ITMI950123A1

ITMI950123A1 - Procedimento per la purificazione del dna genomico da materiale biologico e relativo kit

Info

Publication number: ITMI950123A1
Application number: IT95MI000123A
Authority: IT
Inventors: Claudio Schneider; Piero Carninci; Stefano Cosmini
Original assignee: Talent Srl
Priority date: 1995-01-25
Filing date: 1995-01-25
Publication date: 1996-07-25
Also published as: IT1272936B; ITMI950123A0

Abstract

La presente invenzione si riferisce ad un procedimento per purificare, estrarre il DNA genomico da materiale biologico di partenza, quale sangue, batteri, tessuti, cellule, attraverso il trattamento con una soluzione di lisi comprendente in sospensione una matrice silicea e procedendo alla successiva separazione, lavaggio e risospensione del complesso matrice silicea/DNA, formatosi. Il presente trovato si riferisce ulteriormente ad un kit atto a realizzare il procedimento di purificazione sia manualmente che in maniera automatizzata.

Description

DESCRIZIONE

La presente invenzione si riferisce ad un procedimento per la purificazione del DNA genomico da materiale biologico e al relativo kit.

In particolare la presente invenzione si riferisce ad un procedimento per la purificazione del DNA genomico da materiale biologico, quale preferibilmente sangue, cellule batteriche, cellule in coltura, tessuti ed inoltre si riferisce ad un kit che prevede la purificazione del DNA.

Sono note tecniche per l'estrazione del DNA che prevedono la purificazione dei nuclei delle cellule, la successiva incubazione con enzimi proteolitici e l’estrazione delle restanti proteine con solventi organici, come il fenolo ed il cloroformio (Blinn et al., Nucleic Acids Research 3 (1976), pag. 2303-2306).

Sono inoltre attualmente noti metodi di estrazione del DNA che prevedono sia un numero ridotto di estrazioni in fasi organiche, che l'utilizzo del sangue in toto quale materiale biologico di partenza. Tali metodi inoltre, non necessitano del passaggio iniziale di purificazione dei leucociti o dei loro nuclei, o del buffy coat mediante l'incubazione con enzimi proteolitici. E' noto per esempio da Gustincich et al. (Biotechniques 11, 1991, pag. 298-301), l'utilizzo di cloroformio e di detergenti cationici per l'estrazione del DNA, i quali risultano essere estremamente solubili in soluzioni saline concentrate e pertanto permettono la solubilizzazione di notevoli quantità di proteine quali quelle contenute nel sangue in toto, senza ricorrere alla preventiva purificazione dei leucociti o dei loro nuclei.

Sono ulteriormente note metodologie di estrazione del DNA che non prevedono l'utilizzo di solventi organici, come ad esempio il procedimento descritto da Vogelsteìn et al. (Proc. Natl Acad. SCI USA voi 76. no.2, pag 615-619 (1979), in cui viene utilizzata la polvere di vetro o, come descritto nel brevetto americano U.S. 5,075,430 a nome Little, che prevede l'utilizzo di particelle di terra di diatomea, in presenza di un agente caotropico.

Le metodiche utilizzate nella tecnica nota non sono però scevre dal presentare inconvenienti, tra i quali va annoverato il grave rischio di contrarre infezioni da parte dell'operatore quando sono previste fasi di preparazione all'estrazione del DNA da materiale biologico contaminato da agenti virali, in condizioni non denaturanti. Un ulteriore inconveniente è rappresentato dall'utilizzo di solventi organici (cloroformio, fenolo... come ad es. in Blinn et al.) presentanti un elevato rischio tossicologico e cancerogeno di utilizzo.

Inoltre, i procedimenti attualmente noti che prevedono l'utilizzo di agenti caotropici come i sali di guanidinio (come per es. descritto da Vogelstein et al.), pur permettendo l'estrazione degli acidi nucleici dai tessuti, compreso il sangue, non permettono di recuperare il DNA in una forma altamente purificata, non contaminata da RNA. La presenza di RNA, rende difficile la quantificazione del DNA mediante misure spettrofotometriche portando ad una notevole sovrastima della concentrazione, inoltre, la presenza di RNA, rende difficile la valutazione del peso molecolare del DNA estratto. La rimozione dell'eventuale RNA, richiede inoltre un' ulteriore fase di digestione enzimatica con RNAsi ed una successiva fase per la rimozione dell'RNAsi mediante estrazione con fenolo e cloroformio, allungando ulteriormente i tempi operativi. Infine anche le più recenti tecniche di estrazione del DNA, che prevedono l'utilizzo di ulteriori specifici agenti caotropici, quali ioduro di sodio e sodio perclorato (Little), non permettono di estrarre il DNA dal sangue in toto.

Uno dei compiti precipui del presente trovato consiste nel risolvere gli inconvenienti precedentemente descritti, realizzando un procedimento per la purificazione del DNA in una forma altamente pura, non contaminata da RNA.

Un altro scopo della presente invenzione consiste nel fornire un procedimento per l'estrazione/purificazione del DNA, che permetta di utilizzare quale materiale biologico di partenza il sangue in toto, cellule batteriche, riducendo al minimo la possibilità di contrarre infezioni durante la sua realizzazione.

Un altro scopo ancora consiste nel fornire un procedimento per la purificazione del DNA genomico, che sia di veloce realizzazione e che non preveda l’utilizzo di solventi tossici o cancerogeni.

Non ultimo scopo della presente invenzione consiste nel realizzare un Kit per la purificazione/estrazione del DNA genomico che risulti di semplice e pratico utilizzo, che permetta dì ottenere frazioni di DNA altamente pure, in breve tempo e che possa permettere una automazione delle fasi di estrazione.

Alla luce dei sopraddetti e di altri scopi, viene fornito in accordo con l'invenzione un procedimento per la purificazione del DNA genomico da materiale biologico, caratterizzato dal fatto di comprendere le fasi di: A) porre a contatto il DNA di un campione di materiale biologico di partenza con una matrice silicea in presenza di una soluzione di lisi comprendente un sale non agente caotropico ed un detergente cationico, B) separare il complesso DNA/matrice silicea formatosi durante la fase A, dalla soluzione di lisi contenente le sostanze contaminanti e le proteine rimaste in soluzione, mediante mezzi separatori,

C) lavare detto complesso DNA/matrice silicea mediante una soluzione di lavaggio comprendente un detergente cationico ed un sale non agente caotropico,

D) lavare detto complesso DNA/matrice silicea con una ulteriore soluzione di lavaggio comprendente un alcool ed un sale non agente caotropico,

E) risospendere il DNA purificato mediante aggiunta di acqua e/o di un tampone e recuperare il DNA mediante filtrazione.

Il procedimento secondo l'invenzione permette la purificazione del DNA genomico, a partire da un materiale biologico comprendente il sangue in toto, cellule e batteri in colture, nuclei, leucociti senza prevedere una iniziale fase di digestione enzimatica. Nel caso in cui il materiale biologico di partenza è di tipo tissutale viene invece prevista una iniziale degradazione enzimatica per smembrare il tessuto. In particolare, detta soluzione di lisi viene aggiunta a campioni in toto contenenti un elevato contenuto di proteine, come ad es. il sangue ed in presenza di tale soluzione avviene la degradazione dell'RNA, la denaturazione e la solubilizzazione delle proteine, delle membrane e delle componenti cellulari ed il legame con la sopraddetta matrice silicea. La fase A del procedimento avviene in condizioni denaturanti, permettendo di limitare il rischio, da parte dell'operatore, di contrarre infezioni manipolando materiale potenzialmente infetto.

La matrice silicea utilizzata per realizzare il procedimento secondo l'invenzione è preferibilmente scelta dal gruppo comprendente terra di diatomea e polvere di vetro e vantaggiosamente è terra di diatomea.

Detti sali che non risultano essere agenti caotropici, abbassano la solubilità delle molecole organiche in soluzioni a base acquosa ed essendo agenti precipitanti per le molecole organiche vengono definiti anche come "salting out". Detti sali sono preferibilmenti sali di un metallo alcalino e più preferibilmente ancora sono scelti dal gruppo comprendente cloruro di sodio, cloruro di potassio, cloruro di litio, acetato di sodio, essendo il cloruro di sodio il più preferito.

Si è sorprendentemente trovato che il procedimento per la purificazione del DNA genomico, secondo l'invenzione promuove il legame del DNA con le matricee silicee, in presenza di una soluzione comprendente un sale non agente caotropico ed un detergente di tipo cationico.

Tale effetto risulta del tutto inaspettato in quanto:

- la presenza di detergenti cationici anche inferiori a 0,01%, provoca una potentissima inibizione del legame DNA-matrici silicee, in presenza degli agenti caotropici utilizzati comunemente. Non è possibile recuperare DNA, se non in tracce, neanche a concentrazioni bassissime;

- il cloruro di sodio, che rappresenta il sale particolarmente preferito per realizzare il processo secondo l'invenzione non è un agente caotropico, anzi esercita un'azione contraria agli agenti caotropici utilizzati nella tecnica nota, in quanto, anziché favorire la solubilità delle proteine in soluzione acquosa, ne provoca la precipitazione (e come tale risulta descritto in Miller et Al. Nucleic Acids Research 16, 1988; pag.

1215).

In particolare si è verificato che viene vantaggiosamente promosso il legame DNA-matrice silicea in presenza di detergenti cationici, quando detto sale viene scelto dal gruppo comprendente cloruro di sodio, cloruro di potassio, cloruro di litio, cloruro di potassio preferibilmente quando sono presenti ad una concentrazione, maggiore od uguale a 1 M, rispetto alla miscela risultante da detta fase A, essendo il cloruro di sodio il preferito, vantaggiosamente ad una concentrazione maggiore od uguale a 1 M. I sopraddetti sali svolgono un'azione contraria a quella degli agenti caotropici utilizzati nei procedimenti dell'arte nota, in quanto, anziché favorire la solubilità delle proteine in soluzione, ne provocano la precipitazione.

I detergenti cationici presenti nella soluzione di lisi della fase A del procedimento secondo la presente invenzione sono preferibilmente sali di ammonio quaternario, più preferibilmente sono sali di alchiltrimetilammonio ed ancora più preferibilmente sono tetradeciltrimetilammonio bromuro (TTAB, catena idrofobica a 14 atomi di carbonio) o cetiltrimetilammonio bromuro (CTAB), essendo il TTAB il più preferito in assoluto. Preferibilmente la concentrazione finale di detti detergenti cationici nella miscela risultante dalla fase A del procedimento oggetto del trovato è maggiore od uguale al 3%, più preferibilmente è maggiore o uguale a 5% , aumentando la concentrazione, aumenta l'efficienza del legame DNA-matrice silicea, mentre la concentrazione massima di detergente è data dalla solubilità dello stesso in soluzioni contenenti detto sale alle sopraddette concentrazioni. Per esempio, si verifica la lisi cellulare e la formazione del legame DNA-matrice silicea atto ad ottenere la purificazione di DNA da un campione di partenza di sangue in toto, usando cloruro di sodio 1M, rispetto la miscela della fase A contenente il campione di sangue, con TTAB al 5%, sempre rispetto alla miscela finale della fase A.

Vantaggiosamente detta soluzione di lisi comprende altri composti che vengono addizionati al fine di ottimizzare il legame matrice silicea-DNA ad elevato peso molecolare. Vantaggiosamente detta soluzione di lisi comprende ulteriormente al TTAB, quale detergente cationico, il CTAB, preferibilmente ad una frazione molare minore od uguale al 30% rispetto al TTAB

Vantaggiosamente detta soluzione di lisi comprende ulteriormente tamponi di pH noti, quali ad esempio il TRIS (tris idrossi metilammino metano) o sodio acetato, preferibilmente a concentrazioni comprese nell'intervallo tra 0,01-0,2 M, mantenendo vantaggiosamente il pH nell'intervallo compreso tra 5-10. Vantaggiosamente possono essere ulteriormente compresi in detta soluzione anche agenti chelanti quali ad esempio EDTA, preferibilmente in un intervallo di concentrazione compreso tra 0,001 e 0,1 M.

Inoltre, vantaggiosamente detta soluzione di lisi comprende ulteriormente glicerolo, preferibilmente ad una concentrazione massima del 10% in volume, rispetto alla miscela finale della fase A, più preferibilmente ad una concentrazione compresa tra il 4-6% in volume.

Preferibilmente la miscela risultante dalla fase A viene sottoposta a riscaldamento ad una temperatura compresa nell'intervallo tra 40-70°C per un intervallo di tempo preferibilmente compreso tra uno e dieci minuti, per ottimizzare la denaturazione e la solubilizzazione delle proteine del campione biologico di partenza.

Preferibilmente detta matrice silicea è scelta dal gruppo comprendente polvere di vetro e terra di diatomea. Particolarmente preferita è la terra di diatomea, disponibile commercialmente in tre forme: naturale, calcinata e flusso-calcinata. Una forma di realizzazione particolarmente preferita del procedimento secondo l'invenzione prevede l'utilizzo di terra di diatomea lavata con acido e successivamente calcinata, in quanto risulta notevolmente purificata dalle impurità generalmente presenti nel prodotto non trattato.

Vantaggiosamente detta prima soluzione di lavaggio (fase C) comprende ulteriormente glicerolo , preferibilmente ad un concentrazione massima del 10% in volume, più preferibilmente ad un intervallo di concentrazione compreso tra 4-6% in volume, al fine di permettere una ottimale sospensione delle particelle di matrice silicea, garantendo una manipolazione più semplice. La presenza di glicerolo permette inoltre di massimizzare la estrazione del DNA quando si utilizza quale materiale biologico di partenza, il sangue conservato per tempi lunghi a temperature superiori a quella di congelamento.

Vantaggiosamente i sali di detta soluzione di lavaggio propria della fase D del procedimento sono ricompresi tra i sali precedentemente descritti per la fase A e C, mentre l'alcool utilizzato è preferibilmente un alcool alchilico inferiore, più preferibilmente è scelto tra etanolo, isopropanolo.

Preferibilmente l'acqua utilizzata nella fase E è acqua demineralizzata più preferibilmente del tipo sterile e vantaggiosamente il tampone utilizzato è costituito da TE, essendo preferibilmente 10,0 mM Tris-Cl pH 8 e 1,0 mM EDTA.

Una forma di realizzazione del procedimento per la purificazione del DNA genomico in accordo con la presente invenzione, fornita a scopo puramente illustrativo, comprende le seguenti fasi:

FASE A

Un campione biologico di partenza, preferibilmente costituito da sangue in toto, viene posto a contatto con la soluzione di lisi secondo l'invenzione, comprendente TTAB al 5% (peso/volume) rispetto alla soluzione risultante dalla fase A (comprendente soluzione di lisi e campione di sangue), cloruro di sodio in concentrazione 1M rispetto alla miscela finale (soluzione di lisi e campione di sangue) e CTAB allo 0,5% ed una sospensione di terra di diatomea calcinata, sottoponendo la risultante miscela ad una incubazione dì 3 minuti alla temperatura di ca. 55°C, per ottimizzare la lisi del campione, la denaturazione delle proteine e per promuovere il legame tra terra di diatomea e DNA ad elevato peso molecolare.

FASE B

Successivamente si separa il complesso DNA/terra di diatomea, mediante mezzi separatori preferibilmente costituiti da una centrifuga o da un filtro poroso, con porosità preferibilmente compresa tra 1-20 microns. Vantaggiosamente per volumi di sangue fino a 200 microlitri, lisati mediante 500 microlitri di soluzione di lisi, si utilizza un filtro in propilene a porosità media di 10-15 micrometri inserito in un portafiltro con un volume utile di 0,8 mi. Questo portafiltro viene inserito in un tubo da microcentrifuga da 2 ml ad es. Eppendorf. Dopo centrifugazione la terra di diatomea ed il DNA rimangono nel filtro, mentre le proteine denaturate e tutte le altre sostanze contaminanti, contenute nella soluzione attraversano il filtro e vengono eliminate e raccolte nel tubo da 2ml. Il materiale filtrato viene eliminato.

FASE C

Si lava la terra di diatomea con una soluzione contenente un detergente cationico preferibilmente scelto tra il gruppo comprendente CTAB, TTAB e comprendente cloruro di sodio ad una concentrazione compresa tra 0,5-0,7 M. Il lavaggio mantiene il DNA legato alla terra di diatomea ed elimina le restanti impurità che possono essere rimaste nel volume morto della terra di diatomea. Il suddetto lavaggio viene realizzato aggiungendo al filtro contenente la terra di diatomea ed il DNA, una soluzione contenente almeno uno di detti detergenti cationici a concentrazione preferibilmente compresa tra 0,001-12 e NaCl preferibilmente ad una concentrazione compresa tra 0,5-0,7 M. Vantaggiosamente la soluzione può comprendere glicerolo per aiutare a mantenere separate le particelle di silice e quindi aumentare l'efficenza del lavaggio. In presenza di detta soluzione, il DNA non rimane più legato alla terra di diatomea mediante il meccanismo di lisi, bensì si stacca e forma un precipitato con altre molecole di DNA. Questo precipitato rimane trattenuto dalla terra di diatomea che funge da filtro poroso.

La soluzione risultante viene quindi aggiunta al filtrino contenente la terra di diatomea ed il DNA. Detto filtrino, inserito in un tubo da 2 ml preventivamente vuotato dal precedente filtrato, viene centrifugato. Il DNA rimane pertanto trattenuto dalla terra di diatomea mentre le impurità residue vengono eliminate attraverso il filtro.

FASE D

Viene fatto un ulteriore lavaggio del filtro per eliminare il detergente cationico. Dopo eliminazione del filtrato, al filtro viene aggiunta una soluzione contenente un sale ed un alcole, ad esempio etanolo preferibilmente ad una concentrazione compresa tra 50-80% (volume/volume) oppure isopropanolo ad una concentrazione preferibilmente compressa tra 35-70%, mentre il cloruro di sodio è preferibilmente presente ad una concentrazione compresa tra 150-500 mM. Il DNA rimane precipitato per effetto dell'alcool utilizzato ed il precipitato rimane intrappolato nella matrice silicea. Per eliminare le tracce residue di NaCl si può ripetere il lavaggio del filtro mediante le soluzioni contenenti alcool, preferibilmente etanolo preferibilmente ad una concentrazione compresa tra 70-80% (volume/volume) seguendo le modalità dei precedenti lavaggi.

Si procede quindi alla risospensione del DNA mediante aggiunta di acqua distillata, preferibilmente sterile, oppure mediante aggiunta di un tampone come per es. TE (tampone salino di Tris-Cl 10mM, PH8, e EDTA 1mM). Per incrementare la velocità di risospensione del DNA è possibile preriscaldare l'acqua od il tampone di lavaggio ad una temperatura preferibilmente di 60-70°C, sottoponendo ad agitazione il filtro contenente il DNA e la matrice silicea. Il DNA viene risospeso e quindi recuperato mediante filtrazione. Il filtro viene quindi inserito in un tubo da microcentrifuga (per es. 1,5 o 2 ml) e centrifugato. La matrice silicea rimane nel filtro mentre il DNA, in soluzione acquosa, viene recuperato nel tubo sottostante. Questo processo permette di ottenere DNA ad elevato peso molecolare privo quindi della frazione ribonucleotidica, mediante fasi di semplice realizzazione ed in un periodo di tempo breve, vantaggiosamente compreso tra 10-15 minuti. Il DNA ottenuto presenta un livello di purezza tale da poter essere utilizzato nelle comuni metodologie di biologia molecolare. E' pertanto utilizzabile come substrato per la PCR ed anche come substrato per gli enzimi di restrizione.

I volumi di reazione non sono da ritenersi vincolanti, modificando la forma ed il volume del filtro è possibile processare volumi maggiori o minori a seconda delle esigenze, in accordo con le fasi soprammenzionate. Il procedimento è applicabile a preparazioni di leucociti, o nuclei di leucociti, a tessuti solidi, a cellule in coltura, a batteri.

E' inoltre possibile separare il DNA legato alle particelle silicee mediante centrifugazione anziché mediante filtrazione. Il complesso DNA-particelle viene quindi centrifugato e lavato con le stese soluzioni utilizzate per la filtrazione.

Le fasi del procedimento secondo la presente invenzione possono inoltre essere eseguite mediante una sequenza automatica, utilizzando mezzi noti nella tecnica delle estrazioni del DNA. Detti mezzi sono in particolare in grado di eseguire automaticamente la dispensazione dei reagenti, il riscaldamento a temperature prefissate, per intervalli di tempo predeterminati, la filtrazione, l'agitazione a velocità predeterminate in funzione della miscela biologica di utilizzo etc.

Il procedimento secondo la presente invenzione viene ulteriormente illustrato attraverso i seguenti esempi, che vengono forniti unicamente a scopo illustrativo e non devono essere intesi in senso limitativo dell'ambito della presente invenzione, come risulta definita dalle accluse rivendicazioni

Esempio 1:

Estrazione del DNA da 200 microlitri di sangue

Si sono aggiunti a 200 microlitri di sangue in toto contenente EDTA come anticoagulante a concentrazioni standard, 500 microlitri della soluzione contenente: NaCl 1.5M, TTAB 12%, CTAB 3%, Tris pH 8,5100 mM, EDTA 50mM, Terra di diatomea (lavata con acido, quindi calcinata) a concentrazione di 3% (peso/volume), glicerolo 5% (volume/volume).

La miscela è stata mescolata e incubata a 58°C per 3'.

E' stato quindi invertito il tubo 20 volte al fine di assicurare il completo legame della terra di diatomea col DNA.

Si procede quindi a trasferire la mistura in un filtro da 0,8 mi descritto precedentemente e ad inserire in un tubo da raicrocentrifuga da 2 mi. Si è sottoposto a centrifugazione per 1' a 12.000-14.000 xg.

Si è eliminato quindi il filtrato e si sono aggiunti al filtro 0,5 ml di una soluzione di lavaggio contenente CTAB 0,5% (peso/volume), NaCl 0,6 M, glicerolo 10% (volume/volume). Si è ripetuta la centrifugazione, per 30".

Si è eliminato il filtrato e quindi sono stati aggiunti una soluzione contenente NaCl 300 mM ed Etanolo 50% (v/v) . Si è atteso per 1' per fare avvenire lo scambio ionico dopodiché è stata ripetuta la centrifugazione. Al termine, si sono aggiunti 100 microlitri d'acqua preriscaldata a 70 "C e quindi è stata smossa la resina utilizzando un vortex o una punta sterile. Si è quindi atteso per 2 minuti affinchè il DNA si fosse completamente risospeso. Infine, si è trasferito il filtro in un tubo da microcentrifuga sterile ed è stata ripetuta la centrifugazione. Il DNA ottenuto così nel filtrato era quindi pronto all'uso. La resa per campioni standard era compresa tra 2 e 6 microgrammi.

Esempio 2:

Estrazione del DNA da cellule in coltura e da preparazioni di leucociti arricchite

Sono state preparate per sospensione fino a cinque milioni di cellule animali in coltura in un volume minore o uguale a 200 microlitri; si è quindi preparato il "buffy coat" utilizzando fino ad un millilitro di sangue secondo metodiche tradizionali e quindi si sono processati fino a 200 microlitri della frazione arricchita. Si è quindi aggiunto la soluzione di lisi descritta nell'Esempio 1 e si è nuovamente seguito lo stesso protocollo dell'Esempio 1. La resa ottenibile è stata, in funzione dalla preparazione del buffy coat, fino a 25 microgrammi di DNA, che corrisponde alla capacità della matrice alle suddette condizioni.

Esempio 3:

Trattamento di nuclei di leucociti

Sono stati congelati 1 mi di sangue anticoagulato con EDTA. Dopo due ore,si è scongelato il sangue e si sono aggiunti 2 mi di una soluzione di glicerolo al 50% (volume/volume). Si è mescolato e quindi centrifugato a 2.400 xg per 15 minuti. Al termine, si è eliminato il sopranatante e si è ottenuto un precipitato contenente i nuclei dei leucociti. E' stato risospeso il precipitato in un volume di 100 microlitri della soluzione di glicerolo al 50% (v/v). Sono stati aggiunti 500 microlitri della soluzione di lisi dell'esempio 1 e si è proceduto con lo stesso protocollo, la resa era compresa da 10 a 25 mìcrogrammì di DNA.

Esempio 4:

Estrazione del DNA da tessuti animali solidi

Si è preferibilmente introdotto un passaggio in Proteinasi K per dismembrare il tessuto. Si sono quindi aggiunti una quantità di tessuto fino a 50 mg 200 microlitri di una soluzione contenente TTAB 8%, NaCl 1.5 M, EDTA 50 mM, Tris 100 mM, pH 8.5, e 20 microlitri di proteinasi K, 20 microgrammi/microlitro. Si è incubato a 45°C per 1-16 ore, fino allo smembramento del tessuto. Il tempo di incubazione può variare a seconda della consistenza del tessuto. Si è centrifugato il campione per 5' a 12.500 xg ed eliminato qualsiasi precipitato, formato da tessuto non completamente digerito. Al sopranatante si è aggiunta la soluzione di lisi dell'Esempio 1 e quindi si è proceduto seguendo il protocollo dell'Esempio 1. La resa ottenuta è stata fino a 25 microgrammi.

Esempio 5:

Estrazione del DNA da batteri gram-negativi

Sono stati processati da 1 a 5 ml di una coltura batterica di Escherichia coli in fase di tarda crescita esponenziale, inoculata in L-B Broth. Per altri batteri, il voltane di coltura è stato aggiustato in maniera tale da non utilizzare una quantità eccessiva di batteri, che può variare a seconda delle condizioni di crescita. Sono stati centrifugati i batteri per 5' a 2500 xg. Sono stati quindi risospesi i batteri in 100 microlitri di soluzione fisiologica e quindi sono stati aggiunti 500 microlitri della soluzione di lisi dell'Esempio 1. Si è quindi seguito il protocollo descritto nell'Esempio 1. La quantità recuperata era proporzionale alla quantità di batteri di partenza, e quindi alle condizioni di crescita, fino ad un massimo di 25 microgrammi.

Sotto un ulteriore aspetto, la presente invenzione si riferisce anche ad un kit per realizzare il procedimento di purificazione del DNA genomico da materiale biologico come precedentemente descritto, detto kit comprendendo:

- una soluzione reagente di lisi comprendente un sale non agente caotropico, un detergente cationico ed una matrice silicea sospesa in essa,

- una prima soluzione di lavaggio comprendente un detergente cationico ed un sale non agente caotropico ,

- una seconda soluzione di lavaggio comprendente un alcool ed un sale non agente caotropico,

- almeno un filtro ed almeno una provetta.

Detto sale non agente caotropico è un sale che risulta essere un agente precipitante per le molecole organiche, con particolare riferimento alle proteine e preferibilmente sono sali di un metallo alcalino, ovvero sali di sodio, potassio, litio e più preferibilmente sono scelti dal gruppo comprendente cloruro di sodio, acetato di sodio, cloruro di potassio, cloruro di litio, più preferibilmente detto sale è cloruro di sodio, ed ancora più preferibilmente detto sale viene addizionata in maniera tale da aversi una concentrazione maggiore o uguale a 1M, nella miscela con il materiale di partenza. Vantaggiosamente detta matrice silicea è scelta dal gruppo comprendente polvere di vetro e terra di diatomea, essendo preferita la seconda e detto detergente cationico è preferibilmente un sale di ammonio quaternario, più preferibilmente è un sale di alchiltrimetilammonio ed ancora più preferibilmente è scelto dal gruppo comprendente TTAB e CTAB, essendo il TTAB il più preferito. Detti detergenti vengono addizionati ad una concentrazione maggiore o uguale al 3%, più preferibilmente al 5%, rispetto alla miscela risultante dall'addizione della soluzione di lisi del kit ed il campione di partenza. Preferibilmente detta soluzione di lisi comprende ulteriormente CTAB, che preferibilmente è presente in detta soluzione di lisi ad una concentrazione inferiore al 30% di frazione molare rispetto al TTAB. Preferibilmente detto detergente cationico presente in detta prima soluzione di lavaggio è scelto dal gruppo comprendente TTAB e CTAB. Detto kit vantaggiosamente prevede che detta prima soluzione di lavaggio comprenda ulteriormente glicerolo, inoltre preferibilmente detto alcool presente in detta seconda soluzione di lavaggio è un alcool alchilico inferiore e più preferibilmente è scelto dal gruppo comprendente, etilico ed alcool isopropilico. Detto almeno un filtro e detta almeno una provetta risultano essere mezzi noti ai tecnici del ramo e comunemente utilizzati nelle tecniche di laboratorio.

Vantaggiosamente detto kit può essere utilizzato in un sistema che prevede l'automazione delle principali fasi del procedimento di purificazione\estrazione del DNA.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per la purificazione del DNA genomico da materiale biologico, caratterizzato dal fatto di comprendere le fasi di: A) porre a contatto il DNA di un campione di materiale biologico di partenza con una matrice silicea in presenza di una soluzione di lisi comprendente un sale non agente caotropico ed un detergente cationico, B) separare il complesso DNA/matrice silicea formatosi durante la fase A, dalla soluzione di lisi contenente le sostanze contaminanti e le proteine rimaste in soluzione, mediante mezzi separatori, C) lavare detto complesso DNA/matrice silicea mediante una soluzione di lavaggio comprendente un detergente cationico ed un sale non agente caotropico, D) lavare detto complesso DNA/matrice silicea con una ulteriore soluzione di lavaggio comprendente un alcool ed un sale non agente caotropico, E) risospendere il DNA purificato mediante aggiunta di acqua e/o di un tampone e recuperare il DNA mediante filtrazione.
2. Procedimento secondo la rivendicazioni 1, caratterizzato dal fatto che detto sale non agente caotropico è scelto dal gruppo comprendente cloruro di sodio, acetato di sodio, cloruro di potassio, cloruro di litio.
3. Procedimento secondo la rivendicazioni 2, caratterizzato dal fatto che detto sale è cloruro di sodio.
4. Procedimento secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, caratterizzato dal fatto che detto sale non agente caotropico è presente nella miscela risultante da detta fase A ad una concentrazione maggiore od uguale a 1M.
5. Procedimento secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, caratterizzato dal fatto che detta matrice silicea è terra di diatomea.
6. Procedimento secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, caratterizzato dal fatto che detto detergente cationico presente in detta fase A è un sale di ammonio quaternario.
7. Procedimento secondo la rivendicazione 6, caratterizzato dal fatto che detto sale di ammonio quaternario è tetradeciltrimetilaramonio bromuro.
8. Procedimento secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, caratterizzato dal fatto che detto detergente cationico è presente nella miscela risultante dalla fase A, ad una concentrazione maggiore o uguale al 3%.
9. Procedimento secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, caratterizzato dal fatto che detta soluzione di lisi comprende ulteriormente CTAB.
10. Procedimento secondo la rivendicazione 9, caratterizzato dal fatto che detto CTAB è presente in detta soluzione di lisi ad una concentrazione inferiore al 30% di frazione molare rispetto al TTAB.
11. Procedimento secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, caratterizzato dal fatto che detto detergente cationico utilizzato in detta fase C è scelto dal gruppo comprendente TTAB e CTAB.
12. Procedimento secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, caratterizzato dal fatto che detta soluzione risultante dalla fase A, viene sottoposta a riscaldamento ad un intervallo di temperatura compreso tra 40 - 70°C.
13. Procedimento secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, caratterizzato dal fatto che detta prima soluzione di lavaggio comprende ulteriormente glicerolo.
14. Procedimento secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, caratterizzato dal fatto di prevedere mezzi per la realizzazione automatica delle fasi operative,
15. Kit per realizzare un procedimento di purificazione di DNA genomico secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, caratterizzato dal fatto di comprendere: - una soluzione reagente di lisi comprendente un sale non agente caotropico, un detergente cationico ed una matrice silicea sospesa in essa, - una prima soluzione di lavaggio comprendente un detergente cationico ed un sale non agente caotropico, - una seconda soluzione di lavaggio comprendente un alcool ed un sale non agente caotropico , - almeno un filtro ed almeno una provetta.
16. Kit secondo la rivendicazione 15, caratterizzato dal fatto che detto sale non agente caotropico è scelto dal gruppo comprendente cloruro di sodio, acetato di sodio, cloruro di potassio, cloruro di litio.
17. Kit dignostico secondo la rivendicazione 16, caratterizzato dal fatto che detto sale è cloruro di sodio
18. Kit dignostico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 15-17, caratterizzato dal fatto che detto sale viene addizionato in maniera tale da avere una concentrazione maggiore od uguale a 1M, rispetto alla soluzione comprendente il materiale biologico di partenza.
19. Kit dignostico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 15-18, caratterizzato dal fatto che detta matrice silicea è terra di diatomea.
20. Kit secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 15-19, caratterizzato dal fatto che detto detergente cationico è TTAB.
21. Kit secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 15-20, caratterizzato dal fatto che detta soluzione di lisi comprende ulteriormente CTAB.
22. Kit secondo la rivendicazione 21, caratterizzato dal fatto che detto CTAB è presente in detta soluzione di lisi ad una concentrazione inferiore al 30% di frazione molare rispetto al TTAB.
23. Kit secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 15-22, caratterizzato dal fatto che detto detergente cationico presente in detta prima soluzione di lavaggio è scelto dal gruppo comprendente TTAB e CTAB.
24. Kit secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 15-23, caratterizzato dal fatto che detta prima soluzione di lavaggio comprende ulteriormente glicerolo.
25. Kit secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 15-24, caratterizzato dal fatto che detto alcool presente in detta seconda soluzione di lavaggio è un alcool alchilico inferiore.
26. Kit secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 15-25, caratterizzato dal fatto di prevedere mezzi per la realizzazione automatica delle fasi operative di detto procèsso.