CN109689100A

CN109689100A - 用于原位免疫调节的癌症疫苗接种的放射性卤化剂

Info

Publication number: CN109689100A
Application number: CN201780054398.9A
Authority: CN
Inventors: J·魏歇特; P·M·松德尔; A·平丘克; Z·莫里斯; M·奥托; B·贝德纳兹
Original assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Current assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Priority date: 2016-07-18
Filing date: 2017-07-18
Publication date: 2019-04-26
Also published as: WO2018017526A1; CA3031076C; AU2017300361A1; JP7490361B2; EP3484513A1; IL264267B; KR102396334B1; KR20190035754A; US20180015154A1; IL264267A; EP3484513B1; CA3031076A1; JP2019528253A; US20200330567A1; US10736949B2

Abstract

本文公开了治疗对象的恶性实体瘤的方法。该方法包括以下步骤：给予对象免疫调节剂量的放射性卤化化合物，所述放射性卤化化合物被恶性实体瘤组织特异地吸收并保留在恶性实体瘤组织中，以及通过肿瘤内注射(或通过单独方法治疗)将包含一种或多种能够刺激肿瘤微环境内特异性免疫细胞的试剂的组合物注射到至少一种恶性实体瘤中，在对象中进行原位肿瘤疫苗接种。在某些示例性实施方式中，放射性卤化化合物具有下式：其中R₁是放射性卤素同位素，n是18，R₂是‑N⁺(CH₃)₃。

Description

用于原位免疫调节的癌症疫苗接种的放射性卤化剂

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年7月18日提交的美国临时申请第62/363,608号的权益，该临时申请通过引用整体并入本文。

关于联邦资助研究或开发的声明

本发明是在国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的CA197078下于政府资助下完成。政府对本发明拥有一定的权利。

技术领域

本发明一般涉及治疗癌症的方法。具体说，本发明涉及治疗对象中包括一个或多个恶性实体瘤的癌症的方法，该方法包括(a)全身给予所述对象免疫调节剂量的放射性碘化化合物，其被特异地吸收并保留在实体瘤组织内，和(b)使用一种或多种能够刺激肿瘤微环境中的特异性免疫细胞的处理在一种恶性实体瘤中对对象进行原位肿瘤疫苗接种。

背景

目前的癌症治疗通常涉及全身化学疗法，其中非靶向小分子或抗体将细胞毒试剂优先介导进入或结合(在抗体介导试剂的情况下)并通过多种机制杀死癌细胞。外照射放射疗法(xRT)通常与化学疗法结合，通过诱导导致细胞周期死亡的核DNA双链断裂来杀死癌细胞。与全身化疗不同，xRT取决于准确确定肿瘤解剖位置的能力。肿瘤的手术切除还取决于观察肿瘤和完全切除的能力，因为残留的肿瘤细胞将在手术后快速重建肿瘤。手术和xRT通常局限于恶性肿瘤的局部治疗，因此在治疗播散性或转移性疾病方面受到限制，这就是为什么化疗通常与这些治疗方式结合使用的原因。虽然全身化疗能够到达许多远处转移部位(可能除脑转移外)，但是对于所有如此多的患者，响应通常是短暂的(数月至数年)并最终导致肿瘤复发。

因为身体的天然免疫系统也能够在识别后破坏癌细胞，所以免疫方法在癌症治疗范例中正变得越来越普遍。然而，一些癌细胞，并且在更大程度上癌症干细胞，设法最初避免免疫监视并且实际上通过保持相对免疫的隐形而获得进化和最终存活的能力[Gaipi等，Immunotherapy 6:597-610,2014]。

正在越来越多地研究的一种特异性免疫学方法是“原位疫苗接种”，该策略寻求增强肿瘤免疫原性，产生肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)并驱动针对“未接种的”播散性肿瘤的全身性抗肿瘤免疫应答。在原位疫苗接种中，用一种或多种促进肿瘤抗原释放的试剂注射(或治疗)恶性实体瘤，同时提供促炎信号以逆转肿瘤的免疫耐受微环境[Pierce等，HumanVaccines&Immunotherapoeutics 11(8):1901-1909,2015；Marabelle等，Clin.CancerRes.20(7):1747-56,2014；Morris等，Cancer Research,印刷之前的电子出版,2016]。尽管来自临床试验和临床前模型的最新数据说明了这种方法的潜力，但本领域迫切需要具有改善的全身功效的原位疫苗接种方法。

放射兴奋效应是一个有数十年历史的假设，即低剂量的电离RT可以通过刺激天然保护性修复机制的激活而有益，这种机制在没有电离RT的情况下不被激活[Cameron andMoulder,Med.Phys.25:1407,1998]。当受到刺激时，假设备用修复机制足够有效，不仅可以消除电离RT的有害影响，还可以抑制与RT暴露无关的疾病。也许相关，伴随远隔效应是20世纪50年代报道的一种现象，其中，一个肿瘤的xRT治疗实际上导致RT治疗区域外另一个肿瘤的收缩。虽然罕见，但这种现象被认为取决于免疫系统的激活。兴奋效应和伴随远隔效应一起通过低剂量(免疫刺激但非细胞毒性)RT支持免疫系统的潜在相互作用和刺激，然后可以将其与其他免疫方法(例如原位疫苗接种)组合。

我们之前已经发表过，当存在单个肿瘤时，局部xRT+原位疫苗接种的组合在治疗小鼠中的大规模肿瘤方面具有有效的协同作用[Morris等，Cancer Research，印刷之前的电子出版，2016]。我们惊奇地发现(并在此公开)原位疫苗接种和xRT的组合在第二种非照射肿瘤存在下不会导致抑制的肿瘤生长。显然，非照射肿瘤对xRT和原位疫苗对照射肿瘤的免疫调节作用表现出抑制作用(我们称之为“伴随的免疫耐受”)。当xRT给予肿瘤的所有区域时，可以克服这种伴随的免疫耐受，从而实现原位疫苗接种的功效。然而，在存在多个肿瘤的情况下，xRT不能有效地与原位疫苗接种方法结合使用，特别是如果肿瘤数量不是很少，或者一个或多个肿瘤的位置未被准确知道，或者如果不能将xRT递送到肿瘤的所有部位。因此，需要与原位疫苗接种相结合的向对象内的所有肿瘤递送免疫调节剂量的RT的改进方法，无论肿瘤的数量和解剖位置如何。

发明内容

我们先前已经表明某些烷基磷酸胆碱类似物优先被恶性实体瘤细胞吸收和保留。在美国专利公开2014/0030187中(其全部内容通过引用并入本文)，Weichert等人公开了使用碱性化合物18-(对-碘苯基)十八烷基磷酸胆碱(NM404；见图1)的类似物来检测和定位以及治疗各种恶性实体瘤。如果碘部分是成像优化的放射性核素，如碘-124([¹²⁴I]-NM404)，该类似物可用于正电子发射断层扫描-计算机断层扫描(PET/CT)或单光子发射计算机断层扫描(SPECT)实体瘤的成像。或者，如果碘部分是优化用于将治疗剂量的RT递送至吸收类似物的实体瘤细胞的放射性核素，如碘-125或碘-131([¹²⁵I]-NM404或[¹³¹I]-NM404)，该类似物可用于治疗实体瘤。

这种类似物不仅在体内靶向多种实体瘤类型，而且在肿瘤细胞中经历延长的选择性保留，因此提供作为放射治疗剂的高潜力。此外，肿瘤摄取仅限于恶性癌症，而不是癌前病变或良性病变。因此，这些试剂非常适合于向对象体内存在的所有恶性肿瘤递送亚细胞毒性但免疫调节剂量的电离RT，无论肿瘤的数量和位置是否已知。

因此，在第一方面，本发明涵盖治疗对象中的包括一个或多个恶性实体瘤的癌症的方法。该方法包括以下步骤：(a)给予对象免疫调节剂量的放射性卤化化合物，其被恶性实体瘤组织特异地吸收并保留在恶性实体瘤组织中；(b)使用一种或多种能够刺激肿瘤微环境内特异性免疫细胞的处理，在一个或多个恶性实体瘤中对对象进行原位肿瘤疫苗接种。“免疫调节剂量”是靶向放射治疗剂的低或亚细胞毒性RT剂量。尽管以下实施例中使用NM404，但靶向放射治疗剂可以是任何靶向放射性卤化治疗剂，其包括α、β、螺旋和/或γ发射体，包括但不限于放射性碘化间位碘代苄基胍(MIBG)。关键特征是靶向放射治疗剂发出的低剂量或亚细胞毒性RT剂量，其对癌细胞或相关免疫细胞都不致命。

在一些实施方式中，一种或多种能够刺激特异性免疫细胞的处理可包括xRT。在一些实施方式中，一种或多种能够刺激特异性免疫细胞的处理包括在至少一种恶性实体瘤中注射包含一种或多种能够刺激肿瘤微环境内的特异性免疫细胞的试剂的组合物。在一些实施方式中，一种或多种能够刺激特异性免疫细胞的试剂可包括免疫刺激性单克隆抗体(mAb)，模式识别受体激动剂，免疫刺激性细胞因子，免疫刺激性纳米颗粒，溶瘤病毒或其任何组合。可以使用的免疫刺激性单克隆抗体的非限制性实例包括：抗GD2抗体，抗CTLA-4抗体，抗CD137抗体，抗CD134抗体，抗PD-1抗体，抗KIR抗体，抗LAG-3抗体，抗PD-L1抗体，抗CD40抗体或其组合。在一些实施方式中，免疫刺激性mAb是针对肿瘤特异性抗原的抗体。在一些实施方式中，包含一种或多种免疫刺激性单克隆抗体的组合物还可包括白细胞介素-2(IL-2)。在一些实施方式中，使用的抗GD2mAb可以包括hu14.18，并且任选地，可以进一步包括IL-2(即，两者的融合蛋白)。

在一些实施方式中，免疫刺激性细胞因子是IL-2，白细胞介素-12(IL-12)，白细胞介素-15(IL-15)，白细胞介素-21(IL-21)或干扰素(IFN)。

在一些实施方式中，模式识别受体激动剂是Toll样受体(TLR)的激动剂。这种TLR的非限制性实例包括TLR-1，TLR-2，TLR-3，TLR-4，TLR-5，TLR-6，TLR-7，TLR-8，TLR-9或TLR-10。

在一些实施方式中，放射性卤化化合物是间位碘代苄基胍(MIBG)，其中碘原子是放射性碘同位素。在一些实施方式中，放射性碘同位素是¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I或¹³¹I。

在一些实施方式中，放射性卤化化合物具有下式：

或其盐。R₁是或包括放射性卤素同位素，a是0或1，n是12至30的整数，m是0或1，Y是–H、–OH、-COOH、-COOX、–OX或–OCOX，其中X是烷基或芳基烷基，R₂是-N⁺H₃、-N⁺H₂Z、-N⁺HZ₂或-N⁺Z₃，其中每个Z独立地是烷基或芳基。

在一些实施方式中，放射性卤素同位素是碘、溴或砹的放射性同位素。在一些这样的实施方式中，放射性卤素同位素是²¹¹I、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I或¹³¹I。在一些这样的实施方式中，放射性卤素同位素是¹²⁵I或¹³¹I。在一些这样的实施方式中，放射性卤素同位素是¹³¹I。

在一些实施方式中，a为1且m为0。在一些实施方式中，n为18。在一些实施方式中，R₂为-N⁺H₃。

在一些实施方式中，a为1，m为0，n为18，R₂为-N⁺H₃。在一些这样的实施方式中，放射性卤素同位素是²¹¹As、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、或¹³¹I(化合物是[²¹¹As]-NM404、[¹²³I]-NM404、[¹²⁴I]-NM404、[¹²⁵I]-NM404或[¹³¹I]-NM404)。

在一些实施方式中，放射性卤代化合物静脉内给予。

在一些实施方式中，该对象是人。

在一些实施方式中，该方法任选地包括将一种恶性实体瘤暴露于xRT的步骤。

在一些实施方式中，该方法任选地包括确定放射性卤化化合物的免疫调节剂量的步骤。在一些这样的实施方式中，该步骤包括给予对象检测促进剂量的放射性卤化化合物，并随后检测源自对象体内的一个或多个恶性实体瘤的信号，所述信号表征放射性卤化合物内的放射性卤素同位素。在一些这样的实施方式中，用于检测促进剂量的放射性卤化化合物中包含的放射性卤素同位素是²¹¹As、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I或¹³¹I。可以使用的非限制性示例性放射性卤化化合物是[¹²⁴I]-NM404。在一些这样的实施方式中，放射性卤化化合物的免疫调节剂量由源自对象体内的一个或多个恶性实体瘤的信号的强度计算。任选地，检测表征放射性卤素同位素的信号的步骤通过正电子发射断层扫描(PET)成像或单光子发射计算机断层扫描(SPECT)成像来执行。

可以使用所公开的方法治疗的呈现为恶性实体瘤的癌症的非限制性实例包括：黑色素瘤，神经母细胞瘤，肺癌，肾上腺癌，结肠癌，结肠直肠癌，卵巢癌，前列腺癌，肝癌，皮下癌，皮肤或头颈部的鳞状细胞，肠癌，宫颈癌，胶质瘤，乳腺癌，胰腺癌，软组织肉瘤，尤因肉瘤，横纹肌肉瘤，骨肉瘤，视网膜母细胞瘤，肾母细胞瘤和小儿脑肿瘤。

根据以下详细说明、权利要求和图片之后，本发明的其他目的、特征和优点将显而易见。

附图说明

图1显示了碱化合物18-(对-碘苯基)十八烷基磷酸胆碱(NM404)的化学结构。

图2A，2B和2C是一系列图表，显示xRT+IT-IC引发原位肿瘤疫苗接种。2A)肿瘤生长曲线和2B)Kaplan-Meier存活曲线显示xRT和IT-hu14.18-IL2之间的协同作用。用xRT+IT-IC治疗的小鼠中有71％(22/31)无疾病。2C)其中90％对随后植入B78黑色素瘤产生排斥。

图3是显示伴随的免疫耐受的图。该图显示了原发性肿瘤响应。在2-肿瘤B78黑色素瘤模型中远处未治疗的肿瘤抑制对xRT+IT-IC的响应，并且这种抑制可以通过照射第二肿瘤得以克服。

图4是显示伴随的免疫耐受是由Treg引起的图。该图显示了原发性肿瘤响应。在2-肿瘤B78黑色素瘤模型中远处未治疗的肿瘤抑制对xRT+IT-IC的响应，并且这种抑制可以通过消耗Treg得以克服(使用在其Treg上表达白喉毒素受体的转基因DEREG小鼠，从而通过给予白喉毒素消耗Treg)。

图5是显示B78黑色素瘤选择性摄取¹²⁴I-NM404的图像。携带～200mm³B78肿瘤的小鼠接受IV ¹²⁴INM404并进行连续PET/CT扫描。71小时的该图像显示了肿瘤的选择性摄取，并且心脏和肝脏具有一些残留的背景摄取。

图6是证明在存在残留水平的分子靶向放射疗法(TRT)的情况下可以引发原位疫苗接种的图。在存在或不存在3μCi ¹³¹I-NM404的情况下，使用组合的xRT+IT-IC进行治疗同样有效。这近似于当我们递送xRT(d0)然后递送IT-IC(d6-10)时将存在的TRT的残余活性，如实施例4中所述。

图7A、7B、7C、7D和7E是一系列图，显示在鼠黑色素瘤和胰腺肿瘤模型中远处未处理肿瘤导致局部RT+IT-IC的组合的原发性肿瘤响应的肿瘤特异性抑制。显示携带同源的表达双唾液酸神经节苷脂(GD2+)的原发性同侧肿瘤+/-对侧的继发性肿瘤的C57BL/6小鼠仅对原发性肿瘤进行处理，如所示的那样，在第1天用xRT和在第6-10天肿瘤内(IT)注射50mcg(微克)的抗-GD2免疫细胞因子(IC)，hu14.18-IL2(一种抗GD2mAb和IL2的融合物)。平均原发性肿瘤体积显示在图7A和7C-7E中。7A)在携带原发性B78黑素瘤肿瘤的小鼠中，未处理的继发性B78肿瘤的存在拮抗了对RT+IT-IC的原发性肿瘤的响应。我们将这种效应描述为“伴随的免疫耐受”-未处理的远处肿瘤对处理的肿瘤对xRT+IT-IC的局部反应的拮抗作用。7B)显示了图7A中的小鼠加上重复实验的Kaplan-Meier存活曲线。由于原发性肿瘤进展，几乎所有小鼠都被安乐死。7C)在携带原发性Panc02-GD2+胰腺肿瘤的小鼠中，在相对侧有或没有继发性Panc02-GD2-肿瘤，未处理的Panc02继发性肿瘤的存在抑制了原发性Panc02-GD2+肿瘤对RT+IT-IC的响应。7D)在携带原发性B78黑素瘤肿瘤的小鼠中，继发性B78肿瘤抑制原发性肿瘤对xRT+IT-IC的响应，但是继发性Panc02-GD2+胰腺肿瘤未发挥这种作用。7E)在携带原发性Panc02-GD2+肿瘤的小鼠中，继发性Panc02-GD2-肿瘤抑制原发性肿瘤对组合的xRT和IT-hu14.18-IL2的响应，而B78继发性肿瘤未显示。n＝每组小鼠数。NS＝无显著性，***p<0.001。

图8A、8B和8C包括免疫组织化学图像和图表，显示伴随的免疫耐受通过调节性T细胞(Treg)的特定消耗而被规避。8A)在具有一个(A1和A2)或两个(A3和A4)肿瘤的小鼠中在xRT后第6天评估的Treg标记物FoxP3的免疫组织化学(显示代表性400x图像)。小鼠不接受xRT或仅接受针对原发性肿瘤的xRT。原发性肿瘤显示在A1-A3中，继发性肿瘤显示在A4中。小箭头指出一些FoxP3+细胞(棕色核＝FoxP3+，蓝色＝苏木精复染剂)。右侧显示的图表对每200x场的FoxP3+细胞进行盲法定量，分别对应于A1，A2，A3和A4中所示的条件。8B和8C)DEREG小鼠在Treg特异性FoxP3启动子的控制下表达白喉毒素受体，在IP注射白喉毒素后能够特异性消耗Treg。携带原发性和继发性B78黑色素瘤肿瘤的DEREG小鼠用xRT+IT-IC处理至原发性肿瘤并IP注射白喉毒素或PBS(显示第一个重复实验)。在这些小鼠中消耗Treg后消除了伴随的免疫耐受，导致改善的8B)原发性和8C)继发性肿瘤响应。n＝每组小鼠数。**p<0.01,***p<0.001。

图9A和9B是显示通过将xRT递送至两个肿瘤部位而克服伴随的免疫耐受性的图。在携带原发性和继发性B78肿瘤的小鼠中，继发性肿瘤抑制用xRT+IT-IC对原发性肿瘤进行处理的原发性肿瘤的响应。通过向原发性肿瘤和继发性肿瘤递送12Gy xRT以及向原发性肿瘤递送IT-IC可以克服这一点，从而导致重复实验中改善的9A)原发性肿瘤响应显示第一个重复实验)和改善的9B)合计的动物存活。n＝每组小鼠数。**p<0.01,***p<0.001。

图10A，10B和10C是一系列图表，其显示单独的低剂量xRT不能引发原位疫苗接种，但是当与原位疫苗位点的12Gy+IT-IC处理一起递送到远处肿瘤部位时确实克服了伴随的免疫耐受。10A)在仅携带原发性B78肿瘤的小鼠中，12Gy+IT-IC引发原位免疫接种(如前所示)并导致大多数小鼠(该实验中4/6)完全肿瘤消退和记忆免疫应答(Morris,Cancer Res,2016)。另一方面，在单独的IT-IC或低剂量(2Gy)xRT+IT-IC后，没有动物表现出完全的肿瘤消退(两组中均为0/6)p<0.05。10B)在携带原发性和继发性B78黑素瘤肿瘤的小鼠中，递送至继发性肿瘤的低剂量xRT(2Gy或5Gy)在克服原发性肿瘤中伴随的免疫耐受的能力方面相当于12Gy。10C)在这些相同的动物中，显然通过向继发性肿瘤递送低剂量xRT克服伴随的免疫耐受挽救了对IT-IC免疫疗法的全身响应(图10C)。在这种情况下，当xRT被递送到所有肿瘤部位时，然后原发性肿瘤的IT-IC注射引发全身性抗肿瘤效应，使得继发性肿瘤对2Gy或5Gy的响应大于在没有原发性肿瘤IT-IC注射的情况下对12Gy xRT的响应。

图11A、11B、11C和11D是PET图像(11A)和一系列条形图(11B、11C和11D)，显示具有低剂量TRT和¹³¹I-NM404有效地消耗肿瘤浸润的FoxP3+Treg而没有全身性白细胞减少或肿瘤消耗浸润CD8+效应T细胞。在大多数临床情况中，向所有肿瘤部位递送外部束(甚至低剂量)而不引起明显的骨髓耗竭和导致免疫抑制的白细胞减少是不可行的。在这里，我们测试了TRT是否可以全身给予以特异性消耗肿瘤浸润性抑制性免疫细胞(Treg)，而不会引发全身免疫细胞耗竭和白细胞减少。11A)使用正电子发射的¹²⁴I-NM404在B78黑色素瘤肿瘤模型中进行放射量测定研究，证实NM404的肿瘤选择性摄取。携带B78肿瘤的C57BL/6小鼠用60μCi¹³¹I-NM404处理。该活性近似于将～2Gy TRT递送至B78肿瘤所需的¹³¹I-NM404的量。在未处理的对照小鼠(C)中收集外周血和肿瘤样品，之后以8天的间隔(T1＝d8，T2＝d16，T3＝d24，T4＝d32)收集。11B)该剂量的TRT不会导致任何显著的全身性白细胞减少，并且11C)不会显著影响肿瘤浸润性CD8+效应T细胞的水平(ANOVA p＝0.25)。11D)然而，该剂量的TRT显著消耗了肿瘤浸润的FoxP3+Treg(ANOVA p＝0.03；*p<0.05)。

图12A和12B显示低剂量TRT和¹³¹I-NM404有效克服了伴随的免疫耐受并且挽救了原位疫苗接种的全身性抗肿瘤作用。考虑到低剂量¹³¹I-NM404TRT在不使小鼠白细胞减少的情况下消耗肿瘤浸润性Treg的能力，我们测试了低剂量¹³¹I-NM404是否可以有效克服伴随的免疫耐受。如所示的那样，在第1天用60-mcCi ¹³¹I-NM404(NM404)处理携带两个B78肿瘤的C57BL/6小鼠。在一个半衰期(第8天)后，动物接受针对原发性肿瘤(原位疫苗部位)的12Gy xRT或不接受xRT。如所示的那样，未接受¹³¹I-NM404的对照小鼠处理继发性肿瘤(0,2或12Gy)。如所示的那样，在第13-17天，小鼠每天接受IT注射IC到原发肿瘤(原位疫苗部位)。12A)原发性肿瘤和12B)继发性肿瘤响应表明，给予低剂量TRT有效地克服了伴随的免疫耐受并且挽救了原位接种疫苗的全身性抗肿瘤作用。

具体实施方式

I.概述

应理解，本公开不限于所描述的特定方法、方案、材料和试剂，因为这些可以变化。这里使用的术语仅用于描述具体实施方式的目的，并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅受任何后来提交的非临时申请的限制。

本文和所附权利要求书所用的单数的“一个”、“一种”和“该”包括复数含义，除非文中另有明确说明。同样，术语“一个”(或“一种”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换使用。术语“包括”及其变化形式不具有限制意义，其中这些术语出现在本说明书和权利要求中。因此，术语“包括”、“包含”和“含有”可互换使用。

除非另外定义，否则，本文中所使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的同样含义。虽然可采用与本文所述类似或等同的任何方法和材料实施或测试本发明，但在此描述的是优选的方法和材料。本文具体提及的所有出版物和专利都通过引用全文纳入本文用于所有目的，包括描述和公开所述出版物报道的可与本发明联合使用的化学物质、设备、统计分析和方法。本说明书引用的所有参考文献都应看作对本领域技术水平的指示。

本文术语仅用来描述实施方式，而不是用于限制本发明整体。除非另有说明，“一个”、“一种”、“所述”和“至少一个”可互换使用，表示一个或超过一个。

本发明包括任何药学上可接受的形式的本文所述的化合物(包括中间体)，包括异构体(例如，非对映异构体和对映异构体)、互变异构体、盐、溶剂合物、多晶型物、前药等。具体地，如果化合物有光学活性，本发明具体包含该化合物的各对映异构体以及这类对映异构体的外消旋混合物。应理解，术语“化合物”包括任何或全部这类形式，无论是否明确说明(虽然有时明确说明是“盐”)。

本文所用的“药学上可接受”表示化合物或组合物或载体适于向对象给药以实现本文所述的治疗，而就治疗的必要性而言没有不当的有害的副作用。

本文所用术语“有效量”指引发研究人员、兽医、医生或其它临床工作人员期望的对象、组织或细胞的生物学或医学反应的化合物的量或剂量。

本文所用术语“药学上可接受的载体”包括任何和全部干粉、溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂、吸收延迟剂等。药学上可接受的载体是可用于以本发明的方法给予化合物的目的的物质，其优选是非毒性的，并且可以是固体、液体或气体物质，其另外是惰性的和药学上可接受的，并且与本发明的化合物相容。这类载体的示例包括但不限于：各种乳糖，甘露醇，油类如玉米油，缓冲剂如PBS、盐水、聚乙二醇、甘油、聚丙二醇、二甲亚砜，酰胺如二甲基乙酰胺，蛋白质如白蛋白，和去污剂如吐温80，单糖和低聚多糖如葡萄糖、乳糖、环糊精和淀粉。

本文所用术语“给予”或“给药”是指向患有待治疗或预防的疾病或病症或具有其风险的对象提供本发明的化合物或药物组合物。

药理学中的给药途径是药物进入体内的途径。给药途径一般可根据施用物质的位置分类。常用的示例可包括口服给药和静脉内给药。也可基于作用靶标的位置对途径进行分类。作用可以是局部的(局部)、肠道(系统范围作用，但通过胃肠道递送)，或胃肠外(全身作用，但通过胃肠道以外的途径递送)，通过吸入的经肺部。在本文中提到的一种形式的局部给药是肿瘤内(IT)，其中将药剂直接注射到已知肿瘤部位或邻近已知肿瘤部位。

局部给药强化了局部效果，并且将物质直接施用于希望发挥其作用的地方。然而，有时，术语局部可定义为施用于身体的局部区域或身体部分的表面，而不必涉及物质的目标作用，使得该分类相当于基于施用位置的分类的变化形式。在肠道给药中，所需的效果的全身的(非局部)，通过消化道给予物质。在胃肠外给药中，期望的效果是全身性的，并且物质通过除消化道以外的途径给予。

局部给药的非限制性实例可包括：表皮(施用于皮肤上)，例如过敏试验或典型的局部麻醉，吸入，例如哮喘药物，灌肠剂，例如用于肠成像的造影剂，滴眼剂(在结膜上)，例如用于结膜炎的抗生素，滴耳剂，例如用于外耳炎的抗生素和皮质类固醇，以及通过体内粘膜的那些。

肠道给药可以是涉及胃肠道的任何部分的给药，并且具有全身性效果。该示例可包括经口(口服)的那些，许多药物是片剂、胶囊或滴剂，通过胃饲管、十二指肠饲管或腹孔的那些，许多药物和肠道营养，以及直肠给予的那些，栓剂中的各种药物。

胃肠外给药的示例可包括静脉内(进入静脉)，例如，许多药物，总肠胃外营养动脉内(进入动脉)，例如，用于治疗血管痉挛的血管扩张药物和用于治疗栓塞的血栓溶解药物，骨内输注(进入骨髓)，肌肉内，大脑内(进入脑实质)，脑室内(进入脑室系统)，鞘内(注射到脊柱管内)和皮下(在皮肤下)。其中，骨内输注在间接静脉渠道中是有效的，因为骨髓直接排入静脉系统中。当静脉途径困难时，骨内输注可偶尔用于急救医疗和儿科中的药物和流体。

在公开中使用以下缩写：ADCC，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；B16，与C57Bl/6小鼠同源的黑色素瘤；B78，由于用GD2合酶转染而表达GD2的B16的变体；D，天；Hu14.18-IL2，实施例中公开的研究中使用的初级免疫细胞因子(与GD2反应)；IC，免疫细胞蛋白(与IL2连接的肿瘤反应性mAb的融合蛋白)；IL2，白细胞介素2；IT，瘤内；IV，静脉内；mAb，单克隆抗体；MAHA，小鼠抗人抗体；NM404，用于表示图1中所示的磷脂醚，其被大多数肿瘤选择性吸收并用于实施例中公开的研究中的TRT；NXS2，与AJ小鼠同源的神经母细胞瘤；Panc02-GD2，一种与C57Bl/6小鼠同源的胰腺癌，由于用GD2合酶转染而表达GD2；PLE，磷脂醚；RT，放射治疗；TRT，靶向放射治疗；W，周；9464D-GD2，由于用GD2合酶转染而表达GD2的与C57B1/6小鼠同源的神经母细胞瘤。

II.本发明

本公开内容涉及治疗呈现为恶性实体瘤的任何癌症的方法。所公开的方法结合了两个处理步骤，具有意想不到的协同作用，导致对恶性实体瘤的原位疫苗接种效果大大改善。具体地，给予患者由恶性实体瘤组织特异地吸收并保留在恶性实体瘤组织内的免疫调节剂量的放射性卤化化合物，并且在至少一种恶性实体瘤内通过瘤内注射(或应用)包含一种或多种能够刺激肿瘤微环境内的特异性免疫细胞的试剂的组合物进行原位肿瘤疫苗接种，不论对用免疫刺激剂治疗的至少一种恶性实体瘤有或没有额外的xRT。放射性卤化化合物的免疫调节剂量可能降低Treg水平(和其他免疫抑制元素)并且防止当xRT用于对抗肿瘤并且一个或多个另外的肿瘤未被照射时发生的免疫系统阻碍(伴随的免疫耐受)。

A.瘤内免疫-原位免疫接种

用于瘤内免疫的组合物可包括但不限于：一种或多种细胞因子，免疫检查点抑制剂，模式识别激动剂和/或免疫刺激性单克隆抗体，包括抗肿瘤特异性抗原的抗体。关于可以使用的瘤内免疫/原位疫苗接种策略的综述，参见Pierce等，Human Vaccines&Immunotherapoeutics 11(8):1901-1909,2015；和Marabelle等，Clin.Cancer Res.20(7):1747-56,2014；和Morris等，Cancer Res.,印刷之前的电子出版,2016；所有这些都通过引用结合到本文中。在本文公开的非限制性实施例中，通过注射抗GD2mAb和白细胞介素2的融合蛋白(hu14.18-IL2)进行瘤内免疫。然而，所公开的方法不受这些实施例的任何限制。

B.放射性卤化化合物的免疫调节剂量

所用的放射性卤化化合物必须选择性地靶向多种实体瘤细胞类型，使得放射性卤化化合物发射的RT被导向恶性实体瘤组织，而基本上不会将其他组织类型暴露于发射的RT。具有这些特征的放射性卤化化合物包括MIBG或本文公开的磷脂醚类似物。包含在放射性卤化化合物中的放射性卤素同位素可以是任何已知的放射性卤素同位素，其以一种形式发射电离RT，将导致摄取化合物的细胞的免疫刺激。在一个非限制性实例中，掺入的放射性卤素同位素是放射性碘同位素，例如碘-131。

放射性卤化化合物的免疫调节RT剂量(与注射剂量相反)远小于用于针对恶性实体瘤的常规RT疗法的剂量。具体而言，剂量必须足以刺激肿瘤微环境内免疫细胞的响应(可能通过降低免疫抑制性Treg水平和其他免疫抑制细胞或分子)，同时不消除负责原位疫苗响应的所需免疫细胞。

如实施例中所述，可以从给予“促进检测”剂量的放射性卤化化合物后获得的成像数据计算适当的免疫调节剂量。检测检测剂量可以与免疫调节剂量完全不同，并且掺入放射性卤化化合物中的放射性卤素同位素可以是不同的(尽管化合物结构的其余部分应该相同)。在检测步骤和放射量测定计算中使用的放射性卤素同位素可以是已知以通过常规成像装置容易检测的形式发射RT的任何放射性卤素同位素。“常规成像装置”的非限制性实例包括：伽马射线检测，PET扫描和SPECT扫描。可以使用的放射性卤素同位素的非限制性实例包括：砹-211，碘-123，碘-124，碘-125和碘-131。

C.合成所公开的类似物和组合物的方法

在所公开的方法中使用的烷基磷酸胆碱类似物是本领域已知的，合成这些类似物的方法也是如此。关于合成材料和方法的细节，参见例如美国专利公开2010/0284929,2010/0316567,2012/0128596,2014/0030187和2014/0023587，它们各自通过引用整体并入本文。类似地，用于原位疫苗接种/瘤内免疫癌症疗法的方法和组合物是本领域已知的。

D.适用于各种的成人和儿童实体瘤

如上所述，我们先前已经证明，在体内成像和肿瘤生长抑制研究中证实，所公开方法中使用的烷基磷酸胆碱类似物在各种成人和儿童实体瘤中被选择性地吸收。

本领域众所周知，实体瘤癌细胞表型的相对放射敏感性范围从具有非常低的RT敏感性(例如胰腺癌，结肠直肠癌，神经胶质瘤和乳腺癌)的那些到具有高RT敏感性的那些(例如淋巴瘤)。具有低放射敏感性的肿瘤被认为是高度放射抗性的，而高放射敏感性肿瘤被认为具有低放射抗性。癌细胞的相对放射敏感性通常表示为2Gy体外RT暴露的存活分数(SF₂)。可以通过其相对的放射敏感性对癌症进行分类或排序，表1提供了一些常见实体瘤的已知SF₂值的非限制性实例。

表：选择的癌细胞类型的相对放射敏感性

肿瘤类型	细胞系	SF<sub>2</sub>值
			乳腺癌	MDA-MB-231	0.82
胰腺癌	Mia-Paca	0.80
			结肠直肠癌	HCT-29	0.75
黑色素瘤	B-78	0.65
			胶质瘤(大脑)	U-87	0.63
肺癌(NSCLC)	A-549	0.61
			前列腺癌	PC-3	0.55
淋巴瘤	EL-4	0.30

SF₂＝2Gy体外RT暴露后的存活分数

*几种细胞系

我们先前已经在各种肿瘤类型中证实了良好的肿瘤摄取和生长抑制，包括高放射敏感性肿瘤如淋巴瘤以及高RT抗性肿瘤如胶质瘤、乳腺癌、胰腺癌或结肠直肠肿瘤。因此，可以使用定量成像和放射量测定而无需过度实验来量化在多种实体瘤类型中刺激免疫系统所必需的RT剂量。

E.剂型和给药方法

原位疫苗接种可以通过瘤内注射进行，但也可以应用其他给药方式(局部或全身)。对于协同靶向RT，任何给药途径可能都是合适的。在一个实施方式中，所公开的烷基磷酸胆碱类似物可以通过静脉内注射给予对象。在另一个实施方式中，所公开的烷基磷酸胆碱类似物可以通过任何其他合适的全身递送方式给予对象，例如肠胃外、鼻内、舌下、直肠或透皮给药。

在另一个实施方式中，所公开的烷基磷酸胆碱类似物可以通过鼻腔系统或口腔，通过例如吸入给予对象。

在另一个实施方式中，所公开的烷基磷酸胆碱类似物可以通过腹膜内注射或IP注射给予对象。

在某些实施方式中，所公开的烷基磷酸胆碱类似物可以作为药学上可接受的盐提供。然而，其他盐也可用于制备烷基磷酸胆碱类似物或其药学上可接受的盐。合适的药学上可接受的盐包括但不限于酸加成盐，其可通过例如混合烷基磷酸胆碱类似物的溶液与药学上可接受的酸的溶液来形成，所述酸是例如盐酸、硫酸、甲磺酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、乙酸、苯甲酸、草酸、柠檬酸、酒石酸、碳酸或磷酸。

当公开的烷基磷酸胆碱类似物具有至少一个不对称中心时，其可因此以对映异构体存在。当公开的烷基磷酸胆碱类似物具有两个或更多个不对称中心时，它们可另外作为非对映异构体存在。应理解，所有这些异构体及其任何比例的混合物都包括在本发明的范围内。

本发明还包括使用包含一种或多种所公开的烷基磷酸胆碱类似物的药物组合物与药学上可接受的载体的方法。优选地，这些组合物是单位剂型，例如片剂、丸剂、胶囊、粉末剂、颗粒剂、无菌胃肠外溶液或混悬剂、计量气溶胶或液体喷雾剂、滴剂、安瓿、自动注射器装置或栓剂；用于胃肠外、鼻内、舌下或直肠给药、或通过吸入或吹入给药。

为制备固体组合物如片剂，将主要活性成分与药学上可接受的载体如常规压片成分如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶，以及其他药学稀释剂如水进行混合，以形成包含本发明化合物或其药学上可接受的盐的均质混合物的固体预配制组合物。这些预配制组合物是均质的描述是指活性成分均匀分散在整个组合物中，使组合物可容易地再细分成相等的有效剂型如片剂、丸剂和胶囊。然后固体预制组合物再细分成上述类型的单位剂型，含0.1-500mg本发明的活性成分。典型单位剂型含1-100mg，例如1、2、5、10、25、50或100mg活性成分。可以将新组合物的片剂或丸剂包衣或以另行复合，以提供具有延长作用优点的剂量。例如，片剂或丸剂可包含内部剂量和外部剂量组分，后者包封前者。两种组分可由肠衣层分离，阻止胃内崩解并允许内部组分原封不动地通过十二指肠或延迟释放。多种材料可用于此类肠衣层或包衣，这些材料包括各种聚合酸以及聚合酸与诸如虫胶、十六醇和醋酸纤维素等材料的混合物。

口服或注射给予的可掺有烷基磷酸胆碱类似物的液体形式包括：用糖浆适当调味的水性溶液剂；水性或油性悬液；和用食用油调味的乳剂，所述食用油包括棉籽油、芝麻油、椰子油或花生油；以及酏剂和类似的药用载剂。水性悬液合适的分散剂或助悬剂包括合成和天然树胶如西黄蓍胶、阿拉伯胶、藻酸盐、葡聚糖、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮或明胶。

当以药物可注射剂量的形式，包括与可注射载体系统组合配制时，所公开的烷基磷酸胆碱类似物特别有用。如本文所用，可注射和输注剂型(即胃肠外剂型)包括但不限于脂质体注射剂或脂双层载剂，其具有将活性药物包封在内的磷脂。注射剂包括胃肠道外使用的无菌制备物。

UPS定义了5种不同类别的注射剂：乳液、脂质、粉末、溶液和悬液。乳液注射剂包括包含用于胃肠道外给予的无菌无热源制备物的乳液。用于溶液注射的脂质复合物和粉末是无菌制备物，旨在重建成溶液供胃肠外使用。悬液注射的粉末是无菌制备物，旨在重建成悬液供胃肠外使用。用于脂质体悬液注射的冻干粉末是无菌冷冻干燥制备物，旨在重建后供胃肠外使用，其制备方式允许纳入脂质体，例如具有磷脂的脂双层载剂，由此将活性药物包封在脂双层内或水性空间中，从而可在重建后形成制剂。用于溶液注射剂的冻干粉末为通过冻干(“冷冻干燥”)制备的用于溶液的剂型，过程涉及在极低压下从冷冻状态的产物中去除水分，随后加入液体产生在所有方面均符合注射要求的溶液。经冻干用于悬液注射的粉末是液体制备物，旨在胃肠外使用，其包含悬浮于合适的液体介质中的固体，且其在所有方面符合无菌悬液的要求，从而通过冻干制备用于悬液的药用试剂。溶液注射剂涉及液体制备物，其包含一种或多种溶解于适合注射的合适溶剂或相互混溶的溶剂混合物中的药物物质。

溶液浓缩注射剂涉及用于胃肠道外使用的无菌制备物，在加入合适的溶剂时生成在所有方面均符合注射要求的溶液。悬液注射剂涉及(适合注射的)液体制备物，其包含分散于液相中的固体颗粒，所述颗粒是不溶性的，油相分散于水相或反之。悬液脂质体注射剂是(适合注射的)液体制剂，其以形成脂质体(一种脂双层载剂，通常含有用于将活性药物包封在脂双层内或水性空间中的磷脂)的方式具有分散在整个水相中的油相。悬液超声注射剂是(适合注射的)液体制备物，其包含分散于水相中的固体颗粒，颗粒因此不可溶。此外，在气体从悬液中冒泡时，可对该产物进行超声处理，使得固体颗粒形成微球。

胃肠外运载体系统包括一个或多个药学上合适的赋形剂，如溶剂或共溶剂、增溶剂、润湿剂、悬浮剂、增稠剂、乳化剂、螯合剂、缓冲剂、pH调节剂、抗氧化剂、还原剂、抗菌防腐剂，膨胀剂、保护剂、张力调节剂和特殊的添加剂。

提供以下实施例仅用于说明目的，并非旨在以任何方式限制本发明的范围。事实上，除了本文所示和所述的那些以外，本发明的各种修改对于本领域技术人员而言从前面的描述和以下实施例将变得显而易见，并落入所附权利要求的范围内。

III.实施例

实施例介绍

这些实施例证明了在癌症治疗研究中汇集两种截然不同的前沿学科的潜力，充分利用了意想不到的非常有效的协同作用。这两种学科是：1)全身施用TRT和2)局部定向的抗体介导的癌症免疫疗法。本文提供的数据表明，通过组合这些方法可以产生强大的协同作用。总之，这两种策略可用于破坏肉眼可见的肿瘤，使得被破坏的癌细胞能够作为一种有效的原位疫苗发挥作用，产生肿瘤特异性T细胞免疫，对于任何部位的实体肿瘤，能够根除任何类型的持续性残留转移性疾病。

我们正在进行的临床前研究表明，肿瘤特异性mAb与IL2的组合(激活先天免疫细胞)导致增强的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)[1,2]；这一过程已经转化为神经母细胞瘤患儿的临床获益[3]。最近的临床前数据显示，当肿瘤内注射mAb-IL2融合蛋白(IT)时，其抗肿瘤效果更强[4,5]。值得注意的是，如果xRT与mAb/IL2处理相结合，那么对这些mAb/IL2注射无反应并且如果仅用局部xRT处理则继续生长的大肿瘤可以完全根除。大多数小鼠被治愈并产生对用相似的肿瘤细胞进行再次攻击有排斥的T细胞记忆[6]；这证明组合的xRT+mAb/IL2充当有效的“原位”抗癌疫苗。

一个关键的限制是，当这些动物接受xRT+mAb/IL2处理原发性(第一)肿瘤时，如果存在另一种肉眼可见的肿瘤，则第二肿瘤将继续生长，并且令我们惊讶的是，能够抑制免疫应答，阻止第一处理的肿瘤的任何收缩。这种“伴随的免疫耐受”部分来自第二肿瘤中的抑制性调节性T细胞(Treg)。单独向两个肿瘤提供RT具有最小的抗肿瘤效果，但是消耗这些Treg。因此，当用xRT+mAb/IL2处理第一肿瘤时，向第二肿瘤添加RT可以避免这种免疫耐受，从而可以根除这两个肿瘤[7]。这些观察结果表明在转移性环境中原位肿瘤疫苗接种的局限性，但也表明RT的稳健能力克服了这种限制。

通常不能将xRT以没有过高的正常组织毒性和免疫抑制的情况递送至所有转移部位。然而，不向所有肉眼可见的疾病部位递送xRT可使抑制性免疫谱系保持完整，能够抑制对我们的局部xRT+mAb/IL2免疫疗法的免疫应答。因此，需要的是以有针对性的方式将RT递送至癌症患者的所有肿瘤部位的手段。

我们开发了能够针对原发性和转移性癌症靶向全身给予的TRT运载体。一种这样的TRT试剂是¹³¹I-NM404，静脉内(IV)给予的磷脂醚(PLE)类似物，已经在60多种体内癌症和癌症干细胞模型中显示出几乎普遍的肿瘤靶向性质。该试剂目前正在临床上进行多项影像学和治疗试验[8,9]。全身注射¹³¹I-NM404定位于所有肿瘤，无论解剖位置如何，并在内部提供足够的RT以消除能够阻止有效的肿瘤根除的免疫应答的发展的肿瘤内免疫抑制途径。该方法的独特属性是NM404的近乎普遍的肿瘤靶向能力，以及向所有肿瘤部位递送免疫调节亚致死剂量的RT的能力，这对于xRT通常是不可行的。关于这一点的新内容是我们的TRT试剂可以免疫调节所有肿瘤，无论解剖位置如何，克服伴随的耐受性，这将导致局部xRT后注射肿瘤特异性mAb+IL2的长期原位肿瘤疫苗接种效应。随着越来越多的肿瘤特异性mAb被批准用于临床，这种组合策略可以容易地扩展到可以被肿瘤反应性mAb靶向的任何肿瘤类型的临床应用。此外，该方法可以容易地推广到所有原位肿瘤疫苗接种策略。

在这些实施例中，我们描述了如何评估¹³¹I-NM404和相关类似物启动全局免疫调节反应的能力，以使局部组合的xRT+mAb/IL2处理能够诱导有效的放射免疫促进的原位癌症疫苗。可以对组合的PLE类似物递送的TRT与其他原位癌症疫苗方法进行类似的评估。

总之，我们在此公开了将两种不同方法从看似无关的癌症治疗学科组合成单一统一的治疗的首次努力。这些实施例中提供的数据表明这两种方法可以协同组合以有效地消除恶性实体瘤并防止肿瘤复发。该方法的三个关键概念是(A)局部xRT+IT mAb/IL2根除现有的单个肿瘤并产生T细胞记忆(原位疫苗)；(B)除非受到照射，否则远处肿瘤会引起伴随的免疫耐受，从而阻止原位疫苗的功效；和(C)不同于全身RT，TRT可以定位于所有肿瘤，而没有严重的全身性RT诱导的免疫抑制。这些概念与我们的数据一起得出结论：xRT+IT mAb/IL2对小鼠的原发性肿瘤(加上TRT以消除由转移引起的耐受性)将使有效的原位疫苗接种能够根除所有恶性实体肿瘤癌症(原发性和转移性部位)。

在实施例1中，我们呈现来自我们的B78GD2+模型的背景数据以支持所要求保护的方法。

在实施例2中，我们提供了用于确定针对原发性肿瘤的最佳原位疫苗效应所需的xRT剂量，以及为防止伴随的免疫耐受所需的对于远处肿瘤的最低xRT剂量的指导。

在实施例3中，我们提供了用于确定¹³¹I-NM404剂量的指导，所述剂量近似于xRT对转移的所需剂量，如实施例2中所确定的那样，并随后评估该¹³¹I-NM404剂量对体内免疫功能的影响。

在实施例4中，我们提供指导以使用来自实施例2和3的数据在携带两个或更多个肿瘤的小鼠中设计/测试/开发¹³¹I-NM404+局部xRT+IT-mAb/IL2的方案以破坏局部治疗的肿瘤并诱导T细胞介导的根除所有远处肿瘤。TRT和xRT剂量和时间的关键问题针对抗肿瘤效力进行了优化。

在实施例5、6、7和8中，我们提供了根据实施例1-4的指导进行的实验研究的信息和具体数据。

实施例1：背景支持数据

Sondel实验室已经证明肿瘤特异性mAb+IL2激活先天免疫细胞介导小鼠ADCC[2]，对神经母细胞瘤患儿有临床益处[3]。在小鼠中，静脉内(IV)给予hu14.18-IL2IC比静脉内给予抗GD2mAb+IL2更有效[2,10]。这可以对最近建立的非常小的GD2+肿瘤或非常小的微小转移瘤提供显著的抗肿瘤作用，可能解释了这种方法在缓解但复发风险很高的临床应用[3]。当IC瘤内注射(IT-IC)而不是静脉注射时，针对可测量的肉眼可见的肿瘤[即～50mm³GD2+肿瘤]具有更强的抗肿瘤作用[4,5]。

我们现在正专注于为更大的肉眼可见的肿瘤提供益处的方法。5周前建立的中等大小(200mm³)B78黑色素瘤肿瘤的小鼠对IV-IC没有反应，其生长速度被IT-IC减慢，但肿瘤继续增长。12Gy的xRT后，这些200mm³肿瘤也在生长。相反，当IT-IC和xRT组合时，73％的动物无肿瘤并且看起来似乎已经治愈了疾病(图2A和2B)。然后这些小鼠显示T细胞介导的对相同肿瘤的再攻击的排斥(图2C)。因此IT-IC+xRT协同作用，诱导肿瘤成为“原位肿瘤疫苗”[6]。

为了模拟临床转移，我们在d-1一侧用B78给小鼠接种，第2周接种另一侧。在第5周，第一个肿瘤为200mm³，第二个肿瘤为50mm³。我们预计xRT+IT-IC会破坏第一个肿瘤，然后由此产生的T细胞反应会破坏第二个肿瘤。然而，将IT-IC添加到xRT对50mm³肿瘤或200mm³肿瘤几乎没有影响(图3)。这证明了我们提供的治疗的关键限制；也就是说，如果当这些肿瘤接受xRT+IT-IC到第一个肿瘤时存在另一个肿瘤，则第二个肿瘤将引起全身性肿瘤特异性伴随的免疫耐受效应，从而防止肿瘤的任何收缩。重要的是，我们发现对第一和第二肿瘤同时局部xRT(12Gy)消除了这种耐受性，使得IT-IC能够在第一个肿瘤中诱导免疫应答，从根除大多数小鼠的两个肿瘤(图4)[7]。最近的数据，使用Treg消耗mAb(未显示)或允许选择性Treg消耗的转基因小鼠(图4)[7]，证明这种免疫耐受，部分，是由调节性T细胞(Treg)介导的；对第一和第二肿瘤的RT部分消耗这些Treg，可能解释照射两个肿瘤如何规避耐受效应[7]。

虽然对第一和第二肿瘤的局部xRT规避了耐受性，但临床转移性疾病通常在几个位置。所有肉眼可见的转移性疾病必须接受RT以阻断免疫耐受并使xRT+IT-IC能够有效地根除所有肿瘤部位。然而，向所有疾病部位递送12Gy xRT可能类似于具有主要剂量依赖性(潜在致命)毒性和深度全身免疫抑制的“全身RT”。

此前，Weichert实验室率先开发了TRT，以便为所有全身肿瘤部位提供RT，同时最大限度地减少正常组织(特别是骨髓和免疫组织)的“脱靶”RT。

基于肿瘤细胞含有过多的磷脂醚(PLE)的发现[11]，我们合成了30多种放射性碘标记的PLE类似物，希望能够鉴定出能够选择性靶向肿瘤的类似物[12]。其中之一，NM404，在70多种体内模型中，不论解剖位置如何，除了三种外，其他所有模型都显示接近普遍的肿瘤摄取，包括脑转移和癌症干细胞，而且一旦进入肿瘤细胞，它们还经历了长时间的选择性保留[8]。这些透析疗法(diapeutic)PLE类似物的独特之处在于它们可以避免癌前病变和炎症性病变。相对于正常细胞在癌细胞上过表达的表面膜脂质筏用作PLE(包括NM404)进入癌症和癌症干细胞的入口门户[8]。放射性碘标记的NM404(I-124和I-131)现已分别在5个1期和2期PET成像试验和3个1期TRT放射治疗试验中进行评估，在十几种人类癌症类型中提供了类似的肿瘤摄取和保留特性[8]。已经用¹²⁴I-NM404PET成像证实了与这些实施例(B78GD2+鼠黑色素瘤)相关的癌症模型中的优异肿瘤摄取(图5)。

实施例2：确定xRT的剂量

我们的数据表明这四个假设：(1)我们用于治疗单个肿瘤的xRT剂量引起适度的直接体内肿瘤死亡并增加对免疫介导的死亡的易感性(通过ADCC和T细胞)；(2)通过添加IT-IC而非IT mAb提供的强T细胞应答表明，在IL2存在下，mAb与照射的肿瘤细胞结合而促进抗原呈递和增强的适应性免疫诱导；(3)第二肿瘤的存在导致xRT+IT-IC对第一肿瘤几乎不能造成任何抗肿瘤作用，这主要是由于第二肿瘤中存在的免疫抑制细胞的全身作用引起的耐受[例如Treg和可能是骨髓来源的抑制细胞(MDSC)]；通过消耗Treg(图4)或照射第二肿瘤(图3)可以避免这种耐受性；(4)第二肿瘤所需的RT剂量可以远低于第一肿瘤所需的xRT剂量以成为“原位疫苗”[14]。

优化原发(“原位疫苗”)肿瘤部位的xRT剂量。

我们对xRT+IT-IC的体内研究聚集于对第一肿瘤的一剂12Gy。这是基于我们的数据显示，体外RT诱导B78肿瘤细胞上Fas的剂量依赖性功能性上调(接近峰值>12Gy)，与我们的体内数据相结合，证明我们的xRT+IT-IC的原位疫苗效应需要具有功能性Fas-L的小鼠(6)。我们在选择12Gy剂量之前进行了体内试验研究，其显示较高剂量(16Gy)或增加的分馏侧翼RT具有毒性(皮炎，溃疡和晚期肢体水肿)并且对肿瘤响应没有改善。虽然我们在体内研究中选择了12Gy单剂量的xRT，但随着我们向临床转化的发展，更好地了解局部xRT效应的机制及其剂量要求将是有益的，以便安全有效地诱导原位疫苗效应。

我们的小鼠数据(图2A，2B和2C)显示我们可以用12Gy xRT+IT-IC诱导强效疫苗效应，即使单独使用12Gy的xRT不会导致肿瘤缩小；它只会减缓渐进式增长。我们可能会看到使用较低剂量的RT同样有效的原位疫苗效应。为了测试这种可能，我们在携带～200mm³B78肿瘤的小鼠中评估一系列xRT剂量(4-16Gy)作为单个部分，然后是我们的标准IT-IC方案(在第6-10天50微克/天(mcg/d)))。当与IT-IC结合使用时，我们将确定哪种xRT剂量可以提供最佳的肿瘤根除和T细胞记忆。如果低于12Gy的剂量毒性较低并且显示出相当的功效，则这些较低剂量将是我们对实施例3和4中的“原位疫苗”部位的xRT剂量的更好靶标。

优化远处肿瘤的xRT剂量以防止阻断“原位接种疫苗”的耐受。

用12Gy处理第一和第二肿瘤(图3)使得IT-IC能够对第一肿瘤产生有效的响应从而根除两个肿瘤。我们的目标是通过向单个肿瘤提供xRT+IT-IC，同时使用转移部位所需的最小RT剂量来规避耐受性，从而实现相同的原位疫苗效果。我们认识到xRT本身，特别是如果普遍存在，可能是骨髓/免疫抑制剂。这就是我们在实施例3和4中追求TRT的原因。即使它是靶向的，TRT确实有一些全身的RT递送。为了使TRT的全身免疫抑制最小化，我们希望给予尽可能低的TRT剂量以有效抑制肿瘤诱导的免疫耐受，同时不引起全身性RT诱导的全局免疫抑制。因此，我们将确定需要将多低剂量的xRT递送至远处肿瘤，以便当与针对第一肿瘤的IT-IC组合时，使得第一肿瘤的更高xRT剂量能够用作原位疫苗。

携带200mm³第一B78肿瘤和～50mm³第二B78肿瘤的小鼠将在第0天(植入第一B78肿瘤后约5周)接受12Gy针对第一肿瘤的xRT。接下来是第6-10天我们的IT-IC标准方案。单独的小鼠组将接受不同剂量的xRT至第二肿瘤。根据B.Johnson实验室的数据证明，3Gy的全身xRT可以预防骨髓瘤模型中的免疫抑制作用(15)，我们将评估0、1、5和8Gy的剂量(除了我们知道12Gy剂量是有效的)。我们将看到，显著小于12Gy的剂量对于第二肿瘤是否与消除免疫耐受的全部12Gy剂量一样有效。

一旦我们清楚了将失去有益效果的xRT的临界剂量，我们将进行后续分析以更好地确定临界剂量。例如，如果5Gy与12Gy一样有效，但1Gy并不比0Gy好多，那么我们将比较2、3和4Gy，以确定在接受12Gy+IT-IC到第一肿瘤的这两个肿瘤模型中，消除耐受性和获得疗效所需的临界最低有效RT剂量。

然后进行重复研究以确认当针对第一肿瘤的剂量是在1-肿瘤模型中的最低有效剂量(在上文实施例2中测试)而不是12Gy剂量时，针对第二肿瘤的该最低有效剂量是否仍然能够实现有效的原位疫苗。总之，实施例2的研究将确定第一和第二肿瘤的最低xRT剂量是多少，而不会丧失我们用12Gy证明的两者的功效。

开始对携带除B78以外的肿瘤的小鼠中的第一和第二肿瘤所需的xRT剂量的研究。

为了使我们的小鼠研究能够提供更多的临床普遍性，我们将在其他GD2+肿瘤模型中启动RT+IT-IC分析。我们业已公开了在含有GD2+NXS2神经母细胞瘤的AJ小鼠中的关于具有hu14.18-IL2IC的IT-IC[5]。我们还在携带GD2+9464D-GD2神经母细胞瘤的C57BL/6小鼠和通过插入GD2合酶基因表达GD2的Panc02-GD2胰腺癌中评估具有该相同IC的IT-IC。对于实施例2，对于每种模型，我们将确定原发性和继发性肿瘤所需的最低有效xRT剂量以保持原位疫苗效应。

实施例3：

确定¹³¹I-NM404的剂量及评价对免疫功能的影响

C57BL/6小鼠中TRT的放射量测定和TRT的免疫抑制。

¹³¹I-NM404在>95％的肿瘤系(人和小鼠)中显示出体外选择性摄取，非恶性细胞摄取不良，并且在体内观察到类似的肿瘤特异性。这包括用B78肿瘤体内选择性摄取(图5)。在初步放射量测定研究中，我们给予C57BL/6小鼠¹²⁴I-NM404，并通过连续PET/CT成像表征TRT暴露的时间过程(如图5所示)。基于该研究的蒙特卡罗放射量测定计算[16-18]表明，在四周的衰变期间，需要约60μCi的¹³¹I-NM404将约3Gy递送至已建立的B78肿瘤。在这四周后，对B78肿瘤的剩余TRT剂量将小于0.25Gy。我们将使用xRT复制我们在2-肿瘤模型中获得的数据(图3)，但使用尽可能低剂量的靶向¹³¹I-NM404TRT以在远处疾病的所有部位有效消除肿瘤诱导的耐受性。然而，与xRT不同，xRT在几分钟内递送所有剂量然后完成，TRT随时间沉积剂量，取决于目标同位素的生物和物理半衰期(¹³¹I的8天t1/2)。我们希望在远处的肿瘤部位产生最初的TRT效应，以消除免疫耐受；然而，当我们给予IT-IC诱导ADCC和原位疫苗抗肿瘤作用时，我们希望免疫抑制性TRT效应最小化。这对于在所有部位完全破坏肿瘤至关重要。

使用来自初步数据的放射量测定计算，我们估计剂量为3μCi的¹³¹I-NM404应向肿瘤部位提供相当于～0.2Gy的剂量，我们假设该剂量不应是免疫抑制性的并且不应防止淋巴细胞介导的肿瘤破坏。如上所述，这是我们估计在初始60μCi的¹³¹I-NM404剂量后28天仍需递送的剂量。因此，我们评估了携带单个200mm³B78肿瘤的小鼠组。在第0天，所有小鼠的肿瘤均达到12Gy xRT，并且在第6-10天，所有小鼠均获得50mcg/d的IT-IC。一组在第0天(d-0)上也得到3μCi的¹³¹I-NM404(～0.2Gy)。图6显示接受¹³¹I-NM404的组与没有¹³¹I-NM404的组具有相同程度的肿瘤根除，证明肿瘤中这种低剂量的“残留”TRT不会阻止RT+IT-IC原位疫苗的免疫介导的破坏。因此，我们假设如果我们在第22天使用初始剂量为60μCi的¹³¹I-NM404TRT，它将有效阻断远处肿瘤的致耐受性效应，但在第0天xRT和在第6-10天IT-IC(TRT后28天)至第一肿瘤用作原位疫苗，诱导适应性响应，然后根除所有肿瘤。

本实施例中概述的实验将评估图6中测试的剂量关系。在1-肿瘤B78模型中，我们将测试一系列剂量的¹³¹I-NM404TRT，以确定哪些TRT剂量会导致足够的不希望的全身免疫抑制，从而干扰所需的原位疫苗效应(从而减缓或防止根除第一肿瘤)。这对于实施例4是重要的，因为它将允许我们在具有远处疾病的小鼠中确保TRT的残余放射性在我们启动IT-IC到第一肿瘤时衰减到小于该值。我们还将评估改变TRT剂量后TRT响应的动力学，以确定在对多个肿瘤的动物给予“防止耐受性的TRT剂量”之后我们必须等待多长时间以允许RT+IT-IC处理第一肿瘤仍然诱导原位疫苗效应并根除原发性和远处肿瘤。

相关研究还将探讨作为单药治疗给予的哪种TRT剂量会引起减慢，或者收缩，或者根除单个B78肿瘤。消除肿瘤诱导的免疫耐受所需的TRT剂量将显著小于实际诱导完全肿瘤破坏所需的TRT剂量(仅来自TRT)。

最后，一旦在1-肿瘤模型中确定了不同剂量的TRT的作用，我们将通过评估来自这些小鼠的血清对IC的人IgG组分的免疫应答来评估TRT的微妙免疫抑制作用。我们已经表明，免疫活性小鼠在用这些人源化IC处理后产生易于定量水平的小鼠抗人抗体(MAHA)(19)。我们将使用它来确定哪种剂量下能够在小鼠免疫应答的强度中看到TRT导致可检测的剂量依赖性降低，以评估这些小鼠将从该TRT接受的全身剂量RT的整体免疫抑制效果。我们需要阻止肿瘤诱导的免疫耐受的低TRT剂量将导致最小的全身免疫抑制。

A/J小鼠中TRT的放射量测定和TRT的免疫抑制。

如在实施例2中，一旦我们接近完成上述研究，我们将开始在携带NXS2神经母细胞瘤的A/J小鼠中开始选择性重复研究。

实施例4：在携带两种或更多种肿瘤的小鼠中开发¹³¹I-NM404+局部xRT+IT-mAb/IL2的方案

在2-肿瘤B78模型中测试TRT+xRT+IT-IC的功效。

从实施例2和3概述的研究中获得的剂量和时间信息将提供我们在2-肿瘤模型中评估功效所需的TRT剂量和时间的信息。C57BL/6小鼠将同时在左侧(L)和右侧(R)侧接种B78。两周后每个肿瘤应为～50mm³，五周后为～200mm³。如果我们假设我们在实施例3中的放射量测定计算表明我们需要将60μCi的TRT递送至第二肿瘤以实现接近3Gy的RT(以阻断免疫耐受)，我们的xRT研究预测该剂量应该对肿瘤生长具有最小的减慢作用。我们计划在2周时间点(当肿瘤为～50mm³)用30、60或90μCi处理不同组的小鼠。三周后肿瘤应该是～200mm³；那时我们将在6天后(TRT后约28天)给予xRT(如实施例2中所述测定的剂量)，每天5次向L侧的肿瘤注射IT-IC，以诱导原位疫苗效应。对照小鼠将不会获得TRT，并且只有xRT和IT-IC到L侧，预期由于远处肿瘤的耐受性而没有原位疫苗。一个单独的组将在两个肿瘤处获得局部xRT并且IT-IC到L侧，预期通过原位疫苗效应根除两种肿瘤。另一组将获得TRT+IT-IC，但没有局部xRT，预计疫苗效应不完整。

随后的实验将进一步评估针对原发性肿瘤(L侧)的不同剂量的TRT以及TRT和局部xRT+IT-IC之间各种时间。读数将是：(A)根除原发性肿瘤；(B)根除继发性肿瘤；(C)全身免疫抑制，通过MAHA反应的ELISA分析。我们的目标是确定TRT剂量和时间，以增加局部xRT+IT-IC方案，该方案能够根除大多数小鼠的两种肿瘤，同时最小化全身免疫抑制(通过MAHA反应测量)。我们预计将找到TRT给予和时间的条件，能够与局部xRT+IT-IC组合用于原发性肿瘤，这与我们对两个肿瘤进行xRT的原发性肿瘤的IT-IC方案同样有效(图3)。

在携带超过两个B78肿瘤的小鼠中测试TRT+xRT+IT-IC的功效。

实施例4的这一部分与相关的临床环境最相似；即具有可注射肿瘤的患者，其可用作原位疫苗部位，但同时具有多个远处转移，其可各自引起肿瘤诱导的免疫耐受。这些研究将复制在实施例4的第一部分(上文)中发现最有效的条件。重要的区别是这些小鼠中每个都有四个单独的肿瘤，在L和R侧，以及L和R肩胛下区域。TRT将以在实施例4的第一部分中概述的研究中发现的最有效的剂量和时间给予，其中xRT+IT-IC随后仅给予L-侧损伤。目标是测试TRT剂量和时间问题以使有效的原位疫苗起作用，因为TRT将有效地消除由三个未获得xRT的部位引起的肿瘤诱导的免疫耐受。效力的量度将是消除大多数小鼠中的所有四个肿瘤。将研究TRT剂量和时间的修改以产生最有效的方案。然后可以考虑将这种方案用于具有多个远处转移的患者的临床，这些患者不能全部通过外部光束照射，但可以通过TRT照射，当与局部xRT+IT-IC结合用于“原位疫苗”部位。

在两个或更多个部位携带NXS2、9464D-GD2或Panc02-GD2的小鼠中开始TRT+xRT和IT-IC的研究。

如在实施例2和3中那样，一旦实施例4的前面部分中概述的研究正在进行，我们将在两个或更多个部位携带NXS2、9464D-GD2或Panc02-GD2的小鼠中开始类似的研究。

实施例5：确定针对原发性肿瘤的最佳原位疫苗效应所需的xRT剂量以及防止伴随的免疫耐受所需的对于远处肿瘤的最低剂量xRT的实验

已经对具有1或2个肿瘤的小鼠进行了剂量滴定实验，评估了各种xRT剂量。第一个目标是测试具有一个肿瘤的小鼠所需的xRT剂量，以促进与IT-IC(IL2连接的肿瘤反应性mAb)的协同作用和“原位疫苗”。最初的实验证实了我们之前的观察结果，即在携带单个肿瘤的小鼠中单独使用12Gy RT不会消除甚至消退已建立的B78黑色素瘤肿瘤的生长(0％完全消退)，而12Gy+IT-IC导致大多数B78肿瘤完全消退(66％)。另一方面，与单独的IT-IC相比，2Gy+IT-IC减慢肿瘤进展(平均肿瘤大小在第32天＝472mm³对比1214mm³)但是没有使任何小鼠无疾病(0％完全消退)。

在我们的“2-肿瘤模型”中，我们先前已经表明用xRT+IT-IC处理一个“原发性”肿瘤没有效果，不论是处理经治疗的原发性肿瘤还是未治疗的“继发性”肿瘤。事实上，在这个2-肿瘤模型中，我们观察到第二肿瘤的存在消除了xRT后IT-IC注射的功效。我们已将此现象称为“伴随的免疫耐受”(CIT)，并证明这，至少部分，来自远处(未照射)继发性肿瘤中的T调节性细胞(Treg)，其在全身循环并重新聚集到xRT处理/IT-IC注射的原发性肿瘤。这些返回原发性肿瘤的Tregs似乎会干扰所需的“原位疫苗”效应。

我们现在已经证实了我们之前的观察结果，即通过向原发性和继发性肿瘤提供12Gy xRT可以克服CIT。重要的是，鉴于Treg对RT非常敏感，我们假设可以将较低剂量的RT递送至继发性肿瘤以克服CIT和挽救原发性肿瘤处对原位免疫接种的响应(用12Gy+IT-IC处理原发性肿瘤)。我们现在对此进行了测试并观察到，对于继发性肿瘤，2Gy或5Gy的xRT剂量与12Gy能够钝化CIT并且挽救用12Gy+IT-IC处理对原发性肿瘤的响应的能力相当。这些重要的实验一式两份重复，提示(如假设的那样)必须给予远处肿瘤以预防CIT的xRT剂量远小于为了产生原位疫苗效应的目的IT-IC注射的原发性肿瘤部位所需的剂量。

这支持了我们在本发明中的总体假设，提示在携带多个肿瘤的动物中，与局部xRT和IT-IC注射单个肿瘤部位(原位疫苗部位)相结合时，我们将能够使用靶向放射治疗(TRT)NM404向所有疾病部位提供相对低剂量的RT，从而克服CIT。

实施例6：确定近似于如上所确定的xRT对转移的所需剂量的¹³¹I-NM404给药，然后评估该¹³¹I-NM404剂量对体内免疫功能的影响的实验

基于上述初步数据，已经进行了研究以使用TRT将这些概念转化为体内测试。已经对携带1或2个B78肿瘤的小鼠(我们用于证明我们的原位疫苗方法和CIT障碍的肿瘤模型)进行放射量测定研究。这样做是为了估计接近约2Gy的xRT所需的¹³¹I-NM404的量。

然后，为了确定～2Gy当量剂量的¹³¹I-NM404是否具有针对肿瘤内淋巴样细胞(特别是Treg)的所需效果，已经进行了2种不同的方法。首先，我们将该剂量的¹³¹I-NM404给予携带放射敏感性淋巴瘤肿瘤的小鼠，其表现出与B78肿瘤相当的NM404摄取。在此之后，我们已经记录了在不导致B78肿瘤显著收缩/减慢或任何明显的循环淋巴细胞消耗(如通过外周全血计数所测量)的条件下的有效淋巴肿瘤收缩/剂量依赖性抑制。这些数据与淋巴细胞比典型的实体肿瘤细胞对低剂量RT更敏感的事实是一致的，并且表明在肿瘤中选择性摄取TRT可以使肿瘤内淋巴细胞消耗而没有全身淋巴细胞减少。这些研究还表明，这种淋巴肿瘤可以作为体内生物学“剂量测量计”，用于鉴定和监测TRT对肿瘤内淋巴细胞的作用。

第二种方法涉及用这些相同剂量的¹³¹I-NM404处理具有B78肿瘤的小鼠。然后以半衰期(8天(d))间隔处死这些动物，并且在充分延迟放射性衰变后，通过免疫组织化学，肿瘤由于存在着效应T细胞和Treg而被染色。有趣的是，在该初始实验中接受¹³¹I-NM404的动物显示在任何时间点没有发生全身性淋巴细胞减少症(通过外周全血细胞计数)，但在给予TRT后2个半衰期确实显示肿瘤内FoxP3+Treg减少。在这个2个半衰期的时间点，我们还观察到肿瘤内效应CD8+T细胞的减少。然而重要的是，与未处理的基线和2个半衰期水平相比，在随后的3和4个半衰期时间点，我们观察到肿瘤内CD8+效应T细胞的增加，但肿瘤内Treg水平的进一步下降。该观察结果再次支持我们的假设，即使用TRT克服Treg介导的CIT以便在携带多个肿瘤的动物中挽救原位疫苗效应是可行的。

最后，为了表征TRT对肿瘤内免疫细胞的免疫作用，我们用¹³¹I-NM404处理携带B78的小鼠，并在预处理和之后的半衰期(8d)间隔收集肿瘤组织。然后通过RT-PCR分析这些组织的一组免疫特征的基因表达。结果表明单独TRT处理引起免疫易感性的肿瘤细胞标记物的表达和通常仅由免疫细胞表达的基因的显著变化，后者表现出明显的表达减少的时间过程，随后反弹为过度表达。

实施例7：在携带两个或更多个肿瘤的小鼠中使用来自实施例5和6的数据以开发¹³¹I-NM404+局部xRT+IT-mAb/IL2的方案并诱导T细胞介导的根除所有远处肿瘤的实验

该实施例说明了在至少2个位置处理携带肿瘤的动物。我们的策略涉及在原位疫苗部位使用xRT和局部IT-IC，与全身性TRT联合以抑制CIT，以在所有肿瘤部位获得增强的抗肿瘤免疫活性。TRT和xRT剂量和时间的关键问题将针对抗肿瘤效力进行优化。

使用实施例5和6中总结的数据，在携带2个单独的B78肿瘤的小鼠中进行研究。小鼠接受估计所需的全身性¹³¹I-NM404剂量，然后进行xRT和对原位疫苗位点的局部免疫疗法。通过适当的对照，该剂量的¹³¹I-NM404确实似乎减弱了CIT，如在具有2个肿瘤的小鼠中所期望的那样。此外，在具有一个肿瘤的小鼠中，该TRT剂量似乎不会干扰局部原位疫苗效应(如假设和期望的那样)。正在进行进一步的测试和一些实验变量的修改，以试图在不抑制原位疫苗效应的情况下最大化阻断CIT的所需效果。关于这些实验的更多细节在下面的实施例8中公开。

实施例8：来自携带两个或更多个肿瘤的小鼠的数据

在鼠黑色素瘤和胰腺肿瘤模型中远处未处理肿瘤导致局部xRT+IT-IC的组合的原发性肿瘤响应的肿瘤特异性抑制。

携带同源的GD2+原发性同侧肿瘤+/-对侧的继发性肿瘤的C57BL/6小鼠仅对原发性肿瘤进行处理，如所示的那样，在第1天用xRT和在第6-10天IT注射50mcg的抗-GD2IC，hu14.18-IL2。

在携带原发性B78黑色素瘤肿瘤的小鼠中，未处理的继发性B78肿瘤的存在拮抗了对xRT+IT-IC的原发性肿瘤的响应(图7A)。我们将这种效应描述为“伴随的免疫耐受”-未处理的远处肿瘤对处理的肿瘤对xRT+IT-IC的局部反应的拮抗作用。获得这些小鼠加上重复实验的Kaplan-Meier存活曲线(图7B)。由于原发性肿瘤进展，几乎所有小鼠都被安乐死。

在携带原发性Panc02-GD2+胰腺肿瘤的小鼠中，在相对侧有或没有继发性Panc02-GD2-肿瘤，未处理的Panc02继发性肿瘤的存在抑制了原发性Panc02-GD2+肿瘤对xRT+IT-IC的响应(图7C)。在携带原发性B78黑色素瘤肿瘤的小鼠中，继发性B78肿瘤抑制原发性肿瘤对xRT+IT-IC的响应，但是继发性Panc02-GD2+胰腺肿瘤未发挥这种作用(图7D)。在携带原发性Panc02-GD2+肿瘤的小鼠中，继发性Panc02-GD2-肿瘤抑制原发性肿瘤对组合的xRT和IT-hu14.18-IL2的响应，而B78继发性肿瘤未显示(图7E)。

通过调节性T细胞(Treg)的特定消耗来避免伴随的免疫耐受。

获得在具有一个或两个肿瘤的小鼠中xRT后第6天评估肿瘤的Treg标记物FoxP3的免疫组织化学图像(图8A)。小鼠不接受xRT或仅接受针对原发性肿瘤的xRT。DEREG小鼠在Treg特异性FoxP3启动子的控制下表达白喉毒素受体，在IP注射白喉毒素后能够特异性消耗Treg(图8B和8C)。携带原发性和继发性B78黑色素瘤肿瘤的DEREG小鼠用xRT+IT-IC处理至原发性肿瘤并IP注射白喉毒素或PBS。在这些小鼠中消耗Treg后消除了伴随的免疫耐受，导致改善的原发性(图8B)和继发性(图8C)肿瘤响应。

通过将xRT递送至两个肿瘤部位来克服伴随的免疫耐受。

在携带原发性和继发性B78肿瘤的小鼠中，继发性肿瘤抑制用xRT+IT-IC对原发性肿瘤处理的原发性肿瘤的响应。通过向原发性肿瘤和继发性肿瘤递送12Gy xRT以及向原发性肿瘤递送IT-IC可以克服这一点，从而导致重复实验中改善的原发性肿瘤响应(图9A)和改善的合计的动物存活(图9B)。

单独的低剂量xRT不会引发原位疫苗接种，但是当与原位疫苗位点的12Gy+IT-IC处理一起递送到远处肿瘤部位时确实克服了伴随的免疫耐受。

在仅携带原发性B78肿瘤的小鼠中，12Gy+IT-IC引发原位免疫接种(如前所示)并导致大多数小鼠完全肿瘤消退(图10A)和记忆免疫应答(Morris,Cancer Res,2016)。另一方面，在单独的IT-IC或低剂量(2Gy)xRT+IT-IC后，没有动物表现出完全的肿瘤消退(两组中均为0/6)p<0.05。

在携带原发性和继发性B78黑色素瘤肿瘤的小鼠中，递送至继发性肿瘤的低剂量xRT(2Gy或5Gy)在克服原发性肿瘤中伴随的免疫耐受的能力方面相当于12Gy(图10B)。在这些相同的动物中，显然通过向继发性肿瘤递送低剂量xRT克服伴随的免疫耐受挽救了对IT-IC免疫疗法的全身响应(图10C)。在这种情况下，当RT被递送到所有肿瘤部位时，然后原发性肿瘤的IT-IC注射引发全身性抗肿瘤效应，使得继发性肿瘤对2Gy或5Gy的响应大于在没有原发性肿瘤IT-IC注射的情况下对12Gy RT的响应。

具有¹³¹I-NM404的低剂量TRT有效消耗肿瘤浸润的FoxP3+Treg而没有全身性白细胞减少或肿瘤浸润性CD8+效应T细胞的消耗。

在大多数临床情况中，向所有肿瘤部位递送外部束(甚至低剂量)而不引起明显的骨髓耗竭和导致免疫抑制的白细胞减少是不可行的。在这里，我们测试了TRT是否可以全身给予以特异性消耗肿瘤浸润性抑制性免疫细胞(Treg)，而不会引发全身免疫细胞耗竭和白细胞减少。使用正电子发射的¹²⁴I-NM404在B78黑色素瘤肿瘤模型中进行放射量测定研究，证实NM404的肿瘤选择性摄取(图11A)。携带B78肿瘤的C57BL/6小鼠用60μCi¹³¹I-NM404处理。该活性近似于将～2Gy TRT递送至B78肿瘤所需的¹³¹I-NM404的量。在未处理的对照小鼠(C)中收集外周血和肿瘤样品，之后以8天的间隔(T1＝d8，T2＝d16，T3＝d24，T4＝d32)收集。该剂量的TRT不会导致任何显著的全身性白细胞减少(图11B)，并且不会显著影响肿瘤浸润性CD8+效应T细胞的水平(图11C)。然而，该剂量的TRT显著消耗了肿瘤浸润的FoxP3+Treg(图11D)。

具有¹³¹I-NM404的低剂量TRT有效地克服了伴随的免疫耐受并且挽救了原位疫苗接种的全身性抗肿瘤效果。

考虑到低剂量¹³¹I-NM404TRT在不使小鼠白细胞减少的情况下消耗肿瘤浸润性Treg的能力，我们测试了低剂量¹³¹I-NM404是否可以有效克服伴随的免疫耐受。如所示的那样，在第1天用60-μCi131I-NM404(NM404)处理携带两个B78肿瘤的C57BL/6小鼠。在一个半衰期(第8天)后，动物接受针对原发性肿瘤(原位疫苗部位)的12Gy xRT或不接受xRT。如所示的那样，未接受¹³¹I-NM404的对照小鼠处理继发性肿瘤(0,2或12Gy)。如所示的那样，在第13-17天，小鼠每天接受IT注射IC到原发性肿瘤(原位疫苗部位)。原发性肿瘤(图12A)和继发性肿瘤(图12B)响应表明，给予低剂量TRT有效地克服了伴随的免疫耐受并且挽救了原位接种疫苗的全身性抗肿瘤作用。

实施例的结论

这些实施例说明了一种新的从未测试或考虑过的抗癌策略，基于两种已知治疗方法的协同和广泛适用的组合：(1)靶向全身递送放射治疗(J.Weichert及其同事)，和(2)局部递送联合免疫疗法以诱导原位癌症疫苗(P.Sondel及其同事)。因为¹³¹I-NM404可以靶向几乎任何组织学的癌症，并且局部给予抗肿瘤mAb+IL2可以用于几乎任何癌症类型(因为肿瘤反应性mAb被批准或在几乎所有癌症组织学类型的临床测试中)，联合策略的临床转化可能会导致几乎所有高风险癌症的临床有效治疗。

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本领域的技术人员通过考虑说明书和实施本文所述的发明，将会明显看出本发明的其他实施方式和应用。基于任何原因在本文中引用的所有参考文献，包括所有的杂志文献和美国/外国专利和专利申请，都通过引用具体并全文纳入本文。应理解本发明并不限于本文说明和描述的具体试剂、制剂、反应条件等，但还包括在以下权利要求范围内的其修饰形式。

Claims

1.一种治疗对象中包括一个或多个恶性实体瘤的癌症的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)给予所述对象免疫调节剂量的放射性卤化化合物，其被恶性实体瘤组织特异地吸收并保留在恶性实体瘤组织内；和

(b)使用一种或多种能够刺激肿瘤微环境内的特异性免疫细胞的处理，在一个或多个恶性实体瘤中对对象进行原位肿瘤疫苗接种；

由此治疗对象中的癌症。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述一种或多种能够刺激肿瘤微环境内的特异性免疫细胞的处理包括用xRT治疗肿瘤。

3.如权利要求1所述的方法，其中，所述一种或多种能够刺激肿瘤微环境内的特异性免疫细胞的处理包括在至少一种恶性实体瘤中注射包含一种或多种能够刺激肿瘤微环境内的特异性免疫细胞的试剂的组合物。

4.如权利要求3所述的方法，其中，所述一种或多种能够刺激肿瘤微环境内的特异性免疫细胞的试剂选自：免疫刺激性mAb、模式识别受体激动剂、免疫刺激性细胞因子、免疫刺激性纳米颗粒、溶瘤病毒及其组合。

5.如权利要求2所述的方法，其中，所述免疫刺激性mAb选自：抗GD2抗体、抗CTLA-4抗体、抗CD137抗体、抗CD134抗体、抗PD-1抗体、抗KIR抗体、抗LAG-3抗体、抗PD-L1抗体、抗CD40抗体及其组合。

6.如权利要求4或5所述的方法，其中，所述免疫刺激性mAb是针对肿瘤特异性抗原的抗体。

7.如权利要求5或6所述的方法，其中，所述免疫刺激性mAb是抗GD2抗体。

8.如权利要求7所述的方法，其中，所述包含一种或多种能够刺激肿瘤微环境内的特异性免疫细胞的试剂的组合物还包含白细胞介素-2(IL-2)。

9.如权利要求5或6所述的方法，其中，所述抗GD2抗体包括hu14.18。

10.如权利要求7所述的方法，其中，所述组合物还包含IL-2。

11.如权利要求4所述的方法，其中，所述免疫刺激性细胞因子是IL-2，白细胞介素-15(IL-15)，白细胞介素-21(IL-21)白细胞介素-12(IL-12)或干扰素。

12.如权利要求11所述的方法，其中，所述免疫刺激性细胞因子是IL-2。

13.如权利要求4所述的方法，其中，所述模式识别受体激动剂是Toll样受体(TLR)的激动剂。

14.如权利要求13所述的方法，其中，所述TLR选自：TLR-1、TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-5、TLR-6、TLR-7、TLR-8、TLR-9和TLR-10。

15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中，所述放射性卤化化合物是间位碘代苄基胍(MIBG)，其中MIBG中的碘原子是放射性碘同位素。

16.如权利要求15所述的方法，其中，所述放射性碘同位素选自：¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I。

17.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中，所述放射性卤化化合物具有下式：

或其盐，其中：

R₁包括放射性卤素同位素，

a是0或1，

n是12至30的整数，

m是0或1，

Y选自：–H、–OH、-COOH、-COOX、–OX和–OCOX，其中X是烷基或芳基烷基，

R₂选自：-N⁺H₃、-N⁺H₂Z、-N⁺HZ₂和-N⁺Z₃，其中每个Z独立地是烷基或芳基。

18.如权利要求17所述的方法，其中，所述放射性卤素同位素是溴、碘或砹的放射性同位素。

19.如权利要求18所述的方法，其中，所述放射性卤素同位素选自：¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I和²¹¹As。

20.如权利要求18所述的方法，其中，所述放射性卤素同位素是放射性碘同位素。

21.如权利要求20所述的方法，其中，所述放射性碘同位素是¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I或¹³¹I。

22.如权利要求21所述的方法，其中，所述放射性碘同位素是¹³¹I。

23.如权利要求17-22中任一项所述的方法，其中，a是1，m是0。

24.如权利要求17-23中任一项所述的方法，其中，n是18。

25.如权利要求17-24中任一项所述的方法，其中，R₂是-N⁺H₃。

26.如权利要求17-25中任一项所述的方法，其中，a是1，m是0，n是18并且R₂是-N⁺H₃。

27.如权利要求26所述的方法，其中，所述放射性卤素同位素是¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I或¹³¹I(化合物是[¹²³I]-NM404、[¹²⁴I]-NM404、[¹²⁵I]-NM404或[¹³¹I]-NM404)。

28.如权利要求23所述的方法，其中，所述放射性卤素同位素是¹³¹I(化合物是[¹³¹I]-NM404)。

29.如权利要求1-28中任一项所述的方法，其中，所述放射性卤化化合物静脉内给予。

30.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中，所述对象是人。

31.如权利要求1-30中任一项所述的方法，还包括使一种恶性实体瘤暴露于xRT。

32.如权利要求1-31中任一项所述的方法，还包括确定放射性卤化化合物的免疫调节剂量的步骤。

33.如权利要求32所述的方法，其中，所述确定放射性卤化化合物的免疫调节剂量的步骤包括给予对象检测促进剂量的如权利要求15或17所述的放射性卤化化合物，并随后检测源自对象内一个或多个恶性实体瘤的表征放射性卤化化合物内放射性卤素同位素的信号。

34.如权利要求33所述的方法，其中，所述放射性卤化化合物的免疫调节剂量通过源自对象内一个或多个恶性实体瘤的信号的强度进行计算。

35.如权利要求33或34所述的方法，其中，所述检测表征放射性碘卤素的信号的步骤通过正电子发射断层扫描(PET)成像或单光子发射计算机断层扫描(SPECT)成像来执行。

36.如权利要求33-34中任一项所述的方法，其中，以检测促进剂量使用的所述放射性卤化化合物中包含的放射性卤素同位素选自：²¹¹As、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I和¹³¹I。

37.如权利要求36所述的方法，其中，以检测促进剂量使用的所述放射性卤化化合物中包含的放射性卤素同位素是¹²⁴I。

38.如权利要求37所述的方法，其中，以检测促进剂量使用的放射性卤化化合物是[¹²⁴I]-NM404。

39.如权利要求1-38中任一项所述的方法、其中、治疗的癌症选自：黑色素瘤、神经母细胞瘤、肺癌、肾上腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌、皮下癌、皮肤或头颈部鳞状细胞癌、肠癌、视网膜母细胞瘤、宫颈癌、胶质瘤、乳腺癌、胰腺癌、软组织肉瘤、尤因肉瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、视网膜母细胞瘤、肾母细胞瘤和小儿脑肿瘤。