UA125614C2

UA125614C2 - Комбінована терапія для лікування або профілактики пухлин

Info

Publication number: UA125614C2
Application number: UAA201910449A
Authority: UA
Inventors: Паул Уорен Реддел; Джейсон Кінґслі Каллен; Джейсон Кингсли Каллен; Ґлен Метью Бойль; Глен Мэтью Бойль; Пітер Ґордон Парсонс; Питер Гордон Парсонс; Вікторія Енн Ґордон; Виктория Энн Гордон
Original assignee: Кьюбіотікс Пті Лтд; Кьюбиотикс Пти Лтд
Priority date: 2017-03-23
Filing date: 2018-03-23
Publication date: 2022-05-04
Also published as: LT3600281T; DK3600281T3; IL269522B1; KR20190126431A; JP6905075B2; NZ756754A; US11213506B2; FI3600281T3; IL269522A; EA201992220A1; AU2018238202B2; SI3600281T1; MY197427A; PL3600281T3; CN110461324A; JP2020511512A; AU2018238202A8; IL269522B2; MX2019011221A; CA3056685C

Abstract

Даний винахід стосується способу лікування пухлини, який включає введення суб'єктові, який цього потребує, епокситигліанової сполуки й інгібітора контрольної точки імунітету, причому вказану епокситигліанову сполуку вводять локально в пухлину, де епокситигліанові сполуки є сполуками формули (II), інгібітором контрольної точки імунітету є антитіло антирецептор запрограмованої загибелі 1 (PD-1) або антитіло антицитотоксичний Т-лімфоцитасоційований білок 4 (CTLA-4), де пухлина є пухлиною, що має вроджену чи набуту резистентність до монотерапії з інгібіторами контрольних точок імунітету.

Description

Даний винахід відноситься до комбінованої терапії пухлин, яка включає введення епокситигліанової сполуки й інгібітора контрольної точки імунітету. Також описуються фармацевтичні композиції й набори, які містять епокситигліанові сполуки й інгібітори контрольних точок імунітету.

Передумови створення винаходу

Епокситиглієнонові сполуки мають сильну протипухлинну активність. При введенні інтратуморально епокситиглієнони ініціюють швидкий геморагічний некроз пухлинної маси шляхом прямого руйнування судинної мережі пухлини (Воуїе еї аї!., 2014). На сьогоднішній день немає даних, що локалізоване введення епокситиглієнонових сполук виявляє системну дію на сторонні або більш віддалені пухлини, і вважається, що доставлені в пухлину епокситиглієнонові сполуки впливають, головним чином, у місці обробки. Як наслідок, кожна пухлина підлягає індивідуальному лікуванню.

Різні види імунотерапії для лікування раку одержали широке визнання в клінічній практиці.

Зокрема, була показана перспективність інгібіторів контрольних точок імунітету (ІСІ) при ряді злоякісних новоутворень, включаючи метастатичну меланому пізніх стадій, недрібноклітинний рак легенів, рак нирок, рак сечового міхура й ходжкінську лімфому. ІСІ є молекулами (як правило, моноклональними антитілами), які блокують дію білків, які дозволяють пухлинним клітинам не піддаватися, пригнічувати або чинити спротив імунній системі хазяїна, особливо Т- клітинам, які є специфічними для пухлинних антигенів. Схвалені в цей час Т-клітинні інгібітори контрольних точок підсилюють протипухлинну імунну відповідь через зовсім інші механізми дії.

Наприклад, блокада цитотоксичного Т-лімфоцитасоційованого антигену 4 (СТІ А4) переважно підсилює Т-клітинну активацію під час першої фази імунної відповіді, у той час як виявляється, що блокада білка запрограмованої загибелі клітин 1 (РОТ) вивільняє виснажені, але в інших відносинах активовані популяції ефекторних Т-клітин і знижує функцію регуляторних Т-клітин (Ттед).

Хоча ІСІ можуть забезпечити помітну й тривалу реакцію в пацієнтів з раком пізніх стадій, такі позитивні реакції обмежені невеликою частиною від загальної популяції пацієнтів (Ни-І іеєзКомап еї аїІ., 2017). Тому підходи, які комбінують ІСІ з іншими видами лікування (наприклад, променевою терапією, онколітичними вірусами, протираковими вакцинами), які можуть стимулювати імунну відповідь хазяїна, представляють привабливий і клінічно здійсненний підхід для подолання вродженої й придбаної резистентності до протиракової імунотерапії й потенційно поширюють клінічний успіх на більш широке коло пацієнтів (Зіпуїй еї аї., 2015).

Одним з таких підходів є комбінування ІСІ з низькомолекулярними хіміотерапевтичними засобами (що доставляються системно або інтратуморально), які можуть модулювати імунні відгуки шляхом (1) зменшення загального пухлинного навантаження, (2) потенціювання протипухлинної відповіді шляхом прояву несоантигена під час некрозу пухлини й/або (3) прямого впливу на стромальні клітини пухлини (Адатв еї аї!., 2015; Мапопеу еї аї., 2015; О'Вгієп еї аї., 2014).

Даний винахід щонайменше частково заснований на виявленому авторами факті, що деякі похідні епокситиглієн-3-ону можуть стимулювати імунну відповідь, яка може синергічно взаємодіяти із блокадою контрольних точок імунітету, забезпечуючи терапію не тільки для тієї пухлини, яка зазнає лікування, але також і для інших пухлин, які можуть бути присутніми. у суб'єкта, що одержує лікування.

Сутність винаходу

В одному аспекті даний винахід відноситься до способу лікування щонайменше однієї пухлини в суб'єкта, що включає введення суб'єктові епокситигліанової сполуки або її фармацевтично прийнятної солі й інгібітора контрольної точки імунітету.

В іншому аспекті даний винахід відноситься до способу лікування або попередження сторонньої (від англ. "Ббузіапаег") пухлини в суб'єкта, що включає введення суб'єктові, який цього потребує, епокситигліанової сполуки або її фармацевтично прийнятної солі й інгібітора контрольної точки імунітету, причому зазначену епокситигліанову сполуку вводять локально в пухлину, яка відрізняється від сторонньої пухлини.

В іншому аспекті винахід відноситься до застосування епокситигліанової сполуки або її фармацевтично прийнятної солі й інгібітора контрольної точки імунітету у виробництві лікарського засобу для лікування пухлини.

У ще одному аспекті винахід відноситься до застосування епокситигліанової сполуки або її фармацевтично прийнятної солі у виробництві лікарського засобу для лікування пухлини, причому зазначений лікарський засіб є засобом, призначеним для введення в комбінації з інгібітором контрольної точки імунітету.

В іншому аспекті винахід відноситься до застосування інгібітора контрольної точки імунітету у виробництві лікарського засобу для лікування пухлини, причому зазначений лікарський засіб є засобом, призначеним для введення в комбінації з епокситиглаановою сполукою або її фармацевтично прийнятною сіллю.

В іншому аспекті винахід відноситься до застосування епокситигліанової сполуки або її фармацевтично прийнятної солі й інгібітора контрольної точки імунітету у виробництві лікарського засобу для лікування або попередження сторонньої пухлини.

У ще одному аспекті винахід відноситься до застосування епокситигліанової сполуки або її фармацевтично прийнятної солі у виробництві лікарського засобу для лікування або попередження сторонньої пухлини, причому зазначений лікарський засіб є засобом, призначеним для введення в комбінації з інгібітором контрольної точки імунітету.

В іншому аспекті даний винахід відноситься до застосування інгібітора контрольної точки імунітету у виробництві лікарського засобу для лікування або попередження сторонньої пухлини, причому зазначений лікарський засіб є засобом, призначеним для введення в комбінації з епокситигліановою сполукою або її фармацевтично прийнятною сіллю.

У ще одному аспекті винахід відноситься до епокситигліанової сполуки або її фармацевтично прийнятної солі в комбінації з інгібітором контрольної точки імунітету для лікування пухлини або лікування або попередження сторонньої пухлини.

В іншому аспекті даний винахід відноситься до фармацевтичної композиції, яка включає епокситигліанову сполуку або її фармацевтично прийнятну сіль і інгібітор контрольної точки імунітету, необов'язково разом з одним або декількома фармацевтично прийнятними носіями.

В іншому аспекті даний винахід відноситься до набору, що включає епокситигліанову сполуку або її фармацевтично прийнятну сіль і інгібітор контрольної точки імунітету.

Докладний опис винаходу

Визначення

Якщо не зазначене інше, усі технічні й наукові терміни, використовувані в даному описі, мають такі значення, які їм зазвичай надають фахівці в даній області техніки, до якої відноситься винахід. Хоча на практиці або при тестуванні даного винаходу можна використовувати будь-які методи й матеріали, схожі або еквівалентні описаним у цьому описі, у даному документі наведені кращі методи й матеріали. Нижче приводяться визначення деяких термінів для цілей даного винаходу.

Артиклі "а" ї "ап" використовуються в даному описі стосовно до одного або більше, ніж одного (тобто до щонайменше одного) граматичного об'єкта. Як приклад, "елемент" ("ап еіетепі") означає один елемент або більше, ніж один елемент.

Використовуваний у даному описі термін "приблизно" відноситься до частини, рівня, величини, виміру, розміру або кількості, яка може варіюватися, наприклад, на 30 95, 25 95, 20 9, 15 95 або 10 95 від зазначеної частини, рівня, величини, виміру, розміру або кількості.

У всьому даному описі, якщо контекст не вимагає іншого, слова "включати", "включає" або «, що включає" слід розуміти, як включення зазначеної стадії або елемента або групи стадій або елементів, але без винятку будь-якої іншої стадії або елемента або групи стадій або елементів.

Термін "алкіл" відноситься до необов'язково заміщених лінійних і розгалужених вуглеводневих груп з 1-20 атомами вуглецю. Де доречно, алкільна група може мати певне число атомів вуглецю, наприклад, -С1-Св-алкіл, який включає алкільні групи, які мають 1, 2, 3, 4, 5 або б атомів вуглецю в лінійній або розгалуженій конфігурації. Необмежуючі приклади алкільних груп включають метил, етил, пропіл, ізопропіл, бутил, втор- і трет-бутил, пентил, 2- метилбутил, З-метилбутил, гексил, 2-метилпентил, З-метилпентил, 4-метилпентил, 2-етилбутил,

З-етилбутил, гептил, октил, ноніл, децил, ундецил, додецил, тридецил, тетрадецил і пентадецил.

Термін "алкеніл" відноситься до необов'язково заміщених ненасичених лінійних і розгалужених вуглеводнів з 2-20 атомами вуглецю, які мають щонайменше один подвійний зв'язок. Де доречно, алкенільна група може мати певне число атомів вуглецю, наприклад С2-Св- алкеніл, який включає алкенільні групи, які мають 2, 3, 4, 5 або 6 атомів вуглецю в лінійному або розгалуженому розташуванні. Необмежуючі приклади алкенільних груп включають етеніл, пропеніл, ізопропеніл, бутеніл, втор- і трет-бутеніл, пентеніл, гексеніл, гепт-1,3-дієн, гекс-1,3- дієн, нон-1,3,5-триєн і т.п.

Термін "алкиніл" відноситься до необов'язково заміщених ненасичених лінійних і розгалужених вуглеводнів з 2-20 атомами вуглецю, які мають щонайменше один потрійний зв'язок. У відповідному випадку алкинільна група може мати певне число атомів вуглецю, наприклад Сг2-Св-алкиніл, який включає алкинільні групи, які мають 2, 3, 4, 5 або 6 атомів вуглецю в лінійній або розгалуженій конфігурації. Необмежуючі приклади включають етиніл, пропиніл, бутиніл, пентиніл і гексиніл.

Терміни "циклоалкіл" і "карбоциклічний" відносяться до необов'язково заміщених насичених або ненасичених моноциклічних, біциклічних або трициклічних вуглеводневих груп. Де доречно, циклоалкільна група може мати певне число атомів вуглецю, наприклад С2-Св-циклоалкіл " карбоциклічною групою з 3, 4, 5 або б атомами вуглецю. Необмежуючі приклади можуть включати циклопропіл, циклобутил, циклопентил, циклопентеніл, циклогексил, циклогексеніл, циклогексадиеніл і т.п. "Арил" означає Св-Сі4---ленну моноциклічну, біциклічну або трициклічну карбоциклічну систему, яка має до 7 атомів у кожному циклі, причому щонайменше один цикл є ароматичним.

Приклади арильних груп включають (без обмеження) феніл, нафтил, тетрагідронафтил, інданіл і біфеніл. Арил може включати 1-3 бензольних цикли. Якщо присутні два або більше ароматичних циклів, ці цикли можуть бути конденсовані, так що сусідні цикли мають загальний зв'язок.

Кожний алкіл, алкеніл, алкиніл, циклоалкіл або арил, незалежно від того, чи є він окремою сутністю або частиною більшої сутності, необов'язково може бути заміщено одним або декількома необов'язковими замісниками, обраними із групи, яка включає Сі-в-алкіл, Сг2-в- алкеніл, Сз-є-циклоалкіл, оксо (50), -ОН, -5Н, Сі-в-алкіл-О-, Сг-в-алкеніл-О-, Сз-є-циклоалкіл-О-,

Сі-в-алкіл-5-, Сг--алкеніл-5-, Сз-є-циклоалкіл-5-, -СО2Н, -СО2С.і-в-алкіл, -МН», -МН(Сі-в-алкіл), -

М(Сз-в-алкіл)», -МН(феніл), -М(феніл)г, -СМ, -МО», -галоген, -СЕз, -ОСЕз, -ЗСЕз, -«СНЕ», -ОСНЕ», -

ЗСНЕ», -феніл, -С1-в-алкілфеніл, -О-Феніл, -С(О)-феніл, -С(О)С:-в-алкіл. Приклади придатних замісників включають (без обмеження) метил, етил, пропіл, ізопропіл, бутил, втор-бутил, трет- бутил, вініл, метокси, етокси, пропокси, ізопропокси, бутокси, метилтіо, етилтіо, пропілтіо, ізопропілтіо, бутилтіо, гідрокси, гідроксиметил, гідроксиетил, гідроксипропіл, гідроксибутил, фтор, хлор, бром, йод, ціано, нітро, -«СО2Н, -СО2СНз, -С(О)СНз, трифторметил, трифторметокси, трифторметилтіо, дифторметил, дифторметокси, дифторметилтіо, морфоліно, аміно, метиламіно, диметиламіно, феніл, фенокси, фенілкарбоніл, бензил і ацетил.

Епокситигліанові сполуки можуть перебувати у формі фармацевтично прийнятних солей.

Однак слід мати на увазі, що фармацевтично неприйнятні солі також входять в обсяг винаходу, тому що вони можуть використовуватися в якості проміжних сполук для одержання фармацевтично прийнятних солей або можуть використовуватися під час зберігання або транспортування. Придатні фармацевтично прийнятні солі включають (без обмеження) солі фармацевтично прийнятних неорганічних кислот, таких як хлороводнева, сірчана, фосфорна, азотна, вугільна, борна, сульфамова й бромоводнева кислоти, або солей фармацевтично прийнятних органічних кислот, таких як оцтова, пропіонова, масляна, винна, малеїнова, гідроксималеїнова, фумарова, лимонна, молочна, слизева, глюконова, бензойна, бурштинова, щавлева, фенілоцтова, метансульфонова, толуолсульфонова, бензолсульфонова, саліцилова, сульфанільна, аспарагінова, глутамова, едетова, стеаринова, пальмітинова, олеїнова, лаурилова, пантотенова, дубильна, аскорбінова й валеріанова кислоти.

Солі основ включають (без обмеження) солі, утворені з фармацевтично прийнятними катіонами, такими як натрій, калій, літій, кальцій, магній, амоній і алкіламоній.

Основні азотовмісні групи можуть бути кватернізовані такими агентами, як нижчий алкілгалогенід, такий як метил-, етил-, пропіл- і бутилхлориди, -броміди й -йодиди, диалкілсульфати, подібні диметил- і диетилсульфату, і іншими.

Також слід мати на увазі, що епокситигліанові сполуки можуть мати асиметричні центри й тому здатні існувати в більш, ніж одній стереоізомерній формі. Таким чином, винахід також відноситься до сполук у по суті чистій ізомерній формі за одним або декількома асиметричними центрами, наприклад з більш приблизно 90 95 еї, таким як приблизно 95 95 або 97 95 еві або понад 99 95 вії, а також у вигляді сумішей, включаючи їх рацемічні суміші. Такі ізомери можна одержати виділенням із природних джерел, асиметричним синтезом, наприклад з використанням хіральних проміжних сполук, або шляхом хірального розщеплення. Сполуки за винаходом можуть існувати у вигляді геометричних ізомерів. Винахід також відноситься до сполук у по суті чистих цис (7) або транс (Е) формах або їх сумішах.

Сполуки за даним винаходом можна одержати шляхом виділення з рослини або частини рослини або шляхом дериватизації виділеної сполуки або шляхом дериватизації споріднених сполук. Процедури виділення й процедури дериватизації можна знайти в УМО 2007/070985 і УМО 2014/169356.

Термін "епокситигліанова сполука" відноситься до сполуки, яка має наступну основну вуглецеву циклічну структуру: (516)

1 13 ох; кі 14 у 7

З о

Ці сполуки мають трицикло/9.3.0.0|гтетрадеканову систему з конденсованим циклопропановим циклом, прикріпленим до шестичленного циклу. Епоксид конденсований із 5 семичленним циклом у положенні 6, 7.

Одним прикладом епокситигліанової сполуки є епокситиглієн-3-онова сполуки. Термін "епокситиглієн-3-онова сполука" відноситься до сполуки, яка має епокситигліанову структуру, зазначену вище, де п'ятичленний цикл має 1,2-ен-3-онову структуру: 1172 з вів ві 2 у 7 (в) | є! 10 .

Використовуваний у даному описі термін "стороння пухлина" відноситься до пухлини відмінної від тієї пухлини, яку лікують епокситигліаановою сполукою. Стороння пухлина може бути первинною пухлиною або метастатичною пухлиною.

Термін "у комбінації 3", використовуваний у даному винаході, відноситься до епокситигліанової сполуки й ІСІ, що вводяться в єдиній композиції або окремо, або одночасно, або послідовно. Епокситигліанову сполуку й ІСІ можна вводити в різний час і з різною частотою, але в комбінації вони проявляють біологічну дію в той самий час або в проміжки часу, що перекриваються. Наприклад, ІСІ уводять так, щоб він виявляв дію на імунну відповідь, коли вводять епокситигліанову сполуку.

Способи лікування

Даний винахід відноситься до способів лікування пухлин, включаючи сторонні пухлини, причому цей спосіб включає введення епокситигліанової сполуки або її фармацевтично прийнятної солі в комбінації з інгібітором контрольної точки імунітету (ІСІ). Винахід також відноситься до способів попередження сторонніх пухлин, які включають уведення епокситигліанової сполуки або її фармацевтично прийнятної солі в комбінації з ІСІ.

У деяких варіантах здійснення пухлина, яку лікують, є пухлиною, у яку епокситигліанова сполука може бути доставлена локалізованим чином безпосередньо в пухлину. В окремих варіантах здійснення пухлина є пухлиною шкіри або підшкірною пухлиною або пухлиною, яка

Зо доступна із зовнішньої сторони тіла, наприклад пухлина, яка пальпується. В інших варіантах здійснення пухлина є внутрішньою пухлиною. У деяких варіантах здійснення, де пухлина розташована усередині, локалізована доставка досягається під час операції, коли пухлина оголена, і можна ін'єктувати епокситигліанову сполуку. В інших варіантах здійснення пухлина розташована усередині, і епокситигліанова сполука доставляється за допомогою ін'єкції, супроводжуваної використанням методу візуалізації, наприклад, ендоскопічного ультразвукового дослідження або стереотаксичної візуалізації.

У деяких варіантах здійснення епокситигліанова сполука доставляється системно в одну або кілька пухлин.

У деяких варіантах здійснення пухлина є доброякісною пухлиною. В інших варіантах здійснення пухлина є злоякісною пухлиною. У деяких варіантах здійснення пухлина є первинною пухлиною, і в інших варіантах здійснення пухлина є метастатичною пухлиною.

Приклади шкірних пухлин включають себорейний кератоз, актинічний кератоз, базальноклітинну карциному (ВСС), включаючи нодулярну ВСС, поверхневу ВСС, інфільтруючу ВСС й мікронодулярну ВСС, плоскоклітинну карциному, включаючи плоскоклітинну карциному іп-5йи й інвазивну плоскоклітинну карциному, меланому, включаючи меланому, що поверхнево розповсюджується, нодулярну меланому, меланому типу злоякісного лентиго (Іі диспластичну/нейротропну меланому, підшкірну В-клітинну лімфому і підшкірну Т-клітинну лімфому. Приклади підшкірних пухлин включають ангіокератому, піогенну гранулему, сенільну гемангіому, гломусну пухлину, ангіосаркому, саркому Капоши, саркому Юінга, злоякісну фіброзну гістіоцитому, лейоміосаркому, рабдоміосаркому, ліпосаркому, синовіальну саркому, стромальну саркому, гастроінтестинальну стромальну саркому, злоякісну пухлину периферичного периневрію, приметильну нейроектодермальну пухлину, нейрофіброму, карциному із клітин Меркеля, дерматофіброму, фібросаркому, епітеліоїдну саркому й мастоцитому (тучноклітинну пухлину).

Внутрішня пухлина може бути будь-якою пухлиною, яка доступна для ін'єкції під час операції або скерованої ін'єкції, або пухлиною, яку можна лікувати системно введенням епокситигліана, і включає пухлини головного мозку, легенів, товстої кишки, епідермоїда, плоскоклітинні, сечового міхура, шлунка, підшлункової залози, молочної залози, голови, шиї, ниркової системи, нирок, печінки, яєчників, передміхурової залози, матки, стравоходу, яєчка, шейки матки, піхви, щитовидної залози або шкіри.

Стороння пухлина може бути будь-якою пухлиною, відмінною від пухлини, яку лікують епокситигліаановою сполукою. Наприклад, стороння пухлина може бути другою пухлиною шкіри або підшкірною пухлиною, або вона може бути пухлиною іншого органа або тканини. Приклади сторонніх пухлин включають пухлини головного мозку, легенів, товстої кишки, епідермоїда, плоскоклітинні, сечового міхура, шлунка, підшлункової залози, молочної залози, голови, шиї, ниркової системи, нирок, печінки, яєчників, передміхурової залози, матки, стравоходу, яєчка, шейки матки, піхви, щитовидної залози або шкіри.

У деяких варіантах здійснення стороння пухлина є іншою первинною пухлиною, а в інших варіантах здійснення стороння пухлина є метастатичною пухлиною.

У деяких варіантах здійснення пухлина, яку лікують епокситигліаановою сполукою, є первинною пухлиною, а стороння пухлина є метастатичною пухлиною. У деяких варіантах здійснення пухлина, яку лікують епокситигліановою сполукою, є метастатичною пухлиною, а стороння пухлина є первинною пухлиною. У деяких варіантах здійснення як пухлина, яку лікують епокситигліановою сполукою, так і стороння пухлина є первинними пухлинами. У деяких варіантах здійснення як пухлина, яку лікують епокситигліаановою сполукою, так і стороння пухлина є метастатичними пухлинами.

Зо У деяких варіантах здійснення комбінована терапія попереджає появу сторонньої пухлини або затримує появу сторонньої пухлини. У деяких варіантах здійснення комбінована терапія зменшує розмір сторонньої пухлини.

Епокситигліанові сполуки

У деяких варіантах здійснення епокситигліанова сполука є 6,7-епокситигліанова сполука. У деяких варіантах здійснення епокситигліанова сполука є епоксиглі-1,2-ен-3-онова сполука. У деяких варіантах здійснення епокситигліанова сполука є 6,7-епокситиглі-1,2-ен-3-онова сполука.

У деяких варіантах здійснення епокситигліанова сполука є сполука формули (І) но

Ві Кз нн ва «А

Кв ди н

Го! н но (о)

Нв, отв (), або її геометричний ізомер або стереоїзомер або фармацевтично прийнятна сіль, де в зазначеній формулі

ВА: є водень або Сі..в-алкіл;

Вег є -ОН або -ОН5;

Вз є -ОН або -ОВ5;

Ва і К5 вибирають незалежно з водню й Сз-в-алкілу;

Ве є водень або -Н:о;

В; є гідрокси або -ОВ:о;

Ве є водень або Сі..в-алкіл;

або алкиніл алкеніл алкіл о о --(0С ідалкил--2-- В , -«5(0)Со 1валкенил «2-84 или о, --(0)С здалкинил---Бч1 :

Ве є -Сі.го-алкіл, -С2-го-алкеніл, -С2-го-алкиніл, -С(О)Сі-го-алкіл, -С(О)Сг-го-алкеніл, -С(О)Сег-2о- алкиніл, -С(О)-циклоалкіл, -С(О)С:-1о-алкілциклоалкіл;. -С(О)С2-іо-алкенілциклоалкіл, -С(О)Сг-10- алкинілциклоалкіл, -С(О)-арил, -С(О)С:і-о-алкіларил, -С(О)Сг-о-алкеніларил, /-С(О)Сг2-1о- алкиніларил, -С(О)Сі-о-алкіл-С(СО)К и, -С(О)Сг2-о-алкеніл-С(О)Кч:, -С(О)Сг2-ло-алкиніл-С(О)К чи, -

С(О)Сі-ло-алкіл-СН(ОК ОВ), -С(О0)С2-о-алкеніл-СН(ОК ОВ), -С(О)Сг-1о-алкиніл- сн(ОК ОВ), -С(О)Сі-о-алкіл-ЗВ и, -С(О)Сг-1о-алкеніл-ЗВ11, -С(О)Сг-ло-алкиніл-ЗА11, -С(О)С- то-алкіл-С(О)ОК и, -С(О)Сг-о-алкеніл-«С(О)ОК:, -С(О)Сг-о-алкиніл-«С(О)ОК 1, -С(О)Сч-о-алкіл- 15. С(ФО)5Е 1, -Ф(О)Сг2-іо-алкеніл-С(О)5Вч1, -С(О)Сг-о-алкиніл-С(О)5В 1, алкіл алкиніл або

Во є -Сі-в-алкіл, -Сгв-алкеніл, -Сг-в-алкиніл, -С(О)Сі-в-алкіл, -С(О)Сг-в-алкеніл, -С(О)Сг-6- алкиніл, -С(0)-арил, -С(О) С: -в-алкіларил, -С(О)Сг-в-алкеніларил, -С(О)Сг-в-алкиніларил; і

Ві: є водень, -С:-іо-алкіл, -Сг-о-алкеніл, -Сг-о-алкиніл, циклоалкіл або арил; причому кожна алкільна, алкенільна, алкинільна, циклоалкільна або арильна група є необов'язково заміщеною.

У деяких варіантах здійснення епокситигліанова сполука формули (І) є сполукою формули (1)

Ото нс й Око н Нн Ф СНз н р, нс

Се н о н но (в)

Н в, оре (1)

Зо або її геометричний ізомер або стереоїзомер або фармацевтично прийнятну сіль, де в зазначеній формулі Кв, Н»; і Ке мають значення, зазначені для формули (1).

В окремих варіантах здійснення формул (І) або (ІІ) застосовно одне або кілька визначень із наступних:

Ві є -С З-алкіл, зокрема -СНз;

Аг є -ОС(О)Сі-го-алкіл, -ОС(О)С2-го-алкеніл, -ОС(О)С2-го-алкиніл, -ОС(О)циклоалкіл, -

ОС(О)Сі-іо-алкілциклоалкіл;. -ОС(О)С2-іо-алкенілциклоалкіл, 0 -ОС(О)Сг2-о-алкинілциклоалкіл, -

ОС(О)арил, -ОС(О)С.-1о-алкіларил, -ОС(О)Сг-іо-алкеніларил, -ОС(О)Сг-іо-алкиніларил, -ОС(О)С:- то-алкіл-С(О)Кч:ї, -ОС(О)Сг-о-алкеніл-С(О)Кч:ї, -ОС(О)Сг-о-алкиніл-С(О)К::ї, -ОС(О)Сз-о-алкіл-

СнН(ОКИуО1), -ОФ(О)Сг-іо-алкеніл-«СН(ОК ХО Ви1), / -ОС(О)Сг-ло-алкиніл-СН(ОК ХО), С-

ОС(О)Сі-ло-алкіл-5Аії, -ОС(О)Сг2-1іо-алкеніл-ЗАНії, -ОС(О)С2-о-алкиніл-ЗАВі:ї, -ОС(О)Сі-1іо-алкіл-

С(ООК и, -ОС(О)Сг-о-алкеніл-«С(О)ОК и, /--ОС(О)Сг2г-ло-алкиніл-«С(О)ОК и, /-ОС(О)Сі-1о-алкіл-

С(О)5 1, -ОС(О)Сг2-1о-алкеніл-«С(О)5Кії або -ОС(О)С2-іо-алкиніліліл-С(О)5К 1; особливо -

ОС(О)Сі-го-алкіл,8 -ОС(О)С2-го-алкеніл,8 -ОС(О)С2-го-алкиніл, -ОС(О)циклоалкіл, -ОС(О)Сч-10- алкілциклоалкіл; -ОС(О)С2-1о-алкенілциклоалкіл, -ОС(О)Сг-іо-алкинілциклоалкіл або -ОС(О)арил; особливо -ОС(О) С: -го-алкіл, -ОС(О)Сг2-го-алкеніл або -ОС(О)Сг-го-алкиніл;

Аз є -ОС(О)Сі-го-алкіл, -ОС(О)С2-го-алкеніл, -ОС(О)С2-го-алкиніл, -ОС(О)циклоалкіл, - ОС(О)Сі-ло-алкілциклоалкіл; -ОС(О)С»2-1о-алкенілциклоалкіл, 0 -ОС(О)С2-іо-алкинілциклоалкіл, -

ОС(О)Сі-іо-алкіл-ЗНії, -ОС(О)Сг-о-алкеніл-З5Нії, -ОС(О)Сг2-1іо-алкиніл-ЗАії, -ОС(О)Сч-о-алкіл-

Ф(ФО)ОКи, -ОС(О)Сгло-алкеніл-С(О)ОК::ї, /-ОС(О)Сг2-1о-алкиніл-С(О)ОК:ї, /-ОС(О)Сз-о-алкіл-

С(0)51, -ОС(О)Сг-1іо-алкеніл-С(О)5ЕК її або -ОС(О)Сг-1іо-алкиніл-С(О)5АК чи; особливо -ОС(О)С.- го-алкіл, -ОС(О)Сг го-алкеніл, -ОС(О)Сг-го-алкиніл, -ОС(О)циклоалкіл, -ОС(О)Сі-о- алкілциклоалкіл; -ОС(О)С2-1о-алкенілциклоалкіл, -ОС(О)Сг-іо-алкинілциклоалкіл або -ОС(О)арил; особливо -ОС(О) С: -го-алкіл, -ОС(О)Сг2-го-алкеніл або -ОС(О)Сг-го-алкиніл;

Ва і Е5 обирають незалежно з -С.1-з-алкілу, зокрема-СНз;

Ав є водень, -С(О)Сі-в-алкіл, -С(О)Сг2-в-алкеніл, -С(О)Сг2-в-алкиніл або -С(О)-арил; особливо водень, -С(О)Сі-з-алкіл, -С(О)С2-з-алкеніл або -С(О)С2-з-алкиніл, особливо водень або -

С(О)СН.;

А; є гідроксил, -ОС(О)Сі-в-алкіл, -ОС(О)Сг-в-алкеніл або -ОС(О)Сг-в-алкиніл, особливо гідроксил, -ОС(О)Сі-з-алкіл, -ОС(О)С2-з-алкеніл або -ОС(О)Сг-з-алкиніл, особливо гідроксил або -(О)СН:.;і

Вв є -С:-з-алкіл, зокрема -СНвз.

У деяких варіантах здійснення сполуки формул (І) і/або (ІІ) мають стереохімію, як показано нижче у формулі (ІП):

Не 3 " Аз

Н Нн г Кк нН

Рв Е р, н о н но (в)

Н в,

ОН (1).

У деяких варіантах здійснення епоксид у положенні 6,7 перебуває над площиною циклічної системи. В інших варіантах здійснення епоксид у положенні 6,7 перебуває під площиною

Зо циклічної системи. У деяких варіантах здійснення група Ко у положенні 12 є 5, а в інших варіантах здійснення група К»г у положенні 12 є К.

В окремих варіантах здійснення епокситигліанову сполуку обирають із групи, яка включає 12-тиглоїл-13-(2-метилбутаноїл)-6,7-епокси-4,5,9,12,13,20-гексагідрокси-1-тиглієн-3-он (сполука 1); 12,13-ди(2-метилбутаноїл)-6,7-епокси-4,5,9,12,13,20-гексагідрокси-1-тиглієн-3-он (сполука 2); 12-гексаноїл-13-(2-метилбутаноїл)-6,7-епокси-4,5,9,12,13,20-гексагідрокси-1-тиглієн-3-он (сполука 3); 12,13-дигексаноїл-6,7-епокси-4,5,9,12,13,20-гексагідрокси-1-тиглієн-3-он (сполука 4); 12-міристоїл-13-(2-метилбутаноїл)-6,7-епокси-4,5,9,12,13,20-гексагідрокси-1-тиглієн-3-он (сполука 5); 12-тиглоїл-13-(2-метилбутаноїл)-6,7-епокси-4,5,9,12,13-пентагідрокси-20-ацетилокси-1- тиглієн-3-он (сполука 6); 12-міристоїл-13-ацетилокси-6, 7-епокси-4,5,9,12,13,20-гексагідрокси-1-тиглієн-3-он (сполука 7); 12-пропаноїл-13-(2-метилбутаноїл)-6,7-епокси-4,5,9,12,13,20-гексагідрокси-1-тиглієн-3-он (сполука 8); 12,13-дитиглоїл-б, 7-епокси-4,5,9,12,13,20-гексагідрокси-1-тиглієн-3-он (сполука 9) і

12-(2-метилбутаноїл)-13-тиглоїл-б, 7-епокси-4,5,9,12,13,20-гексагідрокси-1-тиглієн-3-он (сполука 10).

Інгібітор контрольної точки імунітету (ІСІ)

ІСЇ може бути будь-якою молекулою, яка інгібує білки імунної клітини або ракових клітин, які блокують імунні відповіді імунної клітини, зокрема, у випадку, коли імунна клітина є Т-клітиною або клітиною природним кілером (МК-клітиною). Приклади білків імунних клітин і пухлинних клітин включають білок запрограмованої загибелі 1 (РО-1) на Т-клітинах, який зв'язує РО-Ї 1 пухлинної клітини, блокуючи імунну відповідь Т-клітини проти пухлинної клітини, і цитотоксичний

Т-лімфоцитасоційований білок 4 (СТІ А-4) на Т-клітині, який зв'язує білок В7-1/87-2 на раковій клітині, блокуючи імунну відповідь Т-клітини проти пухлинної клітини. Тому ІСІ включають молекули, які зв'язуються або блокують взаємодію РО-1 з РО-І 1/РО-12 або СТІ А-4 з В7-1/87-2.

Інші білки імунних клітин, які блокують імунні відповіді в імунних клітинах і можуть бути модульовані для запобігання їх дії, включають рецептор аденозину А2гА, В7-НЗ, В7-НА, індоламін-2,3-диоксигеназу (ІБО), імуноглобулін-подібний рецептор клітини-кілера (КІК), ген З активації лімфоцитів (ГАСЗ), Т-клітинний імунорецептор з доменами ІС і ІТІМ (ТІСІТ), Т- клітинний імуноглобулін і домен муцину З (ТІМ-3), С0Об і імуноглобуліновий супресор активування Т-клітин домена М (МІ5ТА).

Приклади ІСІ включають (без обмеження) антагоністи РО-1, РО-І1, РО-І 2, СТІ А-4, білок В7- 1/87-2, рецептор аденозину АгА, В7-НЗ, В7-Н4, ІРО, КІВ, ГАСЗ, ТІМ-3, ТІСІТ, 2096 і МІЗТА, зокрема антагоністи РО-1, РО-І1, СТІ А-4 або білок В7-1/87-2, особливо антагоністи РО-1 або

СТІ А-4. В окремих варіантах здійснення антагоніст є антитілом для білка контрольної точки імунітету, наприклад анти-РО-1 антитілом або анти-СТІ А-4 антитілом. В інших варіантах здійснення конкретним антагоністом є антагоніст ІБО.

Композиції

Хоча епокситигліанові сполуки або їх фармацевтично прийнятні солі й ІСІ можна вводити в чистому вигляді, може бути зручно вводити епокситигліанові сполуки й ІСІ у формі однієї або декількох фармацевтичних композицій, кожна з яких уводиться з фармацевтично прийнятним носієм, розріджувачем і/або ексципієнтом.

Лікарську форму й дози для фармацевтичного застосування й композицій може легко

Зо визначити фахівець у даній області техніки.

В окремих варіантах здійснення епокситигліанову сполуку включають до складу для введення безпосередньо на або в пухлину, яку лікують. У деяких варіантах здійснення епокситигліанову сполуку включають до складу для топічного введення у формі гелю, мазі, лосьйону, крему або трансдермального петча, які можна нанести безпосередньо на пухлину, яку лікують. В інших варіантах здійснення епокситигліанову сполуку включають до складу для ін'єкції, зокрема інтратуморальної ін'єкції коли сполуку інектують в одне або кілька місць пухлини.

ІСІ можна вводити будь-яким способом, який здатний доставити молекулу системно або локально. В окремих варіантах здійснення, коли ІСІ є антитілом, молекулу зазвичай доставляють ін'єкцією, наприклад внутрішньовенною, інтраартикулярною, внутрішньом'язовою, підшкірною або інтраперитонеальною ін'єкцією. ІСІ також може бути включений до складу для локальної доставки за допомогою ін'єкції, наприклад інтратуморально. У композиції ІСІ також можуть бути включені фармацевтично прийнятні носії й прийнятні носії для системного або локального введення.

У деяких варіантах здійснення епокситигліанова сполука й ІСІ доставляються окремо або одночасно або послідовно. В інших варіантах здійснення епокситигліанова сполука й ІСІ доставляються в єдиній композиції, наприклад в одній композиції, яка придатна для інтратуморальної доставки, або в одній композиції, складеній для системної доставки.

В іншому аспекті даний винахід відноситься до фармацевтичної композиції, яка включає епокситигліанову сполуку або її фармацевтично прийнятну сіль і інгібітор контрольної точки імунітету необов'язково разом з одним або декількома фармацевтично прийнятними носіями.

У придатному варіанті фармацевтична(ї) композиція(ї) включає(ють) фармацевтично прийнятний або прийнятний ексципієнт. "Фармацевтично прийнятним ексципієнтом" називають твердий або рідкий наповнювач, розріджувач або інкапсулюючу речовину, які можна використовувати безпечно. Залежно від конкретного шляху введення можна використовувати різні носії, добре відомі в техніці. Ці носії або ексципієнти можна вибрати із групи, яка включає цукри, крохмалі, целюлозу і її похідні, циклодекстрини, солод, желатин або інші желатуючі агенти, полімери, тальк, сульфат кальцію, рослинні олії, синтетичні масла, спирти й/або поліолі, альгінову кислоту, забуферені фосфатом розчини, емульгатори, ізотонічний фізіологічний бо розчин і апірогенну воду.

Препарати в рідкій формі включають розчини, суспензії й емульсії, наприклад водяні розчини або розчини в сумішах вода/пропіленгліколь. Наприклад, рідкі препарати для парентеральної ін'єкції можна одержати у вигляді розчинів у водному 1,2-пропандіолі, диметилсульфоксиді (ДМСО), водяних розчинах гама-циклодекстрину або бета- циклодекстрину, у фізіологічному розчині або розчині поліетиленгліколю, з додаванням буфера або без нього. Кращий інтервал рН становить 3,0-4,5. Придатні буфери буферують препарат при рН 3,5-4,5 і включають (без обмеження) ацетатний буфер і цитратний буфер.

Таким чином, композиції епокситиглі«анової сполуки й/або ІСІ можуть бути отримані для парентерального введення (наприклад, ін'єкцією, наприклад болюсною ін'єкцією або тривалою інфузією) і можуть бути представлені в стандартній лікарській формі в ампулах, попередньо заповнених шприців, інфузії невеликого обсягу або в багатодозових контейнерах з додаванням консерванту. Композиції можуть набувати таких форм, як суспензії, розчини, гелі або емульсії в масляних або водних середовищах, і можуть містити допоміжні речовини, такі як суспендуючі, стабілізуючі і/або диспергуючі агенти. З іншого боку активний інгредієнт може перебувати у формі порошку, отриманого асептичним виділенням стерильної твердої речовини або ліофілізацією з розчину, для одержання складу з придатним середовищем, наприклад стерильною апірогенною водою, перед застосуванням.

Фармацевтичні композиції епокситигліанової сполуки й/або ІСІ, які придатні для введення, можуть бути представлені у дискретних одиницях, таких як шприци, флакони, туби або саше, причому кожна містить попередньо задану кількість однієї або декількох фармацевтично активних сполук або екстрактів за винаходом, у вигляді порошку або гранул або у вигляді розчину або суспензії у водній рідині, розчині циклодекстрина, неводної рідини, емульсії олія-в- воді або вода-в-олії або у вигляді розчину або суспензії в кремі або гелі або у вигляді суспензії мікро- або наночастинок, які включають епокситигліанову сполуку, що включають (без обмеження) мікро- або наночастинки диоксиду кремнію або полілактиду. Такі композиції можна одержати будь-яким фармацевтичним методом, але всі ці методи включають стадію приведення в контакт однієї або декількох фармацевтично активних сполук за винаходом з носієм, який складається з одного або декількох необхідних інгредієнтів. Як правило, композиції одержують шляхом рівномірного й ретельно змішування агентів за винаходом з рідкими носіями

Ко) або тонкоподрібненими твердими носіями або тими й іншими, з наступним, за необхідності, наданням продукту потрібної форми.

Для топічного введення на епідерміс або інший орган сполуки за винаходом можна одержувати у вигляді гелів, мазей, емульсій, паст, кремів або лосьйонів або у вигляді трансдермального петча. Гелі можна одержувати з використанням придатних загущувачів і додавання їх у водні/спиртові композиції сполуки. Придатні загущувачі або желатуючі агенти відомі в рівні техніки, наприклад полівінілкарбоксиполімер карбомер 940. Мазі й креми можна одержувати, наприклад, на водній або масляній основі з додаванням придатних загущувачів іабо желатуючих агентів. Лосьйони можна одержувати на водній або масляній основі, і як правило, вони також будуть містити один або більше емульгаторів, стабілізаторів, диспергаторів, суспендуючих агентів, загущувачів або барвників.

Склади, які придатні для топічного введення, також включають розчини або суспензії, які можна наносити топічно у формі розчину для ванн або замочування або спрею, або які можуть абсорбуватися перев'язним матеріалом.

Коли ІСІ є невеликою молекулою, його можна доставити будь-якими придатними способами, включаючи пероральний, топічний, ректальний, парентеральний, сублінгвальний, трансбукальний, внутрішньовенний, інтраартикулярний, внутрішньом'язовий, інтрадермальний, підшкірний, інгаляцією, внутрішньоочне введення, інтарперитонеальний, інтрацеребровентрикулярний, трансдермальний і подібні способи, відомі в даній області техніки або у фармацевтиці.

Схеми приймання

У деяких варіантах здійснення епокситигліанова сполука доставляється в тій же композиції, що й ІСІ. Однак, у деяких варіантах здійснення ІСІ уводять в окремій композиції окремо від епокситигліанової сполуки.

У деяких варіантах здійснення епокситигліанову сполуку вводять безпосередньо в пухлину, наприклад топічним уведенням або інтратуморальною ін'єкцією.

У деяких варіантах здійснення епокситигліанову сполуку вводять у пухлину один раз. В інших варіантах здійснення здійснюють моніторинг обробленої пухлини, і, якщо потрібно, додатково вводять епокситигліанову сполуку, якщо пухлина не повністю реагує на лікування. У варіантах здійснення, де пухлину лікують топічно, епокситигліанова сполука в деяких випадках 60 може вводитися протягом деякого періоду часу, наприклад щодня протягом тижня або один раз на тиждень протягом до 10 тижнів. Фахівець у даній області техніки, який спостерігає суб'єкта, якого лікують, зможе визначити відповідну схему приймання ліків, яка може мінятися залежно від відгуку на лікування.

У деяких варіантах здійснення ІСІ уводять щонайменше один раз перед, одночасно або після епокситигліанової сполуки. У деяких варіантах здійснення кілька доз ІСІ уводять протягом періоду часу, починаючи до або одночасно із уведенням епокситигліанової сполуки й потім продовжуючи після введення епокситигліанової сполуки.

У деяких варіантах здійснення ІСІ уводять більше одного разу й на регулярній основі до й після введення епокситигліанової сполуки. У деяких варіантах здійснення ІСІ уводять до введення епокситигліанової сполуки, послідовно або одночасно із уведенням епокситигліанової сполуки й щонайменше один раз після введення епокситигліанової сполуки. Наприклад, ІСІ можна вводити за період від 1 тижня до 1 дня до введення епокситигліанової сполуки, зокрема, за 1-3 дні й особливо приблизно за 2 дні до введення епокситигліанової сполуки, потім ІСІ уводять послідовно або одночасно з епокситигліаановою сполукою або безпосередньо перед або безпосередньо після введення епокситигліанової сполуки, потім ІСІ уводять один або більше разів протягом наступного місяця після епокситигліанової сполуки, наприклад один раз на тиждень, один раз кожні 5 днів, один раз кожні 4 дні, один раз кожні З дні, один раз кожні 2 дні або щодня, зокрема кожні 1-3 дні, особливо кожні 2 дні. Послідовне введення ІСІ може тривати, так що після введення епокситигліанової сполуки вводять 1-10 доз ІСІ, зокрема 1-8 доз, 1-6 доз, 1-4 дози, 1-3 дози або 1-2 дози.

В одному варіанті здійснення ІСІ уводять за 2 дні до введення епокситигліанової сполуки, послідовно (безпосередньо перед або безпосередньо після) з епокситигліановою сполукою, і потім кожні два дні протягом 6 днів після введення епокситигліанової сполуки.

Епокситигліанову сполуку вводять в ефективній кількості. "Ефективна кількість" означає кількість, необхідну для щонайменше часткового досягнення бажаного відгуку, наприклад для зменшення розміру пухлини або для руйнування пухлини взагалі. Ця кількість міняється залежно від стану здоров'я й фізичного стану індивідуума, якого лікують, таксономічної групи індивідуума, якого лікують, складу композиції, розміру пухлини, оцінки медичної ситуації й інших релевантних факторів. Очікується, що ця кількість буде попадати у відносно широкий діапазон, який можна визначити рутинними дослідженнями. Ефективна кількість, наприклад, може лежати в діапазоні від приблизно 0,1 нг на кг маси тіла до 1 г на кг маси тіла на дозування. Дозування переважно перебуває в діапазоні 1 мкг - 0,5 г на кг маси тіла на дозування, наприклад у діапазоні 0,1 мкг - 100 мг на кг маси тіла на дозування. В одному варіанті здійснення, де дозу вводять інтратуморально, дозування перебуває в діапазоні 50 нг - 100 мг на кг маси тіла, наприклад 0,1 мг - 5 мг на кг маси тіла, 0,1 - 1 мг/кг маси тіла, наприклад 0,25 мг/кг маси тіла. В іншому варіанті здійснення дозування перебуває в діапазоні 0,001 мг - 20 мг на дозу, наприклад 0,005 мг - 15 мг на дозу, зокрема 0,05 - 10 мг на дозу, особливо приблизно 0,1 - приблизно 5 мг на дозу. Схеми приймання ліків можуть бути підігнані для одержання оптимальної терапевтичної відповіді. Наприклад, у деяких варіантах здійснення, де введення є інтратуморальним, епокситигліанову сполуку вводять один раз і контролюють прогрес лікування. У деяких варіантах здійснення, якщо пухлина не зруйнувалася повністю або якщо пухлина рецидивує, може бути введена друга доза. У деяких варіантах здійснення, де введення є топічним, топічний склад сполуки можна вводити безпосередньо на місце пухлини у формі гелю, крему, мазі або лосьйону. Частота обробки буде залежати від пухлини, її розміру, суб'єкта, якого лікують, і т.п. У деяких варіантах здійснення топічний препарат можна наносити щотижня доти, поки пухлина не зруйнується. В інших варіантах здійснення лікування може представляти одну обробку, і другу обробку призначають тільки якщо пухлина не зруйнувалася повністю.

ІСЇ також можна вводити в ефективній кількості. Тут кількість ІСІ, яка вважається ефективною, також буде залежати від суб'єкта, якого лікують, стану його здоров'я й фізичного стану, числа наявних сторонніх пухлин, складу композиції й оцінки медичної ситуації.

Очікується, що кількість ІСІ буде попадати в досить широкий діапазон. Ефективна кількість може лежати в діапазоні від приблизно 0,1 нг/кг до приблизно 500 мг/кг маси тіла, 100 мкг/кг - 100 мг/кг маси тіла, 1 мг/кг - 50 мг/кг маси тіла, 1 мг/кг - 20 мг/кг маси тіла. В іншому варіанті здійснення фактичні дозування можуть перебувати в діапазоні від 1 мкг до 1 г, наприклад, 100 мкг - 750 мг на дозу.

Суб'єктом, якого можна лікувати комбінованою терапією, є ссавець, птах, водна тварина, така як риба, або рептилія. У деяких варіантах здійснення суб'єктом є людина, лабораторна тварина, така як миша, пацюк або кролик, свійська тварина, така як собака або кішка, робоча 60 тварина, така як кінь, віслюк і т.п., домашня худоба, така як корова, буйвол, свиня, вівця, коза,

олень, лама, альпака й т.п., або дикі тварини, які утримуються в неволі, такі як тварини в зоопарках або парках дикої природи, включаючи левів, леопардів, гепардів, слонів, зебр, антилоп, жирафів, коал, кенгуру, і рептилій, таких як крокодили, ящірки, змії й т.п., птахів, таких як хвилястий папужка або канарка, какаду, довгохвостий папуга, ара, папуга й т.п., або риба, така як тропічна риба (риба-зебра, гупі, сіамська бійцівська рибка, риба-клоун, тетра-кардинал і т.п.), дельфіни, кити й т.п. В окремих варіантах здійснення суб'єктом є людина або свійська тварина.

Набори

Композиції епокситигліанової сполуки й ІСІ можуть бути складені окремо й продаватися разом у наборі або впакуванні. Кожний набір може включати дозування кожної сполуки для досягнення лікування пухлини й лікування або попередження однієї або декількох сторонніх пухлин.

У деяких варіантах здійснення епокситигліанову сполуку входить у композицію для топічного введення, таку як гель, лосьйон, крем або мазь або просочений перев'язний матеріал. В інших варіантах здійснення епокситигліанова сполука входить у композицію для ін'єкції, таку як інтратуморальна ін'єкція. У цьому варіанті здійснення епокситигліановий препарат може бути присутнім у наборі у вигляді рідини, готової для набору в шприц, у вигляді порошку або твердого препарату, який можна розчинити в носії перед ін'єкцією, або може бути присутнім у наборі в попередньо наповненому шприці.

Кожний набір може включати одну або кілька доз епокситигліанової сполуки. В одному варіанті здійснення набір буде містити одну дозу епокситигліанової сполуки в препараті, який придатний для інтратуморальної ін'єкції. В іншому варіанті здійснення набір буде містити топічний препарат епокситигліанової сполуки, який містить кілька доз для нанесення на пухлину.

У деяких варіантах здійснення ІСІ входить у препарат для парентерального введення у формі однієї болюсної дози або багатодозової форми. Наприклад, набір може містити ІСІ у попередньо наповненому шприці, у вигляді рідини у флаконі, готової для завантаження в шприц, або у вигляді твердої речовини, готової для розчинення перед завантаженням у шприц.

Рідкі або тверді препарати можуть бути однодозовими препаратами або багатогодозовими

Зо препаратами. З іншого боку, набір може містити кілька доз ІСІ, кожна складена окремо в попередньо наповненому шприці, у вигляді рідини у флаконі, готової до завантаження в шприц, або у вигляді твердої речовини, готової для розчинення й завантаження в шприц.

Набір може додатково включати вкладиш із інструкцією із застосування кожного препарату, включаючи інструкцію з одержання кожної дози, якщо потрібно, інструкцію, як уводити кожне

З5 дозування й коли вводити кожне дозування.

Короткий опис фігур

Фіг. 1 показує А - зображення транслокації РКО-а, -ВІЇ, -у, -6 і -8 після обробки середовищем (порівн.) або 500 нМ сполуки 1 (спол. 1), сполуки З (спол. 3) і РМА. Ці зображення також використовують для кількісного аналізу, показаного на В. В -тепловій карті, що відображає профіль транслокації ізоформ РКС (-а, -ВІ, -ВІЇ, -у, -0, -9, -П і -Є - середній 95 клітин, які показують транслокацію ЕСЕР до плазматичної мембрани) у відповідь на 500, 50 і 5 нМ сполуки 1 і зазначених аналогів. Підраховано »150 клітин на біологічну реплікацію. п-3.

Фіг. 2 показує А - схему експерименту. В: відібрані цитокіни/хемокіни хазяїна з ролями в рекрутменті лейкоцитів індуковані обробкою сполукою 1 (30 мкг). Показана кратність змін в експресії генів зазначених цитокінів/хемокинів. С: одержують теплову карту після порівняння даних за профілями інтенсивності експресії генів як для середовища, так і для сполуки 1 при 1-8 годин. Наступні списки генів аналізують із використанням Іпдепийу РаїШуау Апаїувів (ІРА;

Оіадеп) для ідентифікації шляхів, які зачіпаються обробкою сполукою 1.

Фіг. З показує А - вивільнення І ОН з ліній ракових клітин, оброблених сполукою 1. А431,

МІМб649 і В16-ОМА обробляють сполукою 1 у зазначених концентраціях або тільки середовищем (порівн.), і вивільнений ОН аналізують згодом з використанням набору для аналізу на цитотоксичність Ріегсе ОН. п-3. В. Сполука 1 індукує значне зниження рівнів внутрішньоклітинного АТФ. Знову клітини обробляють сполукою 1 або середовищем (порівн.), і аналізують рівні внутрішньоклітинного АТФ у зазначені моменти часу з використанням набору для аналізу СеПТйег-С1Іо 29). п-3.

Фіг. 4 показує А - визначення вивільнення АТФ із ліній ракових клітин у відповідь на обробку сполукою 1. Клітини обробляють сполукою 1 або середовищем (порівн.) протягом зазначеного часу, і вивільнення АТФ із супернатантів клітинних культур аналізують із використанням набору для аналізу біолюмінесценції на основі АТФ. Визначають середні величини КІ Ш /- 5.0., і бо будують графік залежності від часу. п-4. В. Інші епокситигліанові аналоги (сполука 2: Ві, сполука

З: Вії, і сполука 4: Вії) також промотують вивільнення АТФ із клітинних ліній А431, ММб49 і В16-

ОМА. п-4. С. Визначення вивільнення НМОВІ з ліній ракових клітин, оброблених сполукою 1 і епокситигліановими аналогами. Супернатанти клітинних культур з оброблених епокситигліаном або середовищем (порівн.) А431 (Сі), ММ6б49 (Сії) або В16-ОМА (Сії) аналізують на вивільнення

НМОВІ методом ЕГІЗА. Величини для клітин, оброблених сполукою 1, нормалізують до клітин, оброблених середовищем, для визначення кратності посилення вивільнення НМОВІ1. п-2 для

А431 і ММб49, у той час як п-З3 для В16-ОМА. (Сім) Вивільнення НМОВІ також відбувається у відповідь на обробку сполукою 2, 3 і 4. п-3. ОО. Сполука 1 промотує екстерналізацію кальретикуліна в ряді ліній ракових клітин. А431 (Ої), ММб49 (Оії) і В16-ОМА (фії) обробляють сполукою 1 або тільки середовищем (порівн.) у зазначений час і потім перед проточною цитометрією забарвлюють антикальретикуліновим/антикролячим АїЇеха 488. Показують середні величини інтенсивності флуоресценції (екст. 488 нм, ісп. 530/530 нм) ї/- 5.0. для кожного моменту часу.

Фіг. 5 показує А і В. Оброблені епокситигліаном клітини процесують СО11сВМОСсз5 іп міо.

Мічені СМЕВА клітини В16-ОМА, оброблені сполукою 1 або середовищем (порівн.), інкубують з незрілими ВМОС протягом 4 годин і потім перед проточною цитометрією забарвлюють анти-

СО11с-АРС. Темно-сірий прямокутник - клітини СО11сСВМОС. Заштрихований темний прямокутник - СО11сВМОС, які мають пофарбовані фрагменти клітин В16-ОМА (СО11ЄСМЕОАпіа). Відсоток клітин СО11ССМЕОАтія показаний на 5А, і результат 4 біологічних реплікацій показаний на Фіг. 58. п-4. С. Аналоги епокситигліана також індукують поглинання клітин В16-ЮМА СО11сВМОС. Відображені дані, отримані при використанні сполук 2, З і 4. п-3.

Фіг. б показує А - схему експериментального підходу для комбінацій сполуки 1 і ІСІ. Усі пухлини ін'єктовані або 15/30 мкг сполуки 1, або середовищем (порівн.). Також відображена схема обробки ІСІ. В й С. Графіки Каплана-Мейєра, що показують 95 оброблених пухлин, які залишаються розміром нижче 100 мм у різних умовах обробки ІСІ, з або анти-РО-1 (Фіг. 68) або анти-СТІ А-4 (Фіг. 6С). Також відображене виживання мишей у відповідь на комбінацію.

Фіг. 7 показує А - принципову схему підходу з комбінованою терапією: індекс і стороння пухлина показані разом зі схемою приймання ліків; і В - графічні зображення результатів комбінованої терапії (обсяги пухлин). Антитіло ізотипа ї- сполука 1 (лінія із точок), анти-РО-1

Зо антитіло або анти-СТІ А-4 антитіло - середовище (пунктирна лінія) і анти-РО-1 антитіло або анти-СТІ А-4 антитіло ї сполука 1 (суцільна лінія) у пухлинах, які лікують (світлі кружечки), і сторонніх пухлинах (чорні кружечки).

Фіг. 8 показує як обсяги (ліва панель), так і аналізи пухлин за Капланом-Мейєром (права панель) (95 пухлин « 100 ммуУ), ін'єктованих субоптимальною дозою сполуки 1 (15 мкг) у дикому й нокаутованому фенотипах СС5Е.

Приклади

Сполуки за даним винаходом можна одержати виділенням з рослини або частини рослини або шляхом дериватизації виділеної сполуки або шляхом дериватизації спорідненої сполуки.

Процедури виділення й процедури дериватизації можна знайти в УМО 2007/070985 і

МО2014/169356.

Сполука 6 - 20-ацетилпохідне сполуки 1 можна одержати із сполуки 1 ацетилюванням оцтовим ангідридом (1 еквів.) у присутності триетиламіна в дихлорметані. Такі умови дають селективне ацетилювання С-20 гідроксигрупи без ацетилювання інших гідроксигруп.

Сполуку 10, хоча в ММО2014/169356 не синтезована в явному вигляді, можна одержати з використанням загального методу одержання несиметричних ефірів, представленого в прикладі 1 УУ02014/169356, сторінки 64-70.

Приклад 1. Аналоги епокситигліана активують ізоформи РКС

Протеїнкінази С є сімейством ключових ферментів, залучених у шляху передачі сигналів, які специфічно фосфорилюють субстрат у серинових/треонінових залишках. Фосфорилювання за допомогою РКС є важливим у регуляції ряду клітинних подій, таких як проліферація й регуляція експресії генів. ІЗоформи РКС (-8, -п, -а, -В, -0, -є) безпосередньо залучені в реакції імунних клітин ії можуть також промотувати експресію ключових генів імунної відповіді. Однак картина експресії й рівні кожної з таких ізоформ РКС пов'язані з типом клітин і специфічністю контексту (іт еїаї., 2015; Апеї в аі., 2012; Ртейноїег еї а!., 2006).

Для того, щоб ідентифікувати профілі активації ізоформ РКС (специфічність і дієвість) епокситигліанових сполук, клітини Не а тимчасово трансфікують із селекцією векторів РКС-

ЕСЕР (РКО-а, РКСО-ВІ, РКОС-ВІ, РКС-у, РКОС-б, РК-С8, РКО-пП, РКО-Є - отримані на фірмі) з використанням ліпофектаміну 2000 (Іпмігодеп), дотримуючись методів, описаних в Воуїе еї аї., 2014. Обсяг, що відповідає 0,16 мкг РКСО-ЕСЕР і 0,48 мкл ліпофектаміну, змішують із 25 мкл бо середовища Орії-МЕМ (Іпмйгодеп) і інкубують протягом 5 хв. при КТ. Розчини поєднують і інкубують ще 20 хв. при КТ (відношення ДНК:ліпофектамін 2000 1:3). Комплекси (50 мкл) додають у кожну лунку, і після З год. інкубації при 37" додають ще 50 мкл КРМІ-1640, 10 95

ЕС5, до загального обсягу 100 мкл на лунку. Після 24 год. інкубації при 372С клітини промивають забуференим фосфатом фізіологічним розчином (РВ5) і обробляють 500, 50 і 5 нм епокситигліана. Можна випробовувати три сполуки в 96-ямковому планшеті. Для експерименту потрібні п'ять 96-ямкових планшетів. Після 1- годинної обробки клітини промивають двічі 100 мкл РВ5З ї фіксують 50 мкл у 2 96 формальдегіду/0,2 95 глутеральдегіду в РВ5 протягом 10 хв.

Потім фіксовані клітини двічі промивають 100 мкл РВ5. Для фарбування ядер використовують

Ноеспзхі 3342 у розведенні 1:10000. Після 7-хв. інкубації в темряві Ноесп5ії видаляють, і клітини промивають РВ5. Нарешті, клітини покривають 100 мкл РВЗ і зберігають при 42С у темряві до візуалізації. Візуалізацію виконують із використанням аналізатора СЕ ІпСеїЇ Апаїулег 2000.

Транслокацію РКС до плазматичної мембрани або інші субклітинні позиції рахують вручну з використанням Адобре Рпоїо5пор С56.

Зображення, що показують транслокацію обраних ізоформ РКС -а, -ВІЇ, -у, -6 і -9 до клітинної мембрани в присутності епокситигліанових сполук сполуки 1, сполуки 3, а також РМА (форбол- 12-міристат-13-ацетат), показані на Фіг. 1А. Ці зображення показують, що активувати різні ізоформи РКС можуть різні епокситигліанові сполуки.

Відсоток клітин, які показують транслокацію на плазматичній мембрані сполук 1-10, а також позитивного контролю РМА, конвертують у теплову карту, що відображає профіль транслокації ізоформ РКС у відповідь на 500, 50 і 5 нм кожної сполуки. Теплова карта показана на Фіг. 18.

Результати показують, що всі сполуки 1-7 активують РКС-9 (до різного ступеня) - ізоформу

РКС, відому як залучену в активацію Т- і МК-клітин і супресію розвитку Тгед (Вгелаг еї аї., 2015;

Апеї еї аї., 2012). Усі епокситигліанові сполуки активують РКСОС-ДВ, яка критична при передачі сигналів В-клітинного рецептора й презентації антигену (див., наприклад, Капо еї аї., 2001; іт еї аї,, 2015). Три інші ізоформи РКС (-п, -а, -б), які слабкіше активуються деякими або всіма епокситигліанами, також безпосередньо залучені у відповіді імунних клітин (іт еї аї., 2015;

Рітєеїноїгег єї а!., 2006).

Приклад 2. Зміни експресії генів у стромі пухлин мишей, що збігаються з рекрутментом імунних клітин і індукцією Тп-1/М1-подібної протипухлинної імунної відповіді

Тр-1/М1-подібна відповідь при протипухлинному імунітеті. Тп-1/М1-подібна імунна відповідь асоціюється з індукцією протипухлинного клітинного імунітету через ряд механізмів, включаючи пряму тумороцидну активність, модифікацію протипухлинних реакцій цитокінами й потенціювання тривалої імунологічної пам'яті. Наприклад, кілька наборів даних показують, що бра-Т-хелперні типу 1 (ТИ) клітини - двигуни імунітету. ТИ1 можуть сприяти підтримці кліренсу пухлинних клітин через секрецію різних цитокінів, включаючи інтерферон-у (ІЕМ-у), інтерлейкін-2 (1-2) ії фактор некрозу пухлини а (ТМЕ-а) (Кпиїзоп еї а!., 2005; Оеєпагао еї а!., 2010; ВигтКкпоїдег еї а, 2014). Ці цитокіни промотують активності декількох типів клітин, включаючи антигенпрезентуючі клітини (АРС), цитотоксичні Т-клітини, МК-клітини й різні підтипи вроджених імунних клітин (див., наприклад, Сопеп еї а!., 2000; Во5 5 Зпептап, 2010). Також відомо, що ІЄМ- у ії ТМЕ мають пряму дію на виживання пухлинних клітин (Зидаптап еї аї., 1985; Вауаєгі еї аї., 1994). Хоча 1І--1 ї І--6 (продуковані макрофагами МІ) асоціюються з розвитком пухлини, більш пізні дані припускають, що вони фактично є ключовими компонентами різких протипухлинних імунних відповідей (Наабеїйй еї аї., 2011; СЗабргійомісп еї аїІ.,, 2012; Наабреїйй еї аї., 2016). Вони показують посилення проліферації В-клітин і продукування антитіл, підвищення активності антигенпрезентуючих клітин (АРС), стимуляцію проліферації антигенспецифічних цитотоксичних типів клітин і промотування диференціювання клітин Тп1 (Наабеїйй еї аї., 2011;

ВигкпоЇдег еї аї., 2014). Також показано, що комбінації цитокінів ТИї і Мі є важливими в імунологічному нагляді за пухлинами. Наприклад, як 1-1, так і ІЕМ-у підсилюють взаємну дію для активації тумороцидної активності макрофагів (Ногі еї аїЇ.,, 1989; Наабреш еї аї., 2016).

Важливо, що поява макрофагів МІ їі лімфоцитів Тп1ї у пухлинах позитивно асоціюються з поліпшеним прогнозом і часом виживання при багатьох типах раку (Радез еї а!., 2010; Егідтап еї аі. 2012; бепоміМйа єї аї., 2012). Дійсно, передбачається, що індукція запалення типу ТП1/М1 суттєво поліпшує підходи на основі протиракової терапії (Наареїй еї аї., 2012). Нижче описується дія сполуки 1 при промотуванні протипухлинної імунної відповіді, подібної ТАИ1/М1, у стромі мишачої моделі із ксенотрансплантатом.

Строма миші в ксенотрансплантаті пухлини людини від мишей. Клітинну лінію меланоми людини ЗК-МЕЇ -28 ін'єктують підшкірно (5.с) в 2 місця на боках кожної миші ВАГ В/с Рохпіпи (2 мільйони клітин/місце) і дозволяють рости до приблизно 7 мм у діаметрі. Потім у кожну пухлину ін'єктують 50 мкл 2095 пропіленгліколю, що містить 30 мкг сполуки 1, або 50 мкл 2095 пропіленгліколю. Мишей піддають евтаназії в різні моменти часу після ін'єкції, пухлини збирають, шкірний покрив видаляють, і інтактні пухлини зберігають при -8020.

Екстракція РНК. РНК екстрагують із 30 мг замороженої пухлини з використанням набору

Оіадеп Кпеазу Рій Міпі Кії відповідно до інструкцій виробника, потім визначають кількісно за допомогою приладу МапоОгор, і підтверджують цілісність денатурацією в агарозних гелях, що містять 1 кб маркера ДНК, і забарвлюють бромідом етидію.

Ампліфікація РНК ії мічення. Приблизно 500 нг усієї неміченої РНК доводять до кінцевого обсягу 11 мкл води без нуклеази. РНК інкубують з 9 мкл мастермікса для зворотної транскрипції (1 мкл праймера 17 ОЇїідо (ат), 2 мкл 10х буфера для першого ланцюга, 4 мкл мікса для аМТР, 1 мкл інгібітора РНКази й 1 мкл АгІтаузогір) при 422С протягом 2 годин. За цим іде стадія синтезу другого ланцюга кДНК, яка включає додаткову інкубацію при 162С протягом 2 годин з 80 мкл мастермікса для другого ланцюга (63 мкл води без нуклеази, 10 мкл 10Х буфера для другого ланцюга, 4 мкл мікса для аМТР, 2 мкл ДНК-полімерази й 1 мкл РНКази Н). КДНК очищають фільтрацією через картридж для фільтрації КкДНК із 250 мкл буфера для зв'язування кДНК і промиванням 500 мкл буфера для промивання, представленого в наборі. Очищену кКДНК елююють при 20 мкл нагрітої до 552С води без нуклеази. Кожний зразок кКДНК інкубують з 7,5 мкл мастермікса для ІМТ (2,5 мкл буфера для реакції Т7 10Х, 2,5 мкл ферментної суміші 17 і 2,5 мкл мікса біотин-МТР) при 372С протягом 16 годин. Реакцію зупиняють додаванням 75 мкл води без нуклеази до кожного зразка кРНК. Біотинільовану ампліфіковану РНК очищають фільтрацією зразків КРНК через картриджі для фільтрації КРНК із 350 мкл буфера для зв'язування кРНК ії 250 мкл в 100 95 етанолу, змішаних перед завантаженням у фільтри. Потім картриджі для фільтрації кКРНК із приєднаною РНК промивають 650 мкл буфера для промивання, і потім елююють очищену кРНК 200 мкл нагрітої до 552С води без нуклеази.

Гібридизація на ПШиптіпа Ехргеззіоп ВеайсСтпір. Зразки кРНК гріють при 652С протягом 5 хв. і збирають імпульсним центрифугуванням. Після нагрівання при 652С протягом 5 хв. зразки КРНК приблизно по 750 нг поміщають в окремі пробірки, у які додають «5 мкл води без РНКази й 10 мкл Нуб Міх. Приблизно 15 мкл отриманої суміші із КРНК завантажують на Шитіпа Ехргев5іоп

Веааснпір. Наступні стадії гібридизації й промивання виконують згідно з керівництвом М/поїе-

Сепоте Сепе Ехргеззіоп Оігесі Нургідігайоп Аззау Сиціде, що поставляється Шитіпа. Ехргезв5іоп

Зо Веааснір5 з Нитапнт-12 м4 покривають більше 47000 транскриптів і відомих сплайс-варіантів транскриптома людини. Ехргеззіоп ВеайСпір5е МоизекКеї-8 м2.0 покривають приблизно 25600 добре анотованих транскриптів КеїЗед (еталонна послідовність), включаючи понад 19000 унікальних генів.

Дані аналізу. ВеааСпір зчитують за допомогою системи іЗсап 5узіет, і переносять через

Сепотевзіцаіо в Сепезргіпд ОХ м12.5 (Адіепі ТесппоїІодіеє5, запіа Сіага, СА, ОБА). Величини експресії нормалізують із використанням квантильної нормалізації з настроюваннями за замовчуванням. Елементи фільтрують на основі оцінки виявлення, обчисленої за допомогою

Сепотебвіцайо, де р х 0,05 уважають значимим.

Результати показані на Фіг. 2. Фіг. 2А показує, що деякі цитокіни/хемокіни хазяїна, які важливі для рекрутмента/ активації імунних клітин, апрегулюються в місці пухлини у відповідь на обробку сполукою 1. Відмітимо, що відомо, що Схсії, який із труднощами апрегулюється сполукою 1, промотує рекрутмент нейтрофілів і наступний кілінг ракових клітин, що залишилися (Сагу еї аї., 2017). Крім того, Фіг. 28 показує, що сполука 1 викликає зміни експресії генів у хазяїні, які асоціюються з розвитком ТП-1/М-подібної відповіді, тобто, індукцію ІЕМ-у, ТМЕ, 1-6 і

І--1Д. Дані також припускають, що може відбуватися даунрегуляція передачі сигналів ТОЕ-бета (Фіг. 2С), яка є відомим шляхом передачі імуносупресивних сигналів (Меш2Пеїеїа!., 2015).

Приклад 3. Демонстрація того, що терапевтичні концентрації сполуки 1 і інших епокситигліанів індукують онкозис клітин

Онкозис є формою загибелі клітин, яка характеризується набряканням і розривом субклітинних органел і наступною пермеабілізацією плазматичної мембрани через часткову втрату АТФ-керованої активності іонного насоса, який підтримує осмотичний баланс. Показано, що онкозис є імуногенним за природою й асоціюється з ефективністю деяких онколітичних вірусів і невеликими молекулами, розробленими як протиракові засоби (див., наприклад, Оуег еї а!., 2016).

Клітинні лінії, реагенти й середовища. Клітини А431 (епідермоїдна карцинома людини),

ММ649 (меланома людини), В16-ОМА (клітинна лінія меланоми мишей В16-Е10, стабільно трансфікована курячим овальбуміном), ММ415 (меланома людини) і Раби (гіпофарингеальний рак людини) культивують із КРМІ-1640, 10 95 ЕС5 (повне середовище), при 3720, 595 СО», у вологому інкубаторі. Усі клітинні лінії, використовувані в цьому дослідженні, підтверджують як негативні на мікоплазму з використанням МусолА|Пегі (Гоп7а). Також виконують аналіз профілю

ЗТЕ для того, щоб підтвердити використовувані клітинні лінії людини.

Аналіз на цитотоксичність із ІпсиСуге. Чотири ракові клітинні лінії (А431, ММ649 (меланома людини), Раби (НМ5СС) і ММ415 (меланома людини) оцінюють на їхню реакцію на обробку епокстигліанами. Клітини висівають при щільності 10000 клітин на лунку (100 мкл повного середовища) у темні 96-ямкові планшети з лунками із прозорим дном (Согпіпо, 23603). Після 24- годинної інкубації середовище з кожної лунки аспірують і заміняють 50 мкл свіжого середовища, яке містить 1 мкг/мл йодиду пропідію (РІ). Вихідні розчини (20 мг/мл в етанолі) чотирьох епокстигліанів (сполуки 1, 2, З ї 4) розводять 2х до кінцевої концентрації для аналізу (1 мМ) в ідентичних середовищах і включають в 96-ямковий планшет з О-подібними лунками в препараті для переносу. Розведення (50 мкл) додають у відповідні лунки, і отримані планшети вставляють в Евзеп Віозсіепсе5 ІпсиСуїе при підготовці для візуалізації. Одержують зображення в різні моменти часу (30 хв., 1 година й через годинні діапазони) у цілому протягом 24 год.

Аналізи на вивільнення лактатдегідрогенази (ОН). Вимірювання вивільнення І ОН є добре відомим аналізом для оцінки пермеабілізації до плазматичної мембрани й виявлення загибелі клітин через некроз (Спап еї аї., 2013). У цих аналізах використовують три клітинні лінії (А431,

ММ649 ії В16-ОМА). Клітини висівають при щільності 10000 клітин на лунку (100 мкл повного середовища) у прозорі 96-ямкові планшети (Согпіпуд, 23595; 100 мкл повного середовища), і отримані планшети інкубують протягом ночі, як докладно описано раніше. Наступного дня середовище з кожної лунки аспірують і додають 50 мкл свіжого середовища. Вихідні розчини сполуки 1 розводять 2х до кінцевих концентрацій для аналізу (1 мМ і 600 мкМ), ії 50 мкл таких розведень додають у відповідні лунки. Також складають і включають контрольні розчини тільки етанолу. У зазначені моменти часу витягають 50 мкл середовища й аналізують на вивільнення

МОН з використанням набору для аналізу на цитотоксичність Ріегсе СОН (Тпептогізпег зсієепійіс). Реєструють показання 00 490 нм ї 00 690 нм для кожного зразка з використанням планшет-рідера Нургй Зупегду Н4. Показники поглинання оброблених ліками зразків нормалізують до контролів, оброблених детергентом, для визначення 95 вивільнення ІОН на лунку.

Аналіз на внутрішньоклітинний АТФ. Використовують набори для аналізу СеїЇПйег-СсіоФ 2.0

Зо (Рготеда Согрогайоп) для кількісного визначення на основі люмінесценції АТФ, присутнього в клітинах, для визначення рівнів внутрішньоклітинного АТФ у культурах А431 і ММб49, підданих впливу двох концентрацій (300 мкМ і 500 мкМ) сполуки 1. Знову клітини висівають при щільності 10000 клітин на лунку в темні 9б-ямкові планшети з лунками із прозорим дном (в 100 мкл повного середовища) і інкубують при 372С, 5 95 СО», протягом ночі. Під час аналізу середовище з кожної лунки аспірують, і додають 50 мкл свіжого середовища. Вихідні розчини сполуки 1 розводять 2х до кінцевих концентрацій для аналізу (1 мМ і 600 мкМ), і 50 мкл таких розведень додають у відповідні лунки. Також складають і включають контрольні розчини тільки етанолу. У зазначені моменти часу середовище акуратно витягають, щоб не зруйнувати клітини, і додають 100 мкл реагенту СеїїПіег-сІоФ 2.0. Отриманий планшет поміщають на орбітальний шейкер на 2 хв. для того, щоб викликати лізис клітин, після чого його інкубують у темряві протягом 10 хв.

Після цього визначають сигнал люмінесценції в кожній лунці. Сигнали люмінесценції з лунок, оброблених сполукою, нормалізують до лунок, оброблених середовищем, і виражають у вигляді 95 внутрішньоклітинного АТФ проти часу.

Зображення, отримані з ІпсиСуїе, показують сильне забарвлення в червоний колір через 120 хвилин у більшості клітин усіх чотирьох клітинних ліній, оброблених 500 мкМ сполуки 1, 2, З і 4 (А431, Раби, ММб649 і ММА415). Не забарвлюються клітини, оброблені тільки середовищем, підтверджуючи, що втрата цілісності плазматичної мембрани обмежена клітинами, обробленими сполукою 1. Крім того, також спостерігають значне набрякання цитоплазми й "утворення пухирців" у всіх клітинах, оброблених сполукою 1, 2, З і 4, хоча в різному ступені й з різною кінетикою появи.

Результати аналізів на вивільнення ОН і оцінки рівнів внутрішньоклітинного АТФ приводяться на Фіг. ЗА і ЗВ, відповідно. При порівнянні з контролем є істотне вивільнення ГІ ОН із трьох ракових клітинних ліній при обох концентраціях сполуки 1, які випробовували (300 мкМ і 500 мкМ) (Фіг. ЗА). Рівні внутрішньоклітинного АТФ дуже швидко зменшуються після обробки 500 мкМ сполуки 1, і через 60 хвилин майже не визначаються (Фіг. ЗВ). При 300 мкМ сполуки 1 внутрішньоклітинний АТФ спадає повільніше й менш катастрофічно, ніж у випадку концентрації сполуки 1 500 мкМ, становлячи приблизно 50 95 від рівня до обробки через 120 хвилин (Фіг. ЗВ).

Виснаження АТФ раніше асоціювалося з індукцією онкозису (Кіт еї аї., 2003).

Такі результати показують, що епокситигліанові сполуки викликають онкозис у терапевтично релевантних концентраціях (тобто, концентраціях, які є ефективними для того, щоб викликати геморагічний некроз іп мімо).

Приклад 4. Онкозис, викликаний сполукою 1 і іншими епокситигліаановими сполуками, показує характеристики імуногенної загибелі клітин

Імуногенна загибель клітин (ІСО) є специфічним типом регульованої загибелі клітин, яка приведе до вивільнення або екстерналізації медіаторів, названих молекулярними фрагментами, асоційованими з ушкодженнями (ОАМР), які взаємодіють із рецепторами, які експресуються дендритними клітинами/умакрофагами для промотування їх рекрутмента й стимуляції поглинання/презентації пухлинних антигенів Т-клітинам. ІСО є відомим шляхом для активації імунної системи проти раку. Біохімічні ознаки ІСО включають виставляння кальретикуліна (СА! ЕК) і інших білків ендоплазматичного ретикулума/мітохондріальних білків на поверхню клітин, що гинуть, і вивільнення більших кількостей АТФ і боксу 1 групи білків 3 високою рухливістю (НМОВ1І) у позаклітинне середовище (Ктгоетег еї аї., 2013). Ці параметри використовують для точного прогнозування здатності хіміотерапевтичних засобів (включаючи доксорубіцин, мітоксантрон, оксаліплатин і бортезоміб) індукувати ІСО (Кгоетег еї аї., 2013; саїи27і еї аї., 2017). Здатність епокситигліанів індукувати такі характеристики описана докладно нижче.

ММ649 (меланома людини) і В16-ОМА (клітинна лінія меланоми мишей В16-Е10, стабільно трансфікована курячим овальбуміном) культивують із КРМІ-1640, 1095 БС5 (повне середовище), при 3720, 5 95 СО», у вологому інкубаторі. ВМОС культивують у середовищі К10 (АРМІ, 10 95 ЕС5, 2 мМ глутаміну, 50 мкМ бета-меркаптоетанолу, Реп/5ігер). Усі клітинні лінії, використовувані в цьому дослідженні, підтверджують як негативні на мікоплазму з використанням МусоАїег (Гопла) Також виконують аналіз профілю ЗТК для того, щоб підтвердити використовувані клітинні лінії людини.

Аналізи на вивільнення АТФ. Клітини висівають при щільності 10000 клітин на лунку (100 мкл повного середовища) у прозорі 96-ямкові планшети (Согпіпуд, Ж3595; 100 мкл повного середовища), і отримані планшети інкубують протягом ночі, як докладно описане раніше.

Зо Наступного дня середовище з кожної лунки аспірують і додають 50 мкл свіжого середовища.

Вихідні розчини сполук 1, 2, З і 4 розводять 2х до кінцевих концентрацій для аналізу (1 мМ і 600

МКМ), і 50 мкл таких розведень додають у відповідні лунки. Також складають і включають контрольні розчини тільки етанолу. У зазначені моменти часу витягають 80 мкл середовища, центрифугують при 1200 об/хв. протягом 4 хв. для осідання клітинного дебрису, і 50 мкл аналізують на АТФ із використанням набору для аналізу на АТФ на основі біолюмінесценції (АГАА, 5бідта-Аїйгісп). Реєструють люмінесценцію у відносних одиницях для кожного зразка, використовуючи планшет-рідер Нубгіа зупегду НА (Віотек).

Аналізи на вивільнення НМОВТІ. Клітинні лінії (А431, ММб649 і В16-ОМА) висівають в Т75-сме колби (Мипс) в 10 мл повного середовища й культивують при 372С, 595 СО», доти, поки не досягнуть 90 95 злиття. Сполуки 1, 2, З і 4 розводять в 5 мл ідентичних середовищ до кінцевої концентрації 500 і 300 мкМ і потім уводять у клітини. Готоують кілька колб для того, щоб можна було одержати кінетичну криву вивільнення НМОВІ у відповідь на обробку ліками. Також одержують контроль тільки з етанолом. У потрібний момент часу середовище витягають із колби в 10-мл поліпропіленову пробірку, яку поміщають на лід на 5 хв. Супернатанти клітинних культур центрифугують при 1200 об/хв. протягом 4 хв. для видалення клітинного дебрису, після чого 4,5 мл супернатанта завантажують в обертовий стовпчик концентратора (АтісопФ Опга, мембрана, що відсікає 50 кДа, МегскК) для видалення ЕС5. Потім потік із цього стовпчика завантажують в інший стовпчик концентратора (АтісопФ ОКга, мембрана, що відсікає 10 кДа,

МегсК) і центрифугують при 3500 об/хв. для концентрування НМОВІ1 перед аналізом ЕГІЗА (ЗЕАЗОЗНиИ/ЗЕАЗООМИи, Сіоца-Сіопе Согр). Визначають величини 00 450 нм із використанням планшет-рідера Нубгій бупегду НА (ВіоТек). Величини поглинання зразків, оброблених ліками, нормалізують до зразків, оброблених носієм, для визначення кратності зростання вивільнення

НМОВІ у відповідь на обробку епокситигліанами.

Аналізи на екстерналізацію кальретикуліна. Екстерналізацію кальретикуліна визначають так, як описано раніше (боте;-Садепа еї аї., 2016). Коротко, клітини (А431, ММб649, В16-ОМА), культивовані в повному середовищі при 3720, 5595 СО», роз'єднують через трипсинізацію, центрифугують при 1200 об/хв. і промивають х2 свіжим середовищем. Після додаткового циклу центрифугування отриманий клітинний осад ресуспендують у концентрації 1х106 клітини/мл, після чого додають епокситигліан у кінцевій концентрації 500 або 300 мкМ. Також виконують 60 контроль тільки з етанолом. Клітинні суспензії інкубують при 372С, 5595 СО», і в зазначені моменти часу витягають 200 мкл зразка й інкубують з барвником ГІМЕ/ОЕАО аг гей протягом 5 хв. на льоді. Після цього клітини осаджують при 1200 об/хв. протягом 4 хв. і промивають х1

РВ5. Потім до кожного осаду додають 500 мкл РВ5, 0,25 95 формальдегіду, для виконання легкої фіксації, не ставлячи під загрозу цілісність плазматичної мембрани. Після цього клітини промивають х1 РВЗ і додають 100 мкл РВ5, 1 95 ВЗА, 2 мМ ЕДТК (буфер РАС»), що містить анти-кальретикулін (ар2907, Арсат; розведення 1:50). Після 1-годинної інкубації за кімнатної температури клітини центрифугують при 1200 об/хв. протягом 4 хв. і промивають х1 буфером

ЕАС5 перед інкубацією зі 100 мкл буфера БАС», що містить актикролячий АЇІеха488 в 1:750, протягом ще години за кімнатної температури. Клітини знову осаджують і потім ресуспендують в 500 мкл буфера ЕАСз для підготовки до проточної цитометрії.

Зразки, спочатку закривають Е5С-Н м Е5О-А для ідентифікації окремих клітин, після чого аналізують популяцію негативних (інтактних) клітин до барвника ГІМЕ/ЮЕАО (екст. 640 нм, ісп. 670/14) на зелену флуоресценцію (екст. 488 нм, ем. 530/30; екстерналізація кальретикуліна).

Потім визначають середні величини інтенсивності флуоресценції й будують графік залежності від часу.

Результати показують, що швидкий онкозис, викликаний епокситигліановими сполуками, також індукує характеристики імуногенної загибелі клітин з вивільненням/екстерналізацією критичних ОАМР, включаючи АТФ (Фіг. 4А і 48), НМВОТ (Фіг. 4С) і кальретикулін (Фіг. 40). Має місце значне вивільнення АТФ у межах 60 хвилин у всіх трьох ракових клітинних лініях, оброблених як двома концентраціями сполуки 1 (Фіг. 4А), так і сполук 2, З і 4 (Фіг. АВ). Ці сполуки також промотують вивільнення НМОВІ з ракових клітинних ліній. Після аналізу ЕГІЗА величини для оброблених клітин нормалізують до клітин, оброблених носієм, для визначення кратності зростання, показано, що сполука 1 підвищує вивільнення НМВОЇ1 у межах 120 хвилин на 40 95 для клітин АЗА1 і ММб649 (Фіг. 4сСі і 4Сії) і більш, ніж у З рази для клітин В16-ОМА (фіг. 4сСії). Сполуки 2, З і 4, які також аналізували на клітинах В16-ОМА, показують мінімум 2-кратне зростання вивільнення НМВОЇ1 із цієї клітинної лінії через 120 хвилин (Фіг. 4Сім). Дані для екстерналізації кальретикуліна після обробки З клітинних ліній сполукою 1 показують значне зростання середньої інтенсивності флуоресценції в межах 60 хвилин після обробки (Фіг. 40).

Відомо, що такі вивільнення/екстерналізація САМР промотують рекрутмент

Зо антигенпрезентуючих клітин, стимулюють ефективне поглинання антигенів, асоційованих з раковими клітинами, і стимулюють презентацію підмножин Т-клітин (КоїасаКому5Ка 5 Кирев, 2013).

Приклад 5. Фрагменти оброблених епокситигліаном ракових клітин "проковтуються" популяціями клітин СО11с", отриманими з кісткового мозку

СО11с є добре описаним маркером ЮОС/макрофагів (Мегай еї аї.,, 2013). Один шлях для дослідження потенціалу протиракових засобів (і індукованих ними асоційованих із загибеллю процесів) для промотування розвитку імуногенних реакцій включає визначення того, чи ведуть вони до поглинання клітинних компонентів СО11с" дендритними клітинами/макрофагами і їх наступного дозрівання в ропе їде антигенпрезентуючі клітини (АРС) (С!цептопрге? еї аї., 2002).

У даному прикладі автори демонструють, що онкозис, індукований сполукою 1 і спорідненими епокситиглаанами, веде до поглинання компонентів ракових клітин, що гинуть, такими клітинами.

Виділення й культивування клітин, отриманих з кісткового мозку (ВМОС). Спочатку в 7-8- тижневих мишей С57ВІ/б у стерильних умовах хірургічно видаляють великі й малі гомілкові кістки. Мозок вимивають із кісткової порожнини 10 мл охолодженого на льоді середовища К10 (з використанням голки 27б5/шприца в 50-мл поліпропіленову пробірку). Клітини осаджують при 1500 об/хв. протягом 5 хв. і промивають х2 охолодженим на льоді середовищем К10. Після ресуспендування осаду в 10 мл охолодженого на льоді середовища К10 клітини рахують із використанням удосконаленого гемоцитометра й висівають при щільності 2х105 клітин на планшет (чашка Петрі) в 10 мл К10 з додаванням 20 нг/мл мишачого М-С5Р. Усі чашки інкубують при 3720, 5965 СО», і в день З додають ще 10 мл К10 з 20 нг/мл ЗМ-С5БЕ. Клітини знову підгодовують у день 6 і використовують у наступних аналізах у день 7.

Експерименти з поглинання ВМОС. Перед спільною інкубацією з ВМОС клітини В16- ОМА трипсинізують, центрифугують при 1200 об/хв. протягом 4 хв. для осадження клітин і промивають х2 повним середовищем. Потім клітини забарвлюють 2 мкМ Сеї! ТгасКег сгееп у повному середовищі протягом 45 хв., після чого їх осаджують і промивають х2 як описано вище.

Потім мічені клітини В1Є6-ОМА обробляють сполуками 1, 2, З і 4 у двох концентраціях (500 або 300 мкм) у середовищі при щільності 1х105 клітини/мл протягом 30 і 60 хв., після чого клітини осаджують центрифугуванням, супернатант видаляють аспірацією, і клітинний осад промивають бо х1 повним середовищем. Після промивання оброблені клітини ресуспендують у середовищі

К10, завантажують у лунки б-ямкового планшета (Сопіпод, 23471, ультраслабке прикріплення до поверхні), і додають ВМОС. Спільні культури інкубують протягом 4 годин, після чого клітинні суспензії переносять у мікроцентрифужну пробірку й центрифугують при 1500 об/хв. протягом 5 хв. Осади ресуспендують в 100 мкл буфера БАС», що містить анти-СО11с-АРС, і інкубують протягом 10 хв. при 42С. Клітини знову осаджують, промивають х1! буфером ЕАСз5 і потім фіксують, використовуючи РВ5, 1 965 формальдегіду, протягом 10 хв. Після центрифугування й видалення супернатанта клітини ресуспендують в 500 мкл буфера ЕАС5 при підготовці для проточної цитометрії.

Зразки, спочатку закривають ЕЗС-Н м Е5О-А, потім 55С-Н м 55-А для ідентифікації окремих клітин. Потім визначають частку клітин СО11с- (екст. 640 нм, ісп. 670/14) з СМЕОАпіа (екст. 488 нм, ісп. 530/30) для оброблених і необроблених клітин, як відсоток від усіх клітин СО11 с».

Результати (Фіг. 5А і 58) показують, що онкозис, викликаний сполукою 1, промотує поглинання (тобто ефективне "проковтування") фрагментів ракових клітин СО11с", що гинуть дендритними клітинами/макрофагами. Виявляється, що таке поглинання залежить як від концентрації сполуки 1, так і від часу обробки, так що при 500 мкМ сполуки 1 поглинання антигену відбувається більшою мірою за коротший період часу в порівнянні із застосуванням 300 мкМ. Це узгоджується з кінетикою онкозиса, яка спостерігається в прикладі 3. Фіг. 5С показує, що сполуки 2, З і 4 також здатні індукувати реакцію загибелі клітин, яка є імуногенною іп міго, тобто промотують поглинання СО11с-ВМОС.

Приклад 6. Комбінація сполуки 1 з інгібіторами контрольних точок імунітету

Види терапії з інгібіторами контрольних точок імунітету, зокрема точок, таргетуючих рецептори, залучені в Т-клітинну імуносупресію (наприклад, цитотоксичний (І Т- лімфоцитасоційований білок 4 (СТІ А-4) або білок запрограмованої загибелі 1 (РО-1) і його ліганд РО-І 1), значно поліпшили результати пацієнтів при деяких типах раку на пізній стадії, включаючи меланому, нирково-клітинний рак, рак сечового міхура й плоскоклітинний рак голови й шиї (НЯЗСС) (Мзаоиеї 5 Маззагеїїї, 2016; Зпагта 8. Аїйїзоп, 2015). Однак первинна й де помо резистентність до таких ІСІ ліків є значною клінічною проблемою. Крім того, широке клінічне вивчення віддалених результатів показує, що в деяких пацієнтів з меланомою розвивається резистентність до лікування й відбуваються рецидиви захворювання (О'оппеїЇ еї аї., 2017).

Зо Терапії, що комбінують ІСІ із сполуками, які можуть діяти як ад'юванти шляхом промотування загибелі імуногенних клітин (зокрема, у результаті підвищеної інфільтрації імунних клітин у паренхіму пухлини й поглинання/презентації антигену), дають надію на подолання деяких обмежень ІСІ і поліпшення загальних клінічних результатів (Умогкеппе еї аї., 2014; Ківраз еї аї., 2017). У цьому прикладі й у прикладі 7 перевіряють результати комбінацій ІСІ і ін'єкції у вогнище ураження сполуки 1.

Схему експериментального підходу можна бачити на Фіг. бА. Коротко, 6-7 тижневим мишам

С57ВІ/6 ін'єктують підшкірно (5.с.) в обидва боки клітини мишачої меланоми В16-Е10-0ОМА (2х105 клітин на місце в 100 мкл). Пухлинам дозволяють розвиватися до приблизно 5-50 мму, після чого ін'єктують і.р. 200 мкг анти-РО-1 (ВМР1-14, ВіохсСеї), анти-СТІ А-4 (9НІ10, Віохсеї!)) або ізотип контрольного антитіла (2АЗ і Ід сирійського хом'ячка, ВіохсСеї) на мишу (день -2). У день 0 в обидві пухлини ін'єктують 1І.Т. або сполуку 1 (15 мкг в 50 мкл) або тільки носій (нобс.).

Кожна миша одержує додаткову і.р. ін'єкцію того ж антитіла, яке вводили в день -2 (знову 200 мкг). Антитіла вводять ще З рази і.р. ін'єкцією кожні 2 дні. Вимірюють обсяг оброблених пухлин з використанням штангенциркулів, як описано раніше (Воуїе еї аї., 2014), і визначають виживання мишей згодом.

Результати, представлені на Фіг. 6В і 6С, показують, що сполуку 1 можна комбінувати з анти-РО-1 і анти-СТІ А-4 для обмеження росту пухлини й поліпшення виживання мишей до більш високого ступеня, ніж при лікуванні одним агентом. Виявляється, що цей ефект залежить від концентрації для кожної комбінації сполука 1/СІ. Наприклад, ін'єкція 30 мкг сполуки 1 разом з анти-?РО-1 веде до поліпшення виживання/зменшеного росту пухлини у порівнянні із застосуванням 30 мкг однієї сполуки 1 (Фіг. бВії, ім). Цього не спостерігають, коли використовують 15 мкг сполуки 1 у тих же комбінаціях, тобто, не відбувається поліпшення у виживанні або рості пухлини (Фіг. 6Ві, її). Ситуація зворотна, коли використовують анти-СТІ А4, де 15 мкг сполуки 1 у комбінованій обробці (Фіг. бСі, ї) дають оптимальну реакцію, а 30 мкг сполуки 1 не дають (Фіг. бСіїї, ім).

Приклад 7. Спостереження абскопального ефекту при використанні сполуки 1 у комбінації з інгібіторами контрольних точок імунітету

Схему експериментального підходу можна бачити на Фіг. 7А. Коротко, 6-7 тижневим мишам

С57ВІ/6 ін'єктують 5.с. в обидва боки клітини мишачої меланоми В16-Е10-ОМА (2х105 клітин на бо місце в 100 мкл). Пухлинам дозволяють розвиватися до приблизно 5-50 мм", після чого ін'єктують і.р. 200 мкг анти-РО-1 (АВМРІ1-14, ВіохсеїЇ), анти-СТІ А-4 (9НІ10, ВіохсеїЇ) або ізотип контрольного антитіла (2А3, ВіохсСеїЇ) на мишу (день -2). У день 0 у саму більшу із двох пухлин (приблиз. 50-75 мм3У) ін'єктують І.Т. або сполуку 1 (15 мкг в 50 мкл) або тільки носій (нос.). пухлину, що залишилася, залишають неопрацьованою, і кожна миша одержує додаткову і.р. ін'єкцію того ж антитіла, яке вводили в день -2 (знову 200 мкг). Антитіла вводять ще З рази і.р. ін'єкцією кожні 2 дні. У ході експерименту вимірюють обсяг як оброблених, так і необроблених пухлин, як докладно описане раніше.

Результати показані на Фіг. 7В. Результати показують, що ефективно видаляються не тільки пухлини, оброблені комбінацією антитіл і сполуки 1, але що деякі необроблені сусідні пухлини також показують реакцію на комбіновану терапію, яку не спостерігають із будь-яким одним засобом.

Приклад 8. Супресорні клітини мієлоїдного походження впливають на ефективність низької дози сполуки 1

Супресорні клітини мієлоїдного походження (МОСС) є незрілими мієлоїдними клітинами, які можуть пригнічувати імунну відповідь хазяїна на пухлини декількома шляхами (Ои еї аї., 2016).

Автори винаходу використовували нокаутованих мишей С57ВІ/5 із гранулоцитарним колонієсєтимулюючим фактором (СЕ) для одержання моделі для оцінки майбутнього потенціалу для можливих комбінованих терапій, які включають сполуку 1 з молекулами, які інгібують або блокують білки (наприклад, індолеамін-2,3-диоксигеназу (ІБО)), асоційовані з рекрутментом і функцією МОСС. ЗС5Е - основний регулятор продукування й руху нейтрофілів також відіграє критичну роль у міграції й проліферації МОЗС (Іі еї аї., 2016). З використанням

СС5ЕК нокаутованої моделі, запропонованої авторами винаходу, перевіряють можливу роль гранулоцитарних М5ОС в обмеженні ефективності монотерапії (у субоптимальній дозі) сполуки 1 проти колоректальної аденокарциноми МСЗ38.

Коротко, 6-7 тижневим мишам дикого типу С57ВІ/6 і дові ін'єктгують 5.с. в обидва боки клітини мишачого колоректального раку МС38 (1х105 клітин на місце в 100 мкл). Пухлинам дозволяють розвиватися до приблизно 5-50 мму, після чого ін'єктують І.Т. 15 мкг сполуки 1 або носій (нос.) (50 мкл). Обсяг оброблених пухлин відслідковують так, як описано раніше в прикладах б і 7. Порівняння розміру пухлин і виживання між ін'єктованими сполукою 1

Зо пухлинами в дикого типу (м) і нокаутованих мишей з ЗСЗЕРЕ. можна бачити на Фіг. 8.

З урахуванням ролі СС5ЕК у рекрутменті гранулоцитів ці дані припускають, що така інфільтрація клітин імунної системи може обмежуватися протираковою ефективністю сполуки 1 у відомій субоптимальній дозі (15 мкг). Комбінації сполуки 1 або аналогів зі сполуками, які запобігають розвитку таких імуносупресивних клітинних популяцій (наприклад, інгібіторами

І0О), у такий спосіб можуть привести до кращої протиракової ефективності й поліпшити виживання пацієнтів.

Фахівцям в області техніки, до якої відноситься винахід, слід мати на увазі, що можливі численні його модифікації, що не виходять за межі сутності й обсягу винаходу.

Посилання

Слід мати на увазі, що якщо в даному описі дається посилання на будь-яку публікацію з рівня техніки, це посилання не є визнанням того, що ця публікація утворює частину загальних знань у даній області техніки, будь то в Австралії або будь-якій іншій країні.

Адатз еї аї., 2015. Від орропипійез ог зтаї! тоїесшціев5 іп іттипо-опсоіоду. Маїште Неміємв

Огид Оівсомегу, 14, 603-622.

Апеї! еї аІ., 2012. Ргоївїп Кіпазе С 0 (РКСО) іп паїига! Кійег се їТпсіоп апа апіі-штоиг іттипйу. Егопііег5 іп Іттипо|оду, З, 187.

Веуаєт В. 4. Рієї5 МУ., 1994. МоІесшаг теспапівтв ої Штог песговів Тасюг-іпдисей суїогохісіїу.

УМунаї ме до ипаегтвіапа апа мнаї ме до пої. РЕВЗ І еЦегв, 340: 9-16.

Веуаепнептап, 2010. СО4--Т-сеї! НеІр іп Ше Штог тіїїєи із гедцігейд ог гестийтепі апа сую!уїйс

Типсіоп ої СО8--Т1 ІутрПосуїевз. Сапсег Везвєагсі, 70:8368-8377.

Воуїе еї аї., 2014. ІпігаІевіопа! іпіесіоп ої Ше помеІ РКС асіїмаг ЕВС-46 гарідіу абіаїте5 їмтошів іп тоизе тодві!5. Ріоз Опе, 9, е108777.

Вгегаг єї аї., 2015. РКс-Іпеїа іп гедшіайгу апа епесюг Т-сеї! Типсіоп5. Екопійег5 іп Іттипо!іоду, б, 530.

Виткпоїдег єї аї., 2014. Титог-іпдисей репигбаїййоп5 ої суїюКіпе5 апа іттипе сеїЇ пеймогКв.

Вбра-теміемв оп Сапсег, 1845: 1845201.

СНапеїа!. 2013.ОеєїесііопоїпесгозізругеІєазеопПасіаїєдепуайгодепазеасіїмну. Меїподзтоїесшіагрі оіоду, 979: 65-70.

Сопеп еї а!., 2000. СО4--1 сеї іп адоріїме іттипоїНегару апа Не іпаїгесї теспапівт ої Штог (510) геіесійоп. Стййса! Неміемв5 Іттипоіоіоду, 2:85-95.

Репагадо ві а!., 20182Іпіегасіопореїмеепіутрпосуїезапатуе!оіасеїІзгедиіагерго- «СапсегапамеїавіазізНеміємв, 29: 309-316.

Буеєг еї аї., 2016. Опсоїуїїс дгопр В епадепоїйсігем теаіаев поп-ароріоїіс сеї! аДеаїй м/п тетьгапе аїізгирійоп апа геїІеазе ої іпПаттайюгу тедіаютв. Моієсцаг ТНегару Опсо/міісв., 4: 18-30.

Епйатап еї аї., 2012. Те іттипе сопіехіцге іп питап їштоигв: ітрасі оп сіїпіса! ошсоте.

Маїшге Вемієм5 Сапсегапатеїавіавівгеміємувомісена!., 2912.Соогаіпаіедгедиіанопоїтув!Іоідсеїїзруїштоитг5.Маїигегемівемвіттипо!іоау, 12: 2530968.

СаїПи27івїа!., 2017 ІттиподепіссеПавєаїНіпсапсегапаіп'есііоизаізеазе.МаїигегеміемвіттипоЇоду «17:97-111.

Сагаеєїа!.,2017.Рагшодепгезропзе-

ІКегестийтепіападасіїманопоїпешгорпії5рувзіенІвіттиподепісадуіпдсеїІбагімезпешїгорнії- теаіагеагезідцаїсеїІКіїїпу.СеїІдеатайегепііаноп.Адмапсеопіїперибіїсайоп2г4Ребгиагуг2о17.

Сотег-Садепає!а!.,2016.Іттипе-зувіет-дерепаепіапіі--итоигасіїмнуогтаріапі- дегімедроїурпепоїгіспітасіопіпатеіапотатоизетодве!.СеїІдеаїнапааізеазе, 7:6е2243.

Сюептопргегеїа!.,2002.АпііїдепргезепіайопапаїсеїІві тиайопрудепагйіссеЇІ5.Аппиа|гемівемоїіт типоіоду, 20:621-667.

Наареїпеїа!., 2011 ІпЧаттаїйопагмепруштоиг-5ресіїісіпсеїІвргоїесізадаіпвібр- сеїПсапсег.Маїштесоттипісайоп5, 2:240.

Наабреїпега!., 2016. ІптепеикКіп-1і5гедцігей югсапсегегадісайоптедіаїєавбутштог- в5ресійсіпісеїв.Опсоіттипо!оду, 5 (1): е1039763.

Наареїй Опсоіїттипоіодуа. 2012. А тоде! їог сапсег-зурргезвіме іпПаттаїіоп.

Опсоіїттипоіоду, 1 (7): 1146-1155.

Нотгі еї аї., 1989. Роїє ої Шштог песгові5 Тасіог апа іпіепеицкКіп 1 іп датта-іпіеПегоп-рготоїєй асіїманоп ої тоивзе Штогісіда! тасторнадез. Сапсег Везеєагсиі, 49:2606-2614.

Ни-ПезКомап еї аїЇ., 2017. Мем сотрБіпаййоп зігаїедієє ибіпуд Ргодгаттей СеїЇ Оєаїйн 1/Ргодгаттеєа Сеї! Оєаїйй І ідапа 1 спескКроїпі іппібітюгв5 аз а баскропе. Тне Сапсег Уоигпаї, 23, 10- 22.

Капа єї аї., 2001. РКСД тоашіагез апіїдеп гесеріог 5ідпаїїпу міа тгедшіайоп ої ВІК тетбргапе

Іосаїїзайоп. ЕМВО .., 20, 5692-5702.

Зо Кіт еї аї., 2003. Міоспопагіа! рептеарійу їШапейоп: а соттоп раїймжау 0 песговів апа ароріовзіз. Віоспетіса! Віорпузіса! Везватгсй Соттипісайіопв, 304: 463-470.

Кпшївзоп КІ а Оівіє МІ, 2005. Титог апіїдеп-5ресіїс Т Неїрег сеї іп сапсег іттипіну апа іттипоїНегару. Сапсег Іттипої ІттипоїНег., 54: 721-728.

Коїас2гкомяКа Е й Киреб5 Р., 2013. Мешторпі! гестийтепі апа їпсіоп іп Неайй апа іпаттаїййоп. Маїшге Неміємв Іттипоіоаду, 13: 159-175.

Ктетег сеї аї., 2013. Іттиподепіс сеї! авайй іп сапсег Іегару. Аппиа! Неміем5 Іттипоіоду, 31: 51-72.

ЦП еїаї.,, 2016. с-Сапсег а Кеу тодшиіаюг ої М5С апа соціа ре а роїепійа!| Інегареціїс іагоєї іп соїйі5-аззосіаїейд соіогесіа!| сапсегв5. Ргоївїп Сеї, 7: 130-140. іт еї аї., 2015. Ргоїєїп Кіпазе С іп Шїе іттипе зувівет: їїот 5ідпаїїпуд о спготаїйп гедшіайоп.

Іттипо!іоду, 146, 508-522.

Мапопеу есеї аї., 2015. Сотрбіпайоп сапсег іттипоїпегару апа пем/ іттипотоадиіайогу їагдеїв.

Маїшиге Немієже Огид Оівсомегу, 14, 561-585.

Мегаай еї а!., 2013. Тне Оеєпатйіс СеїЇ Ііпеаде: Опіодепу апа Рипсіп ої Оепайіс СеїЇє апа ТНеїг Зирзеїв іп Те біваду біаіе апа їйе Іттипоїпегеніпд. Аппица! Вемієм ої Іттипоіоау, 31: 563- 604.

Мзаоциеї! Р. 5 Маззагеїїї Е., 2016. Іттипе СпесКроїпі Тнегару іп Неай апа МесК Сапсегв. Те

Сапсег уошгпаї, 22: 108-116.

Мей 27Пеї еї аІ., 2015. Тагдейпуд Ше ТОВ раїпугау Гог сапсег Іпегару. Рпапгтасоїоду 4 Тпегарешісв, 147: 22-31.

О"Вієп еї аї!., 2014. І оса! аріайме ІНегаріев: Орропипійев ог тахітівіпд іттипе епдадетепі апа асіїмайоп. ВВА Немієм Сапсег, 1846: 510-523.

Одоппеї! еї а. 2017. Везізіапсе юю РОТ/РОЇІ 1 спескКроїпі іппібйіоп. Сапсег Тгеаїтепі Неміємув, 52:71-81.

Раздез еї аї., 2010. Іттипе іпійгайоп іп питап їШштотгв: а ргодповіїс Тасіог Ійаї зпоша пої ре ідпогед. Опсодепе, 29: 1093-1102.

Ріеїйтогег єї аї!., 2006. РКСа і5 ехргеззеа іп Т-сеїї апа КпосКоці тісе Наме Т-сеї! асіїмайноп апа іттипіу дегїесів. дошитаї ої Іттипо|оду, 176, 6004-6011.

Ои еї аїІ., 2016. Ехрапвіоп апа Тпсіп5 ої туеєїоід деймей 5ирргезвог сеї іп Те Штоиг тістоепмігоптепі. Сапсег І еЦег5, 380: 253-256.

Віра: сеї аї!., 2017. Опсоїуїїс Мігоїпегару Рготоїез Іпігтаїштога! Т Сеї! Іптійгайоп апа Ітргомев5

Апіі-Ра-1 ІттипоїНегару. Сеїї, 170(6):71109-19.е10.

ЗепоуйШПа еї аї., 2012. Та! маїсп: ргодповіїс апа ргєдісіїме маше ої Ше іттипе іпіййгайе іп сапсег. Опсоіїттипоїіоду 1: 1323-1343.

Зпагта Р. 5 Аїйвоп УР, 2015. Тне їшиге ої іттипе спесКроіпі Іпегару. 5сієпсе, 348(6230):56- 61.

ЗтуїШ еї аї., 2015. СотрБіпайоп сапсег іттипоїйпегарієз їайогей о Ше Штоиг тістоепмігоптепі. Мате Неміємв Сіїпіса! Опсоіоду, 13, 143-158. зидаптанп есеї аї., 1985. Несотбріпапі питап їштог песговів Тасіог-аірна: еМПесів оп ргоїїТегайоп ої погтаї апа їмапвіогтеа сеїв іп міго. Зсіепсе, 230:943-945.

МоЖКкепне еї аї., 2014. Іттиподепіс НОМ-теаіаїей опсоїузіз 5паре5 Ше апійитог іттипе гезропозе апа сопігіршіев То Шегарешіс ейПісасу. Моіесшаг (Шегару: Ше |ошгпа! ої Ше Атеїісап

Босівіу ої Сепе Пегару, 22: 123-31.

Claims

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Спосіб лікування пухлини, який включає введення суб'єктові, який цього потребує, епокситигліанової сполуки або її фармацевтично прийнятної солі й інгібітора контрольної точки імунітету, причому вказану епокситигліанову сполуку вводять локально в пухлину, де епокситигліанові сполуки є сполуками формули (ІЇ) Око нс й Око Мн сна я! р, СН нН Н Ге! Н но (в) Нв, сте (в) або її геометричного ізомеру або стереоіїзомера, або фармацевтично прийнятної солі, де Ве є водень або -В:о; В? є гідрокси або ОКо; Не є -Сі-го-алкіл, -Сг-го-алкеніл, -С2-го-алкініл, -С(О)С:-го-алкіл, -С(О)Сг2-го-алкеніл, -С(О)Сг-го- алкініл, -С(О)-циклоалкіл, -С(О)Сі-іо-алкілциклоалкіл, -С(О)С»2-іо-алкенілциклоалкіл, -С(О)Сг-10- алкінілциклоалкіл, -С(О)-арил, -С(О)Сі-о-алкіларил, -С(О)Сг-о-алкеніларил, /---С(О)Сг-1о- алкініларил, -С(О)Сі-іо-алкіл-«С(О)Кч:ї, -С(О)Сг2-ло-алкеніл-С(О)Кч:ї, -С(О)Сг-о-алкініл-С(О)К т, - С(О)Сі-о-алкіл-СН(ОК: (ОВ), -С(О)Сг-о-алкеніл-СН(ОК: ОВ), -С(О)Сг-1о-алкініл- сн(ОК ОВ), -С(О)Сі-ло-алкіл-5А11, -С(О)Сг2г-о-алкеніл-ЗВиї, -С(О)Сг-о-алкініл-ЗА11, -С(О)С- ло-алкіл-С(О)ОК і, -С(О)С2г-о-алкеніл-«С(О)ОК ії, -С(О)Сг2-іо-алкініл-«С(О)ОК:ї, -С(О)Сі-о-алкіл- С(О)5Е 1, -Ф(О)Сг2-іо-алкеніл-С(О)ЗК и, -С(О)С2-1о-алкініл-С(О)ЗЕА 1, або но Віо є -Сі-в-алкіл, -Сгв-алкеніл, -С2-в-алкініл, -С(О)Сч-в-алкіл, -С(О)Сг-в-алкеніл, -С(О)Сг-в-алкініл, - С(О)-арил, -С(О) С: в-алкіларил, -С(О)Сг-в-алкеніларил або -С(О)Сг-в-алкініларил;

і Ві: є водень, -С:-іо-алкіл, -Сг-о-алкеніл, -Сг-іо-алкініл, циклоалкіл або арил; причому кожна алкільна, алкенільна, алкінільна, циклоалкільна або арильна група є необов'язково заміщеною, і де інгібітором контрольної точки імунітету є антитіло антирецептор запрограмованої загибелі 1 (РО-1) або антитіло антицитотоксичний Т-лімфоцитасоційований білок 4 (СТІ А-4), де пухлина є пухлиною, що має вроджену чи набуту резистентність до монотерапії з інгібіторами контрольних точок імунітету.

2. Спосіб лікування або попередження однієї або декількох сторонніх пухлин у суб'єкта, який включає введення суб'єктові який цього потребує, епокситигліанової сполуки або її фармацевтично прийнятної солі й інгібітора контрольної точки імунітету, причому зазначену епокситигліанову сполуку вводять локально в пухлину, відмінну від зазначеної однієї або декількох сторонніх пухлин, де епокситигліанові сполуки є сполуками формули (ІІ) Ок Нн о нс Не Мн сна Н нс р, СНз Нн н о н но в) н В; що (І) або її геометричного ізомеру або стереоіїзомера, або фармацевтично прийнятної солі, де Не є водень або -В'о; В? є гідрокси або ОКо; кожен Ко незалежно вибраний з наступних груп: -С:-го-алкіл, -С2-го-алкеніл, -Сг-го-алкініл, - С(О)С: го-алкіл, -С(О)Сг го-алкеніл, -С(О)Сг-го-алкініл, -С(0О)-циклоалкіл, -(О)Сі-о- алкілциклоалкіл, -С(О)С2-1о-алкенілциклоалкіл, -С(О)С2-1о-алкінілциклоалкіл, -С(О)-арил, -С(О)С- то-алкіларил, -С(О)Сг-іо-алкеніларил, -С(О)Сг-іо-алкініларил, -С(О)С1-іо-алкіл-С(О)В и, -С(О)Сг-10- алкеніл-С(О)К и, -С(О)Сг-іо-алкініл-С(О)К и, -С(О)Сі-ло-алкіл-СН(ОК ХО), -С(О)Сг-іо-алкеніл- СН(ОКи)ОВІ1), -С(О)Сг-іо-алкініл-«СН(ОК (ОВ), -С(О)Счі-1о-алкіл-ЗВ11, -«С(О)Сг-іо-алкеніл-ЗВ и, -С(О)Сг-іо-алкініл-ЗНії, /--С(О)Сі-о-алкіл-«С(О)ОВ:ї, 0 -С(О)Сг-о-алкеніл-С(О)ОВч:ї, 0 -С(О)Сг-1о- алкініл-С(О)ОК::ї, /-С(О)Сч-ло-алкіл-С(О)5К ії, / -С(О)Сг-о-алкеніл-С(О)5К:ї, /-С(О)Сг-о-алкініл- С(О)5Ач, о Ю в ме: нн ОКОМ лввлювнія певну ва не ВК вловнкинія ве я Зо Во є -Сі-в-алкіл, -С2-є-алкеніл, -С2-в-алкініл, -С(О)Сч-в-алкіл, -С(О)С2-в-алкеніл, -С(О)С»-в-алкініл, - С(О)-арил, -С(О) С: в-алкіларил, -С(О)Сг-в-алкеніларил або -С(О)Сг-в-алкініларил; і Ві: є водень, -С1-1о-алкіл, -С2-о-алкеніл, -Сг-іо-алкініл, циклоалкіл або арил; причому кожна алкільна, алкенільна, алкінільна, циклоалкільна або арильна група є необов'язково заміщеною, і де інгібітором контрольної точки імунітету є антитіло антирецептор запрограмованої загибелі 1 (РО-1) або антитіло антицитотоксичний Т-лімфоцитасоційований білок 4 (СТІ А-4),

де пухлина, в яку вводять епокситигліанову сполуку, є пухлиною, що має вроджену чи набуту резистентність до монотерапії з інгібіторами контрольних точок імунітету.

З. Спосіб за п. 1 або 2, у якому епокситигліанову сполуку вводять за допомогою інтратуморальної ін'єкції.

4. Спосіб за будь-яким із пп. 1-3, у якому інгібітор контрольної точки імунітету вводять системно.

5. Спосіб за п. 4, у якому інгібітор контрольної точки імунітету вводять за допомогою парентеральної ін'єкції.

6. Спосіб за будь яким з пп. 1-5, у якому кожен з Ке» вибирають незалежно з -С(О)С:-го-алкілу, - С(О)Сг-го-алкенілу, -С(О)Сг-го-алкінілу, -С(О)циклоалкілу, -С(О)Сч-1о-алкілциклоалкілу, -С(О)Сг2-10- алкенілциклоалкілу, -С(О)Сг-іо-алкінілциклоалкілу, -С(О)арилу, -С(О)Сі-1іо-алкіларилу, -С(О)Сг-10- алкеніларилу, -С(О)С2-іо-алкініларилу, -С(О)Сі-іо-алкіл-С(О)Кч:ї, -С(О)Сг-о-алкеніл-С(О)К и, - С(О)Сг-іо-алкініл-С(О)К 1, -С(О)Сі1-ло-алкіл-СН(ОК ХО), -С(О)С2-1о-алкеніл-«СН(ООК ОВ), - С(О)Сг-о-алкініл-«СН(ООК: (ОВ), 0 -С(О)Сі-ло-алкіл-ЗАчї, 0 -С(О)С2-о-алкеніл-ЗНії, /--С(О)С2-10- алкініл-ЗНії, /-С(О)Сі-ло-алкіл-С(О)ОКії, 0 -С(О)С2-1о-алкеніл-С(О)ОК:ї, 0 -С(О)Сг-іо-алкініл-

15. С(ФООК т, -Ф(О)Сч-ло-алкіл-С(О)5Еи, -С(О)Сг-1о-алкеніл-С(О)5А и ії -С(О)Сг-о-алкініл-С(О)5Е 1.

7. Спосіб за п. 6, у якому кожен з Ке вибирають незалежно з -С(О)Сі-го-алкілу, -С(О)С2-2о- алкенілу, -С(О)Сг-го-алкінілу, -С(О)циклоалкілу, /-С(О)Сі-іо-алкілциклоалкілу, /--С(О)Сг-10- алкенілциклоалкілу, -С(О)С»2-іо-алкінілциклоалкілу й -С(О)арилу.

8. Спосіб за п. 6 або 7, у якому кожен з Ке вибирають незалежно з -С(О)Сі-го-алкілу, -С(О)С2-2о- алкенілу, -С(О)Сг-го-алкінілу.

9. Спосіб за будь-яким із пп. 1-8, у якому Ке є водень, -С(О)Сі-в-алкіл, -«С(О)Сг-в-алкеніл, -С(О)Се2- в-алкініл або -С(О)арил.

10. Спосіб за будь-яким із пп. 1-9, у якому К»7 є гідроксил, -ОС(О)Сз-в-алкіл, -ОС(О)Сг-в-алкеніл або -ОС(О)Сг-в-алкініл.

11. Спосіб за будь-яким із пп. 1-10, у якому епокситигліанову сполуку формули (ІЇ) вибирають з наступних сполук 12-тиглоїл-13-(2-метилбутаноїл)-6,7-епокси-4,5,9,12,13,20-гексагідрокси-1-тиглієн-3-он; 12,13-ди(2-метилбутаноїл)-6,7-епокси-4,5,9,12,13,20-гексагідрокси-1-тиглієн-3-он; 12-гексаноїл-13-(2-метилбутаноїл)-6,7-епокси-4,5,9,12,13,20-гексагідрокси-1-тиглієн-3-он; 12,13-дигексаноїл-6б,7-епокси-4,5,9,12,13,20-гексагідрокси-1-тиглієн-3-он; 12-міристоїл-13-(2-метилбутаноїл)-6,7-епокси-4,5,9,12,13,20-гексагідрокси-1-тиглієн-3-он; 12-тиглоїл-13-(2-метилбутаноїл)-6,7-епокси-4,5,9,12,13-пентагідроксі-20-ацетилокси-1-тиглієн-3- он; 12-міристоїл-13-ацетилоксі-6,7-епокси-4,5,9,12,13,20-гексагідрокси-1-тиглієн-3-он; 12-пропаноїл-13-(2-метилбутаноїл)-6,7-епокси-4,5,9,12,13,20-гексагідрокси-1-тиглієн-3-он; 12,13-дитиглоїл-б, 7-епокси-4,5,9,12,13,20-гексагідрокси-1-тиглієн-3-он і 12-(2-метилбутаноїл)-13-тиглоїл-б, 7-епокси-4,5,9,12,13,20-гексагідрокси-1-тиглієн-3-он або їх фармацевтично прийнятних солей.

12. Спосіб за будь-яким із пп. 1-11, у якому інгібітор контрольної точки імунітету вводять у вигляді декількох доз.

13. Спосіб за п. 12, у якому кілька доз уводять до, одночасно й/або після введення епокситигліанової сполуки.

14. Спосіб за п. 13, у якому першу дозу інгібітора контрольної точки імунітету вводять до введення епокситигліанової сполуки.

15. Спосіб за будь-яким з пп. 12-14, у якому дозу інгібітора контрольної точки імунітету вводять одночасно з епокситигліаановою сполукою.

16. Спосіб за будь-яким із пп. 12-15, у якому одну або кілька доз інгібітора контрольної точки імунітету вводять після введення епокситигліанової сполуки.

17. Фармацевтична композиція, яка включає епокситигліанову сполуку або її фармацевтично прийнятну сіль і інгібітор контрольної точки імунітету й, необов'язково, фармацевтично прийнятний носій, де епокситигліанові сполуки є сполуками формули (ІЇ)

ОВ Н ніс Ов Мн сна Ід! Нас р. СН Н Н о Нн но в) НК, он (в) або її геометричний ізомер або стереоіїзомер, або фармацевтично прийнятна сіль, де Не є водень або -В'о; В? є гідрокси або ОКо; кожен з Ко незалежно вибраний з наступних груп: -С:-го-алкіл, -Сг-го-алкеніл, -Сг-го-алкініл, - С(О)С: го-алкіл, -С(О)Сг го-алкеніл, -С(О)Сг-го-алкініл, -С(0О)-циклоалкіл, -(О)Сі-о- алкілциклоалкіл, -С(О)С2-1о-алкенілциклоалкіл, -С(О)С2-1о-алкінілциклоалкіл, -С(О)-арил, -С(О)С- то-алкіларил, -С(О)Сг-іо-алкеніларил, -С(О)Сг-іо-алкініларил, -С(О)С1-іо-алкіл-С(О)В и, -С(О)Сг-10- алкеніл-С(О)Ки, -С(О)Сг-о-алкініл-С(О)В:, -С(О)Сі-о-алкіл-СН(ОК ОВ), -С(О)Сег-іо-алкеніл- СнН(ОКОвВ::), -С(О)Сг-іо-алкініл-СН(ОМК: (ОВ), -С(О)Сі-ло-алкіл-ЗА 11, -С(О)Сг-іо-алкеніл-ЗА 11, -С(О)Сг-іо-алкініл-ЗНії, /--С(О)Сі-о-алкіл-«С(О)ОВ:ї, 0 -С(О)Сг-о-алкеніл-С(О)ОВч:ї, 0 -С(О)Сг-1о- алкініл-С(О)ОК::ї, /-С(О)Сч-ло-алкіл-С(О)5К ії, / -С(О)Сг-о-алкеніл-С(О)5К:ї, /-С(О)Сг-о-алкініл- С(О)5Ач, Ох хвата ин Я Коновал опеньок або Св заапюмнія себе о Во є -Сі-в-алкіл, -С2-є-алкеніл, -С2-в-алкініл, -С(О)Сч-в-алкіл, -С(О)С2-в-алкеніл, -С(О)С»-в-алкініл, - С(О)-арил, -С(О) С: в-алкіларил, -С(О)Сг-в-алкеніларил або -С(О)Сг-в-алкініларил; і Ві: є водень, -С1-1о-алкіл, -С2-о-алкеніл, -Сг-іо-алкініл, циклоалкіл або арил; причому кожна алкільна, алкенільна, алкінільна, циклоалкільна або арильна група є необов'язково заміщеною, і де інгібітором контрольної точки імунітету є антитіло антирецептор запрограмованої загибелі 1 (РО-1) або антитіло антицитотоксичний Т-лімфоцитасоційований білок 4 (СТІ А-4).

18. Набір для лікування пухлини, який включає композицію, що містить епокситигліанову сполуку, і композицію, яка містить інгібітор контрольної точки імунітету, де епокситигліанові сполуки є сполуками формули (ІІ)

Ока Мн сна н р. нс СН Н Н о Нн но в) оте (0) або її геометричний ізомер або стереоізомер, або фармацевтично прийнятна сіль, де Не є водень або -В'о; В? є гідрокси або ОКио; кожен з Бе незалежно вибраний з наступних груп:-С:-го-алкіл, -Сгго-алкеніл, -С2-го-алкініл, - С(О)С: го-алкіл, -С(О)Сг го-алкеніл, -С(О)Сг-го-алкініл, -С(0О)-циклоалкіл, -(О)Сі-о- алкілциклоалкіл, -С(О)С2-1о-алкенілциклоалкіл, -С(О)С2-1о-алкінілциклоалкіл, -С(О)-арил, -С(О)С- то-алкіларил, -С(О)Сг-іо-алкеніларил, -С(О)Сг-іо-алкініларил, -С(О)С1-іо-алкіл-С(О)В и, -С(О)Сг-10- алкеніл-С(О)Ки, -С(О)Сг-о-алкініл-«С(О)К чи, -С(О)Сі-о-алкіл-СН(ОК ОВ), -С(О)Сег-іо-алкеніл- СнН(ОКОвВ::), -С(О)Сг-іо-алкініл-СН(ОМК: (ОВ), -С(О)Сі-ло-алкіл-ЗА 11, -С(О)Сг-іо-алкеніл-ЗА 11, -С(О)Сг-іо-алкініл-ЗНії, /--С(О)Сі-о-алкіл-«С(О)ОВ:ї, 0 -С(О)Сг-о-алкеніл-С(О)ОВч:ї, 0 -С(О)Сг-1о- алкініл-С(О)ОК::ї, /-С(О)Сч-ло-алкіл-С(О)5К ії, / -С(О)Сг-о-алкеніл-С(О)5К:ї, /-С(О)Сг-о-алкініл- С(О)5Ач, о о Ах ло пвій ей я ОО СЯКМ кцвенкя и и аа ПО зпетканія не Во є -Сі-в-алкіл, -С2-є-алкеніл, -С2-в-алкініл, -С(О)Сч-в-алкіл, -С(О)С2-в-алкеніл, -С(О)С»-в-алкініл, - С(О)-арил, -С(О) С. в-алкіларил, -С(О)Сг-в-алкеніларил або -С(О)Сг-в-алкініларил; і Ві: є водень, -С1-1о-алкіл, -С2-о-алкеніл, -Сг-іо-алкініл, циклоалкіл або арил; причому кожна алкільна, алкенільна, алкінільна, циклоалкільна або арильна група є необов'язково заміщеною, і де інгібітором контрольної точки імунітету є антитіло антирецептор запрограмованої загибелі 1 (РО-1) або антитіло антицитотоксичний Т-лімфоцитасоційований білок 4 (СТІ А-4).

19. Набір за п. 18, який включає одну або декілька доз епокситигліанової сполуки й одну або декілька доз інгібітора контрольної точки імунітету.

20. Набір за п. 18 або 19, який включає одну або декілька доз епокситигліанової сполуки в складі для топічного введення і одну або декілька доз інгібітора контрольної точки імунітету в складі для введення за допомогою ін'єкції.

21. Набір за п. 18 або 19, який включає одну дозу епокситигліанової сполуки в складі для інтратуморальної ін'єкції й одну або декілька доз інгібітора контрольної точки імунітету в складі для введення за допомогою ін'єкції.

ро Спол.ії Спо РМА ; р аз пу х ї я е 5.

о. | дві ї ле ня б. х: ва Я 25 » 5 ШИ й : і ЯК. й ї ПА с а чт Я як ! з НИ ее. є М, » ї х. пу з зі х УНІ а деяМ я «ву ї. Як о ше : шк і ! ох хе Я КВ в Ох ве ро дз -й я ноз НВ во ДИ Кави ря БО жил ств ЗЕ бі ь Й а Й жк я Я Й У У А Ж Х ; ь їх Ко А Се ак ж. - ще 7 ж І косо ІЗ у З кір. Ек Е З Ж же 4 І ві к. й Ян ші, х от; . и вс РЕ з ер , с г; їж Із і Е; жк. лек: шо ож Й же но КУ ім " в шк | й ков Ж з са а: Му 7. г в ; ЗЕ Фіг 1А і в ап 5 З Яа й вай ва | Е й м М і іш е ї (сер ) ЗНА Во й я ці й й х 5 й ; ; Сп : с ово рова ерикне я ї З до Кн в ВЕ о МОЖЕ «р полпука І: я ОО Мая Ех ПА х з й в не а І Ох о В а Спопука8! (|. с о с шій ПЕ о КК ЗОНІ ОХ З МОЯ Пе ТЕО ее ОН 5 Її її Кс КН Є ен КУ за АХ Зх Сполука З о о Б ОН Ме Ох СО ОКО 5 Б БО в Ко КВ Є В КЗ ВОК 5 ДО ОО у о «попука 4 КІ Н МОВ МОМ КУ ДО МКК КО ОО я ВО КЗ Га і МО о МС ОО щх ОК ЗО БО и ШО о В ОХ. ОК З Ки По й і. АВМ СВ КВ о ВХ я М ПК З сполука КО п. 0. с о . МОХ КО МОМ о ще КЕ ВА ПН я ша Сбпопуке КН ОБУ ПІБ о ок она ОБ і. а Ко В ОН М МО о и . х о ОО ОХ п. ках Є я КО А Сполука г в СХ 5 ще ВО в ОО Ве . ! и КН ОЙ ко В ЩО ПЕВ ВО ее ЗОМ Я ОКО ВО ОО ПЕК о ЕЕ Сполука 10 с с Ес ії. х Ен и КУ ЗК ПОН ВО ШО КФК ще Сполука б о о я о КО п в а и М КК Я Коко ВО в ОМС о ВОК М ОМ ни во м і У ОО ШУ Спо Ох с о НЕ я ш. пука ПОВИ МОХ КВ о ня ПеКу М ПОН З В в п п Ох п Е ВО Я ВКМ ПО ЕК ех В МА о о. і. у МОБ ОО МО В ПЕ І ХХ М ВОК о ОХ М З Я о ВОК ОО ОО 5 З ВВ в ОО Ба ОК БО о Ве З я МОНО ХО ЕК Щ- Он ЩО Сов КВ ДО КУ. м І у Я ; С ща ДО МОХ КК

Фіг. 18

Ф Я ех їв 95

2. ЕМ ші ш Ж ча ее Шк ШИК НЕ ші 5 вия КО ЕЕ дв о шо її ДЕ Б Е со и В В Би иа.

Б. ФО Є її вжАноцог ово , Зо и а 5 БЕК и 5 - ВОНИ Фіг 2А

ШО діло дотттнттуні а; нин Я ЩО а НН о ж ї сю КУ да Б орні в - «а пе» Жодне КА ве ке -- Еектннн Под я 54 сер. Сполука 1 ЗО (мкг) Сполука 1 індукує цитоківи/)хемокіни : ж апучення нейтрофіпів, сег | їж | Ти» | АКТ й ск їз | Твех Запучення МК, моноцитів се? Тзах ши Залучення Т- клітин се ши Запучення дендрітних клітині ! Я Як тіж Е В/Т7 дендритний таргетінег ! ссідів І шШш пімеровних органів ' Н Ше Твех Супресія Тгтед та подв. Т-клітин

Транскрипційні зміни ге у стромі пухлини мишей ФУ Тв КЕ КК ев Б м НН : - Се Ша ше ши и --- т ж я Со ВЕ ЗБ ши кеВ тод мезо В в НН ння -- ж С Фн НИ мш З НН Н вен НН ШІ т терор Не по и ВВ, ДВ Б НЕ ії ши рн кдд дня в рн п томи о ВВ я в я в - Ж сер. Сполука ше ЗО (мкг) вич Іпрепику Раїтуау Апаїубів т о ни че шт к їй ж є ж їх ан пе В ой Як і рю Я ту се вий з дк рев ших не п пес тиф чен Он Лу нн зойе «Кв нев ее БК еБЦК» ви А ще Ще яд пр а ЩЕ. и ОВ с и я я чний и 7 УК р п ще й у би Б у ша і ся ма ШК З Ой а я хе ек пад ж ж осн ше Шо ТЕМІ подібна реакція Даунраегуляція ТОЕ бета Більш вірогідно менш Співвідношення І стек Веде до активації з» Прогнозована шк пис лого з активація : ДЕ де ло інпбування Ов» р сх в мих шк . Прогнозоване яв песен Ефекти не прогнозовані інгібування І

Аді ді ММЗ Ані ВІб-ОУА чної ЗБОЮ мкМ Сполука Її зву, БО мМ Сполука 1 ооуве, ВХО0 мк М Сполука 1 Ї сз30б'юкМм Сполука 7 Ї зоб шк М Сполука 1 Ї шоб жкМ Спопука і ї і І ш -і ! що в я 005 сш ЕНН А АХ и с й Ж в й и З і : А Ів Ж 1 п жк ! ЕК Я с и ЕЕ ЦІ з я В в шен ЩА Ь і КК З к 5: 5 її ге ЗВ і ЕВ г. й! В п з Ї БЕ НИ | т ! ЖЖ й Я СЕУ ме ВВЕ Не ВВ НИ Ше Ії її В ЕН І

Щ. КК ккй Її. М МЕ що: ! в. ЕЕ -уй Ід І Ся сах 253 моди БАК КАоХ речам се т кВ ВЕ тий ЗНЗ ТЯБККІ ЕЕ ТВЕНХ ші тіхвип) Ціхвилі Кіхвит дазі1 ак ММмб49 В Вії яЯХ мкм Сполука з 300 шк М Сполука 7 мк Юм Сполука 1 КК мкм Спопука З ї ч Ж яю) 5-5 «003 я гу я Ф К і. ; в нт і х не визн. рен Ше і: о у і Канн х х не ше З Б СЯ 7 : ХЕ М я Ге х ; о шк ше я зверни еф, вве ПіхВил) ТЧіхвилі ді дазі ді мММБ4о дій ВіБб-ОУдД ЗО мем Сполука. В ЗО КМ попка 1 як 500 мк М Сполука зоба ї КЗЗ мкм Сполука 1 зводех 23300 мк М Стюлука 1 ядввах 200 як М Сполука 1 1 ї ї Я т Я ке ян і. х ке 8003 ОК Я БІ кт й З В в ШИК Нкя! К |. Її ї: Е ЕЕ БЖ ЕЕ пиши Е НИ шк ВИННУ ів В В мк ії ШЕ ВН 8 БЕН МЕ 1 НЕ ше, ши ШЕ венеВ пелав ВеНЕЕ екв і: ї. ї гі т 5 : і т ; . ї с 5 с, 5 с ща м ГБ. жений іо т т іхвил) Ціхвкл) Ніхвипі Зо

Об ек «Юа че, Е З і Б. й о. екя . . КЗ Е | г ке по я ВЕ В ЕЕ ОБ БВ ви Й Сет з Зб жа Боб ем 5: ВИ ! Її ге й ! й ах с Ше. хх їж АК. щ М з їй. Її Жана В щ ЖЕ я. "ШК ЖЕ . ї ваних як | Іще. еВ ох МІ шІ ш КУ Я х КЗ Ж ЖЕ НЕ ЕЕ Зб ч Крем Я 7 че йо щк в ка І | хх т с ї. СЯ джу «ШЕ | що ТЕ я шк: жк. - ВЕ І шк Кк ШЕ. ще Кене ші . . . шко ши і ШЕ ШЕ ШЕ. Ї : . . ІЩЕ ; . Кз щ Х ХЕ Ф і ее с, НУ

Фіг. 48 с А Ся МмМа4З 20 Зв 50пмкМсСполУІ зо за во мим Сполука кмомкМСполуУЮІ (5 в зб мкм Сполука «ЖОВ хх Жащ КО вх уні ви ря о Пежо п КК се х - у З т м КУ

05 . о. М.О вана мо й х З ши емо Ук ЗИ З их я ж ах й з - «КВ й , ше дх Я ля ча Н ВК ЩЕ рей - М іхвил) лу Ка З й : й Ціхвилі Сі В16ОУА Сім В160УА , "вним Сполука 1 з вквомм а вим 800 чу30бмкМм Сполука / я омМ С ж» хо ї з . " Ж є ї 1 В Я шк т5 сх щу с - КС Кр З : в ЩА Й Бі ах ру Б у Ії і В З а У Же щВ Її шо Оу і шк и пі жНЕ міни я и ЗКН ВЯй щ ПО в Кз В а м зе Я в З Бод 5 ЩЕ ек « 5 - з Б КЗ т ро ре ш 5 шов ко с «А са 5 о Її (їхвил) рі дазі ря ММ ба5 ВК ща ци Н ВЕ Еш о ДСемджеюе ЯКЕ - КЗ Середовице же ! ї ВІН мслотк її НО БЮ ЗЕ зах сполука Я жд Н Ї Я «32 М ї ізо Ополу ЧЕК БОМ щ 'бемсюті вет 0 5505 вюежсютияі а І З сива АВТ віп де й ЕЕ: ЕЕ: тїхвилі Кіхиклі ОН ВІ5-ОУА 2коої К-т, ї мале. ї х Б В 000) Ї не

5 В. о Н 1 бОвредовище г Ж В опа й ВИМ Сралукя З ЖЕ ТК ОВО весною роб нюв НЕ ШК нер тк 5 й ша шо МЕ ИН ЕНН т в Зіхвнт

А сіє сн сопе СМЕОД ов в. ие я Ме Не: ША

І. . Оп х авлечці ї тай 0 бе в ши Би Б в Ше як ШИНИ ЖОЖ ОК КО аТия ж, ЄМО Бе о. : ЗбмхМ о А и С НИ в. 5 5 вух коки Бе ІК Ос щ шк зва ; рю 18. як й в 5 мкм Ел сСлолудді щи ши в а СМР Фіг БА ка Середовище 3 500мкМ Сполука ! я 40 г зпомеМ Сполука 1 зо В В Е 20 Е ща з 6 3 о т - З З со що ко ща Ніквит

Фіг. 5В Ж Сполука 2 5 Сполука З Яков ТЗ ЄСпопука 4 5 У ! й я- с ше ще з. шо

5. ЕЕ в ПП шо 500 890 іСпоплука| мкм Фіг 50

ВТВ-Е1О-ОУА 1ЗО мкгополукі: 1 абе середовища ч 15230 мкг сполуки 7 або середовища що о М о 2 я ль а або ат А-Я (20 і є Є і -щт 5; й Ж 8 5 55 що ше я -к - 6 ХО Вимірювавня усіх пухлин і І І та виживання мищей День З й 2 4 в

Фіг. бА єс і Ж облік е ех Фо ще я» |до к сер, м к ї -к ЩО б мМкрсСлопука Су. ж Ва ть | «» ВІЗ-1 ж свв. Е во ее ВО-1 я 15 мкг Сполука в є че ЖЕО б 40 209 30 40 50 Дні Й зоогечечу зе ві Со ак в «-« ДОВ. на 5 - ідо жів мкеСполука З /С щ Я вої хх РІ.1 ж сер. в 000 РОЛ я 15 мкг Сполука я цк ; 4 Я до Зб 40 50 ж: Дні Щі се ВІ ле М І Ши нн ще я - |до ЗО мкг Сполука Тука Я що ВОЗ «я р вер. з и ше РО-Ї я 30 мкг Сполука 1 ща " ; о за я 30 40 о Дні У Ен я -е а м те ДО ж сер. с | ї «реннхенннююкннехюхх 7 103 ж бер. т 30 мкг Сполука г 5042 же ВОЯ ж сер. в я ех РО-1 я 30 мкг Спопука 1 ж я Є ові ща 46 б во Дні І

Фіг. 63

ОВ лдодня ЕН є фени ШИ (ЩО я сер, їй Я за (9-15 мкг Слолука 1 ОН кю СТЬАА ж сер, є КЕ ее СТА 15 мкг Сполука ! Б : ор 0 о 20 30 40 56 , Дні й а Зб нят те у «« ЩО як сер. Ж ! я- ЩО 15 мкг Сполука З В ве пр, т» СТАЯ ж сер. З | ше те» СТА ж 15 мкг Сполука 1 8 тет І 5 0 жо 30 45 бе її Дні ть НН й З я ж ЩО в сер. а я ІЗ й ій сту ; й - ї тк: ДО Кк ЗО мкг Сполука м ще СТІ А4 х сер.

г К. «ек СТІЙ к З0 мкг Сполука 1 віх ЕХ Я б пили вами и в 0 20 30 40 50 . Дні У се 1004-- що З ще мет «ж ДО я сер. ЕЗ З я-к ДО ж 30 мкг Сполука 1 5 В з я «ж СТІАЯ ж сер. в ї : тех СТЬАЯ я 30 мкг Сполука 1 дк Ко х щі ї ще Чет зі х о 0 20 зб ЩЕ 5 Дні: Фіг 6С в1і16-Е10-0УА Необроблений осередок х 15 мкг сполуки 1 або середовища ше р. а-23-1 абога- СТІ А-4 (200 мке)

ів. - реж Говоу о с- о се рех с т зо --о -5 --о КЗ Вимірювання оо 2 о оброблених та і "я необроблених осередків День є 02 465

Фіг. 7А