RS64472B1

RS64472B1 - Kombinovana terapija za lečenje ili prevenciju tumora

Info

Publication number: RS64472B1
Application number: RS20230697A
Authority: RS
Inventors: Paul Warren Reddell; Jason Kingsley Cullen; Glen Mathew Boyle; Peter Gordon Parsons; Victoria Anne Gordon
Original assignee: QBiotics Pty Ltd
Priority date: 2017-03-23
Filing date: 2018-03-23
Publication date: 2023-09-29
Also published as: HUE063299T2; AU2018238202B2; KR102228055B1; AU2018238202A1; EP3600281A4; PH12019502132A1; UA125614C2; DK3600281T3; IL269522B1; WO2018170559A1; LT3600281T; EA201992220A1; CA3056685C; KR20190126431A; HRP20230936T1; FI3600281T3; IL269522B2; NZ756754A; MX2019011221A; SI3600281T1

Description

Opis

Oblast pronalaska

Predmetni pronalazak se odnosi na kombinovanu terapiju za tumore koja obuhvata primenu jedinjenja epoksitigliana formule (I) i inhibitora imunološke kontrolne tačke, kao što je ovde dalje specificirano. Takođe su opisani farmaceutski sastavi i kompleti koji sadrže jedinjenja epoksitigliana formule (I) i određene inhibitore imunološke kontrolne tačke.

Osnovne informacije o pronalasku

Jedinjenja epoksitiglienona imaju snažno antitumorno dejstvo. Kada se daju intratumorski, epoksitiglienoni iniciraju brzu hemoragijsku nekrozu tumorske mase direktnim ometanjem vaskulature tumora (Boyle et al.2014). Do danas, nema dokaza da lokalizovana primena jedinjenja epoksitiglienona ima sistemske efekte na tumor obližnjih ćelija ili udaljenije tumore i smatra se da intratumorno isporučena jedinjenja epoksitiglienona deluju prvenstveno na mestu lečenja. Kao posledica toga, svaki tumor se mora tretirati pojedinačno.

WO2007/070985 opisuje brojna jedinjenja epoksitigliana koja su pokazala aktivnost usmerenu protiv raka.

Imunoterapije za lečenje raka postaju naširoko prihvaćene u klinici. Konkretno, inhibitori imunih kontrolnih tačaka (ICI) deluju obećavajuće kod niza maligniteta, uključujući uznapredovali metastatski melanom, karcinom pluća nemalih ćelija, rak bubrega, rak mokraćne bešike i Hodžkinov limfom. ICI su molekuli (obično monoklonska antitela) koji blokiraju delovanje proteina koji omogućavaju tumorskim ćelijama da izbegnu, potisnu ili se odupru imunološkom sistemu domaćina, posebno T ćelijama koje su specifične za tumorske antigene. Trenutno odobreni inhibitori kontrolnih tačaka T ćelija poboljšavaju antitumorni imuni odgovor kroz izrazito različite mehanizme delovanja. Na primer, blokada antigena 4 (CTLA4) povezana sa citotoksičnim T-limfocitima pretežno pojačava aktivaciju T ćelija tokom prve faze imunog odgovora, dok se čini da programirana blokada proteina 1 ćelijske smrti (PD1) oslobađa iscrpljene, ali inače aktivirane efektore T ćelija i smanjuje regulatornu funkciju T (Treg) ćelija.

Dok ICI-ovi mogu da izazovu izuzetne i trajne reakcije kod pacijenata sa uznapredovalim rakom, ove pozitivne reakcije su ograničene na mali deo ukupne populacije pacijenata (Hu-Lieskovan et al.2017). Shodno tome, pristupi koji kombinuju ICI-ove sa drugim modalitetima lečenja (npr. radioterapija, hemoterapija, onkolitički virusi, vakcine protiv raka) koji bi mogli da stimulišu imuni odgovor domaćina pružaju atraktivan i klinički izvodljiv pristup za prevazilaženje interne i stečene rezistencije na imunoterapiju raka i potencijalno proširiti klinički uspeh na širi spektar pacijenata (Smith et al.2015).

Jedan takav pristup je kombinovanje ICI-ova sa hemoterapeuticima malih molekula (isporučenim sistemski ili intratumorno) koji mogu modulirati imune odgovore (1) smanjenjem ukupnog opterećenja tumora, (2) potenciranjem antitumorskog odgovora izlaganjem neo-antigena tokom tumorske nekroze i/ili (3) direktnim uticanjem na stromalne ćelije tumora (Adams et al.2015; Mahoney et al.

2015; O'Brien et al.2014).

Predmetni pronalazak se zasniva, barem delimično, na otkriću da neka jedinjenja epoksitiglien-3-ona mogu stimulisati imuni odgovor koji može da funkcioniše sinergistički sa blokadom imunih kontrolnih tačaka kako bi se obezbedila terapija ne samo za tumor koji se leči, već i za druge tumore. koji mogu biti prisutni kod subjekta koji se tretira.

Sažetak pronalaska

Predmetni pronalazak je definisan u patentnim zahtevima. U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na metod lečenja najmanje jednog tumora kod subjekta koji se sastoji od davanja subjektu, jedinjenja epoksitigliana formule (1) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli i inhibitora imunološke kontrolne tačke kao što je definisano u patentnom zahtevu 1.

U drugom aspektu predmetnog pronalaska dat je metod lečenja ili prevencije tumora obližnjih ćelija kod subjekta koji se sastoji od davanja subjektu kome je to potrebno, jedinjenja epoksitigliana ili njegove farmaceutski prihvatljive soli i inhibitora imunološke kontrolne tačke kao što je definisano u patentnom zahtevu 1; naznačeno time što se jedinjenje epoksitigliana primenjuje lokalno na tumor koji nije tumor obližnjih ćelija.

U drugom aspektu pronalaska obezbeđena je upotreba jedinjenja epoksitigliana formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli i inhibitora imunološke kontrolne tačke kao što je definisano u patentnom zahtevu 1 u proizvodnji leka za lečenje tumora.

U još jednom aspektu pronalaska obezbeđena je upotreba jedinjenja epoksitigliana formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli u proizvodnji leka za lečenje tumora, naznačeno time što je lek za primenu u kombinaciji sa inhibitorom imunološke kontrolne tačke kao što je definisano u patentnom zahtevu 1.

U daljem aspektu pronalaska, obezbeđena je upotreba inhibitora imunološke kontrolne tačke kao što je definisano u patentnom zahtevu 1 u proizvodnji leka za lečenje tumora, naznačeno time što je lek za primenu u kombinaciji sa jedinjenjem epoksitigliana formule (I ) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

U drugom aspektu pronalaska obezbeđena je upotreba jedinjenja epoksitigliana ili njegove farmaceutski prihvatljive soli i inhibitora imunološke kontrolne tačke kao što je definisano u patentnom zahtevu 2 u proizvodnji leka za lečenje ili prevenciju tumora obližnjih ćelija naznačeno time što se izraz „tumor obližnjih ćelija“ ovde koristi i u celom opisu odnosi na tumor koji nije tumor koji je lečen epoksitiglian jedinjenjem.

U još jednom aspektu pronalaska obezbeđena je upotreba jedinjenja epoksitigliana ili njegove farmaceutski prihvatljive soli u proizvodnji leka za lečenje ili prevenciju tumora obližnjih ćelija, naznačeno time što je lek za primenu u kombinaciji sa inhibitorom kontrolne tačke imunog sistema, kako je definisano u patentnom zahtevu 1.

U drugom aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđena je upotreba inhibitora imunološke kontrolne tačke kao što je definisano u patentnom zahtevu 1 u proizvodnji leka za lečenje ili prevenciju tumora obližnjih ćelija, naznačeno time što je lek za primenu u kombinaciji sa jedinjenjem epoksitigliana formule (I) ili njihove farmaceutski prihvatljive soli.

U još jednom aspektu pronalaska obezbeđeno je jedinjenje epoksitigliana ili njegova farmaceutski prihvatljiva so u kombinaciji sa inhibitorom imunološke kontrolne tačke kao što je definisano u patentnom zahtevu 2 za lečenje tumora ili lečenje ili prevenciju tumora obližnjih ćelija.

U drugom aspektu predmetnog pronalaska obezbeđen je farmaceutski sastav koji sadrži epoksitiglian jedinjenje formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i inhibitor imunološke kontrolne tačke kao što je definisano u patentnom zahtevu 12, opciono zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača.

U daljem aspektu predmetnog pronalaska obezbeđen je komplet koji sadrži epoksitiglian jedinjenje formule (1) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i inhibitor imunološke kontrolne tačke kao što je definisano u patentnom zahtevu 13.

Detaljan opis pronalaska

Definicije

Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini korišćeni ovde generalno imaju isto značenje kao i kada ih koriste osobe sa uobičajenim znanjem u predmetnoj oblasti. Iako se bilo koji metodi i materijali slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani mogu koristiti u praksi ili testiranju predmetnog pronalaska, opisani su poželjni postupci i materijali. Za potrebe predmetnog pronalaska, sledeći termini su definisani u nastavku.

Kako se ovde koriste, članovi „a“ i „an“ se odnose na jedan ili više od jednog (tj. na najmanje jedan) gramatički objekat člana. Na primer, „element“ označava jedan element ili više od jednog elementa.

Kako se ovde koristi, termin „oko“ odnosi se na količinu, nivo, vrednost, dimenziju, veličinu ili iznos koji varira za čak 30%, 25%, 20%, 15% ili 10% u odnosu na referentnu količinu, nivo, vrednost, dimenziju, veličinu ili količinu.

U celoj ovoj specifikaciji, osim ako kontekst ne zahteva drugačije, reči „sadrži“, „sadrži se“ i „koji sadrži“ podrazumevaće uključivanje navedenog koraka ili elementa ili grupe koraka ili elemenata, ali ne i isključivanje bilo kog drugog koraka ili elementa ili grupe koraka ili elemenata.

Termin „alkil“ se odnosi na opciono supstituisane linearne i razgranate ugljovodonične grupe koje imaju 1 do 20 atoma ugljenika. Gde je prikladno, alkil grupa može imati određeni broj atoma ugljenika, na primer, -C1-C6 alkil koji uključuje alkil grupe sa 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 atoma ugljenika u linearnom ili račvastom rasporedu. Neograničavajući primeri alkil grupa uključuju metil, etil, propil, izopropil, butil, s- i t-butil, pentil, 2-metilbutil, 3-metilbutil, heksil, 2-metilpentil, 3-metilpentil, 4-metilpentil, 2 -etilbutil, 3-etilbutil, heptil, oktil, nonil, decil, undecil, dodecil, tridecil, tetradecil i pentadecil.

Termin „alkenil“ se odnosi na opciono supstituisane, nezasićene linearne ili razgranate ugljovodonike, koji imaju 2 do 20 atoma ugljenika i imaju najmanje jednu dvostruku vezu. Tamo gde je prikladno, alkenil grupa može imati određeni broj atoma ugljenika, na primer, C2-C6 alkenil koji uključuje alkenil grupe sa 2, 3, 4, 5 ili 6 atoma ugljenika u linearnom ili račvastom rasporedu. Neograničavajući primeri alkenil grupa uključuju etenil, propenil, izopropenil, butenil, s- i t-butenil, pentenil, heksenil, hept-1,3-dien, heks- 1,3-dien, ne-1,3,5-trien i slično.

Termin „alkinil“ se odnosi na opciono supstituisane nezasićene linearne ili razgranate ugljovodonike, koji imaju 2 do 20 atoma ugljenika, koji imaju najmanje jednu trostruku vezu. Tamo gde je prikladno, alkinil grupa može imati određeni broj atoma ugljenika, na primer, C2-C6 alkinil koji uključuje alkinil grupe sa 2, 3, 4, 5 ili 6 atoma ugljenika u linearnom ili račvastom rasporedu.

Neograničavajući primeri uključuju etinil, propinil, butinil, pentinil i heksinil.

Izrazi „cikloalkil“ i „karbociklični“ odnose se na opciono supstituisane zasićene ili nezasićene monociklične, biciklične ili triciklične ugljovodonične grupe. Gde je prikladno, cikloalkil grupa može imati određeni broj atoma ugljenika, na primer, C3-C6 cikloalkil je karbociklična grupa koja ima 3, 4, 5 ili 6 atoma ugljenika. Neograničavajući primeri mogu uključiti ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, ciklopentenil, cikloheksil, cikloheksenil, cikloheksadienil i slično.

„Aril“ označava C6-C14-člani monociklični, biciklični ili triciklični karbociklični sistem prstena koji ima do 7 atoma u svakom prstenu, naznačeno time što je najmanje jedan prsten aromatičan. Primeri aril grupa uključuju, ali nisu ograničeni na, fenil, naftil, tetrahidronaftil, indanil i bifenil. Aril može da sadrži 1-3 benzenova prstena. Ako su prisutna dva ili više aromatičnih prstenova, onda prstenovi mogu biti spojeni zajedno, tako da susedni prstenovi dele zajedničku vezu.

Svaki alkil, alkenil, alkinil, cikloalkil ili aril, bilo da je pojedinačni entitet ili kao deo većeg entiteta, može biti opciono supstituisan sa jednim ili više opcionih supstituenata izabranih iz grupe koju čine C1-6alkil, C 2-6alkenil, C3-6cikloalkil, okso (=O), -OH, -SH, C1-6alkilO-, C2-6alkenilO-, C3-6cikloalkilO-, C1-6alkilS-, C2-6alkenilS-, C3-

6cikloalkilS-, -CO2H, -CO2C1-6alkil, -NH2, -NH(C1-6alkil), -N(C1-6alkil)2, -NH(fenil), -N(fenil)2, -CN, -NO2, -halogen, -CF3, -OCF3, - SCF3, -CHF2, -OCHF2, -SCHF2, -fenil, -C1-6alkilfenil, -Ofenil, -C(O)fenil, -C(O)C1-6alkil. Primeri pogodnih supstituenata uključuju, ali nisu ograničeni na, metil, etil, propil, izopropil, butil, sek-butil, terc-butil, vinil, metoksi, etoksi, propoksi, izopropoksi, butoksi, metiltio, etiltio, propiltio, izopropiltio, butiltio, hidroksi, hidroksimetil, hidroksietil, hidroksipropil, hidroksibutil, fluor, hloro, bromo, jodo, cijano, nitro, - CO2H, -CO2CH3, -C(O)CH3, trifluorometil, trifluorometoksi, trifluorometiltio, difluorometil, difluorometoksi, difluorometiltio, morfolino, amino, metilamino, dimetilamino, fenil, fenoksi, fenilkarbonil, benzil i acetil.

Jedinjenja epoksitigliana mogu biti u obliku farmaceutski prihvatljivih soli. Međutim, biće procenjeno da nefarmaceutski prihvatljive soli takođe spadaju u obim pronalaska pošto one mogu biti korisne kao intermedijeri u pripremi farmaceutski prihvatljivih soli ili mogu biti korisne tokom skladištenja ili transporta. Pogodne farmaceutski prihvatljive soli uključuju, ali nisu ograničene na, soli farmaceutski prihvatljivih neorganskih kiselina kao što su hlorovodonična, sumporna, fosforna, azotna, ugljena, borna, sulfaminska i bromovodonična kiselina, ili soli farmaceutski prihvatljivih organskih kiselina, kao što je sirćetna kiselina, buterna, vinska, maleinska, hidroksimaleinska, fumarna, maleinska, limunska, mlečna, sluzava, glukonska, benzojeva, sukcinska, oksalna, fenilsirćetna, metansulfonska, toluolsulfonska, benezensulfonska, saliciklična sulfanilna, asparaginska, glutaminska, edetska, stearinska, palmitinska, oleinska, laurinska, pantotenska, taninska, askorbinska i valerinska kiselina.

Bazne soli uključuju, ali nisu ograničene na, one formirane sa farmaceutski prihvatljivim katjonima, kao što su natrijum, kalijum, litijum, kalcijum, magnezijum, amonijum i alkilamonijum.

Osnovne grupe koje sadrže azot mogu biti kvarternizovane sa takvim agensima kao što su niži alkil halid, kao što su metil, etil, propil i butil hloridi, bromidi i jodidi; dialkil sulfati poput dimetil i dietil sulfata; i drugi.

Takođe će biti prepoznato da jedinjenja epoksitigliana mogu posedovati asimetrične centre i stoga su sposobna da postoje u više od jednog stereoizomernog oblika. Pronalazak se tako takođe odnosi na jedinjenja u suštinski čistom izomernom obliku u jednom ili više asimetričnih centara, npr. veći od oko 90% ee, kao što je oko 95% ili 97% ee ili više od 99% ee, kao i na smeše, uključujući racemske smeše i njihove mešavine. Takvi izomeri se mogu dobiti izolacijom iz prirodnih izvora, asimetričnom sintezom, na primer korišćenjem hiralnih intermedijera, ili hiralnom rezolucijom. Jedinjenja pronalaska mogu postojati kao geometrijski izomeri. Pronalazak se takođe odnosi na jedinjenja u suštinski čistim cis (Z) ili trans (E) oblicima ili njihove smeše.

Jedinjenja iz predmetnog pronalaska se mogu dobiti izolovanjem iz biljke ili dela biljke, ili derivatizacijom izolovanog jedinjenja, ili derivatizacijom srodnog jedinjenja. Postupci izolacije i postupci derivatizacije mogu se naći u WO 2007/070985 i WO 2014/169356.

Izraz „epoksitigliansko jedinjenje“ odnosi se na jedinjenje koje ima sledeću osnovnu cikličnu strukturu ugljenika:

Jedinjenja imaju triciklo[9.3.0.0]tetradekan sistem sa fuzionisanim ciklopropanskim prstenom koji je dodat na šestočlani prsten. Epoksid je fuzionisan sa sedmočlanim prstenom u položaju 6,7.

Jedan primer jedinjenja epoksitigliana je jedinjenje epoksitiglien-3-on. Termin "epoksitiglien-3-on jedinjenje" odnosi se na jedinjenje koje ima epoksitiglian strukturu definisanu gore gde petočlani prsten ima 1,2-en-3-on strukturu:

Kako se ovde koristi, izraz „tumor obližnjih ćelija“ odnosi se na tumor koji nije tumor koji je lečen epoksitiglian jedinjenjem. Tumor obližnjih ćelija može biti primarni tumor ili metastatski tumor.

Termin „u kombinaciji sa“ kako se ovde koristi odnosi se na jedinjenje epoksitigliana i ICI-ove koji se primenjuju u jednom sastavu, ili odvojeno, bilo istovremeno ili uzastopno. Jedinjenje epoksitigliana i ICI-ovi se mogu davati u različito vreme i pri različitim frekvencijama, ali u kombinaciji ispoljavaju biološke učinke u isto vreme ili u preklapajućim intervalima. Na primer, ICI-ovi se primenjuju tako da imaju učinak na imunu reakciju kada se primenjuje jedinjenje epoksitigliana.

Metode lečenja

Sve reference na metode lečenja u ovom opisu treba da se tumače kao reference na jedinjenje, farmaceutski sastav ili lek iz predmetnog pronalaska za upotrebu u njima.

Predmetni pronalazak se odnosi na metode lečenja tumora, uključujući tumore obližnjih ćelija, metod koji obuhvata primenu jedinjenja epoksitigliana formule (1) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli u kombinaciji sa inhibitorom imunološke kontrolne tačke (ICI) definisanim u patentnom zahtevu 1.

Pronalazak se takođe odnosi na metode prevencije tumora obližnjih ćelija koji obuhvataju davanje jedinjenja epoksitigliana ili njegove farmaceutski prihvatljive soli u kombinaciji sa pomenutim ICI-em.

U nekim otelotvorenjima, tumor koji se leči je tumor kome jedinjenje epoksitigliana može biti isporučeno na lokalizovan način, direktno u tumor. U posebnim otelotvorenjima, tumor je kožni tumor ili potkožni tumor ili tumor koji je dostupan sa spoljašnje strane tela, na primer, tumor koji je opipljiv. U drugim otelotvorenjima, tumor je unutrašnji tumor. U nekim otelotvorenjima gde je tumor interno lociran tumor, lokalizovana isporuka se postiže tokom operacije kada je tumor izložen i može da mu se ubrizga jedinjenje epoksitigliana. U drugim otelotvorenjima, tumor je interno lociran i jedinjenje epoksitigliana se isporučuje injekcijom vođenom tehnikom snimanja, na primer, vođenom endoskopskim ultrazvukom ili stereotaktičkim snimanjem.

U nekim otelotvorenjima, jedinjenje epoksitigliana se isporučuje u jedan ili više tumora sistemski.

U nekim otelotvorenjima, tumor je benigni tumor. U drugim otelotvorenjima, tumor je maligni tumor. U nekim otelotvorenjima, tumor je primarni tumor, a u drugim otelotvorenjima, tumor je metastatski tumor. Primeri kožnih tumora uključuju seboroičnu keratozu, aktiničnu keratozu, karcinom bazalnih ćelija (BCC) uključujući nodularni BCC, površinski BCC, infiltrativni BCC i mikronodularni BCC, karcinom skvamoznih ćelija, uključujući in-situ karcinom skvamoznih ćelija i invazivni karcinom skvamoznih ćelija, melanom uključujući melanom koji se površinski širi, nodularni melanom, lentigo maligna melanom, akralni lentginous melanom i dezmoplastični/neutropni melanom, kožni B ćelijski limfom i kožni limfom T ćelija. Primeri potkožnih tumora uključuju angiokeratom, piogeni granulom, angiom trešnje, tumor glomusa, angiosarkom, karposi sarkom, Ewingsov sarkom, maligni fibrozni histiocitom, lejomiosarkom, rabdomiosarkom, liposarkom, sinovijalni sarkom, stromalni sarkom, gastrointestinalni stromalni sarkom, maligni tumor omotača perifernog nerava, primitivni neuroektodermalni tumor, neurofibrom, karcinom Merkelovih ćelija, dermatofibrom, fibrosarkom, epiteloidni sarkom i mastocitom (tumor mastocita).

Unutrašnji tumor može biti bilo koji tumor koji je dostupan za injekciju tokom operacije ili vođenom injekcijom ili onaj koji se može lečiti sistemski primenjenim epoksitiglianom i uključuje tumore mozga, pluća, debelog creva, epidermoida, skvamoznih ćelija, bešike, želuca, pankreasa, dojke, glave, vrata, bubrežnog sistema, bubrega, jetre, jajnika, prostate, materice, jednjaka, testisa, grlića materice, vagine, štitne žlezde ili kože.

Tumor obližnjih ćelija može biti bilo koji tumor osim tumora koji se leči jedinjenjem epoksitigliana. Na primer, tumor obližnjih ćelija može biti drugi kožni ili potkožni tumor ili može biti tumor u drugom organu ili tkivu. Primeri tumora obližnjih ćelija uključuju tumore mozga, pluća, debelog creva, epidermoida, skvamoznih ćelija, bešike, želuca, pankreasa, dojke, glave, vrata, bubrežnog sistema, bubrega, jetre, jajnika, prostate, materice, jednjaka, testisa, grlića materice, vagine, štitne žlezde ili kože.

U nekim otelotvorenjima, tumor obližnjih ćelija je dodatni primarni tumor, a u drugim otelotvorenjima tumor obližnjih ćelija je metastatski tumor.

U nekim otelotvorenjima, tumor koji se leči jedinjenjem epoksitigliana je primarni tumor, a tumor obližnjih ćelija je metastatski tumor. U nekim otelotvorenjima, tumor koji se leči jedinjenjem epoksitigliana je metastatski tumor, a tumor obližnjih ćelija je primarni tumor. U nekim otelotvorenjima, i tumor koji se leči jedinjenjem epoksitigliana i tumor obližnjih ćelija su primarni tumori. U nekim otelotvorenjima, i tumor koji se leči jedinjenjem epoksitigliana i tumor obližnjih ćelija su metastatski tumori.

U nekim otelotvorenjima, kombinovana terapija sprečava pojavu tumora obližnjih ćelija ili odlaže pojavu tumora obližnjih ćelija. U nekim otelotvorenjima, kombinovana terapija smanjuje veličinu tumora obližnjih ćelija.

Epoksitiglianska Jedinjenja

Prema pronalasku, jedinjenje epoksitigliana je jedinjenje formule (I):

ili geometrijski izomer ili stereoizomer ili njihova farmaceutski prihvatljiva so;

naznačeno time što

R1 je vodonik ili C1-6alkil;

R2 je -OH ili -OR9;

R3 je -OH ili -OR9;

R4 i R5 se nezavisno biraju između vodonika i C1-6alkila;

R6 je vodonik ili -R10;

R7 je hidroksi ili -OR10;

R8 je vodonik ili C1-6alkil;

R9 je -C1-20alkil, -C2-20alkenil, -C2-20alkinil, -C (O)C1-20alkil, -C(O)C2-20alkenil, -C(O)C2-20alkinil, - C(O)cikloalkil, -C(O)C1-10alkilcikloalkil; -C(O)C2-10alkenilcikloalkil, -C(O)C2-10alkinilcikloalkil, -C(O)aril, -C(O)C 1-10alkilaril, -C(O)C2-10alkenilaril, -C(O)C2-10alkinilaril, -C(O)C1-10alkilC(O)R11, -C(O)C2-10alkenilC(O)R11, -C (O)C2-10alkinilC(O)R11, -C(O)C1-10alkilCH(OR11)(OR11), -C(O)C2-10alkenilCH(OR11)(OR11), -C(O)C2-10alkinilCH(OR11)(OR11), -C(O)C1-10alkilSR11, -C(O)C2-10alkenilSR11, -C(O)C2-10 alkinilSR11, -C(O)C1-10alkilC(O)OR11, -C(O)C2-10alkenilC(O)OR11, -C(O)C2-10alkinilC(O)OR11, -C(O)C1-10alkilC(O)SR11, -C(O)C2-10alkenilC(O)SR11, - C(O)C2-10alkinilC(O)SR11,

ili

R10 je -C1-6alkil, -C2-6alkenil, -C2-6alkinil, -C (O)C1-6alkil, -C(O)C2-6alkenil, -C(O)C2-6alkinil, - C(O)aril, -C(O)C1-6alkilaril, -C(O)C2-6alkenilaril, -C(O)C2 -6alkinilaril; i

R11 je vodonik, -C1-10alkil, -C2-10alkenil, -C2-10alkinil, cikloalkil ili aril;

naznačeno time što je svaka alkil, alkenil, alkinil, cikloalkil ili aril grupa opciono supstituisana.

U nekim otelotvorenjima, jedinjenje epoksitigliana formule (I) je jedinjenje formule (II):

gde su R6, R7 i R9 kao što je definisano za formulu (I).

U posebnim otelotvorenjima formule (I) ili (II), primenjuje se jedno ili više od sledećeg:

R1 je -C1-3alkil, posebno -CH3;

R2 je -OC(O)C1-20alkil, -OC(O)C2-20alkenil, -OC(O)C2-20alkinil, -OC(O)cikloalkil, -OC(O)C1-10alkilcikloalkil; -OC(O)C2-10alkenilcikloalkil, -OC(O)C2-

10alkinilcikloalkil, -OC(O)aril, -OC(O)C 1-10alkilaril, -OC(O)C2-10alkenilaril, -OC(O)C2-10alkinilaril, -OC(O)C1-10alkilC(O)R11, -OC(O)C2-10alkenilC(O)R11, -OC (O)C2-10alkinilC(O)R11, -OC(O)C1-10alkilCH(OR11)(OR11), -OC(O)C2-10alkenilCH(OR11)(OR11), -OC(O)C2-10alkinilCH(OR11)(OR11), -OC(O)C1-10alkilSR11, -OC(O)C2-10alkenilSR11, -OC(O)C2-10 alkinilSR11, -OC(O)C1-10alkilC(O)OR11, -OC(O)C2-10alkenilC(O)OR11, -OC(O)C2-10alkinilC(O)OR11, -OC(O)C1-10alkilC(O)SR11, -OC(O)C2-10alkenilC(O)SR11 ili - OC(O)C2-10alkinilC(O)SR11; posebno -OC(O)C1-20alkil, -OC(O)C2-20alkenil, -OC(O)C2-20alkinil, -OC(O)cikloalkil, -OC(O)C 1-10alkilcikloalkil; -OC(O)C2-10alkenilcikloalkil, -OC(O)C2-10alkinilcikloalkil ili -OC(O)aril; posebno -OC(O)C1-20alkil, -OC(O)C2-20alkenil ili -OC(O)C2-20alkinil;

R3 je -OC(O)C1-20alkil, -OC(O)C2-20alkenil, -OC(O)C2-20alkinil, -OC(O)cikloalkil, -OC(O)C1-10alkilcikloalkil; -OC(O)C2-10alkenilcikloalkil, -OC(O)C2-10alkinilcikloalkil, -OC(O)aril, -OC(O)C 1-10alkilaril, -OC(O)C2-10alkenilaril, -OC(O)C2-10alkinilaril, -OC(O)C1-10alkilC(O)R11, -OC(O)C2-10alkenilC(O)R11, -OC (O)C2-10alkinilC(O)R11, -OC(O)C1-10alkilCH(OR11)(OR11), -OC(O)C2-10alkenilCH(OR11)(OR11), -OC(O)C2-10alkinilCH(OR11)(OR11), -OC(O)C1-10alkilSR11, -OC(O)C2-10alkenilSR11, -OC(O)C2-10 alkinilSR11, -OC(O)C1-10alkilC(O)OR11, -OC(O)C2-10alkenilC(O)OR11, -OC(O)C2-10alkinilC(O)OR11, -OC(O)C1-10alkilC(O)SR11, -OC(O)C2-10alkenilC(O)SR11 ili - OC(O)C2-10alkinilC(O)SR11; posebno -OC(O)C1-20alkil, -OC(O)C2-20alkenil, -OC(O)C2-20alkinil, -OC(O)cikloalkil, -OC(O)C 1-10alkilcikloalkil; -OC(O)C2-10alkenilcikloalkil, -OC(O)C2-10alkinilcikloalkil ili -OC(O)aril; posebno -OC(O)C1-20alkil, -OC(O)C2-20alkenil ili -OC(O)C2-20alkinil;

R4 i R5 su nezavisno izabrani od -C1-3alkila, posebno -CH3;

R6 je vodonik, -C(O)C1-6alkil, -C(O)C2-6alkenil, -C(O) C2-6alkinil ili -C(O)aril;

posebno vodonik, -C(O)C1-3alkil, -C(O)C2-3alkenil ili -C(O)C2-3alkinil, posebno vodonik ili -C(O)CH3;

R7 je hidroksil, -OC(O)C1-6alkil, -OC(O)C2-6alkenil ili -OC(O) C2-6alkinil, posebno hidroksil, -OC(O)C1-3alkil, -OC(O)C2-3alkenil ili - OC(O)C2-3alkinil, tačnije hidroksil ili -OC(O)CH3; i

R8 je -C1-3alkil, posebno -CH3.

U nekim otelotvorenjima, jedinjenja formule (I) i/ili (II) imaju stereohemiju kao što je prikazano u formuli (III) ispod:

U nekim otelotvorenjima, epoksid na poziciji 6,7 je iznad ravni sistema prstenova. U drugim otelotvorenjima, epoksid na poziciji 6,7 je ispod ravni sistema prstenova. U nekim otelotvorenjima, R2 grupa na poziciji 12 je S, a u drugim otelotvorenjima, R2 grupa na poziciji 12 je R

U posebnim otelotvorenjima, jedinjenje epoksitigliana se bira između:

12-tigloil-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tiglien-3-on (Jedinjenje 1);

12,13-di-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tiglien-3-on (Jedinjenje 2);

12-heksanoil-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tiglien-3-on (Jedinjenje 3);

12,13-diheksanoil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tiglien-3-on (Jedinjenje 4);

12-miristoil-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tiglien-3-on (Jedinjenje 5);

12-tigloil-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13-pentahidroksi-20-acetiloksi-1-tiglien-3-on (Jedinjenje 6);

12-miristoil-13-acetiloksi-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tiglien-3-on (Jedinjenje 7);

12-propanoil-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tiglien-3-on (Jedinjenje 8);

12,13-ditigloil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tiglien-3-on (Jedinjenje 9); i

12-(2-metilbutanoil)-13-tigloil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tiglien-3-on (Jedinjenje 10).

Inhibitor imunološke kontrolne tačke (ICI)

ICI kao što je objavljeno, ali nije nužno ovde navedeno, može biti bilo koji molekul koji inhibira imune ćelije ili proteine ćelije raka koji blokiraju imune odgovore u imunoj ćeliji, posebno tamo gde je imuna ćelija T ćelija ili prirodna ćelija ubica (NK ćelija). Primeri imunih ćelija i proteina tumorskih ćelija uključuju programiranu smrt 1 (PD-1) na T ćelijama koja vezuje PD-L1 tumorske ćelije da blokira imuni odgovor T ćelije protiv tumorske ćelije i protein 4 povezan sa citotoksičnim T-limfocitom (CTLA-4) protein na T ćeliji koji vezuje B7-1/B7-2 protein na ćeliji raka da bi blokirao imuni odgovor T ćelije protiv tumorske ćelije. Stoga ICI-ovi uključuju molekule koji se vezuju za ili blokiraju interakciju PD-1 sa PD-L1/PDL2 ili CTLA-4 sa B7-1/B7-2. Drugi proteini imunih ćelija koji blokiraju imune odgovore u imunim ćelijama i mogu biti modulisani da bi se sprečilo njihovo delovanje uključuju Adenozin A2A receptor, B7-H3, B7-H4, indoleamin 2,3-dioksigenazu (IDO), receptor imunoglobulina sličan ćelijama ubica (KIR), Gene aktivacije limfocita-3 (LAG3), imunoreceptor T-ćelije sa IG i ITIM domenima (TIGIT), imunoglobulin T-ćelije i mucin-domen koji sadrži-3 (TIM-3), CD96 i V-domen Imunoglobulinski supresor aktivacije T-ćelije (VISTA).

ICI-ovi su prema pronalasku antagonisti jednog od sledećih PD1 receptora, njegovog liganda PD-L1 i CTLA-4, posebno antagonisti PD-1 ili CTLA-4. U posebnim otelotvorenjima, antagonist je antitelo za protein kontrolne tačke imuniteta, na primer, anti-PD-1 antitelo ili anti-CTLA-4 antitelo.

Sastavi

Dok se jedinjenja epoksitigliana ili njihove farmaceutski prihvatljive soli i ICI-ovi mogu davati u čistom stanju, može biti pogodnije da se jedinjenja epoksitigliana i ICI-ovi daju u obliku jednog ili više farmaceutskih sastava, svaki zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem i razblaživačem i/ili ekscipijensom.

Oblik doziranja i doze za farmaceutsku upotrebu i sastave lako može da odredi osoba koja je stručnjak u predmetnoj oblasti.

U određenim otelotvorenjima, jedinjenje epoksitigliana je formulisano za primenu direktno na ili u tumor koji se leči. U nekim otelotvorenjima, jedinjenje epoksitigliana je formulisano za lokalnu primenu u obliku gela, masti, losiona, kreme ili transdermalnog flastera koji se mogu primeniti direktno na tumor koji se leči. U drugim otelotvorenjima, jedinjenje epoksitigliana je formulisano za injekcije, posebno intratumorske injekcije gde se jedinjenje ubrizgava na jedno ili više mesta u tumoru.

ICI-ovi se mogu primeniti na bilo koji način koji omogućava isporuku molekula sistemski ili lokalno. U posebnim otelotvorenjima, kada je ICI antitelo, molekul se pogodno daje putem injekcije, na primer, intravenskom, intraartikularnom, intramuskularnom, intradermalnom, subkutanom ili intraperitonealnom injekcijom. ICI se takođe može formulisati za lokalnu isporuku injekcijom, na primer, intratumorno. Farmaceutski prihvatljivi nosači i prihvatljivi nosači za sistemsku ili lokalnu primenu takođe mogu biti ugrađeni u sastave ICI-ova. U nekim otelotvorenjima, jedinjenje epoksitigliana i ICI-ovi se isporučuju odvojeno, istovremeno ili uzastopno. U drugim otelotvorenjima, jedinjenje epoksitigliana i ICI se isporučuju u jednom sastavu, na primer, u jednom sastavu pogodnom za intratumorno dostavljanje ili jednom sastavu formulisanom za sistemsko dostavljanje.

U drugom aspektu predmetnog pronalaska je obezbeđen farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenje epoksitigliana ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i inhibitor imunološke kontrolne tačke, opciono zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača.

Pogodno, farmaceutski sastav(i) sadrži farmaceutski prihvatljiv ekscipijent ili prihvatljiv ekscipijent. Pod „farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom“ se podrazumeva čvrsto ili tečno punilo, razblaživač ili supstanca za kapsuliranje koja se može bezbedno koristiti. U zavisnosti od određenog načina primene, mogu se koristiti različiti nosači, dobro poznati u predmetnoj oblasti. Ovi nosači ili ekscipijenti mogu biti izabrani iz grupe koja uključuje šećere, skrobove, celulozu i njene derivate, ciklodekstrine, slad, želatin ili druga sredstva za geliranje, polimere, talk, kalcijum sulfat, biljna ulja, sintetička ulja, alkohole i/ili poliole, alginsku kiselinu, rastvore sa fosfatnim puferom, emulgatore, izotonični fiziološki rastvor i vodu bez pirogena.

Preparati u tečnom obliku uključuju rastvore, suspenzije i emulzije, na primer, vodu ili rastvore vode-propilen glikola. Na primer, tečni preparati za parenteralne injekcije mogu se formulisati kao rastvori u vodenom 1,2-propandiolu, dimetilsulfoksidu (DMSO), vodeni rastvori gama ciklodekstrina ili 2-hidroksipropilbeta-ciklodekstrina, fiziološki rastvor ili rastvor polietilen glikola, sa ili bez pufera. Poželjni opseg pH je 3,0-4,5. Pogodni puferi ublažuju preparat na pH 3,5-4,5 i uključuju, ali nisu ograničeni na, acetatni pufer i citratni pufer.

Sastavi jedinjenja epoksitigliana i/ili ICI-ovi se mogu tako formulisati za parenteralnu primenu (npr. injekcijom, na primer bolus injekcijom ili kontinuiranom infuzijom) i mogu biti predstavljeni u obliku jedinične doze u ampulama, unapred napunjenim špricevima, infuzijama male zapremine ili u višedozne spremnike sa dodatkom konzervansa. Sastavi mogu imati takve oblike kao što su suspenzije, rastvori, gelovi ili emulzije u uljnim ili vodenim nosačima, i mogu da sadrže sredstva za formulaciju kao što su agensi za suspendovanje, stabilizaciju i/ili disperziju.

Alternativno, aktivni sastojak može biti u obliku praha, dobijenog aseptičnom izolacijom sterilne čvrste supstance ili liofilizacijom iz rastvora, za konstituisanje sa odgovarajućim prenosnikom, npr. sterilnom vodom bez pirogena, pre upotrebe.

Farmaceutski sastavi jedinjenja epoksitigliana i/ili ICI-ovi pogodni za primenu mogu biti predstavljeni u diskretnim jedinicama kao što su špricevi, bočice, epruvete ili kesice koje sadrže unapred određenu količinu jednog ili više farmaceutski aktivnih jedinjenja ili ekstrakata pronalaska, kao prah ili granule ili kao rastvor ili suspenzija u vodenoj tečnosti, rastvor ciklodekstrina, ne-vodena tečnost, emulzija ulje u vodi ili emulzija voda u ulju ili kao rastvor ili suspenzija u kremi ili gelu ili kao suspenzija mikro- ili nano-čestica koja uključuje jedinjenje epoksitigliana, uključujući, ali bez ograničenja na mikro- ili nano-čestice silicijum dioksida ili polilaktida. Takvi sastavi se mogu pripremiti bilo kojim od farmaceutskih metoda, ali sve metode uključuju korak dovođenja u vezu jednog ili više farmaceutski aktivnih jedinjenja pronalaska sa nosačem koji čini jedan ili više neophodnih sastojaka. Generalno, sastavi se pripremaju ravnomernim i pažljivim mešanjem sredstava pronalaska sa tečnim nosačima ili fino usitnjenim čvrstim nosačima ili sa oba, a zatim, ako je potrebno, oblikovanjem proizvoda u željenu prezentaciju.

Za lokalnu primenu na epidermu ili drugi organ, jedinjenja prema pronalasku mogu biti formulisana kao gelovi, masti, emulzije, paste, kreme ili losioni, ili kao transdermalni flasteri. Gelovi se mogu pripremiti korišćenjem pogodnih sredstava za zgušnjavanje i njihovim dodavanjem u vodene/alkoholne sastave jedinjenja. Pogodna sredstva za zgušnjavanje ili geliranje su poznata u predmetnoj oblasti, kao što je polivinil karboksi polimer Carbomer 940. Masti i kreme se mogu, na primer, formulisati na vodenoj ili uljnoj bazi uz dodatak odgovarajućih sredstava za zgušnjavanje i/ili geliranje. Losioni mogu biti formulisani sa vodenom ili uljnom bazom i generalno će takođe sadržati jedan ili više agenasa za emulgovanje, stabilizatora, sredstava za raspršivanje, agensa za suspendovanje, agenasa za zgušnjavanje ili agenasa za bojenje.

Formulacije pogodne za lokalnu primenu takođe uključuju rastvore ili suspenzije koje se mogu primeniti lokalno u obliku kupke ili rastvora za namakanje ili spreja ili se mogu apsorbovati u obloge.

Kada je ICI mali molekul, može se isporučiti na bilo koji pogodan način uključujući oralno, lokalno, rektalno, parenteralno, sublingvalno, bukalno, intravenozno, intraartikularno, intra-muskularno, intradermalno, subkutano, inhalaciono, intraokularno, intraperitonealno, intracerebroventrikularno, transdermalno i slično kao što je poznato u oblasti farmacije.

Režimi doziranja

U nekim otelotvorenjima, jedinjenje epoksitigliana se isporučuje u istom sastavu kao ICI. Međutim, u posebnim otelotvorenjima, ICI se primenjuje u odvojenom sastavu od jedinjenja epoksitigliana.

U nekim otelotvorenjima, jedinjenje epoksitigliana se primenjuje direktno na tumor, na primer lokalnom primenom ili intratumoralnom injekcijom.

U nekim otelotvorenjima, jedinjenje epoksitigliana se primenjuje na tumor jednom. U drugim otelotvorenjima, tretirani tumor se prati i može biti potrebna dalja primena jedinjenja epoksitigliana ako tumor ne reaguje u potpunosti na tretman. U otelotvorenjima gde se tumor tretira lokalno, jedinjenje epoksitigliana može se primenjivati u više navrata tokom određenog vremenskog perioda, na primer, dnevno tokom jedne nedelje, ili jednom nedeljno tokom 4 do 10 nedelja. Stručnjak u predmetnoj oblasti, koji prati subjekta koji se leči, mogao bi da odredi odgovarajući raspored doziranja, koji može da varira u zavisnosti od reakcije na tretman.

U nekim otelotvorenjima, ICI se primenjuje najmanje jednom, pre ili istovremeno ili uzastopno sa jedinjenjem epoksitigliana. U određenim otelotvorenjima, višestruke doze ICI se primenjuju tokom određenog vremenskog perioda počevši pre ili zajedno sa primenom jedinjenja epoksitigliana, a zatim se nastavlja nakon primene jedinjenja epoksitigliana.

U nekim otelotvorenjima, ICI se primenjuje više puta i redovno pre i posle primene jedinjenja epoksitigliana. U posebnim otelotvorenjima, ICI se primenjuje pre primene jedinjenja epoksitigliana, uzastopno ili istovremeno sa primenom jedinjenja epoksitigliana i najmanje jednom nakon primene jedinjenja epoksitigliana. Na primer, ICI se može primeniti 1 nedelju do 1 dan pre primene jedinjenja epoksitigliana, posebno 1 do 3 dana, a posebno oko 2 dana pre primene jedinjenja epoksitigliana, ICI se zatim primenjuje uzastopno ili istovremeno sa epoksitiglianskim jedinjenjem, bilo neposredno pre ili odmah nakon primene jedinjenja epoksitigliana, ICI se zatim primenjuje jedan ili više puta tokom narednog meseca nakon primene jedinjenja epoksitigliana, na primer, jednom nedeljno, jednom u 5 dana, jednom u svakom 4 dana, jednom u 3 dana, svaka 2 dana ili svaki dan, posebno svakih 1 do 3 dana, posebno svaka 2 dana.

Naknadna primena ICI može da se nastavi tako da se 1 do 10 doza ICI-ja primenjuje nakon primene jedinjenja epoksitigliana, posebno 1 do 8 doza, 1 do 6 doza, 1 do 4 doze, 1 do 3 doze ili 1 do 2 doze.

U posebnom otelotvorenju, ICI se primenjuje 2 dana pre primene jedinjenja epoksitigliana, uzastopno (neposredno pre ili odmah posle) sa jedinjenjem epoksitigliana, a zatim svaka dva dana tokom 6 dana nakon primene jedinjenja epoksitigliana.

Jedinjenje epoksitigliana se primenjuje u efikasnoj količini. „Efikasna količina“ označava količinu neophodnu bar delimično da se postigne željena reakcija, na primer, da se smanji veličina tumora ili da se tumor potpuno uništi. Količina varira u zavisnosti od zdravlja i fizičkog stanja pojedinca koji se leči, taksonomske grupe pojedinca koji se leči, formulacije sastava, veličine tumora, procene medicinske situacije i drugih relevantnih faktora. Očekuje se da će se količina kretati u relativno širokom rasponu koji se može utvrditi kroz rutinska ispitivanja. Efikasna količina, na primer, može biti u opsegu od oko 0,1 ng po kg telesne težine do 1 g po kg telesne težine po dozi. Doziranje je poželjno u opsegu od 1 µg do 0,5 g po kg telesne težine po dozi, kao što je u opsegu od 0,1 µg do 100 mg po kg telesne težine po dozi. U jednom otelotvorenju, gde se doza primenjuje intratumorski, doza je u opsegu od 50 mg do 100 mg po kg telesne težine, na primer 0,1 mg do 5 mg po kg telesne težine, 0,1 do 1 mg/kg telesne težine, kao što je 0,25 mg/kg telesne težine. U drugom otelotvorenju, doza je u opsegu od 0,001 mg do 20 mg po dozi, na primer, 0,005 mg do 15 mg po dozi, posebno 0,05 do 10 mg po dozi, posebno oko 0,1 do oko 5 mg po dozi. Režimi doziranja se mogu prilagoditi kako bi se obezbedila optimalna terapijska reakcija. Na primer, u nekim otelotvorenjima, gde je primena intratumorska, jedinjenje epoksitigliana se primenjuje jednom i prati se napredak lečenja. U nekim otelotvorenjima, ako se tumor ne povuče u potpunosti ili ako se tumor ponovi, može se primeniti druga doza. U nekim otelotvorenjima, gde je primena lokalna, formulacija jedinjenja za lokalnu upotrebu se može primeniti direktno na mesto tumora u obliku gela, kreme, masti ili losiona. Učestalost lečenja zavisiće od tumora, njegove veličine, subjekta koji se leči i slično. U nekim otelotvorenjima, formulacija za lokalnu upotrebu može da se primenjuje nedeljno dok se tumor ne razreši. U drugim otelotvorenjima, tretman može biti samo jedan tretman i drugi tretman koji se primenjuje samo ako tumor nije potpuno nestao.

ICI se takođe može primeniti u efikasnoj količini. Opet, količina ICI-ja koja se smatra efikasnom zavisiće od subjekta koji se leči, njegovog zdravlja i fizičkog stanja, broja prisutnih tumora obližnjih ćelija, formulacije sastava i procene medicinske situacije. Očekuje se da će se iznos ICI-ja kretati u prilično širokom rasponu iznosa. Efikasna količina može biti u opsegu od oko 0,1 mg/kg do oko 500 mg/kg telesne težine, 100 µg/kg do 100 mg/kg telesne težine, 1 mg/kg do 50 mg/kg telesne težine, 1 mg/kg do 20 mg/kg telesne težine. U drugom otelotvorenju, stvarne doze mogu biti u opsegu od 1 µg do 1 g, na primer, 100 µg do 750 mg po dozi.

Subjekt koji se može lečiti kombinovanom terapijom je sisar, ptica, vodena životinja kao što je riba ili gmizavac. U nekim otelotvorenjima, subjekt je čovek, laboratorijska životinja kao što je miš, pacov ili zec, životinja ljubimac kao što je pas ili mačka, radna životinja kao što je konj, magarac i slično, stoka kao što je krava, bik, svinja, ovca, koza, jelen, lama, alpaka i slično, ili zarobljena divlja životinja kao što su one u zoološkim vrtovima ili parkovima divljih životinja, uključujući lavove, leoparde, geparde, slonove, zebru, antilopu, žirafu, koalu, kengura i gmizavce kao što su krokodili, gušteri, zmije i slično, ptice, posebno ptice u zatočeništvu, kao što je tigrica ili kanarinac, kakadu, papiga, ara, papagaj i slično, ili riba, posebno riba u zatočeništvu kao npr. tropske ribe (zebra, gupi, sijamske borbene ribe, riba klovn, kraljevska neonka i slično), delfini, kitovi i sl. U posebnim otelotvorenjima, subjekt je čovek ili životinja ljubimac.

Kompleti

Sastavi jedinjenja epoksitigliana i ICI-ja mogu se formulisati odvojeno i prodavati zajedno u kompletu ili pakovanju. Svaki komplet može da sadrži doze svakog jedinjenja za ostvarenje lečenja tumora i lečenje ili prevenciju jednog ili više tumora obližnjih ćelija.

U nekim otelotvorenjima, sastav epoksitigliana je formulisan za lokalnu primenu, kao što je gel, losion, krema ili mast ili je impregniran u oblogu. U drugim otelotvorenjima, jedinjenje epoksitigliana je formulisano za injekcije kao što je intratumorska injekcija. U ovom otelotvorenju, formulacija epoksitigliana može biti prisutna u kompletu kao tečnost spremna za unošenje u špric, kao prah ili čvrsta formulacija koja može biti rastvorena u nosaču pre injekcije ili može biti prisutna u kompletu u prethodno napunjenom špric.

Svaki komplet može da sadrži jednu ili više doza jedinjenja epoksitigliana. U jednom otelotvorenju, komplet će sadržati jednu dozu jedinjenja epoksitigliana u formulaciji pogodnoj za intratumoralnu injekciju. U drugom otelotvorenju, komplet će sadržati topikalnu formulaciju jedinjenja epoksitigliana koja sadrži višestruke doze za primenu na tumor.

U nekim otelotvorenjima, ICI je formulisan za parenteralnu primenu u jednoj bolus dozi ili u obliku višestruke doze. Na primer, komplet može da sadrži ICI u prethodno napunjenom špricu, kao tečnost u bočici spremnu za unošenje u špric, ili kao čvrstu supstancu spremnu za rastvaranje pre unošenja u špric. Tečne ili čvrste formulacije mogu biti formulacije sa jednom dozom ili formulacije sa više doza. Alternativno, komplet može sadržati više doza ICI-ja, od kojih je svaka formulisana posebno u prethodno napunjenom špricu, kao tečnost u bočici spremnu za unošenje u špric ili kao čvrsta supstanca spremna za rastvaranje i unošenje u špric.

Komplet može dalje da sadrži umetak sa uputstvima za upotrebu svake formulacije, uključujući kako da se pripremi svaka doza ako je potrebno, kako da se primeni svaka doza i kada da se primeni svaka doza.

Kratak opis Slika

Slika 1 daje A: slike PKC-α, -βII, -γ, -δ i -θ translokacije nakon tretmana sa prenosnikom (Vehc.) ili 500 nM Jedinjenja 1 (Jed 1), Jedinjenja 3 (Jed 3) i PMA. Ove slike su takođe korišćene za kvantifikaciju prikazanu u B. B: Toplotna mapa koja prikazuje profil translokacije izoforme PKC (-α, -βI, -βII, -γ, -δ, -θ, -η i -ζ - srednji procenat ćelija koje pokazuju translokaciju EGFP u plazma membranu) kao odgovor na 500, 50 i 5 nM Jedinjenje 1 i naznačeni analozi. > 150 ćelija prebrojano po biološkoj replici. n = 3.

Slika 2 daje A: Šema eksperimentalnog dizajna. B: Odabrani citokini/hemokini domaćini sa ulogom u regrutovanju leukocita indukuju se tretmanom sa jedinjenjem 1 (30 µg). Prikazani su stepeni promene u ekspresiji gena naznačenih citokina/hemokina. C: Toplotna mapa je generisana nakon poređenja podataka o intenzitetu iz profila ekspresije gena prenosnika i jedinjenja 1 na t=8 h. Naredne liste gena su analizirane pomoću Ingenuity Pathway Analysis (IPA;

Qiagen) kako bi se identifikovali putevi na koje utiče tretman sa jedinjenjem 1.

Slika 3 prikazuje A. oslobađanje LDH iz ćelijskih linija raka tretiranih jedinjenjem 1. A431, MM649 i B16-OVA su tretirani sa Jedinjenjem 1 u naznačenim koncentracijama ili samo sa prenosnikom (Pren.) i LDH koji se oslobađa tokom vremena je analiziran korišćenjem kompleta za ispitivanje citotoksičnosti Pierce LDH. n=3. B. Jedinjenje 1 indukuje značajno smanjenje intracelularnog ATP nivoa. Ponovo, ćelije su tretirane jedinjenjem 1 ili prenosnikom (Pren.) i intracelularni nivoi ATP-a su analizirani u naznačenim vremenskim tačkama korišćenjem kompleta za ispitivanje CellTiter-Glo<2®>. n=3.

Slika 4 daje A. Određivanje oslobađanja ATP-a iz ćelijskih linija raka kao odgovor na tretman sa jedinjenjem 1. Ćelije su tretirane sa Jedinjenjem 1 ili Prenosnikom (Pren.) u naznačenim vremenima i otpuštanje ATP-a iz supernatanata ćelijske kulture je analizirano korišćenjem kompleta za ATP za ispitivanje zasnovanog na bioluminiscenciji. Srednje vrednosti RLU /- SD su određene i prikazane u zavisnosti od vremena. n=4. B. Dodatni analozi epoksitigliana (jedinjenje 2: Bi, Jedinjenje 3 Bii i Jedinjenje 4: Biii) takođe promoviše oslobađanje ATP-a iz ćelijskih linija A431, MM649 i B16-OVA. n=4. C.

Određivanje oslobađanja HMGB1 iz ćelijskih linija raka tretiranih Jedinjenjem 1 i analozima epoksitigliana. Supernatanti ćelijske kulture iz epoksitigliana ili prenosnika (Pren.) tretirani A431 (Ci), MM649 (Cii) ili B16-OVA (Ciii) su analizirani na oslobađanje HMGB1 putem ELISA. Vrednosti ćelija tretiranih jedinjenjem 1 su normalizovane na ćelije tretirane prenosnikom da bi se odredio stepen povećanja oslobađanja HMGB1. n=2 za A431 i MM649, dok je n=3 za B16-OVA. (Civ) Oslobađanje HMGB1 se takođe desilo kao odgovor na tretman sa jedinjenjem 2, 3 i 4. n=3. D. Jedinjenje 1 promoviše eksternalizaciju kalretikulina u nizu ćelijskih linija raka. A431 (Di), MM649 (Dii) i B16-OVA (Diii) su tretirani jedinjenjem 1 ili prenosnikom (Pren.) samo u naznačenim vremenima i zatim obojeni sa anti-Calreticulin/anti-rabbit Alexa 488 pre protočne citometrije. Srednje vrednosti intenziteta fluorescencije (npr.: 488 nm, Em: 530/530nm) /- SD su naznačene za svaku vremensku tačku.

Slika 5 daje A i B. Ćelije tretirane epoksitiglianom se obrađuju pomoću CD11c<+>BMDC in vitro. CMFDA obeležene B16-OVA ćelije tretirane jedinjenjem 1 ili prenosnikom (Pren.) su inkubirane sa nezrelim BMDC-ovima tokom 4 h, a zatim obojene anti-CD11c-APC pre protočne citometrije. Čvrsta siva kutija - CD11c<+>BMDC ćelije. Isprekidana crna kutija - CD11c<+>BMDC-i koji su preuzeli umiruće fragmente B16-OVA ćelija (CD11c<+>CMFDAsredina). Procenat CD11c<+>CMFDAsrednjih ćelija je naznačen na 5A, a podaci iz 4 biološke replike su prikazani na slici 5B. n=4. C.

Analozi epoksitigliana takođe indukuju unos B16-OVA ćelija od strane CD11c<+>BMDC-ovi. Prikazani su podaci dobijeni upotrebom jedinjenja 2, 3 i 4. n=3.

Slika 6 daje A: Šema eksperimentalnog pristupa kombinacijama jedinjenja 1 i ICI. Svim tumorima je ubrizgano ili 15/30 µg Jedinjenja 1 ili Prenosnik (Pren.). Takođe je prikazan režim doziranja ICI tretmana. B i C. Kaplan-Meier grafikoni koji pokazuju procenat lečenih tumora koji ostaju ispod 100 mm<3>u različitim uslovima lečenja sa ICI-ovima, bilo sa anti-PD-1 (Slika 6B) ili anti-CTLA-4 (Slika 6C). Preživljavanje miša kao reakcija na kombinaciju je takođe prikazano.

Slika 7 daje A: Šematski dijagram pristupa kombinovanoj terapiji: indeks i tumor obližnjih ćelija su prikazani zajedno sa režimom doziranja; i B: Grafički prikazi rezultata kombinovane terapije (obimi tumora). Antitelo izotipa jedinjenje 1 (tačkasta linija), anti-PD-1 antitelo ili anti-CTLA-4 antitelo prenosnik (isprekidana linija) i anti-PD-1 antitelo ili anti-CTLA-4 antitelo jedinjenje 1 (puna linija) kod lečenih (beli krugovi) i kod (crni krugovi) tumora obližnjih ćelija.

Slika 8 daje analize zasnovane na zapremini (levi panel) i Kaplan-Meier-u (desni panel) zasnovane na tumorima (% tumora < 100 mm<3>) injektiranih sa suboptimalnom dozom Jedinjenja 1 (15 µg) u tež. i GCSF nokaut pozadini.

Primeri

Jedinjenje 6, 20-acetil derivat jedinjenja 1, može se dobiti iz jedinjenja 1 acetilacijom sa anhidridom sirćetne kiseline (1 ekv.) u prisustvu trietilamina u dihlorometanu. Ovi uslovi omogućavaju selektivnu acetilaciju C-20 hidroksi grupe bez acetilacije sekundarnih hidroksi grupa.

Jedinjenje 10, iako nije specifično sintetizovano u WO2014/169356, može se pripremiti korišćenjem opšte metode za dobijanje nesimetričnih estara date u Primeru 1 WO2014/169356, strane 64 do 70.

Primer 1: Analozi epoksitigliana aktiviraju izoforme PKC

Protein kinaza C je porodica ključnih enzima uključenih u signalne puteve koji specifično fosforilišu supstrate na ostacima serina/treonina.

Fosforilacija pomoću PKC je važna u regulaciji raznih ćelijskih događaja kao što su proliferacija i regulacija ekspresije gena. PKC izoforme (-θ, -η, -α, -β, -δ, -ε) su direktno implicirane u odgovorima imunih ćelija i takođe mogu promovisati ekspresiju ključnih imunih gena. Međutim, obrazac ekspresije i nivoi svake od ovih PKC izoformi su specifični za tip ćelije i kontekst (Lim et al.2015; Anel et al.2012; Pfeifhofer et al.2006).

Da bi se identifikovali specifični profili aktivacije PKC izoforme (specifičnost i potentnost) jedinjenja epoksitigliana, HeLa ćelije su prolazno transfektovane selekcijom vektora PKC-EGFP (PKC-α, PKC-βI, PKC-βII, PKC-γ, PKC-δ, PK-Cθ, PKC-η, PKC-ζ - proizvedeni interno) korišćenjem Lipofectamine 2000 (Invitrogen) prema metodama opisanim u Boyle et al.2014. Zapremina koja odgovara 0,16 µg PKC-EGFP i 0,48 µL Lipofectamine-a je pomešana sa 25 µl Opti-MEM medijuma (Invitrogen) i inkubirana 5 minuta na ST. Rastvori su kombinovani i inkubirani još 20 min na sobnoj temperaturi (odnos 1:3 DNK:Lipofectamine 2000). Kompleksi (50 µl) su dodati u svaku jažicu i nakon 3 h inkubacije na 37 °C, dodato je još 50 µl RPMI-1640, 10 % FCS do ukupne zapremine od 100 µl po jažici. Posle 24 h inkubacije na 37 ° C, ćelije su isprane fiziološkim rastvorom puferovanim fosfatom (PBS) i tretirane sa 500, 50 i 5 nM epoksitigliana. Tri jedinjenja su mogla biti testirana po ploči sa 96 jažica. Bilo je potrebno pet ploča sa 96 jažica po eksperimentalnom ciklusu. Posle tretmana od 1 h, ćelije su dva puta isprane sa 100 µl PBS-a i fiksirane sa 50 µl 2% formaldehida / 0,2% gluteraldehida u PBS-u tokom 10 minuta. Fiksirane ćelije su zatim dva puta isprane sa 100 µl PBS. Za bojenje jezgara, Hoechst 3342 je korišćen pri 1: 10000 razblaženja. Posle 7 minuta inkubacije u mraku, Hoechst je uklonjen i ćelije su isprane sa PBS. Na kraju su ćelije prekrivene sa 100 µl PBS-a i čuvane na 4 °C u mraku do snimanja. Snimanje slika je izvedeno pomoću GE InCell Analyzer 2000. Translokacija PKC-a na plazma membranu ili druge subćelijske pozicije je izbrojana ručno pomoću alata Adobe Photoshop CS6.

Slike koje prikazuju translokaciju odabranih PKC izoforma -α, -βII, -γ, -δ i -θ na ćelijsku membranu u prisustvu jedinjenja epoksitigliana, jedinjenja 1, jedinjenja 3, kao i PMA (forbol-12-miristat-13-acetat) prikazani su na slici 1A. Ove slike pokazuju da različita jedinjenja epoksitigliana mogu aktivirati različite PKC izoforme.

Procenat ćelija koje pokazuju translokaciju jedinjenja 1 do 10 kroz plazma membranu kao i pozitivnu kontrolu PMA su konvertovani u Toplotnu mapu koja prikazuje profil translokacije PKC izoforme kao odgovor na 500, 50 i 5 nM svakog jedinjenja. Toplotna mapa je prikazana na slici 1B.

Rezultati pokazuju da sva jedinjenja 1 do 7 aktiviraju PKC-θ (u različitoj meri), PKC izoformu za koju se zna da je uključena u aktivaciju T- i NK ćelija i supresiju razvoja Treg-a (Brezar et al., 2015; Anel et al., 2012). Sva jedinjenja epoksi-tigliana aktiviraju PKC-β, koji je kritičan u signalizaciji receptora B ćelija i prezentaciji antigena (npr. Kang et al.2001; Lim et al.2015). Tri druge PKC izoforme (-η, -α, -δ) koje su bile slabije aktivirane nekim ili svim epoksitiglianima takođe su direktno implicirane u odgovorima imunih ćelija (Lim et al.2015;

Pfeifhofer et al.2006)

Primer 2: Promene ekspresije gena u stromi mišjeg tumora u skladu sa regrutovanjem imunih ćelija i indukcijom Th-1/M1 sličnog antitumorskog imunog odgovora

Th1/M-1 sličan odgovor kod antitumorskog imuniteta. Imuni odgovor sličan Th1/M1 povezan je sa indukcijom antitumorskog ćelijskog imuniteta kroz niz mehanizama uključujući direktnu tumorocidnu aktivnost, modifikaciju antitumorskih odgovora citokina i potenciranje dugoročne imunološke memorije. Na primer, nekoliko linija dokaza pokazuje da CD4<+>T pomoćne ćelije tipa 1 (Th1), pokretači Th1 imuniteta, mogu pomoći kao podrška uklanjanju tumorskih ćelija putem sekrecije različitih citokina, uključujući interferon-γ (IFN-γ), interleukin-2 (IL-2) i faktor nekroze tumora-α (TNF-α) (Knutson et al.2005; DeNardo et al.2010;

Burkholder et al.2014). Ovi citokini promovišu aktivnosti nekoliko tipova ćelija, uključujući ćelije koje predstavljaju antigen (APC-ovi), citotoksične T ćelije, NK ćelije i različite podtipove urođenih imunih ćelija (npr. Cohen et al. 2000; Bos & Sherman 2010). Takođe je poznato da IFN-γ i TNF imaju direktne efekte na preživljavanje tumorskih ćelija (Sugarman et al.1985; Bayaert et al.1994). Iako su IL-1 i IL-6 (proizvedeni od M1 makrofaga) povezani sa razvojem tumora, noviji dokazi sugerišu da su oni zapravo ključne komponente akutnog antitumorskog imunološkog odgovora (Haabeth et al.2011; Gabrilovich et al.2012; Haabeth et al. 2016). Pokazalo se da poboljšavaju proliferaciju B ćelija i proizvodnju antitela, povećavaju aktivnost ćelija za prezentaciju antigena (APC), stimulišu proliferaciju tipova citotoksičnih ćelija specifičnih za antigen i promovišu diferencijaciju Th1 ćelija (Haabeth et al.2011; Burkholder et al.2014). Takođe se pokazalo da su kombinacije između Th1 i M1 citokina važne u imunonadzoru tumora. Na primer, i IL-1 i IFN-γ se sinergizuju da bi aktivirali tumorsku aktivnost makrofaga (Hori et al.

1989; Haabeth et al.2016). Važno je da je pojava M1 makrofaga i Th1 limfocita u tumorima pozitivno povezana sa poboljšanom prognozom i vremenom preživljavanja kod mnogih karcinoma (Pages et al.2010; Fridman et al.2012; Senovilla et al. 2012). Zaista, predloženo je izazivanje zapaljenja tipa Th1/M1 kako bi značajno poboljšalo pristupe zasnovane na imunoterapiji protiv raka (Haabeth et al. 2012). U nastavku je opisan efekat jedinjenja 1 u promovisanju antitumorskog imunog odgovora sličnog Th1/M1 u stromi mišjeg modela ksenografta.

Mišja stroma u ksenograftu ljudskih tumora od miševa. Ćelijska linija ljudskog melanoma SK-MEL-28 je ubrizgana subkutano (sc) na 2 mesta na bokovima svakog BALB/c Foxnlnu miša (2 miliona ćelija/po mestu) i ostavljena da naraste do prečnika približno 7 mm. Svaki tumor je zatim ubrizgan sa 50 µl 20% propilen glikola koji sadrži 30 µg jedinjenja 1 ili sa 50 µl 20% propilen glikola. U različito vreme nakon injekcije, miš je eutaniziran i tumori su sakupljeni, kožni omotač je uklonjen, a netaknuti tumori čuvani na -80°C

Ekstrakcija RNK. RNK je ekstrahovana iz 30 mg smrznutog tumora korišćenjem Qiagen RNeasy Plus Mini Kompleta, u skladu sa uputstvima proizvođača, zatim je kvantifikovana pomoću NanoDrop instrumenta i integritet je potvrđen na denaturisanim agaroznim gelovima koji nose 1 kb DNK marker i obojeni etidijum bromidom.

RNK amplifikacija i obeležavanje. Približno 500 ng ukupne neobeležene RNK je podešeno na konačnu zapreminu od 11 µl sa vodom bez nukleaze. RNK je inkubirana sa 9 µl glavne mešavine reverzne transkriptaze (1 µl T7 Oligo (dT) prajmera, 2 µl 10x pufera za prvi lanac, 4 µl mešavine dNTP, 1 µl inhibitora RNase i 1 µl ArrayScript-a) na 42 °C tokom 2 h. Zatim je usledio korak sinteze drugog lanca cDNK koji je uključivao dalju inkubaciju na 16 °C tokom 2 sata sa 80 µl glavne mešavine drugog lanca (63 µL vode bez nukleaze, 10 µl 10X pufera za drugi lanac, 4 µl mešavine dNTP, 2 µl DNK polimeraze i 1 µl RNase H). cDNK je prečišćena filtriranjem kroz cDNK Filter Cartridge sa 250 µl pufera za vezivanje cDNK i ispiranjem sa 500 µl pufera za ispiranje koji se nalazi u kompletu.

Prečišćena cDNK je eluirana sa 20 µl vode bez nukleaze na 55 °C. Svaki cDNK uzorak je inkubiran sa 7,5 µl IVT glavne mešavine (2,5 µl T710X reakcionog pufera, 2,5 µl mešavine T7 enzima i 2,5 µl mešavine biotin-NTP) na 37 °C tokom 16 h. Reakcija je zaustavljena dodatkom 75 µl vode bez nukleaza u svaki uzorak cRNK. Biotinilisana, amplifikovana RNK je prečišćena filtriranjem cRNK uzoraka kroz cRNK filter kertridže sa 350 µL pufera za vezivanje cRNK i 250 µl 100% etanola pomešanih zajedno pre stavljanja na filtere. cRNA filter kertridži sa pričvršćenom RNK su zatim isprani sa 650 µl pufera za ispiranje pre eluiranja prečišćene cRNA sa 200 µl vode bez nukleaze na 55 °C.

Hibridizacija Illumina Expression BeadChip-a. Uzorci cRNK su zagrevani na 65 °C tokom 5 minuta i sakupljeni pulsnim centrifugiranjem. Posle zagrevanja na 65°C tokom 5 minuta, približno 750 ng uzorka cRNK je alikvotirano u odvojene epruvete u koje je dodato ~ 5 µl vode bez RNase i 10 µl Hyb miksa. Približno 15 µl pripremljene mešavine cRNA je stavljeno na Illumina Expression BeadChip-ove. Sledeći koraci hibridizacije i ispiranja su sprovedeni u skladu sa Vodičem za direktnu hibridizaciju ekspresije gena celog genoma koji je isporučila Illumina. HumanHT-12 v4 Expression BeadChips pokrivaju više od 47.000 transkripata i poznatih varijanti spajanja širom ljudskog transkriptoma. MouseRef-8 v2.0 Expression BeadChips pokrivaju približno 25.600 dobro obeleženih RefSek (Referentna sekvenca) transkripata, koji sadrže preko 19.000 jedinstvenih gena.

Analiza podataka. BeadChips je pročitao iScan sistem i preneo ih preko GenomeStudio u GeneSpring GX v12.5 (Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornija, SAD). Vrednosti izraza su normalizovane korišćenjem kvantilne normalizacije sa podrazumevanim podešavanjima. Entiteti su filtrirani na osnovu rezultata detekcije koji je izračunao GenomeStudio gde se

p ≤ 0,05 smatralo značajnim.

Rezultati su prikazani na slici 2. Slika 2A pokazuje da se nekoliko citokina/hemokina domaćina koji su važni za regrutovanje/aktivaciju imunih ćelija pojačano regulišu na mestu tumora kao odgovor na tretman jedinjenjem 1. Treba napomenuti da je poznato da je Cxcl1, koji je snažno regulisan jedinjenjem 1, promovisao regrutovanje neutrofila i naknadno ubijanje rezidualnih ćelija raka (Garg et al.2017). Štaviše, Slika 2B pokazuje da jedinjenje 1 indukuje promene ekspresije gena u domaćinu koje su povezane sa razvojem odgovora poput Th-1/M, tj. indukcija IFN-γ, TNF, IL-6 i IL-1β. Podaci takođe sugerišu da može doći do smanjenja TGF beta signalizacije (Slika 2C), što je poznata imunosupresivna signalna staza (Neuzillet et al.2015).

Primer 3: Demonstracija da terapeutske koncentracije jedinjenja 1 i drugih epoksitigliana izazivaju ćelijsku onkozu

Onkoza je oblik nekrotične ćelijske smrti, koju karakteriše oticanje i ruptura subćelijskih organela i naknadna permeabilizacija plazmine membrane, delom zbog gubitka aktivnosti jonske pumpe vođene ATP-om koja održava osmotsku ravnotežu. Pokazalo se da je onkoza imunogene prirode i povezana je sa efikasnošću nekih onkolitičkih virusa i malih molekula razvijenih kao agensi protiv raka (npr. Dyer et al.2016).

Ćelijske linije, reagensi i mediji. A431 (ljudski epidermoidni karcinom), MM649 (ljudski melanom), B16-OVA (ćelijska linija mišjeg melanoma B16-F10 stabilno transfektovana pilećim ovalbuminom), MM415 (ljudski melanom) i FaDu (ljudski hipofaringealni karcinom) ćelije su kultivisane u RPMI-1640, 10% FCS (kompletan medijum) na 37°C, 5% CO2 u vlažnom inkubatoru. Sve ćelijske linije korišćene u ovoj studiji potvrđene su kao negativne na mikoplazmu korišćenjem MycoAlert (Lonza). STR profiliranje je takođe urađeno da bi se potvrdio identitet korišćenih ljudskih ćelijskih linija.

IncuCyte testovi citotoksičnosti. Četiri ćelijske linije raka (A431, MM649 (ljudski melanom), FaDu (HNSCC) i MM415 (ljudski melanom) su procenjene po njihovom odgovoru na tretman epoksitiglianom. Ćelije su postavljene na gustinu od 10.000 ćelija po jažici (100 µl kompletnog medijuma) u crne ploče sa 96 jažica sa čistim dnom (Corning, #3603). Posle 24 h inkubacije, medijum u svakoj jažici je aspiriran i zamenjen sa 50 µl svežeg medijuma koji sadrži 1 µg/ml propidijum jodida (PI). Osnovni rastvori (20 mg/ml u etanolu) četiri epoksitigliana (jedinjenja 1, 2, 3 i 4) su razblaženi do 2× konačne koncentracije testa (1 mM) u identičnom medijumu i ubačeni u ploču sa 96 jažica sa dnom u obliku slova U u pripremi za transfer. 50 µl razblaženja je dodato u potrebne jažice i rezultujuće ploče su ubačene u Essen Biosciences IncuCyte u pripremi za snimanje. Slike su dobijene u različitim vremenskim tačkama (30 min, 1 h i u intervalima po satu) ukupno 24 h.

Testovi oslobađanja laktat dehidrogenaze (LDH). Merenje oslobađanja LDH je dobro priznati test za procenu permeabilizacije plazmine membrane i otkrivanje ćelijske smrti usled nekroze (Chan et al.2013). Tri ćelijske linije (A431, MM649 i B16-OVA) su korišćene u ovim testovima. Ćelije su postavljene gustinom od 10.000 ćelija po jažici u čiste ploče sa 96 jažica (Corning, #3595; 100 µl kompletnog medijuma) i rezultujuće ploče inkubirane preko noći kao što je prethodno opisano. Sledećeg dana, medijum je aspiriran iz svake jažice i ubačeno je 50 µl svežeg medijuma. Osnovni rastvori jedinjenja 1 su razblaženi do

2× konačnih koncentracija testa (1 mM i 600 µM) i 50 µl ovih razblaženja je dodato u potrebne jažice. Kontrolni rastvori sa samim etanolom su takođe sastavljeni i davani. U naznačenim vremenskim tačkama, 50 µl medijuma je uklonjeno i testirano na oslobađanje LDH korišćenjem kompleta za ispitivanje citotoksičnosti Pierce LDH (ThermoFisher Scientific). Očitavanja OD490nm i OD690nm su zabeležena za svaki uzorak korišćenjem čitača ploča Hybrid Synergy H4. Očitavanja apsorpcije iz uzoraka tretiranih lekom su normalizovana na kontrole tretirane deterdžentom da bi se odredio % oslobađanja LDH po jažici.

Intracelularni ATP test. CellTiter-Glo<®>2.0 kompleti za ispitivanje (Promega Corporation), test zasnovan na luminiscenciji koji kvantifikuje količinu ATP-a prisutnog u ćelijama, korišćen za određivanje intracelularnih nivoa ATP-a u kulturama A431 i MM649 izloženim dvema koncentracijama (300 µM i 500 µM) Jedinjenje 1. Ponovo, ćelije su postavljene u gustinu od 10.000 ćelija po jažici u prozirne crne ploče sa 96 jažica (u 100 µl kompletnog medijuma) i inkubirane na 37°C, 5% CO2 preko noći. U vreme testa, medijum je aspiriran iz svake jažice i ubačeno je 50 µl svežeg medijuma. Osnovni rastvori jedinjenja 1 su razblaženi do 2× konačnih koncentracija testa (1 mM i 600 µM) i 50 µl ovih razblaženja je dodato u potrebne jažice. Kontrolni rastvori sa samim etanolom su takođe sastavljeni i davani. U naznačenim vremenskim tačkama, medijum je nežno uklonjen pazeći da se ne ometaju ćelije i dodato je 100 µl CellTiter-Glo<®>2.0 reagensa. Dobijena ploča je mešana na orbitalnom šejkeru 2 minuta da bi se izazvalo razlaganje ćelija nakon čega je inkubirana u mraku 10 minuta. Nakon toga, određen je luminiscentni signal u svakoj jažici. Luminescentni signali iz jažica tretiranih jedinjenjem su normalizovani u jažice tretirane prenosnikom i izraženi kao % intracelularnog ATP-a u odnosu na vreme.

Slike dobijene sa IncuCyte-a pokazale su snažno crveno bojenje nakon 120 minuta u većini ćelija sve četiri ćelijske linije tretiranih sa 500 µM jedinjenja 1, 2, 3 i 4 (A431, FaDu, MM649 i MM415). Nije bilo bojenja ćelija tretiranih samo prenosnikom, što potvrđuje da je gubitak integriteta plazmine membrane ograničen na ćelije tretirane jedinjenjem 1. Pored toga, značajno citoplazmatsko oticanje i „plikovi“ su takođe primećeni u svim ćelijama tretiranim jedinjenjem 1, 2, 3 i 4, iako u različitoj meri i sa različitom kinetikom početka.

Rezultati testova za procenu oslobađanja LDH i za procenu nivoa intracelularnog ATP-a prikazani su na slikama 3A i 3B, respektivno. U poređenju sa kontrolama, došlo je do značajnog oslobađanja LDH iz sve tri ćelijske linije raka tretirane u obe koncentracije jedinjenja 1 koje su testirane (300 µM i 500 µM) (Slika 3A). Intracelularni nivoi ATP-a su veoma brzo opali nakon tretmana sa 500 µM jedinjenja 1 i bili su skoro neotkriveni nakon 60 minuta (Slika 3B). Na 300 µM jedinjenja 1, intracelularni ATP je opadao sporije i manje katastrofalno nego za koncentraciju jedinjenja 1 od 500 µM, što je približno 50% nivoa prethodnog tretmana posle 120 minuta (Slika 3B). Smanjenje ATP-a je ranije bilo povezano sa indukcijom onkoze (Kim et al.2003).

Ovi rezultati pokazuju da jedinjenja epoksitigliana indukuju onkozu u terapijski relevantnim koncentracijama (tj. onim koncentracijama koje su efikasne u izazivanju hemoragijske nekroze in vivo).

Primer 4: Onkoza izazvana jedinjenjem 1 i drugim epoksitiglianima pokazuje karakteristike imunogene ćelijske smrti

Imunogena ćelijska smrt (ICD) je specifičan tip regulisane ćelijske smrti koja rezultira oslobađanjem ili eksternalizacijom medijatora koji se nazivaju molekularni obrasci povezani sa oštećenjem (DAMP), koji stupaju u interakciju sa receptorima eksprimiranim od dendritskih ćelija/makrofaga kako bi promovisali njihovo regrutovanje i stimulisali unos/prezentaciju tumorskih antigena T ćelijama. ICD je istaknuti put za aktivaciju imunog sistema protiv raka. Biohemijska obeležja ICD-a uključuju izlaganje kalretikulina (CALR) i drugih proteina endoplazmatskog retikuluma/mitohondrijalnih proteina na površini umirućih ćelija, i oslobađanje velikih količina ATP-a i kutije 1 grupe visoke pokretljivosti (HMGB1) u vanćelijsku sredinu (Kroemer et al.2013). Ovi parametri su korišćeni za pravljenje tačnih predviđanja o kapacitetu hemoterapeutskih lekova (uključujući doksorubicin, mitoksantron, oksaliplatin i bortezomib) da indukuju ICD (Kroemer et al.2013); Galluzzi et al.2017). Sposobnost epoksitigliana da indukuju ove karakteristike je detaljno opisana u nastavku.

Ćelijske linije, reagensi i mediji. A431 (ljudski epidermoidni karcinom), MM649 (ljudski melanom) i B16-OVA (ćelijska linija mišjeg melanoma B16-F10 stabilno transfektovana pilećim ovalbuminom) kultivisani su u RPMI-1640, 10% FCS (kompletan medijum) na 37°C 5% CO2 u vlažnom inkubatoru. BMDC-ovi su kultivisani u R10 medijumu (RPMI, 10% FCS, 2 mM glutamina, 50 µM betamerkaptoetanola, Pen/Strep). Sve ćelijske linije korišćene u ovoj studiji potvrđene su kao negativne na mikoplazmu korišćenjem MycoAlert (Lonza). STR profiliranje je takođe urađeno da bi se potvrdio identitet korišćenih ljudskih ćelijskih linija.

Testovi oslobađanja ATP-a. Ćelijske linije su postavljene gustinom od 10 000 ćelija po jažici u prozirne ploče sa 96 jažica (Corning, #3595; 100 µl kompletnog medijuma) i rezultujuće ploče inkubirane preko noći kao što je prethodno opisano. Sledećeg dana, medijum je aspiriran iz svake jažice i ubačeno je 50 µl svežeg medijuma. Osnovni rastvori jedinjenja 1, 2, 3 i 4 su razblaženi do 2× konačne koncentracije za ispitivanje (1 mM i 600 µM) i 50 µl ovih razblaženja je dodato u tražene jažice. Kontrolni rastvori sa samim etanolom su takođe sastavljeni i davani. U naznačenim vremenskim tačkama, 80 µl medijuma je uklonjeno, centrifugirano na 1.200 rpm tokom 4 minuta da se talože ostaci ćelija i 50 µl je analizirano na ATP korišćenjem kompleta za ispitivanje ATP zasnovanog na bioluminiscenciji (FLAA, Sigma-Aldrich). Relativne jedinice luminiscencije su snimljene za svaki uzorak korišćenjem čitača ploča Hybrid Synergy H4 (BioTek).

Testovi oslobađanja HMGB1. Ćelijske linije (A431, MM649 i B16-OVA) su postavljene u boce T75 cm<2>(Nunc) u 10 ml kompletnog medijuma i kultivisane na 37°C, 5% CO2 dok nisu dostigle 90% konfluentnosti. Jedinjenja 1, 2, 3 i 4 su razblažena u 5 ml identičnog medijuma do konačne koncentracije od 500 i 300 uM i zatim primenjena na ćelijama. Nekoliko boca je pripremljeno tako da se može uspostaviti kinetička kriva oslobađanja HMGB 1 kao odgovor na lečenje lekovima. Takođe su generisane kontrole samo za etanol. U traženoj vremenskoj tački, medijum je uklonjen iz boce u polipropilensku epruvetu od 10 ml koja je stavljena na led na 5 minuta. Supernatanti ćelijske kulture su centrifugirani na 1.200 rpm tokom 4 minuta da bi se uklonili ćelijski ostaci, nakon čega je 4,5 ml supernatanta ubačeno u centrifugiranu kolonu koncentratora (Amicon<®>Ultra 50 kDa cut-off membrana, Merck) da bi se uklonio FCS. Protok iz ove kolone je zatim ubačen u drugu kolonu koncentratora (Amicon<®>Ultra 10 kDa cut-off membrana, Merck) i centrifugiran na 3.500 rpm da bi se koncentrisao HMGB 1 pre analize putem ELISA (SEA399Hu/SEA399Mu, Cloud-Clone Corp). Vrednosti OD450nm su određene korišćenjem čitača ploča Hybrid Synergy H4 (BioTek). Vrednosti apsorpcije iz uzoraka tretiranih lekom su normalizovane na uzorke tretirane prenosnikom da bi se odredio stepen povećanja oslobađanja HMGB 1 kao odgovor na tretman epoksitiglianom.

Testovi eksternalizacije kalretikulina. Eksternalizacija kalretikulina je određena kao što je prethodno detaljno opisano (Gomez-Cadena et al.2016). Ukratko, ćelije (A431, MM649, B 16-OVA) kultivisane u kompletnom medijumu na 37°C, 5% CO2 su odvojene tripsinizacijom, centrifugirane na 1.200 rpm i isprane ×2 svežim medijumom. Posle dodatnog kruga centrifugiranja, dobijeni talog ćelija je resuspendovan u koncentraciji od 1 × 10<6>ćelija/ml, nakon čega je dodat epoksitiglian do konačne koncentracije od 500 ili 300 µM. Takođe su izvršene kontrole samo na etanol. Suspenzije ćelija su inkubirane na 37°C, 5% CO2 i u naznačenim vremenskim tačkama, 200 µl uzorka je uklonjeno i inkubirano sa LIVE/DEAD fiksiranom dalekom crvenom mrljom tokom 5 minuta na ledu. Nakon toga, ćelije su taložene na 1.200 rpm tokom 4 minuta i isprane × 1 sa PBS.500 µl PBS, 0,25% formaldehida je zatim dodato svakom talogu da bi se izvršila svetlosna fiksacija bez ugrožavanja integriteta plazmine membrane. Nakon toga, ćelije su isprane × 1 sa PBS-om i 100 µl PBS-om, 1 % BSA, 2 mM EDTA (FAC-ov pufer) koji sadrži anti-Calreticulin (ab2907, Abeam); 1:50 razblaživanje) dodat. Posle 1 h inkubacije na sobnoj temperaturi, ćelije su centrifugirane na 1.200 rpm tokom 4 minuta i isprane × 1 sa FAC-ovim puferom pre inkubacije sa 100 µl FAC-ovog pufera koji sadrži anti-rabbit Alexa488 na 1:750 još sat vremena na sobnoj temperaturi. Ćelije su ponovo taložene i zatim resuspendovane u 500 µl FAC-ovih pufera u pripremi za protočnu citometriju.

FSC-H protiv FSC-A uzorke su prvo odredili da bi se identifikovale pojedinačne ćelije, nakon čega je bojena LIVE/DEAD mrlja (npr.640 nm, Em: 670/14) negativna (netaknuta ćelija) populacija je analizirana na zelenu fluorescenciju (npr.: 488 nm, Em: 530/30; eksternalizacija kalretikulina). Srednje vrednosti intenziteta fluorescencije su naknadno određene i prikazane u zavisnosti od vremena.

Rezultati su pokazali da brza onkoza izazvana jedinjenjima epoksitigliana takođe izaziva karakteristike imunogene ćelijske smrti, sa oslobađanjem/ekternalizacijom kritičnih DAMP-ova uključujući ATP (Slike 4A i 4B), HMBG1 (Slika 4C) i kalretikulin (Slika 4D). Došlo je do značajnog oslobađanja ATP-a u roku od 60 minuta u sve tri ćelijske linije raka tretirane sa obe koncentracije jedinjenja 1 (slika 4A) i jedinjenja 2, 3 i 4 (slika 4B). Ova jedinjenja su takođe promovisala oslobađanje HMGB 1 iz ćelijskih linija raka. Nakon što su vrednosti ELISA testa za tretirane ćelije normalizovane na ćelije tretirane prenosnikom da bi se utvrdio stepen povećanja, pokazalo se da jedinjenje 1 povećava oslobađanje HMBG1 u roku od 120 minuta za do 40% za ćelije A341 i MM649 (Slike 4Ci i 4Cii), i za više od 3 puta za B16-OVA ćelije (Slika 4Ciii).

Jedinjenja 2, 3 i 4 koja su takođe analizirana na B 16-OVA ćelijama i pokazala su minimalno dvostruki stepen povećanja oslobađanja HMBG1 iz ove ćelijske linije nakon 120 minuta (Slika 4Civ). Podaci za eksternalizaciju kalretikulina posle tretmana 3 ćelijske linije jedinjenjem 1 pokazali su značajno povećanje srednjeg intenziteta fluorescencije u roku od 60 minuta tretmana (Slika 4D). Poznato je da takvo oslobađanje/eksternalizacija DAMP-ova promoviše regrutovanje ćelija koje predstavljaju antigen, stimuliše efikasno usvajanje antigena povezanih sa ćelijama raka i stimuliše prezentaciju podskupovima T ćelija (Kolaczkowska & Kubes, 2013)

Primer 5: Fragmente ćelija karcinoma tretiranih epoksitiglianom unose CD11c<+>ćelije dobijene iz koštane srži

CD11c je dobro poznat marker DC/makrofaga (Merad et al.2013).

Jedan od načina da se istraži potencijal agensa protiv raka (i povezanih procesa smrti koje oni izazivaju) da promovišu razvoj imunogenih odgovora je da se utvrdi da li oni dovode do preuzimanja ćelijskih komponenti od strane CD 11c<+>dendritskih ćelija/makrofaga i njihovog naknadnog sazrevanja u bone fide ćelije koje predstavljaju antigen (APC-ovi) (Guermonprez et al.2002). Ovde pokazujemo da onkoza izazvana jedinjenjem 1 i srodnim epoksitiglianima dovodi do porasta umirućih komponenti ćelija raka od strane takvih ćelija.

Izolacija i kultura ćelija iz koštane srži (BMDC). Tibije i fibije četiri miša C57Bl/6 stara 7-8 nedelja su prvo hirurški uklonjene u sterilnim uslovima. Srž je isprana iz koštane šupljine sa 10 ml ledeno hladnog medija R10 (pomoću 27G igle/šprica u polipropilensku epruvetu od 50 ml). Ćelije su taložene na 1.500 o/min tokom 5 minuta i isprane ×2 ledeno hladnim R10 medijumom. Nakon resuspenzije taloga u 10 ml ledeno hladnog R10 medijuma, ćelije su izbrojane korišćenjem poboljšanog hemocitometra i postavljene na gustinu od 2×10<6>ćelija po ploči (Petrijeva posuda) u 10 ml R10 dopunjenog sa 20 ng/ml mišjeg GM-CSF. Sve ploče su inkubirane na 37°C, 5% CO2 i 3. dana je dodato dodatnih 10 ml R10 sa 20 ng/ml GM-CSF. Ćelije su ponovo dovedene 6. dana i korišćene za nizvodne analize 7. dana.

Eksperimenti preuzimanja BMDC. Pre ko-inkubacije sa BMDC-ovima, B16-OVA ćelije su tripsinizovane, centrifugirane na 1.200 rpm tokom 4 minuta do taloženih ćelija i isprane ×2 sa kompletnim medijumom. Ćelije su zatim obojene sa 2 µM Cell Tracker Green u kompletnom medijumu tokom 45 minuta, nakon čega su taložene i isprane ×2 kao što je gore navedeno. Obeležene B 16-OVA ćelije su zatim tretirane Jedinjenjima 1, 2, 3 i 4 u dve koncentracije (500 ili 300 µM) u medijumu gustine 1×10<6>ćelija/ml tokom 30 i 60 minuta, nakon čega su ćelije taložene centrifugiranjem, supernatant je uklonjen aspiracijom i ćelijski talog je ispran ×1 kompletnim medijumom. Posle ispiranja, tretirane ćelije su resuspendovane u medijumu R10, ubačene u jažice ploče sa 6 jažica (Corning, #3471. Ultra low attachment surface) i BMDC-ovi dodati. Ko-kulture su inkubirane 4 h, nakon čega su ćelijske suspenzije prebačene u epruvetu za mikrofugiranje i centrifugirane na 1.500 rpm tokom 5 minuta. Talozi su resuspendovani u 100 µl FAC-ova pufera koji sadrži anti-CD11c-APC i inkubirane 10 minuta na 4°C. Ćelije su ponovo taložene, isprane ×1 sa FAC-ovim puferom i zatim fiksirane korišćenjem PBS, 1% formaldehida tokom 10 minuta. Posle centrifugiranja i uklanjanja supernatanta, ćelije su resuspendovane u 500 µl FAC-ovog pufera u pripremi za protočnu citometriju.

Uzorci su prvo bili zatvoreni pomoću FSC-H v FSC-A, zatim SSC-H v SS-A da bi se identifikovale pojedinačne ćelije. Udeo CD11c<+>ćelija (Ex: 640nm, Em: 670/14) sa CMFDAmid (Ex: 488nm, Em: 530/30) je zatim određen za tretirane i netretirane ćelije kao procenat svih CD11c<+>ćelija.

Rezultati (Slike 5A i 5B) pokazuju da onkoza izazvana Jedinjenjem 1 promoviše uzimanje (tj. efektivno gutanje) fragmenata umirućih ćelija raka od strane CD11c<+>dendritskih ćelija/makrofaga. Čini se da ovo gutanje zavisi i od koncentracije Jedinjenja 1 i od vremena tretmana, tako da se pri 500 µM unos antigena Jedinjenja 1 dešava u većoj meri nakon kraćeg vremena tretmana u poređenju sa upotrebom 300 µM. Ovo je u skladu sa kinetikom onkoze uočenom u Primeru 3. Slika 5C pokazuje da su Jedinjenja 2, 3 i 4 takođe sposobna da indukuju odgovor ćelijske smrti koji je imunogen in vitro, tj. promoviše uzimanje od strane CD11c<+>BMDC-ova.

Primer 6: Kombinacija Jedinjenja 1 sa inhibitorima imunološke kontrolne tačke

Terapije inhibitorima imunološke kontrolne tačke, posebno one koje ciljaju receptore uključene u imunosupresiju T ćelija (npr. citotoksični protein povezan sa T-limfocitima 4 (CTLA-4) ili programirana smrt 1 (PD-1) i njen ligand PD-L1), značajno su poboljšali ishod pacijenata kod nekoliko tipova karcinoma u kasnoj fazi, uključujući melanom, karcinom bubrežnih ćelija, rak mokraćne bešike i karcinom skvamoznih ćelija glave i vrata (HNSCC) (Msaouel & Massarelli 2016; Sharma & Allison 2015). Međutim, primarna i de novo rezistencija na ove ICI lekove je značajan klinički problem. Štaviše, opsežno kliničko praćenje je pokazalo da neki pacijenti sa melanomom razvijaju otpornost na lečenje i dožive relaps bolesti (O'Donnell et al., 2017). Terapije koje kombinuju ICI-ove sa jedinjenjima koja mogu da deluju kao pomoćna sredstva promovišući imunogenu ćelijsku smrt (naročito dovodeći do povećane infiltracije imunih ćelija u parahejmu tumora i uzimanje/prezentaciju antigena) obećavaju da će prevazići neka ograničenja ICI-ova i poboljšati ukupne kliničke ishode (Workenhe et al.2014; Ribas et al.2017). Ovde i u Primeru 7, podaci ispituju kombinacije ICI-ova i intralezijske injekcije Jedinjenja 1.

Šematski prikaz eksperimentalnog pristupa može se videti na Slici 6A. Ukratko, miševima C57BL/6 starim 6-7 nedelja su ubrizgane supkutano (sc) na oba boka ćelije mišjeg melanoma B16-F10-OVA (2×10<5>ćelija po mestu u 100 µl).

Tumorima je dozvoljeno da se razviju do približno 5-50 mm<3>, nakon čega je 200 µg anti-PD-1 (RMP1-14, BioXCell), anti-CTLA-4 (9H10, BioXCell) ili kontrolnog antitela izotipa (2A3 i Syrian Hamster IgG, BioXCell) ubrizgano intraperitonealno po mišu (dan -2). Dana 0, oba tumora su injektirana intrarektalno sa Jedinjenjem 1 (15 µg u 50 µL) ili samo sa prenosnikom (Pren.). Svaki miš je dobio dodatnu intraperitonealnu injekciju istog antitela koje je primenjeno na dan -2 (opet, 200 µg). Antitelo je davano još 3 puta putem intraperitonealne injekcije svaka 2 dana. Zapremina tretiranih tumora je merena pomoću klešta kao što je prethodno detaljno opisano (Boyle et al.

2014) i preživljavanje miša je određeno tokom vremena.

Rezultati prikazani na Slikama 6B i 6C pokazuju da Jedinjenje 1 može da se kombinuje sa anti-PD-1 i anti-CTLA-4 da ograniči rast tumora i poboljša preživljavanje miševa u većoj meri nego tretman sa jednim agensom. Čini se da ovaj efekat zavisi od koncentracije za svaku kombinaciju Jedinjenje 1/ICI. Na primer, injekcija 30 µg Jedinjenja 1 zajedno sa anti-PD-1 dovodi do poboljšanog preživljavanja/smanjenog rasta tumora u poređenju sa upotrebom samo 30 µg Jedinjenja 1 (Slika 6Biii, iv). Ovo se ne primećuje kada se 15 µg Jedinjenja 1 koristi u istim kombinacijama, tj. nema poboljšanja u preživljavanju ili rastu tumora (Slika 6Bi, ii). Situacija je obrnuta kada se koristi anti-CTLA4, gde 15 µg Jedinjenja 1 u kombinovanom tretmanu (Slika 6Ci, ii) daje optimalan odgovor, a 30 µg Jedinjenja 1 ne (Slika 6Ciii, iv).

Primer 7: Posmatranje abskopskih efekata kada se koristi Jedinjenje 1 u kombinaciji sa inhibitorima imunološke kontrolne tačke

Šematski prikaz eksperimentalnog pristupa može se videti na Slici 7A. Ukratko, miševima C57BL/6 starim 6-7 nedelja ubrizgane su supkutanom injekcijom na oba boka ćelije melanoma miša B16-F10-OVA (2×10<5>ćelija po mestu u 100 µl). Tumorima je dozvoljeno da se razviju do približno 5-50 mm<3>, nakon čega je 200 µg anti-PD-1 (RMP1-14, BioXCell), anti-CTLA-4 (9H10, BioXCell) ili kontrolnog antitela izotipa (2A3, BioXCell) ubrizgano intraperitonealno po mišu (dan -2). Dana 0, najvećem od dva tumora (približno 50-75 mm<3>) je ubrizgano intrarektalno ili sa Jedinjenjem 1 (15 µg u 50 µL) ili samo prenosnikom (Pren.). Preostali tumor je ostavljen nelečen i svaki miš je dobio dodatnu intraperitonealnu injekciju istog antitela koje je primenjeno na dan -2 (opet, 200 µg). Antitelo je davano još 3 puta putem intraperitonealne injekcije svaka 2 dana. Volumen i lečenih i nelečenih tumora je meren tokom eksperimenta kao što je prethodno detaljno opisano.

Rezultati su prikazani na Slici 7B. Rezultati pokazuju da ne samo da su tumori tretirani kombinacijom antitela i Jedinjenja 1 efikasno ablatirani, već da su neki nelečeni susedni tumori takođe pokazali odgovor na kombinovanu terapiju koji nije primećen ni sa jednim od drugih agenasa samostalno.

Primer 8: Supresorske ćelije izvedene iz mijeloida mogu uticati na efikasnost niske doze Jedinjenja 1

Supresorske ćelije izvedene iz mijeloida (MDSC-ovi) su nezrele mijeloidne ćelije koje mogu da potisnu imuni odgovor domaćina na tumore putem više puteva (Qu et al.2016). Koristili smo nokaut miševe C57BL/6 koji stimulišu koloniju granulocita (GCSF) da bismo obezbedili model za procenu budućeg potencijala za moguće kombinovane terapije koje uključuju Jedinjenje 1 sa molekulima koji inhibiraju ili blokiraju proteine (npr. indoleamin 2,3-dioksigenaza (IDO)) povezane sa angažovanjem i funkcijom MDSC-a. GCSF, suštinski regulator proizvodnje i razmene neutrofila, takođe igra ključnu ulogu u migraciji i proliferaciji MDSC-ova (Li et al.2016). Koristeći naš GCSFR nokaut model ispitana je moguća uloga MSDC-ova dobijenih iz granulocita u ograničavanju efikasnosti monoterapije (u suboptimalnoj dozi) Jedinjenja 1 protiv MC38 kolorektalnih adenokarinkoma.

Ukratko, 6-7 nedelja starim wt C57BL/6 i gcsfr<-/->miševima su ubrizgane supkutane injekcije na oba boka sa MC38 ćelijama mišjeg kolorektalnog karcinoma (1×10<6>ćelija po mestu u 100 µl). Tumori su ostavljeni da se razviju do približno 5-50 mm<3>, nakon čega je intrarektalno ubrizgano 15 µg Jedinjenja 1 ili prenosnika (Pren.). (50 µl). Zapremina tretiranih tumora je praćena kao što je prethodno detaljno opisano u Primerima 6 i 7. Poređenja veličine tumora i preživljavanja između tumora u koje je ubrizgano Jedinjenje 1 kod divljeg tipa (wt) i GCSFR nokaut miševa mogu se videti na Slici 8.

S obzirom na ulogu GCSFR-a u regrutovanju granulocita, ovi podaci sugerišu da takva infiltracija imunih ćelija može ograničavati efikasnost Jedinjenja 1 protiv raka u poznatoj suboptimalnoj dozi (15 µg). Kombinacije Jedinjenja 1 ili analoga sa jedinjenjima koja sprečavaju razvoj takvih imunosupresivnih populacija ćelija (npr. IDO inhibitori) mogu na taj način dovesti do bolje efikasnosti u borbi protiv raka i poboljšati preživljavanje pacijenata.

Reference

Podrazumeva se da, ako se ovde pominje bilo koja publikacija iz predmetne oblasti, takva referenca ne predstavlja priznanje da ta publikacija čini deo opšteg znanja u oblasti, u Australiji ili bilo kojoj drugoj zemlji.

Adams et al.2015. Big opportunities for small molecules in immunooncology. Nature Reviews Drug Discovery 14, 603-622.

Anel et al.2012. Protein kinase C θ (PKCθ) in natural killer cell function and anti-tumour immunity. Frontiers in Immunology 3, 187.

Beyaert R i Fiers W.1994. Molecular mechanisms of tumor necrosis factor-induced cytotoxicity. What we do understand and what we do not. FEBS Letters 340:9-16.

Bos i Sherman.2010. CD4+ T-cell help in the tumor milieu is required for recruitment and cytolytic function of CD8+ T lymphocytes. Cancer Research 70: 8368-8377.

Boyle et al.2014. Intralesional injection of the novel PKC activator EBC-46 rapidly ablates tumours in mouse models. PLoS One 9, e108777.

Brezar et al.2015. PKC-Theta in regulatory and effector T-cell functions. Frontiers in Immunology 6, 530.

Burkholder et al.2014. Tumor-induced perturbations of cytokines and immune cell networks. BBA-Reviews on Cancer.1845: 182-201.

Chan et al.2013. Detection of necrosis by release of lactate dehydrogenase activity. Methods Molecular Biology 979: 65-70.

Cohen et al.2000. CD4+ T cells in adoptive immunotherapy and the indirect mechanism of tumor rejection. Critical Reviews Immunolology 2: 85-95.

DeNardo et al. 2010. Interactions between lymphocytes and myeloid cells regulate pro-versus anti-tumor immunity. Cancer and Metastasis Reviews 29: 309-316.

Dyer et al.2016. Oncolytic group B enadenotucirev mediates nonapoptotic cell death with membrane disruption and release of inflammatory mediators. Molecular Therapy Oncolytics.4: 18-30.

Fridman et al.2012. The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome. Nature Reviews Cancer 12: 298-306.

Gabrilovic et al.2012. Coordinated regulation of myeloid cells by tumours. Nature Reviews Immunology 12: 253-268.

Galluzzi et al.2017. Immunogenic cell death in cancer and infectious disease. Nature Reviews Immunology 17: 97-111.

Garg et al.2017. Pathogen response-like recruitment and activation of neutrophils by sterile immunogenic dying cells drives neutrophil-mediated residual cell killing. Cell Death Differentiation. Advance online publication 24 February 2017.

Gomez-Cadena et al.2016. Immune-system-dependent anti-tumour activity of a plant-derived polyphenol rich fraction in a melanoma mouse model. Cell Death and Disease 7: e2243.

Guermonprez et al.2002. Antigen presentation and T cell stimulation by dendritic cells. Annual Review of Immunology 20: 621-667.

Haabeth et al.2011. Inflammation driven by tumour-specific Th1 cells protects against B-cell cancer. Nature Communications 2: 240.

Haabeth et al.2016. Interleukin-1 is required for cancer eradication mediated by tumor-specific Th1 cells. Oncoimmunology 5 (1): e1039763.

Haabeth OA & Corthnay A.2012. A model for cancer-suppressive inflammation. Oncoimmunology.1 (7): 1146-1155.

Hori et al.1989. Role of tumor necrosis factor and interleukin 1 in gamma-interferon-promoted activation of mouse tumoricidal macrophages. Cancer Research 49:2606-2614.

Hu-Lieskovan et al.2017. New combination strategies using Programmed Cell Death 1/Programmed Cell Death Ligand 1 checkpoint inhibitors as a backbone. The Cancer Journal 23, 10-22.

Kang et al.2001. PKCP modulates antigen receptor signaling via regulation of Btk membrane localisation. EMBO J 20, 5692-5702.

Kim et al.2003. Mitochondrial permeability transition: a common pathway to necrosis and apoptosis. Biochemical Biophysical Research Communications 304: 463-470.

Knutson KL & Disis ML.2005. Tumor antigen-specific T helper cells in cancer immunity and immunotherapy. Cancer Immunol Immunother.54:721-728.

Kolaczkowska E & Kubes P 2013. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology 13: 159-175.

Kroemer et al.2013. Immunogenic cell death in cancer therapy. Annual Reviews Immunology 31: 51-72.

Li et al.2016. G-CSF is a key modulator of MSC and could be a potential therapeutic target in colitis-associated colorectal cancers. Protein Cell 7: 130-140.

Lim et al.2015. Protein kinase C in the immune system: from signaling to chromatin regulation. Immunology 146, 508-522.

Mahoney et al.2015. Combination cancer immunotherapy and new immunomodulatory targets. Nature Reviews Drug Discovery 14, 561-585.

Merad et al.2013. The Dendritic Cell Lineage: Ontogeny and Function of Dendritic Cells and Their Subsets in the Steady State and the Inflamed Setting. Annual Review of Immunology 31: 563-604.

Msaouel P & Massarelli E 2016. Immune Checkpoint Therapy in Head and Neck Cancers. The Cancer Journal.22: 108-116.

Neuzillet et al.2015. Targeting the TGFβ pathway for cancer therapy. Pharmacology & Therapeutics 147: 22-31.

O'Brien et al.2014. Local ablative therapies: Opportunities for maximising immune engagement and activation. BBA Reviews Cancer 1846: 510-523.

O'Donnell et al.2017. Resistance to PD1/PDL1 checkpoint inhibition. Cancer Treatment Reviews 52: 71-81.

Pages et al.2010. Immune infiltration in human tumors: a prognostic factor that should not be ignored. Oncogene, 29: 1093-1102.

Pfeifhofer et al.2006. PKCα is expressed in T-cells and knockout mice have T-cell activation and immunity defects. Journal of Immunology 176, 6004-6011.

Qu et al.2016. Expansion and functions of myeloid derived suppressor cells in the tumour microenvironment. Cancer Letters 380: 253-256.

Ribas et al.2017. Oncolytic Virotherapy Promotes Intratumoral T Cell Infiltration and Improves Anti-PD-1 Immunotherapy. Cell 170(6):1109-19.e 10.

Senovilla et al.2012. Trial watch: prognostic and predictive value of the immune infiltrate in cancer. Oncoimmunology 1: 1323-1343.

Sharma P & Allison JP 2015. The future of immune checkpoint therapy. Science. 348(6230):56-61.

Smyth et al.2015. Combination cancer immunotherapies tailored to the tumour microenvironment. Nature Reviews Clinical Oncology 13, 143-158.

Sugarman et al.1985. Recombinant human tumor necrosis factor-alpha: effects on proliferation of normal and transformed cells in vitro. Science 230:943-945.

Workenhe et al.2014. Immunogenic HSV-mediated oncolysis shapes the antitumor immune response and contributes to therapeutic efficacy. Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy.22: 123-31.

_____________________

Claims

PATENTNI ZAHTEVI 1. Jedinjenje epoksitigliana ili njegova farmaceutski prihvatljiva so i inhibitor imunološke kontrolne tačke za upotrebu u lečenju tumora; naznačeno time što je jedinjenje epoksitigliana jedinjenje formule (I):

ili geometrijski izomer ili stereoizomer ili njihova farmaceutski prihvatljiva so; naznačeno time što: R1 je vodonik ili C1-6alkil; R2 je -OH ili -OR9; R3 je -OH ili -OR9; R4 i R5 se nezavisno biraju između vodonika i C1-6alkila; R6 je vodonik ili -R10; R7 je hidroksi ili OR10; R8 je vodonik ili C1-6alkil; R9 je -C1-20alkil, -C2-20alkenil, -C2-20alkinil, -C (O)C1-20alkil, -C(O)C2- 20alkenil, -C(O)C2-20alkinil, - C(O)cikloalkil, -C(O)C1-10alkilcikloalkil; -C(O)C2-10alkenilcikloalkil, -C(O)C2-10alkinilcikloalkil, -C(O)aril, -C(O)C 1-10alkilaril, -C(O)C2-10alkenilaril, -C(O)C2-10alkinilaril, -C(O)C1-10alkilC(O)R11, -C(O)C210alkenilC(O)R11, -C (O)C2-10alkinilC(O)R11, -C(O)C1-10alkilCH(OR11)(OR11), -C(O)C2-10alkenilCH(OR11)(OR11), -C(O)C2-10alkinilCH(OR11)(OR11), -C(O)C1- 10alkilSR11, -C(O)C2-10alkenilSR11, -C(O)C2-10 alkinilSR11, -C(O)C1- 10alkilC(O)OR11, -C(O)C2-10alkenilC(O)OR11, -C(O)C2-10alkinilC(O)OR11, -C(O)C1- 10alkilC(O)SR11, -C(O)C2-10alkenilC(O)SR11, - C(O)C2-10alkinilC(O)SR11,

ili

R10 je -C1-6alkil, -C2-6alkenil, -C2-6alkinil, -C (O)C1-6alkil, -C(O)C2-6alkenil, -C(O)C2-6alkinil, - C(O)aril, -C(O)C1-6alkilaril, -C(O)C2-6alkenilaril, ili -C(O)C 2-6alkinilaril; i R11 je vodonik, -C1-10alkil, -C2-10alkenil, -C2-10alkinil, cikloalkil ili aril; naznačeno time što je svaka alkil, alkenil, alkinil, cikloalkil ili aril grupa opciono supstituisana; naznačeno time što je inhibitor imunološke kontrolne tačke antagonist jednog od sledećih receptora programirane smrti 1 (PD-1), njegovog liganda PD-L1 i proteina 4 povezanog sa citotoksičnim T-limfocitom (CTLA-4).
2. Jedinjenje epoksitigliana ili njegova farmaceutski prihvatljiva so i inhibitor imunološke kontrolne tačke; za upotrebu u lečenju ili prevenciji jednog ili više tumora obližnjih ćelija; naznačeno time što je jedinjenje epoksitigliana za lokalnu primenu na tumor koji nije jedan ili više tumora obližnjih ćelija; naznačeno time što je jedinjenje epoksitigliana jedinjenje formule (I):

ili geometrijski izomer ili stereoizomer ili njihova farmaceutski prihvatljiva so; naznačeno time što: R1 je vodonik ili C1-6alkil; R2 je -OH ili -OR9; R3 je -OH ili -OR9; R4 i R5 se nezavisno biraju između vodonika i C1-6alkila; R6 je vodonik ili -R10; R7 je hidroksi ili OR10; R8 je vodonik ili C1-6alkil; R9 je -C1-20alkil, -C2-20alkenil, -C2-20alkinil, -C (O)C1-20alkil, -C(O)C2-20alkenil, -C(O)C2-20alkinil, - C(O)cikloalkil, -C(O)C1-10alkilcikloalkil; -C(O)C2-10alkenilcikloalkil, -C(O)C2-10alkinilcikloalkil, -C(O)aril, -C(O)C 1-10alkilaril, -C(O)C2-10alkenilaril, -C(O)C2-10alkinilaril, -C(O)C1-10alkilC(O)R11, -C(O)C2-10alkenilC(O)R11, -C (O)C2-10alkinilC(O)R11, -C(O)C1-10alkilCH(OR11)(OR11), -C(O)C2-10alkenilCH(OR11)(OR11), -C(O)C2-10alkinilCH(OR11)(OR11), -C(O)C1-10alkilSR11, -C(O)C2-10alkenilSR11, -C(O)C2-10 alkinilSR11, -C(O)C1-10alkilC(O)OR11, -C(O)C2-10alkenilC(O)OR11, -C(O)C2-10alkinilC(O)OR11, -C(O)C1-10alkilC(O)SR11, -C(O)C2-10alkenilC(O)SR11, - C(O)C2-10alkinilC(O)SR11,

ili

R10 je -C1-6alkil, -C2-6alkenil, -C2-6alkinil, -C (O)C1-6alkil, -C(O)C2-6alkenil, -C(O)C2-6alkinil, - C(O)aril, -C(O)C1-6alkilaril, -C(O)C2-6alkenilaril, ili -C(O)C 2-6alkinilaril; i R11 je vodonik, -C1-10alkil, -C2-10alkenil, -C2-10alkinil, cikloalkil ili aril; naznačeno time što je svaka alkil, alkenil, alkinil, cikloalkil ili aril grupa opciono supstituisana; i naznačeno time što je inhibitor imunološke kontrolne tačke antagonist jednog od sledećih receptora programirane smrti 1 (PD-1), njegovog liganda PD-L1 i proteina 4 povezanog sa citotoksičnim T-limfocitima (CTLA-4), i naznačeno time što se termin „tumor obližnjih ćelija" odnosi na tumor koji nije tumor koji se leči jedinjenjem epoksitigliana.
3. Jedinjenje epoksitigliana i inhibitor imunološke kontrolne tačke za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, naznačeno time što je jedinjenje epoksitigliana za lokalnu primenu na tumor, posebno za intratumoralnu injekciju.
4. Jedinjenje epoksitigliana i inhibitor imunološke kontrolne tačke za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, naznačeno time što je inhibitor imunološke kontrolne tačke za sistemsku primenu, posebno parenteralnom injekcijom.
5. Jedinjenje epoksitigliana i inhibitor imunološke kontrolne tačke za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, naznačeno time što se primenjuje jedno ili više od sledećeg: i) R1 je -CH3; ii) R2 i R3 se nezavisno biraju između -OC(O)C1-20alkil, -OC(O)C2-20alkenil, -OC(O)C2-20alkinil, -OC(O)cikloalkil, -OC(O)C1-10alkilcikloalkila; -OC(O)C2- 10alkenilcikloalkil, -OC(O)C2-10alkinilcikloalkil, -OC(O)aril, -OC(O)C1 -10alkilaril, -OC(O)C2-10alkenilaril, -OC(O)C2-10alkinilaril, -OC(O)C 1-10alkilC(O)R11, -OC(O)C2- 10alkenilC(O)R11, -OC( O)C2-10alkinilC(O)R11, -OC(O)C1-10alkilCH(OR11 )(OR11), -OC(O)C2-10alkenilCH(OR11)(OR11), - OC(O)C2-10alkinilCH(OR11)(OR11), -OC(O)C1-10alkilSR11, -OC(O)C2-10alkenilSR11, -OC(O)C2-10alkinilSR 11, -OC(O)C1-10alkilC(O)OR11, - OC(O)C2-10alkenilC(O)OR11, -OC(O)C2- 10alkinilC(O)OR11, -OC(O)C1-10alkilC(O)SR11, -OC(O)C2-10alkenilC(O)SR11 i -OC (O)C2-10alkinilC(O)SR11; posebno -OC(O)C1-20alkil, -OC(O)C2-20alkenil, -OC(O)C2- 20 alkinil, -OC(O)cikloalkil, -OC(O)C1-10alkilcikloalkil; -OC(O)C2-10alkenilcikloalkil, -OC(O)C2-10alkinilcikloalkil i -OC(O)aril, posebno -OC(O)C1-20alkil, -OC(O)C2- 20alkenil i -OC(0)C2-20alkinil; iii) R4 i R5 su svaki nezavisno odabrani od H i -CH3; iv) R6 je vodonik, -C(O)C1-6alkil, -C(O)C2-6alkenil, -C( O)C2-6alkinil ili - C(O)aril; v) R7 je hidroksil, -OC(O)C1-6alkil, -OC(O)C2-6alkenil ili -OC( O)C2-6alkinil; i vi) R8 je H ili -CH3.
6. Jedinjenje epoksitigliana i inhibitor imunološke kontrolne tačke za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, naznačeno time što je jedinjenje formule (I) jedinjenje formule (II):

ili geometrijski izomer ili stereoizomer ili njihova farmaceutski prihvatljiva so; naznačeno time što su R6, R7 i R9 kao što je definisano u patentnom zahtevu 1.
7. Jedinjenje epoksitigliana i inhibitor imunološke kontrolne tačke za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, naznačeno time što je jedinjenje epoksitigliana formule (II) izabrano od sledećih jedinjenja: 12-tigloil-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tiglien-3-on; 12,13-di-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tiglien-3-on; 12-heksanoil-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tiglien-3-on; 12,13-diheksanoil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tiglien-3-on; 12-miristoil-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tiglien-3-on; 12-tigloil-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13-pentahidroksi-20-acetiloksi-1-tiglien-3-on; 12-miri stoil-13-acetiloksi-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tiglien-3-on; 12-prop anoil-13-2-metilbutanoil)-6,7-ep oksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tiglien-3-on; 12,13-ditigloil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tiglien-3-on; i 12-(2-metilbutanoil)-13-tigloil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tiglien-3-on; ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
8. Jedinjenje epoksitigliana i inhibitor imunološke kontrolne tačke za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, naznačeno time što je inhibitor imunološke kontrolne tačke antagonist receptora programirane smrti 1 (PD-1) ili proteina 4 povezanog sa citotoksičnim T-limfocitom (CTLA-4).
9. Jedinjenje epoksitigliana i inhibitor imunološke kontrolne tačke za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, naznačeno time što se inhibitor imunološke kontrolne tačke primenjuje u više doza.
10. Jedinjenje epoksitigliana i inhibitor imunološke kontrolne tačke za upotrebu prema patentnom zahtevu 9, naznačeno time što se višestruke doze daju pre, istovremeno sa i/ili posle davanja jedinjenja epoksitigliana.
11. Epoksitiglian jedinjenje i inhibitor imunološke kontrolne tačke za upotrebu prema patentnom zahtevu 10, naznačen time što se prva doza inhibitora imunološke kontrolne tačke primenjuje pre primene jedinjenja epoksitigliana ili naznačeno time što se doza inhibitora imunološke kontrolne tačke primenjuje istovremeno sa jedinjenjem epoksitigliana ili naznačeno time što se jedna ili više doza inhibitora imunološke kontrolne tačke primenjuje nakon primene jedinjenja epoksitigliana.
12. Farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenje epoksitigliana ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i inhibitor imunološke kontrolne tačke i opciono farmaceutski prihvatljiv nosač; naznačeno time što je jedinjenje epoksitigliana jedinjenje formule (I):

ili geometrijski izomer ili stereoizomer ili njihova farmaceutski prihvatljiva so; naznačeno time što R1 je vodonik ili C1-6alkil; R2 je -OH ili -OR9; R3 je -OH ili -OR9; R4 i R5 se nezavisno biraju između vodonika i C1-6alkila; R6 je vodonik ili -R10; R7 je hidroksi ili OR10; R8 je vodonik ili C1-6alkil; R9 je -C1-20alkil, -C2-20alkenil, -C2-20alkinil, -C (O)C1-2oalkil, -C(O)C2-20alkenil, -C(O)C2-20alkinil, - C(O)cikloalkil, -C(O)C1-10alkilcikloalkil; -C(O)C2-10alkenilcikloalkil, -C(O)C2-10alkinilcikloalkil, -C(O)aril, -C(O)C 1-10alkilaril, -C(O)C2-10alkenilaril, -C(O)C2-10alkinilaril, -C(O)C1-10alkilC(O)R11, -C(O)C2-10alkenilC(O)R11, -C (O)C2-10alkinilC(O)R11, -C(O)C1-10alkilCH(OR11)(OR11), -C(O)C2-10alkenilCH(OR11)(OR11), -C(O)C2-10alkinilCH(OR11)(OR11), -C(O)C1-10alkilSR11, -C(O)C2-10alkenilSR11, -C(O)C2-10 alkinilSR11, -C(O)C1-10alkilC(O)OR11, -C(O)C2-10alkenilC(O)OR11, -C(O)C2-10alkinilC(O)OR11, -C(O)C1-10alkilC(O)SR11, -C(O)C2-10alkenilC(O)SR11, - C(O)C2-10alkinilC(O)SR11,

ili

R10 je -C1-6alkil, -C2-6alkenil, -C2-6alkinil, -C (O)C1-6alkil, -C(O)C2-6alkenil, -C(O)C2-6alkinil, - C(O)aril, -C(O)C1-6alkilaril, -C(O)C2-6alkenilaril, ili -C(O)C 2- 6alkinilaril; i R11 je vodonik, -C1-10alkil, -C2-10alkenil, -C2-10alkinil, cikloalkil ili aril; naznačeno time što je svaka alkil, alkenil, alkinil, cikloalkil ili aril grupa opciono supstituisana; naznačeno time što je inhibitor imunološke kontrolne tačke antagonist jednog od sledećih receptora programirane smrti 1 (PD-1), njegovog liganda PD-L1 i proteina 4 povezanog sa citotoksičnim T-limfocitom (CTLA-4).
13. Komplet koji sadrži sastav koji sadrži jedinjenje epoksitigliana i sastav koji sadrži inhibitor imunološke kontrolne tačke; naznačeno time što je jedinjenje epoksitigliana jedinjenje formule (I):

ili geometrijski izomer ili stereoizomer ili njihova farmaceutski prihvatljiva so; naznačeno time što R1 je vodonik ili C1-6alkil; R2 je -OH ili -OR9; R3 je -OH ili -OR9; R4 i R5 se nezavisno biraju između vodonika i C1-6alkila; R6 je vodonik ili -R10; R7 je hidroksi ili OR10; R8 je vodonik ili C1-6alkil; R9 je -C1-20alkil, -C2-20alkenil, -C2-20alkinil, -C (O)C1-20alkil, -C(O)C2-20alkenil, -C(O)C2-20alkinil, - C(0)cikloalkil, -C(0)C1-10alkilcikloalkil; -C(O)C2-10alkenilcikloalkil, -C(O)C2-10alkinilcikloalkil, -C(O)aril, -C(O)C 1-10alkilaril, -C(O)C2-10alkenilaril, -C(O)C2-10alkinilaril, -C(O)C1-10alkilC(O)R11, -C(O)C2-10alkenilC(O)R11, -C (O)C2-10alkinilC(O)R11, -C(O)C1-10alkilCH(OR11)(OR11), -C(O)C2-10alkenilCH(OR11)(OR11), -C(O)C2-10alkinilCH(OR11)(OR11), -C(O)C1-10alkilSR11, -C(O)C2-10alkenilSR11, -C(O)C2-10 alkinilSR11, -C(O)C1-10alkilC(O)OR11, -C(O)C2-10alkenilC(O)OR11, -C(O)C2-10alkinilC(O)OR11, -C(O)C1-10alkilC(O)SR11, -C(O)C2-10alkenilC(O)SR11, - C(O)C2-10alkinilC(O)SR11,

ili

R10 je -C1-6alkil, -C2-6alkenil, -C2-6alkinil, -C (O)C1-6alkil, -C(O)C2-6alkenil, -C(O)C2-6alkinil, - C(O)aril, -C(O)C1-6alkilaril, -C(O)C2-6alkenilaril, ili -C(O)C 2- 6alkinilaril; i R11 je vodonik, -C1-10alkil, -C2-10alkenil, -C2-10alkinil, cikloalkil ili aril; naznačeno time što je svaka alkil, alkenil, alkinil, cikloalkil ili aril grupa opciono supstituisana; i naznačeno time što je inhibitor imunološke kontrolne tačke antagonist jednog od sledećih receptora programirane smrti 1 (PD-1), njegovog liganda PD-L1 i proteina 4 povezanog sa citotoksičnim T-limfocitom (CTLA-4).
14. Komplet prema patentnom zahtevu 13 koji sadrži jednu ili više doza jedinjenja epoksitigliana i jednu ili više doza inhibitora imunološke kontrolne tačke.
15. Komplet prema patentnom zahtevu 13 ili 14 koji sadrži jednu ili više doza jedinjenja epoksitigliana formulisanog za topikalnu primenu i jednu ili više doza inhibitora imunološke kontrolne tačke formulisanog za primenu injekcijom.
16. Komplet prema patentnom zahtevu 13 ili 14 koji sadrži jednu dozu jedinjenja epoksitigliana formulisanog za intratumoralnu injekciju i jednu ili više doza inhibitora imunološke kontrolne tačke formulisanog za primenu injekcijom.