CN105308052B - 用于伤口愈合的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及环氧‑惕各烷化合物和它们在促进伤口愈合中的用途。在特定实施方案中，所述环氧‑惕各烷化合物是环氧‑惕各烯‑3‑酮化合物。描述了诱导或促进伤口愈合的方法以及减少瘢痕形成和改善伤口愈合后的美容结果的方法。还描述了用在伤口愈合中的化合物和组合物。

Description

用于伤口愈合的方法和组合物
技术领域
本发明涉及环氧(epoxy)-惕各烷(tigliane)化合物和它们在促进伤口愈合中的用途。在特定实施方案中，所述环氧-惕各烷化合物是环氧-惕各烯(tigliaen)-3-酮化合物。描述了诱导或促进伤口愈合的方法以及在伤口愈合后减少瘢痕形成和改善美容结果的方法。还描述了用在伤口愈合中的化合物和组合物。
背景技术
伤口愈合是一个复杂的过程，其中皮肤或另一个器官或组织在损伤以后修复它自身。在正常的皮肤中，表皮(最外层)和真皮(内层或更深层)以稳态平衡存在，从而形成对抗外部环境的保护屏障。一旦该保护屏障被破坏，就立即启动伤口愈合的正常生理学过程。伤口愈合的经典模型被分成3个连续的、仍然重叠的阶段：即:炎症性阶段、增生性阶段和最后的重塑阶段。
在伤口愈合的炎症性阶段中，存在嗜中性粒细胞和然后单核细胞从周围脉管系统向伤口中的活跃募集。嗜中性粒细胞是伤口中的细菌和真菌感染的最初控制和破坏所必需的。单核细胞随着它们进入伤口而成熟成巨噬细胞，其中它们在伤口消退的过程中具有众多作用，包括最初的吞噬作用以及基体和细胞碎片的清除。嗜中性粒细胞和巨噬细胞在伤口中对酶、细胞因子和生长因子的释放然后可以对伤口和周围组织内的其它细胞施加深远影响。例如，巨噬细胞分泌：胶原酶，其清理伤口；白介素和肿瘤坏死因子(TNF)，其刺激成纤维细胞和促进血管生成；和转化生长因子(TGF)，其刺激角质形成细胞。它们也分泌血小板衍生的生长因子和血管内皮生长因子，其开始肉芽组织的形成并从而开始向增生性阶段和重塑阶段的转变。快速的和稳健的、但是暂时的炎症性阶段经常与良好伤口愈合结果有关。
伤口愈合的第二个阶段涉及细胞增殖和迁移以及伤口收缩。这涉及细胞在伤口内所起的作用以实现伤口间隙的闭合和补充丢失的组织。角质形成细胞的迁移和增殖是实现伤口的表皮细胞再生的基础，而基础真皮的重构源自成纤维细胞的迁移、增殖和分化，所述成纤维细胞帮助牵拉伤口闭合并促进胶原纤维的合成、成束和对齐。
在最终的重塑阶段中，在伤口边缘处的迁移和增殖角质形成细胞重新分层以封闭伤口和形成连续表皮。在该阶段中，许多变化也发生在真皮中，包括细胞外基质的重塑以恢复正常的真皮体系结构和脉管系统。
在某些情况下，伤口可能缓慢地愈合或根本不愈合。许多因素会影响伤口愈合，例如，受伤的受试者的一般健康、受伤的受试者的年龄、疾病诸如糖尿病或可能影响循环的其它疾病、感染、异物或坏死组织的存在、或在某些情况下可能影响伤口愈合速率的药物。
此外，在某些伤口中，伤口消退的不完美调节可以导致纤维化和过度瘢痕形成以留下在功能上和美容上劣于正常组织的瘢痕组织。
有大量改善伤口愈合和减少瘢痕组织的研究。但是，需要找到能够促进伤口愈合(例如，增加伤口愈合的速率，特别是在慢性伤口中)的药剂。也需要使伤口愈合且具有比天然发生的愈合更少的瘢痕形成的药剂。
发明内容
本发明至少部分地基于下述发现：得自含有环氧-惕各烷化合物的植物的提取物能够促进伤口愈合，且也减少在伤口愈合后形成的瘢痕组织。
在本发明的第一方面，提供了一种促进受试者的伤口愈合的方法，所述方法包括给所述受试者施用环氧-惕各烷化合物或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，所述环氧-惕各烷化合物是呈植物提取物、特别是乙醇提取物的形式。在某些实施方案中，所述植物提取物可得自或得自是Fontainea物种(species)或Hylandia物种的植物。在某些实施方案中，所述环氧-惕各烷化合物分离自植物提取物。在其它实施方案中，所述环氧-惕各烷化合物是分离的惕各烷化合物的合成的或半合成的衍生物。
在某些实施方案中，所述促进伤口愈合包括增加伤口愈合的速率。在某些实施方案中，所述促进伤口愈合包括减少伤口组织中的瘢痕形成。在某些实施方案中，所述促进伤口愈合包括增加伤口愈合的速率和减少伤口组织中的瘢痕形成。在某些实施方案中，所述伤口是慢性伤口、急性伤口或现存伤口。
在本发明的另一个方面，提供了一种治疗或预防过度瘢痕形成的方法，其包括向伤口或瘢痕施加环氧-惕各烷化合物或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，所述过度瘢痕形成是瘢痕疙瘩或肥厚性瘢痕。
在本发明的另一个方面，提供了环氧-惕各烷化合物或其药学上可接受的盐在药物制备中的用途，所述药物用于促进受试者的伤口愈合。
在本发明的另一个方面，提供了环氧-惕各烷化合物或其药学上可接受的盐用于促进受试者的伤口愈合的用途。
具体实施方式
定义
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料都可以用于实践或检验本发明，仍描述了优选的方法和材料。为了本发明的目的，在下面定义了以下术语。
冠词“一个”和“一种”在本文中用于表示一个/种或超过一个/种(即至少一个/种)该冠词的语法对象。作为例子，“一个要素”是指一个要素或超过一个要素。
本文中使用的术语“约”表示变化高至参比数量、水平、值、尺寸、大小或量的30％、25％、20％、15％或10％的数量、水平、值、尺寸、大小或量。
贯穿本说明书，除非上下文另外要求，否则词语“包含”和“包括”应理解为暗示包括所述的步骤或要素、或者步骤或要素的集合，但是不排除任意其它步骤或要素、或者步骤或要素的集合。
术语“烷基”表示具有1-20个碳原子的任选地取代的直链和支链烃基。在适当的情况下，所述烷基可以具有指定数目的碳原子，例如，-C1-C6烷基，其包括具有1、2、3、4、5或6个呈直链或支链排列的碳原子的烷基。烷基的非限制性例子包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基和叔丁基、戊基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2-乙基丁基、3-乙基丁基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基和十五烷基。
术语“烯基”表示任选地取代的、不饱和的直链或支链烃，其具有2-20个碳原子且具有至少一个双键。在适当的情况下，所述烯基可以具有指定数目的碳原子，例如，C2-C6烯基，其包括具有2、3、4、5或6个呈直链或支链排列的碳原子的烯基。烯基的非限制性例子包括乙烯基、丙烯基、异丙烯基、丁烯基、仲丁烯基和叔丁烯基、戊烯基、己烯基、庚-1,3-二烯、己-1,3-二烯、壬-1,3,5-三烯等。
术语“炔基”表示任选地取代的不饱和的直链或支链烃，其具有2-20个碳原子，具有至少一个三键。在适当的情况下，所述炔基可以具有指定数目的碳原子，例如，C2-C6炔基，其包括具有2、3、4、5或6个呈直链或支链排列的碳原子的炔基。非限制性例子包括乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基和己炔基。
术语“环烷基”和“碳环的”表示任选地取代的饱和的或不饱和的单环、二环或三环烃基。在适当的情况下，所述环烷基可以具有指定数目的碳原子，例如，C3-C6环烷基，其为具有3、4、5或6个碳原子的碳环基团。非限制性例子可以包括环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环己二烯基等。
“芳基”是指C6-C14元单环、二环或三环碳环环系，在每个环中具有至多7个原子，其中至少一个环是芳族的。芳基的例子包括、但不限于苯基、萘基、四氢萘基、茚满基和联苯基。芳基可以包含1-3个苯环。如果存在2个或更多个芳族环，那么所述环可以稠合在一起，使得相邻环共用一个共有键。
每个烷基、烯基、炔基、环烷基和芳基(无论是单个实体还是作为较大实体的一部分)可以任选地被一个或多个任选的取代基取代，所述取代基选自C1-6烷基、C2-6烯基、C3-6环烷基、氧代(＝O)、-OH、-SH、C1-6烷基O-、C2-6烯基O-、C3-6环烷基O-、C1-6烷基S-、C2-6烯基S-、C3-6环烷基S-、-CO2H、-CO2C1-6烷基、-NH2、-NH(C1-6烷基)、-N(C1-6烷基)2、-NH(苯基)、-N(苯基)2、-CN、-NO2、-卤素、-CF3、-OCF3、-SCF3、-CHF2、-OCHF2、-SCHF2、-苯基、-O苯基、-C(O)苯基、-C(O)C1-6烷基。合适的取代基的例子包括、但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、叔丁基、乙烯基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、甲基硫基、乙基硫基、丙基硫基、异丙基硫基、丁基硫基、羟基、羟基甲基、羟乙基、羟丙基、羟基丁基、氟、氯、溴、碘、氰基、硝基、-CO2H、-CO2CH3、三氟甲基、三氟甲氧基、三氟甲基硫基、二氟甲基、二氟甲氧基、二氟甲基硫基、吗啉代、氨基、甲基氨基、二甲基氨基、苯基、苯氧基、苯基羰基、苄基和乙酰基。
本发明的化合物可以呈药学上可接受的盐的形式。但是，应当明白，非药学上可接受的盐也落入本发明范围内，因为这些可以在药学上可接受的盐的制备中用作中间体或可以在贮存或运输过程中是有用的。合适的药学上可接受的盐包括、但不限于：药学上可接受的无机酸诸如盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、碳酸、硼酸、氨基磺酸和氢溴酸的盐，或药学上可接受的有机酸诸如乙酸、丙酸、丁酸、酒石酸、马来酸、羟基马来酸、富马酸、马来酸、柠檬酸、乳酸、粘酸、葡糖酸、苯甲酸、琥珀酸、草酸、苯乙酸、甲磺酸、甲苯磺酸、苯磺酸、脂环族磺胺酸(salicyclic sulphanilic acid)、天冬氨酸、谷氨酸、依地酸、硬脂酸、棕榈酸、油酸、月桂酸、泛酸、鞣酸、抗坏血酸和戊酸的盐。
碱性盐包括、但不限于与药学上可接受的阳离子(诸如钠、钾、锂、钙、镁、铵和烷基铵)形成的那些。
碱性含氮基团可以用诸如以下试剂季铵化：低级烷基卤化物，诸如甲基、乙基、丙基和丁基的氯化物、溴化物和碘化物；二烷基硫酸盐如二甲基和二乙基硫酸盐；和其它试剂。
还应认识到，本发明的化合物可能具有不对称中心，并因此能够以超过一种立体异构形式存在。因此本发明还涉及在一个或多个不对称中心处的基本上纯的异构形式的化合物，例如，大于约90％ee，诸如约95％或97％ee或大于99％ee，以及其混合物，包括外消旋混合物。通过从天然来源分离，通过不对称合成(例如使用手性中间体)，或通过手性拆分，可以得到这样的异构体。本发明的化合物可以作为几何异构体存在。本发明还涉及基本上纯的顺式(Z)或反式(E)形式的化合物或其混合物。
通过从植物或植物部分分离，或通过分离的化合物的衍生化，或通过相关化合物的衍生化，可以得到本发明的化合物。
本文中使用的术语“伤口”表示组织结构的连续性或完整性的物理破坏。伤口可以是急性的或慢性的，且包括切口和撕裂伤、外科手术切口或伤口、穿刺伤、擦伤、划痕(scratch)、压伤、磨损伤、摩擦伤、褥疮溃疡(例如受压溃疡或褥疮)；热效应伤口(来自冷源和热源的烧伤)、化学伤口(例如酸或碱烧伤)或病原性感染(例如病毒性、细菌性或真菌性感染，包括开放的或完整的皮下脓肿、斑疹、疤痕(blemishes)和痤疮)、溃疡、慢性伤口(包括糖尿病相关的伤口诸如小腿和足部溃疡、静脉腿溃疡和受压溃疡)、皮肤移植/移植物供体和受体位点、免疫应答病症(例如银屑病和湿疹)、胃或肠溃疡、口腔伤口(包括口腔溃疡)、损伤的软骨或骨、截肢术伤口和角膜病损。
本文中使用的术语“慢性伤口”表示在其它方面健康的受试者的正常愈合时间段内没有愈合的伤口。慢性伤口可以是因为受试者的健康而没有愈合的那些，例如，在受试者具有较差循环或疾病(诸如糖尿病)的情况下，或在受试者正在接受抑制正常愈合过程的药物的情况下。感染(诸如细菌、真菌或寄生虫感染)的存在也可能损害愈合。在某些情况下，慢性伤口可能保持未愈合数周、数月或甚至数年。慢性伤口的例子包括、但不限于糖尿病性溃疡、受压溃疡和热带溃疡。
本文中使用的术语“促进伤口愈合”表示，与在未治疗的伤口中观察到的伤口愈合相比，改善伤口愈合。促进伤口愈合包括增加伤口愈合的速率，例如，所述伤口可以以比保持不治疗的伤口快数小时、数天或数周的速率愈合。促进伤口愈合也可以包括，与当伤口保持不治疗时预见到的结果相比，愈合中的或愈合的伤口内的瘢痕组织的减少。
术语“伤口愈合”表示组织完整性的部分或完全恢复。
本文提及的术语“减少瘢痕形成”或“减少瘢痕组织”是指，与如果伤口保持不治疗相比，改善的美容结果和/或减少的由伤口愈合造成的异常组织。在某些实施方案中，减少瘢痕组织包括与当伤口保持不治疗时相比减少或最小化异常组织、减少或最小化皮肤色素沉着的变化和/或改善毛发再生长。
术语“环氧-惕各烷化合物”表示具有下述基本碳环结构之一的化合物：
所述化合物具有三环[9.3.0.0]十四烷系统，其具有附加至6元环的稠合环丙烷环。所述环氧基在5,6-或6,7-位与7元环稠合。
术语“环氧-惕各烯-3-酮化合物”表示具有上面定义的环氧-惕各烷结构的化合物，其中5元环具有1,2-烯-3-酮结构：
伤口愈合的方法
在本发明的第一方面，提供了一种促进受试者的伤口愈合的方法，所述方法包括给所述受试者施用环氧-惕各烷化合物或其药学上可接受的盐。
要愈合的伤口可以存在于任意器官或组织中，包括内部器官或组织或外部组织，诸如皮肤。所述伤口可以是损伤、咬伤或烧伤的结果。所述器官或组织可以是皮肤、肌肉、肝、肾、肺、心脏、胰腺、脾、胃、肠、膀胱、卵巢、睾丸、子宫、软骨、肌腱、韧带、骨等中的任意一种或多种。在特定实施方案中，所述伤口是在皮肤和/或肌肉中。
在某些实施方案中，在遭受伤口以后不久施用环氧-惕各烷化合物。在其它实施方案中，所述伤口是在数天、数周、数月或数年中没有愈合的慢性伤口。在其它实施方案中，所述伤口是没有以正常速率愈合或没有对其它治疗做出应答的现存伤口。
本发明的化合物也可以应用于具有过度瘢痕形成的正在愈合中或已经愈合的伤口。这样的伤口的例子是正在产生或已经产生瘢痕疙瘩或肥厚性瘢痕的那些。
在某些实施方案中，所述伤口被细菌感染所感染。所述细菌感染可以由革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌、特别是革兰氏阳性细菌造成。被本发明的化合物控制的细菌的非限制性例子包括以下属的细菌：芽孢杆菌属(Genus Bacillus)，诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)、蜡状芽孢杆菌(B.cereus)、坚硬芽孢杆菌(B.firmis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、泛酸芽孢杆菌(B.pantothenticus)、蜂房芽孢杆菌(B.alvei)、短芽孢杆菌(B.brevis)、环状芽孢杆菌(B.circubins)、侧孢芽孢杆菌(B.laterosporus)、胶质芽孢杆菌(B.macerans)、多粘芽孢杆菌(B.polymyxa)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)和球形芽孢杆菌(B.sphaericus)；葡萄球菌属(Staphlococcus)诸如金黄色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、溶血性葡萄球菌(S.haemolyticus)、腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)；链球菌属(Streptococcus)，例如，热原链球菌(S.pyrogenes)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)、S.alagactiae、停乳链球菌(S.dysgalactiae)、类马链球菌(S.equisimilis)、马链球菌(S.equi)、兽疫链球菌(S.zooepidemicus)、咽峡炎链球菌(S.anginosus)、S.salwarius、米勒链球菌(S.milleri)、血链球菌(S.sanguis)、轻型链球菌(S.mitior)、变异链球菌(S.mutans)、粪链球菌(S.faecalis)、屎链球菌(S.faecium)、牛链球菌(S.bovis)、马肠链球菌(S.equinus)、S.uberus和鸟链球菌(S.avium)；气球菌属种(Aerococcus spp.)、孪生球菌属种(Gemella spp.)、棒杆菌属种(Corynebacteriumspp.)、李斯特菌属种(Listeria spp.)、库特氏菌属种(Kurthia spp.)、乳杆菌属种(Lactobacillus spp.)、丹毒丝菌属种(Erysipelothrix spp.)、蛛网菌属种(Arachniaspp.)、放线菌属种(Actinomyces spp.)、丙酸杆菌属种(Propionibacterium spp.)、罗氏菌属种(Rothia spp.)、双歧杆菌属种(Bifidobacterium spp.)、梭菌属种(Clostridiumspp.)、真杆菌属种(Eubacterium spp.)、沙雷氏菌属种(Serratia spp.)、克雷伯氏菌属种(Klebsiella spp.)、变形菌属种(Proteus spp.)、肠球菌属种(Enterococcus spp.)、假单胞菌属种(Pseudomonas spp.)、诺卡氏菌属种(Nocardia spp.)和分枝杆菌属种(Mycobacterium spp.)。
在某些实施方案中，所述伤口被真菌感染所感染。所述真菌感染可以由丝状真菌或酵母造成。被本发明的化合物控制的真菌的非限制性例子包括以下属的真菌：诸如曲霉菌属种(Aspergillus spp.)、毛霉菌属种(Mucor spp.)、Trichtophyton spp.、枝孢属种(Cladosporium spp.)、单格孢属种(Ulocladium spp.)、弯孢属种(Curvularia spp.)、短梗霉属种(Aureobasidium spp.)、白色假丝酵母(Candida albicans)、假丝酵母属种(Candida spp.)、隐球菌属(Cryptococcus spp.)、厚皮马拉色菌属(Malesseziapachydermatis)、马拉色霉菌属(Malessezia spp.)和毛孢子菌属种(Trichosporonspp.)。
在某些实施方案中，所述伤口被细菌和真菌感染所感染，包括在生物膜中。
具有要愈合的伤口的受试者可以是任意受试者，包括哺乳动物、禽类、鱼类和爬行动物。在某些实施方案中，所述受试者是人、伴侣动物、实验动物、农业或劳动动物、畜牧禽类(farmed bird)、赛跑动物(racing animal)或被监禁的野生动物诸如保持在动物园中的那些。合适的受试者的例子包括、但不限于人类、狗、猫、兔、仓鼠、豚鼠、小鼠、大鼠、马、牛、绵羊、山羊、鹿、猪、猴、有袋动物、鸡、鹅、金丝雀、鹦鹉、鳄鱼、蛇、蜥蜴等。在特定实施方案中，所述受试者是哺乳动物受试者诸如人、狗、猫、马、牛、绵羊、山羊、猪、鹿、大鼠、豚鼠、袋鼠、兔或小鼠。
在某些实施方案中，所述环氧-惕各烷化合物的施用通过增加伤口愈合的速率而促进伤口愈合。在某些实施方案中，所述环氧-惕各烷化合物的施用通过减少瘢痕形成或在没有治疗存在下会形成的瘢痕组织的量而促进愈合。在某些实施方案中，所述治疗会改善伤口已经愈合以后的美容结果或后果或外观，包括与没有治疗的伤口相比改善皮肤色素沉着和改善毛发再生长。
在促进伤口愈合的特定实施方案中，所述治疗优选地局限于该部位处或附近，或在病灶内施用以提供局限性效应。
“有效量”是指至少部分地达到期望的应答(例如，以开始伤口愈合或增加伤口愈合的速率)所必需的量。所述量随要治疗的个体的健康和身体状况、要治疗的个体的分类群、组合物的组成、医学情况的评估和其它有关因素而变化。预见到，所述量将落入通过常规试验可以确定的相对宽范围内。例如，与人患者有关的有效量可以位于每剂约0.1ng/千克体重至1g/千克体重的范围内。所述剂量优选地是在每剂1μg至1g/千克体重的范围内，诸如是在每剂0.5mg至1g/千克体重的范围内。在一个实施方案中，所述剂量是在每剂1mg至500mg的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在每剂1mg至250mg的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在每剂1mg至100mg的范围内，诸如高至每剂50mg。在另一个实施方案中，所述剂量是在每剂1μg至1mg/千克体重的范围内。可以调节剂量方案以提供最适治疗应答。例如，可以每天、每周、每月或以其它合适的时间间隔施用几个分份剂量，或者可以如情形的紧急情况所述指示地相应地减小剂量。
在某些实施方案中，所述环氧-惕各烷化合物或含有至少一种环氧-惕各烷化合物的植物提取物可以单独地同时或依次施用，或者在与另一种药学活性剂(其在伤口愈合中是有用的)相同的组合物中施用。例如，所述环氧-惕各烷化合物可以与抗生素和/或抗炎剂联合施用。合适的抗生素包括β-内酰胺抗生素诸如青霉素、氨苄西林、阿莫西林、氟氯西林、双氯西林、甲氧西林(methacillin)、羧苄西林和norocillin；头孢菌素类诸如头孢氨苄、头孢乙腈、头孢羟氨苄、头孢来星、头孢洛宁、头孢利定(cefalordidine)、头孢曲秦、氯头孢菌素(ceaclor)、头孢丙烯(cefproxil)、头孢唑南、头孢美唑(cefmetozole)、氯碳头孢、头孢米诺、头孢地尼、头孢泊肟和头孢匹罗；碳青霉烯诸如亚胺培南、美罗培南、厄他培南、多尼培南(daripenem)、帕尼培南和比阿培南；氨基糖苷诸如庆大霉素、链霉素、新霉素、卡那霉素、万古霉素、红霉素和阿奇霉素(asithromycin)；噁唑烷酮诸如利奈唑胺和泊西唑利德(posizolid)、林可胺类诸如克林霉素、喹啉诸如奥索利酸、环丙沙星、依诺沙星、氧氟沙星、洛美沙星、左氧氟沙星和二氟沙星；和磺酰胺诸如磺胺甲噁唑、磺胺嘧啶(sulfoadiazine)和磺胺醋酰或混合物诸如amoxyclav(阿莫西林和克拉维酸)。合适的抗炎剂包括非甾体类抗炎药诸如美洛昔康、吡罗昔康、昔康(oxicam)、阿司匹林、二氟尼柳(difunisal)、布洛芬、右布洛芬、萘普生、酮洛芬、吲哚美辛、托美丁、甲芬那酸、尼美舒利(numisulide)等和皮质类固醇诸如氢化可的松、泼尼松龙、甲泼尼龙、泼尼松、布地奈德、倍他米松和地塞米松。
所述环氧-惕各烷化合物可以与其它伤口愈合治疗剂(诸如敷料和软膏剂、洗剂和凝胶剂)联合使用。例如，所述环氧-惕各烷化合物可以与包含治疗剂诸如碘、芦荟、paw paw或医学活性蜂蜜诸如manuka蜂蜜或其它生物学或生理学活性剂诸如抗病毒剂、抗细菌剂、抗真菌剂和维生素(诸如A、C、D和E)和它们的酯的银敷料和敷料、软膏剂、洗剂和凝胶剂联合使用。所述环氧-惕各烷化合物还可以与给伤口提供分子结构的敷料联合使用。这样的敷料可以包括聚合薄膜和交联的聚合薄膜，诸如透明质酸和有关的结构，包括交联的透明质酸。
在某些实施方案中，所述环氧-惕各烷化合物是式(I)的化合物或其几何异构体或立体异构体或药学上可接受的盐：
其中
R1是氢且R2是-OR17；或R1和R2一起形成羰基(＝O)；
R3是氢或C1-6烷基；
R4和R5独立地是氢或-OR17；或R4和R5一起形成双键或环氧基(epoxide)(-O-)；
R6是氢或C1-6烷基；
R7是-OH或-OR18；
R8是-OH或-OR18；前提条件是，R7和R8不都是-OH；
R9和R10独立地选自氢和C1-6烷基；
R11和R12或R12和R13一起形成环氧基且R11和R13中的剩余基团是氢、-OH或-OR17；
R14是氢或-R17；
R15是氢或-R17；
R16是氢或-R17；
R17是氢、-C1-6烷基、-C2-6烯基、-C2-6炔基、-C(O)C1-6烷基、-C(O)C2-6烯基或-C(O)C2-6炔基；
R18是C1-20烷基、-C2-20烯基、-C2-20炔基、-C(O)C1-20烷基、-C(O)C2-20烯基、-C(O)C2-20炔基、-C(O)环烷基、-C(O)C1-10烷基环烷基；-C(O)C2-10烯基环烷基、-C(O)C2-10炔基环烷基、-C(O)芳基、-C(O)C1-10烷基芳基、-C(O)C2-10烯基芳基、-C(O)C2-10炔基芳基、-C(O)C1-10烷基C(O)R19、-C(O)C2-10烯基C(O)R19、-C(O)C2-10炔基C(O)R19、-C(O)C1-10烷基CH(OR19)(OR19)、-C(O)C2-10烯基CH(OR19)(OR19)、-C(O)C2-10炔基CH(OR19)(OR19)、-C(O)C1-10烷基SR19、-C(O)C2-10烯基SR19、-C(O)C2-10炔基SR19、-C(O)C1-10烷基C(O)OR19、-C(O)C2-10烯基C(O)OR19、-C(O)C2-10炔基C(O)OR19、-C(O)C1-10烷基C(O)SR19、-C(O)C2-10烯基C(O)SR19、-C(O)C2-10炔基C(O)SR19，
且
R19是氢、-C1-10烷基、-C2-10烯基、-C2-10炔基、环烷基或芳基；
其中每个烷基、烯基、炔基、环烷基或芳基任选地被取代。
在某些实施方案中，所述式(I)的化合物是式(II)的环氧-惕各烯-3-酮化合物：
其中R3、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13和R15如关于式(I)所定义。
在某些实施方案中，所述式(I)或(II)的化合物是式(III)的化合物：
其中R7、R8、R11、R12、R13和R15如关于式(I)所定义。
在式(I)、式(II)或式(III)的特定实施方案中，以下一项或多项适用：
R1是氢且R2是OH或-OC(O)C1-6烷基、-OC(O)C2-6烯基或-OC(O)C2-6炔基，或R1和R2一起形成羰基；特别在R1和R2一起形成羰基的情况下；
R3是氢或-C1-3烷基，特别是-C1-3烷基，更特别是甲基；
R4是氢或-OH、-OC(O)C1-6烷基、-OC(O)C2-6烯基或-OC(O)C2-6炔基和
R5是氢或-OH、-OC(O)C1-6烷基、-OC(O)C2-6烯基或-OC(O)C2-6炔基；或R4和R5一起形成双键或环氧基；特别是R4和R5一起形成双键；
R6是氢或-C1-3烷基，特别是-C1-3烷基，更特别是甲基；
R7是-OH、-OC(O)C1-15烷基、-OC(O)C2-15烯基、-OC(O)C2-15炔基、-OC(O)芳基(其中所述芳基任选地被取代)、-OC(O)C1-15烷基芳基、-OC(O)C1-10烷基C(O)H、-OC(O)C2-10烯基C(O)H、-OC(O)C1-10烷基C(O)C1-6烷基、-OC(O)C2-10烯基C(O)C1-6烷基、-OC(O)C1-10烷基CH(OC1-3烷基)(OC1-3烷基)、-OC(O)C2-10烯基CH(OC1-3烷基)(OC1-3烷基)、-OC(O)C1-10烷基SC1-6烷基、-OC(O)C2-10烯基SC1-6烷基、-OC(O)C1-10烷基C(O)OC1-6烷基或-OC(O)C2-10烷基C(O)OC1-6烷基；特别是-OH、-OC(O)C1-15烷基、-OC(O)C2-12烯基、-OC(O)C2-12炔基、-OC(O)芳基(其中所述芳基任选地被取代)、-OC(O)C1-12烷基芳基、-OC(O)C1-6烷基C(O)H、-OC(O)C2-6烯基C(O)H、-OC(O)C1-6烷基C(O)C1-6烷基、-OC(O)C2-6烯基C(O)C1-6烷基、-OC(O)C1-6烷基CH(OC1-3烷基)(OC1-3烷基)、-OC(O)C2-6烯基CH(OC1-3烷基)(OC1-3烷基)、-OC(O)C1-6烷基SC1-3烷基、-OC(O)C2-6烯基SC1-3烷基、-OC(O)C1-6烷基C(O)OC1-3烷基或-OC(O)C2-6烷基C(O)OC1-3烷基；
R8是-OC(O)C1-15烷基、-OC(O)C2-15烯基、-OC(O)C2-15炔基或-OC(O)芳基，其中所述芳基任选地被取代，特别是-OC(O)C1-10烷基、-OC(O)C2-10烯基、-OC(O)C2-10炔基或-OC(O)芳基，其中所述芳基任选地被取代；更特别是-OC(O)C1-10烷基、-C(O)C2-10烯基和-OC(O)芳基，其中所述芳基任选地被取代；
R9和R10独立地是-C1-3烷基，特别是R9和R10二者是甲基；
R11和R12一起形成环氧基且R13是-OH、-OC(O)C1-6烷基、-OC(O)C2-6烯基或-OC(O)C2-6炔基，特别是-OH或-C(O)C1-3烷基；或者
R12和R13一起形成环氧基且R11是-OH、-OC(O)C1-6烷基、-OC(O)C2-6烯基或-OC(O)C2-6炔基，特别是-OH；且
R14是氢、-C(O)C1-6烷基、-C(O)C2-6烯基或-C(O)C2-6炔基，特别是氢；
R15是氢、-C(O)C1-6烷基、-C(O)C2-6烯基或-C(O)C2-6炔基，特别是氢或-C(O)C1-3烷基；且
R16是氢、-C(O)C1-6烷基、-C(O)C2-6烯基或-C(O)C2-6炔基，特别是氢。
在特定实施方案中，所述环氧-惕各烷化合物选自表1-6中的下述化合物之一：
表1
表2：
表3：
表4：
表5：
表6：
本发明的化合物可以呈纯化合物的形式或呈植物提取物的形式。
在将化合物描绘为具有立体化学的情况下，描绘的立体化学是相对立体化学，且基于生物合成途径和化学分析的知识。
在某些实施方案中，所述植物提取物来自属Fontainea或Hylandia的植物，特别地所述种是Fontainea pancheri、Fontainea australis、Fontainea borealis、Fontaineafugax、Fontainea oraria、Fontainea picrosperma、Fontainea rostrata、Fontaineasubpapuana、Fontainea venosa或Hylandia dockrillii，特别是Fontainea picrosperma、Fontainea australis、Fontainea rostrata或Hylandia dockrillii。
所述植物的部分可以包括果实、种子、树皮、茎、叶、花、根、胚乳、外果皮和木材，特别是所述提取物得自种子。
可以通过标准方法得到植物的提取物，例如，对得自植物的种子、叶、果实、胚乳、外果皮、茎或树皮的生物质进行最初的溶剂提取，诸如用极性溶剂例如乙醇。然后将最初的提取物浓缩，并用水稀释和进行使用第二种溶剂(例如，乙酸乙酯)的提取。将得自第二次提取的溶剂样品合并和进行通过制备型HPLC分级分离的分离。将所述级分通过分析型HPLC进行分析，并根据在样品中发现的化合物的保留时间进行合并。将合并的级分称重、生物测定和通过分析型HPLC进行分析。进行使用一种或多种制备型HPLC的进一步分级分离以分离特定化合物。将每种化合物生物测定，并通过UV、NMR和质谱测定技术鉴别它的结构。
通过衍生化从植物或植物部分、特别是从Fontainea属、特别是从种Fontaineapicrosperma、特别是Fontainea picrosperma的种子分离出的化合物，可以得到本发明的其它化合物。
通过本领域已知的技术可以得到天然化合物的衍生物。例如，通过暴露于氧化剂诸如铬酸、Jones氏试剂、KMnO4、过酸诸如mCPBA(间氯过苯甲酸)或二氧杂环丙烷诸如二甲基二氧杂环丙烷(DMDO)和甲基(三氟甲基)二氧杂环丙烷(TFDO)，可以将羟基氧化成酮、醛或羧酸。可以选择氧化剂，使得分子中的其它官能团也被或不被氧化。例如，使用试剂诸如RuCl2(PPh3)3-苯，可以在有仲醇存在下将伯醇选择性地氧化成醛或羧酸。使用Cl2-吡啶或NaBrO3-硝酸铈铵，可以在有伯醇存在下将仲醇选择性地氧化成酮。与或不与硅藻土(Celite)(或氯化铵)一起使用Jones氏试剂，可以在有双键和三键存在下且没有在邻近立体中心处的差向异构化的情况下氧化醇。可替换地，选择的试剂可以是更低选择性的，从而导致在超过一个官能团处的氧化。
羟基也可以通过醚化或酰化而衍生。例如，通过在有碱存在下形成烷醇盐(alkoxide)离子，和使所述烷醇盐与适当的烷基卤化物、烯基卤化物、炔基卤化物或芳基卤化物反应，可以制备醚。类似地，通过形成烷醇盐离子和与适当的羧酸或活化的羧酸(诸如酸酐或酰氯)反应，可以实现酰化。
通过本领域已知的酸或碱水解，可以将酰基水解以提供醇，且那些醇可以如上进一步衍生化。
用还原剂诸如氢化铝锂和其它金属氢化物，可以将酮还原为仲醇，而不还原双键，包括α-不饱和的酮。
使用催化还原，例如，H2/Pd，可以将双键和三键还原成单键。使用氧化剂诸如过酸，例如mCPBA或二氧杂环丙烷，诸如DMDO和TFDO，也可以将双键氧化成环氧基。还可以对双键进行加成反应以引入取代基诸如卤代基团、羟基或烷氧基。
本领域技术人员能够确定用于得到分离的化合物的衍生物的合适条件，例如，通过参考与合成方法学有关的教科书，其例子是Smith M.B.和March J.,March's AdvancedOrganic Chemistry,第五版,John Wiley&Sons Inc.,2001以及Larock R.C.,Comprehensive Organic Transformations,VCH Publishers Ltd.,1989。此外，官能团的选择性操作可能需要其它官能团的保护。防止不希望的副反应的合适保护基提供在Green和Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,John Wiley&Sons Inc.,第3版,1999中。
本发明的化合物
在本发明的另一个方面，存在新颖的化合物，包括：
12-己酰基-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物5)；
12-乙酰基-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物6)；
12-丙酰基-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物7)；
12-丁酰基-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物8)；
12-[(2E,4E)-(6,6-二甲氧基己-2,4-二烯酰基]-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物9)；
12-[(2E,4E)-6-氧代己-2,4-二烯酰基]-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物10)；
12-[(2E,4E)-6,7-二羟基十二-2,4-二烯酰基]-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物11)；
12-[(2E)-4,5-二羟基-癸-2-烯酰基]-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物12)；
12-巴豆酰基(tigloyl)-13-(2-甲基丙酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物13)；
12-[(2E)-3-甲硫基丙-2-烯酰基]-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物14)；
12-(2-甲基丙-2-烯酰基-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物15)；
12-[(2E,4E)-己-2,4-二烯酰基]-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物16)；
12-[(2E,4E)-8-氧代十二-2,4-二烯酰基]-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物17)；
12-[(2Z,4E)-癸-2,4-二烯酰基]-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物18)；
13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物19)；
12-[(2E)-丁-2-烯酰基]-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物20)；
12-巴豆酰基-13-丁酰基-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物21)；
12-(3-丁烯酰基)-13-壬酰基-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物22)；
12-苯甲酰基-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物23)；
12-[(2Z,4E)-癸-2,4-二烯酰基]-13-(2-甲基丙酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物25)；
12-[(2E,4E)-6,7-(反(anti))-环氧-十二-2,4-二烯酰基]-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物26)；
12,13-二丁酰基-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物27)；
12-苯甲酰基-13-丁酰基-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物28)；
12-巴豆酰基-13-(2-甲基丁酰基)-5,6-环氧-4,7,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物29)；
13-(2-甲基丁酰基)-5,6-环氧-4,7,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物30)；
12-乙酰基-13-(2-甲基丁酰基)-5,6-环氧-4,7,9,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物31)；
12,13-二-(2-甲基丁酰基)-5,6-环氧-4,7,9,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物32)；
12-丙酰基-13-(2-甲基丁酰基)-5,6-环氧-4,7,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物33)；
12-己酰基-13-(2-甲基丁酰基)-5,6-环氧-4,7,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物34)；
12-巴豆酰基-13-(2-甲基丙酰基)-5,6-环氧-4,7,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物35)；
12-[(2E)-3-甲硫基丙-2-烯酰基]-13-(2-甲基丁酰基)-5,6-环氧-4,7,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物36)；
12-{[2-(甲基硫烷基(sulfanyl))羰基]-乙酰基}-13-(2-甲基丁酰基)-5,6-环氧-4,7,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物39)；
12-[(2-甲氧基羰基)-乙酰基]-13-(2-甲基丁酰基)-5,6-环氧-4,7,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物40)；
12,13-二-壬酰基-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物41)；
12,13-二-己酰基-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物42)；
12,13-二-戊酰基-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物43)；
12,13-二-巴豆酰基-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物44)
5,20-二乙酰基-12-巴豆酰基-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物45)；
12,13-二-(2E,4E)-己-2,4-烯酰基-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物46)；
12-己酰基-13-[2-(N-甲基氨茴酰基)]-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物47)
12-乙酰基-13-[2-(N-甲基氨茴酰基)]-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物48)；
12,13-二-庚酰基-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物49)；
12-肉豆蔻酰基-13-乙酰基-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物50)；
12-肉豆蔻酰基-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物51)；
12-(2-甲基丁酰基)-13-乙酰基-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物52)；和
13-己酰基-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物53)；
12,13-二-(3-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3酮(化合物60)；
或其药学上可接受的盐。
在本发明的另一个方面，化合物5-53或60中的任一种或其药学上可接受的盐可以呈与药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂一起的药物组合物的形式。
组合物
尽管环氧-惕各烷化合物或其药学上可接受的盐可以作为纯品施用，可能更方便地以与药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂一起的药物组合物的形式施用环氧-惕各烷化合物。
本领域技术人员会容易地确定药物用途和组合物的剂型和速率。
剂型包括片剂、分散剂、混悬剂、注射剂、溶液剂、糖浆剂、糖锭、胶囊剂、栓剂、气雾剂、透皮贴剂、浸渍性(闭塞性)敷料、乳膏剂、凝胶剂等。这些剂型还可以包括为了药物组合物的控制释放而特别设计或改进的注射或植入装置。治疗剂的控制释放可以通过包被它们来实现，例如，用疏水的聚合物包括丙烯酸树脂、蜡、高级脂肪醇、聚乳酸和聚乙醇酸以及某些纤维素衍生物诸如羟丙基甲基纤维素包被。此外，控释可以通过使用其它聚合物基质、脂质体和/或微球实现。
药学上可接受的载体和用于全身施用的可接受的载体也可以掺入本发明的组合物中。
适当地，所述药物组合物包含药学上可接受的赋形剂或可接受的赋形剂。“药学上可接受的赋形剂”是指可安全地使用的固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。取决于特定施用途径，可以使用本领域众所周知的各种载体。这些载体或赋形剂可以选自糖、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽、明胶或其它胶凝剂、滑石粉、硫酸钙、植物油、合成的油、醇和/或多元醇、海藻酸、磷酸盐缓冲溶液、乳化剂、等渗盐水和无热原水。
任何合适的施用途径都可以用于向人或非人患者提供本发明的药物组合物。例如，可以采用口服、局部、直肠、胃肠外、舌下、含服、静脉内、关节内、肌肉内、真皮内、皮下、吸入、眼内、腹膜内、脑室内、透皮等。
适合于施用的本发明的药物组合物可以呈现在不连续单元诸如注射器、管形瓶、试管、胶囊剂、药囊或片剂中，每个含有预定量的一种或多种本发明的药学活性化合物或提取物，作为粉末或颗粒，或作为在水性液体、环糊精溶液、非水性液体、水包油乳剂或油包水乳剂中的溶液或悬浮液，或作为在乳膏剂或凝胶中的溶液或悬浮液，或作为包含本发明的化合物的微米或纳米颗粒的悬浮液，包括、但不限于硅胶(silica)或聚丙交酯微米或纳米颗粒。这样的组合物可以通过任意药学方法来制备，但是所有方法包括将一种或多种本发明的药学活性化合物与构成一种或多种必要成分的载体结合的步骤。一般而言，如下制备所述组合物：将本发明的药剂与液体载体或精细粉碎的固体载体或二者均匀地和亲密地混合，然后，如果必要的话，将所述产品成形为期望的呈现。
在粉剂中，所述载体是精细粉碎的固体，其与精细粉碎的活性组分混合。
在片剂中，将活性组分与具有必需结合能力的载体以合适的比例混合，并压紧成期望的形状和大小。
粉剂和片剂的合适载体包括碳酸镁、硬脂酸镁、滑石粉、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲纤维素钠、低熔点蜡、可可脂等。术语“制剂”意图包括用包封材料作为载体从而形成胶囊的活性化合物制剂，其中所述活性组分与或不与载体一起被载体包裹，并从而与之结合。类似地，包括扁囊剂和锭剂。片剂、粉剂、胶囊剂、丸剂、扁囊剂和锭剂可以用作适合于口服施用的固体形式。
为了制备栓剂，首先将低熔点蜡(诸如脂肪酸甘油酯或可可脂的混合物)熔化，如通过搅拌使活性组分均匀地分散在其中。然后将熔化的同质混合物倒入方便大小的模具中，使其冷却，并由此固化。
适合用于阴道施用的制剂可以呈现为子宫托、卫生栓、乳膏剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾剂，其除了含有活性成分以外还含有本领域已知适当的载体。
液体形式制剂包括溶液、混悬剂和乳剂，例如，水或水-丙二醇溶液。例如，可以将胃肠外注射液体制剂配制为在水性1,2-丙二醇、二甲基亚砜(DMSO)、γ环糊精或2-羟丙基-β-环糊精水溶液、盐水溶液或聚乙二醇溶液中的溶液，含有或不含缓冲剂。优选的pH范围是3.5-4.5。合适的缓冲剂会将制剂缓冲在pH 3.5-4.5，且包括、但不限于乙酸盐缓冲剂和柠檬酸盐缓冲剂。
根据本发明的化合物因而可以配制用于胃肠外施用(例如通过注射，例如快速浓注或连续输注)，并且可以以单元剂量形式存在于安瓿、预充注射器、小体积输注液中或含有添加的防腐剂的多剂量容器中。所述组合物可以呈现诸如以下形式：在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳剂，并可以含有配制试剂诸如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。可替换地，所述活性成分可以呈粉末形式，其通过无菌固体的无菌分离或通过从溶液冷冻干燥而得到，用于在使用前用合适的媒介物(例如，无菌的无热原的水)构造。
通过将活性组分溶解于水中，并按需要加入合适的着色剂、矫味剂、稳定剂和增稠剂，可以制备适合于口服使用的水溶液。
通过将精细粉碎的活性组分与粘稠物质(诸如天然的或合成的树胶、树脂、甲基纤维素、羧甲纤维素钠或其它众所周知的助悬剂)一起分散在水中，可以制备适合于口服使用的水性悬浮液。
还包括这样的固体形式制剂：其意图在即将使用前转化为用于口服施用的液体形式制剂。这样的液体形式包括溶液、悬浮液和乳剂。这些制剂除了含有活性组分以外还可以含有着色剂、矫味剂、稳定剂、缓冲剂、人工和天然甜味剂、分散剂、增稠剂、增溶剂等。
就局部施用给表皮或其它器官而言，可以将根据本发明的化合物配制为凝胶剂、软膏剂、乳剂、糊剂、乳膏剂或洗剂，或配制为透皮贴剂。使用合适的增稠剂，并将它们加入化合物的水性/醇性组合物中，可以制备凝胶剂。合适的增稠剂或胶凝剂是本领域已知的，诸如聚乙烯基羧基聚合物、卡波姆940。软膏剂和乳膏剂可以例如用水性或油性基质配制，并加入合适的增稠剂和/或胶凝剂。洗剂可以用水性或油性基质配制，且通常也含有一种或更多种乳化剂、稳定剂、分散剂、助悬剂、增稠剂或着色剂。
适合于局部施用的制剂也包括可以以洗浴或浸渍溶液或喷雾剂的形式局部施用的溶液或悬浮液。这些制剂可以适当地施用以抵抗皮肤刺激、昆虫叮咬和足部伤口。
适合于在口中局部施用的制剂包括：锭剂，其包含在矫味基质(经常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)中的活性剂；软锭剂，其包含在惰性基质(诸如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶)中的活性成分；和漱口剂，其包含在合适的液体载体中的活性成分。
通过常规方式，例如用滴管、移液器或喷雾器，可以将溶液或悬浮液直接施用至鼻腔。所述制剂可以以单剂量或多剂量形式提供。在滴管或移液器的后一种情况下，这可以通过给患者施用适当的、预定体积的溶液或悬浮液来实现。在喷雾器的情况下，这可以例如借助于计量雾化喷雾泵来实现。为了改善鼻递送和保留，可以将根据本发明的化合物用环糊精包封，或者用它们的预期会增强在鼻粘膜层中的递送和保留的试剂配制。
向呼吸道施用也可以借助于气雾剂制剂实现，其中将活性成分与合适的推进剂(诸如含氯氟烃(CFC)，例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷或二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体)一起提供在增压包装中。所述气雾剂还可以方便地含有表面活性剂诸如卵磷脂。通过计量阀的供给可以控制药物的剂量。
可替换地，所述活性成分可以以干粉的形式提供，例如所述化合物在合适的粉末基质(诸如乳糖、淀粉、淀粉衍生物诸如羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮(PVP))中的粉末混合物。
方便地，粉末载体将在鼻腔中形成凝胶。粉末组合物可以以单元剂量形式呈现，例如在例如明胶的胶囊或药筒中，或在泡罩包中，从所述泡罩包可以借助于吸入器而施用粉末。
在意图施用给呼吸道的制剂(包括鼻内制剂)中，所述化合物通常具有小颗粒尺寸，例如具有1-10微米或更小的量级。这样的颗粒尺寸可以通过本领域已知的方式(例如通过微粉化)得到。
现在将参考下述实施例描述本发明，所述实施例举例说明本发明的一些优选方面。但是，应当理解，本发明的以下描述的细节不会替代本发明的以上描述的一般性。
附图说明
图1是划痕后24小时用仅媒介物对照处理的人新生儿成纤维细胞中的划痕闭合的照片说明。
图2是划痕后24小时用30ng/mL的化合物1处理的人新生儿成纤维细胞中的划痕闭合的照片说明。
图3是与仅媒介物对照相比用10ng/mL或30ng/mL的化合物1处理的人新生儿成纤维细胞的Matrigel侵入(invasion)测定的图解说明。在24小时温育后计数细胞。*p<0.05；***p<0.001。
图4是用化合物1处理的人新生儿成纤维细胞的蛋白质印迹分析，并显示参与伤口修复和愈合的关键信号传递分子的活化和随后下调。
图5是成纤维细胞(在有TGF-β1存在下培养)向一定浓度范围的化合物1的暴露对向肌成纤维细胞的分化的影响的照片说明，所述分化的特征在于增加的α-平滑肌肌动蛋白的表达和张力纤维形成。
图6是成纤维细胞(在有TGF-β1存在下培养)向一定浓度范围的化合物37的暴露对向肌成纤维细胞的分化的影响的照片说明，所述分化的特征在于增加的α-平滑肌肌动蛋白的表达和张力纤维形成。
具体实施方式
实施例1:植物提取物
如下制备所有植物提取物：劈开植物材料，并以1份植物材料/2-5份乙醇(w/w)的适当比例经乙醇提取。将提取物在4℃静置过夜，然后将上清液倾析并在4℃储存备用。
使用与ABI3200三重四极质谱仪偶联的Shimadzu HPLC，通过LCMSMS证实环氧-惕各烷化合物在植物提取物中的存在。使用乙腈/水混合物作为溶剂系统，采用卤代酰胺C18柱分离混合物中的化合物。
使用C18Kinetix 4.6mm×100mm 2.6微米C18柱，用KinC18Gen方法运行大多数样品：
使用得自Advanced Materials Technology的卤代酰胺柱RP 4.6mm×150mm,2.7微米，用Amide Long方法运行一些样品：
乙腈: 45％ 58％ 95％ 95％ 45％ 45％
分钟: 0 13 20 24 24.1 27
实施例2：环氧-惕各烷化合物的分离和阐明
如下从Fontainea picrosperma的种子纯化化合物：使用下述的一般方法，提取和在硅胶上进行色谱法，继之以制备型HPLC(C18柱,甲醇/水溶剂组合)。
将大约1-2kg植物材料(叶、果实、种子、茎、根、花、树皮或木材)细碎地劈开，用2份乙醇(w/v)提取3次，将提取物合并、蒸发，并将残余物在水和不可混溶的有机溶剂(通常是石油溶剂油沸点40-60(PE)或乙酸乙酯EtOAc)之间分配。将得自有机溶剂蒸发的残余物在具有递增极性的溶剂混合物(从PE或庚烷开始，并发展至EtOAc，然后甲醇)中在硅胶上色谱分离。然后将得自硅胶的级分通过C18柱上的制备型HPLC进一步纯化，通常使用甲醇-水梯度。将较后的级分分析生物活性，根据通过分析型HPLC发现的化合物的保留时间进行合并，并进行其它制备型HPLC以得到纯化合物。将每种化合物进行生物测定，并通过UV、NMR和质谱测定技术证实它的结构。
化合物1:12-巴豆酰基-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.84(3H(18),d,J＝6.4Hz),0.92(3H(4”),t,J＝7.3Hz),1.11(3H(5”),d,J＝6.8Hz),1.21(3H(16),s),1.24(3H(17),s),1.26(1H(14),d,J＝6.8Hz),1.43(1H(3”),m,J＝14.1,7.3,7.2Hz),1.69(1H(3”),m),1.73(3H(19),dd,J＝2.9,1.5Hz),1.77(3H(4'),dd,J＝7.1,1.2Hz),1.8(3H(5'),d,J＝1.5Hz),1.94(1H(11),m),2.37(1H(2”),qt,J＝7.0,6.8Hz),3.17(1H(8),d),3.26(1H(7),s),3.69(1H,OH,br.s),3.80,(1H(20),d,J＝12.7Hz),3.83(1H(20),d,J＝12.2Hz),4.06(1H(10),t,J＝2.7Hz),4.22(1H(5),s),5.42(1H(12),d,J＝9.8Hz),6.02(1H,OH,br.s),6.79(1H(3'),m,J＝7.2,7.0,1.2Hz),7.71(1H,(1),dd)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:9.7(19),11.6(4”),12.2(5'),14.4(4'),15.1(18),16.1(5”),17.2(16),23.6(17),26.1(3”),26.6(15),36.0(8),36.1(14),41.2(2”),45.9(11),48.9(10,)61.8(6),64.6(20),65.2(7),65.5(13),71.3(5),72.4(4),76.7(12),77.2(9),128.4(2'),133.4(2),137.6(3'),164.7(1),167.4(1'),178.9(1”),209.9(3)。
化合物2:12,13-二-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.85(3H(18),d,J＝6.4Hz),0.89(3H(4”),J＝7.3Hz),0.91(3H(4'),t,J＝7.8Hz),1.11(3H(5”),d,J＝6.8Hz),1.12(3H(5'),d,J＝6.8Hz),1.21(3H(17),s),1.22(3H(16),s),1.26(1H(14),d,J＝6.8Hz),1.44(1H(3'),td,J＝13.9,7.3Hz),1.44(1H(3”),td,J＝13.9,7.3Hz),1.63(1H(3'),dd,J＝7.8,5.9Hz),1.69(1H(3”),dd,J＝13.9,7.1Hz),1.74(3H(19),dd,J＝2.7,1.2Hz),1.90(1H(11),dd,J＝10.0,6.6Hz),2.36(1H(2'),q,J＝7.0Hz),2.36(1H(2”),q,J＝7.0Hz),3.16(1H(8),d,J＝6.8Hz),3.26(1H(7),s),3.61(1H(OH),m),3.78(1H(20),m,J＝12.7Hz),3.85(1H(20),d,J＝12.2Hz),4.06(1H(10),t,J＝2.7Hz),4.22(1H(5),s),5.40(1H(12),d,J＝10.3Hz),5.98(1H(9-OH),m),7.71(1H(1),dd,J＝2.4,1.5Hz)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:9.7(19),11.6(4'),11.6(4”),15.0(18),16.1(5”),17.0(5'),17.2(17),23.7(16),26.2(3”),26.5(15),26.7(3'),36.0(8),36.0(14),41.2(2”),41.8(2'),45.5(11),48.9(10),61.7(6),64.5(20),65.2(7),65.5(13),71.5(5),72.4(4),76.2(12),77.2(9),133.5(2),164.7(1),175.9(1'),178.8(1”),209.9(3)。
化合物3:12-[(2E,4E,6E)-十二-2,4,6-三烯酰基]-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.86(3H(18),d,J＝7.0Hz),0.87(3H(12'),m,J＝7.0Hz),0.92(3H(4”),t,J＝7.5Hz),1.12(3H(5”),d,J＝7.0Hz),1.22(3H(17),s),1.24(3H(16),s),1.26(2H(10'),m),1.27(1H(14),m),1.29(2H(11'),m),1.39(2H(9'),m),1.45(1H(3”),dd,J＝14.1,7.0Hz),1.71(1H(3”),m),1.74(3H(19),dd,J＝2.8,1.2Hz),1.95(1H(11),dq),2.12(2H(8'),q),2.38(1H(2”),sxt,J＝7.0Hz),3.17(1H(8),d,J＝6.7Hz),3.27(1H(7),s),3.57(1H,(4-OH),s)、(3.78(1H(20),m),3.86(1H(20),m),4.06(1H(10),d,J＝2.7Hz),4.22(1H(5),s),5.41(1H(12),d),5.79(1H(2'),d,J＝15.2Hz),5.92(1H(7'),dt,J＝15.2,7.2Hz),6.04(1H(OH),m),6.11(1H(6'),dd,J＝15.1,10.7Hz),6.19(1H(4'),dd,J＝14.8,11.2Hz),6.51(1H(5'),dd,J＝14.9,10.7Hz),7.23(1H(3'),dd,J＝15.5,10.9Hz),7.72(1H(1),dd,J＝2.4,1.3Hz)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:9.7(19),11.6(4”),14.0(12'),15.1(18),16.2(5”),17.2(16),22.5(11'),23.6(17),26.2(3”),26.7(15),28.6(9'),31.4(10'),33.0(8'),36.0(8),36.2(14),41.2(2”),45.9(11),48.9(10),61.6(6),64.5(20),65.3(7),65.5(13),71.6(5),72.4(4),76.7(9),77.1(12),119.5(2'),127.5(4'),129.7(6'),133.5(2),141.1(7'),141.7(5'),145.3(3'),164.8(1),166.6(1'),170.0(1”),210.0(3)。
化合物4:12-[(2E,4Z)-癸-2,4-二烯酰基]-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.87(3H(18),d,J＝6.4Hz),0.87(3H(10'),s),0.93(3H(4”),t,J＝7.5Hz),1.13(3H(5”),d,J＝7.1Hz),1.23(3H(16),s),1.25(3H(17),s),1.27(1H(14),d,J＝1.6Hz),1.27(2H(9'),m),1.30(2H(8'),m),1.40(2H(7'),m),1.46(1H(3”),dd,J＝14.2,6.9Hz),1.71(1H(3”),m),1.75(3H(19),dd,J＝2.9,1.3Hz),1.95(1H(11),d,J＝3.3Hz),2.11(1H(20-OH),m),2.26(2H(6'),m),2.38(1H(2”),q,J＝7.0Hz),3.18(1H(8),d,J＝6.6Hz),3.28(1H(7),s),3.53(1H(4-OH),d,J＝0.9Hz),3.77(1H(20),m),3.81(1H(5-OH),d,J＝2.8Hz),3.87(1H(20),dd,J＝12.4,7.6Hz),4.06(1H(10),d,J＝2.7Hz),4.22(1H(5),d,J＝1.7Hz),5.43(1H(12),d,J＝9.9Hz),5.83(1H(2'),d,J＝15.2Hz),5.86(1H(5'),ddd,J＝10.8,7.9,7.8Hz),6.03(1H(9-OH),m),6.10(1H(4'),td,J＝11.2,0.7Hz),7.56(1H(3'),ddd,J＝15.3,11.7,1.1Hz),7.72(1H(1),dd,J＝2.5,1.4Hz)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:9.7(19),11.6(4”),14.0(10'),15.2(18),16.2(5”),17.2(17),22.5(9'),23.7(16),26.2(3”),26.7(15),28.3(6'),29.0(7'),31.4(8'),36.1(8),36.2(14),41.2(2”),45.9(11),49.0(10),61.6(6),64.5(20),65.3(7),65.5(13),71.7(5),72.3(4),76.8(12),77.1(9),120.8(2'),126.4(4'),133.5(2),140.0(3'),142.2(5'),164.8(1),166.6(1'),179.0(1”),210.0(3)。
化合物5:12-己酰基-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.84(3H(18),d,J＝6.5Hz),0.87(3H(6'),t,J＝7.0Hz),0.91(3H(4”),t,J＝7.5Hz),1.11(3H(5”),d,J＝7.0Hz),1.21,(3H(16),s),1.21,(3H(17),s),1.25(1H(14),d,J＝6.6Hz),1.43(1H(3”),m,J＝14.1,7.4,7.1Hz),1.60(2H(3'),quin,J＝7.4Hz),1.70(1H(3”),ddd,J＝13.9,7.3,7.1Hz),1.74(3H(19),dd,J＝2.9,1.3Hz),1.9(1H(11),dq,J＝10.0,6.5Hz),2.27(2H(2'),dt,J＝7.4,3.7Hz),1.29(2H(4'),m,J＝7.5,7.2,3.9Hz),1.29(2H(5'),m,J＝7.5,7.2,3.9Hz),2.36(1H(2”),sxt,J＝7.0Hz),3.14(1H(8),d,J＝6.6Hz),3.25(1H(7),s),3.64(1H,(OH),s),3.83(1H(OH),dd,J＝12.5,7.9Hz),3.79(2H(20),dd,J＝12.5,5.7Hz),3.94,(1H(OH),d,J＝2.5Hz),4.06(1H(10),t,J＝2.6Hz),4.22(1H(5),s),5.37(1H(12),d,J＝10.0Hz),5.95(1H(OH),br.s.)7.7(1H(1),dd,J＝2.4,1.3Hz)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:9.7(19),11.6(4”),13.9(6'),15.0(18),16.1(5”),17.1(16),22.3(5'),23.6(17),24.9(3'),26.2(3”),26.6(15),31.1(4'),34.5(2'),35.96(8),36.04(14),41.2(2”),45.6(11),48.9(10),61.8(6),64.6(20),65.2(7),65.5(13),71.4(5),72.4(4),76.5(12),77.1(9),133.4(2),164.6(1),173.3(1'),178.8(1”),209.9(3)。
化合物6:12-乙酰基-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.85(3H(18),d,J＝6.4Hz),0.92(3H(4”),t,J＝7.6Hz),1.12(3H(5”),d,J＝6.8Hz),1.21(3H(16),s),1.23(3H(17),s),1.25(1H(14),d,J＝6.8Hz),1.44(1H(3”),m,J＝14.1,7.3,7.2Hz),1.71(1H(3”),dd),1.75(3H(19),dd,J＝2.9,1.0Hz),1.91(1H(11),m),2.04(3H(2'),s),2.36(1H(2”),m,J＝7.0,6.8Hz),3.14(1H(8),d,J＝6.8Hz),3.26(1H(7),s),3.78(1H(20),d,J＝12.7Hz),3.85(1H(20),d,J＝12.7Hz),4.04(1H(10),t,J＝2.7Hz),4.21(1H(5),s),5.33(1H(12),d,J＝9.8Hz),7.7(1H(1),s)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:9.7(19),11.6(4”),15.1(18),16.2(5”),17.1(16),21.0(2'),23.7(17),26.2(3”),26.7(15),36.0(8),36.1(14),41.2(2”),45.7(11),48.9(10),61.7(6),64.5(20),65.2(7),65.4(13),71.5(5),72.4(4),76.8(9),77.1(12),133.5(2),164.6(1),170.6(1'),178.9(1”),209.9(3)。
化合物7:12-丙酰基-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.85(3H(18),d,J＝6.8Hz),0.92(3H(4”),t,J＝7.6Hz),1.12(3H(5”),d,J＝7.3Hz),1.13(3H(3'),t),1.21(3H(16),s),1.22(3H(17),s),1.25(1H(14),dd,J＝10.3,6.8Hz),1.44(1H(3”),m J＝14.0,7.0,6.6Hz),1.70(1H(3”),dd,J＝14.2,6.8Hz),1.74(3H(19),dd,J＝2.9,1.5Hz),1.91(1H(11),m),2.31(2H(2'),m),2.37(1H(2”),dd,J＝13.7,6.8Hz),3.15(1H(8),d,J＝6.8Hz),3.26(1H(7),s),3.78(1H(20),d,J＝12.2Hz),3.84(1H(20),d,J＝12.7Hz),4.05(1H(10),m),4.21(1H(5),s),5.35(1H(12),d,J＝9.8Hz),5.92(1H(OH),br.s.),7.71(1H(1),m)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:9.3(3'),9.7(19),11.6(4”),15.1(18),16.1(5”),17.1(16),23.7(17),26.2(3”),26.7(15),27.8(2'),36.0(8),36.1(14),41.2(2”),45.7(11),48.9(10),61.7(6),64.6(20),65.2(7),65.4(13),71.5(5),72.4(4),76.8(12),77.1(9),133.5(2),164.6(1),173.9(1'),178.9(1”),209.9(3)。
化合物8:12-丁酰基-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.85(3H(18),d,J＝6.4Hz),0.92(3H(4”),t,J＝7.6Hz),0.94(3H(4'),t,J＝7.3Hz),1.12(3H(5”),d),1.22(3H(16),s),1.23(3H(17),s),1.26(1H(14),d,J＝6.8Hz),1.45(1H(3”),dq,J＝14.0,7.1Hz)1.64(2H(3'),m,J＝14.6,7.2,7.1Hz),1.71(1H(3”),dd,J＝13.7,6.8Hz),1.75(3H(19),d,J＝2.9Hz),1.90(1H(11),dd,J＝10.0,6.6Hz),2.27(2H(2'),m),2.37(1H(2”),qt,J＝7.0,6.8Hz),3.15(1H(8),d,J＝6.4Hz),3.27(1H(7),s),3.77(1H(20),m,J＝12.2Hz),3.86(1H(20),m,J＝12.7Hz),4.05(1H(10),d,J＝2.4Hz),4.21(1H(5),s),7.71(1H(1),dd,J＝2.4,1.0Hz)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:9.7(19),11.6(4”),13.5(4'),15.1(18),16.1(5”),17.1(16),18.7(3'),23.7(17),26.2(3”),26.6(15),36.0(8),36.1(14),36.4(2'),41.2(2”),45.6(11),48.9(10),61.6(6),64.5(20),65.2(7),65.5(13),71.7(5),72.3(4),76.6(12),77.1(9),133.5(2),164.7(1),173.1(1'),178.8(1”),209.9(3)。
化合物9:12-[(2E,4E)-(6,6-二甲氧基己-2,4-二烯酰基]-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.86(3H(18),d,J＝6.4Hz),0.92(3H(4”),t,J＝7.3Hz),1.12(3H(5”),d,J＝6.8Hz),1.22(3H(17),s),1.24(3H(16),s),1.27(1H(14),dd,J＝11.2,6.8Hz),1.44(1H,(3”),m),1.72(1H(3”),m),1.75(3H(19),dd,J＝2.9,1.5Hz),1.96(1H(11),dd,J＝10.0,6.6Hz),2.37(1H(2”),m),3.17(1H(8),d,J＝6.8Hz),3.27(1H(7),s),3.31(3H(7'),s),3.31(3H(8'),s),3.79,(1H(20),m,J＝12.2Hz),3.86(1H(20),m),4.06(1H(10),br.s.),4.22(1H(5),d,J＝2.4Hz),4.89(1H(6'),dd,J＝4.4,1.0Hz),5.42(1H(12),d,J＝9.8Hz),5.91(1H(2'),d,J＝15.7Hz),5.98(1H(5'),dd,J＝15.7,4.4Hz),6.47(1H(4'),dd,15.6,11.2Hz),7.21(1H(3'),dd,J＝15.6,11.2Hz),7.71(1H(1),s)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:9.7(19),11.6(4”),15.1(18),16.2(5”),17.2(17),23.6(16),26.2(3”),26.8(15),36.0(8),36.2(14),41.2(2”),45.8(11),48.9(10),52.7(7'),52.7(8'),61.7(6),64.5(20),65.2(7),65.4(13),71.6(5),72.4(4),77.1(9),77.1(12),101.3(6'),122.8(2'),131.0(4'),133.5(2),137.9(5'),143.4(3'),164.7(1),166.1(1'),178.9(1”),209.9(3)。
化合物10:12-[(2E,4E)-6-氧代己-2,4-二烯酰基]-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.88(3H(18),d,J＝6.4Hz),0.93(3H(4”),t,J＝7.5Hz),1.13(3H(5”),d,J＝7.1Hz),1.24(3H(17),s),1.25(3H(16),s),1.28(1H(14),m),1.46(1H(3”),td,J＝14.1,7.3Hz),1.70(1H(3”),m),1.75(3H(19),dd,J＝2.9,1.2Hz),1.99(1H(11),dddd,J＝9.8,6.5,6.4,6.1Hz),2.38(1H(2”),d,J＝6.8Hz),3.19(1H(8),d,J＝6.8Hz),3.28(1H(7),s),3.77(1H(20),m,J＝12.5Hz),3.87(1H(20),d,J＝13.0Hz),4.06(1H(10),d,J＝2.7Hz),4.22(1H(5),s),5.46(1H(12),d,J＝9.8Hz),6.28(1H(2'),d,J＝15.4Hz),6.40(1H(5'),dd,J＝15.4,7.8Hz),7.14(1H(4'),dd,J＝14.9,11.2Hz),7.36(1H(3'),dd,J＝15.4,11.2Hz),7.71(1H(1),dd,J＝2.6,1.3Hz),9.66(1H(6'),d,J＝7.6Hz)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:9.7(19),11.6(4”),15.2(18),16.2(5”),17.2(16),23.6(17),26.2(3”),26.9(15),36.0(8),36.3(14),41.2(2”),45.8(11),48.9(10),61.7(6),64.5(20),65.1(7),65.3(13),71.6(5),72.3(4),77.1(9),78.2(12),129.4(2'),133.6(2),137.2(5'),140.8(3'),146.9(4'),164.4(1),165.0(1'),178.9(1”),192.8(6；),209.8(3)。
化合物11:12-[(2E,4E)-6,7-二羟基十二-2,4-二烯酰基]-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.87(3H(18),d,J＝2.0Hz),0.87(3H(12'),d,J＝2.0Hz),0.92(3H(4”),t,J＝7.3Hz),1.12(3H(5”),d,J＝6.8Hz),1.22(3H(17),s),1.24(3H(16),s),1.28(1H(14),d,J＝6.4Hz),1.28(2H(11'),d,J＝6.4Hz),1.44(2H(8'),d,J＝6.8Hz),1.46(1H(3”),d,J＝6.8Hz),1.47(2H(9'),d,J＝2.9Hz),1.69(1H(3”),m),1.76(3H(19),m),1.95(1H(11),dd,J＝9.5,6.6Hz),2.38(1H(2”),dq,J＝13.7,6.8Hz),3.17(1H(8),d,J＝6.4Hz),3.27(1H(7),s),3.49(1H(7'),br.s.),3.60(1H(OH),s),3.82(2H(20),),4.03(1H(6'),m),4.06(1H(10),br.s.),4.22(1H(5),d,J＝2.9Hz),5.42(1H(12),d,J＝9.8Hz),5.88(1H(2'),d,J＝15.2Hz),6.08(1H(OH),t,J＝6.1Hz),6.11(1H(5'),t,J＝6.1Hz),6.43(1H(OH),m),6.47(1H(4'),m),7.21(1H(OH),dd,J＝13.2,2.0Hz),7.24(1H(3'),s),7.71(1H(1),s),
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:9.7(19),11.6(4”),14.0(12'),15.1(18),16.2(5”),17.2(16),22.6(11'),23.6(17),25.3(9'),26.2(3”),26.8(15),31.7(10'),33.1(8'),36.0(8),36.2(14),41.2(2”),45.8(11),48.9(10),61.7(6),64.5(20),65.2(7),65.4(13),71.6(5),72.4(4),74.5(7'),75.1(6'),77.1(9),77.1(12),133.5(2),121.8(2'),129.7(4'),141.6(5'),143.8(3'),164.6(1),166.2(1'),178.9(1”),209.9(3)。
化合物12:12-[(2E)-4,5-二羟基-癸-2-烯酰基]-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.86(3H(18),d),0.87(3H(10'),t),0.93(3H(4”),t,J＝7.5Hz),1.12(3H(5”),d,J＝7.0Hz),1.22(3H(17),s),1.23(3H(16),s),1.26(2H(9'),m),1.27(1H(14),m),1.28(2H(8'),m),1.30(1H(7'),m),1.42(2H(6'),m),1.44(1H(3”),m),1.46(1H(7'),m),1.70(1H(3”),m),1.74(3H(19),d,J＝1.6Hz),1.95(1H(11),m),2.37(1H(2”),m),3.16(1H(8),d,J＝6.5Hz),3.27(1H(7),s),3.75(1H(5'),m),3.77(1H(20),m),3.85(1H(20),d,J＝19.3Hz),4.05(1H(10),br.s.),4.21(1H(5),s),4.32(1H(4'),m),5.41(1H(12),d,J＝9.5Hz),6.11(1H(2'),dd,J＝8.8,1.8Hz),6.92(1H(3'),dd,J＝4.9,1.6Hz),7.71(1H(1),dd)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:9.7(19),11.6(4”),14(10'),15.1(18),16.2(5”),17.2(16),22.5(9'),23.7(17),25.5(7'),26.2(3”),26.8(15),31.7(8'),32.0(6'),36.0(8),36.2(14),41.2(2”),45.8(11),48.9(10),61.7(6),64.5(20),65.2(7),65.4(13),71.6(5),72.3(4),73.9(4'),74.1(5'),77.1(12),77.3(9),122.5(2'),133.6(2),145.9(3'),164.6(1),165.5(1'),179(1”),209.9(3)。
化合物13:12-巴豆酰基-13-(2-甲基丙酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.84(3H(18),d,J＝6.4Hz),1.14(3H(4”)d,J＝7.3Hz,1.17(3H(3”),d,J＝6.8Hz),1.22(3H(16),s),1.24(3H(17),s),1.28(1H(8),m),1.74(3H(19),s),1.77(3H(4'),d,J＝7.3Hz),1.95(1H(11),dd,J＝10.0,6.6Hz),2.56(1H,(2”),m,J＝7.3,7.1,7.0Hz),3.16(1H(14),d,J＝6.4Hz),3.26(1H(7),s),3.82(2H(20),m),4.06(1H(10),br.s.),4.22(1H(5),d,J＝2.4Hz),5.41(1H(12),d,J＝9.8Hz),6.80(1H(3'),m),7.71(1H(1),s)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:9.7(19),12.2(5'),14.4(4'),15.1(18),17.2(17),18.5(3”),18.6(4”),23.7(16),26.5(15),34.1(2”),36.0(8),36.1(14),45.8(11),48.9(10),61.7(6),64.6(20),65.2(7),65.5(13),71.4(5),72.4(4),76.6(12),77.2(9),128.4(2'),133.4(2),137.6(3'),164.7(1),167.5(1'),179.3(1”),209.9(3)。
化合物14:12-[(2E)-3-甲硫基丙-2-烯酰基]-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.86(3H(18),d,J＝6.4Hz),0.92(3H(4”),t,J＝7.3Hz),1.12(3H(5”),d,J＝6.8Hz),1.23(3H(17),s),1.24(3H(16),s),1.27(1H(14),d,J＝6.8Hz),1.44(1H(3”),m),1.71(1H(3”),m),1.75(3H(19),s),1.94(1H(11),m),2.14(1H(OH),t,J＝5.9Hz),2.32(3H(4'),s),2.38(1H(2”),m),3.16(1H(8),d,J＝6.8Hz),3.27(1H(7),s),3.55(1H(4-OH),s),3.78(1H(20),dd,J＝12.7,5.9Hz),3.84(1H(5-OH),s),3.85(1H(20),s),4.05(1H(10),m),4.21(1H(5),d,J＝2.4Hz),5.41(1H(12),d,J＝9.8Hz),5.61(1H(2'),d,J＝14.7Hz),6.02(1H(9-OH),m),7.69(1H(3'),d,J＝14.7Hz),7.71(1H(1),s)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:9.7(19),11.6(4”),14.3(4'),15.1(18),16.2(5”),17.2(16),23.7(17),26.2(3”),26.7(15),36.1(8),36.2(14),41.2(2”),45.9(11),49.0(10),61.6(6),64.5(20),65.2(7),65.5(13),71.7(5),72.4(4),76.8(12),77.1(9),112.8(2'),133.5(2),147.5(3'),164.5(1'),164.8(1),178.9(1”),210.0(3)。
化合物15:12-(2-甲基丙-2-烯酰基-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.86(3H(18),d),0.92(3H(4”),t,J＝7.3Hz),1.12(3H(5”),d,J＝6.8Hz),1.23(3H(17),br.s.),1.25(3H(16),s),1.27(1H(14),dd,J＝11.2,6.4Hz),1.45(1H(3”),m),1.72(1H(3”),m),1.75(3H(19),dd,J＝2.9,1.0Hz),1.92(3H(4'),s),1.95(1H(11),m),2.38(1H(2”),m),3.18(1H(8),d),3.28(1H(7),s),3.54(1H(OH),d,J＝1.0Hz),3.78(1H(20),m),3.87(1H(20),dd),4.06(1H(10),m),4.22(1H(5),d,J＝2.0Hz),5.42(1H(12),s),5.56(1H(3'),dt,J＝2.9,1.5Hz),6.05(1H(3'),m),7.72(1H(1),dd,J＝2.4,1.5Hz)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:9.7(19),11.6(4”),15.1(18),16.2(5”),17.2(17),18.5(4'),23.7(16),26.2(3”),26.7(15),36.1(8),36.2(14),41.2(2”),45.9(11),49.0(10),61.6(6),64.5(20),65.2(7),65.5(13),71.7(5),72.3(4),77.1(9),77.3(12),125.8(3'),133.5(2),136.2(2'),164.7(1),166.8(1'),178.9(1”),209.9(3)。
化合物16:12-[(2E,4E)-己-2,4-二烯酰基]-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.87(3H(18),d,J＝6.5Hz),0.93(3H(4”),t),1.13(3H(5”),m,J＝6.8Hz),1.23(3H(16),br.s.),1.26(3H(17),s),1.27(1H(14),m),1.45(1H(3”),s),1.70(1H(3”),m),1.75(3H(19),dd,J＝2.8,1.2Hz),1.86(3H(6'),dd,J＝7.3,1.7Hz),1.96(1H(11),dd,J＝9.8,6.2Hz),2.37(1H(2”),m),3.18(1H(8),d,J＝6.7Hz),3.28(1H(7),s),3.78(1H(20),m),3.87(1H(20),m),4.06(1H(10),br.s.),4.21(1H(5),br.s.),5.44(1H(12),d,J＝10.1Hz),5.83(1H(2'),d,J＝15.0Hz),5.94(1H(5'),m),6.14(1H(4'),m),7.59(1H(3'),ddd,J＝15.3,11.7,1.2Hz),7.72(1H(1),dd,J＝2.2,1.3Hz)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:9.7(19),11.6(4”),14.1(6'),15.2(18),16.2(5”),17.2(17),23.7(16),26.2(3”),26.7(15),36.1(8),36.2(14),41.2(2”),45.9(11),49.0(10),61.6(6),64.5(20),65.3(7),65.5(13),71.7(5),72.4(4),76.8(12),77.1(9),120.7(2'),127.3(4'),133.5(2),136.2(5'),139.6(3'),164.8(1),166.6(1'),179.0(1”),210.0(3)。
化合物17:12-[(2E,4E)-8-氧代十二-2,4-二烯酰基]-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.85(3H(18),d,J＝5.3Hz),0.88(3H(12'),t,J＝7.3Hz),0.92(3H(4”),t,J＝7.4Hz),1.12(3H(5”),d,J＝7.0Hz),1.22(3H(16),br.s.),1.23(3H(17),s),1.26(1H(14),d,J＝5.4Hz),1.28(2H(11'),d,J＝2.8Hz),1.43(1H(3”),br.s.),1.53(2H(10'),m),1.71(1H(3”),m),1.75(3H(19),dd,J＝2.9,1.3Hz),1.95(1H(11),m),2.37(1H(2”),m),2.38(2H(9'),d,J＝7.2Hz),2.42(2H(6'),m),2.52(2H(7'),s),3.17(1H(8),d,J＝6.6Hz),3.27(1H(7),s),3.53(1H(OH),s),3.81(1H(20),br.s.),3.86(1H(20),m),4.05(1H(10),m),4.22(1H(5),d,J＝2.4Hz),5.41(1H(12),d,J＝9.8Hz),5.76(1H(2'),d,J＝15.4Hz),6.09(1H(5'),t,J＝6.8Hz),6.15,(1H(4'),d,J＝10.6Hz),7.16(1H(3'),dd,J＝15.4,10.6Hz),7.71(1H(1),dd,J＝2.6,1.3Hz)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:9.7(19),11.6(4”),13.8(12'),15.1(18),16.2(5”),17.2(17),22.3(11'),23.7(16),25.9(10'),26.2(3”),26.7(15),26.9(6'),36.1(8),36.1(14),41.2(2”),41.3(7'),42.7(9'),45.9(11),49.0(10),61.6(6),64.5(20),65.3(7),65.5(13),71.7(5),72.3(4),77.1(12),77.2(9),119.6(2'),129.1(4'),133.5(2),142.8(5'),145.0(3'),164.8(1),166.6(1'),179.0(1”),209.7(8'),210.1(3)。
化合物18:12-[(2Z,4E)-癸-2,4-二烯酰基]-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.86(3H(10'),t,J＝6.9Hz),0.87(3H(18),d,J＝6.6Hz),0.94(3H(4”),t,J＝7.5Hz),1.14(3H(5”),d,J＝7.1Hz),1.22(3H(16),s),1.23(3H(17),s),1.25(1H(14),br.s.),1.27(2H(8'),br.s.),1.28(2H,(9'),br.s.),1.41(2H(7'),m),1.46(1H(3”),m),1.71(1H(3”),m),1.75(3H(19),dd,J＝2.9,1.3Hz),1.94(1H(11),dd,J＝10.0,6.4Hz),2.16(2H(6'),s),2.39(1H(2”),m,J＝7.2,7.0Hz),3.16(1H(8),d,J＝6.8Hz),3.27(1H(7),s),3.53(1H(4-OH),d,J＝0.6Hz),3.77(1H(20),dd,J＝12.7,5.7Hz),3.83(1H(5-OH),d,J＝3.1Hz),3.86(1H(20),m,J＝12.6,7.7Hz),4.05(1H(10),t,J＝2.7Hz),4.21(1H(5),d,J＝2.9Hz),5.43(1H(12),d,J＝9.9Hz),5.51(1H(2'),d,J＝11.4Hz),6.06(1H(5'),ddd,J＝15.1,7.2,6.8Hz),6.55(1H(3')。t,J＝11.6Hz),7.29(1H(4'),ddd,J＝15.1,7.2,6.8Hz),7.72(1H(1),dd,J＝2.3,1.3Hz)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:9.7(19),11.6(4”),14.0(10'),15.1(18),16.2(5”),17.1(16),22.5(9'),23.7(17),26.2(3”),26.6(15),28.3(7'),31.4(8'),33.0(6'),36.0(14),36.1(8),41.2(2”),45.8(11),49.0(10),61.6(6),64.5(20),65.3(7),65.5(13),71.7(5),72.3(4),76.1(12),77.1(9),115.0(2'),126.9(4'),145.9(3'),146.1(5'),133.5(2),164.8(1),165.9(1'),178.9(1”),210.0(3)。
化合物19:13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.92(3H(4'),t,J＝7.6Hz),1.07(3H(18),d,J＝6.4Hz),1.16(3H(5'),d,J＝6.8Hz),1.20(3H(16),s),1.24(1H(14),m),1.26(3H(17),s),1.45(1H(3'),ddd,J＝13.8,7.1,7.0Hz),1.71(1H(3'),dt,J＝13.7,7.3Hz),1.76(1H(11),d,J＝15.7Hz),1.77(3H(19),dd,J＝2.7,1.2Hz),2.41(1H(2'),m,J＝7.0,6.8Hz),3.08(1H(8),d,J＝7.3Hz),3.27(1H(7),s),3.79(1H(10),d,J＝2.9Hz),3.81(2H(20),m),3.90(1H(12),d,J＝9.8Hz),4.20(1H(5),s),7.70(1H(1),dd,J＝2.4,1.5Hz)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:9.8(19),11.7(4')。16.6(5'),16.2(18),17.2(17),23.4(16),26.5(3'),27.9(15),34.8(14),36.5(8),41.0(2'),47.3(11),50.7(10),62.4(6),65.0(20),66.0(7),68.4(13),71.5(5),72.1(4),77.6(9),78.3(12),133.9(2),163.8(1),180.1(1'),209.7(3)。
化合物20:12-[(2E)-丁-2-烯酰基]-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.85(3H,(18),d,J＝6.4Hz),0.92(3H(4”),t,J＝7.5Hz),1.12(3H(5”),d,J＝7.1Hz),1.22(3H(17),s),1.24(3H(16),s),1.26(1H(14),d,J＝6.7Hz),1.45(1H(3”),dd,J＝14.5,6.4Hz),1.72(1H(3”),dd,J＝14.1,6.8Hz),1.75(3H(19),dd,J＝2.8,1.3Hz),1.87(3H(4'),dd,J＝6.9,1.7Hz),1.94(1H(11),dd,J＝9.8,6.4Hz),2.37(1H(2”),dd,J＝13.8,6.8Hz),3.16(1H(8),d,J＝6.5Hz),3.27(1H(7),s),3.78(1H(20),d,J＝12.2Hz),3.87(1H(20),m),4.05(1H(10),m),4.21(1H(5),s),5.40(1H(12),d,J＝9.9Hz),5.81(1H(2'),dddd,J＝15.5,1.6,1.5,1.2Hz),6.92(1H(3'),dd,J＝15.5,7.0Hz),7.71(1H(1),m)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:9.7(19),11.6(4”),15.1(18),16.2(5”),17.2(17),18.1(4'),23.7(16),26.2(3”),26.7(15),36.1(8),36.2(14),41.2(2”),45.9(11),49.0(10),61.6(6),64.5(20),65.3(7),65.5(13),71.7(5),72.3(4),76.7(12),77.1(9),122.6(2'),133.6(2),145.0(3'),164.8(1),166.1(1'),178.9(1”)。210.2(3)。
化合物24:12-[(2E,4E)-癸-2,4-二烯酰基]-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.86(3H(18),d,J＝5.6Hz),0.87(3H(10'),d J＝11.7Hz),0.93(3H(4”),t,J＝7.5Hz),1.12(3H(5”),d,J＝7.0Hz),1.22(3H(16),s),1.24(3H(17),s),1.26(1H(14),m),1.26(2H(8'),br.s.),1.29(2H(9'),m),1.45(1H(3”),m),1.41(2H(7'),m),1.73(1H(3”),m),1.75(3H(19),dd,J＝2.9,1.3Hz),1.95(1H(11),dd,J＝9.7,6.4Hz),2.15(2H(6'),m),2.38(1H(2”),m),3.17(1H(8),d,J＝6.6Hz),3.27(1H(7),s),3.55(1H(OH),m),3.78(1H(20),dd,J＝12.0,4.6Hz),3.87(1H(20),m),4.05(1H(10),m),4.22(1H(5),m),5.41(1H(12),d,J＝9.9Hz),5.75(1H(2'),d,J＝15.4Hz),6.13(1H(5'),dd,J＝6.7,6.2Hz),6.16(1H(4'),s),7.20(1H(3'),dd,J＝15.5,9.9Hz),7.72(1H(1),dt,J＝2.5,1.3Hz)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:9.7(19),11.6(4”),14.0(10'),15.1(18),16.2(5”),17.2(17),22.4(9'),23.6(16),26.2(3”),26.7(15),28.4(7'),31.3(8'),33.0(6'),36.1(8),36.2(14),41.2(2”),45.9(11),49.0(10),61.6(6),64.5(20),65.3(7),65.5(13),71.7(5),72.3(4),76.7(12),77.1(9),118.8(2'),128.3(4'),133.5(2),145.3(5'),145.6(3'),164.8(1),166.6(1'),178.9(1”),210.0(3)。
化合物25:12-[(2Z,4E)-癸-2,4-二烯酰基]-13-(2-甲基丙酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.85(3H(18),d),0.86(3H(10'),t),1.16(3H(4”),d),1.19(3H(3”),d,J＝7.0Hz),1.22(3H(16),s),1.22(3H(17),s),1.25(2H(8'),m),1.27(1H(14),d,J＝3.1Hz),1.29(2H(9'),m),1.41(2H(7'),br.s.),1.75(3H(19),s),1.94(1H(11),dd,J＝10.0,6.4Hz),2.16(2H(6'),s),2.58(1H(2”),dt,J＝14.0,7.0Hz),3.16(1H(8),d,J＝6.7Hz),3.27(1H(7),s),3.55(1H(OH),br.s),3.78(1H(20),d,J＝12.5Hz),3.86(1H(20),d,J＝13.1Hz),4.05(1H(10),d,J＝5.4Hz),4.21(1H(5),s),5.41(1H(12),d,J＝9.9Hz),5.51(1H(2'),d,J＝11.2Hz),6.06(1H(5'),dd,J＝15.3,7.0Hz),6.55(1H(3'),t,J＝11.4Hz),7.29(1H(4'),dd,J＝15.3,7.0Hz),7.71(1H(1),s)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:9.7(19),14.7(10'),15.1(18),17.1(16),18.6(3”),18.6(4”),22.5(9'),23.7(17),26.6(15),28.4(7'),31.4(8'),33.0(6'),34.2(2”),36.0(14),36.1(8),45.7(11),49.0(10),61.6(6),64.5(20),65.3(7),65.5(13),71.7(5),72.3(4),76.0(12),77.2(9),115.0(2'),126.9(4'),133.5(2),145.9(3'),146.2(5'),164.8(1),165.9(1'),179.3(1”),210.0(3)。
化合物26:12-[(2E,4E)-6,7-(反)-环氧-十二-2,4-二烯酰基]-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.87(3H(18),d,J＝4.4Hz),0.86(3H(12'),br.s.),0.92(3H(4”),t,J＝7.3Hz),1.12(3H(5”),d,J＝6.8Hz),1.22(3H(17),br.s.),1.24(3H(16),s),1.27(1H(14),d,J＝7.3Hz),1.28(2H(11'),m),1.29(2H(10'),m),1.44(2H(9'),m),1.57(2H(8'),m),1.72(2H(3”),dd,J＝13.9,7.1Hz),1.75(3H(19),d,J＝1.5Hz),1.95(1H(11),m),2.37(1H(2”),m),2.85(1H(7'),tt,J＝5.6,2.0Hz),3.15(1H(6'),d,J＝7.8Hz),3.17(1H(8),s),3.28(1H(7),s),3.52(1H(OH),d,J＝2.9Hz),3.76(1H(OH),m),3.79(1H(20),d,J＝2.9Hz),3.87(1H(20),m),4.05(1H(10),d,J＝2.0Hz),4.22(1H(5),d),5.42(1H(12),d,J＝10.3Hz),5.83(1H(5'),d,J＝15.2,7.8Hz),5.87(1H(2'),d,J＝15.7Hz),6.00(1H(OH),m),6.47(1H(4'),dd,J＝14.7,11.2Hz),7.20(1H(3'),dd,J＝15.2,11.2Hz),7.71(1H(1),br.s.)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:9.7(19),11.6(4”),14.0(12'),15.1(18),16.2(5”),17.2(16),22.5(11'),23.7(17),25.5(9'),26.2(3”),26.8(15),31.5(10'),31.9(8'),36.1(8),36.2(14),41.2(2”),45.9(11),49.0(10),57.5(6'),61.6(7'),61.7(6),64.5(20),65.2(7),65.4(13),71.7(5),72.3(4),77.1(9),77.1(12),121.6(2'),130.9(4'),133.5(2),139.7(5'),143.3(3'),164.7(1),166.2(1'),179.0(1”),210.1(3)。
化合物29:12-巴豆酰基-13-(2-甲基丁酰基)-5,6-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.83(3H(18),d,J＝6.8Hz),0.92(3H(4”),t,J＝7.6Hz),1.13(3H(5”),d,J＝6.8Hz),1.20(1H(14),d,J＝5.9Hz),1.22(3H(17),s),1.23(3H(16),s),1.45(1H(3”),tt,J＝14.2,7.3Hz),1.72(1H(3”),dd),1.77(3H(5'),dd,J＝7.1,1.2Hz),1.80(3H(4'),d,J＝1.5Hz),1.81(3H(19),dd,J＝2.9,1.5Hz),2.11(1H(11),dq),2.29(1H(8),d,J＝5.4Hz),2.38(1H(2”),m,J＝7.0,6.8Hz),2.47(1H(20-OH),t,J＝6.8Hz),2.98(1H(4-OH),s),3.53(1H(10),m),3.73(1H(5),d,J＝1.0Hz),3.81(1H(20),dd,J＝12.7,6.8Hz),3.92(1H(20),m,J＝12.7,6.8Hz),4.46(1H(7),d,J＝5.4Hz),5.10(1H(7-OH),d,J＝5.4Hz),5.39(1H(12),d,J＝10.3Hz),6.55(1H(9-OH),m),6.80(1H(3'),m,J＝7.1,6.8,1.5Hz),7.58(1H(1),s)，
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:10.3(19),11.6(4”),12.2(4'),14.0(18),14.4(5'),16.2(5”),17.0(17),23.5(16),26.2(15),26.2(3”),34.7(14),35.2(8),41.3(2”),43.7(11),57.3(10),62.6(5),64.2(20),67.0(6),67.0(13),71.3(4),75.8(12),77.3(7),79.1(9),128.3(2'),134.7(2),137.8(3'),159.7(1),167.4(1'),179.7(1”),205.7(3)。
化合物30:13-(2-甲基丁酰基)-5,6-环氧-4,7,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.91(3H(4'),t,J＝7.6Hz),1.02(3H(18),d,J＝6.4Hz),1.15(1H(14),d,J＝5.9Hz),1.15(3H(5'),d,J＝7.3Hz),1.19(3H(16),s),1.22(3H(17),s),1.46(1H(3'),ddd,J＝14.1,7.0,6.8Hz),1.70(1H(3'),dt,J＝13.7,7.3Hz),1.81(3H(19),dd,J＝2.9,1.5Hz),1.93(1H(11),dq,J＝9.8,6.6,6.5Hz),2.24(1H(8),d,J＝5.9Hz),2.40(1H(2'),m,J＝7.0,6.8Hz),2.84(1H(20-OH),br.s.),3.44(1H(4-OH),s),3.50(1H(10),t,J＝2.4Hz),3.76(1H(5),s),3.84(1H(20),dd,J＝12.2,3.9Hz),3.88(1H(12),dd,J＝10.0,3.7Hz),3.92(1H(20),d,J＝12.2,5.9Hz),4.46(1H(7),d,J＝4.4Hz),4.57(1H(OH),m),5.20(1H(OH),m),7.60(1H(1),s)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:10.3(19),11.7(4'),14.6(18),16.5(5'),16.7(16),23.6(17),26.4(15),26.5(3'),33.8(14),35.5(8),41.1(2'),45.5(11),57.8(10),62.6(5),64.1(20),66.9(6),68.0(13),71.3(4),76.8(12),77.3(7),78.8(9),134.4(2),160.2(1),180.0(1'),206.2(3)。
化合物31:12-乙酰基-13-(2-甲基丁酰基)-5,6-环氧-4,7,9,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.84(3H(18),d,J＝6.6Hz),0.92(3H(4”),t,J＝7.5Hz),1.12(3H(5”),d,J＝7.0Hz),1.17(3H(16),s),1.18(1H(14),s),1.22(3H(17),s),1.44(1H(3”),m,J＝14.1,7.3,7.1Hz),1.81(3H(19),dd,J＝2.8,1.2Hz),2.04(3H(2'),s),2.09(1H(11),dq,J＝10.2,6.5Hz),2.31(1H(8),d,J＝5.6Hz),2.37(1H(2”),sxt,J＝7.0Hz),2.88(1H(20-OH),m),3.52(1H(10),d,J＝2.6Hz),3.59(1H(4-OH),s),3.81(1H(5),d,J＝0.9Hz),3.83(1H(20),d,J＝12.4Hz),3.96(1H(20),d),4.39(1H(7),d,J＝5.1Hz),5.04(1H(7-OH),d,J＝5.5Hz),5.3(1H(12),d,J＝10.1Hz),6.48(1H(9-OH),br.s.),7.58(1H(1),s)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:10.3(19),11.6(4”),14.0(18),16.2(5”),16.7(16),20.9(2'),23.5(17),26.1(3”),26.2(15),34.6(14),35.1(8),41.3(2”),43.4(11),57.3(10),62.4(5),63.7(20),65.6(13),67.3(6),71.3(4),76.1(12),77.2(7),79.0(9),134.6(2),159.8(1),170.6(1'),179.7(1”),206.1(3)。
化合物32:12,13-二-(2-甲基丁酰基)-5,6-环氧-4,7,9,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.84(3H(18),d,J＝6.6Hz),0.89(3H(4'),m,J＝7.6Hz),0.91(3H(4”),d,J＝7.5Hz),1.11(3H(5”),d,J＝7.0Hz),1.12(3H(5'),d,J＝7.0Hz),1.17(3H(16),s),1.18(1H(14),d,J＝5.7Hz),1.19(3H(17),s),1.42(1H(3'),m),1.46(1H(3”),dt,J＝6.8,3.3Hz),1.62(1H(3'),dt,J＝8.2,6.9Hz),1.68(1H(3”),d,J＝7.1Hz),1.80(3H(19),dd,J＝2.8,1.3Hz),2.10(1H(11),dd,J＝10.2,6.Hz),2.33(1H(8),d,J＝5.4Hz),2.35(1H(2'),m),2.38(1H(2”),d,J＝4.3Hz),3.14(1H(20-OH),br.s.),3.54(1H(10),dd,J＝2.4,2.2Hz),3.83(1H(20),d,J＝13.0Hz),3.85(1H(5),d,J＝1.0Hz),3.96(1H(4-OH),s),3.98(1H(20),m,J＝12.8Hz),4.37(1H(7),d,J＝5.3Hz),5.03(1H(7-OH),d,J＝5.5Hz),5.36(1H(12),d,J＝10.3Hz),6.46(1H(9-OH),s),7.59(1H(1)s)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:10.3(19),11.6(4”),11.6(4'),13.9(18),16.1(5”),16.8(5'),16.9(16),23.5(17),26.0(15),26.2(3”),26.7(3'),34.6(14),35.1(8),41.3(2”),41.7(2'),43.3(11),57.2(10),62.2(5),63.2(20),65.6(13),67.6(6),71.3(4),75.4(12),77.2(7),79.1(9),134.6(2),160.0(1),175.9(1'),179.6(1”),206.3(3)。
化合物33:12-丙酰基-13-(2-甲基丁酰基)-5,6-环氧-4,7,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.83(3H(18),d),0.92(3H(4”),t,J＝7.5Hz),1.12(3H(5”),d,J＝7.0Hz),1.13(3H(3'),t,J＝7.6Hz),1.18(3H(16),s),1.19(1H(14),s),1.22(3H(17),s),1.44(1H(3”),m,J＝14.1,7.5,7.1Hz),1.71(1H(3”),ddd,J＝13.9,7.3,7.1Hz),1.81,(3H(19),dd,J＝2.8,1.3Hz),2.08(1H(11),dd,J＝10.2,6.5Hz),2.29(1H(8),m),2.31(2H(2'),m),2.37(1H(2”),d,J＝7.0Hz),2.72(1H(20-OH),t,J＝6.7Hz),3.34(1H(4-OH),s),3.53(1H(10),d,J＝2.4Hz),3.78(1H(5),d),3.82(1H(20),dd,J＝12.7,5.9Hz),3.94(1H(20),dd,J＝12.7,5.9Hz),4.42(1H(7),d,J＝5.6Hz),5.06(1H(7-OH),d,J＝5.6Hz),5.32(1H(12),d,J＝10.3Hz),6.49(1H(9-OH),s),7.58(1H(1),d,J＝1.3Hz)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:9.3(3'),10.3(19),11.6(4”),14.0(18),16.2(5”),16.8(16),23.5(17),26.1(3”),26.2(15),27.8(2'),34.6(14),35.1(8),41.3(2”),43.4(11),57.3(10),62.5(5),63.8(20),65.6(13),67.2(6),71.3(4),75.9(12),77.3(7),79.1(9),134.6(2),159.8(1),173.9(1'),179.7(1”),206.0(3)。
化合物34:12-己酰基-13-(2-甲基丁酰基)-5,6-环氧-4,7,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.83(3H(18),d),0.88(3H(6'),t,J＝6.9Hz),0.92(3H(4”),t,J＝7.5Hz),1.12(3H(5”),d,J＝7.1Hz),1.18(3H(16),s),1.19(1H(14),s),1.21(3H(17),s),1.29(2H(4'),m),1.30(2H(5'),m,J＝7.6,7.3,3.6Hz),1.44(1H,(3”),dt,J＝14.1,7.0Hz),1.61(2H(3'),m),1.70(1H(3”),m,J＝14.1,7.3,7.1Hz),1.81(3H(19),dd,J＝2.8,1.3Hz),2.08(1H(11),dq,J＝10.3,6.5Hz),2.3(1H(8),d,J＝3.8Hz),2.28(2H(2'),m),2.37(1H(2”),q,J＝7.0Hz),2.73(1H(20-OH),m),3.35(1H(4-OH),br.s.),3.53(1H(10),t,J＝2.5Hz),3.78(1H(5),d,J＝1.1Hz),3.82(1H(20),d,J＝12.6Hz),3.94(1H(20),d,J＝12.5Hz),4.42(1H(7),d,J＝3.9Hz),5.06(1H(7-OH),d,J＝5.4Hz),5.34(1H(12),d,J＝10.3Hz),6.48(1H(9-OH),s),7.58(1H(1),d,J＝1.5Hz)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:10.3(19),11.6(4”),13.9(18),13.9(6'),16.1(5”),16.8(16),22.3(5'),23.5(17),24.9(3'),26.1(15),26.2(3”),31.1(4'),34.5(2'),34.6(14),35.2(8),41.3(2”),43.3(11),57.3(10),62.5(5),64.0(20),65.6(13),67.1(6),71.3(4),75.6(12),77.2(7),79.1(9),134.6(2),159.8(1),173.3(1'),179.6(1”),206.0(3)。
化合物35:12-巴豆酰基-13-(2-甲基丙酰基)-5,6-环氧-4,7,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.84(3H(18),d),1.15(3H(3”),d,J＝7.0Hz),1.17(3H(4”),d,J＝7.0Hz),1.21(1H(14),m),1.21(3H(16),s),1.21(3H(17),s),1.77(3H(4'),dd,J＝7.1,1.1Hz),1.80(3H(5'),d,J＝1.3Hz),1.81(3H(19),dd,J＝2.9,1.4Hz),2.13(1H(11),dd,J＝9.6,6.3Hz),2.32(1H(8),d,J＝6.1Hz),2.58(1H(2”),spt,J＝7.0Hz),3.46(1H(4-OH),s),3.54(1H(10),d,J＝2.5Hz),3.81(1H(5),d,J＝1.2Hz),3.82(1H(20),m),3.96(1H(20),d,J＝13.0Hz),4.42(1H(7),d,J＝4.9Hz),5.07(1H(7-OH),d,J＝5.5Hz),5.37(1H(12),d,J＝10.2Hz),6.52(1H(9-OH),s),6.80(1H(3'),dq,J＝7.0,1.4Hz),7.58(1H(1),dd,J＝2.0,1.4Hz)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:10.3(19),12.2(5'),14.0(18),14.4(4'),16.9(16),18.5(3”),18.6(4”),23.5(17),26.0(15),34.2(2”),34.6(14),35.2(8),43.6(11),57.3(10),62.4(5),63.7(20),65.7(13),67.3(6),71.3(4),75.7(12),77.2(7),79.1(9),128.3(2'),134.6(2),137.8(3'),159.9(1),167.5(1'),180.1(1”),206.0(3)。
化合物36:12-[(2E)-3-甲硫基丙-2-烯酰基]-13-(2-甲基丁酰基)-5,6-环氧-4,7,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.92(3H(4”),t,J＝7.0Hz),0.84(3H(18),d,J＝6.5Hz),1.13(3H(5”)d,J＝7.0Hz),1.18(1H(14),s),1.20(3H(16),s),1.22(3H(17),s),1.44(1H(3”),dt,J＝13.9,7.0Hz),1.72(1H(3”),d,J＝13.8Hz),1.81(3H(19),dd,J＝2.7,1.2Hz),2.12(1H(11),dd,J＝9.4,5.6Hz),2.31(1H(8),d,J＝6.0Hz),2.32(3H(5'),s),2.38(1H(2”),q,J＝7.0Hz),3.36(1H(4-OH),s),3.53(1H(10),d,J＝2.3Hz),3.78(1H(5),d,J＝0.9Hz),3.82(1H(20),d,J＝12.6Hz),3.94(1H(20),d),4.43(1H(7),d,J＝4.6Hz),5.08(1H(7-OH),d),5.37(1H(12),d,J＝10.2Hz),5.61(1H(2'),d,J＝14.9Hz),6.53(1H(9-OH),s),7.58(1H(1),d,J＝1.9Hz),7.68(1H(3'),d,J＝14.9Hz)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:10.3(19),11.6(4”),14.0(18),14.3(5'),16.2(5”),16.9(16),23.5(17),26.2(15),26.2(3”),34.7(14),35.2(8),41.3(2”),43.6(11),57.3(10),62.5(5),64.0(20),65.6(13),67.1(6),71.3(4),75.8(12),77.3(7),79.1(9),112.7(2'),134.6(2),147.7(3'),159.8(1),164.5(1'),179.8(1”),206.0(3)。
化合物37:12-巴豆酰基-13-(2-甲基丁酰基)-5,6-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.84(2H(18),d,J＝6.6Hz),0.92(3H(4”),t,J＝7.5Hz),1.12(3H(5”),d,J＝6.9Hz),1.19(1H(14),s),1.20(1H(16),s),1.21(1H(17),s),1.44(1H(3”),dt,J＝14.1,7.0Hz),1.72(1H(3”),dq),1.77(3H(4'),dd,J＝7.1,1.1Hz),1.8(3H(5'),t,J＝1.3Hz),1.81(3H(19),dd,J＝2.9,1.5Hz),2.13(1H(11),q,J＝2.9Hz),2.33(1H(8),d,J＝5.7Hz),2.38(1H(2”),q,J＝7.0Hz),2.99(1H(20-OH),br.s.),3.55(1H(10),t,J＝2.6Hz),3.70(1H(4-OH),br.s.),3.83(1H(20),dd,J＝12.8,4.9Hz),3.84(1H(5),d,J＝1.1Hz),3.98(1H(20),dd,J＝12.8,7.3Hz),4.39(1H(7),d,J＝5.5Hz),5.06(1H(7-OH),d,J＝5.5Hz),5.39(1H(12),d,J＝10.2Hz),6.53(1H(9-OH),br.s.),6.8(1H(3'),dd,J＝7.1,1.5Hz),7.59(1H(1),dd,J＝2.0,1.5Hz)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:10.3(19),11.6(4”),12.2(5'),14.0(18),14.4(4'),16.2(5”),17.0(16),23.5(17),26.1(15),26.1(3”),34.7(14),35.2(8),41.2(2”),43.7(11),57.2(10),62.3(5),63.5(20),65.7(13),67.5(6),71.3(4),75.9(12),77.2(7),79.1(9),128.3(2'),134.6(2),137.7(3'),159.9(1),167.4(1'),179.7(1”),206.1(3)。
化合物38:12,13-二-(2-甲基丁酰基)-5,6-环氧-4,7,9,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.84(3H(18),d,J＝6.6Hz),0.89(3H(4'),t,J＝7.4Hz),0.92(3H(4”),t,J＝7.5Hz),1.12(3H(5'),d,J＝7.0Hz),1.12(3H(5”),d,J＝7.0Hz),1.19(1H(14),d,J＝1.5Hz),1.20(3H(16)s),1.21(3H(17),s),1.45(1H(3'),dd,J＝14.1,6.8Hz),1.45(1H(3”),dd,J＝14.1,6.8Hz),1.62(1H(3'),dd,J＝8.3,7.5Hz),1.68(1H(3”),dd,J＝14.1,6.9Hz),1.81(3H(19),dd,J＝2.8,1.3Hz),2.08(1H(11),dd,J＝10.3,6.5Hz),2.30(1H(8),d,J＝5.5Hz),2.36(1H(2'),m),2.36(1H(2”),m),2.62(1H(10-OH),t,J＝6.8Hz),3.22(1H(4-OH),s),3.53(1H(10),br.s.),3.76(1H(5),d,J＝1.1Hz),3.82(1H(20),dd,J＝12.5,6.3Hz),3.93(1H(20),dd,J＝12.6,7.0Hz),4.44(1H(7),d,J＝5.5Hz),5.06(1H(7-OH),d,J＝5.6Hz),5.36(1H(12),d,J＝10.3Hz),6.48(1H(9-OH),s),7.58(1H(1),d,J＝2.0Hz)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:10.3(19),11.6(4'),11.6(4”),13.9(18),16.1(5”),16.9(5'),17.0(16),23.5(17),26.0(15),26.2(3”),26.7(3'),34.6(14),35.2(8),41.3(2'),41.8(2”),43.3(11),57.3(10),62.5(5),63.9(20),65.6(13),67.2(6),71.3(4),75.4(12),77.3(7),79.1(9),134.7(2),159.8(1),175.9(1'),179.6(1”),205.9(3)。
化合物39:12-{[2-(甲基硫烷基)羰基]-乙酰基}-13-(2-甲基丁酰基)-5,6-环氧-4,7,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.87(3H(18),d,J＝6.6Hz,0.92(3H(4”),t,J＝7.5Hz),1.13(3H(5”),d,J＝7.0Hz),1.16(3H(16),s),1.20(1H(14),d,J＝5.9Hz),1.23(17),br.s.),1.45(1H(3”),td,J＝14.1,7.2Hz),1.70(1H(3”),td,J＝14.0,7.2Hz),1.82(3H(19),dd,J＝2.8,1.3Hz),2.05(1H(OH),d,J＝3.40Hz),2.09(1H(11),dd,J＝10.3,6.5Hz),2.27(1H(8),d,J＝5.9Hz),2.34(3H(4'),s),2.38(1H(2”),t,J＝7.0Hz),2.85(1H(4-OH),s),3.52(1H(10),dd,J＝2.6,2.3Hz),3.57(2H(2'),d,J＝4.5Hz),3.70(1H(5),d,J＝1.1Hz),3.81(1H(20),dd,J＝12.2,6.2Hz),3.89(1H(20),m),4.46(1H(7),d,J＝5.7Hz),5.02(1H(7-OH),d,J＝5.9Hz),5.35(1H(12),d,J＝10.3Hz),6.47(1H(9-OH),m),7.56(1H(1),dd,J＝2.0,1.3Hz)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:10.3(19),11.6(4”),12.1(4'),14.0(18),16.2(5”),16.6(16),23.5(17),26.2(3”),26.5(15),34.8(14),35.2(8),41.3(2”),43.3(11),49.5(2'),57.4(10),62.7(5),64.4(20),65.3(13),66.8(6),71.3(4),77.2(7),77.9(12),79.1(9),134.7(2),159.5(1),165.7(1'),179.8(1”),190.9(3'),205.6(3)。
化合物40:12-[(2-甲氧基羰基)-乙酰基]-13-(2-甲基丁酰基)-5,6-环氧-4,7,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.88(3H(18),d),0.92(3H(4”),t,J＝7.6Hz),1.13(3H(5”),d,J＝6.8Hz),1.17(3H(16),s),1.21(1H(14),d,J＝5.9Hz),1.23(3H(17),s),1.45(1H(3”),dt,J＝14.2,6.8Hz),1.70(1H(3”),dd,J＝14.2,6.8Hz),1.82(3H(19),dd,J＝2.7,1.2Hz),2.09(1H(11),dd,J＝10.3,6.4Hz),2.27(1H(8),d,J＝4.9Hz),2.38(1H(2”),m,J＝14.1,7.0,6.8Hz),2.72(1H(4-OH),s),3.37(2H(2'),s),3.53(1H(10),d,J＝2.4Hz),3.70(1H(5),d,J＝1.0Hz),3.72(3H(4'),s),3.80(1H(20),m),3.90(1H(20),m),4.46(1H(7),d,J＝2.4Hz),5.02(1H(7-OH),d,J＝5.9Hz),6.49(1H(9-OH),s),7.56(1H(1),d,J＝2.0Hz)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:10.3(19),11.6(4”),13.9(18),16.2(5”),16.7(16),23.5(17),26.2(3”),26.5(15),34.8(14),35.2(8),41.3(2”),41.4(2'),43.3(11),52.5(4'),57.4(10),62.7(5),64.7(20),65.3(13),66.6(6),71.3(4),77.2(7),77.7(12),79.1(9),134.8(2),159.4(1),166.1(1'),166.1(3'),179.8(1”),205.5(3)。
实施例3：惕各烷衍生物的制备
通过水解惕各烷化合物的5,20-丙酮化合物(acetonides)的混合物(诸如化合物1和有关化合物)的C-12和C-13酯，随后使用下述方法用标准试剂在C-12和C-13处重新酯化，半合成地制备许多化合物。
如下制备用于合成惕各烷类似物的惕各烷酯的粗制混合物：粗糙地粉碎150gFontainea picrosperma的种子，然后将其通过与丙酮一起在1L烧瓶中搅拌进行提取。4小时以后，将该悬浮液真空过滤，并将滤饼用丙酮洗涤，直到TLC(PE:EtOAc:4:6)表明惕各烷酯的不存在。将合并的滤液蒸发，得到酯的粗制混合物。然后通过硅胶上的短重力柱色谱法(石油醚/乙酸乙酯；PE/EtOAc 8:2→4:6作为洗脱液)除去脂肪，得到8.2g(5.5％)粗制酯混合物。
然后将酯的混合物保护、去酯化和在C-12和C-13位置重新酯化(如在以下反应中解释的，使用不同的酰基)，以提供化合物21、22、23、27、28、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53和60。
将10mL酯混合物A在二甲基甲酰胺(DMF)中的溶液加入50mL吡啶鎓-对甲苯磺酸盐(PPTS,4.1g,过量)在DMF(10mL)中的溶液中，并在室温搅拌2分钟。然后加入120mL 2,2-二甲氧基丙烷(DMP)，并将溶液搅拌24小时。将反应物用NaCl溶液(150mL)稀释，并用乙酸乙酯(EtOAc,50mL)洗涤。将有机相用NaCl溶液洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并蒸发。将残余物通过硅胶上的重力柱色谱法(PE/EtOAc 8:2→6:4作为洗脱液)纯化，得到5.2g(3.5％)5,20-丙酮化合物酯混合物B。使未反应的起始原料在相同条件下再次反应，得到另外的酯混合物B。
通过将小块钠(9.7g)缓慢地加入搅拌的甲醇(HPLC级,2L)中，新鲜制备0.21NNaOMe溶液。然后，在剧烈搅拌下，将128mL该溶液快速地加入6.4g 5,20-丙酮化合物酯混合物B中。得到的溶液的pH必须通过小心地加入0.21M NaOMe而维持在11.5-12.0的范围内，注意不超过pH12.5。在室温搅拌24小时以后，将反应物用乙酸中和，过滤并蒸发至原始体积的约1/20。加入EtOAc(20mL)，将溶液用2N H2SO4(100mL)洗涤。将酸性洗液用EtOAc反萃取，并将合并的EtOAc溶液用NaCl溶液(2×300mL)洗涤。干燥(Na2SO4)、过滤并蒸发以后，将残余物通过硅胶上的重力柱色谱法(PE/EtOAc 6:4→4:6作为洗脱液)纯化，得到1.4g白色粉末。
具有对称酯化模式的惕各烷类似物的合成；示例性方法
改进的Steglich酯化
1.
向去酰基-惕各烷丙酮化合物(100mg；0,23mMol)在THF(5mL)中的溶液中，加入4-二甲基氨基吡啶(DMAP)(15mg；0,12mMol)，并将溶液加热至60℃(油浴温度)。单独地，向酯化羧酸(10当量)在THF(10mL/g)中的溶液中，加入N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC,10当量)；搅拌约15分钟以后，将悬浮液穿过棉花塞过滤，并逐滴加入到去酰基-惕各烷丙酮化合物的THF溶液中。在60℃搅拌24小时以后，通过用EtOAc(≈200mL)稀释和用2N H2SO4(≈50mL)、盐水(2×≈50mL)、接下来用饱和NaHCO3(≈50mL)和盐水(2×≈50mL)洗涤，将反应物后处理。干燥(Na2SO4)、过滤并蒸发以后，通过硅胶上的重力柱色谱法(PE/EtOAc9:1→6:4作为洗脱液)纯化残余物，得到111mg(80％)白色粉末。
3.2去保护
方法A(在CH2Cl2中的TFA)
将丙酮化合物二酯(100mg)加入新鲜制备的三氟乙酸(TFA)在CH2Cl2(2％V/V；200μL,2μL/mg)中的溶液中。在室温搅拌6-12h以后，如下将反应物后处理：用饱和NaHCO3(≈10mL)和盐水(≈40mL)的混合物洗涤，接下来用单独的盐水(2×≈40mL)洗涤。干燥(Na2SO4)、过滤并蒸发以后，通过硅胶上的重力柱色谱法(PE/EtOAc 8:2→2:8作为洗脱液)纯化残余物，得到惕各烷类似物(收率约：60-70％)。
方法B(在MeOH中的HClO4)
将丙酮化合物二酯(100mg)加入新鲜制备的HClO4在MeOH中的溶液[pH范围:1.5-2.0]中。在室温搅拌6-24小时以后，如下将反应物后处理：用醋酸钠中和，过滤并蒸发至原始体积的约1/20。接下来加入EtOAc(10mL)，并将溶液用2N H2SO4(30mL)洗涤，然后用盐水(30mL)洗涤。干燥(Na2SO4)、过滤并蒸发以后，通过硅胶上的重力柱色谱法(PE/EtOAc-→4:6作为洗脱液)纯化残余物，以约60-70％收率得到二酯。
使用该方法生产化合物27、41、42、43、44、46、49和60。
不对称二酯的合成，示例性方法：
1.
向12,13-去酰基-5,20-丙酮化合物(C)(1.4g；3,4mMol)在10mL四氢呋喃(THF)中的溶液中，加入740mL 34mMol三乙胺(TEA)，并将溶液加热至60℃。单独地，向(S)-(+)-2-甲基丁酸(3,702mL；34mMol)在THF(20mL)中的溶液中，加入N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC,7,015g；34mMol)。搅拌约15分钟以后，将悬浮液过滤并加入到起始二醇(C)的温热溶液中。在60℃搅拌24小时以后，将反应物用EtOAc(≈200mL)稀释，并用2N H2SO4(≈50mL)、NaCl溶液(2×≈50mL)洗涤，然后用NaHCO3溶液(≈50mL)和NaCl溶液(2×≈50mL)洗涤。干燥(Na2SO4)、过滤并蒸发以后，通过硅胶上的重力柱色谱法(PE/EtOAc 9:1→6:4作为洗脱液)纯化残余物，得到作为白色粉末的12-去酰基-5,20-丙酮化合物-13-[(S)-(+)-2-甲基丁酸酯(D)。
2.
向12,13-去酰基-5,20-丙酮化合物C(100mg；0,25mMol)在THF(5mL)中的溶液中，加入(S)-(+)-2-甲基丁酸(109μL；1,00mMol)和N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC,206,33mg；1,00mMol)。将溶液在60℃(油浴温度)搅拌24h，然后通过用EtOAc(≈20mL)稀释和用2N H2SO4(≈50mL)、盐水(2×≈50mL)、饱和NaHCO3(≈50mL)和盐水(2×≈50mL)洗涤进行后处理。干燥(Na2SO4)、过滤并蒸发以后，通过硅胶上的重力柱色谱法(PE/EtOAc 9:1→6:4作为洗脱液)纯化残余物，得到106.2mg(60％)作为白色粉末的12-去酰基-5,20-丙酮化合物-13-((S)-2-甲基丁酸酯)D。
3.
向12,13-去酰基-5,20-丙酮化合物C(100mg；0,25mMol)在THF(5mL)中的溶液中，加入二异丙基乙胺(DIPEA)(131μL；0,75mMol)和乙酸酐(94μL；0,75mMol)。在室温搅拌72h以后，加入EtOAc(10mL)，并将溶液用2N H2SO4(2×20mL)和盐水(20mL)洗涤。干燥(Na2SO4)、过滤并蒸发以后，通过硅胶上的重力柱色谱法(PE/EtOAc-→4:6作为洗脱液)纯化残余物，得到104mg(87％)作为白色粉末的12-去酰基-13-乙酰基-5,20-丙酮化合物。
4.
向去酰基-5,20-丙酮化合物(100mg；0,25mMol)在甲苯(5mL)/二甲基甲酰胺(2mL)中的溶液中，加入N-甲基靛红酸酐(266mg；1,50mMol)和二甲基氨基吡啶(DMAP)(31mg；0,25mMol)。在80℃搅拌24h以后，通过用EtOAc(≈10mL)稀释以及用[2N H2SO4(≈20mL)+盐水(≈60mL)](×2)和[饱和NaHCO3(≈20mL)+盐水(≈60mL)](×2)先后洗涤，将反应物后处理。干燥(Na2SO4)、过滤并蒸发以后，通过硅胶上的重力柱色谱法(PE/EtOAc 9:1→7:3作为洗脱液)纯化残余物，得到114mg(80％)作为白色粉末的12-去酰基-13-[(N-甲基)-邻氨基苯甲酸酯-5,20-丙酮化合物。
13-单酯的酰化：示例性方法
1.
向12-去酰基-5,20-丙酮化合物-13-[(S)-(+)-2-甲基丁酸酯(D)(1062mg；2,04mMol)在甲苯(10mL)中的溶液中，加入二甲基氨基吡啶(DMAP)(249mg；2.04mMol)。单独地，向苯甲酸1224mg；10.02mMol)在甲苯(20mL)中的溶液中，加入三乙胺(1.397mL；10.02mMol)，并将溶液搅拌约2分钟至完全溶解；然后加入2,4,6-三氯苯甲酰氯(1.566mL；10.02mMol)(溶液1)。将含有化合物D的组合物搅拌6小时以后，将悬浮液过滤并倒入溶液1中。在60℃搅拌24-48小时以后，将反应物用EtOAc(≈10mL)稀释，并用NH2SO4溶液(≈40mL)、NaCl溶液(2×≈40mL)洗涤，然后用NaHCO3溶液(≈40mL)和NaCl溶液(2×≈40mL)洗涤。干燥(Na2SO4)、过滤并蒸发以后，通过硅胶上的重力柱色谱法(PE/EtOAc9:1→7:3作为洗脱液)纯化残余物，得到作为白色粉末的5,20-丙酮化合物-12-苯甲酸酯-13-[(S)-(+)-2-甲基丁酸酯E。
2.
向去酰基-13-(N-甲基邻氨基苯甲酰基)-5,20-丙酮化合物(100mg；0,18mMol)在四氢呋喃(THF,5mL)中的溶液中，依次加入乙酸酐(51mg；0,54mMol)和二甲基氨基吡啶(DMAP)(2,2mg；0,018mMol)。在50℃搅拌6h以后，通过用EtOAc(约10mL)稀释以及用2N H2SO4(2×约40mL)、饱和NaHCO3(2×约40mL)和盐水(2×约40mL)先后洗涤，将反应物后处理。干燥(Na2SO4)、过滤并蒸发以后，通过硅胶上的重力柱色谱法(PE/EtOAc 95:05→7:3作为洗脱液)纯化残余物，得到105mg(95％)作为白色粉末的12-乙酰基-13-(N-甲基)anthranylate-5,20-丙酮化合物。
3.
向12-去酰基-5,20-丙酮化合物-13-[(S)-2-甲基丁酸酯](100mg；0,19mMol)在甲苯(5mL)中的溶液中，加入二甲基氨基吡啶(DMAP)(23mg；0,19mMol)。单独地，向惕各酸(95mg；0,95mMol)在甲苯(5mL)中的溶液中，加入三乙胺(132μL；0,95mMol)，并将溶液搅拌约2min至完全溶解；然后加入2,4,6-三氯苯甲酰氯(148μL；0,95mMol)，并在室温搅拌6h以后，将悬浮液过滤(棉花塞)并逐滴加入到二萜类化合物单酯在甲苯中的溶液中。在60℃搅拌24-48h以后，通过用EtOAc(约10mL)稀释以及用2N H2SO4(约40mL)、盐水(2×≈40mL)洗涤和接下来用NaHCO3(约40mL)和盐水(2×≈40mL)洗涤，将反应物后处理。干燥(Na2SO4)、过滤并蒸发以后，通过硅胶上的重力柱色谱法(PE/EtOAc9:1→7:3作为洗脱液)纯化残余物，得到59mg(50％)作为白色粉末的12-巴豆酰基-13-甲基丁酰基-5,20-丙酮化合物。
4.
将12-去酰基-5,20-丙酮化合物-13-(S)-2-甲基丁酸酯(100mg；0,19mMol)在甲苯(10mL)中的溶液加热至60℃，并依次加入肉豆蔻酸(217mg；0,95mMol)、N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)(196mg；0,95mMol)和二甲基氨基吡啶(DMAP)(23mg；0,19mMol)。在60℃搅拌12小时以后，通过用EtOAc(≈10mL)稀释以及用2N H2SO4(2×≈40mL)、饱和NaHCO3(2×≈40mL)和盐水(2×≈40mL)洗涤，将反应物后处理。干燥(Na2SO4)、过滤并蒸发以后，通过硅胶上的重力柱色谱法(PE/EtOAc9:1→7:3作为洗脱液)纯化残余物，得到121mg(70％)作为白色粉末的12-肉豆蔻酰基-13-(2-甲基丁酰基)-5,20-丙酮化合物。
5.
将12-去酰基-5,20-丙酮化合物-13-乙酸酯(100mg；0,25mMol)在甲苯(10mL)中的溶液加热至60℃(油浴温度)，然后加入肉豆蔻酸(286mg；1,00mMol)、N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)(206mg；1,00mMol)和二甲基氨基吡啶(DMAP)(31mg；0,25mMol)。在60℃搅拌12小时以后，通过用EtOAc(约10mL)稀释以及用2N H2SO4(2×约40mL)、饱和NaHCO3(2×约40mL)和盐水(2×约40mL)洗涤，将反应物后处理。干燥(Na2SO4)、过滤并蒸发以后，通过硅胶上的重力柱色谱法(PE/EtOAc9:1→7:3作为洗脱液)纯化残余物，得到121mg(70％)作为白色粉末的12-肉豆蔻基-13-乙酰基-5,20-丙酮化合物。
6.
向加热的(60℃,油浴温度)去酰基-13-(N-甲基邻氨基苯甲酰基)-5,20-丙酮化合物(100mg；0,18mMol)在甲苯(10mL)中的溶液中，依次加入己酸(84mg；0,72mMol)、二环己基碳二亚胺(DCC,149mg；0,72mMol)和二甲基氨基吡啶(DMAP 22mg；0,18mMol)。在60℃搅拌12h以后，通过用EtOAc(约10mL)稀释以及用2N H2SO4(2×约40mL)、饱和NaHCO3(2×约40mL)和盐水(2×约40mL)先后洗涤，将反应物后处理。干燥(Na2SO4)、过滤并蒸发以后，通过硅胶上的重力柱色谱法(PE/EtOAc9:1→7:3作为洗脱液)纯化残余物，得到108mg(90％)作为白色粉末的12-己酰基-13-(N-甲基邻氨基苯甲酰基)-5,20-丙酮化合物。
去保护
1.
将5,20-丙酮化合物-12-苯甲酸酯-13-[(S)-(+)-2-甲基丁酸酯E(637mg；1.02mMol)加入新鲜制备的HClO4在MeOH中的溶液[1.5<pH<2.0]中。搅拌6-24小时以后，将反应物用醋酸钠中和，过滤并蒸发至原始体积的约1/20。加入EtOAc(10mL)，并将溶液用2NH2SO4(30mL)洗涤，然后用NaCl溶液(30mL)洗涤。干燥(Na2SO4)、过滤并蒸发以后，通过硅胶上的重力柱色谱法(PE/EtOAc-→4:6作为洗脱液)纯化残余物，得到作为白色粉末的12-苯甲酸酯-13-[(S)-(+)-2-甲基丁酸酯F(化合物23)。
2.
作为代表，与12-乙酰基-13-N-甲基邻氨基苯甲酰基-5,20-丙酮化合物的反应：向12-乙酰基-13-N-甲基邻氨基苯甲酰基-5,20-丙酮化合物(100mg；0,16mMol)在CH2Cl2(10mL)中的溶液中，加入三氟乙酸(TFA)(300μL；3％V/V)。搅拌约12小时以后，通过用[NaHCO3(≈10mL)+盐水(≈40mL)]洗涤和接下来用盐水(2×≈40mL)洗涤，将反应物后处理。干燥(Na2SO4)、过滤并蒸发以后，通过硅胶上的重力柱色谱法(PE/EtOAc8:2→2:8作为洗脱液)纯化残余物，得到69mg(75％)作为白色粉末的12-乙酰基-13-(N-甲基邻氨基苯甲酰基)-惕各烷。
通过这些方法制备化合物21、22、23、28、45、47、48、50、51、52和53。
化合物21
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.84(3H,d,J＝6.6Hz),0.93(3H,t,J＝7.4Hz),1.21(3H,s),1.23(3H,s),1.29(1H,d,J＝6.7Hz),1.64(2H,sxt,J＝7.6Hz),1.73(3H,dd,J＝2.9,1.3Hz),1.77(3H,dq,J＝7.2,1.2Hz),1.79-1.81(3H,m),1.95(1H,dd,J＝9.9,6.5Hz),2.24-2.38(2H,m),3.16(1H,d,J＝6.7Hz),3.26(1H,d,J＝0.5Hz),3.65(1H,s),3.83(2H,dd,J＝13.3,12.5Hz),3.94(1H,d,J＝3.1Hz,OH),4.06(1H,t,J＝2.6Hz),4.22(1H,s),5.41(1H,d,J＝9.9Hz),5.82-6.00(1H,br.s.,OH),6.80(1H,qq,J＝7.1,1.4Hz),7.71(1H,dd,J＝2.6,1.3Hz)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:9.72,12.20,13.62,14.43,15.07,17.12,18.03,23.66,26.35,35.98,36.03,36.13,45.76,48.92,61.77,64.56,65.23,65.65,71.36,72.41,76.74,77.20,128.38,133.46,137.73,164.63,167.62,176.12,209.88。
化合物22
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.85(3H,d,J＝7.3Hz),0.86(3H,t,J＝7.2Hz),1.20(3H,s),1.21(3H,s),1.20-1.40(10H,m),1.29(1H,d,J＝6.8Hz),1.67(2H,d,J＝13.7Hz),1.75(3H,dd,J＝2.9,1.0Hz),1.88-1.92(2H,m)1.89-1.95(1H,m),3.07(2H,dd,J＝6.8,1.5Hz),3.15(1H,d,J＝6.4Hz),3.26(1H,s),3.85(2H,dd,J＝12.7,4.4Hz),4.04(1H,d,J＝2.9Hz),4.21(1H,s),5.13-5.15(1H,m),5.16-5.18(1H,m),5.35(1H,d,J＝9.8Hz),5.82-5.92(1H,m),7.70(1H,dd,J＝2.4,1.0Hz)。
13C NMR(125MHz,氯仿-d)δppm:9.74,14.08,15.12,17.03,22.63,23.69,24.48,26.51,29.07,29.08,29.19,31.81,34.25,36.01,36.04,39.29,45.50,48.94,61.69,64.54,65.21,65.49,71.58,72.35,77.17,77.41,118.62,130.03,133.55,164.54,171.11,176.25,209.86。
化合物23
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.90(3H,d,J＝6.5Hz),0.94(3H,t,J＝7.5Hz),1.14(3H,d,J＝7.1Hz),1.22(3H,s),1.32(1H,d,J＝6.6Hz),1.35(3H,s),1.41-1.51(1H,m,J＝14.1,7.5,7.0Hz),1.69-1.79(1H,m),1.73(3H,dd,J＝2.9,1.3Hz),2.08(1H,dq,J＝9.9,6.5Hz),2.39(1H,sxt,J＝7.0Hz),3.24(1H,d,J＝6.6Hz),3.29(1H,s),3.84(2H,dd,J＝12.8,1.3Hz),4.10(1H,t,J＝2.5Hz),4.24(1H,d,J＝0.7Hz),5.62(1H,d,J＝9.9Hz),6.07(1H,br.s.,OH),7.43(2H,t,J＝7.7Hz),7.55(1H,tt,J＝7.5,1.3Hz),7.72(1H,dd,J＝2.6,1.3Hz),7.99(2H,dm,J＝8.4,1.3Hz)
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:9.73,11.61,15.14,16.14,17.32,23.63,26.18,26.82,36.03,36.34,41.22,45.92,48.92,61.86,64.59,65.20,65.48,71.27,72.46,77.23,77.60,128.44(2C),129.70(2C),130.02,133.07,133.52,164.54,165.94,179.00,209.84。
化合物27
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.85(3H,d,J＝6.5Hz),0.93(6H,t,J＝7.4Hz),1.20(6H,s),1.28(1H,d,J＝6.6Hz),1.58-1.68(4H,m),1.74(3H,d,J＝1.8Hz),1.91(1H,dq,J＝10.0,6.4Hz),2.20-2.36(4H,m),3.14(1H,d,J＝6.6Hz),3.25(1H,s),3.63(1H,s,OH),3.76-3.86(1H,m),3.93(1H,d,J＝3.1Hz,OH),4.05(1H,d,J＝2.4Hz),4.21(1H,d,J＝2.4Hz),5.36(1H,d,J＝10.0Hz),5.84(1H,br.s.,OH),7.70(1H,s)。
13C NMR(125MHz,氯仿-d)δppm:9.72,13.46,13.62,15.04,17.02,18.01,18.61,23.66,26.34,35.90,35.95,36.14,36.38,45.42,48.90,61.79,64.58,65.21,65.60,71.34,72.40,76.59,77.18,133.49,164.54,173.30,176.05,209.85。
化合物28
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.91(3H,d,J＝6.6Hz),0.96(3H,t,J＝7.4Hz),1.21(3H,s),1.34(3H,s),1.36(1H,d,J＝3.4Hz),1.60-1.72(2H,m),1.74(3H,d,J＝2.1Hz),2.09(1H,dd,J＝9.8,6.5Hz),2.31(1H,t,J＝15.9,7.6Hz),2.38(1H,t,J＝15.9,7.6Hz),3.24(1H,d,J＝6.7Hz),3.29(1H,s),3.80(1H,d,J＝12.4Hz),3.87(1H,d,J＝12.4Hz),4.09(1H,d,J＝2.7Hz),4.24(1H,s),5.62(1H,d,J＝9.9Hz),7.43(2H,t,J＝7.7Hz),7.56(1H,t,J＝7.4Hz),7.73(1H,s),7.99(2H,d,J＝7.3Hz)
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:9.73,13.65,15.16,17.25,18.07,23.66,26.59,36.07,36.18,36.23,45.80,48.95,61.74,64.55,65.23,65.62,71.54,72.40,77.21,77.63,128.46(2C),129.72(2C),129.98,133.12,133.56,164.57,166.15,176.19,209.88。
化合物41
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.85(3H(18),d,J＝7.3Hz),0.85(3H(9'),t,J＝7.3Hz),0.86(3H(9”),t,J＝6.8Hz),1.20(3H(16),s),1.20(3H(17),s),1.22-1.30(10H(4',5',6',7',8'),m),1.22-1.30(10H,4”,5”,6”,7”,8”),m),1.28(1H(14),d,J＝6.8Hz),1.53-1.62(2H(3”),m),1.56-1.63(2H(3'),m),1.74(3H(19),dd,J＝2.9,1.3Hz),1.90(1H(11),dq,J＝10.1,6.5Hz),2.19(1H(20-OH),t,J＝6.8Hz),2.24-2.32(2H(2'),m),2.29-2.37(2H(2”),m),3.14(1H(8),d,J＝6.8Hz),3.26(1H(7),s),3.59(1H(4-OH),s),3.78(1H(20),dd,J＝12.5,5.2Hz),3.82-3.87(1H(20),m,J＝12.5,7.3Hz),3.89(1H(5-OH),d,J＝3.1Hz),4.05(1H(10),dq),4.21(1H(5),d,J＝2.6Hz),5.36(1H(12),d,J＝10.4Hz),5.86(1H 9-OH),br.s.),7.70(1H(1),dd,J＝2.6,1.6Hz)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:9.7(19),14.1(9”),14.1(9'),15.1(18),17.0(16),22.6(8”),22.6(8'),23.7(17),24.5(3”),25.2(3'),26.3(15),28.99(4”),29.07(6'),29.07(6”),29.15(4'),29.18(5”),29.2(4'),29.22(5'),31.78(7”),31.80(7'),34.3(2”),34.5(2'),35.9(14),36.0(8),45.4(11),48.9(10),61.7(6),64.5(20),65.2(7),65.6(13),71.5(5),72.4(4),76.5(12),77.2(9),133.5(2),164.6(1),173.5(1'),176.2(1”),209.9(3)。
化合物42
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.84(3H(18),d,J＝6.2Hz),0.87(3H(6'),t,J＝7.0Hz),0.88(3H(6”),t,J＝7.0Hz),1.20(3H(17),s),1.21(3H(16),s),1.25-1.31(2H(4'),m),1.25-1.31(2H(4”),m),1.26-1.32(2H(5”),m),1.26-1.32(2H(5'),m),1.27-1.29(1H(14),m,J＝6.8Hz),1.57-1.62(2H(3”),m),1.58-1.63(2H(3'),m),1.74(3H(19),dd,J＝2.9,1.3Hz),1.91(1H(11),dq,J＝10.1,6.5Hz),2.20(1H(20-OH),t,J＝6.8Hz),2.26-2.30(2'),m),2.29-2.34(2H(2”),m),3.14(1H(8),d,J＝6.8Hz),3.26(1H(7),s),3.59(1H(4-OH),d,J＝1.0Hz),3.78(1H(20),dd,J＝12.5,5.2Hz),3.82-3.87(1H,(20),m),3.88(1H(5-OH),d,J＝3.1Hz),4.05(1H(10),t,J＝2.6Hz),4.21(1H(5),d,J＝3.6Hz),5.36(1H(12),d,J＝9.9Hz),5.86(1H,(9-OH),br.s.),7.70(1H(1),dd,J＝2.3,1.3Hz),
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:9.7(19),13.8(6”),13.9(6'),15.1(18),17.0(16),22.26(5”),22.3(5'),23.7(17),24.1(3”),24.8(3'),26.3(15),31.1(4”),31.2(4'),34.2(2”),34.5(2'),35.9(14),36.0(8),45.4(11),48.9(10),61.7(6),64.5(20),65.2(7),65.6(13),71.5(5),72.4(4),76.5(12),77.2(9),133.5(2),164.6(1),173.5(1'),176.2(1”),210.0(3)。
化合物43
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.85(3H(18),d,J＝6.5Hz),0.89(3H(5'),t,J＝7.2Hz),0.90,(3H(5”),t,J＝7.3Hz),1.21(3H(16),s),1.21(3H(17),s),1.28(1H(14),d,J＝6.6Hz),1.29-1.37(2H(4”),m),1.29-1.38(2H(4'),m),1.55-1.59(2H(3”),m),1.56-1.62(2H(3'),m),1.75(3H(19),dd,J＝2.9,1.2Hz),1.91(1H(11),dq,J＝10.1,6.5Hz),2.19(1H(20-OH),t,J＝6.6Hz),2.24-2.32(2H(2'),m),2.30-2.38(2H(2”),m),3.15(1H(8),d,J＝6.6Hz),3.25(1H(7),s),3.59(1H(4-OH),s),3.78(1H(20),dd,J＝12.6,5.2Hz),3.85(1H(20),dd,J＝12.6,7.4Hz),3.88(1H(20-OH),d,J＝3.1Hz),4.05(1H(10),t,J＝2.6Hz),4.21(1H(5),d,J＝2.3Hz),5.36(1H(12),d,J＝10.0Hz),5.85(1H(9-OH),br.s.),7.70(1H(1),dd,J＝2.3,1.4Hz)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:9.7(19),13.65(5”),13.68(5'),15.1(18),17.0(16),22.1(4”),22.2(4'),23.7(17),26.4(15),26.5(3”),27.2(3'),34.0(2”),34.2(2'),35.9(14),36.0(8),45.5(11),48.9(10),61.7(6),64.6(20),65.2(7),65.6(13),71.5(5),72.4(4),76.6(12),77.2(9),133.5(2),164.6(1),173.5(1'),176.2(1”),209.9(3)。
化合物44
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.86(3H(18),d,J＝6.2Hz),1.24(3H(16),s),1.26(3H(17),s),1.33(1H(14),d,J＝6.8Hz),1.74(3H(19),dd,J＝2.9,1.3Hz),1.76-1.78(2H(4'),m),1.77-1.79(2H(4”),m),1.78-1.79(3H(5”),m),1.80-1.81(3H(5'),m),1.97(1H(11),dq,J＝9.9,6.4Hz),2.19(1H(20-OH),br.s.),3.18(1H(8),d,J＝6.8Hz),3.27(1H(7),s),3.60(1H(4-OH),s),3.74-3.81(1H(20),m),3.86(1H(20),br.s.),3.89(1H(5-OH),br.s.),4.04-4.11(1H(10),m),4.22(1H(5),s),5.45(1H(12),d,J＝9.9Hz),6.28(1H(9-OH),br.s.),6.75-6.83(1H(3'),m),6.85-6.94(1H(3”),m),7.72(1H(1),dd,J＝2.6,1.6Hz)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:9.7(19),11.8(5”),12.2(5'),14.4(4'),14.7(4”),15.2(18),17.3(16),23.7(17),26.8(15),36.1(8),36.2(14),45.9(11),49.0(10),61.6(6),64.5(20),65.3(7),65.6(13),71.7(5),72.4(4),77.0(12),77.2(9),128.2(2'),128.5(2”),133.4(2),137.6(3'),139.8(3”),164.9(1),167.5(1'),169.7(1”),210.0(3)。
化合物45
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.79(3H(18),d,J＝6.6Hz),0.93(3H(4”’),t,J＝7.5Hz),1.13(3H(5”’),d,J＝7.0Hz),1.24(3H(17),s),1.28(3H(16),s),1.28(1H(14),d,J＝6.7Hz),1.45(1H(3”’),dq,J＝14.1,7.3Hz),1.69-1.76(1H(3”’),m),1.71(3H(19),dd,J＝2.8,1.4),1.77(3H(4”),dq,J＝7.1,1.1Hz),1.79-1.81(3H(5”),m),1.90(1H(11),dq,J＝9.8,6.5Hz),2.01(3H(2””),s),2.18(3H(2'),s),2.38(1H(2”’),sxt,J＝7.0Hz),2.99(1H(4-OH),s),3.15(1H(7),s),3.26(1H(8),d,J＝6.8Hz),3.54(1H(20),d,J＝12.1Hz),4.14-4.17,(1H(10),m),4.69(1H(20),d,J＝12.1Hz),5.42(1H(12),d,J＝9.9Hz),5.52(1H(5),s),5.98(1H(9-OH),br.s.),6.80(1H(3”),qq,J＝7.1,1.3Hz),7.62(1H(1),dd,J＝2.3,1.2Hz)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:9.8(19),11.6(4”’),12.2(5”),14.4(4”),15.0(18),16.2(5”’),17.3(16),20.7(2””),20.8(2'),23.7(17),26.2(3”’),26.7(15),36.0(14),36.1(8),41.2(2”'),45.8(11),49.4(10),60.4(6),65.4(7),65.6(13),66.3(20),68.1(5),71.8(4),76.7(12),76.9(9),128.5(2”),133.8(2),137.6(3”),162.5(1),167.4(1”),168.8(1'),170.6(1””),178.9(1”’),206.3(2)。
化合物46
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.87(3H(18),d,J＝6.6Hz),1.23(3H(16),s),1.25(3H(17),s),1.34(1H(14),d,J＝6.8Hz),1.75(3H(19),dd,J＝2.6,1.0Hz),1.82-1.85(3H(6'),m),1.82-1.85(3H(6”),m),1.93-1.99(1H(11),m),3.17(1H(8),d,J＝6.8Hz),3.27(1H(7),br.s.),3.78(1H(20),d,J＝12.6Hz),3.85(1H(20),d,J＝12.2Hz),4.05-4.08(1H(10),m),4.22(1H(5),d,J＝1.6Hz),5.47(1H(12),d,J＝9.9Hz),5.73(1H(2'),d,J＝15.2Hz),5.75(1H(2”),d,J＝15.1Hz),6.08-6.19(1H(4'),m),6.08-6.19(1H(4”),m),6.14-6.19(1H(5'),m),6.15-6.18(1H(5”),m),7.16-7.23(1H(3'),m),7.26-7.33(1H(3”),m),7.71-7.73,(1H(1),m)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:9.7(19),15.2(18),17.2(16),18.7(6'),18.7(6”),23.6(17),26.7(15),36.1(8),36.2(14),45.9(11),49.0(10),61.6(6),64.6(20),65.3(7),65.6(13),71.7(5),72.4(4),77.0(12),77.1(9),117.7(2”),118.7(2'),129.7(4'),129.7(4”),133.4(2),139.7(5'),141.0(5”),145.5(3'),147.3(3”),164.8(1),166.8(1'),169.2(1”),210.0(3)。
化合物47
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.89(3H(18),d,J＝6.7Hz),0.90(3H(6'),t,J＝6.7Hz),1.28(3H(16),s),1.29-1.34(2H(4'),m),1.30-1.35(2H(5'),m),1.31(3H(17),s),1.40(1H(14),d,J＝6.6Hz),1.60-1.65(2H(3'),m),1.77(3H(19),dd,J＝2.7,1.2Hz),1.97(1H(11),dq,J＝9.9,6.5Hz),2.14(1H(20-OH),dd,J＝7.4,6.4Hz),2.30(2H,(2'),td,J＝7.4,7.3Hz),2.87(3H(MeNH),d,J＝4.8Hz),3.22(1H(8),d,J＝6.6Hz),3.29(1H(7),s),3.80(1H(20),dd,J＝12.5,5.7Hz),3.86(1H(20),dd,J＝12.9,7.8Hz),4.08-4.11(1H(10),m),4.24(1H(5),d,J＝2.5Hz),5.53(1H(12),d,J＝9.9Hz),6.30-6.37(1H(9-OH),m),6.52(1H(6”),ddd,J＝7.9,7.0,0.9Hz),6.64(1H(4”),d,J＝8.4Hz),7.36(1H(5”),ddd,J＝8.4,7.1,1.4Hz),7.56(1H(3”NH),q,J＝4.8Hz),7.75(1H,7”),dd,J＝8.2,1.6Hz),7.72-7.76(1H(1),m)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:9.8(19),14.0(6'),15.2(18),17.2(16),22.4(5'),23.9(17),24.9(3'),27.0(15),29.5(MeNH),31.2(4'),34.5(2'),36.1(8),36.2(14),45.7(11),49.0(10),61.8(6),64.6(20),65.4(7),65.5(13),71.6(5),72.4(4),76.8(12),77.4(9),108.6(2”),111.0(4”),114.5(6”),131.8(7”),133.6(2),135.6(5”),152.7(3”),164.4(1),170.2(1”),173.2(1'),209.9(3)。
化合物48
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.9(3H(18),d,J＝6.6Hz),1.27(3H(16),s),1.32(3H(17),s),1.4(1H(14),d,J＝6.6Hz),1.77(3H(19),dd,J＝2.7,1.0Hz),1.98(1H(11),dq,J＝9.9,6.5Hz),2.05(3H(2'),s),2.88(3H(MeNH),d,J＝5.1Hz),3.22(1H(8),d,J＝6.6Hz),3.29(1H(7),s),3.80(1H(20),dd,J＝12.2,5.2Hz),3.83-3.88(1H(20),m),4.09(1H(10),br.s.),4.24(1H(5),d,J＝2.9Hz),5.49(1H(12),d,J＝9.9Hz),6.53(1H(6”),t,J＝7.6Hz),6.64(1H(4”),d,J＝8.6Hz),7.36(1H(5”),ddd,J＝8.4,7.0,1.6Hz),7.55(1H(3”-NH),q,J＝4.6Hz),7.73(1H(1),s),7.78(1H(7”),dd,J＝8.0,1.6Hz)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:9.8(19),15.3(18),17.2(16),21.0(2'),23.9(17),27.1(15),29.5(MeNH),36.1(8),36.3(14),45.8(11),49.0(10),61.8(6),64.6(20),65.3(7),65.4(13),71.6(5),72.4(4),77.3(9),77.4(12),108.6(2”),111.0(4”),114.5(6”),131.9(7”),133.6(2),135.6(5”),152.7(3”),164.4(1),170.3(1”),170.4(1'),209.9(3)。
化合物49
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.84(3H(18),d,J＝6.8Hz),0.86(3H(7'),t,J＝6.7Hz),0.86(3H(7”),t,J＝6.7Hz),1.20(3H(16),s),1.20(3H(17),s),1.22-1.32(12H,(4',5',6',4”,5”,6”),m),1.28(1H(14),d,J＝6.7Hz),1.55-1.63(4H(3',3”),m),1.74(3H(19),dd,J＝2.6,1.0Hz),1.90(1H(11),m),2.28(2H(2”),m),2.32(2H(2'),m),3.14(1H(8),d,J＝6.7Hz),3.25(1H(7),s),3.65(1H(4-OH),s),3.81(2H(20),br.s.),3.97(1H(5-OH),br.s.),4.05(1H(10),t,J＝2.6Hz),4.21(1H(5),s),5.35(1H(12),d,J＝9.9Hz),5.85(1H(9-OH),br.s.),7.70(1H(1),dd,J＝2.6,1.6Hz),
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:9.7(19),14.0(7'),14.0(7”),15.0(18),17.0(16),22.4(6”),22.5(6'),23.7(17),24.4(3'),25.1(3”),26.3(15),28.7(4'),28.7(4”),31.4(5'),31.4(5”),34.3(2'),34.5(2”),35.9(8),35.9(14),45.4(11),48.9(10),61.8(6),64.6(20),65.2(7),65.6(13),71.3(5),72.4(4),76.5(9),77.2(9),133.5(2),164.5(1),173.5(1'),176.2(1”),209.8(2)。
化合物50
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.84(3H(18),d,J＝6.8Hz),0.85(3H(14'),t,J＝6.8Hz),1.20(3H(16),s),1.20(3H(17),s),1.21-1.28(20H(4',5',6',7',8',9',10',11',12',13'),m),1.30(1H(14),d,J＝6.8Hz),1.60(2H(3'),quin,J＝7.3Hz),1.74(3H(19),dd,J＝2.9,1.3Hz),1.91(1H(11),dq,J＝10.1,6.5Hz),2.07(3H,(2”),s),2.23-2.34(2H(2'),m),3.14(1H(8),d,J＝6.8Hz),3.24(1H(7),s),3.46(1H(5-OH),s),3.65(1H(4-OH),s),3.77-3.83(2H(20),m,J＝3.1Hz),3.97(1H(20-OH),d,J＝3.1Hz),4.04(1H(10),t,J＝2.6Hz),4.21(1H(5),d,J＝2.1Hz),5.36(1H(12),d,J＝10.4Hz),5.70(1H(9-OH),br.s.),7.69(1H(1),dd,J＝2.6,1.6Hz)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:9.7(19),14.1(14'),15.0(18),17.0(16),21.0(2”),22.7(13'),23.6(17),25.1(3'),26.2(15),29.0(4'),29.2(5'),29.3(6'),29.5(7'),29.6(8'),29.6(8'),29.6(9'),29.6(10'),29.6(11'),31.9(12'),34.5(2'),35.8(14),35.9(8),45.3(11),48.9(10),61.8(6),64.6(20),65.2(7),65.8(13),71.2(5),72.4(4),76.5(12),77.2(9),133.5(2),164.4(1),173.6(1'),173.6(1”),209.8(3)。
化合物51
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.84(3H(18),d,J＝6.8Hz),0.86(3H(14'),t,J＝7.0Hz),0.92(3H(4”),t,J＝7.5Hz),1.12(3H(5”),d,J＝6.8Hz),1.21(3H(16),s),1.22(3H(17),s),1.21-1.31(20H(4',5',6',7',8',9',10',11',12',13'),m),1.25(1H(14),d,J＝6.2Hz),1.44(1H(3”),ddq,J＝14.0,7.1,7.1Hz),1.60(2H(3'),m),1.71(1H(3”),ddq,J＝14.0,7.5,7.5Hz),1.75(3H(19),dd,J＝2.9,1.3Hz),1.90(3H(11),dq,J＝10.1,6.5Hz),2.18(1H(20-OH),m,J＝6.8,4.7Hz),2.28(2H(2'),m,J＝11.4,7.4Hz),2.36(2H(2”),sxt,J＝7.3Hz),3.15(1H(8),d,J＝6.8Hz),3.26(1H(7),s),3.57(1H(4-OH),d,J＝1.0Hz),3.78(1H(20),dd,J＝12.5,4.2Hz),3.86(1H(20),dd,J＝12.5,6.8Hz),3.87(1H(5-OH),d,J＝3.1Hz),4.05(1H(10),m,J＝2.6Hz),4.21(1H(5),d,J＝2.6Hz),5.37(1H(12),d,J＝9.9Hz),5.98(1H(9-OH),br.s.),7.71(1H(1),dd,J＝2.6,1.6Hz)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:9.7(19),11.6(4”),14.1(14'),15.1(18),16.1(5”),17.2(16),22.7(13'),23.7(17),25.2(2'),26.2(3”),26.6(15),29.0(5'),29.3(4'),29.3(4'),29.5(6'),29.6(8'),29.6(9'),29.6(10'),29.7(11'),31.9(12'),34.6(2'),36.0(8),36.1(14),41.2(2”),45.6(11),48.9(10),61.7(6),64.5(20),65.2(7),65.5(13),71.6(5),72.4(4),76.5(12),77.2(9),133.5(2),164.7(1),173.3(1'),178.8(1”),209.9(3)。
化合物52
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.85(3H(18),d,J＝6.8Hz),0.90(3H(4'),t,J＝7.5Hz),1.11(3H(5'),d,J＝7.3Hz),1.19(3H(16),s),1.21(3H(17),s),1.31(1H(14),d,J＝6.8Hz),1.44-1.56(1H(3'),m),1.58-1.67(1H(3'),m),1.74(3H(19),dd,J＝2.9,1.3Hz),1.88-1.96(1H(11),m),2.08(3H(2”),s),2.33-2.43(2H(2'),m),3.15(1H(8),d,J＝6.2Hz),3.25(1H(7),s),3.59(1H(4-OH),br.s.),3.78(1H(20),d,J＝13.0Hz),3.85(1H(20),d,J＝12.5Hz),4.05(1H(10),t,J＝2.9Hz),4.21(1H(5),s),5.38(1H(12),d,J＝10.4Hz),5.74(1H(9-OH),br.s.),7.71(1H(1),dd,J＝2.3,1.3Hz)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:9.7(19),11.3(4'),15.0(18),16.5(5'),17.0(16),21.0(2”),23.6(17),26.1(15),26.9(3'),35.7(14),35.9(8),41.2(2'),45.3(11),48.9(10),61.7(6),64.5(20),65.2(7),65.8(13),71.5(5),72.4(4),76.2(12),76.9(9),133.5(2),164.6(1),173.6(1”),176.4(1'),209.9(3)。
化合物53
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm:0.88(3H(6'),m,J＝7.3Hz),1.06(3H(18),d,J＝6.2Hz),1.18(3H(16),s),1.25(3H(17),s),1.25(1H(14),d,J＝7.3Hz),1.27-1.33(4H(4',5'),m),1.59-1.65(2H(3'),m),1.74-1.80(1H(11),m),1.76(3H(19),dd,J＝2.9,1.3Hz),2.23(1H(20-OH),t,J＝6.2),2.35(2H(2'),td,J＝7.5,1.6Hz),3.06(1H(8),d,J＝7.3Hz),3.26(1H(7),s),3.57(1H(4-OH),s),3.77(1H(10),t,J＝2.6Hz),3.81(2H(20),dd,J＝7.3,4.7Hz),3.94(1H(12),dd,J＝9.1,1.3Hz),4.2(1H(5),s),7.69,(1H(1),dd,J＝2.3,1.3Hz)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δppm:9.8(19),13.9(6'),16.3(18),17.2(16),22.3(5'),23.3(17),24.5(3'),28.0(15),31.3(4'),34.0(2'),34.8(14),36.5(8),47.2(11),50.8(10),62.5(6),65.0(20),66.0(7),68.6(13),71.4(5),72.1(4),77.7(9),78.2(12),134.0(2),163.7(1),177.3(1'),209.6(3)。
化合物60
HPLC：Kinetex C18柱4.6mm，0.8mL/min，甲醇-水(70:30)。保留时间：10.9分钟。
对参与伤口愈合的细胞类型的体外作用的实施例
实施例4:体外划痕闭合和成纤维细胞迁移
使用下述3种方法中的一种或多种，确定在RPMI 1640-10％胎牛血清中培养的早期传代新生儿包皮成纤维细胞(NFF)在用纯化的化合物或植物提取物处理以后跨产生于汇合单层中的划痕伤口迁移的能力。
方法1
将细胞接种进16-mm直径孔(24-孔板)中，允许其变得汇合，并使用无菌塑料移液器尖头在每个孔中产生2个划痕。将培养基除去，将孔用磷酸盐缓冲盐水pH 7.2(PBS)洗涤以除去移动的细胞，加入新鲜培养基，随后加入纯化合物或植物提取物的系列10倍稀释物(2μL)。继续温育16-30小时。当未处理的培养物的划痕边缘已经接近最初间隙的大约25％时，终止实验。将单层用PBS洗涤，用乙醇固定，并用0.05％结晶紫染色。将每个孔的显微照片(EVOS显微镜)打印，并在3个位置测量每个划痕以确定平均宽度。如果剩余的间隙<未经处理的对照组的间隙的40％，认为加速伤口闭合是显著的。
方法2
以2-6个重复孔/稀释度(dilution)，将细胞接种进6mm孔(96-孔板)或16mm(24-孔板)中，并如在方法1中处理。处理以后，立即用细尖签字笔在孔的底面上划出划痕边缘。固定和染色以后，在显微镜下借助于标线评估迁移，将迁移评分为最初宽度的0、25、50、75或100％(完全闭合)。如果副本的平均四分位数小于未经处理的对照组的平均四分位数(p<0.05,t-检验)，认为加速伤口闭合是显著的。另外，如下建立“伤口”区域：在有3mm不锈钢针存在下接种细胞(96-孔板)，或插入扁平边缘的特氟隆环。在过夜温育NFF细胞以后，除去这些装置。
方法3
除了用具有96个1mm厚特氟隆包被的针的工具(Essen Bioscience Woundmaker)在一个动作中产生划痕以外，如在方法2(5个重复孔/稀释度)中那样在96-孔板中接种和处理细胞。然后将该板放在IncuCyte FLR仪器内的37℃、5％CO2控湿气氛中，所述仪器被程序化成以3小时间隔在相位差下拍摄每个孔的照片持续42小时。该软件确定最初划痕边界和它们的闭合比率。如果最初闭合比率>未经处理的对照组的10％，认为加速伤口闭合是显著的。
结果显示在表7-9中。
表7：在用纯化合物处理后人新生儿成纤维细胞中的划痕闭合比率
灰色阴影和加粗指示划痕闭合比率显著高于对照处理
证实了所有纯化合物与仅媒介物对照处理相比具有显著增加的划痕闭合比率。
表8：在用Fontainea picrosperma的不同植物部分的未分级分离的乙醇提取物处理以后人新生儿成纤维细胞的划痕闭合比率
灰色阴影和加粗指示划痕闭合比率显著高于对照处理
试验的Fontainea picrosperma的所有植物部分的乙醇粗提取物具有与仅媒介物对照处理相比显著增加的划痕闭合比率。
表9：在用3个不同植物种的不同植物部分的未分级分离的乙醇提取物处理以后人新生儿成纤维细胞中的划痕闭合比率
灰色阴影和加粗指示划痕闭合比率显著高于对照处理
得自Fontainea的两个另外种F.australis和F.rostrata以及密切相关种Hylandia dockrillii的植物部分的提取物表现出与仅媒介物对照处理相比显著增加的划痕闭合比率。
另外，试验板在显微镜下的观察结果(方法1)提示，在用化合物1处理以后，成纤维细胞显示染色图案的显著差异。更近的研究揭示，这是由于细胞明显以多层方式生长，可能指示接触抑制的丧失、增殖的增加或重塑能力。在图1和2中分别图解了在划痕后24小时对照和化合物1处理中的划痕闭合的实施例。
实施例5：人新生儿成纤维细胞的迁移能力的Matrigel侵入测定
Matrigel侵入腔室给细胞提供允许在体外评估它们的侵入性质的条件。Matrigel侵入腔室由细胞培养配对板与细胞培养插入物组成，所述细胞培养插入物含有8微米孔径PET膜，所述膜具有Matrigel基膜基体的薄层。Matrigel基体充当体外重构基膜。所述层封闭所述膜的孔，从而阻断非侵入性细胞穿过所述膜迁移。相反，侵入性细胞能够使它们自身脱离Matrigel基体和8微米膜孔并侵入其中。可以将所述膜加工用于光学和电子显微术，且可以在染色以后容易地除去。
如下面在两个研究中所述，根据生产商的说明书使用腔室，以评估化合物1、2、5和42对人新生儿成纤维细胞的迁移的影响。第一个研究评估化合物1的3种浓度(0、10和30ng/mL)对孔中的新生儿成纤维细胞的影响，所述孔含有含10％胎牛血清的培养基。第二个研究使用化合物1、2、5和42中的每一种的2种浓度(0和30ng/mL)以检查对新生儿成纤维细胞的迁移的影响，所述新生儿成纤维细胞在处理之前饥饿2天并然后转移至含有1％胎牛血清的培养基。
再水合
将含有所述腔室的包从-20℃贮存器取出并使其达到室温。将温暖的(37℃)基于碳酸氢盐的培养基加入插入物(500μL)的内部和孔(750μL)的底部。使含有Matrigel的腔室在恒湿组织培养箱中、在37℃、5％CO2气氛下再水合2小时。再水合以后，在不扰动膜上的MatrigelTM基体层的情况下，通过抽吸小心地除去培养基。
侵入研究
将细胞收获，并以20,000细胞/mL再悬浮。将共250μL细胞悬浮液放入插入物的内部(5,000细胞)。然后将另外250μL含有各种化合物的培养基加入插入物的内部以达到两个研究各自的期望终浓度。将每种处理中共750μL含有适当浓度的每种化合物的培养基放在适当插入物下面的孔中。然后将Matrigel腔室在恒湿组织培养箱中在37℃、5％CO2气氛下温育24小时。
细胞侵入的测量
通过“擦洗”，从膜的上表面除去非侵入细胞。在除去培养基以后，将具有棉花尖部的拭子浸入插入物中，并当所述尖部在膜表面上面移动时施加坚实的压力。用被PBS润湿的第二个拭子重复该擦洗。然后将已经侵入至插入物的外表面的细胞如下固定：在500μL100％甲醇中放置至少5分钟。然后将插入物转移至含有500μL在甲醇中的0.1％结晶紫的配对板，并染色至少15分钟。如下将插入物脱色：穿过3个含有500μL水的配对板，然后风干。
次日，如下从插入物壳体取出膜：将插入物反转，并在靠近壳体壁的边缘处将锐利的解剖刀片的尖部插入膜。将插入物壳体靠着静止刀片上旋转，并释放膜。将所述膜用镊子挑出壳体，并面朝下放在10μL Kaiser氏甘油溶液上，并用盖玻片覆盖。将载玻片干燥过夜，然后计数侵入细胞。
结果
在第一个研究中，用10或30ng/mL的化合物1处理的成纤维细胞在Matrigel侵入腔室系统中显示出与仅媒介物处理的细胞相比增加的迁移能力(图3)。第二个研究证实了使用化合物1的第一个研究的结果，并证实了对于化合物2、5和42而言迁移能力增强的类似水平(表10)。
表10：用30ng/mL的每种化合物处理的人新生儿成纤维细胞的Matrigel侵入测定。将数据表达为与仅媒介物对照相比膜侵入的增加％，加或减得自两个重复实验的标准差。在24小时温育以后，计数细胞。
化合物 细胞计数，作为对照的百分比(对照＝没有加入化合物)
1 356±141
2 366±122
5 218±21
42 350±101
实施例6：在体外使用永生化的人角质形成细胞(HaCaT)的划痕再生和闭合
通过下述方法确定在用化合物1或化合物37处理以后永生化的人角质形成细胞(HaCaT)跨产生于汇合单层中的划痕伤口迁移的能力。
以7.4×104个细胞/mL的细胞密度将胰蛋白酶处理过的HaCaT细胞接种在24-孔BDFalcon平底组织培养板(VWR International,UK)内的1mL Dulbecco氏改良的伊格尔培养基(DMEM)中，以达到在每个孔中接种7.4×104个细胞的细胞密度，所述培养基补充了L-谷氨酰胺(2mM)、抗生素(100U/mL的青霉素G钠、100μg/mL的硫酸链霉素和0.25μg/mL的两性霉素B)；和10％胎牛血清(都得自Invitrogen Ltd.,UK)。然后将细胞在37℃在5％CO2/95％空气气氛中维持过夜。次日早晨，用无血清DMEM替换含有10％胎牛血清的DMEM，并随后将HaCaT细胞在DMEM中血清饥饿48小时。
48小时以后，除去无血清DMEM，并用无菌移液器跨每个细胞层产生单个划痕‘伤口’。在1mL PBS中洗涤2次以后，将含有化合物1-或化合物37的培养基(1mL)加入每个孔中。该培养基由DMEM组成，所述DMEM除了0、0.001、0.01、0.1、1.0、10或100μg/mL的终浓度的化合物1或化合物37以外还补充了L-谷氨酰胺(2mM)、抗生素(如上)和1％胎牛血清。每种化合物的浓度存在3个重复孔。
将HaCaT培养物维持在37℃在5％CO2/95％空气气氛中，并通过时滞共焦显微术(Leica TCS SP5Confocal Microscope,Leica Microsystems UK Ltd.,UK)在100倍放大率监测裸露的‘伤口’区域的再生，在48h时段中每20min在固定位置捕获数字图像。将数字图像序列输出并使用LAS AF Software(Leica Microsystems)制成.avi影片文件。使用ImageJ Software(ImageJ 1.37v；http://rsb.info.nih.gov/ij/)定量体外HaCaT伤口闭合的比率。通过单因素方差分析和事后检验Tukey分析，分析数据。在3个单独场合进行每个实验。
在应用后48小时，与在0.001、0.01和0.1ng/ml的浓度的对照处理相比，化合物1显著地增加划痕闭合的比率(p<0.01)(表11)。在48小时，与在0.001、0.01、0.1和1.0μg/ml的浓度的对照处理相比，化合物37也增加划痕闭合的比率(p<0.01)(表11)。
表11：在用一定浓度范围的化合物1和化合物37处理以后48小时永生化的人角质形成细胞(HaCaT)细胞的划痕再生和闭合的程度。数据是处理以后保持开放的划痕伤口区域的百分比(±标准误差)。
为了确定化合物1和化合物37在增强划痕再生和闭合中的作用(如在表11中所示)是否由细胞增殖或迁移介导，进行了两个另外的实验。这些实验中的第一个研究了(addressed)迁移方面并重复了划痕再生研究，但是在施加化合物的同时将1μg/mL的丝裂霉素C加入培养基中。已知丝裂霉素C会抑制细胞增殖，包括HaCaT细胞的增殖；且经确定在1μg/mL浓度在培养系统中没有细胞毒性。该迁移研究的结果发现了在化合物1和化合物37的0.001至1.0μg/mL之间的浓度增强的(p<0.05)划痕再生和闭合。
增殖实验评估了在4个时间段(24、48、120和168小时)两种化合物对培养系统中的HaCaT增殖的影响(通过MTT测量)。与没有加入化合物的对照处理相比，两种化合物1和37在0.001至10μg/mL之间的浓度范围内在增加HaCaT细胞的增殖中具有显著影响(p<0.01)。
这些结果证实，对于化合物1和37，增殖和增强的细胞迁移都涉入划痕再生和闭合过程。
实施例7：化合物使单核细胞分化成巨噬细胞
巨噬细胞在伤口愈合中起许多作用，包括在早期炎症性阶段中清洁细胞碎片和坏死组织，随后在愈合的晚期阶段中支持细胞增殖和组织恢复。认为M1表型与早期炎症性阶段有关且M2表型与愈合阶段有关。
为了确定化合物1和阵列中的15种其它环氧-惕各烷化合物对单核细胞分化的潜在影响，通过肝素化的得自72-岁男人供体的血液的Ficoll-Paque沉降来分离人外周血单核细胞(PBMC)，并以100,000个细胞/孔铺板在RPMI-164010％FCS中。将重复孔用化合物的10倍稀释物处理，并在37℃温育4天。将所述孔针对细胞附着和形态学进行视觉评分，然后用PBS洗涤2次，用sulfurhodamine染色，并在ELISA读数器中定量掺入的染色剂。然后将板用水洗涤，并用1％的结晶紫在甲醇中的溶液染色用于粘附细胞形态学的摄影和评分。
得自使用人PBMC的剂量-响应实验的结果(表12)表明，试验的所有16种环氧-惕各烷化合物在ng浓度将外周血单核细胞分化成巨噬细胞(如通过附着和形态学所判断的)，其为M2表型的典型树突细胞和M1表型的典型圆形细胞的混合物。
表12：阵列中的环氧-惕各烷化合物用于诱导人外周血单核细胞的巨噬细胞表型的稀释物系列的端点浓度。
化合物 分化端点(ng/mL)
1 1
2 1
3 10
5 1
8 10
21 10
22 100
23 1
24 1
41 0.1
42 1
49 1
50 1
51 1
52 10
53 100
实施例8：化合物1和37对成年真皮成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化的影响
成纤维细胞在伤口愈合过程中起重要作用，且当被活化时，它们分化成肌成纤维细胞表型，其特征在于α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达。尽管肌成纤维细胞促进组织修复和伤口闭合，它们的过表达与损伤愈合和过度瘢痕形成有关。
通过TGF-β1-刺激的真皮成纤维细胞的α-SMA表达的程度，检查了化合物1和37对真皮成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化的影响。
方法
在胰蛋白酶消化后，以2.5×104个细胞/孔的细胞密度将成纤维细胞接种在8-孔Permanoxchamber载玻片(VWR International)内的DMEM培养基中，并在37℃在5％CO2/95％空气中维持48h，所述DMEM培养基含有抗生素、2mM L-谷氨酰胺和10％胎牛血清(250μL，都购自Invitrogen)。
在48小时，将成纤维细胞在无血清DMEM中阻止生长48小时，然后用含有0、0.001、0.01、0.1、1.0和10.0μg/mL的浓度的化合物1或37(3个孔/浓度/化合物)和TGF-β1(10ng/ml,Peprotech)的无血清DMEM(250μL)替换。将成纤维细胞在37℃在5％CO2/95％空气中维持72小时。
在72小时，将腔室载玻片孔用PBS(x1,250μL)洗涤并在4％低聚甲醛(100μL/孔)中固定10min。然后将腔室载玻片孔再次用PBS(×1,250μl)洗涤，用0.1％的Triton X-100在PBS中的溶液(100μL,Sigma)处理5min，并用PBS(×1,250μL)再次洗涤。将孔用1％的BSA在PBS中的溶液(250μL,Sigma)封闭1h并在0.1％BSA/PBS中洗涤(×3)。
将孔与单克隆小鼠抗-人α-SMA,克隆1A4(1:100,150ul,Sigma)一起在4℃温育过夜，在0.1％BSA/PBS中洗涤(×6)，并与Alexa Fluor 488山羊抗-小鼠IgG抗体(1:1000,250μL,Invitrogen)一起在黑暗中在室温温育1h。将腔室载玻片在0.1％BSA/PBS中洗涤(×6)，并用Hoescht 33258溶液在黑暗中复染色30min(1:2000,250μL,Sigma)。随后取出腔室的载玻片，并在黑暗中用Fluorsave(Santa Cruz)处理10min。通过荧光显微术(LeicaMicrosystem)观察载玻片，在200倍放大率捕获数字图像。使用HC Image J Software处理数字图像。
结果
在使用TGF-β1、但是没有加入化合物的对照处理中，成年真皮成纤维细胞分化成肌成纤维细胞，通常特征在于增加的α-SMA表达、α-SMA张力纤维组装和膨大的多角形细胞形态的总体形成。相反，用TGF-β1处理的成年真皮成纤维细胞向化合物1和化合物37的暴露会以浓度依赖性的方式影响向肌成纤维细胞的分化。在0.1μg/mL浓度的化合物1的情况下，成纤维细胞培养物缺乏代表肌成纤维细胞分化的α-SMA张力纤维形成和典型多角形细胞形态(图5)。对于化合物37，在10μg/mL浓度存在对α-SMA张力纤维形成和多角形形态发展的破坏作用(图6)。
此外，在1-10μg/mL之间(对于化合物1)和0.1-1.0μg/mL之间(对于化合物37)的浓度范围，看起来存在肌成纤维细胞形态学的其它微小改变(图5和6)。
所述化合物对成纤维细胞/肌成纤维细胞分化的特异性作用可能与在用化合物1体内处理过的伤口中观察到的微小瘢痕形成(实施例16和17)有关。
实施例9：嗜中性粒细胞响应于化合物1对活性氧爆发的诱导
嗜中性粒细胞是先天性免疫系统的专有吞噬细胞，且它们的流入和活化是在伤口愈合的早期阶段中清除细菌、真菌和细胞碎片所必需的。嗜中性粒细胞的广泛抗微生物活性是基于几种策略，包括活性氧类别(ROS)的爆发。
进行了一项研究以评估化合物1在诱导通过嗜中性粒细胞实现的活性氧爆发中的潜在作用。
通过裂解已经由Ficoll-Paque沉降得到的红血细胞沉淀物，从健康人供体的新鲜血液分离出嗜中性粒细胞。将嗜中性粒细胞(～4×106个细胞/ml)与10μg/ml的二氢乙锭(DHE)(Sigma-Aldrich)一起在完全培养基中在37℃温育15min，同时未染色的待试细胞的等分试样作为未染色的对照。该温育之后用一定浓度范围(0、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml)的化合物1处理15min。使用FACS Canto流式细胞计确定温育以后活性氧类别的产生，以测量由于DHE氧化为乙锭(ethidium)离子引起的荧光。
该研究发现，在没有化合物1存在下，在对照处理中没有产生ROS。相反，化合物1以剂量依赖性的方式诱导活性氧类别(ROS)的显著产生，其中ROS产生随着化合物1的浓度而增加。
化合物对与改善的伤口愈合结果有关的蛋白、基因和细胞因子的影响的实施例
实施例10：用化合物1和42处理的人新生儿成纤维细胞的分子分析
使用蛋白质印迹方法来鉴别化合物1和42对与人新生儿成纤维细胞(NFF)中的伤口修复和愈合有关的蛋白的影响。进行了两个研究。在第一个研究中，将NFF用10或30ng化合物1/mL处理6或24小时，然后进行收获和蛋白提取。在第二个研究中，将NFF分别用30ng/mL浓度的化合物1和42个别地处理6小时。对从两个研究得到的裂解物进行蛋白质印迹分析，并用针对参与伤口修复和愈合的关键信号传递分子的特异性抗体探测。
用于蛋白质印迹法的蛋白样品的制备。
从在75cm2板中生长的附着人新生儿成纤维细胞除去培养基，并将细胞在冰冷的PBS中洗涤2次。将附着的细胞使用细胞刮器(Corning)收获在10mL冰冷的PBS中，通过离心(1,500rpm,室温)沉淀5min，再悬浮于1mL冰冷的PBS中，并转移至1.5mL微量离心管。通过离心(13,200rpm,室温,2s)收集细胞，将PBS除去，并将沉淀物在需要之前在-20℃保存。
将冷冻的沉淀物在冰上融化，并通过上下抽吸再悬浮于体积为所述沉淀物体积的3-4倍的细胞裂解缓冲液中。将细胞悬浮液在4℃声处理60s并离心20min(13,200rpm,4℃)，并将含有蛋白的相间物转移至新鲜1.5ml微量离心管。在-20℃保存蛋白。
蛋白浓度的确定
使用BCA Protein Assay试剂盒(Pierce)确定蛋白浓度。该方法是基于碱性溶液中蛋白将Cu2+还原为Cu1+。形成的Cu1+随后与二喹啉甲酸(bicinchronic acid)(BCA)螯合，从而形成紫色反应产物。
将蛋白样品在MilliQ水中1/10和1/20(v/v)稀释，并将10μL一式两份地铺板在平底96-孔板(Corning)中。以100、200、400、600、1,000和1,200μg/mL制备牛血清白蛋白(BSA)的储备溶液，并将10μL/孔一式两份地铺板和对样品进行测定。通过将50份试剂A与1份试剂B混合并将100μL等分至每个孔，制备BCA工作试剂。将板在37℃温育30-45min以允许反应发生。在微量培养板读数器(VERSAmax,Molecular Devices)上在A590nm读出粗吸光度，并使用SOFTmax PRO软件(Molecular Devices)产生标准曲线。从该曲线估计未知样品的浓度。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE).
通过与适当体积的2×SDS加载缓冲液混合来制备蛋白样品，并通过在70℃加热10min进行变性。如Laemmli(6)所述，使用Mini-Protean II双平板凝胶仪器(Bio-RadLaboratories)执行SDS-PAGE凝胶。分离凝胶由0.275M Tris-HCl(pH 8.8)、0.1％(w/v)SDS、0.05％(w/v)新鲜制备的过硫酸铵、1％(v/v)TEMED和7.5-12％(w/v)丙烯酰胺/双丙烯酰胺(29:1)组成。将溶液用MilliQ H2O补足至5mL，并将其在用水-饱和丁醇覆盖的同时固化至少30min(室温)。在倾倒成层胶之前，倒出(tip off)水-饱和丁醇。成层胶由0.125MTris-HCl(pH 6.8)、0.1％(w/v)SDS、0.05％(w/v)新鲜制备的过硫酸铵、0.1％(v/v)TEMED和4％(w/v)丙烯酰胺/双丙烯酰胺(29:1)组成。将溶液用MilliQ H2O补足至每个凝胶2.5mL，倒在分离胶的上面，并与10-孔梳(Bio-Rad Laboratories)一起固化至少30min。在1×SDS运行缓冲液中执行电泳大约1h或直到染料已经跑出凝胶的底部(200V,室温)。
蛋白质印迹转移
SDS-PAGE电泳以后，小心地分离凝胶板，将成层胶切出并转移至Mini Trans-BlotCell(Bio-Rad Laboratories)。如下组装“转移夹心”：1块多孔海绵，2张印迹(Whatmann)纸，硝酸纤维素膜，所述凝胶，另外2块印迹纸和另一块多孔海绵，并插入转移仪器中。将所述海绵、膜和印迹纸在冷电印迹缓冲液中预润湿，并小心地防止任何气泡形成，因为这会导致不一致的蛋白转移。将蛋白在冰冷的转移缓冲液中在4℃在100V转移1h(恒定电压)，硝酸纤维素膜(HybondTM-C,Amersham Biosciences)更靠近阴离子侧，且加入冰袋和磁力搅拌器。
探测蛋白膜
转移后，在温和轨道摇动下将膜在5％(w/v)的Blotto在0.1％(v/v)吐温20/TBS中的溶液中在室温温育至少30min，以封闭非特异性的结合位点。如生产商推荐的(参见下面表13)，将第一抗体在5％(w/v)BSA中稀释至2mL的终体积。制备含有膜和抗体的塑料外壳，并热封，除去尽可能多的气泡。将外壳在定制的转子上在4℃旋转过夜(大约16h)。
将膜从袋取出，放在含有0.1％(v/v)吐温20/TBS的塑料托盘中，并在剧烈轨道摇动下在室温洗涤4次，每次洗涤15min。如下将与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的适当第二抗体探测至膜：将它在5％(w/v)的Blotto在0.1％(v/v)吐温20/TBS中的溶液中1/1,000稀释，并将它放入新鲜塑料外壳中，将其在室温旋转2小时。
蛋白的免疫检测
为了除去任何未结合的或非特异性地结合的抗体，将膜在0.1％(v/v)吐温20/TBS中/在室温洗涤4次，每次15min。使用Western LightingTMChemiluminescence ReagentPlus(PerkinElmer Life Sciences)从HRP标记的第二抗体产生可检测信号。所述试剂依赖于HRP催化的鲁米诺的氧化降解，从而导致光的发射，所述光在420nm可检测到且可以捕获在胶片上。在即将检测之前，混合来自瓶子1和瓶子2的等体积。应用每个膜2mL的总体积，并在室温温育1min。小心地确保整个膜同样暴露。将膜取出，在一些印迹纸上快速地干燥，在两块聚丙烯片保护器之间插入胶片盒(HypercassetteTM,Amersham Biosciences)并暴露于胶片条(SuperRX,Fujifilm)。使用2min的最初暴露来判断最佳检测时间。将胶片在KodakImage Station(Kodak)中显影。
表13：在该研究中使用的抗体是:
在使用化合物1的第一个研究中，蛋白质印迹分析出用10或30ng/mL的化合物1处理6小时以后MEK1/2和ERK1/2的短暂活化和24小时处理以后活化的随后下调。已知MAP激酶途径的MEK/ERK分支的活化会影响许多细胞类型(包括成纤维细胞)的迁移表型。没有检测到MMP9水平的差异。
在NFF上使用30ng/mL浓度的化合物1和42，在第二个研究中在蛋白质印迹上发现了磷酸-ERK的磷酸化的类似模式。
实施例11:化合物1对参与伤口愈合的基因的表达的影响
在两种情况下检查了化合物1对与伤口愈合有关的基因的表达的影响：(a)人PBMC和(b)人肿瘤异种移植物的小鼠间质。
材料和方法
通过肝素化的得自68-岁男人供体的血液的Ficoll-Paque沉降来分离人外周血单核细胞(PBMC)，并在RPMI-164010％FCS中培养。用30ng/mL的化合物1处理以后，将单层用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤1次，并将细胞用无菌刮器收获和在-80℃保存为沉淀物。
从小鼠得到人肿瘤异种移植物的小鼠间质，其中将Sk-Mel-28人黑素瘤细胞系皮下地注射进每只BALB/c Foxn1nu小鼠的胁腹的2个部位(2×106个细胞/部位)，并允许生长至大约7mm直径。然后给每个肿瘤注射50μL含有30μg化合物1的20％丙二醇或50μL 20％丙二醇。在注射后的不同时间，将小鼠安乐死，并收获肿瘤，除去覆盖皮肤，并将完整肿瘤在-80℃保存。
根据生产商的说明书使用QiagenRNeasyPlus Mini Kit从30mg冷冻肿瘤或1x 107细胞提取RNA，然后用NanoDrop仪器定量，并在带有1kb DNA标志物的变性琼脂糖凝胶上证实完整性和用溴化乙锭染色。
RNA扩增和标记.
用无核酸酶的水将大约500ng总未标记的RNA调至11μL的终体积。将RNA与9μL逆转录酶主混合物(1μL T7寡(dT)引物、2μL 10X第一链缓冲液、4μL dNTP混合物、1μL RNA酶抑制剂和1μLArrayScript)一起在42℃温育2小时。这之后是第二链cDNA合成步骤，其包括与80μL第二链主混合物(63μL无核酸酶的水、10μL 10X第二链缓冲液、4μL dNTP混合物、2μLDNA聚合酶和1μL RNA酶H)一起在16℃进一步温育2小时。如下纯化cDNA：穿过cDNA过滤筒(Filter Cartridge)与250μL cDNA结合缓冲液一起过滤，并用500μL提供在试剂盒中的洗涤缓冲液洗涤。将纯化的cDNA用20μL 55℃无核酸酶的水洗脱。将每个cDNA样品与7.5μLIVT主混合物(2.5μL T710X反应缓冲液、2.5μL T7酶混合物和2.5μL生物素-NTP混合物)一起在37℃温育16小时。通过向每个cRNA样品中加入75μL无核酸酶的水，停止反应。通过将cRNA样品与混合在一起的350μL cRNA结合缓冲液和250μL 100％乙醇一起穿过cRNA过滤筒过滤，纯化生物素化的、扩增的RNA，然后加载到过滤器上。然后将具有附着的RNA的cRNA过滤筒用650μL洗涤缓冲液洗涤，然后用200μL 55℃无核酸酶的水洗脱纯化的cRNA。
Illumina Expression BeadChip杂交。将cRNA样品在65℃加热5min，并通过脉冲离心进行收集。在65℃加热5min以后，将大约750ng cRNA样品等分进单独的试管中，向其中加入约5μL无RNA酶的水和10μL杂交混合物(Hyb Mix)。将大约15μL制备的cRNA混合物加载到Illumina Expression BeadChips上。根据Illumina供应的全基因组基因表达直接杂交测定指南(Whole-Genome Gene Expression Direct Hybridization Assay Guide)，进行随后的杂交和洗涤步骤。
人HT-12v4Expression BeadChips覆盖人转录组中的超过47,000种转录物和已知剪接变体。MouseRef-8v2.0Expression BeadChips覆盖大约25,600种充分注解的RefSeq(参照序列)转录物，其包含超过19,000个独特基因。
数据分析。通过iScan System读出BeadChips，并经由GenomeStudio转移进GeneSpring GX v12.5(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)。使用具有默认设置的分位数标准化，将表达值标准化。基于通过GenomeStudio计算的检测评分来过滤实体，其中认为p≤0.05是显著的。
化合物1在人PBMC中诱导伤口愈合有关的基因表达变化。
人外周血单核细胞(PBMC)富含淋巴细胞和巨噬细胞前体(单核细胞)，它们涉入与伤口愈合过程有关的细胞因子和组织重塑酶的产生。表14列出了30ng/mL的化合物1诱导的基因表达变化，其比对照(未处理的PBMC)高>2倍或低>2倍，且与伤口愈合具有已知的联系。伤口愈合是一个复杂的多阶段序列，其中随后需要下调过程诸如炎症。因此，应当指出，在表14中显示的基因举例说明了在体外混合淋巴样群体中化合物1调节的有关分子的范围，没有指定体内组织特异性表达的次序。
所述基因包括：参与保护免于感染的促炎细胞因子(IL-1α、IL-1β和IL-6)，减轻炎症应答(IL-10和IL-24)的细胞因子，生长因子(GMCSF、CSF1和HBEGF)，以及用于组织重塑的许多趋化因子和基质金属肽酶(后者通过TIMP2的下调来促进)。THBS1(其抑制肉芽组织形成)的下调也是伤口愈合中的积极因素。KLF10的上调会促进血管生成，且指示TGF-β的诱导。转谷氨酰胺酶(TGM)通过将蛋白交联而稳定它们，且在伤口愈合中具有其它有益效果。
表14.在人PBMC中被化合物1诱导的、与改善的伤口愈合结果有关的基因的表达的变化
化合物1在人肿瘤异种移植物的小鼠间质中诱导的伤口愈合有关的基因表达变化
小鼠和伴侣动物中肿瘤部位的优良愈合(如通过毛发和毛发颜色的恢复以及微小瘢痕形成所证实的)是通过肿瘤内注射进行的化合物1治疗的显著特征(实施例16和17)。因此，在注射后的早期，当肿瘤仍然完整时，在人肿瘤异种移植物的小鼠-衍生的间质中测定与伤口愈合有关的基因表达的变化。
对于2-3个通过肿瘤内注射30μg化合物1(与3个仅媒介物部位一起)进行治疗的单个人SK-Mel-28异种移植物，执行使用小鼠基因特异性的微阵列的表达数据，将数据组合。仅检查以下小鼠基因与伤口愈合的关联性：其在化合物1治疗的部位中的表达比在媒介物注射部位中的表达高>2倍或低>2倍。
表15列出了通过以上标准选择的且与伤口愈合具有已知关联的基因。
化合物1将许多对于伤口愈合而言具有已知有利结果的基因上调至少2倍。这些是参与肌肉收缩(ACTA1)、生长(EGR1)、炎症调节(CXCL1)、用于角质形成细胞更新的角蛋白(krt5、10、14、15、17、71、krtdap)、角质形成细胞迁移(Col17a1)、表皮分化和细胞通信(lor、Tgm2、Itga7)的基因。
一个伤口愈合有关的基因，凝血酶敏感蛋白2(Thbs2)，被下调。该基因的下调与增加的血管密度和伤口愈合的早期阶段中纤连蛋白的增加有关。
表15.化合物1在人肿瘤异种移植物的小鼠间质中诱导的、与改善的伤口愈合结果有关的基因的表达的变化
实施例12：化合物对细胞因子产生的影响
特定细胞因子在伤口愈合过程中起关键作用，且调节这些物质的试剂可能用于治疗伤口和/或改善愈合的美容结果(例如减少的瘢痕形成)。在人外周血单核细胞(PBMC)中研究了化合物1、2、5和42对已知在伤口愈合过程的早期阶段中重要的4种细胞因子(IL-1β、IL-6、IL-8和TNFα)的调节的影响。
通过肝素化的得自72-岁男性(供体1)和34-岁(供体2)男性人供体的血液的Ficoll-Paque沉降，分离PBMC。如前面详述的，在10％FCS、RPMI中培养所有细胞。
在保湿培养箱中在37℃、5％CO2中，以1.5×105个细胞/孔的密度将PBMC接种在10％FCS、RPMI中。在4种浓度(0ng/mL、3ng/mL、30ng/mL、300ng/mL)用所述4种化合物一式两份地刺激这些细胞24h。从每个要求的孔取培养基样品，并在-80℃冷冻备用。
使用Cytometric Bead Array(CBA)测定来测量结果。CBA测定会提供使用具有已知大小和荧光的抗体包被的珠子捕获一种可溶性分析物或分析物集合的方法。然后使用另一种荧光地标记的第二抗体进行检测，以形成夹心复合物。根据生产商的说明书，使用BD(Becton Dickinson)CBA Human Inflammatory Cytokine Detection Kit，针对可溶性的IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70和TNFα的存在来测定每种培养基样品。将得自每个样品的平均荧光强度值与标准曲线进行对比以确定细胞因子浓度(pg/mL)。
每种化合物的CBA测定的结果显示在表16中。
所有4种化合物显著地增加从处理过的PBMC测定的上清液中检测到的4种细胞因子(TNFα、IL-1β、IL-6、IL-8)的水平，在得自两种供体的PBMC之间具有一致的趋势。最高细胞因子水平通常发生在所述化合物的两种最高浓度(30和300ng/mL)。
表16.对于化合物1、2、5和42，在0、3、30和300ng化合物/ml的浓度温育24小时以后从PBMC产生的细胞因子。以pg/ml±标准差表达细胞因子水平，并呈现两种供体中的每一种。
体内活性的实施例
实施例13：在小鼠皮肤中的急性炎症应答
急性炎症应答是伤口愈合过程的一个重要最初阶段。促炎症细胞(主要是嗜中性粒细胞和巨噬细胞)迁移至该部位并保护它免于感染和释放参与随后组织修复的起始和调节的细胞因子和趋化因子。
给雄性裸鼠在每个胁腹皮下地注射50μL的100μg/mL的化合物1、2、5和42的溶液(分别在20％丙二醇中)。受影响区域的在4小时内和在24小时之前变红的每个部位覆盖大约1cm直径的皮肤。所述部位在接下来的6天中和在14天之前形成的硬结已经完全愈合，具有微小瘢痕形成。
所述化合物在小鼠皮肤中开始的急性炎症应答(随后快速消退)与观察到的所述化合物对促炎症细胞(实施例7和9)和对PBMC中的基因表达和细胞因子特性(实施例11和12)的直接作用相一致。这样的稳健的、但是短暂的促炎症应答已通常与良好体内伤口愈合结果相关联。
实施例14：化合物1的凝胶制剂
将30mg或50mg化合物1(通过HPLC确定>97％纯度)溶解在5mL99.5％异丙醇(Biotech Pharmaceuticals)中并静置过夜。将0.6％卡波姆940(Snowdrift Farms)的溶液制备为在5mL无菌水中的胶凝剂。然后将化合物1浓缩物和0.6％卡波姆940溶液一起加入20mL注射器中并彻底混合。然后加入20μL 100％三乙醇胺(Sigma-Aldrich)，并快速混合。然后将得到的化合物1凝胶分配进各个1mL胰岛素注射器中以产生3mg化合物1/mL和5mg化合物1/mL的剂量。
实施例15：化合物1的可注射制剂
将20mg化合物1(通过HPLC确定>97％纯度)溶解在20mL容量的玻璃闪烁瓶内的8mL1,2丙二醇(Sigma-Aldrich)中，并在室温静置过夜。然后将12mL 30mM乙酸盐缓冲液(pH4.2)或盐水(注射用氯化钠BP0.9％-AstraZeneca)加入溶液中并彻底混合。然后将溶液过滤除菌，并分配进1mL剂量的1mg/mL浓度的化合物1中。
实施例16：未愈合伤口和对当前护理标准无应答的伤口的兽医临床治疗
已经使用化合物1治疗来愈合10只宠物(即私有和照顾)动物中的困难伤口，其目的是改善二期(second intention)伤口愈合。
独立兽医用化合物1治疗7只狗(Canis lupus familiaris)和1只树袋鼠(Dendrolagus lumholtzii)，其具有慢性未愈合伤口，对这些适应症的当前兽医护理标准无应答。还用化合物1治疗第二只树袋鼠和眼镜飞狐(Pteropus conspicillatus)，其具有不适合于使用当前护理标准的初次治疗的伤口。将所有病例处理为开放性伤口，在化合物1治疗过程中和随后的伤口消退阶段中不使用敷料或其它绷带。除非在个例研究中说明，否则在使用化合物1治疗过程中不使用伴随药物。
下面总结了这些患者中的每一位的病例和治疗笔记。应当指出，这些动物给主治兽医的返回呈现经常是不规则的，且伤口愈合结果可能在返回评估就诊之前已经较好地发生。
化合物1治疗在8个完成的病例中导致有效的伤口消退，具有微小瘢痕形成。在最近治疗的2个进行中病例研究(病例研究8和10)中，伤口消退较好地进展。
病例研究1-8:未愈合伤口
病例研究1：未愈合的深度坏死面部伤口，3岁Bernese山犬
病例笔记：
●在患者鼻子左侧的大椭圆形面部伤口7cm长×4cm宽×直到2cm深。
●用坏死性脓疱排出的贴剂(patches of necrotic postulant discharge)使伤口结痂。
●组织病理学：深度坏死损伤可能与蜘蛛咬伤有关，且特征在于球形细菌和化脓性炎症的存在。
●在3个月的时段内，伤口尚未对涉及抗生素(头孢氨苄、amoxyclav、庆大霉素)和抗炎药(macrolone)的标准伤口治疗方案做出应答。
●伤口的大小逐渐增加，从而造成眼睛闭合，且显著地影响患者的视力和一般行为。患者的颚(mandibullar)淋巴结已经变得膨大。
●剩余护理标准选项是针对侵入性面部外科手术和重构。
●初次治疗包括在最初14天时段内5次应用(总计5.3mL)化合物1凝胶(3mg/mL)(在第1、2、6、10和14天应用化合物1)。
●在第28天伤口部分消退以后，用单个1mL剂量的化合物1(0.5mg/mL)治疗患者，所述化合物1在遍布伤口区域的多个位置刚好在表面下面注射。
●在注射化合物1以后35天，伤口已经被健康的分化肉芽组织填实，且不存在感染的证据。
●在用化合物1治疗过程中的伴随药物是：在用凝胶制剂第一次治疗时的盐酸丁丙诺啡和利多卡因，在注射治疗时和在注射治疗以后紧邻的日子(即第28和29天)的盐酸丁丙诺啡和曲马多，然后是从第42天开始每天低剂量口服皮质类固醇(macrolone)的支持覆盖。
●在最终治疗以后76天，伤口已经愈合且被正常组织填实，具有微小瘢痕形成以及覆盖大于原始伤口区域的95％的毛发再生长。
病例研究2:爆发性感染性腹部囊肿，13岁Boxer
病例笔记：
●具有严重骨关节炎的虚弱患者，考虑任何外科手术干预的高麻醉风险。
●患者在靠近尾巴的背部具有持久性感染性囊肿，其对5个月阶段内的常规引流和给囊肿注射抗生素(庆大霉素、恩氟沙星、norocillin)没有应答。
●患者呈现爆发性囊肿和高温。将囊肿清洁以除去死皮，然后用盐水和氯己定冲洗。用抗生素(克林霉素和norocillin)和抗炎药(metacam)治疗患者。
●5天以后，与爆发性囊肿有关的伤口没有表现出消退征象，且被显著的局部炎症包围。然后将暴露的伤口区域(大约5cm长×3cm宽×直到2.5cm深)用盐水冲洗，并将0.5mL化合物1凝胶(3mg/mL)均匀地应用于伤口区域。
●在用化合物1凝胶治疗后5天之前，伤口已经显著收缩至小于原始伤口区域的30％(近似尺寸3cm长×1.5cm宽×1cm深)，且包含健康的肉芽组织。
●在30天，伤口已经消退，具有正常组织和在大于70％的原始伤口区域上的毛发再生长。
●该患者在化合物1治疗过程中的伴随药物是在治疗时可注射的非甾体类抗炎药(metacam)。
病例研究3:未愈合的感染性穿刺伤口，11岁Chow Chow
病例笔记：
●患者由于狗打架而在臀部上呈现2个大的撕咬伤口(每个大约4cm长×1.5cm宽×2cm深)。
●将伤口洗涤，并用抗生素(amoxyclav片剂和可注射的norocillin)治疗患者。
●8天以后，伤口是持续的，没有闭合，且被感染。
●将伤口清洁，并将0.4mL化合物1凝胶(3mg/mL)均匀地应用于每个伤口。
●在用化合物1治疗后15天之前，伤口已经显著收缩至小于它们的原始大小的40％，形成焦痂，且不存在感染的迹象。
●在用化合物1治疗后46天，伤口已经完全地消退，在伤口区域上具有正常组织、无瘢痕形成和完全毛发再生长。
●在化合物1治疗中，该患者没有伴随药物。
病例研究4:在犬(11岁Boxer)的面部和跖骨上的未愈合的感染性伤口
病例笔记：
●患者呈现2个未愈合的感染的和发炎的伤口区域，一个在面部的左侧上，一个在左后跖骨上，所述区域对延长的8周抗生素(头孢氨苄、多西环素)和皮质类固醇(macrolone)疗程没有应答。
●将5mg/mL的化合物1的凝胶制剂的单次治疗应用于面部上的伤口(0.4mL)和腿上的伤口(0.6mL)。
●面部伤口对化合物1治疗快速地应答，小焦痂在7天时呈现，且完全伤口闭合(包括显著的毛发再生长)在治疗以后14天之前是明显的。伤口区域在治疗以后63天之前完全愈合。
●腿上的伤口也快速地应答，焦痂呈现在限定的区域。在14天之前，焦痂已经大量脱落，且观察到健康的下面肉芽组织。伤口区域已经完全地闭合，且在治疗以后63天具有大于95％的毛发覆盖。
●该患者在化合物1治疗过程中的伴随药物是用于治疗犬特应性皮炎综合征的低剂量皮质类固醇(macrolone)的持续每天治疗。
病例研究5：在犬(4岁Bull Arab)耳朵上的未愈合的感染性伤口
病例笔记：
●患者由于狩猎事故而呈现未愈合的撕裂，其已经在左耳上呈现超过6周。
●以8天间隔将3次治疗(各0.1mL 5mg/mL的化合物1的凝胶制剂)应用于受影响的区域。在用化合物1治疗患者的过程中，不使用伴随药物。
●在使用化合物1的第一次治疗以后41天之前，伤口已经完全闭合。在初次治疗以后152天的进一步评估显示完全伤口消退、微小瘢痕形成，在原始伤口部位上具有大于80％的毛发覆盖度。
病例研究6：在犬(11岁Boxer)的耳朵上的未愈合的感染性伤口
病例笔记：
●患者在左耳的上部呈现未愈合的(感染的和发炎的)溃疡，并用护理标准方案治疗10周，所述护理标准方案包括常规应用：(i)局部皮肤病学制剂(Neotopic)，其组合抗细菌剂(硫酸新霉素)、抗炎剂(氢化可的松)和抗瘙痒剂(利多卡因)；和(b)市售悬浮液(Auracol)，其具有抗炎组分(泼尼松龙)、抗真菌组分(硝酸咪康唑)和抗细菌组分(硫酸多粘菌素B)。在这些治疗之前，患者正在接受用于治疗慢性犬特应性皮炎综合征的持续低剂量口服皮质类固醇(macrolone)疗程。
●10周的护理标准方案以后，不存在伤口消退的迹象。
●将3mL 5mg/mL的化合物1的凝胶制剂的单次治疗应用于受影响的区域，且在化合物1应用的15分钟内，存在治疗区域的可辨别的变红。
●从化合物1治疗以后4天开始，患者重新开始每天低剂量的用于治疗严重特应性皮炎的皮质类固醇(macrolone)。该治疗持续贯穿伤口愈合和消退的整个过程。
●在化合物1治疗以后17天，不存在感染或炎症的迹象，在治疗的部位已经发展出较好地形成肉芽的伤口床。
●在治疗以后83天，存在完全伤口闭合，且毛发再生长已经发生在原始伤口区域的超过90％。
●在治疗以后139天之前，不可能辨别原始伤口的部位，在治疗区域中和周围不存在瘢痕形成的证据和/或皮肤色素沉着或表观厚度的差异。
病例研究7：在犬(8岁Jack Russell terrier)的耳朵和面部上的未愈合的感染性伤口
病例笔记：
●患者呈现在右耳的尖部和基部处的2个未愈合伤口和在鼻口部上的1个未愈合伤口，其主人已经观察到存在超过4周。可能的起源是被感染的蜘蛛或其它昆虫咬伤。
●以5天间隔将两次治疗(各0.1mL 5mg/mL的化合物1的凝胶制剂)应用于耳朵上的两个受影响的区域。将0.1mL 5mg/mL的化合物1的凝胶制剂的单次治疗应用于面部病灶。
●在使用化合物1的第一次治疗以后13天之前，耳朵上的两个伤口已经显著收缩且已经形成焦痂。在29天之前，所述伤口已经完全闭合且具有毛发生长的完全覆盖。
●在治疗以后16天，在鼻口部上的伤口已经完全消退。
●该患者的伴随药物是在初次治疗时5天疗程的口服抗生素阿莫西林和克拉维酸(amoxyclav)。
病例研究8：在树袋鼠(有袋目,Dendrolagus lumholtzi)的腿上的被感染的骨伤口
病例笔记：
●患者呈现为在狗攻击中受伤的野生树袋鼠，其导致lacrosacral脱位和骨髓炎。用可注射的抗生素头孢他啶(Fortum)和甲氧苄啶磺胺甲噁唑(TMS)治疗患者1个月。尽管炎症已经减轻，细菌拭子揭示革兰氏阴性细菌和粘质沙雷氏菌(Serratia marcesens)仍然存在。受影响的肢体没有承重。
●用头孢他啶治疗另外2周没有导致病症的改善，且兽医劝告从骨清除感染的预后不良和对骨结构(其包括将来的步态)的可能显著的机械破坏。在此时取自跗关节和垫上的释放窦的新细菌拭子揭示混合的厌氧菌种和革兰氏阳性的放线菌属(Actinomyces)种，所以递送单次缓慢的碘化钠(Sodide)静脉内输注。
●因为缺乏对其它治疗的应答和使用这些护理标准的总预后不良，在2周后开始包括5mg/mL的化合物1的凝胶制剂的4次应用的挽救治疗。
●对于第一次应用，将0.1mL化合物1凝胶应用于右跗关节上的3个病灶(一个病灶在踝关节上面，一个病灶在足垫下面，和一个在足跟基部处(base of the heal)的小病灶)中的每一个，且开始缓慢的碘化钠静脉内输注。在应用化合物1凝胶的10分钟内，存在来自治疗区域的脓性排出物。
●在呈现上，在第一次治疗以后8天，脓性排出物从腿上的3个伤口中的2个渗出。其它伤口(在足跟上的最小病灶)已经收缩且开始愈合。使用0.15mL 5mg/mL的化合物1的凝胶制剂的另一次治疗来治疗两个开放性伤口(一个在踝关节上面，另一个在足垫基部上)中的每一个。还给出了缓慢的碘化钠静脉内输注。
●另外15天以后(初次治疗以后23天)，将几mL浓脓性脓汁从足垫上的伤口挤出，然后迫使0.15mL 5mg/mL的化合物1的凝胶制剂进入排出的伤口窦。
●一周后，存在感染的显著改善。从足垫中的洞取出一小块骨。没有明显的脓，但是存在浆液性排出物。将另外0.2mL化合物1凝胶应用于每个病灶，一个在踝上面，另一个在脚下面。还递送了缓慢的碘化钠静脉内输注。肢体现在承重，但是足跟和足垫仍然非常坚硬，炎症和动物的步态是非常不均匀的，且强烈地有利于未损伤的后腿。
●另外15天以后，在踝关节上面的伤口已经完全闭合，且毛发正在长回。在足垫的足跟上(heal of the foot)的伤口已经收缩至小于在前一次就诊时它的大小的50％，且周围的皮肤和组织是软的、柔韧的和正常的。该肢体现在完全承重，且动物的步态不存在不均匀性。
●除了可注射的碘化钠以外，在用化合物1治疗过程中没有将其它伴随药物施用给患者。
不适合于当前护理标准的困难伤口的病例研究
病例研究9：在树袋鼠(有袋目,Dendrolagus lumholtzi)的耳朵中的传染性血管炎
病例笔记：
●患者呈现为在野外发现的年轻受伤动物。
●患者是非常虚弱的、脱水的和贫血的。尿样品揭示血液和细菌感染，可能是败血病。将患者置于输液疗法并用抗恶心药物柠檬酸马罗匹坦(cerenia)和两种可注射的抗生素制剂Tribacteral(甲氧苄啶、磺胺嘧啶)和头孢他啶(fortum)治疗。
●9天后，在液体滴注时，患者的病症已经改善，但是存在对右耳的损伤和可能的传染性血管炎和坏疽。由于患者的高度受损的状况，因为显著的麻醉风险，外科手术是不可能的。相反，开始用化合物1的凝胶制剂治疗。
●以7天间隔将0.1mL 5mg/mL浓度的化合物1凝胶的3次治疗应用于受影响的区域。在该时间中唯一的并行药物是头孢菌素抗生素头孢他啶(fortum)。
●在化合物1凝胶的第一次治疗以后7天，紧密地附着的焦痂覆盖伤口表面。在10天时提起该焦痂以揭示发育良好的粉红色肉芽形成床。
●在初次治疗以后14天在第三次和最终治疗应用的时间之前，伤口区域已经减小了大约50％，且在25天，健康组织呈现在整个伤口区域上面。
●在67天，病灶已经完全消退，且在耳朵上存在完全的毛发覆盖度。
病例研究10：在眼镜飞狐(哺乳动物,Pteropus conspicillatus)的头上的严重撕裂伤
病例笔记：
●患者呈现为4月龄飞狐，具有由缠入带刺铁丝中造成的在4-月龄飞狐的头上的深贯通伤。
●按照具有广泛野生动物(包括飞狐)损伤经验的主治兽医的观点，通常的护理标准治疗可能是非常有问题的，造成右眼失去形状和不能闭合，这归因于与外科手术有关的过度瘢痕组织形成或如果施加伤口愈合敷料的话需要的肉芽形成的程度。
●在经历28天时段(第1、10和28天)的0.1mL 5mg/mL凝胶制剂的3次施用中将化合物1应用于伤口。在治疗过程中不使用其它伴随药物或干预。
●在初次治疗以后14天，存在显著的组织填实和重塑，且在28天之前，眼睛能够完全闭合。在38天之前，焦痂覆盖整个伤口区域，且这在49天时开始脱离以暴露良好的肉芽形成床。
●在初次治疗以后55天之前，在整个原始伤口区域上存在良好的组织填实，且右眼正在恢复它的原始位置。存在非常健康的肉芽形成床。
实施例17：在用化合物1治疗的伴侣动物中自发肿瘤的坏死和脱落以后产生的伤口的消退和美容结果
在表17中总结了关于在24只伴侣动物中的伤口消退速度的兽医临床数据，所述伤口在自发肿瘤的坏死和脱落以后形成，所述自发肿瘤已经通过化合物1(30％1,2丙二醇制剂，在0.5或1.0mg/mL浓度)的肿瘤内注射进行了治疗。
应当指出，将所有伤口处理为开放性伤口，且在这些病例中的任一个中不使用绷带、敷料、洗剂或伴随药物。
表17：在已经用可注射的化合物1制剂治疗的自发肿瘤脱落以后在伴侣动物中的伤口大小和消退速度(达到闭合的时间)
得自这些病例的数据也显示伤口消退的良好美容结果，在大多数患者中具有微小瘢痕形成和正常毛发再生长(表18)。在没有发生瘢痕形成的少数病例中，这些经常与通常薄皮肤的区域(例如在马和狗的肢体上)相一致。
表18：已经用可注射的化合物1制剂治疗的自发肿瘤脱落以后在伴侣动物中愈合的伤口部位的组织、皮肤和毛发特征
1组织缺乏分类
无或极少：原始伤口区域的<5％组织缺乏
微小：原始伤口区域的5-10％组织缺乏
大量：原始伤口区域的>10％组织缺乏
2.瘢痕形成和皮肤变厚分类：
无或极少：肉眼或触摸不明显的瘢痕形成
微小：覆盖原始伤口区域的<10％的局部瘢痕
大量：覆盖原始伤口区域的>10％的瘢痕形成
3.在伤口区域上的毛发再生长分类
完全：毛发覆盖原始伤口区域的>95％
部分：毛发覆盖原始伤口区域的>50％
稀疏：毛发覆盖原始伤口区域的<50％。

Claims (14)

1.5,6-或6,7-环氧-惕各烷化合物或其药学上可接受的盐在制备用于促进受试者的伤口愈合的药物中的用途，其中所述5,6-或6,7-环氧-惕各烷化合物是式(III)的化合物：
其中
R7是-OH或-OR18；
R8是-OC(O)C1-10烷基、-OC(O)C2-10烯基或-OC(O)C2-10炔基；
R11和R12或R12和R13一起形成-O-且R11和R13中的剩余基团是氢、-OH或-OR17；
R15是氢或-R17；
R17是氢、-C(O)C1-6烷基、-C(O)C2-6烯基或-C(O)C2-6炔基；
R18是-C(O)C1-16烷基、-C(O)C2-16烯基、-C(O)C2-16炔基、-C(O)苯基、-C(O)C1-10烷基苯基、-C(O)C2-10烯基苯基、-C(O)C2-10炔基苯基、-C(O)C1-10烷基C(O)R19、-C(O)C2-10烯基C(O)R19、-C(O)C2-10炔基C(O)R19、-C(O)C1-10烷基CH(OR19)(OR19)、-C(O)C2-10烯基CH(OR19)(OR19)、-C(O)C2-10炔基CH(OR19)(OR19)、-C(O)C1-10烷基SR19、-C(O)C2-10烯基SR19、-C(O)C2-10炔基SR19、-C(O)C1-10烷基C(O)OR19、-C(O)C2-10烯基C(O)OR19、-C(O)C2-10炔基C(O)OR19、-C(O)C1-10烷基C(O)SR19、-C(O)C2-10烯基C(O)SR19、-C(O)C2-10炔基C(O)SR19；
其中在R18的任意烯基可以是E或Z的几何异构体形式，且任意烷基、烯基或炔基可以任选地被一个或两个羟基取代；且
R19是氢、-C1-10烷基、-C2-10烯基或-C2-10炔基。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述促进伤口愈合选自增加伤口愈合的速率、减少伤口组织中的瘢痕形成或者增加伤口愈合的速率和减少伤口组织中的瘢痕形成。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述促进伤口愈合是改善愈合的伤口的美容结果。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述伤口是慢性伤口、急性伤口或现存伤口。
5.根据权利要求1所述的用途，其中所述环氧-惕各烷化合物是呈植物提取物的形式。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述植物提取物可得自Fontainea种或Hylandia种的植物。
7.根据权利要求1-3中的任一项所述的用途，其中R7是-OH，-OC(O)C1-15烷基，-OC(O)C2-15烯基，-OC(O)C2-15炔基，-OC(O)苯基，-OC(O)C1-15烷基苯基，-OC(O)C1-10烷基C(O)H，-OC(O)C2-10烯基C(O)H，-OC(O)C1-10烷基C(O)C1-6烷基，-OC(O)C2-10烯基C(O)C1-6烷基，-OC(O)C1-10烷基CH(OC1-3烷基)(OC1-3烷基)，-OC(O)C2-10烯基CH(OC1-3烷基)(OC1-3烷基)，-OC(O)C1-10烷基SC1-6烷基，-OC(O)C2-10烯基SC1-6烷基，-OC(O)C1-10烷基C(O)OC1-6烷基或-OC(O)C2-10烷基C(O)OC1-6烷基。
8.根据权利要求1-3中的任一项所述的用途，其中R8是-OC(O)C1-15烷基、-OC(O)C2-15烯基、-OC(O)C2-15炔基或-C(O)苯基。
9.根据权利要求1-3中的任一项所述的用途，其中R11和R12形成环氧基，且R13是-OH、-OC(O)C1-6烷基、-OC(O)C2-6烯基或-OC(O)C2-6炔基或者其中R12和R13形成环氧基，且R11是-OH、-OC(O)C1-6烷基、-OC(O)C2-6烯基或-OC(O)C2-6炔基。
10.根据权利要求1-3中的任一项所述的用途，其中R15是氢、-C(O)C1-6烷基、-C(O)C2-6烯基或-C(O)C2-6炔基。
11.5,6-或6,7-环氧-惕各烷化合物或其药学上可接受的盐在制备用于在急性或慢性伤口中预防过度瘢痕形成的药物中的用途，其中所述5,6-或6,7-环氧-惕各烷化合物是式(III)的化合物：
其中
R7是-OH或-OR18；
R8是-OC(O)C1-10烷基、-OC(O)C2-10烯基或-OC(O)C2-10炔基；
R11和R12或R12和R13一起形成-O-且R11和R13中的剩余基团是氢、-OH或-OR17；
R15是氢或-R17；
R17是氢、-C(O)C1-6烷基、-C(O)C2-6烯基或-C(O)C2-6炔基；
R18是-C(O)C1-16烷基、-C(O)C2-16烯基、-C(O)C2-16炔基、-C(O)苯基、-C(O)C1-10烷基苯基、-C(O)C2-10烯基苯基、-C(O)C2-10炔基苯基、-C(O)C1-10烷基C(O)R19、-C(O)C2-10烯基C(O)R19、-C(O)C2-10炔基C(O)R19、-C(O)C1-10烷基CH(OR19)(OR19)、-C(O)C2-10烯基CH(OR19)(OR19)、-C(O)C2-10炔基CH(OR19)(OR19)、-C(O)C1-10烷基SR19、-C(O)C2-10烯基SR19、-C(O)C2-10炔基SR19、-C(O)C1-10烷基C(O)OR19、-C(O)C2-10烯基C(O)OR19、-C(O)C2-10炔基C(O)OR19、-C(O)C1-10烷基C(O)SR19、-C(O)C2-10烯基C(O)SR19、-C(O)C2-10炔基C(O)SR19；
其中在R18的任意烯基可以是E或Z的几何异构体形式或其混合物，且任意烷基、烯基或炔基可以任选地被一个或两个羟基取代；且
R19是氢、-C1-10烷基、-C2-10烯基或-C2-10炔基。
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述过度瘢痕形成是瘢痕疙瘩或肥厚性瘢痕。
13.化合物，其选自：
12-己酰基-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物5)；
12-乙酰基-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物6)；
12-丙酰基-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物7)；
12-丁酰基-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物8)；
12-[(2E,4E)-(6,6-二甲氧基己-2,4-二烯酰基]-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物9)；
12-[(2E,4E)-6-氧代己-2,4-二烯酰基]-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物10)；
12-[(2E,4E)-6,7-二羟基十二-2,4-二烯酰基]-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物11)；
12-[(2E)-4,5-二羟基-癸-2-烯酰基]-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物12)；
12-巴豆酰基-13-(2-甲基丙酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物13)；
12-[(2E)-3-甲硫基丙-2-烯酰基]-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物14)；
12-(2-甲基丙-2-烯酰基-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物15)；
12-[(2E,4E)-己-2,4-二烯酰基]-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物16)；
12-[(2E,4E)-8-氧代十二-2,4-二烯酰基]-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物17)；
12-[(2Z,4E)-癸-2,4-二烯酰基]-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物18)；
13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物19)；
12-[(2E)-丁-2-烯酰基]-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物20)；
12-巴豆酰基-13-丁酰基-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物21)；
12-(3-丁烯酰基)-13-壬酰基-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物22)；
12-苯甲酰基-13-(2-甲基丁酰基-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物23)；
12-[(2Z,4E)-癸-2,4-二烯酰基]-13-(2-甲基丙酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物25)；
12-[(2E,4E)-6,7-(反)-环氧-十二-2,4-二烯酰基]-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物26)；
12,13-二丁酰基-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物27)
12-苯甲酰基-13-丁酰基-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物28)；
12-巴豆酰基-13-(2-甲基丁酰基)-5,6-环氧-4,7,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物29)；
13-(2-甲基丁酰基)-5,6-环氧-4,7,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物30)；
12-乙酰基-13-(2-甲基丁酰基)-5,6-环氧-4,7,9,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物31)；
12,13-二-(2-甲基丁酰基)-5,6-环氧-4,7,9,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物32)；
12-丙酰基-13-(2-甲基丁酰基)-5,6-环氧-4,7,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物33)；
12-己酰基-13-(2-甲基丁酰基)-5,6-环氧-4,7,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物34)；
12-巴豆酰基-13-(2-甲基丙酰基)-5,6-环氧-4,7,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物35)；
12-[(2E)-3-甲硫基丙-2-烯酰基]-13-(2-甲基丁酰基)-5,6-环氧-4,7,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物36)；
12-{[2-(甲基硫烷基)羰基]-乙酰基}-13-(2-甲基丁酰基)-5,6-环氧-4,7,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物39)；和
12-[(2-甲氧基羰基)-乙酰基]-13-(2-甲基丁酰基)-5,6-环氧-4,7,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物40)；
12,13-二-壬酰基-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物41)；
12,13-二-己酰基-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物42)；
12,13-二-戊酰基-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物43)；
12,13-二-巴豆酰基-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物44)；
5,20-二-乙酰基-12-巴豆酰基-13-(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物45)；
12,13-二-(2E,4E)-己-2,4-烯酰基-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物46)；
12,13-二-庚酰基-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物49)；
12-肉豆蔻酰基-13-乙酰基-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物50)；
12-肉豆蔻酰基-13(2-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物51)；
12-(2-甲基丁酰基)-13-乙酰基-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物52)；和
12-羟基-13-己酰基-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物53)；
12,13-二-(3-甲基丁酰基)-6,7-环氧-4,5,9,12,13,20-六羟基-1-惕各烯-3-酮(化合物60`)；
或其药学上可接受的盐。
14.一种药物组合物，其包含权利要求13的化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
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