたがっていると考えられる。
【０２０２】
発現解析：
以下のプライマー：
ＭＥＸ４．Ｆ１［ｄＡＡＣＣＡＡＡＣＴＧＣＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣ］；
ＭＥＸ４．Ｒ１［ｄＡＡＧＡＣＧＧＡＧＴＣＣＴＣＴＡＣＴＴＣＴＧＧ］；及び
ＭＥＸ４．Ｒ２［ｄＡＴＧＧＡＣＣＡＡＣＴＣＡＣＡＣＴＴＴＧＧＡＧＣ］、
を設計して、成体脳由来のｃＤＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＭＥＸ４エキソンが、単離された胎児脳クローンの他に、別のｃＤＮＡ源において、クローンＡＢ０４０９２５、及びＡＫ０２５０７５中に見出されたＤＰＰ１０エキソン配列に連結されることを確認するために、この実験を行った。プライマーＭＥＸ４．Ｆ１は、ＭＥＸ４エキソンの始まり（ＤＰＰ１０エキソン１）に位置し、プライマーＭＥＸ４．Ｒ１は、ＤＰＰ１０エキソン６に、プライマーＭＥＸ４．Ｒ２は、エキソン１０に位置する。ＭＥＸ４．Ｆ１がＭＥＸ４．Ｒ２とともに使用されるときには、ＭＥＸ４．Ｆ１をＭＥＸ４．Ｒ１及び９１９ｂｐの産物と組み合わせて用いれば、５１９ｂｐの産物が予想される。用いたＰＣＲ条件は、約５０ｎｇのｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ ｒｅａｄｙ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（各プライマーを１０ｐｍｏｌ有する５０μｌの反応物に含有）、２．５μＭ ｄＮＴＰ １．５ｍＭ 塩化マグネシウム、及び０．５単位のＡｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄ（１×ａｍｐｌｉｔａｑ ｇｏｌｄ緩衝液ＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に含有）であり、サイクル条件は、９５℃で１回の１２分間のサイクル、次いで、９４℃の変性１５秒間、６０℃のアニーリング温度で１５秒間、及び７２℃３０秒間を３８サイクル、その後に７２℃で５分間であった。ゲノムＤＮＡの５０ｎｇのアリコートを、陰性対照として用い、非ＤＮＡ対照も用いた。標準的な方法を用いて、１×ＴＢＥで調製した１％アガロースゲル上において、各反応物の分取試料５μｌを泳動した。結果を図２０に示す。各々の反応物について脳のレーンに、明確なバンドが見られ、このことは、胎児脳ｃＤＮＡと同様に、成体脳においても、ＭＥＸ４エキソンが発現されており、ＤＰＰ１０下流エキソンに連結されていることを示している。
【０２０３】
５１９ｂｐのＲＴ−ＰＣＲ産物を、製造業者の指示に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製して、ノーザンブロット解析におけるプローブとして用いた。２３の異なる組織から得られたｍＲＮＡに相当する、購入した３つのノーザンブロット（ＭＴＮＩ、ＭＴＮＩＩ、及びＭＴＮＩＩＩ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に対して、単一の標識プローブ５０ｎｇをハイブリダイズさせた。α３２Ｐ−ｄＣＴＰでの標識は、ｃＤＮＡライブラリースクリーニングについて報告されたとおりであった。ハイブリダイゼーションは、ＥＸＰＲＥＳＳＨＹＢＥＴＭ緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中、６５℃で行った。洗浄は、５０℃で３０分間、５００ｍｌの２×ＳＳＣ／０．０１％ＳＤＳを用いて２回、５０℃で３０分間、５００ｍｌの１×ＳＳＣ／０．０１％ＳＤＳを用いて１回行った。次いで、シグナル増感スクリーンを用いて、フィルターを、２日間、オートラジオグラフのフィルムに感光させた。
【０２０４】
結果を図１３に示す。４８時間の曝露後、ハイブリダイズしている３．６〜４．１ｋｂの二つの別個のバンドから構成される二重のバンドが、膵臓、精巣、脊髄、及び副腎で明確に観察された。これよりずっと弱いこれらの産物の発現が、胎盤、肝臓、及び小腸で観察された。この二重バンドは、これより大きな５．２ｋｂと７．５ｋｂの二つのさらなる転写物に加えて、脳にも見られた。全体的に、脳、膵臓、及び副腎で最強の発現が観察された。
【０２０５】
組織及び細胞株由来のｃＤＮＡに対して、さらにＲＴ−ＰＣＲを実施した。ヒトＰＢＬで、ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、＃７６２１３２）を用いた場合を除き、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、＃７４１０４）を用いて、様々な細胞株及び組織からＲＮＡを抽出した。ＯＭＮＩＳＣＲＩＰＴ 逆転写酵素キット（Ｑｉａｇｅｎ，＃２０５１１１）、続いてＨｏｔＳｔａｒ Ｔａｑ ＰＣＲキットを用いるＰＣＲによって、ＲＮＡからｃＤＮＡを調製した。３８サイクル（１サイクルについて、９５℃１分、５４℃１分、及び７２℃１分）でＰＣＲを実施した。多数の異なるＰＣＲプライマー対を用いた。これらは、エキソン１ａ〜７（転写物１特異的）と、エキソン１ｂ〜７（転写物２特異的）と、エキソン１ｆ及び７（転写物５特異的）の間で増幅した。エキソン２及び７と、エキソン１９及び２５との間で増幅するプライマー対（全ての転写物に存在すると予測される）も用いた。最後の２つのプライマー対は、マウスの転写物２（ｍｕｓ−エキソン１ｃ〜７）及び転写物３（ｍｕｓ−エキソン１ｅ〜７）の存在について試験した。これらのプライマー配列は、表４ａに存在する。発現データは、表４ｂに要約されている。
【０２０６】
新規肝臓転写物のＲＴ−ＰＣＲクローニング：
エキソン１ｇ及び１０中のプライマーを用いる肝臓ｃＤＮＡに対するＲＴ＿ＰＣＲによって、予想外のサイズのバンドが増幅された。製造業者の指示に従って、これらのバンドをＴＯＰＯ２．１ＰＣＲクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングした。挿入物陽性のクローニングを配列決定して、その配列を元のＤＰＰ１０クローンと比較した。合計３つの代替的転写物を同定した（図９、及び２４）。
【０２０７】
配列相同性を決定するためのＢＬＡＳＴＸによる配列解析
Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースに対するＢＬＡＳＴＸ解析では、合わせたｃＤＮＡクローンから得られるヌクレオチド配列を用いた（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７）。これによって、様々な種から近縁タンパク質配列が数多く同定された。最も密接に関連した二つのタンパク質は、ヒトジペプチジルペプチダーゼＶＩ（ＤＰＰ６）タンパク質（ＸＰ＿００４７０９：Ｐ４２６５８）（７１％類似性）、とヒトジペプチジル−ペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ４）タンパク質（ＡＡＡ５２３０８）（５２％類似性）であった。染色体２ｑ１４の予想ペプチドがＤＤＰ６とＤＰＰ４に類似していることを考慮して、これをＤＰＰ１０と命名した。ＤＰＰ６は、ＤＰＰＸとしても公知であり、ＤＰＰＸには、２つの異なるアイソフォーム（ＤＰＰＸ−ＬとＤＰＰＸ−Ｓ）が存在することが知られている。ＤＰＰ１０、ＤＰＰＸ−Ｌ、ＤＰＰＸ−Ｓ，及びＤＰＰ４のＣｌｕｓｔａｌ−Ｘアラインメントを、図２３に示す。
【０２０８】
ＤＰＰ１０タンパク質配列解析
複合性ＤＰＰ１０転写物は、７９６アミノ酸の予想タンパク質をコードする。ＤＰＰ６及びＤＰＰ４との比較によって、クラスＳ９Ｂのセリンプロテアーゼに特徴的な多数のドメイン及び残基を同定することができる（図１１）。ＤＰＰ１０では、触媒性三連構造Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓのセリン残基がグリシンで置換されている。さらに、ＤＰＰ１０は、３４アミノ酸のＮＨ２末端細胞質ドメイン、単一の膜貫通ドメイン、βプロペラドメイン（触媒活性に必要）、及びＮ−グリコシル化残基と予想される５つの残基を有する。
【０２０９】
ヒトＤＰＰ１０選択的転写物の性質決定
市販のＲＡＣＥ ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用い、製造業者の指示に従って、各種組織からヒトの５’及び３’ＲＡＣＥ実験を実施した。５’ＲＡＣＥ用のネステッドプライマーは、ＤＰＰ１０エキソン３内に設計し、チェックプライマーはエキソン２の中に設計した。
【０２１０】
ＤＰＰ１０５’ＲＡＣＥ．Ｒ１ ＴＣＡＴＴＧＡＴＣＣＡＣＣＧＡＧＣＣＴＣＴＧＧ； ＤＰＰ１０５’ＲＡＣＥ．Ｒ２ ＡＣＣＧＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＣＧＴＧＡＡＧＣ；及び
ＤＰＰ１０５’ＲＡＣＥ．チエックＧＣＴＣＡＣＴＣＡＴＣＡＣＴＡＴＧＴＣＡＧ。
【０２１１】
３’ＲＡＣＥ用のネステッドプライマーは、エキソン１０と１１の中に設計し、チェックプライマーはエキソン１９の中に設計した。
【０２１２】
ＤＰＰ１０３’ＲＡＣＥ．Ｆ１ＡＧＴＣＴＧＴＧＡＧＡＣＣＡＣＴＡＣＡＧＧＴＧＣ；
ＤＰＰ１０３’ＲＡＣＥ．Ｆ２ＴＧＡＧＡＴＧＡＣＡＴＣＡＧＡＴＡＣＧＴＧＧＣ；及び
ＤＰＰ１０３’ＲＡＣＥ．チエックＧＧＡＡＣＴＴＡＴＣＴＧＴＡＡＣＣＡＧＣＴＧＧ。
【０２１３】
１回目及び２回目のネストテッドＰＣＲを、１．２％アガロース上で泳動し、ブロッティングして、内部のチェックオリゴとともにハイブリダイズして、ＲＡＣＥ産物が正しい予測配列を含むことを確認した。１０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ）を用いて、γ３２ＡＴＰによって、１００ｎｇのオリゴを末端標識して、リン酸／ＳＤＳ緩衝液（上記）中で、５０℃で一晩ハイブリダイズさせた。フィルターを０．５× ＳＳＣ／０．０１％ＳＤＳに対して５０℃で洗浄した。ハイブリダイズするＰＣＲ産物を、製造業者の指示に従って、ＰＣＲ２．１ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングした。アンピシリンを含有する１２５μｌのルリア（ｌｕｒｉａ）ブロスの中に白色コロニーを採取し、一晩増殖させた後、ニトロセルロースフィルター（Ｈｕｂｏｎｄ Ｎ＋、Ａｍｅｒｓｈａｍ）上にスタンプして、ＬＢアガープレート上で一晩増殖した。標準的な技術を用いて、コロニーフィルターを処理し、内部チェックオリゴを用いてスクリーニングして、正しい配列を含むクローンを同定した。上記のように、プラスミドを調製して配列決定した。
【０２１４】
さらに、ＭＥＸ４／Ｅｘｏｎ １ａ内から、５’及び３’ＲＡＣＥ実験を実施した。この場合、利用できるチェックプライマーはなく、ハイブリダイゼーションによって予め選択することなしに、ＰＣＲ２．１ＴＯＰＯ中にＰＣＲ産物を直接クローニングした。５’ＲＡＣＥに用いたネステッドプライマーは、ＭＥＸ４ＲＡＣＥ．Ｒ１ ＣＴＴＧＡＴＴＧＴＴＴＴＴＧＡＧＧＧＴＴＧＡＣＡＣ、及びＭＥＸ４ＲＡＣＥ．Ｒ２ ＧＴＧＡＧＡＡＣＴＣＣＡＣＴＴＡＡＧＧＡＴＧＣＣであり、３’ＲＡＣＥに用いたプライマーは、ＭＥＸ４ＲＡＣＥ．Ｆ１ ＡＡＣＣＡＡＡＣＴＧＣＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣ、及びＭＥＸ４ＲＡＣＥ．Ｆ２ＧＴＣＣＣＡＴＣＡＣＡＴＣＡＡＧＴＧＴＣＡＡＣＣであった。
【０２１５】
５つの異なる転写物を同定し、１−５と命名した（図６）。これらの転写物は、１ａ−１ｇと命名された７つの異なるエキソンを含んだ（図９、ここでＭＥＸ４は、エキソン１ａである）。転写物１−３は、脳及び胎児脳のｃＤＮＡから単離し、４及び５は、膵臓から単離した。３’ＲＡＣＥクローンの配列は、図２ｄに示す。これは、９７０ｂｐの３’ＵＴＲを含む、エキソン１１−２５をコードする。
【０２１６】
さらに、エキソン１ｂ内に基部を有するプライマーを用いて、３’ＲＡＣＥも実施した。ＤＰＰ１０１ｂＲＡＣＥ．Ｆ１ＴＧＣＴＧＣＣＡＴＣＣＧＴＡＡＡＴＴＧＧＡＧＧを用いて、第一回のＲＡＣＥを実施し、ＤＰＰ１０１ｂＲＡＣＥ．Ｆ２ ＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＡＴＧＣＴＧＧＴＴＡＧＧを用いて、第二回のＲＡＣＥを実施した。配列決定の前に、ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ２．１ＴＯＰＯ中に直接クローニングした。５つの短いペプチド配列をコードする計５つの異なる転写物を同定した。これらのエキソンの配置を図１５に模式的にまとめる。前記エキソンの配列と完全な転写物から得られる予想ペプチドを、図２ｄ及び９に示す。
【０２１７】
マウスＤＰＰ１０の同定と性質決定
マウスＥＳＴデータベースに対するヒトＤＰＰ１０配列を用いたＢＬＡＳＴＮ解析によって、ヒト配列に対して、８４％のヌクレオチド同一性を有するＥＳＴ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＢＥ８６２７６７）を同定した。このクローンの挿入物を配列決定して、ネステッド５’ＲＡＣＥプライマー、及び内部ＲＡＣＥチェックオリゴを設計するために用いた。以前に記載のように、ＲＡＣＥを実施して、ＰＣＲ２．１ＴＯＰＯ中にＰＣＲ産物をクローニングした。これらのクローン由来の配列を用いて、第二の５’ＲＡＣＥプライマー群を設計した。同定された主要な転写物は、７８９残基の推定ペプチド配列を有する２３７０ｂｐのＯＲＦをコードする（図８）。マウス配列は、ヒト遺伝子に対してヌクレオチドレベルで８４％同一である。タンパク質：タンパク質のアラインメントを示す（図２１）。
【０２１８】
マウスＤＰＰ１０オールタナティブ転写物の性質決定
計４つの異なるマウスＤＰＰ１０転写物の性質決定を行い、１−４と命名したが、これらの転写物は、５つの異なるエキソン１ａ−１ｅを含んでいる（図７）。
【０２１９】
ヒト対マウスの比較による配列解析
マウスＢＡＣクローンから生成された１７のコンティグを、抽出して、ｂｌａｓｔデータベース中にフォーマットした。ＢＬＡＳＴＮ（ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ２．２．１）により、全４６２．５４１ｋｂのヒト配列を用いてこのデータベースを検索し、ヒト配列と比較して、前記１７のマウスコンティグの順序を決定した。次いで、この結果から、Ｂｌａｓｔ結果によって順序を決定した元のコンティグから構成される単一の配列を生成した。ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒバージョン０７／０７／２００１によって、この配列とＨｕｍａｎ ２５Ｋｂ配列を、繰り返しマスクした。Ｈｕｍａｎ２５Ｋｂは、ＭＥＸ４を包含する２５ｋｂのヒトＤＮＡの連続する領域である。配列Ｈｕｍａｎ２５Ｋｂ内には、ＭＥＸ４が、ヌクレオチド３２３５〜３２９５に配置されている。
【０２２０】
１７片の配列をつなぎ合わせてマスクしたマウスコンティグを、ｂｌａｓｔデータベース中にフォーマットして、マスクしたＨｕｍａｎ２５Ｋｂ配列を用いて検索した。８０％を超える配列同一性をともなって、１４の有意なＨＳＰ（期待ｅ値＜１）が同定され、得られたマウス配列を抽出して、ｂｌａｓｔデータベース中にフォーマットした。このデータベースを、照会配列（クエリー配列）として、マスクしたＨｕｍａｎ２５Ｋｂ配列を用いて、ＢＬＡＳＴＮによって検索して結果を得た（表５）。これらの配列保存された領域は、ＤＰＰ１０遺伝子に対する調節ドメインとして機能し得る。
【０２２１】
ＤＰＰ１０遺伝子中のＳＮＰの発見
２３の対照ＤＮＡ及び３１の喘息患者ＤＮＡの集団から、各々のエキソンと、いくつかの隣接するイントロンの配列とを増幅するために、プライマー対を設計した。Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ ＷＡＶＥ装置（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ Ｉｎｃ．）を用いた、変性高速液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）による変異検出に、ＰＣＲ産物を供した。融解曲線解析によって、変異検出温度を経験的に決定した。ＰＣＲ直接配列決定を用いて、ヘテロ二重鎖プロフィールを示すＤＮＡを配列決定して、ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲＴＭ配列解析ソフトウェア、バージョン４．０．５ｂ５（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｉｎｃ．）を用いて解析して、多型塩基を決定した。アルギニンからプロリンへのアミノ酸置換（Ｃ１２５Ｇ）が、エキソン１０の中に確認された。
【０２２２】
ＴＡＡＡＣＡＴＡＣＡＴＴＴＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＣＣＡＡＡＣＴＡＧＡＧＡＡＴＡＣＴＡＴＡＴＣＡＣＴＡＴＧＧＴＴＡＡＡＴＧＧＧＴＡＡＧＣＡＡＴＡＣＣＡＡＧＡＣＴＧＴＧＧＴＡＡＧＡＴＧＧＴＴＡＡＡＣＣＧＡＣ／ＧＣＴＣＡＧＡＡＣＡＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＡＣＡＧＴＣＴＧＴＧＡＧＡＣＣＡＣＴＡＣＡＧＧＴＧＣＴＴＧＴＡＧＴＡＡＡＧＴＧＡＧＴＡＴＡＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴＡＴＧＣＣＴＡＡＡＡＴＧＡＡＧＴＡＧＣＴＴＡＴＧＣＡＧＣＴＴＴＡＣＡＡＡＧＧＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＡＡＴＧＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＡＡＴＴＣＡＧＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＴＡＡＡＡＣＴＡＡＴＡＧＧＡＡＡＡＧ。
【０２２３】
図１の配列中に存在するその他のＳＮＰが、表１ａ及び１ｂ中に示されており、ＤＰＰ１０遺伝子の残りに存在するＳＮＰは、表１ｃ中に示されている。
【０２２４】
ＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇＴＭによるＳＮＰ遺伝子型決定
ＰＣＲで増幅するためのオリゴヌクレオチド対を、各二対立遺伝子多型の何れかの側に設計して、５０ｂｐ〜３５０ｂｐのサイズの産物を得た。配列決定オリゴヌクレオチドは、各多型部位に対して５’側又は３’側の３０ｂｐの範囲内で終結するように設計した。配列決定プライマーの相補鎖を生成するために用いた増幅オリゴヌクレオチドは全て、５’−ビオチンで標識した（表７を参照）。
【０２２５】
各マーカーについて、ＰＣＲ増幅オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲによって、遺伝子型を決定した全てのサンプルを増幅した。用いた各反応物は、最終容積１０μｌ中に、２０ｎｇＤＮＡ（乾燥）、０．６単位のＡｍｐｌｉＴａｑ ＧｏｌｄＴＭＤＮＡポリメラーゼ、１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ｄＮＴＰ、及び１０ｐｍｏｌの各々のＰＣＲオリゴヌクレオチドを有していた。用いたＰＣＲサイクル条件は、９５℃１２分間、以下の４５サイクル：９４℃１５秒間、ＴＡ１５秒間（表２）、７２℃３０秒間、及び７２℃５分間であった。
【０２２６】
増幅後、配列決定プライマーに相補的な各ＰＣＲテンプレートのＤＮＡ鎖を単離して、パイロシーケンシング（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＰＳＱ）用に準備した。これを行うために、１）５０μｌのＤｙｎａｂｅａｄ溶液（２ｍｇ／ｍｌ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）、５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）を、ＰＣＲ産物に添加して、６５℃で１５秒間振盪し、２）磁石を用いてテンプレートを、１分間、５０μｌの０．５Ｍ ＮａＯＨに移し、３）磁石を用いて前記テンプレートを、１分間、１００μｌの１×アニーリング緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸、５ｍＭ ＭｇＡｃ２）に移し、４）磁石を用いて、テンプレートを、４５μｌの１×アニーリング緩衝液（１５ｐｍｏｌの配列決定オリゴヌクレオチドを含有）に移した（表２）。
【０２２７】
テンプレートの単離後、８０℃で２分間変性させた後、１０分間室温に冷却することによって、配列決定オリゴヌクレオチドをこのテンプレートにアニーリングさせた。次いで、ＰＳＱ９６ＴＭ（ＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇＡＢ）上で、ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇＴＭによって、各々のマーカー／サンプルの組み合わせを配列決定／遺伝子型決定した（図２６）。統計学的解析が可能なＰＳＱ ｏｒａｃｌｅ（登録商標）データベースに、遺伝子型決定の結果を記憶させた。
【０２２８】
転写物１及び転写物２の細胞内分布
トランスフェクション試薬として、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）を用い、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＤＰＰ１０（エキソン１ａ〜２５）、又はｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＤＰＰ１０（エキソン１〜２５）を用いて、ＨｅＬａ細胞をトランスフェクトした。遺伝子発現の２日後、Ｖ５に対するマウス抗体を用いた後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６を抱合させた抗マウス抗体を用い、続いて固定前又は固定後に、細胞を免疫染色した。固定前に染色する場合には、１％ＢＳＡを含有し、界面活性剤を含まない緩衝液を用いて、生存している細胞上で、免疫反応を直接実施した後、３％パラホルムアルデヒドを用いて細胞を固定した。固定後に染色する場合には、まず３％パラホルムアルデヒドを用いて細胞を固定し、次いで０．１％のサポニンの存在下又は非存在下で免疫染色した。染色した細胞は、Ｌｅｉｃａ ＤＭＩＲＥ２蛍光顕微鏡下で観察した。
【０２２９】
過剰発現した完全長のＤＰＰ１０は、膜タンパク質のパターンを示す。固定後の染色によって、膜構造が、核膜、原形質膜、及び細胞質中に分布していることが明らかになった。この結果は、ＧＦＰタグ化ベクターであるプラスミドｐｃＤＮＡ３．１／ＮＴ−ＧＦＰ−ＤＰＰ１０（エキソン１ａ〜２５）を用いた、ＨｅＬａ細胞へのトランスフェクションによっても確認された。完全長のＤＰＰ１０は、細胞表面上に検出することができる。完全長ＤＰＰ１０を発現させた細胞に対する固定前免疫反応から、陽性染色が得られた。このことは、ａ）完全長ＤＰＰ１０が原形質膜上に分布していること、ｂ）これは膜貫通タンパク質であり、かつ細胞の外側から抗体に接近可能であること、を示唆していた。完全長ＤＰＰ１０のＣ末端は、このタンパク質の細胞外ドメイン中にある。なぜなら、Ｃ末端タグＶ５は、固定前条件下で、抗体によって検出されたからである。
【０２３０】
過剰発現されたＤＰＰ１０転写物２は、細胞質内のプロフィールを示す。これは、固定後の条件下でのみ陽性であり、固定前の条件下では陽性ではなかった。
【０２３１】
発現の解析
組織及び細胞株由来のｃＤＮＡに対して、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。ヒトＰＢＬに対してＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、＃７６２１３２）を用いた以外は、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、＃７４１０４）を用いて、様々な細胞株及び組織からＲＮＡを抽出した。ＯＭＮＩＳＣＲＩＰＴ 逆転写酵素キット（Ｑｉａｇｅｎ，＃２０５１１１）を用い、続いてＨｏｔＳｔａｒ Ｔａｑ ＰＣＲキットを用いるＰＣＲによって、ＲＮＡからｃＤＮＡを調製した。３８サイクル（１サイクルについて、９５℃１分、５４℃１分、及び７２℃１分）でＰＣＲを実施した。多数の異なるＰＣＲプライマー対を用いた。これらは、エキソン１ａ〜７（転写物１特異的）と、エキソン１ｂ〜７（転写物２特異的）と、エキソン１ｆ及び７（転写物５特異的）の間で増幅した。エキソン２及び７と、エキソン１９及び２５との間で増幅するプライマー対（全ての転写物に存在すると予測される）も用いた。最後の２つのプライマー対によって、マウス転写物２（ｍｕｓ−エキソン１ｃ〜７）、及びマウス転写物３（ｍｕｓ−エキソン１ｅ〜７）の存在を調べた。これらのプライマー配列は、表４ａに存在する。発現データは、表４ｂに要約されている。
【０２３２】
喘息の血液、及びコントロールの血液におけるＤＰＰ１０発現を評価するための定量的ＰＣＲ：
血液からのＲＮＡ、及びｃＤＮＡ調製： 製造業者によって記載されたとおり、ＢＤ Ｓａｆｅｔｙ−ＬｏｋＴＭ血液収集セットを用いて、患者１例あたり、全部で７．５ｍｌ（コントロールについては２０ｍｌ）の血液を、ＰＡＸｇｅｎｅＴＭ血液ＲＮＡチューブ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ，Ｑｉａｇｅｎ／ＢＤ）中に収集した。このＰＡＸｇｅｎｅＴＭ血液ＲＮＡチューブを１０回反転させて、室温で３時間〜１日間保存した。次いで、このサンプルを処理するか、又は４℃で５日間まで保存した。このサンプルを製造業者（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ，Ｑｉａｇｅｎ／ＢＤ）の指示によって記載されるとおり調製した。同じ個体由来の複数のサンプルを、２ｍｌのエッペンドルフチューブ中にプールした。次いで、そのサンプルを、ヒートブロック中において、６５℃で５分間変性させた。次いでそのサンプルを直ちに氷上に置いて、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒを用いて解析した。ＲＮＡ６０００ Ｎａｎｏアッセイキット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及び真核生物総ＲＮＡのＮａｎｏアッセイを用いて、そのＲＮＡを解析した。このアッセイによって、２５〜５００ｎｇ／μｌの範囲のＲＮＡの定量、並びにＤＮＡ混入、及びＲＮＡ変性に関する情報を提供することが、可能になる。
【０２３３】
ＡｍｂｉｏｎのＥｎｄｏＦｒｅｅ ＴＲＴＭキットを用いて、逆転写を実施した。総容積８μｌ中に、１μｇのＲＮＡ、１０ｐＭｏｌのアンカーオリゴ（ｄＴ）（Ｔ２０ＶＮ、ここでＶ＝Ａ、Ｃ、又はＧ；Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、又はＴ）、及び１０ｐＭｏｌのランダムヘキサマーを含有する混合物を調製した。これを、ヒートブロック中で７０℃で５分間変性させた。次いで、これを直ちに氷上に３分間置き、その後、２２℃のＰＣＲ機に移して、５分間、平衡化した。以下；１０×ＲＴ緩衝液、ｄＣＴＰ（２．５ｍＭ）、ｄＴＴＰ（２．５ｍＭ）、ｄＧＴＰ（２．５ｍＭ）、ｄＡＴＰ（２．５ｍＭ）、及び１μｌのＲＮａｓｅインヒビター（１０Ｕ／μｌ）の各々を２μｌ含有する反応混合物をまた、２２℃で５分間平衡化した。次いで、１１μｌの反応混合物を、２２℃のＲＮＡ：ＲＴプライマー混合物中に添加した。引き続き、１μｌの逆転写酵素を、各々のチューブに添加して、混合した。この反応物を、サーマルサイクラー中で２２℃で１０分間、続いて４９℃で２時間インキュベートした。
【０２３４】
次いで、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒによる定量の前、ｃＤＮＡを−２０℃で保管した。ＲＮＡについて記載（上記）されたとおり、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒを用いてｃＤＮＡを定量した。方法論における唯一の相違は、真核生物ｍＲＮＡのＮａｎｏアッセイを用いてこのチップを解析したことであった。
【０２３５】
ｃＤＮＡの定量的ＰＣＲ解析；全ての増幅においては、ＰＬＡＴＩＮＵＭ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ＳＵＰＥＲＭＩＸ−ＵＤＧを用いる。この混合物は、ｄＵＴＰ（ｄＴＴＰの代わり）、及びＵＤＧ（ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ、ＵＮＧ）を含み、これが、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡからウラシル残基を除く。従って、ＵＤＧで消化された（サイクルの前に５０℃で２分間のＰＣＲ反応の予備インキュベーション）ｄＵ含有ＤＮＡは、将来のＰＣＲにおいてテンプレートとして機能することはできず、従ってこれによって、ＰＣＲの余剰産物の再増幅が防止される。高温で（サイクル中）ＵＤＧは不活性化され、従って真の標的の増幅が可能になる。
【０２３６】
ＢｉｏＲａｄ ｉＣｙｃｌｅｒ ｉＱＴＭ Ｍｕｌｔｉ−Ｃｏｌｏｕｒ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（多色リアルタイム検出システム）中で増幅を実施した。ＤＰＰ１０（エキソン１５〜１７）について、及び□アクチンについてアッセイを実施した。ＰＣＲサイクルのパラメータは以下であった：５０℃２分間の１サイクル、次いで９５℃１０分間、続いて９５℃３０秒間の１サイクル、及び６１℃３０秒間の５０サイクル。次いで、サンプルを４℃で保持した。用いたオリゴは以下であった；βアクチンフォワードプライマー：ＴＧＣＧＴＧＡＣＡＴＴＡＡＧＧＡＧＡＡＧ、βアクチンリバースプライマー：ＧＣＴＣＧＴＡＧＣＴＣＴＴＣＴＣＣＡ、及びβアクチンＴａｑｍａｎプローブ：ＣＡＣＧＧＣＴＧＣＴＴＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣ｛ＦＡＭで標識し、かつＢｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ １でクエンチした｝。βアクチンアッセイについてのＰＣＲ反応成分の最終濃度は以下のとおりであった；１０ｎｇ ｃＤＮＡ、１２５ｎＭのフォワードプライマー及びリバースプライマー、１５０ｎＭプローブ、０．６単位のＰＬＡＴＩＮＵＭ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭ ｄＧＴＰ、２００μＭ ｄＡＴＰ、２００μＭ ｄＣＴＰ、４００μＭ ｄＵＴＰ、０．４単位のＵＤＧ、並びに安定化剤。
【０２３７】
ＤＰＰ１０フォワードプライマー：ＴＴＧＡＴＧＣＣＡＧＴＴＴＴＡＧＴＣＣＣ，ＤＰＰ１０リバースプライマー：ＴＣＡＧＧＡＴＡＧＣＴＴＣＣＴＴＣＡＧＣ、及びＤＰＰ１０ Ｔａｑｍａｎプローブ：ＡＧＧＧＴＣＣＣＡＧＴＧＧＴＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＡ｛ＨＥＸで標識して、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ １でクエンチした｝。ＤＰＰ１０アッセイについてのＰＣＲ反応成分の最終濃度は以下のとおりであった；１０ｎｇ ｃＤＮＡ、１５０ｎＭのフォワードプライマー及びリバースプライマー、１００ｎＭプローブ、０．６単位のＰＬＡＴＩＮＵＭ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭ ｄＧＴＰ、２００μＭ ｄＡＴＰ、２００μＭ ｄＣＴＰ、４００μＭ ｄＵＴＰ、０．４単位のＵＤＧ、並びに安定化剤。
【０２３８】
ヒト血清におけるＤＰＰ１０のアッセイ
Ｖａｃｕｅｔｔｅサンプルチューブを用いて、４例のボランティア（ＷＴ１−４）から血清を単離した。各々の血清サンプルを、サンプル緩衝液（７．５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）、３．８％ ＳＤＳ、４Ｍ、尿素、２０％グリセロール、５％メルカプトエタノール）中で希釈（１／２０、１／４０、１／８０）し、総容積２０μｌにして、９５℃で５分間変性させた。このサンプルを１２％のポリアクリルアミドＳＤＳ変性ゲル上にロードして、２００Ｖで６０分間電気泳動させた。電気泳動後、２００Ｖで２時間のブロッティングによって、このタンパク質を０．４μｍのニトロセルロースメンブレンに転写した。このフィルターを、抗体検出の前に、５％ミルク溶液中で４℃で一晩ブロックした。
【０２３９】
ウサギにおいて、ＤＰＰ１０ペプチド（ＮＨ２−ＣＬＫ−ＥＥＩ−ＳＶＬ−ＰＱＥ−ＰＥＥ−ＤＥ）に対して、親和性精製したＤＰＰ１０Ｃ末端抗体を生成した。このフィルターを、５％ミルク中で、室温で６０分間、ＤＰＰ１０ Ａｂ（１／２５０）とともにインキュベートした。洗浄後、このフィルターを５％ミルク中で、室温で６０分間、抗ウサギＩｇＧ結合化ＡＰ（１／２０００）とともにインキュベートした。最終の厳格な洗浄工程後、蛍光発光基質（Ｒｏｃｈｅ）、及びオートラジオグラフィーによって、結合した抗体を検出した。図２７は、ヒト血清におけるＤＰＰ１０の存在を実証する、このようなブロットの結果を示す。
【０２４０】
考察
喘息関連マイクロサテライトマーカーＤ２Ｓ３０８の周囲に４６２ｋｂのＢＡＣコンティグを構築して、配列決定した。この領域中に同定された多数の新規ＳＮＰを、一群の喘息家族に対して広く遺伝子型を決定した。ＴＤＴによる関連の検査によって、喘息に強力な関連を有する多数のマーカーが明らかになった。遺伝子型データを用いて、このマイクロサテライトマーカー、及び関連のＳＮＰ周囲の連鎖不均衡（ＬＤ）の程度を精査した。関連するマーカー配列を含む連鎖不均衡のブロックを同定した。ここには、喘息感受性の遺伝子座が存在すると予測された。
【０２４１】
公的ＥＳＴデータベースの検討では、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んだ領域由来のクローンも、５’又は３’ＲＡＣＥによって伸長され得るクローンも同定されなかった。従って、ゲノム配列からエキソンの予測を行った。少なくとも２つのエキソン予測プログラムによって、２７のエキソンの候補が同定された。反復配列がなく、少なくとも５０ｂｐ長であるエキソンを増幅させ、プール中で用いて、市販の（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）ｃＤＮＡライブラリー（胎児脳、肺、精巣、気管、及び骨格筋）のパネルをスクリーニングした。
【０２４２】
中程度のストリンジェンシーでのスクリーニングによって、２９個のｃＤＮＡクローンを同定した。このうち２３個は、第二染色体の配列を含んでいなかった。他の５つのクローンは、本発明者が対象としていた領域に由来する連続したゲノム配列からなっていた（それらは、ＯＲＦを含まず、ｃＤＮＡライブラリーのゲノムＤＮＡ混入に起因するものであった）。１つのクローン（ＭＥＸ４ＦＢ−１）は、１１３７ｂｐのＯＲＦを有する１３０１ｂｐの挿入物を含んでいた。このクローンは、６０ｂｐのエキソン（ＭＥＸ４）を含み、これは３つのプログラムによって予想されていた。ＭＥＸ４の完全長配列は、ＯＲＦの５’末端に存在していた。本発明者らによるライブラリーの徹底的な検索、並びにエキソン候補を全て用いた５’及び３’ＲＡＣＥ実験によって、ＭＥＸ４ＦＢ−１は、この領域から発現された唯一の遺伝子であることが示唆される。
【０２４３】
ＭＥＸ４ＦＢ−１配列を用いた、Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＲデータベースに対するＢＬＡＳＴＮ解析によって、ＭＥＸ４ＦＢ−１の３’末端と、部分的ｃＤＮＡクローンＫＩＡＡ１４９２の５’末端との間の重複を特定した。このクローンはＭＥＸ４ＦＢ−１の３’末端からさらに３３４９ｂｐ伸長しており、この配列は両者で完全長のｃＤＮＡをコードしていた。全長配列を用いてさらに検索を行うことによって、ＫＩＡＡ１４９２に見出されたものよりさらに上流に３’ポリＡテールを含有するクローン（ＡＫ０２５０７５）がさらに同定された。様々な組織で３’ＲＡＣＥ実験を繰り返したが、ＡＫ０２５０７５３’ＵＴＲ終止を確認できたに留まった。
【０２４４】
この遺伝子の完全な３．６Ｋｂ ｃＤＮＡは、２３９１ｂｐ（すなわち７９６残基）の予想ＯＲＦをもたらす（図２ｃ）。この遺伝子は、ＨＴＧＳデータベースに対するＢＬＡＳＴＮ解析によって、２５エキソンを含むことが示された（Altschul,S.F.ら、Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res 25,3389〜402.(1997)）。第二染色体上にエキソンを含むＢＡＣクローンの相対位置（未定）(http://genome.ucsc.edu/goldenPath/septTracks.html)から、この遺伝子が、ゲノムＤＮＡの１Ｍｂ超にわたることが示唆される。
【０２４５】
特に、イントロン１のサイズは大きく、５００ｋｂ以上にわたって広がっており、少なくとも７つの代替的エキソン１（ａ〜ｆ）を含んでいる。このため、コンピュータシミュレーションによる遺伝子予想プログラムは、これらのエキソンをＤＰＰ１０遺伝子のＮ末端の候補として同定することができない。本発明でのＲＡＣＥ実験によって、ＤＰＰ１０の真の代替的Ｎ末端としてエキソン１ａ〜１ｆが確定される。これらのエキソンがＤＰＰ１０転写物のＮ末端であることが明らかとなったことは、本発明において３つの意味を有している。第一に、それらは、完全長オープンリーディングフレームの予測を可能にする。エキソン１ａ及び１ｆの場合、開始コドンは、エキソン配列内でコードされる。エキソン１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ、及び１ｇは、非コードであるが、エキソン２における開始コドンの予測は可能である。転写物１−５から、３つの異なるＤＰＰ１０ペプチドが、本発明において予測される。第二に、これらのペプチド予測によって、このタンパク質の膜結合型及び細胞質内型がともに存在することが示唆され、この提案は、転写物１と２を用いる細胞内分布実験によって、その後実験的に確認された。第三に、マーカーＤ２Ｓ３０８を含有するＬＤの関連ブロック内における代替的エキソン１ａ、１ｂ、及び１ｃの位置から、ＤＰＰ１０遺伝子を喘息表現型での役割と関連付けることができる。
【０２４６】
ノーザンブロットは、この遺伝子が、脳、膵臓、及び副腎において、転写物とともに、神経内分泌様式で発現されることを示した（図１３）。気道、及び小腸において、低レベルの転写物を観察した。マルチスプライスバリアントは、脳及び脊髄に見られた。
【０２４７】
３回の５’ＲＡＣＥによって、全長ｃＤＮＡに伸長されたクローン（ＢＥ８６２７６７）を、この遺伝子を用いるマウスｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによって、単離した。同定された主な転写物は、７８９残基の推定ペプチド配列を有する２３７０ｂｐのＯＲＦをコードする。マウス配列は、ヒト遺伝子に対して、ヌクレオチドレベルで８４％同一である。
【０２４８】
遺伝子の相同性
ＭＥＸ４ＦＢ−１／ＫＩＡＡ１４９２タンパク質は、ジペプチジルアミノペプチダーゼ（ＤＰＰ）ファミリーに属し、このため、本発明者らはこれをＤＰＰ１０と名付けた。この遺伝子ファミリーの三次構造は、ブタのプロリルオリゴペプチダーゼが代表的である（Ｆｕｌｏｐら（１９９８））（図２ａ）。この酵素は、２つのドメインからなる。第一は、調節性−プロペラであり、内腔を通して別のＣ末端（／ヒドロラーゼ）触媒性ドメイン内に存在する活性部位へ小基質を送る。
【０２４９】
β−プロペラブレードは、反復配列によって構成されており、ＤＰＰ１０とブタのプロリルオリゴペプチダーゼリピートとの配列類似性（Ｆｕｌｏｐら（１９９８））は、公知の３Ｄ構造中では低いが、ＤＰＰ１０配列にマッピングされ得る。配列中のこれらの相違は、βプロペラの腔への入口を広げるか又は狭くすることによって、基質特異性を付与し得る。
【０２５０】
第二に、ブタプロリルオリゴペプチダーゼ中に存在する触媒性ドメインは、活性部位三連構造：Ｓｅｒ５５４、Ａｓｐ６４１、及びＨｉｓ６８０を含んでいる。ＤＰＰ１０は、この触媒性三連構造のセリンを欠き、セリンがグリシン残基によって置換されている。
【０２５１】
ジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ４）は、より近縁のＤＰＰ１０相同体である（Ｍｉｓｕｍｉら（１９９２））。ジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ４）は、ＣＤ２６として知られており（Ｆｌｅｉｓｃｈｅｒら（１９９４））、ヒトＴリンパ球上のＣＤ４、及びアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）を含むタンパク質に結合する（Ｋａｍｅｏｋａら（１９９３））。ジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ４）は、腎尿細管上皮細胞、小腸における上皮細胞、及び毛細胆管上にも構成的に発現されている（ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｅｌｄｅｎ（１９９９））。
【０２５２】
ＤＰＰ４は、最後から２番目の残基がプロリンであれば、未置換のＮ末端を有するポリペプチドから連続的にＮ末端ジペプチドを除去する触媒活性を有する。公知の基質としては、間質細胞由来因子−１、及びマクロファージ由来ケモカインが挙げられる（Ｌａｍｂｅｉｒら（２００１））。ＤＰＰ４は、可溶性の様式で存在しており（Ｄｕｒｉｎｘら（２０００））、このことは、ＤＰＰ１０に類似のアイソフォームが存在する可能性を示唆している。ＤＰＰ４は、別のＤＰＰ相同体であるＦＡＰ（上皮癌の反応性間質性線維芽細胞、治癒中の創傷の肉芽組織、並びに骨及び軟部組織肉腫の悪性細胞中で選択的に発現される細胞表面抗原である）と、ヘテロ二量体を形成する（Ｓｃａｎｌａｎら（１９９４））。このことは、ＤＰＰ１０も、ヘテロ二量体又はホモ二量体を形成し得ることを示唆する。
【０２５３】
ＤＰＰ６は、ＤＰＰ１０の最も近縁の相同体である。ＤＰＰ６は、最初、ヒト海馬から単離された（Ｙｏｋｏｔａｎｉら（１９９３））。ＤＰＰ１０と同じく、ＤＰＰ６は、アスパラギン酸による置換のために、触媒性三連構造にセリンを欠いている。この置換は、ウシ及びげっ歯類のＤＰＰ６配列中にも観察される。別の相同体であるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ＣＧ９０５９も、アスパラギン酸及びヒスチジンの触媒性残基は保持しているが、ＤＰＰ１０と同様に、活性部位のセリンがグリシンで置換されている。ＤＰＰ１０と幾つかの相同体において、触媒性セリンが存在しない状態で触媒性のヒスチジンとアスパラギン酸残基が保存されているということは、進化上の制限及び何らかの触媒機能が保持されている可能性を示唆している。
【０２５４】
活性部位のセリンに代替し得る他の酵素的なドメイン中に別のセリンが存在するという証拠はないが、基質によって触媒性セリンがもたらされる可能性がある（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら（２０００））。ＤＰＰ切断は、最後から２番目の残基がプロリンである部位のみに生じるので、切断点に位置するプロリンの＋２後ろにセリンを有するＰｘＳモチーフを含有する基質によって、触媒性セリンが付与される可能性がある。従って、本発明者らは、Ｅｎｔｒｅｚデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez)から得られる、約１０００の豊富なヒトサイトカインアミノ酸配列のリストの中からＰｘＳモチーフを検索した。ｐｅｒｌスクリプト、及びｓｉｇｃｌｅａｖｅモジュール（Ｂｉｏｐｅｒｌ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｐｅｒｌ．ｏｒｇ）由来）を用いてこの配列をフィルタリングした。Ｎ末端から２０アミノ酸以下であるシグナルペプチド、及び＋２の位置から始まるＰｘＳトリペプチドを有する全ての配列を同定した。対照として、＋２の位置にＳｘＰトリペプチドを有するサイトカインを検出するために同一のプロトコールを用いたが、何も見出されなかった。＋２の位置にＰｘＳモチーフを含む配列の中には、ＳＤＦ−１，ＩＰ１０、エオタキシン（Ｅｏｔａｘｉｎ）、及びＲＡＮＴＥＳを含む、いくつかの重要な炎症性サイトカイン及びケモカインがある（図１９）。従って、これらのサイトカインの活性化によって、喘息の気道及び他の炎症を調節するという機序がＤＰＰ１０に関して示唆される。ＤＰＰ１０タンパク質の構造は、小さな分子がＤＰＰ１０の酵素活性を阻害し得ることを示唆しており、ＤＰＰ１０を薬学的に標的誘導することによって、喘息の気道やその他の炎症を阻害する新しい手段が得られるであろう。
【０２５５】
選択的スプライシング及び遺伝子発現
ＤＰＰ１０のエキソンＩＩＩ内のプライマーを用いて５’ＲＡＣＥを実施した。５つの異なるＮ末端が同定された。対応するｃＤＮＡを１−５と命名した。これらは、１ａ―１ｇと命名された７つの異なるエキソンを含んでいた（図６）。転写物１−３は脳及び胎児脳のｃＤＮＡから単離し、４及び５は膵臓から単離した。エキソン１ａ及び１ｆ（転写物１及び４）は、エキソン２の起始部の２３残基上流に代替的Ｎ末端コード配列を与える。他のＮ末端エキソンは非コードであって、次の利用可能な開始コドンは、エキソン２の中にある。従って、これらの５つの転写物によって、３つの予測タンパク質がコードされる。このうち２つ（エキソン１ａ及びエキソン１ｆ内から始まる）は、膜貫通領域を含み、このことは、このタンパク質のほとんどが、細胞質ゾル内に位置することを示唆する。
【０２５６】
エキソン１ａからの３’ＲＡＣＥによって、１ａエキソンの６６５５ｂｐ下流にある代替的エキソン２（２ａ）を同定した（図６）。脳及び精巣由来のｃＤＮＡ中に、この転写物が同定されたがこれは４７残基のペプチドをコードしている。この「ストッパー（ｓｔｏｐｐｅｒ）」エキソン及びエキソン２と、残りの遺伝子との選択的スプライシングが、完全な遺伝子産物の膜発現を制御する機序となっている可能性がある。
【０２５７】
次いで、本発明者らは、この領域のＬＤマップ上でのこれらの代替的初期エキソンの位置を決定した。総血清ＩｇＥレベルとの関連は、エキソン１ａに近い、ＬＤの島部Ａにマッピングした。喘息に対して最強の関連を示す２つのマーカーは、２ａストッパーエキソンに近接して、ＬＤの島部Ｂの最初に配置されていた。エキソン１ｂと１ｃの近くで、これより弱い関連が喘息に対してみられた。他のエキソンは、関連領域の外側にある。
【０２５８】
何れのエキソンにもコーディンング多型は見出されなかった。本発明者らは、全てのＳＮＰが何れかのコード配列に対して１００Ｋｂより近接していることを明らかにした。従って、この遺伝子座での遺伝的効果は、膜結合型のタンパク質と他の型とのタンパク質間で生じる選択的スプライシングに対する多型性の作用に起因する可能性がある。ＩＬ４受容体遺伝子のスプライシングに影響を与える各個の多型に、別の喘息関連形質をマッピングすることによって、同様の効果が観察された（Ｏｂｅｒら（２０００）、及びＫｒｕｓｅら（１９９９）、及びＫｒｕｓｅら（１９９９））。
【０２５９】
プロテアーゼアッセイ
基質の候補（例えば、ＲＡＮＴＥＳ、エオタキシンのようなケモカイン）として試験すべきペプチドとともに、ＤＰＰ１０（発現系、又は細胞溶解物の何れかから精製された）をインキュベートする。様々な時点でサンプルを採取して、ＴＣＡ中で反応を停止させる。次いで、試料を脱塩して、その混合物の組成を、質量分析計で確認する。このような手順の例は、Ｌａｍｂｅｉｒら、２００１ Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６，２９３８９〜２９８４５に見出され得る。
【０２６０】
細胞接着アッセイ
完全長ＤＰＰ１０タンパク質が細胞接着に関与しているか否かを明らかにするために、細胞間接着アッセイ(Gee B.E.and Platt O.S.1995 Sickle Reticulocyes adhere to VCAM1.Blood 85(1):268-274.)、及びロゼット形成アッセイ(DeRose V.ら、1994 Substance P increases neutrophil adhesion to bronchial epithelial cells.J.Immunol.152(3):1339〜1346;Walsh G.M.ら、1991 Human eosinophil、but not neutrophil、adherence to IL-1-stimulated human umbilical vascular endothelial cells is α4β1(very late antigen-4)dependent.J.Immunol.146(10):3419-3423)を実施する。要約すると、トランスフェクション試薬としてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを用いて、ＨｅＬａ細胞、又はＣＯＳ細胞にｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＤＰＰ１０（ｆｕｌｌ）をトランスフェクトする。遺伝子発現の２日後、細胞間接着アッセイのために、時々回転させながら、白血球とともにこの細胞をインキュベートする。固定の前に、未結合の細胞を洗浄により除いた後、免疫染色を行う。細胞結合を、顕微鏡下で確認する。ロゼット形成アッセイの場合、遺伝子発現後に、トリプシン／ＥＤＴＡによって細胞を剥離する。細胞懸濁液を白血球と混合する。インキュベーション後、細胞をガラススライド上に固定した後に染色する。顕微鏡下でロゼットにスコアを付与する。
【０２６１】
細胞のシグナル伝達／活性化アッセイ（例えば、白血球免疫反応）。ＤＰＰ１０タンパク質がいかにしてリンパ球免疫応答に直接関与しているかを理解するために、以下の点を検討する。
【０２６２】
１）ＤＰＰ１０レベルは、リンパ球の生理的条件によって調節されるか？。初代Ｔ細胞及びＢ細胞（ＤＰＰ１０陽性であることが確認されている）、並びにＤＰＰ１０陽性Ｔ細胞の株を免疫刺激して、この研究に用いる。定量的ｒｔＰＣＲを用いて、これらの細胞の休止形態と活動形態のＤＰＰ１０レベルを比較する。
【０２６３】
２）ＤＰＰ１０発現は、リンパ球免疫応答に影響するか？。ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＤＰＰ１０（ｆｕｌｌ）、又はｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＤＰＰ１０（Ｔｐｔ２）を用いるトランスフェクションによって、ＤＰＰ１０は、ＤＰＰ１０陰性Ｔ細胞（またＢ細胞でもあり得る）株中に過剰発現される。遺伝子発現後、細胞を免疫刺激する。サイトカインアッセイ、又は増殖アッセイを用いて、免疫応答の強度を、ＤＰＰ１０過剰発現細胞と対照細胞との間で比較する。
【０２６４】
３）ＤＰＰ１０は、リンパ球免疫応答にどのように関与するか？ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＤＰＰ１０（ｆｕｌｌ）、又はｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＤＰＰ１０（Ｔｐｔ２）をリンパ球にトランスフェクトする。異なるシグナル伝達経路（例えば、Ｐ１−３Ｋ、ＥＰＫ、Ｊａｋ−Ｓｔａｔ、及びＮＦκＢ経路）に対するＤＰＰ１０過剰発現の効果を、ウエスタンブロット、インビトロアッセイを用いて記述する。
【表１ａ】
Figure 2004532030
Figure 2004532030
Figure 2004532030
【表１ｂ】
Figure 2004532030
Figure 2004532030
【表１ｃ】
Figure 2004532030
Figure 2004532030
Figure 2004532030
【表２】
Figure 2004532030
【０２６５】
Figure 2004532030
【０２６６】
Figure 2004532030
【表３】
Figure 2004532030
【表４ａ】
Figure 2004532030
【表４ｂ】
Figure 2004532030
【表５】
Figure 2004532030
【表６】
Figure 2004532030
【表７】
Figure 2004532030

【図面の簡単な説明】
【０２６７】
【図１−１】図１−１は、第２染色体の喘息遺伝子座由来のＤＮＡ配列を示す。
【図１−２】図１−２は、図１−１の続きである。
【図１−３】図１−３は、図１−２の続きである。
【図１−４】図１−４は、図１−３の続きである。
【図１−５】図１−５は、図１−４の続きである。
【図１−６】図１−６は、図１−５の続きである。
【図１−７】図１−７は、図１−６の続きである。
【図１−８】図１−８は、図１−７の続きである。
【図１−９】図１−９は、図１−８の続きである。
【図１−１０】図１−１０は、図１−９の続きである。
【図１−１１】図１−１１は、図１−１０の続きである。
【図１−１２】図１−１２は、図１−１１の続きである。
【図１−１３】図１−１３は、図１−１２の続きである。
【図１−１４】図１−１４は、図１−１３の続きである。
【図１−１５】図１−１５は、図１−１４の続きである。
【図１−１６】図１−１６は、図１−１５の続きである。
【図１−１７】図１−１７は、図１−１６の続きである。
【図１−１８】図１−１８は、図１−１７の続きである。
【図１−１９】図１−１９は、図１−１８の続きである。
【図１−２０】図１−２０は、図１−１９の続きである。
【図１−２１】図１−２１は、図１−２０の続きである。
【図１−２２】図１−２２は、図１−２１の続きである。
【図１−２３】図１−２３は、図１−２２の続きである。
【図１−２４】図１−２４は、図１−２３の続きである。
【図１−２５】図１−２５は、図１−２４の続きである。
【図１−２６】図１−２６は、図１−２５の続きである。
【図１−２７】図１−２７は、図１−２６の続きである。
【図１−２８】図１−２８は、図１−２７の続きである。
【図１−２９】図１−２９は、図１−２８の続きである。
【図１−３０】図１−３０は、図１−２９の続きである。
【図１−３１】図１−３１は、図１−３０の続きである。
【図１−３２】図１−３２は、図１−３１の続きである。
【図１−３３】図１−３３は、図１−３２の続きである。
【図１−３４】図１−３４は、図１−３３の続きである。
【図１−３５】図１−３５は、図１−３４の続きである。
【図１−３６】図１−３６は、図１−３５の続きである。
【図１−３７】図１−３７は、図１−３６の続きである。
【図１−３８】図１−３８は、図１−３７の続きである。
【図１−３９】図１−３９は、図１−３８の続きである。
【図１−４０】図１−４０は、図１−３９の続きである。
【図１−４１】図１−４１は、図１−４０の続きである。
【図１−４２】図１−４２は、図１−４１の続きである。
【図１−４３】図１−４３は、図１−４２の続きである。
【図１−４４】図１−４４は、図１−４３の続きである。
【図１−４５】図１−４５は、図１−４４の続きである。
【図１−４６】図１−４６は、図１−４５の続きである。
【図１−４７】図１−４７は、図１−４６の続きである。
【図１−４８】図１−４８は、図１−４７の続きである。
【図１−４９】図１−４９は、図１−４８の続きである。
【図１−５０】図１−５０は、図１−４９の続きである。
【図１−５１】図１−５１は、図１−５０の続きである。
【図１−５２】図１−５２は、図１−５１の続きである。
【図１−５３】図１−５３は、図１−５２の続きである。
【図１−５４】図１−５４は、図１−５３の続きである。
【図１−５５】図１−５５は、図１−５４の続きである。
【図１−５６】図１−５６は、図１−５５の続きである。
【図１−５７】図１−５７は、図１−５６の続きである。
【図１−５８】図１−５８は、図１−５７の続きである。
【図１−５９】図１−５９は、図１−５８の続きである。
【図１−６０】図１−６０は、図１−５９の続きである。
【図１−６１】図１−６１は、図１−６０の続きである。
【図１−６２】図１−６２は、図１−６１の続きである。
【図１−６３】図１−６３は、図１−６２の続きである。
【図１−６４】図１−６４は、図１−６３の続きである。
【図１−６５】図１−６５は、図１−６４の続きである。
【図１−６６】図１−６６は、図１−６５の続きである。
【図１−６７】図１−６７は、図１−６６の続きである。
【図１−６８】図１−６８は、図１−６７の続きである。
【図１−６９】図１−６９は、図１−６８の続きである。
【図１−７０】図１−７０は、図１−６９の続きである。
【図１−７１】図１−７１は、図１−７０の続きである。
【図１−７２】図１−７２は、図１−７１の続きである。
【図１−７３】図１−７３は、図１−７２の続きである。
【図１−７４】図１−７４は、図１−７３の続きである。
【図１−７５】図１−７５は、図１−７４の続きである。
【図１−７６】図１−７６は、図１−７５の続きである。
【図１−７７】図１−７７は、図１−７６の続きである。
【図１−７８】図１−７８は、図１−７７の続きである。
【図１−７９】図１−７９は、図１−７８の続きである。
【図１−８０】図１−８０は、図１−７９の続きである。
【図１−８１】図１−８１は、図１−８０の続きである。
【図１−８２】図１−８２は、図１−８１の続きである。
【図１−８３】図１−８３は、図１−８２の続きである。
【図１−８４】図１−８４は、図１−８３の続きである。
【図１−８５】図１−８５は、図１−８４の続きである。
【図１−８６】図１−８６は、図１−８５の続きである。
【図１−８７】図１−８７は、図１−８６の続きである。
【図１−８８】図１−８８は、図１−８７の続きである。
【図１−８９】図１−８９は、図１−８８の続きである。
【図１−９０】図１−９０は、図１−８９の続きである。
【図１−９１】図１−９１は、図１−９０の続きである。
【図１−９２】図１−９２は、図１−９１の続きである。
【図１−９３】図１−９３は、図１−９２の続きである。
【図１−９４】図１−９４は、図１−９３の続きである。
【図１−９５】図１−９５は、図１−９４の続きである。
【図１−９６】図１−９６は、図１−９５の続きである。
【図１−９７】図１−９７は、図１−９６の続きである。
【図１−９８】図１−９８は、図１−９７の続きである。
【図１−９９】図１−９９は、図１−９８の続きである。
【図１−１００】図１−１００は、図１−９９の続きである。
【図１−１０１】図１−１０１は、図１−１００の続きである。
【図１−１０２】図１−１０２は、図１−１０１の続きである。
【図１−１０３】図１−１０３は、図１−１０２の続きである。
【図１−１０４】図１−１０４は、図１−１０３の続きである。
【図１−１０５】図１−１０５は、図１−１０４の続きである。
【図１−１０６】図１−１０６は、図１−１０５の続きである。
【図１−１０７】図１−１０７は、図１−１０６の続きである。
【図１−１０８】図１−１０８は、図１−１０７の続きである。
【図１−１０９】図１−１０９は、図１−１０８の続きである。
【図１−１１０】図１−１１０は、図１−１０９の続きである。
【図１−１１１】図１−１１１は、図１−１１０の続きである。
【図１−１１２】図１−１１２は、図１−１１１の続きである。
【図１−１１３】図１−１１３は、図１−１１２の続きである。
【図１−１１４】図１−１１４は、図１−１１３の続きである。
【図１−１１５】図１−１１５は、図１−１１４の続きである。
【図１−１１６】図１−１１６は、図１−１１５の続きである。
【図１−１１７】図１−１１７は、図１−１１６の続きである。
【図１−１１８】図１−１１８は、図１−１１７の続きである。
【図１−１１９】図１−１１９は、図１−１１８の続きである。
【図１−１２０】図１−１２０は、図１−１１９の続きである。
【図１−１２１】図１−１２１は、図１−１２０の続きである。
【図１−１２２】図１−１２２は、図１−１２１の続きである。
【図１−１２３】図１−１２３は、図１−１２２の続きである。
【図１−１２４】図１−１２４は、図１−１２３の続きである。
【図１−１２５】図１−１２５は、図１−１２４の続きである。
【図１−１２６】図１−１２６は、図１−１２５の続きである。
【図１−１２７】図１−１２７は、図１−１２６の続きである。
【図１−１２８】図１−１２８は、図１−１２７の続きである。
【図１−１２９】図１−１２９は、図１−１２８の続きである。
【図１−１３０】図１−１３０は、図１−１２９の続きである。
【図１−１３１】図１−１３１は、図１−１３０の続きである。
【図１−１３２】図１−１３２は、図１−１３１の続きである。
【図１−１３３】図１−１３３は、図１−１３２の続きである。
【図１−１３４】図１−１３４は、図１−１３３の続きである。
【図１−１３５】図１−１３５は、図１−１３４の続きである。
【図１−１３６】図１−１３６は、図１−１３５の続きである。
【図１−１３７】図１−１３７は、図１−１３６の続きである。
【図１−１３８】図１−１３８は、図１−１３７の続きである。
【図１−１３９】図１−１３９は、図１−１３８の続きである。
【図１−１４０】図１−１４０は、図１−１３９の続きである。
【図１−１４１】図１−１４１は、図１−１４０の続きである。
【図１−１４２】図１−１４２は、図１−１４１の続きである。
【図１−１４３】図１−１４３は、図１−１４２の続きである。
【図１−１４４】図１−１４４は、図１−１４３の続きである。
【図１−１４５】図１−１４５は、図１−１４４の続きである。
【図１−１４６】図１−１４６は、図１−１４５の続きである。
【図１−１４７】図１−１４７は、図１−１４６の続きである。
【図１−１４８】図１−１４８は、図１−１４７の続きである。
【図１−１４９】図１−１４９は、図１−１４８の続きである。
【図１−１５０】図１−１５０は、図１−１４９の続きである。
【図１−１５１】図１−１５１は、図１−１５０の続きである。
【図１−１５２】図１−１５２は、図１−１５１の続きである。
【図２ａ】図２ａは、ＭＥＸ４の予測エキソン配列を示す。
【図２ｂ】図２ｂは、連鎖不均衡の細密領域内における、マーカーＤ２Ｓ３０８と比較したＭＥＸ４の位置を示す。
【図２ｃ−１】図２ｃ−１は、ＭＥＸ４を用いたスクリーニングによって同定された、胎児脳ｃＤＮＡクローンの完全長挿入配列、及び翻訳を示す。ＭＥＸ４配列は、太字であり、開始コドンは下線である。
【図２ｃ−２】図２ｃ−２は図２ｃ−１の続きである。
【図２ｄ】図２ｄは、ＭＥＸ４ ＦＢ−１中のプライマーから増幅された３’ＲＡＣＥクローンの全長挿入配列を示す。
【図３】図３は、ＭＥＸ４ＦＢ−１クローンとＫＩＡＡ１４９２クローンとの間、及びＫＩＡＡ１４９２クローンとＡＫ０２５０７５クローンとの間の重複の略図である。全長ｃＤＮＡ配列は、２５のエキソンで構成される。エキソン１〜１２（部分）は、ＭＥＸ４ＦＢ−１クローン内にコードされる。エキソン３（部分）〜２５は、ＫＩＡＡ１４９２クローン内にコードされる。しかし、ＫＩＡＡ１４９２予測タンパク質内で利用可能な第一のＭＥＴ残基は、ヌクレオチド９２７にあり、これによって、わずか１６２９ｂｐの予想ＯＲＦが生じる。ＭＥＸ４ＦＢ−１クローンに由来する最初の２つのエキソンの付加によって、真のＭＥＴ残基及び２３９１ｂｐの予測ＯＲＦ（合わせたクローン由来）が得られる。
【図４−１】図４−１は、ＭＥＸ４ＦＢ−１クローン、及び３’ＲＡＣＥクローンの重複から生成したヒトＤＰＰ１０ ｍＲＮＡの全長配列を示す。ＭＥＸ４配列は太字であり、開始コドン及び終止コドンは下線である。
【図４−２】図４−２は図４−１の続きである。
【図４−３】図４−３は図４−２の続きである。
【図４−４】図４−４は図４−３の続きである。
【図５−１】図５−１は、全長マウスＤＰＰ１０コード配列を示す。
【図５−２】図５−２は図５−１の続きである。
【図５−３】図５−３は図５−２の続きである。
【図５−４】図５−４は図５−３の続きである。
【図５−５】図５−５は図５−４の続きである。
【図５ａ−１】図５ａ−１は、マウスＤＰＰ１０全長ｃＤＮＡ配列を示す。
【図５ａ−２】図５ａ−２は図５ａ−１の続きである。
【図５ａ−３】図５ａ−３は図５ａ−２の続きである。
【図５ａ−４】図５ａ−４は図５ａ−３の続きである。
【図５ａ−５】図５ａ−５は図５ａ−４の続きである。
【図６】図６は、ヒトＤＰＰ１０オールタナティブ転写物１〜６の重複、予測膜貫通ドメイン、エキソン２Ａ（転写物６）、及びＢＡＣ位置（登録番号による）を示す。
【図７】図７は、マウスＤＰＰ１０転写物の略図を示す。
【図８−１】図８−１は、マウスＤＰＰ１０オールタナティブエキソン、転写物１〜４の予測ペプチド配列、及び転写物１の全長配列を示す。
【図８−２】図８−２は図８−１の続きである。
【図９−１】図９−１は、ヒトのオールタネイトエキソン１ｂ〜１ｇの配列、及びオールタネイトエキソン２Ａの配列、肝臓クローン１〜３、エキソン２Ｂ〜２Ｇ、転写物１〜６からの予測ペプチド、エキソン１ｂ ３’ＲＡＣＥクローン転写物１〜５の予測ペプチド、ヒト転写物６（ＭＥＸ４〜６「ストッパー（ｓｔｏｐｐｅｒ）」配列、及びヒト３’ＲＡＣＥクローン配列を示す。
【図９−２】図９−２は図９−１の続きである。
【図９−３】図９−３は図９−２の続きである。
【図９−４】図９−４は図９−３の続きである。
【図１０−１】図１０−１は、ＤＰＰ１０エキソンの配列を示す。５’ＵＴＲは、エキソン１ａに、３’ＵＴＲ配列はエキソン２５に含まれる。これらの２つのエキソンのコード領域は太字である。
【図１０−２】図１０−２は図１０−１の続きである。
【図１１】図１１は、７９６アミノ酸のＤＰＰ１０予測タンパク質配列を示す。
【図１２】図１２は、ＤＰＰ１０のアミノ酸配列を示す。アミノ酸３４〜５４（下線）は、膜を貫通することが予測される。βプロペラ（β−ｐｒｏｐｅｌｌｅｒ）内の反復配列を太字イタリック体で示す。触媒性残基に対して相同な残基を下線、かつ影付にしている。
【図１３】図１３は、複数の転写物の存在を実証する、ＤＰＰ１０のノーザンブロットを示す。
【図１４】ＤＰＰ１０相同体の触媒性ドメインのマルチアラインメントを示す。アスタリスク（＊）は、触媒性部位の位置を記す。
【図１５】図１５は、エキソン１ｂ ３’ＲＡＣＥ転写物の略図を示す。
【図１６】図１６は、ＤＰＰ１０及び相同体の膜貫通領域のマルチアラインメントを示す。
【図１７】図１７は、ＤＰＰ１０のβ−プロペラドメイン、及びプロリルオリゴペプチダーゼ相同体のマルチアラインメントを示す。
【図１８】図１８は、ブタのプロリルオリゴペプチダーゼの提案された構造を示す(Fulop V、Bocskei Z、Polgar L.(1998)Prolyl oligopeptidase:an unusual beta-propeller domain regulates proteolysis.Cell 1998 Jul 24;94(2):161〜70)。
【図１９】図１９は、ＰｘＳモチーフを含むサイトカインを示す。１０アミノ酸の予想シグナルペプチド切断部位内にセリンを有し、かつＰｘＳモチーフを含む（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸を示す）、ヒトのケモカイン及びサイトカイン。予想されるシグナルペプチド切断結合は、「＾」として示し、ＰｘＳモチーフを強調している。最初の分子の群は、この切断部位の後ろにＰｘＳの２つの残基を含む。
【図２０】図２０は、成体脳ｃＤＮＡにおける下流のＤＰＰ１０エキソンとＭＥＸ４を結び付けるＲＴ−ＰＣＲを示す。予測される５１９ｂｐの生成物を、ＭＥＸ４．Ｆ１、及びＭＥＸ４．Ｒ１を有するレーン１において観察し、予測される９１９ｂｐの生成物を、ＭＥＸ４．Ｆ１、及びＭＥＸ４．Ｒ２を有するレーン４において観察する。用いたマーカー（レーンＭ）は、１００ｂｐのラダーである。陰性コントロール（ゲノムＤＮＡ、及び水（Ｈ２Ｏ））が含まれる。
【図２１】図２１は、マウス及びヒトのＤＰＰ１０転写物１のペプチドの配列アラインメントを示す。
【図２２ａ】図２２ａは、喘息遺伝子座内の連鎖不均衡を示す。
【図２２ｂ】図２２ｂは、ＬＤマップ内のＤＰＰ１０エキソンの位置を示す。ＤＰＰ中に存在する最初のエキソンの配置を、ＬＤマップに対して示す。ＬｎＩｇＥ及び喘息に対する有意な関連をこのエキソンの上の矢印で示す。目盛りの棒は、５０ｋＤの距離を示す。
【図２３】図２３は、以下のＣＬＵＳＴＡＬ Ｘマルチ配列アラインメントを示す：ＤＰＰＸ−Ｌ（ＤＰＰ６）：Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｐ４２６５８（ＤＰＰ６）；ＤＰＰＸ−Ｓ：Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｐ４２６５８；ＤＰＰ４：Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＡＡ５３２０８。
【図２４】図２４は、ＤＰＰ１０の選択的１ｇ胎児肝臓転写物を示す。
【図２５】図２５は、染色体２ｑ１４のＢＡＣ／ＰＡＣコンティグを示す。これは、連鎖不均衡の絞り込まれた領域、及びマーカーＤ２Ｓ３０８の相対的配置を示す。
【図２６】図２６は、ＳＮＰ遺伝子型決定についてのパイロシークエンシングの例を示す。
【図２７】図２７は、抗ＤＰＰ１０ｃ末端抗体を用いてプローブした、希釈ヒト血清試料のウエスタンブロットを示す。

Claims (99)

  1. ＤＰＰ１０ ｍＲＮＡ配列を備えた単離された核酸配列。
  2. 前記配列がヒトＤＰＰ１０、若しくはこれに相補的な配列若しくはこれに実質的に相同な配列、又はこれらの断片をコードする請求項１に記載の単離された核酸配列。
  3. 前記配列がマウスＤＰＰ１０、若しくはこれに相補的な配列若しくはこれに実質的に相同な配列、又はこれらの断片をコードする請求項１に記載の単離された核酸配列。
  4. 一以上のＤＰＰ１０のエキソン、若しくはこれに相補的な配列若しくはこれに実質的に相同な配列、又はこれらの断片を備えた、請求項１乃至３の何れかに記載の単離された核酸配列。
  5. ＤＰＰ１０の発現を制御するための請求項１乃至４の配列の使用。
  6. ＤＰＰ１０発現の制御用医薬を製造するための請求項１乃至４の何れかの配列の使用。
  7. インビトロ又はインビボでのＤＰＰ１０の発現を可能とする、請求項１乃至４の何れかの単離された核酸を備えたベクター。
  8. 請求項１乃至４の何れかの単離された核酸、若しくは実質的にこれに相同な配列、又はこれらの断片によってコードされるポリペプチド配列。
  9. 前記ポリペプチドが膜貫通ドメインを欠如した可溶性ＤＰＰ１０タンパク質である請求項８に記載のポリペプチド配列。
  10. 分泌シグナルに作用可能に連結されている請求項８又は９の何れかに記載の可溶性ＤＰＰ１０タンパク質。
  11. 前記タンパク質がヒスチジンタグを有する請求項１０に記載の可溶性ＤＰＰ１０タンパク質。
  12. 請求項８若しくは９のポリペプチド又は請求項１０若しくは１１の可溶性タンパク質を含んだ融合タンパク質であって、前記融合タンパク質又はタンパク質が担体に連結されている融合タンパク質。
  13. 請求項８若しくは９に記載のポリペプチド配列、又は請求項１０乃至１２の何れかに記載のタンパク質であって、前記タンパク質が翻訳後修飾を受けているポリペプチド配列。
  14. 請求項８乃至１３のポリペプチド配列又は請求項１乃至４の単離された核酸配列に対して特異的な抗体。
  15. 請求項８、９、若しくは１３に記載のポリペプチド又は請求項１０乃至１３の何れかに記載のタンパク質の抗原と反応する抗体。
  16. 可溶型のＤＰＰ１０、β−プロペラドメイン、外側ドメイン、又は触媒ドメインに対して特異的である請求項１４に記載の抗体。
  17. 可溶型のＤＰＰ１０、β−プロペラドメイン、外側ドメイン、又は触媒ドメインと反応する請求項１５に記載の抗体。
  18. 前記抗体がキメラ抗体であるか又はヒト化されている請求項１６又は１７に記載の抗体。
  19. 試料中のＤＰＰ１０を検出又は測定するためのアッセイにおける請求項１４乃至１８の何れかの抗体の使用。
  20. 請求項１乃至４の何れかに記載の核酸配列を調製する方法であって、連続するヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチド残基を連結することを備えた方法。
  21. 請求項８乃至１３に記載のポリペプチドを調製する方法であって、連続するアミノ酸及び／又はオリゴペプチドを連結することを備えた方法。
  22. 前記ポリペプチド又はタンパク質が無細胞系で産生される請求項２１に記載の方法。
  23. 請求項７のベクターを備えたヒト以外のトランスジェニック動物。
  24. ＤＰＰ１０を実質的に発現しないヒト以外のトランスジェニック動物。
  25. 疾病をもたらすＤＰＰ１０のバリアントをコードするヒト以外のトランスジェニック動物。
  26. 炎症性疾患に対する被験体の感受性を診断又は決定する方法であって、病状に関連するＤＰＰ１０のバリアントが試料中に存在するか判定すること、又は試料中のＤＰＰ１０のレベルを測定することを備えた方法。
  27. 疾患又はＤＰＰ１０関連疾患に対する素因を診断する方法であって、図１の２５９００７、２６７９０１、及び／又は３１８５２４位にＳＮＰを有するリスク対立遺伝子の有無を判定することを備え、前記リスク対立遺伝子が存在することが、疾患又は疾患に対する素因の診断指標となる方法。
  28. 前記リスク対立遺伝子が、図１の２５９００７に位置するアデニン以外の任意のヌクレオチド残基、２６７９０１に位置するアデニン以外の任意のヌクレオチド残基、３１８５２４に位置するチミン以外の任意のヌクレオチド残基である請求項２７に記載の方法。
  29. 前記リスク対立遺伝子が、図１の２５９００７に位置するシトシン残基、２６７９０１に位置するグアニン残基、３１８５２４に位置するシトシン残基である請求項２７又は２８に記載の方法。
  30. 請求項２７乃至２９の何れかに記載の方法であって、表１ａ、１ｂ、１ｃ又は表３のＳＮＰを一以上有するリスク対立遺伝子の有無を判定することをさらに備えた方法。
  31. 請求項２７乃至３０の何れかに記載の方法であって、前記方法が試料に対して実施される方法。
  32. 請求項２７乃至３１の何れか一項に記載の方法であって、被験体から試料を採取することと、試料から核酸を単離することとを備えた方法。
  33. 被験者の疾病を予防又は治療する方法であって、ＤＰＰ１０の活性、発現、半減期、又は翻訳後修飾をモジュレートすることを備えた方法。
  34. 前記疾病が炎症性腸疾患、喘息、アトピー、慢性間接リウマチ、又は乾癬である請求項３３に記載の方法。
  35. 請求項３３又は３４に記載の疾病を治療又は予防する方法であって、図１の２５９００７、２６７９０１、及び／又は３１８５２４位にＳＮＰを有するリスク対立遺伝子の有無を判定することと、リスク対立遺伝子が存在すれば、前記疾病を予防、遅延、又は軽減するために治療を施すこととを備えた方法。
  36. 請求項３３乃至３５の何れかに記載の方法であって、発症対立遺伝子の効果をモジュレートすることができる物質を被験体に投与することを備えた方法。
  37. 請求項３３乃至３５の何れかに記載の方法であって、前記疾病が炎症性腸疾患、喘息、アトピー、慢性関節リウマチ、又は乾癬等の炎症性疾患である方法。
  38. ＤＰＰ１０核酸分子中にＳＮＰを含む単離された核酸分子。
  39. 図１の配列の一部を含み、且つ表１ａ、１ｂ、１ｃ、又は表３のうちの何れか一以上に列記された図１の位置に対応する位置に一以上のＳＮＰを有する、請求項３８に記載の単離された核酸分子。
  40. 図１の３１８５２４位に対応する位置に、又は図１の２５９００７位の対応する位置に、又は図１の２６７９０１位に対応する位置にＳＮＰを有する単離された核酸分子。
  41. 請求項３８乃至４０の何れか一項の配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする単離された核酸分子。
  42. 表１のＳＮＰの対立遺伝子を識別することができる、請求項４１に記載の単離された核酸分子。
  43. 表２に記載されているプライマー配列。
  44. 請求項３８乃至４３の何れか一項の単離された核酸分子を備えたベクター。
  45. 請求項４４のベクター又は請求項３８乃至４３の何れか一項の単離された核酸分子を備えた宿主細胞。
  46. 請求項３８乃至４２の何れかの単離された核酸によってコードされるポリペプチド配列若しくはこれに実質的に相同な配列、又はそれらの断片。
  47. 前記ポリペプチドが膜貫通ドメインを欠いた可溶性ＤＰＰ１０タンパク質である請求項４６に記載のポリペプチド配列。
  48. 分泌シグナルに作用可能に連結された請求項４６又は４７の何れかに記載の可溶性ＤＰＰ１０タンパク質。
  49. 前記タンパク質がヒスチジンタグを備えた請求項４８に記載の可溶性ＤＰＰ１０タンパク質。
  50. 請求項４６若しくは４７のポリペプチド又は請求項４８若しくは４９の可溶性タンパク質を含んだ融合タンパク質であって、前記ポリペプチド又は融合タンパク質が担体に連結されている融合タンパク質。
  51. 請求項４６若しくは４７に記載のポリペプチド配列又は請求項４８乃至５０の何れかに記載のタンパク質であって、前記タンパク質が翻訳後修飾されているポリペプチド又はタンパク質。
  52. 請求項３８乃至４２の単離された核酸に対して、又は請求項４６、４７、若しくは５１のポリペプチド配列に対して、又は請求項４８乃至５１のタンパク質に対して特異的な抗体。
  53. 請求項４６、４７、若しくは５１に記載のポリペプチド又は請求項４８乃至５７の何れかに記載のタンパク質の抗原と反応する抗体。
  54. 前記抗体がキメラ抗体又はヒト化抗体又は二種特異性抗体である請求項５２又は５３に記載の抗体。
  55. 試料中のＤＰＰ１０多型を検出又は測定するためのアッセイにおける、請求項５２乃至５４の何れかの抗体の使用。
  56. 組換えＤＰＰ１０遺伝子産物を作製するための又はＤＰＰ１０の制御若しくは分析で使用するための請求項７又は４４のベクターを備えた宿主細胞。
  57. 組換えＤＰＰ１０遺伝子産物を作製するための、又は炎症性疾患を有する若しくは炎症性疾患に対して感受性を有する個体の診断若しくは治療で使用するための物質を同定する薬物スクリーニング系において使用するための請求項７又は請求項４４のベクターを備えた宿主細胞。
  58. 炎症性疾患を有する個体又は炎症性疾患に対して感受性を有する個体の診断又は治療で使用するための物質を同定する薬物スクリーニング系において使用するための、請求項５７の宿主細胞の使用。
  59. 請求項７若しくは４４のベクター又は請求項３８乃至４２の何れか一項の単離された核酸分子を備えたヒト以外のトランスジェニック動物。
  60. 疾病又は疾病に対する素因を診断するためのキットであって、表１ａ、１ｂ、１ｃ、又は表３のＳＮＰを有するリスク対立遺伝子の有無を判定するための手段を備え、前記リスク対立遺伝子が疾病又は疾病に対する素因の診断指標となるキット。
  61. 図１の２５９００７位、２６７９０１位、及び／又は３１８５２４位にＳＮＰを有するリスク対立遺伝子の有無を判定するための手段を備えた、請求項６０に記載のキット。
  62. 疾病を治療するための化合物を同定する方法であって、（ａ）表１ａ、１ｂ、１ｃ、又は表３に列記された位置にＳＮＰを有する単離された核酸分子を含む組織に化合物を投与することと、（ｂ）前記化合物が前記ＳＮＰの下流効果をモジュレートするかどうかを測定することと、を備えた方法。
  63. 炎症性腸疾患、喘息、アトピー、慢性関節リウマチ、又は乾癬等の炎症性疾患の予防又は治療において使用するための物質又は抗体。
  64. 炎症性腸疾患、喘息、アトピー、慢性関節リウマチ、又は乾癬等の炎症性疾患の予防又は治療において使用するための医薬の製造における物質の使用。
  65. 請求項１乃至４若しくは３８乃至４２の何れかに記載の核酸、又は請求項８乃至１３若しくは４６乃至５１の何れかに記載のポリペプチドを含む薬学的組成物。
  66. 請求項１４乃至１８、５２、又は５３の何れかに記載の抗体を含む薬学的組成物。
  67. ＤＰＰ１０活性をモジュレートする物質を同定するためのスクリーニングであって、
    請求項８乃至１３の何れか１項に記載のＤＰＰ１０ポリペプチド配列を準備することと、
    ＤＰＰ１０の基質を準備することと、
    検査すべき物質を準備することと、
    前記ＤＰＰ１０の基質の加工を測定することによって、前記検査すべき物質がＤＰＰ１０をモジュレートするかどうかを測定することと、
    を備えたスクリーニング。
  68. 前記基質がＸＰＸＳモチーフを有する分子、又は一般式ＮＨ２Ｘ−Ｐ（Ｘ）ｙＳ−（Ｘ）ｎを有する分子、又はケモカインである請求項６６に記載のスクリーニング。
  69. 前記ＸＰＸＳモチーフ又は一般式ＮＨ２Ｘ−Ｐ（Ｘ）ｙＳ−（Ｘ）ｎが小ペプチド分子中に存在する、請求項６７乃至６８の何れか一項に記載の基質。
  70. 前記基質が蛍光標識されている請求項６６乃至６９の何れか一項に記載の基質。
  71. 前記ＤＰＰ１０ポリペプチドが精製されている、請求項１乃至４の何れかに記載のスクリーニング。
  72. 前記基質の加工の測定がプロテアーゼ活性を測定することを備える、請求項６７乃至７１の何れか一項に記載のスクリーニング。
  73. 前記ＤＰＰ１０ポリペプチドが細胞によって発現されている請求項６７乃至７２の何れか一項に記載のスクリーニング。
  74. 検査すべき前記物質が非生物分子又は生物分子である請求項６７乃至７３の何れか一項に記載のスクリーニング。
  75. ＤＰＰ１０活性をモジュレートする物質を同定するためのスクリーニングであって、
    請求項８乃至１３の何れか一項に記載されているＤＰＰ１０ポリペプチドを準備することと、
    検査すべき物質を準備することと、
    細胞を準備することと、
    前記細胞の表面への接着を測定することによって、検査すべき前記物質がＤＰＰ１０をモジュレートするかどうかを測定することと、
    を備えたスクリーニング。
  76. 前記表面がさらなる細胞の表面である、請求項７５に記載のスクリーニング。
  77. 前記表面が非生物分子を備える、請求項７５又は７６の何れか一項に記載のスクリーニング。
  78. 前記表面が生物分子である、請求項７５乃至７７の何れか一項に記載のスクリーニング。
  79. 前記細胞の一以上が不死化されている、請求項７５乃至７８の何れか一項に記載のスクリーニング。
  80. 前記細胞の一以上がリンパ球である、請求項７５乃至７９の何れかに記載のスクリーニング。
  81. 前記細胞の一以上が請求項７若しくは請求項４３のベクターをトランスフェクトした細胞であるか又は請求項４４若しくは４５の宿主細胞である、請求項７５乃至８０の何れかに記載のスクリーニング。
  82. ＤＰＰ１０活性をモジュレートする物質を同定するためのスクリーニングであって、
    請求項８乃至１３の何れか一項に記載されているＤＰＰ１０ポリペプチドを準備することと、
    検査すべき物質を準備することと、
    細胞を準備することと、
    前記細胞の分化又は増殖の変化を測定することと、
    を備えたスクリーニング。
  83. 前記細胞が請求項８乃至１３の何れか一項に記載のＤＰＰ１０を発現している、請求項８２に記載のスクリーニング。
  84. 分化を測定する細胞がＴリンパ球である、請求項８２又は８３の何れか一項に記載のスクリーニング。
  85. 細胞の分化の変化がＴ細胞の活性化である、請求項８２乃至８４の何れか一項に記載のスクリーニング。
  86. 前記細胞の分化の変化が細胞シグナル伝達因子の発現の変化を伴う、請求項８２乃至８４の何れかに記載のスクリーニング。
  87. 前記細胞シグナル伝達因子が免疫調節物質又はペプチド制御因子である、請求項８６に記載のスクリーニング。
  88. 患者又は実験動物から採取した後に前記細胞が培養される、請求項８２乃至８７の何れかに記載のスクリーニング。
  89. ＤＰＰ１０活性をモジュレートする物質を同定するためのスクリーニングであって、
    請求項２３乃至２５又は５９の何れか一項に記載のトランスジェニック動物を準備することと、
    検査すべき物質を準備することと、
    前記トランスジェニック動物を検査すべき前記物質に接触させることと、
    前記トランスジェニック動物の表現型の変化を検出することと、
    を備えたスクリーニング。
  90. 表現型の変化がＴ細胞の表現型の変化を伴う、請求項８９に記載のスクリーニング。
  91. 表現型の変化がＢ細胞の表現型の変化を伴う、請求項８９に記載のスクリーニング。
  92. ＤＰＰ１０をモジュレートする物質の使用に伴う副作用を検出するためのスクリーニングであって、
    ＤＰＰ１０を実質的に発現しない細胞を準備することと、
    検査すべき物質を準備することと、
    検査すべき前記物質を前記細胞に接触させることと、
    前記物質により前記細胞に対して生じた何らかの副作用を測定することと、
    を備えたスクリーニング。
  93. 前記副作用が細胞分化の変化を伴う、請求項９２に記載のスクリーニング。
  94. 前記副作用が細胞増殖の変化を伴う、請求項９２に記載のスクリーニング。
  95. 前記細胞がトランスジェニック動物の一部である請求項９２乃至９４の何れか一項に記載のスクリーニング。
  96. 前記副作用が表現型の変化の指標である、請求項９２乃至９５の何れか一項に記載のスクリーニング。
  97. ＤＰＰ１０活性をモジュレートする物質を同定するスクリーニングであって、
    請求項１乃至４の何れか一項に記載されているＤＰＰ１０核酸を準備することと、
    検査すべき物質を準備することと、
    前記核酸の試料との前記物質の相互作用を測定することによって、前記検査すべき物質がＤＰＰ１０をモジュレートするかどうかを測定することと、
    を備えたスクリーニング。
  98. 前記スクリーニングがＤＰＰ１０の転写を測定するインビトロ転写アッセイである、請求項９７に記載のスクリーニング。
  99. ＤＰＰ１０の活性をモジュレートする物質のスクリーニングにおける、請求項１乃至４若しくは３８乃至４２の何れかに記載の核酸配列又は請求項８乃至１３若しくは４６乃至５１の何れかに記載のポリペプチド配列の使用。
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