CN103052399A - 用于减少病毒组合物中dna杂质的方法 - Google Patents

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Abstract

提供了一种用于纯化病毒组合物的方法。尤其是，提供了一种用于减少病毒组合物中不期望的残余DNA，同时保留病毒本身免疫原性的方法。得到的免疫原性病毒组合物基本不含残余DNA，并适用于医学产品的制造，如为人或动物而设计的疫苗。

Description

用于减少病毒组合物中DNA杂质的方法
技术领域
本发明通常涉及疫苗的制造，特别是病毒的纯化，以及更特别是通过从用于病毒增殖的细胞基质中消除残余DNA而实现的病毒纯化。尤其是，本发明涉及使用传代细胞系的病毒生产，特别是使用Vero细胞。生产过程可包括收获目标病毒颗粒、净化病毒组合物、灭活病毒以及将病毒组合物与具有高离子强度溶液混合，随后通过体积排阻色谱的进一步纯化。本发明适用于医学产品（如用于人和动物的疫苗）制造的病毒生产，且特别是狂犬病病毒的生产。
背景技术
1介绍
改造的病毒颗粒可用于多种人类医学应用，比如疫苗。在这种情况下，需要对所用病毒组合物进行纯化，从而消除潜在的医学风险，比如由不需要的杂质而引起的副作用，或将副作用最大程度降低至可接受的水平。纯化过程包括去除包括源自用于培养病毒的细胞基质中不期望的残余DNA片段的各种杂质。然而，纯化过程必须生产出符合最严苛的监管安全标准的产品，所用的纯化方法不得降低病毒本身的医用性质，还不应使得生产过程是非经济有效的，以避免最终的医学产品变得价格过高。
依赖于使用核酸酶或化学试剂的纯化技术，将残余DNA降解为极小的片段，以至于不能引起明显临床风险，但这可能导致病毒颗粒的降解，继而不利地降低目标病毒的免疫原性。各种过滤、离心及其它净化病毒溶液的技术依赖于所需病毒相较于不期望的杂质之间差异的物理性质（比如尺寸重量、密度等），可能无法完全除去DNA以至于达到满足医学产品监管标准的水平。
纯化技术如离子色谱法等依赖于同病毒颗粒与不期望的杂质相关的电荷差异，这种方法可导致生产产量低，因而生产成本高。
本发明提供了一种成本有效的方式来标准化批量生产高纯病毒组合物，同时保留病毒颗粒的免疫原性。因此，本发明满足了生产高品质、高疗效且实惠的病毒组合物的需求，病毒组合物可满足安全和有效的国际监管标准，并因此适用于人类医学应用。
45年多以来，使用源自各种来源的原代细胞来增殖用于疫苗的病毒，来源包括：鸡胚胎以及猴、狗、兔和仓鼠肾脏细胞。虽然这些制造过程所生产的产品用于人类使用被认为是安全的，但是潜在的传染性病原体污染、个体动物之间的不一致性以及收集动物细胞的伦理敏感性导致对替代细胞基质的寻求。
发现二倍体细胞克服原代细胞中观察到的许多缺点。二倍体细胞的耐受性好、无致肿瘤性、染色体变异的频率低以及连续增殖的能力有限。然而，二倍体细胞难以用于批量生产而且成功的使用二倍体细胞对环境条件的要求更加严苛。
传代细胞系，第三类细胞基质，逐渐成为病毒生产的优选选择。传代细胞系的优势是无限生产标准且特征清晰的细胞，这些细胞生长快速并可用在生物反应器中大规模生产病毒。WHO建立了Vero细胞的主细胞库，Vero细胞是一种源自非洲绿猴肾脏的传代细胞系，被认为有助于疫苗抗原生产的细胞系（WHO技术报告747 1987）。
然而，传代细胞系本身和一些涉及其医学目的的用途的相关缺点。残余DNA可能会整合入宿主基因组中，可潜在地导致宿主/接受者DNA的恶性转化，导致细胞复制中的异常比如癌症。
有4个影响风险程度的因素：细胞基质本身，不同类型具有不同的安全性谱、DNA片段的尺寸，即200个碱基对以下通常小于功能基因的尺寸、施用途径，即通过口服DNA摄取的效率相对于肠胃外施用组合物的效率低约10000倍、以及存在的DNA浓度。
FDA联邦法规法典第21篇（title）第610.13部分对生物产品的普遍标准规定“产品应不含外源性材料，除非它是在已批准的生物许可应用中所描述的制造过程中所不能避免的”。WHO和国家监管机构也发布了具体的条例或指南，专门控制源自使用传代细胞系的生产过程的疫苗抗原中的DNA含量水平。
WHO专家委员会在1998年发表的关于生物学标准化技术报告878总结道“当这种DNA的量等于或少于100pg每肠胃外剂量时，在产品中和残余传代细胞系DNA相关的风险是可以忽略的”。委员会评估的结论为每疫苗纯化剂量中10ng以内的残余传代细胞系DNA视为是可接受的。
欧洲药品评价局专利药品委员会于2001年发表了关于使用人源致肿瘤性细胞生产生物和生物技术医学产品的立场声明，其引用了WHO的上述结论，但是还注明WHO报告所指出的当临床风险可能性较高时，例如，当残余DNA可含有感染性逆转录酶病毒前病毒体序列时，可发生意外。报告结论是成品中所允许的DNA水平“应尽可能低”，且以具体案例的风险因素评估为基础。
于2010年发表的FDA产业指南“用于生产传染病适应症的病毒疫苗的细胞基质和其它生物材料的特征和描述（qualification）”，其规定“应将传代非致肿瘤性细胞（比如低传代Vero细胞）中的残余DNA，对于肠胃外接种，限制到低于10ng/剂量，如WHO所建议的”。建议口服施用的组合物低于100μg/剂量，因为这种施用方法的天然摄入率不高。
中国食品药品协会（SFDA）主席负责的委员会于2010年发布的中国药典，其中规定来自狂犬病疫苗生产中所用的Vero细胞基质的残余DNA必须低于100pg/剂量，即0.1ng/剂量，或低于WHO建议值的100倍（见上文）。
对于经济有效的生产适用于人类医学应用的高品质病毒组合物的可靠大规模供应，一直存在需求，这包括但不限于疫苗。此种情况下，质量定义为i）病毒的抗原性质，从而它产生预期的医学效果；以及ii）同时，病毒组合物的纯度，从而将制造过程期间引入的任何污染物（例如来自细胞基质的DNA）消除或减少到成品中可接受的最低水平，以确保组合物安全地用于人类使用。
因此本发明的一个目标是提出一种易于自动化的以很高产量纯化病毒的新方法。
本发明的另一目标是提出一种允许获得完整的、未降解病毒的纯化方法。
本发明的再一个目标是提出一种显著降低不期望的杂质浓度的纯化方法，特别是显著减少成品中来自细胞系基质的残余DNA，从而产生高度纯化的病毒颗粒。
本发明再一个目标是提出一种可规模化的纯化方法，即，使大量生产所需纯化的病毒组合物成为可能。
本发明的目标亦包括改善加工技术、简化所需的设备、最小化生产成本以及确保批间一致性。
为了实现这些目标，本发明的主题是用于纯化病毒培养物的方法，其中根据本发明病毒培养物的纯化特征在于，方法由过程的组合组成，其包括至少一个用来增加病毒组合物的离子浓度的步骤，然后至少一个用来通过体积排阻色谱法从不期望的残余DNA中分离所需病毒的步骤。这种过程的结果是，纯化的病毒组合物，其可以用于生产高效价的疫苗，且不会在接受者中引起显著副作用。
2.相关技术的描述
用于纯化病毒的方法在现有技术中是公知的。纯化残余DNA的一个方法是将DNA降解至尺寸足够小而减轻DNA功能性残余片段的风险，也就是说，减少残余DNA保留功能基因的机会，使之达到临床可接受水平。
降解DNA的一个方法是引入核酸酶，以酶能够破坏残余DNA片段的能力为基础进行酶的选择。细胞裂解前或后使用核酸酶的方法在专利申请US 2009/0017523和US 2009/0123989中已有描述。还可以通过除了引入核酸酶之外的方法来实现不期望的DNA的降解，例如使用化学组合物，比如在专利申请US 2009/0304729中所描述的那些。
然而，降解DNA片段并不是优选解决方案，因为用于降解不期望的DNA的组合物、核酸酶或其它也易于使目标病毒的免疫原性受到不利影响。为了满足整体目标，获得的病毒组合物必须具有低残余DNA浓度且病毒颗粒具有所需的免疫原性。此外，用于降解DNA的核酸酶、化学品或其它物质其本身必须之后从病毒组合物中除去。因此，根据本发明，纯化方法的部分特征在于除去或减少DNA的过程不使用核酸酶。
去污剂可被用于沉淀病毒组合物悬液中的DNA，从而有助于将DNA通过过滤或离心技术去除。然而，去污剂本身之后必须从最终的病毒组合物中去除，这导致制造过程中的额外步骤和成本。因此，根据本发明，纯化方法部分特征在于不使用去污剂的去除或减少DNA的过程。
体积排阻色谱法已用于从病毒组合物中消除不期望的残余DNA，且特别是如在传代细胞系基质（比如Vero细胞）上生产的狂犬病病毒组合物（见Chtioui等人，2007、Kumar等人，2002以及Kumar等人，2005）。如现有技术所述，体积排阻在低盐浓度下进行，其中“低盐浓度”指高达0.5M NaCl。这种现有技术公开未教导在进行体积排阻色谱法之前使用高离子浓度缓冲液来进一步增强不期望残余DNA的去除的好处。
现有技术中描述的另一种方法是使用离子色谱法。与体积排阻色谱法相比，离子色谱法有一些限制，它使纯化的病毒的终产量显著降低（Purification of rabies virus produced on Vero cells usingchromatography techniques,Chtioui等人2007），使得这种离子色谱方法不适于大规模的病毒生产。
本发明的优势在于可实现残余DNA的显著减少，整个过程可以按商业规模进行，其高病毒产量适于医学用途，比如疫苗生产。
3.参考资料
·US 2009/0017523 Virus Purification Methods
·US 2009/0123989 Virus Purification Using Ultrafiltration
·US 2009/0304729 Cell-derived Viral Vaccines with Low Levels ofResidual Cell DNA
·U.S.专利No.6,194,191 Method for the production and purificationof adenoviral vectors
·Purification of Rabies Virus Produced on Vero Cells UsingChromatography Techniques Chtioui等人.Cell Technology for CellProducts,629-634 2007
·Process Standardization for Optimal Virus Recovery and Removal ofSubstrate DNA and Bovine Serum Proteins in Vero Cell-Derived RabiesVaccine,Kumar等人.Journal of Bioscience and Bioengineering,Vol.94,No.5,3375-383,2002
·Purification,Potency and Immunogenicity Analysis of Vero CellCulture-derived Rabies Vaccine:a Comparative Study of Single-stepColumn Chromatography and Zonal Centrifuge Purification,Microbes andInfection7(2005)1110-1116Kumar at.al.2005
·中国药典2010版
·1987年发布的WHO技术报告Ref.747
·US FDA联邦法规法典第21篇第610.13部分
·1998年发布的WHO技术报告Ref.878
·欧洲药品评价局专利药品委员会于2001年发表的：关于使用人源致肿瘤性细胞生产生物和生物技术医学产品的立场声明
·2010年发布的FDA产业指南“用于生产传染病适应症的病毒疫苗的细胞基质和其它生物材料的特征和描述”。
发明内容
本发明涉及病毒纯化的领域，尤其涉及通过细胞系培养获得的病毒纯化，以及更尤其，当使用传代细胞系作为病毒增殖的基质时，甚至更尤其当细胞基质包含Vero细胞时。
在本发明的主题中，收获的病毒组合物不仅含有目标病毒，还含有来自培养细胞的DNA，以及其它不期望的杂质。当这些病毒生产用于医学用途时，比如制造疫苗，优选将其尽可能的纯化，即残余DNA和其它杂质的含量降低至一定的水平，在此水平上没有风险或任何副作用的最小临床上可接受的最小风险。作为最低限度，最终病毒组合物的纯度必须符合适用的安全和有效的监管标准。
本发明的主题包括所有病毒，尤其是顺序单股反链病毒目（mononegavirales）的病毒，以及更具体地弹状病毒科（Rhabdoviridae）的科，甚至更具体地狂犬病病毒。本发明的主题还适用于尤其是适于传代细胞系进行增殖的病毒，例如，狂犬病（rabies）、小儿麻痹症（Poliomyelitis）、出血热（hemorrhagic fever）、日本脑炎（JapaneseEncephalitis）等。
在本发明的具体实施方式中，用于收获的步骤不得使用核酸酶或用于裂解细胞基质的细胞的其它物质。在本发明的另一个实施方式中，没有使用化学品（如，去污剂）来沉淀DNA，尽管这有助于从含目标病毒的溶液中除去DNA。在本发明的另一些实施方式中，没有使用化学品来降解DNA，从而减小DNA尺寸以便减弱存在保留了功能基因的DNA片段的风险。
本发明的主题包括适用于病毒增殖的所有细胞基质，尤其是传代细胞系，更尤其是Vero细胞。所选细胞系将在适当的环境条件下培养并用目标病毒进行感染。
在本发明的具体实施方式中，当在病毒培养必要的所需条件下，培养一段适宜的时间后，收获病毒组合物。在本发明的相关实施方式中，悬液中不需要的杂质应经过滤基本上被清除。这类技术的使用通常依赖于目标病毒相较于不期望的杂质的差异物理性质（比如尺寸），以便纯化或净化病毒溶液。
然而，病毒溶液中的一些残余细胞基质DNA，特别是悬液中沉淀的DNA片段，可以经过滤被清除。
残余DNA与病毒颗粒之间结合亲和性的作用在浓缩病毒颗粒期间会进一步加强，因为在病毒颗粒聚集期间DNA会被物理地捕获。一旦DNA特异性或非特异性地结合病毒，或被病毒聚集体捕获，那么使用如本领域所述的超滤和/或体积排阻法，作为用于高效去除DNA的方式，变得相对不是有效的。
本发明还涉及纯化最终收获的病毒的过程，其将优选，但不必要，包括至少以下步骤：经过滤从细胞基质去除细胞碎片和部分未结合的残余DNA的病毒溶液净化、将纯化的病毒浓缩至有助于进一步处理的水平的步骤、在高盐缓冲液以及然后在低盐缓冲液中冲洗病毒、灭活步骤从而通过化学品处理或本领域技术人员已知的其它过程使收获的病毒灭活。
在这一阶段的纯化过程中，病毒溶液通常仍然含有超过100pg/ml的来自细胞基质的残余DNA的浓度，就是说，没有预期病毒组合物将符合中国FDA在中国药典2010中规定的针对适用于人类使用的DNA含量的最大浓度的指南。
举例说明，本发明包括纯化过程中两个额外重要步骤，即用高离子（即高盐）溶液冲洗浓缩的病毒组合物，随后是体积排阻色谱法，导致去除大量不期望的残余DNA，从而为制备大规模商业量级的高纯度病毒提供了更稳健且经济上可行的方法。
在本发明的某些具体实施方式中，在高离子强度缓冲液中适当处理病毒之后是体积排阻色谱法，病毒组合物的DNA浓度可低于100pg/ml，优选在10和100pg/ml之间，且更优选在10和50pg/ml之间。将期望这种病毒组合物满足中国药典2010中所规定的残余DNA含量的SFDA标准。
在本发明的一些具体实施方式中，体积排阻色谱法之后进行另外的过滤步骤，以便在病毒用于医学目的之前去除其它微粒。随后，可将病毒组合物稀释或者调整以至于符合具体目标医学产品的制剂要求。
本发明的整体效果是，通过提供一种用于纯化病毒组合物的标准过程，克服了现有技术的局限性，标准过程涉及去除杂质，且特别是最大可能程度地去除细胞DNA，同时保留了目标病毒的所需抗原性质，其然后可用于适于人类医学用途的产品。
通过阅读以下的详细说明，将更好地理解本发明。
附图说明
无图。
具体实施方式
可通过参考后续本发明某些具体实施方式以及其中所包括的实施例的详细描述，更容易理解本发明。
贯穿本申请，当参考出版物时，这些出版物的公开其全部并入此处作为参考，列入本申请中以便更加充分地描述本发明所属技术领域的状态。
在进一步说明本发明之前，应了解本发明不局限于所述特定实施方式，就其本身而言可以，当然，有所变化。还应了解此处使用的术语仅是为了描述特定实施方式的目的，而非意图进行限制，因为本发明的范围仅受限于所附权利要求。
除非另有指明，在此使用的所有技术和科学术语均与本发明所属技术领域普通技术人员通常理解的含义相一致。尽管和此处所述的那些相似或等同的方法和材料也可用于本发明的实施或测试中，现在描述优选的方法和材料。此处提到的所有出版物并入此处作为参考，以便公开和描述和引用的出版物有关的方法和/或材料。
必须注意，如此处以及在所附权利要求中所用，除非上下文中另有明确说明，否则单数形式“一”、“和”以及“该”包括复数指代。因此，例如，涉及“一个内容”包括这种内容的复数形式，以及涉及“该段落”包括一个或更多个段落以及本领域技术人员熟知的等同形式等。还要注意，可以这样撰写权利要求以便排除任何任选元素。因此，这种表述意图作为使用这种和复述权利要求要素关联的排除性术语如“仅”、“只”等、或使用“负向（negative）”限制的前提基础。
术语定义
“特异性”结合或“特异性地”结合此处指，从细胞基质中分离出的DNA片段与目标病毒DNA融合，或加强与病毒在特定位置（在表面上或其它）的结合，或者对DNA片段结构的特定的结合亲和性。
“非特异性”结合或“非特异性地”结合的DNA此处是指，以某种方式与病毒通过电子或物理亲和性相结合的DNA，但没有与病毒基因组遗传整合或与病毒的任何特定位点结合。
整个文件中使用了符合缩写标准惯例的特定测量单位，比如“μg”指微克、“pg”指皮克、“ng”指纳克、“ml”指毫升以及“l”指升。
发明概述
本发明涉及优选在无菌条件下对病毒组合物进行纯化，具体而言，除去杂质，更具体地，除去来自用于病毒增殖的细胞基质的残余DNA。通过除去这种杂质，使获得的病毒组合物可适用于医学应用，例如生产人或动物用的疫苗，而无需使疫苗接受者接触和任何杂质有关和不期望的副作用有关的过度风险，特别是引起出现来自目标病毒增殖中所用的宿主细胞培养物的残余DNA片段的杂质。
本发明的主题涉及病毒组合物的纯化过程，其导致能成本有效地回收具有极高纯度特征的商业上可行量的免疫原性病毒颗粒，使得这种方法尤其适用于制备用于人类使用的医学产品，比如疫苗。
在本发明的一个实施方式中，描述了一种纯化病毒颗粒的方法。尤其是，本发明涉及纯化病毒颗粒的方法，方法包括通过多步骤过程从病毒颗粒除去所有或部分残余DNA杂质（如来自用于目标病毒增殖的宿主细胞的DNA片段），这一过程的特征在于通过将病毒颗粒浸入高离子浓度缓冲液，然后通过色谱法步骤除去DNA杂质。
在本发明的一个相关实施方式中，描述了一种纯化病毒颗粒的方法。尤其是，本发明涉及纯化病毒颗粒的方法，方法包括通过多步骤过程从病毒颗粒除去所有或部分残余DNA杂质（如来自用于目标病毒增殖的宿主细胞的DNA片段），这一过程的特征在于将病毒颗粒浸入高离子浓度缓冲液，然后通过体积排阻色谱法步骤除去DNA杂质。
在本发明的再一个相关实施方式中，描述了一种纯化病毒颗粒的方法。尤其是，本发明涉及纯化病毒颗粒的方法，方法包括通过多步骤过程从病毒颗粒除去所有或部分残余DNA杂质（如来自用于目标病毒增殖的宿主细胞的DNA片段），这一过程的特征在于将病毒颗粒浸入高离子浓度缓冲液，然后灭活目标病毒，然后通过体积排阻色谱法步骤除去DNA杂质。
在本发明的另一个相关实施方式中，描述了一种纯化病毒颗粒的方法。尤其是，本发明涉及纯化病毒颗粒的方法，方法包括通过多步骤过程从病毒颗粒中除去所有或部分残余DNA杂质（如来自用于目标病毒增殖的宿主细胞的DNA片段），这一过程的特征在于将病毒颗粒浸入高离子浓度缓冲液，然后灭活目标病毒，然后通过体积排阻色谱法步骤除去DNA杂质，其中DNA片段与目标病毒特异性地和/或非特异性地结合。
缓冲溶液的离子强度可以根据溶液中存在的所有离子的摩尔浓度和电荷数来确定。离子强度I可按照下面的公式进行计算：
I = 1 2 Σ i = 1 n c i z i 2
其中，Ci是离子i的摩尔浓度（mol·dm-3），zi是该离子的电荷数，对溶液中所有离子求和。一般而言，1：1电解质，比如NaCl，离子强度等于它的摩尔浓度，而多价离子对于溶液离子强度的贡献更大，例如，2：2电解质MgSO4的离子强度为NaCl的4倍。
在本发明的一些具体实施方式中，在进行体积排阻色谱法之前，用于冲洗病毒颗粒的缓冲液的离子强度优选在0.5至5.0mol/L之间，更优选在0.8至2.0mol/L之间，最优选在0.8至1.2mol/L之间。
在本发明的一些具体实施方式中，病毒将选自下列病毒种类：双链DNA病毒、单链DNA病毒、双链RNA病毒、正义单链RNA病毒、反义单链RNA病毒、单链RNA逆转录病毒或者双链DNA逆转录病毒。
在本发明的一些实施方式中，病毒将选自顺序单股反链病毒目，或优选弹状病毒科，或者更优选狂犬病病毒属（lyssavirus genus），或者甚至更优选狂犬病的病毒种（野生型或改造的狂犬病病毒）或者最优选特定类型的狂犬病病毒株，包括但不限于PM狂犬病病毒、PV狂犬病病毒以及此处将进一步讨论的示例狂犬病病毒CTN狂犬病病毒。
在本发明的一些相关实施方式中，病毒可以是有包膜病毒或者逆转录病毒。
本发明的主题同样适用于尤其是适合用传代细胞系增殖的病毒，例如，狂犬病、小儿麻痹症、出血热、日本脑炎等。
所选病毒先在宿主细胞系中增殖，在其中细胞系可源自原代细胞系、二倍体细胞系、异倍体细胞系或传代细胞系。
在本发明的一些实施方式中，优选细胞系为传代细胞系。传代细胞系可选自但不限于如下细胞系之一：PER.C6、NIH-3T3、BHK、CHO、Vero和MDCK。
选择用于具体病毒增殖的合适细胞系的方法是本领域技术人员所熟知的。
优选细胞系是传代细胞系，更优选培养的细胞来源源自哺乳动物，最可能来自灵长类，特别是非人类的灵长类。用于CTN狂犬病病毒增殖的示例细胞系为Vero细胞。
本邻域中已知的可经过调整而用于优选传代细胞系更优选Vero细胞的大规模细胞培养的任何上游病毒生产过程，可被用于产生受病毒感染的宿主细胞培养物。细胞培养物要经受一段感染后的培养时期，使病毒在本领域技术人员已知的条件下进行复制，以便细胞内和/或细胞外的病毒的量最大化，从而用于本发明纯化方法。本领域已知的细胞培养方法，例如U.S.专利No.6,194,191其全部并入此处，提供了细胞培养技术的综述，这种技术可依病毒和细胞培养物的不同而进行调整来优化病毒产量。
受病毒感染的细胞进行培养以及病毒复制一段适当的时间后，通过本领域技术人员所熟知的技术收获病毒。在本发明的某些实施方式中，用化学品、核酸酶或其它等同试剂在细胞培养物中裂解细胞之后，收集病毒。在另一些实施方式中，只从细胞培养物上清液中收集病毒，细胞培养物的细胞在病毒复制过程中仅自然裂解。在一些相关的实施方式中，可将病毒从细胞培养物上清液中收集一次、或两次、或三次、或四次、或五次或五次以上。
在本发明的某些实施方式中，用于收获病毒的步骤不包括使用核酸酶或裂解细胞基质的细胞的其它物质。本发明的另一些实施方式中，不使用化学品（比如去污剂）来沉淀DNA，以协助从含目标病毒的溶液中除去DNA。本发明的另一些实施方式中，不使用化学品来降解DNA，从而减小DNA的尺寸来减轻存在保留了功能基因的DNA片段的风险。
获得的活病毒保存在适当的缓冲液中。除了收获的病毒外，缓冲溶液含有某些制造过程中产生的不期望的残余。一般而言，不期望的残余由细胞碎片，尤其是残余DNA组成，即来自细胞基质的核酸片段。
收获之后，含病毒的缓冲溶液可进行净化，即一个或多个过程步骤除去缓冲液中的细胞碎片和/或核酸。这种净化过程提供了有效且经济的方式来除去悬浮于缓冲溶液中的细胞碎片。提供具有适当清澈度的过滤物的任何这种净化方法，包括过滤、微过滤或者色谱法等，在本发明中实施是可接受的。
本发明的一个实施方式包括对含病毒颗粒的缓冲液进行过滤来除去杂质，特别是悬浮或沉淀于缓冲溶液中的那些。病毒颗粒的过滤技术是本领域技术人员所熟知的。过滤过程的选择部分上是沉淀物尺寸分布相对于待保留病毒颗粒尺寸的函数。优选的过滤选择将以成本有效的方式优化除去不期望的残余颗粒和维持保留了病毒抗原性的高病毒产量之间的平衡。适用的过滤器采用纤维素过滤器、再生纤维素纤维、组合有无机助滤器的纤维素纤维、组合有无机助滤器和有机树脂的纤维素纤维、或者其组合，以及聚合过滤器等。一般而言，优选但不要求多阶段过程。示例过程为病毒溶液的两阶段过滤，首先使用孔径不小于1.5微米、或不小于2.0微米、或不小于2.5微米、或不小于3.0微米、或不小于3.5微米、或不小于4.0微米或不小于4.5微米或不小于5.0微米的合适过滤器，然后通过孔径小于0.5微米、或小于1.0微米或小于1.5微米的合适精细过滤器进行过滤。
在本发明的某些实施方式中，上清液中的病毒含量然后可以通过本领域技术人员已知的一些过程中的任意一种进行浓缩，例如，超滤法或渗滤等。
在本发明的一个实施方式中，可以通过超滤法浓缩病毒含量。示例过程是使用具有达100千道尔顿、或达200千道尔顿、或达300千道尔顿、或达400千道尔顿或达500千道尔顿的孔径的过滤器介质的超滤法，以生产浓度比原始上清液浓度高10倍、或高20倍、或高30倍、或高40倍、或高50倍、或高60倍、或高70倍、或高80倍、或高90倍、或高100倍、或高110倍、或高120倍的病毒溶液。
在本发明的某些实施方式中，然后将得到的病毒上清液进行冲洗。冲洗病毒溶液的技术是本领域技术人员所熟知的。示例过程是用等体积、2倍体积、3倍体积、4倍体积、5倍6倍体积或7倍体积、或8倍体积或9倍体积、或10倍体积、或11倍体积、或12倍体积、或13倍体积、或14倍体积、或15倍体积的pH值达5、或达6、或达7、或达7.1、或达7.2或达7.3、或达7.4、或达7.5、或达7.6、或达7.7、或达7.8、或达7.9、或达8、或达9的PBS，使用盐浓度达0.5M、或达0.6M、或达0.7M、或达0.8M、或达0.9M、或达1M、或达1.1M、或达1.2M、或达1.3M、或达1.4M、或达1.5M、或达1.6M、或达1.7M、或达1.8M、或达1.9M、或达2M、或达2.5M、或达3M、或达3.5M、或达4M、或达4.5M或达5M而获得的高离子强度溶液冲洗病毒上清液1次或2次、或3次或4次或5次或6次或7次、或8次或9次、或10次、或11次、或12次、或13次、或14次、或15次，其中盐溶液可含有常见阳离子，如Na+、K+、Al3+、Ca2+、Mg2+、NH4+，和常见阴离子，如Cl-、（OH）-、（CO3）2-、（SO4）2-、（PO4）3-、（HCO3）-、（HSO4）-、（HPO4）2-、（H2PO4）-的任何组合，更尤其包括Na2SO4、（NH4）2SO4、Na2HPO4、NaCl或KCl，最尤其包括NaCl。
在本发明的相关实施方式中，然后进一步在低盐缓冲液中冲洗病毒溶液。示例过程是用等体积、2倍体积、3倍体积、4倍体积、5倍6倍体积或7倍体积、或8倍体积或9倍体积、或10倍体积、或11倍体积、或12倍体积、或13倍体积、或14倍体积、或15倍体积的pH值达5、或达6、或达7、或达7.1、或达7.2或达7.3、或达7.4、或达7.5、或达7.6、或达7.7、或达7.8、或达7.9、或达8或达9的盐浓度达0.1M、或达0.2M、或达0.3M、或达0.4M、或达0.5M、或达0.6M、或达0.7M、或达0.8M、或达0.9M、或达1M的PBS冲洗病毒上清液1次或2次、或3次或4次或5次或6次或7次、或8次或9次、或10次、或11次、或12次、或13次、或14次、或15次，其中盐溶液可含有常见阳离子，如Na+、K+、Al3+、Ca2+、Mg2+、NH4+，以及常见阴离子，如Cl-、（OH）-、（CO3）2-、（SO4）2-、（PO4）3-、（HCO3）-、（HSO4）-、（HPO4）2-、（H2PO4）-的任何组合，更尤其包括Na2SO4、（NH4）2SO4、Na2HPO4、NaCl或KCl，最尤其包括NaCl。
在本发明的其它相关实施方式中，在进行上述超滤过程之前，可用高离子浓度溶液与目标病毒混合。在本发明的这种具体实施方式中，在高离子溶液存在下对病毒进行冲洗或纯化，其中使用达0.5M、或达0.6M、或达0.7M、或达0.8M、或达0.9M、或达1M、或达1.1M、或达1.2M、或达1.3M、或达1.4M、或达1.5M、或达1.6M、或达1.7M、或达1.8M、或达1.9M、或达2M、或达2.5M、或达3M、或达3.5M、或达4M、或达4.5M或达5M的盐浓度获得高离子强度的溶液，其中盐溶液可含有常见阳离子，如Na+、K+、Al3+、Ca2+、Mg2+、NH4+，以及常见阴离子，如Cl-、（OH）-、（CO3）2-、（SO4）2-、（PO4）3-、（HCO3）-、（HSO4）-、（HPO4）2-、（H2PO4）-的任何组合，更尤其包括Na2SO4、（NH4）2SO4、Na2HPO4、NaCl或KCl，最尤其包括NaCl。
在本发明的某些实施方式中，然后灭活活病毒。活病毒的灭活技术是本领域技术人员所熟知的。示例过程步骤是用浓度从0.1%至0.01%的β-丙内酯在4至8摄氏度之间的冷藏条件下处理病毒组合物直至24小时的时间，然后在25至40摄氏度之间的室温下处理直至2小时的时间。被灭活的病毒然后留待进行进一步纯化。
在本发明的某些实施方式中，然后冲洗所得的灭活的病毒溶液。冲洗病毒溶液的技术是本领域技术人员所熟知的。示例过程是用等体积、2倍体积、3倍体积、4倍体积、5倍6倍体积或7倍体积、或8倍体积或9倍体积、或10倍体积、或11倍体积、或12倍体积、或13倍体积、或14倍体积、或15倍体积的pH值达5、或达6、或达7、或达7.1、或达7.2或达7.3、或达7.4、或达7.5、或达7.6、或达7.7、或达7.8、或达7.9、或达8或达9的PBS，使用盐浓度达0.5M、或达0.6M、或达0.7M、或达0.8M、或达0.9M、或达1M、或达1.1M、或达1.2M、或达1.3M、或达1.4M、或达1.5M、或达1.6M、或达1.7M、或达1.8M、或达1.9M、或达2M、或达2.5M、或达3M、或达3.5M、或达4M、或达4.5M或达5M而获得的高离子强度溶液冲洗病毒上清液1次或2次、或3次或4次或5次或6次或7次、或8次或9次、或10次、或11次、或12次、或13次、或14次、或15次，其中盐溶液可含有常见阳离子，如Na+、K+、Al3+、Ca2+、Mg2+、NH4+，和常见阴离子，如Cl-、（OH）-、（CO3）2-、（SO4）2-、（PO4）3-、（HCO3）-、（HSO4）-、（HPO4）2-、（H2PO4）-的任何组合，更尤其包括Na2SO4、（NH4）2SO4、Na2HPO4、NaCl或KCl，最尤其包括NaCl。
在本发明的某些实施方式中，用色谱法过程进一步纯化病毒溶液。色谱法技术是本领域技术人员所熟知的。
在本发明的一个具体实施方式中，通过体积排阻色谱法的手段进一步纯化病毒灭活过程所得到的病毒溶液。
在体积排阻色谱法中，在填装有惰性多孔介质特别是惰性凝胶介质的床中把分子按尺寸分开，优选介质由交联的多糖组成，如球珠形式的交联琼脂糖和葡聚糖。比膨胀的凝胶珠中最大的孔还大的分子不进入凝胶珠中，所以它最快速地通过色谱床。进入凝胶珠的更小分子，根据自身尺寸和形状，不同程度地在其通过床的过程中被滞留。因此，分子通常按照由大至小的分子尺寸的顺序被洗脱。由于病毒的尺寸大，一般在空隙体积（void volume）中被洗脱，而那些不期望的杂质，包括但不限于来自细胞基质的残余DNA片段，其尺寸较小，常常捕获于惰性介质孔内。
对流的液流量性质取决于珠的尺寸。更小的珠需要更高的压力才可以在柱内保持等同流量。然而，平衡吸附容量（capacity）不取决于珠的尺寸。因此，材料的静态容量和流量性质不一定关联或相互依赖。然而，因为大多容量是通过扩散法进行评估的，动态结合容量（在给定流速在流通模式下的容量）与珠的尺寸相关，因此与吸附物的对流性质相关。
因为珠子是多孔的，所选定的待捕获的分子需要扩散进入介质孔后被捕获，系统的速度和容量在扩散上是有限的。存在2种扩散限制，一种是在珠周围形成一层材料膜，阻碍了选定分子向珠表面的移动，第二种是内部扩散阻力，这由珠表面所形成的孔的尺寸、数目和长度所决定的。此外，介质的渗透性与珠的尺寸（尺寸可大范围地变化）及介质稳定性有关。大一些的珠和有较大孔的珠倾向于具有较高的渗透性。不受制于或少受制于压缩（受到位于其上方的珠的重量，以及流经床的液流的压力）的珠，也倾向于具有较高渗透性。然而，在高流速时，渗透性降低且动态容量也降低。
优选所选的基质是高度多孔的，这样会有最少的但足够的壁或固体材料位于其内，以提供结构完整性和高多孔性和流量。珠的尺寸可从约100到约300微米不等，或从约50到150微米、或从约20到约80微米或从约10到40微米，这取决于流以及需要由珠所捕获的成分。例如，在一个应用中，在缓冲溶液中从病毒颗粒组合物中捕获所需DNA，基质的孔应足够大以使肉汤以高流速通过介质时保持良好的渗透性。色谱法所用缓冲溶液应含有标准PBS溶液，pH值在约5到9之间，优选pH在约6到8之间，以及最优选在约7至8之间。
本发明的一个实施方式进一步涉及并入其它下游净化过程，包括1个或多个以下步骤的合理组合：过滤、超滤或色谱法，以求作为最后的机会来除去任何残留的杂质。示例过程是使用具有孔径小于0.25微米、或小于0.50微米、或小于0.75微米、或小于1.0微米的过滤器过滤病毒溶液。
本发明的过程，可以规模化，从实验台上规模的细胞培养到商业规模的制造。因此，本发明涉及用于大规模生产商业上可行的量的高纯病毒的纯化方法。当此处使用术语“大规模”时，认为是指总的宿主细胞培养物体积大于约100升，高达约2000升，优选批量从约100升到约800升。
测量最终溶液中残余DNA的技术是本领域技术人员所熟知的。优选使用的技术是中国药典2010中所规定的斑点印迹杂交测试。测试抗原含量和病毒颗粒免疫原性的方法也是本领域技术人员所熟知的。优选用于测量抗原含量和免疫原性/效价的方法分别是ELISA和NIH方法（动物体内测试），这两种方法均见于中国药典2010中。
对于技术人员是显而易见的，残余宿主细胞DNA含量的测量并不意图限制或限定本方法的特征。反之，实施例中的这些数据支持本发明的实质意义：大规模生产病毒颗粒的方法，产生可用于临床和商业环境的高纯度产品。可注意的是，最终产品中达到特定DNA水平的重要性因产品而异。用传代细胞系生产的用于在人类中肠胃外使用的病毒产品将要求最为苛刻的纯度标准，但是即使在这种情况下，目标可从100pg/剂量到10ng/剂量不等（WHO对生物产品生产中使用动物细胞作为体外基质的生物物质要求第50号，WHO技术报告系列，编号878，1998），或更高，似乎要根据产品的适应症进行调整。
另外，对于基于病毒的产品，比如疫苗，剂量可跨越几个数量级而变化。因此，获得特定残余DNA水平以下，并没有什么具体意义，且在大部分应用中，批间围绕某水平的波动似乎不是重要的。
因此，如上所提到的，优选本发明的狂犬病制剂具有大于2.5IU/剂量，更优选大于3.5IU/剂量的免疫原性，而残余宿主细胞DNA水平至少低于10ng/剂量，或者优选低于100pg/剂量。
上文的公开概括描述了本发明。通过参考体现病毒纯化过程的如下实施例，将更好地理解本发明。描述这些实施例仅供说明性目的，并不意图限制本发明的范围。本发明形式上的变化和等价替代视为因地制宜或视为应变。尽管此处使用了特定的术语，但这些术语意图具备描述性意义，而没有任何限制目的。
实施例
纯化之前和之后残余DNA含量的确定
实施例1——不使用高离子浓度缓冲液的旧过程
本实施例说明，当纯化过程未使用高离子浓度的缓冲液冲洗病毒组合物时，狂犬病病毒溶液的残余DNA含量是如何不减少的。
在Vero细胞中培养CTN狂犬病病毒，从上清液中收获活的狂犬病病毒，即不使用核酸酶。首先净化病毒上清液，从悬液中除去残余DNA，然后通过超滤法将活狂犬病病毒颗粒浓缩至原始浓度的直至50倍，在使用β-丙内酯进行化学灭活之前用低盐浓度的缓冲液冲洗。此时，用中国药典2010中所规定的标准测试法测量抗原含量和残余DNA（见下表1）。
之后，使用4FF琼脂糖介质进行体积排阻色谱法处理病毒溶液。此时，采用中国药典2010中所规定的标准测试法测量抗原含量和残余DNA（见下表1）。
在用中国药典2010中所规定的标准测试法在此时对抗原含量和残余DNA进行最后的评价之前，过滤病毒组合物（见下表1）。
用不同批次的狂犬病病毒重复上述过程3次。
表1：狂犬病病毒的抗原和DNA含量
Figure BDA00002824323400181
结论：经上述纯化过程后，原始病毒上清液的DNA含量没有可观察到的降低。
实施例2——在实验室规模下，离子浓度对清除DNA的影响
本实施例说明，在实验室规模下，不同离子浓度对降低狂犬病病毒溶液的残余DNA含量的影响。
在Vero细胞中培养CTN狂犬病病毒，从上清液中收获活的狂犬病病毒，即不使用核酸酶。过滤病毒上清液，然后通过超滤法浓缩至原始浓度的直至50倍，在使用β-丙内酯进行化学灭活之前，先在高离子浓度缓冲液中冲洗，然后在低盐浓度缓冲液中冲洗。此时，用中国药典2010中所规定的标准测试法测量抗原含量和残余DNA（见下表2）。
之后，用高离子浓度缓冲液（含0.5M（B）、1M（C）、2.0M（D）、3.0M（E）NaCl）和常规PBS缓冲液（A）冲洗病毒溶液。冲洗病毒溶液之后，使用4FF琼脂糖介质进行体积排阻色谱法处理。此时，用中国药典2010中所规定的标准测试法测量抗原含量和残余DNA（见下表2）。
采用不同批次的狂犬病病毒重复上述过程3次。
表2：狂犬病病毒的抗原和DNA含量
Figure BDA00002824323400191
IU—国际单位
A：常规PBS；B：含0.5M Nacl的PBS；C：含1.0M Nacl的PBS；D：含2.0M Nacl的PBS；E：含3.0M Nacl的PBS
结论：在实验室规模下，使用高离子浓度缓冲液冲洗病毒上清液且随后通过体积排阻色谱法的组合过程，显著降低不期望的残余DNA的浓度。应注意的是，随着离子浓度的增加，残余DNA急剧减少，但抗原的回收率也降低了。
实施例3——大规模使用高离子浓度缓冲液的新过程
本实施例说明，降低狂犬病病毒溶液的残余DNA含量的同时是如何保留狂犬病病毒颗粒免疫原性的。
在Vero细胞中培养CTN狂犬病病毒，从上清液中收获活的狂犬病病毒，即不使用核酸酶。过滤病毒上清液，然后通过超滤法浓缩至原始浓度的直至50倍，在使用β-丙内酯进行化学灭活之前，先在高离子浓度缓冲液中冲洗，然后在低盐浓度缓冲液中冲洗。此时，用中国药典2010中规定的标准测试法测量抗原含量和残余DNA（见下表3）。
然后，用含1M NaCl高离子浓度缓冲液冲洗病毒溶液。冲洗之后，使用4FF琼脂糖介质进行体积排阻色谱法处理。此时，用中国药典2010中所规定的标准测试法测量抗原含量和残余DNA（见下表3）。
在用中国药典2010中所规定的标准测试法在此时对抗原含量和残余DNA进行最后的评价之前，过滤病毒组合物（见下表3）。
用不同批次的狂犬病病毒重复上述过程3次。
表3：狂犬病病毒的抗原和DNA含量
IU—国际单位
抗原含量为13IU/ml的狂犬病病毒组合物，预计具有超过6IU/ml的免疫原性效价。因此，对于上述所有的三组样品，疫苗剂量为0.6ml或1.0ml/剂量，会具有高于WHO/中国药典标准所规定的2.5IU/剂量的免疫原性效价，2.5IU/剂量被视为是人类使用所需的最低效价。
结论：使用高离子浓度缓冲液冲洗病毒上清液且随后通过体积排阻色谱法的组合过程，显著降低不期望的残余DNA的浓度，同时不会对灭活的狂犬病病毒颗粒的免疫原性带来不利影响。

Claims (8)

1.一种用于从病毒组合物中除去DNA杂质的方法，该方法包括步骤：a）不使用核酸酶从细胞培养物上清液中收获病毒，然后b）使用离子强度在0.5mol/L和3.0mol/L之间的溶液与病毒相混合，然后c）进行体积排阻色谱法。
2.一种用于从病毒组合物中除去DNA杂质的方法，该方法包括步骤：a）不使用核酸酶从细胞培养物上清液中收获病毒，然后b）使用离子强度在0.8mol/L和2.0mol/L之间的溶液与病毒相混合，然后c）进行体积排阻色谱法。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述病毒属于顺序单股反链病毒目。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述病毒是狂犬病病毒。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述病毒是有包膜病毒。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述病毒是狂犬病病毒，且所述细胞培养物是传代细胞系。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述病毒是狂犬病病毒，且所述细胞培养物是Vero细胞。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述病毒是狂犬病病毒，且所述细胞培养物是Vero细胞，且使用0.1%和0.01%之间的β-丙内酯灭活收获的狂犬病病毒。
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