JP2019528253A - ｉｎ ｓｉｔｕ免疫調節癌ワクチン接種のための放射性ハロゲン化剤 - Google Patents

Abstract

対象において悪性固形腫瘍を治療する方法が本明細書に開示される。本方法は、悪性固形腫瘍組織によって差次的に取り込まれ保持される免疫調節用量の放射性ハロゲン化化合物を対象に投与するステップ、および、腫瘍微小環境内の特定の免疫細胞を刺激することができる１以上の薬剤を含む組成物を少なくとも１つの悪性固形腫瘍に腫瘍内注射すること（または別の方法によって治療すること）により、対象においてｉｎ ｓｉｔｕ腫瘍ワクチン接種を実施するステップを含む。特定の例示的な実施形態では、放射性ハロゲン化化合物は、式（Ａ）：を有し、式中、Ｒ１は放射性ハロゲン同位体であり、ｎは１８であり、Ｒ２は−Ｎ＋（ＣＨ３）３である。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本願は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、２０１６年７月１８日出願の米国特許仮出願第６２／３６３６０８号の利益を主張する。

連邦政府資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、米国国立衛生研究所によって与えられたＣＡ１９７０７８の下で政府支援によってなされた。合衆国政府は本発明に一定の権利を有する。

本開示は、一般に癌を治療する方法に関する。特に、本開示は、対象において（ａ）固形腫瘍組織によって差次的に（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ）取り込まれ保持される、免疫調節用量の放射性ヨウ素化化合物を対象に全身投与すること、および（ｂ）腫瘍微小環境内の特定の免疫細胞を刺激することができる１以上の治療を用いて、対象の１以上の悪性固形腫瘍にｉｎ ｓｉｔｕ腫瘍ワクチン接種を実施することによる、１以上の悪性固形腫瘍を含む癌を治療する方法に向けられる。

現在の癌治療は、一般に、標的化されない小分子または細胞傷害性薬剤に対する抗体が優先的に癌細胞に侵入するか、癌細胞と結合し（薬剤に対する抗体の場合）、多様な機構によって癌細胞を死滅させる、全身性の化学療法を含む。外照射療法（ｘＲＴ）は、しばしば化学療法と併用され、核ＤＮＡ二重鎖の切断を誘導し、その結果、細胞周期の死をもたらすことによって癌細胞を死滅させる。全身化学療法とは異なり、ｘＲＴは、腫瘍の解剖学的部位を正確に決定する能力に依存する。また、腫瘍の外科的切除は、腫瘍を調べる能力と完全な除去に依存する、それは残存腫瘍細胞が手術後に腫瘍を急速に再建するためである。手術およびｘＲＴは通常、悪性腫瘍の局所治療において限界があり、したがって播種性または転移性疾患の治療に限定されている。これが、これらの治療様式と併せて化学療法がしばしば使用される理由である。全身化学療法は、脳転移は例外かもしれないが、多くの遠隔転移部位に到達することができるが、あまりにも多くの患者にとって、応答は一般に短命（数カ月から数年）であり、最終的に腫瘍再発をもたらす。

身体の自然免疫系は、癌細胞を認識後に破壊することもできるので、免疫学的手法は癌治療のパラダイムにおいて急速に普及しつつある。しかし、一部の癌細胞、そしてさらに多くの範囲で癌幹細胞は、最初は免疫監視を回避しようとし、比較的免疫的に見えないままでいることによって進化し、最終的に生き延びる能力を実際に獲得する［Ｇａｉｐｉ ｅｔ ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ６：５９７−６１０，２０１４］。

ますます調査されている１つの特定の免疫学的手法は、「ｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種」、つまり、腫瘍免疫原性を増強し、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を生成し、「ワクチン接種していない」播種性腫瘍に対する全身性抗腫瘍免疫応答を引き起こそうとする戦略である。ｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種では、腫瘍の免疫を寛容化する微小環境を逆転させる炎症促進性シグナルを同時に提供しながら、悪性固形腫瘍に、腫瘍抗原の放出を促進する１以上の薬剤を注射する（またはそれで治療する）［Ｐｉｅｒｃｅ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ＆Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｏｅｕｔｉｃｓ １１（８）：１９０１−１９０９，２０１５；Ｍａｒａｂｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０（７）：１７４７−５６，２０１４；Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｅ−ｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ，２０１６］。臨床試験および前臨床モデルから得た最近のデータはそのような手法の可能性を示しているが、全身の有効性の改良されたｉｎ−ｓｉｔｕワクチン接種方法が当技術分野で大いに必要とされている。

放射線ホルミシスは、低用量のイオン化ＲＴが、イオン化ＲＴの非存在下では活性化されない天然の保護修復機構の活性化を刺激することによって有益となり得るという数十年前の仮説である［Ｃａｍｅｒｏｎ ａｎｄ Ｍｏｕｌｄｅｒ，Ｍｅｄ．Ｐｈｙｓ．２５：１４０７，１９９８］。予備修復機構は、イオン化ＲＴの有害作用を取り消すだけでなく、ＲＴ曝露に関連しない疾患を抑制するように刺激された場合に十分に有効であると仮定される。おそらく関連している、アブスコパル効果は、１つの腫瘍のｘＲＴ治療が、ＲＴ治療領域外の別の腫瘍の縮小を実際に引き起こす、１９５０年代に報告された現象である。稀ではあるが、この現象は免疫系の活性化に依存すると考えられる。まとめると、ホルミシスおよびアブスコパル効果は、低用量（免疫刺激性であるが非細胞傷害性）ＲＴによる免疫系の相互作用および刺激作用の可能性を裏付ける。これを次にｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種などのその他の免疫学的手法と組み合わせることができる。

本発明者らは、１つの腫瘍が存在する場合には、局所ｘＲＴ＋ｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種の組合せが、マウスにおける大きな確立された腫瘍を治療する際に強力に相乗的であることを、以前に発表した［Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｅ−ｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ，２０１６］。本発明者らは驚くべきことに、ｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種とｘＲＴの組合せが、第２の非照射腫瘍の存在下で腫瘍増殖を抑制しないことを見出した（そして本明細書に開示した）。明らかに、非照射腫瘍は、照射腫瘍に対するｘＲＴおよびｉｎ ｓｉｔｕワクチンの免疫調節効果に対する抑制効果（本発明者らは「付随する免疫寛容」と呼ぶ）を示す。ｘＲＴが腫瘍の全領域に投与される場合、この付随する免疫寛容は克服されることができ、ｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種の有効性を可能にする。しかし、ｘＲＴは、複数の腫瘍が存在する場合、特に腫瘍の数が少なくない場合、または１以上の腫瘍の部位が正確に分かっていない場合、またはｘＲＴを腫瘍のすべての部位に送達することができない場合には、ｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種法と組み合わせて効果的に使用することができない。したがって、腫瘍の数および解剖学的部位にかかわらず、ｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種と組み合わせて、免疫調節用量のＲＴを対象内のすべての腫瘍に送達する改善された方法が必要とされている。

本発明者らは、特定のアルキルホスホコリン類似体が悪性固形腫瘍細胞によって優先的に取り込まれ保持されることを以前に示した。参照によりその全文が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４／００３０１８７号において、Ｗｅｉｃｈｅｒｔらは、多様な悪性固形腫瘍の検出および位置特定ならびに治療のための主剤１８−（ｐ−ヨードフェニル）オクタデシルホスホコリン（ＮＭ４０４；図１参照）の類似体の使用を開示している。ヨード部分がイメージングに最適化された放射性核種、例えばヨウ素−１２４（［^１２４Ｉ］−ＮＭ４０４）である場合、この類似体を、固形腫瘍のポジトロン放出断層撮影−コンピュータ断層撮影（ＰＥＴ／ＣＴ）または単一光子放射型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）画像法で使用することができる。あるいは、ヨード部分が、ヨウ素−１２５またはヨウ素−１３１（［^１２５Ｉ］−ＮＭ４０４または［^１３１Ｉ］−ＮＭ４０４）などの、類似体が取り込まれる固形腫瘍細胞に治療用量のＲＴを送達するために最適化された放射性核種である場合、この類似体を用いて固形腫瘍を治療することができる。

そのような類似体は、インビボで幅広い種類の固形腫瘍型を標的とするだけでなく、腫瘍細胞において長期間の選択的な保持を受け、したがって放射線治療剤として高い可能性をもたらす。さらに、腫瘍取り込みは悪性癌に限定され、前悪性または良性病変にはなされない。したがって、腫瘍の数および解剖学的部位が分かっていようといまいと、そのような薬剤は、細胞傷害性未満であるが免疫調節用量のイオン化ＲＴを対象内に存在するすべての悪性腫瘍に送達するのに非常に適している。

したがって、第１の態様では、本開示は、対象において１以上の悪性固形腫瘍を含む癌を治療する方法を包含する。本方法は、（ａ）悪性固形腫瘍組織によって差次的に取り込まれ保持される免疫調節用量の放射性ハロゲン化化合物を対象に投与するステップ；および（ｂ）腫瘍微小環境内の特定の免疫細胞を刺激することができる１以上の治療を用いて、対象の１以上の悪性固形腫瘍にｉｎ ｓｉｔｕ腫瘍ワクチン接種を実施するステップを含む。「免疫調節用量」は、標的化された放射線治療剤の低いかまたは細胞傷害性未満のＲＴ用量である。ＮＭ４０４が下の実施例で使用されているが、標的化された放射線治療剤は、アルファ、ベータ、オージェ、および／またはガンマ放出体を含む任意の標的化された放射性ハロゲン化治療剤であってよく、それには、限定されるものではないが、放射性ヨウ素化メタヨードベンジルグアニジン（ＭＩＢＧ）が挙げられる。重要な特徴は、標的化された放射線治療剤が、癌細胞または関連する免疫細胞のいずれにも致死性でない低いかまたは細胞傷害性未満のＲＴ用量を放出することである。

いくつかの実施形態では、特定の免疫細胞を刺激することができる１以上の治療には、ｘＲＴが含まれ得る。いくつかの実施形態では、特定の免疫細胞を刺激することができる１以上の治療には、少なくとも１つの悪性固形腫瘍に、腫瘍微小環境内の特定の免疫細胞を刺激することができる１以上の薬剤を含む組成物を腫瘍内注射することが含まれる。いくつかの実施形態では、特定の免疫細胞を刺激することができる１以上の薬剤には、免疫刺激性モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、パターン認識受容体アゴニスト、免疫刺激性サイトカイン、免疫刺激性ナノ粒子、腫瘍溶解性ウイルス、またはそれらの任意の組合せが含まれ得る。使用され得る免疫刺激性モノクローナル抗体の限定されない例としては、抗ＧＤ２抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＣＤ１３４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＫＩＲ抗体、抗ＬＡＧ−３抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＤ４０抗体、またはそれらの組合せが挙げられる。いくつかの実施形態では、免疫刺激性ｍＡｂは、腫瘍特異的抗原に対する抗体である。いくつかの実施形態では、１以上の免疫刺激性モノクローナル抗体を含む組成物は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）も含んでよい。いくつかの実施形態では、使用される抗ＧＤ２ ｍＡｂは、ｈｕ１４．１８を含んでよく、所望により、ＩＬ−２（すなわちこれら２つの融合タンパク質）をさらに含んでよい。

いくつかの実施形態では、免疫刺激性サイトカインは、ＩＬ−２、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）、またはインターフェロン（ＩＦＮ）である。

いくつかの実施形態では、パターン認識受容体アゴニストは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）のアゴニストである。そのようなＴＬＲｓ ＴＬＲの限定されない例としては、ＴＬＲ−１、ＴＬＲ−２、ＴＬＲ−３、ＴＬＲ−４、ＴＬＲ−５、ＴＬＲ−６、ＴＬＲ−７、ＴＬＲ−８、ＴＬＲ−９、またはＴＬＲ−１０が挙げられる。

いくつかの実施形態では、放射性ハロゲン化化合物は、メタヨードベンジルグアニジン（ＭＩＢＧ）であり、ここでヨウ素原子は放射性ヨウ素同位体である。いくつかの実施形態では、放射性ヨウ素同位体は、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ、または^１３１Ｉである。

いくつかの実施形態では、放射性ハロゲン化化合物は、式：
またはその塩を有する。Ｒ_１は、放射性ハロゲン化同位体であるかまたはこれを含み、ａは０または１であり、ｎは１２〜３０の整数であり、ｍは０または１であり、Ｙは−Ｈ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＸ、−ＯＸ、または−ＯＣＯＸであり、ここでＸはアルキルまたはアリールアルキルであり、Ｒ_２は−Ｎ^＋Ｈ_３、−Ｎ^＋Ｈ_２Ｚ、−Ｎ^＋ＨＺ_２、または−Ｎ^＋Ｚ_３であり、ここで各Ｚは独立にアルキルまたはアリールである。

いくつかの実施形態では、放射性ハロゲン同位体は、ヨウ素、臭素、またはアスタチンの放射性同位体である。いくつかのそのような実施形態では、放射性ハロゲン同位体は、^２１１Ｉ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ、または^１３１Ｉである。いくつかのそのような実施形態では、放射性ハロゲン同位体は、^１２５Ｉ、または^１３１Ｉである。いくつかのそのような実施形態では、放射性ハロゲン同位体は、^１３１Ｉである。

いくつかの実施形態では、ａは１であり、ｍは０である。いくつかの実施形態では、ｎは１８である。いくつかの実施形態では、Ｒ_２は−Ｎ^＋Ｈ_３である。

いくつかの実施形態では、ａは１であり、ｍは０であり、ｎは１８であり、Ｒ_２は−Ｎ^＋Ｈ_３である。いくつかのそのような実施形態では、放射性ハロゲン同位体は、^２１１Ａｓ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ、または^１３１Ｉである（化合物は［^２１１Ａｓ］−ＮＭ４０４、［^１２３Ｉ］−ＮＭ４０４、［^１２４Ｉ］−ＮＭ４０４、［^１２５Ｉ］−ＮＭ４０４または［^１３１Ｉ］−ＮＭ４０４である）。

いくつかの実施形態では、放射性ハロゲン化化合物は静脈内投与される。

いくつかの実施形態では、対象はヒトである。

いくつかの実施形態では、この方法は所望により、悪性固形腫瘍の１つをｘＲＴに曝露するステップを含む。

いくつかの実施形態では、この方法は所望により、放射性ハロゲン化化合物の免疫調節用量を決定するステップを含む。いくつかのそのような実施形態では、このステップは、対象に検出促進用量の放射性ハロゲン化化合物を投与し、続いて放射性ハロゲン化化合物内の放射性ハロゲン同位体の特徴である、対象内の１以上の悪性固形腫瘍から発するシグナルを検出することによって実施される。いくつかのそのような実施形態では、検出促進用量に使用される放射性ハロゲン化化合物に含まれる放射性ハロゲン同位体は、^２１１Ａｓ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ、または^１３１Ｉである。使用することのでき得る限定されない例示的な放射性ハロゲン化化合物は、［^１２４Ｉ］−ＮＭ４０４である。いくつかのそのような実施形態では、免疫調節用量の放射性ハロゲン化化合物は、対象内の１以上の悪性固形腫瘍から発するシグナルの強度から計算される。所望により、放射性ハロゲン同位体に特徴的なシグナルを検出するステップは、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）画像法または単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）画像法によって実施される。

本開示の方法を用いて治療され得る、悪性固形腫瘍として示される癌の限定されない例としては、黒色腫、神経芽細胞腫、肺癌、副腎癌、結腸癌、結腸直腸癌、卵巣癌、前立腺癌、肝癌、皮下癌、皮膚または頭頸部の扁平上皮癌、腸癌、子宮頸癌、神経膠腫、乳癌、膵臓癌、軟部組織肉腫、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、および小児脳腫瘍が挙げられる。

本発明のその他の目的、特徴および利点は、明細書、特許請求の範囲および図面を検討した後に明らかになるであろう。

主剤１８−（ｐ−ヨードフェニル）オクタデシルホスホコリン（ＮＭ４０４）の化学構造を示す図である。 図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃは、ｘＲＴ＋ＩＴ−ＩＣがｉｎ ｓｉｔｕ腫瘍ワクチン接種を誘発することを示す、一連のグラフを示す図である。２Ａ）腫瘍増殖曲線および２Ｂ）カプラン・マイヤー生存曲線は、ｘＲＴとＩＴ−ｈｕ１４．１８−ＩＬ２との間の相乗効果を示す。ｘＲＴ＋ＩＴ−ＩＣで処置したマウスの７１％（２２／３１）が、無病になっている。 カプラン・マイヤー生存曲線 これらの９０％が、Ｂ７８黒色腫によるその後の生着を拒絶する。 付随する免疫寛容を示すグラフを示す図である。原発性腫瘍応答が示される。遠隔未処置腫瘍は、２腫瘍Ｂ７８黒色腫モデルにおいてｘＲＴ＋ＩＴ−ＩＣに対する応答を抑制する。この抑制は、第２の腫瘍を照射することによって克服することができる。 付随する免疫寛容がＴｒｅｇに起因することを示すグラフを示す図である。原発性腫瘍応答が示される。遠隔未処置腫瘍は、２腫瘍Ｂ７８黒色腫モデルにおいてｘＲＴ＋ＩＴ−ＩＣに対する応答を抑制し、この抑制は、Ｔｒｅｇを枯渇させる（ジフテリア毒素受容体をそれらのＴｒｅｇに発現するトランスジェニックＤＥＲＥＧマウスを使用し、したがってジフテリア毒素を投与することによってＴｒｅｇを枯渇させる）ことによって克服することができる。 Ｂ７８黒色腫による^１２４Ｉ−ＮＭ４０４の選択的取り込みを示す画像を示す図である。約２００ｍｍ^３のＢ７８腫瘍を有するマウスにＩＶ^１２４ＩＮＭ４０４を静脈内投与し、連続ＰＥＴ／ＣＴスキャンを行った。７１時間でのこの画像は、腫瘍による選択的取り込みと、心臓および肝臓によるいくらかの残留バックグラウンド取り込みを示す。 ｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種が、残留レベルの分子標的化放射線治療（ＴＲＴ）の存在下で誘発され得ることを示すグラフを示す図である。併用されたｘＲＴ＋ＩＴ−ＩＣによる治療は、３μＣｉの^１３１Ｉ−ＮＭ４０４の存在下または不在下で等しく効果的である。これは、実施例４に記載されるように、本発明者らがｘＲＴ（０日目）に続いてＩＴ−ＩＣ（６〜１０日目）を送達する場合に存在するであろうＴＲＴの残留活性に近づく。 図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄおよび７Ｅは、マウス黒色腫および膵腫瘍モデルにおける遠隔未処置腫瘍による、局所ＲＴ＋ＩＴ−ＩＣの組合せに対する原発性腫瘍応答の腫瘍特異的抑制を示す一連のグラフを示す図である。同系のジシアロガングリオシドを発現する（ＧＤ２＋）原発性側腹部腫瘍＋／−対側腹部の続発性腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスを、示されるように原発性腫瘍だけに、「１」日目にｘＲＴによって、そして６〜１０日目に５０ｍｃｇの抗ＧＤ２免疫サイトカイン（ＩＣ）、ｈｕ１４．１８−ＩＬ２（抗ＧＤ２ ｍＡｂとＩＬ２の融合体）の腫瘍内（ＩＴ）注射によって処置した。平均原発性腫瘍体積を図７Ａおよび７Ｃ−７Ｅに示す。７Ａ）．原発性Ｂ７８黒色腫腫瘍を有するマウスでは、未処置の続発性Ｂ７８腫瘍の存在が、ＲＴ＋ＩＴ−ＩＣに対する原発性腫瘍応答に拮抗した。本発明者らは、この作用を「付随する免疫寛容」−ｘＲＴ＋ＩＴ−ＩＣに対する処置腫瘍の局所応答への、未処置遠隔腫瘍の拮抗作用−として説明する。 カプラン・マイヤー生存曲線は、パネルＡのマウスと反復実験について示される。ほぼすべてのマウスが原発性腫瘍の進行のために安楽死した。 原発性Ｐａｎｃ０２−ＧＤ２＋膵腫瘍を有するマウスでは、反対側腹部の続発性Ｐａｎｃ０２−ＧＤ２−腫瘍の有無にかかわらず、未処置のＰａｎｃ０２続発性腫瘍の存在が、ＲＴ＋ＩＴ−ＩＣに対する原発性Ｐａｎｃ０２−ＧＤ２＋腫瘍の応答を抑制した。 原発性Ｂ７８黒色腫腫瘍を有するマウスでは、続発性Ｂ７８腫瘍がＲＴ＋ＩＴ−ＩＣに対する原発性腫瘍応答を抑制したが、続発性Ｐａｎｃ０２−ＧＤ２＋膵腫瘍はこの作用を発揮しなかった。 原発性Ｐａｎｃ０２−ＧＤ２＋腫瘍を有するマウスでは、続発性Ｐａｎｃ０２−ＧＤ２−腫瘍がｘＲＴおよびＩＴ−ｈｕ１４．１８−ＩＬ２の併用に対する原発性腫瘍応答を抑制したが、Ｂ７８続発性腫瘍は抑制しなかった。ｎ＝１群当たりのマウスの数。ＮＳ＝有意でない、^＊＊＊ｐ＜０．００１。 図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃは、付随する免疫寛容が、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の特異的枯渇によって回避されることを示す免疫組織化学画像およびグラフを示す図である。８Ａ）。腫瘍を１つ（Ａ１およびＡ２）または２つ（Ａ３およびＡ４）有するマウスにおいてｘＲＴ後６日目に評価された腫瘍のＴｒｅｇマーカー、ＦｏｘＰ３の免疫組織化学（代表的な４００倍画像が示される）。マウスはｘＲＴを受けなかったか、または原発性腫瘍に対してのみｘＲＴを受けた。原発性腫瘍をＡ１〜Ａ３に示し、続発性腫瘍をＡ４に示す。小さな矢印は、ＦｏｘＰ３＋細胞の一部を指摘する（褐色の核＝ＦｏｘＰ３＋、青色＝ヘマトキシリン対比染色）。右側のグラフは、それぞれＡ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４に示される条件に対応する、２００倍視野当たりのＦｏｘＰ３＋細胞の盲検定量化を示す。 図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃは、付随する免疫寛容が、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の特異的枯渇によって回避されることを示す免疫組織化学画像およびグラフを示す図である。８Ａ）。腫瘍を１つ（Ａ１およびＡ２）または２つ（Ａ３およびＡ４）有するマウスにおいてｘＲＴ後６日目に評価された腫瘍のＴｒｅｇマーカー、ＦｏｘＰ３の免疫組織化学（代表的な４００倍画像が示される）。マウスはｘＲＴを受けなかったか、または原発性腫瘍に対してのみｘＲＴを受けた。原発性腫瘍をＡ１〜Ａ３に示し、続発性腫瘍をＡ４に示す。小さな矢印は、ＦｏｘＰ３＋細胞の一部を指摘する（褐色の核＝ＦｏｘＰ３＋、青色＝ヘマトキシリン対比染色）。右側のグラフは、それぞれＡ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４に示される条件に対応する、２００倍視野当たりのＦｏｘＰ３＋細胞の盲検定量化を示す。 ＤＥＲＥＧマウスは、Ｔｒｅｇ特異的ＦｏｘＰ３プロモーターの制御下でジフテリア毒素受容体を発現し、ジフテリア毒素のＩＰ注射時にＴｒｅｇの特異的枯渇を可能にする。原発性および続発性Ｂ７８黒色腫腫瘍を有するＤＥＲＥＧマウスを、原発性腫瘍へのｘＲＴ＋ＩＴ−ＩＣと、ジフテリア毒素またはＰＢＳのいずれかのＩＰ注射で処置した（最初の反復実験を示す）。付随する免疫寛容は、これらのマウスにおいてＴｒｅｇの枯渇の後に除去され、原発性の腫瘍応答の改善がもたらされる。ｎ＝１群当たりのマウスの数。^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。 ＤＥＲＥＧマウスは、Ｔｒｅｇ特異的ＦｏｘＰ３プロモーターの制御下でジフテリア毒素受容体を発現し、ジフテリア毒素のＩＰ注射時にＴｒｅｇの特異的枯渇を可能にする。原発性および続発性Ｂ７８黒色腫腫瘍を有するＤＥＲＥＧマウスを、原発性腫瘍へのｘＲＴ＋ＩＴ−ＩＣと、ジフテリア毒素またはＰＢＳのいずれかのＩＰ注射で処置した（最初の反復実験を示す）。付随する免疫寛容は、これらのマウスにおいてＴｒｅｇの枯渇の後に除去され、続発性の腫瘍応答の改善がもたらされる。ｎ＝１群当たりのマウスの数。^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。 図９Ａおよび９Ｂは、付随する免疫寛容がｘＲＴを両方の腫瘍部位に送達することによって克服されることを示すグラフを示す図である。原発性および続発性Ｂ７８腫瘍を有するマウスでは、続発性腫瘍は、ｘＲＴ＋ＩＴ−ＩＣによる原発性腫瘍処置に対する原発性腫瘍応答を抑制する。これは、１２ＧｙのｘＲＴを原発性腫瘍と続発性腫瘍の両方に、そしてＩＴ−ＩＣを原発性腫瘍に送達することによって克服され、その結果９Ａ）原発性腫瘍応答（最初の反復実験を示す）および９Ｂ）反復実験からの総動物生存率（ａｇｇｒｅｇａｔｅ ａｎｉｍａｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ）が改善される。ｎ＝１群当たりのマウスの数。^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。 付随する免疫寛容がｘＲＴを両方の腫瘍部位に送達することによって克服されることを示すグラフを示す図である。 図１０Ａ、１０Ｂおよび１０Ｃは、低用量のｘＲＴは、単独ではｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種を誘発しないが、ｉｎ ｓｉｔｕワクチン部位の１２Ｇｙ＋ＩＴ−ＩＣ処置とともに遠隔腫瘍部位に送達した場合に、付随する免疫寛容を実際に克服することを示す一連のグラフを示す図である。１０Ａ）原発性Ｂ７８腫瘍のみを有するマウスでは、１２Ｇｙ＋ＩＴ−ＩＣは、ｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種を誘発し（すでに示した通り）、大部分のマウスにおける完全な腫瘍退縮（本実験では４／６）および記憶性免疫応答をもたらす（Ｍｏｒｒｉｓ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０１６）。一方、ＩＴ−ＩＣ単独かまたは低用量（２Ｇｙ）ｘＲＴ＋ＩＴ−ＩＣの後に完全な腫瘍退縮を示す動物はない（両方の群で０／６）ｐ＜０．０５。 原発性および続発性Ｂ７８黒色腫腫瘍を有するマウスでは、続発性腫瘍に送達された低用量ｘＲＴ（２Ｇｙまたは５Ｇｙ）は、原発性腫瘍で付随する免疫寛容を克服するその能力では１２Ｇｙに匹敵する。 これらの同じ動物において、低用量ｘＲＴを続発性腫瘍に送達することによって付随する免疫寛容を克服することが、ＩＴ−ＩＣ免疫療法に対する全身応答を救済することは明らかである。これに関連して、ｘＲＴがすべての腫瘍部位に送達されると、原発性腫瘍のＩＴ−ＩＣ注射は、全身性抗腫瘍効果を引き起こし、２Ｇｙまたは５Ｇｙに対する続発性腫瘍応答を、原発性腫瘍のＩＴ−ＩＣ注射を行わない場合の１２ＧｙのｘＲＴに対する応答よりも大きくする。 図１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃおよび１１Ｄは、低用量ＴＲＴと^１３１Ｉ−ＮＭ４０４が、全身性白血球減少症を伴わないかまたは腫瘍浸潤ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞を枯渇させずに、腫瘍浸潤ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇを効果的に枯渇させることを示すＰＥＴ画像（１１Ａ）および一連の棒グラフ（１１Ｂ、１１Ｃおよび１１Ｄ）を示す図である。大部分の臨床シナリオでは、免疫抑制をもたらすことになる顕著な骨髄枯渇および白血球減少を引き起こすことなく、外照射を低用量でさえもすべての腫瘍部位に送達することは実現不可能である。ここで、本発明者らは、ＴＲＴを全身投与して、全身の免疫細胞の枯渇および白血球減少症を引き起こすことなく、腫瘍浸潤抑制性免疫細胞（Ｔｒｅｇ）を特異的に枯渇させることができるかどうかを試験した。１１Ａ）ポジトロン放出^１２４Ｉ−ＮＭ４０４を用いるこのＢ７８黒色腫腫瘍モデルにおける線量測定研究は、ＮＭ４０４の腫瘍選択的取り込みを裏付ける。Ｂ７８腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスを、６０μＣｉの^１３１Ｉ−ＮＭ４０４で処置した。この活性は、約２ＧｙのＴＲＴをＢ７８腫瘍に送達するのに必要な^１３１Ｉ−ＮＭ４０４の量に近づく。末梢血および腫瘍試料を未処置の対照マウス（Ｃ）およびその後８日間隔（Ｔ１＝ｄ８、Ｔ２＝ｄ１６、Ｔ３＝ｄ２４、Ｔ４＝ｄ３２）で収集した。 この用量のＴＲＴは有意な全身性白血球減少症をもたらさなかった。 腫瘍浸潤ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞のレベルに有意な影響を及ぼさなかった（ＡＮＯＶＡ ｐ＝０．２５）。 腫瘍浸潤ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇは、この用量のＴＲＴによって有意に枯渇した（ＡＮＯＶＡ ｐ＝０．０３；^＊ｐ＜０．０５）。 図１２Ａおよび１２Ｂは、低用量ＴＲＴと^１３１Ｉ−ＮＭ４０４が付随する免疫寛容を効果的に克服し、ｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種の全身性抗腫瘍効果を救済することを示すグラフを示す図である。低用量^１３１Ｉ−ＮＭ４０４ ＴＲＴが、マウスを白血球減少症にすることなく腫瘍浸潤Ｔｒｅｇを枯渇させる能力を考慮に入れて、本発明者らは低用量^１３１Ｉ−ＮＭ４０４が付随する免疫寛容を効果的に克服するかどうかについて試験した。２つのＢ７８腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスを、示されるように、１日目に６０ｍｃＣｉの^１３１Ｉ−ＮＭ４０４で処置した（ＮＭ４０４）。１半減期（８日）後、動物に１２ＧｙのｘＲＴを原発性腫瘍（ｉｎ ｓｉｔｕワクチン部位）に投与したか、またはｘＲＴを投与しなかった。^１３１Ｉ−ＮＭ４０４を投与しなかった対照マウスに、示されるような（０、２、または１２Ｇｙ）処置を続発性腫瘍に対して行った。１３〜１７日目に、示されるように、マウスに原発性腫瘍（ｉｎ ｓｉｔｕワクチン部位）へのＩＣのＩＴ注射を毎日投与した。原発性腫瘍応答が示され、低用量ＴＲＴの投与が付随する免疫寛容を効果的に克服し、ｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種の全身性抗腫瘍効果を救済することが実証される。 続発性腫瘍応答が示され、低用量ＴＲＴの投与が付随する免疫寛容を効果的に克服し、ｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種の全身性抗腫瘍効果を救済することが実証される。

Ｉ．概要
本開示が記載されている特定の方法論、プロトコール、材料、および試薬に限定されず、これらが変わる可能性があることは理解される。本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、後に出願された非仮出願によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

本明細書および添付される特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈上明らかに指示されている場合を除いて複数形への言及が含まれる。同様に、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１以上」および「少なくとも１つ」は、本明細書において同義的に使用され得る。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」およびその変化形は、これらの用語が本明細書および特許請求の範囲に現れる場合には限定的な意味を有さない。したがって、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する」は、同義的に使用され得る。

別に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似または同等のどんな方法および材料も本発明の実践または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料をここに記載する。本明細書に具体的に言及されたすべての刊行物および特許は、本発明に関連して使用され得る刊行物に報告されている化学物質、機器、統計解析および方法論を記載および開示することを含むあらゆる目的のために参照により組み込まれる。本明細書中で引用されたすべての参考文献は、当業者の技術水準を示すものとして解釈される。

本明細書に記載の専門用語は、実施形態の説明のためのだけのものであり、全体として本発明を限定するものと解釈されるべきではない。特に断りのない限り、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および「少なくとも１つ」は同義的に使用され、１つまたは複数を意味する。

本開示は、本明細書に記載される化合物（中間体を含む）をその薬剤的に許容される形態のいずれかで含み、その形態には異性体（例えば、ジアステレオマーおよびエナンチオマー）、互変異性体、塩、溶媒和物、多形体、プロドラッグなどが含まれる。特に、化合物が光学活性である場合、本発明は、化合物のエナンチオマーの各々、ならびにエナンチオマーのラセミ混合物を具体的に含む。用語「化合物」は、（時折、「塩」が明示的に述べられているが）明示的に述べられているかいないかにかかわらず、そのような形態のいずれかまたはすべてを含むことを理解されたい。

本明細書において使用される「薬剤的に許容される」とは、その化合物または組成物または担体が、治療の必要性を考慮して過度に有害な副作用なく本明細書に記載の治療を達成するための対象への投与に適していることを意味する。

用語「有効量」とは、本明細書において、研究者、獣医師、医師またはその他の臨床医が求める対象、組織または細胞の生物学的または医学的応答を引き出す化合物の量または投与量をさす。

本明細書において、「薬剤的に許容される担体」には、ありとあらゆる乾燥粉末、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤などが含まれる。薬剤的に許容される担体は、本発明の方法において化合物を投与するために有用な物質である。この物質は好ましくは無毒であり、固体、液体または気体の物質であってよく、その他の点では不活性であって薬剤的に許容され、本発明の化合物と相溶性である。そのような担体の例としては、限定されるものではないが、さまざまなラクトース、マンニトール、トウモロコシ油などの油、ＰＢＳなどの緩衝液、生理食塩水、ポリエチレングリコール、グリセリン、ポリプロピレングリコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミドなどのアミド、アルブミンなどのタンパク質、およびＴｗｅｅｎ８０などの界面活性剤、グルコース、ラクトース、シクロデキストリンおよびデンプンなどの単糖類およびオリゴ多糖類が挙げられる。

用語「投与すること」または「投与」とは、本明細書において、治療または予防されるべき疾患または状態に罹患しているかまたはその危険性がある対象に本発明の化合物または医薬組成物を提供することをさす。

薬理学において投与経路は薬物が体内に取り込まれる経路である。投与経路は、通常、物質が適用される部位によって分類される。一般的な例としては、経口および静脈内投与が含まれる。また、経路は作用標的がどこにあるかに基づいて分類されることもできる。作用は、局所的、経腸的（全身に及ぶ作用、ただし消化管を通じて送達される）、または吸入によって肺を経由する非経口的（全身作用、ただし消化管以外の経路によって送達される）であってよい。本出願で言及される局所投与の一形態は、腫瘍内（ＩＴ）であり、薬剤が既知の腫瘍部位に直接または隣接して注入される。

局所投与は局所的な作用を強調し、物質はその作用が望まれる場所に直接適用される。しかし、時には、局所という用語は、物質の標的効果を伴わなくても、身体の局所領域に、または身体部分の表面に適用されるものとして定義されることがあり、この分類をどちらかといえば適用部位に基づく分類の変形とする。経腸投与では、望ましい作用は全身的（非局所的）であり、物質は消化管を介して投与される。非経口投与では、望ましい作用は全身的であり、物質は消化管以外の経路によって投与される。

局所投与の限定されない例としては、経皮投与（皮膚に適用）、例えばアレルギー試験または典型的な局所麻酔、吸入、例えば喘息薬、浣腸、例えば腸のイメージング用の造影剤、点眼薬（結膜に適用）、例えば結膜炎用の抗生物質、点耳薬、例えば外耳炎用の抗生物質および副腎皮質ステロイド、ならびに身体内の粘膜を介する投与を挙げることができる。

経腸投与は、消化管のいずれかの部分を伴い、全身性の作用を有する投与であってよい。例としては、経口（経口）による、錠剤、カプセル剤、または滴剤としての多くの薬物の投与、胃栄養チューブ、十二指腸栄養チューブ、または胃瘻造設による、多くの薬物および経腸栄養の投与、ならびに直腸内への坐剤中のさまざまな薬物の投与を挙げることができる。

非経口投与の例としては、静脈内（静脈内への）投与、例えば多くの薬物、中心動脈栄養法の動脈内（動脈の中への）投与、例えば、血管攣縮の治療における血管拡張薬および塞栓症の治療のための血栓溶解薬、骨内注入（骨髄内への）投与、筋肉内投与、大脳内（脳実質内への）投与、脳室内（脳室系内への）投与、髄腔内投与（脊柱管への注射）、ならびに皮下（皮膚の下への）投与を挙げることができる。これらの中で、骨内注入は、骨髄が静脈系に直接排出されるので、実質的に、間接的静脈内アクセスである。骨内注入は、静脈内へのアクセスが困難な場合に、救急医療や小児科において薬物や輸液に時折使用されることがある。

本開示では以下の略語が使用される：ＡＤＣＣ、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害；Ｂ１６、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスと同系の黒色腫；Ｂ７８、ＧＤ２シンターゼによるトランスフェクションのためにＧＤ２を発現するＢ１６の変異体；Ｄ、日；Ｈｕ１４．１８−ＩＬ２、実施例に開示される調査で使用される一次免疫サイトカイン（ＧＤ２に対して反応する）；ＩＣ、イムノサイトリン（Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｌｉｎｅ）（ＩＬ２に結合した腫瘍反応性ｍＡｂの融合タンパク質）；ＩＬ２、インターロイキン２；ＩＴ、腫瘍内；ＩＶ、静脈内；ｍＡｂ、モノクローナル抗体；ＭＡＨＡ、マウス抗ヒト抗体；ＮＭ４０４、図１に示されるリン脂質エーテルをさすために使用され、大部分の腫瘍によって選択的に取り込まれ、実施例に開示される調査においてＴＲＴに使用される；ＮＸＳ２、ＡＪマウスと同系の神経芽細胞腫；Ｐａｎｃ０２−ＧＤ２、ＧＤ２シンターゼによるトランスフェクションのためにＧＤ２を発現するＣ５７Ｂｌ／６マウスと同系の膵臓癌；ＰＬＥ、リン脂質エーテル；ＲＴ、放射線治療；ＴＲＴ、標的化された放射線治療；Ｗ、週；９４６４Ｄ−ＧＤ２、ＧＤ２シンターゼによるトランスフェクションのためにＧＤ２を発現するＣ５７Ｂｌ／６マウスと同系の神経芽細胞腫。

ＩＩ．本発明
本開示は、１以上の悪性の固形腫瘍として存在するあらゆる癌を治療する方法に関する。開示される方法は、２つの治療ステップを組み合わせ、予期せぬ相乗効果によって、悪性固形腫瘍に対してはるかに改善されたｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種効果をもたらす。具体的には、悪性固形腫瘍組織によって差次的に取り込まれ保持される免疫調節用量の放射性ハロゲン化化合物が患者に投与され、免疫刺激剤で治療されている少なくとも１つの悪性固形腫瘍への追加のｘＲＴの有無にかかわらず、腫瘍微小環境内の特定の免疫細胞を刺激することができる１以上の薬剤を含む組成物を、少なくとも１つの悪性固形腫瘍内に腫瘍内注射すること（または適用すること）によって、ｉｎ ｓｉｔｕ腫瘍ワクチン接種が実施される。免疫調節用量の放射性ハロゲン化化合物は、Ｔｒｅｇレベル（およびその他の免疫抑制要素）を低下させる可能性が高く、ｘＲＴを１つの腫瘍に対して使用し、１以上の追加の腫瘍が照射されない場合に生じる免疫系の低下（付随する免疫寛容）を防ぐ。

Ａ．腫瘍内免疫化−ｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種
腫瘍内免疫化に使用される組成物としては、限定されるものではないが、１以上のサイトカイン、免疫チェックポイント阻害剤、パターン認識アゴニスト、および／または腫瘍特異的抗原に対する抗体を含む免疫刺激性モノクローナル抗体を挙げることができる。腫瘍内免疫化／ｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種戦略の概説には（戦略の中には使用可能なものもある）、Ｐｉｅｒｃｅ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ＆ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｏｅｕｔｉｃｓ １１（８）：１９０１−１９０９，２０１５；およびＭａｒａｂｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０（７）：１７４７−５６，２０１４；およびＭｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，ｅ−ｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ，２０１６を参照されたい；これらすべては参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に開示される限定されない例では、腫瘍内（ｉｍｔｒａｔｕｍｏｒａｌ）免疫化は、抗ＧＤ２ ｍＡｂとインターロイキン２の融合タンパク質（ｈｕ１４．１８−ＩＬ２）を注射することによって実施された。しかし、開示される方法は、決してこれらの例に限定されない。

Ｂ．免疫調節用量の放射性ハロゲン化化合物
使用される放射性ハロゲン化化合物は、放射性ハロゲン化化合物によって放出されるＲＴが、放出されたＲＴにその他の組織種を実質的にさらすことなく、悪性固形腫瘍組織に向けられるように、広範囲の固形腫瘍細胞種を選択的に標的としなければならない。そのような特徴を有する放射性ハロゲン化化合物には、ＭＩＢＧまたは本明細書に開示されるリン脂質エーテル類似体が含まれる。放射性ハロゲン化化合物に含まれる放射性ハロゲン化同位体は、化合物を取り込む細胞の免疫刺激をもたらす形態でイオン化ＲＴを放出することが知られているあらゆる放射性ハロゲン同位体であってよい。限定されない一例では、組み込まれた放射性ハロゲン同位体は、放射性ヨウ素同位体、例えばヨウ素−１３１などである。

放射性ハロゲン化化合物の免疫調節ＲＴ用量は（注射される用量とは対照的に）、悪性固形腫瘍に対して従来ＲＴ治療に使用される用量よりもはるかに少ない。具体的には、用量は、ｉｎ ｓｉｔｕワクチン効果を担う望ましい免疫細胞を除去しない一方で、（おそらく免疫抑制Ｔｒｅｇレベルおよびその他の免疫抑制細胞または分子を減少させることによって）腫瘍微小環境内の免疫細胞において応答を刺激するのに十分でなければならない。

実施例に述べられているように、適切な免疫調節用量は、「検出促進」用量の放射性ハロゲン化化合物を投与した後に得られる画像データから計算することができる。検出促進用量は、免疫調節用量とは全く異なることがあり、放射性ハロゲン化化合物に組み込まれる放射性ハロゲン同位体は異なることがある（しかし化合物構造の残りは同じであるべきである）。検出ステップおよび線量測定計算で用いられる放射性ハロゲン同位体は、従来のイメージング手段によってすぐに検出可能な形態でＲＴを放出することが公知のどんな放射性ハロゲン同位体であってもよい。「従来のイメージング手段」の限定されない例としては、ガンマ線検出、ＰＥＴ走査、およびＳＰＥＣＴ走査が挙げられる。使用され得る放射性ハロゲン同位体の限定されない例としては、アスタチン−２１１、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１２４、ヨウ素−１２５、およびヨウ素−１３１が挙げられる。

Ｃ．開示される類似体および組成物の合成方法
開示される方法で使用されるアルキルホスホコリン類似体は、そのような類似体を合成する方法と同様に、当技術分野で公知である。合成材料および方法に関する詳細については、例えば、米国特許出願公開第２０１０／０２８４９２９号、同第２０１０／０３１６５６７号、同第２０１２／０１２８５９６号、同第２０１４／００３０１８７号、および同第２０１４／００２３５８７号を参照されたい。これらの各々は参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。同様に、ｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種／腫瘍内免疫化癌治療で用いられる方法および組成物は当技術分野で公知である。

Ｄ．広範囲の成人および小児固形腫瘍への適用
上に述べたように、本発明者らは、インビボイメージングと腫瘍増殖抑制研究の両方によって確認されたように、開示される方法で使用されるアルキルホスホコリン類似体が広範囲の成人および小児固形腫瘍に選択的に取り込まれることを以前に実証した。

固形腫瘍癌細胞表現型の相対的な放射線感受性が、非常に低いＲＴ感受性を有するもの（例えば、膵臓、結腸直腸、神経膠腫および乳房）から高いＲＴ感受性を有するもの（例えば、リンパ腫）に及ぶことは当分野で周知である。放射線感受性の低い腫瘍は、放射線抵抗性が高いと考えられ、放射線感受性の高い腫瘍は低い放射線抵抗性を有すると考えられる。癌細胞の相対的な放射線感受性は、一般に２ＧｙのインビトロＲＴ曝露を生き延びる割合（ＳＦ_２）として示される。癌はその相対的な放射線感受性によって分類またはランク付けされることができ、表１はいくつかの一般的な固形腫瘍の既知のＳＦ_２値の限定されない例を提供する。

本発明者らは、以前に、リンパ腫のような高放射線感受性腫瘍と、神経膠腫、乳房、膵臓または結腸直腸腫瘍のような高ＲＴ抵抗性腫瘍の両方を含む、広範囲の腫瘍型において、開示される化合物による良好な腫瘍取り込みおよび増殖阻害を実証した。したがって、過度の実験を行うことなく、定量的イメージングおよび線量測定を用いて、幅広い種類の固形腫瘍型において免疫系を刺激するために必要なＲＴ用量を定量することができる。

Ｅ．剤形および投与方法
Ｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種は、腫瘍内注射によって実施することができるが、その他の投与を（局所または全身に）適用することができる。相乗的標的化ＲＴには、どんな投与経路も適するであろう。一実施形態では、開示されるアルキルホスホコリン類似体は、静脈内注射を介して対象に投与されてよい。もう一つの実施形態では、開示されるアルキルホスホコリン類似体は、任意のその他の適した全身送達、例えば非経口投与、鼻腔内投与、舌下投与、直腸投与、または経皮投与を介して対象に投与されてよい。

もう一つの実施形態では、開示されるアルキルホスホコリン類似体は、鼻腔系または口を介して、例えば、吸入によって対象に投与されてよい。

もう一つの実施形態では、開示されるアルキルホスホコリン類似体は、腹腔内注射またはＩＰ注射を介して対象に投与されてよい。

ある種の実施形態では、開示されるアルキルホスホコリン類似体は、薬剤的に許容される塩として提供されてよい。しかし、その他の塩は、アルキルホスホコリン類似体またはその薬剤的に許容される塩の調製に有用であることがある。適した薬剤的に許容される塩としては、限定されるものではないが、例えば、アルキルホスホコリン類似体の溶液を、塩酸、硫酸、メタンスルホン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酢酸、安息香酸、シュウ酸、クエン酸、酒石酸、炭酸またはリン酸などの薬剤的に許容される酸の溶液と混合することによって形成され得る酸付加塩が挙げられる。

開示されるアルキルホスホコリン類似体が少なくとも１つの不斉中心を有する場合、それらはそれに応じてエナンチオマーとして存在してよい。開示されるアルキルホスホコリン類似体が２以上の不斉中心を有する場合、それらはそれに応じてジアステレオ異性体として存在してよい。そのような異性体およびその任意の割合の混合物がすべて本開示の範囲内に包含されることは理解される。

本開示は、１以上の開示されるアルキルホスホコリン類似体を薬剤的に許容される担体とともに含む医薬組成物を使用する方法も含む。好ましくは、これらの組成物は、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、滅菌非経口液剤または懸濁剤、定量エアゾール剤または液体スプレー剤、滴剤、アンプル剤、自動注射装置または坐剤などの、非経口投与、鼻腔内投与、舌下投与もしくは直腸投与、または吸入もしくは吹送による投与用の、単位剤形の形である。

錠剤などの固体組成物を調製するには、主要な有効成分を、薬学的に許容される担体、例えば従来の錠剤化成分、例えばトウモロコシデンプン、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウムまたはゴム、およびその他の薬学的希釈剤、例えば水などと混合して、本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩のための均質な混合物を含有する、固体の予備製剤組成物を形成する。これらの予備製剤組成物を均質と呼ぶ場合、それは、有効成分が組成物全体にわたって均一に分散されているので、組成物が錠剤、丸剤およびカプセル剤などの等しく有効な単位剤形に容易に細分され得ることを意味する。この固体の予備製剤組成物は、次に、０．１〜約５００ｍｇの本発明の有効成分を含有する上記の種類の単位剤形に細分される。典型的な単位剤形は、１〜１００ｍｇ、例えば、１、２、５、１０、２５、５０または１００ｍｇの有効成分を含有する。新規組成物の錠剤または丸剤は、長期作用の利点を与える投与量を提供するためにコーティングされるか、または別の方法で配合され得る。例えば、錠剤または丸薬は、内側投薬成分および外側投薬成分を含むことができ、後者は、前者の上の外被の形態である。２つの成分は、胃での分解に抵抗するのに役立ち、内側の成分が損傷を受けずに十二指腸に入るかまたは放出が遅延されるのに役立つ、腸溶層によって隔てられ得る。多様な材料がそのような腸溶層または腸溶コーティングに使用され得、そのような材料には、多数のポリマー酸、ならびにポリマー酸と、セラック、セチルアルコールおよび酢酸セルロースとしてのそのような材料との混合物が含まれる。

アルキルホスホコリン類似体を経口または注射による投与のために組み込んでよい液体形態としては、水溶液、適切に風味付けされたシロップ、水性または油性懸濁液、および、綿実油、ゴマ油、ココナッツ油またはピーナッツ油などの食用油を含む風味付き乳濁液、ならびにエリキシル剤および同様の薬学的賦形剤が挙げられる。水性懸濁液に適した分散剤または沈殿防止剤としては、トラガカントゴム、アラビアゴム、アルギン酸塩、デキストラン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンまたはゼラチンなどの合成および天然ゴムが挙げられる。

開示されるアルキルホスホコリン類似体は、注射可能な担体系との組合せを含む、薬学的に注射可能な投薬形態に処方される場合に特に有用である。本明細書において、注射可能な剤形および注入剤形（すなわち非経口剤形）としては、限定されるものではないが、リポソーム注射剤または活性のある原薬を封入するリン脂質を有する脂質二重層小胞が挙げられる。注射剤には、非経口使用を意図した無菌調製物が含まれる。

ＵＳＰによって定義されるように５つの異なるクラスの注射剤：乳濁液、脂質、粉末、溶液および懸濁液が存在する。乳濁液注射には、非経口投与が意図される無菌の発熱物質を含まない調製物を含む乳濁液が含まれる。溶液注射用の脂質複合体および粉末は、非経口使用のための溶液を形成するための再構成を意図した無菌調製物である。懸濁液注射用粉末は、非経口使用のための懸濁液を形成するための再構成を意図した無菌調製物である。リポソーム懸濁液注射用の凍結乾燥粉末は、再構成時に製剤が形成される、非経口使用のための再構成を目的とする無菌のフリーズドライ調製物であり、これは、脂質二重層内または水性空間に活性のある原薬を封入するために使用されるリン脂質を有する、脂質二重層小胞などのリポソームの組み込みを可能にする形で処方される。溶液注射用の凍結乾燥粉末は、その製法が極低圧で凍結状態の生成物から水分を除去することを含み、その後の液体の添加により注射の必要条件にあらゆる点で適合する溶液を生成する、凍結乾燥（「フリーズドライ」）によって調製される溶液用の剤形である。懸濁液注射用の凍結乾燥粉末は、適した液状媒体中に懸濁された固体を含む、非経口使用を目的とする液体調製物であり、そしてそれは、懸濁液を意図する薬剤が凍結乾燥によって調製される、滅菌懸濁液の必要条件にあらゆる点で適合する。溶液注射は、注射に適している、適した溶媒または相互に混和性の溶媒の混合物に溶解した１以上の原薬を含有する液体調製物を含む。

溶液濃縮物注射は、適した溶媒を添加すると、注射の必要条件にあらゆる点で適合する溶液を生じる非経口使用用の無菌調製物を含む。懸濁液注射は、粒子が不溶性であり、油相が水相全体に分散しているかまたは逆も同じである、液相全体にわたって分散した固体粒子を含有する液体調製物（注射に適している）を含む。懸濁リポソーム注射剤は、リポソーム（脂質二重層内かまたは水性空間のいずれかに活性のある原薬を封入するために使用されるリン脂質を通常含有する脂質二重層小胞）が形成されるように、油相が水相全体に分散した液体調製物（注射に適している）である。懸濁液超音波処理注射液は、粒子が不溶性である、液相全体に分散した固体粒子を含有する液体調製物（注射に適している）である。その上、生成物は、ガスを懸濁液に吹き込む際に超音波処理されてもよく、その結果、固体粒子によるミクロスフェアが形成される。

非経口担体系には、１以上の薬学的に適した賦形剤、例えば溶媒および共溶媒、可溶化剤、湿潤剤、懸濁剤、増粘剤、乳化剤、キレート剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、還元剤、抗菌性保存剤、充填剤、保護剤、等張化剤、および特殊添加剤などが含まれる。

以下の実施例は説明目的のためだけに提供され、本発明の範囲を限定することを決して意図するものではない。実際に、本明細書中に示され記載されたものに加えて、本発明のさまざまな変更は、前述の説明および以下の実施例から当業者に明らかとなり、添付される特許請求の範囲に入る。

ＩＩＩ．実施例
実施例の序論
これらの実施例は、予想外の非常に強力な相乗効果を利用して、癌治療研究における２つの非常に異なる最先端の学問分野を１つにする可能性を示す。これらの学問分野は、１）全身投与されたＴＲＴ、および２）局所に向けられる、抗体に媒介される癌免疫療法である。本明細書に提示されるデータは、これらの手法を組み合わせることによって生じる強力な相乗効果を示唆する。一緒に、これらの２つの戦略を用いて、どんな部位のどんな種類の固形腫瘍に対しても、破壊された癌細胞が持続性残存転移性疾患を根絶することの可能な腫瘍特異的Ｔ細胞免疫を生じる強力なｉｎ ｓｉｔｕワクチンとして機能することを可能にする方法で、目に見える肉眼的腫瘍を破壊することができる。

本発明者らの進行中の前臨床研究は、腫瘍特異的ｍＡｂとＩＬ２（自然免疫細胞を活性化するための）の組合せが抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の増強［１、２］；神経芽細胞腫の小児に対する臨床的利益にすでに変換されているプロセス［３］をもたらすことを示した。最近の前臨床データは、ｍＡｂ−ＩＬ２融合タンパク質が腫瘍内注射（ＩＴ）された場合の、より強力な抗腫瘍効果を示す［４、５］。注目すべきことに、これらのｍＡｂ／ＩＬ２注射に応答せず、局所ｘＲＴのみで治療した場合には成長し続ける大きな腫瘍は、ｘＲＴをｍＡｂ／ＩＬ２治療と組み合わせると完全に根絶することができる。大部分のマウスが治癒し、同様の腫瘍細胞による再攻撃を拒絶するＴ細胞記憶を発達させており［６］；併用されたｘＲＴ＋ｍＡｂ／ＩＬ２が強力な「ｉｎ ｓｉｔｕ」抗癌ワクチンとして作用していることを示している。

重要な制限は、これらの動物が原発性（第１の）腫瘍に対してｘＲＴ＋ｍＡｂ／ＩＬ２治療を受けた場合に別の肉眼的腫瘍が存在するならば、第２の腫瘍は増殖し続け、本発明者らの驚くべきことに、免疫反応を抑制して、１回目の治療を受けた腫瘍の縮小を防ぐことである。この「付随する免疫寛容」は、一部分、第２の腫瘍の抑制性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に起因する。ＲＴだけを両方の腫瘍に送達すると最小の抗腫瘍効果があるが、これらのＴｒｅｇを枯渇させる。このように、第１の腫瘍をｘＲＴ＋ｍＡｂ／ＩＬ２で治療すると、第２の腫瘍へのＲＴの追加によってこの免疫寛容が回避され、両方の腫瘍の根絶が可能になる［７］。これらの知見は、転移性の状況におけるｉｎ ｓｉｔｕ腫瘍ワクチン接種の制限を示すが、ＲＴがこの制限を克服する強い能力も示唆する。

ｘＲＴは、一般に、禁止された正常組織毒性および免疫抑制なしに転移性の部位に送達されることができない。しかし、肉眼的疾患のすべての部位にｘＲＴを送達しなくても、抑制性免疫系統を無傷のままにすることがあり、それは本発明者らの局所的ｘＲＴ＋ｍＡｂ／ＩＬ２免疫療法に対する免疫学的応答を抑制することができる。そのため、必要とされているのは、標的化された方法で癌患者のすべての腫瘍部位にＲＴを送達する手段である。

本発明者らは、全身投与されたＲＴを原発性癌と転移性癌の両方に標的化することができるＴＲＴ賦形剤を開発した。そのようなＴＲＴ試薬の１つである、^１３１Ｉ−ＮＭ４０４は、静脈内（ＩＶ）投与されるリン脂質エーテル（ＰＬＥ）類似体で、６０を超えるインビボ癌および癌幹細胞モデルにおいてほぼ万能の腫瘍標的化特性を示した。この試薬は現在、複数のイメージングおよび臨床試験で臨床的に評価されている［８、９］。^１３１Ｉ−ＮＭ４０４の全身注射は、解剖学的部位にかかわらず、すべての腫瘍に集中して、効果的な腫瘍根絶性免疫応答の生成を防ぐことのできる、腫瘍内免疫抑制経路を切断するのに十分なＲＴを内部的に提供する。この手法の独特の特質は、ＮＭ４０４のほぼ万能の腫瘍標的化能力、ならびに免疫調節性の致死量以下の用量のＲＴをすべての腫瘍部位に送達する能力であり、これは一般にｘＲＴでは実現不可能である。これについての新しいことは、本発明者らのＴＲＴ剤が、解剖学的部位にかかわらず、すべての腫瘍を免疫調節し、付随する寛容性を克服することができ、それにより局所ｘＲＴとそれに続く腫瘍特異的ｍＡｂ＋ＩＬ２の注射の後に長期間のｉｎ ｓｉｔｕ腫瘍ワクチン接種効果がもたらされるということである。ますます多くの腫瘍特異的ｍＡｂが臨床使用のために承認されるようになっているので、この併用戦略は、腫瘍反応性ｍＡｂによって標的化され得るどんな腫瘍型の臨床応用にも容易に拡張させることができ得る。さらに、この手法は、すべてのｉｎ ｓｉｔｕ腫瘍ワクチン接種戦略に容易に一般化することができる。

これらの実施例では、本発明者らは、局所のｘＲＴ＋ｍＡｂ／ＩＬ２併用治療が強力な放射免役促進性のｉｎ ｓｉｔｕ癌ワクチンを誘導することを可能にするために必要な全身免疫調節応答を開始する^１３１Ｉ−ＮＭ４０４および関連する類似体の能力を評価する方法を説明する。同様の評価は、ＰＬＥ類似体に送達されるＴＲＴとその他のｉｎ ｓｉｔｕ癌ワクチン法の併用について行うことができ得る。

要するに、本発明者らは、一見したところ切り離された癌治療の学問分野に由来する２つの異なる方法を１つの統合された治療に組み合わせる最初の試みを本明細書において開示する。これらの実施例に提示されるデータは、これら２つの方法を相乗的に組み合わせて、悪性固形腫瘍を効果的に除去し、腫瘍再発を防ぐことができることを示す。この手法の根底にある３つの重要なコンセプトは、（Ａ）局所ｘＲＴ＋ＩＴ ｍＡｂ／ＩＬ２が既存の１つの腫瘍を根絶し、Ｔ細胞記憶を生成する（ｉｎ ｓｉｔｕワクチン）；（Ｂ）照射されない限り、遠隔腫瘍が付随する免疫寛容を引き起こし、ｉｎ ｓｉｔｕワクチンの有効性を妨げる；および（Ｃ）全身ＲＴとは異なり、ＴＲＴは重度の全身性のＲＴによる免疫抑制を伴わずに、すべての腫瘍に局在することができる、である。これらのコンセプトは、本発明者らのデータとともに、マウスの原発性腫瘍に対するｘＲＴ＋ＩＴ ｍＡｂ／ＩＬ２と、転移に起因する寛容性を除去するためのＴＲＴは、すべての悪性固形腫瘍に基づく癌（原発部位および転移部位）を根絶するために効果的なｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種を可能にするであろうという結論をもたらす。

実施例１では、本発明者らは、特許請求される方法の裏付けとしてＢ７８ ＧＤ２＋モデルから得たバックグラウンドデータを提示する。

実施例２では、本発明者らは、原発性腫瘍に対する最適なｉｎ ｓｉｔｕワクチン効果に必要なｘＲＴの用量、および付随する免疫寛容を防ぐために必要な遠隔腫瘍に対するｘＲＴの最小用量を決定するためのガイダンスを提供する。

実施例３では、本発明者らは、実施例２で決定されるように、転移に対するｘＲＴの必要な投薬に近づく、^１３１Ｉ−ＮＭ４０４の投薬を決定し、その後、^１３１Ｉ−ＮＭ４０４用量のインビボ免疫機能への効果を評価するためのガイダンスを提供する。

実施例４では、本発明者らは、実施例２および３から得たデータを使用して、２以上の腫瘍を有するマウスにおいて、局所的に治療された腫瘍を破壊し、すべての遠隔腫瘍のＴ細胞媒介性根絶を誘導するための、^１３１Ｉ−ＮＭ４０４＋局所ｘＲＴ＋ＩＴ−ｍＡｂ／ＩＬ２の投与計画を設計／試験／開発するためのガイダンスを提供する。ＴＲＴおよびｘＲＴの用量および時間の重大な問題は、抗腫瘍効果のために最適化されている。

実施例５、６、７および８では、本発明者らは、実施例１〜４のガイダンスに従って実施された実証研究から得た情報および具体的なデータを提供する。

実施例１：バックグラウンドを裏付けるデータ
Ｓｏｎｄｅｌ研究室は、腫瘍特異的ｍＡｂ＋ＩＬ２が自然免疫細胞を活性化させてマウスにおいてＡＤＣＣを媒介し［２］、神経芽腫をもつ小児にとって臨床的に有益である［３］ことを示した。マウスにおいて、ｈｕ１４．１８−ＩＬ２ ＩＣのＩＶ投与は、抗ＧＤ２ ｍＡｂ＋ＩＬ２のＩＶ投与よりも強力であった［２、１０］。これは、ごく小さい、最近確立されたＧＤ２＋腫瘍またはごく小さい顕微鏡レベルの転移に対して劇的な抗腫瘍効果を提供することができ、寛解状態であるが再発の危険性が高い患者におけるこの手法の臨床使用を潜在的に説明する［３］。測定可能な肉眼的腫瘍［すなわち、約５０ｍｍ^３のＧＤ２＋腫瘍］に対するより強力な抗腫瘍効果は、ＩＣがＩＶよりもむしろ腫瘍内注射された（ＩＴ−ＩＣ）場合に実現され得る［４、５］。

本発明者らはこれから、はるかに大きい肉眼的腫瘍の状況で利益をもたらす方法に注目する。５週間前に確立された、中程度の大きさ（２００ｍｍ^３）のＢ７８黒色腫腫瘍を有するマウスは、ＩＶ−ＩＣに対して応答を示さず、ＩＴ−ＩＣによってその増殖が遅くされているが、腫瘍は増殖を続ける。これらの同じ２００ｍｍ^３腫瘍も、１２ＧｙのｘＲＴの後に増殖する。対照的に、ＩＴ−ＩＣおよびｘＲＴを併用すると、７３％の動物の腫瘍がなくなり、その疾患が治癒したように見える（図２Ａおよび２Ｂ）。次に、これらのマウスは、同じ腫瘍による再負荷のＴ細胞媒介性拒絶を示す（図２Ｃ）。したがってＩＴ−ＩＣ＋ｘＲＴは相乗作用を示し、腫瘍が「ｉｎ ｓｉｔｕ腫瘍ワクチン」になることを誘導する［６］。

臨床転移をシミュレートするために、本発明者らはＢ７８を１日目にマウスの側腹部に、そして２週間目に他方の側腹部に接種する。５週目に、第１の腫瘍は２００ｍｍ^３であり、第２の腫瘍は５０ｍｍ^３である。本発明者らは、ｘＲＴ＋ＩＴ−ＩＣが第１の腫瘍を破壊し、得られるＴ細胞応答が次に第２の腫瘍を破壊するであろうと予測した。しかし、ＩＴ−ＩＣをｘＲＴに加えても、５０ｍｍ^３腫瘍にも２００ｍｍ^３腫瘍にも実質的に効果がなかった（図３）。これは本発明者らが提供した治療法への重要な制限を示した；つまり、これらのマウス（ｍｏｃｅ）がｘＲＴ＋ＩＴ−ＩＣを第１の腫瘍に受けたときに別の腫瘍が存在する場合、第２の腫瘍は全身性の腫瘍特異的な付随する免疫寛容作用を引き起こし、どちらの腫瘍の縮小も防ぐことになることである。重要なことに、本発明者らは、第１および第２の腫瘍に対する局所ｘＲＴ（１２Ｇｙ）が同時にこの寛容作用を抑止し、大部分のマウスで両方の腫瘍を根絶する免疫応答を第１の腫瘍に対するＩＴ−ＩＣに誘導させることを見出した（図４）［７］。Ｔｒｅｇ枯渇ｍＡｂ（図示せず）または選択的Ｔｒｅｇ枯渇を可能にするトランスジェニックマウス（図４）［７］を用いる最近のデータは、この免疫寛容が、一部分、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）によって媒介されることを示す；第１および第２の腫瘍に対するＲＴは、これらのＴｒｅｇを部分的に枯渇させ、両方の腫瘍への照射が寛容作用を回避する方法を潜在的に説明する［７］。

第１および第２の腫瘍の両方に対する局所ｘＲＴは寛容性を回避するが、臨床転移性疾患は多くの場合、いくつかの部位に存在する。すべての肉眼的転移性疾患は、免疫寛容を阻止し、ｘＲＴ＋ＩＴ−ＩＣがすべての腫瘍部位を効果的に根絶することを可能にするためにＲＴを受けなければならない。しかし、１２ＧｙのｘＲＴをすべての疾患部位に送達することは、主な用量依存的（致死となり得る）毒性および深刻な全身性免疫抑制を伴う「全身ＲＴ」に近い可能性がある。

以前に、Ｗｅｉｃｈｅｒｔ研究室は、すべての全身性腫瘍部位にＲＴを送達し、同時に正常組織（特に骨髄および免疫組織）に対する「標的外」ＲＴを最小限に抑えるために、ＴＲＴを先駆的に開発した。

腫瘍細胞が過剰なリン脂質エーテル（ＰＬＥ）を含むという知見に基づいて［１１］、本発明者らは、腫瘍を選択的に標的化する類似体を同定することを狙って３０を超える放射性ヨウ素化ＰＬＥ類似体を合成した［１２］。これらのうちの１つである、ＮＭ４０４は、脳転移および癌幹細胞を含む解剖学的部位にかかわらず、調査した７０を超えるインビボモデルの３つを除くすべてにおいてほぼ万能の腫瘍取り込みを示しただけでなく、腫瘍細胞に侵入すると、長期間選択的に保持された［８］。これらのｄｉａｐｅｕｔｉｃ ＰＬＥ類似体は、それらが前悪性病変および炎症性病変を回避するという点で独特である。正常細胞と比較して癌細胞で過剰発現する表面膜脂質ラフトは、ＮＭ４０４を含むＰＬＥの癌および癌幹細胞への侵入の入り口として役立つ［８］。放射性ヨウ素化ＮＭ４０４（Ｉ−１２４およびＩ−１３１）は、今回５回の第１相および第２相ＰＥＴイメージング試験および３回の第１相ＴＲＴ放射線療法試験においてそれぞれ評価され、１ダースを超えるヒト癌種において同様の腫瘍取り込みおよび保持特性を示す［８］。これらの例に関連する癌モデル（Ｂ７８ ＧＤ２＋マウス黒色腫）での優れた腫瘍取り込みは、^１２４Ｉ−ＮＭ４０４ ＰＥＴイメージングで確認された（図５）。

実施例２：ｘＲＴの投与量の決定
本発明者らのデータはこれらの４つの仮説を示唆する：（１）１つの腫瘍を治療するために使用したｘＲＴの用量は、適度の直接インビボ腫瘍死を引き起こし、免疫に媒介される死（ＡＤＣＣとＴ細胞の両方による）に対する感受性を増大させる；（２）ＩＴ ｍＡｂでなくＩＴ−ＩＣの添加によってもたらされる強いＴ細胞応答は、ＩＬ２の存在下で照射を受けた腫瘍細胞と結合するｍＡｂが、抗原提示および適応免疫の誘導の増強を促進することを示唆する；（３）第２の腫瘍が存在すると、第２の腫瘍に存在する免疫抑制細胞［例えばＴｒｅｇおよびおそらく骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）など］の全身作用によって主に引き起こされる寛容性のために、第１の腫瘍へのｘＲＴ＋ＩＴ−ＩＣが実質的にどんな抗腫瘍効果も引き起こさない；この寛容性は、Ｔｒｅｇの枯渇（図４）または第２の腫瘍への照射（図３）によって回避することができる；（４）寛容性を回避するために第２の腫瘍で必要なＲＴの用量は、第１の腫瘍が「ｉｎ ｓｉｔｕワクチン」となるために必要なｘＲＴ用量よりもはるかに低いかもしれない［１４］。

原発性（「ｉｎ ｓｉｔｕワクチン」）腫瘍部位のｘＲＴ用量の最適化。

ｘＲＴ＋ＩＴ−ＩＣの本発明者らのインビボ研究は、第１の腫瘍に対する１用量の１２Ｇｙに注目してきた。これは、本発明者らのｘＲＴ＋ＩＴ−ＩＣのｉｎ ｓｉｔｕワクチン効果が、機能的Ｆａｓ−Ｌを有するマウスを必要とすることを実証するインビボデータと組み合わせた、インビトロＲＴがＢ７８腫瘍細胞でＦａｓの用量依存性の機能アップレギュレーション（＞１２Ｇｙのピーク付近）を誘導することを示す本発明者らのデータに基づく（６）。本発明者らは１２Ｇｙの用量を選択する前にインビボ予備研究を実施した。それは高用量（１６Ｇｙ）または分割を増加した側腹部ＲＴが毒性（皮膚炎、潰瘍、および後肢浮腫）を有することを示し、腫瘍応答の改善は示さなかった。本発明者らは、インビボ研究に１２Ｇｙの１回照射（ｓｉｎｇｌｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ）のｘＲＴを選択したが、本発明者らが臨床解釈へと進む時に、ｉｎ ｓｉｔｕワクチン効果を安全かつ効果的に誘導するために、局所ｘＲＴ効果の機構およびその用量条件をより良く理解することが有益であろう。

本発明者らのマウスデータ（図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃ）は、たとえ１２ＧｙのｘＲＴ単独では腫瘍の縮小が引き起こされないとしても、１２ＧｙのｘＲＴ＋ＩＴ−ＩＣで強力なワクチン効果を誘導することができることを示す；それは進行性の成長を遅らせるだけである。本発明者らは、より低い用量のＲＴを用いるｉｎ ｓｉｔｕワクチン効果が同じように強力なのではないかと考えた。これを試験するために、本発明者らは、約２００ｍｍ^３のＢ７８腫瘍を有するマウスにおいて一連のｘＲＴ用量（４〜１６Ｇｙ）を１回照射として、それに続いて本発明者らの標準的なＩＴ−ＩＣ投与計画（６〜１０日目に５０ｍｃｇ／日）によって評価する。本発明者らは、ＩＴ−ＩＣと併用した場合に、どのｘＲＴ用量が最適な腫瘍根絶およびＴ細胞記憶をもたらすかを決定する。１２Ｇｙ未満の用量がより毒性が少なく、匹敵する有効性を示す場合、そのようなより低い用量は、実施例３および４の「ｉｎ ｓｉｔｕワクチン」部位への本発明者らのｘＲＴ用量のより良い標的となるであろう。

寛容性が「ｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種」を阻止することを防ぐための遠隔腫瘍でのｘＲＴ用量の最適化。

第１の腫瘍と第２の腫瘍の両方を１２Ｇｙで治療することにより（図３）、第１の腫瘍へのＩＴ−ＩＣが、両方の腫瘍を根絶する強力な応答を誘導することが可能になる。本発明者らの目的は、寛容性を回避するために転移部位で必要な最小ＲＴ用量を使用しながら、ｘＲＴ＋ＩＴ−ＩＣを１つの腫瘍に提供することによってこの同じｉｎ ｓｉｔｕワクチン効果の達成を可能にすることである。本発明者らは、ｘＲＴ自体が、特に広まっている場合には、骨髄／免疫抑制性になり得ることを認識している。そのため、本発明者らは実施例３および４でＴＲＴを追跡している。たとえ標的化されているとしても、ＴＲＴはＲＴのいくらかの全身送達を行っている。ＴＲＴからの全身性免疫抑制を最小にするために、本発明者らは、全身性ＲＴ誘導性の全体的な免疫抑制を引き起こさずに、腫瘍誘導性免疫寛容を効果的に抑制するのに必要な限り低い用量のＴＲＴを投与することを望んでいる。そのため、本発明者らは、第１の腫瘍へのＩＴ−ＩＣと併用した場合に、第１の腫瘍へのより高いｘＲＴ用量が、ｉｎ ｓｉｔｕワクチンとして機能することを可能にするために、どの程度低い用量のｘＲＴが遠隔腫瘍に送達されるために必要であるかを決定する。

２００ｍｍ^３の第１のＢ７８腫瘍（ｔｕｍｏｔ）および約５０ｍｍ^３の第２のＢ７８腫瘍を有するマウスは、０日目（第１のＢ７８腫瘍の移植の約５週間後）に１２ＧｙのｘＲＴを第１の腫瘍に投与される。これに続いて、６〜１０日目に本発明者らの標準的なＩＴ−ＩＣの投与計画が行われる。別々の群のマウスには、さまざまな用量のｘＲＴが第２の腫瘍に投与される。３Ｇｙの全身ｘＲＴが骨髄腫モデルにおいて免疫抑制作用を防ぐことができることを示すＢ．Ｊｏｈｎｓｏｎの研究室のデータに基づいて（１５）、本発明者らは、０、１、５および８Ｇｙの用量を（現在効果的であると分かっている１２Ｇｙ量に加えて）評価する。第２の腫瘍に対して実質的に１２Ｇｙ未満の用量でも、免疫寛容を排除する上で十分な１２Ｇｙの用量と同じくらい効果的であるかどうかが分かるであろう。

本発明者らが有益な効果を失うｘＲＴの限界用量を解明したら、限界用量をより良好に識別するために次の分析を実行する。例えば、５Ｇｙが１２Ｇｙと同程度に効果的であるが、１Ｇｙが０Ｇｙとあまり変わらない場合は、本発明者らは、１２Ｇｙ＋ＩＴ−ＩＣを第１の腫瘍に投与されるこの２つの腫瘍モデルで２、３、および４Ｇｙを比較して、寛容性を排除して効力を得るために必要な限界最低有効ＲＴ用量を特定する。

次に、反復研究を行って、第１の腫瘍に対する用量が１２Ｇｙの用量でなく１腫瘍モデルでの最小有効量（上の実施例２で試験済み）である場合に、第２の腫瘍へのこの最小有効量が有効なｉｎ ｓｉｔｕワクチンをなお可能にするかを確かめる。要するに、実施例２の研究が、本発明者らが１２Ｇｙで両方に対して実証した有効性を失うことなく、第１および第２の腫瘍の最小ｘＲＴ用量が何であるかを決定することになる。

Ｂ７８以外の腫瘍を有するマウスにおける第１および第２の腫瘍への必要なｘＲＴ用量の研究の開始。

本発明者らのマウス研究によってより多くの臨床一般化可能性が提案されるようにするために、ＧＤ２＋腫瘍の追加のモデルでＲＴ＋ＩＴ−ＩＣの分析を開始する。本発明者らは、ＧＤ２＋ＮＸＳ２神経芽細胞腫を有するＡＪマウスにおけるｈｕ１４．１８−ＩＬ２ ＩＣを伴うＩＴ−ＩＣについて発表した［５］。また、本発明者らは、ＧＤ２＋９４６４Ｄ−ＧＤ２神経芽細胞腫、および、ＧＤ２シンターゼの遺伝子の挿入によってＧＤ２を発現するＰａｎｃ０２−ＧＤ２膵臓癌を有するＣ５７ＢＬ／６マウスにおいてこの同じＩＣでのＩＴ−ＩＣを評価している。実施例２に関して、各モデルについて本発明者らは、ｉｎ ｓｉｔｕワクチン効果を保持するために原発性腫瘍および二次性腫瘍に必要な最小有効ｘＲＴ用量を決定する。

実施例３：^１３１Ｉ−ＮＭ４０４の投与量の決定および免疫機能への効果の評価
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＴＲＴによる線量測定およびＴＲＴからの免疫抑制。

^１３１Ｉ−ＮＭ４０４は、＞９５％の腫瘍株（ヒトおよびマウス）においてインビトロで選択的な取り込みを示し、非悪性細胞による取り込みは少なく、インビボでも同様の腫瘍特異性が見られる。これには、Ｂ７８腫瘍によるインビボでの選択的取り込みが含まれる（図５）。予備的線量測定研究では、本発明者らは^１２４Ｉ−ＮＭ４０４をＣ５７ＢＬ／６マウスに投与し、連続ＰＥＴ／ＣＴイメージングによって（図５のように）ＴＲＴ曝露の経時的推移を特徴付けた。この研究に基づくモンテカルロ線量測定計算［１６−１８］により、４週間の崩壊期間にわたって確立されたＢ７８腫瘍に約３Ｇｙを送達するために、約６０μＣｉの^１３１Ｉ−ＮＭ４０４が必要であることが示された。その４週間後、Ｂ７８腫瘍への残りのＴＲＴ用量は、０．２５Ｇｙ未満となることになる。本発明者らは、ｘＲＴを用いて２腫瘍モデルで得たデータを複製する（図３）が、遠隔疾患のすべての部位の腫瘍に誘導される寛容性を効果的に排除することを可能にする、あり得る最小用量の標的化された^１３１Ｉ−ＮＭ４０４ ＴＲＴを使用する。しかし、数分ですべての線量を送達し、その後行われるｘＲＴとは違って、ＴＲＴは、標的化された同位体の生物学的半減期と物理的半減期の両方（^１３１Ｉについて８日ｔ１／２）に応じて、経時的に用量を蓄積させる。本発明者らは、免疫寛容を根絶するために遠隔腫瘍部位に初期ＴＲＴ効果を求める；しかし、本発明者らは、ＩＴ−ＩＣを投与してＡＤＣＣおよびｉｎ ｓｉｔｕワクチン抗腫瘍効果を誘導すると免疫抑制ＴＲＴ効果が最小であることを求める。これはすべての部位で完全に腫瘍を破壊するために必要不可欠である。

予備データから線量測定計算を用いて、本発明者らは３μＣｉの用量の^１３１Ｉ−ＮＭ４０４は、約０．２Ｇｙに相当する量を腫瘍部位に送達するはずであると推定した。本発明者らが仮定した用量は免疫抑制性であるべきでなく、リンパ球に媒介される腫瘍破壊を妨げるべきでない。上記のように、これは６０μＣｉの初期^１３１Ｉ−ＮＭ４０４用量の２８日後になってもまだ送達されていないと本発明者らが推定した用量である。このようにして、本発明者らは単一の２００ｍｍ^３のＢ７８腫瘍を有するマウスの群を評価した。０日目に、すべてのマウスに１２ＧｙのｘＲＴをその腫瘍に投与し、６〜１０日目に、すべてのマウスに５０ｍｃｇ／日のＩＴ−ＩＣを投与した。１つの群には０日目に３μＣｉの^１３１Ｉ−ＮＭ４０４も投与した（約０．２Ｇｙ）。図６は、^１３１Ｉ−ＮＭ４０４を投与された群が、^１３１Ｉ−ＮＭ４０４を投与されていない群と同程度の腫瘍根絶を示したことを示し、腫瘍のこの低用量の「残留」ＴＲＴが、ＲＴ＋ＩＴ−ＩＣ ｉｎ ｓｉｔｕワクチンによる免疫媒介性破壊を阻止しないことを実証する。したがって、本発明者らは、２２日目に６０μＣｉの初期用量の^１３１Ｉ−ＮＭ４０４ ＴＲＴを使用すると、それは遠隔腫瘍の免疫寛容原性作用を効果的に阻止し、さらに第１の腫瘍に対する０日目のｘＲＴ、および６〜１０日目（ＴＲＴの２８日後）のＩＴ−ＩＣをｉｎ ｓｉｔｕワクチンとして機能させ、その後すべての腫瘍を根絶する適応応答を誘導すると仮定する。

この実施例に概説した実験は、図６で試験された用量相関を評価するであろう。本発明者らの１腫瘍Ｂ７８モデルにおいて、本発明者らは、^１３１Ｉ−ＮＭ４０４ ＴＲＴの用量範囲を試験して、どんなＴＲＴ用量が、望ましいｉｎ ｓｉｔｕワクチン効果に干渉する（そしてそれによって第１の腫瘍の根絶を遅らせるかまたは妨げる）のに十分な望まない全身性免疫抑制をもたらすのかを決定する。これは、実施例４にとって重要である、それは遠隔疾患を有するマウスにおいて第１の腫瘍へのＩＴ−ＩＣを開始した時点で、ＴＲＴの残留放射能がこの値よりも小さく減衰したことを確認することができるためである。本発明者らはまた、「寛容性を妨げるＴＲＴ用量」を複数の腫瘍を有する動物に投与した後に、第１の腫瘍のＲＴ＋ＩＴ−ＩＣ治療がなおｉｎ ｓｉｔｕワクチン効果を誘導し、原発性腫瘍ならびに遠隔腫瘍を根絶させるまで、どのくらい待つ必要があるかを決定するために、さまざまなＴＲＴ用量後のＴＲＴ応答の速度を評価する。

関連研究は、単剤治療として投与されるＴＲＴの用量が、単一のＢ７８腫瘍の減速、対縮小、対根絶にどれほど必要とされるかについても注目する。腫瘍誘導性免疫寛容を排除するために必要になるＴＲＴの用量は、（ＴＲＴ単独から）完全な腫瘍破壊を実際に誘導するために必要なＴＲＴ用量よりも実質的に少ないであろう。

最後に、さまざまな用量のＴＲＴの効果が１腫瘍モデルで決定されれば、本発明者らはこれらのマウスの血清をＩＣのヒトＩｇＧ成分に対する免疫応答について評価することによって、ＴＲＴのわずかな免疫抑制効果を評価する。本発明者らは、免疫適格マウスがこれらのヒト化ＩＣでの処置の後に容易に定量されるレベルのマウス抗ヒト抗体（ＭＡＨＡ）を生成することを示した（１９）。本発明者らが見ているどんな用量でＴＲＴがマウス免疫応答の強度の検出可能な用量依存性減少を引き起こすかを決定する手段として本発明者らはこれを使用し、これらのマウスがこのＴＲＴから受け取る全身用量のＲＴからの全体的な免疫抑制効果を計測する。本発明者らが腫瘍誘導性免疫寛容を阻止するために必要とする低いＴＲＴ用量は、最小の全身性免疫抑制を引き起こすであろう。

Ａ／ＪマウスにおけるＴＲＴでの線量測定およびＴＲＴからの免疫抑制。

実施例２と同様に、上に概説した研究が完了に近づいたら、本発明者らは、ＮＸＳ２神経芽細胞腫を有するＡ／Ｊマウスにおいて選択的反復研究を開始し始める。

実施例４：２以上の腫瘍を有するマウスにおける^１３１Ｉ−ＮＭ４０４＋局所ｘＲＴ＋ＩＴ−ｍＡｂ／ＩＬ２の投与計画の開発
２腫瘍Ｂ７８モデルにおけるＴＲＴ＋ｘＲＴ＋ＩＴ−ＩＣの有効性の試験。

実施例２および３で概説した研究から得られた用量およびタイミングの情報は、本発明者らの２腫瘍モデルでの有効性に必要なＴＲＴの投薬およびタイミングを推定するために必要な情報をもたらす。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、Ｂ７８を左（Ｌ）および右（Ｒ）側腹部に同時に接種する。各腫瘍は、２週間後に約５０ｍｍ^３、５週間後に約２００ｍｍ^３であるはずである。実施例３の線量測定計算で、３ＧｙのＲＴ（免疫寛容を阻止するため）に近づけるために６０μＣｉのＴＲＴを第２の腫瘍に送達する必要があると本発明者らが考える場合、本発明者らのｘＲＴ研究は、この用量が腫瘍増殖に最小限の減速効果を有するべきであると予測している。本発明者らは、２週間の時点で（腫瘍が約５０ｍｍ^３であるとき）、異なる群のマウスを３０、６０または９０μＣｉで処置することを計画するであろう。３週間後、腫瘍は約２００ｍｍ^３になっているはずである；その時点で本発明者らは、ｘＲＴ（実施例２に概説した通り決定した用量）を投与し、続いて６日後（ＴＲＴの約２８日後）にＬ側腹部の腫瘍にＩＴ−ＩＣの注射を毎日５回投与して、ｉｎ ｓｉｔｕワクチン効果を誘導する。対照マウスには、遠隔腫瘍からの寛容性のためにｉｎ ｓｉｔｕワクチンがないことを見込んで、ＴＲＴを投与せず、ｘＲＴおよびＩＴ−ＩＣだけをＬ側腹部に投与する。別の群には、ｉｎ ｓｉｔｕワクチン効果による両方の腫瘍の根絶を見込んで、局所ｘＲＴを両方の腫瘍に、そしてＩＴ−ＩＣをＬ側腹部に投与する。別の群には、不完全なワクチン効果を見込んで、ＴＲＴ＋ＩＴ−ＩＣを投与するが局所ｘＲＴは投与しない。

追跡実験は、さまざまな用量のＴＲＴおよびＴＲＴと原発性腫瘍（Ｌ側腹部）への局所ｘＲＴ＋ＩＴ−ＩＣとの間のタイミングの変動をさらに評価する。読み出し情報は、（Ａ）原発性腫瘍の根絶；（Ｂ）続発性腫瘍の根絶；および（Ｃ）ＭＡＨＡ応答のＥＬＩＳＡ分析による全身性免疫抑制、となる。本発明者らの目的は、全身免疫抑制を最小限に抑えながら（ＭＡＨＡ応答によって測定される）、大部分のマウスにおいて両方の腫瘍を根絶させることのできる局所ｘＲＴ＋ＩＴ−ＩＣ投与計画を加えるために、ＴＲＴ用量およびタイミングを特定することである。本発明者らは、両方の腫瘍へのｘＲＴの後の原発性腫瘍へのＩＴ−ＩＣの本発明者らの投与計画と同程度に効果的である、原発性腫瘍への局所ｘＲＴ＋ＩＴ−ＩＣと併用することのできるＴＲＴ投与の条件およびタイミングが見つかることを予測する（図３）。

２よりも多いＢ７８腫瘍を有するマウスにおけるＴＲＴ＋ｘＲＴ＋ＩＴ−ＩＣの有効性の試験。

実施例４のこの項は、関連する臨床状況；つまり、ｉｎ ｓｉｔｕワクチン部位として使用することのでき得る注射可能な腫瘍を有するが、各々が腫瘍誘導性免疫寛容を引き起こすことのあり得る複数の遠隔転移を有する患者に最も類似している。これらの研究は、実施例４（上記）の最初の部分で最も効果的であることが見出された条件を再現することになる。重要な違いは、これらのマウスの各々がＬおよびＲ側腹部とＬおよびＲ肩甲側部に４つの別々の腫瘍を有することである。ＴＲＴは、実施例４の最初の項で概説した研究で最も効果的であると認められた用量およびタイミングで投与され、ｘＲＴ＋ＩＴ−ＩＣがその後Ｌ側腹部病変にのみ投与された。ＴＲＴは、ｘＲＴを投与されていない３つの部位によって引き起こされる腫瘍誘導性免疫寛容を効果的に排除するので、ここでの目的は、効果的なｉｎ ｓｉｔｕワクチンが機能することを可能にするＴＲＴ用量およびタイミングの問題を試験することである。有効性の尺度は、大部分のマウスにおける４つすべての腫瘍の除去であろう。最も効果的な投与計画を生成するために、ＴＲＴの用量およびタイミングの変更を検討する。そのような投与計画は、すべてを外部ビームによって照射することはできないが、「ｉｎ ｓｉｔｕワクチン」部位への局所ｘＲＴ＋ＩＴ−ＩＣと併用した場合にＴＲＴによって照射することができ得る、複数の遠隔転移を有する患者のために、診療所に将来的に解釈されることが考えられ得る。

２以上の部位でＮＸＳ２、９４６４Ｄ−ＧＤ２またはＰａｎｃ０２−ＧＤ２を有するマウスにおけるＴＲＴ＋ｘＲＴおよびＩＴ−ＩＣの研究の開始。

実施例２および３と同様に、実施例４の前の項に概説される研究が進行したら、ＮＸＳ２、９４６４Ｄ−ＧＤ２またはＰａｎｃ０２−ＧＤ２を２以上の部位に有するマウスにおいて同様の研究を本発明者らは開始する。

実施例５：原発性腫瘍に対する最適なｉｎ ｓｉｔｕワクチン効果に必要なｘＲＴの用量、および付随する免疫寛容を防ぐために必要な遠隔腫瘍に対するｘＲＴの最小用量を決定する実験
１または２の腫瘍を有するマウスに対するさまざまなｘＲＴ用量を評価する用量滴定実験が実施された。第１の目的は、１つの腫瘍を有するマウスにおいて、相乗作用、およびＩＴ−ＩＣ、ＩＬ２と結合した腫瘍反応性ｍＡｂを含む「ｉｎ ｓｉｔｕワクチン」を促進するために必要なｘＲＴの用量を試験することであった。初期実験により、１２ＧｙのＲＴ単独は確立されたＢ７８黒色腫腫瘍を根絶することもその増殖を後退させることもなく（完全な退縮は０％）、一方、１２Ｇｙ＋ＩＴ−ＩＣは１つの腫瘍を有するマウスにおいて大部分のＢ７８腫瘍の完全な退縮をもたらす（６６％）という、本発明者らの以前の知見が確認された。一方、２Ｇｙ＋ＩＴ−ＩＣは、ＩＴ−ＩＣ単独と比較して腫瘍の進行を遅らせる（３２日目の平均腫瘍サイズは、それぞれ、４７２ｍｍ^３と１２１４ｍｍ^３）が、どのマウスも無病にならなかった（完全な退縮０％）。

本発明者らの「２腫瘍モデル」では、ｘＲＴ＋ＩＴ−ＩＣによる１つの「原発性」腫瘍の治療が、治療された原発性腫瘍または未治療の「続発性」腫瘍のいずれの治療にも効果がないことが以前に示された。実際に、この２腫瘍モデルにおいて、第２の腫瘍の存在が、ｘＲＴの後のＩＴ−ＩＣ注射の効力を除去することを本発明者らは観察した。本発明者らはこの現象を「付随する免疫寛容」（ＣＩＴ）と命名し、これが少なくとも一部分、遠隔（非照射）続発性腫瘍の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）から生じ、それが全身を循環し、ｘＲＴ処置／ＩＴ−ＩＣ注射された原発性腫瘍に再び集合することを実証した。原発性腫瘍に戻るこれらのＴｒｅｇは、望ましい「ｉｎ ｓｉｔｕワクチン」効果を妨害すると思われる。

本発明者らは、今回、１２ＧｙのｘＲＴを原発性腫瘍と続発性腫瘍の両方に送達することによってＣＩＴが克服され得るという本発明者らの以前の知見を確認した。重要なことに、ＴｒｅｇはＲＴに対する感受性がかなり高いと考えて、ＣＩＴを克服し、原発性腫瘍（１２Ｇｙ＋ＩＴ−ＩＣで処置した原発性腫瘍）でのｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種に対する応答を救済するために、より低用量のＲＴを続発性腫瘍に送達することができると本発明者らは仮定した。本発明者らはここでこれを試験し、続発性腫瘍への２Ｇｙまたは５ＧｙのｘＲＴ用量が、ＣＩＴを鈍らせ、１２Ｇｙ＋ＩＴ−ＩＣによる原発性腫瘍処置に対する応答を救済する能力では１２Ｇｙに匹敵することを観察した。これらの重要な実験は、二回繰り返され、（仮定したように）ＣＩＴを防ぐために遠隔腫瘍に投与されなければならないｘＲＴの用量は、ｉｎ ｓｉｔｕワクチン効果を生じる目的でＩＴ−ＩＣを注射した原発性腫瘍部位で必要な用量よりもはるかに低いことを示唆する。

これは、本開示中の本発明者らの包括的な仮説を裏付け、本発明者らが複数の腫瘍を有する動物において、標的化放射線治療薬（ＴＲＴ）ＮＭ４０４を使用して比較的低用量のＲＴを疾患のすべての部位に送達することが可能となり、それによって、これを局所ｘＲＴおよび１つの腫瘍部位（ｉｎ ｓｉｔｕワクチン部位）のＩＴ−ＩＣ注射と併用すると、ＣＩＴを克服することになることを示唆する。

実施例６：上記で決定されたように、転移に対するｘＲＴの必要な投与量に近い^１３１Ｉ−ＮＭ４０４投与量を決定し、次に、その^１３１Ｉ−ＮＭ４０４用量のインビボ免疫機能への効果を評価する実験
上記の予備データに基づいて、これらのコンセプトをＴＲＴを用いるインビボ試験に移すための研究が行われてきた。線量測定研究は、１または２のＢ７８腫瘍を有するマウス（本発明者らの最良のｉｎ ｓｉｔｕワクチン手法およびＣＩＴのハードルを実証するために本発明者らが使用している腫瘍モデル）で実施した。これは、約２ＧｙのｘＲＴに近づくために必要となる^１３１Ｉ−ＮＭ４０４の量を推定するために行われた。

次に、約２Ｇｙの等価線量の^１３１Ｉ−ＮＭ４０４が腫瘍内リンパ球系細胞（特にＴｒｅｇ）に対して望ましい効果を有するかどうかを決定するために、２つの別々の手法が追求されてきた。最初に、本発明者らは、Ｂ７８腫瘍に匹敵するＮＭ４０４取り込みを示す放射線感受性リンパ腫腫瘍を有するマウスにこの用量の^１３１Ｉ−ＮＭ４０４を投与した。これに続いて、本発明者らは、Ｂ７８腫瘍の実質的な縮小／減速も循環リンパ球系細胞の明白な枯渇（末梢全血球数によって計測される通り）も引き起こさない条件下で、強力なリンパ系腫瘍の縮小／用量依存性の抑制を記述した。これらのデータは、リンパ球系細胞が典型的な固形腫瘍細胞よりも低用量のＲＴに対してはるかに敏感であるという事実と一致しており、腫瘍におけるＴＲＴの選択的取り込みが、全身性リンパ球減少症を伴わない腫瘍内リンパ球系細胞枯渇を可能にすることがあることを示唆する。これらの研究はまた、そのようなリンパ系腫瘍が、腫瘍内リンパ球系細胞へのＴＲＴの効果を同定しモニターするためのインビボの生物学的「線量計」として役立ち得ることを示唆する。

第２の手法は、Ｂ７８腫瘍を有するマウスをこれらの同じ用量の^１３１Ｉ−ＮＭ４０４で処置することを伴った。次に、これらの動物を半減期（８日）の間隔で犠牲にし、放射性崩壊のための十分な遅延の後に、免疫組織化学によってエフェクターＴ細胞およびＴｒｅｇの存在について腫瘍を染色した。興味深いことに、この初期実験で^１３１Ｉ−ＮＭ４０４を投与された動物は、どの時点でも全身性リンパ球減少症を示さず（末梢の全血球数による）、ＴＲＴ投与に続く２半減期で腫瘍内ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇの減少を示した。この２半減期の時点で、本発明者らは腫瘍内エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞の減少も観察した。しかし、重要なことに、その後の３および４半減期の時点で、本発明者らは、どちらも未治療のベースラインおよび第２の半減期レベルと比較して、腫瘍内ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の増加、ただし、腫瘍内Ｔｒｅｇレベルのさらなる低下を観察した。この知見もやはり、複数の腫瘍を有する動物においてｉｎ ｓｉｔｕワクチン効果を救済するために、ＴＲＴを使用してＴｒｅｇに媒介されるＣＩＴを克服することが実現可能であろうという本発明者らの仮説を裏付ける。

最後に、腫瘍内の免疫細胞へのＴＲＴの免疫学的効果を特徴付けるために、本発明者らはＢ７８を有するマウスを^１３１Ｉ−ＮＭ４０４で処置し、前処置およびその後の半減期（８日）の間隔で腫瘍組織を採取した。次に、これらの組織を、免疫シグネチャー（ｉｍｍｕｎｅ ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ）のパネルの遺伝子発現についてＲＴ−ＰＣＲによって分析した。結果は、ＴＲＴ処置が単独で、免疫感受性の腫瘍細胞マーカーの発現と免疫細胞によってのみ通常発現する遺伝子の顕著な変化を引き起こし、後者は発現の減少とそれに続くリバウンドの過剰発現（ｒｅｂｏｕｎｄ ｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）の明白な経時的推移を示すことを示す。

実施例７：実施例５および６から得たデータを使用して、２以上の腫瘍を有するマウスにおける^１３１Ｉ−ＮＭ４０４＋局所ｘＲＴ＋ＩＴ−ｍＡｂ／ＩＬ２の投与計画を開発し、すべての遠隔腫瘍のＴ細胞媒介性根絶を誘導する実験
この実施例は、少なくとも２つの部位に腫瘍を有する動物を治療することを説明する。本発明者らの戦略は、すべての腫瘍部位で抗腫瘍免疫活性を増強させるために、ＣＩＴを抑制するための全身性ＴＲＴと組み合わせた、ｘＲＴおよびｉｎ ｓｉｔｕワクチン部位での局所ＩＴ−ＩＣの使用を含む。ＴＲＴおよびｘＲＴの用量およびタイミングの重大な問題は、抗腫瘍効果のために最適化される。

実施例５および６でまとめたデータを用いて、２つの別個のＢ７８腫瘍を有するマウスで研究を行った。マウスに、推定される必要な全身への^１３１Ｉ−ＮＭ４０４用量を投与し、それに続いてｘＲＴおよびｉｎ ｓｉｔｕワクチン部位への局所免疫療法を投与した。適切な制御によって、^１３１Ｉ−ＮＭ４０４のこの用量は、２つの腫瘍を有するマウスにおいて求められるように、ＣＩＴを弱めると思われた。その上、１つの腫瘍を有するマウスでは、このＴＲＴ用量は、局所ｉｎ ｓｉｔｕワクチン効果を（仮定され、望まれたように）妨害するように見えなかった。ｉｎ ｓｉｔｕワクチン効果を抑制することなくＣＩＴを阻止する望ましい作用を最大化しようとして、さらなる試験、および実験変数の一部の修正が行われている。これらの実験に関するさらなる詳細は、下の実施例８に開示される。

実施例８：２以上の腫瘍を有するマウスから得られるデータ
マウス黒色腫および膵腫瘍モデルにおける遠隔未処置腫瘍による、局所ｘＲＴ＋ＩＴ−ＩＣの組合せに対する原発性腫瘍応答の腫瘍特異的抑制。

同系のＧＤ２＋原発性側腹部腫瘍＋／−対側腹部の続発性腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスを、示されるように原発性腫瘍だけに、「１」日目にｘＲＴによって、そして６〜１０日目に５０ｍｃｇの抗ＧＤ２ ＩＣ、ｈｕ１４．１８−ＩＬ２のＩＴ注射によって処置した。

原発性Ｂ７８黒色腫腫瘍を有するマウスでは、未処置の続発性Ｂ７８腫瘍の存在は、ｘＲＴ＋ＩＴ−ＩＣに対する原発性腫瘍応答に拮抗した（図７Ａ）。本発明者らは、この作用を「付随する免疫寛容」−ｘＲＴ＋ＩＴ−ＩＣに対する処置腫瘍の局所応答への、未処置遠隔腫瘍の拮抗作用−として説明する。カプラン・マイヤー生存曲線を。これらのマウスと反復実験について得た（図７Ｂ）。ほぼすべてのマウスが原発性腫瘍の進行のために安楽死した。

原発性Ｐａｎｃ０２−ＧＤ２＋膵腫瘍を有するマウスでは、反対側腹部の続発性Ｐａｎｃ０２−ＧＤ２−腫瘍の有無にかかわらず、未処置のＰａｎｃ０２続発性腫瘍の存在が、ｘＲＴ＋ＩＴ−ＩＣに対する原発性Ｐａｎｃ０２−ＧＤ２＋腫瘍の応答を抑制した（図７Ｃ）。原発性Ｂ７８黒色腫腫瘍を有するマウスでは、続発性Ｂ７８腫瘍がｘＲＴ＋ＩＴ−ＩＣに対する原発性腫瘍応答を抑制したが、続発性Ｐａｎｃ０２−ＧＤ２＋膵腫瘍はこの作用を発揮しなかった（図７Ｄ）。原発性Ｐａｎｃ０２−ＧＤ２＋腫瘍を有するマウスでは、続発性Ｐａｎｃ０２−ＧＤ２−腫瘍がｘＲＴおよびＩＴ−ｈｕ１４．１８−ＩＬ２の併用に対する原発性腫瘍応答を抑制したが、Ｂ７８続発性腫瘍は抑制しなかった（図７Ｅ）。

付随する免疫寛容は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の特異的枯渇によって回避される。

腫瘍を１または２個有するマウスにおいてｘＲＴ後６日目に調べた腫瘍の、Ｔｒｅｇマーカー、ＦｏｘＰ３についての免疫組織化学画像を得た（図８Ａ）。マウスはｘＲＴを受けなかったか、または原発性腫瘍に対してのみｘＲＴを受けた。ＤＥＲＥＧマウスは、Ｔｒｅｇ特異的ＦｏｘＰ３プロモーターの制御下でジフテリア毒素受容体を発現し、ジフテリア毒素のＩＰ注射と同時にＴｒｅｇの特異的枯渇を可能にする（図８Ｂおよび８Ｃ）。原発性および続発性Ｂ７８黒色腫腫瘍を有するＤＥＲＥＧマウスを、原発性腫瘍へのｘＲＴ＋ＩＴ−ＩＣと、ジフテリア毒素またはＰＢＳのいずれかのＩＰ注射で処置した。付随する免疫寛容は、これらのマウスにおいてＴｒｅｇの枯渇の後に除去され、原発性（図８Ｂ）および続発性（図８Ｃ）腫瘍応答の改善をもたらす。

付随する免疫寛容は、ｘＲＴを両方の腫瘍部位に送達することによって克服される。

原発性および続発性Ｂ７８腫瘍を有するマウスでは、続発性腫瘍は、ｘＲＴ＋ＩＴ−ＩＣによる原発性腫瘍処置に対する原発性腫瘍応答を抑制する。これは、１２ＧｙのｘＲＴを原発性腫瘍と続発性腫瘍の両方に、そしてＩＴ−ＩＣを原発性腫瘍に送達することによって克服され、その結果改善された原発性腫瘍応答（図９Ａ）および反復実験からの総動物生存率（ａｇｇｒｅｇａｔｅ ａｎｉｍａｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ）（図９Ｂ）が改善される。

低用量のｘＲＴは、単独ではｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種を誘発しないが、ｉｎ ｓｉｔｕワクチン部位の１２Ｇｙ＋ＩＴ−ＩＣ処置とともに遠隔腫瘍部位に送達した場合に、付随する免疫寛容を実際に克服する。

原発性Ｂ７８腫瘍のみを有するマウスでは、１２Ｇｙ＋ＩＴ−ＩＣは、ｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種を誘発し（すでに示した通り）、大部分のマウスにおける完全な腫瘍退縮（図１０Ａ）および記憶性免疫応答をもたらす（Ｍｏｒｒｉｓ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０１６）。一方、ＩＴ−ＩＣ単独または低用量（２Ｇｙ）ｘＲＴ＋ＩＴ−ＩＣの後に完全な腫瘍退縮を示す動物はない（両方の群で０／６）ｐ＜０．０５。

原発性および続発性Ｂ７８黒色腫腫瘍を有するマウスでは、続発性腫瘍に送達された低用量ｘＲＴ（２Ｇｙまたは５Ｇｙ）は、原発性腫瘍で付随する免疫寛容を克服するその能力では１２Ｇｙに匹敵する（図１０Ｂ）。これらの同じ動物において、低用量ｘＲＴを続発性腫瘍に送達することによって付随する免疫寛容を克服することが、ＩＴ−ＩＣ免疫療法に対する全身応答を救済することは明らかである（図１０Ｃ）。これに関連して、ＲＴがすべての腫瘍部位に送達されると、原発性腫瘍のＩＴ−ＩＣ注射は、全身性抗腫瘍効果を引き起こし、２Ｇｙまたは５Ｇｙに対する続発性腫瘍応答を、原発性腫瘍のＩＴ−ＩＣ注射を行わない場合の１２ＧｙのＲＴに対する応答よりも大きくする。

低用量ＴＲＴと^１３１Ｉ−ＮＭ４０４は、全身性白血球減少症を伴わないかまたは腫瘍浸潤ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞を枯渇させずに、腫瘍浸潤ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇを効果的に枯渇させる。

大部分の臨床シナリオでは、免疫抑制をもたらすことになる顕著な骨髄枯渇および白血球減少を引き起こすことなく、外照射を低用量でさえもすべての腫瘍部位に送達することは実現不可能である。ここで、本発明者らは、ＴＲＴを全身投与して、全身の免疫細胞の枯渇および白血球減少症を引き起こすことなく、腫瘍浸潤抑制性免疫細胞（Ｔｒｅｇ）を特異的に枯渇させることができるかどうかを試験した。このＢ７８黒色腫腫瘍モデルにおける線量測定研究は、ポジトロン放出^１２４Ｉ−ＮＭ４０４を用いて実施して、ＮＭ４０４の腫瘍選択的取り込みを確認した（図１１Ａ）。Ｂ７８腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスを、６０μＣｉの^１３１Ｉ−ＮＭ４０４で処置した。この活性は、約２ＧｙのＴＲＴをＢ７８腫瘍に送達するのに必要な^１３１Ｉ−ＮＭ４０４の量に近づく。末梢血および腫瘍試料を未処置の対照マウス（Ｃ）およびその後８日間隔（Ｔ１＝ｄ８、Ｔ２＝ｄ１６、Ｔ３＝ｄ２４、Ｔ４＝ｄ３２）で収集した。この用量のＴＲＴは有意な全身性白血球減少症をもたらさず（図１１Ｂ）、腫瘍浸潤ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞のレベルに有意な影響を及ぼさなかった（図１１Ｃ）。しかし、腫瘍浸潤ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇは、この用量のＴＲＴによって有意に枯渇した（図１１Ｄ）。

低用量ＴＲＴと^１３１Ｉ−ＮＭ４０４は、付随する免疫寛容を効果的に克服し、ｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種の全身性抗腫瘍効果を救済する。

低用量^１３１Ｉ−ＮＭ４０４ ＴＲＴが、マウスを白血球減少症にすることなく腫瘍浸潤Ｔｒｅｇを枯渇させる能力を考慮に入れて、本発明者らは低用量^１３１Ｉ−ＮＭ４０４が付随する免疫寛容を効果的に克服するかどうかについて試験した。２つのＢ７８腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスを、示したように１日目に６０μＣｉの^１３１Ｉ−ＮＭ４０４で処置した（ＮＭ４０４）。１半減期（８日）後、動物に１２ＧｙのｘＲＴを原発性腫瘍（ｉｎ ｓｉｔｕワクチン部位）に投与したか、またはｘＲＴを投与しなかった。^１３１Ｉ−ＮＭ４０４を投与しなかった対照マウスに、示されるような（０、２、または１２Ｇｙ）処置を続発性腫瘍に対して行った。１３〜１７日目に、マウスに毎日ＩＣのＩＴ注射を示されるように原発性腫瘍（ｉｎ ｓｉｔｕワクチン部位）に投与した。原発性腫瘍（図１２Ａ）および続発性腫瘍（図１２Ｂ）応答は、低用量ＴＲＴの投与が付随する免疫寛容を効果的に克服し、ｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種の全身性抗腫瘍効果を救済することを実証する。

実施例の結論

これらの実施例は、２つの既知治療方法：（１）放射線療法の標的化全身送達（Ｊ． Ｗｅｉｃｈｅｒｔおよび同僚ら）、および（２）ｉｎ ｓｉｔｕ癌ワクチンを誘導するための複合免疫療法の局所送達（Ｐ． Ｓｏｎｄｅｌおよび同僚ら）、の相乗的かつ広く応用可能な組合せに基づく、新規な、これまでに試験または検討されていない抗癌戦略を説明する。^１３１Ｉ−ＮＭ４０４は事実上どんな組織の癌も標的にすることができ、抗腫瘍ｍＡｂ＋ＩＬ２の局所投与は事実上どんな癌種にも使用され得る可能性があるので（腫瘍反応性ｍＡｂは承認されている、または臨床試験でほぼすべての癌組織種に対応するので）、この複合戦略を臨床に翻訳すると、事実上すべてのハイリスク癌に臨床上有効な治療をもたらす可能性がある。

実施例で引用された参考文献：
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［２］Ｎｅａｌ ＺＣ，Ｙａｎｇ ＪＣ，Ｒａｋｈｍｉｌｅｖｉｃｈ ＡＬ，Ｂｕｈｔｏｉａｒｏｖ Ｉ，Ｌｕｍ ＨＥ，Ｉｍｂｏｄｅｎ Ｍ，Ｈａｎｋ ＪＡ，Ｌｏｄｅ ＨＮ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ＲＡ，Ｇｉｌｌｉｅｓ ＳＤ，Ｓｏｎｄｅｌ ＰＭ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｈｕ１４．１８‐ＩＬ２ ＩＣ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｍｕｒｉｎｅ ＮＸＳ２ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ｗｈｅｎ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ＩＬ２ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００４ Ｊｕｌ １５；１０（１４）：４８３９−４７．
［３］Ｙｕ ＡＬ，Ｇｉｌｍａｎ ＡＬ，Ｏｚｋａｙｎａｋ ＭＦ，Ｌｏｎｄｏｎ ＷＢ，Ｋｒｅｉｓｓｍａｎ Ｓ，Ｃｈｅｎ Ｈ，Ｓｍｉｔｈ Ｍ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｂ，Ｖｉｌｌａｂｌａｎｃａ Ｊ，Ｍａｔｔｈａｙ ＫＫ，Ｓｈｉｍａｄａ Ｈ，Ｇｒｕｐｐ ＳＡ，Ｓｅｅｇｅｒ Ｒ，Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ＣＰ，Ｂｕｘｔｏｎ Ａ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ＲＡ，Ｇｉｌｌｉｅｓ ＳＤ，Ｃｏｈｎ ＳＬ，Ｍａｒｉｓ ＪＭ，Ｓｏｎｄｅｌ ＰＭ．Ａｎｔｉ‐ＧＤ２ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗｉｔｈ ＧＭ‐ＣＳＦ，ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ‐２，ａｎｄ ｉｓｏｔｒｅｔｉｎｏｉｎ ｆｏｒ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ．Ｍｅｄ．２０１０ Ｓｅｐ ３０；３６３（１４）：１３２４−３４．
［４］Ｊｏｈｎｓｏｎ ＥＥ，Ｙａｍａｎｅ ＢＨ，Ｌｕｍ ＨＤ，Ｂｕｈｔｏｉａｒｏｖ ＩＮ，Ｒａｋｈｍｉｌｅｖｉｃｈ ＡＬ，Ｍａｈｖｉ ＤＭ，Ｇｉｌｌｉｅｓ ＳＤ，Ｓｏｎｄｅｌ，ＰＭ．Ｒａｄｉｏｆｒｅｑｕｅｎｃｙ Ａｂｌａｔｉｏｎ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ＫＳ−ＩＬ２ ＩＣ （ＥＭＤ ２７３０６６） Ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ａｎ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ Ｅｆｆｅｃｔ Ａｇａｉｎｓｔ Ｍｕｒｉｎｅ Ｃｏｌｏｎ Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００９ Ａｕｇ １；１５（１５）：４８７５−８４．
［５］Ｙａｎｇ ＲＫ，Ｋａｌｏｇｒｉｏｐｏｕｌｏｓ ＮＡ，Ｒａｋｈｍｉｌｅｖｉｃｈ ＡＬ，Ｒａｎｈｅｉｍ ＥＡ，Ｓｅｏ Ｓ，Ｋｉｍ ＫＭ，Ａｌｄｅｒｓｏｎ ＫＬ，Ｇａｎ Ｊ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ＲＡ，Ｇｉｌｌｉｅｓ ＳＤ，Ｈａｎｋ ＪＡ，Ｓｏｎｄｅｌ ＰＭ．Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ ｈｕ１４．１８‐ＩＬ２（ＩＣ）Ｉｎｄｕｃｅｓ Ｌｏｃａｌ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｔｈａｔ Ｉｎｖｏｌｖｅ Ｂｏｔｈ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ− ａｎｄ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ Ｅｎｈａｎｃｅｄ ＩＣ Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２ Ｓｅｐ １；１８９（５）：２６５６−６４．
［６］Ｍｏｒｒｉｓ ＺＳ，Ｅｍｉｌｙ Ｉ．Ｇｕｙ ＥＩ，Ｆｒａｎｃｉｓ ＤＭ，Ｇｒｅｓｓｅｔｔ ＭＭ，Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ ＬＬ，Ｙａｎｇ ＲＫ，Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ ＥＡ，Ｈｕａｎｇ Ｓ，Ｎａｖｉｄ Ｆ，Ｇｉｌｌｉｅｓ ＳＤ，Ｋｏｒｍａｎ Ａ，Ｈａｎｋ ＪＡ，Ｒａｋｈｍｉｌｅｖｉｃｈ ＡＬ，Ｈａｒａｒｉ ＰＭ，Ｓｏｎｄｅｌ ＰＭ． Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ Ｌｏｃａｌ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｒ ＩＣ ｔｏ ｅｌｉｃｉｔ ｉｎ ｓｉｔｕ ｔｕｍｏｒ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｅ−ｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ，２０１６．
［７］Ｍｏｒｒｉｓ ＺＳ，Ｇ．Ｅ．，Ｆｒａｎｃｉｓ ＤＭ，Ｇｒｅｓｓｅｔｔ ＭＭ，Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ ＥＡ，Ｈｕａｎ Ｓ，Ｇｉｌｌｉｅｓ ＳＤ，Ｋｏｒｍａｎ ＡＪ，Ｈａｎｋ ＪＡ，Ｒａｋｈｍｉｌｅｖｉｃｈ ＡＬ，Ｈａｒａｒｉ ＰＭ，ａｎｄ Ｓｏｎｄｅｌ ＰＭ．，ＩＣ ａｕｇｍｅｎｔｓ ｌｏｃａｌ ａｎｄ ａｂｓｃｏｐａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ＣＴＬＡ−４ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｍｕｒｉｎｅ ｍｅｌａｎｏｍａ ｍｏｄｅｌ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２０１５年１０月抄録採択（基礎−翻訳科学カテゴリーで会議の受賞抄録に選ばれた）。
［８］Ｗｅｉｃｈｅｒｔ ＪＰ，Ｃｌａｒｋ ＰＡ，Ｋａｎｄｅｌａ ＩＫ，Ｖａｃｃａｒｏ ＡＭ，Ｃｌａｒｋｅ Ｗ，Ｌｏｎｇｉｎｏ ＭＡ，Ｐｉｎｃｈｕｋ ＡＮ，Ｆａｒｈｏｕｄ Ｍ，Ｓｗａｎｓｏｎ ＫＩ，Ｆｌｏｂｅｒｇ ＪＭ，Ｇｒｕｄｚｉｎｓｋｉ Ｊ，Ｔｉｔｚ Ｂ，Ｔｒａｙｎｏｒ ＡＭ，Ｃｈｅｎ ＨＥ，Ｈａｌｌ ＬＴ，Ｐａｚｏｌｅｓ ＣＪ，Ｐｉｃｋｈａｒｄｔ ＰＪ，Ｋｕｏ ＪＳ． Ａｌｋｙｌｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ Ａｎａｌｏｇｓ ｆｏｒ Ｂｒｏａｄ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６，２４０ｒａ７５，１‐１０．２０１４．
［９］Ｍｏｒｒｉｓ ＺＳ，ＪＰ Ｗｅｉｃｈｅｒｔ，Ｊ Ｓａｋｅｒａ，ＥＡ Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ａ Ｂｅｓｅｍｅｒ，Ｂ Ｂｅｄｎａｒｚ，Ｒ Ｋｉｍｐｌｅ，ＰＭ Ｈａｒａｒｉ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ ＮＭ４０４ ｗｉｔｈ ｅｘｔｅｒｎａｌ ｂｅａｍ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ ｍｏｄｅｌ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，ＤＯＩ：１０．１０１６．２０１５．
［１０］Ｌｏｄｅ ＨＮ，Ｘｉａｎｇ Ｒ，Ｄｒｅｉｅｒ Ｔ，Ｖａｒｋｉ ＮＭ，Ｇｉｌｌｉｅｓ ＳＤ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ＲＡ． Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ ｔｏ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ‐２ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｂｌｏｏｄ ９１（５），１７０６‐１７１５． １９９８．
［１１］Ｓｎｙｄｅｒ Ｆ，Ｗｏｏｄ Ｒ．Ａｌｋｙｌ ａｎｄ ａｌｋ‐１‐ｅｎｙｌ ｅｔｈｅｒｓ ｏｆ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｉｎ ｌｉｐｉｄｓ ｆｒｏｍ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｈｕｍａｎ ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２９，２５１‐２５７．１９６９．
［１２］Ｐｉｎｃｈｕｋ ＡＮ，Ｒａｍｐｙ ＭＡ，Ｌｏｎｇｉｎｏ ＭＡ，Ｓｋｉｎｎｅｒ ＲＷ，Ｇｒｏｓｓ ＭＤ，Ｗｅｉｃｈｅｒｔ ＪＰ，Ｃｏｕｎｓｅｌｌ ＲＥ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ‐ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｔｈ ｔｕｍｏｒ ａｖｉｄｉｔｙ ｏｆ ｒａｄｉｏｉｏｄｉｎａｔｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ｅｔｈｅｒ ａｎａｌｏｇｕｅｓ．Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ４９，２１５５‐ ２１６５．２００６．
［１３］Ｓｗａｎｓｏｎ ＫＩ，Ｃｌａｒｋ ＰＡ，Ｐｉｎｃｈｕｋ ＡＮ，Ｌｏｎｇｉｎｏ ＭＡ，Ｆａｒｈｏｕｄ Ｍ，Ｗｅｉｃｈｅｒｔ ＪＰ，Ｋｕｏ ＪＳ．Ｉｎｉｔｉａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ Ｎｏｖｅｌ Ｃａｎｃｅｒ‐Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ａｌｋｙｌｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ Ａｎａｌｏｇｓ ＣＬＲ１５０１ ａｎｄ ＣＬＲ１５０２ ｆｏｒ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ‐ｇｕｉｄｅｄ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ．７６（２）：１１５‐１２３．２０１５．
［１４］Ｆｉｌａｔｅｎｋｏｖ Ａ，Ｂａｋｅｒ Ｊ，Ｍｕｅｌｌｅｒ ＡＭ，Ｋｅｎｋｅｌ Ｊ，Ａｈｎ ＧＯ，Ｄｕｔｔ Ｓ，Ｚｈａｎｇ Ｎ，Ｋｏｈｒｔ Ｈ，Ｊｅｎｓｅｎ Ｋ，Ｄｅｊｂａｋｈｓｈ‐Ｊｏｎｅｓ Ｓ，Ｓｈｉｚｕｒｕ ＪＡ，Ｎｅｇｒｉｎ ＲＮ，Ｅｎｇｌｅｍａｎ ＥＧ，Ｓｔｒｏｂｅｒ Ｓ． Ａｂｌａｔｉｖｅ Ｔｕｍｏｒ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｃａｎ Ｃｈａｎｇｅ ｔｈｅ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｔｏ Ｉｎｄｕｃｅ Ｄｕｒａｂｌｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｒｅｍｉｓｓｉｏｎｓ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２１：３７２７‐３９．２０１５．
［１５］Ｊｉｎｇ Ｗ，Ｇｅｒｓｈａｎ ＪＡ，Ｗｅｂｅｒ Ｊ，Ｔｌｏｍａｋ Ｄ，ＭｃＯｌａｓｈ Ｌ，Ｓａｂａｔｏｓ‐Ｐｅｙｔｏｎ Ｃ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ＢＤ． Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｌｏｃｋａｄｅ ａｎｄ ｌｏｗ ｄｏｓｅ ｗｈｏｌｅ ｂｏｄｙ ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ ａｓ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｍｙｅｌｏｍａ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｃａｎｃｅｒ．３：２．２０１５．
［１６］Ｂｅｄｎａｒｚ Ｂ．，Ｂｅｓｅｍｅｒ Ａ．，Ｙａｎｇ Ｙ．Ａ Ｍｏｎｔｅ Ｃａｒｌｏ‐Ｂａｓｅｄ Ｓｍａｌｌ Ａｎｉｍａｌ Ｄｏｓｉｍｅｔｒｙ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ Ｐｒｅ‐Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ：Ｐｒｏｏｆ ｏｆ Ｃｏｎｃｅｐｔ．Ｍｅｄ．Ｐｈｙｓ．３９，３８９９．２０１２．
［１７］Ｂｅｓｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｔｏｗａｒｄｓ Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ Ｄｏｓｉｍｅｔｒｙ Ｕｓｉｎｇ Ｄｉａｐｅｕｔｉｃ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．Ｍｅｄ．Ｐｈｙｓ．４０，３８２． ２０１３．
［１８］Ｂｅｓｅｍｅｒ Ａ． ａｎｄ Ｂｅｄｎａｒｚ Ｂ．Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐａｔｉｅｎｔ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｏｎｔｅ Ｃａｒｌｏ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｄｏｓｉｍｅｔｒｙ ｐｌａｔｆｏｒｍ．Ｍｅｄ．Ｐｈｙｓ．４１，３０３．２０１４．
［１９］Ｉｍｂｏｄｅｎ Ｍ，Ｍｕｒｐｈｙ ＫＲ，Ｒａｋｈｍｉｌｅｖｉｃｈ ＡＬ，Ｎｅａｌ ＺＣ，Ｘｉａｎｇ Ｒ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ＲＡ，Ｇｉｌｌｉｅｓ ＳＤ ａｎｄ Ｓｏｎｄｅｌ ＰＭ．Ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＭＨＣ Ｃｌａｓｓ Ｉ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｎ ｍｕｒｉｎｅ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃａｎ ｃｈａｎｇｅ ｔｈｅ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｋｉｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１：１５００‐７．２００１．

本発明のその他の実施形態および使用は、本明細書に開示される本発明の明細書および実践を考慮すれば当業者に明白である。すべての学術誌の引用および米国／海外の特許および特許出願を含む、何らかの事情により本明細書に引用されるすべての参考文献は、参照により具体的にかつ完全に本明細書に組み込まれる。本発明は、本明細書に例示され説明される特定の試薬、製剤、反応条件等に限定されないが、そのようなそれらの変更形態を以下の特許請求の範囲内に入るとして包含することは理解される。

Claims (39)

1. 対象において１以上の悪性固形腫瘍を含む癌を治療する方法であって、
   （ａ）悪性固形腫瘍組織によって差次的に（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ）取り込まれ保持される、免疫調節用量の放射性ハロゲン化化合物を前記対象に投与するステップ；および
   （ｂ）腫瘍微小環境内の特定の免疫細胞を刺激することができる１以上の治療を用いて前記対象の前記１以上の悪性固形腫瘍にｉｎ ｓｉｔｕ腫瘍ワクチン接種を実施するステップ；
   を含み、
   それによって前記対象において前記癌を治療する、方法。
2. 前記腫瘍微小環境内の特定の免疫細胞を刺激することができる前記１以上の治療が、前記腫瘍をｘＲＴで治療することを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記腫瘍微小環境内の特定の免疫細胞を刺激することができる前記１以上の治療が、前記腫瘍微小環境内の特定の免疫細胞を刺激することができる１以上の薬剤を含む組成物を、前記悪性固形腫瘍の少なくとも１つに腫瘍内注射することを含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記腫瘍微小環境内の特定の免疫細胞を刺激することができる前記１以上の薬剤が、免疫刺激性ｍＡｂ、パターン認識受容体アゴニスト、免疫刺激性サイトカイン、免役刺激性ナノ粒子、腫瘍溶解性ウイルス、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
5. 前記免疫刺激性ｍＡｂが、抗ＧＤ２抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＣＤ１３４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＫＩＲ抗体、抗ＬＡＧ−３抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＤ４０抗体、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
6. 前記免疫刺激性ｍＡｂが、腫瘍特異的抗原に対する抗体である、請求項４または請求項５に記載の方法。
7. 前記免疫刺激性ｍＡｂが、抗ＧＤ２抗体である、請求項５または請求項６に記載の方法。
8. 前記腫瘍微小環境内の特定の免疫細胞を刺激することができる１以上の薬剤を含む前記組成物が、インターロイキン−２（ＩＬ−２）をさらに含む、請求項７に記載の方法。
9. 前記抗ＧＤ２抗体が、ｈｕ１４．１８を含む、請求項５または請求項６に記載の方法。
10. 前記組成物が、ＩＬ−２をさらに含む、請求項７に記載の方法。
11. 前記免疫刺激性サイトカインが、ＩＬ−２、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、またはインターフェロンである、請求項４に記載の方法。
12. 前記免疫刺激性サイトカインがＩＬ−２である、請求項１１に記載の方法。
13. 前記パターン認識受容体アゴニストが、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）のアゴニストである、請求項４に記載の方法。
14. 前記ＴＬＲが、ＴＬＲ−１、ＴＬＲ−２、ＴＬＲ−３、ＴＬＲ−４、ＴＬＲ−５、ＴＬＲ−６、ＴＬＲ−７、ＴＬＲ−８、ＴＬＲ−９、およびＴＬＲ−１０からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
15. 前記放射性ハロゲン化化合物が、メタヨードベンジルグアニジン（ＭＩＢＧ）であり、前記ＭＩＢＧ中の前記ヨウ素原子が放射性ヨウ素同位体である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記放射性ヨウ素同位体が、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ、および^１３１Ｉからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
17. 前記放射性ハロゲン化化合物が、式：
    またはその塩を有し、上式で：
    Ｒ_１は、放射性ハロゲン同位体を含み；
    ａは、０または１であり；
    ｎは、１２〜３０の整数であり；
    ｍは、０または１であり；
    Ｙは、−Ｈ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＸ、−ＯＸ、および−ＯＣＯＸからなる群から選択され、Ｘは、アルキルまたはアリールアルキルであり；
    Ｒ_２は、−Ｎ^＋Ｈ_３、−Ｎ^＋Ｈ_２Ｚ、−Ｎ^＋ＨＺ_２、および−Ｎ^＋Ｚ_３からなる群から選択され、各Ｚは、独立にアルキルまたはアリールである、
    請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記放射性ハロゲン同位体が、臭素、ヨウ素またはアスタチンの放射性同位体である、請求項１７に記載の方法。
19. 前記放射性ハロゲン同位体が、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、および^２１１Ａｓからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
20. 前記放射性ハロゲン同位体が、放射性ヨウ素同位体である、請求項１８に記載の方法。
21. 前記放射性ヨウ素同位体が、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ、または^１３１Ｉである、請求項２０に記載の方法。
22. 前記放射性ヨウ素同位体が^１３１Ｉである、請求項２１に記載の方法。
23. ａが１であり、ｍが０である、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の方法。
24. ｎが１８である、請求項１７〜２３のいずれか一項に記載の方法。
25. Ｒ_２が−Ｎ^＋Ｈ_３である、請求項１７〜２４のいずれか一項に記載の方法。
26. ａが１であり、ｍが０であり、ｎが１８であり、Ｒ_２が−Ｎ^＋Ｈ_３である、請求項１７〜２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記放射性ハロゲン同位体が、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ、または^１３１Ｉである（前記化合物が［^１２３Ｉ］−ＮＭ４０４、［^１２４Ｉ］−ＮＭ４０４、［^１２５Ｉ］−ＮＭ４０４または［^１３１Ｉ］−ＮＭ４０４である）、請求項２６に記載の方法。
28. 前記放射性ハロゲン同位体が、^１３１Ｉである（前記化合物が［^１３１Ｉ］−ＮＭ４０４である）、請求項２３に記載の方法。
29. 前記放射性ハロゲン化化合物が静脈内投与される、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
30. 前記対象がヒトである、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
31. 前記悪性固形腫瘍の１つをｘＲＴに曝露することをさらに含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
32. 前記放射性ハロゲン化化合物の免疫刺激用量を決定するステップをさらに含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
33. 前記放射性ハロゲン化化合物の前記免疫調節用量を決定する前記ステップが、前記対象に検出促進用量の請求項１５または請求項１７に記載の前記放射性ハロゲン化化合物を投与し、続いて前記放射性ハロゲン化化合物内の前記放射性ハロゲン同位体に特徴的な、前記対象内の前記１以上の悪性固形腫瘍から発するシグナルを検出することを含む、請求項３２に記載の方法。
34. 前記放射性ハロゲン化化合物の前記免疫調節用量が、前記対象内の前記１以上の悪性固形腫瘍から発する前記シグナルの強度から計算される、請求項３３に記載の方法。
35. 前記放射性ヨウ素ハロゲンに特徴的なシグナルを検出する前記ステップが、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）画像法、または単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）画像法によって実施される、請求項３３または請求項３４に記載の方法。
36. 前記検出促進用量で使用される放射性ヨウ素化化合物に含まれる前記放射性ハロゲン同位体が、^２１１Ａｓ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ、および^１３１Ｉからなる群から選択される、請求項３３〜３４のいずれか一項に記載の方法。
37. 前記検出促進用量で使用される前記放射性ヨウ素化化合物に含まれる前記放射性ハロゲン同位体が、^１２４Ｉである、請求項３６に記載の方法。
38. 前記検出促進用量で使用される前記放射性ハロゲン化化合物が［^１２４Ｉ］−ＮＭ４０４である、請求項３７に記載の方法。
39. 治療される前記癌が、黒色腫、神経芽腫、肺癌、副腎癌、結腸癌、結腸直腸癌、卵巣癌、前立腺癌、肝癌、皮下癌、皮膚または頭頸部の扁平上皮癌、腸癌、網膜芽細胞腫、子宮頸癌、神経膠腫、乳癌、膵臓癌、軟部組織肉腫、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、および小児脳腫瘍からなる群から選択される、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法。