KR20220004025A - 종양-선택적 병용 요법 - Google Patents

Abstract

본원에 기재된 요법은 대상체에서 다양한 상이한 암 세포 유형 및 암 상태를 대해 선택적으로 치명적일 수 있다. 본원에 기재된 병용 요법은 질환의 관리, 치료, 제어 또는 보조 치료에 유용할 수 있으며, 여기서 선택적 치사율은 특히 질환이 상승된 수준의 NQO1을 동반하는 면역요법에서 유익하다. 특히, 면역요법, 예를 들어, 체크포인트 억제제가 NQO1 생체활성화 가능한 약물과 조합되는 구현예.

Description

종양-선택적 병용 요법

우선권 주장

본 출원은 2019년 3월 18일자로 출원된 미국 가출원 일련 번호 제62/819,870호의 우선권의 이점을 주장하며, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 인용된다.

정부 지원

본 발명은 국립 보건원에 의해 수여된 계약 번호 R01 CA102792-18하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 갖는다.

I. 분야

본 개시 내용의 분야는 일반적으로 의약 화학, 의학, 종양학, 화학요법 및 면역요법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시내용은 암 치료에서 체크포인트 억제제와 조합된 NQO1-생체활성화 가능한 약물의 용도에 관한 것이다.

II. 관련 기술

항프로그램된 세포 사멸 단백질(Anti-Programmed Cell Death Protein) 1(PD-1)및 그의 리간드 프로그래밍된 사멸-리간드 1(PDL1) 모노클로날 항체는 몇개의 상이한 암 유형에 걸쳐 전례없는 내구성 반응을 입증하였고, 이들 초기 임상 성공은 암 면역요법 분야를 강조했다. PD-1과 그의 리간드 PD-L1 사이의 상호작용을 차단하면 T 세포 생존 및 증식이 증가하고 T 세포 소진이 감소하여 세포독성 T 세포 기능을 회복시켜 항종양 면역 반응을 촉진시킨다(Topalian et al., 2015; Pauken and Wherry, 2015). 불행하게도, 항-PD1/PD-L1 제제로 치료된 소수의 환자만이 내구성 반응을 갖는다(Sharma et al., 2017). 다른 체크포인트가 낮은 반응 및 재발에 기여할 수 있지만, T 세포 상의 추가의 체크포인트 차단은 반응 속도를 개선하지 않았다(Jenkins et al., 2018; Garber, 2018). 종양 미세환경 내부의 기능장애 항원 제시 세포는 T 세포의 최적의 활성화를 제한할 수 있다(Lee et al., 2009). 종양 항원은 종양 미세환경 내부에서 이용가능할 수 있지만, 항원 처리 및 제시의 적절한 활성화의 부족은 종양-특이적 T 세포가 재활성화되는 것을 제한할 수 있다.

효과적인 적응형 면역의 생성은 선천적 세포(즉, 수지상 세포 대식세포 및 자연 살해 세포)를 활성화하기 위한 위험 또는 손상 신호의 감지, 항원 처리 및 제시, I형 IFN 생산 및 T 세포의 교차 프라이밍(cross priming)을 포함하는 조정 선천적 면역 반응을 필요로 한다(Woo and Corrales, 2015). 일반적으로, 이러한 위험 또는 손상 신호는 선천적 면역 세포에 의해 발현되는 세포외 및 세포내 패턴 인식 수용체(PRR)에 의해 인식되고, 항원의 흡수를 촉진하고, 항원 제시 세포(APC)를 활성화시키고, APC와 손상된 세포 사이의 상호작용을 용이하게 한다(Takeuchi and Akira, 2010). 그러나, 정상적인 선천적 면역 반응의 이러한 중요한 특성은 종종 종양 미세환경에서 손상된다(Patel and Minn, 2018). 예를 들어, 암은 적절한 신생항원이 없거나 제시할 수 없는 종양 클론의 생존을 적극적으로 선호하고; 종양은 또한 적응형 반응을 프라이밍하기 보다는 암 염증을 촉진하는 PRR 신호 또는 기능장애 선천적 면역 세포를 선호한다(Lee et al., 2009; Hernandez et al., 2016; Grivennikov et al., 2010).

종양은 면역억제성 미세환경을 선호하는 손상된 선천적 감지를 나타내기 때문에, 체크포인트 차단을 개선하는 데 있어서 중요한 고려사항은 종양 미세환경에서 선천적 신호를 강화하는 것이다. 이 목표를 달성하기 위한 한 가지 가능한 접근법은 종양 미세환경 내에서 면역원성 세포 사멸(ICD)의 유도를 포함한다(Patel and Minn, 2018). 예를 들어, 다수의 DNA 손상 또는 DNA 복구 억제 화학요법(예: 방사선요법, 안트라사이클린 및 옥살리플라틴)은 ICD를 유발한다(Garg et al., 2017). ICD는 죽어가는 종양 세포에 의해 높은 이동성 그룹 박스 1(HMGB1) 단백질, 세포외 ATP, 세포질 칼레티큘린, 및 내인성 핵산과 같은 일련의 면역자극성 손상 관련 분자 패턴(DAMP)의 방출을 특징으로 한다(Sistigu et al., 2014). 이들 DAMP는 선천적 세포에 의해 발현되는 그들의 동족체 PRR에 의해 인식된다. 이 DAMP/PRR 신호전달은 염증성 미세환경을 변경하고/하거나 신생항원 생산을 자극하고, 현재 종양을 공격하도록 허가된 T 세포를 활성화하기 위해 APC를 유인하고 활성화시킨다(Galluzzi et al., 2015). 따라서, 면역자극 특성은 ICD-유도제가 병용 면역요법을 위한 매력적인 후보이도록 한다. 그러나, 단지 몇개의 세포독성 약물만이 ICD 유도제로서 동정되었고, 일반적인 독성, 면역 억제 특성, 및 종양 선택성의 부족은 그들의 사용을 제한한다. 따라서, "표적화된" 제제가 보다 구체적으로 선천적 감지를 증가시키고, 이어서 항-PDl/PD-Ll 치료의 이점을 확장할 수 있는지 여부를 탐색하는 것이 매우 바람직하다.

NAD(P)H:퀴논 옥시도리덕타제 1(NQO1)은 결장직장암(colorectal cancer), 폐암(lung cancer), 흑색종(melanoma), 담관암종(cholangiocarcinoma), 및 췌장암(pancreatic cancer)(Oh el al., 2016)을 포함하는 많은 인간 암(Li el al., 1995)에서 상향조절되는 세포질 2-전자 옥시도리덕타제이다. NQO1의 고수준 발현은 후기 임상 단계, 불량한 예후 및 림프절 전이와 관련이 있다(Li et al., 2015; Ma et al., 2014). β-라파콘(β-lap, 임상 형태, ARQ761)을 포함하는 NQO1 생체활성화 가능한 약물은 반응성 산소 종(ROS)을 생성하기 위해 NQO1에 의해 촉매화될 수 있는 독특한 퀴논 구조를 갖는다(Huang et al., 2016). 일반적으로, β-lap 1몰은 약 120몰의 슈퍼옥사이드를 생성하고, 약 2분 동안 약 60몰의 NAD(P)H를 소모한다(Pink et al., 2000). NQO1은 종양 세포에서 과발현되고, 과산화수소(H₂O₂) 제거 효소인 카탈라제는 종양 조직 대 정상 조직에서 손실된다(Doskey et al., 2016). 인간 암에서 높은 NQO1:카탈라제 비율은 NQO1 '생체활성화 가능한' 약물의 사용을 위한 최적의 치료 창을 제공할 수 있지만, 낮은 발현 비율은 정상 조직을 보호한다. 집중적인 종양 특이적 ROS 생산은 광범위한 산화성 DNA 병변 및 종양 선택적 세포 사멸을 유도한다(Huang et al., 2012). NQO1 생체활성화 가능한 β-lap은 복구되지 않은 DNA 손상 및 세포 사멸을 야기하고, 이종이식 모델에서 PARP1 억제제 및 방사선요법과 상승작용하는 것으로 입증되었다(Huang et al., 2016; Li et al., 2016). β-lap은 현재 단일요법으로 또는 NQO1 + 고형 종양을 갖는 환자에서 다른 화학약물과 조합하여 시험되고 있다(ClinicalTrials.gov identifiers NCT02514031 and NCT01502800). 그러나, 항종양 효능 β-lap의 평가는 주로 시험관내 및 면역결핍 마우스 모델에서 수행되었고, 개선 요법은 종종 적응형 면역에 거의 주의를 기울이지 않고 향상된 직접 종양 사멸에 초점을 맞추었다. 본 발명자들은 최근에 β-lap이 면역원성 세포 사멸(ICD)을 유발하고 숙주 TLR4/MyD88/I형 인터페론 경로 및 Batf3 수지상 세포-의존 교차 프라이밍을 활성화하여 NQO1 양성 종양에 대한 선천적 및 적응형 면역 반응을 가교하는 손상 관련 분자 패턴(DAMP) 방출을 유도한다는 것을 입증했다(Li et al., 2019). 또한, 그들은 β-lap이 종양 미세환경 내에서 선천적 감지를 유발하여 잘 확립된 종양에서 체크포인트 차단 내성을 극복한다는 것을 발견했다(Li et al., 2019). 이소부틸-데옥시니보퀴논(IB-DNQ)은 많은 고형 종양에서 과발현되는 효소인 NAD(P)H:퀴논 옥시도리덕타제(NQO1)에 대한 신규한 선택적 기질이다. IB-DNQ는 NQO1 양성 고형암을 표적으로 하는 유망하고 강력한 항암제이다(Lundberg et al., 2017).

따라서, 본 개시내용에 따르면, NQO1 생체활성화 가능한 약물을 체크포인트 억제제와 함께 투여하는 단계를 포함하는, 암 환자에서 암 세포의 성장을 사멸 또는 억제하는 방법이 제공된다. 또한, 암성 세포를 갖는 환자에서 암 세포의 성장을 사멸 또는 억제하기 위한 약제의 제조를 위한, 제2 제제와 조합된 NQO1 생체활성화 가능한 약물의 용도가 제공되고, 여기서 상기 제2 제제는 체크포인트 억제제이고, 상기 약제는 유효 치사량 또는 억제량의 NQO1 생체활성화 가능한 약물 및 체크포인트 억제제를 포함한다. 또한, 암 환자의 치료에 있어서, 제2 제제와 조합된 NQO1 생체활성화 가능한 약물의 용도가 제공되며, 여기서 상기 제2 제제는 체크포인트 억제제이다. 상기 방법은 화학요법, 방사선요법, 면역요법, 독소 요법 또는 수술과 같은 추가의 항암 요법을 추가로 포함할 수 있다.

암 세포는 DNA 복구 과정의 결함에 기인하여 염기 절단 복구(BER) 결함 또는 취약성을 가질 수 있다. BER 결함 또는 취약성은 X-선 교차 상보성 1 또는 XRCC1 유전자/단백질/효소의 결함 수준을 포함할 수 있다. NQO1 생체활성화 가능한 약물은 소분자 체크포인트 억제제 또는 항체 체크포인트 억제제와 조합하여 사용될 수 있다. NQO1 생체활성화 가능한 약물은 PD-1 또는 CTLA-4의 억제제와 조합하여 사용될 수 있다. NQO1 생체활성화 가능한 약물은 β-라파콘 또는 DNQ 화합물일 수 있다. 상기 방법은 추가의 화학요법제 또는 방사선요법을 추가로 포함할 수 있다. 암 세포는 상승된 수준의 NQO1을 가질 수 있다. 암 세포는 고형 종양의 형태일 수 있다. 상기 암 세포는 비소세포 폐암 세포, 전립선암 세포, 췌장암 세포, 유방암 세포, 두경부암 세포 또는 결장암 세포일 수 있다.

NQO1 생체활성화 가능한 약물은 다음과 같을 수 있다:

또는 이의 염 또는 용매화물. NQO1 생체활성화 가능한 약물은 DNQ 또는 DNQ-87일 수 있다.

NQO1 생체활성화 가능한 약물은 체크포인트 억제제 전에, 체크포인트 억제제 이후에, 또는 체크포인트 억제제와 동시에 투여될 수 있다. NQO1 생체활성화 가능한 약물은 1회 이상 투여될 수 있다. 체크포인트 억제제는 1회 이상 투여될 수 있다. NQO1 생체활성화 가능한 약물 및 체크포인트 억제제는 모두 1회 이상 투여될 수 있다.

당업자는 구체적으로 예시된 것들 이외의 출발 물질, 생물학적 물질, 시약, 합성 방법, 정제 방법, 분석 방법, 검정 방법, 및 생물학적 방법이 과도한 실험에 의존하지 않고 본 개시내용의 실시에 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 임의의 이러한 물질 및 방법의 모든 기술 분야 공지된 기능적 등가물은 본 개시내용에 포함되도록 의도된다.

사용된 용어 및 표현은 설명의 관점에서 제한 없이 사용되고, 이러한 용어 및 표현의 사용에서, 제시되고 기재된 특징 또는 이의 일부의 임의의 등가물을 배제할 의도는 없지만, 청구된 개시내용의 범위 내에서 다양한 변형이 가능하다는 것이 인식된다.

따라서, 본 개시내용이 특정 구현예 및 임의의 특징에 의해 구체적으로 개시되었지만, 본원에 개시된 개념의 변형 및 변경이 당업자들에 의해 재분류될 수 있고, 이러한 변형 및 변경이 첨부된 청구범위에 의해 정의된 바와 같은 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 간주된다고 이해되어야 한다.

다음 도면은 명세서의 일부를 형성하고, 본 발명의 특정 구현예 또는 다양한 측면을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 일부 예에서, 본 발명의 구현예는 본원에 제시된 상세한 설명과 함께 첨부되는 도면을 참조함으로써 가장 잘 이해될 수 있다. 상세한 설명 및 첨부 도면은 특정의 구체적인 예, 또는 본 발명의 특정 측면을 강조할 수 있다. 그러나, 당업자는 실시예 또는 측면의 일부가 본 발명의 다른 실시예 또는 측면과 조합하여 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
도 1a-j. NQO1 생체활성화 가능한 약물 β-lap은 시험관내 및 생체내에서 NQO1-의존 방식으로 뮤린 종양 세포를 사멸시킨다. (도 1a) 48-웰 플레이트에서 성장된 NQO1 양성 종양 세포주 MC38, TC-1 및 Ag104Ld 및 NQO1 음성 세포주 Panc02 및 B16을 β-lap(0 내지 8μM)으로 3시간 동안 처리하고, 이어서 세척하고 배지를 교체하였다. 세포 생존력은 4일 후에 설포로다민 B(SRB) 검정으로 결정되었다. (도 1b) MC38, TC-1 및 Ag104Ld 세포를 4μM β-lap ± 디쿠마롤(DIC, 50μM)에 3시간 동안 노출시키고, 4일 후에 세포 생존을 평가하였다. (도 1c) 96-웰 플레이트에 주입된 CRISPR 기반 NQO1 녹아웃(knockout)(MC38 NQO1KO #5)이 있는 MC38 세포를 3시간 동안 β-lap에 노출시키고 48시간 후에 세포 생존을 평가하였다. (도 1d) 96 웰 플레이트에 주입된 pCMV-NQO1 발현 벡터(B16 NQO1#1)를 신선하지 않게 보유하는 B16 세포를 3시간 동안 β-lap ± 디쿠마롤(DIC, 50μM)에 노출시키고 48시간 후에 생존을 평가하였다. (도 1e) MC38 세포를 표시된 시간 동안 치사량의 β-lap(4μM)에 노출시킨 다음, 7-AAD 및 아넥신 V로 염색한 후 유세포 분석을 수행했다. (f-g) MC38 세포(도 1f) 또는 B16 및 B16 NQO1#1 세포(도 1g)를 β-lap ± 디쿠마롤(DIC, 50μM)에 3시간 동안 노출시킨 후, DCFDA 세포 ROS 검정에 의해 ROS 수준을 결정하였다. (도 1h) MC38 및 B16 NQO1#1 세포를 3시간 동안 β-lap에 노출시켰다. 카탈라제(1000U/ml)를 첨가하고, 48시간 후에 세포 생존을 평가하였다. (도 1i) C57BL/6 마우스(n=5/그룹)에 MC38 세포를 이식하고 β-lap(0.03mg, 0.1mg 또는 0.3mg, 종양내; 또는 25mg/kg, i.v.)으로 격일로 4회 처리하였다. (도 1j) C57BL/6 마우스에 MC38 세포(NQO1 WT 또는 KO, n=5/그룹)를 이식하고 β-lap(0.3mg, i.t.)으로 격일로 4회 처리하였다. 종양 성장은 일주일에 두 번 모니터링했다. 데이터는 2 내지 3개의 독립적인 실험에서 평균 ± SEM으로 표시된다. ^**P < 0.01, ^***P < 0.001, ^****P < 0.0001은 짝을 이루지 않은 스튜던트 t-테스트(도 1f, 도 1g 및 도 1h) 또는 2원 ANOVA(도 1i 및 도 1j)에 의해 결정된다.
도 2a-f. β-Lap의 항종양 효과는 CD8 ⁺ T 세포 의존적이다. (도 2a) MC38 세포를 C57BL/6 WT(n=5-6/그룹) 및 Rag1 KO 마우스(n=5/그룹)에 각각 피하 이식하였다. 종양 보유 마우스를 β-lap(0.3mg, i.t.)으로 격일로 4회 처리하였다. 치료 후 종양 부재 마우스의 수를 표시했다. (도 2b) MC38 종양 보유 C57BL/6 마우스(n=5/그룹)를 β-lap(0.3mg, i.t.)으로 격일로 4회 처리하였다. CD8⁺ T 세포 고갈을 위해, 200㎍의 항-CD8 항체를 치료 동안 3일 간격으로 4회 복강내 주사하였다. (도 2c) TC-1 종양 보유 C57BL/6 마우스(n=4-5/그룹)를 항-CD8 항체의 존재 또는 부재하에 β-lap(0.1mg, i.t.)으로 4회 처리하였다. (도 2d) 나이브(n=5/그룹) 및 β-lap 치료된 MC38 종양 부재(n=7/그룹) C57BL/6 마우스는 완전 거부 30일 후에 원발성 종양의 반대 부위에 3 x 10⁶ MC38 세포를 피하 재도전하고, 종양 성장 곡선을 모니터링했다. (도 2e) 2×10⁶ A549 세포를 C57BL/6 Rag1^-/- 마우스(비히클 및 β-lap의 경우 n=5/그룹; 비히클 + OT-1 및 β-lap + OT-1의 경우 n=7/그룹)에 피하 주사했다. 30일 후, 마우스는 OT-1 유전자도입 마우스의 2x10⁶ 림프절 세포로 i.v. 입양 형질감염시켰다. 다음 날, 종양 보유 마우스를 β-lap(0.2mg)으로 격일로 4회 종양내 처리하였다. (도 2f) A549 세포를 NSG-SGM3(n=5/그룹) 또는 인간 CD34⁺ 조혈 줄기 세포(Hu-NSG 비히클의 경우 n=5/그룹, Hu-NSG β-lap의 경우 n=6/그룹)를 보유하는 NSG-SGM3에 피하 주사하였다. 종양 보유 마우스를 β-lap(0.2mg, i.t.)으로 격일로 4회 처리하였다. 종양 성장은 일주일에 두 번 측정하였다. 데이터는 3개의 독립적인 실험에서 평균 ± SEM으로 표시된다. ^**P < 0.01, ^***P < 0.001, ^****P < 0.0001은 2원 ANOVA에 의해 결정된다.
도 3a-e. Batf3-의존 수지상 세포 매개된 T 세포 교차 프라이밍은 β-lap의 항종양 효과에 필요하다. (도 3a) MC38 종양 보유 C57BL/6 마우스(n=5/그룹)를 β-lap(0.3mg, i.t.)으로 격일로 3회 처리하고, 첫 번째 치료 후 10일째에 비장으로부터 림프구를 단리시키고, 배지 또는 60Gy로 조사된 MC38 세포로 자극하였다. (도 3b) MC38-OVA 종양 보유 마우스(n=4/그룹)는 β-lap(0.3mg, i.t.)으로 격일로 3회 처리하고, 첫 번째 치료 후 10일째에 비장으로부터 림프구를 단리시키고, 2.5㎍/ml의 OT-1 펩티드로 자극하였다. IFNγ 생산 세포를 ELISPOT 검정에 의해 결정하였다. (도 3c) MC38 종양 보유 C57BL/6 마우스(n=5/그룹)는 β-lap(0.3mg, i.t.)으로 격일로 4회 처리하였다. 항-CSF1R Ab 100㎍을 치료 동안 3일 간격으로 3회 종양내 주사하였다. (도 3d) MC38 세포를 C57BL/6 WT(n=5/그룹) 및 Batf3^-/- 마우스(Batf3^-/- 비히클의 경우 n=5/그룹; Batf3^-/- β-lap의 경우 n=6/그룹)에 각각 피하 이식하였다. 종양 보유 마우스를 β-lap(0.3mg, i.t.)으로 격일로 4회 처리하였다. 종양 성장은 일주일에 두 번 모니터링했다. (도 3e) MC38-OVA 보유 마우스(n=3/그룹)는 β-lap(0.3mg, i.t.)으로 1회 처리하고, 4일 후, 종양 배수 림프절로부터 CD11c⁺ 수지상 세포를 정제하고, OT-1 유전자도입 마우스의 비장에서 단리된 CD8 T 세포와 공동 배양하였다. T 세포의 교차 프라이밍 활성은 혈구계산 비드 어레이(CBA) 마우스 IFNγ 검정을 통해 세포 분비된 IFNγ의 수준에 의해 결정되었다. 데이터는 3개의 독립적인 실험에서 평균 ± SEM으로 표시된다. ^**P < 0.01, ^***P < 0.001, ^****P < 0.0001은 짝을 이루지 않은 스튜던트 t-테스트(도 3a, 3b 및 3e) 또는 2원 ANOVA(도 3c 및 3d)에 의해 결정된다.
도 4a 내지 f. I형 IFN 및 TLR4/MyD88/신호전달은 β-lap 및 종양 특이적 CTL의 항종양 효과에 필요하다. (도 4a) MC38 종양 보유 C57BL/6 마우스(n = 5/그룹)를 β-lap(0.3mg, i.t.)으로 격일로 4회 처리하였다. 항-IFNAR 차단 항체(150μg, i.t.)를 치료 동안 4일 마다 3회 투여하였다. (도 4b) MC38 종양 보유 WT(n=5/그룹) 및 Ifnar1^-/-(n=4/그룹) C57BL/6 마우스를 β-lap(0.3mg, i.t.)으로 격일로 4회 처리하였다. (도 4c) MC38 종양 보유 WT(n=5/그룹) 및 Myd88^-/-(n=3/그룹) C57BL/6 마우스를 β-lap(0.3mg, i.t.)으로 격일로 4회 처리하였다. (도 4d) MC38 종양 보유 WT(n=5/그룹) 및 Tlr4^-/-(n=4/그룹) C57BL/6 마우스를 β-lap(0.3mg, i.t.)으로 격일로 4회 처리하였다. (도 4e) MC38 종양 보유 C57BL/6 마우스(n=5/그룹)를 β-lap(0.3mg, i.t.)으로 격일로 4회 처리하였다. 항-HMGB1 중화 항체(200μg, i.p)를 치료 동안 3일 마다 3회 투여하였다. 종양 성장을 일주일에 두 번 모니터링했다. (도 4f) MC38 종양 보유 WT(n=4/그룹) 또는 Tlr4^-/-(n=4/그룹) 또는 MyD88-/-(n=6/그룹) C57BL/6 마우스를 β-lap(0.3mg, i.t.)으로 격일로 4회 처리하였다. 항-HMGB1 중화 항체(200μg, i.p)를 치료 동안 3일 마다 3회 투여하였다. 초기 치료 12일 후, TdLN으로부터 림프구를 단리시키고 60Gy로 조사된 MC38 종양 세포로 자극하였다. IFNγ 생성 세포는 ELISPOT 검정에 의해 결정되었다. 데이터는 2~3개의 독립적인 실험에서 평균 ± SEM으로 표시된다. ^*P < 0.05, ^**P < 0.01, ^***P < 0.001, ^****P < 0.0001은 2원 ANOVA에 의해 결정된다.
도. 5a-f. β-Lap 치료 유도 HMGB1 방출은 종양 면역원성을 향상시키고 생체내에서 항종양 T 세포 면역을 유발한다. (도 5a) MC38, TC-1 및 B16(NQO null 및 과발현 클론)을 3시간 동안 β-lap으로 처리한 후 세척하고 배지를 교체하였다. 배양 상청액으로 방출된 HMGB1의 수준은 24시간 후 ELISA에 의해 결정되었다. (도 5b) 도 5c 및 5d의 β-lap-유도된 사멸 종양 세포로부터 종양 특이적 항원의 생체내 교차-제시를 위한 연구 도식. (도 5c-d) 살아있는 또는 β-lap-유도된 사멸 MC38-OVA 세포를 항-HMGB1 항체와 함께 또는 없이 WT 또는 Tlr4^-/- C57BL/6(n=3-4/그룹) 마우스의 옆구리에 피하 접종하였다. 5일 후, 종양 배수 림프 모드 세포를 수집하고, OVA 단백질, OT-1 펩티드 또는 조사된 MC38-OVA 세포로 48시간 동안 재자극하였다. IFNγ 생산 세포는 ELISPOT 검정(도 5c)에 의해 결정되었고, IFNγ 분비 수준은 CBA 마우스 IFNγ 검정(도 5d)에 의해 정량화되었다. (도 5e) 도 5f의 면역원성 백신 검정을 위한 연구 도식. (도 5f) 시험관내에서 β-lap으로 처리된 MC38-OVA 세포를 항-HMGB1 항체와 함께 또는 없이 C57BL/6 마우스(n=5-7/그룹)의 옆구리에 피하 접종하였다. 7일 후, 마우스는 반대쪽 옆구리에 주사하여 살아있는 MC38-OVA 세포로 재도전했다. 재도전된 종양 부재 마우스의 백분율이 표시되었다. 데이터는 적어도 2 내지 3개의 독립적인 실험에서 평균 ± SEM으로 표시된다. ^*P < 0.05, ^**P < 0.01, 및 ^***P < 0.001은 2원 ANOVA(도 5c 및 도 5d) 또는 로그 순위 테스트(도 5f)에 의해 결정된다.
도. 6a-h. β-Lap은 항-PD-L1 요법과 조합하여 대규모 확립된 및 체크포인트 차단 불응성 종양을 근절한다. (도 6a) 도 6b 및 도 6c의 국소 β-lap 치료 기반 병용 요법에 대한 치료 도식. (도 6b-c) MC38 종양 세포를 C57BL/6 마우스(n=5/그룹)의 옆구리에 피하 접종하였다. 작은 종양(약 50mm³, b) 또는 진행성 종양(약 150-200mm³, 도 6c)을 보유하는 마우스를 항-PD-L1 기반 체크포인트 차단의 존재 또는 부재하에 4회 β-lap(0.3mg, i.t.)으로 국소 처리하였다. 종양 성장은 일주일에 두 번 모니터링하고, 치료 후 종양 부재 마우스의 수를 표시했다. (도 6d) 도 6e 및 도 6f의 전신적 β-lap 치료 기반 병용 요법에 대한 치료 도식. (도 6e) MC38 종양 세포를 C57BL/6 마우스(n=5-8/그룹)의 옆구리에 피하 접종하였다. 종양 보유 마우스(약 50-100mm³)는 항-PD-L1 기반 체크포인트 차단의 존재 또는 부재하에 β-lap(30mg/kg, i.p.)으로 6회 전신 처리하였다. 종양 성장은 일주일에 두 번 모니터링하고, 치료 후 종양 부재 마우스의 수를 표시했다. (도 6f) 도 6e의 조합 치료를 받은 MC38 종양 보유 마우스에 대한 생존 곡선. (도 6g, 도 6h) MC38-OVA 종양(약 150mm³, n=4/그룹)을 보유한 C57BL/6 마우스를 β-lap(0.3mg, i.t.)으로 격일로 4회, 또는 항-PD-L1(100μg, i.p.)로 3회 단독으로 또는 조합하여 국소 처리하였다. 첫 번째 치료 12일 후, 종양 침윤성 CD45⁺ 세포 및 림프구를 유세포 분석법으로 분석하고(도 6g), 비장에서 OT-1 항원 특이적 T 세포를 IFNγ ELISPOT 검정에 의해 결정했다(도 6h). 데이터는 2 내지 3개의 독립적인 실험에서 평균 ± SEM으로 표시된다. ^*P < 0.05, ^**P < 0.01, ^***P < 0.001, ^****P < 0.0001은 2원 ANOVA(도 6b, 도 6c, 도 6e, 도 6g 및 도 6h) 또는 로그 순위 테스트(도 6f)에 의해 결정된다.
도 7. NQO1 생체활성화 가능한 약물에 의한 개선된 표적화 요법을 위한 항종양 면역 반응의 활성화를 위한 제안된 모델.
도. 8a-e. β-lap은 종양 특이적 ROS를 유도하고 카스파제 독립적인 프로그램된 괴사를 유발한다. (도 8a) 다중 뮤린 종양주에서 NQO1 발현을 지시된 바와 같이 면역블롯팅하였다. (도 8b) NQO1⁺ 세포(MC38, TC-1 및 Ag104Ld) 및 NQO1^- 세포(B16 및 Pan02)를 β-lap ± DIC(50μM)로 3시간 동안 처리했다. 약물을 제거하고 5일 후 생존을 평가했다. (도 8c) 상대적 H₂O₂ 수준은 CellRox-Glo를 사용하여 표시된 투여량에서 3시간 동안 β-lap으로 처리된 다양한 세포에서 평가하였다. 값은 DMSO 처리된 대조군 세포에 대해 정규화되었다. (도 8d) 12시간 동안 β-lap에 TC-1 세포 노출 후 PARP-1 및 카스파제-3 수준을 웨스턴 블롯팅 검정에 의해 분석하였다. (도 8e) 12시간 동안 β-lap(4μM)에 대한 TC-1 세포 노출 사진.
도. 9a-b. β-lap의 항종양 기능은 CD8 ⁺ 에 의존하지만 CD4 ⁺ , T 세포에는 의존하지 않는다. (도 9a) C57BL/6 WT 또는 rag-/- 마우스(n = 5/그룹)에 6 x 10⁵ MC38 세포를 피하(s.c.) 접종하고, 9일, 12일 및 15일째에 0.3mg의 β-lap 또는 비히클로 종양내(i.t.) 처리했다. (도 9b) MC38 종양을 보유하는 C57BL/6 마우스를 상기 지시된 바와 같이 β-lap으로 처리하였다. CD4-고갈(클론 GK1.5) 또는 CD8-고갈(클론 2.43) 항체(200μg)를 8일째부터 시작하여 주 2회 복강내 투여했다. 종양 성장을 주 2회 측정했다. ^*P < 0.05, ^**P < 0.01, ^***P < 0.001, ^****P < 0.0001은 2원 ANOVA에 의해 결정된다.
도. 10a-c. β-Lap은 STING 의존적 DNA 감지 및 I형 IFN 신호전달에 의존하는 종양 퇴행을 유도한다. (도 10a) C57BL/6 WT 마우스(n=5/그룹)에 6 x 10⁵ MC38 세포를 피하(s.c.) 접종하고, 14일, 16일, 18일 및 20일째에 0.1mg의 β-lap 또는 비히클로 종양내(i.t.) 처리했다. 항-IFNAR 차단 Ab(150μg)를 13일째에 시작하여 주 2회 복강내 투여하였다. (도 10b-c) C57BL/6 WT IFNAR^-/- 또는 STING^mut/mut 마우스(n=5/그룹)에 MC-38 세포를 피하(s.c.) 접종하고, 9일, 12일 및 15일째에 0.3mg의 β-lap 또는 비히클로 종양내(i.t.) 처리하였다. ^*P < 0.05, ^**P < 0.01, ^***P < 0.001, ^****P < 0.0001은 2원 ANOVA에 의해 결정된다.
도. 11a-d. β-Lap 유도 호중구 침윤은 항종양 면역 반응에 기여한다. (도 11a-b) 3일 β-lap 치료 후 MC38(도 11a) 또는 TC-1(도 11b) 종양 조직으로부터 단일 세포를 수행하였다. 이어서, CD11b+ Gr1+ 세포의 빈도를 유세포 분석법으로 분석했다. (도 11c-d) C57BL/6 WT 마우스(n=5/그룹)에 6 x 10⁵ MC38(도 11_C) 또는 1 x 10⁵ TC-1(도 11d) 세포를 피하(s.c.) 접종하고, 9일, 12일 및 15일째에 0.3(mg)의 β-lap 또는 비히클로 종양내(i.t.) 처리했다. 항-Ly6G 차단 Ab(200㎍)는 8일째에 시작하여 일주일에 2회 복강내 투여했다. 종양 성장은 일주일에 두 번 모니터링했다. 데이터는 2 내지 3개의 독립적인 실험에서 평균 ± SEM으로 표시된다. ^**P < 0.01, ^***P < 0.001, ^****P < 0.0001은 2원 ANOVA에 의해 결정된다.
도. 12a-b. 저용량의 β-Lap은 면역 체크포인트 차단(항-PD-L1) 요법과 상승작용을 한다. (도 12a) C57BL/6J WT 마우스(n=5/그룹)에 6 x 10⁵ MC38 세포를 피하(s.c.) 접종하고, 3일 마다 4회 주사로 항-PD-L1(아테졸리주맙)의 존재 또는 부재하에 비히클 또는 0.1mg의 β-Lap으로 종양내(i.t.) 처리하였다. 종양 용적이 > 100mm³일 때 치료를 시작했다. 100㎍의 항-PD-L1(클론 10F.9G2) 또는 이소형 대조군 항체(클론 LTF-2)를 β-Lap 치료 하루 전에 복강내(i.p.) 주사하였다. (도 12b) 동일한 MC38 종양 보유 마우스를 3일 마다 6회 주사로 항-PD-L1(아테졸리주맙)의 존재 또는 부재하에 비히클 또는 30mg/kg의 β-Lap으로 복강내(i.p.) 처리하였다. 종양 용적이 > 50mm³일 때 치료를 시작했다. 종양 직경은 일주일에 두 번 캘리퍼스로 측정했다. 종양 용적은 평균 ± SD로 표시된다. ^*p < 0.05, ^**p < 0.01, ^***P < 0.001.
도. 13a-b. 낮은 투여량의 β-lap에 의한 피하 뮤린 암의 방사선 감작. (도 13a) C57BL/6J WT 마우스(n=5/그룹)에 6 x 10⁵ MC38 세포를 피하(s.c.) 접종하고, 3일 마다 3회 주사로 IR의 존재 또는 부재하에 비히클, IR(10Gy) 또는 0.1mg의 β-lap으로 종양내(i.t.) 처리했다. 종양 용적이 > 100mm³일 때 치료를 시작했다. (도 13b) 동일한 MC38 종양 보유 마우스를 격일로 6회 주사로 IR의 존재 또는 부재하에 비히클 IR(10Gy) 또는 30mg/kg의 β-Lap으로 복강내(i.p.) 처리하였다. 종양 용적이 > 50mm³일 때 치료를 시작했다. β-lap 치료 전에 IR이 제공되었다. 종양 직경은 캘리퍼스로 일주일에 두 번 측정했다. 종양 용적은 평균 ± SD로 표시된다. ^*p < 0.05, ^**p < 0.01, ^***P < 0.001.
도. 14a-h. IB-DNQ는 NQO1-의존 방식으로 뮤린 암 세포를 사멸하고 NAD+/ATP 고갈과 DNA 손상을 유도한다. (도 14a-c) NQO1⁺ 세포 MC38(a) 및 TC-1(b) 및 NQO1^- 세포 B16(c)을 다양한 투여량의 IB-DNQ ± DIC(50μM)로 2시간 동안 처리하였다. 약물을 제거하고 6일 후 생존을 평가했다. (도 14d) 다중 뮤린 종양주에서 NQO1 발현을 지시된 바와 같이 면역블롯팅하였다. (도 14e-f) 2시간 동안 다양한 투여량의 IB-DNQ에 노출된 TC-1 세포에서 상대적 NAD⁺(e) 또는 ATP(f) 수준을 평가하였다. 값은 DMSO 처리된 대조군 세포에 대해 정규화되었다. (도 14g-h) 60분 동안 IB-DNQ(0.25μM)에 대한 TC-1 세포 노출, 세포를 알칼리성 코멧 검정(alkaline comet assays)을 사용하여 전체 DNA 병변에 대해 평가했다(도 14g). 코멧 꼬리 길이(a.u.)는 지정된 시간에 모니터링되었고; DSB는 표시된 시간에 면역형광법을 사용하여 γH2AX 병소/핵에 의해 정량화되었다(도 14h). 그래프는 도 14a-c, 도 14e 및 도 14f의 3회 실험으로부터의 평균 ± SD이다. 스튜던츠 t 테스트를 수행했다. ^*p < 0.05, ^**p < 0.01, ^***P < 0.001.
도. 15a-b. IB-DNQ는 적응형 면역 시스템에 따라 종양 퇴행을 유도한다. (도 15a) C57BL/6J WT 또는 rag-/- 마우스(n=5/그룹)에 6 x 10⁵ MC38 세포를 피하(s.c.) 접종하고, 10일, 12일, 14일 및 16일째에 0.15mg의 IB-DNQ 또는 비히클로 종양내(i.t.) 처리했다. (도 15b) C57BL/6J WT 또는 rag-/- 마우스(n=5/그룹)에 1 x 10⁵ TC-1 세포를 피하(s.c.) 접종하고, 10일, 12일, 14일 및 16일째에 0.15mg의 IB-DNQ 또는 비히클로 종양내(i.t.) 처리했다. 종양 직경은 캘리퍼스로 일주일에 두 번 측정하였다. 종양 용적은 평균 ± SD로 표시된다. ^*p < 0.05, ^**p < 0.01, ^***P < 0.001.
도. 16a-b. IB-DNQ는 면역 체크포인트 차단(항 PD-L1) 요법과 상승작용을 한다. C57BL/6J WT 마우스(n=5/그룹)에 6 x 10⁵ MC38 세포를 피하(s.c.) 접종하고, 10일, 13일, 16일 및 19일째에 비히클, 항-PD-L1(아테졸리주맙) 또는 항-PD-L1을 갖거나 갖지 않는 0.05mg의 IB-DNQ로 종양내(i.t.) 처리하였다. 100㎍의 항-PD-L1(클론 10F.9G2) 또는 이소형 대조군 항체(클론 LTF-2)를 9일째부터 시작하여 3일 마다 복강내(i.p.) 주사했다. 종양 직경은 일주일에 두 번 캘리퍼스로 측정되었다. 종양 용적이 1000mm³에 도달하면 마우스를 희생시켰다. (도 16a) 대표적인 마우스 종양 용적(평균 ± SD). (도 16b) 카플란-마이어 생존 곡선. ^*p < 0.05, ^**p < 0.01, ^***P < 0.001.
도 17a-i(도 1a-j와 관련됨). NQO1 생체활성화 가능한 약물 β-lap은 시험관내 및 생체내에서 NQO1 의존적 방식으로 뮤린 종양 세포를 사멸시킨다. (도 17a) 상이한 뮤린 암 세포주에서의 NQO1 발현은 웨스턴 블롯팅 검정에 의해 결정되었다. (도 17b) CRISPR 기반 NQO1 녹아웃을 갖는 MC38 세포의 상이한 클론에서의 NQO1 발현은 웨스턴 블롯팅 검정에 의해 결정되었다. (도 17c) MC38 세포(NQO1 WT 또는 KO)를 3시간 동안 β-lap으로 처리한 후 세척하고 새로운 배지로 교체하였다. 세포 생존력은 48시간 후 설포로다민 B(SRB) 검정에 의해 결정되었다. (도 17d) pCMV-NQO1 발현 벡터를 안정적으로 보유하는 B16 세포의 상이한 클론에서의 NQO1 발현은 웨스턴 블롯팅 검정에 의해 결정되었다. (도 17e, 도 17f) B16 세포(NQO1 null 또는 안정한 과발현)를 3시간 동안 디쿠마롤(DIC, 50μM)의 존재 또는 부재하에 β-lap으로 처리한 후 세척하고 배지를 교체하였다. 세포 생존력은 48시간 후 SRB 검정에 의해 결정되었다. (도 17g) NQO1 과발현 B16 세포(클론 #3 및 #4)를 3시간 동안 β-lap에 노출시켰다. 카탈라제(1000U/ml)를 첨가하고 48시간 후에 세포 생존력을 평가하였다. (도 17h) C57BL/6 마우스(n=5/그룹)에 TC-1 세포를 이식하고, β-lap(0.1 또는 0.3mg)으로 격일로 4회 종양내 처리하였다. 종양 성장을 일주일에 두 번 모니터링했다. (도 17i) C57BL/6 마우스(n=4/그룹)에 부모 B16 세포(NQO1 null) 또는 NQO1 안정한 과발현 B16 세포(클론 #1 및 #4)를 이식하고, β-lap(0.3mg, i.t.)으로 격일로 4회 처리하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. ^**P < 0.01, ^***P < 0.001, ^****P < 0.0001은 짝을 이루지 않은 스튜던트 t-테스트(도 17g) 또는 2원 ANOVA(도 17h 및 도 17i)에 의해 결정된다.
도 18a-d(도 2a-f에 대해). β-Lap 매개 항종양 효과는 면역 매개 사멸에 의존한다. (도 18a) B16 NQO1 #1 세포를 C57BL/6 WT 및 Rag1KO 마우스(n=5/그룹)에 각각 피하 이식하였다. 종양 보유 마우스를 β-lap(0.3mg, i.t.)으로 격일로 4회 처리하였다. (도 18b) β-lap 치료 7일 후 종양 미세환경에서 면역세포의 변화. C57BL/6 마우스(n=4/그룹)에 MC38 세포를 이식하고, 0.3mg의 β-lap으로 2회 종양내 처리하였다. 마지막 치료 7일 후, 종양 조직을 제거하고 소화시키고, 면역 세포를 유세포 분석기로 분석했다(짝을 이루지 않은 스튜던트 t-테스트를 사용하여 변화의 유의성을 분석했다, ^*P < 0.05, ^**P < 0.01). (도 18c) C57BL/6 마우스에 MC38 세포를 이식하고 β-lap(0.3mg, i.t.)으로 격일로 4회 처리하였다. T 세포 고갈을 위해, 200㎍의 항-CD4 또는 항-CD8 항체를 치료 동안 3일 간격으로 4회 주사하였다. (도 18d) 48웰 플레이트에서 성장된 NQO1 양성 인간 폐 암종주 A549를 β-lap(0-6μM) ± 디쿠마롤(DIC, 50μM)에 3시간 동안 노출시키고, 4일 후 세포 생존을 SRB 검정으로 평가하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다.
도 19a-c(도 4a-f와 관련됨). β-lap의 항종양 효과에 TLR4/MyD88 경로는 필요하지만 TLR9 신호전달은 필요하지 않다. (도 19a-b) MC38-OVA 보유 마우스를 β-lap(0.3mg, i.t.)으로 2회 처리하였다. 6일 후, 단일 세포 소화(도 19a) 및 RNA 추출(도 19b) 둘 다를 위해 종양 조직을 수집하였다. (도 19a) 현탁된 세포 상청액으로부터 분비된 IFNβ를 24시간 배양 후 ELISA로 측정하였다. (도 19b) IFNα1, IFNγ, TNFα 및 CXCL10의 mRNA 수준은 실시간 PCR 검정에 의해 결정되었다. (도 19c) MC38 세포를 Myd88^-/-, Tlr4^-/- 및 Tlr9^-/- C57BL/6 마우스에 각각 이식하였다. 이어서, 종양 보유 마우스는 β-lap(0.3mg, i.t.)으로 격일로 4회 처리하였다. 종양 성장은 일주일에 두 번 모니터링했다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. ^*P < 0.05, ^**P < 0.01, ^***P < 0.001은 짝을 이루지 않은 t-테스트에 의해 결정된다.
도 20a-f(도 6a-h와 관련됨). 국소 및 전신 β-lap 치료는 모두 항-PD-L1 면역 체크포인트 차단과 상승작용을 할 수 있다. (도 20a) MC38 종양 세포는 C57BL/6 마우스(n=5/그룹)의 옆구리에 피하 접종했다. 진행성 종양(약 150-200mm³)을 보유하는 마우스를 3회 항-PD-L1 기반 체크포인트 차단(100μg, i.p.)의 존재 또는 부재하에 β-lap(0.3mg, i.t.)으로 4회 국소 처리했다. 종양 성장은 주 2회 모니터링하였고, 각 그룹의 개체 마우스의 성장 곡선을 나타내었다. (도 20b) MC38 종양 세포는 C57BL/6 마우스(n=5/그룹)의 옆구리에 피하 접종했다. 진행성 종양(약 100mm³)을 보유하는 마우스는 PD-L1 기반 체크포인트 차단의 존재 또는 부재하에 낮은 투여량의 β-lap(0.1mg, i.t.)으로 4회 국소 처리했다. (도 20c, 도 20d) MC38 종양 보유 마우스(약 50-100mm³, n=5-8/그룹)를 PD-L1 기반 체크포인트 차단의 존재 또는 부재하에 β-lap(30mg/kg, ip)으로 6회 전신 처리하였다. 종양 성장(도 20c) 및 체중(도 20d)을 주 2회 모니터링하였다. 각 그룹의 개체 마우스의 성장 곡선이 표시되었다. (도 20e, 도 20f) 안정한 NQO1 과발현을 갖는 B16 세포(혼합 클론 #1, #3 및 #4)는 C57BL/6 마우스에 피하 접종했다. 종양 보유 마우스(약 100mm³)를 3회 항-PD-L1 기반 체크포인트 차단(150μg, i.p.)의 존재 또는 부재하에 β-lap(0.3mg, i.t.)으로 4회 국소 처리했다. 치료 도식을 나타내었고(도 20e), 종양 성장 곡선을 모니터링하였다(도 20f). 데이터는 적어도 2개의 독립적인 실험에서 평균 ± SEM으로 표시된다. ^*P < 0.05, ^**P < 0.01, ^***P < 0.001, ^****P < 0.0001은 2원 ANOVA에 의해 결정된다.
도. 21a-f. IB-DNQ는 집중적인 종양 특이적 ROS 생산과 광범위한 DNA 손상을 통해 NQO1 ⁺ 종양 세포 사멸을 선택적으로 유도한다. (도 21a) 4시간 동안 IB-DNQ 치료 후 뮤린 세포주의 생존력. TC-1, Ag104Ld 및 MC38 세포는 내인성 NQO1을 발현하는 반면, Pan02 및 B16 세포는 NQO1에 대해 무효이다. (도 21b) 4시간 동안 IB-DNQ 치료 후 NQO1 KO(MC38 NQO1^-/-) 및 NQO1 과발현(B16 NQO1⁺) 세포의 생존력. (도 21c) IB-DNQ에 1시간 노출 후 MC38 세포에서의 ROS 수준. (도 21d-e) 코멧 검정(도 21d) 및 γH2AX 병소/핵 면역형광법(도 21e)을 통해 DNA 이중 가닥 파손을 평가하였다. (도 21f) IB-DNQ에 4시간 노출 후 MC38 세포 사멸은 유세포 분석을 사용하여 7AAD 및 아넥신 V 염색에 의해 결정되었다. (도 21a), (도 21b) 데이터는 3개의 독립적인 실험(6회 반복/각 실험)에서 평균 ± SD로 표시되고; (도 21c-f) 데이터는 3개의 독립적인 실험에서 평균 ± SD로 표시된다. 통계 분석은 짝을 이루지 않은 스튜던츠 양측 t 테스트를 사용하여 수행되었다. ^*P < 0.05; ^**P < 0.01; ^***P < 0.001; NS, 유의하지 않다.
도. 22a-f. IB-DNQ 매개 항종양 효과는 면역계와 관련이 있다. 6 x 10⁵ MC38 또는 8 x 10⁵ MC38 NQO1 KO 세포를 Rag1^-/-, C57BL/6 및 NSG 마우스에 각각 피하 이식했다(n=5/그룹). 종양 보유 마우스는 종양 용적이 50mm³에 도달한 후 IB-DNQ(12mg/kg, i.t.) 또는 20% HPβCD(비히클)로 격일로 4회 처리하였다. 종양 용적 및 생존을 평가하였다. (도 22a) WT C57BL/6 및 NSG 마우스에서 MC38의 종양 용적. (도 22b) MC38 종양-보유 WT C57BL/6 및 NSG 마우스의 생존 곡선. (도 22c-d) WT C57BL/6 및 Rag1^-/- 마우스에서 각각 MC38 및 TC-1의 종양 용적. (도 22e-f) C57BL/6 마우스에서 MC38 및 MC38 NQO1 KO 모델의 종양 용적 및 생존 분석. 데이터는 적어도 2개의 독립적인 실험에서 평균 ± SD로 표시된다. 통계 분석은 짝을 이루지 않은 스튜던트 양측 t 테스트를 사용하여 수행되었다. ^*P < 0.05; ^**P < 0.01; ^***P < 0.001; NS, 유의하지 않다.
도. 23a-d. IB-DNQ 매개 항종양 효과는 종양 미세환경에 영향을 미친다. 6 x 10⁵ MC38 세포를 C57BL/6 마우스(n=3/그룹)에 피하 이식했다. 종양 용적이 50mm³에 도달한 후 종양 보유 마우스를 IB-DNQ(12mg/kg, i.t.) 또는 비히클로 격일로 4회 처리하였다. 종양은 마지막 IB-DNQ 주사 후 24시간 후에 수집되었다. (도 23a) 비히클 및 IB-DNQ 처리된 종양으로부터의 종양-침윤성 면역 세포의 유세포 분석. (도 23b) 비히클 및 IB-DNQ 처리된 종양으로부터의 면역 집단의 정량화. (도 23c) IB-DNQ의 존재/부재하에 T 세포 증식. CFSE로 표지된 비장세포를 4시간 동안 치사량 IB-DNQ로 처리한 다음, 세척하고 항-CD3(1μg/ml) 및 항-CD28(2μg/ml)로 48시간 동안 자극한 후, 증식성 CD8 T 세포를 유세포 분석 검정에 의해 분석했다. (도 23d) T 세포에 대한 IB-DNQ의 효과. 나이브(n=3/그룹) 및 종양 보유(n=3/그룹) 마우스의 비장세포를 4시간 동안 상이한 농도의 IB-DNQ에 노출시킨 후 세척하고 배지를 교체했다. 24시간 후, 세포 사멸을 유세포 분석으로 분석했다. 동일한 치료를 한 Ag104 세포를 대조군으로 사용했다. 데이터는 두개의 독립적인 실험에서 평균 ± SD로 표시된다. 통계 분석은 짝을 이루지 않은 스튜던츠 양측 t 테스트를 사용하여 수행되었다. ^*P < 0.05; ^**P < 0.01; NS, 유의하지 않다.
도. 24a-f. CD8 ⁺ 및 CD4 ⁺ T 세포는 IB-DNQ 매개 항종양 효과에 중요하다. 6 x 10⁵ MC38 세포를 C57BL/6 마우스(n=5/그룹)에 피하 이식했다. 종양 용적이 50mm³에 도달한 후 종양 보유 마우스를 IB-DNQ(12mg/kg, i.t.) 또는 비히클로 격일로 4회 처리하였다. CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포 고갈을 위해, 항-CD4 및/또는 CD8⁺ 항체 200μg을 치료 동안 3일 간격으로 3회 복강내 주사했다. (도 24a-b) IB-DNQ ± 항-CD4 항체의 존재/부재하에 처리된 MC38-보유 마우스의 종양 용적 및 생존 분석. (도 24c-d) IB-DNQ ± 항-CD8 항체의 존재/부재하에 처리된 MC38-보유 마우스의 종양 용적 및 생존 분석. (도 24e-f) IB-DNQ ± 항-CD4 및 항-CD8 항체의 존재/부재하에 처리된 MC38-보유 마우스의 종양 용적 및 생존 분석. 데이터는 적어도 2개의 독립적인 실험에서 평균 ± SD로 표시된다. 통계 분석은 짝을 이루지 않은 스튜던츠 양측 t 테스트를 사용하여 수행되었다. ^*P < 0.05; ^**P < 0.01; ^***P < 0.001; NS, 유의하지 않다.
도. 25a-e. IB-DNQ는 종양 ICD 및 수지상 세포 매개 T 세포 교차 프라이밍을 유도한다. (도 25a) IB-DNQ 치료 후 세포 배양 상청액으로 방출된 HMGB1의 수준. MC38, MC38 NOQ1^-/-, B16 및 B16 NOQ1⁺ 세포를 4시간 동안 IB-DNQ로 처리한 후 배지를 교체하고 24시간 동안 성장시키고 배양 상청액을 수집하고 HMGB1 수준을 ELISA로 결정했다. (도 25b-c) IFN-α 및 IFN-β의 상대적 발현. 종양 샘플은 도 23a와 동일한 것들이었고, 총 RNA 추출은 제조사의 지시에 따라 수행하였고, cDNA로 역전사한 후 qPCR을 수행하였다. (도 25d-e) IFN-γ-지시된 T 세포 반응. 6 × 10⁵ MC38 또는 8×10⁵ MC38-OVA 세포를 C57BL/6 마우스(n=3/그룹)에 이식했다. 종양이 50mm³에 도달한 후, 마우스를 IB-DNQ 또는 비히클로 격일로 4회 처리하고, 마지막 투여 후 24시간 후, 종양-보유 마우스로부터 단리된 비장세포를 배지 또는 60Gy로 조사된 MC38 세포(도 25d) 또는 OT-1(도 25e)로 자극하였다. 데이터는 적어도 2개의 독립적인 실험에서 평균 ± SD로 표시된다. 통계 분석은 짝을 이루지 않은 스튜던츠 양측 t 테스트를 사용하여 수행되었다. ^*P < 0.05; ^**P < 0.01; ^***P < 0.001.
도. 26a-h. IB-DNQ는 고전적인 면역학적 기억 대신 선천적 면역 기억을 유도한다. 나이브(n=5/그룹) 및 IB-DNQ-치료된 MC38 종양 부재(n =7/그룹) C57BL/6 마우스는 완전 거부 60일 후에 원발성 종양의 반대쪽 부위에 3 x 10⁶ MC38 세포로 피하 재도전했다. 이러한 종양 부재 마우스의 기관은 종양이 다시 근절된 지 30일 후에 수집되었다. (도 26a-b) MC38 모델의 종양 용적 및 생존 분석. (도 26c-d) 상이한 기관에서의 기억 CD8⁺ T 세포(도 26c) 및 CD4⁺ T 세포(도 26d). (도 26e) 림프절(LN)의 CD44⁺ DC. (도 26f) 종양 부재(TF) 또는 종양 보유 마우스의 LN으로부터의 DC를 IB-DNQ(1μM)에 의해 유도된 항원으로 5시간 동안 자극한 다음, DC 상의 CD44 발현을 평가하였다. (도 26g) TF 또는 종양 보유 마우스의 비장에서 분리된 CD8⁺ T 세포를 CFSE로 표지하고 IB-DNQ(1μM)에 의해 유도된 항원과 48시간 동안 공동 배양하였다. T 세포 증식은 유세포 분석에 의해 결정되었다. (도 26h) CFSE 표지된 비장세포는 항원, 항-CD3(1㎍/ml) 및 항-CD28(2㎍/ml) 자극의 존재하에 TF 또는 종양-보유 마우스의 LN으로부터의 세포와 48시간 동안 공동 배양하였다. T 세포 증식은 유세포 분석에 의해 결정하였다. 데이터는 3개의 독립적인 실험에서 평균 ± SD로서 표시된다. 통계 분석은 짝을 이루지 않은 스튜던츠 양측 t 테스트를 사용하여 수행되었다. ^*P < 0.05; ^**P < 0.01; ^***P < 0.001; NS, 유의하지 않다.
도. 27a-b. IB-DNQ 치료 후 TME에서 PD-L1 상향조절. 6 x 10 ⁵ MC38 세포를 C57BL/6 마우스(n=5/그룹)에 피하 이식했다. 종양 보유 마우스는 종양 용적이 50mm³(소형) 또는 150mm³(대형)에 도달한 후 IB-DNQ(12mg/kg, i.t.) 또는 비히클로 격일로 4회 처리했다. (도 27a-b) 작은 종양(도 27a) 또는 진행성 종양(도 27b)을 마지막 IB-DNQ 주사 후 24시간 후에 수집하였다. CD45⁺ 면역 세포 또는 CD45^- 종양 세포에서 PD-L1 단백질 수준은 유세포 분석에 의해 측정하였다. 통계 분석은 짝을 이루지 않은 스튜던츠 양측 t 테스트를 사용하여 수행되었다. ^*P < 0.05; NS, 유의하지 않다.
도. 28a-f. IB-DNQ와 항 PD-L1의 병용 요법은 체크포인트 차단 내성을 극복한다. (도 28a-d) 소형(50mm³, 적색 선) 또는 진행성(150mm³, 파란색 선) MC38 종양을 보유하는 마우스는 IB-DNQ(12mg/kg, i.v.) 또는 비히클로 격일로 4회 주사로 처리하거나(도 28a-b), 또는 mIgG 또는 항-PD-L1로 3회 주사로 처리하였다(도 28c-d). (도 28e-f) MC38 종양 보유 마우스(150mm³)를 IB-DNQ, 항-PD-L1 또는 IB-DNQ+ 항-PD-L1로 격일로 4회 주사로 처리하였고, 비히클은 mIgG 또는 HPβCD였다. 종양 용적(도 28a, 28c 및 28e) 및 전체 생존(도 28b, 28d 및 28f)을 측정하였다. 종양 성장은 일주일에 두 번 측정하였다. 데이터는 3개의 독립적인 실험에서 평균 ± SD로 표시된다. 카플란-마이어 생존 곡선은 Prism 8 소프트웨어에 의해 전체 생존에 대해 정의되었다. ^*P < 0.05, ^**P < 0.01, ^***P < 0.001은 2원 ANOVA에 의해 결정되고, NS, 유의하지 않다.

본 발명자들의 이전 연구는 NQO1 생체활성화 가능한 약물(β-lap 및 IB-DNQ)이 광범위한 DNA 손상 및 PARP1-구동 종양 프로그램된 괴사를 유도하는 동시에 면역결핍 마우스에서 종양 억제를 유도할 수 있음을 밝혔다. 이러한 NQO1 생체활성화 가능한 약물의 치사량 이하의 용량의 효능을 증가시키기 위한 전략은 강력한 화학요법 또는 방사선요법 섭생 내에서 효능을 증가시키기 위해 추구된다. 여기서, 본 발명자들은 호중구-매개 선천적 면역 및 CD8-매개 적응형 면역 시스템이 모두 자극되어 면역적격 마우스에서 NQO1 생체활성화 가능한 약물의 더욱 효과적인 항종양 효과를 유도한다는 것을 보여준다. 그들은 또한 NQO1 생체활성화 가능한 약물이 면역원성 세포 사멸(ICD)을 유발하고 손상 관련 분자 패턴(DAMP) 방출 및 식세포/APC(항원 제시 세포) 모집을 유도할 수 있으며, 이는 또한 항원/DNA 흡수 및 I형 인터페론(IFN) 생산을 통한 종양 성장 억제를 위한 세포독성 T 세포(CTL)의 교차 프라이밍을 촉진한다(도 7)는 것을 나타냈다. 이 연구는 종양-특이적 반응성 산소 종(ROS) 및 NQO1 생체활성화 가능한 약물에 의해 유도된 DNA 손상이 항종양 면역을 자극할 수 있는 방법 및 이러한 반응의 활성화가 종양 표적화 요법 효능을 향상시킬 수 있는지 여부를 보여준다. T 세포 체크포인트 차단과 같은 적응형 면역을 활성화시키는 접근법과 NQO1 생체활성화 가능한 약물의 조합은 지속적인 효능 및 환자 이점을 제공할 것이다. 본 개시내용의 이들 및 다른 측면이 아래에서 상세히 제시된다.

I. 정의

일반적으로, 본원에서 사용된 용어 및 구는 당해 기술 분야에서 인식된 의미를 가지며, 이는 표준 텍스트, 저널 참조문헌 및 당업자에게 공지된 문맥을 참조하여 찾을 수 있다. 이러한 기술 분야에서 인식된 의미는 문헌(참조: Hawley's Condensed Chemical Dictionary 14^th Edition, by R.J. Lewis, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 2001)과 같은 기술 사전을 참조하여 얻을 수 있다.

BER, 염기 절제 복구; SSBR, 단일 가닥 파손 복구; DSBR, 이중 가닥 파손 복구.

단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "화합물"에 대한 언급은 복수의 이러한 화합물을 포함하여, 화합물 X는 복수의 화합물 X를 포함한다. 또한, 청구범위는 임의의 요소를 배제하도록 초안을 작성할 수 있음에 유의한다. 이와 같이, 이 진술은 청구 요소의 인용 또는 "부정적인" 제한의 사용과 관련하여 "단독", "오직" 등과 같은 배타적 용어의 사용에 대한 선행 근거로 기능하도록 의도된다.

용어 "및/또는"은 항목 중 어느 하나, 항목의 임의의 조합, 또는 이 용어가 관련된 모든 항목을 의미한다. 어구 "하나 이상"은, 특히 그의 사용 문맥에서 판독될 때 당업자에 의해 쉽게 이해된다. 예를 들어, 페닐 환 상의 하나 이상의 치환체는, 예를 들어, 페닐 환이 이치환되는 경우, 1 내지 5개, 또는 1 내지 4개를 지칭한다.

용어 "약"은 명시된 값의 ± 5%, ± 10%, ± 20%, 또는 ± 25%의 변화를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서 "약 50"%는 45 내지 55%의 변화를 수반할 수 있다. 정수 범위에 대해, 용어 "약"은 상기 범위의 각 단부에서 인용된 정수보다 크고/크거나 작은 하나 또는 2개의 정수들을 포함할 수 있다. 본원에서 달리 지시되지 않는 한, 용어 "약"은 개별 성분, 조성물 또는 구현예의 기능성 면에서 등가인 인용된 범위에 근접한 값, 예를 들어, 중량%를 포함하도록 의도된다.

당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 성분의 양, 특성, 예를 들어, 분자량, 반응 조건 등을 나타내는 것들을 포함하는 모든 숫자는 근사치이며, 모든 경우에 용어 "약"에 의해 임의로 변형되는 것으로 이해된다. 이들 값은 본원 설명의 교시를 이용하여 당업자가 얻고자 하는 목적하는 특성에 따라 변할 수 있다. 또한, 이러한 값은 본질적으로 그들 각각의 시험 측정에서 발견되는 표준 편차로 인해 필연적으로 발생하는 가변성을 함유하는 것으로 이해된다.

본 발명은 많은 상이한 형태를 취할 수 있지만, 본 발명의 원리에 대한 이해를 촉진하기 위해, 이제 도면에 예시된 구현예를 참조할 것이며, 특정 언어를 사용하여 동일한 것을 기재할 것이다. 그럼에도 불구하고, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되지 않는 것으로 이해될 것이다. 기재된 구현예의 임의의 변경 및 추가 변형 및 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 원리의 임의의 추가 적용은 본 발명이 관련된 기술 분야의 숙련자에게 일반적으로 발생하는 바와 같이 고려된다.

치환체의 그룹이 본원에 개시되어 있는 경우, 그 그룹의 모든 개별 구성원 및 그룹 구성원의 임의의 이성체, 거울상 이성체 및 부분입체 이성체를 포함하는 모든 하위 그룹이 별도로 개시되는 것으로 이해된다. 마쿠시(Markush) 그룹 또는 다른 그룹화가 본원에서 사용될 때, 그룹의 모든 개별 구성원 및 그룹의 가능한 모든 조합 및 하위 조합은 본 개시내용에 개별적으로 포함되도록 의도된다. 화합물의 특정 이성체, 거울상 이성체 또는 부분입체 이성체가, 예를 들어, 화학식 또는 화학명으로 명시되지 않도록 화합물이 본원에 기재된 경우, 그 설명은 개별적으로 또는 임의의 조합으로 기재된 화합물의 각각의 이성체 및 거울상 이성체를 포함하도록 의도된다. 추가로, 달리 명시되지 않는 한, 본원에 개시된 화합물의 모든 동위원소 변이체는 본 개시내용에 포함되는 것으로 의도된다. 예를 들어, 개시된 분자 내의 임의의 하나 이상의 수소는 중수소 또는 삼중수소로 대체될 수 있음이 이해될 것이다. 분자의 동위원소 변이체는 일반적으로 분자에 대한 검정 및 분자 또는 이의 용도와 관련된 화학적 및 생물학적 연구의 표준으로 유용하다. 이러한 동위원소 변이체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 화합물의 구체적인 명칭은, 당업자가 동일한 화합물을 다르게 명명할 수 있음이 공지되어 있기 때문에, 예시적인 것으로 의도된다.

범위가 명세서에 제공될 때마다, 예를 들어, 온도 범위, 시간 범위, 탄소 쇄 범위, 조성 또는 농도 범위, 모든 중간 범위 및 하위 범위뿐만 아니라 주어진 범위에 포함된 모든 개별 값은 개시내용에 개별적으로 포함되도록 의도된다. 설명에 포함된 범위 또는 하위 범위 내의 임의의 하위 범위 또는 개별 값은 본 발명의 구현예에서 임의로 제외될 수 있음이 이해될 것이다.

본원에 사용된 바와 같이, "포함하는(comprising)"은 "포함하는(including)", "함유하는(containing)" 또는 "~에 의해 특성화되는(characterized by)"과 동의어이며, 포괄적이거나 개방형이며, 추가의 인용되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 본원에 사용된 바와 같이, "~로 구성되는"은 청구항 요소에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 본원에 사용된 바와 같이, "본질적으로 ~로 구성되는"은 청구범위의 기본적이고 신규한 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 재료 또는 단계를 배제하지 않는다. 본원에서 각각의 경우에, "포함하는", "본질적으로 ~로 구성되는" 및 "~로 구성되는"이라는 용어 중 임의의 것은 다른 두 용어 중 하나로 대체될 수 있다. 본원에 적절하게 예시적으로 기재된 본 발명은 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부재하에 실시될 수 있다.

"화학요법제"는 암 세포, 암 세포의 집단, 종양 또는 기타 악성 조직의 성장, 증식 또는 확산을 감소시키거나 예방할 수 있는 임의의 물질을 지칭한다. 상기 용어는 또한 임의의 항종양제 또는 항암제를 포함하는 것으로 의도된다.

대상체 치료 방법과 관련하여 화합물의 "치료적 유효량"은 목적하는 투여 섭생의 일부로서 (인간과 같은 포유동물에게) 투여될 때 치료할 장애 또는 상태 또는 미용 목적에 대한 임상적으로 허용되는 표준에 따라, 예를 들어, 임의의 의학적 치료에 적용할 수 있는 합리적인 이익/위험 비율로 증상을 완화하거나, 상태를 개선하거나, 질환 상태의 발병을 늦추는 제제 내 화합물(들)의 양을 지칭한다.

용어 "치료하는", "치료하다" 및 "치료"는 (i) 질환, 병리학적 또는 의학적 상태가 발생하는 것을 예방함(예: 예방); (ii) 질환, 병리학적 또는 의학적 상태를 억제하거나 이의 발병을 저지함; (iii) 질환, 병리학적 또는 의학적 상태를 완화시킴; 및/또는 (iv) 질환, 병리학적 또는 의학적 상태와 관련된 증상을 감소시킴을 포함한다. 따라서, 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은 예방으로 확장될 수 있고, 치료되는 상태 또는 증상의 진행 또는 중증도를 예방함, 예방, 예방하는, 저하시키는, 중지시키는 또는 역전시키는 것을 포함할 수 있다. 이와 같이, 용어 "치료"는 적절하게 의학적, 치료적 및/또는 예방적 투여를 포함할 수 있다. 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 대상체의 상태를 개선하거나 안정화하는 방식으로 상태의 증상, 임상 징후 및 근본적인 병리를 역전, 감소 또는 정지시키는 것을 포함할 수 있다.

용어 "억제하다", "억제하는" 및 "억제"는 질환, 감염, 상태 또는 세포 그룹의 성장 또는 진행을 둔화, 정지 또는 역전시키는 것을 지칭한다. 억제는, 예를 들어, 치료 또는 접촉의 부재하에 발생하는 성장 또는 진행과 비교하여 약 20%, 40%, 60%, 80%, 90%, 95%, 또는 99% 초과일 수 있다.

용어 "접촉하는"은, 예를 들어, 용액 내, 반응 혼합물 내, 시험관내, 또는 생체내에서 생리학적 반응, 화학적 반응, 또는 물리적 변화를 일으키는 세포 또는 분자 수준을 포함하여 만지거나, 접촉하거나, 또는 즉각적이거나 근접하게 만드는 작용을 지칭한다.

용어 "노출시키는"은 당업계에서 광범위하게 이해되는 바와 같은 정의를 포함하도록 의도된다. 하나의 구현예에서, 상기 용어는 작용, 영향, 또는 조건에 적용되거나 적용되도록 하는 것을 의미한다. 예를 들어, 그리고 단지 예로서, 세포는 화학요법제의 약제학적으로 허용되는 형태의 치료적 유효량의 작용, 영향 또는 상태에 적용될 수 있다.

용어 "암 세포"는 당업계에서 광범위하게 이해되는 정의를 포함하는 것으로 의도된다. 하나의 구현예에서, 상기 용어는 인간 또는 동물에서 암의 임상 상태에 기여할 수 있는 비정상적으로 조절된 세포를 지칭한다. 하나의 구현예에서, 상기 용어는 배양된 세포주 또는 인간 또는 동물 신체 내의 또는 유래된 세포를 지칭할 수 있다. 암 세포는 당업계에서 이해되는 바와 같이 매우 다양한 분화된 세포, 조직 또는 기관 유형일 수 있다.

용어 "종양"은 전형적으로 다수의 응집된 악성 세포를 포함하는 덩어리인 신생물을 지칭한다.

하기 그룹은 본원에 기재된 화학식에서 적절하게 R 그룹 또는 브릿징 그룹일 수 있다.

용어 "알킬"은 바람직하게는 1 내지 30개의 탄소 원자를 갖는 모노라디칼 분지형 또는 비분지형 포화 탄화수소 쇄를 지칭한다. 짧은 알킬 그룹은 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸 및 헥실 그룹을 포함하는 1 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 것들이며, 이들의 모든 이성체를 포함한다. 긴 알킬 그룹은 12 내지 30개의 탄소 원자를 갖는 것들이다. 상기 그룹은 말단 그룹 또는 브리징 그룹일 수 있다.

알킬, 헤테로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 및 헤테로사이클 그룹, 및 이의 사이클릭 및/또는 불포화 버전은 화학식 I의 R 그룹일 수 있고, 각 그룹은 임의로 치환될 수 있다.

용어 "치환된"은 "치환된"을 사용하는 표현에 표시낸 그룹 상의 하나 이상의 수소 원자가 "치환체"로 대체된다는 것을 나타낸다. '하나 이상의'로 지칭되는 수는 치환체가 존재하는 잔기로부터 명백할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상은, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6; 일부 구현예에서는 1, 2 또는 3; 다른 구현예에서는 1 또는 2를 지칭할 수 있다. 치환체는 표시된 그룹의 선택 중 하나일 수 있거나, 또는 당업자에게 공지된 적합한 그룹일 수 있고, 단 치환된 원자의 정상적인 원자가는 초과되지 않고, 치환은 안정한 화합물을 초래한다. 적합한 치환체 그룹은, 예를 들어, 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 할로, 할로알킬, 하이드록시, 하이드록시알킬, 아릴, 아로일, (아릴)알킬(예: 벤질 또는 페닐에틸), 헤테로아릴, 헤테로사이클, 사이클로알킬, 알카노일, 알콕시카르보닐, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 트리플루오로메틸, 트리플루오로메톡시, 트리플루오로메틸티오, 디플루오로메틸, 아실아미노, 니트로, 카복시, 카복시알킬, 케토, 티옥소, 알킬티오, 알킬설피닐, 알킬설포닐, 아릴설피닐, 아릴설포닐, 헤테로아릴설피닐, 헤테로아릴설포닐, 헤테로사이클설피닐, 헤테로사이클설포닐, 포스페이트, 설페이트, 하이드록실 아민, 하이드록실 (알킬)아민 및 시아노를 포함한다. 또한, 적합한 치환체 그룹은, 예를 들어, -X, -R, -O^-, -OR, -SR, -S^-, -NR₂, -NR₃, =NR, -CX₃, -CN, -OCN, -SCN, -N=C=O, -NCS, -NO, -NO₂, =N₂, -N₃, -NC(=O)R, -C(=O)R, -C(=O)NRR, -S(=O)₂O^-, -S(=O)₂OH, -S(=O)₂R, -OS(=O)₂OR, -S(=O)₂NR, -S(=O)R, -OP(=O)O₂RR, -P(=O)O₂RR, -P(=O)(O^-)₂, -P(=O)(OH)₂, -C(=O)R, -C(=O)X , -C(S)R, -C(O)OR, -C(O)O-, -C(S)OR, -C(O)SR, -C(S)SR, -C(O)NRR , -C(S)NRR, 또는 -C(NR)NRR일 수 있고, 여기서 각각의 X는 독립적으로 할로겐("할로"): F, Cl, Br, 또는 I이고; 각각의 R은 독립적으로 H, 알킬, 아릴, (아릴)알킬(예: 벤질), 헤테로아릴, (헤테로아릴)알킬, 헤테로사이클, 헤테로사이클(알킬), 또는 보호 그룹이다. 당업자에 의해 용이하게 이해되는 바와 같이, 치환체가 케토(=O) 또는 티옥소(=S) 등인 경우, 치환된 원자 상의 2개의 수소 원자가 대체된다. 일부 구현예에서, 상기 치환체 중 하나 이상은 치환된 그룹 상의 치환체에 대한 잠재적 값의 그룹으로부터 제외될 수 있다.

용어 "헤테로알킬"은 그 자체로 또는 다른 용어와 조합하여, 달리 언급되지 않는 한, 종종 적어도 하나의 탄소 원자 및 O, N, P, Si 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자를 포함하여 2 내지 14개의 탄소 또는 2 내지 10개의 탄소를 쇄에 갖는 안정한 직쇄 또는 분지쇄, 또는 사이클릭 탄화수소 라디칼, 또는 이들의 조합을 의미하고, 여기서 질소 및 황 원자는 임의로 산화될 수 있고, 질소 헤테로원자는 임의로 4급화될 수 있다. 헤테로원자(들) O, N, P 및 S 및 Si는 헤테로알킬 그룹의 임의의 내부 위치 또는 알킬 그룹이 분자의 나머지에 부착되는 위치에 위치될 수 있다. 헤테로알킬 그룹은, 예를 들어, 쇄에 1 내지 약 20개의 탄소 원자를 가질 수 있다. 예에는 --CH₂--CH₂--O--CH₃, --CH₂--CH₂--NH--CH₃, --CH₂--CH₂--N(CH₃)--CH₃, --CH₂--S--CH₂--CH₃, --CH₂--CH₂--S(O)--CH₃, --CH₂--CH₂--S(O)₂--CH₃, --CH=CH--O--CH₃, --Si(CH₃)₃, --CH₂-CH=N--OCH₃, --CH=CH--N(CH₃)--CH₃, O--CH₃, --O--CH₂--CH₃, 및 --CN을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 헤테로알킬 그룹의 추가 예는 알킬 에테르, 2차 및 3차 알킬 아민, 아미드, 알킬 설파이드 등을 포함한다. 그룹은 말단 그룹 또는 브리징 그룹일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 브릿징 그룹의 맥락에서 사용될 때 쇄에 대한 언급은 브릿징 그룹의 2개의 말단 위치를 연결하는 원자의 직접 쇄를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "알콜"은 수소 원자에서 1개의 하이드록실 그룹으로 치환된 C_1-12 알킬 부분을 포함하는 알콜로서 정의될 수 있다. 알콜은 에탄올, n-프로판올, i-프로판올, n-부탄올, i-부탄올, s-부탄올, t-부탄올, n-펜탄올, i-펜탄올, n-헥산올, 사이클로헥산올, n-헵탄올, n-옥탄올, n-노난올, n-데칸올 등을 포함한다. 알콜의 탄소 원자는 직선형, 분지형 또는 사이클릭일 수 있다.

"아실"은 알킬-CO- 그룹으로 정의될 수 있고, 여기서 알킬 그룹은 본원에 기재된 바와 같다. 아실의 예에는 아세틸 및 벤조일이 포함된다. 알킬 그룹은 C₁-C₆ 알킬 그룹일 수 있다. 상기 그룹은 말단 그룹 또는 브릿징(즉, 2가) 그룹일 수 있다.

"알콕시"는 -O-알킬 그룹을 지칭하고, 여기서 알킬은 본원에서 정의된다. 바람직하게는, 알콕시는 C₁-C₆알콕시이다. 예에는 메톡시 및 에톡시가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 상기 그룹은 말단 그룹 또는 브리징 그룹일 수 있다.

그룹 또는 그룹의 일부로서 "알케닐"은 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 함유하는 지방족 탄화수소 그룹을 나타내고, 이는 정상 쇄에 바람직하게는 2 내지 14개의 탄소 원자, 더욱 바람직하게는 2 내지 12개의 탄소원자, 가장 바람직하게는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지형일 수 있다. 상기 그룹은 정상 쇄에 다수의 이중 결합을 함유할 수 있고, 각각에 대한 배향은 독립적으로 E 또는 Z이다. 예시적인 알케닐 그룹은 에테닐, 프로페닐, 부테닐, 펜테닐, 헥세닐, 헵테닐, 옥테닐 및 노네닐을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 상기 그룹은 말단 그룹 또는 브릿징 그룹일 수 있다.

그룹 또는 그룹의 일부로서 "알키닐"은 탄소-탄소 삼중 결합을 함유하는 지방족 탄화수소 그룹으로서 정의될 수 있으며, 이의 쇄는 정상 쇄에 바람직하게는 2 내지 14개의 탄소 원자, 더욱 바람직하게는 2 내지 12개의 탄소 원자, 더욱 바람직하게는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지형일 수 있다. 예시적인 구조는 에티닐 및 프로피닐을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 상기 그룹은 말단 그룹 또는 브릿징 그룹일 수 있다.

"알케닐옥시"는 알케닐이 본원에 정의된 바와 같은 -O-알케닐 그룹을 지칭한다. 바람직한 알케닐옥시 그룹은 C₁-C₆ 알케닐옥시 그룹이다. 상기 그룹은 말단 그룹 또는 브릿징 그룹일 수 있다.

"알키닐옥시"는 알키닐이 본원에 정의된 바와 같은 -O-알키닐 그룹을 지칭한다. 바람직한 알키닐옥시 그룹은 C₁-C₆ 알키닐옥시 그룹이다. 상기 그룹은 말단 그룹 또는 브릿징 그룹일 수 있다.

"알콕시카르보닐"은 알킬이 본원에 정의된 바와 같은 -C(0)--O-알킬 그룹을 지칭한다. 알킬 그룹은 바람직하게는 C₁-C₆ 알킬 그룹이다. 예는 메톡시카르보닐 및 에톡시카르보닐을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 상기 그룹은 말단 그룹 또는 브릿징 그룹일 수 있다.

"알킬설피닐"은 알킬이 상기 정의된 바와 같은 -S(0)-알킬 그룹으로 정의될 수 있다. 알킬 그룹은 바람직하게는 C₁-C₆ 알킬 그룹이다. 예시적인 알킬설피닐 그룹은 메틸설피닐 및 에틸설피닐을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 상기 그룹은 말단 그룹 또는 브릿징 그룹일 수 있다.

"알킬설포닐"은 알킬이 상기 정의된 바와 같은 -S(0)₂-알킬 그룹을 지칭한다. 알킬 그룹은 바람직하게는 C₁-C₆ 알킬 그룹이다. 예는 메틸설포닐 및 에틸설포닐을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 상기 그룹은 말단 그룹 또는 브릿징 그룹일 수 있다.

"아미노"는 -NH₂를 지칭하고, "알킬아미노"는 -NR₂를 지칭하며, 여기서 적어도 하나의 R은 알킬이고, 두 번째 R은 알킬 또는 수소이다. 용어 "아실아미노"는 RC(=O)NH-를 지칭하며, 여기서 R은 알킬 또는 아릴이다. 알킬 그룹은, 예를 들어, C₁-C₆ 알킬 그룹일 수 있다. 예에는 메틸아미노 및 에틸아미노가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 상기 그룹은 말단 그룹 또는 브릿징 그룹일 수 있다.

"알킬아미노카르보닐"은 알킬아미노가 상기 정의된 바와 같은 알킬아미노-카르보닐 그룹을 지칭한다. 상기 그룹은 말단 그룹 또는 브릿징 그룹일 수 있다.

"사이클로알킬"은 종종 환당 3 내지 약 9개의 탄소를 함유하는 3 내지 약 30개의 탄소 원자의 포화된 또는 부분적으로 포화된, 모노사이클릭 또는 융합된 또는 스피로 폴리사이클릭, 카르보사이클, 예를 들어, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로옥틸 등을 지칭한다. 그것은 모노사이클릭 시스템, 예를 들어, 사이클로프로필 및 사이클로헥실, 바이사이클릭 시스템, 예를 들어, 데칼린, 및 폴리사이클릭 시스템, 예를 들어, 아다만탄을 포함한다. 상기 그룹은 말단 그룹 또는 브릿징 그룹일 수 있다.

"사이클로알케닐"은 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 함유하고, 바람직하게는 환당 5 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 비방향족 모노사이클릭 또는 다중사이클릭 환 시스템으로 정의될 수 있다. 예시적인 모노사이클릭 사이클로알케닐 환은 사이클로펜테닐, 사이클로헥세닐 또는 사이클로헵테닐을 포함한다. 사이클로알케닐 그룹은 하나 이상의 치환체 그룹에 의해 치환될 수 있다. 상기 그룹은 말단 그룹 또는 브릿징 그룹일 수 있다.

알킬 및 사이클로알킬 그룹은 다른 그룹의 알킬 부분 상의 치환체, 예를 들어, 제한 없이, 알콕시, 알킬 아민, 알킬 케톤, 아릴알킬, 헤테로아릴알킬, 알킬설포닐 및 알킬 에스테르 치환체 등일 수 있다. 상기 그룹은 말단 그룹 또는 브릿징 그룹일 수 있다.

"사이클로알킬알킬"은 사이클로알킬-알킬-그룹으로서 정의될 수 있으며, 여기서 사이클로알킬 및 알킬 부분은 이전에 기재된 바와 같다. 예시적인 모노사이클로알킬알킬 그룹은 사이클로프로필메틸, 사이클로펜틸메틸, 사이클로헥실메틸 및 사이클로헵틸메틸을 포함한다. 상기 그룹은 말단 그룹 또는 브릿징 그룹일 수 있다.

"헤테로사이클로알킬"은 적어도 하나의 환에 질소, 황, 산소로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자, 바람직하게는 1 내지 3개의 헤테로원자를 함유하는 포화된 또는 부분적으로 포화된 모노사이클릭, 바이사이클릭 또는 폴리사이클릭 환을 지칭한다. 각각의 환은 바람직하게는 3 내지 10원, 더욱 바람직하게는 4 내지 7원이다. 적합한 헤테로사이클로알킬 치환체의 예는 피롤리딜, 테트라하이드로푸릴, 테트라하이드로티오푸라닐, 피페리딜, 피페라질, 테트라하이드로피라닐, 모르폴리노, 1,3-디아자판, 1,4-디아자판, 1,4-옥사제판, 및 1,4-옥사티아판을 포함한다. 상기 그룹은 말단 그룹 또는 브릿징 그룹일 수 있다.

"헤테로사이클로알케닐"은 상기 기재된 바와 같지만 적어도 하나의 이중 결합을 함유하는 헤테로사이클로알킬을 지칭한다. 상기 그룹은 말단 그룹 또는 브릿징 그룹일 수 있다.

"헤테로사이클로알킬알킬"은 헤테로사이클로알킬-알킬 그룹을 지칭하며, 여기서 헤테로사이클로알킬 및 알킬 부분은 이전에 기재된 바와 같다. 예시적인 헤테로사이클로알킬알킬 그룹은 (2-테트라하이드로푸릴)메틸 및 (2-테트라하이드로티오푸라닐)메틸을 포함한다. 상기 그룹은 말단 그룹 또는 브릿징 그룹일 수 있다.

"할로"는 플루오로, 클로로, 브로모 또는 요오도와 같은 할로겐 치환체를 지칭한다.

용어 "아릴"은 부모 방향족 환 시스템의 단일 탄소 원자로부터 하나의 수소 원자의 제거로부터 유도된 방향족 탄화수소 그룹을 지칭한다. 라디칼은 부모 환 시스템의 포화 또는 불포화 탄소 원자일 수 있다. 아릴 그룹은 6 내지 18개의 탄소 원자를 가질 수 있다. 아릴 그룹은 단일 환(예: 페닐) 또는 다중 축합된(융합된) 환을 가질 수 있으며, 여기서 적어도 하나의 환은 방향족(예: 나프틸, 디하이드로페난트레닐, 플루오레닐, 또는 안트릴)이다. 전형적인 아릴 그룹은 벤젠, 나프탈렌, 안트라센, 비페닐 등으로부터 유도된 라디칼을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 아릴은 알킬 그룹에 대해 상기 기재된 바와 같이 치환되지 않거나 임의로 치환될 수 있다.

용어 "헤테로아릴"은 본원에서 방향족 환 내에 1개, 2개 또는 3개의 방향족 환을 함유하고, 적어도 하나의 질소, 산소 또는 황 원자를 함유하는 모노사이클릭, 바이사이클릭, 또는 트리사이클릭 환 시스템으로 정의되며, 이는 치환되지 않거나 또는, 예를 들어, "치환된"의 정의에서 상기 기재된 바와 같이 하나 이상의, 특히 1 내지 3개의 치환체로 치환될 수 있다. 헤테로아릴 그룹의 예는 2H-피롤릴, 3H-인돌릴, 4H-퀴놀리지닐, 아크리디닐, 벤조[b]티에닐, 벤조티아졸릴, β-카볼리닐, 카바졸릴, 크로메닐, 신놀리닐, 디벤조[b,d]푸라닐, 푸라자닐, 푸릴, 이미다졸릴, 이미디졸릴, 인다졸릴, 인돌리시닐, 인돌릴, 이소벤조푸라닐, 이소인돌릴, 이소퀴놀릴, 이소티아졸릴, 이속사졸릴, 나프티리디닐, 옥사졸릴, 페리미디닐, 페난트리디닐, 페난트롤리닐, 페나르사지닐, 페나지닐, 페노티아지닐, 페녹사티이닐, 페녹사지닐, 프탈라지닐, 프테리디닐, 푸리닐, 피라닐, 피라지닐, 피라졸릴, 피리다지닐, 피리딜, 피리미디닐, 피리미디닐, 피롤릴, 퀴나졸리닐, 퀴놀릴, 퀴녹살리닐, 티아디아졸릴, 티안트레닐, 티아졸릴, 티에닐, 트리아졸릴, 테트라졸릴 및 크산테닐을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 하나의 구현예에서, 용어 "헤테로아릴"은 탄소를 함유하는 5개 또는 6개의 환 원자 및 비-퍼옥사이드 산소, 황 및 N(X)로부터 독립적으로 선택된 1, 2, 3 또는 4개의 헤테로원자를 함유하는 모노사이클릭 방향족 환을 나타내며, 여기서 Z는 부재이거나 H, O, 알킬, 아릴 또는 (C₁-C₆)알킬아릴이다. 또 다른 구현예에서, 헤테로아릴은 그로부터 유도된 약 8 내지 10개의 환 원자를 갖는 오르토-융합된 바이사이클릭 헤테로사이클, 특히 벤즈-유도체, 또는 프로필렌, 트리메틸렌 또는 테트라메틸렌 디라디칼을 이에 융합시킴으로써 유도된 것을 나타낸다.

용어 "헤테로사이클"은 그룹 산소, 질소 및 황으로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하고 용어 "치환된"하에 본원에 정의된 바와 같은 하나 이상의 그룹으로 임의로 치환된 포화된 또는 부분적으로 불포화된 환 시스템을 지칭한 다. 헤테로사이클은 하나 이상의 헤테로원자를 함유하는 모노사이클릭, 바이사이클릭 또는 트리사이클릭 그룹일 수 있다. 헤테로사이클 그룹은 또한 환에 부착된 옥소 그룹(=0)을 함유할 수 있다. 헤테로사이클 그룹의 비제한적인 예는 1,3-디하이드로벤조푸란, 1,3-디옥솔란, 1,4-디옥산, 1,4-디티안, 2H-피란, 2-피라졸린, 4H-피란, 크로마닐, 이미다졸리디닐, 이미다졸리닐, 인돌리닐, 이소크로마닐, 이소인돌리닐, 모르폴린, 피페라지닐, 피페리딘, 피페리딜, 피라졸리딘, 피라졸리디닐, 피라졸리닐, 피롤리딘, 피롤린, 퀴누클리딘 및 티오모르폴린을 포함한다.

본원에 사용된 약어 "DNQ_d"는 DNQ의 유사체 또는 유도체를 지칭한다.

R₁, R₂, R₃ 및 R₄의 브리징 그룹 또는 말단 그룹일 수 있는 추가 그룹은 하기에 기재되어 있다.

용어 "카보네이트 에스테르"는 일반 구조 R'0C(=0)0R을 갖는 작용성 그룹으로서 정의될 수 있으며, 여기서 R'는 화학식 I의 트리사이클릭 코어일 수 있고, R은 화학식 I의 변수들의 정의에서 정의된 바와 같을 수 있다.

용어 "에스테르"는 일반적인 구조 RC(=0)OR'를 갖는 작용성 그룹으로서 정의될 수 있으며, 여기서 R'는 화학식 I의 트리사이클릭 코어일 수 있고, R은 화학식 I의 변수들의 정의에서 정의된 바와 같을 수 있거나, 또는 그 반대일 수 있다.

"피리딜" 그룹은 2-피리딜, 3-피리딜, 또는 4-피리딜 그룹일 수 있다.

용어 "설프하이드릴"은 일반적인 구조 -S-H를 갖는 작용성 그룹으로서 정의될 수 있다.

용어 "설피닐"은 일반적인 구조 R-S(=0)-R'를 갖는 작용성 그룹으로서 정의될 수 있으며, 여기서 R'는 화학식 I의 트리사이클릭 코어일 수 있고, R은 화학식 I의 변수들의 정의에서 정의된 바와 같을 수 있거나, 또는 그 반대일 수 있다.

용어 "설포닐"은 일반적인 구조 R-S(=0)₂-R'를 갖는 작용성 그룹으로서 정의될 수 있으며, 여기서 R'는 화학식 I의 트리사이클릭 코어일 수 있고, R은 화학식 I의 변수들의 정의에서 정의된 바와 같을 수 있거나, 또는 그 반대일 수 있다.

용어 "헥소스"는 화학식 C₆H₁₂O₆을 갖는 6개의 탄소 원자를 갖는 단당류로서 정의될 수 있고, 위치 1에 알데히드 작용성 그룹을 갖는 알도헥소스 또는 위치 2에 케톤 작용성 그룹을 갖는 케토헥소스를 포함할 수 있다. 알도헥소스의 예는 알로스, 알트로스, 글루코스, 만노스, 굴로스, 이도스, 갈락토스 및 탈로스를 D 또는 L 형태로 포함한다.

반응식 및 실시예에 사용된 약어는 다음을 포함할 수 있다:

A549 = 선암성 인간 폐포 기저 상피 세포

ATP = 아데노신 트리포스페이트

β-lap = β-라파콘

DHE = 디하이드로에티듐

DNQ = 데옥시니보퀴논

DNQ_d = 데옥시니보퀴논의 임의의 유사체 또는 유도체

ELISA = 효소-결합된 면역흡착 검정

h = 시간

H596 =[NCI-H596] 인간 폐 선편평 암종 세포주

HT1080 = 영장류 섬유육종 세포주

LD₅₀ = 사망을 유발할 50% 확률을 갖는 치사량

LD₉₀ = 사망을 유발할 90% 확률을 갖는 치사량

LD₁₀₀ = 사망을 유발할 100% 확률을 갖는 치사량

MCF-7 = 인간 유방 선암종 세포주

MDA-MB-231 = 인간 유방암 세포주

MIA-PaCa2 = 췌장암 세포주

분 = 분

NADH = 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드

NQO1 = NAD(P)H:퀴논 옥시도리덕타제 1

NSCLC = 비소세포 폐암 세포

OCR = 산소 소비 속도

p53 = 종양 억제 단백질

PC-3 = 인간 전립선암 세포주

ROS = 반응성 산소 종

±SE = 표준 오차

siRNA = 작은 간섭 리보핵산

shRNA = 작은 헤어핀 리보핵산

μM = 마이크로몰

nM = 나노몰

μmol = 마이크로몰

II. 치료적 퀴논

DNQ는 췌장 및 비소세포 폐암을 포함하는, 암을 치료하기 어려운 넓은 스펙트럼에 대한 표적화된 요법에 대한 큰 가능성을 유지하는 광범위한 치료 창을 나타내는 강력한 화학요법제이다. 암 화학요법의 상당한 진보에도 불구하고, 대부분의 암 화학요법제의 선택성의 부족은 주요 제한 인자로 잔류한다. 대부분의 고형 종양, 특히 비소세포 폐암 세포(NSCLC), 전립선, 췌장 및 유방에서 발견된 상승된 NAD(P)H:퀴논 옥시도리덕타제-1(NQO1, DT-디아포라제, EC 1.6.99.2) 수준은 본원에 기재된 치료적 치료를 위한 표적을 제공한다. NQO1은 대부분의 퀴논을 환원시켜 안정적인 하이드로퀴논을 형성할 수 있는 2-전자 옥시도리덕타제를 해독하는 유도성 상 II이다. 대부분의 경우, 글루타티온 트랜스퍼라제는 하이드로퀴논을 해독하여 그들을 분비를 위해 글루타티온과 접합하고 더욱 독성인 세미퀴논을 효과적으로 회피한다.

그러나, 몇몇 희귀 화합물의 경우, NQO1-매개 생물 환원이 항종양 활성에 활용될 수 있다. NQO1 활성은 해독을 촉진시키기 보다는 특정 퀴논을 높은 세포독성 종으로 전환할 수 있다. NQO1에 의존하는 대부분의 항종양 퀴논은 DNA 알킬화제: (a) 미토마이신 C(MMC); (b) RH1; (c) E09; 및 (d) AZQ이다. 그러나, 이러한 DNA 알킬화제는 해독 경로의 대상체일 뿐만 아니라 상승된 또는 유도성 DNA 복구 경로로부터의 내성은 그들의 유용성을 제한한다. 또한, 이들 약물 중 다수는 정상 조직에서 유비퀴틴적으로 발현된 1-전자 옥시도리덕타제에 대한 효율적인 기질이다.

오르토-나프토퀴논, β-라파콘(β-lap, 반응식 1)은 NQO1 의존적 방식으로 생체내에서 배양된 암 세포 및 뮤린 이종이식편 및 동소 인간 또는 마우스 종양 모델을 사멸시킨다. 알킬화 퀴논과 대조적으로, β-lap은 NQO1 의존적 반응성 산소종(ROS) 형성 및 산화성 스트레스에 의해 세포 사멸을 유도한다. β-lap의 NQO1 대사는 2당량의 이산소에 의해 자발적으로 산화되어 수퍼옥사이드를 생성하는 불안정한 하이드로퀴논으로 귀결된다.

[반응식 1] .

따라서, 산화환원의 무의미한 주기가 확립되고, 상승된 수퍼옥사이드 수준은 또한 일반적으로 용이하고 신속하게 복구되는 대규모 DNA 염기 및 단일 가닥 파손(SSB) 병변을 유발한다. 그러나, β-lap-처리된 NQO1 과발현 암 세포에서 생성된 광범위한 DNA 병변은 폴리(ADP-리보스)폴리머라제-1(PARP1), 그렇지 않으면 필수 염기 및 SSB 복구 효소의 과활성화를 초래한다. 또한, PARP1 과활성화는 ADP-리보실화로 인한 NAD⁺/ATP 풀의 극적인 감소를 초래하여 엄청난 에너지 고갈 및 세포 사멸을 유발한다. 결과적으로, β-lap은 (a) 카스파제 활성화 또는 p53 상태와 독립적이고, (b) bcl-2 수준과 독립적이고, (c) BAX/BAK 결핍에 의해 영향을 받지 않으며; (d) EGFR, Ras 또는 다른 구성적 신호 전달 활성화와 독립적이고/이거나 (e) NQ01이 모든 세포 주기 상에서 발현되기 때문에 증식에 의존하지 않는 고유한 프로그램된 괴사 메커니즘에 의해 NQO1+ 암 세포를 사멸한다. 따라서, β-lap은 매력적인 실험적 화학요법제이며, 다양한 β-lap 제형은 상 I/II 임상 시험되었거나 시험 중이다.

데옥시니보퀴논(DNQ, 반응식 1)은 유망한 항신생물제이다. 이전의 데이터는 DNQ가 산화적 스트레스 및 ROS 형성을 통해 암 세포를 사멸시킨다는 것을 나타냈다. DNQ의 세포독성은 N-아세틸시스테인, 전체 자유 라디칼 스캐빈저 및 글루타티온에 대한 전구체에 의해 부분적으로 예방되었다. 이제 DNQ가 β-lap과 유사한 NQO1-의존적 무의미한 주기를 겪고, 여기서 산소가 소비되고 ROS가 형성되고 광범위한 DNA 손상이 프로그램된 괴사를 나타내는 필수적 NAD⁺/ATP 뉴클레오티드 풀의 극적인 감소와 함께 PARP1 과활성화를 유발하는 것으로 나타났다. 중요하게는, DNQ는 NQ01+ 대 NQO1- NSCLC 세포에서 상당히 향상된 치료 창과 함께 β-lap보다 20 내지 100배 더 강력하다. DNQ에 의한 효과적인 NQO1-의존적 사멸은 또한 시험관내 유방, 전립선 및 췌장암 모델에서도 나타난다. 또한, 시험관내 NQO1은 β-lap보다 훨씬 더 효율적으로 DNQ를 처리하여 증가된 활용도가 증가된 효능을 설명한다는 것을 나타낸다. 따라서, DNQ는 상승된 NQO1 수준을 갖는 고형 종양의 치료를 위한 선택적 화학요법제로서 상당한 가능성을 제공하지만, 본원에 기재된 병용 요법은 조합의 상승작용으로 인해 다양한 퀴논 화합물을 사용하는 효과적인 요법을 제공할 수 있다.

NQO1은 대부분의 고형 종양에서 과발현되고 다양한 퀴논 화합물의 세포독성은 주로 효소 NQO1의 상승된 발현에 의존하기 때문에, 퀴닌 화합물 및 그들의 유도체는 고형 종양을 표적으로 하는 접근법에 대한 우수한 수단일 수 있다. 본 발명은 본원에 기재된 바와 같이, 새로운 암 치료제로서 사용될 수 있는 다수의 새로운 세포독성 화합물을 제공한다.

본 개시내용의 상기 및 다른 목적 및 특징은 첨부되는 도면을 참조하여 진행되는 다음의 상세한 설명으로부터 더욱 명백해질 것이다. 본 출원의 다른 구현예, 형태, 특징, 측면, 이점, 목적 및 장점은 여기에 제공된 상세한 설명 및 도면으로부터 명백해질 것이다.

NQO1 생체활성화 가능한 약물(NQO1을 위한 기질인 모든 β-라파콘 및 DNQ 유도체)은 NQO1-의존적 종양 선택적 방식으로 엄청난 수준의 반응성 산소 종을 생성하여 모든 PARP1 억제제, DNA 이중 가닥 파손 복구 억제제 뿐만 아니라 염기 절단 복구 억제제를 포함하는 DNA 복구 억제제가 종양 특이적 방식으로 사용되어 두 제제의 종양 선택적 효능에 영향을 미치도록 한다. DNA 복구 억제제는 일반적으로 종양 선택성의 부족으로 인해 실패하였다. 이러한 NQO1 생체활성화 가능한 약물은 DNA 염기 손상, 단일 가닥 파손 및 이중 가닥 파손을 포함하는 DNA 병변의 종양 선택적 생성을 야기하기 때문에, DNA 복구 억제제는 종양 선택적 항종양 활성을 제공하는데 사용될 수 있다. 종양-선택적 활성 및 반응은 다른 종양-선택적 대사 억제뿐만 아니라 당분해의 극적인 억제를 포함한다.

NQO1 생체활성화 가능한 약물은 생성되는 DNA 병변을 알지 못하는 한 명확하지 않은 방식으로 및 명확하지 않고 사용된 DNA 복구 억제제에 따라 변경되는 대사 변화 및 세포 사멸 반응을 유발하는 방식으로 DNA 복구 억제제를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, DNQ 생체활성화 가능한 약물과 함께 투여되는 PARP1 억제제는 에너지 손실 없이 표준 아폽토시스 반응을 유발한다. 대조적으로, DNA 이중 가닥 파손 복구, 단일 가닥 파손 복구 및 염기 절제 복구 억제제는 PARP1 과활성화를 향상시켜 에너지 대사 및 프로그램된 괴사의 후속 손실을 초래한다.

PARP-1 억제제와 같은 DNA 복구 억제제의 유일한 현재 사용은 종양 특이적 합성 치사 반응의 독특한 활용(예: BRACA1/2 돌연변이체 종양에서 PARP1 억제제의 사용)을 통해서이다. 그러나, 이는 DNA 복구 억제제의 매우 제한된 사용 - 대략적으로 단지 5%의 유방암만이다. 대조적으로, 본원에 기재된 접근법은 상승된 NQO1 및 낮은 카탈라제 수준을 갖는 모든 암을 치료할 수 있는 반면, 정상 조직은 상승된 카탈라제 및 낮은 수준의 NQO1을 갖는다. 본원에 기재된 방법은 DNA 복구 억제제의 새로운 용도를 제공하여 종양-선택적 방식으로 그들의 사용을 가능하게 하는 동시에 NQO1 생체활성화 가능한 약물을 증강시키는 것을 가능하게 한다. 두 제제는 무독성 투여량으로 사용되어 종양-선택적 효능 반응이 상승작용적이도록 할 수 있다.

현재까지, DNA 복구 억제제는 종양-선택적 반응 및 효능이 부족하여 실패한다. 본원에 기재된 방법은 NQO1 생체활성화 가능한 약물을 크게 강화시키면서 이러한 제한을 해결한다. 본 방법은 또한 2 내지 4배 초과 낮은 용량의 NQO1 생체활성화 가능한 약물의 사용을 가능하게 하여 이러한 NQO1 생체활성화 가능한 약물의 독성 효과(예: 메트헤모글로빈혈증)를 해결한다. 치료 방법에서, 억제제는 NQO1 생체활성화 가능한 약물 전 및 후에, 최소한 전에, 임의로 전, 동시에, 후에 또는 이의 조합으로 첨가될 수 있다. 세포 사멸 반응은 사용되는 억제제에 의존한다. 반응은 명백하지 않으며, 생체내에서 따라야 할 특정 바이오마커를 수반할 것이다.

본 개시내용은 DNQ 화합물, β-라파콘(beta-lapachone) 및 이의 유도체, 및 암의 치료를 위한 병용 요법에서 NQO1 생체활성화 가능한 약물(bioactivatable drug)의 사용을 제공한다. DNQ 화합물의 예는 하기 화학식 I의 화합물 또는 이의 염 또는 용매화물을 포함한다:

[화학식 I]

상기 화학식 I에서,

R₁, R₂, R₃ 및 R₄는 각각 독립적으로 -H 또는 -X-R이고;

각각의 X는 독립적으로 직접 결합 또는 브릿징 그룹(bridging group)이고, 여기서 브릿징 그룹은 -O-, -S-, -NH-, -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)-O-, -OC(=O)-O-, 또는 화학식 -W-A-W-의 링커(linker)이고, 여기서

각 W는 독립적으로 -N(R')C(=O)-, -C(=O)N(R')-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -O-, -S-, -S(O)-, -S(O)₂-, -N(R')-, -C(=O)-, -(CH₂)_n-(여기서, n은 1-10이다) 또는 직접 결합이고, 여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, (C₁-C₆)알킬, 또는 질소 보호 그룹이고; 각각의 A는 독립적으로 2개의 탄소 사이에서 또는 탄소와 산소 사이에서 사이클로알킬, 헤테로사이클 또는 아릴 그룹으로 차단된 (C₁-C₂₀)알킬, (C₂-C₁₆)알케닐, (C₂-C₁₆)알키닐, (C₃-C₈)사이클로알킬, (C₆-C₁₀)아릴, -(OCH₂-CH₂)_n-(여기서 n은 1 내지 약 20이다), -C(O)NH(CH₂)_n-(여기서, n은 1 내지 약 6이다), -OP(O)(OH)O-, -OP(O)(OH)O(CH₂)_n-(여기서, n은 1 내지 약 6이다), 또는 (C₁-C₂₀)알킬, (C₂-C₁₆)알케닐, (C₂-C₁₆)알키닐, 또는 -(OCH₂-CH₂)_n-이고;

각각의 R은 독립적으로 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알케닐, (사이클로알킬)알킬, (헤테로사이클로알킬)알킬, (사이클로알킬)헤테로알킬, (헤테로사이클로알킬)헤테로알킬, 아릴, 헤테로아릴, (아릴)알킬, (헤테로아릴)알킬, 수소, 하이드록시, 하이드록시알킬, 알콕시, (알콕시)알킬, 알케닐옥시, 알키닐옥시, (사이클로알킬)알콕시, 헤테로사이클로알킬옥시, 아미노, 알킬아미노, 아미노알킬, 아실아미노, 아릴아미노, 설포닐아미노, 설피닐아미노, -COR^x, -COOR^x, -CONHR^x, -NHCOR^x, -NHCOOR^x, -NHCONHR^x, -N₃, -CN, -NC, -NCO, -NO₂, -SH, -할로, 알콕시카르보닐, 알킬아미노카르보닐, 설포네이트, 설폰산, 알킬설포닐, 알킬설피닐, 아릴설포닐, 아릴설피닐, 아미노설포닐, R^xS(O)R^y-, R^xS(O)²R^y-, R^xC(O)N(R^x)R^y-, R^xSO₂N(R^x)R^y-, R^xN(R^x)C(O)R^y-, R^xN(R^x)SO₂R^y-, R^xN(R^x)C(O)N(R^x)R^y-, 카르복실알데히드, 아실, 아실옥시, -OPO₃H₂, -OPO₃Z₂(여기서, Z는 무기 양이온이다) 또는 당류이고; 여기서 각각의 R^x는 독립적으로 H, OH, 알킬 또는 아릴이고, 각각의 R^y는 독립적으로 그룹 W이고;임의의 알킬 또는 아릴은 하나 이상의 하이드록시, 아미노, 시아노, 니트로, 또는 할로 그룹으로 임의로 치환될 수 있다.

일부 구현예에서, R₁, R₂, 및 R₃이 메틸이면, R₄는 H 또는 메틸이 아니다. 다른 구현예에서, R₁, R₂, 및 R₄가 메틸이면, R₂의 그룹 -X-R은 -CH₂-OAC이다. 특정 구현예에서, R₁, R₃, 및 R₄가 메틸이면, R₂의 R 그룹은 아실옥시가 아니다. 다양한 구현예에서, R₁-R₄는 각각 H가 아니다. 특정 구현예에서, R₁-R₄는 각각 알킬, 예를 들어, 치환되지 않은 알킬이 아니다. 일부 구현예에서, R₁-R₄는 각각 메틸이 아니다.

하나의 구현예에서, R₁, R₂, R₃ 및 R₄는 각각 (C_1-20)알킬 그룹이다. 일부 구현예에서, (C_1-20)알킬 그룹은 (C_2-20)알킬 그룹, (C_3-20)알킬 그룹, (C_4-20)알킬 그룹, (C_5-20)알킬 그룹, 또는 (C_10-20)알킬 그룹이다. 알킬 그룹은, 예를 들어, 하이드록실 또는 포스페이트 그룹으로 치환될 수 있다. 포스페이트 그룹은 포스폰산 또는 포스폰산 염, 예를 들어, 리튬 염, 나트륨 염, 칼륨 염, 또는 다른 공지된 포스폰산의 염일 수 있다.

R₁에 대한 특정 값은 H이다. R₂에 대한 특정 값은 H이다. R₃에 대한 특정 값은 H이다. R₄에 대한 특정 값은 H이다.

R₁에 대한 특정 값은 메틸이다. R₂에 대한 특정 값은 메틸이다. R₃에 대한 특정 값은 메틸이다. R₄에 대한 특정 값은 메틸이다. 메틸은 용어 "치환된"에 대해 상기 기재된 바와 같이 치환될 수 있다.

화학식 I의 일부 구현예에서,

R₁ 및 R₂는 메틸이고; R₃은 수소이고; R₄는 2-메틸-프로판이고;

R₁ 및 R₂는 메틸이고; R₃은 수소이고; R₄는 부틸이고;

R₁ 및 R₄는 메틸이고 R₃은 수소이고; R₂는 에틸이고;

R₁ 및 R₂는 메틸이고 R₃은 수소이고; R₄는 에틸이고;

R₁은 메틸이고; R₃은 수소이고; R₂는 프로필이고; R₄는 부틸이고;

R₁ 및 R₄는 메틸이고; R₂는 프로필이고; R₃은 수소이고;

R₁은 프로필이고; R₂ 및 R₄는 메틸이고, R₃은 수소이고;

R₁ 및 R₂는 에틸이고; R₃은 수소이고; R₂는 메틸이고;

R₁은 프로필이고; R₂는 메틸이고; R₃은 수소이고; R₄는 부틸이고;

R₁ 및 R₂는 프로필이고; R₃은 수소이고; R₄는 부틸이고;

R₁ 및 R₂는 메틸이고; R₃은 수소이고; R₄는 C₁₂알킬이고;

R₁ 및 R₂는 메틸이고; R₃은 수소이고; R₄는 3급-부틸이고;

R₁ 및 R₂는 메틸이고; R₃은 수소이고; R₄는 하이드록시프로필이고;

R₁ 및 R₂는 메틸이고; R₃은 수소이고; R₄는 3,3-디메틸부틸[-CH₂CH₂C(CH₃)₂CH₃]이고;

R₁ 및 R₂는 메틸이고; R₃은 수소이고; R₄는 3-메틸부틸[-CH₂CH₂C(CH₃)CH₃]이고;

R₂ 및 R₄는 메틸이고; R₃은 수소이고; R₁은 에틸이고;

R₁ 및 R₂는 메틸이고; R₃은 수소이고; R₄는 프로필이고;

R₁ 및 R₂는 메틸이고; R₃은 수소이고; R₄는 n-펜틸이고;

R₁ 및 R₂는 메틸이고; R₃은 수소이고; R₄는 n-헥실이고;

R₁ 및 R₂는 메틸이고; R₃은 수소이고; R₄는 이소프로필이고;

R₁ 및 R₂는 메틸이고; R₃은 수소이고; R₄는 사이클로옥틸이고;

R₁ 및 R₂는 메틸이고; R₃은 수소이고; R₄는 사이클로프로필이고;

R₁ 및 R₂는 메틸이고; R₃은 수소이고; R₄는 메틸사이클로프로필이고;

R₁ 및 R₂는 메틸이고; R₃은 수소이고; R₄는 에틸사이클로프로필이고;

R₁은 C₁₂알킬이고; R₂ 및 R₄는 메틸이고; R₃은 수소이고;

R₁ 및 R₄는 메틸이고; R₃은 수소이고; R₂는 C₁₂알킬이고;

R₁, R₂ 및 R₃은 메틸이고; R₄는 -CH₂OPO₃Na₂이고;

R₁은 -CH₂OPO₃Na₂이고; R₂ 및 R₃은 메틸이고; R₄는 수소이고;

R₁ 및 R₃은 메틸이고; R₂는 -CH₂OPO₃Na₂이고; R₄는 수소이고;

R₁ 및 R₂는 메틸이고; R₃은 -CH₂OPO₃Na₂이고; R₄는 수소이고;

R₁ 및 R₂는 메틸이고; R₃은 -CH₂CH₂OPO₃Na₂이고; R₄는 수소이고;

R₁, R₂ 및 R₃은 메틸이고; R₄는 -CH₂OH이고;

R₁은 -CH₂OH이고; R₂ 및 R₃은 메틸이고; R₄는 수소이고;

R₁ 및 R₃은 메틸이고; R₂는 -CH₂OH이고; R₄는 수소이고;

R₁ 및 R₂는 메틸이고; R₃은 -CH₂OH이고; R₄는 수소이고; 또는

R₁ 및 R₂는 메틸이고; R₃은 -CH₂CH₂OH이고; R₄는 수소이다.

화학식 I의 특정 구현예에서, R¹은 (C_1-4) 알킬 그룹이다. 특정 경우에, R¹은 (C_1-3) 알킬 그룹이다. 특정 경우에, R¹은 (C_1-2)알킬 그룹이다.

화학식 I의 특정 구현예에서, R²는 (C_1-4) 알킬 그룹이다. 특정 경우에, R²는 (C_1-3) 알킬 그룹이다. 특정 경우에, R²는 (C_1-2) 알킬 그룹이다.

화학식 I의 특정 구현예에서, R³은 수소이다.

화학식 I의 특정 구현예에서, R⁴는 임의로 치환된 (C_1-10)알킬 그룹이고, 여기서 알킬 그룹은 하이드록실, 할로겐, 아미노 또는 티올로 치환된다. 특정 경우에, R⁴는 (C_1-10) 알킬 그룹, (C_1-8) 알킬 그룹, (C_1-6) 알킬 그룹, 또는 (C_1-4) 알킬 그룹이다. 특정 경우에, R⁴는 (C_2-6) 알킬 그룹이다. 특정 경우에, R₄는 치환된 (C_1-10) 알킬 그룹, 치환된 (C_1-8) 알킬 그룹, 치환된 (C_1-6) 알킬 그룹, 또는 치환된 (C_1-4) 알킬 그룹이고, 여기서 알킬 그룹은 하이드록실, 할로겐, 아미노 또는 티올로 치환된다. 특정 경우에, R⁴는 하이드록실로 치환된 알킬 그룹이다. 특정 예에서, R⁴는 할로겐으로 치환된 알킬 그룹이다. 특정 예에서, R⁴는 아미노로 치환된 알킬 그룹이다. 특정 예에서, R⁴는 티올로 치환된 알킬 그룹이다.

화학식 I의 특정 구현예에서, R¹ 및 R²는 독립적으로 (C_1-4) 알킬 그룹이고; R³은 수소이고; R⁴는 임의로 치환된 (C_1-10) 알킬 그룹이고, 여기서 알킬 그룹은 하이드록실, 할로겐, 아미노 및 티올로 치환된다.

화학식 I의 특정 구현예에서, R¹ 및 R²는 독립적으로 (C_1-2) 알킬 그룹이고; R³은 수소이고; R⁴는 임의로 치환된 (C_1-10) 알킬 그룹이고, 여기서 알킬 그룹은 하이드록실, 할로겐, 아미노 및 티올로 치환된다.

화학식 I의 특정 구현예에서, R¹ 및 R²는 독립적으로 (C_1-2) 알킬 그룹이고; R³은 수소이고; R⁴는 (C_1-10) 알킬 그룹이다. 화학식 I의 특정 구현예에서, R¹ 및 R²는 독립적으로 (C_1-2) 알킬 그룹이고; R³은 수소이고; R⁴는 (C_1-8) 알킬 그룹이다. 화학식 I의 특정 구현예에서, R¹ 및 R²는 독립적으로 (C_1-2) 알킬 그룹이고; R³은 수소이고; R⁴는 (C_1-6) 알킬 그룹이다. 화학식 I의 특정 구현예에서, R¹ 및 R²는 독립적으로 (C_1-2) 알킬 그룹이고; R³은 수소이고; R⁴는 (C_1-4) 알킬 그룹이다. 화학식 I의 특정 구현예에서, R¹ 및 R²는 독립적으로 (C_1-2) 알킬 그룹이고; R³은 수소이고; R⁴는 (C_2-6) 알킬 그룹이다. 화학식 I의 특정 구현예에서, R¹ 및 R²는 독립적으로 (C_1-2) 알킬 그룹이고; R³은 수소이고; R⁴는 치환된 (C_1-6) 알킬 그룹이고, 여기서 알킬 그룹은 하이드록실, 할로겐, 아미노 및 티올로 치환된다. 화학식 I의 특정 구현예에서, R¹ 및 R²는 독립적으로 (C_1-2) 알킬 그룹이고; R³은 수소이고; R⁴는 치환된 (C_1-4) 알킬 그룹이고, 여기서 알킬 그룹은 하이드록실, 할로겐, 아미노 및 티올로 치환된다.

특정 구현예에서, 화학식 I의 화합물은 화합물 87 또는 이의 염 또는 용매화물이다:

특정 구현예에서, 화학식 I의 화합물은 화합물 9-253 또는 이의 염 또는 용매화물이다:

특정 구현예에서, 화학식 I의 화합물은 화합물 9-251 또는 이의 염 또는 용매화물이다:

특정 구현예에서, 화학식 I의 화합물은 화합물 10-41 또는 이의 염 또는 용매화물이다:

특정 구현예에서, 화학식 I의 화합물은 화합물 109 또는 이의 염 또는 용매화물이다:

특정 구현예에서, 화학식 I의 화합물은 화합물 107 또는 이의 염 또는 용매화물이다:

특정 구현예에서, 화학식 I의 화합물은 화합물 9-281 또는 이의 염 또는 용매화물이다:

특정 구현예에서, 화학식 I의 화합물은 화합물 9-249 또는 이의 염 또는 용매화물이다:

특정 구현예에서, 화학식 I의 화합물은 화합물 9-255 또는 이의 염 또는 용매화물이다:

특정 구현예에서, 화학식 I의 화합물은 화합물 9-257 또는 이의 염 또는 용매화물이다:

본 개시내용은 또한 화학식 I의 화합물 및 약제학적으로 허용되는 희석제, 부형제 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 담체는, 예를 들어, 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린(HPβCD)의 존재하에 물일 수 있다. 화합물의 용해도는 HPβCD 없이 물에서의 화합물의 용해도와 비교하여 약 100배, 약 200배, 약 500배, 약 1000배, 약 2000배, 또는 약 3000배 증가될 수 있다. 추가의 DNQ 화합물 및 방법은 국제 출원 번호 PCT/US12/59988(Hergenrother et al.)에 기재되어 있다.

하나 이상의 치환체를 함유하는 상기 화학식 또는 그룹 중 어느 하나와 관련하여, 물론 이러한 그룹은 입체적으로 비실용적이고/이거나 합성적으로 실행 불가능한 임의의 치환 또는 치환 패턴을 함유하지 않는 것으로 이해된다. 또한, 본 개시내용의 화합물은 이들 화합물의 치환으로부터 발생하는 모든 입체화학적 이성체를 포함한다.

본원에 기재된 화합물의 선택된 치환체는 반복적인 정도로 존재할 수 있다. 이러한 맥락에서, "반복적 치환체"는 치환체가 그 자체의 또 다른 예를 인용할 수 있다는 것을 의미한다. 이러한 치환체의 반복적 특성 때문에 이론적으로 다수가 임의의 주어진 청구범위에 존재할 수 있다. 의약 화학 및 유기 화학 분야의 숙련가는 이러한 치환체의 총 수가 의도된 화합물의 목적하는 특성에 의해 합리적으로 제한된다는 것을 이해한다. 이러한 특성은, 예로써, 제한 없이, 물리적 특성, 예를 들어, 분자량, 용해도 또는 log P, 의도된 표적에 대한 활성과 같은 적용 특성, 및 합성 용이성과 같은 실용적인 특성을 포함한다.

반복적 치환체는 본 개시내용의 의도된 측면이다. 의약 및 유기 화학 분야의 당업자는 이러한 치환체의 다양성을 이해한다. 반복적 치환체가 본 개시내용의 청구범위에 존재하는 정도로, 총 수는 상기 기재된 바와 같이 결정될 것이다. 일부 구현예에서, 반복적 치환체는 화합물의 분자량이 약 400 내지 약 1600, 약 450 내지 약 1200, 약 500 내지 약 100, 약 600 내지 약 800인 정도로만 존재한다. 다른 구현예에서, 반복적 치환체는 화합물의 분자량이 2000 미만, 1800 미만, 1600 미만, 1500 미만, 1400 미만, 1200 미만, 1000 미만, 900 미만, 800 미만, 750 미만, 700 미만, 또는 약 600 미만인 정도로만 존재한다.

상승된 NQO1 수준을 갖는 고형 종양 환자는 DNQ 및/또는 DNQ_d(DNQ 화합물)의 약제학적으로 활성 형태의 유효량의 투여를 통해 처리될 수 있다. 하기 반응식은 몇 가지 더 특별한 화학식을 나타낸다:

DNQ_d-27 및 DNQ_d-28의 경우, X는 화학식 -W-A-W-의 링커 또는 2가 브리징 그룹, 예를 들어, 2가 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 아사이클로알킬, 사이클로알케닐, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알케닐, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클로알킬알킬, 사이클로알킬헤테로알킬, 헤테로사이클로알킬헤테로알킬, 알콕시, 알콕시알킬, 알케닐옥시, 알키닐옥시, 사이클로알킬콕시, 헤테로사이클로알킬옥시, 아미노, 알킬아미노, 아미노알킬, 아실아미노, 아릴아미노, 설포닐아미노, 설피닐아미노, 알콕시카르보닐, 알킬아미노카르보닐, 설포닐, 알킬설포닐, 알킬설피닐, 아릴설포닐, 아릴설피닐, 아미노설포닐, 또는 아실일 수 있고, 이들 각각은 임의로 치환될 수 있다.

DNQ_d-29의 경우, 각각의 X는 독립적으로 DNQ_d-27 및 DNQ_d-28에 대해 상기 기재된 바와 같은 화학식 -W-A-W-의 링커 또는 2가 브리징 그룹일 수 있고; 각각의 Y는 독립적으로 다음과 같을 수 있다:

(1) 하이드록실, (11) 아세테이트, (21) 니트로소,

(2) 알데히드, (12) 아미노, (22) 피리딜,

(3) 카르복실, (13) 아지드, (23) 설프하이드릴,

(4) 할로포르밀, (14) 아조, (24) 설폰산

(5) 하이드로퍼옥시, (15) 시아노, (25) 설포네이트,

(6) 페닐, (16) 이소시아네이토, (26) 이소티오시아네이토,

(7) 벤질, (17) 니트레이트, (27) 포스핀,

(8) 알킬, (18) 이소니트릴, (28) 포스페이트,

(9) 알케닐, (19) 니트로소옥시, (29) 할로, 또는

(10) 알키닐, (20) 니트로, (30) 헥소스

본원에 기재된 화합물의 약제학적으로 허용되는 염은 본 개시내용의 범위 내에 있으며, 목적하는 약리학적 활성을 보유하고 생물학적으로 바람직하지 않은 산 또는 염기 부가 염을 포함한다(예를 들어, 염은 과도하게 독성, 알레르기 유발성 또는 자극성이 아니며, 생체이용가능하다). 화합물이 염기성 그룹, 예를 들어, 아미노 그룹을 가질 때, 약제학적으로 허용되는 염은 무기산(예: 염산, 붕산, 질산, 황산, 및 인산), 유기산(예: 알기네이트, 포름산, 아세트산, 벤조산, 글루콘산, 푸마르산, 옥살산, 타르타르산, 락트산, 말레산, 시트르산, 석신산, 말산, 메탄설폰산, 벤젠설폰산, 나프탈렌 설폰산, 및 p-톨루엔설폰산) 또는 산성 아미노산(예: 아스파르트산 및 글루탐산)으로 형성될 수 있다. 본 개시내용의 화합물이 산성 그룹, 예를 들어, 카르복실산 그룹을 가질 때, 금속, 예를 들어, 알칼리 및 알칼리 토금속(예: Na⁺, Li⁺, K⁺, Ca²⁺, Mg²⁺, Zn²⁺), 암모니아 또는 유기 아민(예: 디사이클로헥실아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민) 또는 염기성 아미노산(예: 아르기닌, 리신 및 오르니틴)과 염을 형성할 수 있다. 이러한 염은 화합물의 단리 및 정제 동안 또는 그의 유리 염기 또는 유리 산 형태의 정제된 화합물을 적절한 산 또는 염기와 각각 개별적으로 반응시키고, 이렇게 형성된 염을 단리시킴으로써 동일 반응계에서 제조될 수 있다

본원에 개시된 많은 분자는 하나 이상의 이온화 가능한 그룹(양성자가 제거될 수 있는 그룹(예: -COOH) 또는 첨가될 수 있는 그룹(예: 아민), 또는 4급화될 수 있는 그룹(예: 아민))을 함유한다. 이러한 분자 및 이의 염의 모든 가능한 이온 형태는 본원 개시내용에 개별적으로 포함되도록 의도된다. 본원에 기재된 화합물의 염과 관련하여, 당업자는 광범위한 종류의 이용가능한 반대 이온 중에서 주어진 적용에 대한 본 개시내용의 염의 제조에 적합한 것을 선택할 수 있다. 특정 적용에서, 염의 제조를 위한 주어진 음이온 또는 양이온의 선택은 그 염의 증가된 또는 감소된 용해도를 초래할 수 있다.

본원에 기재된 화합물의 적합한 염의 예는 그들의 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 설페이트, 메탄설포네이트, 니트레이트, 말레에이트, 아세테이트, 시트레이트, 푸마레이트, 타르트레이트(예: (+)-타르트레이트, (-)-타르트레이트 또는 라세미 혼합물을 포함하는 이의 혼합물), 석시네이트, 벤조에이트 및 글루탐산과 같은 아미노산과의 염을 포함한다. 이들 염은 당업자에게 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 암모늄, 유기 아미노, 또는 마그네슘 염, 또는 유사한 염과 같은 염기 부가 염이 포함된다. 본 개시내용의 화합물이 비교적 염기성 작용기를 함유하는 경우, 산 부가염은 순수한 또는 적합한 불활성 용매 중에서 이러한 화합물의 중성 형태를 충분한 양의 목적하는 산과 접촉시킴으로써 수득될 수 있다. 허용되는 산 부가염의 예는 염산, 브롬화수소산, 질산, 탄산, 탄산일수소, 인산, 인산일수소, 인산이수소, 황산, 황산일수소, 요오드화수소산, 또는 아인산 등과 같은 무기산으로부터 유도된 것들 뿐만 아니라, 아세트산, 프로피온산, 이소부티르산, 말레산, 말론산, 벤조산, 석신산, 수베르산, 푸마르산, 락트산, 만델산, 프탈산, 벤젠설폰산, p-톨릴설폰산, 시트르산, 타르타르산, 메탄설폰산 등과 같은 유기산에서 유도된 염을 포함한다. 또한, 아르기네이트 등과 같은 아미노산의 염, 및 글루쿠론산 또는 갈락투론산 등과 같은 유기산의 염이 포함된다. 본 개시내용의 특정의 구체적 화합물은 화합물이 염기 또는 산 부가 염으로 전환되도록 하는 염기성 및 산성 작용기를 모두 함유할 수 있다.

본 개시내용의 특정 화합물은 비용매화된 형태 뿐만 아니라 수화된 형태를 포함하여 용매화된 형태로 존재할 수 있다. 일반적으로, 용매화된 형태는 본 개시내용의 범위 내에 포함되는 비용매화된 형태와 등가이다. 본 개시내용의 특정 화합물은 다수의 결정질 또는 무정형 형태로 존재할 수 있다. 일반적으로, 모든 물리적 형태는 본 개시내용에 의해 고려되는 용도에 대해 등가이며, 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.

용어 "용매화물"은 그의 고체 구조와 관련된 하나 이상의 용매 분자를 갖는 고체 화합물을 지칭한다. 용매화물은 화합물이 용매로부터 결정화될 때 형성될 수 있다. 용매화물은 하나 이상의 용매 분자가 고화시 고체 결정성 매트릭스의 일체형 부분이 될 때 형성된다. 본원에 기재된 화학식의 화합물은 용매화물, 예를 들어, 에탄올 용매화물일 수 있다. 또 다른 형태의 용매화물은 수화물이다. "수화물"은 마찬가지로 분자 수준에서 그의 고체 또는 결정성 구조와 밀접하게 관련된 하나 이상의 물 분자를 갖는 고체 화합물을 지칭한다. 수화물은 화합물이 물에서 고화되거나 결정화될 때 형성될 수 있으며, 여기서 하나 이상의 물 분자는 고체 결정성 매트릭스의 일체형 부분이 된다. 본원에 기재된 화학식의 화합물은 수화물일 수 있다.

II. DNQ 화합물의 제조 방법

본 발명은 또한 본 발명의 화합물 및 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 화합물 및 조성물은 유기 합성의 적용 가능한 기술 중 임의의 것에 의해 제조될 수 있다. 많은 이러한 기술은 당업계에 익히 공지되어 있다. 그러나, 많은 공지된 기술은 문헌[참조: Compendium of Organic Synthetic Methods (John Wiley & Sons, New York), Vol. 1, Ian T. Harrison and Shuyen Harrison, 1971; Vol. 2, Ian T. Harrison and Shuyen Harrison, 1974; Vol. 3, Louis S. Hegedus and Leroy Wade, 1977; Vol. 4, Leroy G. Wade, Jr., 1980; Vol. 5, Leroy G. Wade, Jr., 1984; and Vol. 6, Michael B. Smith; as well as standard organic reference texts such as March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 5th Ed. byM.B. Smith and J. March (John Wiley & Sons, New York, 2001), Comprehensive Organic Synthesis; Selectivity, Strategy & Efficiency in Modern Organic Chemistry, in 9 Volumes, Barry M. Trost, Ed.-in-Chief (Pergamon Press, New York, 1993 printing) ); Advanced Organic Chemistry, Part B: Reactions and Synthesis, Second Edition, Cary and Sundberg (1983); Protecting Groups in Organic Synthesis, Second Edition, Greene, T.W., and Wutz, P.G.M., John Wiley & Sons, New York; and Comprehensive Organic Transformations, Larock, R.C., Second Edition, John Wiley & Sons, New York (1999)]에 자세히 설명되어 있고, 이들 각각은 참조로 여기에 인용된다.

본 개시내용의 조성물을 제조하기 위한 다수의 예시적인 방법이 하기에 제공된다. 이러한 방법은 이러한 제제의 특성을 예시하기 위한 것으로 의도되고, 적용가능한 방법의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 추가의 방법 및 유용한 기술은 WO 2013/056073(Hergenrother et al)에 기재되어 있다.

일반적으로, 온도, 반응시간, 용매, 후처리 절차 등과 같은 반응 조건은 수행될 특정 반응에 대해 당업계에서 통상적인 것일 것이다. 인용된 참고 자료는 그 안에 인용된 자료와 함께 이러한 조건의 상세한 설명을 함유한다. 전형적으로, 온도는 -100℃ 내지 200℃일 것이고, 용매는 필요한 조건에 따라 비양성자성 또는 양성자성일 것이고, 반응 시간은 1분 내지 10일일 것이다. 후처리는 전형적으로 임의의 미반응된 시약을 급냉시킨 후 물/유기 층 시스템(추출) 사이의 분배 및 생성물을 함유하는 층의 분리로 이루어진다. 산화 및 환원 반응은 전형적으로 실온 근처의 온도(약 20℃)에서 수행되지만, 금속 수소화물 환원의 경우 종종 온도는 0℃ 내지 -100℃로 감소된다. 적절한 경우, 가열이 또한 사용될 수 있다. 용매는 전형적으로 환원의 경우 비양성자성이고, 산화의 경우 양성자성 또는 비양성자성일 수 있다. 반응 시간은 목적하는 전환을 달성하도록 조정된다.

응축 반응은 전형적으로 실온 근처의 온도에서 수행되지만, 평형이 아닌 동역학적으로 제어된 응축의 경우, 감소된 온도(0℃ 내지 -100℃)가 또한 일반적이다. 용매는 양성자성(평형 반응에서 일반적) 또는 비양성자성(동역학적으로 제어된 반응에서 일반적)일 수 있다. 반응 부산물의 공비 제거와 같은 표준 합성 기술 및 무수 반응 조건(예: 불활성 가스 환경)의 사용은 당업계에서 일반적이며, 적용가능할 때 적용될 것이다.

보호 그룹. 용어 "보호 그룹", "차단 그룹", 또는 "PG"는 하이드록시 또는 다른 헤테로원자에 결합될 때 원하지 않는 반응이 이 그룹에서 발생하는 것을 방지하고, 하이드록실 그룹을 재설정하기 위해 통상적인 화학적 또는 효소적 단계에 의해 제거될 수 있는 임의의 그룹을 지칭한다. 사용되는 특정의 제거가능한 차단 그룹은 항상 중요한 것은 아니며, 바람직한 제거가능한 하이드록실 차단 그룹은, 예를 들어, 알릴, 벤질, 아세틸, 클로로아세틸, 티오벤질, 벤질리덴, 펜아실, 메틸 메톡시, 실릴 에테르(예: 트리메틸실릴(TMS), t-부틸-디페닐실릴(TBDPS), 또는 t-부틸디메틸실릴(TBS)), 및 하이드록실 작용기에 화학적으로 도입될 수 있고 나중에 생성물의 성질과 양립할 수 있는 온화한 조건에서 화학적 또는 효소적 방법에 의해 선택적으로 제거될 수 있는 임의의 다른 그룹과 같은 통상적인 치환체를 포함한다. 화학식 I의 R 그룹은 또한 본원에 기재된 바와 같이, 보호 그룹일 수 있다.

적합한 하이드록실 보호 그룹은 당업자에게 공지되어 있으며, 문헌[참조: T.W. Greene, Protecting Groups In Organic Synthesis; Wiley: New York, 1981 ("Greene") and the references cited therein, and Kocienski, Philip J.; Protecting Groups (Georg Thieme Verlag Stuttgart, New York, 1994)]에 보다 상세히 개시되어 있고, 이들 모두는 본원에 참고로 인용된다.

보호 그룹은 입수 가능하고, 통상적으로 공지되어 있고 사용되며, 합성 절차, 즉 본 개시내용의 방법에 의해 환합물을 제조하는 경로 또는 방법 동안 보호된 그룹과와 부반응을 방지하기 위해 임의로 사용된다. 대부분의 부분에 대해, 그렇게 할 때, 보호할 그룹, 및 화학적 보호 그룹 "PG"의 특성에 관한 결정은 보호될 반응의 화학(예: 산성, 염기성, 산화성, 환원성 또는 다른 조건) 및 의도된 합성 방향에 의존할 것이다.

보호 그룹은 존재할 필요는 없으며, 일반적으로 화합물이 다중 PG로 치환되는 경우 동일하지 않다. 일반적으로, PG는 카르복실, 하이드록실, 티오, 또는 아미노 그룹과 같은 작용성 그룹을 보호하고 따라서 부반응을 방지하거나 달리 합성 효율을 촉진하는 데 사용될 것이다. 유리 탈보호된 그룹을 생성하기 위한 탈보호 순서는 의도된 합성 방향 및 직면하게 될 반응 조건에 따라 달라지며, 숙련가에 의해 결정된 임의의 순서로 발생할 수 있다.

본 개시내용의 화합물의 다양한 작용성 그룹은 보호될 수 있다. 예를 들어, -OH 그룹을 위한 보호 그룹(하이드록실, 카복실산, 또는 다른 작용기이든)은 "에테르- 또는 에스테르-형성 그룹"을 포함한다. 에테르- 또는 에스테르-형성 그룹은 본원에 제시된 합성 반응식에서 화학적 보호 그룹으로서 기능할 수 있다. 그러나, 몇몇 하이드록실 및 티오 보호 그룹은 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 에테르-형성 그룹도 에스테르 형성 그룹도 아니다. 카르복실산 보호 그룹 및 산에 대한 다른 보호 그룹에 관한 추가 세부사항은 상기 인용된 문헌[Greene]을 참조한다. 이러한 그룹은 예로서, 제한 없이, 에스테르, 아미드, 하이드라지드 등을 포함한다.

III. 체크포인트 억제제

체크포인트 억제제 요법은 현재 연구 중인 암 치료 면역요법의 한 형태이다. 상기 요법은 작용을 자극하거나 억제하는 면역계의 주요 조절자인 면역 체크포인트를 표적으로 하고, 이 종양은 면역계에 의한 공격으로부터 자신을 보호하기 위해 사용될 수 있다. 체크포인트 요법은 억제 체크포인트를 차단하여 면역계 기능을 회복시킬 수 있다. 면역 체크포인트를 표적으로 하는 제1 항암 약물은 2011년 미국에서 승인된 CTLA-4 차단제인 이필리무맙이었다.

현재 승인된 체크포인트 억제제는 분자 CTLA4, PD-1 및 PD-L1을 표적으로 한다. PD-1은 PD-L1(PD-1 리간드 1 또는 CD274)과 상호작용하는 막관통 프로그램된 세포 사멸 1 단백질(PDCD1 및 CD279라고도 함)이다. 세포 표면 상의 PD-L1은 면역 세포 표면 상의 PD1에 결합하고, 이는 면역 세포 활성을 억제한다. PD-L1 기능 중에는 T 세포 활성에 대한 주요 조절 역할이 있다. 세포 표면 상에서 PD-L1의 (암 매개) 상향조절은 그렇지 않으면 공격할 수 있는 T 세포를 억제할 수 있는 것으로 보인다. PD-1 또는 PD-L1에 결합하고 따라서 상호작용을 차단하는 항체는 T 세포가 종양을 공격하도록 할 수 있다.

일부 구현예에서, 면역 체크포인트 억제제 요법은 아데노신 A2A 수용체(A2AR), B7-H3(CD276으로도 공지됨), B 및 T 림프구 감쇠제(BTLA), 세포독성 T-림프구 관련 단백질 4(CTLA-4, CD152로도 공지됨), 인돌아민 2,3-디옥시게나제(IDO), 킬러-세포 면역글로불린(KIR), 림프구 활성화 유전자-3(LAG3), T-세포 면역글로불린 도메인 및 뮤신 도메인 3(TIM-3) 및 T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제제(VISTA)를 표적으로 하는 분자일 수 있다.

면역 체크포인트 억제제는 소분자, 리간드 또는 수용체의 재조합 형태와 같은 약물일 수 있거나, 특히 항체, 예를 들어, 인간 항체일 수 있다(예를 들어, 국제 특허 공개 번호 WO2015016718; 둘 다 본원에 참조로 포함됨). 면역 체크포인트 단백질 또는 이의 유사체의 공지된 억제제가 사용될 수 있으며, 특히 키메라화, 인간화 또는 인간 형태의 항체가 사용될 수 있다. 당업자가 알고 있는 바와 같이, 대안적 및/또는 등가의 명칭이 본 개시내용에서 언급된 특정 항체에 대해 사용될 수 있다. 이러한 대안적 및/또는 등가 명칭은 본 개시내용의 맥락에서 상호교환가능하다. 예를 들어, 람브롤리주맙은 대안적 및 등가 명칭 MK-3475 및 펨브롤리주맙으로도 공지되는 것으로 공지되어 있다.

IV. 약제학적 조성물 및 치료 방법

A. 약제학적 조성물

다음은 약제학적 및 약리학적 구현예와 관련된 정보를 기재하고 당업자가 이용할 수 있는 당업계의 정보에 의해 추가로 보충된다. 정확한 제형, 투여 경로 및 용량은 환자의 상태를 고려하여 개별 의사 또는 임상의가 선택할 수 있다(참조: 예를 들어, Fingl et al., in The Pharmacological Basis of Therapeutics, 1975, Ch. 1).

주치의는 독성 또는 장기 기능 장애 등으로 인해 투여를 종결, 중단 또는 조정하는 방법과 시기를 알고 있음을 유의해야 한다. 반대로, 주치의는 또한 임상 반응이 적절하지 않았을 때(독성 측면을 고려하거나 배제하는 경우), 치료를 더 높은 수준으로 조정하는 것도 알고 있다. 관심 장애의 관리에서 투여된 투여량의 크기는 치료할 상태의 중증도 및 투여 경로에 따라 달라질 수 있다. 상태의 중증도는, 예를 들어, 부분적으로 표준 예후 평가 방법에 의해 평가될 수 있다. 또한, 투여량 및 투여 빈도도 상황, 예를 들어, 연령, 체중 및 개별 환자의 반응에 따라 달라질 수 있다. 위에서 논의한 것과 필적할 만한 프로그램이 또한 수의학에서 사용될 수 있다.

치료되는 특정 상태 및 선택된 표적화 방법에 따라, 이러한 제제는 제형화되고 전신적으로 또는 국소적으로 투여될 수 있다. 제형화 및 투여 기술은 문헌(참조: Alfonso and Gennaro (1995)) 및 당업계의 다른 곳에서 찾을 수 있다.

화합물은 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 환자에게 투여될 수 있다. "약제학적으로 허용되는"이라는 문구는 건전한 의학적 판단 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉 사용하기에 적합하고 합리적인 이익/위험 비율에 상응하는 리간드, 물질, 조성물 및/또는 용량 형태를 지칭한다.

"약제학적으로 허용되는 담체"라는 문구는 당업자에게 공지된 바와 같이(참조: 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329, 본원에 참조로 인용됨), 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 희석제, 코팅, 계면활성제, 항산화제, 방부제(예: 항균제, 항진균제), 등장제, 흡수 지연제, 염, 완충제, 방부제, 약물, 약물 안정제, 겔, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 향미제, 염료, 이러한 유사 물질 및 이의 조합을 포함한다. 임의의 통상적인 담체가 활성 성분과 양립할 수 없는 경우를 제외하고, 화학요법 또는 약제학적 조성물에서의 그의 사용이 고려된다.

DNQ_d 또는 DNQ 화합물은 고체, 액체 또는 에어로졸 형태로 투여해야 하는지 여부와 주사와 같은 투여 경로에 대해 멸균되어야 하는지 여부에 따라 다양한 유형의 담체와 조합될 수 있다. 본 개시내용은 정맥내, 피내, 동맥내, 복강내, 병변내, 두개내, 관절내, 전립선내, 흉막내, 기관내, 비강내, 유리체내, 질내, 직장내, 국소, 종양내, 근육내, 복강내, 피하, 결막하, 방광내, 점막, 심낭내, 배꼽내, 안구내, 경구, 국소, 국부적으로, 주사, 주입, 연속 주입, 국소 관류 욕 표적 세포를 직접, 카테터를 통해, 세척을 통해, 지질 조성물(예: 리포솜)로, 또는 당업자에게 공지되어 있는 바와 같은 다른 방법 또는 전술한 것의 임의의 조합에 의해 투여될 수 있다(참조: 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, 참조로 본원에 인용됨).

환자에게 투여되는 본 개시내용의 조성물의 실제 투여량은 물리적 및 생리학적 인자, 예를 들어, 체중, 상태의 중증도, 치료되는 질환의 유형, 이전 또는 동시 치료 중재술, 환자의 특발성 및 투여 경로에 의해 결정될 수 있다. 투여에 책임이 있는 의사는 임의의 경우에, 조성물 중의 활성 성분(들)의 농도 및 개별 대상체에 대한 적절한 투여량(들)을 결정할 것이다.

대상체에게 투여될 때, 유효량은 물론 치료되는 특정 암; 특정 암의 유전형;암의 중증도; 연령, 신체 상태, 크기 및 체중, 동시 치료, 치료 빈도, 및 투여 방식을 포함하는 개별 환자 매개변수에 의존할 것이다. 이러한 요인은 의사에게 익히 공지되어 있으며, 단지 일상적인 실험으로 다룰 수 있다. 일부 구현예에서, 건전한 의학적 판단에 따라 최고 안전한 투여량을 사용하는 것이 바람직하다.

특정 구현예에서, 약제학적 조성물은, 예를 들어, 적어도 약 0.1%의 DNQ_d 또는 DNQ 화합물을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 활성 화합물은 단위 중량의 약 2% 내지 약 75%, 또는, 예를 들어, 약 25% 내지 약 60%, 및 그 안에서 유도가능한 임의의 범위를 포함할 수 있다. 다른 비제한적인 예에서, 투여량은 또한 투여당 약 0.1mg/kg/체중, 0.5mg/kg/체중, 1mg/kg/체중, 약 5mg/kg/체중, 약 10mg/kg/체중, 약 20mg/kg/체중, 약 30mg/kg/체중, 약 40mg/kg/체중, 약 50mg/kg/체중, 약 75mg/kg/체중, 약 100mg/kg/체중, 약 200mg/kg/체중, 약 350mg/kg/체중, 약 500mg/kg/체중, 약 750mg/kg/체중 내지 약 1000mg/kg/체중 또는 그 이상, 및 그 안에서 유도 가능한 임의의 범위를 포함할 수 있다. 본원에 열거된 수치로부터 유도가능한 범위의 비제한적인 예에서, 상기 기재된 수치에 기초하여 약 10mg/kg/체중 내지 약 100mg/kg/체중 등의 범위가 투여될 수 있다.

임의의 경우에, 조성물은 하나 이상의 성분의 산화를 지연시키기 위해 다양한 항산화제를 포함할 수 있다. 추가로, 미생물 작용의 예방은 파라벤(예: 메틸파라벤, 프로필파라벤), 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 항균제 및 항진균제와 같은 방부제에 의해 야기될 수 있다.

DNQ_d 또는 DNQ 화합물과 같은 본원에 기재된 활성제는 유리 염기, 중성 또는 염 형태의 조성물로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 염은 무기 염기, 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 제2철 수산화물과 같은 무기 염기; 또는 이소프로필아민, 트리에틸아민, 히스티딘 또는 프로카인과 같은 유기 염기로부터 유도된 유리 카르복실 그룹으로 형성된 염을 포함한다.

경구 사용을 위한 약제학적 제제는 활성 화합물을 고체 부형제와 조합하고, 임의로 생성된 혼합물을 분쇄하고, 필요에 따라 적절한 보조제를 첨가한 후, 과립의 혼합물을 처리하여 정제 또는 당의정 코어를 수득함으로써 수득될 수 있다. 적합한 부형제는 특히 충전제, 예를 들어, 락토스, 수크로스, 만니톨 또는 소르비톨을 포함하는 당; 셀룰로스 제제, 예를 들어, 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트라가칸트 검, 메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필메틸-셀룰로스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 및/또는 폴리비닐피롤리돈(PVP)이다. 필요한 경우, 가교결합된 폴리비닐 피롤리돈, 한천 또는 알긴산 또는 이의 염, 예를 들어, 나트륨 알기네이트와 같은 붕해제가 첨가될 수 있다.

당의정 코어에는 임의로 적합한 코팅이 제공된다. 이 목적을 위해, 아라비아 고무, 활석, 폴리비닐 피롤리돈, 카보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜, 및/또는 이산화티탄, 래커 용액, 및 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 임의로 함유할 수 있는 농축된 당 용액이 사용될 수 있다. 염료 또는 안료는 식별 또는 활성 화합물 투여량의 상이한 조합을 특성화하기 위해 정제 또는 당의정 코팅에 첨가될 수 있다.

조성물이 액체 형태인 구현예에서, 담체는 물, 에탄올, 폴리올(예: 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 지질(예: 트리글리세라이드, 식물성 오일, 리포좀) 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해; 예를 들어, 액체 폴리올 또는 지질과 같은 담체에 분산에 의해 필요한 입자 크기의 유지에 의해; 예를 들어, 하이드록시프로필셀룰로스(HPC)와 같은 계면활성제의 사용에 의해; 또는 이러한 방법의 조합에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우에, 예를 들어, 당, 염화나트륨 또는 이들의 조합과 같은 등장제를 포함하는 것이 바람직할 것이다.

멸균 주사가능한 용액은 필요한 양의 적절한 용매에 활성 화합물을 필요에 따라 상기 열거된 다양한 다른 성분과 함께 혼입한 다음, 여과 멸균화함으로써 제조된다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균된 활성 성분을 염기성 분산 매질 및/또는 기타 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사용 용액, 현탁액 또는 에멀젼의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 성분의 분말과 이의 사전 멸균 여과된 액체 배지로부터 임의의 추가의 목적하는 성분을 생성하는 진공 건조 또는 동결 건조 기술이다. 액체 배지는 필요한 경우 적절하게 완충되어야 하고, 액체 희석제는 충분한 식염수 또는 글루코스로 주사하기 전에 먼저 등장성이도록 한다.

조성물은 제조 및 저장 조건하에서 안정해야 하고, 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 따라서, 바람직한 조성물은 약 5 초과, 바람직하게는 약 5 내지 약 8, 더욱 바람직하게는 약 5 내지 약 7의 pH를 갖는다. 내독소 오염은, 예를 들어, 0.5ng/mg 단백질 미만의 안전한 수준에서 최소한으로 유지되어야 함이 이해될 것이다.

특정 구현예에서, 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트, 젤라틴 또는 이들의 조합과 같은 흡수를 지연시키는 제제의 조성물에서의 사용에 의해 야기될 수 있다.

B. 생체내 투여를 위한 DNQ 화합물의 제형화

인산염 완충 식염수(PBS) 중 pH 7.4에서 DNQ의 수 용해도는 LC-MS로 측정했다. DNQ를 PBS에서 30분 동안 초음파 처리한 다음, 0.45μm 주사기 필터를 통한 여과에 의해 용해되지 않은 고체를 제거하고, 여액을 LC-MS로 분석했다(λ= 275nm, 음성 모드의 ESI-TOF). 최적의 초음파 처리 시간은 DNQ를 1, 5, 10 및 30분 동안 초음파 처리하여 결정되었다. 용액 내 DNQ의 농도는 1, 5, 10분 사이에 상당히 증가했지만, 10분과 30분 사이에는 최소한의 차이만 있었다. 30분 초음파 처리하는 동안 수욕을 45℃로 가온시켰다(샘플은 여과 전에 실온으로 냉각되었다). DNQ를 메탄올에 500μM의 농도로 용해하고 이 스톡을 물:메탄올 80:20으로 희석함으로써 1-100μM에서 교정 곡선을 생성했다. 교정 곡선(UV 흡광도로 측정)은 이 범위에서 선형이었다: 1μM은 대략적으로 검출 한계였다. PBS에서 DNQ의 용해도는 115μM로 측정되었다. 용액은 매우 연한 황색이었다.

DNQ의 낮은 수용해도 때문에, 본 발명자들은 DNQ의 용해도를 개선하기 위해 일반적인 부형제인 2-하이드록시프로필-베타-사이클로덱스트린(HPβCD)의 사용을 조사했다. HPβCD의 부재하에 DNQ의 용해도는 강염기성 용액에서 크게 증가하고, pH가 중성으로 돌아오면 DNQ가 침전된다. 그러나, 충분한 양의 HPβCD의 존재하에, pH가 중성으로 되돌아오면 DNQ는 침전되지 않는다. HPβCD에서 DNQ의 이 동일한 중성 용액은 직접(즉, pH 조정 없이) 제조될 수 없다. 이것은 DNQ 화합물이 염기에서 탈양성자화되고 이 탈양성자화된 분자가 pH가 감소함에 따라 양자화를 방지하기에 충분히 안정한 HPβCD와 단단한 복합체를 형성한다는 것을 나타낸다. 수성 염기에서 합리적으로 탈양성자화될 수 있는 DNQ 상의 유일한 양성자는 N-H이다. DNQ의 N-H 결합의 산도는 측정되지 않았지만, DNQ의 유도체에 대해 측정한 결과 pKa가 8.0인 것으로 밝혀졌다.

HPβCD에서 DNQ 화합물을 제형화하기 위한 프로토콜은 다음과 같다: DNQ 화합물을 pH 7.4 PBS 중 HPβCD의 20% 용액에 슬러리화한 다음, 10M NaOH를 첨가하여 pH를 증가시켜 DNQ 화합물의 용해를 유도한다. 1M HCl을 조심스럽게 첨가하여 pH를 pH 7.5-8.0으로 되돌린다. DNQ 화합물의 3.3mM 용액은 적어도 24시간 동안 안정한 이 방법으로 제조될 수 있다. 이것은 PBS 단독에 비해 DNQ의 용해도가 30배 증가함을 나타낸다. 본 발명자들은 처음에 20% HPβCD 용액을 선택했다. 그러나, 본 발명자들은 β-lap이 인간 임상 시험을 위한 HPβCD의 40% 용액으로 제형화되었음을 발견하였고, DNQ를 사용하는 본 발명자들의 경험은 DNQ의 농도가 HPβCD의 농도와 선형적으로 증가함을 나타내고; 따라서 40% HPβCD 용액은 DNQ 및 기타 DNQ 화합물의 6.6mM 용액의 생성을 허용한다.

C. 치료

본 개시내용은 또한 상승된 NQO1 수준을 갖는 종양 세포를 갖는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상승된 NQO1 수준을 갖는 종양 세포를 갖는 환자에게 본원에 기재된 화학식 I의 화합물, 또는 조성물의 치료학적 유효량을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 본 개시내용은 또한 종양 세포를 본원에 기재된 화합물 또는 조성물의 치료적 유효량에 노출시키는 단계를 포함하는 상승된 NQO1 수준을 갖는 종양 세포를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 종양 세포는 치료되거나 사멸되거나 또는 성장이 억제된다. 종양 또는 종양 세포는 악성 종양 세포일 수 있다. 일부 구체예에서, 종양 세포는 암 세포, 예를 들어, 비소세포 폐 암종(Non-Small-cell Lung Carcinoma)이다

따라서, 본 개시내용의 방법은 말단 흑자 흑색종(acral lentiginous melanoma), 광선 각화증(actinic keratoses), 선암종(adenocarcinoma), 선양 낭포성 암종(adenoid cycstic carcinoma), 선종(adenomas), 선육종(adenosarcoma), 선편평 암종(adenosquamous carcinoma), 성상세포 종양(astrocytic tumors), 바르톨린선 암종(bartholin gland carcinoma), 기저 세포 암종(basal cell carcinoma), 기관지 암종(bronchial gland carcinomas), 모세혈관(capillary), 유암종(carcinoid), 암종(carcinoma), 암육종(carcinosarcoma), 해면체(cavernous), 담관암종(cholangiocarcinoma), 연골육종(chondosarcoma), 맥락총 유두종(choriod plexus papilloma)/암종, 투명 세포 암종(clear cell carcinoma), 낭선종(cystadenoma), 내배엽 부비동 종양(endodermal sinus tumor), 자궁내막 증식증(endometrial hyperplasia), 자궁내막 기질 육종(endometrial stromal sarcoma)자궁내막선암(endometrioid adenocarcinoma), 뇌실막(ependymal), 상피양(epitheloid), 유잉 육종(Ewing's sarcoma), 섬유층(fibrolamellar), 국소 결절 증식증(focal nodular hyperplasia), 가스트린종(gastrinoma), 생식 세포 종양(germ cell tumors), 교모세포종(glioblastoma), 글루카곤종(glucagonoma), 혈관모세포종(hemangiblastomas), 혈관내피종(hemangioendothelioma), 혈관종(hemangiomas), 간 선종(hepatic adenoma), 간 선종증(hepatic adenomatosis), 간세포 암종(hepatocellular carcinoma), 인슐린종(insulinoma), 상피내 종양(intaepithelial neoplasia), 상피간 편평 세포 종양(interepithelial squamous cell neoplasia), 침습성 편평 세포 암종(invasive squamous cell carcinoma), 대세포 암종(large cell carcinoma), 평활근육종(leiomyosarcoma), 악성 흑자 흑색종(lentigo maligna melanomas), 악성 흑색종(malignant melanoma), 악성 중피 종양(malignant mesothelial tumors), 수모세포종(medulloblastoma), 수상피종(medulloepithelioma), 흑색종(melanoma), 수막(meningeal), 중피(mesothelia), 전이성 암종(metastatic carcinoma), 점막표피양 암종(mucoepidermoid carcinoma), 신경아세포종(neuroblastoma), 신경상피 선암종 결절성 흑색종(neuroepithelial adenocarcinoma nodular melanoma), 귀리 세포 암종(oat cell carcinoma), 희소 돌기아교세포(oligodendroglial), 골육종(osteosarcoma), 췌장 폴리펩티드(pancreatic polypeptide), 유두 장액성 선암종(papillary serous adenocarcinoma), 송과체 세포(pineal cell), 뇌하수체 종양(pituitary tumors), 형질세포종(plasmacytoma), 가육종(pseudosarcoma), 폐모세포종(pulmonary blastoma), 신세포암종(renal cell carcinoma), 망막모세포종(retinoblastoma), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 육종(sarcoma), 장액 암종(serous carcinoma), 소세포 암종(small cell carcinoma), 연조직 암종(soft tissue carcinomas), 소마토스타틴 분비 종양(somatostatin-secreting tumor), 편평상피 암종(squamous carcinoma), 편평 세포 암종(squamous cell carcinoma), 중피하(submesothelial), 표재성 확산 흑색종(superficial spreading melanoma), 미분화 암종(undifferentiated carcinoma), 포도막 흑색종(uveal melanoma), 사마귀 암종(verrucous carcinoma), 비포마(vipoma), 잘 분화된 암종 및 윌름 종양(Wilm's tumor)을 포함하는 다양한 신생물 장애의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 방광암, 뇌암(신경교종, 수막종, 신경종 및 선종과 같은 두개내 신생물 포함), 유방암, 결장암, 폐암(SCLC 또는 NSCLC) 난소암, 췌장암, 전립선암을 치료하는 데 사용될 수 있다.

D. 병용 요법

본원에 기재된 활성 성분(예: 화학식 I의 화합물)은 또한 다른 활성 성분과 조합하여 사용될 수 있다. 이러한 조합은 치료될 상태, 성분들의 교차-반응성 및 조합의 약리학적 특성에 기초하여 선택된다. 예를 들어, 암을 치료할 때, 조성물은 다른 항암 화합물(예: 파클리탁셀 또는 라파마이신)과 조합될 수 있다.

환자에게 동시 또는 순차적 투여를 위한 단일 투여 형태로 본 개시내용의 화합물을 하나 이상의 다른 활성 성분과 조합하는 것이 또한 가능하다. 병용 요법은 동시 또는 순차적 섭생으로 투여될 수 있다. 순차적으로 투여되는 경우, 조합은 2회 이상의 투여로 투여될 수 있다.

병용 요법은 "상승 효과" 및 "상승작용"을 제공할 수 있다, 즉 활성 성분이 함께 사용될 때 달성되는 효과가 화합물을 개별적으로 사용함으로써 생성되는 효과의 합보다 더 크다. 상승적 효과는, 활성 성분이 (1) 공동 제형화되고, 조합된 제형으로 동시에 투여되거나 전달되고; (2) 별도의 제형으로 교호로 또는 병행하여 전달되고; 또는 (3) 일부 다른 섭생에 의해서인 경우, 달성된다. 교호 요법으로 전달되는 경우, 상승적 효과는 화합물이 순차적으로, 예를 들어, 별도의 정제, 환제 또는 캡슐로 또는 별도의 주사기에 상이한 주사로 투여되거나 전달되는 경우 달성될 수 있다. 일반적으로 교호 요법 동안, 각 활성 성분의 유효 용량은 순차적으로, 즉 직렬로 투여되는 반면, 병용 요법에서, 2개 이상의 활성 성분의 효과적인 용량은 함께 투여된다. 상승적 항암 효과는 조합의 개별 화합물의 예측된 순수한 첨가제 효과보다 큰 항암 효과를 나타낸다.

병용 요법은 본원에 기재된 화합물과 조합될 수 있는 추가의 활성제, 및 본원에 기재된 화합물로 치료될 수 있는 추가 유형의 암 및 기타 조건을 포함하는 미국 특허 제6,833,373호(McKeam el ah)에 의해 추가로 기재된다.

따라서, DNQ_d 또는 DNQ가 다른 제제 또는 치료 방법, 바람직하게는 또 다른 암 치료와 조합하여 사용될 수 있다는 것이 본 개시내용의 측면이다. DNQ_d 또는 DNQ는 몇 분 내지 수 주 범위의 간격으로 다른 제제 치료를 선행하거나 따를 수 있다. 다른 제제 및 발현 작제물이 개별적으로 적용되는 구현예에서, 일반적으로 제제 및 발현 작제물이 세포에 유리하게 조합된 효과를 발휘할 수 있도록 각 전달 시간 사이에 상당한 시간이 경과하지 않았음을 보장할 것이다. 예를 들어, 이러한 경우, 세포, 조직 또는 유기체를 2개, 3개, 4개 이상의 양식으로 활성제(들)와 실질적으로 동시에(즉, 약 1분 이내에) 접촉할 수 있다는 것이 고려된다. 다른 측면에서, 하나 이상의 제제는 활성제(들)를 투여하기 전 및/또는 후 약 1분, 약 5분, 약 10분, 약 20분, 약 30분, 약 45분, 약 60분, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 6시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 12시간, 약 15시간, 약 18시간, 약 21시간, 약 24시간, 약 28시간, 약 31시간, 약 35시간, 약 38시간, 약 42시간, 약 45시간 내지 약 48시간 이상 내에 투여될 수 있다. 특정의 다른 구현예에서, 제제는 활성제(들)의 투여 전 및/또는 후 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 8일, 약 9일, 약 12일, 약 15일, 약 16일, 약 18일, 약 20일 내지 약 21 일 이내에 투여될 수 있다. 그러나, 일부 상황에서, 치료 기간을 상당히 연장하는 것이 바람직할 수 있고, 여기서 수 주(예: 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 6, 또는 약 8주 이상)가 각각의 투여 사이에 경과한다.

본 개시내용의 화학요법 조성물을 환자에게 투여하면 존재하는 경우 독성을 고려하여 화학요법제의 투여를 위한 일반적인 프로토콜을 따를 것이다. 치료 주기는 필요에 따라 반복될 것으로 예상된다. 다양한 표준 요법 또는 보조 암 요법뿐만 아니라 외과적 개입이 기재된 활성제(들)와 조합하여 적용될 수 있음이 또한 고려된다. 이러한 요법은 화학요법, 방사선요법, 면역요법, 유전자 요법 및 수술을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

i. 화학요법

암 요법은 또한 화학적 및 방사선 기반 치료를 모두 포함하는 다양한 조합 요법을 포함할 수 있다. 조합 화학요법은 화학요법제, 예를 들어, 시스플라틴, 에토포사이드, 이리노테칸, 캄프토스타, 토포테칸, 파클리탁셀, 도세탁셀, 에포틸론, 탁소테레, 타목시펜, 5-플루오로우라실, 메톡스트렉세이트, 테모졸로마이드, 사이클로포스파미드, SCH 66336, R115777, L778,123, BMS 214662, IRESSA™(게피티닙), TARCEVA™(에를로티닙 하이드로클로라이드), EGFR에 대한 항체, GLEEVEC™(이마티닙), 인트론, ara-C, 아드리아마이신, 사이톡산, 젬시타빈, 우라실 머스타드, 클로르메틴, 이포스파미드, 멜팔란, 클로람부실, 피포브로만, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌티오포스포라민, 부설판, 카르무스틴, 로무스틴, 스트렙토조신, 다카르바진, 플록수리딘, 시타라빈, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 플루다라빈 포스페이트, 펜토스타틴, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 블레오마이신, 독소루비신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 에피루비신, 이다루비신, 미트라마이신, 데옥시코포르마이신, 미토마이신-C, L-아스파라기나제, 테니포사이드, 17α-에티닐에스트라디올, 디에틸스틸베스트롤, 테스토스테론, 프레드니손, 플루옥시메스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 테스토락톤, 메게스테롤아세테이트, 메틸프레드니솔론, 메틸테스토스테론, 프레드니솔론, 트리암시놀론, 클로로트리아니센, 하이드록시프로게스테론, 아미노글루테티미드, 에스트라무스틴, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 류프롤리드, 플루타미드, 토레미펜, 고세렐린, 카르보플라틴, 하이드록시우레아, 암사크린, 프로카르바진, 미토탄, 미톡산트론, 레바미솔, 나벨벤, 아나스트라졸, 레트라졸, 카페시타빈, 렐록사핀, 드롤록사핀, 헥사메틸멜라민, 아바스틴, 헤르셉틴, 벡사르, 벨케이드, 제발린, 트리세녹스, 젤로다, 비노렐빈, 포르피머, Erbitux™(세툭시맙), 리포솜, 티오테파, 알트레타민, 멜팔란, 트라스투주맙, 레로졸, 풀베스트란트, 엑세메스탄, 풀베스트란트, 이포스포미드, 리툭시맙, C225, 캄패스, 카르보플라틴, 프로카르바진, 메클로레타민, 사이클로포스파미드, 캄프토테신, 이포스파미드, 멜팔란, 클로람부실, 부설판, 니트로스우레아, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 블레오마이신, 플리코마이신, 미토마이신, 에토포사이드(VP 16), 타목시펜, 랄록시펜, 에스트로겐 수용체 결합제, 파클리탁셀, 겜시타빈, 나벨빈, 파르네실-단백질 트랜스퍼라제 억제제, 트랜스플레티늄, 5-플루오로우라실, 빈크리스틴, 빈블라스틴 및 메토트렉세이트, 또는 상기한 것들의 임의의 유사체 또는 유도체 변이체의 사용을 포함한다.

ii. 방사선요법

DNA 손상을 유발하고 광범위하게 사용되는 다른 인자는 일반적으로 감마선, X선 및/또는 종양 세포로의 방사성 동위원소의 유도 전달로서 공지된 것을 포함한다. 마이크로파 및 UV 조사와 같은 다른 형태의 DNA 손상 인자도 또한 고려된다. 이러한 모든 요인이 DNA, DNA 전구체, DNA 복제 및 복구, 염색체 조립 및 유지에 대한 광범위한 손상 범위에 영향을 미칠 가능성이 가장 높다. X선의 선량 범위는 장기간의 경우(예: 3 내지 4주), 50 내지 200뢴트겐의 1일 선량에서 2000 내지 6000뢴트겐의 단일 선량 범위이다. 방사성 동위원소의 선량 범위는 매우 다양하며 동위원소의 반감기, 방출되는 방사선의 강도와 유형, 신생물 세포에 의한 흡수에 따라 다르다. 세포에 적용될 때 용어 "접촉된" 및 "노출된"은 치료 작제물 및 화학요법제 또는 방사선요법제가 표적 세포에 전달되거나 표적 세포와 직접 병치되는 과정을 기재하기 위해 본원에 사용된다. 세포 사멸 또는 정지를 달성하기 위해, 두 제제는 세포를 사멸시키거나 분열을 방지하기에 효과적인 조합된 양으로 세포에 전달된다.

iii. 면역요법

면역치료제는 일반적으로 암 세포를 표적으로 하고 파괴하기 위한 면역 이펙터 세포 및 분자의 사용에 의존한다. 면역 이펙터는, 예를 들어, 종양 세포의 표면 상의 일부 마커에 특이적인 항체일 수 있다. 항체 단독은 요법의 이펙터로서 작용할 수 있거나, 실제로 세포 사멸에 영향을 주기 위해 다른 세포를 모집할 수 있다. 항체는 또한 약물 또는 독소(화학요법제, 방사성 뉴클레오티드, 리신 A 쇄, 콜레라 독소, 백일해 독소 등)에 접합될 수 있고, 단지 표적화제로서 작용할 수 있다. 대안적으로, 이펙터는 종양 세포 표적과 직접 또는 간접적으로 상호작용하는 표면 분자를 운반하는 림프구일 수 있다. 다양한 이펙터 세포는 세포독성 T 세포 및 NK 세포를 포함한다.

따라서, 면역요법은 유전자 요법과 함께 조합된 요법의 일부로서 사용될 수 있다. 조합된 요법을 위한 일반적인 접근법은 아래에서 논의된다. 일반적으로, 종양 세포는 표적화할 수 있는 일부 마커를 보유해야 한다, 즉 대부분의 다른 세포에는 존재하지 않는다. 많은 종양 마커가 존재하고, 이들 중 임의의 것은 본 개시내용의 맥락에서 표적화에 적합할 수 있다. 통상적인 종양 마커는 암배아 항원, 전립선 특이적 항원, 요로 종양 관련 항원, 태아 항원, 티로시나제(p97), gp68, TAG-72, HMFG, 시알릴 루이스 항원, MucA, MucB, PLAP, 에스트로겐 수용체, 라미닌 수용체, erb B 및 p155를 포함한다.

iv. 유전자 요법

또 다른 구현예에서, 2차 치료는 치료적 폴리뉴클레오티드가 제1 화학요법제 이전, 이후 또는 동시에 투여되는 2차 유전자 요법이다. 유전자 산물을 인코딩하는 벡터와 함께 화학요법제의 전달은 표적 조직에 대해 조합된 항과증식성 효과를 가질 것이다.

v. 수술

암에 걸린 사람의 대략 60%는 예방, 진단 또는 병기, 치료 및 완화 수술을 포함하는 몇몇 유형의 수술을 받게 될 것이다. 치료적 수술은 본 개시내용의 치료, 화학요법, 방사선요법, 호르몬 요법, 유전자 요법, 면역요법 및/또는 대안적인 요법과 같은 다른 요법과 함께 사용될 수 있는 암 치료이다. 치료적 수술은 암성 조직의 전부 또는 일부가 물리적으로 제거되고, 절제되고/되거나 파괴되는 절제를 포함한다. 종양 절제는 종양의 적어도 일부의 물리적 제거를 지칭한다. 종양 절제 이외에, 수술에 의한 치료는 레이저 수술, 극저온 수술, 전기 수술, 및 현미경으로 제어되는 수술(모스 수술)을 포함한다. 본 개시내용은 표재성 암, 전암, 또는 부수적인 양의 정상 조직의 제거와 관련하여 사용될 수 있음이 추가로 고려된다.

IV. 실시예

하기 실시예는 상기 개시내용을 예시하기 위한 것이며, 그 범위를 좁히는 것으로 해석되어서는 안된다. 당업자는 실시예가 본 개시내용이 실시될 수 있는 많은 다른 방법을 제시한다는 것을 쉽게 인식할 것이다. 본 개시내용의 범위 내에서 유지하면서 다수의 변형 및 변경이 이루어질 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 본 개시내용은 다음의 비제한적인 예에 의해 추가로 이해될 수 있다.

실시예 1- 물질 및 방법

마우스. 암컷 C57BL/6J 및 Rag1^-/- 마우스는 UT 남서부 마우스 번식 코어에서 구입했다. C57BL/6J 배경에서 Myd88^-/-, Tlr4 ^-/- , Tlr9^-/-, Batf3^-/- 및 OT1CD8⁺ T 세포 수용체(TCR)-Tg 마우스 및 NSG-SMG3 마우스는 잭슨 실험실(Jackson Laboratory)로부터 구입하였다. Ifnar1^-/- 마우스는 시카고 대학(University of Chicago)의 Dr. Anita Chong에 의해 제공되었다. 모든 마우스는 특정 병원균 부재 조건에서 유지시켰다. 동물 관리 및 실험은 기관 및 국립 보건원 프로토콜 및 지침에 따라 수행되었다. 이 연구는 University of Texas Southwestern Medical Center의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았다.

세포주 및 시약. MC38, TC-1, b16, Panc02, Ag104Ld 및 A549 세포를 37℃ 에서 5% CO₂하에서 10% 열-불활성화된 태아 소 혈청, 100 U/ml 페니실린 및 100 U/ml 스트렙토마이신이 보충된 DMEM 또는 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. β-라파콘은 기재된 바와 같이 합성되었고(Pink et al., 2000), 시험관내 연구를 위해 DMSO에 용해시켰다. 카탈라제, 디쿠마롤 및 FTY720은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)에서 구입했다. OT-1 펩티드 및 OVA 단백질은 써모피셔(ThermoFisher)로부터 유래된다. 항-CD4(GK1.5), 항-CSF1R(AFS98), 항-IFNAR1(MAR1-5A3), 항-PD-L1(10F.9G2), 항-CD8(YTS) 및 항-HMGB1 mAb는 바이오엑스셀(BioXCell)로부터 구입했다.

설포로다민 B(SRb) 세포독성 검정. 4,000개의 세포를 3중으로 96 또는 48웰 플레이트에 심었다. 밤새 성장시킨 후, 세포를 NQO1 억제제 디쿠마롤(50μM)의 존재 또는 부재하에 3시간 펄스 동안 β-라파콘에 노출시켰다. 그 후, 세포 상청액을 새로운 배지로 교체하고, 플레이트를 5% CO₂를 갖는 가습 인큐베이터에서 37℃에서 추가로 2일 또는 4일 동안 배양했다. 치료 후, 배양 상청액을 제거하고 고정 시약을 각 웰에 부드럽게 첨가하였다. 웰을 물로 세척하고, 플레이트를 밤새 공기 건조시켰다. 100μL SRB 염료 용액을 첨가하고, 30분 동안 배양한 후 세척 및 공기 건조시켰다. 세포 성장은 마이크로플레이트 판독기(SpectroSTAR Nano, BMG Labtech)에서 560nM에서의 흡광도에 의해 결정되었다. % 세포 성장 = (100 × (세포 대조군 - 실험)) ÷ (세포 대조군).

NQO1 녹아웃 및 과발현. MC38 세포에서 NQO1 유전자는 CRISPR/Cas9 기술에 의해 녹아웃되었다(knock out). 가이드 서열 5'-TTGTGTTCGGCCACAATATC-3'를 푸로마이신 선택 유전자를 함유하는 pSpCas9 (BB)-2A-Puro 플라스미드(Addgene, # 62988)에 클로닝하였다. 플라스미드를 MC38 세포내로 일시적으로 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후, 푸로마이신 내성 세포를 선택하고, 선택적 배양 배지하에서 서브클로닝하였다. NQO1 발현 없이 MC38 세포 클론(#1, #2, 및 #5)을 시험관내 및 생체내 연구에 사용하였다. NQO1 과발현에 대해, B16 세포(NQO1 null)는 전장 마우스 NQO1 단백질 발현 벡터(pCMV3-HA-NQ01)로 일시적으로 형질감염시켰다. NQO1 안정 발현 세포를 선택하고, 하이그로마이신 함유 배양 배지하에 서브클로닝하였다. NQO1 안정 발현을 갖는 B16 세포 클론(#1, #3 및 #4)을 다음 연구에 사용하였다. NQO1 발현 수준은 웨스턴 블롯팅 검정에 의해 결정되었다.

종양 성장 및 치료. 대략 6×10⁵ MC38 세포 또는 1.5×10⁵ TC-1, 또는 1.5×10⁵ B16 세포를 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 접종하였다. 종양이 특정 크기로 성장될 때 종양 보유 마우스를 무작위로 치료 그룹으로 그룹화했다. β-lap 단일요법의 경우, 종양 보유 마우스는 β-lap으로 국소적으로(종양내, 0.03mg, 0.1mg 또는 0.3mg, 격일로 4회) 또는 전신적으로(정맥내 또는 복강내, 25 또는 30mg/kg 격일로 4 또는 6회) 처리했다. CD4 및 CD8 T 세포 고갈을 위해, 200㎍의 항체를 3일 간격으로 4회 복강내 주사하였다. 대식세포 고갈의 경우, 100㎍의 항-CSF1R mAb를 β-lap 치료 동안 3일 간격으로 3회 종양내 주사하였다. I형 IFN 차단 실험의 경우, 150㎍의 항-IFNAR1 차단 mAb를 3일 간격으로 총 3회 종양내 주사하였다. 상기 차단 및 고갈 실험은 첫 번째 β-lap 치료 하루 전에 시작했다. HMGB1 차단 실험의 경우, 200㎍의 항-HMGB1 mAb를 첫 번째 β-lap 치료와 같은 날 시작하여 3일 마다 총 3회 복강내(i.p.) 투여했다. PD-L1 체크포인트 차단 병용 요법의 경우, 100㎍(MC38 모델의 경우) 또는 150㎍의 항-PD-L1(클론 10F.9G2)을 첫 번째 β-lap 치료와 같은 날 시작하여 3일 마다 총 3회에 걸쳐 종양 보유 마우스에 복강내 투여하였다. 종양 용적은 적어도 주 2회 측정되었고, 0.5 × 길이 × 너비 × 높이로 계산되었다.

면역 재구성된 마우스 모델. C57BL/6 Rag1-/- 면역 재구성된 모델(Lee et al., 2009; Tang et al., 2016)의 경우, 2x10⁶ A549 세포를 암컷 Rag1-/- 마우스에 피하 접종하였다. 종양이 잘 확립된 후(약 100mm³), OTI 유전자도입 마우스의 2 x 10⁶ 총 LN 세포를 치료 하루 전에 종양 보유 마우스에 정맥내 주사하였다. 이후에, 마우스는 β-lap으로 격일로 4회 국소적으로(i.t., 0.2mg) 처리하였다. 종양 용적은 매주 적어도 2회 측정하였다.

NSG-SGM3 인간화 마우스 모델의 경우, 4주령 NSG-SGM3 암컷 마우스에 인간 CD34+ 세포 전달 하루 전에 100cGy(X-RAD 320 방사선 조사기로 X선 조사)를 조사했다. 조사된 마우스는 Bactrim(Aurora Pharmaceutical LLC) 물로 2주 동안 처리했다. 제대혈은 UT 사우스웨스턴 파크랜드 병원에서 입수했다. 인간 CD34+ 세포는 밀도 구배 원심분리(Ficoll® Paque Plus, GE Healthcare)에 이어 항-인간 CD34 마이크로비드(Stem Cell)를 사용한 양성 면역자기 선택에 의해 제대혈로부터 정제되었다. 10⁵개의 CD34+ 세포를 각 수용자 마우스에 정맥내 주사했다. 생착 12주 후, 40% 이상의 인간 CD45⁺ 세포 재구성을 갖는 인간화 마우스 및 연령 및 성별이 일치된 인간화되지 않은 마우스는 우측 옆구리에 2 x 10⁶ A549 종양 세포를 피하 접종하였다. 19일째에, 종양 보유 마우스를 격일로 4회 β-lap으로 국소(i.t., 0.2mg) 처리하였다. 종양 용적은 적어도 주 2회 측정하였다. 모든 실험은 UTSW 인간 조사 위원회 프로토콜 및 UTSW 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 따라 수행되었다.

HMGB1 방출 검출. 종양 세포를 6-웰 플레이트에 심고, 70% 컨플루언스(confluence)로 성장시키고, 3시간 동안 증가하는 농도의 β-lap으로 처리하고, 이어서 세척하고 배지 교체하였다. 24시간 후, 상청액을 ELISA KIT(Chondrex)를 사용하여 세포외 HMGB1에 대해 검정했다.

IFNγ 효소 결합 면역흡착 스폿 검정(ELISPOT). 종양 보유 마우스로부터 종양 배수 LN 및 비장을 수집하고, 단일 세포 현탁액을 제조하였다. 조사된 종양 세포 또는 OT-1 펩티드를 사용하여 종양 특이적 T 세포를 재자극하였다. 일반적으로, 총 2-4×10⁵개의 LN 세포 또는 비장세포 및 2-4×10⁵개의 조사된 종양 세포를 48시간 동안 공배양하였고, 제조사의 지침에 따라 IFNγ ELISPOT 키트(BD Bioscience)를 이용하여 ELISPOT 검정을 수행하였다. 스팟은 ImmunoSpot Analyzer(Cellular Technology Limited)로 계산했다.

조직으로부터 세포 단리. CD11c⁺ DC 또는 CD8⁺ T 세포는 제조사의 지침에 따라 양성 CD11c 단리 키트 또는 음성 CD8 단리 키트(Stemcell)를 사용하여 마우스의 림프절 또는 비장에서 단리시켰다. 종양 단일 세포 현탁액의 경우, 종양 조직을 작은 조각으로 절단하고, 37℃ 진탕 배양기에서 45분 동안 소화 완충제(1.5 mg/ml I형 콜라게나제 및 100μg/ml DNase I)에 재현탁시켰다. 소화 후, 세포를 70-μm 세포 스트레이너를 통해 통과시켰다.

유세포 분석. 종양 세포 현탁액을 항-CD16/32 항체(클론 2.4G2)로 10분 동안 차단시킨 후, 암흑에서 4℃에서 30분 동안 표시된 항체와 함께 배양하였다. 고정가능한 생존력 염료 eFlour 506(eBioscience)을 사용하여 사멸 세포를 배제하였다. 샘플을 cytoFLEX(Backman coulter) 유세포 분석기로 분석하였다.

DCFDA 세포 ROS 검출 분석. 세포 ROS의 수준은 제조사의 지침에 따라 DCFDA-세포 ROS 검출 검정 키트(Abeam)에 의해 결정되었다. 간략하게, 세포를 12-웰 플레이트에 플레이팅하고, 약 70% 컨플루언스로 성장시키고, 30분 동안 37℃에서 DCFDA로 염색시켰다. 그 후, 세포를 상이한 농도의 β-lap으로 3시간 동안 처리하였다. ROS 신호는 Ex/Em:485/535nm에서 유세포 분석법을 사용하여 결정하였다.

통계 분석. 모든 데이터 분석은 GraphPad Prism 통계 소프트웨어로 수행하였고, 평균 ± SEM으로 나타내었다. ^*P < 0.05, ^**p < 0.01, ^***p < 0.001 및 ^****p < 0.0001은 2원 ANOVA 또는 짝을 이루지 않은 양측 t 테트트에 의해 결정된다. p < 0.05의 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.

실시예 2 - 결과

β-lap은 시험관내 및 생체내 모두에서 NQO1 의존 방식으로 뮤린 종양 성장을 억제한다. 다중 뮤린 암 세포주는 β-lap 기능에서 NQO1의 역할을 조사하기 위해 사용되었다. 높은 수준의 NQO1(도 17a)을 발현하는 종양 세포주(MC38 결장직장 선암종, TC-1 폐암 및 Ag104Ld 섬유육종)는 3시간 β-lap 노출(도 1a)에 민감했다. 대조적으로, NQO1 결핍 세포주인 B16(흑색종) 및 Panc02(췌장암)(도 17a)는 β-lap노출에 대해 내성이었다(도 1a). NQO1 특이적 억제제인 디쿠마롤은 NQO1 매개 치사율을 역전시켰다(도 1b). 다음으로, 본 발명자들은 NQO1의 고갈이 β-lap의 세포독성을 폐지하는지 여부를 결정하였다. CRISPR 매개 NQO1 녹아웃(도 17b)은 MC38 세포에 β-lap 치료에 대한 내성을 부여했다(도 1c; 도 17c). 유사하게, B16 세포에서 NQO1의 과발현(도 17d)은 β-lap에 대한 민감성을 유도하고(도 1d; 도 1e), 디쿠마롤에 의한 NQO1의 억제는 β-lap 치사율을 보존하였다(도 17f). β-lap의 치사량은 카스파제 활성화 없이 빠른 세포 팽창, 막 파열 및 아넥신 V+/7AAD+ 세포 사멸을 야기했다(도 1e 및 데이터는 표시되지 않음). NQO1은 β-lap의 2-전자 산화환원을 촉매하여 높은 수준의 ROS(즉, 과산화수소/H₂O₂)를 생성하여 대량의 DNA 산화와 세포 사멸을 유발한다(Huang et al., 2016). 실제로, β-lap-유도된 높은 수준의 ROS는 NQO1 양성 뮤린 종양 라인에서, 그리고 NQO1 null 라인에서는 훨씬 적다(도 1f-1g). 디쿠마롤에 의한 NQO1의 억제는 이러한 효과를 폐지했다(도 1f-g). 다음으로, 본 발명자들은 ROS를 중화시키는 것이 β-lap 유도된 세포 치사율을 억제할 수 있는지 여부를 결정하였다. H₂O₂ 제거 효소인 카탈라제는 β-lap-매개 치사율을 유의하게 보존하였다(도 1h; 도 17g). 이러한 결과는 β-lap이 시험관내에서 집중적인 종양 특이적 ROS 생산을 통해 NQO1+ 종양 세포 사멸을 유도함을 시사한다.

본 발명자들은 각각 상이한 NQO1 수준을 갖는 3개의 피하 동계 종양 모델: MC38, TC-1 및 B16에서 β-lap의 항종양 효능을 추가로 조사하였다. MC38 종양 모델에서, 25mg/kg의 β-lap을 종양 접종 후 7일째에 종양 보유 WT C57BL/6 마우스에 전신(정맥내) 투여하였다. β-lap으로 치료하면 현저한 종양 억제를 초래했다(도 1i). β-Lap은 전신적으로 전달될 때 다양한 세포에 작용할 수 있다. 종양 퇴행을 위해 국소 종양 환경 내에서 β-lap이 기능하는지 여부와 기능하는 방법을 기계적으로 조사하기 위해, 다양한 투여량의 β-lap을 총 4회 투여량에 대해 격일로 종양내 주사하였다. 국소 치료는 또한 용량 의존 방식으로 종양 성장을 유의하게 억제했다. 종양 성장 억제율(TGI, %)은 전신 β-lap 치료를 받은 마우스의 경우 62.5%, 국소 β-lap(1.5mg/kg mg, 5mg/kg 및 15mg/kg mg) 치료를 받은 마우스의 경우 11.8%, 69.4% 및 89.3%였다(도 1i). 특히, 훨씬 더 낮은 용량의 β-lap(15mg/kg)을 사용한 국소 치료는 전신 치료보다 더 강력한 종양 퇴행을 유도했고 마우스의 46.7%(7/15)가 완전한 종양 거부를 달성했으며(도 1i), 이는 주요 작용 부위가 국소 종양 미세환경과 관련이 있을 수 있음을 시사한다. 시험관내 연구와 일치하게, β-lap의 치료 효과는 NQO1 녹아웃 MC38 마우스 모델에서 폐지되었다(도 1j). 유사하게, TC-1, HPV E6/E7 형질전환된 종양 모델에서, β-lap 치료는 또한 상당한 종양 억제를 유도하였다(도 17h). 생체내 β-lap의 특이성을 추가로 확인하기 위해, 본 발명자들은 WT C57BL/6 WT 마우스에서 부모 NQO1 결핍 또는 NQO1 과발현 B16 세포 클론(#1 및 #4)을 사용하여 피하 이종이식편을 확립했다. 예상된 바와 같이, NQO1null 종양은 β-lap 치료에 반응하지 않았다(도 17i). 극명하게 대조적으로, NQO1 과발현(클론 #1 및 #4) 종양 보유 마우스는 β-lap 치료 후 극적인 종양 억제를 나타냈다(도 17i). 참고로, NQO1을 과발현하는 B16 종양은 B16 부모 세포보다 훨씬 빠르게 성장하여 NQO1이 생체내 종양 성장을 촉진함을 나타낸다(Oh et al., 2016). 이러한 결과는 β-lap이 시험관내 및 생체내에서 NQO1 양성 뮤린 종양 성장을 선택적으로 억제한다는 증거를 제공한다. NQO1은 β-lap 매개 항종양 효과에 필수적이며 충분하다.

β-lap 매개-항종양 효과는 CD8 ⁺ T 세포에 의존한다. β-lap이 종양 세포를 사멸시키는 방법에 대한 대부분의 연구는 암 세포 자율 메커니즘에 초점을 맞추었다(Huang et al., 2016; Pink et al., 2000; Li et al., 2016). 여기서, 본 발명자들은 β-lap 매개 항종양 효과가 면역계와 관련되는지 여부를 물었다. 그들은 적응형 면역에 대한 β-lap의 효과를 연구하기 위해 면역 적격 마우스와 면역 결핍 마우스에서 각각 MC38 종양을 확립했다. 단 4회 투여량의 β-lap 치료 후, 50%의 마우스가 치료된 WT C57BL/6 마우스에서 MC38 종양이 근절되었다(도 2a). 예기치 않게, β-lap은 면역 결핍 Rag1 KO(Rag1^-/-) C57BL/6 마우스에서 치료 활성을 상실하였다(도 2a). 유사한 효과가 NQO1 과발현 B16 종양 모델(도 18a) 및 TC-1 모델(데이터는 표시되지 않음)에서 관찰되었으며, 이는 생체내 β-lap의 심오한 항종양 효과에 적응형 면역 시스템이 필요함을 시사한다. 실제로, 본 발명자들은 대조군 MC38 종양과 비교하여 β-lap 처리된 종양에서 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포의 증가를 발견하였고(도 18b), 이는 T 세포의 일부 서브세트가 적응 면역에 기여할 수 있음을 시사한다. 어떤 T 세포 서브세트가 필수적이었는지를 테스트하기 위해, 마우스를 β-lap 치료와 함께 항-CD4 또는 항-CD8 고갈 항체로 처리했다. β-lap 단독 또는 CD4⁺ T 세포 고갈과 조합된 β-lap을 사용한 치료가 MC38 종양 성장을 제어한 반면, CD8⁺ T 세포 고갈은 β-lap의 항종양 효과를 폐지했다(도 2b; 도 18c). 이 데이터는 CD4⁺ T 세포가 아닌 CD8⁺ T 세포가 β-lap 매개 종양 퇴행에 필요함을 시사한다. TC-1 종양을 보유하는 마우스에서 유사한 결과가 수득되었다(도 2c). β-lap-매개 항종양 반응이 연장된 보호 T 세포 면역을 초래하는지 여부를 결정하기 위해, 본 발명자들은 치사량의 MC38 세포로 β-lap 치료 후 완전한 MC38 종양 거부를 겪은 마우스를 재도전시켰다. 모든 β-lap 치료된 마우스는 재도전된 종양을 거부했으며(도 2d), 이는 β-lap 치료 후 기억 T 세포의 생성을 나타낸다.

인간 종양을 제어하는 데 있어서 β-lap의 효능을 테스트하기 위해, 본 발명자들은 면역-재구성된 C57BL/6 Rag1^-/-(도 2e) 및 NSG-SGM3 마우스(도 2f)에서 2개의 이종이식 모델을 개발하였다. NQO1을 고도로 발현하는 인간 폐 암종 세포주 A549는 시험관내 β-lap 치료에 민감하였다(도 18d). C57BL/6 Rag1^-/-면역 재구성 모델(Lee et al., 2009; Tang et al., 2016)에서, A549 세포를 피하 접종했다. 종양이 잘 확립된 후(약 100mm³), OTI 유전자도입 마우스의 총 2 x 10⁶ 림프절(LN) 세포를 종양 보유 Rag1^-/- 마우스로 옮겨 종양 성장을 감소시키지 않고 소수의 T 세포를 재구성했다. OTI 유전자도입 마우스의 LN 세포는 인간 종양 항원에 반응할 수 없지만 소수의 비-OTI T 세포의 항상성 증식을 억제하는 약 98% OVA 특이적 T 세포를 함유한다. 비-OT-1 T 세포의 작은 분획은 인간 환자의 종양 반응성 T 세포 수인 200-1000개 클론에 가까운 인간 종양 항원을 인식할 가능성을 갖는다. T 세포 전달 없이, β-lap 치료는 A549 종양 성장을 부분적으로만 억제했다. 그러나, T 세포의 존재에서, β-lap은 종양의 50%가 완전히 거부된 보다 강력한 종양 퇴행을 유도하였고(도 2e), 이는 β-lap-매개 항종양 효과가 T 세포에 크게 의존함을 나타낸다. 인간 특이적 시스템에서 β-lap 매개 종양 억제에서 T 세포 기능을 연구하기 위해, 본 발명자들은 인간 골수 세포 증식을 지원하고 인간 면역계를 보다 잘 모방하는 생체내 조건 및 자연 종양 미세환경(Morton et al., 2016)을 제공하는 NSG-SGM3 마우스를 사용하여 차세대 인간화 이종이식 모델을 추가로 개발했다. 인간 CD34+ 조혈 줄기 세포(Hu-NSG-SGM3)가 주사된 NSG-SGM3 마우스는 인간 CD45, CD3, CD4 및 CD8 백혈구 마커를 사용하여 유세포 분석에 의해 측정된 강력한 생착 효율을 보여주었다. 나이브 NSG-SGM3 및 Hu-NSG-SGM3 마우스에 A549 세포를 개별적으로 접종하고, β-lap으로 처리하였다. 특히, 인간 면역계의 존재하에서 β-lap 치료는 훨씬 더 나은 종양 조절을 유도하였고, 이는 재구성된 면역계가 β-lap의 항종양 효과를 회복하였음을 나타낸다(도 2f). 본 발명자들은 종양 미세환경에서 종양 침윤된 면역 세포를 추가로 조사하였고, β-lap 치료 후 종양 조직에서 CD45⁺ 세포, 및 CD8⁺ T 세포의 유의한 증가를 발견했지만 CD4⁺ T 세포는 그렇지 않음을 발견하였다. 함께, 이러한 데이터는 β-lap 유도 종양 제어에서 T 세포의 필요성을 보여준다.

β-lap-유도-항종양 효과는 수지상 세포-매개 T 세포 교차-프라이밍에 의존한다. CD8+ T 세포가 β-lap의 항종양 효능에 필수적임을 감안하여, 본 발명자들은 β-lap 치료가 항원 특이적 T 세포 반응을 증가시킨다는 가설을 세웠다. CD8 T 세포에 대한 β-lap의 직접적인 효과를 배제하기 위해, 본 발명자들은 CD8 T 세포에 대한 NQO1의 발현 및 CD8 T 세포의 생존, 증식 및 기능에 대한 β-lap의 효과를 평가하였다. 결과는 비장의 나이브 CD8 T 세포도 종양 침윤성 CD8 T 세포도 NQO1을 발현하지 않았다는 것을 보여주었다. 더욱이, β-lap의 종양 치사량은 CD8 T 세포 아폽토시스 및 항-CD3/CD28 자극 세포 증식 및 IFNγ 생산에 영향을 미치지 않았다. β-lap이 항원 특이적 T 세포 반응을 증가시키는지를 테스트하기 위해, 초기 β-lap 치료 후 10일째에 MC38 종양 보유 마우스의 비장세포를 수집하고, 활성화된 T 세포의 이펙터 기능을 측정하기 위해 IFGNγ ELISPOT 검정을 수행했다. 나타낸 바와 같이, 종양 자극(조사된 종양 세포)의 존재하에, IFNγ-생산 T 세포는 β-lap 치료 그룹에서 극적으로 증가했다(도 3a). 본 발명자들은 T 세포 반응을 더 잘 추적하기 위해 OTI 펩티드를 사용하여 MC38-OVA 세포주를 추가로 생성하였다. 유사하게, IFNγ ELISPOT 검정 OTI 펩티드에서, OTI 특이적 T 세포의 수는 β-lap 치료 후 마우스의 비장에서 훨씬 더 높았다(도 3b). 종양 특이적 CD8 세포의 증가는 β-lap 치료가 종양 성장을 제어하기 위해 교차 프라이밍을 유도하고 T 세포를 재활성화할 수 있음을 시사한다. 수지상 세포(DC) 또는 대식세포와 같은 APC에 의한 교차 제시는 종양 특이적 T 세포를 활성화하는 주요 프라이밍 메커니즘으로 간주된다. 어떤 APC가 필수적인 β-lap 유도 항종양 효과인지를 더 명확히 하기 위해, 본 발명자들은 먼저 항-CSF1R Ab를 사용하여 종양 조직에서 대식세포를 고갈시켰다(Tang et al., 2018). 나타낸 바와 같이, 대식세포 고갈은 β-lap 치료에 대한 MC38 보유 마우스의 반응에 영향을 미치지 않았다(도 3c). Batf3 의존적 DC CD8α⁺ 또는 CD103⁺ DC)는 CD8⁺ T 세포를 직접 활성화하기 위해 괴사성 종양 세포 유래 에피토프의 교차 제시를 전문적으로 다룬다(Sanchez-Paulete et al., 2016; Broz et al., 2014; Salmon et al., 2016). Batf3^-/- 마우스는 기능적 CD8α⁺ 또는 CD103+ DC가 부족하고, 손상된 세포 교차 제시 활성을 갖는다. WT 마우스에서, β-lap 치료는 강력한 종양 퇴행을 유도하였다(도 3d). 극명하게 대조적으로, 동일하게 처리된 Batf3-/- 마우스에서는 치료 효과가 나타나지 않았다(도 3d). β-lap이 교차 제시를 증가시킬 수 있다는 가능성을 추가로 다루기 위해, 본 발명자들은 종양 항원 특이적 T 세포의 프라이밍 및 활성화를 추적하기 위해 항원 특이적 시스템을 사용하였다. MC38-OVA 종양을 보유하는 WT 마우스를 β-lap으로 처리한 다음, DC를 종양 배수 림프절(TdLN)로부터 단리시키고 OTI 유전자도입 마우스의 CD8 T 세포와 공동 배양했다. IFNγ 분비를 측정하여 항원 특이적 T 세포를 프라이밍하는 DC의 능력을 평가하였다. 실제로, β-lap 치료 후, DC는 OTI T 세포에 의한 더 많은 IFNγ 생산을 유도하였다(도 3e). 이러한 결과는 DC 매개 교차 프라이밍이 β-lap-유도 종양 퇴행 및 종양 반응성 T 세포 반응에 필요하다는 것을 시사한다.

I형 IFN 및 TLR4/MyD88 신호전달이 β-lap 및 종양 특이적 CTL의 항종양 효과에 필요하다. 종양 미세환경의 APC는 기능 장애가 있어 T 세포의 비효율적인 프라이밍 및 활성화를 유발한다(Lee et al., 2009; Corrales et al., 2017). I형 인터페론(IFN)은 T 세포의 최적 교차 프라이밍에 필수적이다(Corrales et al., 2017; Deng et al., 2014). 본 발명자들은 I형 IFN 신호전달이 β-lap의 치료 효과에 필요한지 여부를 추가로 조사하였다. IFNAR1 차단 항체는 종양 미세환경에서 I형 IFN 신호전달을 중화시키기 위해 종양내 투여했다. 놀랍게도, I형 IFN을 차단하면 β-lap의 치료 효과를 유의하게 감소시켰다(도 4a). 종양 세포 또는 숙주 IFN 신호전달이 필수적인지 여부를 결정하기 위해, MC38 종양을 WT 및 IFNAR1 결핍(Ifnar-/-) C57BL/6 마우스에 접종한 후 β-lap 치료하였다. 결과는 IFNAR1 신호전달이 손상된 마우스에서 치료 효과가 폐지되었음을 보여주었다(도 4b). 예상된 바와 같이, 본 발명자들은 β-lap으로 처리된 종양에서 IFNγ 및 TNFα와 같은 다른 사이토카인으로서 상향조절된 IFNα/β 및 IFN 반응 유전자 CXCL10을 관찰하였다(도 19a-b). MyD88은 일부 화학요법제에 의해 I형 IFN 생산 및 항종양 면역에 관여하는 것으로 입증되었다(Sistigu et al., 2014; Zitvogel et al., 2015; Apetoh et al., 2007). MyD88 신호전달이 β-lap 치료에 필요한지 여부를 결정하기 위해, 종양 세포를 WT 및 MyD88 결핍(Myd88-/-) 마우스에 피하 이식했다. β-lap 유도 종양 퇴행은 동일한 치료 도식을 갖는 Myd88-/- 마우스에서 사라졌으며(도 4c), 이는 숙주 MyD88이 β-lap의 항종양 효과에 필수적임을 입증하였다. β-lap이 강력한 종양 세포 사멸을 유도할 수 있기 때문에, 본 발명자들은 이것이 또한 손상 관련 분자 패턴(DAMP)의 분비 및 종양 항원의 노출을 초래하여 항종양 면역 반응을 증가시킨다는 가설을 세웠다. 흥미롭게도, 둘 다 DAMP를 감지하기 위한 MyD88 신호전달의 주요 상류 수용체인 TLR9가 아닌 TLR4의 녹아웃은 또한 유사한 치료 내성을 야기하였다(도 4d; 도 19c). 이전 연구에서는 TLR4의 내인성 리간드 중 하나인 HMGB1(및 HMGB1/DNA 복합체)이 MyD88 의존 방식으로 DC 교차 프라이밍을 자극하는 위험 신호로 기능할 수 있음을 보여주었다(Apetoh et al., 2007). β-lap-유도된 종양 퇴행이 HMGB1 의존적인지 여부를 결정하기 위해, β-lap 치료와 함께 유리 HMGB1을 중화시키기 위해 항-HMGB1 mAb를 투여했다. 결과는 HMGB1 신호전달의 차단이 β-lap의 효과를 감소시켰고(도 4e), 이는 β-lap이 종양 미세환경에서 HMGB1 방출을 유도하여 TLR4/MyD88 경로를 통해 선천적 반응을 향상시킬 수 있음을 나타낸다는 것을 보여주었다. HMGB1의 필수적인 역할을 추가로 다루기 위해, 본 발명자들은 β-lap 치료와 함께 신호전달을 차단할 때 종양 특이적 T 세포 반응을 평가했다. MC38 종양 세포를 WT 또는 Tlr4-/- 또는 Myd88-/- C57BL/6 마우스에 피하 이식하고, 종양 보유 마우스를 항-HMGB1 Ab의 존재 또는 부재하에 β-lap으로 처리했다. 치료 후, 종양 배수 림프절(TdLN)의 림프구를 수집하고 IFNγ ELISPOT 검정에 적용했다. WT 마우스에서, β-lap 치료는 종양-반응성 T 세포의 수를 증가시켰고, 이 효과는 항-HMGB1 중화 Ab와 공동 투여될 때 폐지되었다(도 4f). 유사하게, Tlr4-/- 및 Myd88-/- 마우스에서는 WT 마우스에서와 비교하여 대조군에서 종양 반응성 T 세포가 훨씬 더 적었다(도 4f). 더 중요하게는, β-lap 치료는 이러한 결핍 마우스에서 종양 특이적 T 세포 반응을 향상시킬 수 없었다(도 4f). 이러한 결과는 TLR4/MyD88/I형 IFN 신호전달 캐스케이드가 β-lap 유도된 선천적 및 적응형 항종양 면역 반응에 필요함을 시사한다.

β-Lap 치료는 종양 면역원성 세포 사멸을 유도하고, 생체내에서 HMGB1-의존 항종양 T 세포 면역을 유발한다. 생체내 β-lap의 HMGB1-의존적 종양 특이적 T 세포 반응 및 HMGB1-의존적 항종양 효과는 β-lap이 종양에서 잠재적으로 면역원성 세포 사멸(ICD)을 유도할 수 있음을 시사했다. 이 가설을 테스트하기 위해, 본 발명자들은 시험관내에서 β-lap 처리된 종양 세포에서 ICD 특징인 HMGB1 분비를 체크했다. 실제로, 그들은 NQO1+ 종양 세포(MC38, TC-1 및 NQO1-과발현 B16 세포)에서 HMGB1의 용량 의존적 분비를 관찰했지만 NQO1-세포(B16 부모 세포)에서는 그렇지 않았다(도 5a). 디쿠마롤에 의한 NQO1 억제는 β-lap-유도 HMGB1 분비를 폐지했다(데이터는 표시되지 않음). 본 발명자들은 HMGB1 노출이 β-lap-유도 종양 세포 사멸의 면역원성을 지시할 수 있다고 추정하였다. HMGB1은 두 가지 실험에서 β-lap-유도 면역원성에 중요한 것으로 밝혀졌다: (i) 시험관내 β-lap에 의해 유도된 죽어가는 MC38-OVA 세포를 항-HMGB1Ab의 존재 또는 부재하에 C57BL/6 마우스의 옆구리에 주사하였다(도 5b). TdLN에서 종양 항원-특이적 T 세포(도 5c) 및 IFNγ 생산(도 5d)의 수가 결정되었고; (ii) 항-HMGB1Ab의 존재하에 β-lap-유도된 죽어가는 MC38-OVA 세포로 백신 접종을 받은 C57BL/6 마우스를 항종양 보호의 평가를 위해 MC38-OVA로 재도전하였다(도 5e-f). 나타낸 바와 같이, β-lap-유도된 죽어가는 세포로 백신접종된 마우스는 살아있는 세포로 백신접종된 마우스와 비교하여 더 많은 IFNγ-생산 항원 특이적 T 세포를 가졌다(도 5c-d). 그러나, 종양-특이적 T 세포 반응은 죽어가는 세포 및 항-HMGB1Ab 혼합물로 백신접종될 때 감소되었다(도 5c-d). 일관되게, TLR4-/- 마우스는 또한 동일한 죽어가는 세포로 백신접종된 경우 WT 마우스와 비교하여 감소된 종양 반응성 T 세포 및 IFNγ 생산을 나타내었다(도 5c-d). 적응형 면역 시스템을 활성화하는 β-lap-유도된 죽어가는 세포의 능력을 시험하기 위해, 본 발명자들은 면역적격 C57BL/6 마우스에서 예방적 종양 백신접종 모델을 사용하였다(도 5e). β-lap-유도된 죽어가는 세포에 의한 마우스의 면역화는 재도전된 종양의 성장을 방지하였다(도 5f). 특히, 마우스에 죽어가는 세포 및 항-HMGB1 중화된 항체로 백신접종한 경우 항종양 보호 효과가 감소되었다(도 5f). 이러한 결과는 β-lap이 ICD를 유도하고 HMGB1 의존 방식으로 항종양 면역원성을 향상시킴을 나타낸다.

β-lap은 항-PD-Ll 요법과 조합하여 큰 확립된 및 체크포인트 차단 불응성 종양을 근절한다. 임상 실습에서, 종양이 잘 확립된 환자는 복잡한 면역억제 네트워크를 생성할 수 있으며 일반적으로 면역요법에 불응성이다(Sharma et al., 2017; Smyth et al., 2016). 유사하게, 우리의 전임상 모델에서, 완전한 종양 거부는 β-lap 치료 후 작은 종양(약 50mm³)을 보유하는 마우스에서만 달성되었고(TGI, 93.0%; 도 6a-b), 큰 확립된 종양(약 150-200mm³)은 동일한 치료 프로토콜에 의해 부분적으로만 제어되었다(TGI, 59.36%; 도 6a-b). β-lap이 이의 작용 메커니즘의 일부로서 선천적 및 적응형 면역 반응을 유발한다는 발견은 진행된 및 체크포인트 차단 불응성 종양을 근절하기 위해 β-lap과 T 세포 체크포인트 차단(도 6a)의 조합을 위한 경로를 열었다. 이를 테스트하기 위해, 본 발명자들은 다음으로 확립된 대형 MC38 종양을 보유하는 마우스에서 국소 β-lap 치료(15mg/kg, i.t.)와 항-PD-L1 치료를 조합하였다. 진행된 MC38 종양은 항-PD-L1 단독에 대해 중등도의 반응만을 나타내었다(TGI, 63.25%, 도 6c). 극명하게 대조적으로, 조합 그룹의 마우스는 강력한 종양 제어 및 퇴행을 나타냈다(TGI, 96.86%; 도 6c; 도 20a). 특히, 종양-보유 마우스의 60%는 병용 치료에서 그들의 종양을 완전히 거부하였다(도 6c; 도 20a). 흥미롭게도, β-lap 및 면역요법의 상승 효과가 훨씬 더 낮은 용량(5 mg/kg, i.t.)의 β-lap을 국소적으로 사용하여 관찰되었다(도 20b). 최근 연구는 암 면역요법은 국소에 의해 향상되고 전신 화학요법 치료에 의해 폐지된다는 것을 보여주었다(Mathios et al., 2016; Ariyan et al., 2018). 전신 β-lap 치료가 임의의 면역억제 효과를 갖고 항-PD-L1 면역요법을 손상시키는지 여부를 추가로 평가하기 위해, MC38 종양 보유 마우스에 전신 β-lap 치료(30mg/kg, i.p.) 단일요법을 투여하거나 항-PD-L1과 조합했다(도 6d). β-lap 또는 항-PD-L1의 단일요법은 유사하게 중간 정도의 종양 성장 억제를 유도하였다(도 6e; 도 20c). 병용 치료는 종양의 25%가 완전히 거부된 항종양 작용에 대한 상승 효과를 나타냈고(도 6e; 도 20c), 종양 보유 마우스의 생존을 현저하게 개선시켰다(도 6f). B16 종양은 PD-L1을 발현하지만 면역원성이 낮고 PD-L1/PD-1 면역 체크포인트 차단에 반응하지 않는다(Chen et al., 2015; Curran et al., 2010). 본 발명자들은 β-lap 및 항-PD-L1 병용 치료의 치료 효능을 평가하기 위해 그들의 NQO1 과발현 B16 종양 모델을 사용하였다(도 20e). 예상된 바와 같이, B16 종양을 과발현하는 NQO1은 항-PD-L1 Ab 단독에 반응하지 못했다(도 20f). 대조적으로, β-lap 단일요법은 B16-NQO1 종양의 성장을 크게 억제하였다(TGI, 68.67%). 놀랍게도, PD-L1 차단과 조합될 때, β-lap은 현저한 상승적 항종양 효과를 가졌다(TGI, 88.76%; 도 20f).

β-lap과 PD-L1 차단 사이의 상승작용의 메커니즘을 추가로 설명하기 위해, 본 발명자들은 MC38-OVA 종양 모델에서 초기 치료 후 12일째에 종양 미세환경에서 종양 침윤된 면역 세포를 조사하고 종양 조직 및 비장에서 항원 특이적 T 세포를 추적했다. 그들은 β-lap 또는 항-PD-L1 단일요법으로 종양 조직에서 CD45⁺ 세포, CD8⁺ T 세포 및 CD8⁺ T 세포:Treg 세포 비율의 유의한 증가를 발견했다(도 6g). 중요하게는, 이러한 효과는 조합 그룹에서 극적으로 확대되었다(도 6g). 그들은 종양 조직과 비장에서 모델 항원 OVA257-264(OT1 펩티드)에 특이적인 CD8⁺ T 세포를 추가로 추적했다. 나타낸 바와 같이, β-lap도 항-PD-L1 단일요법도 종양 조직(도 6g) 및 비장(도 6h)에서 OT1 항원 특이적 T 세포를 증가시키지 않았다. 놀랍게도, 병용 요법은 종양 조직 및 비장 둘 다에서 종양 항원 특이적 T 세포를 강력하게 확장시켰다(도 6g-h). 이러한 결과는 β-lap 치료가 PD-L1 차단과 조합될 때 종양 면역원성을 향상시키고 T 세포 침윤 및 종양 특이적 T 세포 반응을 증가시켰음을 시사한다. 이러한 데이터는 큰 확립된 및 체크포인트 차단 불응성 NQO1-양성 종양을 제어하는 데 있어 β-lap과 PD-L1 차단 사이의 강력한 상승효과를 입증한다.

β-Lap은 종양-특이적 ROS 및 DNA 손상을 유도하며, NQO1 양성 세포의 프로그램된 괴사를 선택적으로 촉진한다. NSCLC, 췌장암, 결장암, 유방암 및 두경부암을 포함한 다수의 인간 암에서 특이적이고 고유하게 상승된 효소인 NQO1은 요법에 대해 종양 선택적 방식으로 활용될 수 있다. β-lap은 특히 PARP1 억제제와 조합될 때 상당한 항종양 효과를 나타냈다. 그러나, β-lap 매개 종양 특이적 DNA 손상과 세포 사멸이 면역계와 일부 상호작용을 갖는지 여부; β-lap이 면역원성 세포 사멸을 유발하고 숙주 면역계에 의존하는 종양 퇴행을 초래하는지 여부는 여전히 불분명하다. 이를 위해, 본 발명자들은 시험관내 및 면역적격 마우스에서 β-lap의 항종양 활성을 조사하였다. 나타낸 바와 같이, β-lap은 NQO1⁺ 뮤린 종양 세포주(MC38, TC-1, Ag104Ld)를 선택적으로 사멸시켰고, 이 효과는 디쿠마롤(DIC, 상당히 특이적 NQO1 억제제)에 의해 억제될 수 있으며, NQO1^- 세포(B16, pan02)에서는 발생하지 않는다(도 8a-b). NQO1⁺ 세포에서 β-lap에 3시간 노출 후 높은 수준의 H₂O₂가 생성되었지만 NQO1^- 세포에서는 그렇지 않았으며(도 8c), 이는 β-lap의 이상적인 표적화 효과를 시사한다. β-lap은 독특한 카스파제-독립적 방식에 의해 NQO1⁺ 암 세포 사멸을 유발하였고(도 8d), PARP1 매개 프로그램된 괴사를 유도하였다(도 8e).

마우스에서 β-lap의 항종양 효능은 숙주 적응형 면역 시스템을 필요로 한다. 본 발명자들은 NQO1-양성 뮤린 폐암 세포, TC-1을 보유하는 면역적격 및 면역결핍 마우스를 별도로 확립하였다. 3회 투여량의 β-lap 치료 후, 종양 퇴행은 TC-1 종양 보유 WT 마우스에서 발생했지만 적응형 면역 결핍 rag^-/- 마우스에서는 발생하지 않았다(도 9a). 이 결과는 생체내에서 β-lap의 심오한 항종양 효능을 위해 적응형 면역계가 필요했음을 시사했다. 어떤 T 세포 서브세트가 부담을 제어하는 데 필수적인지 테스트하기 위해, 마우스를 β-lap 치료와 함께 항-CD4 또는 항-CD8 고갈 항체로 처리했다. β-lap 단독 또는 항-CD4 항체와 조합된 β-lap에 의한 치료는 유사한 종양 성장 억제를 초래한 반면, β-lap + 항-CD8 항체와의 병용 요법은 β-lap 단독에 비해 종양 성장 억제의 완전한 실패를 야기하였다(도 9b). 이러한 데이터는 CD8⁺ T 세포가 β-lap 매개 종양 퇴행에 필요했음을 시사했다. 뮤린 결장암 모델인 MC-38 세포를 보유한 마우스에서도 유사한 결과가 수득되었다.

β-lap은 STING-의존적 DNA 감지 및 I형 IFN 신호전달에 의존하는 종양 퇴행을 유도한다. I형 IFN은 다양한 항종양 요법의 개시 후 항종양 T 세포 반응을 개시하여 선천적 면역과 적응형 면역을 연결하는 잠재적인 주요 위험 신호로서 부상했다. I형 IFN이 β-lap-유도 종양 퇴행에 관여하는지 여부를 테스트하기 위해, 본 발명자들은 I형 IFN 신호전달을 차단하는 두 가지 모델을 생성했다: 종양 미세환경에서 항-IFNAR(인터페론-알파/베타 수용체) 차단 항체의 주사(도 10a) 및 마우스에서 숙주 IFNAR 유전자의 녹아웃(도 10). 본 발명자들은 미세환경에서 I형 IFN 신호전달의 차단이 β-lap의 항종양 효능을 크게 손상시킨다는 것을 발견하였다(도 10a). 이러한 결과와 일치하게, β-lap-유도 종양 퇴행은 WT 마우스에서와 비교하여 IFNAR 녹아웃 마우스에서 완전히 폐지되었으며(도 10b), 이는 I형 IFN이 β-lap-매개 종양 퇴행에 필수적인 사이토카인일 수 있음을 시사한다. 최근에, TLR/MyD88 경로와 STING 매개 세포질 DNA 감지 캐스케이드는 모두 I형 IFN 생산의 주요 메커니즘인 것으로 입증되었다. MyD88 및 STING 신호전달 경로가 β-lap 치료에 대한 반응을 매개하는 데 필요한지 여부를 조사하기 위해, TC-1 세포를 WT, MyD88 또는 STING 결핍 마우스에 이식했다. 본 발명자들은 β-lap 치료 후, WT 마우스(도 10c) 및 MyD88 결핍 마우스(데이터는 표시되지 않음)에서 종양 부담이 상당히 감소된 반면, 숙주 STING의 부재는 β-lap의 항종양 효능을 유의하게 손상시켰다(도 10c)는 것을 발견했다. 이러한 결과는 STING 의존적 세포질 DNA 감지 및 I형 IFN 생산이 생체내에서 β-lap의 치료 효과에 중요하다는 것을 시사한다.

종양-침윤성 호중구가 생체내에서 β-lap의 항종양 효능에 대해 필요하다. I형 IFN은 선천적 면역 및 적응형 면역을 연결하는 것으로 공지되어 있으며, 종양 특이적 T 세포 반응의 교차 프라이밍에 중요하다. 본 발명자들은 β-lap의 치료가 일부 위험 신호전달을 증가시키고 일부 식세포를 모집함으로써 선천적 감지를 유발하고 종양 항원의 교차 제시를 유도할 수 있다고 제안했다. 이 사상을 테스트하기 위해, 그들은 β-lap 치료 3일 후 종양 미세환경에서 면역 세포 집단을 해부했다. 흥미롭게도, 그들은 종양 침윤성 호중구(CD11b⁺Gr1⁺ 서브세트)가 유의하게 증가된 반면(도 11a), 대식세포, DC, CD8⁺ 및 CD4⁺ T 세포의 백분율은 덜 영향을 받았다는 것을 발견했다. 이 증가된 호중구 서브세트가 β-lap-유도된 종양 퇴행에 관여하였는지 여부를 조사하기 위해, 종양 침윤성 호중구를 특이적으로 표적으로 하는 항-Ly-6G(클론 1A8) 항체를 사용하여 이 서브세트를 고갈시켰다. 항체 매개 호중구 고갈은 생체내에서 β-lap의 치료 효과를 크게 손상시켰으며(도 11b), 항종양 면역 반응에서 새로운 호중구 침윤의 중요한 역할을 시사한다.

β-lap은 NQ01 ⁺ 종양 세포를 효과적으로 사멸시키기 위해 면역 체크포인트 차단(항-PD-Ll/PD-1) 요법과 상승작용할 수 있다. β-lap이 작용 메커니즘의 일부로 선천적 면역 반응을 유발할 수 있다는 발견은 적응형 면역을 추가로 활성화하기 위해 PD-L1/PD-1 억제제와 같은 적응형 T 세포 기반 면역 체크포인트 차단 전략과의 조합에 대해 심오한 의미를 갖는다. 종양 미세환경에서 PD-L1의 I형 IFN 유도된 상향조절은 다중 치료에 대한 후천적 종양 내성의 주요 원인 중 하나이며, 이는 β-lap + PD-L1/PD-1 억제제 사이의 병용 요법을 위한 치료 창으로 이어진다. 이 가설을 테스트하기 위해, 본 발명자들은 C57BL/6J WT 마우스에서 6 x 10⁵ MC38 세포를 사용하여 피하 이종이식편을 확립했다. 마우스(n=5)는 HPβCD 비히클 단독, 항-PD-L1(아테졸리주맙) 또는 항-PD-L1을 포함하거나 포함하지 않는 0.1mg(i.t.) 또는 30mg/kg(i.p.)의 β-Lap으로 3일 마다 4회 주사로 종양내(i.t.)(도 12a) 또는 복강내(i.p.)(도 12b) 처리했다. 종양 용적이 > 50mm³(i.p.) 또는 100mm³(i.t.)일 때 치료를 시작했다. 100㎍의 항-PD-L1(클론 10F.9G2) 또는 이소형 대조군 항체(클론 LTF-2)를 β-Lap 치료 하루 전에 복강내(i.p.) 주사하였다. 이어서, 마우스를 종양 용적의 변화에 대해 모니터링하였다(도 12a-b). 저용량의 HPβCD-β-lap 또는 항-PD-L1 단독에 의한 치료는 비히클에 비해 종양 용적을 약간 감소시켰지만, 약물 병용 요법은 극적인 상승적 항종양 효능을 초래하였다(도 12a-b).

조사 및 NQO1 생체활성화 가능한 약물 치료는 마우스에서 항종양 면역을 상승적으로 촉진시킨다. 본 발명자들의 이전 결과는 β-lap이 면역결핍 마우스에서 방사선 감작제임을 보여주었다. 여기에서, 본 발명자들은 면역적격 마우스에서 방사선감작성 NQO1+ MC38 뮤린 암 세포에 대한 β-lap의 효과를 조사하였다. 높은 수준의 NQO1(130 + 15 단위)을 발현하는 MC38 NSCLC 암 세포는 10 Gy + 0.1mg β-lap을 3회 종양내(i.t.) 주사한 C57BL/6J WT 마우스의 피하 종양(100mm³)에서 테스트한 바와 같이 종양 성장의 유의한 억제와 함께(p<0.01, 도 13a) 매우 반응성이었다. 유사하게, MC38 피하 종양(50mm3)은 6회 주사로 격일로 제공된 10 Gy + β-lap(30mg/kg, i.p.)에 대해 유의한 상승적 반응을 나타낸다(p<0.01, 도 13b). 마우스는 유의한 메트헤모글로빈혈증 또는 체중 감소가 없었다(데이터는 표시되지 않음).

IB-DNQ는 NQO1-의존적 방식으로 뮤린 암 세포를 사멸시키고 NAD+/ATP 고갈 및 DNA 손상을 유도한다. IB-DNQ는 새로운 더욱 강력한 NQO1 생체활성화 가능한 약물이다. IB-DNQ는 β-lap과 동일하지만 10 내지 20배 더 강력하고, β-lap에 비해 메트헤모글로빈혈증(MH)을 개시할 수 있는 능력은 훨씬 적었다. β-lap과 마찬가지로, IB-DNQ는 또한 NQO1-의존적 무의미한 산화환원 주기를 거치며, 이는 약물을 해독하여 하이드로퀴논을 형성한다. β-lap과 유사한 IB-DNQ 매개 종양 특이적 DNA 손상 및 세포 사멸이 면역계와 일부 상호작용을 하는지 여부는 불분명하다. 본 발명자들은 시험관내에서 IB-DNQ의 항종양 활성을 조사하였다. 나타낸 바와 같이, NQO1은 뮤린 종양 세포주(MC38 및 TC-1)에서 과발현되었고, B16 뮤린 종양 세포주(B16 및 tubo)에서는 결핍되었다(도 14a). IB-DNQ는 NQO1⁺ 뮤린 종양 세포주 MC38(도 14b) 및 TC-1(도 14c)을 선택적으로 사멸시켰지만 NQO1^- 뮤린 종양 세포 B16(도 14d)은 사멸시키지 않았으며, 이러한 효과는 디쿠마롤(DIC, 상당히 특이적 NQO1 억제제)에 의해 억제될 수 있고(도 14b-c), NQO1^- 세포(B16)에서는 발생하지 않는다(도 14d). 필수적인 뉴클레오티드 NAD⁺ 및 ATP 고갈은 또한 TC-1 세포에서 2시간 동안 IB-DNQ 치료 후 주목되었고, 디쿠마롤은 효과를 보존할 수 있다(도 14e-f). 60분 동안 0.25μM IB-DNQ로 치료 후, 높은 DNA 총 손상을 나타내는 꼬리 길이의 극적인 증가가 있었고(도 14g), DSB 마커인 γ-H2AX 병소가 유의하게 증가하여(도 14h) 이중 가닥 파손을 나타낸다.

IB-DNQ는 적응형 면역 시스템에 의존하는 종양 퇴행을 유도한다. IB-DNQ 가 항종양 면역을 자극하는지 여부는 공지되어 있지 않다. 여기서, 본 발명자들은 개별적으로 NQO1-양성 뮤린 MC-38 결장암 세포 또는 TC-1 폐암 세포를 보유하는 면역적격 마우스(C57BL/6J WT) 및 면역결핍 마우스(rag^-/-)를 확립하였다. 4회 투여량의 IB-DNQ(0.15mg) 치료 후, MC-38 또는 TC-1 종양 보유 WT 마우스에서 종양 퇴행이 발생했지만, 적응형 면역 결핍 rag^-/- 마우스에서는 발생하지 않았다(도 15a-b). 이 결과는 적응형 면역 시스템이 또한 생체내에서 IB-DNQ의 심오한 항종양 효능에 필요했음을 시사했다.

IB-DNQ 및 면역 체크포인트 차단(항-PD-Ll) 요법의 조합으로 인한 상승 효과. 이전의 연구는 β-lap이 면역 체크포인트 차단 요법과 상승작용할 수 있음을 나타내었다. 여기서, 본 발명자들은 IB-DNQ가 면역 체크포인트 차단 요법과 상승작용할 수 있는지 여부를 조사한다. MC38 종양 보유 마우스(C57BL/6J WT)는 HPβCD 비히클 단독, 항-PD-L1(아테졸리주맙) 또는 항-PD-L1을 포함하거나 포함하지 않는 0.05mg(i.t.)의 IB-DNQ로 3일 마다 4회 주사로 종양내(i.t.) 처리했다. 종양 용적이 약 100mm³일 때 치료를 시작했다. IB-DNQ 치료 하루 전에 100㎍의 항-PD-L1(클론 10F.9G2) 또는 이소형 대조군 항체(클론 LTF-2)를 복강내(i.p.) 주사하였다. 이어서, 마우스를 종양 용적 및 전체 생존의 변화에 대해 모니터링하였다(도 16a-b). 유사하게, 본 발명자들은 저용량의 HPβCD-IB-DNQ 또는 항-PD-L1 단독으로의 치료가 또한 비히클에 비해 유의하게 종양 성장을 감소시키고 마우스 수명을 증가시키지만, 약물-병용 요법이 극적인 상승적 항종양 효능을 초래한다는 것을 발견하였다(도 16a-b).

IB-DNQ는 NQO1-의존 방식으로 종양 특이적 ROS 형성 및 광범위한 DNA 손상을 유도한다. Nad(P)H:퀴논 옥시도리덕타제 1(NQO1)은 대부분의 고형암에서 상승된(> 100배) 2-전자 옥시도리덕타제이고, 직접적인 종양-사멸을 위한 유망한 표적으로 부상했다. NQO1은 특이성으로 인해 요법에 종양 선택적 방식으로 활용될 수 있다. 약물 이소부틸데옥시니보퀴논(IB-DNQ)은 NQO1⁺ 인간 고형암에 대해 상당한 항종양 효과를 나타냈다. 그러나, IB-DNQ 매개 종양 특이적 DNA 손상 및 세포 사멸이 면역계와 약간의 상호작용을 하는지 여부는 여전히 불분명하다. IB-DNQ가 NQO1⁺ 종양을 선택적으로 표적화하고 면역 반응을 유발하는지 여부를 결정하기 위해, 본 발명자들은 다중 뮤린 암 세포주를 스크리닝하여 시험관내에서 IB-DNQ의 항종양 효과를 조사했다. 도 21a-b에 도시된 바와 같이. IB-DNQ는 NQO1⁺ 뮤린 종양 세포주(NQO1을 과발현하는 TC-1, Ag104Ld, MC38 및 B16)를 선택적으로 사멸시켰으며, 이 효과는 디쿠마롤(DIC, 상당히 특이적 NQO1 억제제) 또는 NQO1의 녹아웃에 의해 억제될 수 있다(도 21b). 더욱이, IB-DNQ에 1시간 노출 후 높은 ROS 수준(도 21c) 및 IB-DNQ에 4시간 노출 후 DNA 손상(전체 또는 이중 가닥 파손)(도 21d-e)이 NOQ1⁺ 뮤린 암 세포에서 관찰되었다. 추가의 검정은 IB-DNQ의 존재에서 아넥신-V⁺-표시된 아폽토시스 세포 사멸이 관찰되었음을 보여주었다(도 21f). 이러한 결과는 IB-DNQ가 시험관내에서 집중적인 종양 특이적 ROS 생산과 광범위한 DNA 손상을 통해 NQO1⁺ 종양 세포 사멸을 선택적으로 유도한다는 것을 나타냈다.

마우스에서 IB-DNQ의 항종양 효능은 숙주 면역계를 필요로 한다. 지금까지 종양 세포 사멸에 대한 IB-DNQ 치료의 효과에 초점을 맞춘 대부분의 연구는 암 세포 자율 메카니즘을 표적화했다. 여기서, 본 발명자들은 IB-DNQ-매개 항종양 효과가 면역 반응의 활성화를 포함한다는 가설을 세웠다. IB-DNQ의 항종양 효과에서 면역 반응의 역할을 조사하기 위해, 본 발명자들은 면역적격 및 면역결핍 마우스에서 MC38 피하 동계 종양 모델을 확립하였다. 종양 접종 후 7일째에, IB-DNQ를 종양-보유 WT C57BL/6 또는 NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rgt^m1Wjl/SzJ(NSG) 마우스에 종양내 투여하였다(도 22a-b). 놀랍게도, 종양은 20% 치료 분획과 함께 종양 보유 WT 그룹에서 4회 IB-DNQ 치료 후에 퇴행되었다. 대조적으로, IB-DNQ-처리된 NSG 마우스의 종양은 비히클과 비교하여 종양 크기의 최소 감소만을 나타내었다. 이러한 결과는 IB-DNQ 매개 항종양 효과가 면역 반응을 포함함을 나타냈다. 적응형 면역에 대한 IB-DNQ의 효과를 추가로 연구하기 위해, MC38 및 TC-1 종양 세포를 WT 및 Rag1 KO(Rag1^-/-) C57BL/6 마우스에 피하 이식하였다(도 22c-d). 나타내고 예상된 바와 같이, Rag1 KO는 IB-DNQ의 항종양 효과를 차단하고, 종양은 극적으로 성장하여 적응형 면역 시스템이 생체내에서 IB-DNQ의 심오한 항종양 효능에 필요하였음을 시사한다. 더욱이, 시험관내 연구와 일치하게, 비록 치료 개시시에 종양 크기가 약간 감소했지만(도 22e-f) IB-DNQ 치료 효과는 NQO1 KO MC38 마우스 모델에서 폐지되었으며, 이는 NQO1이 IB-DNQ 매개 항종양 효과에 필수적이고 충분하다는 것을 나타낸다.

IB-DNQ 치료는 종양 미세환경에서 CD45 ⁺ 면역 세포 집단에 영향을 미친다. 어떤 면역 세포 서브세트가 종양 부담을 제어하는 데 필수적인지 및 종양 미세환경이 IB-DNQ에 의해 어떻게 변화되는지 테스트하기 위해, 본 발명자들은 IB-DNQ 치료 후 MC38 종양의 면역 미세환경을 조사하였다. 나타낸 바와 같이, 대조군 종양과 비교하여 IB-DNQ-처리된 종양에서 CD8⁺ 및 CD4⁺ T 세포의 상당한 증가가 관찰되었다(도 23a-b). 또한, IB-DNQ는 MHC II⁺ DC 비율을 유의하게 증가시켰지만 대식세포 침윤에는 영향을 미치지 않았다(도 23a-b). 이러한 결과는 CD8⁺ 및 CD4⁺ T 세포가 IB-DNQ의 항종양 효능에 필수적인 역할을 할 수 있음을 시사했다. T 세포에 대한 IB-DNQ의 직접적인 효과를 배제하기 위해, 치사량의 IB-DNQ에 노출된 후 CD8⁺ T 세포 증식(도 23c) 및 생존(도 23d)을 결정하였다. 실제로, IB-DNQ는 CD8⁺ T 세포 사멸 및 항-CD3/항-CD28-자극된 세포 증식에 영향을 미치지 않았다.

IB-DNQ-매개-항종양 효과는 CD8 ⁺ 및 CD4 ⁺ T 세포에 의존한다. IB-DNQ의 효과에서 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포의 역할을 조사하기 위해, CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포 고갈 후 IB-DNQ의 항종양 효과를 조사했다. 예상대로, CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포 고갈은 IB-DNQ의 항종양 효과를 완전히 폐지했지만(도 24e-f), 놀랍게도 CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포 고갈 단독은 IB-DNQ의 효과를 부분적으로 차단했고(도 24a-d), CD8⁺ 및 CD4⁺ T 세포 모두가 IB-DNQ 매개 종양 퇴행에 필요함을 나타낸다.

IB-DNQ는 종양 ICD 및 수지상 세포-매개된 T 세포 교차-프라이밍을 유도한다. 본 발명자들의 이전 연구는 일부 화학-방사선요법에 의한 종양 치료가 종양의 항원성 및 면역원성을 촉진하는 종양 세포 면역원성 세포 사멸(ICD)을 유도함을 시사했다. ICD를 통해 죽어가는 종양 세포의 면역원성은 종양 제어를 담당하는 항종양 CD8 T-세포에 DC에 의한 항원의 교차 제시에 의해 선호된다. CD8⁺ T 세포가 IB-DNQ 항종양 효과에서 필수적인 역할을 한다는 점을 감안할 때, 이에 의해 IB-DNQ는 잠재적으로 종양에서 ICD를 유도하여 CD8⁺ T 세포에 대한 항원 제시를 유도한다. 이 가설을 테스트하기 위해, ICD 특징 중 하나인 HMGB1을 IB-DNQ 치료 후 체크했다. 실제로, IB-DNQ에 의해 표적화된 MC38 및 B16 NQO1⁺ 세포는 높은 수준의 HMGB1을 분비한 반면, IB-DNQ에 의해 세포 사멸을 유도할 수 없는 MC38 NQO1^-/- 및 B16(NQO1 결핍) 세포는 더 적은 HMGB1을 분비했다(도 25a). 1형 인터페론(IFN)은 T 세포의 최적 교차 프라이밍에 필수적이므로, 1형 IFN은 IB-DNQ에 의해 매개되는 T 세포 반응에 관여하는지 여부를 결정했다. 나타낸 바와 같이, IFN-α 및 IFN-β의 발현은 대조군과 비교하여 IB-DNQ 치료와 함께 종양에서 유의하게 상향조절되었다(도 25b-c). 한편, IFN-γ-지시된 항원 특이적 T 세포 반응도 관찰되었다(도 25d-e). 종양 항원(조사된 종양 세포)의 존재하에, IFN-γ-지시된 T 세포는 IB-DNQ 치료 그룹에서 극적으로 증가되었다(도 25d). 유사하게, OT-1 펩티드를 사용한 IFN-γ ELISPOT 검정에서, OT-1 특이적 T 세포의 수는 IB-DNQ 치료 그룹에서 유의하게 증가되었다(도 25e). 함께, 이러한 결과는 IB-DNQ가 교차 프라이밍을 위한 ICD를 유도하고 T 세포를 활성화하여 종양 성장을 억제함을 나타냈다.

IB-DNQ는 고전적인 면역학적 기억 대신 선천적 면역 기억을 유도한다. IB-DNQ 매개된 항종양 반응이 연장된 보호 T 세포 면역을 초래하는지 여부를 조사하기 위해, IB-DNQ 치료 후 완전한 MC38 종양 거부를 겪은 마우스는 MC38 세포(3 x 10⁶)에 의해 재도전했다. 흥미롭게도, 모든 IB-DNQ 치료된 마우스는 재도전된 종양을 거부했으며(도 26a-b), 이는 IB-DNQ 치료 후에 기억 T 세포가 생성될 수 있음을 시사한다. 기억 T 세포의 생성을 추가로 결정하기 위해, CD44⁺-지시된 기억 T 세포를 치료된 마우스에서 검사했다. 재도전된 종양을 거부한 후 30일 후, 치료된 마우스에서 다른 기관을 단리시키고, 단일 세포를 유세포 분석법으로 분석했다. 놀랍게도, CD44⁺CD8⁺도 CD44⁺CD4⁺ 기억 T 세포도 비장 및 LN(도 26c-d) 및 기타 기관(데이터는 표시되지 않음)에서 관찰되지 않았다. 기억 B 세포도 조사되었지만 기억 T 세포와 유사한 결과가 관찰되었다(데이터는 표시되지 않음). 흥미롭게도, CD44⁺DC의 상당한 증가가 치료된 마우스에서 관찰되었다(도 26e). 여러 연구는 CD44가 DC-T 세포 밀착 접합체의 형성에 중요하고, DC 상의 CD44가 T 세포 활성화에 영향을 미칠 수 있다고 시사했다. 본 결과는 항원(조사된 또는 IB-DNQ 처리된 종양 세포)의 존재 하에 종양 보유 LN(TDLN) 또는 종양 부재 LN(TF-LN)의 CD44⁺DC가 대조군과 비교하여 자극된 반면, TF-LN 그룹이 더 유의한 증가를 나타냈다(도 26f)는 것을 보여주었다. 한편, 비장에서 분리된 CD8⁺ T 세포를 조사된 종양 세포와 공배양한 경우 T 세포 증식은 유의하게 증가되지 않았다(도 26g). 그러나, 나이브 비장에서 분리된 CD8⁺ T 세포가 항원의 존재하에 종양 보유 또는 종양 부재 마우스의 LN 세포와 공 배양되었을 때, T 세포 증식은 유의하게 자극되었고(도 26h), 이는 TF-LN 중 CD44⁺DC가 T 세포 활성화 및 증식에 중요한 역할을 할 수 있음을 나타낸다. 함께, 이러한 모든 결과는 IB-DNQ 항종양 효과가 고전적 면역학적 기억 대신 선천적 면역 기억(기억 유사 수지상 세포 반응 등)을 유도할 수 있음을 시사했다.

프로그램된 사멸-리간드 1(PD-L1) 발현은 큰 종양 부담을 갖는 마우스에서 상향조절된다. 다른 연구 그룹의 이전 연구는 종양 미세환경에서 PD-L1 발현의 I형 IFN 유도 상향조절이 다중 치료에 대한 후천적 종양 내성의 주요 원인 중 하나임을 입증한다. 본 발명자들의 이전 연구는 IB-DNQ 치료가 종양 미세환경에서 I형 IFN 신호전달의 상향조절을 초래함을 나타낸다(도 25b-c). IB-DNQ 치료가 TME에서 PD-L1 발현을 증가시키는지 여부를 결정하기 위해, 본 발명자들은 작은 종양(50mm³) 또는 진행성 종양(150mm³)을 보유하는 2마리 마우스 모델을 확립하였다. 유세포 분석을 위해 마지막 IB-DNQ 주사 후 24시간 후에 종양을 수집했다. 실제로, 그들은 PD-L1 발현이 종양 부담이 큰 마우스(도 27a)의 CD45⁺ 면역 세포에서 IB-DNQ 치료(12mg/kg, i.v.)에 의해 유의하게 상향조절되었지만, 종양 부담이 작은 마우스에서는 그렇지 않다는 것을 발견했다(도 27b). 이러한 발견은 IB-DNQ 치료가 TME 내에서 PD-L1 수준의 상향조절을 유발하여 진행성 NQO1+ 종양에 대한 IB-DNQ + PD-L1 억제제의 병용 요법을 위한 치료 창을 유도한다는 것을 시사한다.

IB-DNQ는 체크포인트 차단 내성을 극복한다. 잘 확립된 종양은 고유한 내성 메카니즘의 대상이며, 완전한 종양 거부를 달성하기 어렵다. 큰 확립된 종양이 IB-DNQ 또는 PD-L1 차단 치료 단독에 민감한지 조사하기 위해, 본 발명자들은 C57BL/6 WT 마우스(12mg/kg의 IB-DNQ, i.v. 또는 100㎍의 항-PD-L1, i.p.)에서 작은(약 50mm³) 및 큰(약 150mm³) 종양 부담을 생성했다. 종양 용적 및 장기 생존을 모니터링했다. 완전한 종양 거부는 IB-DNQ 또는 항-PD-1 단독 치료 후에 큰 확립된 종양에서가 아니라 작은 확립된 종양을 보유하는 마우스에서만 달성된다는 것을 발견하였다(도 28a-d). 이전 연구(도 27)에 기초하여, 본 발명자들은 IB-DNQ가 면역 체크포인트 차단 요법과 상승작용하여 잘 확립된 NQO1⁺ 종양을 효과적으로 사멸시킨다고 제안한다. 이 가설을 테스트하기 위해, 그들은 큰 확립된 MC38 종양을 보유하는 마우스에서 IB-DNQ(12mg/kg, i.v.) 치료와 항-PD-L1 치료(100μg, i.p.)를 조합했다. 그들은 진행성 MC38 종양이 IB-DNQ 또는 항-PD-L1 단독에 대해 중간 정도의 반응만을 보였다는 것을 발견했다(도 28e-f). 극명하게 대조적으로, 조합 그룹의 마우스는 강력한 종양 제어 및 퇴행을 나타냈다(도 28e-f). 특히, 종양 보유 마우스의 40%가 전신 치료에 의한 병용 치료에서 종양을 완전히 거부했다. 이러한 발견은 TME 내의 증가된 PD-L1이 IB-DNQ에 대한 초기 반응 후 큰 종양의 종양 재발에 기여하고, IB-DNQ와 면역 체크포인트 차단의 병용 요법이 진행성 및 체크포인트 불응성 종양을 근절함을 시사했다.

실시예 3 - 토론

적절한 선천적 감지의 부족은 T 세포 표적화 면역요법을 제한할 수 있다(Patel et al., 2018; Qiao et al., 2017; Gajewski et al., 2013). 본 발명자들은 일부 종양-표적화 유전독성제를 통한 면역원성 선천적 감지의 유도가 항종양 면역을 유도하고 면역 체크포인트 차단 내성을 극복할 수 있다는 가설을 세웠다. 여기서, 그들은 NQO1 생체활성화 가능한 β-라파콘(β-lap)의 항종양 효능을 평가하기 위해 인간 질환을 밀접하게 요약하는 여러 동계 면역적격 마우스 모델과 면역 재구성된 인간 이종이식 모델을 사용했다. 그들은 β-lap이 주로 선천적 면역과 적응형 면역에 의존하는 생체내 인상적인 항종양 효과를 가졌음을 입증했다. 그들은 NQO1에 의한 활성화 후, β-lap이 종양 선택적 세포 사멸을 일으키고 적응형 항종양 면역에 대한 선천적 감지를 유도했음을 발견했다. 기계적으로, 종양 β-lap은 면역원성 세포 사멸을 유발하고, HMGB1의 방출에 의해 종양 면역원성을 증가시켰다. 이것은 선천적 면역 반응을 활성화하고 TLR4/MyD88 의존 방식으로 I형 IFN 시그니처를 유도하여 항종양 T 세포 적응형 면역을 자극하고 종양 성장을 억제했다. 중요하게도, β-lap은 면역요법 내성을 극복했다. 항-PDL1 mAb와 조합될 때, β-lap은 CD8 T 세포 침윤 및 항원 특이적 T 세포 반응을 더욱 강화하고, 큰 확립된 및 체크포인트 차단 불응성 종양을 근절했다.

전임상 및 임상 연구에서 체크포인트 차단은 국소 면역 활성을 활성화하고 목적하는 T 세포 반응을 유도하기 위해 특정 "연료"와 함께 공투여되지 않는 한 면역계에서 "브레이크"를 본질적으로 없애고 내성을 파괴하기에 불충분한 것으로 입증되었다(Salmon et al., 2016; Kleponis et al., 2015; Kamhorst et al., 2017). T 세포 체크포인트 면역요법과 함께 선천적 면역 감지를 자극하는 것이 하나의 답일 수 있다. 종양의 자연적인 선천적 면역 감지는 항원 흡수 및 제시, 숙주 PRR 경로, I형 IFN 생산 및 T 세포의 교차 프라이밍을 통해 발생하는 것으로 보인다(Woo et al., 2015). 일반적으로, 선천적 면역 세포는 DC 활성화 또는 이펙터 T 세포 분화를 지원하는 사이토카인의 생산을 통해 직접 또는 간접적으로 종양 제어에 기여할 수 있다. 그러나, 종양은 또한 PRR 신호전달을 침묵시키거나 PRR 신호를 전복시키고 기능장애 선천적 세포를 축적하여 적응형 면역 반응을 프라이밍하기보다는 암 억제성 염증을 촉진함으로써 면역 제거를 피한다(Lee et al., 2009; Hernandez et al., 2016; Givennikov et al., 2010). 따라서, 종양 미세환경에서 적절한 선천적 감지의 존재 또는 부재는 실제로 체크포인트 차단 치료 성공의 중요한 결정 요인이 될 수 있다.

면역원성 선천적 감지를 유도하고 종양 미세환경을 재구성하는 한 가지 접근법은 이미 암 치료에 널리 사용되는 화학요법과 같은 유전독성제를 사용하는 것이다(Patel et al., 2018; Emens et al., 2015; Pfirschke et al., 2016). 암 치료제로 인해 죽어가는 종양 세포는 특정 선천적 감지 경로를 통해 면역 세포의 활성화를 위한 DAMP를 발현하거나 방출할 수 있으며, 종양 관련 항원에 대한 항종양 면역 반응을 유발할 수 있다. 실제로, 면역 체크포인트 차단과 화학요법을 조합하는 것은 임상 시험에서 광범위하게 연구되고 있다(Garg et al., 2017; Langer et al., 2016; Gandhi et al., 2018; Weiss et al., 2017). 그러나, 전통적인 화학요법 약물의 사용에서 주요 제한 사항 중 하나는 선택성의 부족 및 비표적화된 조직, 특히 적응형 면역계에 대한 관련 유해 독성으로부터 발생한다. NQO1은 정상 조직보다 5배 내지 200배 이상의 수준에서 여러 종양 유형에서 발현되는 2-전자 옥시도리덕타제이며 잠재적인 치료 표적이다(Huang et al., 2016; Li et al., 2016). β-Lap은 NQO1에 의해 촉매되어 반응성 산소 종(ROS)을 생성할 수 있는 새로운 부류의 NQO1 표적화 약물이다(Huang et al., 2016; Doskey et al., 2016). 실제로, 본 발명자들은 β-lap이 시험관내 및 생체내 모두에서 NQO1을 고도로 발현하는 종양을 선택적으로 사멸시켰고, 이 사멸 효과는 발명자들이 NQO1을 녹아웃시킬 때 폐지되었고, 이 약물의 이상적인 선택성을 나타냄을 발견하였다. 오랜 기간 동안 유전독성제는 주로 암 세포-자율 메카니즘을 통해, 즉 악성 세포의 증식을 직접 억제하거나 악성 세포의 사멸을 유발함으로써 효과를 발휘하는 것으로 가정되었지만, 축적된 증거는 수십 년 동안 임상에서 성공적으로 사용된 다수의 화학요법이 또한 면역원성 세포 사멸(ICD)을 유발하고 새로운 항암 면역 반응을 유도한다는 것을 나타낸다(Sistigu et al., 2014). 불행하게도, 대부분의 ICD 유도제는 종양 선택성의 결여 및 심각한 면역억제(급속히 분열하는 면역 세포 집단을 고갈시킴)로 인해 치료 용량에서 심각한 부작용을 갖는다. 중요하게도, β-lap은 NQO1 과발현 종양에 대한 이상적인 표적 효과와 세포독성 면역에 대한 면역 억제가 없다는 점에서 다른 화학요법제와 구별된다. 본 발명자들은 종양 침윤된 CD8 β-lap이 종양-치사량에서도 천연 및 활성화된 CD8 T 세포에 대해 세포독성 효과를 갖지 않음을 입증하였다. 새로운 질문은 NQO1 생체활성화 가능한 β-lap 매개 종양 특이적 세포 사멸이 면역계와 일부 상호작용을 하는지 여부; 이 "표적화된" 화학요법 약물이 면역원성 세포 사멸을 유발하고 선천적 감지를 유발하는지 여부이다. 현재, 본 발명자들은 β-lap-유도된 NQO1+ 종양 퇴행이 숙주 CD8⁺ T 세포에 크게 의존하고; 약물은 이러한 세포가 결여된 마우스(Rag1-/- 마우스 및 항-CD8 항체가 고갈된 야생형 마우스)에서 종양 진행을 제어하는 데 실패했음을 발견했다. 본 발명자들은 추가로 β-lap이 HMGB1/TLR4 경로를 통해 면역원성 세포 사멸 및 활성화된 선천적 감지를 유도하고, 종양 미세환경에서 I형 IFN 신호전달을 상향조절하여 Batf3 DC를 촉진하여 T 세포를 교차 프라이밍하고 항종양 적응형 면역 반응을 활성화하였음을 입증했다.

종양 부담의 감소 및 종양 면역원성의 증가는 면역요법을 개선하는 두 가지 핵심 요인으로 여겨진다(Zappasodi et al., 2018). 특히, β-lap은 HMGB1 의존적 면역원성을 촉진하고 선천적 감지를 활성화하여 선천적 면역 반응과 적응형 면역 반응을 연결하고, 종양 덩어리를 현저하게 축소시키고, 따라서 면역요법과의 조합에 대한 유망한 파트너이다. 실제로, 본 발명자들은 β-lap이 항-PD-L1 면역요법과의 조합에 의해 큰 확립된 및 체크포인트 차단 불응성 MC38 및 B16 종양을 근절하고, 생존율을 극적으로 증가시켰다는 것을 입증하였다. 그들은 또한 병용 요법이 β-lap 또는 항-PDL1 단일요법과 비교하여 종양 미세환경에서 종양 침윤성 림프구 및 종양 항원 특이적 T 세포 및 CD8/Treg 비율을 극적으로 증가시켰음을 입증했다. 화합물의 최적 투여량과 이러한 조합의 조합에 대한 일정 및 서열분석을 탐색하기 위한 향후 작업이 필요하다.

전반적으로, 이 연구는 독특한 표적화 화학요법 약물인 β-lap이 조화된 선천적 면역 및 적응형 면역을 통해 항종양 효과를 유도하는 방법과 β-lap 치료가 면역요법을 위한 이상적인 미세환경을 설정하는 방법에 대한 새로운 통찰력을 제공했다. β-lap은 현재 NQO1+ 고형 종양 환자에서 단일요법으로 또는 다른 화학약물과의 조합으로 시험 중이다. 이 연구는 β-lap의 선천적 감지 능력이 NQO1+ 환자가 면역요법에 대한 성공적인 반응을 준비할 수 있음을 지적한다.

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본원에서 사용된 용어 및 표현은 설명의 용어로 사용되었으며 제한하지 않고, 이러한 용어 및 표현의 사용에서 나타내고 기재된 특징 또는 이의 일부의 임의의 등가물을 배제하려는 의도는 없지만, 청구된 본 개시내용의 범위 내에서 다양한 변형이 가능한 것으로 인식된다. 따라서, 비록 본 개시내용이 바람직한 구현예, 예시적인 구현예 및 임의의 특징에 의해 구체적으로 개시되었지만, 본원에 개시된 개념의 변형 및 변경이 당업자에 의해 재분류될 수 있고, 이러한 변형 및 변경이 첨부된 청구범위에 의해 정의된 바와 같은 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 간주되는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 제공된 특정 구현예는 본 개시내용의 유용한 구현예의 예이며, 본 개시내용이 본 설명에 제시된 장치, 장치 구성요소, 방법 단계의 다수의 변형을 사용하여 수행될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 본 방법에 유용한 방법 및 장치는 다수의 임의의 조성 및 처리 요소 및 단계를 포함할 수 있다.

V. 참조문헌

다음 참조문헌은 예시적인 절차 또는 본원에 제시된 것들을 보완하는 기타 세부 사항을 제공하는 정도로 본원에 구체적으로 참조로 포함된다:

Claims (26)

1. NQO1 생체활성화 가능한 약물(bioactivatable drug)을 체크포인트 억제제(checkpoint inhibitor)와 조합하여 투여하는 단계를 포함하여, 암 환자에서 암 세포의 성장을 사멸 또는 억제하는 방법.
2. 암성 세포(cancerous cell)를 갖는 환자에서 암 세포의 성장을 사멸 또는 억제하기 위한 약제의 제조를 위한, 제2 제제와 조합된 NQO1 생체활성화 가능한 약물의 용도로서, 상기 제2 제제가 체크포인트 억제제이고, 상기 약제가 NQO1 생체활성화 가능한 약물 및 체크포인트 억제제의 유효한 치사량 또는 억제량을 포함하는, 용도.
3. 암을 갖는 환자의 치료에서의, 제2 제제와 조합된 NQO1 생체활성화 가능한 약물의 용도로서, 상기 제2 제제가 체크포인트 억제제인, 용도.
4. 제1항에 있어서, 상기 암 세포가 DNA 복구 과정 결함(faulty DNA repair process)에 기인하여 염기 절단 복구(base excision repair; BER) 결함 또는 취약성(vulnerability)을 갖는, 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 BER 결함 또는 취약성이 X-선 교차 상보성 1 또는 XRCCl 유전자/단백질/효소의 결함 수준을 포함하는, 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 NQO1 생체활성화 가능한 약물의 사용이 소분자 체크포인트 억제제와 조합되는, 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 NQO1 생체활성화 가능한 약물의 사용이 항체 체크포인트 억제제와 조합되는, 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 NQO1 생체활성화 가능한 약물의 사용이 PD-1 또는 CTLA-4의 억제제와 조합되는, 방법.
9. 제6항에 있어서, 상기 NQO1 생체활성화 가능한 약물이 β-라파콘(β-lapachone) 또는 DNQ 화합물인, 방법.
10. 제7항에 있어서, 상기 NQO1 생체활성화 가능한 약물이 β-라파콘 또는 DNQ 화합물인, 방법.
11. 제8항에 있어서, 상기 NQO1 생체활성화 가능한 약물이 β-라파콘 또는 DNQ 화합물인, 방법.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 추가의 화학요법제 또는 방사선요법을 추가로 포함하는, 방법.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암 세포가 상승된 수준의 NQO1을 갖는, 방법.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암 세포가 고체 종양 형태인, 방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 암 세포가 비소세포 폐암 세포(non-small cell lung cancer cell), 전립선암 세포(prostate cancer cell), 췌장암 세포(pancreatic cancer cell), 유방암 세포(breast cancer cell), 두경부암 세포(head and neck cancer cell) 또는 결장암 세포(colon cancer cel)인, 방법.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NQO1 생체활성화 가능한 약물이
    

    

    
    또는 이의 염 또는 용매화물인, 방법.
17. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 NQO1 생체활성화 가능한 약물이
    

    

    
    또는 이의 염 또는 용매화물인, 용도.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NQO1 생체활성화 가능한 약물이 DNQ 또는 DNQ-87인, 방법.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NQO1 생체활성화 가능한 약물이 체크포인트 억제제 전에 투여되는, 방법.
20. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NQO1 생체활성화 가능한 약물이 체크포인트 억제제 이후에 투여되는, 방법.
21. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NQO1 생체활성화 가능한 약물이 체크포인트 억제제와 동시에 투여되는, 방법.
22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NQO1 생체활성화 가능한 약물이 1회 이상 투여되는, 방법.
23. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 체크포인트 억제제가 1회 이상 투여되는, 방법.
24. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NQO1 생체활성화 가능한 약물 및 상기 체크포인트 억제제가 1회 이상 투여되는, 방법.
25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 추가의 항암 요법(anti-cancer therapy)을 추가로 포함하는, 방법.
26. 제25항에 있어서, 상기 추가의 항암 요법이 화학요법, 방사선요법, 면역요법, 독소 요법(toxin therapy) 또는 수술일 수 있는, 방법.

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