KR20190138840A - 암 치료를 위한 화합물, 조성물 및 이것의 용도 - Google Patents

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마띨드 불피캉뜨
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무아드 알라미
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Abstract

본 발명은 약물 및 암 치료 분야에 관한 것이다. 본 발명은 더욱 구체적으로, 전형적으로 약물로 사용하기 위한 신규 화합물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 대상체에서 암 세포에 의한 선구 번역 생성물 (PTP)-유래 항원의 제시, 전형적으로는 생성 및 제시를 증가시키기 위한 그리고 대상체에서 면역 반응을 유도하거나 자극하기 위한 이러한 신규 화합물의 용도에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한, 특히 약제 조성물을 제조하기 위한, 및/또는 암 치료가 필요한 대상체에서 암 치료 효율을 허용하거나 증가시키기 위한 그와 같은 화합물의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 대상체에서 암, 암 전이 및/또는 암 재발을 예방하거나 치료하는 방법을 개시한다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 조성물을 제조하고/하거나 본 명세서에 기재된 방법을 수행하기에 적합한 키트를 제공한다.

Description

암 치료를 위한 화합물, 조성물 및 이것의 용도
본 개시내용은 일반적으로 약물 및 암 치료 분야에 관한 것이다. 본 발명은 더욱 구체적으로 이소진게틴(isoginkgetin)의 유도체이며 각각이 전형적으로 약물로서 사용하기 위한 신규 화합물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 대상체에서 암 세포에 의한 (항원성) 펩티드, 바람직하게는 선구 번역 생성물(Pioneer Translation Products: PTP)-유래 항원의 제시, 전형적으로는 생성 및 제시를 증가시키기 위한, 그리고 대상체에서 면역 반응을 유도하거나 자극하기 위한 이러한 신규 화합물의 용도에 관한 것이다. 면역 반응은 전형적으로 종양 항원을 향하며, 더욱 일반적으로는 대상체가 앓고 있는 암성 종양을 향한다.
본 개시내용은 또한, 특히 약제 조성물을 제조하고/하거나 암 치료가 필요한 대상체에서 암 치료의 효율을 허용하거나 개선시키는 그와 같은 화합물의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 화합물의 각각은 대상체에서 암을 치료하기 위해, 암 전이를 예방하기 위해 및/또는 암 재발을 예방하기 위해 적어도 하나의 별개의 (distinct) 항암제, 전형적으로 화학요법 약물과 함께, 및/또는 방사선치료와 함께 실제로 유리하게 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 대상체에서 암, 암 전이 및/또는 암 재발을 예방하거나 치료하는 방법을 개시한다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 조성물을 제조하기에 및/또는 본 명세서에 기재된 방법을 수행하기에 적합한 키트를 제공한다.
모든 유핵 세포는 부류 I의 주 조직적합성 복합체 (MHC-I) 경로를 통하여 그 표면에 항원성 펩티드 (AP)를 제시한다. AP는 8 내지 10개의 아미노산 길이로 되어 있고 고유 세포 활동을 나타낸다 (Caron et al.). 이들의 제시가 면역 세포, 주로 세포독성 CD8+ T 세포 (CTL) 및 CD4+ T 헬퍼 세포에 의한 잠재적으로 위험한 요소의 감시를 안내하기 때문에, AP는 현재 개발된 치료용 항암 백신의 표적이다. 유망성에도 불구하고, 종양-관련된 항원 (TAA)을 표적화하는 치료용 백신을 사용한 임상 시험 결과는 그 기대를 충족하지 못하였다. 주요 실패는 면역억제 메커니즘과, 그리고 항원의 차선(suboptimal) 선택과 관련되었다 (Mellman et al.; Burg et al.). 종양 면역선택을 유도하고 좋지않은 예후와 상호 관련되는 중요한 사건 중 하나는, 종양 세포에 의한 MHC 부류 I 항원 제시의 손실 또는 하향조절이다 (Watson et al.; Liu et al.). 이 마지막 것은 MHC 부류 I 경로의 성분에서의 결함 때문에 CTL 및 자연 살해 세포 인식을 벗어날 수 있다 (Leone et al.). MHC 부류 I 항원 제시의 전반적인 감소와 함께, MHCI 부류 I 면역펩티돔 (MIP)으로 불리는, 세포 표면에 존재하는 항원의 성질은 면역 인식에 매우 중요하다. 특정 TAA가 확인되고 면역치료제, 예컨대 유방암에서 Her/neu 또는 결장암에서 CEA로 표적화되는 암에서, 종양 세포 표면에서 이 TAA 발현의 손실은 면역 회피를 일으킨다 (Lee et al.; Kmieciak et al.). 이를 막기 위해, 현재의 전략들은 표적화된 암 펩티드의 범위를 확대시키고 MHC 항원 제시를 회복시키는 것을 목표로 한다.
MIP의 역학을 이해하기 위해, MHC 부류 I 제시 경로에 대한 AP의 원천(source)에 주목할 수 있었다. 내인성 AP는 엄밀하게는 노화 단백질의 분해로부터 비롯되는 것으로 처음에는 생각되었다. 그러나, 대안적인 원천을 제안하는 모델은 이 생각에 도전하였다. 1996년에, J. Yewdell의 그룹은 불안정한 형태 때문에 초기에 신속하게 분해된 생성물로 설명된 결손 리보솜 생성물(Defective ribosomal products: DRIP)의 개념을 도입한다 (Yewdell et al, 1996). 더욱 최근에 발명자들은, 상이한 관점으로부터의 개념이, AP의 주요 원천이, 인트론이 스플라이싱되기 전에 일어나며 전장 단백질의 번역 사건과는 독립적인 선구 번역으로부터 유래함을 보여줌을 조사하였다 (Apcher et al., 2011). 따라서 생성된 비-표준(non-canonical) 펩티드는 인트론 서열 3' 또는 5' UTR 영역 뿐만 아니라 대안적인 리딩 프레임(reading frame)으로부터 유래할 수 있다. 이러한 폴리펩티드는 선구 번역 생성물 (PTP)로 기재된다. PTP의 발견은, MHC 부류 I 경로에 대하여 관련되고 적합한 폴리펩티드를 생성시킴으로써 MIP를 형상화시키는 것을 부분적으로 목표로 하는 복잡한 번역 핵 메커니즘의 존재를 제안한다. 또한, PTP는 암 발달의 역학에서 역할을 담당하는 것으로 보인다. 마우스에 접종한 경우, 표면에 PTP-유래 항원을 제시하는 암 세포가 특정 T-세포에 의해 인식되어 종양 성장 감소를 일으킬 수 있음이 입증되었다. 또한, 모델 에피토프를 함유하는 정제된 PTP는 마우스에서 펩티드 백신으로 주입된 경우에 항암 면역 반응을 효율적으로 촉진시킨다 (Duvallet et al.).
전구체-mRNA (pre-mRNA) 스플라이싱은 핵에서 200개 초과 단백질과의 복합체인 5개의 작은 핵 RNA (snRNA) U1, U2, U4, U5 및 U6으로 구성된 보존적이며 동적인 다중-단백질 복합체인 스플라이시오좀(spliceosome)에 의해 촉매화된다. 점점 더 많은 연구는 스플라이시오좀 복합체의 통제해제(deregulation)가 많은 암에서 비정상적인 스플라이싱 패턴을 수반하며 이는 비정상적인 종양 세포 증식 및 진행에 기여함을 보고한다. 2011년 이후, 재발성 스플라이시오좀 돌연변이가 골수단핵구 백혈병, 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 유방암 또는 다발성 골수종을 포함하는 몇몇의 암에서 보고되었다.
본 발명자들은 대상체에서 암의 치료에, 암 전이의 예방에 및/또는 암 재발의 예방에 사용하기 위한 신규 화합물을 본 명세서에서 지금 설명한다.
본 발명자들은 약물로서 사용하기 위해 하기 식 (I)의 화합물을 최초로 생성하였고 이것을 본 명세서에 기재한다:
Figure pct00001
상기 식에서, R1 및 R2는 독립적으로 Na, H, -CH3, -CH2-CH3, -CH2-CH=CH3, n-CH2-CH2-CH3, P(O)(O-CH2-CH3)2, P(O)(OH)2 또는 P(O)(ONa)2의 그룹으로부터 선택되고, R1, R2, R3, R4 및 R5는 동시에 H가 아니며, R2가 P(O)(ONa)2 또는 P(O)(OH)2이고 R3, R4 및 R5의 각각이 H이면 R1은 -CH3이 아니고, R2가 -CH3이고 R3, R4 및 R5의 각각이 H이면 R1은 -CH3 또는 H가 아니고;
R3, R4 및 R5는 독립적으로 H, CH3, -CH2-CH3, -CH2-CH=CH3, 및 CnH2n +1 (이 때 n=3-10)의 그룹으로부터 선택된다.
이 화합물 및 이것의 입체이성질체 또는 이것의 약제학적으로 허용되는 염이 약물로 유리하게 사용될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 R1이 Na이고 R2가 P(O)(ONa)2이며 R3, R4 및 R5의 각각이 H인 식 (I)의 특정 화합물 (또한 본 명세서에서 일반적으로 "IP2" 또는 더욱 구체적으로는 "IP2-6Na"로 확인됨)에 관한 것이다:
Figure pct00002
.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 R1이 H이고 R2가 P(O)(ONa)2이며 R3, R4 및 R5의 각각이 H인 식 (I)의 특정 화합물 (또한 본 명세서에서 일반적으로 "IP2"로 또는 더욱 구체적으로 "IP2-4Na"로 확인됨)에 관한 것이다:
Figure pct00003
.
본 명세서에 기재된 바람직한 측면에서, 식 (I)의 화합물, 바람직하게는 "IP2" 화합물 (IP2-6Na 또는 IP2-4Na), 또는 이것의 입체이성질체 또는 약제학적으로 허용되는 염은 대상체에서 암의 치료에 사용하기 위한, 암 전이의 예방에 사용하기 위한 및/또는 암 재발의 예방에 사용하기 위한 것이다.
암 세포에 의한 (항원성) 펩티드, 바람직하게는 선구 번역 생성물 (PTP)-유래 항원의 제시, 전형적으로는 생성 및 제시를 유도하거나 증가시키기 위한 식 (I)의 화합물, 바람직하게는 "IP2" 화합물 (IP2-6Na 또는 IP2-4Na)의 생체 내에서, 시험관 내에서 또는 생체 외에서의 용도가 추가로 기재된다.
식 (I)의 화합물, 바람직하게는 "IP2" 화합물 (IP2-6Na 또는 IP2-4Na)은 대상체의 면역계를 자극함으로써 의사가 암 세포 증식을 예방 또는 조절, 바람직하게는 감소시킬 수 있게 한다. 이것은 또한 다른 암 치료의 유효성을 유리하게 증가시킬 수 있다. 본 발명자들은 본 명세서에서 이 화합물이 또한 전이 및/또는 암 재발의 위험을 감소시킬 수 있음을 입증한다.
바람직하게는 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 사용될 적어도 하나의 별개의 항암제와 함께 그와 같은 식 (I)의 화합물, 바람직하게는 "IP2" 화합물 (IP2-6Na 또는 IP2-4Na), 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물이 또한 본 명세서에 기재된다. 그와 같은 조성물은 대상체에서 암을 치료하기 위한, 암 전이를 예방하기 위한 및/또는 암 재발을 예방하기 위한 용도를 위한 것이다.
화합물, 전형적으로 식 (I)의 화합물, 바람직하게는 "IP2" 화합물 (IP2-6Na 또는 IP2-4Na), 또는 본 명세서에 기재된 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하여, 대상체에서 암을 치료하는 방법이 또한 본 명세서에 기재된다.
식 (I)의 화합물, 바람직하게는 "IP2" 화합물 (IP2-6Na 또는 IP2-4Na), 및 바람직하게는 적어도 하나의 별개의 항암제를 별개의 용기에 포함하는 키트, 및 특히 본 명세서에 기재된 조성물을 제조하기 위한 이것의 용도가 또한 기재된다.
본 발명자들은 본 발명의 맥락에서 최초로 설명되고 "식 (I)의 화합물"로 확인되는 비플라보노이드 이소진게틴 유도체를 생성시켰다:
Figure pct00004
상기 식에서, R1 및 R2는 독립적으로 Na, H, -CH3, -CH2-CH3, -CH2-CH=CH3, n-CH2-CH2-CH3, P(O)(O-CH2-CH3)2, P(O)(OH)2 또는 P(O)(ONa)2의 그룹으로부터 선택되고, R1, R2, R3, R4 및 R5는 동시에 H가 아니며, R2가 P(O)(ONa)2 또는 P(O)(OH)2이고 R3, R4 및 R5의 각각이 H이면 R1은 -CH3이 아니고, R2가 -CH3이고 R3, R4 및 R5의 각각이 H이면 R1은 -CH3 또는 H가 아니고;
R3, R4 및 R5는 독립적으로 H, CH3, -CH2-CH3, -CH2-CH=CH3, 및 CnH2n +1 (이 때 n=3-10, 바람직하게는 n=3-8)의 그룹으로부터 선택된다.
"하이드록시메틸"은 Me가 메틸 (-CH3)을 나타내는 식 -OMe의 라디칼을 지칭한다. "수산화나트륨"은 Na가 나트륨을 나타내는 식 -ONa의 라디칼을 지칭한다. n=3-10인 CnH2n+1 기는 포화, 선형 또는 분지형 지방족 기인 "알킬" 기를 지칭한다. 이것은 예를 들어, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, tert-부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐 또는 데실 기를 포함한다. 바람직하게는, n은 3-8 또는 3-6이다.
R1이 Na이고 R2가 P(O)(ONa)2이며 R3, R4 및 R5의 각각이 H인 특정한 식 (I)의 화합물이 또한 본 명세서에서는 "IP2" 분자로 또는 더욱 구체적으로는 "IP2-6Na"로, 또는 나트륨 8-(2-메톡시-5-(5-옥시도-4-옥소-7-(포스포나토옥시)-4H-크로멘-2-일)페닐)-2-(4-메톡시페닐)-5-옥시도-4-옥소-4H-크로멘-7-일 포스페이트로 일반적으로 확인된다:
Figure pct00005
.
R1이 H이고 R2가 P(O)(ONa)2이며 R3, R4 및 R5의 각각이 H인 또 다른 특정한 식 (I)의 화합물이 또한 본 명세서에서는 "IP2" 분자로 또는 더욱 구체적으로는 "IP2-4Na"로 또는 나트륨 5-하이드록시-8-(5-(5-하이드록시-4-옥소-7-(포스포나토옥시)-4H-크로멘-2-일)-2-메톡시페닐)-2-(4-메톡시페닐)-4-옥소-4H-크로멘-7-일 포스페이트로 일반적으로 확인된다:
Figure pct00006
.
식 (I)의 화합물, 바람직하게는 "IP2" 화합물 (IP2-6Na 또는 IP2-4Na) 및 이것의 입체이성질체 또는 이것의 약제학적으로 허용되는 염은 약물로 유리하게 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는"은, 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 대상체의 조직과 접촉시키기에 적합하거나, 합리적인 유익/위해 비(benefit/risk ratio)에 상응하는 과도한 독성 또는 다른 합병증 없이 대상체에게 투여될 수 있는 조성물, 화합물, 염 등을 지칭한다. 예를 들어, 약제학적으로 허용되는 염은 나트륨, 칼륨, 염화물, 암모늄, 아세테이트 염 등을 포함한다.
본 발명자들은 본 명세서에서 식 (I)의 화합물, 바람직하게는 "IP2" 화합물 (IP2-6Na 또는 IP2-4Na)이 암에 대한 양성 면역조절제로 유리하게 사용될 수 있음을 입증한다. 본 발명자들은 인간 및 마우스 암 세포주에서 발현된 PTP-유래 항원 모델의 항원 제시를 조사하였고, 이소진게틴 및 더욱 바람직하게는 IP2를 사용한 이들의 시험관 내에서의 처리가 이 항원의 제시를 증가시킴을 관찰하였다. 또한, 본 발명자들은 육종 함유 마우스의 DMSO에 용해시킨 이소진게틴을 사용한 생체 내에서의 처리가 면역 의존적인 방식으로 종양 성장을 늦춤을 입증하였다. 그 효과를 개선시키기 위해, 본 발명자들은 물에 가용성인 이소진게틴 유도체 IP2를 시험하였고 놀랍게도 이것이 이소진게틴 자체보다 훨씬 더 효능있는 암 성장 억제제임을 관찰하였다. 면역결핍 Nu/Nu 마우스에서는 천연 생성물 및 유도체가 종양 성장에 대해서는 효과가 없기 때문에, 본 발명자들은 그 효과가 면역 반응에 의존적임을 결론내렸다. 그러한 결과는 PTP-유래 항원 제시가 조절될 수 있음을 입증하고, 본 발명자들이 시장 개발을 위한 신규 유망 분자: 이소진게틴의 다른 유도체와는 반대로 항암 반응을 촉진시키고 암을 치료하는데 사용될 수 있는 IP2 스플라이싱 억제제 또는 식 (I)의 화합물을 제공한다.
본 명세서에 기재된 바람직한 측면에서, 식 (I)의 화합물, 바람직하게는 "IP2" 화합물 (IP2-6Na 또는 IP2-4Na)은 대상체에서 암 치료에 사용하기 위한, 암 전이의 예방에 사용하기 위한 및/또는 암 재발의 예방에 사용하기 위한 것이다.
본 명세서에 기재된 또 다른 바람직한 측면에서, 식 (I)의 화합물, 바람직하게는 "IP2" 화합물 (IP2-6Na 또는 IP2-4Na)은 항암 면역 반응 자극이 필요한 대상체에서 항암 면역 반응을 자극하기 위해 사용하기 위한 것이다.
추가의 바람직한 측면에서, 식 (I)의 화합물, 바람직하게는 "IP2" 화합물 (IP2-6Na 또는 IP2-4Na)은 암 세포에 의한 선구 번역 생성물 (PTP)-유래 항원의 제시, 전형적으로는 생성 및 제시를 유도하거나 증가시키기 위해 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 화합물은 당업자에게 잘 알려진 방법, 예컨대 반-합성 또는 전체 합성에 의해 얻어질 수 있다. 식 (I)의 화합물의 생성 방법의 예가 본 명세서에서 실험 부분에 기재되어 있고, 도 5에 추가로 예시되어 있다 (도 5에서 식 (I)의 화합물은 화합물 "2" 및 "2'"에 상응하고, 이것은 일반적으로 본 명세서에서 "IP2"로 확인된다). 식 (I)의 화합물은 그 자체로 자연적으로 발견될 수 없는 인공 생성물이다.
식 (I)의 화합물은 mRNA 스플라이싱의 일반적인 억제제로 설명되었고 은행나무(maidenhair tree), Ginko biloba L.의 잎으로부터 전형적으로 추출되는 비플라보노이드 이소진게틴으로부터 전형적으로 제조될 수 있다. 이소진게틴을 추출하는 방법은 다른 것들 중에서 문헌 [Kang et al (1990) 및 Lee et al (1995)]에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 개시내용은 본 명세서에 참조로 편입된다.
식 (I)의 화합물은 또한 통상의 화학 반응을 사용함으로써 화학적인 합성에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 추가 대상은 별개의 항암제, 전형적으로는 별개의 화학요법제에 대한 암 또는 암을 앓고 있는 대상체의 내성을 감소시키기 위한 식 (I)의 화합물, 바람직하게는 "IP2" 화합물 (IP2-6Na 또는 IP2-4Na), (또는 이것의 입체이성질체 또는 약제학적으로 허용되는 염)의 용도이다.
본 발명에 따른 식 (I)의 화합물, 바람직하게는 "IP2" 화합물 (IP2-6Na 또는 IP2-4Na) (또는 이것의 입체이성질체 또는 약제학적으로 허용되는 염), 또는 대상체에서 암을 치료하기 위해, 암 전이를 예방하기 위해 및/또는 암 재발을 예방하기 위해 적어도 하나의 별개의 항암제, 전형적으로 별개의 화학요법 약물과 함께, 및/또는 방사선치료와 함께 사용하기 위한 그와 같은 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물이 또한 본 명세서에 기재된다.
용어 "대상체"는 임의의 대상체, 바람직하게는 포유동물을 지칭한다.
포유동물의 예는 인간 및 비-인간 동물, 예컨대, 제한없이 가축 (예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 비-인간 영장류 (예컨대 원숭이), 토끼, 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 랫트)를 포함한다. 치료는 바람직하게는 연령 또는 성별과는 상관없이 치료를 필요로 하는 인간에 대하여 의도된다.
용어 "대상체"는 전형적으로 환자, 특히 종양을 지닌 환자를 지칭한다. 본 개시내용에서 달리 특정되지 않는 한, 종양은 암성 또는 악성 종양이다. 특정 측면에서, 대상체는 암 치료, 예컨대 화학요법 및/또는 방사선치료 중인 대상체, 또는 암 발병 위험에 있거나 위험에 있는 것으로 의심된 대상체이다.
대상체는 예를 들어, 암을 앓고 있고 암 치료에, 전형적으로는 화학요법에 내성이 있는 인간이다.
대상체는 완전한 통상의 치료 프로토콜의 일부에, 예를 들어, 적어도 한 주기의 모든 치료 프로토콜에, 예를 들어, 2 주기의 모든 치료 프로토콜에 노출되었을 수 있다.
암 또는 종양은 임의 종류의 암 또는 신생물일 수 있다. 종양은 전형적으로 특히 상피, 신경외배엽 또는 중간엽 기원의 고형 종양이다. 암은 또한 전형적으로 암종, 육종, 림프종, 생식 세포 종양, 모세포종, 백혈병 및 다발성 골수종으로부터, 바람직하게는 암종, 육종, 모세포종, 림프종, 백혈병 및 다발성 골수종으로부터 선택된다. 암은 전이성 암일 수 있거나 아닐 수 있다.
암은 예를 들어, 제한없이 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구 백혈병, 필라델피아 염색체 양성 급성 림프모구 백혈병 (Ph+ ALL), 호지킨 병, 호지킨 또는 비-호지킨 림프종, 편평 세포 암종, 소 세포 폐암, 비-소 세포 폐암, 신경교종, 위장암, 신장암, 난소암, 간암, 결장직장암, 자궁내막암, 신장암, 전립선암, 갑상선암, 신경모세포종, 뇌암, 중추신경계 암, 췌장암, 다형성 아교모세포종, 자궁경부암, 위암, 방광암, 악성 간암, 유방암, 결장 암종, 두경부암, 위암, 생식 세포 종양, 소아 육종, 횡문근육종, 유잉 육종, 골육종, 연조직 육종, 비부비동(sinonasal) NK/T-세포 림프종, 골수종, 흑색종, 다발성 골수종, 급성 골수성 백혈병 (AML), 및 만성 림프구성 백혈병으로 이루어지는 그룹으로부터 선택될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 암은 폐암, 유방암, 비뇨-생식암 (예컨대 전립선암, 방광암, 고환암, 자궁경부암 또는 난소암) 및 육종 (소아 연 조직 육종, 신경모세포종, 골수종 및 흑색종을 포함하는, 예컨대 골육종 또는 연조직 육종)으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된다.
더욱 바람직하게는, 암은 흑색종, 폐암 (비-소 세포 폐 암종 (또는 NSCLC) 및 소 세포 폐 암종 (또는 SCLC)) 및 유방암으로부터 선택된다.
훨씬 더 바람직하게는, 암종은 흑색종 또는 폐암이다.
한 측면에서, 암은 폐암, 전형적으로 소 세포 폐암 또는 비-소 세포 폐암이다.
또 다른 측면에서, 암은 백혈병, 전형적으로는 급성 골수성 백혈병 (AML) 또는 만성 림프구성 백혈병이다.
추가 측면에서, 암은 결장암, 전형적으로 결장 암종이다. 암은 또한 결장직장암일 수 있다.
추가 측면에서, 암은 소아 암, 전형적으로 소아 육종, 림프종, 백혈병, 신경모세포종, 뇌암, 또는 중추 신경계 암이다.
본 명세서에 기재된 특정 측면에서, 항암제는 화학요법제, 면역 관문 차단제 및 항암 백신 (또한 본 명세서에서는 "암 백신"으로 확인됨)으로부터 선택된다. 이러한 제제는 전형적으로 암을 치료하기 위한 "통상의" 제제로 간주된다.
화학요법제는 전형적으로 예를 들어, 항종양/세포독성 항생제, 알킬화제, 항대사물질, 국소이성화효소 억제제, 유사분열 억제제, 플라틴 기반 성분, 특정 키나아제 억제제, 호르몬, 사이토킨, 항혈관형성제, 항체, DNA 메틸트랜스퍼라아제 억제제 및 혈관 파괴제로부터 선택된 제제이다.
항종양제 또는 세포독성 항생제는 예를 들어, 안트라사이클린 (예를 들어, 독소루비신, 다우노루비신, 아드리아마이신, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 발루비신), 액티노마이신, 블레오마이신, 미토마이신 C, 플리카마이신 및 하이드록시우레아로부터 선택될 수 있다.
알킬화제는 예를 들어, 메클로레타민, 사이클로포스파미드, 멜팔란, 클로람부실, 이포스파미드, 테모졸로마이드 부설판, N-니트로소-N-메틸우레아 (MNU), 카머스틴 (BCNU), 로머스틴 (CCNU), 세머스틴 (MeCCNU), 포테머스틴, 스트렙토조토신, 다카바진, 미토졸로마이드, 티오테파, 미토마이신, 디아지쿠온 (AZQ), 프로카바진, 헥사메틸멜라민 및 우라머스틴으로부터 선택될 수 있다.
항대사물질은 예를 들어, 피리미딘 유사체 (예를 들어, 플루오로피리미딘 유사체, 5-플루오로우라실 (5-FU), 플록스우리딘 (FUDR), 시토신 아라비노사이드 (시타라빈), 겜시타빈 (겜자르®), 카페시타빈); 퓨린 유사체 (예를 들어, 아자티오프린, 머캅토퓨린, 티오구아닌, 플루다라빈, 펜토스타틴, 클라드리빈, 클로파라빈); 엽산 유사체 (예를 들어, 메토트렉세이트, 엽산, 페메트렉세드, 아미노프테린, 랄티트렉세드, 트리메토프림, 피리메타민)로부터 선택될 수 있다.
국소이성화효소 억제제는 예를 들어, 캄프토테신, 이리노테칸, 토포테탄, 암사크린, 에토포사이드, 에토포사이드 포스페이트 및 테니포사이드로부터 선택될 수 있다.
유사분열 억제제는 예를 들어, 탁산 [파클리탁셀 (PG-파클리탁셀 및 DHA-파클리탁셀) (탁솔 ®), 도세탁셀 (탁소테레 ®), 라로탁셀, 카바지탁셀, 오르타탁셀, 테세탁셀, 또는 탁소프렉신]; 방추체 독 또는 빈카 알칼로이드 (예를 들어, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 빈데신 또는 빈플루닌); 메벤다졸; 및 콜히친으로부터 선택될 수 있다.
플라틴 기반 성분은 예를 들어, 백금, 시스플라틴, 카보플라틴, 네다플라틴, 옥살리플라틴, 사트라플라틴 및 트리플라틴 테트라니트레이트로부터 선택될 수 있다.
특정 키나아제 억제제는 예를 들어, BRAF 키나아제 억제제, 예컨대 베무라페닙; MAPK 억제제 (예컨대 다브라페닙); MEK 억제제 (예컨대 트라메티닙); 및 티로신 키나아제 억제제, 예컨대 이마티닙, 게피티닙, 에를로티닙, 서니티닙 또는 카보잔티닙으로부터 선택될 수 있다.
타목시펜, 항아로마타아제, 또는 항에스트로겐 약물이 또한 호르몬요법의 맥락에서 전형적으로 사용될 수 있다.
면역요법의 맥락에서 사용가능한 사이토킨은 예를 들어, IL-2 (인터류킨-2), IL-11 (인터류킨-11), IFN (인터페론) 알파 (IFNa), 및 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)로부터 선택될 수 있다.
항혈관형성제는 예를 들어, 베바시주마브, 소라페닙, 서니티닙, 파조파닙 및 에베롤리머스로부터 선택될 수 있다.
항체, 특히 단일클론 항체 (mAb)는 항-CD20 항체 (항-pan B-세포 항원), 항-Her2/Neu (인간 표피 성장 인자 수용체-2/NEU) 항체; 암 세포 표면 표적화 항체 (예컨대, 리툭시마브 및 알렘투주마브); 성장 인자 표적화 항체 (예컨대, 베바시주마브, 세툭시마브, 파니투무마브 및 트라스투주마브); 효능성 항체 (예컨대 항-ICOS mAb, 항-OX40 mAb, 항-41BB mAb); 및 면역접합체 (예컨대 90Y-이브리투모마브 티욱세탄, 131I-토시투모마브, 또는 아도-트라스투주마브 엠탄신)로부터 선택될 수 있다.
DNA 메틸트랜스퍼라아제 억제제는 예를 들어, 2'-데옥시-5-아자시티딘 (DAC), 5-아자시티딘, 5-아자-2'-데옥시시티딘, 1-[beta]-D-아라비노푸라노실-5-아자시토신 및 디하이드로-5-아자시티딘으로부터 선택될 수 있다.
혈관 파괴제는 예를 들어, 플라본 아세트산 유도체, 5,6-디메틸산테논-4-아세트산 (DMXAA) 및 플라본 아세트산 (FAA)으로부터 선택될 수 있다.
다른 화학요법 약물은 프로테아좀 억제제 (예컨대, 보르테조밉), DNA 가닥 파괴 화합물 (예컨대, 티라파자민), 티오레독신 환원효소 및 리보누클레오타이드 환원효소 (예컨대, 크시트린) 둘 모두의 억제제, 및 Thl 면역 반응의 증강인자 (예컨대, 티말파신)를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 화학요법 약물 또는 제제는 항종양/세포독성 항생제, 알킬화제, 항대사물질, 국소이성화효소 억제제, 유사분열 억제제, 플라틴 기반 성분, 특정 키나아제 억제제, 항혈관형성제, 항체 및 DNA 메틸트랜스퍼라아제 억제제로부터 선택된다.
면역 관문 차단제는 전형적으로 면역 관문을 표적화하는 항체이다. 그와 같은 면역 관문 차단제는 유리하게는 항-CTLA4 (이필리무마브 및 트레멜리무마브), 항-PD-1 (니볼루마브 및 펨브롤리주마브), 항-PD-L1 (아테졸리주마브, 더발루마브, 및 아벨루마브), 항-PD-L2 및 항-Tim3으로부터 선택될 수 있다.
암 백신은 예를 들어, (항원성) 펩티드, 특히 PTP를 포함하는 백신 조성물; 인간 유두종바이러스 (HPV) 백신 (예컨대, 가다실®, 가다실9®, 및 서바릭스®); 전립선 산 포스파타아제 (PAP)에 대한 면역 반응을 자극하는 백신 시풀루셀-T (프로벤지®); 종양용해성 바이러스; 및 탈리모겐 라헤르파렙벡 (T-VEC 또는 임리직®)으로부터 선택될 수 있다.
또 다른 특정 측면에서, ("통상의") 암 치료는 방사선조사 (또한 본 명세서에서는 "방사선치료"로 확인됨)이다. 방사선치료는 전형적으로 X-선 ("XR"), 감마 선 및/또는 UVC 선으로부터 선택된 선을 포함한다.
몇몇 항암제를 포함할 수 있는 치료는 예방하거나 치료하고자 하는 특정 암에 따라 암 전문가에 의해 선택된다.
특정 흑색종은 이필리무마브, 니볼루마브, 펨브롤리주마브, IFNα, 다카바진, BRAF 억제제, 다브라페닙, 트라메티닙, 소라페닙, 테모졸로마이드, 전기화학요법, TNF알파 및/또는 포테머스틴으로 통상적으로 처리된 흑색종이다.
특정 구현예에서, 흑색종은 전술된 세포독성의 통상의 치료에 대하여 내성이 있는 흑색종이다.
특정 유방암은 유방 종양을 제거하는 수술 단계 전 또는 후에, 바람직하게는 그와 같은 수술 단계 전에 안트라사이클린, 탁산, 트라스투주마브, 항-PARP (폴리 (ADP-리보스) 폴리머라아제), 항-PI3K (포스포이노시타이드 3-키나아제), mTOR (라파마이신의 포유동물 표적) 억제제, 비노렐빈, 겜시타빈, 항에스트로겐, 및/또는 항아로마타아제로 통상적으로 처리된 유방암이다.
특정 구현예에서, 유방암은 전술된 통상의 치료에 내성이 있는 유방암이다.
특정 폐암은 XR 및 플라틴 또는 퍼메트렉세드로 통상적으로 처리된 폐암이다.
특정의 초기 단계 NSCLC는 파클리탁셀, 도세탁셀 겜시타빈, 비노렐빈, 에토포사이드, 탁산, 아바스틴 [항-VEGF (혈관 내피 성장 인자) 항체], 에를로티닙 및/또는 게피티닙으로 통상적으로 처리된 NSCLC이다. 특정 구현예에서, 폐암은 통상의 치료에 대하여 내성이 있다.
본 개시내용은 추가로 약제 조성물 또는 약물을 제조하기 위한 본 발명의 식 (I)의 화합물, 바람직하게는 "IP2"의 용도에 관한 것으로, 상기 조성물은 대상체의 면역계를 자극함으로써 암 치료가 필요한 대상체에서 암 치료의 효율을 개선시키거나 암을 치료할 수 있다. 본 발명의 화합물은 대상체에서 암을 치료하기 위해, 암 전이를 예방하기 위해 및/또는 암 재발을 예방하기 위해 전술된 적어도 하나의 별개의 항암제 또는 임의의 다른 치료적 활성 화합물과 함께, 및/또는 방사선치료와 함께 특히 유리하게 사용될 수 있다.
따라서, 상기 암의 치료에서 동시적, 개별적 또는 순차적 사용을 위한 바람직하게는 적어도 하나의 별개의 항암제와 함께, 전형적으로 조합된 제제로서의 식 (I)의 화합물, 바람직하게는 "IP2" 화합물 (IP2-6Na 또는 IP2-4Na), 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물이 또한 본 명세서에 기재된다.
(i) 암을 예방하거나 치료하는 방법, (ii) 항암제에 대한 암의 민감도를 증가시키는 방법, 및 (iii) 항암제에 대한 암의 내성을 감소시키는 방법이 또한 본 명세서에 기재되는데, 상기 방법의 각각은, 필요로 하는 대상체에, 바람직하게는 (조합된 제제로) 본 명세서에 기재된 암의 예방 또는 치료에 전통적으로 사용된 항암제와 함께, 유효량, 전형적으로 치료적 유효량의, 상기 정의된 적어도 하나의 식 (I)의 화합물, 바람직하게는 "IP2" 화합물 (IP2-6Na 또는 IP2-4Na), 또는 약제 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 특정 측면에서, 상기 방법은 암 또는 암 치료 부작용을 예방하거나 치료하기 위해 유효량의 또 다른 치료적 활성 화합물을 투여하는 것을 추가로 포함한다.
본 명세서에 사용된 "치료" 또는 "치료하다"는 치료할 대상체의 자연적인 경과를 변경시키기 위한 치료적 개입을 지칭하며, 이는 예방적(preventive or prophylactic) 또는 완화적 목적을 위해 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질병의 발생 또는 재발의 예방, 증상의 완화, 및 질병의 임의의 직접적인 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 질병 진행 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 완화, 및 경감 또는 개선된 예후를 포함하지만 이것들로 제한되지 않는다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 암의 발달을 지연시키거나 암의, 전형적으로는 종양 성장의 진행을 늦추는데 사용된다.
전형적으로, 치료는 대상체의 면역계의 치료 반응, 전형적으로 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 반응(들)을 유도할 것이다.
T 세포 반응을 유도하는 것은 본 명세서에서는 전형적으로, 특정 항원을 향한 T 세포 반응이 이끌어내짐을 의미한다. 상기 유도 전에, 상기 T 세포 반응은 존재하지 않았거나 검출 수준 아래였거나 기능하지 않았다. T 세포 반응을 증강시키는 것은 본 명세서에서는, 특정 항원을 향한 T 세포의 전반적인 작용이 상기 증강 전에 상기 T 세포의 전반적인 작용과 비교하여 더 높아지고/지거나 더 효율적이게 됨을 의미한다. 예를 들어, 상기 증강 후에, 상기 항원을 향하여 더 많은 T 세포가 생성될 수 있다. 결과적으로, 추가로 생성된 T 세포의 작용은 상기 항원에 대한 전반적인 작용을 증가시킨다. 대안적으로, 상기 증강은 상기 항원을 향한 T 세포의 작용의 증진을 포함할 수 있다. 상기 T 세포는 예를 들어, 상기 항원과 더욱 강하게 및/또는 더욱 신속하게 반응할 수 있다. 물론, 상기 증강의 결과는 상기 T 세포의 작용의 증대와 함께 추가적인 T 세포의 생성일 수 있다. 대안적으로, 상기 증강은 추가적인 T 세포의 생성, 또는 T 세포 작용의 증대 중 단 하나를 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 또 다른 대상은, 전형적으로는 특정 표적, 바람직하게는 종양 항원 또는 암/종양 세포 또는 조직에 대한, 대상체에서의 면역 반응을 생성시키는 방법으로서, 상기 방법이 상기 대상체에게 본 발명에 따른 식 (I)의 화합물 또는 그와 같은 화합물을 포함하는 본 발명에 따른 조성물을 전형적으로는 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 치료적 면역 반응의 검출은 ELISA, ELISPOT, 지연된 유형의 과민 반응, 세포내 사이토킨 염색, 및/또는 세포외 사이토킨 염색과 같은 기술을 이용하여 당업자에 의해 용이하게 측정될 수 있다.
본 명세서에 사용된 "유효 량 또는 용량" 또는 "치료적 유효 량 또는 용량"은 암을 예방하고, 제거하고, 늦추거나, 대상체에서 상기 질병과 관련되거나 상기 질병에 의해 야기된 하나 또는 몇몇의 증상 또는 장애를 감소시키거나 지연시키거나, 바람직하게는 인간인 대상체에서 측정가능한 면역 반응을 유도하는 화합물의 양을 지칭한다. 본 발명의 화합물 및 그 약제 조성물의 유효량, 및 더욱 일반적으로 투약 요법(dosage regimen)은 당업자에 의해 결정되고 개조될 수 있다. 유효 용량은 통상의 기술을 사용함에 의해서 그리고 유사한 환경 하에서 얻어진 결과를 관찰함에 의해서 결정될 수 있다. 본 발명의 화합물의 치료적 유효 용량은 치료하거나 예방할 질병, 그 중대함, 투여 경로, 관련된 임의의 공동-치료법, 환자의 연령, 체중, 일반적인 의학적 상태, 병력 등에 따라 가변될 것이다.
전형적으로, 환자에게 투여할 화합물의 양은 약 0.01 내지 500 mg/인간 환자에 대한 체중 kg의 범위일 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 약제 조성물은 0.1 내지 100 mg/본 발명의 화합물 kg, 예를 들어 0.5 내지 10 mg/kg을 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명의 화합물은 비경구 경로, 경구 경로, 또는 정맥 내 (IV), 종양 내 (IT) 또는 복강 내 (IP) 주사에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물 또는 나노입자는 연속되는 몇일 동안 예를 들어, 연속되는 2 내지 10일, 바람직하게는 연속되는 3 내지 6일 동안 대상체에게 매일 (하루 1회) 투여될 수 있다. 상기 치료는 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7주 동안, 또는 2 또는 3주마다 또는 1, 2 또는 3개월마다 반복될 수 있다. 대안적으로, 임의로 2개의 치료 주기 사이에 예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5주의 휴식 기간과 함께, 몇 개의 치료 주기가 수행될 수 있다. 본 발명의 화합물은 예를 들어, 1주일에 1회, 2주마다 1회, 또는 1개월에 1회의 단일 용량으로 투여될 수 있다. 치료는 연간 1회 또는 몇 회로 반복될 수 있다. 용량은 당업자에 의해 결정될 수 있는 적절한 간격에서 투여된다. 선택된 양은 투여 경로, 투여의 지속기간, 투여 시간, 선택된 식 (I)의 화합물, 또는 상기 화합물과 함께 사용된 다양한 생성물의 제거 속도, 환자의 연령, 체중 및 물리적 상태 및 그/그녀의 병력, 및 약물에서 알려진 임의의 다른 정보를 포함하는 다수 인자에 의존할 것이다.
투여 경로는 다양한 경로에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 이것은 경구 또는 비경구일 수 있다. 이것은 전형적으로 전신 주사, 예를 들어, 정맥 내, 근육 내, 복막 내, 종양 내, 피하 등에 의해 수행된다. 약제 조성물은 상기 언급된 경로 중 하나 또는 몇몇에 적합하다. 약제 조성물은 바람직하게는 적합한 멸균 용액의 주사에 의해 또는 정맥 내 주입에 의해, 또는 영양 관을 통한 액체 또는 고체 용량 형태로 투여된다.
약제 조성물은 가능하게는 지속된 및/또는 지연된 방출을 제공하는 투여형 또는 장치를 통하여 약제학적으로 적합한 용매 또는 비히클 중의 용액으로서, 또는 당해 분야에 공지된 방식으로 고체 비히클을 함유하는 알약, 정제, 캡슐, 분말, 좌약 등으로서 제형화될 수 있다. 이러한 유형의 제형을 위해, 셀룰로오스, 지질, 탄산염 또는 전분과 같은 제제가 유리하게 사용된다.
제형에 사용될 수 있는 제제 또는 비히클 (액체 및/또는 주사가능한 및/또는 고체)은 부형제 또는 불활성 비히클, 즉 약제학적 불활성이며 비-독성의 비히클이다.
예를 들어, 약제학적 용도에 적합하고 당업자에게 공지된 식염수, 생리학적, 등장성 및 완충 용액이 언급될 수 있다. 조성물은 분산제, 가용화제, 안정제, 보존제 등으로부터 선택된 하나 이상의 제제 또는 비히클을 함유할 수 있다.
경구 투여에 적합한 본 발명의 제형은 각각 소정량의 활성 성분을 함유하는 캡슐, 향낭(sachet), 정제 또는 로젠지로서의 개별 유닛 형태; 분말 또는 과립 형태; 수성 액체 또는 비-수성 액체 중의 용액 또는 현탁액 형태; 또는 수중유형 에멀젼 또는 유중수형 에멀젼 형태일 수 있다. 비경구 투여에 적합한 제형은 편리하게는 바람직하게는 수용자의 혈액과 등장성인 활성 성분의 멸균성의 유성 또는 수성 제조물을 포함한다. 그와 같은 모든 제형은 또한 다른 약제학적으로 적합하며 비-독성인 보조 제제, 예컨대 안정제, 항산화제, 결합제, 염료, 유화제 또는 향미 물질을 함유할 수 있다.
본 발명의 제형은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 및 임의적으로 다른 활성 또는 치료 성분과 함께, 활성 성분, 식 (I)의 화합물, 바람직하게는 "IP2"를 포함한다. 담체는 제형의 다른 성분과 상용성이며 이것의 수용자에게 유해하지 않다는 측면에서 "허용가능"해야 한다. 이러한 항암제 대부분의 안전하고 효과적인 투여 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 또한, 이들의 투여는 표준 문헌에 기재되어 있다.
본 발명의 다른 대상은 별개의 용기 중에 본 발명에 따른 적어도 하나의 식 (I)의 화합물, 바람직하게는 "IP2", 및 바람직하게는 적어도 하나의 별개의 항암제, 전형적으로 화학요법 약물을 포함하는 키트이다. 키트는 본 발명에 따른 조성물을 제조하기 위한, 본 명세서에 기재된 방법 중 어느 하나를 수행하기 위한, 예를 들어, 대상체에서 암을 예방하거나 치료하기 위한, 암 전이를 예방하거나 치료하기 위한 및/또는 암 재발을 예방하거나 치료하기 위한 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 조성물을 제조하기 위한 본 발명에 따른 키트의 용도에 관한 것이다.
또 다른 특정 구현예에서, 키트는 본 명세서에 기재된 방법, 특히 대상체에서 암을 치료하는, 암 전이를 예방하는 및/또는 암 재발을 예방하는 방법 중 어느 하나를 수행하기에 적합하다.
본 발명의 추가 측면 및 이점은 단지 예시로 간주되어야 하는 하기 실험 부분 및 도면에서 개시될 것이다.
도면에 대한 설명
도 1: 이소진게틴 처리는 암 세포에서 인트론 -유래 항원의 항원 제시를 증가시킨다.
2.5 μM 및 6.25 μM 이소진게틴으로 처리한 후의 (A) 인간 흑색종 세포주 A375, (B) 인간 폐 암종 세포주 A549, (C) 정상 폐 섬유모세포 세포주 MRC5의, B3Z 특이적 T-세포 활성화. (D) 6.25 μM 및 15 μM 이소진게틴으로 처리한 후의 마우스 흑색종 세포주 B16F10의, B3Z 특이적 T-세포 활성화. (E) 15 μM 및 25 μM 이소진게틴으로 처리한 후의 마우스 육종 세포주 MCA205의, B3Z 특이적 T-세포 활성화.
도 2: 이소진게틴 처리는 암 세포에서 인트론 -유래 항원의 항원 제시를 증가시킨다.
6.25 μM, 15 μM 및 25 μM 이소진게틴으로 처리한 후의 (A) 글로빈-SL8-인트론 구성물, (B) 글로빈-SL8-엑손 구성물, (C) 난알부민 구성물로 미리 형질감염시킨 MCA205 세포의, B3Z 특이적 T-세포 활성화. 6.25 μM, 15 μM 및 25 μM 이소진게틴으로 처리한 후의 (D) 글로빈-SL8-인트론 구성물, (E) 글로빈-SL8-엑손 구성물, (F) 난알부민 구성물으로 미리 형질감염시킨 B16F10세포의, B3Z 특이적 T-세포 활성화. 데이터는 평균 ± SEM으로 주어진다. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 (짝지어지지 않은 스튜던트 t 시험).
도 3: 이소진게틴 처리는 생체 내에서 종양 성장을 늦춘다.
(A) 실험 환경. (B) MCA205 글로빈-SL8-인트론 세포를 마우스 옆구리에 피하 접종하였다. 5일 및 15일 후에, 6 mg/kg, 12 mg/kg 또는 18 mg/kg 이소진게틴을 복막 내로 주사하였다. 종양 크기를 27일째까지 3 내지 4일마다 평가하였다. 각각의 선은 각 그룹에서 6마리 마우스의, 면적(mm2)으로 표시된 종양 크기를 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 주어진다. *p<0.05 (모든 그룹을 비교하는 Tukey의 다중 비교 시험을 이용한 ANOVA).
도 4: 이소진게틴 유도체 IP2는 시험관 내에서 인트론-유래 항원의 MHC 부류 I 제시를 효율적으로 증가시키고, 면역 의존적인 방식으로 생체 내에서 종양 성장을 감소시킨다.
15 μM, 25 μM 및 35 μM (A) IP2 또는 (B) IM2P2, (C) 생성물 10으로, 인트론-유래 SL8 항원을 발현하는 MCA205 세포를 처리한 후의, B3Z 특이적 T-세포 활성화. (D) MCA205 글로빈-SL8-인트론 세포를 C56BL/7 마우스 옆구리에 피하 접종하였다. 5일 및 15일 후에, PBS 또는 18 mg/kg의 이소진게틴, IP2, 또는 M2P2를 복막 내로 주사하였다. 종양 크기를 27일째까지 3 내지 4일마다 평가하였다. 각각의 선은 각 그룹에서 6마리 마우스의, 면적(mm2)으로 표시된 종양 크기를 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 주어진다. *p<0.05, **p<0.01 (모든 그룹을 비교하는 Tukey의 다중 비교 시험을 이용한 ANOVA). (E) MCA205 글로빈-SL8-인트론 세포를 누드 nu/nu 마우스 옆구리에 피하 접종하였다. 5일 및 15일 후에, PBS, 18 mg/kg의 이소진게틴 또는 IP2를 복막 내로 주사하였다. 종양 크기를 27일째까지 3 내지 4일마다 평가하였다. 각각의 선은 각 그룹에서 6마리 마우스의, 면적(mm2)으로 표시된 종양 크기를 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 주어진다.
도 5: 이소진게틴 유도체의 합성 도식.
도 6: 이소진게틴 유도체의 합성 도식.
도 7: 스플라이싱 억제는 암 세포에서 엑손- 및 인트론-유래 항원 MHC-I 제시를 증가시킨다.
모두 인트론-유래 SL8 펩티드 및 H2-Kb 분자를 일시적으로 발현하며 18시간 동안 상류에서 2.5 μM 또는 6.25 μM 이소진게틴으로 처리한 (A) 인간 흑색종 A375, 인간 폐 암종 A549 또는 정상 인간 폐 섬유모세포 MRC5 세포주와; 또는 둘 모두 인트론-유래 SL8 펩티드를 일시적으로 발현하고 18시간 동안 상류에서 6.25 μM, 15 μM 또는 25 μM 이소진게틴으로 처리한 (B) 마우스 육종 MCA205 또는 마우스 흑색종 B16F10 세포주와 공동 배양시킨 후의 B3Z SL8-특이적 T-세포 활성화. 스플라이싱시킬 필요가 없는 둘 모두 (C) 엑손-유래 SL8 펩티드 또는 (D) Ova cDNA 구성물을 일시적으로 발현하며 18시간 동안 상류에서 6.25 μM, 15 μM 또는 25 μM 이소진게틴으로 처리한 MCA205 또는 B16F10 세포와 공동 배양시킨 후의 B3Z 활성화. T-세포 검정이 비-포화 조건에서 수행되고 MHC-I 분자의 발현이 결과에서 고려되게 하도록 유리 SL8 펩티드를 각각의 조건에서 첨가하였다. 각각의 그래프는 적어도 4개의 독립적인 실험의 하나의 대표예이다.
데이터는 평균 ± SEM으로 주어진다. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 (짝지어지지 않은 스튜던트 t-시험)
도 8: 세포 표면에서 H2-K b 분자의 발현.
(A) 이소진게틴으로 처리한 MCA205 및 B16F10 세포 상에서 H2-Kb 발현의 흐름 세포측정법 분석. (B) 이소진게틴으로 처리한 A375, A549 및 MRC5 세포 상에서 일시적으로 발현된 H2-Kb 발현의 흐름 세포측정법 분석.
도 9: 이소진게틴 스플라이싱 억제제는 종양 함유, 인트론-유래-SL8의 성장을 면역 의존적인 방식으로 감소시킨다.
(A) 실험 환경. 둘 모두 글로빈-SL8-인트론 구성물을 안정하게 발현하는 (B) 육종 MCA205 또는 (C) 흑색종 B16F10 세포, 또는 접종 후 5, 10 및 15일 째에 12 mg/kg 또는 18 mg/kg의 이소진게틴을 복막 내로 주사한 면역적격 C57BL/6 마우스 옆구리에 피하 접종시킨 (D) MCA205 야생형 (WT) 또는 (E) B16F10 WT 세포의 성장. 종양 크기를 확립된 윤리적 종결점에 도달할 때까지 3 내지 4일마다 평가하였다. 각각의 선은 각 그룹에서 6마리 마우스의, 면적(mm2)으로 표시된 종양 크기를 나타낸다. 접종 후 5, 10 및 15일 째에 18 mg/kg 이소진게틴을 복막 내로 주사한 면역결핍 Nu/Nu 누드 마우스의 옆구리에 피하 접종한 (F) MCA205 글로빈-SL8-인트론, (G) B16F10 글로빈-SL8-인트론, (H) MCA205 WT 또는 (I) B16F10 WT 종양의, 면적 (mm2)으로 표시된 크기. 데이터는 종결점에 도달하기 전의 일(day)로 제시된다.
데이터는 평균 ± SEM으로 주어진다. *p<0.05, **p<0.01 (모든 그룹을 비교하는 Tukey의 다중 비교 시험을 이용한 ANOVA).
도 10: 이소진게틴 유도체 IP2 및 M2P2 (본 명세서에서는 또한 "IM2P2"로 확인됨)의 합성 및 활성
(A) 이소진게틴, (B) IP2 (IP2-6Na 및 IP2-4Na) 및 (C) M2P2 화합물의 분자 구조. (D) B16F10 글로빈-SL8-인트론 또는 (E) MCA205 글로빈-SL8-인트론을 48시간 동안 15 μM 이소진게틴, 35 μM IP2 또는 35 μM M2P2로 처리하였다. RNA를 추출하였고, 스플라이싱되지 않은 (인트론) 및 스플라이싱된 (엑손) 글로빈-SL8-인트론 RNA를 증폭시키는 프라이머를 사용하여 qRT-PCR을 수행하였다. 데이터는 적어도 3개의 독립적인 실험의 2-ΔΔCt 인트론 및 2-ΔΔCt 엑손 비의 평균 ± SEM으로 주어진다. 15 μM 또는 35 μM의 (F) IP2 또는 (G) M2P2로 처리한 MCA205 또는 B16F10 세포 상에서 MTT 검정을 수행하였다. 데이터는 적어도 3개의 독립적인 실험의 통제 조건과 비교한 생존가능한 세포의 백분율의 평균 ± SEM으로 표시된다. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 (짝지어지지 않은 스튜던트 t 시험).
도 11: IP2 처리는 종양 성장을 감소시키고 생존을 연장시킨다.
둘 모두 인트론-유래 SL8 펩티드를 일시적으로 발현하고 상류에서 15μM 또는 35 μM의 IP2 (좌측 패널) 또는 M2P2 (우측 패널)로 처리한 마우스 (A) 육종 MCA205 또는 (B) 흑색종 B16F10 세포주와 공동 배양한 후의, B3Z SL8-특이적 T-세포 활성화. 데이터는 평균 ± SEM으로 주어진다. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 (짝지어지지 않은 스튜던트 t 시험). 둘 모두 글로빈-SL8-인트론 구성물을 안정하게 발현하는 (C) MCA205 (좌측 패널) 또는 흑색종 B16F10 세포 (우측 패널) 또는 접종 후 5, 10 및 15일 째에 18 mg/kg의 이소진게틴, M2P2 또는 IP2 또는 24 mg/kg 또는 36 mg/kg의 IP2를 복막 내로 주사한 면역적격 C57BL/6 마우스의 옆구리에 피하 접종시킨 (D) MCA205 WT (좌측 패널) 또는 B16F10 WT (우측 패널) 세포의 성장. 종양 크기를 확립된 윤리적 종결점에 도달할 때까지 3 내지 4일마다 평가하였다. 각각의 선은 각 그룹에서 적어도 6마리 마우스의, 면적 (mm2)으로 표시된 종양 크기를 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 주어진다. *p<0.05, **p<0.01 (모든 그룹을 비교하는 Tukey의 다중 비교 시험을 이용한 ANOVA). PBS 또는 18 mg/kg의 이소진게틴, M2P2 또는 IP2를 복막 내로 주사한 면역적격 C57BL/6 마우스의 옆구리에 피하 접종한 (E) MCA205 글로빈-SL8-인트론 세포의 카플란 메이어 플롯. 로그-순위 (Mantel-Cox) 검정을 수행하였다.
도 12: IP2는 세포 표면에서 H2-K b 분자 발현에 영향을 미치지 않으며 세포 자멸사를 유도하지 않는다.
IP2 및 M2P2로 처리한 (A) MCA205 및 (B) B16F10 세포 상에서 H2-Kb 발현의 흐름 세포측정법 분석. (C) 18시간 동안 35 μM 또는 1000 μM IP2로 처리한 이른, 늦은 및 전체 세포자멸사성 MCA205 및 B16F10 세포의 흐름 세포측정법 분석.
도 13: IP2 처리 효과는 면역 반응에 의존적이다.
5, 10 및 15일 째에 18, 24 또는 36 mg/kg의 IP2를 복막 내로 주사한 면역결핍 Nu/Nu 누드 마우스 옆구리에 피하 접종시킨 (A) MCA205 글로빈-SL8-인트론 (좌측 패널), MCA205 WT (우측 패널), (B) B16F10 글로빈-SL8-인트론 (좌측 패널) 또는 B16F10 WT (우측 패널)의 성장 곡선. 접종 후 5, 10 및 15일 째에 PBS 또는 24 mg/kg의 IP2 뿐만 아니라 3일마다 생체 내에서 항-CD8 또는 동종형으로 처리한 면역적격 마우스의 옆구리에 피하 접종시킨 (C, 좌측 패널) MCA205 글로빈-SL8-인트론의 성장 곡선. 각각의 선은 각 그룹에서 적어도 6마리 마우스의, 면적 (mm2)으로 표시된 종양 크기를 나타낸다. C 우측 패널은 27일째의 종양 크기를 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 주어진다. *p<0.05, **p<0.01 (모든 그룹을 비교하는 Tukey의 다중 비교 시험을 이용한 ANOVA). (D) MCA205 글로빈-SL8-인트론을 미리 접종시키고 IP2 (좌측 패널) 또는 이소진게틴 (우측 패널)으로 처리한 100일의 종양 비함유 C57BL/6 마우스에 접종시킨 MCA205 글로빈-SL8-인트론 세포 또는 B16F10 WT 세포의 성장 곡선. 각각의 선은 각 그룹에서 적어도 4마리 마우스의, 면적 (mm2)으로 표시된 종양 크기를 나타낸다.
도 14: IP2 처리는 확립된 종양으로부터 종양 성장을 감소시킨다.
면역적격 C57BL/6 마우스의 옆구리에 피하 접종시킨, 글로빈-SL8-인트론 구성물을 안정하게 발현하는 육종 15*105 MCA205 세포의 성장. 동일한 종양 부담(burden)을 갖는 그룹으로 정렬시키고 배정하기 전에 종양을 10일 동안 발달시켰다. 40 mm2 (정사각형)의 종양 크기를 갖는 하나의 종양 크기 그룹, 50 mm2 (삼각형)의 종양 크기를 갖는 하나의 그룹 및 100 mm2 (원형)의 종양 크기를 갖는 하나의 그룹에 따라 6마리 마우스로 된 3개 그룹을 만들었다. 11일 째에 모든 마우스에 24 mg/kg의 IP2-4Na를 복막 내로 주사하였다. 이 처리를 3 내지 4일마다 5회 반복하였다. 동시에, 확립된 윤리적 종결점에 도달할 때까지 종양 크기를 3 내지 4일마다 평가하였다. 각각의 선은 각 그룹에서 6마리 마우스의, 면적 (mm2)으로 표시된 종양 크기를 나타낸다.
실시예
재료 및 방법
세포 배양
MCA205 마우스 육종 세포주를 표준 조건 하에 1% 글루타민, 1% 피루브산나트륨, 1% 비-필수 아미노산, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 10% FBS (Life Technologies)가 존재하는 가운데 RPMI 1640 배지 (Life Technologies)에서 5% CO2 하 37℃에서 배양한다. B16F10 마우스 흑색종 세포주, MRC5 인간 섬유모세포 세포주 및 A375 인간 흑색종 세포주를 표준 조건 하에 1% 글루타민, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 10% FCS를 함유하는 DMEM 배지 (Life Technologies)에서 5% CO2 하 37℃에서 배양한다. A549 인간 폐 암종 세포주를 표준 조건 하에 1% Hepes, 1% 피루브산나트륨 및 10% FBS가 존재하는 가운데 DMEM/F12 + Glutamax I에서 5% CO2 하 37℃에서 배양한다. 안정한 MCA205-글로빈-SL8-인트론 세포주를 선택을 위해 추가적인 2 mg/ml G418 (Life Technologies로부터의 제네티신)과 함께 MCA205 세포주와 동일한 조건 하에서 배양한다. 안정한 B16F10-글로빈-SL8-인트론 세포주를 선택을 위해 추가적인 2 mg/ml G418 (Life Technologies로부터의 제네티신)과 함께 B16F10 세포주와 동일한 조건 하에서 배양한다. SL8/Kb-특이적 (B3Z) T-세포 리포터 하이브리도마를 표준 조건 하에 1% 글루타민, 0.1% β-갈락토시다아제, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 10% FCS가 존재하는 가운데 RPMI 1640 배지 (Life Technologies)에서 5% CO2 하 37℃에서 배양한다.
T-세포 검정
MCA205 및 B16F10 마우스 세포주를 각각의 제조업체 프로토콜에 따라 각각 형질감염 시약 jetPRIME (Ozyme) 또는 GeneJuice (Millipore)를 사용하여 플라스미드 YFP-글로빈-SL8-인트론으로 또는 PCDNA3 빈(empty) 플라스미드 (음성 대조)로 형질감염시킨다. A375, A549 및 MRC5 인간 세포주를 12시간 동안 마우스 H2-Kb 분자를 코드화하는 플라스미드로 형질감염시킨 다음, 제조업체 프로토콜에 따라 형질감염 시약 jetPRIME (Ozyme)을 사용하여 플라스미드 YFP-글로빈-SL8-인트론을 형질감염시켰다. 형질감염시키고 나서 24시간 후에, 세포를 상이한 용량의 이소진게틴 (Merk Millipore), IP2 또는 IM2P2 (본 명세서에서는 또한 "M2P2"로 확인됨)로 밤새 처리한다. 그 후, 세포를 PBS 1X로 3회 세척하고, 5x104 세포를 1x105 B3Z 세포와 함께 공동 배양한다. 양성 대조 웰에서는, 4 μg/ml의 합성 펩티드 SL8을 첨가한다. 그 후, 세포를 밤새 5% CO2를 사용하여 37℃에서 인큐베이션한다. 세포를 5분 동안 1200 rpm에서 원심분리하고, PBS 1X로 2회 세척하고, 다음의 용해(lysis) 완충액과 함께 진탕시키면서 4℃에서 5분 동안 용해시켰다: 0.2% TritonX-100, 0.2% DTT, 0.5M K2HPO4, 0.5M KH2PO4. 용해물을 10분 동안 3000 rpm에서 원심분리하고, 상청액을 96웰 옵티플레이트 (Packard Bioscience, Randburg, SA)로 옮긴다. 33 mM의 메틸엄벨리페리 β-D-갈락토피라노사이드 (MUG)를 함유하는 적발(revelation) 완충액을 첨가하고, 플레이트를 실온에서 3시간 동안 인큐베이션한다. 종국적으로, β-갈락토시다아제 활성을 FLUOstar OPTIMA (BMG LABTECH Gmbh, Offenburg, Germany)를 이용하여 측정한다. 결과는 평균 ± SEM으로 표시된다. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 (짝지어지지 않은 스튜던트 t 시험).
종양 접종 및 처리
C57Bl/6J 암컷 마우스를 Harlan으로부터 입수한다. NU/NU 누드 마우스를 Charles River로부터 입수한다. 7주령 마우스의 우측 옆구리에 마트리겔 (VWR)과 함께 5x104 MCA205-글로빈-SL8-인트론 세포를 또는 4x104 B16F10-글로빈-SL8-인트론 세포를 피하 주사한다. 접종하고 5일 후에, 마우스를 PBS, 이소진게틴 (Merk Milllipore), IP2 또는 IM2P2로 복막 내 처리한다. 접종하고 15일 후에 마우스를 동일한 약물로 다시 복막 내 처리하였다. 27일까지 3 내지 4일마다 종양 면적을 기록한다. 모든 동물 실험은 프랑스 및 유럽의 법률 및 규제를 준수하여 수행하였다. 결과는 평균 ± SEM으로 주어진다. *p<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 (모든 그룹을 비교하는 Tukey 다중 비교 시험을 이용한 ANOVA).
결과
이소진게틴 처리는 암 세포에서 인트론-유래 항원의 항원 제시를 증가시킨다.
최근의 연구에서, 본 발명자들은 선구 번역 생성물 ("PTP")이 시험관 내에서 내인성 MHC 부류 I 경로에 대한 주요한 펩티드 공급원임을 입증하였다. 암 세포 표면에서 PTP-유래 항원의 제시를 조절하기 위해, 본 발명자들은 흑색종 A375, 폐 암종 A549 및 정상 섬유모세포 폐 MRC5 세포주에 대한 이소진게틴 처리 효과를 시험하였다. 이 목적을 위해, 모든 세포를 각각 β-글로빈 유전자 구성물 내 인트론으로부터의 SL8 에피토프 및 MHC 부류 I Kb 분자로 일시적으로 발현시켰다. 도 1A, 1B 및 1C에서 보여지듯이, 천연 이소진게틴 화합물은 용량 의존적인 효과를 나타내면서 시험된 암 세포주에서 인트론-PTP-의존적 항원 제시에서의 증가를 일으킨다. 유사하게, 마우스 종양 세포주, 하나의 흑색종 (B16F10) 및 하나의 육종 (MCA205) 세포주에 대하여 동일한 실험을 수행하였다. 둘 모두의 쥐과(murine) 세포주를 β-글로빈 유전자 구성물 내 인트론으로부터 유래한 PTP-SL8 에피토프로 일시적으로 발현시켰다. 인간 세포주에서의 이전 결과와 일치되게, 이소진게틴은 마우스 세포주에서 용량 의존적인 효과를 나타내면서 PTP-의존적 항원 제시에서의 증가를 이끌어낸다. 이러한 결과는, PTP 항원 또는 PTP-유래 항원의 생성 및 제시가 이소진게틴 처리된 암 세포주에서 양성 조절될 수 있음을 보여준다. 본 발명자들은 이 분자가 PTP 생성 및 제시에 의존적인 특이적 항-종양 면역 반응을 강화시키는 양성 면역조절제로 사용될 수 있다는 가설을 지지한다.
이소진게틴 처리 후 암 세포에서 엑손 및 인트론-유래 항원 제시의 효율적인 증가를 위해서는 스플라이싱 사건이 필요하다.
이소진게틴이 인트론 코드화된 영역으로부터 세포 표면에 SL8 에피토프의 제시를 증가시킨다는 사실은, 스플라이싱된 기관(machinery)이 짝지어지지 않은 경우에 pre-mRNA가 항원 제시에 대한 원천이라는 생각을 지지한다. 그 후, 본 발명자들은 이소진게틴이 또한 스플라이싱시킬 필요가 없는 cDNA 구성물로부터가 아니라 엑손 코드화된 영역으로부터 항원성 에피토프의 증가를 이끌어낼 것임을 추측한다. 이 목적을 위해, 상기 언급된 둘 모두의 쥐과 세포주를 β-글로빈 유전자 구성물 내의 엑손으로부터의 PTP-SL8 에피토프로 일시적으로 발현시켰거나, SL8 에피토프가 그 우측 보기에서 확인되는 Ova cDNA로 일시적으로 발현시켰다. 예상된 대로, 천연 이소진게틴 화합물은 용량 의존적인 효과를 나타내면서 시험된 암 세포주에서 엑손 및 인트론-PTP-의존적 항원 제시에서 증가를 일으킨 반면 (도 2A, 2B, 2D 및 2E), 스플라이싱 억제제는 Ova cDNA 구성물에 의해 코드화된 SL8 에피토프의 생성에는 효과를 나타내지 않는다 (도 2C 및 2F). 이러한 결과는 이소진게틴이 암 세포에서 PTP 항원 또는 PTP-유래 항원 제시의 부스터(booster)로 작용하게 하는데 스플라이싱이 필요함을 보여준다.
이소진게틴 처리는 생체 내에서 종양 성장을 늦춘다.
상기 결과는, 엑손 또는 인트론 서열에 의해 코드화된 PTP-의존적 항원의 원천과는 독립적으로, 이소진게틴의 천연 생성물이 처리된 종양 세포주의 세포 표면에서 이들의 생성 및 제시를 시험관 내에서 증가시킬 수 있음을 입증한다. 다음의 명백한 현안은, DMSO 중에 용해되어야 하는 이소진게틴이 생체 내에서 종양 성장 및 CD8+ T 세포 증식에 대하여 동일한 효과를 가질 수 있는지를 확인하는 것이었다. 이 목적을 위해, β-글로빈 유전자 내 인트론으로부터 SIINFEKL (SL8) 에피토프 (글로빈-인트론-SL8)를 안정하게 발현하는 MCA205 육종 세포를 마우스에 피하 접종하였다. 이렇게 접종하고 5일 후에, 마우스의 복막 내로 명확한 용량의 이소진게틴을 백신 접종하였다. 그 후, 10일 후에 동일한 용량을 다시 주사하였다. 그 시간 동안, 2 내지 3일마다 종양 성장을 모니터하였다 (도 3A). 본 발명자들은 6, 및 18 mg/kg의 이소진게틴으로 처리한 마우스에서 접종 후 27일 째에 종양 성장의 현격한 50% 감소를 관찰하였다 (도 3B). 이 효과에 대한 면역 반응의 필요를 평가하기 위해, 본 발명자들은 전술된 것과 동일한 환경을 갖는 면역결핍 nu/nu 마우스에서 18 mg/kg 이소진게틴 처리의 영향을 시험하였고, 이것이 종양 성장에 효과가 없음을 확인하였다 (도 4D). 이러한 결과는, 이소진게틴 처리한 경우의 종양 크기 감소는 생체 내에서 활성 면역 반응의 존재가 필요함을 보여준다. 본 발명자들은 다음으로, 항-종양 반응 증가를 시험하기 위해 이소진게틴 유도체를 생성시키기로 결정하였다. 사실상, 이소진게틴은 물에 불용성이며 단지 DMSO 용매 중에만 용해될 수 있는데, 이 점은 복강 내에서 이소진게틴의 약동학을 덜 효율적이게 만든다.
천연 이소진게틴 생성물로부터의 유도체 화합물: 합성 도식.
독성 담체 또는 공용매 (DMSO)를 사용하지 않고 이소진게틴이 생체 내에서의 더욱 광범위한 검증(validation)에 이용될 수 있게 하기 위해, 이것의 용해도를 증진시키는 전략을 발견하는 것이 필요한 것으로 간주되었다. 본 발명의 화합물을 상업적으로는 이소진게틴, 은행나무 (Ginko biloba L.)의 잎으로부터 추출된, 더욱 일반적으로는 비플라보노이드로 지칭된 작은 폴리페놀 분자로부터 제조하였다. DMSO에 용해시킨 천연 생성물이 마우스에 잘 흡수되지 않을 수 있다는 점을 고려하여, 본 발명자들은 이들의 기능을 유지할 유도체 화합물을 생성시키기로 결정하였는데, 상기 유도체 화합물은 공용매에 용해된 천연 화합물보다 나은 약동학을 갖는, 암 세포주에 대한 양성 면역조절제 및 스플라이시오좀의 억제제를 의미한다.
디에틸클로로포스파이트의 현장(in situ) 형성을 이용하는 포스포릴화에 의해 이소진게틴으로부터 도식 1에 도시된 IP2 화합물 (2 및 2')의 합성 (도 5)을 수행하여 1을 얻었다. 에틸 에스테르 보호 기를 아이오도트리메틸실란을 사용하여 추가로 분할하여 인산 중간체를 얻었는데, 이것을 수산화나트륨으로 즉시 처리하여 인산이나트륨 전구약물 2 및 2'로의 실제적인 경로를 완결하였다. 2 및 2'의 수 용해도는 모 화합물 이소진게틴의 수 용해도보다 상당히 더 높은 것으로 확인되었다.
도식 1에 도시된 대로 IM2P2, 유도체 4의 합성을 수행하였다. 1의 남아있는 2개의 페놀 기를 아이오딘화메틸을 사용하여 알킬화시켜서 화합물 3을 얻었다. 1로부터 2 및 2'를 제조하는 것과 유사한 조건 하에서 화합물 3을 처리하여 인산이나트륨 전구약물 4를 얻은 반면, 염기성 조건 하에서 이것을 반응시켜서 화합물 5를 얻었다.
전구약물 8은 페놀 기의 C4 위치에서의 포스포릴화에 이어 아이오딘화 트리메틸실릴을 사용하여 7의 에틸 기를 분할하고 생성되는 인산을 수 중 수산화나트륨으로 반응시켜서 인산나트륨 전구약물 8을 얻음으로써 6으로부터 3개 단계로 합성하였다.
도식 1 (도 5 참조):
Figure pct00007
염기성 조건 하에서 과량의 아이오딘화나트륨 (5 당량)으로 이소진게틴을 처리하여 완전히 메틸화된 화합물 11을 얻었다 [도식 2 (도 6) 참조]. 3 당량의 MeI를 사용하여 트리알킬화 생성물 9와 10의 혼합물을 생성시켰는데, 상기 혼합물은 컬럼 크로마토그래피에 의해 용이하게 분리되었다. 이소진게틴을 염화피리디늄과 반응시켜서 에테르를 분할시키고 폴리페놀성 화합물 12를 얻었다.
도식 2 (도 6 참조):
Figure pct00008
이소진게틴 유도체 IP2는 시험관 내에서 인트론 -유래 항원의 MHC 부류 I의 제시를 효율적으로 증가시키고 면역 의존적인 방식으로 생체 내에서 종양 성장을 극적으로 감소시킨다.
신규 화합물을 종양 세포주에 대한 양성 면역조절제로서 시험하기 위해, 본 발명자들은 먼저 이들을 시험관 내 검정으로 시험하기로 결정하였다. 둘 모두 본 명세서에서 또한 "IP2"로 확인된 둘 모두의 유도체 2 및/또는 2', 및 "IM2P2"로 불리는 유도체 4를 물에 용해시킬 수 있었다. β-글로빈 유전자 내 인트론으로부터 유래한 PTP-SL8 에피토프 (글로빈-인트론-SL8)를 일시적으로 발현하는 MCA205 세포를 15 μM, 25 μM 또는 35 μM의 IP2로 처리한 후에, 본 발명자들은 PTP-의존적 항원 제시에서의 증가를 관찰한다 (도 4A). 반대로, 본 발명자들의 PTP-코드화된 구성물을 발현하는 MCA205 세포를 15 μM, 25 μM 및 35 μM의 IM2P2 (도 4B)로 또는 생성물 또는 화합물 10 (도 4C)으로 처리하여도 본 발명자들의 PTP-유래 항원의 제시는 증가하지 않는다. 그 후, 본 발명자들은 항-종양 성장 및 특이적 항-종양 면역 반응의 유도자 측면에서 이러한 유도체의 효과를 생체 내에서 조사하기로 결정하였다. 이 목적을 위해, β-글로빈 유전자 내 인트론 환경으로부터 SIINFEKL (SL8) 에피토프 (글로빈-인트론-SL8)를 안정하게 발현하는 MCA205 육종 세포를 마우스에 피하 접종하였다. 그 후, 이렇게 접종하고 5일 후에, 각 그룹의 마우스에 각각 18 mg/kg의 이소진게틴, IP2 또는 IM2P2를 복막 내로 백신 접종하였다. 10일 후에, 동일한 용량의 각 화합물을 다시 주사하였다. 그 시간 동안 2 내지 3일마다 종양 성장을 모니터하였다 (도 3A). 18 mg/kg의 IP2로 처리한 마우스 그룹에서, 본 발명자들은 18 mg/kg의 이소진게틴으로 처리한 마우스 그룹과 비교하여 종양 성장의 극적인 감소를 관찰하였다 (도 4D). 동시에 그러나 반대로, 18 mg/kg의 IM2P2로 처리한 마우스는 임의의 종양 성장 감소를 입증하지 않았다 (도 4D).
종양 성장 감소가 PTP-의존적 방식으로의 특이적 항-종양 면역 반응에 기인한 것임을 입증하기 위해, 본 발명자들은 Nu/Nu 무흉선 누드 마우스에서 상기 화합물의 효과를 조사하였다. 이 목적을 위해, β-글로빈 유전자 내 인트론 환경으로부터 SIINFEKL (SL8) 에피토프 (글로빈-인트론-SL8)를 안정하게 발현하는 MCA205 육종 세포를 마우스에 피하 접종하였다. 그 후, 이렇게 접종하고 5일 후에, 각 그룹의 마우스에 각각 18 mg/kg의 이소진게틴, IP2 및 IM2P2을 복막 내로 백신 접종하였다. 그 후, 10일 후에 동일한 용량의 각 화합물을 다시 주사하였다. 그 시간 동안 종양 성장을 2 내지 3일마다 모니터하였다 (도 3A). 도 4E는 사용된 화합물 중 임의의 것이 이러한 면역결핍 마우스에서 육종 세포주의 종양 성장에 효과를 나타냄을 보여주는데, 이는 스플라이싱 억제제인 천연 생성물 이소진게틴의 선택된 유도체가 암에 대한 양성 면역조절제로 확인될 수 있고 신규 화학요법용 치료제로 사용될 수 있다는 사실을 지지하며 이 사실을 더욱 강조한다.
논의
본 발명은 본 명세서에서 IP2로 확인된 생성물이 항종양 면역 반응에 및 따라서 종양 성장에 매우 긍정적인 효과를 미침을 최초로 입증한다. 본 발명자들은 천연 생성물 이소진게틴의 특정 유도체가 시험관 내에서 및 또한 생체 내에서 항-종양 면역 반응의 효력있는 자극제임을 실제로 입증하였다. 이러한 종류의 작용 메커니즘을 나타내는 그와 같은 소 분자는 전례가 없다. 본 발명자들의 데이터는 표적화된 분자 치료의 체제(framework) 내에서 신규 항암 적용에 대한 길을 연다.
Pre-mRNA 스플라이싱은 모든 포유동물 세포의 정상적인 기능에 필요한 필수적인 메커니즘이다. 지난 몇 년 동안, 몇몇의 연구에서는 다양한 암에서 비정상적인 스플라이싱 활성과 관련된 주요 스플라이시오좀 인자의 과발현 및 돌연변이의 존재가 보고되었다. 몇 년 전, 본 발명자들은 또한 스플라이시오좀의 억제가 MHC 부류 I PTP-의존적 항원 제시를 증가시킨다는 몇몇 증거를 제공하였다. 이러한 발견은 항암 치료에서 효력있는 표적으로서의 스플라이시오좀에 초점을 맞춘다. 소 분자는 스플라이시오좀을 억제하고 구체적으로는 스플라이시오좀 인자 SF3B1 기능을 억제하는 것으로 이미 보고되었다. 이러한 소 분자의 정확한 메커니즘은 아직 완전히 이해되지 않는다 하지만, 이들이 사용된 화합물에 따라 종양 크기를 40%에서 80%까지 감소시킴으로써 암 치료에 효과적일 수 있음은 보고되었다. 현재까지 인간에서 시험된 유일한 것은 E7107이다. 이것은 독성 문제 때문에 중단되었다. 이 화합물은 SF3B1과 상호작용함으로써 스플라이시오좀을 억제하는 것으로 공지되어 있다. 그 연구에서, 본 발명자들은 본 명세서에 기재된 천연 생성물 이소진게틴의 특정 유도체 화합물 IP2를 사용하여 스플라이시오좀 활성을 조절함으로써 특이적 항-종양 면역 반응이 유도될 수 있다는 시험관 내에서 및 생체 내에서의 둘 모두의 증거를 제공한다.
스플라이시오좀의 특정 성분을 억제하는 이러한 상이한 화합물의 효과를 조사하는 대신, 본 발명자들은 스플라이시오좀 복합체의 형성을 억제하는 것으로 보고된 또 다른 부류의 억제제를 조사하기로 결정하였다. 이소진게틴은 스플라이시오좀의 초기 집합(assembly) 단계에 간섭하는 것으로 보고되었고, 효력있는 종양 세포 침습 억제제인 것으로 또한 보고되었다. 사실상, 이소진게틴이 pre-스플라이시오좀의 A 복합체를 억제하여 더욱 큰 전-촉매 스플라이시오좀 B 복합체를 형성함이 입증되었다. 본 발명자들은 시험관 내에서 및 생체 내에서 이소진게틴의 유도체 IP2를 사용하여 스플라이시오좀의 형성을 가능한 한 초기에 억제함으로써 PTP-의존적 에피토프에 대한 CD8+ T 세포 증식을 특이적으로 유도하여 항-종양 항원 제시가 매우 현격히 증가되었음을 입증하였다. 본 발명자들은 IP2가 암에 대한, 특히 흑색종 및 육종에 대한 신규 화학요법제로 사용될 수 있음을 본 명세서에서 보고한다.
추가적인 결과
스플라이싱 억제는 암 세포에서 인트론 및 엑손으로부터 유래한 항원의 제시를 증가시킨다.
암 세포는 이들의 표면에서 MHC 부류 I (MHC-I) 분자 위에 제시된 펩티드의 양 및 풀(pool)을 형상화할 수 있는 상이한 세포내 메커니즘을 나타내서, 이들의 항원성을 감소시키고 T-세포 인식을 벗어나게 한다. 본 발명자들은 PTP가 시험관 내에서 내인성 MHC-I 경로에 대한 펩티드의 주요 원천임을 입증하였다. 또한, 이들은 HEK 세포를 스플라이싱 억제제 이소진게틴으로 처리하여 PTP-의존적 항원 제시에 대한 스플라이싱 억제의 긍정적인 영향의 첫번째 증거를 제공하였다. 뒤의 것은 스플라이시오좀의 초기 집합 단계 동안 이것을 억제하는 것으로 보고되었다. 암 세포주의 항원성 및 면역 인식을 개선시키기 위해, 본 발명자들은 이소진게틴이 암 세포 표면에서 종양 관련된 PTP-유래 항원 (TA-PTP)의 발현 및 제시를 양성 조절할 수 있었는 지를 측정하였다. 이 목적을 위해, 인간 흑색종 세포주 A375, 인간 폐암 세포주 A549 및 정상 인간 섬유모세포 폐 세포주 MRC5를 MHC-I H2-Kb 분자, 및 β-글로빈 유전자 구성물 내 인트론으로부터의 PTP-SL8 에피토프 (글로빈-SL8-인트론)로 일시적으로 발현시켰고, 18시간 동안 상이한 농도의 이소진게틴으로 처리하였다. 모든 결과는, 처리한 세포 표면에서 H2-Kb 분자의 전체 발현에서의 조절에 의해 한쪽으로 치우치지 않도록 SL8 펩티드를 세포외적으로 첨가하거나 첨가하지 않는 경우의 B3Z 활성화의 비를 기반으로 표시되었다. 이소진게틴으로의 처리는 용량 의존적인 방식으로 3가지 세포 유형에서 인트론-유래-SL8 항원 제시를 증가시킨다 (도 7A). 생존력이 처리 시에 80%를 초과하는 것으로 확인되기 때문에 사용된 이소진게틴의 농도는 인간 세포에 대해서는 독성이 아니었다 (표 1).
Figure pct00009
2.5 μM 또는 6.25 μM의 이소진게틴으로 처리한 A375, A549 및 MRC5 세포주에 대한 MTT 검정. 적어도 3개의 독립적인 실험으로부터의 세포 생존력 ± SEM의 백분율의 평균으로 주어져 있다.
동시에, 글로빈-SL8-인트론 구성물로 일시적으로 발현되는 마우스 흑색종 B16F10 및 육종 MCA205 세포주에 대하여 동일한 실험을 수행하였다. 이전 결과와 일치되게, 이소진게틴은 용량 의존적인 방식으로 인트론-유래-SL8 항원 제시에서 증가를 이끌어낸다 (도 7B). 효율적인 용량은 이러한 세포주에서 50% 초과의 세포 생존력으로 이어진다 (표 2).
Figure pct00010
6.25 μM, 15 μM 또는 25 μM의 이소진게틴으로 처리한 MCA205 및 B16F10 세포주에 대한 MTT 검정. 적어도 3개의 독립적인 실험으로부터의 세포 생존력 ± SEM의 백분율의 평균으로 주어져 있다.
PTP 제시에 대한 이소진게틴의 영향을 추가로 조사하기 위해, 쥐과 육종 및 흑색종 세포주 둘 모두를 β-글로빈 유전자 구성물 내 엑손으로부터의 PTP-SL8 에피토프 (글로빈-SL8-엑손)로 일시적으로 발현시키거나 Ova cDNA로 일시적으로 발현시켰다. 뒤 구성물에서, SL8 에피토프는 그 우측 환경에서 확인되고 스플라이싱될 필요가 없다. 본 발명자들은, 이소진게틴이 용량-의존적인 효과를 나타내면서 MCA205 및 B16F10 암 세포주에서 엑손-유래-SL8 항원 제시를 증가시키는 반면 (도 7C), 스플라이싱 억제제는 Ova cDNA 구성물에 의해 코드화된 SL8 에피토프의 생성에는 효과가 없음(도 7D)을 관찰하였다. 그러므로, 스플라이싱 사건은 이소진게틴이 PTP-의존적 항원 제시에 영향을 미치게 하는데 필요한 것으로 보인다. 이는 PTP의 생성 단계 동안의 이소진게틴의 작용은 제안하지만 MHC-I 항원 제시 경로에서는 추가로 제안하지 않는다. 이러한 결과와 함께, 본 발명자들은 세포 표면에서의 H2-Kb 분자의 발현은 이소진게틴으로 처리한 세포주에서 상이하게 영향을 받는데, 즉 이것은 MCA205에서는 감소되고 (도 8A, 좌측 패널) B16F10에서는 증가되며 (도 8A, 우측 패널) 인간 세포주에서는 안정함을 입증하였다 (도 8B).
전체로, 이러한 결과는, 천연 생성물 이소진게틴이 에피토프 환경, 즉 엑손 내 또는 인트론 내 서열과는 독립적으로, 그리고 시험된 세포주와는 독립적으로 암 세포에서 PTP-유래 항원 제시의 부스터로 작용함을 보여준다. 이것은 암 세포에서 MHC-I 항원의 생성 및 제시에 대한 스플라이싱 사건의 중요성을 강조한다. 종국적으로, 본 발명자들의 데이터는 스플라이싱된 기관이 짝지어지지 않는 경우에 pre-mRNA가 항원 제시에 대한 원천이라는 생각을 지지한다.
이소진게틴 처리는, 인트론-유래-SL8 에피토프가 발현되고 이것의 작용이 면역 반응에 의존적인 경우에 생체 내에서 종양 성장을 늦춘다.
세포 표면에서 풍부한 항원은 CD8+ T 세포 반응의 세기를 결정하고 따라서 면역우세를 규정함에 있어 중요한 파라미터인 것으로 입증되었다 (Doherty et al., 2006). SL8 펩티드는 생체 내에서 매우 면역원성인 것으로 널리 입증되었다. 시험관 내에서 SL8-특이적 T-세포 활성화를 조사하였을 때, 본 발명자들은 스플라이싱 억제 후에 암 세포 표면에서 SL8 발현의 풍부성에서의 변화를 관찰하였다. 생체 내에서 이 가설을 시험하기 위해, 본 발명자들은 먼저 인트론-유래 SL8 펩티드를 발현하는 종양의 성장에 대한 이소진게틴 처리의 영향을 조사하였다. 이 목적을 위해, 글로빈-인트론-SL8 구성물을 안정하게 발현하는 MCA205 육종 세포 및 B16F10 흑색종 세포 둘 모두를 마우스에 피하 접종하였다. 종양 접종한 후 5, 10 및 15일 째에, 마우스에 규정된 용량의 이소진게틴을 복막 내로 주사하였고, 종양 성장을 모니터하였다 (도 9A). MCA205 글로빈-SL8-인트론 (MCA205 GI) 종양 함유 마우스에서, 본 발명자들은 12 및 18 mg/kg의 이소진게틴으로 처리한 경우에 접종 후 27일 째에 50% 초과의, 종양 크기의 현격한 감소를 관찰하였다 (도 9B). B16F10 글로빈-SL8-인트론 (B16F10 GI) 종양 성장에 대한 이소진게틴 처리의 영향은 MCA205 GI에 대한 것보다 적다; 그러나, 약물은 여전히 종양 성장을 현격히 늦춘다 (도 9C). 이소진게틴 처리 후 생체 내에서 SL8 과발현과 종양 성장 감소 사이의 관련성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 MCA205 또는 B16F10 야생형 (WT) 세포가 접종된 마우스를 사용하여 동일한 실험을 수행하였다. 12 및 18 mg/kg의 이소진게틴으로 처리한 후에 MCA205 WT (도 9D) 또는 B16F10 WT (도 9E) 종양 성장의 현격한 감소는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는, 면역우세한 에피토프, 본 명세서에서는 SL8 펩티드의 발현이 이소진게틴이 생체 내에서 종양 성장에 영향을 미치게 하는데 필요함을 제안한다.
그 후, 본 발명자들은 이소진게틴이 종양 성장을 감소시키는데 면역 반응이 필요한 지를 평가하였다. 면역결핍 Nu/Nu 누드 마우스에 글로빈-인트론-SL8 또는 WT를 안정하게 발현하는 MCA205 또는 B16F10 세포를 피하 접종하였고, 전술된 것과 동일한 환경을 이용하여 처리하였다 (도 9A). 4개의 종양 유형 각각의 성장에 대한 이소진게틴 처리 효과는 관찰되지 않았다 (도 9F-I).
전체로, 이러한 결과는, 이소진게틴으로 처리한 경우의 종양 크기 감소는 생체 내에서 활성 면역 반응의 존재를 필요로 하며, 이는 면역우세 에피토프의 발현 증가가 항-종양 면역 반응을 유도함을 보여준다.
천연 이소진게틴 (생성물 IP2 및 생성물 M2P2, 뒤의 것은 또한 본 명세서에서 "IM2P2"로 확인됨)으로부터의 화합물 유도체는 수용성이고 스플라이싱을 억제하며 덜 독성이다.
천연 이소진게틴 생성물의 유도체를 합성하였고, 스플라이싱을 억제하고 시험관 내에서 PTP-유래 항원을 증가시키는 이들의 능력에 대하여 그리고 생체 내에서 종양 성장을 감소시키는 능력에 대하여 시험하였다. 유도체 IP2 (도 10B에서는 IP2-6Na 및 IP2-4Na로 확인됨) 및 M2P2 (도 10C)를, 은행나무, Ginko biloba L.의 잎으로부터 추출한, 더욱 일반적으로는 비플라보노이드로 지칭된 상업적인 이소진게틴 (도 10A)으로부터 합성하였다. 합성 도식은 도 5에 제시되어 있다. 간단하게는, 디에틸클로로포스파이트의 현장 형성을 이용하는 이소진게틴의 포스포릴화에 의해 IP2 또는 (도식에서 명명된) 화합물 2 및 2'의 합성을 수행하여 화합물 1을 얻었다. 에틸 에스테르 보호 기를 아이오도트리메틸실란을 사용하여 추가로 분할하여 인산 중간체를 얻었고, 이것을 수산화나트륨으로 즉시 처리하여 인산이나트륨 전구약물로의 실제 경로를 완결하였다. M2P2 분자를 합성하기 위해, 화합물 1의 남아있는 2개의 페놀 기를 아이오딘화메틸을 사용하여 알킬화시켜서 화합물 3을 얻었다. 화합물 1로부터 화합물 2 및 2'를 제조하는 것과 유사한 조건 하에서 화합물 3을 처리하여 인산이나트륨 전구약물 4 또는 M2P2를 얻은 반면, 염기성 조건 하에서 이것을 반응시켜서 화합물 5를 얻었다.
IP2 및 M2P2의 수 용해도는 모 화합물 이소진게틴의 수 용해도보다 상당히 더 높은 것으로 확인되었다 (데이터는 표시되지 않음). 또한, 본 발명자들은 MCA205 및 B16F10 세포에서 글로빈-SL8-인트론 유전자 생성물의 스플라이싱을 억제하는 IP2 및 M2P2의 능력을 시험하였다. 흥미롭게도, IP2 및 M2P2는 각각의 세포주에서 스플라이싱 억제의 2개의 별개 패턴을 제공한다. IP2 처리는 이소진게틴 처리 용량과 같은 둘 모두의 세포에서 비-스플라이싱된 RNA 생성물의 존재를 증가시킨다. 대조적으로, M2P2 처리는 IP2 및 이소진게틴 처리와 비교하여 B16F10 세포에서는 스플라이싱에 영향을 미치지 않는 한편, MCA205에서는 스플라이싱에 강한 영향을 미친다 (도 10D 및 10E). 그러므로, IP2 및 M2P2는 스플라이싱 억제에 대하여 상이한 메커니즘을 나타내는 것으로 보인다. 중요하게는, 본 발명자들은 IP2의 스플라이싱 패턴이 연구된 유전자 생성물에 대한 이소진게틴의 스플라이싱 패턴과 유사함을 관찰하였다. 또한, 암 세포는 스플라이싱 기관에서 결핍을 얻을 수 있는데, 이는 예를 들어, 종양 억제제 유전자의 발현을 방지함으로써 이들의 성장에 유익함이 입증되었다. 이러한 결핍은 모든 종양에서 동일한 성질을 갖는 것이 아니므로 개별 종양 유형에 대한 스플라이싱 억제제의 별개의 효과를 설명할 수 있었다. IP2 및 M2P2 둘 모두는 시험된 용량에서 MCA205 및 B16F10 WT 세포에서 독성을 나타내지 않는다 (도 10F 및 10G). 전체로, 본 발명자들은 수용성이며 세포 생존력에 영향을 미치지 않는 용량에서 2개의 별개의 모델 세포주에서 스플라이싱에 상이하게 영향을 미칠 수 있는 2개의 신규 약물을 최초로 제공하였고 본 명세서에서 확인한다.
이소진게틴 유도체 IP2는 시험관 내에서 인트론-유래 항원의 MHC-I 제시를 효율적으로 증가시키고 생체 내에서 종양 성장을 감소시키며 생존을 연장시킨다.
이소진게틴과 비교하여 IP2 및 M2P2 화합물의 잠재적인 면역조절성 효과를 시험하기 위해, 상기 2개 분자를 먼저 시험관 내에서 PTP-유래 항원의 MHC-I 제시를 증가시키는 이들의 능력에 대하여 시험하였다. 이 목적을 위해, MCA205 및 B16F10 세포를 글로빈-인트론-SL8 구성물로 일시적으로 발현시키고, 15 μM 또는 35 μM의 IP2 또는 M2P2로 처리하였다. IP2로의 처리는 이소진게틴 처리 후에 발명자들이 관찰한 것과 유사하게 MCA205 및 B16F10 세포에서 인트론-SL8-유래 항원 제시를 증가시키는 한편 (도 11A 및 B, 좌측 패널), M2P2는 MCA205 세포에서는 그 제시를 감소시키고 B16F10 세포에서는 제시에 영향을 미치지 않는다 (도 11A 및 B 우측 패널). 이러한 결과는 흥미롭게도 글로빈-SL8-인트론 유전자 스플라이싱을 억제하는 IP2 및 M2P2의 각각의 능력에 서로 관련되어 있다. 사실상, M2P2는 B16F10에서의 SL8 항원 제시 그리고 스플라이싱 둘 모두에 영향을 미치지 않는다. 반대로, M2P2는 MCA205에서는 스플라이싱을 강하게 억제하며 SL8 제시에 부정적인 영향을 미친다. 이러한 결과와 함께, 본 발명자들은 세포 표면에서 H2-Kb 분자의 발현이 IP2 및 M2P2로 처리한 세포주에서는 영향을 받지 않음을 입증하였다 (도 12A 및 12B). 그러므로, 아마도 인트론-유래 에피토프의 제시에 긍정적인 영향을 미치기 위해서는 스플라이싱의 엄격한 조절이 치료에 필요할 것으로 보인다. 이러한 결과는, 이소진게틴 유도체 IP2가 천연 생성물과 동일한 방식으로 시험관 내에서 PTP-유래 항원 제시의 부스터로 작용함을 보여준다.
그 후, IP2 및 M2P2 분자를 생체 내에서 이들의 항-종양 효과에 대하여 시험하였다. 이소진게틴 처리를 사용하여 이전에 수행한 대로, 글로빈-인트론-SL8 구성물 또는 WT를 안정하게 발현하는 MCA205 육종 세포 또는 B16F10 흑색종 세포를 마우스에 피하 접종하였다. 종양 접종한 후 5, 10 및 15일 째에, 각 그룹의 마우스를 18 mg/kg의 이소진게틴, IP2 또는 M2P2로 각각 복막 내로 처리하였다. 이 용량에서, 이소진게틴 처리와 비교하여 IP2로 처리한 후에 MCA205 GI 종양 성장의 현격한 감소가 관찰된 한편, M2P2 처리의 영향은 모니터되지 않았다 (도 11C, 좌측 패널). 또한, B16F10 GI 종양 성장의 감소는 18 mg/kg의 이소진게틴 또는 IP2로 처리한 후와 유사한 한편, M2P2는 성장에 효과를 나타내지 않았다 (도 11C, 우측 패널). IP2 처리가 종양 성장을 감소시키고 수 용해성이기 때문에, 본 발명자들은 마우스에 주사된 용량을 증가시키기로 결정하였다. 증가된 용량의 IP2는 24 mg/kg에서는 MCA205 GI에 대한 이것의 항-종양 효과를 개선시키지 않았지만, 36 mg/kg에서는 B16F10 GI에 대한 항-종양 효과를 증가시켰다 (도 11C). 두드러지게, 이소진게틴 및 M2P2 처리는 MCA205 WT 또는 B16F10 WT의 종양 성장에 대해서는 영향을 미치지 않은 한편, IP2 처리는 둘 모두의 종양 성장을 늦춘다 (도 11D). 본 발명자들은 IP2가 심지어 고 용량에서도 종양 세포의 세포자멸사를 유도하지 않음을 확인하였다 (도 12C). 종국적으로, IP2 처리는 종양 접종 후 100일 째에 50% 초과의 생존을 나타내면서 마우스의 생존을 연장시키는 것으로 입증되었다 (도 11E, 하부 패널). 동시에, 이소진게틴으로 처리한 마우스의 약 30%는 여전히 살아 있었다 (도 11E, 중간 패널). M2P2 처리는 생존에 영향을 미치지 않는다 (도 11E, 상부 패널).
전체로, 이러한 결과는 시험관 내에서 관찰된 PTP-유래 항원 제시의 증가와 처리 후 생체 내에서 종양 성장의 감소 사이의 상호관련성을 입증한다. 흥미롭게도, 이소진게틴과는 반대로, IP2 처리는 PTP로부터 유래한 고도로 면역우세한 SL8 에피토프를 함유하지 않는 종양의 성장을 늦춘다. 본 발명자들은 스플라이싱 억제제 IP2가 항-종양 반응을 유도하는, 세포 표면에서의 면역우세한 에피토프의 출현을 강화시킴을 믿는다.
IP2 처리 효능은 면역-반응에 의존적이며, 장기간 지속되는 항-종양 반응을 일으킨다.
종양에 대한 IP2 효능에 대한 면역계의 그리고 특히 T-세포 반응의 요건을 결정하기 위해, 본 발명자들은 B 및 NK 세포가 아닌 T-세포가 결핍되어 있는 Nu/Nu 무흉선 누드 마우스에서 이것의 효과를 조사하였다. 이소진게틴을 사용하여 전에 시험된 대로, 글로빈-인트론-SL8 구성물 또는 WT를 안정하게 발현하는 MCA205 또는 B16F10 세포를 마우스에 피하 접종하였다. 종양 접종한 후 5, 10 및 15일 째에, 각 그룹의 마우스를 면역적격 마우스에서 관찰된 종양 성장에 대하여 가장 효율적인 용량의 IP2로 복막 내로 처리하였다. 따라서, MCA205GI, MCA205 WT 및 B16F10 GI 또는 WT 함유 마우스를 각각 18 mg/kg, 24 mg/kg 및 36 mg/kg으로 처리하였다. 각각의 조건에서, 종양 성장에 대한 IP2 처리의 영향이 관찰되지 않았다 (도 13A 및 B).
또한, IP2 효능에 대한 CD8+ T 세포의 특이적인 요건을 평가하기 위해, 본 발명자들은 마우스에서 생체 내 CD8+ T 세포 결핍(depletion)의 영향을 시험하였다. 마우스에 MCA205 GI 세포를 피하 접종한 다음, 항-CD8+ T 세포 항체로 또는 동종형 2A3으로 예정대로 처리하였다. IP2 처리물을 5, 10 및 15일 째에 이전과 같이 투여하였다. 흥미롭게도, 항-CD8+ T 세포 항체 처리는 IP2 처리의 항-종양 효과를 완전히 폐지시켰다 (도 13C). 그러므로, 이 결과는, 종양 성장에 대한 IP2 처리의 효과가 CD8+ T 세포 반응에 의존적인데, 이는 종양 세포에 대한 항원-유래 세포독성 활성을 지지함을 확증한다.
종국적으로, 전술된 대로 MCA205 GI를 접종한 후 IP2로 처리한 마우스의 약 50%는 처리 후 종양을 함유하지 않게 되었다. 첫번째 종양 접종 후 100일 째에, 이러한 마우스의 우측 옆구리에는 MCA205 GI 종양 세포를 그리고 좌측 옆구리에는 B16F10 세포를 재 접종하였다. B16F10 종양은 시간 경과에 따라 성장하였지만, MCA205 GI는 마우스에서 성장하지 않았다 (도 13D). 이러한 결과는, 마우스에서 IP2 처리 후 MCA205 GI 종양에 대하여 특이적인 장기간의 항-종양 반응이 나타났음을 입증한다.
IP2 (IP2-4Na) 처리는 확립된 종양으로부터 종양 성장을 감소시킨다.
특정 항-종양 CD8+ T 세포의 증식을 증진시킴으로써 종양 성장을 조절하는 것에 대한 특이적인 IP2 효능을 평가하기 위해, 본 발명자들은 생체 내에서 확립된 종양에 대한 IP2의 영향을 시험하였다. 글로빈-인트론-SL8 구성물을 안정하게 발현하는 MCA205 육종 종양 세포 (15.105)를 피하에 주사하고, 동일한 종양 부담을 갖는 그룹으로 정렬하고 배정하기 전에 10일까지 발달시켜서, IP2 처리를 시작하기 전에 40, 50 및 100 mm2 종양 크기의 3개 그룹을 형성시켰다. 그 후, 3 내지 4일마다, 각 그룹의 마우스를 각각 24 mg/kg의 IP2로 복막 내로 처리하였다. 이 용량에서, 시험된 그룹과는 독립적으로, 처리하지 않은 마우스와 비교하여 IP2로 처리한 후에 MCA205 GI 종양 성장의 두드러진 감소가 관찰되었다 (도 14). 심지어 종양이 100 mm2의 크기 (원)에 도달한 경우에도, 5개 용량의 24 mg/kg IP2는 처리되지 않은 마우스 (검은색 원)와 비교하여 약 30일의 생존 증가 (회색 원)와 함께 현격한 종양 퇴행을 유도할 수 있었다.
결론적으로, 면역조절제로 IP2를 사용한 이러한 모든 실험은, 이 분자가 장기간 항-종양 반응을 유도함으로써 마우스를 매우 초기에 처리한 경우에 (종양이 단지 촉진가능한 경우에 있을 때) 완전한 종양 폐기를 유도하는데 효율적임을 보여주며, IP2 처리가 또한 확립된 종양에 대한 종양 성장을 감소시킬 수 있음을 보여준다.
전체로, 이러한 결과는 항-종양 면역 반응을 긍정적으로 조절하기 위한, 특정 스플라이싱 억제제, 예컨대 이소진게틴 및 IP2의 능력을 강조하였다. 또한, 이러한 결과는, PTP-유래 항원이 시험관 내에서 그리고 생체 내에서 CD8+ T 세포에 의해 효율적으로 제시되고 인식되며 그리고, 세포 표면에서 이들의 제시에서의 질적으로 또는 양적으로의 변화가 암에 대한 CD8+ T 세포 반응을 유도할 수 있음을 확증한다.
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Figure pct00011
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Claims (14)

  1. 약물로 사용하기 위한 하기 식 (I)의 화합물:
    Figure pct00012

    상기 식에서, R1 및 R2는 독립적으로 Na, H, -CH3, -CH2-CH3, -CH2-CH=CH3, n-CH2-CH2-CH3, P(O)(O-CH2-CH3)2, P(O)(OH)2 또는 P(O)(ONa)2의 그룹으로부터 선택되고, R1, R2, R3, R4 및 R5는 동시에 H가 아니며, R2가 P(O)(ONa)2 또는 P(O)(OH)2이고 R3, R4 및 R5의 각각이 H이면 R1은 -CH3이 아니고, R2가 -CH3이고 R3, R4 및 R5의 각각이 H이면 R1은 -CH3 또는 H가 아니고;
    R3, R4 및 R5는 독립적으로 H, CH3, -CH2-CH3, -CH2-CH=CH3, 및 CnH2n +1 (이 때 n=3-10)의 그룹으로부터 선택된다.
  2. 제1항에 있어서, 화합물이
    Figure pct00013

    인, 약물로 사용하기 위한 식 (I)의 화합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 대상체에서 암의 치료에 사용하기 위한, 암 전이의 예방에 사용하기 위한 및/또는 암 재발의 예방에 사용하기 위한, 식 (I)의 화합물.
  4. 제3항에 있어서, 적어도 하나의 별개의(distinct) 항암제와 및/또는 방사선치료와 조합되는, 식(I)의 화합물.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 암이 암종, 육종, 림프종, 생식 세포 종양, 모세포종, 백혈병 및 다발성 골수종으로부터 선택되는, 식(I)의 화합물.
  6. 제5항에 있어서, 암종이 흑색종, 폐암 또는 유방암인, 식(I)의 화합물.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 별개의 항암제가 화학요법제, 면역 관문 차단제 및 항암 백신으로부터 선택되는, 식 (I)의 화합물.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항암 면역 반응 자극이 필요한 대상체에서 항암 면역 반응을 자극하기 위해 사용되는, 식 (I)의 화합물.
  9. 바람직하게는 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 사용될 적어도 하나의 별개의 항암제와 함께 제1항 또는 제2항에 기재된 식 (I)의 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 대상체에서 암의 치료에, 암 전이의 예방에 및/또는 암 재발의 예방에 사용하기 위한, 조성물.
  11. 암 세포에 의한 선구 번역 생성물(Pioneer Translation Products: PTP)-유래 항원의 제시, 전형적으로 생성 및 제시를 유도하거나 증가시키기 위한, 제1항 또는 제2항에 기재된 식 (I)의 화합물의 용도.
  12. 제3항 내지 제8항, 제9항 또는 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 포유동물, 바람직하게는 인간인, 식 (I)의 화합물 또는 조성물.
  13. 별개의 용기에 식 (I)의 화합물 및 적어도 하나의 별개의 항암제를 포함하는, 키트.
  14. 제9항, 제10항 또는 제12항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 제조하기 위한 제13항에 따른 키트의 용도.
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