ES2953575T3 - Terapia de combinación para el tratamiento o la prevención de tumores - Google Patents

Terapia de combinación para el tratamiento o la prevención de tumores Download PDF

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Jason Kingsley Cullen
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Peter Gordon Parsons
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Abstract

La presente invención se refiere a una terapia combinada para tumores que comprende la administración de un compuesto de epoxitigliano y un inhibidor de puntos de control inmunológico. En realizaciones particulares, existe un método para tratar un tumor y/o tratar o prevenir uno o más tumores espectadores con la terapia. También se describen composiciones farmacéuticas y kits que contienen compuestos de epoxitigliano e inhibidores de puntos de control inmunológico. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Terapia de combinación para el tratamiento o la prevención de tumores
Campo de la invención
La presente invención se refiere a una terapia de combinación para tumores que comprende la administración de un compuesto de epoxitigliano de fórmula (I) y un inhibidor de puntos de regulación inmunitarios como se especifica adicionalmente en el presente documento. También se describen composiciones farmacéuticas y kits que contienen compuestos de epoxitigliano de fórmula (I) y determinados inhibidores de puntos de regulación inmunitarios.
Antecedentes de la invención
Los compuestos de epoxitiglienona tienen una potente actividad antitumoral. Cuando se administran por vía intratumoral, las epoxitiglienonas inician una necrosis hemorrágica rápida de la masa tumoral interrumpiendo directamente la vasculatura tumoral (Boyle y col. 2014). Hasta la fecha, no hay evidencia de que la administración localizada de compuestos de epoxitiglienona tenga efectos sistémicos sobre tumores vecinos o más distantes y se considera que los compuestos de epoxitiglienona suministrados por vía intratumoral actúan principalmente en el sitio de tratamiento. Como consecuencia, cada tumor debe tratarse individualmente.
El documento WO2007/070985 describe un número de compuestos de epoxitigliano que han demostrado actividad antineoplásica.
Las inmunoterapias para el tratamiento del cáncer están ganando una amplia aceptación en la clínica. En particular, los inhibidores de puntos de regulación inmunitarios (ICI, por sus siglas en inglés) han demostrado ser prometedores en una gama de tumores malignos, incluyendo el melanoma metastásico avanzado, el cáncer de pulmón no microcítico, el cáncer renal, el cáncer de vejiga y el linfoma de Hodgkin. Los ICI son moléculas (típicamente, anticuerpos monoclonales) que bloquean la acción de las proteínas que permiten que las células tumorales evadan, supriman o resistan el sistema inmunológico del hospedador, especialmente los linfocitos T que son específicos para antígenos tumorales. Los inhibidores de puntos de regulación de linfocitos T aprobados actualmente potencian la respuesta inmunitaria antitumoral a través de mecanismos de acción claramente diferentes. Por ejemplo, el bloqueo del antígeno 4 asociado a linfocitos T citotóxicos (CTLA4) potencia predominantemente la activación de los linfocitos T durante la fase de preparación de la respuesta inmunitaria, mientras que el bloqueo de la proteína de muerte celular programada 1 (PD1) parece liberar poblaciones de linfocitos T efectores agotados, pero por lo demás activados, y reducir la función de los linfocitos T reguladores (Treg).
Aunque los ICI pueden provocar respuestas notables y duraderas en pacientes con cáncer avanzado, estas respuestas positivas se limitan a una pequeña proporción de la población total de pacientes (Hu-Lieskovan y col. 2017). Por consiguiente, los enfoques que combinan los ICI con otras modalidades de tratamiento (p. ej., radioterapia, quimioterapia, virus oncolíticos, vacunas contra el cáncer) que podrían estimular una respuesta inmunitaria del hospedador proporcionan un enfoque atractivo y clínicamente factible para superar la resistencia intrínseca y adquirida a la inmunoterapia contra el cáncer y potencialmente extender el éxito clínico a una gama más amplia de pacientes (Smyth y col. 2015).
Uno de estos enfoques es combinar los ICI con quimioterápicos de molécula pequeña (suministrados por vía sistémica o por vía intratumoral) que pueden modular las respuestas inmunitarias (1) reduciendo la carga tumoral general, (2) potenciando la respuesta antitumoral al exponer el neoantígeno durante la necrosis tumoral y/o (3) afectando directamente a las células del estroma tumoral (Adams y col. 2015; Mahoney y col. 2015; O'Brien y col. 2014).
La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que algunos compuestos de epoxitiglien-3-ona pueden estimular una respuesta inmunitaria que puede trabajar sinérgicamente con el bloqueo de puntos de regulación inmunitarios para proporcionar una terapia no solo para el tumor que se está tratando, sino también para otros tumores que pueden estar presentes en el sujeto que se está tratando.
Descripción detallada de la invención
Definiciones
A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen los mismos significados que entiende habitualmente un experto en la técnica a la que pertenece la invención. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente memoria puede usarse en la práctica o el ensayo de la presente invención, se describen métodos y materiales preferidos. Para los fines de la presente invención, los siguientes términos se definen a continuación.
Los artículos “ un” y “ una” se usan en la presente memoria para referirse a uno o más de uno (es decir, al menos a uno) del objeto gramatical del artículo. A manera de ejemplo, “ un elemento” significa un elemento o más de un elemento.
Como se usa en la presente memoria, el término “ aproximadamente” se refiere a una cantidad, nivel, valor, dimensión, tamaño o cantidad que varía tanto como el 30 %, 25 %, 20 %, 15 % o 10 % con respecto a una cantidad, nivel, valor, dimensión, tamaño o cantidad de referencia.
A lo largo de la presente memoria descriptiva, a menos que el contexto requiera cualquier otra cosa, se entiende que las expresiones “ comprenden” , “ comprende” o “ que comprende/n” , implican la inclusión de una etapa o elemento o grupo de etapas o elementos declarados, pero no la exclusión de ninguna otra etapa o elemento o grupo de etapas o elementos.
El término “ alquilo” se refiere a grupos hidrocarbonados lineales y ramificados opcionalmente sustituidos que tienen de 1 a 20 átomos de carbono. Cuando corresponda, el grupo alquilo puede tener un número específicado de átomos de carbono, por ejemplo, -alquilo C1-C6 que incluye grupos alquilo que tienen 1, 2, 3, 4, 5 o 6 átomos de carbono en disposiciones lineales o ramificadas. Los ejemplos no limitativos de grupos alquilo incluyen metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, s- y t-butilo, pentilo, 2-metilbutilo, 3-metilbutilo, hexilo, 2-metilpentilo, 3-metilpentilo, 4-metilpentilo, 2-etilbutilo, 3-etilbutilo, heptilo, octilo, nonilo, decilo, undecilo, dodecilo, tridecilo, tetradecilo y pentadecilo.
El término “ alquenilo” se refiere a hidrocarburos lineales o ramificados, insaturados, opcionalmente sustituidos, que tienen de 2 a 20 átomos de carbono y que tienen al menos un doble enlace. Cuando corresponda, el grupo alquenilo puede tener un número específicado de átomos de carbono, por ejemplo, -alquenilo C2-C6 que incluye grupos alquenilo que tienen 2, 3, 4, 5 o 6 átomos de carbono en disposiciones lineales o ramificadas. Los ejemplos no limitativos de grupos alquenilo incluyen etenilo, propenilo, isopropenilo, butenilo, s- y t-butenilo, pentenilo, hexenilo, hept-1,3-dieno, hex-1,3-dieno, no-1,3,5-trieno y similares.
El término “ alquinilo” se refiere a hidrocarburos lineales o ramificados, insaturados, opcionalmente sustituidos, que tienen de 2 a 20 átomos de carbono, que tienen al menos un triple enlace. Cuando corresponda, el grupo alquinilo puede tener un número específicado de átomos de carbono, por ejemplo, -alquinilo C2-C6 que incluye grupos alquinilo que tienen 2, 3, 4, 5 o 6 átomos de carbono en disposiciones lineales o ramificadas. Los ejemplos no limitativos incluyen etinilo, propinilo, butinilo, pentinilo y hexinilo.
Los términos “ cicloalquilo” y “ carbocíclico” se refieren a grupos hidrocarbonados monocíclicos, bicíclicos o tricíclicos, saturados o insaturados, opcionalmente sustituidos. Cuando corresponda, el grupo cicloalquilo puede tener un número específicado de átomos de carbono, por ejemplo, cicloalquilo C3-C6 es un grupo carbocíclico que tiene 3, 4, 5 o 6 átomos de carbono. Los ejemplos no limitativos pueden incluir ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclopentenilo, ciclohexilo, ciclohexenilo, ciclohexadienilo y similares.
“Arilo” significa un sistema de anillo carbocíclico monocíclico, bicíclico o tricíclico de C6-C14 miembros que tiene hasta 7 átomos en cada anillo, en donde al menos un anillo es aromático. Los ejemplos de grupos arilo incluyen, aunque no de forma limitativa, fenilo, naftilo, tetrahidronaftilo, indanilo y bifenilo. El arilo puede comprender 1-3 anillos de benceno. Si hay presentes dos o más anillos aromáticos, entonces los anillos pueden condensarse, de manera que los anillos adyacentes compartan un enlace común.
Cada alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo o arilo, ya sea una entidad individual o como parte de una entidad más grande, puede estar opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes opcionales seleccionados del grupo que consiste en alquilo C1-6, alquenilo C2-6, cicloalquilo C3-6, oxo (=O), -OH, -SH, alquil C1-6O-, alquenil C2-6O-, cicloalquil C3-6O-, alquilo C1-6S-, alquenil C2-6S-, cicloalquil C3-6S-, -CO2H, -CO2alquil C1-6, -NH2 , -NH(alquilo C1-6), -N(alquilo C1-6)2, -NH(fenilo), -N(fenilo)2, -CN, -NO2 , -halógeno, -CF3 , -OCF3, -SCF3, -CHF2 , -OCHF2 , -SCHF2 , -fenilo, -alquil C1-6fenilo, -Ofenilo, -C(O)fenilo, -C(O)alquilo C1-6. Los ejemplos de sustituyentes adecuados incluyen, aunque no de forma limitativa, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, sec-butilo, terc-butilo, vinilo, metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, butoxi, metiltio, etiltio, propiltio, isopropiltio, butiltio, hidroxi, hidroximetilo, hidroxietilo, hidroxipropilo, hidroxibutilo, fluoro, cloro, bromo, yodo, ciano, nitro, -CO2H, -CO2CH3, -C(O)CH3, trifluorometilo, trifluorometoxi, trifluorometiltio, difluorometilo, difluorometoxi, difluorometiltio, morfolino, amino, metilamino, dimetilamino, fenilo, fenoxi, fenilcarbonilo, bencilo y acetilo.
Los compuestos de epoxitigliano pueden estar en forma de sales farmacéuticamente aceptables. Sin embargo, se apreciará que las sales no farmacéuticamente aceptables también caen dentro del alcance de la invención puesto que pueden ser útiles como intermedios en la preparación de sales farmacéuticamente aceptables o pueden ser útiles durante el almacenamiento o el transporte. Las sales farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen, aunque no de forma limitativa, sales de ácidos inorgánicos farmacéuticamente aceptables, tales como los ácidos clorhídrico, sulfúrico, fosfórico, nítrico, carbónico, bórico, sulfámico y bromhídrico, o sales de ácidos orgánicos farmacéuticamente aceptables, tales como los ácidos acético, propiónico, butírico, tartárico, maleico, hidroximaleico, fumárico, maleico, cítrico, láctico, múcico, glucónico, benzoico, succínico, oxálico, fenilacético, metanosulfónico, toluenosulfónico, bencenosulfónico, salicílico, sulfanílico, aspártico, glutámico, edético, esteárico, palmítico, oleico, láurico, pantoténico, tánico, ascórbico y valérico.
Las sales de bases incluyen, aunque no de forma limitativa, aquellas formadas con cationes farmacéuticamente aceptables, tales como sodio, potasio, litio, calcio, magnesio, amonio y alquilamonio.
Los grupos básicos que contienen nitrógeno pueden cuaternizarse con agentes tales como haluros de alquilo inferior, tales como cloruros, bromuros y yoduros de metilo, etilo, propilo y butilo; sulfatos de dialquilo como sulfato de dimetilo y dietilo; y otros.
T ambién se reconocerá que los compuestos de epoxitigliano pueden poseer centros asimétricos y, por lo tanto, son capaces de existir en más de una forma estereoisomérica. Por lo tanto, la invención también se refiere a compuestos en forma isomérica sustancialmente pura en uno o más centros asimétricos, p. ej., más de aproximadamente el 90 % de ee, tal como aproximadamente el 95 % o el 97 % de ee o más del 99 % de ee, así como mezclas, incluyendo mezclas racémicas, de los mismos. Dichos isómeros pueden obtenerse por aislamiento de fuentes naturales, por síntesis asimétrica, por ejemplo, usando intermediarios quirales, o por resolución quiral. Los compuestos de la invención pueden existir como isómeros geométricos. La invención también se refiere a compuestos en formas cis (Z) o trans (E) sustancialmente puras o mezclas de las mismas.
Los compuestos de la presente invención pueden obtenerse por aislamiento de una planta o parte de una planta, o por derivatización del compuesto aislado, o por derivatización de un compuesto relacionado. Pueden encontrarse procedimientos de aislamiento y de derivatización en los documentos WO 2007/070985 y WO2014/169356.
La expresión “ compuesto de epoxitigliano” se refiere a un compuesto que tiene la siguiente estructura cíclica de carbono básica:
Figure imgf000004_0001
Los compuestos tienen un sistema de triciclo[9.3.0.0]tetradecano con un anillo de ciclopropano condensado adjunto al anillo de seis miembros. El epóxido se condensa con el anillo de siete miembros en la posición 6,7.
Un ejemplo de un compuesto de epoxitigliano es un compuesto de epoxitiglien-3-ona. La expresión “ compuesto de epoxitiglien-3-ona” se refiere a un compuesto que tiene una estructura de epoxi-tigliano definida anteriormente donde el anillo de cinco miembros tiene una estructura de 1,2-eno-3-ona:
Figure imgf000004_0002
Como se usa en la presente memoria, la expresión “ tumor vecino” se refiere a un tumor distinto del tumor que se trata con el compuesto de epoxitigliano. El tumor vecino puede ser un tumor primario o un tumor metastásico.
La expresión “junto con” como se usa en la presente memoria se refiere al compuesto de epoxitigliano y el ICI que se administran en una única composición, o por separado, ya sea simultáneamente o secuencialmente. El compuesto de epoxitigliano y el ICI pueden administrarse en diferentes momentos y con diferentes frecuencias, pero en combinación ejercen efectos biológicos al mismo tiempo o en momentos superpuestos. Por ejemplo, el ICI se administra para que tenga un efecto sobre la respuesta inmunitaria cuando se administra el compuesto de epoxitigliano.
Métodos de tratamiento
Cualquier referencia a métodos para tratar en la presente descripción debe interpretarse como referencia al compuesto, composición farmacéutica o medicamento de la presente invención para su uso en aquellos.
La presente invención se refiere a métodos para tratar tumores, incluyendo tumores vecinos, comprendiendo el método la administración de un compuesto de epoxitigliano de fórmula (1) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo junto con el inhibidor de puntos de regulación inmunitarios (iC i) definido en la reivindicación 1.
La invención también se refiere a métodos para prevenir tumores vecinos que comprenden la administración de un compuesto de epoxitigliano o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo junto con dicho ICI.
En algunas realizaciones, el tumor que se está tratando es un tumor al que se le puede suministrar el compuesto de epoxitigliano de manera localizada directamente al tumor. En realizaciones particulares, el tumor es un tumor cutáneo o un tumor subcutáneo o un tumor accesible desde el exterior del cuerpo, por ejemplo, un tumor que es palpable. En otras realizaciones, el tumor es un tumor interno. En algunas realizaciones donde el tumor es un tumor ubicado internamente, el suministro localizado se logra durante la cirugía cuando el tumor está expuesto y se le puede inyectar el compuesto de epoxitigliano. En otras realizaciones, el tumor está ubicado internamente y el compuesto de epoxitigliano se suministra mediante inyección guiada por una técnica de formación de imágenes, por ejemplo, guiada por ultrasonido endoscópico o por formación de imágenes estereotácticas.
En algunas realizaciones, el compuesto de epoxitigliano se suministra a uno o más tumores por vía sistémica.
En algunas realizaciones, el tumor es un tumor benigno. En otras realizaciones, el tumor es un tumor maligno. En algunas realizaciones, el tumor es un tumor primario y en otras realizaciones, el tumor es un tumor metastásico. Los ejemplos de tumores cutáneos incluyen queratosis seborreica, queratosis actínica, carcinoma de células basales (CCB) que incluye CCB nodular, CCB superficial, CCB infiltrante y CCB micronodular, carcinoma de células escamosas, incluyendo carcinoma de células escamosas in situ y carcinoma de células escamosas invasivo, melanoma incluyendo melanoma de propagación superficial, melanoma nodular, melanoma lentigo maligno, melanoma lentiginoso acral y melanoma desmoplásico/neutrópico, linfoma cutáneo de linfocitos B y linfoma cutáneo de linfocitos T. Los ejemplos de tumores subcutáneos incluyen angioqueratoma, granuloma piógeno, angioma cereza, tumor glómico, angiosarcoma, sarcoma de Karposi, sarcoma de Ewings, histiocitoma fibroso maligno, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, liposarcoma, sarcoma sinovial, sarcoma del estroma, sarcoma del estroma gastrointestinal, tumor maligno de la vaina del nervio periférico, tumor neuroectodérmico primitivo, neurofibroma, carcinoma de células de Merkel, dermatofibroma, fibrosarcoma, sarcoma epitelioide y mastocitoma (tumor de mastocitos).
El tumor interno puede ser cualquier tumor que sea accesible a la inyección durante la cirugía o mediante inyección guiada o uno que pueda tratarse con epoxitigliano administrado por vía sistémica e incluye tumores de cerebro, pulmón, colon, células epidermoides, células escamosas, vejiga, estómago, páncreas, mama, cabeza, cuello, sistema renal, riñón, hígado, ovario, próstata, útero, esófago, testículos, cuello del útero, vagina, tiroides o piel.
El tumor vecino puede ser cualquier tumor distinto del tumor que se está tratando con el compuesto de epoxitigliano. Por ejemplo, el tumor vecino puede ser un segundo tumor cutáneo o subcutáneo o puede ser un tumor en otro órgano o tejido. Los ejemplos de tumores vecinos incluyen tumores de cerebro, pulmón, colon, células epidermoides, células escamosas, vejiga, estómago, páncreas, mama, cabeza, cuello, sistema renal, riñón, hígado, ovario, próstata, útero, esófago, testículos, cuello del útero, vagina, tiroides o piel.
En algunas realizaciones, el tumor vecino es un tumor primario adicional y en otras realizaciones el tumor vecino es un tumor metastásico.
En algunas realizaciones, el tumor que se está tratando con el compuesto de epoxitigliano es un tumor primario y el tumor secundario es un tumor metastásico. En algunas realizaciones, el tumor que se está tratando con el compuesto de epoxitigliano es un tumor metastásico y el tumor secundario es un tumor primario. En algunas realizaciones, tanto el tumor que se está tratando con el compuesto de epoxitigliano como el tumor vecino son tumores primarios. En algunas realizaciones, tanto el tumor que se está tratando con el compuesto de epoxitigliano como el tumor vecino son tumores metastásicos.
En algunas realizaciones, la terapia de combinación previene que aparezca el tumor vecino o retrasa la aparición del tumor vecino. En algunas realizaciones, la terapia de combinación reduce el tamaño del tumor vecino.
Compuestos de epoxitigliano
Según la invención, el compuesto de epoxitigliano es un compuesto de fórmula (I):
Figure imgf000005_0001
o un isómero geométrico o estereoisómero o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;
en donde
Ri es hidrógeno o alquilo Ci-6;
R2 es -OH u -OR9 ;
R3 es -OH u -OR9 ;
R4 y R5 se seleccionan independientemente de hidrógeno y alquilo C1-6;
R6 es hidrógeno o -R10;
R7 es hidroxi u -OR10;
R8 es hidrógeno o alquilo C1-6;
R9 es -alquilo C1-20, -alquenilo C2-20, -alquinilo C2-20, -C(O)alquilo C1-20, -C(O)alquenilo C2-20, -C(O)alquinilo C2-20, -C(O)cicloalquilo, -C(O)alquil C1-10cicloalquilo; -C(O)alquenil C2-10cicloalquilo, -C(O)alquinil C2-10cicloalquilo, -C(O)arilo, -C(O)alquil C1-10arilo, -C(O)alquenil C2-10arilo, -C(O)alquinil C2-10arilo, -C(O)alquil C1-10C(O)Rn, -C(O)alquenil C2-10C(O)R11, -C(O)alquinil C2-10C(O)Rn, -C(O)alquil C1-10CH(OR11)(OR11), -C(O)alquenil C2-10CH(OR11)(OR11), -C(O)alquinil C2-10CH(OR11)(OR11), -C(O)alquil C1-10SR11, -C(O)alquenil C2-10SR11, -C(O)alquinil C2-10SR11, -C(O)alquil C1-10C(O)OR11, -C(O)alquenil C2-10C(O)OR11, -C(O)alquinil C2-10C(O)OR11, -C(O)alquil C1-10C(O)SR11, -C(O)alquenil C2-10C(O)SR11, -C(O)alquinil C2-10C(O)SR11,
C ^C ^^a lq u ilo — ^ ^ Rn
Figure imgf000006_0001
o
Figure imgf000006_0002
R10 es -alquilo C1-6, -alquenilo C2-6, -alquinilo C2-6, -C(O)aquilo C1-6, -C(O)alquenilo C2-6, -C(O)alquinilo C2-6, -C(O)arilo, -C(O)alquil C1 -6arilo, -C(O)alquenil C2-6arilo, -C(O)alquinil C2-6arilo; y
R11 es hidrógeno, -alquilo C1-10, -alquenilo C2-10, -alquinilo C2-10, cicloalquilo o arilo;
en donde cada grupo alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo o arilo está opcionalmente sustituido.
En algunas realizaciones, el compuesto de epoxitigliano de fórmula (I) es un compuesto de fórmula (II):
Figure imgf000006_0003
o un isómero geométrico o estereoisómero o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;
donde R6, R7 y R9 son como se definen para la fórmula (I).
En realizaciones particulares de las fórmulas (I) o (II), se aplica uno o más de los siguientes:
R1 es -alquilo C1-3, especialmente -CH3 ;
R2 es -OC(O)alquilo C1-20, -OC(O)alquenilo C2-20, -OC(O)alquinilo C2-20, -OC(O)cicloalquilo, -OC(O)alquil C1-10cicloalquilo; -OC(O)alquenil C2-10cicloalquilo, -OC(O)alquinil C2-10cicloalquilo, -OC(O)arilo, -OC(O)alquil C1-10arilo, -OC(O)alquenil C2-10arilo, -OC(O)alquinil C2-10arilo, -OC(O)alquil Cm 0C(O)Rh , -OC(O)alquenil C2-10C(O)Rn, -OC(O)alquinil C2-10C(O)Rn, OC(O)alquil C1 -10CH(OR1 1 )(OR11 ), -OC(O)alquenil C2-10CH(OR1 1 )(OR1 1 ), -OC(O)alquinil C2-10CH(OR1 1 )(OR1 1 ), -Oc(o)alquil C1-10SR11, -Oc(O)alquenil C2-10SR11, -OC(O)alquinil C2-10SR11, -OC(O)alquil C1 -10C(O)OR 11 , -Oc(O)alquenil C2-10C(O)OR 11 , -OC(O)alquinil C2-10C(O)ORh , -OC(O)alquil C1-10C(O)SRh , -OC(O)alquenil C2-10C(O)SRh u -OC(O)alquinil C2-10C(O)s Rh ; especialmente -OC(O)alquilo C1-20, -Oc(O)alquenilo C2-20, -OC(O)alquinilo C2-20, -OC(O)cicloalquilo, -OC(O)alquil C1-10CÍcloalquilo; -Oc(O)alquenil C2-10CÍcloalquilo, -OC(O)alquinil C2-10CÍcloalquilo u -OC(O)arilo; más especialmente -OC(O)alquilo C1-20, -OC(O)alquenilo C2-20 u -OC(O)alquinilo C2-20;
R3 es -OC(O)alquilo C1-20, -OC(O)alquenilo C2-20, -OC(O)alquinilo C2-20, -OC(O)cicloalquilo, -OC(O)alquil C1-10cicloalquilo; -OC(O)alquenil C2-10cicloalquilo, -OC(O)alquinil C2-10cicloalquilo, -OC(O)arilo, -OC(O)alquil C1-10arilo, -OC(O)alquenil C2-10arilo, -OC(O)alquinil C2-10arilo, -OC(O)alquil Cm 0C(O)Rh , -OC(O)alquenil C2-10C(O)Rh , -OC(O)alquinil C2-10C(O)Rh , -OC(O)alquil C1-10CH(ORh )(ORh ), -OC(O)alquenil C2-10CH(ORh )(ORh ), -OC(O)alquinil C2-10CH(ORh )(ORh ), -OC(O)alquil C1-10SR11, -OC(O)alquenil C2-10SR11, -OC(O)alquinil C2-10SR11, -OC(O)alquil Cm 0C(O)ORh , -OC(O)alquenil C2-10C(O)ORh , -OC(O)alquinil C2-10C(O)ORh , -OC(O)alquil C1 0C(O)SRh , -OC(O)alquenil C2-10C(O)s Rh u -OC(O)alquinil C2-10C(O)s Rh ; especialmente -OC(O)alquilo C1-20, -OC(O)alquenilo C2-20, -OC(O)alquinilo C2-20, -OC(O)cicloalquilo, -OC(O)alquil C1-10cicloalquilo; -OC(O)alquenil C2-10cicloalquilo, -OC(O)alquinil C2-10cicloalquilo u -OC(O)arilo; más especialmente -OC(O)alquilo C1-20, -OC(O)alquenilo C2-20 u -OC(O)alquinilo C2-20;
R4 y R5 se seleccionan independientemente de -alquilo C1-3, especialmente -CH3 ;
R6 es hidrógeno, -C(O)alquilo C1-6, -C(O)alquenilo C2-6, -C(O)alquinilo C2-6 o -C(O)arilo;
especialmente hidrógeno, -C(O)alquilo C1-3, -C(O)alquenilo C2-3 o -C(O)alquinilo C2-3, más especialmente hidrógeno o -C(O)CH3;
R7 es hidroxilo, -OC(O)alquilo C1-6, -OC(O)alquenilo C2-6 u -OC(O)alquinilo C2-6, especialmente hidroxilo, -OC(O)alquilo C1-3, -OC(O)alquenilo C2-3 u -OC(O)alquinilo C2-3, más especialmente hidroxilo u -OC(O)CH3 ; y R8 es -alquilo C1-3, especialmente -CH3.
En algunas realizaciones, los compuestos de las fórmulas (I) y/o (II) tienen la estereoquímica que se muestra en la fórmula (III) a continuación:
Figure imgf000007_0001
En algunas realizaciones, el epóxido en la posición 6,7 está por encima del plano del sistema de anillos. En otras realizaciones, el epóxido en la posición 6,7 está por debajo del plano del sistema de anillos. En algunas realizaciones, el grupo R2 en la posición 12 es S y, en otras realizaciones, el grupo R2 en la posición 12 es R. En realizaciones particulares, el compuesto de epoxitigliano se selecciona de:
12-tigloil-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoxi-4,5,9,12,13,20-hexahidroxi-1-tiglien-3-ona (Compuesto 1);
12.13- di-(2-metilbutanoil)-6,7-epoxi-4,5,9,12,13,20-hexahidroxi-1-tiglien-3-ona (Compuesto 2);
12-hexanoil-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoxi-4,5,9,12,13,20-hexahidroxi-1-tiglien-3-ona (Compuesto 3);
12.13- dihexanoil-6,7-epoxi-4,5,9,12,13,20-hexahidroxi-1-tiglien-3-ona (Compuesto 4);
12-miristoil-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoxi-4,5,9,12,13,20-hexahidroxi-1-tiglien-3-ona (Compuesto 5);
12-tigloil-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoxi-4,5,9,12,13-pentahidroxi-20-acetiloxi-1-tiglien-3-ona (Compuesto 6); 12-miristoil-13-acetiloxi-6,7-epoxi-4,5,9,12,13,20-hexahidroxi-1-tiglien-3-ona (Compuesto 7);
12-propanoil-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoxi-4,5,9,12,13,20-hexahidroxi-1-tiglien-3-ona (Compuesto 8);
12,13-ditigloil-6,7-epoxi-4,5,9,12,13,20-hexahidroxi-1-tiglien-3-ona (Compuesto 9); y
12-(2-metilbutanoil)-13-tigloil-6,7-epoxi-4,5,9,12,13,20-hexahidroxi-1-tiglien-3-ona (Compuesto 10).
Inhibidor de puntos de regulación inmunitarios (ICI)
El ICI como se describe, pero no necesariamente se reivindica en la presente memoria, puede ser cualquier molécula que inhiba las proteínas de las células inmunitarias o de las células cancerosas que bloquean las respuestas inmunitarias en la células inmunitaria, especialmente cuando la célula inmunitaria es un linfocito T o un linfocito citolítico natural (linfocito NK). Los ejemplos de proteínas de células tumorales y células inmunitarias incluyen la Muerte programada 1 (PD-1) en los linfocitos T que se une a PD-L1 de una célula tumoral para bloquear la respuesta inmunitaria del linfocito T contra la célula tumoral y la proteína 4 asociada a los linfocitos T citotóxicos (CTLA-4) en un linfocito T que se une a la proteína B7-1/B7-2 en una célula cancerosa para bloquear la respuesta inmunitaria del linfocito T contra la célula tumoral. Por lo tanto, los ICI incluyen moléculas que se unen o bloquean la interacción de PD-1 con PD-L1/PDL2 o CTLA-4 con B7-1/B7-2. Otras proteínas de las células inmunitarias que bloquean las respuestas inmunitarias en las células inmunitarias y pueden modularse para evitar su acción incluyen el receptor de adenosina A2A, B7-H3, B7-H4, indoleamina 2,3-dioxigenasa (IDO), receptor similar a inmunoglobulina de linfocitos citolíticos (KIR), gen-3 de activación de linfocitos (LAG3), inmunorreceptor de linfocitos T con dominios IG e ITIM (TIGIT), inmunoglobulina de linfocitos T y 3 que contiene dominio de mucina (TIM-3), CD96 e inmunoglobulina de dominio V supresor de activación de linfocitos T (VISTA).
Los ICI según la invención son antagonistas de uno de los siguientes: receptor de PD1, su ligando PD-L1 y CTLA-4, especialmente antagonistas de PD-1 o CTLA-4. En realizaciones particulares, el antagonista es un anticuerpo para la proteína de los puntos de regulación inmunitarios, por ejemplo, el anticuerpo Anti-PD-1 o el anticuerpo Anti-CTLA-4.
Composiciones
Aunque los compuestos de epoxitigliano o las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos y los ICI pueden administrarse puros, puede ser más conveniente administrar los compuestos de epoxitigliano y los ICI en forma de una o más composiciones farmacéuticas, cada una junto con un portador, diluyente y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.
La forma farmacéutica y las velocidades para el uso farmacéutico y las composiciones son fácilmente determinables por un experto en la técnica.
En realizaciones particulares, el compuesto de epoxitigliano se formula para la administración directamente sobre o dentro del tumor que se está tratando. En algunas realizaciones, el compuesto de epoxitigliano se formula para la administración tópica en forma de gel, pomada, loción, crema o parche transdérmico que puede aplicarse directamente sobre el tumor que se está tratando. En otras realizaciones, el compuesto de epoxitigliano se formula para la inyección, especialmente la inyección intratumoral donde el compuesto se inyecta en uno o más lugares en un tumor.
El ICI puede administrarse por cualquier medio que sea capaz de suministrar la molécula por vía sistémica o por vía local. En realizaciones particulares, cuando el ICI es un anticuerpo, la molécula se suministra convenientemente por inyección, por ejemplo, inyección intravenosa, intraarticular, intramuscular, intradérmica, subcutánea o intraperitoneal. El ICI también puede formularse para el suministro local por inyección, por ejemplo, por vía intratumoral. También pueden incorporarse portadores farmacéuticamente aceptables y los portadores aceptables para la administración sistémica o local en las composiciones de ICI. En algunas realizaciones, el compuesto de epoxitigliano y el ICI se suministran por separado, ya sea simultánea o secuencialmente. En otras realizaciones, el compuesto de epoxitigliano y el ICI se suministran en una composición única, por ejemplo, una composición única adecuada para el suministro intratumoral o una composición única formulada para el suministro sistémico.
En otro aspecto de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende el compuesto de epoxitigliano o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y el inhibidor de puntos de regulación inmunitarios, opcionalmente junto con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables.
Adecuadamente, la composición o composiciones farmacéuticas comprenden un excipiente farmacéuticamente aceptable o un excipiente aceptable. Por “excipiente farmacéuticamente aceptable” se entiende una carga, un diluyente o una sustancia encapsulante sólida o líquida que puede usarse con seguridad. Dependiendo de la vía particular de administración, puede usarse una diversidad de portadores bien conocidos en la técnica. Estos portadores o excipientes pueden seleccionarse de un grupo que incluye azúcares, almidones, celulosa y sus derivados, ciclodextrinas, malta, gelatina u otros agentes gelificantes, polímeros, talco, sulfato de calcio, aceites vegetales, aceites sintéticos, alcoholes y/o polioles, ácido algínico, soluciones tamponadas con fosfato, emulsionantes, solución salina isotónica y agua apirógena.
Las preparaciones en forma líquida incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones, por ejemplo, agua o soluciones de agua-propilenglicol. Por ejemplo, las preparaciones líquidas para inyección parenteral pueden formularse como soluciones en 1,2-propanodiol acuoso, dimetilsulfóxido (DMSO), soluciones acuosas de ciclodextrina gamma o 2-hidroxipropil-beta-ciclodextrina, solución salina o solución de polietilenglicol, con o sin tampón. Un intervalo preferido de pH es 3,0-4,5. Los tampones adecuados tamponan la preparación a pH 3,5-4,5 e incluyen, aunque no de forma limitativa, tampón de acetato y tampón de citrato.
Las composiciones de compuesto de epoxitigliano y/o ICI pueden formularse, por lo tanto, para la administración parenteral (p. ej., mediante inyección, por ejemplo, inyección en embolada o infusión continua) y pueden presentarse en forma de dosis unitaria en ampollas, jeringas precargadas, infusión de pequeño volumen o en recipientes multidosis con conservante añadido. Las composiciones pueden adoptar formas tales como suspensiones, soluciones, geles o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. Como alternativa, el principio activo puede estar en forma de polvo, obtenido por aislamiento aséptico de un sólido estéril o por liofilización de la solución, para su reconstitución con un vehículo adecuado, p. ej., agua estéril, apirógena, antes de su uso.
Las composiciones farmacéuticas de compuesto de epoxitigliano y/o ICI adecuadas para la administración pueden presentarse en unidades discretas tales como jeringas, viales, tubos o bolsitas, cada uno de los cuales contiene una cantidad predeterminada de uno o más compuestos o extractos farmacéuticamente activos de la invención, en forma de polvo o gránulos, o en forma de una solución o una suspensión en un líquido acuoso, una solución de ciclodextrina, un líquido no acuoso, una emulsión aceite en agua o una emulsión agua en aceite o en forma de una solución o suspensión en una crema o gel o en forma de una suspensión de micro o nanopartículas que incorporan un compuesto de epoxitigliano, incluyendo, aunque no de forma limitativa, micro o nanopartículas de sílice o polilactida. Dichas composiciones pueden prepararse mediante cualquiera de los métodos de farmacia, pero todos los métodos incluyen la etapa de asociar uno o más compuestos farmacéuticamente activos de la invención con el portador que constituye uno o más ingredientes necesarios. En general, las composiciones se preparan mezclando uniforme e íntimamente los agentes de la invención con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos o ambos, y después, si es necesario, moldeando el producto en la presentación deseada.
Para la administración tópica en la epidermis u otro órgano, los compuestos según la invención pueden formularse en forma de geles, pomadas, emulsiones, pastas, cremas o lociones, o en forma de parche transdérmico. Los geles pueden prepararse usando agentes espesantes adecuados y añadiéndolos a composiciones acuosas/alcohólicas del compuesto. En la técnica se conocen agentes espesantes o gelificantes adecuados, tales como el polímero de polivinil carboxi carbómero 940. Las pomadas y cremas pueden formularse, por ejemplo, con una base acuosa u oleosa con la adición de agentes espesantes y/o gelificantes adecuados. Las lociones pueden formularse con una base acuosa u oleosa y, en general, también contendrán uno o más agentes emulsionantes, agentes estabilizantes, agentes dispersantes, agentes de suspensión, agentes espesantes o agentes colorantes.
Las formulaciones adecuadas para la administración tópica también incluyen soluciones o suspensiones que pueden administrarse por vía tópica en forma de baño o solución de remojo o pulverización o pueden absorberse en un apósito.
Cuando el ICI es una molécula pequeña, puede suministrarse por cualquier medio adecuado, incluyendo oral, tópico, rectal, parenteral, sublingual, bucal, intravenoso, intraarticular, intramuscular, intradérmico, subcutáneo, por inhalación, intraocular, intraperitoneal, intracerebroventricular, transdérmico y similares como se sabe en la técnica de la farmacia.
Pautas de dosificación
En algunas realizaciones, el compuesto de epoxitigliano se suministró en la misma composición que el ICI. Sin embargo, en realizaciones particulares, el ICI se administra en una composición separada del compuesto de epoxitigliano.
En algunas realizaciones, el compuesto de epoxitigliano se administra directamente al tumor, por ejemplo, mediante administración tópica o mediante inyección intratumoral.
En algunas realizaciones, el compuesto de epoxitigliano se administra al tumor una vez. En otras realizaciones, el tumor tratado se monitoriza y puede ser necesaria la administración adicional del compuesto de epoxitigliano si el tumor no responde completamente al tratamiento. En realizaciones donde el tumor se trata por vía tópica, el compuesto de epoxitigliano puede administrarse en un número de ocasiones durante un período de tiempo, por ejemplo, diariamente durante una semana o una vez a la semana durante 4 a 10 semanas. Una persona experta en la técnica, al monitorizar al sujeto que está siendo tratado, sería capaz de determinar un programa de dosificación apropiado, que puede variar dependiendo de la respuesta al tratamiento.
En algunas realizaciones, el ICI se administra al menos una vez, antes o simultánea o secuencialmente con el compuesto de epoxitigliano. En realizaciones particulares, se administran múltiples dosis de ICI durante un período de tiempo que comienza antes o junto con la administración del compuesto de epoxitigliano y a continuación continúa después de la administración del compuesto de epoxitigliano.
En algunas realizaciones, el ICI se administra más de una vez y de forma regular antes y después de la administración del compuesto de epoxitigliano. En realizaciones particulares, el ICI se administra antes de la administración del compuesto de epoxitigliano, secuencial o simultáneamente con la administración del compuesto de epoxitigliano y al menos una vez posteriormente a la administración del compuesto de epoxitigliano. Por ejemplo, el ICI puede administrarse de 1 semana a 1 día antes de la administración del compuesto de epoxitigliano, especialmente de 1 a 3 días y más especialmente aproximadamente 2 días antes de la administración del compuesto de epoxitigliano, después, el ICI se administra secuencial o simultáneamente con el compuesto de epoxitigliano, ya sea inmediatamente antes o inmediatamente después de la administración del compuesto de epoxitigliano, el ICI después se administra una o más veces durante el siguiente mes después de la administración del compuesto de epoxitigliano, por ejemplo, una vez a la semana, una vez cada 5 días, una vez cada 4 días, una vez cada 3 días, cada 2 días o todos los días, especialmente cada 1 a 3 días, más especialmente cada 2 días. La administración posterior del ICI puede continuar de manera que se administren de 1 a 10 dosis de ICI después de la administración del compuesto de epoxitigliano, especialmente de 1 a 8 dosis, de 1 a 6 dosis, de 1 a 4 dosis, de 1 a 3 dosis o de 1 a 2 dosis.
En una realización particular, el ICI se administra 2 días antes de la administración del compuesto de epoxitigliano, secuencialmente (inmediatamente antes o inmediatamente después) con el compuesto de epoxitigliano y después cada dos días durante los 6 días posteriores a la administración del compuesto de epoxitigliano.
El compuesto de epoxitigliano se administra en una cantidad eficaz. Una “cantidad eficaz” significa una cantidad necesaria al menos parcialmente para lograr la respuesta deseada, por ejemplo, para reducir el tamaño del tumor o para destruir el tumor en su totalidad. La cantidad varía dependiendo de la salud y el estado físico del individuo que ha de tratarse, el grupo taxonómico del individuo que ha de tratarse, la formulación de la composición, el tamaño del tumor, la evaluación de la situación médica y otros factores pertinentes. Se espera que la cantidad esté en un intervalo relativamente amplio que puede determinarse a través de ensayos de rutina. Una cantidad eficaz, por ejemplo, puede encontrarse en el intervalo de aproximadamente 0,1 ng por kg de peso corporal a 1 g por kg de peso corporal por dosificación. La dosificación está preferiblemente en el intervalo de 1 |jg a 0,5 g por kg de peso corporal por dosis, tal como en el intervalo de 0,1 |jg a 100 mg por kg de peso corporal por dosificación. En una realización, cuando la dosificación se administra por vía intratumoral, la dosificación está en el intervalo de 50 ng a 100 mg por kg de peso corporal, por ejemplo de 0,1 mg a 5 mg por kg de peso corporal, de 0,1 a 1 mg/kg de peso corporal, tal como 0,25 mg/kg de peso corporal. En otra realización, la dosificación está en el intervalo de 0,001 mg a 20 mg por dosis, por ejemplo, de 0,005 mg a 15 mg por dosis, especialmente de 0,05 a 10 mg por dosificación, más especialmente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 5 mg por dosificación. Las pautas de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, en algunas realizaciones, cuando la administración es intratumoral, el compuesto de epoxitigliano se administra una vez y se monitoriza el progreso del tratamiento. En algunas realizaciones, si el tumor no se resuelve completamente o si el tumor reaparece, puede administrarse una segunda dosis. En algunas realizaciones, cuando la administración es tópica, la formulación tópica del compuesto puede administrarse directamente en el sitio del tumor en forma de gel, crema, pomada o loción. La frecuencia del tratamiento dependerá del tumor, su tamaño, el sujeto que se está tratando y similares. En algunas realizaciones, puede aplicarse una formulación tópica semanalmente hasta que el tumor se resuelva. En otras realizaciones, el tratamiento puede ser un tratamiento único y un segundo tratamiento administrado solamente si el tumor no se resuelve completamente.
El ICI también puede administrarse en una cantidad eficaz. De nuevo, la cantidad de ICI que se considera eficaz dependerá del sujeto que se esté tratando, su salud y estado físico, el número de tumores vecinos presentes, la formulación de la composición y la evaluación de la situación médica. Se espera que la cantidad de ICI caiga dentro de un intervalo bastante amplio de cantidades. Una cantidad eficaz puede encontrarse en el intervalo de aproximadamente 0,1 ng/kg a aproximadamente 500 mg/kg de peso corporal, de 100 jg/kg a 100 mg/kg de peso corporal, de 1 mg/kg a 50 mg/kg de peso corporal, de 1 mg/kg a 20 mg/kg de peso corporal. En otra realización, las dosificaciones reales pueden estar en el intervalo de 1 jg a 1 g, por ejemplo, de 100 jg a 750 mg por dosis.
El sujeto que puede tratarse con la terapia de combinación es un mamífero, un pájaro, un animal acuático tal como un pez o un reptil. En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano, un animal de laboratorio tal como un ratón, rata o conejo, un animal de compañía tal como un perro o gato, un animal de trabajo tal como un caballo, burro y similares, un animal de ganado tal como una vaca, toro, cerdo, oveja, cabra, ciervo, llama, alpaca y similares, o un animal silvestre cautivo tal como los que se encuentran en zoológicos o parques de vida silvestre, incluyendo leones, leopardos, guepardo, elefante, cebra, antílope, jirafa, koala, canguro y reptiles tales como cocodrilos, lagartijas, serpientes y similares, un pájaro, especialmente un ave cautiva, tal como un periquito o canario, cacatúa, perico, guacamayo, loro y similares, o un pez, especialmente un pez cautivo tal como peces tropicales (pez cebra, guppy, pez luchador siamés, pez payaso, cardenal tetra y similares), delfines, ballenas y similares. En realizaciones particulares, el sujeto es un ser humano o un animal de compañía.
Kits
Las composiciones de compuesto de epoxitigliano e ICI pueden formularse por separado y comercializarse juntas en un kit o envase. Cada kit puede comprender dosificaciones de cada compuesto para lograr el tratamiento de un tumor y tratar o prevenir uno o más tumores vecinos.
En algunas realizaciones, la composición de epoxitigliano se formula para la administración tópica, tal como en un gel, loción, crema o pomada, o se impregna en un apósito. En otras realizaciones, el compuesto de epoxitigliano se formula para la inyección tal como la inyección intratumoral. En esta realización, la formulación de epoxitigliano puede estar presente en el kit en forma de un líquido listo para la captación en una jeringa, en forma de una formulación en polvo o sólida que puede solubilizarse en un portador antes de la inyección o puede estar presente en el kit en una jeringa precargada.
Cada kit puede comprender una o más dosis de compuesto de epoxitigliano. En una realización, el kit contendrá una única dosis de compuesto de epoxitigliano en una formulación adecuada para la inyección intratumoral. En otra realización, el kit contendrá una formulación tópica de compuesto de epoxitigliano que contiene múltiples dosis para la aplicación al tumor.
En algunas realizaciones, el ICI se formula para la administración parenteral en una única dosis en embolada o en una forma de múltiples dosis. Por ejemplo, el kit puede contener el ICI en una jeringa precargada, en forma de un líquido en un vial listo para la captación en una jeringa, o en forma de un sólido listo para la disolución antes de la captación en una jeringa. Las formulaciones líquidas o sólidas pueden ser formulaciones de dosis única o formulaciones de múltiples dosis. Alternativamente, el kit puede contener múltiples dosis de ICI, cada una formulada por separado en una jeringa precargada, en forma de un líquido en un vial listo para la captación en una jeringa o en forma de un sólido listo para la disolución y la captación en una jeringa.
El kit puede comprender además un prospecto con instrucciones para el uso de cada formulación, que incluye cómo preparar cada dosis si es necesario, cómo administrar cada dosificación y cuándo administrar cada dosificación.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 proporciona A: imágenes de translocación de PKC-a, -pII, -y, -8 y -0 después del tratamiento con vehículo (Vehíc.) o Compuesto 1 (Comp. 1), Compuesto 3 (Comp. 3) y PMA 500 nM. Estas imágenes también se usaron para la cuantificación que se muestra en B. B: Mapa de calor que representa el perfil de translocación de isoformas de PKC (-a, -pI, -pII, -y, -8, -0, -r| y -Z - % medio de células que muestran la translocación de EGFP a la membrana plasmática) en respuesta a Compuesto 1500, 50 y 5 nM y los análogos indicados. >150 células contadas por réplica biológica. n = 3.
La Figura 2 proporciona A: Esquema del diseño experimental. B: Se inducen citocinas/quimiocinas del hospedador seleccionadas con funciones en el reclutamiento de leucocitos por el tratamiento con el Compuesto 1 (30 |jg). Se muestran los factores de cambio en la expresión génica de las citocinas/quimiocinas indicadas. C: Se generó un mapa de calor después de la comparación de los datos de intensidad de los perfiles de expresión génica del Vehículo y del Compuesto 1 en t = 8 h. Las listas de genes posteriores se analizaron mediante Análisis de la Vía (IPA; Qiagen) para identificar las vías afectadas por el tratamiento con el Compuesto 1.
La Figura 3 proporciona A . Liberación de LDH de líneas celulares de cáncer tratadas con el Compuesto 1. Se trataron A431, MM649 y B16-OVA con el Compuesto 1 a las concentraciones indicadas o con vehículo solamente (Vehíc.) y la LDH liberada se ensayó a lo largo del tiempo usando un kit de ensayo de citotoxicidad de LDH Pierce. n = 3. B. El Compuesto 1 induce una reducción significativa de los niveles de ATP intracelular. De nuevo, las células se trataron con el Compuesto 1 o el Vehículo (Vehíc.) y los niveles de ATP intracelular se analizaron en los puntos temporales indicados usando un kit de ensayo CellTiter-Glo 2®. n = 3.
La Figura 4 proporciona A. Determinación de la liberación de ATP de las líneas celulares de cáncer en respuesta al tratamiento con el Compuesto 1. Las células se trataron con el Compuesto 1 o el Vehículo (Vehíc.) durante los tiempos indicados y se ensayó la liberación de ATP de los sobrenadantes del cultivo celular usando un kit de ensayo de ATP basado en bioluminiscencia. Se determinaron valores medios de ULR /- D.T. y se representaron frente al tiempo. n = 4. B. Análogos de epoxitigliano adicionales (Compuesto 2: Bi, compuesto 3: Bii y Compuesto 4: Biii) también promueven la liberación de ATP de las líneas celulares A431, MM649 y B16-OVA. n = 4. C. Determinación de la liberación de HMGB1 de líneas celulares de cáncer tratadas con el Compuesto 1 y análogos de epoxitigliano. Se analizaron sobrenadantes de cultivos celulares de epoxitigliano o vehículo (Vehíc.) tratados con A431 (Ci), MM649 (Cii) o B16-OVA (Ciii) para la liberación de HMGB1 mediante ELISA. Los valores de las células tratadas con el Compuesto 1 se normalizaron a las células tratadas con el vehículo para determinar el aumento en veces de la liberación de HMGB1. n = 2 para A431 y MM649, mientras que n = 3 para B16-OVA. (Civ) La liberación de HMGB1 también se produjo en respuesta al tratamiento con los Compuestos 2, 3 y 4. n = 3. D. El Compuesto 1 promueve la externalización de calreticulina en una gama de líneas celulares de cáncer. Se trataron A431 (Di), MM649 (Dii) y B16-OVA (Diii) con el Compuesto 1 o el Vehículo (Vehíc.) solamente durante los tiempos indicados y después se tiñeron con Alexa 488 anti-Calreticulina/anti-conejo antes de la citometría de flujo. Se indican los valores medios de intensidad de fluorescencia (Ex: 488 nm, Em: 530/530 nm) /- DT para cada punto temporal.
La Figura 5 proporciona A y B. Las células tratadas con epoxitigliano se procesan por BMDC CD11c+ in vitro. Se incubaron células B16-OVA marcadas con CMFDA tratadas con el Compuesto 1 o el vehículo (Vehíc.) con BMDC inmaduras durante 4 h y después se tiñeron con anti-CD11c-APC antes de la citometría de flujo. Caja de color gris sólida - Células BMDC CD11c+. Caja de color negro discontinua - BMDC CD11c+ que han absorbido fragmentos de células B16-OVA moribundas (CMFDAmid CD11c+). El porcentaje de células CMFDAmid CD11c+ se indica en 5A y se muestran los datos de 4 réplicas biológicas en la Figura 5B. n = 4. C. Los análogos de epoxitigliano también inducen la captación de células B16-OVA por BMDC CD11 c+. Se representan los datos adquiridos a partir del uso de los Compuestos 2, 3 y 4. n = 3.
La Figura 6 proporciona A: Esquema del enfoque experimental para las combinaciones de Compuesto 1 e ICI. Todos los tumores se inyectaron con 15/30 |jg de Compuesto 1 o Vehículo (Vehíc.). También se representa la pauta de dosificación del tratamiento con ICI. B y C. Gráficos de Kaplan-Meier que indican el % de tumores tratados que permanecen por debajo de 100 mm3 de tamaño bajo las distintas condiciones de tratamiento con ICI, ya sea con anti-PD-1 (Figura 6B) o anti-CTLA-4 (Figura 6C). También se representa la supervivencia del ratón en respuesta a la combinación.
La Figura 7 proporciona A: Un diagrama esquemático del enfoque de la terapia de combinación: el tumor índice y el vecino se muestran junto con la pauta de dosificación; y B: Representaciones gráficas de los resultados de la terapia de combinación (volúmenes tumorales). Anticuerpo de isotipo Compuesto 1 (línea de puntos), Anticuerpo anti-PD-1 o Anticuerpo anti-CTLA-4 vehículo (línea de guiones) y Anticuerpo anti-PD-1 o Anticuerpo anti-CTLA-4 Compuesto 1 (línea sólida) en tumores tratados (círculos de color blanco) y vecinos (círculos de color negro).
La Figura 8 proporciona análisis de tumores basados en el volumen (panel izquierdo) y Kaplan-Meier (panel derecho) (% de tumores ≤ 100 mm3) inyectados con una dosis subóptima del Compuesto 1 (15 jg ) en entornos ts y con inactivación de GCSF.
Ejemplos
Los compuestos de la presente invención pueden obtenerse por aislamiento de una planta o parte de una planta, o por derivatización del compuesto aislado, o por derivatización de un compuesto relacionado. Pueden encontrarse procedimientos de aislamiento y de derivatización en los documentos WO 2007/070985 y WO2014/169356.
El Compuesto 6, el derivado de 20-acetilo del compuesto 1, puede producirse a partir del Compuesto 1 mediante acetilación con anhídrido acético (1 equiv) en presencia de trietilamina en diclorometano. Estas condiciones permiten la acetilación selectiva del grupo C-20 hidroxi sin acetilación de los grupos hidroxi secundarios.
El Compuesto 10, aunque no se sintetiza específicamente en el documento WO2014/169356, puede prepararse usando el método general para obtener ésteres asimétricos establecido en el Ejemplo 1 del documento WO2014/169356, páginas 64 a 70.
Ejemplo 1: Los análogos de epoxitigliano activan las isoformas de PKC
La proteína cinasa C es una familia de enzimas clave implicadas en las vías de señalización que fosforilan específicamente los sustratos en los restos de serina/treonina. La fosforilación por PKC es importante en la regulación de una diversidad de eventos celulares tales como la proliferación y la regulación de la expresión génica. Las isoformas de PKC (-0, -r|, -a, -p, -8, -£) están directamente implicadas en las respuestas de las células inmunitarias y también pueden promover la expresión de genes inmunitarios clave. Sin embargo, el patrón de expresión y los niveles de cada una de estas isoformas de PKC son específicos del tipo de célula y del contexto (Lim y col. 2015; Anel y col. 2012; Pfeifhofer y col. 2006).
Para identificar perfiles específicos de activación de isoformas de PKC (especificidad y potencia) de compuestos de epoxitigliano, se transfectaron transitoriamente células HeLa con una selección de vectores PKC-EGFP (PKC-a, p Kc -PI, PKC-pII, PKC-y , PKC-8, PK-C0, PKC-r|, PKC-Z - generados internamente) usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen) siguiendo los métodos descritos en Boyle y col. 2014. Se mezcló un volumen correspondiente a 0,16 jg de PKC-EGFP y 0,48 j l de lipofectamina con 25 j l de medio Opti-MEM (Invitrogen) y se incubó durante 5 min a TA. Las soluciones se combinaron y se incubaron durante otros 20 min a TA (relación 1:3 de ADN:Lipofectamina 2000). Se añadieron los complejos (50 j l ) a cada pocillo y después de 3 h de incubación a 37 °C, se añadieron otros 50 j l de RPMI-1640, FCS al 10 % hasta un volumen total de 100 j l por pocillo. Después de 24 h de incubación a 37 °C, las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se trataron con 500, 50 y 5 nM de epoxitigliano. Se pudieron ensayar tres compuestos por placa de 96 pocillos. Se requirieron cinco placas de 96 pocillos por ciclo experimental. Después de 1 h de tratamiento, las células se lavaron dos veces con 100 j l de PBS y se fijaron con 50 j l de formaldehído al 2 %/gluteraldehído al 0,2 % en PBS durante 10 min. Posteriormente, las células fijadas se lavaron dos veces con 100 j l de PBS. Para teñir los núcleos se usó Hoechst 3342 a una dilución de 1:10000. Después de 7 min de incubación en la oscuridad, se retiró Hoechst y las células se lavaron con PBS. Por último, las células se cubrieron con 100 j l de PBS y se almacenaron a 4 °C en la oscuridad hasta la formación de imágenes. Las imágenes se realizaron usando un GE InCell Analyzer 2000. La translocación de PKC a la membrana plasmática u otras posiciones subcelulares se contó manualmente usando Adobe Photoshop CS6.
Las imágenes que muestran la translocación de isoformas de PKC seleccionadas -a, -pII, -y , -8 y -0 a la membrana celular en presencia de los compuestos epoxitigliano Compuesto 1, Compuesto 3, así como PMA (forbol-12-miristato-13-acetato) se muestran en la Figura 1A. Estas imágenes indican que diferentes compuestos de epoxitigliano pueden activar diferentes isoformas de PKC.
El porcentaje de células que muestran translocación de la membrana plasmática de los Compuestos 1 a 10, así como el control positivo de PMA, se convirtieron en un Mapa de calor que representaba el perfil de translocación de la isoforma de PKC en respuesta a 500, 50 y 5 nM de cada compuesto. El Mapa de calor se muestra en la Figura 1B.
Los resultados muestran que los Compuestos 1 a 7 activan PKC-0 (en diferentes grados), una isoforma de PKC que se sabe que está implicada en la activación de linfocitos T y NK y la supresión del desarrollo de Treg (Brezar y col., 2015; Anel y col., 20l2). Todos los compuestos epoxi-tigliano activan PKC-p, que es crítico en la señalización del receptor de linfocitos B y la presentación de antígenos (p. ej., Kang y col. 2001; Lim y col. 2015). También se han implicado otras tres isoformas de PKC (-r|, -a, -8) que fueron activadas más débilmente por algunos o todos los epoxitiglianos directamente en las respuestas de las células inmunitarias (Lim y col. 2015; Pfeifhofer y col. 2006)
Ejemplo 2: Cambios en la expresión génica en el estroma tumoral de ratón coherentes con el reclutamiento de células inmunitarias y la inducción de una respuesta inmunitaria antitumoral similar a Th-1/M1
La respuesta similar a Th1/M-1 en la inmunidad antitumoral. Se ha asociado una respuesta inmunitaria similar a Th1/M1 con la inducción de inmunidad celular antitumoral a través de una gama de mecanismos que incluyen actividad tumoricida directa, modificación de las respuestas de citocinas antitumorales y potenciación de la memoria inmunológica a largo plazo. Por ejemplo, varias líneas de evidencia muestran que los linfocitos T CD4+ auxiliares de tipo 1 (Th1), los impulsores de la inmunidad de Th1, pueden contribuir al aclaramiento de las células tumorales a través de la secreción de diversas citocinas, incluyendo interferón-Y (IFN-y), interleucina-2 (IL-2) y factor de necrosis tumoral-a (TNF-a) (Knutson y col.2005; DeNardo y col. 2010; Burkholder y col. 2014). Estas citocinas promueven las actividades de varios tipos celulares, incluyendo las células presentadoras de antígenos (APC), los linfocitos T citotóxicos, los linfocitos NK y diversos subtipos de células inmunitarias innatas (p. ej., Cohen y col.2000; Bos y Sherman 2010). También se sabe que IFN-y y TNF tienen efectos directos sobre la supervivencia de las células tumorales (Sugarman y col. 1985; Bayaert y col. 1994). Aunque IL-1 e IL-6 (producidas por los macrófagos M1) se han asociado con el desarrollo de tumores, la evidencia más reciente sugiere que, de hecho, son componentes cruciales de las respuestas inmunitarias antitumorales agudas (Haabeth y col.
2011; Gabrilovich y col. 2012; Haabeth y col. 2016). Se ha demostrado que potencian la proliferación de linfocitos B y la producción de anticuerpos, aumentan la actividad de las células presentadoras de antígenos (APC), estimulan la proliferación de tipos celulares citotóxicos específicos de antígeno y promueven la diferenciación de linfocitos Th1 (Haabeth y col. 2011; Burkholder y col. 2014). También se ha demostrado que las combinaciones entre las citocinas Th1 y M1 son importantes en la inmunovigilancia tumoral. Por ejemplo, tanto IL-1 como IFN-y actúan en sinergia para activar la actividad tumoricida de los macrófagos (Hori y col. 1989; Haabeth y col. 2016). Es importante destacar que la aparición de macrófagos M1 y linfocitos Th1 en los tumores se ha asociado positivamente a un pronóstico y tiempos de supervivencia mejorados en muchos tipos de cáncer (Pages y col. 2010; Fridman y col. 2012; Senovilla y col. 2012). De hecho, se ha propuesto inducir la inflamación de tipo Th1/M1 para mejorar significativamente los enfoques basados en la inmunoterapia contra el cáncer (Haabeth y col. 2012). A continuación se describe el efecto del Compuesto 1 en la promoción de una respuesta inmunitaria antitumoral similar a Th1/M1 en el estroma de un modelo en ratón de xenoinjerto.
Estroma de ratón en xenoinjertos de tumores humanos de ratones. La línea celular de melanoma humano SK-MEL-28 se inyectó por vía subcutánea (s.c.) en 2 sitios en los flancos de cada ratón BALB/c Foxnlnu (2 millones de células/sitio) y se dejó crecer hasta aproximadamente 7 mm de diámetro. Después, se inyectó a cada tumor 50 μl de propilenglicol al 20 % que contenía 30 μg del Compuesto 1 o 50 μl de propilenglicol al 20 %. En diferentes momentos después de la inyección, se practicó la eutanasia a un ratón y se recogieron los tumores, se retiró la cubierta de piel y se almacenaron los tumores intactos a -80 °C
Extracción de ARN. El ARN se extrajo de 30 mg de tumor congelado usando el kit Qiagen RNeasy Plus Mini, según las instrucciones del fabricante, después se cuantificó con un instrumento NanoDrop y se confirmó la integridad en geles de agarosa desnaturalizantes que llevaban un marcador de ADN de 1 kb y se tiñeron con bromuro de etidio.
Amplificación y marcaje de ARN. Aproximadamente 500 ng de ARN total sin marcar se ajustaron a un volumen final de 11 μl con agua sin nucleasas. El ARN se incubó con 9 μl de la mezcla maestra de transcriptasa inversa (1 μl de Cebador T7 Oligo (dT), 2 μl de tampón de primera cadena 10x, 4 μl de mezcla de dNTP, 1 μl de inhibidor de RNasa y 1 μl de ArrayScript) a 42 °C durante 2 h. A esto le siguió la etapa de síntesis del ADNc de la segunda cadena, que implicó una incubación adicional a 16 °C durante 2 horas con 80 μl de la mezcla maestra de la segunda cadena (63 μl de agua sin nucleasas, 10 μl de tampón de la segunda cadena 10X, 4 μl de mezcla de dNTP, 2 μl de ADN polimerasa y 1 μl de ARNasa H). El ADNc se purificó filtrando a través de un cartucho de filtro de ADNc con 250 μl de tampón de unión a ADNc y lavando con 500 μl del tampón de lavado proporcionado en el kit. El ADNc purificado se eluyó con 20 μl de agua sin nucleasas a 55 °C. Cada muestra de ADNc se incubó con 7,5 μl de la mezcla maestra IVT (2,5 μl de tampón de reacción T710X, 2,5 μl de mezcla de enzimas T7 y 2,5 μl de mezcla de biotina-NTP) a 37 °C durante 16 h. La reacción se detuvo con la adición de 75 μl de agua sin nucleasas a cada muestra de ARNc. El ARN biotinilado y amplificado se purificó filtrando las muestras de ARNc a través de cartuchos de filtro de ARNc con 350 μl de tampón de unión de ARNc y 250 μl de etanol al 100 % mezclados antes de cargarlos en los filtros. Los cartuchos de filtro de ARNc con ARN adjunto se lavaron después con 650 μl de tampón de lavado antes de eluir el ARNc purificado con 200 μl de agua libre de nucleasas a 55 °C.
Hibridación de BeadChip de expresión Illumina. Las muestras de ARNc se calentaron a 65 °C durante 5 min y se recogieron mediante centrifugación por pulsos. Después de calentar a 65 °C durante 5 min, se dividieron en alícuotas aproximadamente 750 ng de la muestra de ARNc en tubos separados a los que se le añadieron ~5 μl de agua sin RNasa y 10 μl de Hyb Mix. Se cargaron aproximadamente 15 μl de la mezcla de ARNc preparada en BeadChips (chips de perlas) de expresión Illumina. Las etapas posteriores de hibridación y lavado se realizaron según la Guía de ensayo de hibridación directa de expresión génica del genoma completo suministrada por Illumina. Los BeadChips de expresión HumanHT-12 v4 cubren más de 47.000 transcritos y variantes de corte y empalme conocidas en el transcriptoma humano. Los BeadChips de expresión MouseRef-8 v2.0 cubren aproximadamente 25.600 transcritos de RefSeq (secuencia de referencia) bien anotados, que comprenden más de 19.000 genes únicos.
Análisis de los datos. Los BeadChips se leyeron mediante el sistema iScan y se transfirieron a través de GenomeStudio a GeneSpring GX v12.5 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.). Los valores de expresión se normalizaron usando la normalización por cuantiles con la configuración predeterminada. Las entidades se filtraron basándose la puntuación de detección calculada por GenomeStudio donde p ≤ 0,05 se consideró significativo.
Los resultados se muestran en la Figura 2. La Figura 2A muestra que varias citocinas/quimiocinas del hospedador que son importantes para el reclutamiento/activación de células inmunitarias se regulan positivamente en el sitio tumoral en respuesta al tratamiento con el Compuesto 1. Cabe destacar que se sabe que Cxcll, que está muy regulada positivamente por el Compuesto 1, promueve el reclutamiento de neutrófilos y la posterior destrucción de células cancerosas residuales (Garg y col. 2017). Además, la Figura 2B muestra que el Compuesto 1 induce cambios en la expresión génica en el hospedador que se asocian al desarrollo de una respuesta similar a Th-1/M, es decir, inducción de IFN-y, TNF, IL-6 e IL-1 p. Los datos también sugieren que puede haber una regulación negativa de la señalización de TGF beta (Figura 2C), que es una vía de señalización inmunosupresora conocida (Neuzillet y col. 2015).
Ejemplo 3: Demostración de que las concentraciones terapéuticas del compuesto 1 y otros epoxitiglianos inducen oncosis celular
La oncosis es una forma de muerte celular necrótica, caracterizada por la inflamación y ruptura de los orgánulos subcelulares y la posterior permeabilización de la membrana plasmática, debido en parte a la pérdida de la actividad de la bomba de iones impulsada por ATP que mantiene el equilibrio osmótico. Se ha demostrado que la oncosis es de naturaleza inmunogénica y se asocia a la eficacia de algunos virus oncolíticos y moléculas pequeñas desarrolladas como agentes antineoplásicos (p. ej., Dyer y col. 2016).
Líneas celulares, reactivos y medios. Se cultivaron células A431 (carcinoma epidermoide humano), MM649 (melanoma humano), B16-OVA (línea celular de melanoma de ratón B16-F10 transfectada de forma estable con ovoalbúmina de pollo), MM415 (melanoma humano) y FaDu (carcinoma hipofaríngeo humano) en RPMI-1640, FCS al 10 % (medio completo) a 37 °C, CO2 al 5 % en una incubadora humidificada. Todas las líneas celulares utilizadas en este estudio se confirmaron como negativas para micoplasma usando MycoAlert (Lonza). También se realizó un perfil de STR para confirmar la identidad de las líneas celulares humanas utilizadas.
Ensayos de citotoxicidad IncuCyte. Se evaluaron cuatro líneas celulares de cáncer (A431, MM649 (melanoma humano), FaDu (CCECC) y MM415 (melanoma humano) para determinar su respuesta al tratamiento con epoxitigliano. Las células se sembraron en placas a una densidad de 10.000 células por pocillo (100 μl de medio completo) en placas de 96 pocillos de color negro de fondo transparente (Corning, n.° 3603). Después de 24 h de incubación, se aspiró el medio de cada pocillo y se reemplazó con 50 μl de medio fresco que contenía yoduro de propidio (PI) 1 μg/ml. Se diluyeron soluciones madre (20 mg/ml en etanol) de cuatro epoxitiglianos (Compuestos 1, 2, 3 y 4) a 2* la concentración final del ensayo (1 mM) en medios idénticos y se insertaron en una placa de 96 pocillos con fondo en U en preparación para la transferencia. Se añadieron 50 μl de dilución a los pocillos necesarios y las placas resultantes se insertaron en un IncuCyte de Essen Biosciences en preparación para la formación de imágenes. Las imágenes se obtuvieron en diversos puntos temporales (30 min, 1 h y a intervalos de una hora) durante un total de 24 h.
Ensayos de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH). La medición de la liberación de LDH es un ensayo bien reconocido para evaluar la permeabilización de la membrana plasmática y detectar la muerte celular por necrosis (Chan y col. 2013). En estos ensayos se usaron tres líneas celulares (A431, MM649 y B16-OVA). Las células se sembraron en placas a una densidad de 10.000 células por pocillo en placas transparentes de 96 pocillos (Corning, n.° 3595; 100 μl de medio completo) y las placas resultantes se incubaron durante la noche como se ha detallado anteriormente. Al día siguiente, se aspiró el medio de cada pocillo y se insertaron 50 μl de medio fresco. Se diluyeron soluciones madre del Compuesto 1 a concentraciones de ensayo finales 2* (1 mM y 600 μM) y se añadieron 50 μl de estas diluciones a los pocillos necesarios. También se compilaron y administraron soluciones de control de etanol solamente. En los puntos temporales indicados, se retiraron 50 μl de medio y se analizó la liberación de LDH usando un kit de ensayo de citotoxicidad de LDH Pierce (ThermoFisher Scientific). Se registraron lecturas de DO490 nm y DO690 nm para cada muestra usando un lector de placas Hybrid Synergy H4. Las lecturas de absorbancia de las muestras tratadas con fármaco se normalizaron con respecto a los controles tratados con detergente para determinar el % de liberación de LDH por pocillo.
Ensayo de ATP intracelular. Se usaron kits de ensayo CellTiter-Glo® 2.0 (Promega Corporation), un ensayo basado en luminiscencia que cuantifica la cantidad de ATP presente en las células, para determinar los niveles de ATP intracelular en cultivos de A431 y MM649 expuestos a dos concentraciones (300 μM y 500 μM) del Compuesto 1. De nuevo, las células se sembraron en placas a una densidad de 10.000 células por pocillo en placas de color negro de 96 pocillos de fondo transparente (en 100 μl de medio completo) y se incubaron a 37 °C, CO2 al 5 % durante la noche. En el momento del ensayo, se aspiró el medio de cada pocillo y se insertaron 50 μl de medio fresco. Se diluyeron soluciones madre del Compuesto 1 a concentraciones de ensayo finales 2* (1 mM y 600 μM) y se añadieron 50 μl de estas diluciones a los pocillos necesarios. También se compilaron y administraron soluciones de control de etanol solamente. En los puntos temporales indicados, los medios se retiraron suavemente asegurándose de no perturbar las células y se añadieron 100 |jl de Reactivo CellTiter-Glo® 2.0. La placa resultante se mezcló en un agitador orbital durante 2 minutos para inducir la lisis celular, después de lo cual se incubó en la oscuridad durante 10 minutos. Después, se determinó la señal luminiscente en cada pocillo. Las señales luminiscentes de los pocillos tratados con compuesto se normalizaron a pocillos tratados con vehículo y se expresaron como % de ATP intracelular frente al tiempo.
Las imágenes adquiridas del IncuCyte mostraron una fuerte tinción roja después de 120 minutos en la mayoría de las células de las cuatro líneas celulares tratadas con 500 jM de los Compuestos 1, 2, 3 y 4 (A431, FaDu, MM649 y MM415). No hubo tinción de las células tratadas con el vehículo solamente, lo que confirma que la pérdida de integridad de la membrana plasmática se limitó a las células tratadas con el Compuesto 1. Además, también se observó una hinchazón citoplásmica significativa y formación de ampollas en todas las células tratadas con los Compuestos 1, 2, 3 y 4, aunque en diferentes grados y con diferentes cinéticas de aparición.
Los resultados de los ensayos para evaluar la liberación de LDH y para evaluar los niveles de ATP intracelular se muestran en las Figuras 3A y 3B, respectivamente. En comparación con los controles, hubo una liberación significativa de LDH de las tres líneas de células cancerosas tratadas con ambas concentraciones del Compuesto 1 que se ensayaron (300 jM y 500 jM ) (Figura 3A). Los niveles de ATP intracelular disminuyeron muy rápidamente después del tratamiento con 500 jM del Compuesto 1 y eran casi indetectables después de 60 minutos (Figura 3B). A 300 jM del Compuesto 1, el ATP intracelular disminuyó más lentamente y de forma menos catastrófica que para la concentración de 500 jM del Compuesto 1, siendo aproximadamente el 50 % del nivel de pretratamiento después de 120 minutos (Figura 3B). El agotamiento de ATP se ha asociado anteriormente con la inducción de oncosis (Kim y col. 2003).
Estos resultados demuestran que los compuestos de epoxitigliano inducen oncosis a concentraciones terapéuticamente pertinentes (es decir, aquellas concentraciones que son eficaces para inducir necrosis hemorrágica in vivo).
Ejemplo 4: La oncosis inducida por el compuesto 1 y otros epoxitiglianos muestra características de muerte celular inmunogénica
La muerte celular inmunogénica (ICD, por sus siglas en inglés) es un tipo específico de muerte celular regulada que da como resultado la liberación o externalización de mediadores llamados patrones moleculares asociados al daño (DAMP, por sus siglas en inglés), que interactúan con los receptores expresados por las células dendríticas/macrófagos para promover su reclutamiento y estimular la captación/ presentación de antígenos tumorales a los linfocitos T. ICD es una vía importante para la activación del sistema inmunológico contra el cáncer. Las características bioquímicas de la ICD incluyen la exposición de calreticulina (CALR) y otras proteínas del retículo endoplásmico/mitocondriales en la superficie de las células moribundas, y la liberación de grandes cantidades de ATP y la caja 1 del grupo de alta movilidad (HMGB1) en el entorno extracelular (Kroemer y col. 2013). Estos parámetros se han utilizado para hacer predicciones precisas sobre la capacidad de los fármacos quimioterápicos (incluyendo doxorrubicina, mitoxantrona, oxaliplatino y bortezomib) para inducir ICD (Kroemer y col.2013; Galluzzi y col.2017). La capacidad de los epoxitiglianos para inducir estas características se detalla a continuación.
Líneas celulares, reactivos y medios. Se cultivaron células A431 (carcinoma epidermoide humano), MM649 (melanoma humano) y B16-OVA (línea celular de melanoma de ratón B16-F10 transfectada de forma estable con ovoalbúmina de pollo) en Rp MI-1640, FCS al 10 % (medio completo) a 37 °C, CO2 al 5 % en una incubadora humidificada. Las BMDC se cultivaron en medio R10 (RPMI, FCS al 10 %, glutamina 2 mM, beta-mercaptoetanol 50 jM , Pen/Strep). Todas las líneas celulares utilizadas en este estudio se confirmaron como negativas para micoplasma usando MycoAlert (Lonza). También se realizó un perfil de STR para confirmar la identidad de las líneas celulares humanas utilizadas.
Ensayos de liberación de ATP. Las líneas celulares se colocaron en placas a una densidad de 10.000 células por pocillo en placas transparentes de 96 pocillos (Corning, n.° 3595; 100 j l de medio completo) y las placas resultantes se incubaron durante la noche como se ha detallado anteriormente. Al día siguiente, se aspiró el medio de cada pocillo y se insertaron 50 j l de medio fresco. Se diluyeron soluciones madre los Compuestos 1,2, 3 y 4 a una concentración de ensayo final 2* (1 mM y 600 jM ) y se añadieron 50 j l de estas diluciones a los pocillos necesarios. También se compilaron y administraron soluciones de control de etanol solamente. En los puntos temporales indicados, se retiraron 80 j l de medio, se centrifugaron a 1200 rpm durante 4 minutos para sedimentar los restos celulares y se ensayaron para determinar el ATP en 50 j l usando un kit de ensayo de ATP basado en bioluminiscencia (FLAA, Sigma-Aldrich). Se registraron las unidades relativas de luminiscencia para cada muestra usando un lector de placas Hybrid Synergy H4 (BioTek).
Ensayos de liberación de HMGB1. Las líneas celulares (A431, MM649 y B16-OVA) se sembraron en matraces T75 cm2 (Nunc) en 10 ml de medio completo y se cultivaron a 37 °C, CO2 al 5 % hasta alcanzar el 90 % de confluencia. Los Compuestos 1,2, 3 y 4 se diluyeron en 5 ml de medios idénticos hasta una concentración final de 500 y 300 jM y después se administraron a las células. Se prepararon varios matraces de manera que se pudiera establecer una curva cinética de liberación de HMGB 1 en respuesta al tratamiento farmacológico. También se generaron controles de etanol solamente. En el punto temporal requerido, los medios se retiraron del matraz a un tubo de polipropileno de 10 ml que se colocó en hielo durante 5 minutos. Los sobrenadantes de cultivos celulares se centrifugaron a 1200 rpm durante 4 minutos para retirar los restos celulares, después de lo cual se insertaron 4,5 ml de sobrenadante en una columna de centrifugación concentradora (Membrana de corte Ultra 50 kDa Amicon®, Merck) para retirar FCS. Después, el flujo de esta columna se insertó en otra columna concentradora (Membrana de corte Ultra 10 kDa Amicon®, Merck) y se centrifugó a 3500 rpm para concentrar HMGB 1 antes del ensayo mediante ELISA (SEA399Hu/SEA399Mu, Cloud-Clone Corp). Los valores de DO450 nm se determinaron usando un lector de placas Hybrid Synergy H4 (BioTek). Los valores de absorbancia de las muestras tratadas con fármaco se normalizaron con respecto a las muestras tratadas con vehículo para determinar el aumento de veces en la liberación de HMGB 1 en respuesta al tratamiento con epoxitigliano.
Ensayos de extemalización de calreticulina. La externalización de calreticulina se determinó como se detalló anteriormente (Gómez-Cadena y col. 2016). Brevemente, se separaron células (A431, MM649, B 16-OVA) cultivadas en medio completo a 37 °C, CO2 al 5 % mediante tripsinización, se centrifugaron a 1200 rpm y se lavaron x2 con medio fresco. Después de una ronda adicional de centrifugación, el sedimento celular resultante se resuspendió a una concentración de 1 * 106 células/ml, después de lo cual se añadió epoxitigliano hasta una concentración final de 500 o 300 |jM. También se realizaron controles de etanol solamente. Las suspensiones celulares se incubaron a 37 °C, CO2 al 5 % y en los puntos temporales indicados, se retiraron 200 j l de la muestra y se incubaron con colorante rojo lejano fijable VIVO/MUERTO durante 5 minutos en hielo. Después de esto, las células se sedimentaron a 1200 rpm durante 4 minutos y se lavaron * 1 con PBS. Después, se añadieron 500 j l de PBS, formaldehído al 0,25 % a cada sedimento para realizar una fijación ligera sin comprometer la integridad de la membrana plasmática. Después de esto, las células se lavaron * 1 con PBS y se añadieron 100 j l de PBS, BSA al 1 %, EDTA 2 mM (tampón FAC) que contenía anti-Calreticulina (ab2907, Abeam; dilución 1:50). Después de 1 hora de incubación a temperatura ambiente, las células se centrifugaron a 1200 rpm durante 4 minutos y se lavaron * 1 con tampón FAC antes de la incubación con 100 j l de tampón FAC que contenía anti-Alexa488 de conejo a 1:750 durante una hora más a temperatura ambiente. Las células se sedimentaron de nuevo y después se resuspendieron en 500 j l de tampón FAC en preparación para la citometría de flujo.
Las muestras se controlaron por FSC-H v FSC-A en primer lugar para identificar células individuales, después de lo cual la tinción VIVO/MUERTO (Ex: 640 nm, Em: 670/14) se analizó la población negativa (células intactas) para fluorescencia verde (Ex: 488 nm, Em: 530/30; externalización de calreticulina). Los valores medios de intensidad de fluorescencia se determinaron posteriormente y se representaron gráficamente frente al tiempo.
Los resultados mostraron que la rápida oncosis inducida por los compuestos de epoxitigliana también indujo características de muerte celular inmunogénica, con la liberación/externalización de DAMP críticos que incluyen ATP (Figuras 4A y 4B), HMBG1 (Figura 4C) y calreticulina (Figura 4D). Hubo una liberación significativa de ATP a los 60 minutos en las tres líneas de células cancerosas tratadas con ambas concentraciones del Compuesto 1 (Figura 4A) y de los Compuestos 2, 3 y 4 (Figura 4B). Estos compuestos también promovieron la liberación de HMGB 1 de las líneas de células cancerosas. Después de que los valores del ensayo ELISA para las células tratadas se normalizasen a las células tratadas con vehículo para determinar el aumento de veces, se demostró que el Compuesto 1 aumenta la liberación de HMBG1 en 120 minutos hasta en un 40 % para las células A341 y MM649 (Figuras 4Ci y 4Cii), y en más de 3 veces para las células B16-OVA (Figura 4Ciii). Los Compuestos 2, 3 y 4 que también se analizaron en linfocitos B 16-OVA y mostraron un aumento mínimo de 2 veces en la liberación de HMBG1 de esta línea celular después de 120 minutos (Figura 4Civ). Los datos de externalización de calreticulina después del tratamiento de las 3 líneas celulares con el Compuesto 1 mostraron aumentos significativos en la intensidad de fluorescencia media a los 60 minutos de tratamiento (Figura 4D). Se sabe que dicha liberación/externalización de DAMP promueve el reclutamiento de células presentadoras de antígenos, estimula la absorción eficiente de antígenos asociados a células cancerosas y estimula la presentación a subconjuntos de linfocitos T (Kolaczkowska y Kubes, 2013)
Ejemplo 5: Fragmentos de células cancerosas tratadas con epoxitigliano son ingeridos por poblaciones de células derivadas de médula ósea CD11c+
CD11c es un marcador bien descrito de DC/macrófagos (Merad y col. 2013). Una forma de investigar el potencial de los agentes antineoplásicos (y los procesos de muerte asociados que inducen) para promover el desarrollo de respuestas inmunogénicas es determinar si conducen a la captación de componentes celulares por parte de células dendríticas/macrófagos CD 11c+ y su posterior maduración en células presentadoras de antígeno (APC) auténticas (Guermonprez y col. 2002). En la presente memoria los presentes inventores demuestran que la oncosis inducida por el Compuesto 1 y los epoxitiglianos relacionados conduce a la captación de componentes de células cancerosas moribundas por dichas células.
Aislamiento y cultivo de células derivadas de médula ósea (BMDC, por sus siglas en inglés). En primer lugar se extirparon quirúrgicamente las tibias y los peroné de cuatro ratones C57Bl/6 de 7-8 semanas de edad en condiciones estériles. La médula se descargó de la cavidad ósea con 10 ml de medio R10 enfriado con hielo (usando una aguja/jeringa 27G en un tubo de polipropileno de 50 ml). Las células se sedimentaron a 1500 rpm durante 5 minutos y se lavaron x 2 con medio R10 enfriado con hielo. Después de la resuspensión del sedimento en 10 ml de medio R10 enfriado con hielo, las células se contaron usando un hemocitómetro mejorado y se sembraron en placas a una densidad de 2x106 células por placa (placa petri) en 10 ml de R10 suplementado con GM-CSF murino 20 ng/ml. Todas las placas se incubaron a 37 °C, CO2 al 5 % y el día 3 se añadieron 10 ml adicionales de R10 con GM-CSF 20 ng/ml. Las células se alimentaron de nuevo el día 6 y se usaron para ensayos corriente abajo el día 7.
Experimentos de captación de BMDC. Antes de la coincubación con BMDC, las células B16-OVA se tripsinizaron, se centrifugaron a 1200 rpm durante 4 minutos para sedimentar las células y se lavaron *2 con medio completo. Después, las células se tiñeron con Cell Tracker Green 2 jM en medio completo durante 45 minutos, después de lo cual se sedimentaron y lavaron *2 como anteriormente. Los linfocitos B 16-OVA marcados se trataron posteriormente con los Compuestos 1,2, 3 y 4 a dos concentraciones (500 o 300 j M) en medios a una densidad de 1x106 células/ml durante 30 y 60 minutos, después de lo cual las células se sedimentaron mediante centrifugación, el sobrenadante se retiró mediante aspiración y el sedimento celular se lavó * 1 con medio completo. Después del lavado, las células tratadas se resuspendieron en medio R10, se insertaron en los pocillos de una placa de 6 pocillos (Corning, n.° 3471. Superficie de fijación ultrabaja) y se añadieron BMDC. Los cocultivos se incubaron durante 4 h, después de lo cual las suspensiones celulares se transfirieron a un tubo de microcentrífuga y se centrifugaron a 1.500 rpm durante 5 minutos. Los sedimentos se resuspendieron en 100 j l de tampón FAC que contenía anti-CD11c-APC y se incubaron durante 10 minutos a 4 °C. Las células se sedimentaron de nuevo, se lavaron x 1 con tampón FAC y después se fijaron usando PBS, formaldehído al 1 % durante 10 minutos. Después de la centrifugación y la retirada del sobrenadante, las células se resuspendieron en 500 j l de tampón FAC en preparación para la citometría de flujo.
Las muestras se seleccionaron en primer lugar por FSC-H frente a FSC-A, después por SSC-H frente a SS-A para identificar células individuales. La proporción de células CD11c+ (Ex: 640 nm, Em: 670/14) con CMFDAmid (Ex: 488 nm, Em: 530/30) se determinó después para las células tratadas y sin tratar como porcentaje de todas las células CD11 c+.
Los resultados (Figuras 5A y 5B) muestran que la oncosis inducida por el Compuesto 1 promueve la captación (es decir, la ingestión eficaz) de fragmentos de células cancerosas moribundas por parte de células dendríticas/macrófagos CD11c+. Esta ingestión parece depender tanto de la concentración del Compuesto 1 como del tiempo de tratamiento, de manera que a 500 j M del Compuesto 1 se produce la captación del antígeno en mayor medida después de un tiempo de tratamiento más corto en comparación con el uso de 300 j M. Esto es coherente con la cinética de la oncosis observada en el Ejemplo 3. La Figura 5C demuestra que los Compuestos 2, 3 y 4 también son capaces de inducir una respuesta de muerte celular que es inmunogénica in vitro, es decir promueve la captación por BMDC CD11c+.
Ejemplo 6: Combinación del compuesto 1 con inhibidores de puntos de regulación inmunitarios
Las terapias con inhibidores del puntos de regulación inmunitarios, especialmente aquellas dirigidas a los receptores implicados en la inmunosupresión de los linfocitos T (p. ej., la proteína 4 asociada a los linfocitos T citotóxicos (CTLA-4) o la muerte programada 1 (PD-1) y su ligando PD-L1), han mejorado enormemente la resultados en varios tipos de cáncer en etapa tardía, incluyendo el melanoma, el carcinoma de células renales, el cáncer de vejiga y el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (CCECC) (Msaouel y Massarelli 2016; Sharma y Allison 2015). Sin embargo, la resistencia primaria y de novo a estos fármacos ICI es un problema clínico importante. Además, un extenso seguimiento clínico ha demostrado que algunos pacientes con melanoma están desarrollando resistencia al tratamiento y experimentan una recaída de la enfermedad (O'Donnell y col., 2017). Las terapias que combinan ICI con compuestos que pueden actuar como adyuvantes al promover la muerte celular inmunogénica (especialmente al dar como resultado una mayor infiltración de células inmunitarias en el parénquima tumoral y la captación/presentación de antígenos) prometen superar algunas limitaciones de los ICI y mejorar los resultados clínicos globales (Workenhe y col. 2014; Ribas y col. 2017). En la presente memoria, y en el Ejemplo 7, los datos examinan combinaciones de ICI e inyección intralesional del Compuesto 1.
Puede observarse un esquema del enfoque experimental en la Figura 6A. Brevemente, a ratones C57BL/6 de 6-7 semanas de edad se les inyectaron por vía subcutánea (s.c.) en ambos flancos células de melanoma de ratón B16-F10-OVA (2x105 células por sitio en 100 jl). Se permitió que los tumores se desarrollaran hasta aproximadamente 5­ 50 mm3, después de lo cual se inyectaron i.p. por ratón (día -2) 200 jg de anticuerpo anti-PD-1 (RMP1-14, BioXCell), anti-CTLA-4 (9H10, BioXCell) o de control de isotipo (2 A3 e IgG de hámster sirio, BioXCell). El día 0, se inyectó por vía I.T. a ambos tumores el Compuesto 1 (15 jg en 50 j l ) o vehículo (Vehíc.) solamente. Cada ratón recibió una inyección i.p. adicional del mismo anticuerpo que se administró el día -2 (de nuevo, 200 jg ). El anticuerpo se administró 3 veces más por vía inyección i.p. cada 2 días. El volumen de los tumores tratados se midió usando calibradores como se detalló anteriormente (Boyle y col. 2014) y se determinó la supervivencia del ratón a lo largo del tiempo.
Los resultados mostrados en las Figuras 6B y 6C muestran que el Compuesto 1 puede combinarse con anticuerpo anti-PD-1 y anti-CTLA-4 para restringir el crecimiento tumoral y mejorar la supervivencia del ratón en mayor medida que el tratamiento con un único agente. Este efecto parece depender de la concentración para cada combinación de Compuesto 1/ICI. Por ejemplo, la inyección de 30 jg del Compuesto 1 junto con anticuerpo anti-PD-1 conduce a una supervivencia mejorada/crecimiento tumoral reducido en comparación con el uso de 30 jg del Compuesto 1 solo (Figura 6Biii, iv). Esto no se observa cuando se usan 15 jg del Compuesto 1 en las mismas combinaciones, es decir, ninguna mejora en la supervivencia o el crecimiento del tumor (Figura 6Bi, ii). La situación se invierte cuando se usa anticuerpo anti-CTLA4, donde 15 jg del Compuesto 1 en el tratamiento de combinación (Figura 6Ci, ii) proporcionan la respuesta óptima y 30 jg del Compuesto 1 no (Figura 6Ciii, iv).
Ejemplo 7: Observación de los efectos de abscopal cuando se usa el compuesto 1 junto con inhibidores de puntos de regulación inmunitarios
Puede observarse un esquema del enfoque experimental en la Figura 7A. Brevemente, a ratones C57BL/6 de 6-7 semanas de edad se les inyectaron por vía s.c. en ambos flancos células de melanoma de ratón B16-F10-OVA (2x105 células por sitio en 100 jl). Se permitió que los tumores se desarrollaran hasta aproximadamente 5-50 mm3, después de lo cual se inyectaron i.p. por ratón (día -2) 200 jg de anticuerpo anti-PD-1 (RMP1-14, BioXCell), antiCTLA-4 (9H10, BioXCell) o de control de isotipo (2A3, BioXCell). El día 0, al mayor de los dos tumores (aprox. 50­ 75 mm3) se le inyectó por vía I.T. el Compuesto 1 (15 |jg en 50 j l ) o vehículo (Vehíc.) solamente. El tumor restante se dejó sin tratar y cada ratón recibió una inyección i.p. adicional del mismo anticuerpo que se administró el día -2 (de nuevo, 200 jg ). El anticuerpo se administró 3 veces más por vía inyección i.p. cada 2 días. El volumen de los tumores tratados y no tratados se midió durante el transcurso del experimento como se detalló anteriormente.
Los resultados se muestran en la Figura 7B. Los resultados muestran que no solamente los tumores tratados con una combinación de anticuerpos y el Compuesto 1 fueron eliminados eficazmente, sino que algunos tumores adyacentes no tratados también mostraron una respuesta a la terapia de combinación que no se observó con ninguno de los agentes solos.
Ejemplo 8: Las células supresoras derivadas de mieloides pueden afectar a la eficacia de dosis bajas del compuesto 1
Las células supresoras derivadas de mieloides (MDSC, por sus siglas en inglés) son células mieloides inmaduras que pueden suprimir la respuesta inmunitaria del hospedador a los tumores a través de múltiples vías (Qu y col.
2016). Los presentes inventores han utilizado ratones C57BL/6 nuligénicos para el factor estimulante de colonias de granulocitos (GCSF) para proporcionar un modelo para evaluar el potencial futuro de posibles terapias de combinación que implican el Compuesto 1 con moléculas que inhiben o bloquean proteínas (p. ej., indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO)) asociadas al reclutamiento y la función de MDSC. GCSF, un regulador esencial de la producción y el tráfico de neutrófilos, también desempeña una función fundamental en la migración y proliferación de MDSC (Li y col. 2016). Usando el modelo de eliminación de GCSFR de los presentes inventores, se examinó la posible función de las MSDC derivadas de granulocitos en la limitación de la eficacia de la monoterapia (a una dosis subóptima) del Compuesto 1 contra los adenocarincomas colorrectales MC38.
Brevemente, a ratones C57BL/6 wt y gcsfr1- de 6-7 semanas de edad se les inyectaron por vía s.c. en ambos flancos células de cáncer colorrectal de ratón MC38 (1*106 células por sitio en 100 jl). Se permitió que los tumores se desarrollasen hasta aproximadamente 5-50 mm3, después de lo cual se les inyectaron por vía I.T. 15 jg del Compuesto 1 o vehículo (Vehíc.) (50 jl). Se siguió el volumen de los tumores tratados como se detalló anteriormente en los Ejemplos 6 y 7. En la Figura 8 pueden observarse comparaciones de supervivencia y tamaño tumoral entre los tumores inyectados con el Compuesto 1 en ratones de tipo silvestre (ts) y nuligénicos para GCSFR.
Dado la función de GCSFR en el reclutamiento de granulocitos, estos datos sugieren que dicha infiltración de células inmunitarias puede estar limitando la eficacia antineoplásica del Compuesto 1 a una dosis subóptima conocida (15 jg ). Las combinaciones del Compuesto 1 o análogos con compuestos que previenen el desarrollo de dichas poblaciones de células inmunosupresoras (p. ej., inhibidores de IDO) pueden conducir, por lo tanto, a una mejor eficacia antineoplásica y a mejorar la supervivencia del paciente.
Referencias
Debe entenderse que, si en la presente memoria se hace referencia a alguna publicación anterior, dicha referencia no constituye una admisión de que la publicación forma parte del conocimiento general común en la técnica, en Australia o en cualquier otro país.
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Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    Un compuesto de epoxitigliano o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un inhibidor de puntos de regulación inmunitarios para su uso en el tratamiento de un tumor; en donde el compuesto de epoxitigliano es un compuesto de fórmula (I):
    Figure imgf000021_0001
    o un isómero geométrico o estereoisómero o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; en donde
    R1 es hidrógeno o alquilo C1-6;
    R2 es -OH u -OR9 ;
    R3 es -OH u -OR9 ;
    R4 y R5 se seleccionan independientemente de hidrógeno y alquilo C1-6;
    R6 es hidrógeno o -R10;
    R7 es hidroxi u OR10;
    R8 es hidrógeno o alquilo C1-6;
    R9 es -alquilo C1-20, -alquenilo C2-20, -alquinilo C2-20, -C(O)alquilo C1-20, -C(O)alquenilo C2-20, -C(O)alquinilo C2-20, -C(O)cicloalquilo, -C(O)alquil C1-10cicloalquilo; -C(O)alquenil C2-10cicloalquilo, -C(O)alquinil C2-10cicloalquilo, -C(O)arilo, -C(O)alquil C1-10arilo, -C(O)alquenil C2-10arilo, -C(O)alquinil C2-10arilo, -C(O)alquil C1 0C(O)Rh , -C(O)alquenil C2-10C(O)Rn, -C(O)alquinil C2-10C(O)Rn, -C(O)alquil C1-10CH(OR11)(ORn), -C(O)alquenil C2-10CH(ORn)(ORn), -C(O)alquinil C2-10CH(ORn)(ORn), -C(O)alquil C1-10SR11, -C(O)alquenil C2-10SR11, -C(O)alquinil C2-10SR11, -C(O)alquil C1-10C(O)ORn, -C(O)alquenil C2-10C(O)ORn, -C(O)alquinil C2-10C(O)ORn, -C(O)alquil C1-10C(O)SRn, -C(O)alquenil C2-10C(O)SRn, -C(O)alquinil C2-10C(O)SRn,
    O O
    —cpjC ^oa lqu ilo / X Rn ? —C(0)C2-ioalquen¡lo / N Rn
    o
    O
    — C(O)C2-ioalquinilo— ^ ^ Rn ;
    R10 es -alquilo C1-6 , -alquenilo C2-6 , -alquinilo C2-6 , -C(O)alquilo C1-6 , -C(O)alquenilo C2-6 , -C(O)alquinilo C2-6 , -C(O)arilo, -C(O)alquil C1-6arilo, -C(O)alquenil C2-6arilo o -C(O)alquinil C2-6arilo; y
    R11 es hidrógeno, -alquilo C1-10, -alquenilo C2-10, -alquinilo C2-10, cicloalquilo o arilo;
    en donde cada grupo alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo o arilo está opcionalmente sustituido; y en donde el inhibidor de puntos de regulación inmunitarios es un antagonista de uno de los siguientes receptores de muerte programada 1 (PD-1), su ligando PD-L1 y la proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4).
    Un compuesto de epoxitigliano o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un inhibidor de puntos de regulación inmunitarios; para su uso en el tratamiento o la prevención de uno o más tumores vecinos; en donde el compuesto de epoxitigliano es para la administración por vía local a un tumor distinto del uno o más tumores vecinos; en donde el compuesto de epoxitigliano es un compuesto de fórmula (I):
    Figure imgf000022_0001
    o un isómero geométrico o estereoisómero o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; en donde
    Ri es hidrógeno o alquilo C1-6;
    R2 es -OH u -OR9 ;
    R3 es -OH u -OR9 ;
    R4 y R5 se seleccionan independientemente de hidrógeno y alquilo C1-6;
    R6 es hidrógeno o -R10;
    R7 es hidroxi u OR10;
    R8 es hidrógeno o alquilo C1-6;
    R9 es -alquilo C1-20, -alquenilo C2-20, -alquinilo C2-20, -C(O)alquilo C1-20, -C(O)alquenilo C2-20, -C(O)alquinilo C2-20, -C(O)cicloalquilo, -C(O)alquil C1-10cicloalquilo; -C(O)alquenil C2-10cicloalquilo, -C(O)alquinil C2-10cicloalquilo, -C(O)arilo, -C(O)alquil C1-10arilo, -C(O)alquenil C2-10arilo, -C(O)alquinil C2-10arilo, -C(O)alquil C1-10C(O)R11, -C(O)alquenil C2-10C(O)R11, -C(O)alquinil C2-10C(O)R11, -C(O)alquil C1-10CH(OR11)(OR11), -C(O)alquenil C2-10CH(OR11)(OR11), -C(O)alquinil C2-10CH(OR11)(OR11), -C(O)alquil C1-10SR11, -C(O)alquenil C2-10SR11, -C(O)alquinil C2-10SR11, -C(O)alquil C1-10C(O)OR11, -C(O)alquenil C2-10C(O)OR11, -C(O)alquinil C2-10C(O)OR11, -C(O)alquil C1-10C(O)SR11, -C(O)alquenil C2-10C(O)SR11, -C(O)alquinil C2-10C(O)SR11,
    ■C(O)C1.10alquilo / X R-n ? —C(0)C2.ioalquen¡lo / X Rn
    o
    0
    —C(0)C2.ioalquinilo— Rn ¡
    R10 es -alquilo C1-6, -alquenilo C2-6, -alquinilo C2-6, -C(O)alquilo C1-6, -C(O)alquenilo C2-6, -C(O)alquinilo C2-6, -C(O)arilo, -C(O)alquil C1-6arilo, -C(O)alquenil C2-6arilo o -C(O)alquinil C2-6arilo; y
    R11 es hidrógeno, -alquilo C1-10, -alquenilo C2-10, -alquinilo C2-10, cicloalquilo o arilo;
    en donde cada grupo alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo o arilo está opcionalmente sustituido; y en donde el inhibidor de puntos de regulación inmunitarios es un antagonista de uno de los siguientes receptores de muerte programada 1 (PD-1), su ligando PD-L1 y la proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4), y en donde la expresión “ tumor vecino” se refiere a un tumor distinto del tumor que se trata con el compuesto de epoxitigliano.
    El compuesto de epoxitigliano y el inhibidor de puntos de regulación inmunitarios para su uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el compuesto de epoxitigliano es para la administración por vía local al tumor, especialmente por inyección intratumoral.
    El compuesto de epoxitigliano y el inhibidor de puntos de regulación inmunitarios para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el inhibidor de puntos de regulación inmunitarios es para la administración por vía sistémica, especialmente por inyección parenteral.
    El compuesto de epoxitigliano y el inhibidor de puntos de regulación inmunitarios para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde se aplica uno o más de los siguientes:
    i) R1 es -CH3 ;
    ii) R2 y R3 se seleccionan independientemente de -OC(O)alquilo C1-20, -OC(O)alquenilo C2-20, -Oc(O)alquinilo C2-20, -OC(O)cicloalquilo, -OC(O)alquil C1-10cicloalquilo; -OC(O)alquenil C2-10cicloalquilo, OC(O)alquinil C2-i0CÍdoalquilo, -OC(O)arilo, -OC(O)alquil Ci-i0arilo, -OC(O)alquenil C2-i0arilo, -Oc(o)alquinil C2-10arilo, -Oc(O)alquil Ci-i0C(O)Rii, -OC(O)alquenil C2-i0C(O)Rii, -OC(O)alquinil C2-i0C(O)Rii, -OC(O)alquil Ci-i0CH(ORii)(ORii), -OC(O)alquenil C2-i0CH(ORii)(ORii), -OC(O)alquinil C2-i0CH(ORii)(ORii), -OC(O)alquil Ci-i0SRii, -OC(O)alquenil C2-10SR11, -OC(O)alquinil C2-10SR11, -OC(O)alquil Ci-i0C(O)oRii, -OC(O)alquenil C2-iüC(o)oRii, -OC(O)alquinil C2-i0C(O)ORii, -OC(O)alquil Ci-iüC(O)SRii, -OC(O)alquenil C2-i0C(O)SRii y -OC(O)alquinil C2-i0C(O)SRii; especialmente -OC(O)alquilo C1-20, -OC(O)alquenilo C2-20, -OC(O)alquinilo C2-20, -OC(O)cicloalquilo, -OC(O)alquil Cii0cicloalquilo; -OC(O)alquenil C2-i0Cicloalquilo, -OC(O)alquinil C2-i0Cicloalquilo y -OC(O)arilo, más especialmente -OC(O)alquilo C1-20, -OC(O)alquenilo C2-20 y -OC(0)alquinilo C2-20;
    iii) R4 y R5 se seleccionan cada uno independientemente de H y -CH3 ;
    iv) R6 es hidrógeno, -C(O)alquilo C1-6, -C(O)alquenilo C2-6, -C(O)alquinilo C2-6 o -C(O)arilo; v) R7 es hidroxilo, -OC(O)alquilo C1-6, -oC(O)alquenilo C2-6 u -OC(O)alquinilo C2-6; y vi) Rs es H o -CH3.
    6. El compuesto de epoxitigliano y el inhibidor de puntos de regulación inmunitarios para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones i a 5, en donde el compuesto de fórmula (I) es un compuesto de fórmula (II):
    Figure imgf000023_0001
    o un isómero geométrico o estereoisómero o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;
    en donde R6, R7 y R9 son como se definen en la reivindicación i .
    7. El compuesto de epoxitigliano y el inhibidor de puntos de regulación inmunitarios para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones i a 6, en donde el compuesto de epoxitigliano de fórmula (II) se selecciona de los siguientes compuestos:
    12-tigloil-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoxi-4,5,9,12,13,20-hexahidroxi-1-tiglien-3-ona;
    12.13- di-(2-metilbutanoil)-6,7-epoxi-4,5,9,12,13,20-hexahidroxi-1-tiglien-3-ona;
    12-hexanoil-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoxi-4,5,9,12,13,20-hexahidroxi-1-tiglien-3-ona;
    12.13- dihexanoil-6,7-epoxi-4,5,9,12,i3,20-hexahidroxi-1-tiglien-3-ona;
    12-miristoil-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoxi-4,5,9,12,13,20-hexahidroxi-1-tiglien-3-ona;
    12-tigloil-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoxi-4,5,9,12,13-pentahidroxi-20-acetiloxi-1-tiglien-3-ona;
    12-miristoil-13-acetiloxi-6,7-epoxi-4, 5,9,12,13,20-hexahidroxi-1-tiglien-3-ona;
    12-propanoil-13-2-metilbutanoil)-6,7-epoxi-4,5,9,12,13,20-hexahidroxi-1-tiglien-3-ona; 12,13-ditigloil-6,7-epoxi-4,5,9,12,13,20-hexahidroxi-1-tiglien-3-ona; y
    12-(2-metilbutanoil)-13-tigloil-6,7-epoxi-4,5,9,12,13,20-hexahidroxi-1-tiglien-3-ona; o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
    8. El compuesto de epoxitigliano y el inhibidor de puntos de regulación inmunitarios para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el inhibidor de puntos de regulación inmunitarios es un antagonista del receptor de muerte programada 1 (PD-1) o la proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4).
    9. El compuesto de epoxitigliano y el inhibidor de puntos de regulación inmunitarios para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el inhibidor de puntos de regulación inmunitarios se administra en múltiples dosis.
    10. El compuesto de epoxitigliano y un inhibidor de puntos de regulación inmunitarios para su uso según la reivindicación 9, en donde las múltiples dosis se administran antes, simultáneamente con y/o después de la administración del compuesto de epoxitigliano.
    11. El compuesto de epoxitigliano y un inhibidor de puntos de regulación inmunitarios para su uso según la reivindicación 10, en donde la primera dosis del inhibidor de puntos de regulación inmunitarios se administra antes de la administración del compuesto de epoxitigliano o en donde una dosis del inhibidor de puntos de regulación inmunitarios se administra simultáneamente con el compuesto de epoxitigliano o en donde se administran una o más dosis de inhibidor de puntos de regulación inmunitarios posteriormente a la administración del compuesto de epoxitigliano.
    Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de epoxitigliano o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un inhibidor de puntos de regulación inmunitarios y, opcionalmente, un portador farmacéuticamente aceptable; en donde el compuesto de epoxitigliano es un compuesto de fórmula (I):
    Figure imgf000024_0001
    o un isómero geométrico o estereoisómero o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;
    en donde
    R1 es hidrógeno o alquilo C1-6;
    R2 es -OH u -OR9 ;
    R3 es -OH u -OR9 ;
    R4 y R5 se seleccionan independientemente de hidrógeno y alquilo C1-6;
    R6 es hidrógeno o -R10;
    R7 es hidroxi u OR10;
    R8 es hidrógeno o alquilo C1-6;
    R9 es -alquilo C1-20, -alquenilo C2-20, -alquinilo C2-20, -C(O)alquilo C1-20, -C(O)alquenilo C2-20, -C(O)alquinilo C2-20, -C(O)cicloalquilo, -C(O)alquil C1-10cicloalquilo; -C(O)alquenil C2-10cicloalquilo, -C(O)alquinil C2-10cicloalquilo, -C(O)arilo, -C(O)alquil C1-10arilo, -C(O)alquenil C2-10arilo, -C(O)alquinil C2-10arilo, -C(O)alquil Cm 0C(O)Rh , -C(O)alquenil C2-10C(O)Rn, -C(O)alquinil C2-10C(O)Rn, -C(O)alquil C1-10CH(OR11)(ORn), -C(O)alquenil C2-10CH(ORn)(ORn), -C(O)alquinil C2-10CH(ORn)(ORn), -C(O)alquil C1-10SR11, -C(O)alquenil C2-10SR11, -C(O)alquinil C2-10SR11, -C(O)alquil C1-10C(O)ORn, -C(O)alquenil C2-10C(O)ORn, -C(O)alquinil C2-10C(O)ORn, -C(O)alquil C1-10C(O)SRn, -C(O)alquenil C2-10C(O)SRn, -C(O)alquinil C2-10C(O)SRn,
    —C ic lo a lq u ilo
    Figure imgf000024_0002
    o
    O
    — C(O)C2_10alquinilo— ^ ^ Rn ;
    R10 es -alquilo C1-6 , -alquenilo C2-6 , -alquinilo C2-6 , -C(O)alquilo C1-6 , -C(O)alquenilo C2-6 , -C(O)alquinilo C2-6 , -C(O)arilo, -C(O)alquil C1-6arilo, -C(O)alquenil C2-6arilo o -C(O)alquinil C2-6arilo; y
    R11 es hidrógeno, -alquilo C1-10, -alquenilo C2-10, -alquinilo C2-10, cicloalquilo o arilo;
    en donde cada grupo alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo o arilo está opcionalmente sustituido; y en donde el inhibidor de puntos de regulación inmunitarios es un antagonista de uno de los siguientes receptores de muerte programada 1 (PD-1), su ligando PD-L1 y la proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4).
    Un kit que comprende una composición que comprende un compuesto de epoxitigliano y una composición que comprende un inhibidor de puntos de regulación inmunitarios; en donde el compuesto de epoxitigliano es un compuesto de fórmula (I):
    Figure imgf000025_0001
    o un isómero geométrico o estereoisómero o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;
    en donde
    R1 es hidrógeno o alquilo C1-6;
    R2 es -OH u -OR9 ;
    R3 es -OH u -OR9 ;
    R4 y R5 se seleccionan independientemente de hidrógeno y alquilo C1-6;
    R6 es hidrógeno o -R10;
    R7 es hidroxi u OR10;
    R8 es hidrógeno o alquilo C1-6;
    R9 es -alquilo C1-20, -alquenilo C2-20, -alquinilo C2-20, -C(O)alquilo C1-20, -C(O)alquenilo C2-20, -C(O)alquinilo C2-20, -C(O)cicloalquilo, -C(O)alquil C1-10cicloalquilo; -C(O)alquenil C2-10cicloalquilo, -C(O)alquinil C2-10cicloalquilo, -C(O)arilo, -C(O)alquil C1-10arilo, -C(O)alquenil C2-10arilo, -C(O)alquinil C2-10arilo, -C(O)alquil Cm 0C(O)Rh , -C(O)alquenil C2-10C(O)Rn, -C(O)alquinil C2-10C(O)Rn, -C(O)alquil C1-10CH(OR11)(ORn), -C(O)alquenil C2-10CH(ORn)(ORn), -C(O)alquinil C2-10CH(ORn)(ORn), -C(O)alquil C1-10SR11, -C(O)alquenil C2-10SR11, -C(O)alquinil C2-10SR11, -C(O)alquil C1-10C(O)ORn, -C(O)alquenil C2-10C(O)ORn, -C(O)alquinil C2-10C(O)ORn, -C(O)alquil C1-10C(O)SRn, -C(O)alquenil C2-10C(O)SRn, -C(O)alquinil C2-10C(O)SRn,
    —C icloalqu il
    Figure imgf000025_0002
    o
    O
    — C(O)C2_10alquinilo— ^ ^ Rn ;
    R10 es -alquilo C1-6 , -alquenilo C2-6 , -alquinilo C2-6 , -C(O)alquilo C1-6 , -C(O)alquenilo C2-6 , -C(O)alquinilo C2-6 , -C(O)arilo, -C(O)alquil C1-6arilo, -C(O)alquenil C2-6arilo o -C(O)alquinil C2-6arilo; y
    R11 es hidrógeno, -alquilo C1-10, -alquenilo C2-10, -alquinilo C2-10, cicloalquilo o arilo;
    en donde cada grupo alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo o arilo está opcionalmente sustituido; y en donde el inhibidor de puntos de regulación inmunitarios es un antagonista de uno de los siguientes receptores de muerte programada 1 (PD-1), su ligando PD-L1 y la proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4).
    El kit según la reivindicación 13 que comprende una o más dosis de compuesto de epoxitigliano y una o más dosis de inhibidor de puntos de regulación inmunitarios.
    El kit según la reivindicación 13 o 14, que comprende una o más dosis de compuesto de epoxitigliano formulado para la administración tópica y una o más dosis de inhibidor de puntos de regulación inmunitarios formulado para la administración por inyección.
    El kit según la reivindicación 13 o 14, que comprende una dosis de compuesto de epoxitigliano formulado para la inyección intratumoral y una o más dosis de inhibidor de puntos de regulación inmunitarios formulado para la administración por inyección.
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