ES2859679T3 - Compuestos, composición y usos de los mismos para tratar el cáncer - Google Patents

Compuestos, composición y usos de los mismos para tratar el cáncer Download PDF

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Abstract

Un compuesto de fórmula **(Ver fórmula)** para su uso como un medicamento.

Description

DESCRIPCIÓN
Compuestos, composición y usos de los mismos para tratar el cáncer
Campo de la invención
La presente descripción se refiere generalmente a los campos de la medicina y del tratamiento del cáncer. La invención se refiere más específicamente a nuevos compuestos que son derivados de isoginkgetina y son cada uno típicamente para su uso como un medicamento. En particular, la invención se refiere a el uso de estos nuevos compuestos para incrementar la presentación, típicamente la producción y presentación, de péptidos (antigénicos), preferiblemente antígenos derivados de los Productos de la Traducción Pionera (PTP), por células cancerosas en un sujeto, e inducir o estimular una respuesta inmune en el sujeto. La respuesta inmune está dirigida típicamente frente a un antígeno tumoral, más generalmente frente al tumor canceroso que padece el sujeto.
La presente descripción también se refiere a los usos de dichos compuestos, en particular para preparar una composición farmacéutica y/o para permitir o mejorar la eficiencia de una terapia del cáncer en un sujeto que lo necesita. Cada uno de los compuestos de la invención puede usarse de hecho ventajosamente, en combinación con al menos un agente anticanceroso distinto, típicamente un fármaco quimioterapéutico, y/o con radioterapia, para tratar el cáncer, para prevenir las metástasis del cáncer y/o para prevenir la recurrencia del cáncer en un sujeto.
La invención también describe métodos para prevenir o tratar el cáncer, las metástasis del cáncer y/o la recurrencia del cáncer en un sujeto. La presente invención proporciona además kits adecuados para preparar una composición según la presente invención y/o para implementar los métodos descritos en la presente memoria.
Antecedentes de la invención
Todas las células nucleadas presentan péptidos antigénicos (AP) en su superficie a través de la ruta del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I (MHC-I). Los AP tienen una longitud de 8 a 10 aminoácidos y reflejan la actividad celular inherente (Caron etal.). Debido a que su presentación guía la vigilancia de elementos potencialmente peligrosos por las células inmunes, principalmente células T CD8+ citotóxicas (CTL) y células T CD4+ auxiliares, los AP son las dianas de las vacunas anticancerosas terapéuticas desarrolladas actualmente. A pesar de ser prometedores, los resultados de ensayos clínicos con vacunas terapéuticas dirigidas a antígenos asociados a tumores (TAA) no han cumplido con sus expectativas. Los fallos principales se han asociado a mecanismos inmunosupresores y a una elección subóptima de antígenos (Mellman et al.; Burg et al.). Uno de los eventos importantes que dirigen la inmunoselección de tumores, y que está correlacionado con un mal pronóstico, es la pérdida o la regulación a la baja de la presentación antigénica de MHC de clase I por las células tumorales (Watson et al.; Liu et al.). Estas últimas pueden escapar del reconocimiento por las CTL y células asesinas naturales debido a defectos en componentes de la ruta de MHC de clase I (Leone et al.). Junto con la disminución global de la presentación antigénica de MHC de clase I, la naturaleza de los antígenos presentados en la superficie celular, denominada inmunopeptidoma MHCI de clase I (MIP), tiene una importancia crítica para el reconocimiento inmune. En el cáncer, donde un TAA específico se identifica y se toma como diana con inmunoterapia, tal como Her/neu en el cáncer de mama o CEA en el cáncer de colon, la pérdida de la expresión de este TAA en la superficie de las células tumorales da lugar a la evasión inmune (Lee et al.; Kmieciak et al.). Para contrarrestar esto, las estrategias actuales tienen como objetivo agrandar el rango de péptidos cancerosos diana y restaurar la presentación antigénica de MHC.
Con el fin de entender la dinámica del MIP, nos podríamos centrar en la fuente de los AP para la ruta de presentación de MHC de clase I. Al principio, se pensó que los AP endógenos provenían estrictamente de la degradación de proteínas senescentes. Sin embargo, los modelos que sugieren fuentes alternativas han desafiado esta noción. En 1996, el grupo de J. Yewdell introduce el concepto de los productos ribosomales defectuosos (DRIP) (Yewdell et al, 1996), descritos inicialmente como productos que se degradan rápidamente debido a su conformación inestable. Más recientemente, los inventores han explorado este concepto desde una perspectiva diferente mostrando que la fuente principal de los AP proviene de un evento de traducción pionera que ocurre antes de que los intrones se eliminen por corte y empalme y que es independiente del evento de traducción de proteínas de longitud completa (Apcher et al., 2011). Los péptidos no canónicos producidos pueden derivar, por lo tanto, de secuencia intrónica, regiones UTR 3' o 5', así como de marcos de lectura alternativos. Estos polipéptidos se describen como Productos de Traducción Pionera (PTP). El descubrimiento de los PTP sugiere la existencia de un mecanismo nuclear de traducción complejo que, en parte, tiene como objetivo dar forma al MIP mediante la generación de polipéptidos relevantes y adecuados para la ruta de MHC de clase I. Además, parece que los PTP juegan un papel en la dinámica del desarrollo del cáncer. Cuando se inoculan en ratones, se ha mostrado que las células cancerosas que presentan los antígenos derivados de los PTP en su superficie pueden ser reconocidas por células T específicas dando lugar a la reducción del crecimiento tumoral. Además, los PTP purificados que contienen un epítopo modelo promueven eficientemente la respuesta inmune anticancerosa cuando se inyectan como una vacuna peptídica en ratones (Duvallet et al.).
El corte y empalme del ARNm precursor (pre-ARNm) está catalizado en el núcleo por el espliceosoma, un complejo multiproteico conservado y dinámico compuesto por cinco ARN nucleares pequeños (snARN) U1, U2, U4, U5 y U6 que son complejos con más de 200 proteínas. Un número creciente de estudios informan que la desrregulación del complejo del espliceosoma conlleva patrones de corte y empalme aberrantes en muchos cánceres contribuyendo a la proliferación y progresión anormales de las células tumorales Desde 2011, se han reportado mutaciones recurrentes en el espliceosoma en varios cánceres, incluyendo leucemia mielomonocítica, leucemia mieloide, leucemia linfocítica crónica, cánceres de mama o mieloma múltiple.
Los inventores describen ahora en la presente memoria nuevos compuestos para su uso en el tratamiento del cáncer, en la prevención de las metástasis del cáncer y/o en la prevención de la recurrencia del cáncer en un sujeto.
Resumen de la invención
Los inventores produjeron y describen en la presente memoria por primera vez un compuesto de fórmula
Figure imgf000003_0001
en donde R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo de Na, H, -CH3 , -CH2-CH3 , -CH2-CH=CH3 , n-CH2-CH2-CH3 , P(O)(O-CH2-CH3)2 , P(O)(OH)2 o P(O)(ONa)2 y en donde R1, R2 , R3 , R4 y R5 no son H simultáneamente, en donde R1 no es -CH3 cuando R2 es P(O)(ONa)2 o P(O)(o H)2 y cada uno de R3 , R4 y R5 es H, y en CH3 o H cuando R2 es -CH3 y cada uno de R3 , R4 y R5 es H;
y en donde R3 , R4 y R5 se seleccionan independientemente del grupo de H, CH3 , -CH2-CH3 , -CH2-CH=CH3 , y CnH2n+1 con n=3-10
, para su uso como un medicamento.
Este compuesto, así como un estereoisómero del mismo, o así como una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, puede usarse ventajosamente como un medicamento.
En una realización preferida, la invención se refiere a un compuesto particular de fórmula (I) en donde R1 es Na, R2 es P(O)(ONa)2 y cada uno de R3 , R4 y R5 es H (también identificado en la presente memoria generalmente como "IP2" o más específicamente como "IP2-6Na"):
Figure imgf000003_0002
En otra realización preferida, la invención se refiere a un compuesto particular de fórmula (I) en donde R1 es H, R2 es P(O)(ONa)2 y cada uno de R3 , R4 y R5 es H (también identificado en la presente memoria generalmente como "IP2" o más específicamente como "IP2-4Na"):
Figure imgf000004_0001
En un aspecto preferido descrito en la presente memoria, el compuesto de fórmula (I), preferiblemente un compuesto "IP2" (IP2-6Na o IP2-4Na), o estereoisómero o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, es para su uso en el tratamiento del cáncer, para su uso en la prevención de las metástasis del cáncer y/o para su uso en la prevención de la recurrencia del cáncer en un sujeto.
Se describe adicionalmente el uso in vivo, in vitro o ex vivo de un compuesto de fórmula (I), preferiblemente un compuesto "IP2" (IP2-6Na o IP2-4Na), para inducir o incrementar la presentación, típicamente la producción y presentación, de péptidos (antigénicos), preferiblemente antígenos derivados de Productos de la Traducción Pionera (PTP), por células cancerosas.
El compuesto de fórmula (I), preferiblemente un compuesto "IP2" (IP2-6Na o IP2-4Na), permite al médico prevenir o controlar, preferiblemente disminuir, la proliferación de las células cancerosas mediante la estimulación del sistema inmune del sujeto. Ventajosamente, es además capaz de incrementar la efectividad de otros tratamientos del cáncer. Los inventores demuestran en la presente memoria que este compuesto es capaz además de reducir el riesgo de metástasis y/o recurrencia del cáncer.
En la presente memoria también se describe una composición que comprende dicho compuesto de fórmula (I), preferiblemente un compuesto "IP2" (IP2-6Na o IP2-4Na), y un vehículo farmacéuticamente aceptable, preferiblemente junto con al menos un agente anticanceroso distinto para ser usada simultáneamente, separadamente o secuencialmente. Dicha composición es típicamente para su uso para tratar cáncer, para prevenir las metástasis del cáncer y/o para prevenir la recurrencia del cáncer en un sujeto.
En la presente memoria también se describe un método para tratar cáncer en un sujeto, que comprende una etapa de administrar un compuesto, típicamente el compuesto de fórmula (I), preferiblemente un compuesto "IP2" (IP2-6Na o IP2-4Na), o una composición como se describe en la presente memoria al sujeto.
También se describe un kit que comprende el compuesto de fórmula (I), preferiblemente un compuesto "IP2" (IP2-6Na o IP2-4Na), y preferiblemente al menos un agente anticanceroso distinto en contenedores distintos, así como los usos del mismo, en particular para preparar una composición como se describe en la presente memoria.
Descripción detallada de la invención
Los inventores generaron un derivado de isoginkgetina biflavonoide que se describe por primera vez en el contexto de la presente invención y se identifica como "compuesto de fórmula (I)":
en donde R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo de Na, H, -CH3 , -CH2-CH3 , -CH2-CH=CH3 , n-CH2-CH2-CH3 , P(O)(O-CH2-CH3)2 , P(O)(OH)2 o P(O)(ONa)2 y en donde R1, R2 , R3 , R4 y R5 no son H simultáneamente, en donde R1 no es -CH3 cuando R2 es P(O)(ONa)2 o P(O)(o H)2 y cada uno de R3 , R4 y R5 es H, y en donde R1 no es -CH3 o H cuando R2 es -CH3 y cada uno de R3 , R4 y R5 es H;
y en donde R3 , R4 y R5 se seleccionan independientemente del grupo de H, CH3 , -CH2-CH3 , -CH2-CH=CH3 , y CnH2n+1 con n=3-10, preferiblemente n=3-8.
Un "hidroximetilo" se refiere a un radical de fórmula -OMe en donde Me representa un metilo (-CH3). Un "hidróxido de sodio" se refiere a un radical de fórmula -ONa en donde Na representa un sodio. El grupo CnH2n+1 donde n=3-10 se refiere a un grupo "alquilo" que es un grupo alifático saturado lineal o ramificado. Incluye, por ejemplo, un grupo propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, terc-butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo o decilo. Preferiblemente, n es de 3-8 o de 3-6.
Un compuesto particular de fórmula (I) en donde R1 es Na, R2 es P(O)(ONa)2 y cada uno de R3 , R4 y R5 es H también se identifica en la presente memoria generalmente como una molécula "IP2" o, más específicamente, como "IP2-6Na", o como fosfato sódico de 8-(2-metoxi-5-(5-óxido-4-oxo-7-(fosfonatooxi)-4H-cromen-2-il)fenil)-2-(4-metoxifenil)-5-oxido-4-oxo-4H-cromen-7-ilo:
Figure imgf000005_0001
Otro compuesto particular de fórmula (I) en donde R1 es H, R2 es P(O)(ONa)2 y cada uno de R3 , R4 y R5 es H también se identifica en la presente memoria generalmente como una molécula "IP2" o, más específicamente, como "IP2-4Na" o como fosfato sódico de 5-hidroxi-8-(5-(5-hidroxi-4-oxo-7-(fosfonatooxi)-4H-cromen-2-il)-2-metoxifenil)-2-(4-metoxifenil)-4-oxo-4H-cromen-7-ilo:
Figure imgf000005_0002
El compuesto de fórmula (I), preferiblemente un compuesto "IP2" (IP2-6Na o IP2-4Na), así como un estereoisómero del mismo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, puede usarse ventajosamente como un medicamento.
Tal y como se usa en la presente memoria, el término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a composiciones, compuestos, sales y similares que, en el alcance del criterio médico sólido, son adecuados para el contacto con los tejidos del sujeto, o que pueden administrarse al sujeto, sin toxicidad excesiva u otras complicaciones proporcionales con una relación beneficio/riesgo razonable. Por ejemplo, las sales farmacéuticamente aceptables engloban las sales de sodio, potasio, cloruro, amonio, acetato y similares.
Los inventores demuestran en la presente memoria que el compuesto de fórmula (I), preferiblemente un compuesto "IP2" (IP2-6Na o IP2-4Na), puede usarse ventajosamente como un inmunomodulador positivo frente al cáncer.
Los inventores investigaron la presentación antigénica de un modelo de antígeno derivado de los PTP expresado en líneas de células cancerosas humanas y de ratón y observaron que su tratamiento in vitro con isoginkgetina y, más preferiblemente IP2, incrementa la presentación de este antígeno. Además, mostraron que el tratamiento in vivo con la isoginkgetina disuelta en DMSO de ratones con sarcoma ralentiza el crecimiento tumoral de una manera dependiente de inmunidad. Con el fin de mejorar su efecto, ensayaron el derivado de isoginkgetina IP2 que es soluble en agua y, sorprendentemente, observaron que es un inhibidor mucho más potente del crecimiento canceroso que la propia isoginkgetina. Como en ratones inmunodeficientes Nu/Nu, el producto natural y el derivado no tienen efecto en el crecimiento tumoral, concluyeron que sus efectos son dependientes de la respuesta inmune. Estos resultados demuestran que la presentación antigénica derivada de los PTP puede modularse y los inventores proporcionan una nueva molécula prometedora para el desarrollo comercial: el inhibidor del corte y empalme IP2 o compuesto de fórmula (I) que puede usarse para reforzar la respuesta anticancerosa y tratar el cáncer, a diferencia de otros derivados de la isoginkgetina.
En un aspecto preferido descrito en la presente memoria, el compuesto de fórmula (I), preferiblemente un compuesto "IP2" (IP2-6Na o IP2-4Na), es para su uso en el tratamiento del cáncer, para su uso en la prevención de las metástasis del cáncer y/o para su uso en la prevención de la recurrencia del cáncer en un sujeto.
En otro aspecto preferido descrito en la presente memoria, el compuesto de fórmula (I), preferiblemente un compuesto "IP2" (IP2-6Na o IP2-4Na), es para su uso para estimular una respuesta inmune anticancerosa en un sujeto que lo necesita.
En un aspecto preferido adicional, el compuesto de fórmula (I), preferiblemente un compuesto "IP2" (IP2-6Na o IP2-4Na), es para su uso para inducir o incrementar la presentación, típicamente la producción y presentación, de antígenos derivados de Productos de Traducción Pionera (PTP) por células cancerosas.
El compuesto de la invención puede obtenerse por métodos muy conocidos por el experto en la técnica tales como hemisíntesis o síntesis total. Un ejemplo de un método para producir el compuesto de fórmula (I) se describe en la presente memoria en la parte experimental y se ilustra además en la figura 5 (el compuesto de fórmula (I) corresponde al compuesto "2" y "2"') en la figura 5, que se identifica en la presente memoria generalmente como "IP2"). El compuesto de fórmula (I) es un producto artificial que no puede encontrarse como tal en la naturaleza.
El compuesto de fórmula (I) puede prepararse típicamente a partir del biflavonoide Isoginkgetina que se ha descrito como un inhibidor general del corte y empalme del ARNm y se extrae típicamente de hojas del árbol de los cuarenta escudos, Ginko biloba L. Los métodos para extraer Isoginkgetina se describen, entre otros, en Kang et al (1990) y en Lee et al (1995), cuya descripción se incorpora en la presente memoria por referencia. El compuesto de fórmula (I) también puede prepararse por síntesis química usando reacciones químicas convencionales.
Un objeto adicional descrito en la presente memoria es el uso de un compuesto de fórmula (I), preferiblemente un compuesto "IP2" (IP2-6Na o IP2-4Na), (o un estereoisómero o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo) para disminuir la resistencia de un cáncer o sujeto que padece de cáncer con respecto a un agente anticanceroso distinto, típicamente un agente quimioterapéutico distinto.
En la presente memoria también se describe un compuesto de fórmula (I), preferiblemente un compuesto "IP2" (IP2-6Na o IP2-4Na), o un estereoisómero o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una composición que comprende dicho compuesto y un vehículo farmacéuticamente aceptable, para su uso, en combinación con al menos un agente anticanceroso distinto, típicamente un fármaco quimioterapéutico distinto, y/o con radioterapia, para tratar cáncer, para prevenir las metástasis del cáncer y/o para prevenir la recurrencia del cáncer en un sujeto.
El término "sujeto" se refiere a cualquier sujeto, preferiblemente un mamífero.
Los ejemplos de mamíferos incluyen seres humanos y animales no humanos tales como, sin limitación, animales domesticados (p. ej., vacas, ovejas, gatos, perros, y caballos), primates no humanos (tales como monos), conejos, y roedores (p. ej., ratones y ratas). El tratamiento está destinado preferiblemente a un ser humano que lo necesita, cualquiera que sea su edad o sexo.
El término "sujeto" designa típicamente un paciente, en particular, un paciente que tiene un tumor. A no ser que se especifique otra cosa en la presente descripción, el tumor es un tumor canceroso o maligno. En un aspecto particular, el sujeto es un sujeto que se está sometiendo a tratamiento del cáncer tal como quimioterapia y/o radioterapia, o un sujeto que tiene riesgo, o que se sospecha que tiene riesgo, de desarrollar un cáncer.
El sujeto es, por ejemplo, un ser humano que está padeciendo de un cáncer y que es resistente al tratamiento del cáncer, típicamente a quimioterapia.
El sujeto puede haber estado expuesto a parte de un protocolo de tratamiento convencional completo, por ejemplo, al menos a un ciclo de todo el protocolo de tratamiento, por ejemplo, dos ciclos de todo el protocolo de tratamiento.
El cáncer o tumor puede ser cualquier clase de cáncer o neoplasia. El tumor es típicamente un tumor sólido, en particular de origen epitelial, neuroectodérmico o mesenquimal. El cáncer también se selecciona típicamente de un carcinoma, sarcoma, linfoma, tumor de células germinales, blastoma, leucemia y mieloma múltiple, preferiblemente de un carcinoma, sarcoma, blastoma, linfoma, leucemia y mieloma múltiple. El cáncer puede ser o no un cáncer metastásico.
El cáncer puede seleccionarse, por ejemplo, sin estar limitado a, del grupo que consiste en leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfoblástica aguda positiva para el cromosoma Philadelphia (Ph+ ALL), enfermedad de Hodgkin, linfoma de Hodgkin o no de Hodgkin, carcinoma de células escamosas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, glioma, cáncer gastrointestinal, cáncer renal, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer colorrectal, cáncer endometrial, cáncer de riñón, cáncer de próstata, cáncer de tiroides, neuroblastoma, cáncer de cerebro, cáncer del sistema nervioso central, cáncer pancreático, glioblastoma multiforme, cáncer del cuello uterino, cáncer de estómago, cáncer de vejiga, hepatoma maligno, cáncer de mama, carcinoma de colon, cáncer de cabeza y cuello, cáncer gástrico, tumor de células germinales, sarcoma pediátrico, rabdomiosarcoma, sarcoma de Ewing, osteosarcoma, sarcoma de tejido blando, linfoma de células NK/T sinonasal, mieloma, melanoma, mieloma múltiple, leucemia mielógena aguda (AML), y leucemia linfocítica crónica.
En una realización preferida, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer genitourinario (tal como cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de testículos, cáncer del cuello uterino o cáncer de ovarios) y sarcoma (tal como osteosarcoma o sarcoma de tejido blando, incluyendo sarcoma de tejido blando pediátrico, neuroblastoma, mieloma y melanoma).
Más preferiblemente, el cáncer se selecciona de melanoma, cáncer de pulmón (incluyendo carcinoma de pulmón de células no pequeñas (o NSCLC) y carcinoma de pulmón de células pequeñas (o SCLC)) y cáncer de mama.
Incluso más preferiblemente, el carcinoma es un melanoma o un cáncer de pulmón.
En un aspecto, el cáncer es un cáncer de pulmón, típicamente un cáncer de pulmón de células pequeñas o un cáncer de pulmón de células no pequeñas.
En otro aspecto, el cáncer es una leucemia, típicamente una leucemia mielógena aguda (AML) o una leucemia linfocítica crónica.
En un aspecto adicional, el cáncer es un cáncer de colon, típicamente un carcinoma de colon. El cáncer también puede ser un cáncer colorrectal.
En un aspecto adicional, el cáncer es un cáncer pediátrico típicamente un sarcoma, linfoma, leucemia, neuroblastoma, cáncer de cerebro, o cáncer del sistema nervioso central pediátrico.
En un aspecto particular descrito en la presente memoria, el agente anticanceroso se selecciona de un agente quimioterapéutico, un bloqueante de un punto de control inmune y una vacuna anticancerosa (también identificada en la presente memoria como "vacuna del cáncer"). Estos agentes se consideran típicamente como agentes "convencionales" para tratar el cáncer.
El agente quimioterapéutico es típicamente un agente seleccionado, por ejemplo, de un antibiótico antitumoral/citotóxico, un agente alquilante, un antimetabolito, un inhibidor de topoisomerasa, un inhibidor mitótico, un componente basado en platino, un inhibidor de quinasa específico, una hormona, una citoquina, un agente antiangiogénico, un anticuerpo, un inhibidor de metiltransferasa de ADN y un agente disruptor de la vasculatura.
El agente antitumoral o antibiótico citotóxico puede seleccionarse, por ejemplo, de una antraciclina (p. ej., doxorrubicina, daunorrubicina, adriamicina, idarrubicina, epirrubicina, mitoxantrona, valrrubicina), actinomicina, bleomicina, mitomicina C, plicamicina e hidroxiurea.
El agente alquilante puede seleccionarse, por ejemplo, de mecloretamina, ciclofosfamida, melfalán, clorambucilo, ifosfamida, temozolomida busulfán, N-Nitroso-N-metilurea (MNU), carmustina (BCNU), lomustina (CCNU), semustina (MeCCNU), fotemustina, estreptozotocina, dacarbazina, mitozolomida, tiotepa, mitomicina, diazicuona (AZQ), procarbazina, hexametilmelamina y uramustina.
El antimetabolito puede seleccionarse, por ejemplo, de un análogo de pirimidina (p. ej., un análogo de fluoropirimidina, 5-fluorouracilo (5-FU), floxuridina (FUDR), arabinósido de citosina (Citarabina), Gemcitabina (Gemzar®), capecitabina); un análogo de purina (p. ej., azatioprina, mercaptopurina, tioguanina, fludarabina, pentostatina, cladribina, clofarabina); un análogo de ácido fólico (p. ej., metotrexato, ácido fólico, pemetrexed, aminopterina, raltitrexed, trimetoprim, pirimetamina).
El inhibidor de topoisomerasa puede seleccionarse, por ejemplo, de camptotecina, irinotecán, topotecán, amsacrina, etopósido, fosfato de etopósido y tenipósido.
El inhibidor mitótico puede seleccionarse, por ejemplo, de un taxano [paclitaxel (PG-paclitaxel y DHA-paclitaxel) (Taxol®), docetaxel (Taxotere®), larotaxel, cabazitaxel, ortataxel, tesetaxel, o taxoprexina]; un veneno del huso o un alcaloide de vinca (p. ej., vincristina, vinblastina, vinorelbina, vindesina o vinflunina); mebendazol; y colchicina.
El componente basado en platino puede seleccionarse, por ejemplo, de platino, cisplatino, carboplatino, nedaplatino, oxaliplatino, satraplatino y tetranitrato de triplatino.
El inhibidor de quinasa específico puede seleccionarse, por ejemplo, de un inhibidor de la quinasa BRAF tal como vemurafenib; un inhibidor de MAPK (tal como dabrafenib); un inhibidor de MEK (tal como trametinib); y un inhibidor de tirosina quinasa tal como imatinib, gefitinib, erlotinib, sunitinib o carbozantinib.
También puede usarse típicamente en el contexto de la terapia hormonal tamoxifeno, un antiaromatasa, o un fármaco antiestrogénico.
Una citoquina usable en el contexto da una inmunoterapia puede seleccionarse, por ejemplo, de IL-2 (Interleuquina-2), IL-11 (Interleuquina-11), IFN (Interferón) alfa (IFNa), y Factor estimulante de las colonias de granulocitosmacrófagos (GM-CSF).
El agente antiangiogénico puede seleccionarse, por ejemplo, de bevacizumab, sorafenib, sunitinib, pazopanib y everolimus.
El anticuerpo, en particular el anticuerpo monoclonal (mAb), puede seleccionarse de un anticuerpo anti-CD20 (antiantígeno de células B general), anticuerpo anti-Her2/Neu (Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico Humano-2/NEU); un anticuerpo dirigido a la superficie de las células cancerosas (tal como rituximab y alemtuzumab); un anticuerpo dirigido a factor de crecimiento (tal como bevacizumab, cetuximab, panitumumab y trastuzumab); un anticuerpo agonista (tal como mAb anti-ICOS, mAb anti-OX40, mAb anti-41 BB); y un inmunoconjugado (tal como 90Y-ibritumomab tiuxetán, 131 I-tositumomab, o ado-trastuzumab emtansina).
Un inhibidor de metiltransferasa de ADN puede seleccionarse, por ejemplo, de 2'-desoxi-5-azacitidina (DAC), 5-azacitidina, 5-aza-2'-desoxicitidina, 1-[beta]-D-arabinofuranosil-5-azacitosina y dihidro-5-azacitidina.
Un agente disruptor de la vasculatura puede seleccionarse, por ejemplo, de un derivado flavona de ácido acético, ácido 5,6-dimetilxantenona-4-acético (DMXAA) y ácido flavona acético (FAA).
Otros fármacos quimioterapéuticos incluyen un inhibidor del proteasoma (tal como bortezomib), un compuesto de rotura de las cadenas de ADN (tal como tirapazamina), un inhibidor tanto de la tioredoxina reductasa como de la ribonucleótido reductasa (tal como xcitrina), y un potenciador de la respuesta inmune Th1 (tal como timalfasina).
En una realización preferida, el fármaco o agente quimioterapéutico se selecciona de un antibiótico antitumoral/citotóxico, un agente alquilante, un antimetabolito, un inhibidor de topoisomerasa, un inhibidor mitótico, un componente basado en platino, un inhibidor de quinasa específico, un agente antiangiogénico, un anticuerpo y un inhibidor de metiltransferasa de ADN.
Un bloqueante de punto de control inmune es típicamente un anticuerpo dirigido a un punto de control inmune. Dicho bloqueante de punto de control inmune puede seleccionarse ventajosamente de anti-CTLA4 (ipilimumab y Tremelimumab), anti-PD-1 (Nivolumab y Pembrolizumab), anti-PD-L1 (Atezolizumab, Durvalumab, y Avelumab), anti-PD-L2 y anti-Tim3.
La vacuna del cáncer puede seleccionarse, por ejemplo, de una composición de vacuna que comprende péptidos (antigénicos), en particular PTP; una vacuna de papilomavirus humano (HPV) (tal como Gardasil®, Gardasil9®, y Cervarix®); una vacuna que estimula una respuesta inmune frente a la fosfatasa ácida prostática (PAP) sipuleucel-T (Provenge®); un virus oncolítico; y talimogeno laherparepvec (T-VEC o Imlygic®).
En otro aspecto particular, el tratamiento del cáncer ("convencional") es una irradiación (también identificado en la presente memoria como "radioterapia"). La radioterapia implica típicamente rayos seleccionados de rayos X ("XR"), rayos gamma y/o rayos UVC.
El tratamiento que puede incluir varios agentes anticancerosos es seleccionado por el cancerólogo dependiendo del cáncer específico que se va a prevenir o tratar.
Un melanoma particular es un melanoma tratado convencionalmente con ipilimumab, nivolumab, pembrolizumab, IFNa, dacarbazina, un inhibidor de BRAF, dabrafenib, trametinib, sorafenib, temozolomida, electroquimioterapia, TNFalfa y/o fotemustina.
En una realización particular, el melanoma es un melanoma resistente a las terapias citotóxicas convencionales descritas previamente.
Un cáncer de mama particular es un cáncer de mama tratado convencionalmente con una antraciclina, un taxano, trastuzumab, un anti-PARP (Poli (ADP-ribosa) polimerasa), un anti-PI3K (Fosfoinosítido 3-quinasa), un inhibidor de mTOR (diana de mamíferos de la rapamicina), vinorelbina, gemcitabina, un antiestrógeno, y/o un antiaromatasa, antes o después de una etapa quirúrgica para eliminar un tumor de mama, preferiblemente antes de dicha etapa quirúrgica.
En una realización particular, el cáncer de mama es un cáncer de mama resistente a las terapias convencionales descritas previamente.
Un cáncer de pulmón particular es un cáncer de pulmón tratado convencionalmente con XR y bien platino o permetrexed.
Un NSCLC de estadio temprano particular es un NSCLC tratado convencionalmente con paclitaxel, docetaxel gemcitabina, vinorelbina, etopósido, taxano, avastina [anticuerpo anti-VEGF (factor de crecimiento del endotelio vascular)], erlotinib y/o gefitinib. En una realización particular, el cáncer de pulmón es resistente a las terapias convencionales.
La presente descripción se refiere además al uso del compuesto de fórmula (I) de la invención, preferiblemente "IP2", para preparar una composición farmacéutica o medicamento, siendo capaz dicha composición de tratar el cáncer o de mejorar la eficiencia de una terapia del cáncer en un sujeto que lo necesita mediante la estimulación del sistema inmune del sujeto. El compuesto de la invención puede usarse en particular ventajosamente, en combinación con al menos un agente anticanceroso distinto como se ha descrito previamente o cualquier otro compuesto terapéuticamente activo, y/o con radioterapia, para tratar el cáncer, para prevenir las metástasis del cáncer y/o para prevenir la recurrencia del cáncer en un sujeto.
En la presente memoria también se describe así una composición que comprende, típicamente como una preparación combinada, un compuesto de fórmula (I), preferiblemente un compuesto "IP2" (IP2-6Na o IP2-4Na), y un vehículo farmacéuticamente aceptable, preferiblemente junto con al menos un agente anticanceroso distinto, para un uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento de dicho cáncer.
En la presente memoria también se describen (i) un método para prevenir o tratar el cáncer, (ii) un método para incrementar la sensibilidad de un cáncer a un agente anticanceroso, y (iii) un método para disminuir la resistencia de un cáncer con respecto a un agente anticanceroso, comprendiendo cada uno de dichos métodos administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad efectiva, típicamente una cantidad terapéuticamente efectiva, de al menos un compuesto de fórmula (I), preferiblemente un compuesto "IP2" (IP2-6Na o IP2-4Na), o una composición farmacéutica como se ha definido anteriormente, preferiblemente junto con un agente anticanceroso usado clásicamente en la prevención o tratamiento del cáncer como se describe en la presente memoria (como una preparación combinada).
En otro aspecto particular, dicho método comprende además administrar una cantidad efectiva de otro compuesto terapéuticamente activo para prevenir o tratar el cáncer o un efecto secundario del tratamiento del cáncer.
Tal y como se usa en la presente memoria, "tratamiento" o "tratar" se refiere a una intervención terapéutica en un intento de alterar el curso natural del sujeto que se está tratando, y puede realizarse bien para un propósito preventivo (profiláctico) o curativo. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero no están limitados a, prevenir la aparición o recurrencia de la enfermedad, aliviar los síntomas, y disminuir cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, disminuir la tasa de la progresión de la enfermedad, mejora o paliación del estado de la enfermedad, y remisión o pronóstico mejorado. En realizaciones preferidas, las composiciones y métodos de la invención se usan para retrasar el desarrollo de un cáncer o para ralentizar la progresión de un cáncer, típicamente del crecimiento tumoral.
Típicamente, el tratamiento inducirá una respuesta terapéutica del sistema inmune del sujeto, típicamente repuesta(s) de células T CD4+ y/o CD8+.
Por inducción de una respuesta de células T se quiere decir típicamente en la presente memoria que se incita una respuesta de células T dirigida hacia un determinado antígeno. Antes de dicha inducción, dicha respuesta de células T no estaba presente, o estaba por debajo de los niveles de detección o no era funcional. Por aumento de una respuesta de células T se quiere decir en la presente memoria que la acción global de las células T dirigida hacia un determinado antígeno se eleva y/o se hace más eficiente en comparación con la acción global de dichas células T antes de dicho aumento. Por ejemplo, después de dicho aumento, pueden generarse más células T dirigidas hacia dicho antígeno. Como resultado, la acción de las células T generadas adicionalmente incrementa la acción global frente a dicho antígeno. Alternativamente, dicho aumento puede comprender el incremento de la acción de las células T dirigidas hacia dicho antígeno. Dichas células T pueden, por ejemplo, reaccionar más fuertemente y/o rápidamente con dicho antígeno. Por supuesto, el resultado de dicho aumento puede ser la generación de células T adicionales junto con un incremento de la acción de dichas células T. Alternativamente, dicho aumento puede comprender la generación de células T adicionales, o solo un incremento de la acción de las células T.
Otro objeto descrito en la presente memoria se refiere a un método para producir una respuesta inmune en un sujeto, típicamente frente a una diana específica, preferiblemente un antígeno tumoral o célula o tejido canceroso/tumoral, comprendiendo el método inyectar a dicho sujeto un compuesto de fórmula (I) según la invención o composición según la invención que comprende dicho compuesto, típicamente en una cantidad efectiva.
La detección de una respuesta inmune terapéutica puede determinarla fácilmente el experto en la técnica gracias a tecnologías tales como ELISA, ELISPOT, respuesta de hipersensibilidad de tipo retardado, tinción de citoquinas intracelulares, y/o tinción de citoquinas extracelulares.
Tal y como se usa en la presente memoria, "una cantidad o dosis efectiva" o "una cantidad o dosis terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad del compuesto de la invención que previene, elimina, ralentiza el cáncer o reduce o retrasa uno o varios síntomas o trastornos causados por o asociados con dicha enfermedad en el sujeto, o que induce una respuesta inmune mensurable en el sujeto, que es preferiblemente un ser humano. La cantidad efectiva, y más generalmente el régimen de dosificación, del compuesto de la invención y composiciones farmacéuticas del mismo pueden ser determinadas y adaptadas por un experto en la técnica. Una dosis efectiva puede determinarse por el uso de técnicas convencionales y observando los resultados obtenidos bajo circunstancias análogas. La dosis terapéuticamente efectiva del compuesto de la invención variará dependiendo de la enfermedad que se va a tratar o prevenir, de su gravedad, de la ruta de administración, de cualquier coterapia implicada, de la edad, peso, condición médica general, historial médico del paciente, etc.
Típicamente, la cantidad del compuesto que se va a administrar a un paciente puede variar de aproximadamente 0,01 mg/kg a 500 mg/kg de peso corporal para un paciente humano. En una realización particular, la composición farmacéutica según la invención comprende 0,1 mg/kg a 100 mg/kg del compuesto de la invención, por ejemplo, de 0,5 mg/kg a 10 mg/kg.
En un aspecto particular, los compuestos de la invención pueden administrarse al sujeto por la ruta parenteral, ruta oral, o inyección intravenosa (IV), intratumoral (IT) o intraperitoneal (IP). El compuesto o la nanopartícula de la invención puede administrarse al sujeto diariamente (1 vez al día) durante varios días consecutivos, por ejemplo, durante 2 a 10 días consecutivos, preferiblemente de 3 a 6 días consecutivos. Dicho tratamiento puede repetirse durante 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 semanas, o cada dos o tres semanas o cada uno, dos o tres meses. Alternativamente, pueden realizarse varios ciclos de tratamiento, opcionalmente con un periodo de descanso entre dos ciclos de tratamiento, por ejemplo, de 1,2, 3, 4 o 5 semanas. El compuesto de la invención puede administrarse, por ejemplo, como una única dosis una vez a la semana,
una vez cada dos semanas, o una vez al mes. El tratamiento puede repetirse una o varias veces al año.
Las dosis se administran en intervalos apropiados que pueden ser determinados por el experto en la técnica. La cantidad elegida dependerá de múltiples factores, incluyendo la ruta de administración, la duración de la administración, el tiempo de la administración, la tasa de eliminación del compuesto de fórmula (I) seleccionado, o de los diversos productos usados en combinación con dicho compuesto, la edad, peso y condición física del paciente y su historial médico, y cualquier otra información conocida en medicina.
La ruta de administración puede realizarse por diversas rutas. Por ejemplo, puede ser oral o parenteral. Se realiza típicamente por inyección sistémica, p. ej., intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intratumoral, subcutánea, etc. La composición farmacéutica se adapta para una o varias de las rutas mencionadas anteriormente. La composición farmacéutica se administra preferiblemente por inyección o por infusión intravenosa de disoluciones estériles adecuadas, o en la forma de dosis líquidas o sólidas a través del canal alimentario.
La composición farmacéutica puede formularse como disoluciones en disolventes o vehículos farmacéuticamente compatibles, o como píldoras, comprimidos, cápsulas, polvos, supositorios, etc. que contienen vehículos sólidos de una manera conocida en la técnica, posiblemente a través de formas de dosificación o dispositivos que proporcionen una liberación sostenida y/o retrasada. Para este tipo de formulación, se usa ventajosamente un agente tal como celulosa, lípidos, carbonatos o almidones.
Los agentes o vehículos que pueden usarse en las formulaciones (líquidas y/o inyectables y/o sólidas) son excipientes o vehículos inertes, es decir, vehículos farmacéuticamente inactivos y no tóxicos.
Pueden mencionarse, por ejemplo, disoluciones salinas, fisiológicas, isotónicas y/o tamponadas, compatibles con el uso farmacéutico y conocidas para los expertos en la técnica. Las composiciones pueden contener uno o más agentes o vehículos elegidos de dispersantes, solubilizantes, estabilizantes, conservantes, etc.
Las formulaciones de la presente invención adecuadas para administración oral pueden estar en la forma de unidades discretas como cápsulas, sobres, comprimidos o pastillas para chupar, conteniendo cada una una cantidad predeterminada del ingrediente activo; en la forma de un polvo o gránulos; en la forma de una disolución o una suspensión en un líquido acuoso o líquido no acuoso; o en la forma de una emulsión de aceite en agua o una emulsión de agua en aceite. Las formulaciones adecuadas para administración parenteral comprenden convenientemente una preparación estéril aceitosa o acuosa del ingrediente activo que es preferiblemente isotónica con la sangre del receptor. Cada una de dichas formulaciones también puede contener otros agentes auxiliares farmacéuticamente compatibles y no tóxicos, tales como, p. ej., sustancias estabilizantes, antioxidantes, aglutinantes, colorantes, emulsionantes o saporíferas.
Las formulaciones de la presente invención comprenden un ingrediente activo, el compuesto de fórmula (I), preferiblemente "IP2", en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable y opcionalmente con otros ingredientes activos o terapéuticos. El vehículo debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los demás ingredientes de las formulaciones y no perjudicial para el receptor del mismo. Los métodos para la administración segura y efectiva de la mayor parte de estos agentes anticancerosos son conocidos por los expertos en la técnica. Además, su administración se describe en la bibliografía estándar.
Otro objeto de la descripción es un kit que comprende al menos un compuesto de fórmula (I), preferiblemente "IP2", y preferiblemente al menos un agente anticanceroso distinto, típicamente un fármaco quimioterapéutico, en contenedores distintos. El kit puede comprender además instrucciones para preparar una composición según la invención, para llevar a cabo uno cualquiera de los métodos descritos en la presente memoria, por ejemplo, para prevenir o tratar el cáncer, para prevenir o tratar las metástasis del cáncer y/o para prevenir o tratar la recurrencia del cáncer en un sujeto.
En un aspecto particular, la presente invención se refiere al uso de un kit como se describe en la presente memoria para preparar una composición como se describe en la presente memoria.
En otro aspecto particular, el kit es adecuado para implementar uno cualquiera de los métodos descritos en la presente memoria, en particular un método para tratar el cáncer, para prevenir las metástasis del cáncer y/o para prevenir la recurrencia del cáncer en un sujeto.
Los aspectos y ventajas adicionales de la presente invención se describirán en la siguiente sección experimental y en las figuras que deben considerarse solo como ilustrativas.
Leyendas de las figuras
Figura 1: el tratamiento con isoginkgetina incrementa la presentación antigénica de antígenos derivados de intrones en células cancerosas.
Activación de células T específicas de B3Z después del tratamiento con isoginkgetina 2,5pM y 6,25pM de (A) la línea celular de melanoma humano A375, (B) la línea celular de carcinoma de pulmón humano A549, (C) la línea celular de fibroblastos de pulmón normales MRC5. (D) Activación de células T específicas de B3Z después del tratamiento con isoginkgetina 6,25pM y 15pM de la línea celular de melanoma de ratón B16F10. (E) Activación de células T específicas de B3Z después del tratamiento con isoginkgetina 15pM y 25 pM de la línea celular de sarcoma de ratón MCA205.
Figura 2: el tratamiento con isoginkgetina incrementa la presentación antigénica de antígenos derivados de intrones en células cancerosas.
Activación de células T específicas de B3Z después del tratamiento con isoginkgetina 6,25pM, 15pM y 25pM de células MCA205 transfectadas previamente con (A) la construcción globina-SL8-intrón, (B) la construcción globina-SL8-exón, (C) la construcción de ovoalbúmina. Activación de células T específicas de B3Z después del tratamiento con isoginkgetina 6,25pM, 15pM y 25pM de células B16F10 transfectadas previamente con (D) la construcción globina-SL8-intrón, (E) la construcción globina-SL8-exón, (F) la construcción de ovoalbúmina. Los datos se proporcionan como media ± s Em . *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 (ensayo de la t de student no apareado).
Figura 3: el tratamiento con isoginkgetina ralentiza el crecimiento tumoral in vivo.
(A) Ajustes experimentales. (B) Las células MCA205 globina-SL8-intrón se inocularon subcutáneamente en el flanco de ratones. Cinco días y quince días después, se inyectaron 6mg/kg, 12mg/kg o 18mg/kg de isoginkgetina intraperitonealmente. El tamaño tumoral se evaluó cada 3 a 4 días hasta el día 27. Cada línea representa el tamaño tumoral en área (mm2) de 6 ratones en cada grupo. Los datos se proporcionan como media ± SEM. *p<0,05 (ANOVA con ensayo de comparación múltiple de Turkey comparando todos los grupos).
Figura 4: el derivado de Isoginkgetina IP2 incrementa eficientemente la presentación por MHC de clase I de antígenos derivados de intrones in vitro y reduce el crecimiento tumoral in vivo de una manera dependiente de inmunidad.
Activación de células T específicas de B3Z después del tratamiento de células MCA205 que expresan el antígeno SL8 derivado de intrón con 15pM, 25pM y 35pM de (A) IP2 o (B) IM2P2, (C) producto 10. (D) Las células MCA205 globina-SL8-intrón se inocularon subcutáneamente en el flanco de ratones C56BL/7. Cinco días y quince días después, se inyectó intraperitonealmente PBS o 18mg/kg de isoginkgetina, IP2, o M2P2. El tamaño tumoral se evaluó cada 3 a 4 días hasta el día 27. Cada línea representa el tamaño tumoral en área (mm2) de 6 ratones en cada grupo. Los datos se proporcionan como media ± SEM. *p<0,05, **p<0,01 (ANOVA con ensayo de comparación múltiple de Turkey comparando todos los grupos). (E) Las células MCA205 globina-SL8-intrón se inocularon subcutáneamente en el flanco de ratones desnudos nu/nu. Cinco días y quince días después, se inyectó intraperitonealmente PBS, 18mg/kg de isoginkgetina o IP2. El tamaño tumoral se evaluó cada 3 a 4 días hasta el día 27. Cada línea representa el tamaño tumoral en área (mm2) de 6 ratones en cada grupo. Los datos se proporcionan como media ± SEM.
Figura 5: esquema de la síntesis de derivados de isoginkgetina.
Figura 6: esquema de la síntesis de derivados de isoginkgetina.
Figura 7: la inhibición del corte y empalme incrementa la presentación por MHC-I de antígenos derivados de exón e intrón en células cancerosas.
Activación de células T específicas de SL8 de B3Z después de cocultivo con las líneas celulares de (A) melanoma humano A375, carcinoma de pulmón humano A549 o fibroblastos de pulmón humanos normales MRC5, que expresan todas transitoriamente el péptido SL8 derivado de intrón y las moléculas H2-Kb y tratadas aguas arriba con isoginkgetina 2,5j M o 6,25j M durante 18 horas; o con las líneas celulares de (B) sarcoma de ratón MCA205 o melanoma de ratón B16F10 que expresan ambas transitoriamente el péptido SL8 derivado de intrón y tratadas aguas arriba con isoginkgetina 6,25j M, 15j M o 25j M durante 18 horas. Activación de B3Z después del cocultivo con las células MCA205 o B16F10 que expresan ambas transitoriamente (C) los péptidos SL8 derivados de exón o (D) la construcción de ADNc Ova, que no necesita ser sometido a corte y empalme, tratadas aguas arriba con isoginkgetina 6,25gM, 15gM o 25j M durante 18 horas. Se añadieron péptidos SL8 libres en cada condición para asegurar que los ensayos de células T se llevaban a cabo en condiciones no saturadas y que la expresión de las moléculas de MHC-I se estaba teniendo en cuenta en los resultados. Cada gráfico es uno representativo de al menos cuatro experimentos independientes.
Los datos se proporcionan como media ± SEM. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 (ensayo de la t de student no apareado).
Figura 8: expresión de moléculas H2-Kb en la superficie de las células.
Análisis por citometría de flujo de la expresión de H2-Kb en células MCA205 y B16F10 tratadas con (A) isoginkgetina. Análisis por citometría de flujo de la expresión de H2-Kb expresada transitoriamente en células A375, A549 y MRC5 tratadas con (B) isoginkgetina.
Figura 9: el inhibidor del corte y empalme isoginkgetina reduce el crecimiento de tumor que porta el SL8 derivado de intrón de una manera dependiente de inmunidad.
(A) Ajustes experimentales. Crecimiento de células de (B) sarcoma MCA205 o (C) melanoma B16F10 que expresan ambas establemente la construcción globina-SL8-intrón o células (D) MCA205 de tipo salvaje (WT) o (E) B16F10 WT que se inocularon subcutáneamente en el flanco de ratones C57BL/6 inmunocompetentes a los que se inyectaron intraperitonealmente 12mg/kg o 18mg/kg de isoginkgetina en los días 5, 10 y 15 después de la inoculación. El tamaño tumoral se evaluó cada 3 a 4 días hasta que alcanzaron los puntos finales éticos establecidos. Cada línea representa el tamaño tumoral en área (mm2) de 6 ratones en cada grupo. Tamaño en área (mm2) de tumores (F) MCA205 globina-SL8-intrón, (G) B16F10 globina-SL8-intrón, (H) MCA205 WT o (I) B16F10 Wt inoculados subcutáneamente en el flanco de ratones desnudos Nu/Nu inmunodeficientes a los que se inyectaron intraperitonealmente 18mg/kg de isoginkgetina en los días 5, 10 y 15 después de la inoculación. Los datos se presentan en el día anterior a alcanzar los puntos finales.
Los datos se proporcionan como media ± SEM. *p<0,05, **p<0,01 (ANOVA con ensayo de comparación múltiple de Turkey comparando todos los grupos).
Figura 10: síntesis y actividad de los derivados de isoginkgetina IP2 y M2P2 (también identificado en la presente memoria como "IM2P2").
Estructura molecular de los compuestos (A) isoginkgetina, (B) IP2 (IP2-6Na e IP2-4Na) y (C) M2P2. Se trataron (D) B16F10 globina-SL8-intrón o (E) MCA205 globina-SL8-intrón con isoginkgetina 15j M, IP235|jM o M2P235j M durante 48 horas. Se extrajo el ARN y se realzó una qRT-PCR con cebadores que amplifican el ARN sin corte y empalme (intrón) y con corte y empalme (exón) de globina-SL8-intrón. Los datos se proporcionan como media ± SEM de la relación de 2-AACt intrón y 2-AACt exón de al menos tres experimentos independientes. Ensayo de MTT realizado en células MCA205 o B16F10 tratadas con 15j M o 35j M de (F) IP2 o (G) M2P2. Los datos se expresan como media ± SEM del porcentaje de células viables en comparación con la condición control de al menos tres experimentos independientes. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 (ensayo de la t de student no apareado).
Figura 11: el tratamiento con IP2 reduce el crecimiento tumoral y prolonga la supervivencia.
Activación de células T específicas de SL8 B3Z después del cocultivo con líneas celulares de ratón de (A) sarcoma MCA205 o (B) melanoma B16F10 que expresan ambas transitoriamente el péptido SL8 derivado de intrón y tratadas aguas arriba con 15j M o 35j M de IP2 (paneles izquierdos) o de M2P2 (panel derecho). Los datos se proporcionan como media ± SEM. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 (ensayo de la t de student no apareado). Crecimiento de las células (C) MCA205 (panel izquierdo) o melanoma B16F10 (panel derecho) que ambas expresan establemente la construcción globina-SL8-intrón o células (D) MCA205 WT (panel izquierdo) o B16F10 WT (panel derecho) que se inocularon subcutáneamente en el flanco de ratones C57BL/6 inmunocompetentes a los que se inyectaron intraperitonealmente 18mg/kg de isoginkgetina, de M2P2 o de IP2 o 24mg/kg o 36mg/kg de IP2 en el día 5, 10 y 15 después de la inoculación. El tamaño tumoral se evaluó cada 3 a 4 días hasta que se alcanzaron los puntos finales éticos establecidos. Cada línea representa el tamaño tumoral en área (mm2) de al menos 6 ratones en cada grupo. Los datos se proporcionan como media ± SEM. *p<0,05, **p<0,01 (ANOVA con ensayo de comparación múltiple de Turkey comparando todos los grupos). Gráficos de Kaplan Meier de (E) células MCA205 globina-SL8-intrón inoculadas subcutáneamente en el flanco de ratones C57BL/6 inmunocompetentes a los que se inyectaron intraperitonealmente PBS o 18mg/kg de isoginkgetina, de M2P2 o de IP2. Se realizó un ensayo de rango logarítmico (Mantel-Cox).
Figura 12: IP2 no influye en la expresión de las moléculas H2-Kb en la superficie celular y no induce apoptosis Análisis por citometría de flujo de la expresión de H2-Kb en células (A) MCA205 y (B) B16F10 tratadas con IP2 y M2P2. (C) Análisis por citometría de flujo de células MCA205 y B16F10 apoptóticas tempranas, tardías y totales tratadas con IP2 35pM o 1.000pM durante 18 horas.
Figura 13: el efecto terapéutico de IP2 depende de la respuesta inmune
Curva de crecimiento de (A) MCA205 globina-SL8-intrón (panel izquierdo), MCA205 WT (panel derecho), (B) B16F10 globina-SL8-intrón (panel izquierdo) o B16F10 WT (panel derecho) inoculadas subcutáneamente en el flanco de ratones desnudos Nu/Nu inmunodeficientes, a los que se inyectaron intraperitonealmente en los días 5, 10 y 15 18, 24 o 36mg/kg de IP2. Curva de crecimiento de (C, panel izquierdo) MCA205 globina-SL8-intrón inoculadas subcutáneamente en el flanco de ratones inmunocompetentes tratados con PBS o 24mg/kg de IP2 en el día 5, 10 y 15 después de la inoculación, así como con anti-CD8 o isotipo in vivo cada 3 días. Cada línea representa el tamaño tumoral en área (mm2) de al menos 6 ratones en cada grupo. El panel derecho C representa el tamaño tumoral en el día 27. Los datos se proporcionan como media ± SEM. *p<0,05, **p<0,01 (ANOVA con ensayo de comparación múltiple de Turkey comparando todos los grupos). (D) Curva de crecimiento de células MCA205 globina-SL8-intrón o células B16F10 WT inoculadas en ratones C57BL/6 100 días sin tumor inoculados previamente con MCA205 globina-SL8-intrón y tratados con IP2 (panel izquierdo) o isoginkgetina (panel derecho). Cada línea representa el tamaño tumoral en área (mm2) de al menos 4 ratones en cada grupo.
Figura 14: el tratamiento con IP2 reduce el crecimiento tumoral de tumor establecido
Crecimiento de 15*105 células de sarcoma MCA205 que expresan establemente la construcción globina-SL8-intrón se inocularon subcutáneamente en el flanco de ratones C57BL/6 inmunocompetentes. Se dejó que los tumores progresaran 10 días antes de ser clasificados y asignados a grupos con carga tumoral equivalente. Se hicieron tres grupos de 6 ratones según el tamaño tumoral un grupo con un tamaño tumoral de 40 mm2 (cuadrado), uno con un tamaño tumoral de 50 mm2 (triángulo) y uno con un tamaño tumoral de 100 mm2 (círculo). En el día 11, se inyectaron intraperitonealmente a todos los ratones 24 mg/kg de IP2-4Na. Este tratamiento se repitió 5 veces cada 3 a 4 días. En paralelo, el tamaño tumoral se evaluó cada 3 a 4 días hasta que se alcanzaron los puntos finales éticos establecidos. Cada línea representa el tamaño tumoral en área (mm2) de 6 ratones en cada grupo.
Ejemplos
Materiales y métodos
Cultivo celular
La línea celular de sarcoma de ratón MCA205 se cultiva a 37 °C bajo CO2 al 5 % en medio RPMI 1640 (Life Technologies) en presencia de glutamina al 1 %, piruvato de sodio al 1 %, aminoácidos no esenciales al 1 %, penicilina/estreptomicina al 1 % y FBS al 10 % (Life Technologies) en condiciones estándar. La línea celular de melanoma de ratón B16F10, línea celular de fibroblastos humanos MRC5 y línea celular de melanoma humano A375 se cultivan a 37 °C bajo CO2 al 5 % en medio DMEM (Life Technologies) que contiene glutamina al 1 %, penicilina/estreptomicina al 1 % y FCS al 10 % en condiciones estándar. La línea celular de carcinoma de pulmón humano A549 se cultiva a 37 °C bajo CO2 al 5 % en DMEM/F12 Glutamax I en presencia de Hepes al 1 %, piruvato de sodio al 1 % y FBS al 10 % en condiciones estándar. La línea celular estable MCA205-Globina-SL8-intrón se cultiva en la misma condición que la línea celular MCA205 con 2mg/ml de G418 adicionales (geneticina de Life Technologies) para la selección. La línea celular estable B 16F10-Globina-SL8-intrón se cultiva en la misma condición que la línea celular B16F10 con 2mg/ml de G418 adicionales (geneticina de Life Technologies) para la selección. El hibridoma informador de células T específico de SL8/Kb (B3Z) se cultiva a 37 °C bajo CO2 al 5 % en medio RPMI 1640 (Life Technologies) en presencia de glutamina al 1 %, p-galactosidasa al 0,1%, penicilina/estreptomicina al 1 % y FCS al 10 % en condiciones estándar.
Ensayo de células T
Las líneas celulares de ratón MCA205 y B16F10 se transfectan con el plásmido YFP-Globina-SL8-intrón o con el plásmido PCDNA3 vacío (control negativo) con el reactivo de transfección jetPRIME (Ozyme) o GeneJuice (Millipore) respectivamente según el protocolo de cada fabricante. Las líneas celulares humanas A375, A549 y MRC5 se transfectan con el plásmido que codifica la molécula H2-Kb de ratón durante 12 horas seguido de la transfección del plásmido YFP-Globina-SL8-intrón con el reactivo de transfección jetPRIME (Ozyme) según el protocolo del fabricante. Veinticuatro horas después de la transfección, las células se tratan con diferentes dosis de Isoginkgetina (Merk Millipore), IP2 o IM2P2 (también identificado en la presente memoria como "M2P2") toda la noche. Entonces, las células se lavan tres veces con PBS 1X y se cocultivan 5x104 células con 1 x105 células B3Z. En los pocillos de control positivo, se añaden 4pg/ml de péptido sintético SL8. Las células se incuban entonces a 37 °C con CO2 al 5 % toda la noche. Las células se centrifugan a 1.200rpm durante 5min, se lavan dos veces con PBS 1X y se lisan durante 5min a 4 °C con agitación con el siguiente tampón de lisis: TritonX-100 al 0,2 %, DTT al 0,2 %, k 2h PO40,5M, KH2PO4 0,5M. El lisado se centrifuga a 3.000rpm durante 10min y el sobrenadante se transfiere a una optiplate de 96 pocillos (Packard Bioscience, Randburg, SA). Se añade tampón de revelado que contiene 33mM de metilumbeliferil p-D-galactopiranósido (MUG) y la placa se incuba a temperatura ambiente durante 3 horas. Finalmente, la actividad pgalactosidasa se mide usando el FLUOstar OPTIMA (BMG LABTECH Gmbh, Offenburg, Alemania). Los resultados se expresan como media ± SEM. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 (ensayo de la t de student no apareado).
Pulso y tratamiento del tumor
Los ratones hembra C57B1/6J se obtienen de Harlan. Los ratones desnudos NU/NU se obtienen de Charles River. A las 7 semanas de edad, se inyectan subcutáneamente a los ratones en el flanco derecho 5x104 células MCA205-Globina-SL8-intrón o 4x104 células B16F10-Globina-SL8-intrón junto con matrigel (VWR). Cinco días después del pulso, los ratones se tratan intraperitonealmente con PBS, Isoginkgetina (Merk Milllipore), IP2 o IM2P2. Quince días después del pulso, los ratones se tratan de nuevo intraperitonealmente con el mismo fármaco. Se registra el área del tumor cada 3 a 4 días hasta el día 27. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo cumpliendo las leyes y regulaciones francesas y europeas. Los resultados se expresan como media ± SEM. *p<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 (ANOVA con ensayo de comparación múltiple de Turkey comparando todos los grupos).
Resultados
El tratamiento con Isoginkgetina incrementa la presentación antigénica de antígenos derivados de intrón en células cancerosas.
En estudios recientes, los inventores han mostrado que los Productos de Traducción Pionera (''PTP'') son una fuente importante de péptidos para la ruta endógena de MHC de clase I in vitro. Con el fin de modular la presentación de antígenos derivados de los PTP en la superficie de las células cancerosas, ensayaron el impacto del tratamiento con isoginkgetina en las líneas celulares de melanoma A375, de carcinoma de pulmón A549 y de fibroblastos de pulmón normales MRC5. Para este propósito, todas las células expresaron transitoriamente respectivamente la molécula de MHC de clase I Kb y el epítopo SL8 de un intrón en las construcciones del gen de la p-Globina. Como se muestra en las figuras 1A, 1B y 1C, el compuesto Isoginkgetina natural causa un incremento en la presentación de antígenos dependiente de PTP de intrón en las líneas celulares cancerosas ensayadas, con un efecto dependiente de la dosis. De forma similar, el mismo experimento se ha realizado en líneas celulares tumorales de ratones, en las líneas celulares de melanoma (B16F10) y sarcoma (MCA205). Ambas líneas celulares murinas expresaban transitoriamente el epítopo SL8 de PTP derivado de un intrón en la construcción del gen de la p-Globina. Consistente con los resultados previos en líneas celulares humanas, la Isoginkgetina incita un incremento en la presentación de antígenos dependiente de PTP, con un efecto dependiente de la dosis en las líneas celulares de ratón. Estos resultados muestran que la producción y presentación de antígenos de los PTP o antígenos derivados de los PTP puede modularse positivamente en líneas celulares cancerosas después del tratamiento con isoginkgetina. Apoyan la hipótesis de que esta molécula podría usarse como un inmunomodulador positivo para potenciar una respuesta inmune antitumoral específica dependiente de la producción y presentación de los PTP.
Se requiere un evento de corte y empalme para un incremento eficiente de la presentación antigénica derivada de exón e intrón en células cancerosas después del tratamiento con Isoginkgetina.
El hecho de que la Isoginkgetina incrementa la presentación del epítopo SL8 en la superficie celular de una región codificada por intrón apoya la idea de que los pre-ARNm son una fuente para la presentación de antígenos cuando la maquinaria de corte y empalme está alterada. Los inventores especulan entonces que la Isoginkgetina también incitará un incremento del epítopo antigénico a partir de una región codificada por exón, pero no a partir de una construcción de ADNc que no necesita ser sometida a corte y empalme. Para este propósito, ambas líneas celulares murinas mencionadas anteriormente expresaron transitoriamente el epítopo SL8 de los PTP a partir de un exón en la construcción del gen de la p-Globina o expresaron transitoriamente el ADNc de Ova donde se encuentra el epítopo SL8 en su entorno correcto. Como se esperaba, el compuesto Isoginkgetina natural causa un incremento en la presentación de antígeno dependiente de los PTP en exón e intrón en las líneas celulares cancerosas ensayadas, con un efecto dependiente de la dosis (Fig 2A, 2B, 2D y 2E), mientras el inhibidor del corte y empalme no tiene ningún efecto en la producción del epítopo SL8 codificado por la construcción de ADNc de Ova (Fig 2C y 2F). Estos resultados muestran que se requiere el corte y empalme para que la isoginkgetina actúe como un refuerzo para la presentación de los antígenos de los PTP o derivados de PTP en las células cancerosas.
El tratamiento con Isoginkgetina ralentiza el crecimiento tumoral in vivo.
Los resultados anteriores demuestran que independientemente de la fuente del antígeno dependiente de los PTP codificado por secuencias exónicas o intrónicas, el producto natural de Isoginkgetina es capaz de incrementar su producción y presentación in vitro en la superficie celular de las líneas celulares tumorales tratadas. La siguiente cuestión evidente fue observar si la Isoginkgetina, que tiene que disolverse en DMSO, puede tener el mismo efecto sobre el crecimiento tumoral y la proliferación de las células T CD8+ in vivo. Para este propósito, las células de sarcoma MCA205 que expresan establemente el epítopo SIINFEKL (SL8) a partir de un intrón en el gen de la p-Globina (Globina-intrón-SL8) se inocularon subcutáneamente en ratones. Cinco días después de esta inoculación, los ratones se vacunaron intraperitonealmente con una dosis definida de Isoginkgetina. Entonces, 10 días después, se inyectó de nuevo la misma dosis. Durante este tiempo, se monitorizó el crecimiento tumoral cada dos a tres días (Fig. 3A). Los inventores observaron una reducción significativa del 50 % del crecimiento tumoral en el día 27 después del pulso en ratones tratados con 6, y 18mg/kg de Isoginkgetina (Fig. 3B). Con el fin de evaluar el requerimiento de la respuesta inmune para este efecto, ensayaron el impacto del tratamiento con 18mg/kg de isoginkgetina en ratones nu/nu inmunodeficientes con los mismos ajustes que se han descrito previamente y observaron que no tiene ningún efecto sobre el crecimiento tumoral (Fig. 4D). Estos resultados muestran que la reducción del tamaño tumoral después del tratamiento con isoginkgetina requiere la presencia de una respuesta inmune activa in vivo. A continuación, los inventores decidieron generar derivados de la Isoginkgetina con el fin de intentar incrementar la respuesta antitumoral. De hecho, la isoginkgetina es insoluble en agua y solo puede disolverse en el disolvente DMSO haciendo que su farmacocinética en la cavidad peritoneal sea menos eficiente.
Compuestos derivados del producto Isoginkgetina natural: esquema de síntesis.
Con el fin de hacer que la isoginkgetina esté disponible para una validación más amplia in vivo sin el uso de vehículos o codisolventes tóxicos (DMSO), se consideró necesario encontrar una estrategia para aumentar su solubilidad. Los compuestos de la invención se prepararon a partir de isoginkgetina comercial, una pequeña molécula polifenólica referida más comúnmente como biflavonoide, extraída de las hojas del árbol de los cuarenta escudos, Ginko biloba L. Teniendo en cuenta que los productos naturales disueltos en DMSO podrían no asimilarse bien en ratones, los inventores decidieron generar compuestos derivados que mantendrían sus funciones, lo que significa inhibición del espliceosoma e inmunomodulación positiva frente a líneas celulares cancerosas con una mejor farmacocinética que el compuesto natural disuelto en un codisolvente.
La síntesis de los compuestos IP2 (2 y 2'), representada en el Esquema 1 (Fig. 5), se consiguió a partir de isoginkgetina por fosforilación empleando la formación in situ de dietilclorofosfito para proporcionar 1. La escisión adicional de los grupos protectores de éster etílico con yodotrimetilsilano rindió el intermedio ácido fosfórico, que se trató inmediatamente con hidróxido de sodio para completar una ruta práctica hacia los profármacos de fosfato de disodio 2 y 2'. Se encontró que la solubilidad en agua de 2 y 2' era considerablemente mayor que la del compuesto parental isoginkgetina.
La síntesis de IM2P2, derivado 4, se consiguió como se representa en el Esquema 1. Los dos grupos fenol remanentes de 1 se alquilaron usando yoduro de metilo para suministrar el compuesto 3. El tratamiento de este último en condiciones similares a la preparación de 2 y 2' a partir de 1, proporcionó el profármaco de fosfato de disodio 4, mientras que su reacción en condiciones básicas proporcionó el compuesto 5.
El profármaco 8 se sintetizó en tres etapas a partir de 6 por fosforilación de los grupos fenol en la posición C4 seguido de escisión de los grupos etilo de 7 con yoduro de trimetilsililo y reacción del ácido fosfórico resultante con hidróxido de sodio en agua para rendir el profármaco de fosfato de sodio 8.
Esquema 1 (véase la Figura 5):
Figure imgf000016_0001
El tratamiento de isoginkgetina con un gran exceso de yoduro de metilo (5 equiv) en condiciones básicas suministró el compuesto completamente metilado 11 [véase el Esquema 2 (Fig. 6)]. El uso de 3 equivalentes de Mel produjo una mezcla de productos trialquilados 9 y 10 que se separaron fácilmente por cromatografía en columna. La reacción de isoginkgetina con cloruro de piridinio permite la escisión del éter y rindió el compuesto polifenólico 12.
Esquema 2 (véase la Figura 6):
Figure imgf000017_0001
El derivado de Isoginkgetina IP2 incrementa eficientemente la presentación de MHC de clase I de antígeno derivado
de intrón in vitro y reduce dramáticamente el crecimiento tumoral in vivo de una manera dependiente de la inmunidad.
Con el fin de ensayar los nuevos compuestos como inmunomoduladores positivos frente a líneas celulares tumorales,
los inventores decidieron en primer lugar ensayarlos en un ensayo in vitro. Los dos derivados 2 y/o 2', identificados
también ambos en la presente memoria como "IP2", y el derivado 4, denominado "IM2P2", se pudieron disolver en
agua. Después del tratamiento de células MCA205 que expresan transitoriamente el epítopo SL8 de los PTP derivado
de un intrón en el gen de la p-Globina (Globina-intrón-SL8) con 15|jM, 25|jM o 35|jM de IP2, los inventores observan
un incremento de la presentación de antígeno dependiente de los PTP (Fig. 4A). Por el contrario, el tratamiento de las
células MCA205 que expresan la construcción codificada por PTP de los inventores con 15jiM, 25 jiM y 35jiM de
IM2P2 (Fig. 4B) o el producto o compuesto 10 (Fig. 4C) no incrementa la presentación del antígeno derivado de los
PTP de los inventores. Entonces, los inventores decidieron investigar in vivo el efecto de estos derivados en términos
de anti-crecimiento tumoral e inductores de respuestas inmunes antitumorales específicas. Para este propósito, las
células de sarcoma MCA205, que expresan establemente el epítopo SIINFEKL (SL8) a partir de un entorno de intrón
en el gen de la p-Globina (Globina-intrón-SL8), se inocularon subcutáneamente en ratones. Entonces, 5 días después
de esta inoculación, cada grupo de ratones se vacunó intraperitonealmente respectivamente con 18mg/kg de
Isoginkgetina, IP2 o IM2P2. Diez días después, se inyectó de nuevo la misma dosis de cada compuesto. Durante este
tiempo, se monitorizó el crecimiento tumoral cada dos a tres días (Fig. 3A). En el grupo de ratones tratados con
18mg/kg de IP2, los inventores observaron una disminución dramática del crecimiento tumoral en comparación con el
grupo de ratones tratados con 18mg/kg de Isoginkgetina (Fig. 4D). En paralelo y por el contrario, los ratones que se
trataron con 18mg/kg de IM2P2 no demostraron ninguna disminución del crecimiento tumoral (Fig. 4D).
Para demostrar que la disminución del crecimiento tumoral se debe a respuestas inmunes antitumorales específicas
de una manera dependiente de los PTP, los inventores investigaron el efecto de los compuestos en ratones atímicos
desnudos Nu/Nu. Para este propósito, las células de sarcoma MCA205 que expresan establemente el epítopo
SIINFEKL (SL8) a partir de un entorno de intrón en el gen de la p-Globina (Globina-intrón-SL8) se inocularon
subcutáneamente en ratones. Entonces, 5 días después de esta inoculación, cada grupo de ratones se vacunaron
intraperitonealmente respectivamente con 18mg/kg de Isoginkgetina, IP2 e IM2P2. Entonces 10 días después, se
inyectó de nuevo la misma dosis de cada compuesto. Durante este tiempo, se monitorizó el crecimiento tumoral cada
dos a tres días (Fig. 3A). La Figura 4E muestra que cualquiera de los compuestos usados tiene un efecto sobre el
crecimiento tumoral de las líneas celulares de sarcoma en estos ratones inmunodeficientes, lo que apoya y ofrece más
luz sobre el hecho de que el derivado seleccionado del producto natural Isoginkgetina que es un inhibidor del corte y
empalme puede verse como un inmunomodulador positivo frente a cánceres y puede usarse como un nuevo
tratamiento quimioterapéutico.
Discusión
La presente invención demuestra por primera vez que el producto identificado en la presente memoria como IP2 tiene
un efecto muy positivo sobre la respuesta inmune antitumoral y, por lo tanto, sobre el crecimiento tumoral. Los inventores demostraron de hecho que un derivado específico del producto natural Isoginkgetina es un estimulador potente de la respuesta inmune antitumoral in vitro y también in vivo. Dicha molécula pequeña que presenta esta clase de mecanismo de acción no tiene precedentes. Los datos de los inventores abren el camino a nuevas aplicaciones anticancerosas en el marco de terapias moleculares dirigidas.
El corte y empalme del pre-ARNm es un mecanismo esencial requerido para la función normal de todas las células de mamíferos. En los últimos años, varios estudios reportaron la presencia de mutaciones y la sobreexpresión de factores principales del espliceosoma asociados con una actividad de corte y empalme aberrante en diversos cánceres. Hace pocos años, los inventores también han proporcionado alguna evidencia de que la inhibición del espliceosoma incrementa la presentación de antígenos dependiente de los PTP por el MHC de clase I. Estos descubrimientos ponen el foco en el espliceosoma como una diana potencial en el tratamiento anticanceroso. Ya se ha reportado que las moléculas pequeñas inhiben el espliceosoma e inhiben específicamente la función del factor del espliceosoma SF3B1. Aunque todavía no se entienden completamente los mecanismos precisos de estas moléculas pequeñas, se ha reportado que pueden ser efectivas en la terapia del cáncer mediante la reducción del tamaño tumoral del 40 al 80 % dependiendo del compuesto usado. El único que se ha ensayado hasta la fecha en seres humanos es E7107. Se ha detenido debido a problemas de toxicidad. Se sabe que este compuesto inhibe el espliceosoma interaccionando con SF3B1. En ese estudio, los inventores proporcionan evidencias tanto in vitro como in vivo de que mediante la modulación de la actividad del espliceosoma usando el compuesto derivado específico IP2 del producto natural Isoginkgetina descrito en la presente memoria puede inducirse una respuesta inmune antitumoral específica.
En lugar de investigar el efecto de estos diferentes compuestos en la inhibición de un componente específico del espliceosoma, los inventores decidieron investigar otra clase de inhibidores que se ha reportado que inhiben la formación del complejo del espliceosoma. Se ha reportado que la Isoginkgetina interfiere en la etapa temprana de ensamblaje del espliceosoma y también se ha reportado que es un potente inhibidor de la invasión de las células tumorales. De hecho, se ha demostrado que la Isoginkgetina inhibe el complejo A del pre-espliceosoma para formar un complejo B del espliceosoma precatalítico mayor. Los inventores demostraron que mediante la inhibición de la formación del espliceosoma, tan pronto como sea posible usando el derivado IP2 de la Isoginkgetina in vitro e in vivo, la presentación antigénica antitumoral se incrementaba muy significativamente, mediante la inducción específica de la proliferación de células T CD8+ frente a los epítopos dependientes de los PTP. Los inventores reportan en la presente memoria que IP2 puede usarse como un nuevo agente quimioterapéutico frente al cáncer, en particular, frente al melanoma y sarcoma.
Resultados adicionales
La inhibición del corte y empalme incrementa la presentación de antígenos derivados de intrones y exones en células cancerosas
Las células cancerosas presentan diferentes mecanismos intracelulares que pueden dar forma al combinado y la cantidad de péptidos presentados en las moléculas de MHC de clase I (MHC-I) en su superficie, dando lugar a una reducción de su antigenicidad y al escape del reconocimiento por las células T. Los inventores han mostrado que los PTP son una fuente importante de péptidos para la ruta endógena de MHC-I in vitro. Además, han proporcionado la primera prueba del impacto positivo de la inhibición del corte y empalme sobre la presentación de antígenos dependientes de los PTP mediante el tratamiento de células HEK con el inhibidor del corte y empalme isoginkgetina. Se ha reportado que la última inhibe el espliceosoma durante las etapas tempranas de su ensamblaje. Con vista a mejorar la antigenicidad y reconocimiento inmune de las líneas celulares cancerosas, los inventores determinaron si la isoginkgetina era capaz de modular positivamente la expresión y la presentación de antígenos asociados a tumor derivados de los PTP (TA-PTP) en la superficie de las células cancerosas. Para este propósito, la línea celular de melanoma humano A375, la línea celular de cáncer de pulmón humano A549 y la línea celular de fibroblastos de pulmón humanos normales MRC5 expresaron transitoriamente la molécula de MHC-1H2-Kb y el epítopo PTP-SL8 a partir de un intrón en la construcción del gen de la p-Globina (Globina-SL8-intrón) y se trataron con diferentes concentraciones de isoginkgetina durante 18h. Todos los resultados se expresaron sobre la base de la relación de la activación de B3Z con y sin la adición extracelular del péptido SL8 con el fin de evitar el sesgo por las modulaciones en la expresión global de las moléculas H2-Kb en la superficie celular después del tratamiento. El tratamiento con isoginkgetina incrementa la presentación del antígeno SL8 derivado de intrón en los tres tipos de células, de una manera dependiente de la dosis (Figura 7A). Las concentraciones de isoginkgetina usadas no eran tóxicas para las células humanas, ya que se muestra que la viabilidad era superior al 80 % después del tratamiento (tabla 1).
Tabla 1: Porcentaje de supervivencia de líneas celulares humanas después del tratamiento con isoginkgetina.
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Ensayo de MTT en las líneas celulares A375, A549 y MRC5 tratadas con 2,5|jM o 6,25|jM de isoginkgetina. Los datos se proporcionan como la media del porcentaje de la viabilidad celular ± SEM de al menos tres experimentos independientes.
En paralelo, se realizó el mismo experimento en las líneas celulares de ratón de melanoma B16F10 y sarcoma MCA205 que expresaban transitoriamente la construcción Globina-SL8-intrón. Consistente con los resultados previos, la isoginkgetina incita un incremento en la presentación del antígeno SL8 derivado de intrón, de una manera dependiente de la dosis (Figura 7B). Las dosis eficientes dieron lugar a una viabilidad celular superior al 50 % en estas líneas celulares (tabla 2).
Tabla 2: Porcentaje de supervivencia de líneas celulares humanas después del tratamiento con isoginkgetina.
Figure imgf000019_0002
Ensayo de MTT en las líneas celulares MCA205 y B16F10 tratadas con 6,25j M, 15j M o 25j M de isoginkgetina. Los datos se proporcionan como la media del porcentaje de la viabilidad celular ± SEM de al menos tres experimentos independientes.
Para investigar adicionalmente el impacto de la isoginkgetina en la presentación de los PTP, las líneas celulares tanto de sarcoma como de melanoma murinos expresaban transitoriamente el epítopo SL8 de los PTP a partir de un exón en la construcción del gen de la p-Globina (Globina-SL8-exón) o expresaban transitoriamente el ADNc de Ova. En la última construcción, el epítopo SL8 se encuentra en su ajuste correcto y no necesita ser sometido a corte y empalme. Los inventores observaron que la isoginkgetina incrementa la presentación del antígeno SL8 derivado de exón en las líneas celulares cancerosas MCA205 y B16F10 con un efecto dependiente de la dosis (Figura 7C), mientras que el inhibidor del corte y empalme no tiene efecto en la producción del epítopo SL8 codificado por la construcción de ADNc de Ova (Figura 7D). Por lo tanto, el evento de corte y empalme parece requerirse para que la isoginkgetina afecte la presentación de antígeno dependiente de los PTP. Esto sugiere una acción de la isoginkgetina durante la etapa de producción de los PTP y no más adelante en la ruta de presentación de antígenos por MHC-I. Junto con estos resultados, los inventores mostraron que la expresión de las moléculas H2-Kb en la superficie celular está afectada de manera diferente en las líneas celulares tratadas con isoginkgetina, es decir, disminuye en MCA205 (figura 8A, panel izquierdo), se incrementa en B16F10 (figura 8 A, panel derecho) y es estable en las líneas celulares humanas (figura 8B).
Globalmente, estos resultados muestran que el producto natural isoginkgetina actúa como un refuerzo en la presentación de antígenos derivados de los PTP en las células cancerosas independientemente del entorno del epítopo, es decir, en secuencias exónicas o intrónicas, e independientemente de las líneas celulares ensayadas. Esto arrojó luz sobre la importancia del evento de corte y empalme para la producción y la presentación de antígenos por MHC-I en las células cancerosas. Finalmente, los datos de los inventores apoyan la idea de que los pre-ARNm son una fuente para la presentación de antígenos cuando la maquinaria de corte y empalme está alterada.
El tratamiento con Isoginkgetina ralentiza el crecimiento tumoral in vivo cuando el epítopo SL8 derivado de intrón se expresa y su acción depende de la respuesta inmune.
Se ha demostrado que la abundancia de antígenos en la superficie celular es un parámetro clave en la determinación de la magnitud de la respuesta de las células T CD8+ y, por lo tanto, en la definición de la inmunodominancia (Doherty et al., 2006). Se ha mostrado ampliamente que el péptido SL8 es altamente inmunogénico in vivo. Observando la activación de células T específicas de SL8 in vitro, los inventores observaron un cambio en la abundancia de la expresión de SL8 en la superficie de las células cancerosas después de la inhibición del corte y empalme. Con el fin de ensayar esta hipótesis in vivo, en primer lugar, observaron el impacto del tratamiento con isoginkgetina en el crecimiento de tumores que expresan el péptido SL8 derivado de intrón. Para este propósito, tanto las células de sarcoma MCA205 como las células de melanoma B16F10 que expresan establemente la construcción globina-intrón-SL8 se inocularon subcutáneamente en ratones. En los días 5, 10 y 15 después de la inoculación del tumor, se inyectó a los ratones intraperitonealmente una dosis definida de isoginkgetina, y se monitorizó el crecimiento tumoral (Figura 9A). En los ratones que portaban tumores MCA205 globina-SL8-intrón (MCA205 GI), los inventores observaron una reducción significativa del tamaño tumoral, superior al 50 % en el día 27 después del pulso cuando se trataron con 12 y 18mg/kg de isoginkgetina (Figura 9B). El impacto del tratamiento con isoginkgetina en el crecimiento tumoral de B16F10 globina-SL8-intrón (B16F10 GI) es menor que en MCA205 GI; sin embargo, el fármaco todavía ralentiza significativamente el crecimiento tumoral (Figura 9C). Para evaluar el vínculo entre la sobreexpresión de SL8 y la reducción del crecimiento tumoral in vivo después del tratamiento con isoginkgetina, los inventores realizaron el mismo experimento con ratones a los que se inoculó bien células MCA205 o B16F10 de tipo salvaje (WT). No se observó una reducción significativa del crecimiento tumoral de MCA205 WT (Figura 9D) o B16F10 WT (Figura 9E) después del tratamiento con 12 y 18mg/kg de isoginkgetina. Estos resultados sugieren que se requiere la expresión de un epítopo inmunodominante, en la presente memoria el péptido SL8, para que la isoginkgetina afecte el crecimiento tumoral in vivo.
Los inventores evaluaron entonces el requerimiento de la respuesta inmune para que la isoginkgetina reduzca el crecimiento tumoral. Se inocularon subcutáneamente a ratones desnudos Nu/Nu inmunodeficientes bien células MCA205 o B16F10 que expresan establemente la Globina-intrón-SL8 o WT, y se trataron con los mismos ajustes que los descritos previamente (Figura 9A). No se observó ningún efecto del tratamiento con isoginkgetina en el crecimiento de cada uno de los cuatro tipos de tumor (Figura 9F-I).
Globalmente, estos resultados muestran que la reducción del tamaño tumoral después del tratamiento con isoginkgetina requiere la presencia de una respuesta inmune activa in vivo, y sugiere que el incremento de la expresión de un epítopo inmunodominante dirige la respuesta inmune antitumoral.
Los derivados del compuesto de la Isoginkgetina natural (producto IP2 y producto M2P2, siendo el último también identificado en la presente memoria anteriormente como "IM2P2") son solubles en agua, inhiben el corte y empalme y son menos tóxicos.
Los derivados del producto natural isoginkgetina se sintetizaron y ensayaron para determinar su capacidad de inhibir el corte y empalme, para incrementar los antígenos derivados de los PTP in vitro, así como para determinar su capacidad de reducir el crecimiento tumoral in vivo. Los derivados IP2 (véase IP2-6Na e IP2-4Na en la figura 10B) y M2P2 (figura 10C) se sintetizaron a partir de isoginkgetina comercial (Figura 10A), referida más comúnmente como biflavonoide, extraída de las hojas del árbol de los cuarenta escudos, Ginko biloba L. El esquema de la síntesis se proporciona en la figura 5. Brevemente, la síntesis de IP2 o de los compuestos 2 y 2' (como se denominan en el esquema) se consiguió por la fosforilación de isoginkgetina empleando la formación in situ de dietilclorofosfito para proporcionar el compuesto 1. La escisión adicional de los grupos protectores de éster etílico con yodotrimetilsilano rindió el intermedio ácido fosfórico, que se trató inmediatamente con hidróxido de sodio para completar una ruta práctica hacia el profármaco de fosfato de disodio. Para la síntesis de la molécula M2P2, los dos grupos fenol remanentes del compuesto 1 se alquilaron usando yoduro de metilo para suministrar el compuesto 3. El tratamiento del último en condiciones similares a la preparación de los compuestos 2 y 2' a partir del compuesto 1 proporcionó el profármaco de fosfato de disodio 4 o M2P2, mientras que su reacción en condiciones básicas proporcionó el compuesto 5.
Se encontró que la solubilidad en agua de IP2 y M2P2 era considerablemente mayor que la del compuesto parental isoginkgetina (datos no mostrados). Además, los inventores ensayaron la capacidad de IP2 y M2P2 para inhibir el corte y empalme del producto génico Globina-SL8-intrón en las células MCA205 y B16F10. De forma interesante, IP2 y M2P2 proporcionan dos patrones distintos de inhibición del corte y empalme en cada línea celular. El tratamiento con IP2 incrementa la presencia de productos de ARN no sometidos a corte y empalme en ambas células, tal y como hace el tratamiento con isoginkgetina. Por el contrario, el tratamiento con M2P2 no afecta el corte y empalme en las células B16F10, mientras que tiene un impacto fuerte en el corte y empalme en MCA205 en comparación con el tratamiento con IP2 e isoginkgetina (Figura 10D y 10E). Por lo tanto, parece que IP2 y M2P2 presentan mecanismos diferentes para inhibir el corte y empalme. De forma importante, los inventores observaron que el patrón de corte y empalme de IP2 es similar al de la isoginkgetina para el producto génico estudiado. Además, se ha mostrado que las células cancerosas pueden adquirir deficiencias en la maquinaria de corte y empalme que benefician su crecimiento, por ejemplo, evitando la expresión de genes supresores de tumores. Estas deficiencias no son de la misma naturaleza en todos los tumores y, por lo tanto, podrían explicar los distintos efectos de los inhibidores del corte y empalme en tipos de tumores separados. Ni IP2 ni M2P2 presentan toxicidad en células MCA205 y B16F10 WT a las dosis ensayadas (Figura 10F y 10G). Globalmente, los inventores han proporcionado e identificado en la presente memoria, por primera vez, dos nuevos fármacos que son solubles en agua y que pueden afectar el corte y empalme de forma diferente en dos líneas celulares modelo distintas a dosis que no afectan la viabilidad de las células.
El derivado de Isoginkgetina IP2 incrementa eficientemente la presentación por MHC-I de antígeno derivado de intrón in vitro, reduce el crecimiento tumoral in vivo y prolonga la supervivencia.
Con el fin de ensayar el efecto inmunomodulador potencial de los compuestos IP2 y M2P2 en comparación con la isoginkgetina, las dos moléculas se ensayaron en primer lugar para determinar su capacidad de incrementar la presentación por MHC-I de antígenos derivados de los PTP in vitro. Para este propósito, las células MCA205 y B16F10 expresaban transitoriamente la construcción Globina-intrón-SL8 y se trataron con 15gM o 35gM de IP2 o M2P2. Mientras que el tratamiento con IP2 incrementa la presentación del antígeno SL8 derivado de intrón en las células MCA205 y B16F10 de forma similar a la que los inventores observaron después del tratamiento con isoginkgetina (Figura 11A y B, paneles izquierdos), M2P2 disminuye su presentación en las células MCA205 y no la afecta en las células B16F10 (Figura 11A y B paneles derechos). Estos resultados se correlacionan de forma interesante con la capacidad respectiva de IP2 y M2P2 para inhibir el corte y empalme del gen Globina-SL8-intrón. De hecho, M2P2 no tiene impacto ni en el corte y empalme ni en la presentación del antígeno SL8 en B16F10. A la inversa, M2P2 inhibe fuertemente el corte y empalme en MCA205 y afecta negativamente la presentación de SL8. Junto con estos resultados, los inventores mostraron que la expresión de las moléculas H2-Kb en la superficie celular no se ve afectada en las líneas celulares tratadas con IP2 y M2P2 (figura 12A y 12B). Por lo tanto, parece probable que se requiere una regulación firme del corte y empalme para que los tratamientos afecten positivamente la presentación de epítopos derivados de intrón. Estos resultados muestran que el derivado de isoginkgetina IP2 actúa como un refuerzo de la presentación antigénica derivada de los PTP in vitro de la misma manera que el producto natural.
Las moléculas IP2 y M2P2 se ensayaron entonces para determinar su efecto antitumoral in vivo. Como se ha realizado previamente con el tratamiento de isoginkgetina, las células de sarcoma MCA205 o células de melanoma B16F10, que expresan establemente la construcción Globina-intrón-SL8 o WT, se inocularon subcutáneamente en ratones. En los días 5, 10 y 15 después de la inoculación del tumor, cada grupo de ratones se trató intraperitonealmente respectivamente con 18mg/kg de isoginkgetina, IP2 o M2P2. A esta dosis, se observó una disminución significativa del crecimiento tumoral de MCA205 GI después del tratamiento con IP2 en comparación con el tratamiento con isoginkgetina, mientras que no se monitorizó ningún impacto del tratamiento con M2P2 (Figura 11C, panel izquierdo). Además, la reducción del crecimiento tumoral de B16F10 GI fue similar después del tratamiento con 18mg/kg de isoginkgetina o IP2, mientras que M2P2 no tuvo efecto en el crecimiento (Figura 11C, panel derecho). Como el tratamiento con IP2 reduce el crecimiento tumoral y es soluble en agua, los inventores decidieron incrementar la dosis inyectada en ratones. La dosis incrementada de IP2 no mejoró su efecto antitumoral en MCA205 GI a 24mg/kg, pero lo incrementó en B16F10 GI a 36mg/kg (Figura 11C). De forma llamativa, el tratamiento con isoginkgetina y M2P2 no afectó el crecimiento tumoral ni de MCA205 WT ni de B16F10 WT, mientras que el tratamiento con IP2 ralentiza ambos crecimientos tumorales (Figura 11D). Los inventores confirmaron que IP2 no induce apoptosis de las células tumorales incluso a una dosis alta (Figura 12C). Finalmente, se mostró que el tratamiento con IP2 prolongaba la supervivencia de los ratones, con más del 50 % de supervivientes 100 días después de la inoculación del tumor (Figura 11E, panel inferior). Al mismo tiempo, alrededor del 30 % de los ratones tratados con isoginkgetina estaban todavía vivos (Figura 11E, panel medio). El tratamiento con M2P2 no afecta la supervivencia (Figura 11E, panel superior).
Globalmente, estos resultados demuestran una correlación entre un incremento de la presentación de antígenos derivados de los PTP observada in vitro y una reducción del crecimiento tumoral in vivo después del tratamiento. De forma interesante, al contrario que la isoginkgetina, el tratamiento con IP2 ralentiza el crecimiento de los tumores que no portan el epítopo SL8 altamente inmunodominante derivado de los PTP. Los inventores creen que el inhibidor del corte y empalme IP2 potencia la aparición de epítopos inmunodominantes en la superficie celular que dirige la respuesta antitumoral.
La eficacia del tratamiento con IP2 depende de la respuesta inmune y crea una respuesta antitumoral duradera.
Para determinar el requerimiento del sistema inmune y especialmente de la respuesta de las células T para la eficacia de IP2 frente al tumor, los inventores investigaron su efecto en ratones atímicos desnudos Nu/Nu que carecen de células T pero no de células B y NK. Como se ha ensayado previamente con isoginkgetina, las células MCA205 o B16F10 que expresan establemente la construcción Globina-intrón-SL8 o WT se inocularon subcutáneamente en ratones. En los días 5, 10 y 15 después de la inoculación del tumor, cada grupo de ratones se trató intraperitonealmente con la dosis más eficiente de IP2 frente al crecimiento tumoral observada en ratones inmunocompetentes. Por lo tanto, se trataron ratones que portaban MCA205GI, MCA205 WT y B16F10 GI o WT con 18mg/kg, 24mg/kg y 36mg/kg, respectivamente. En cada condición, no se observó ningún impacto del tratamiento con IP2 en el crecimiento tumoral (Figura 13A y B).
Además, con el fin de evaluar el requerimiento específico de células T CD8+ para la eficacia de IP2, los inventores ensayaron el impacto de la depleción de células T CD8+ in vivo en ratones. Los ratones se inocularon con células MCA205 GI subcutáneamente seguido de un tratamiento programado con anticuerpo anti-células T CD8+ o con el isotipo 2A3. El tratamiento con IP2 se administró como previamente en el día 5, 10 y 15. De forma interesante, el tratamiento con anticuerpo anti-células T CD8+ suprimió completamente el efecto antitumoral del tratamiento con IP2 (Figura 13C). Por lo tanto, este resultado confirma que el efecto del tratamiento con IP2 sobre el crecimiento tumoral depende de la respuesta de células T CD8+, lo que apoya una actividad citotóxica dirigida por antígeno frente a las células tumorales.
Finalmente, alrededor del 50 % de los ratones inoculados con MCA205 GI y tratados posteriormente con IP2 como se ha descrito anteriormente estaban desprovistos de tumor después del tratamiento. 100 días después de la primera inoculación de tumor, estos ratones se volvieron a pulsar con células tumorales MCA205 GI en el flanco derecho y con células B16F10 en el flanco izquierdo. Mientras que los tumores de B16F10 crecieron con el tiempo, MCA205 GI no creció en los ratones (Figura 13D). Estos resultados demuestran que los ratones desarrollaron una respuesta antitumoral duradera específica del tumor MCA205 GI después del tratamiento con IP2.
El tratamiento con IP2 (IP2-4Na) reduce el crecimiento tumoral de tumor establecido
Con el fin de evaluar la eficacia específica de IP2 en la modulación del crecimiento tumoral mediante el aumento de la proliferación de células T CD8+ antitumorales específicas, los inventores ensayaron el impacto de IP2 sobre el tumor establecido in vivo. Las células tumorales de sarcoma MCA205 (15.105) que expresan establemente la construcción Globina-intrón-SL8 se inyectaron subcutáneamente y se dejó que progresaran 10 días antes de ser clasificadas y asignadas a grupos de carga tumoral equivalente, dando lugar a la formación de tres grupos de tamaños tumorales de 40, 50 y 100 mm2 antes del inicio del tratamiento con IP2. Entonces, cada 3 a 4 días, cada grupo de ratones se trató intraperitonealmente respectivamente con 24mg/kg de IP2. A esta dosis, se observó una disminución importante del crecimiento tumoral de MCA205 GI después del tratamiento con IP2 en comparación con los ratones no tratados (Figura 14) independientemente del grupo ensayado. Incluso cuando los tumores habían alcanzado un tamaño de 100 mm2 (círculo), 5 dosis de 24 mg/kg de IP2 fueron capaces de inducir una regresión tumoral significativa con un incremento de la supervivencia de alrededor de 30 días (círculo gris) en comparación con los ratones no tratados (círculos negros).
En conclusión, todos estos experimentos usando IP2 como inmunomoduladores muestran que esta molécula es eficiente para inducir un rechazo tumoral completo cuando los ratones se tratan muy pronto (justo cuando el tumor es palpable) mediante la inducción de una respuesta antitumoral a largo plazo, y muestran que el tratamiento con IP2 también puede reducir el crecimiento tumoral en tumor establecido.
Globalmente, estos resultados arrojan luz sobre la capacidad de inhibidores específicos del corte y empalme, tales como isoginkgetina e IP2, para modular positivamente la respuesta inmune antitumoral. Además, confirman que los antígenos derivados de los PTP son presentados y reconocidos eficientemente por las células T CD8+ in vitro e in vivo y que un cambio en su presentación en la superficie celular en cantidad o en calidad puede dar lugar a una respuesta de células T CD8+ frente al cáncer.
REFERENCIAS
- Apcher, S. et al. Major source of antigenic peptides for the MHC class I pathway is produced during the pioneer round of mRNA translation. Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A. 108, 11572-7 (2011).
- Burg, S. H. et al. Vaccines for established cancer: overcoming the challenges posed by immune evasion. Nat. PubL. Gr. 16, 219-233 (2016).
- Caron, E. et al. The MHC I immunopeptidome conveys to the cell surface an integrative view of cellular regulation. Mol Syst Biol. 7 , 533 (2011).
- Dolan, B. P. et al. Distinct pathways generate peptides from defective ribosomal products for CD8+ T cell immunosurveillance. J. Immunol. 186, 2065-72 (2011).
- Doherty, S. J. et al. Immunoproteasome Subunit Deficiencies Impact Differentially on Two Immunodominant Influenza Virus-Specific CD8+ T Cell Responses. J Immunol Ref. 177, 7680-7688 (2006).
- Duvallet, E., et al. Exosome-driven transfer of tumor-associated Pioneer Translation Products (TA PTPs) for the MHC class I cross-presentation pathway. Oncoimmunology 5 , e1198865 (2016).
- Kang SS, et al. Flavonoids from the leaves of Ginkgo biloba, Korea. J Pharmacogn. 1990;21:111-20
- Kmieciak, M., et al. HER-2/neu antigen loss and relapse of mammary carcinoma are actively induced by T cellmediated anti-tumor immune responses. Eur. J. Immunol. 37, 675-685 (2007).
- Lee, S.J., et al. Suppression of mouse lymphocyte proliferation in vitro by naturally-occurring bioflavonoids. Life Sc.
57, 551-558 (1995).
- Lee, S. y Sin, J. MC32 tumor cells acquire Ag-specific CTL resistance through the loss of CEA in a colon cancer model. Hum Vaccin Immunother 11, 2012-2020 (2015).
- Leone, P. et al. MHC class I antigen processing and presenting machinery: organization, function, and defects in tumor cells. J. Nat. CancerInst. 105, 1172-87 (2013).
- Liu, Y. et al. Expression of antigen processing and presenting molecules in brain metastasis of breast cancer. Cancer Immunol. Immunother. 61, 789-801 (2012).
- Mellman, I., et al. Cancer immunotherapy comes of age. Nature 480, 480-489 (2014).
- Watson, N. F. S. et al. Immunosurveillance is active in colorectal cancer as downregulation but not complete loss of MHC class I expression correlates with a poor prognosis. Int. J. Cancer 118, 6-10 (2006).
- Yewdell, JW., et al. Defective ribosomal products (DRiPs): a major source of antigenic peptides for MHC class I molecules? J Immunol 157(5):1823-6 (1996).

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto de fórmula
Figure imgf000025_0001
para su uso como un medicamento.
2. El compuesto para su uso según la reivindicación 1 en donde el uso es en el tratamiento del cáncer, en la prevención de las metástasis del cáncer y/o en la prevención de la recurrencia del cáncer en un sujeto.
3. El compuesto para su uso según la reivindicación 2 en combinación con al menos un agente anticanceroso distinto y/o con radioterapia.
4. El compuesto para su uso según la reivindicación 2 o 3, en donde el cáncer se selecciona de un carcinoma, sarcoma, linfoma, tumor de células germinales, blastoma, leucemia y mieloma múltiple.
5. El compuesto para su uso según la reivindicación 4, en donde el carcinoma es un melanoma, un cáncer de pulmón o un cáncer de mama.
6. El compuesto para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en donde el al menos un agente anticanceroso distinto se selecciona de un agente quimioterapéutico, un bloqueante de punto de control inmune y una vacuna anticancerosa.
7. El compuesto para su uso según la reivindicación 1, para su uso para estimular una respuesta inmune anticancerosa en un sujeto que lo necesita.
8. Una composición que comprende un compuesto de fórmula
Figure imgf000025_0002
Figure imgf000026_0001
y un vehículo farmacéuticamente aceptable, preferiblemente junto con al menos un agente anticanceroso distinto para ser usado simultáneamente, separadamente o secuencialmente.
9. La composición según la reivindicación 8 para su uso en el tratamiento del cáncer, en la prevención de las metástasis del cáncer y/o en la prevención de la recurrencia del cáncer en un sujeto.
10. Uso in vitro o ex vivo de un compuesto de fórmula
Figure imgf000026_0002
para inducir o incrementar la presentación, típicamente la producción y presentación, de antígenos derivados de Productos de la T raducción Pionera (PTP) por células cancerosas.
11. El compuesto para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, la composición según la reivindicación 8 o la composición para su uso según la reivindicación 9, en donde el sujeto es un mamífero, preferiblemente un ser humano.
12. Un kit que comprende un compuesto de fórmula
Figure imgf000027_0001
y al menos un agente anticanceroso distinto en contenedores distintos.
13. Uso de un kit según la reivindicación 12 para preparar una composición según la reivindicación 8.
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