EA044756B1

EA044756B1 - Комбинированная терапия для лечения или предупреждения опухолей

Info

Publication number: EA044756B1
Application number: EA201992220
Authority: EA
Inventors: Пол Уоррен Реддел; Джейсон Кингсли Каллен; Глен Мэтью Бойль; Питер Гордон Парсонс; Виктория Энн Гордон
Original assignee: Кьюбиотикс Пти Лтд
Priority date: 2017-03-23
Filing date: 2018-03-23
Publication date: 2023-09-28

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к комбинированной терапии опухолей, включающей введение эпокситиглианового соединения и ингибитора контрольной точки иммунитета. Также описываются наборы, содержащие эпокситиглиановые соединения и ингибиторы контрольных точек иммунитета.

Предпосылки создания изобретения

Эпокситиглиеноновые соединения обладают сильной противоопухолевой активностью. При введении интратуморально эпокситиглиеноны инициируют быстрый геморрагический некроз опухолевой массы путем прямого разрушения сосудистой сети опухоли (Boyle et al., 2014). На сегодняшний день не имеется данных, что локализованное введение эпокситиглиеноновых соединений оказывает системное действие на сторонние или более удаленные опухоли, и полагают, что доставленные в опухоль эпокситиглиеноновые соединения воздействуют, главным образом, в месте обработки. Как следствие, каждая опухоль подлежит индивидуальному лечению.

Различные виды иммунотерапии для лечения рака получили широкое признание в клинической практике. В частности, была показана перспективность ингибиторов контрольных точек иммунитета (ICI) при ряде злокачественный образований, включая метастатическую меланому поздних стадий, немелкоклеточный рак легких, рак почек, рак мочевого пузыря и ходжкинскую лимфому. ICI представляют собой молекулы (как правило, моноклональные антитела), которые блокируют действие белков, позволяющих опухолевым клеткам не поддаваться, подавлять или сопротивляться иммунной системе хозяина, в особенности Т-клеткам, которые являются специфическими для опухолевых антигенов. Одобренные в настоящее время Т-клеточные ингибиторы контрольных точек усиливают противоопухолевый иммунный ответ через совершенно иные механизмы действия. Например, блокада цитотоксического Тлимфоцитассоциированного антигена 4 (CTLA4) преимущественно усиливает Т-клеточную активацию во время первой фазы иммунного ответа, в то время как оказывается, что блокада белка запрограммированной гибели клеток 1 (PD1) высвобождает истощенные, но в иных отношениях активированные популяции эффекторных Т-клеток и снижает функцию регуляторных Т-клеток (Treg).

Хотя ICI могут обеспечить заметную и длительную реакцию у пациентов с раком поздних стадий, такие положительные реакции ограничены небольшой частью от общей популяции пациентов (HuLieskovan et al., 2017). Поэтому подходы, которые комбинируют ICI с другими видами лечения (например, лучевой терапией, онколитическими вирусами, противораковыми вакцинами), которые могут стимулировать иммунный ответ хозяина, представляют привлекательный и клинически осуществимый подход для преодоления врожденной и приобретенной резистентности к противораковой иммунотерапии и потенциально распространяют клинический успех на более широкий круг пациентов (Smyth et al., 2015).

Одним из таких подходов является комбинирование ICI с низкомолекулярными химиотерапевтическими средствами (доставляемыми системно или интратуморально), которые могут модулировать иммунные отклики путем (1) уменьшения общей опухолевой нагрузки, (2) потенцирования противоопухолевого ответа путем проявления неоантигена во время некроза опухоли и/или (3) прямого воздействия на стромальные клетки опухоли (Adams et al., 2015; Mahoney et al., 2015; O'Brien et al., 2014).

Настоящее изобретение по меньшей мере частично основано на обнаруженном авторами факте, что некоторые производные эпокситиглиен-3-она могут стимулировать иммунный ответ, который может синергично взаимодействовать с блокадой контрольных точек иммунитета, обеспечивая терапию не только для той опухоли, которая подвергается лечению, но также и для других опухолей, которые могут присутствовать у получающего лечение субъекта.

Сущность изобретения

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения опухоли у субъекта, включающему введение субъекту эпокситиглианового соединения и ингибитора контрольной точки иммунитета, где эпокситиглиановое соединение вводят локально в опухоль; где эпокситиглиановое соединение представляет собой соединение формулы (I)

- 1 044756

или его геометрический изомер или стереоизомер или фармацевтически приемлемую соль, где

R1 представляет собой водород или C_1-6-алкил;

R2 представляет собой -OH или -OR9;

R₃ представляет собой -OH или -OR9;

R₄ и R₅ выбирают независимо из водорода и С1-₆-алкила;

R6 представляет собой водород или -R₁₀;

R7 представляет собой гидрокси или OR₁₀;

R8 представляет собой водород или C_1-6-алкил;

R9 представляет собой -C_1-20-алкил, -С_2-20-алкенил, -С_2-20-алкинил, -C(O)C_1-20-алкил, -С(О)С₂-₂₀алкенил, -С(O)С₂.₂₀-алкинил, -С(О)-Cз.6-циклоαлкил, -С(O)C₁.₁₀-алкил-Cз.6-циклоалкил; -C(O)C₂-₁₀алкенил-С₃-₆-циклоалкил, -С(О)С₂_₁₀-алкинил-С₃_₆-циклоалкил, -С(О)-арил, -С(O)C₁.₁₀-αлкиларил, -С(O)C₂.₁₀-алкениларил, -С(O)C₂.₁₀-алкиниларил, -C(O)C₁.₁₀-алкил-C(O)R₁₁, -C(O)C₂.₁₀-алкенил-C(O)R₁₁, -С(O)C2_10-алкинил-С(О)R_π, -C(O)C1_10-алкил-CH(OR_n)(OR_π), -С(О)C2_10-алкенил-CH(OR_π)(OR_n), -c(o)c₂.₁₀-алкинил-CH(OR₁₁)(OR₁₁), -С(O)C₁.₁₀-алкuл-SR₁₁, -С(О)C₂._1O-αлkенил-SR₁₁, -C(O)C₂.₁₀-алкинилSR11, -C(O)C₁.₁₀-алкил-C(O)OR₁₁, -С(O)C₂.₁₀-алкенил-C(O)OR₁₁, -C(O)C₂.₁₀-алкинил-C(O)OR₁₁, -C(O)C₁.₁₀αлkил-C(O)SR₁₁, -С(О)C₂.₁₀-алкенuл-C(O)SR₁₁,-С(О)C₂.₁₀-алкuнuл-С(o)SR₁₁,

Р ⁰ о

-CiO^oa™ _R11 , -с(О)С₂.₁₀—или =

R₁₀ представляет собой -C₁.6-алкuл, -С₂.б-алкенил, -С₂.б-алкинил, -C(O)C₁.6-алкил, -С(О)С₂.б-алкенил, -С(О)С₂-₆-алкинил, -С(О)-арил, -С(О)C₁.₆-алкиларил, -С(О)С₂-₆-алкениларил или -С(О)С₂-₆-алкиниларил; и

R11 представляет собой водород, -C₁.₁₀-алкил, -С₂-₆-алкенил, -C₂.₁₀-алкинил, C₃.₆-циклоалкил или арил;

где термин арил при использовании в вышеуказанных значениях радикалов означает C₆-C₁₄членную моноциклическую, бициклическую или трициклическую карбоциклическую систему, имеющую до 7 атомов в каждом цикле, причем по меньшей мере один цикл является ароматическим;

где ингибитор контрольной точки иммунитета представляет собой антитело против белка запрограммированной гибели 1 (PD-1) или антитело против цитотоксического Т-лимфоцитассоциированного белка 4 (CTLA-4); и где опухоль является опухолью с врожденной и приобретенной резистентностью по отношению к монотерапии ингибитором контрольной точки иммунитет.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения одной или нескольких сторонних (от англ. bystander) опухолей у субъекта, включающему введение субъекту, нуждающемуся в этом, эпокситиглианового соединения и ингибитора контрольной точки иммунитета, причем указанное эпокситиглиановое соединение вводят локально в опухоль, отличающуюся от указанной одной или нескольких сторонних опухолей; где эпокситиглиановое соединение представляет собой соединение вышеуказанной формулы (I) или его геометрический изомер или стереоизомер или фармацевтически приемлемую соль; где ингибитор контрольной точки иммунитета представляет собой антитело против белка запрограммированной гибели 1 (PD-1) или антитело против цитотоксического Т-лимфоцитассоциированного белка 4 (CTLA-4); где сторонняя опухоль представляет собой опухоль, отличную от той опухоли, в которую вводят эпокситиглиановое соединение; где сторонняя опухоль представляет собой другую первичную опухоль или метастатическую опухоль; и где опухоль, в которую вводят эпокситиглиановое соединение, является опухолью с врожденной и приобретенной резистентностью по отношению к монотерапии ингибитором контрольной точки иммунитета.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к набору для использования в любом из вышеуказанных способов, включающему композицию, содержащую вышеуказанное эпокситиглиановое соединение, и композицию, содержащую вышеуказанный ингибитор контрольной точки иммунитета.

- 2 044756

Подробное описание изобретения

Определения.

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют такие значения, какие им обычно придают специалисты в данной области техники, к которой относится изобретение. Хотя на практике или при тестировании настоящего изобретения можно использовать любые методы и материалы, схожие или эквивалентные описанным в настоящем описании, в настоящем документе приведены предпочтительные методы и материалы. Ниже приводятся определения некоторых терминов для целей настоящего изобретения.

Артикли a и an используются в настоящем описании как относящиеся к одному или более, чем одному (т.е. по меньшей мере к одному) грамматическому объекту. Как пример, элемент (an element) означает один элемент или более, чем один элемент.

Используемый в настоящем описании термин примерно относится к части, уровню, величине, измерению, размеру или количеству, которое может варьироваться, например, на 30%, 25%, 20%, 15% или 10% от указанной части, уровня, величины, измерения, размера или количества.

Во всем настоящем описании, если контекст не требует иного, слова включать, включает или включающий следует понимать, как включение указанной стадии или элемента или группы стадий или элементов, но без исключения любой другой стадии или элемента или группы стадий или элементов.

Термин алкил относится к необязательно замещенным линейным и разветвленным углеводородным группам с 1-20 атомами углерода. Где уместно, алкильная группа может иметь определенное число атомов углерода, например, -C₁-С₆-алкил, который включает алкильные группы, имеющие 1, 2, 3, 4, 5 или 6 атомов углерода в линейной или разветвленной конфигурации. Неограничивающие примеры алкильных групп включают метил, этил, пропил, изопропил, бутил, втор- и трет-бутил, пентил, 2метилбутил, 3-метилбутил, гексил, 2-метилпентил, 3-метилпентил, 4-метилпентил, 2-этилбутил, 3этилбутил, гептил, октил, нонил, децил, ундецил, додецил, тридецил, тетрадецил и пентадецил.

Термин алкенил относится к необязательно замещенным ненасыщенным линейным и разветвленным углеводородам с 2-20 атомами углерода, имеющим по меньшей мере одну двойную связь. Где уместно, алкенильная группа может иметь определенное число атомов углерода, например C₂-С₆-алкенил, который включает алкенильные группы, имеющие 2, 3, 4, 5 или 6 атомов углерода в линейном или разветвленном расположении. Неограничивающие примеры алкенильных групп включают этенил, пропенил, изопропенил, бутенил, втор- и трет-бутенил, пентенил, гексенил, гепт-1,3-диен, гекс-1,3-диен, нон1,3,5-триен и т.п.

Термин алкинил относится к необязательно замещенным ненасыщенным линейным и разветвленным углеводородам с 2-20 атомами углерода, имеющим по меньшей мере одну тройную связь. В соответствующем случае алкинильная группа может иметь определенное число атомов углерода, например C₂-С₆-алкинил, который включает алкинильные группы, имеющие 2, 3, 4, 5 или 6 атомов углерода в линейной или разветвленной конфигурации. Неограничивающие примеры включают этинил, пропинил, бутинил, пентинил и гексинил.

Термины циклоалкил и карбоциклический относятся к необязательно замещенным насыщенным или ненасыщенным моноциклическим, бициклическим или трициклическим углеводородным группам. Где уместно, циклоалкильная группа может иметь определенное число атомов углерода, например C₃-С₆-циkлоалкил представляет собой карбоциклическую группу с 3, 4, 5 или 6 атомами углерода. Неограничивающие примеры могут включать циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклопентенил, циклогексил, циклогексенил, циклогексадиенил и т.п.

Арил означает С₆-C₁4-членную моноциклическую, бициклическую или трициклическую карбоциклическую систему, имеющую до 7 атомов в каждом цикле, причем по меньшей мере один цикл является ароматическим. Примеры арильных групп включают (без ограничения) фенил, нафтил, тетрагидронафтил, инданил и бифенил. Арил может включать 1-3 бензольных цикла. Если присутствуют два или больше ароматических циклов, эти циклы могут быть конденсированы, так что соседние циклы имеют общую связь.

Каждый алкил, алкенил, алкинил, циклоалкил или арил, вне зависимости от того, является ли он отдельной сущностью или частью более крупной сущности, необязательно может быть замещен одним или несколькими необязательными заместителями, выбранными из группы, включающей C₁.₆-алкил, С₂.₆алкенил, C₃.₆-циkлоалкил, оксо (=O), -OH, -SH, C₁.₆-алкил-О-, С₂_₆-алкенил-О-, C₃.₆-циkлоалкил-О-, C1_₆алкил-S-, C₂.₆-алкенил-S-, C₃.₆-циклоалкил-S-, -СО2Н, -CO₂C₁.₆-алкил, -NH2, -NH(C₁.₆-алкил), -N(Ci.₆алкил)₂, -NH(фенил), -N(фенил)₂, -CN, -NO2, -галоген, -CF₃, -OCF3, -SCF3, -CHF2, -OCHF2, -SCHF2, -фенил, -C₁.₆-алкилфенил, -О-фенил, -С(О)-фенил, -С(O)С₁.₆-алкил. Примеры подходящих заместителей включают (без ограничения) метил, этил, пропил, изопропил, бутил, втор-бутил, трет-бутил, винил, метокси, этокси, пропокси, изопропокси, бутокси, метилтио, этилтио, пропилтио, изопропилтио, бутилтио, гидрокси, гидроксиметил, гидроксиэтил, гидроксипропил, гидроксибутил, фтор, хлор, бром, иод, циано, нитро, -CO2H, -СО2СН3, -C(O)CH₃, трифторметил, трифторметокси, трифторметилтио, дифторметил, дифторметокси, дифторметилтио, морфолино, амино, метиламино, диметиламино, фенил, фенокси, фенилкарбонил, бензил и ацетил.

- 3 044756

Эпокситиглиановые соединения могут находиться в форме фармацевтически приемлемых солей. Однако следует иметь в виду, что фармацевтически неприемлемые соли также входят в объем изобретения, так как они могут использоваться в качестве промежуточных соединений для получения фармацевтически приемлемых солей или могут использоваться во время хранения или транспортировки. Подходящие фармацевтически приемлемые соли включают (без ограничения) соли фармацевтически приемлемых неорганических кислот, таких как хлороводородная, серная, фосфорная, азотная, угольная, борная, сульфамовая и бромоводородная кислоты, или солей фармацевтически приемлемых органических кислот, таких как уксусная, пропионовая, масляная, винная, малеиновая, гидроксималеиновая, фумаровая, лимонная, молочная, слизевая, глюконовая, бензойная, янтарная, щавелевая, фенилуксусная, метансульфоновая, толуолсульфоновая, бензолсульфоновая, салициловая, сульфанильная, аспарагиновая, глутамовая, эдетовая, стеариновая, пальмитиновая, олеиновая, лауриловая, пантотеновая, дубильная, аскорбиновая и валериановая кислоты.

Соли оснований включают (без ограничения) соли, образованные с фармацевтически приемлемыми катионами, такими как натрий, калий, литий, кальций, магний, аммоний и алкиламмоний.

Основные азотсодержащие группы могут быть кватернизованы таким агентами, как низший алкилгалогенид, такой как метил-, этил-, пропил- и бутилхлориды, -бромиды и -иодиды, диалкилсульфаты, подобные диметил- и диэтилсульфату, и другими.

Также следует иметь в виду, что эпокситиглиановые соединения могут обладать асимметричными центрами и поэтому способны существовать в более чем одной стереоизомерной форме. Таким образом, изобретение также относится к соединениям в по существу чистой изомерной форме по одному или нескольким асимметричным центрам, например с более примерно 90% эи, таким как примерно 95% или 97% эи или свыше 99% эи, а также в виде смесей, включая их рацемические смеси. Такие изомеры можно получить выделением из природных источников, асимметричным синтезом, например с использованием хиральных промежуточных соединений, или путем хирального расщепления. Соединения по изобретению могут существовать в виде геометрических изомеров. Изобретение также относится к соединениям в по существу чистых цис (Z) или транс (E) формах или их смесях.

Соединения по настоящему изобретению можно получить путем выделения из растения или части растения или путем дериватизации выделенного соединения или путем дериватизации родственных соединений. Процедуры выделения и процедуры дериватизации можно найти в WO 2007/070985 и WO 2014/169356.

Термин эпокситиглиановое соединение относится к соединению, имеющему следующую основную углеродную циклическую структуру:

Эти соединения имеют трицикло[9.3.0.0]тетрадекановую систему с конденсированным циклопропановым циклом, прикрепленным к шестичленному циклу. Эпоксид конденсирован с семичленным циклом в положении 6, 7.

Одним примером эпокситиглианового соединения является эпокситиглиен-3-оновое соединение. Термин эпокситиглиен-3-оновое соединение относится к соединению, имеющему эпокситиглиановую структуру, определенную выше, где пятичленный цикл имеет 1,2-ен-3-оновую структуру:

Используемый в настоящем описании термин сторонняя опухоль относится к опухоли отличной от той опухоли, которую лечат эпокситиглиановым соединением. Сторонняя опухоль может представлять собой первичную опухоль или метастатическую опухоль.

Термин в комбинации с, используемый в настоящем изобретении, относится к эпокситиглиановому соединению и ICI, вводимым в единой композиции или по отдельности, либо одновременно, либо последовательно. Эпокситиглиановое соединение и ICI можно вводить в различное время и с различной частотой, но в комбинации они проявляют биологическое действие в одно и то же время или в перекры- 4 044756 вающиеся промежутки времени. Например, ICI вводят так, чтобы он оказывал действие на иммунный ответ, когда вводят эпокситиглиановое соединение.

Способы лечения.

Настоящее изобретение относится к способам лечения опухолей, включая сторонние опухоли, причем этот способ включает введение вышеуказанного эпокситиглианового соединения в комбинации с вышеуказанным ингибитором контрольной точки иммунитета (ICI). Изобретение также относится к способам предупреждения сторонних опухолей, включающим введение вышеуказанной эпокситиглианового соединения или его фармацевтически приемлемой соли в комбинации с вышеуказанным ICI.

В некоторых вариантах осуществления опухоль, которую лечат, представляет собой опухоль, в которую эпокситиглиановое соединение может быть доставлено локализованным образом непосредственно в опухоль. В отдельных вариантах осуществления опухоль представляет собой опухоль кожи или подкожную опухоль или опухоль, которая доступна с наружной стороны тела, например опухоль, которая пальпируется. В других вариантах осуществления опухоль представляет собой внутреннюю опухоль. В некоторых вариантах осуществления, где опухоль расположена внутри, локализованная доставка достигается во время операции, когда опухоль обнажена, и можно инъецировать эпокситиглиановое соединение. В других вариантах осуществления опухоль расположена внутри, и эпокситиглиановое соединение доставляется посредством инъекции, сопровождаемой использованием метода визуализации, например, эндоскопического ультразвукового исследования или стереотаксической визуализации.

В некоторых вариантах осуществления опухоль представляет собой доброкачественную опухоль. В других вариантах осуществления опухоль представляет собой злокачественную опухоль. В некоторых вариантах осуществления опухоль представляет собой первичную опухоль, и в других вариантах осуществления опухоль представляет собой метастатическую опухоль. Примеры кожных опухолей включают себорейный кератоз, актиничный кератоз, базальноклеточную карциному (BCC), включая нодулярную BCC, поверхностную BCC, инфильтрирующую BCC и микронодулярную BCC, плоскоклеточную карциному, включая плоскоклеточную карциному in-situ и инвазивную плоскоклеточную карциному, меланому, включая поверхностно-распространяющуюся меланому, нодулярную меланому, меланому типа злокачественного лентиго и диспластическую/нейротропную меланому, подкожную B-клеточную лимфому и подкожную Т-клеточную лимфому. Примеры подкожных опухолей включают ангиокератому, пиогенную гранулему, сенильную гемангиому, гломусную опухоль, ангиосаркому, саркому Капоши, саркому Юинга, злокачественную фиброзную гистиоцитому, лейомиосаркому, рабдомиосаркому, липосаркому, синовиальную саркому, стромальную саркому, гастроинтестинальную стромальную саркому, злокачественную опухоль периферического периневрия, примитивную нейроэктодермальную опухоль, нейрофиброму, карциному из клеток Меркеля, дерматофиброму, фибросаркому, эпителиоидную саркому и мастоцитому (тучноклеточную опухоль).

Внутренняя опухоль может представлять собой любую опухоль, которая доступна для инъекции во время операции или направляемой инъекции, или опухоль, которую можно лечить системно введением эпокситиглиана, и включает опухоли головного мозга, легких, толстой кишки, эпидермоида, плоскоклеточные, мочевого пузыря, желудка, поджелудочной железы, молочной железы, головы, шеи, почечной системы, почек, печени, яичников, предстательной железы, матки, пищевода, яичка, шейки матки, влагалища, щитовидной железы или кожи.

Сторонняя опухоль может представлять собой любую опухоль, отличную от опухоли, которую лечат эпокситиглиановым соединением. Например, сторонняя опухоль может представлять собой вторую опухоль кожи или подкожную опухоль, или она может представлять собой опухоль другого органа или ткани. Примеры сторонних опухолей включают опухоли головного мозга, легких, толстой кишки, эпидермоида, плоскоклеточные, мочевого пузыря, желудка, поджелудочной железы, молочной железы, головы, шеи, почечной системы, почек, печени, яичников, предстательной железы, матки, пищевода, яичка, шейки матки, влагалища, щитовидной железы или кожи.

В некоторых вариантах осуществления сторонняя опухоль представляет собой другую первичную опухоль, а в других вариантах осуществления сторонняя опухоль представляет собой метастатическую опухоль.

В некоторых вариантах осуществления опухоль, которую лечат эпокситиглиановым соединением, представляет собой первичную опухоль, а сторонняя опухоль представляет собой метастатическую опухоль. В некоторых вариантах осуществления опухоль, которую лечат эпокситиглиановым соединением, представляет собой метастатическую опухоль, а сторонняя опухоль представляет собой первичную опухоль. В некоторых вариантах осуществления как опухоль, которую лечат эпокситиглиановым соединением, так и сторонняя опухоль являются первичными опухолями. В некоторых вариантах осуществления как опухоль, которую лечат эпокситиглиановым соединением, так и сторонняя опухоль являются метастатическими опухолями.

В некоторых вариантах осуществления комбинированная терапия предупреждает появление сторонней опухоли или задерживает появление сторонней опухоли. В некоторых вариантах осуществления комбинированная терапия уменьшает размер сторонней опухоли.

- 5 044756

Эпокситиглиановые соединения.

В контексте настоящего изобретения эпокситиглиановое соединение представляет собой соединение формулы (I) или его геометрический изомер или стереоизомер или фармацевтически приемлемую соль

R1 представляет собой водород или С_1-6-алкил;

R2 представляет собой -OH или -OR9;

R₃ представляет собой -OH или -OR9;

R₄ и R₅ выбирают независимо из водорода и С_1-6-алкила;

R6 представляет собой водород или -R₁₀;

R7 представляет собой гидрокси или OR₁₀;

R8 представляет собой водород или С_1-6-алкил;

R9 представляет собой -C_1-20-алкил, -С_2-20-алкенил, -С_2-20-алкинил, -C(O)C_1-20-алкил, -С(О)С_2-20алкенил, -С(O)С_2-20-алкинил, -С(О)-С_3-6-циклоалкил, -С(O)C_1-10-алкил-C_3-6-циклоалкил; -С(О)С₂-юалкенил-С_3-6-циклоалкил, -С(О)С_2-10-алкинил-С_3-6-циклоалкил, -С(О)-арил, -С(O)C_1-10-алкиларил, -С(O)C_2-10-алкениларил, -С(O)C_2-10-алкиниларил, -C(O)C_1-10-алкил-C(O)R₁₁, -C(O)C_2-10-алкенил-C(O)R₁₁, -С(o)c_2-10-алкинил-С(О)R₁₁, -C(O)C_1-10-алкил-CH(OR₁₁)(OR₁₁), -С(О)C_2-10-алкенил-CH(OR₁₁)(OR₁₁), -C(O)C₂.₁₀-алкuнил-CH(OR₁₁)(OR₁₁), -С(O)C₁.₁₀-αлкuл-SR₁₁, -С(О)C₂._1O-алкенил-SR₁₁, -C(O)C_2-10-алкинилSR11, -C(O)C_1-10-алкил-C(O)0R₁₁, -С(O)C_2-10-алкенил-C(O)OR₁₁, -C(O)C_2-10-алкинил-C(O)OR₁₁, -C(O)C_1-10αлкил-C(O)SR₁₁, -С(О)C₂.₁₀-алкенил-C(O)SR₁₁,-С(О)C₂.₁₀-алкuнил-С(o)SR₁₁,

А Я ⁰

С(О)С-|.₁₀алкил _R11 , или ' ' И ;

R₁₀ представляет собой -С_1-6-алкил, -С_2-6-алкенил, -С_2-6-алкинил, -C(O)C_1-6-алкил, -С(О)С_2-6-алкенил, -С(О)С_2-б-алкинил, -С(О)-арил, -С(О)С_1-б-алкиларил, -С(O)С_2-6-алкениларил или -С(О)С_2-б-алкиниларил; и

R11 представляет собой водород, -С_1-10-алкил, -С_2-б—алкенил, -С_2-10-алкинил, С_3-6-циклоалкил или арил;

где термин арил при использовании в вышеуказанных значениях радикалов означает С₆-С₁₄членную моноциклическую, бициклическую или трициклическую карбоциклическую систему, имеющую до 7 атомов в каждом цикле, причем по меньшей мере один цикл является ароматическим.

В некоторых вариантах осуществления эпокситиглиановое соединение формулы (I) представляет собой соединение формулы (II)

- 6 044756 или его геометрический изомер или стереоизомер или фармацевтически приемлемую соль, где в указанной формуле R₆, R7 и R9 имеют значения, указанные для формулы (I).

В отдельных вариантах осуществления формул (I) или (II) применимо одно или несколько определений из следующих:

R1 представляет собой -C₁.₃-алkил, в частности -CH₃;

R2 представляет собой -ОС(O)C₁.₂o-алкил, -ОС(O)С₂.₂₀-алκенил, -ОС(О)С₂.₂₀-алкинил, -ОС(О)-С₃-₆циклоалкил, -ОC(O)C_1-10-алкил-C_3-6-циклоалкил; -ОС(О)С_2-6-алкенил-С_3-6-циклоалкил, -ОС(О)С_2-10алкинил-С_3-6-циклоалкил, -ОС(О)-арил, -ОС(O)C_1-10-алкиларил, -ОС(O)C_2-10-алкениларил, -ОС(О)С_2-10алкиниларил, -OC(O)C_1-10-алкил-C(O)R₁₁, -ОС(О)C_2-10-алкенил-С(О)R₁₁, -ОС(О)C_2-10-алкинил-C(O)R₁₁, -OC(O)С_1-10-алкил-Сн(OR₁₁)(OR₁₁), -ОС(О)C_2-10-алкенил-CH(OR₁₁)(OR₁₁), -ОC(O)C_2-10-алкинилCH(0Rh)(ORh), -0c(O)C_1-10-алкил-SR₁₁, -ОC(О)C_2-10-алкенил-SR₁₁, -OC(O)C_2-10-алкинил-SR₁₁, -OC(O)C_1-10-алкил-C(O)OR₁₁, -OC(O)C_2-10-алкенил-C(o)OR₁₁, -OC(O)C_2-10-алкинил-C(o)OR₁₁, -ОС(О)С₁₁₀-алкил-C(O)SR₁₁, -ОС(О)C_2-10-алкенил-С(О)SR₁₁ или -ОC(О)C₂.lo-αлkuнилилил-C(О)SRll; в особенности -ОС(O)С_1-20-алкил, -ОС(O)С_2-20-алкенил, -ОС(О)С_2-20-алкинил, -ОС(О)циклоалкил, -ОС^Сь^алкилциклоалкил; -ОС(O)C_2-10-алкенилциклоалкил, -ОС(О)С_2-10-алкинилциклоалкил или -ОС(О)арил; особенно -ОС(O)C_1-20-алкил, -ОС(O)С_2-20-алкенил или -ОС(О)С_2-20-алкинил;

R₃ представляет собой -ОС(O)C_1-20-αлкил, -ОС(O)С_2-20-алкенил, -ОС(O)С_2-20-алкинил, -ОС(О)-С_3-6циклоалкил, -ОC(O)C_1-10-алкил-C_3-6-циклоалкил; -ОС(О)С_2-10-алкенил-С_3-6-циклоалкил, -ОС(О)С_2-10-алкинил-С_3-6циклоалкил, -ОС(О)-арил, -ОС(O)C_1-10-алкиларил, -ОС(O)C_2-10-алкениларил, -ОС(О)С_2-10-алкиниларил, -OC(O)C₁.₁₀-алкuл-C(0)R₁₁, -OC(O)C_2-10-алкенил-C(O)R₁₁, -0C(О)C_2-10-алкинил-C(O)R₁₁, -OC(O)C_1-10-алкилCH(OR_n)(OR_n), -ОС(О)C2-1o-алкенил-CH(OR_π)(OR_π), -OC(O)C2-1o-алкинил-СН(OR_π)(OR_π), -OC(O)C1-1o-алкилSR11, -ОC(О)C_2-10-алкенил-SR₁₁, -ОC(О)C_2-10-алкинил-SR₁₁, -ОC(O)C_1-10-алкил-C(O)0R₁₁, -OC(o)c_2-10-алкенилC(O)OR11, -OC(O)C_2-10-алкинил-С(O)OR₁₁, -ОC(O)C_1-10-алкил-C(0)SR₁₁, -OC(0)С_2-10-алкенил-C(O)SR₁₁ или -OC(O)C_2-10-алкенил-C(O)SR₁₁; особенно -ОC(O)C_1-20-алкил, -ОC(O)C_2-20-алкенил, -ОС(О)С_2-20-алкинил, -ОС(О)циклоалкил, -ОC(O)C_1-10-алкилциклоалкил; -ОC(O)C_2-10-алкенилциклоалкил, -ОС(О)С_2-10-алкинилциклоалкил или -ОС(О)-арил; особенно -ОC(O)C_1-20-алкил, -ОC(O)C_2-20-алкенил или -ОС(О)С_2-20-алкинил;

R₄ и R₅ выбирают независимо из -С_1-3-алкила, в частности -CH₃;

R₆ представляет собой водород, -С(О)С_1-6-алкил, -С(О)С_2-6-алкенил, -С(О)С_2-6-алкинил или -С(О)арил; особенно водород, -С(О)С_1-3-алкил, -С(О)С_2-3-алкенил или -С(О)С_2-3-алкинил, особенно водород или -С(О)СН₃;

R7 представляет собой гидроксил, -ОС(О)С_1-6-алкил, -ОС(О)С_2-6-алкенил или -ОС(О)С_2-6-алкинил, особенно гидроксил, -ОС(О)С_1-3-алкил, -ОС(О)С_2-3-алкенил или -ОС(О)С_2-3-алкинил, особенно гидроксил или -ОС(О)СН₃; и

R8 представляет собой -С_1-3-алкил, в частности -CH₃.

В некоторых вариантах осуществления соединения формул (I) и/или (II) обладают стереохимией, как показано ниже в формуле (III)

В некоторых вариантах осуществления эпоксид в положении 6,7 находится над плоскостью циклической системы. В других вариантах осуществления эпоксид в положении 6,7 находится под плоскостью циклической системы. В некоторых вариантах осуществления группа R2 в положении 12 представляет собой S, а в других вариантах осуществления группа R2 в положении 12 представляет собой R.

В отдельных вариантах осуществления эпокситиглиановое соединение выбирают их группы, включающей

12-тиглоил-13-(2-метилбутаноил)-6,7-эпокси-4,5,9,12,13,20-гексагидрокси-1-тиглиен-3-он (соединение 1);

12,13 -ди(2-метилбутаноил)-6,7-эпокси-4,5,9,12,13,20-гексагидрокси-1 -тиглиен-3-он (соединение 2);

12-гексаноил-13 -(2-метилбутаноил)-6,7-эпокси-4,5,9,12,13,20-гексагидрокси-1 -тиглиен-3 -он (соединение 3) и

- 7 044756

12,13 -дигексаноил-6,7-эпокси-4,5,9,12,13,20-гексагидрокси-1 -тиглиен-3-он (соединение 4).

Ингибитор контрольной точки иммунитета (ICI).

ICI может представлять собой любую молекулу, которая ингибирует белки иммунной клетки или раковых клеток, блокирующие иммунные ответы иммунной клетки, в частности, в случае, когда иммунная клетка представляет собой Т-клетку или клетку естественный киллер (NK-клетку). В частности, ICI может представлять собой антагонист PD-1 или CTLA-4. В контексте настоящего изобретения вышеказанный антагонист представляет собой антитело протии белка контрольной точки иммунитета, выбранное из анти-PD-1 антитела или анти-CTLA-4 антитела.

Композиции.

Хотя эпокситиглиановые соединения или их фармацевтически приемлемые соли и ICI можно вводить в чистом виде, может быть удобно вводить эпокситиглиановые соединения и ICI в форме одной или нескольких фармацевтических композиций, каждая из которых вводится с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем и/или эксципиентом.

Лекарственную форму и дозы для фармацевтического применения и композиций может легко определить специалист в данной области техники.

В отдельных вариантах осуществления эпокситиглиановое соединение включают в состав для введения непосредственно на или в опухоль, которую лечат. В некоторых вариантах осуществления эпокситиглиановое соединение включают в состав для топического введения в форме геля, мази, лосьона, крема или трансдермального пэтча, которые можно нанести непосредственно на опухоль, которую лечат. В других вариантах осуществления эпокситиглиановое соединение включают в состав для инъекции, в частности интратуморальной инъекцией, когда соединение инъецируют в одно или несколько мест опухоли.

ICI можно вводить любым способом, который способен доставить молекулу системно или локально. В отдельных вариантах осуществления, когда ICI представляет собой антитело, молекулу обычно доставляют инъекцией, например внутривенной, интраартикулярной, внутримышечной, подкожной или интраперитонеальной инъекцией. ICI также может быть включен в состав для локальной доставки посредством инъекции, например интратуморально. В композиции ICI также могут быть включены фармацевтически приемлемые носители и приемлемые носители для системного или локального введения.

Эпокситиглиановое соединение и ICI могут доставляться по отдельности или одновременно или последовательно. Эпокситиглиановое соединение и ICI могут доставляться в единой композиции, например в одной композиции, подходящей для интратуморальной доставки.

В настоящем описании также раскрыта фармацевтическая композиция, включающая эпокситиглиановое соединение или его фармацевтически приемлемую соль и ингибитор контрольной точки иммунитета необязательно вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями.

В подходящем варианте фармацевтическая(ие) композиция(ии) включает(ют) фармацевтически приемлемый или приемлемый эксципиент. Фармацевтически приемлемым эксципиентом называют твердый или жидкий наполнитель, разбавитель или инкапсулирующее вещество, которые можно использовать безопасно. В зависимости от конкретного пути введения можно использовать различные носители, хорошо известные в технике. Эти носители или эксципиенты можно выбрать из группы, включающей сахара, крахмалы, целлюлозу и ее производные, циклодекстрины, солод, желатин или другие желирующие агенты, полимеры, тальк, сульфат кальция, растительные масла, синтетические масла, спирты и/или полиолы, альгиновую кислоту, забуференные фосфатом растворы, эмульгаторы, изотонический физиологический раствор и апирогенную воду.

Препараты в жидкой форме включают растворы, суспензии и эмульсии, например водные растворы или растворы в смесях вода/пропиленгликоль. Например, жидкие препараты для парентеральной инъекции можно получить в виде растворов в водном 1,2-пропандиоле, диметилсульфоксиде (ДМСО), водных растворах гамма-циклодекстрина или 2-гидроксипропил-бета-циклодекстрина, в физиологическом растворе или растворе полиэтиленгликоля, с добавлением буфера или без него. Предпочтительный интервал pH составляет 3,0-4,5. Подходящие буферы буферируют препарат при pH 3,5-4,5 и включают (без ограничения) ацетатный буфер и цитратный буфер.

Таким образом, композиции эпокситиглианового соединения и/или ICI могут быть получены для парентерального введения (например, инъекцией, например болюсной инъекцией или длительной инфузией) и могут быть представлены в стандартной лекарственной форме в ампулах, предварительно заполненных шприцев, инфузии небольшого объема или в многодозовых контейнерах с добавлением консерванта. Композиции могут принимать такие формы, как суспензии, растворы, гели или эмульсии в масляных или водных средах, и могут содержать вспомогательные вещества, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты. С другой стороны активный ингредиент может находиться в форме порошка, полученного асептическим выделением стерильного твердого вещества или лиофилизацией из раствора, для получения состава с подходящей средой, например стерильной апирогенной водой, перед применением.

Фармацевтические композиции эпокситиглианового соединения и/или ICI, подходящие для введения, могут быть представлены в дискретных единицах, таких как шприцы, флаконы, тубы или саше, при- 8 044756 чем каждая содержит предварительно заданное количество одного или нескольких фармацевтически активных соединений или экстрактов по изобретению, в виде порошка или гранул или в виде раствора или суспензии в водной жидкости, растворе циклодекстрина, неводной жидкости, эмульсии масло-в-воде или вода-в-масле или в виде раствора или суспензии в креме или геле или в виде суспензии микро- или наночастиц, включающих эпокситиглиановое соединение, включающих (без ограничения) микро- или наночастицы диоксида кремния или полилактида. Такие композиции можно получить любым фармацевтическим методом, но все эти методы включают стадию приведения в контакт одного или нескольких фармацевтически активных соединений по изобретению с носителем, который состоит из одного или нескольких необходимых ингредиентов. Как правило, композиции получают путем равномерного и тщательно смешивания агентов по изобретению с жидкими носителями или тонкоизмельченными твердыми носителями или теми и другими, с последующим, при необходимости, приданием продукту нужной формы.

Для топического введения на эпидермис или другой орган соединения по изобретению можно получать в виде гелей, мазей, эмульсий, паст, кремов или лосьонов или в виде трансдермального пэтча. Гели можно получать с использованием подходящих загустителей и добавления их в водные/спиртовые композиции соединения. Подходящие загустители или желирующие агенты известны в уровне технике, например поливинилкарбоксиполимер карбомер 940. Мази и кремы можно получать, например, на водной или масляной основе с добавлением подходящих загустителей и/или желирующих агентов. Лосьоны можно получать на водной или масляной основе, и как правило, они также будут содержать один или больше эмульгаторов, стабилизаторов, диспергаторов, суспендирующих агентов, загустителей или красителей.

Составы, подходящие для топического введения, также включают растворы или суспензии, которые можно наносить топически в форме раствора для ванн или замачивания или спрея, или которые могут абсорбироваться перевязочным материалом.

Когда ICI представляет собой небольшую молекулу, его можно доставить любыми подходящими способами, включая пероральный, топический, ректальный, парентеральный, сублингвальный, трансбуккальный, внутривенный, интраартикулярный, внутримышечный, интрадермальный, подкожный, ингаляцию, внутриглазное введение, интарперитонеальный, интрацеребровентрикулярный, трансдермальный и подобные способы, известные в данной области техники или в фармацевтике.

Схемы приема.

В некоторых вариантах осуществления эпокситиглиановое соединение доставляется в той же композиции, что и ICI. Однако, в некоторых вариантах осуществления ICI вводят в отдельной композиции отдельно от эпокситиглианового соединения.

В некоторых вариантах осуществления эпокситиглиановое соединение вводят непосредственно в опухоль, например топическим введением или интратуморальной инъекцией.

В некоторых вариантах осуществления эпокситиглиановое соединение вводят в опухоль один раз. В других вариантах осуществления осуществляют мониторинг обработанной опухоли, и, если требуется, дополнительно вводят эпокситиглиановое соединение, если опухоль не полностью реагирует на лечение. В вариантах осуществления, где опухоль лечат топически, эпокситиглиановое соединение в некоторых случаях может вводиться в течение некоторого периода времени, например ежедневно в течение недели или один раз в неделю в течение до 10 недель. Специалист в данной области техники, наблюдающий субъекта, которого лечат, сможет определить соответствующую схему приема лекарства, которая может меняться в зависимости от отклика на лечение.

В некоторых вариантах осуществления ICI вводят по меньшей мере один раз перед, одновременно или после эпокситиглианового соединения. В некоторых вариантах осуществления несколько доз ICI вводят в течение периода времени, начиная до или одновременно с введением эпокситиглианового соединения и затем продолжая после введения эпокситиглианового соединения.

В некоторых вариантах осуществления ICI вводят более одного раза и на регулярной основе до и после введения эпокситиглианового соединения. В некоторых вариантах осуществления ICI вводят до введения эпокситиглианового соединения, последовательно или одновременно с введением эпокситиглианового соединения и по меньшей мере один раз после введения эпокситиглианового соединения. Например, ICI можно вводить за период от 1 недели до 1 дня до введения эпокситиглианового соединения, в частности, за 1-3 дня и особенно приблизительно за 2 дня до введения эпокситиглианового соединения, затем ICI вводят последовательно или одновременно с эпокситиглиановым соединением или непосредственно перед или непосредственно после введения эпокситиглианового соединения, затем ICI вводят один или больше раз в течение следующего месяца после эпокситиглианового соединения, например один раз в неделю, один раз каждые 5 дней, один раз каждые 4 дня, один раз каждые 3 дня, один раз каждые 2 дня или каждый день, в частности каждые 1-3 дня, особенно каждые 2 дня. Последовательное введение ICI может продолжаться, так что после введения эпокситиглианового соединения вводят 1-10 доз ICI, в частности 1-8 доз, 1-6 доз, 1-4 дозы, 1-3 дозы или 1-2 дозы.

В одном варианте осуществления ICI вводят за 2 дня до введения эпокситиглианового соединения, последовательно (непосредственно перед или непосредственно после) с эпокситиглиановым соединением, и затем каждые два дня в течение 6 дней после введения эпокситиглианового соединения.

- 9 044756

Эпокситиглиановое соединение вводят в эффективном количестве. Эффективное количество означает количество, необходимое для по меньшей мере частичного достижения желаемого отклика, например для уменьшения размера опухоли или для разрушения опухоли вообще. Это количество меняется в зависимости от состояния здоровья и физического состояния индивидуума, которого лечат, таксономической группы индивидуума, которого лечат, состава композиции, размера опухоли, оценки медицинской ситуации и других релевантных факторов. Ожидается, что это количество будет попадать в относительно широкий диапазон, который можно определить рутинными исследованиями. Эффективное количество, например, может лежать в диапазоне от примерно 0,1 нг на 1 кг массы тела до 1 г на 1 кг массы тела на дозировку. Дозировка предпочтительно находится в диапазоне 1 мкг - 0,5 г на 1 кг массы тела на дозировку, например в диапазоне 0,1 мкг - 100 мг на 1 кг массы тела на дозировку. В одном варианте осуществления, где дозу вводят интратуморально, дозировка находится в диапазоне 50 нг - 100 мг на 1 кг массы тела, например 0,1 мг - 5 мг на 1 кг массы тела, 0,1-1 мг/кг массы тела, например 0,25 мг/кг массы тела. В другом варианте осуществления дозировка находится в диапазоне 0,001 мг - 20 мг на дозу, например 0,005 мг - 15 мг на дозу, в частности 0,05 - 10 мг на дозу, особенно примерно 0,1 - примерно 5 мг на дозу. Схемы приема лекарства могут быть подогнаны для получения оптимального терапевтического ответа. Например, в некоторых вариантах осуществления, где введение является интратуморальным, эпокситиглиановое соединение вводят один раз и контролируют прогресс лечения. В некоторых вариантах осуществления, если опухоль не разрушилась полностью или если опухоль рецидивирует, может быть введена вторая доза. В некоторых вариантах осуществления, где введение является топическим, топический состав соединения можно вводить непосредственно на место опухоли в форме геля, крема, мази или лосьона. Частота обработки будет зависеть от опухоли, ее размера, субъекта, которого лечат, и т.п. В некоторых вариантах осуществления топический препарат можно наносить еженедельно до тех пор, пока опухоль не разрушится. В других вариантах осуществления лечение может представлять одну обработку, и вторую обработку назначают только если опухоль не разрушилась полностью.

ICI также можно вводить в эффективном количестве. Здесь количество ICI, считающееся эффективным, также будет зависеть от субъекта, которого лечат, состояния его здоровья и физического состояния, числа имеющихся сторонних опухолей, состава композиции и оценки медицинской ситуации. Ожидается, что количество ICI будет попадать в довольно широкий диапазон. Эффективное количество может лежать в диапазоне от примерно 0,1 нг/кг до примерно 500 мг/кг массы тела, 100 мкг/кг- 100 мг/кг массы тела, 1 мг/кг - 50 мг/кг массы тела, 1 мг/кг - 20 мг/кг массы тела. В другом варианте осуществления фактические дозировки могут находиться в диапазоне от 1 мкг до 1 г, например, 100 мкг - 750 мг на дозу.

Субъект, которого можно лечить комбинированной терапией, представляет собой млекопитающее, птицу, водное животное, такое как рыба, или рептилию. В некоторых вариантах осуществления субъектом является человек, лабораторное животное, такое как мышь, крыса или кролик, домашнее животное, такое как собака или кошка, рабочее животное, такое как лошадь, осел и т.п., домашний скот, такой как корова, буйвол, свинья, овца, коза, олень, лама, альпака и т.п., или содержащиеся в неволи дикие животные, такие как животные в зоопарках или парках дикой природы, включая львов, леопардов, гепардов, слонов, зебр, антилоп, жирафов, коал, кенгуру, и рептилий, таких как крокодилы, ящерицы, змеи и т.п., птиц, таких как волнистый попугайчик или канарейка, какаду, длиннохвостый попугай, ара, попугай и т.п., или рыба, такая как тропическая рыба (рыба-зебра, гуппи, сиамская бойцовая рыбка, рыба-клоун, тетра-кардинал и т.п.), дельфины, киты и т.п. В отдельных вариантах осуществления субъектом является человек или домашнее животное.

Наборы.

Композиции эпокситиглианового соединения и ICI могут быть составлены отдельно и продаваться вместе в наборе или упаковке. Каждый набор может включать дозировки каждого соединения для достижения лечения опухоли и лечения или предупреждения одной или нескольких сторонних опухолей.

В некоторых вариантах осуществления эпокситиглиановое соединение входит в композицию для топического введения, такую как гель, лосьон, крем или мазь или пропитанный перевязочный материал. В других вариантах осуществления эпокситиглиановое соединение входит в композицию для инъекции, такой как интратуморальная инъекция. В этом варианте осуществления эпокситиглиановый препарат может присутствовать в наборе в виде жидкости, готовой для набора в шприц, в виде порошка или твердого препарата, который можно растворить в носителе перед инъекцией, или может присутствовать в наборе в предварительно наполненном шприце.

Каждый набор может включать одну или несколько доз эпокситиглианового соединения. В одном варианте осуществления набор будет содержать одну дозу эпокситиглианового соединения в препарате, подходящем для интратуморальной инъекции. В другом варианте осуществления набор будет содержать топический препарат эпокситиглианового соединения, содержащий несколько доз для нанесения на опухоль.

В некоторых вариантах осуществления ICI входит в препарат для парентерального введения в форме одной болюсной дозы или многодозовой форме. Например, набор может содержать ICI в предварительно наполненном шприце, в виде жидкости во флаконе, готовой для загрузки в шприц, или в виде

- 10 044756 твердого вещества, готового для растворения перед загрузкой в шприц. Жидкие или твердые препараты могут представлять собой однодозовые препараты или многодозовые препараты. С другой стороны, набор может содержать несколько доз ICI, каждая составленная отдельно в предварительно наполненном шприце, в виде жидкости во флаконе, готовой к загрузке в шприц, или в виде твердого вещества, готового для растворения и загрузки в шприц.

Набор может дополнительно включать вкладыш с инструкцией по применению каждого препарата, включая инструкцию по получению каждой дозы, если требуется, инструкцию, как вводить каждую дозировку и когда вводить каждую дозировку.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 показывает А - изображения транслокации PKC-α, -βΠ, -γ, -δ и -θ после обработки средой (ср.) или 500 нМ соединения 1 (соед. 1), соединения 3 (соед. 3) и РМА. Эти изображения также используют для количественного анализа, показанного на В. В -тепловая карта, отображающая профиль транслокации изоформ PKC (-α, -βΤ, -βΠ, -γ, -δ, -θ, -η и -ζ - средний % клеток, показывающих транслокацию EGFP к плазматической мембране) в ответ на 500, 50 и 5 нМ соединения 1 и указанных аналогов. Подсчитано >150 клеток на биологическую репликацию, n=3.

Фиг. 2 показывает А - схему эксперимента. В: отобранные цитокины/хемокины хозяина с ролями в рекрутменте лейкоцитов индуцированы обработкой соединением 1 (30 мкг). Показана кратность изменений в экспрессии генов указанных цитокинов/хемокинов. С: получают тепловую карту после сравнения данных по профилям интенсивности экспрессии генов как для среды, так и для соединения 1 при t=8 ч. Последующие списки генов анализируют с использованием Ingenuity Pathway Analysis (IPA; Qiagen) для идентификации путей, затрагиваемых обработкой соединением 1.

Фиг. 3 показывает А - высвобождение LDH из линий раковых клеток, обработанных соединением 1. А431, ММ649 и B16-OVA обрабатывают соединением 1 в указанных концентрациях или только средой (ср.), и высвобожденный LDH анализируют со временем с использованием набора для анализа на цитотоксичность Pierce LDH. n=3. В. Соединение 1 индуцирует значительное снижение уровней внутриклеточного АТФ. Снова клетки обрабатывают соединением 1 или средой (ср.), и анализируют уровни внутриклеточного АТФ в указанные моменты времени с использованием набора для анализа CellTiter-Glo 2®. n=3.

Фиг. 4 показывает А - определение высвобождения АТФ из линий раковых клеток в ответ на обработку соединением 1. Клетки обрабатывают соединением 1 или средой (ср.) в течение указанного времени, и высвобождение АТФ из супернатантов клеточных культур анализируют с использованием набора для анализа биолюминесценции на основе АТФ. Определяют средние величины RLU ±S.D., и строят график зависимости от времени. n=4. В. Другие эпокситиглиановые аналоги (соединение 2: Bi, соединение 3: Bii, и соединение 4: Biii) также промотируют высвобождение АТФ из клеточных линий А431, ММ649 и B16-OVA. n=4. С. Определение высвобождения HMGB1 из линий раковых клеток, обработанных соединением 1 и эпокситиглиановыми аналогами. Супернатанты клеточных культур из обработанных эпокситиглианом или средой (ср.) А431 (Ci), MM649 (Cii) или B16-OVA (Ciii) анализируют на высвобождение HMGB1 методом ELISA. Величины для клеток, обработанных соединением 1, нормализуют к клеткам, обработанным средой, для определения кратности усиления высвобождения HMGB1. n=2 для А431 и ММ649, в то время как n=3 для В16-OVA. (Civ) Высвобождение HMGB1 также происходит в ответ на обработку соединением 2, 3 и 4. n=3. D. Соединение 1 промотирует экстернализацию кальретикулина в ряде линий раковых клеток. А431 (Di), MM649 (Dii) и В16-OVA (Diii) обрабатывают соединением 1 или только средой (ср.) в указанное время и затем перед проточной цитометрией окрашивают антикальретикулиновым/антикроличьим Alexa 488. Показывают средние величины интенсивности флуоресценции (экст. 488 нм, исп.530/530 нм) ±S.D. для каждого момента времени.

Фиг. 5 показывает А и В. Обработанные эпокситиглианом клетки процессируют CD11c⁺ BMDCs in vitro. Меченные CMFDA клетки B16-OVA, обработанные соединением 1 или средой (ср.), инкубируют с незрелыми BMDC в течение 4 ч и затем перед проточной цитометрией окрашивают анти-CD11c-APC. Темно-серый прямоугольник - клетки CD11c⁺ BMDC. Заштрихованный темный прямоугольник -CD11c⁺BMDC, которые имеют окрашенные фрагменты клеток B16-OVA (CD11c⁺ CMFDA_mid). Процент клеток CD11c⁺ CMFDAmjd показан на 5А, и результат 4 биологических репликаций показан на фиг. 5В. n=4. С. Аналоги эпокситиглиана также индуцируют поглощение клеток B16-OVA CD11c⁺ BMDC. Отображены данные, полученные при использовании соединений 2, 3 и 4. n=3.

Фиг. 6 показывает А - схему экспериментального подхода для комбинаций соединения 1 и ICI. Все опухоли инъецированы либо 15/30 мкг соединения 1, либо средой (ср.). Также отображена схема обработки ICI. В и С. Графики Каплана-Мейера, показывающие % обработанных опухолей, которые остаются размером ниже 100 мм³ в различных условиях обработки ICI, с или анти-PD-1 (фиг. 6В) или антиCTLA-4 (фиг. 6С). Также отображено выживание мышей в ответ на комбинацию.

Фиг. 7 показывает А - принципиальную схему подхода с комбинированной терапией: индекс и сторонняя опухоль показаны вместе со схемой приема лекарства; и В - графические представления результатов комбинированной терапии (объемы опухолей). Антитело изотипа + соединение 1 (линия из точек),

- 11 044756 анти-PD-l антитело или aHTu-CTLA-4 антитело + среда (пунктирная линия) и анти-PD-l антитело или aHTu-CTLA-4 антитело + соединение 1 (сплошная линия) в опухолях, которые лечат (светлые кружочки), и сторонних опухолях (черные кружочки).

Фиг. 8 показывает как объемы (левая панель), так и анализы опухолей по Каплану-Мейеру (правая панель) (% опухолей < 100 мм³), инъецированных субоптимальной дозой соединения 1 (15 мкг) в диком и нокаутированном фенотипах GCSF.

Примеры

Соединения по настоящему изобретению можно получить выделением из растения или части растения или путем дериватизации выделенного соединения или путем дериватизации родственного соединения. Процедуры выделения и процедуры дериватизации можно найти в WO 2007/070985 и WO2014/169356.

Соединение 6 - 20-ацетилпроизводное соединения 1 можно получить из соединения 1 ацетилированием уксусным ангидридом (1 эквив.) в присутствии триэтиламина в дихлорметане. Такие условия дают селективное ацетилирование С-20 гидроксигруппы без ацетилирования других гидроксигрупп.

Соединение 10, хотя в WO2014/169356 не синтезировано в явном виде, можно получить с использованием общего метода получения несимметричных эфиров, представленного в примере 1 WO2014/169356, страницы 64-70.

Пример 1. Аналоги эпокситиглиана активируют изоформы РКС.

Протеинкиназы С являются семейством ключевых ферментов, вовлеченных в пути передачи сигналов, которые специфически фосфорилируют субстрат в сериновых/треониновых остатках. Фосфорилирование с помощью PKC является важным в регуляции ряда клеточных событий, таких как пролиферация и регуляция экспрессии генов. Изоформы PKC (-θ, -η, -α, -β, -δ, -ε) непосредственно вовлечены в реакции иммунных клеток и могут также промотировать экспрессию ключевых генов иммунного ответа. Однако картина экспрессии и уровни каждой из таких изоформ PKC связаны с типом клеток и специфичностью контекста (Lim et al., 2015; Anel et al., 2012; Pfeifhofer et al., 2006).

Для того чтобы идентифицировать профили активации изоформ PKC (специфичность и действенность) эпокситиглиановых соединений, клетки HeLa временно трансфицируют с селекцией векторов PKC-EGFP (PKC-α, PKC-βI, PKC-βΠ, PKC-γ, PKC-δ, PKC-θ, PKC-η, PKC-ζ, - получены на фирме) с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen), следуя методам, описанным в Boyle et al., 2014. Объем, соответствующий 0,16 мкг PKC-EGFP и 0,48 мкл липофектамина, смешивают с 25 мкл среды Opti-MEM (Invitrogen) и инкубируют в течение 5 мин при RT. Растворы объединяют и инкубируют еще 20 мин при RT (отношение ДНК:липофектамин 2000 1:3). Комплексы (50 мкл) добавляют в каждую лунку, и после 3 ч инкубации при 37°С добавляют еще 50 мкл RPMI-1640, 10% FCS, до общего объема 100 мкл на лунку. После 24 ч инкубации при 37°С клетки промывают забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS) и обрабатывают 500, 50 и 5 нМ эпокситиглиана. Можно испытывать три соединения в 96луночном планшете. Для эксперимента требуются пять 96-луночных планшетов. После 1-часовой обработки клетки промывают дважды 100 мкл PBS и фиксируют 50 мкл 2% формальдегида/0,2% глутеральдегида в PBS в течение 10 мин. Затем фиксированные клетки дважды промывают 100 мкл PBS. Для окрашивания ядер используют Hoechst 3342 в разведении 1:10000. После 7-мин инкубации в темноте Hoechst удаляют, и клетки промывают PBS. Наконец, клетки покрывают 100 мкл PBS и хранят при 4°С в темноте до визуализации. Визуализацию выполняют с использованием анализатора GE InCell Analyzer 2000. Транслокацию PKC к плазматической мембране или другие субклеточные позиции считают вручную с использованием Adobe Photoshop CS6.

Изображения, показывающие транслокацию выбранных изоформ PKC-α, -βΠ, -γ, -δ и -θ к клеточной мембране в присутствии эпокситиглиановых соединений соединения 1, соединения 3, а также РМА (форбол-12-миристат-13-ацетат), показаны на фиг. 1А. Эти изображения показывают, что активировать различные изоформы PKC могут различные эпокситиглиановые соединения.

Процент клеток, показывающих транслокацию на плазматической мембране соединений 1-10, а также положительного контроля РМА, конвертируют в тепловую карту, отображающую профиль транслокации изоформ PKC в ответ на 500, 50 и 5 нМ каждого соединения. Тепловая карта показана на фиг. 1В.

Результаты показывают, что все соединения 1-7 активируют PKC-9 (до различной степени) - изоформу РКС, известную как вовлеченную в активацию Т- и NK-клеток и супрессию развития Treg (Brezar et al., 2015; Anel et al., 2012). Все эпокситиглиановые соединения активируют PKC-β, которая критична при передаче сигналов В-клеточного рецептора и презентации антигена (см., например, Kang et al., 2001; Lim et al., 2015). Три другие изоформы PKC (-η, -α, -δ), которые слабее активируются некоторыми или всеми эпокситиглианами, также непосредственно вовлечены в ответы иммунных клеток (Lim et al., 2015; Pfeifhofer et al., 2006).

Пример 2. Изменения экспрессии генов в строме опухолей мышей, совпадающие с рекрутментом иммунных клеток и индукцией Th-1/M1-подобного противоопухолевого иммунного ответа.

Th-1/M1-подобный ответ при противоопухолевом иммунитете. Th-1/M1-подобный иммунный ответ ассоциируется с индукцией противоопухолевого клеточного иммунитета через ряд механизмов, включая

- 12 044756 прямую тумороцидную активность, модификацию противоопухолевых реакций цитокинами и потенцирование длительной иммунологической памяти. Например, несколько наборов данных показывают, что CD4+ Т-хелперные типа 1 (Th1) клетки - двигатели иммунитета Th1 могут способствовать поддержанию клиренса опухолевых клеток через секрецию различных цитокинов, включая интерферон-γ (IFN-γ), интерлейкин-2 (IL-2) и фактор некроза опухоли α (TNF-α) (Knutson et al., 2005; DeNardo et al., 2010; Burkholder et al., 2014). Эти цитокины промотируют активности нескольких типов клеток, включая антигенпредставляющие клетки (АРС), цитотоксические Т-клетки, NK-клетки и различные подтипы врожденных иммунных клеток (см., например, Cohen et al., 2000; Bos & Sherman, 2010). Также известно, что IFN-γ и TNF имеют прямое действие на выживание опухолевых клеток (Sugarman et al., 1985; Bayaert et al., 1994). Хотя IL-1 и IL-6 (продуцированные макрофагами M1) ассоциируются с развитием опухоли, более поздние данные предполагают, что они фактически являются ключевыми компонентами резких противоопухолевых иммунных ответов (Haabeth et al., 2011; Gabrilovich et al., 2012; Haabeth et al., 2016). Они показывают усиление пролиферации В-клеток и продуцирования антител, повышение активности антигенпредставляющих клеток (АРС), стимуляцию пролиферации антигенспецифических цитотоксических типов клеток и промотирование дифференцировки клеток Th1 (Haabeth et al., 2011; Burkholder et al., 2014). Также показано, что комбинации цитокинов Th1 и M1 являются важными в иммунологическом надзоре за опухолями. Например, как IL-1, так и IFN-γ усиливают взаимно действие для активации тумороцидной активности макрофагов (Hori et al., 1989; Haabeth et al., 2016). Важно, что появление макрофагов M1 и лимфоцитов Th1 в опухолях положительно ассоциируются с улучшенным прогнозом и временами выживания при многих типах рака (Pages et al., 2010; Fridman et al. 2012; Senovilla et al., 2012). Действительно, предполагается, что индукция воспаления типа Th1/M1 существенно улучшает подходы на основе противораковой терапии (Haabeth et al., 2012). Ниже описывается действие соединения 1 при промотировании противоопухолевого иммунного ответа, подобного Th1/M1, в строме мышиной модели с ксенотрансплантатом.

Строма мыши в ксенотрансплантате опухоли человека от мышей. Клеточную линию меланомы человека SK-MEL-28 инъецируют подкожно (s.c) в 2 места на боках каждой мыши BALB/c Foxnlnu (2 миллиона клеток/место) и позволяют расти до приблизительно 7 мм в диаметре. Затем в каждую опухоль инъецируют 50 мкл 20% пропиленгликоля, содержащего 30 мкг соединения 1, или 50 мкл 20% пропиленгликоля. Мышей подвергают эвтаназии в различные моменты времени после инъекции, опухоли собирают, кожный покров удаляют, и интактные опухоли хранят при -80°С.

Экстракция РНК. РНК экстрагируют из 30 мг замороженной опухоли с использованием набора Qiagen RNeasy Plus Mini Kit согласно инструкциям изготовителя, затем определяют количественно с помощью прибора NanoDrop, и подтверждают целостность денатурацией в агарозных гелях, содержащих 1 кб маркера ДНК, и окрашивают бромидом этидия.

Амплификация РНК и мечение. Приблизительно 500 нг всей немеченной РНК доводят до конечного объема 11 мкл воды без нуклеазы. РНК инкубируют с 9 мкл мастермикса для обратной транскрипции (1 мкл праймера Т7 Oligo (dT), 2 мкл 10х буфера для первой цепи, 4 мкл микса для dNTP, 1 мкл ингибитора РНКазы и 1 мкл ArrayScript) при 42°С в течение 2 ч. За этим следует стадия синтеза второй цепи кДНК, которая включает дополнительную инкубацию при 16°С в течение 2 ч с 80 мкл мастермикса для второй цепи (63 мкл воды без нуклеазы, 10 мкл 10х буфера для второй цепи, 4 мкл микса для dNTP, 2 мкл ДНК-полимеразы и 1 мкл РНКазы Н). кДНК очищают фильтрацией через картридж для фильтрации кДНК с 250 мкл буфера для связывания кДНК и промывкой 500 мкл буфера для промывки, представленного в наборе. Очищенную к ДНК элюируют при 20 мкл нагретой до 55°С воды без нуклеазы. Каждый образец кДНК инкубируют с 7,5 мкл мастермикса для IVT (2,5 мкл буфера для реакции Т7 10х, 2,5 мкл ферментной смеси Т7 и 2,5 мкл микса биотин-NTP) при 37°С в течение 16 ч. Реакцию останавливают добавлением 75 мкл воды без нуклеазы к каждому образцу кРНК. Биотинилированную амплифицированную РНК очищают фильтрацией образцов кРНК через картриджи для фильтрации кРНК с 350 мкл буфера для связывания кРНК и 250 мкл 100% этанола, смешанных перед загрузкой в фильтры. Затем картриджи для фильтрации кРНК с присоединенной РНК промывают 650 мкл буфера для промывки, и затем элюируют очищенную кРНК 200 мкл нагретой до 55°С воды без нуклеазы.

Гибридизация на Illumina Expression BeadChip. Образцы! кРНК греют при 65°С в течение 5 мин и собирают импульсным центрифугированием. После нагревания при 65°С в течение 5 мин образцы кРНК приблизительно по 750 нг помещают в отдельные пробирки, в которые добавляют ~5 мкл воды без РНКазы и 10 мкл Hyb Mix. Приблизительно 15 мкл полученной смеси с кРНК загружают на Illumina Expression BeadChip. Последующие стадии гибридизации и промывки выполняют согласно руководству Whole-Genome Gene Expression Direct Hybridization Assay Guide, поставляемому Illumina. Expression. BeadChips с HumanHT-12 v4 покрывают более 47000 транскриптов и известных сплайс-вариантов транскриптома человека. Expression BeadChips MouseRef-8 v2.0 покрывают приблизительно 25600 хорошо аннотированных транскриптов RefSeq (эталонная последовательность), включая свыше 19000 уникальных генов.

Данные анализа. BeadChip считывают с помощью системы iScan System, и переносят через GenomeStudio в GeneSpring GX v12.5 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Величины экспрессии

- 13 044756 нормализуют с использованием квантильной нормализации с настройками по умолчанию. Элементы фильтруют на основании оценки обнаружения, вычисленной с помощью GenomeStudio, где р<0,05 считают значимым.

Результаты показаны на фиг. 2. Фиг. 2А показывает, что некоторые цитокины/хемокины хозяина, которые важны для рекрутмента/активации иммунных клеток, апрегулируются в месте опухоли в ответ на обработку соединением 1. Заметим, что известно, что Cxcl1, который с трудом апрегулируется соединением 1, промотирует рекрутмент нейтрофилов и последующий киллинг оставшихся раковых клеток (Garg et al., 2017). Кроме того, фиг. 2В показывает, что соединение 1 вызывает изменения экспрессии генов в хозяине, которые ассоциируются с развитием Th-1/М-подобного ответа, т.е. индукцию IFN-γ, TNF, IL-6 и IL-1e. Данные также предполагают, что может происходить даунрегуляция передачи сигналов TGF-β (фиг. 2С), которая является известным путем передачи иммуносупрессивных сигналов (Neuzillet et al., 2015).

Пример 3. Демонстрация того, что терапевтические концентрации соединения 1 и других эпокситиглианов индуцируют онкозис клеток.

Онкозис является формой гибели клеток, характеризующейся набуханием и разрывом субклеточных органелл и последующей пермеабилизацией плазматической мембраны из-за частичной потери АТФ-управляемой активности ионного насоса, который поддерживает осмотический баланс. Показано, что онкозис является иммуногенным по природе и ассоциируется с эффективностью некоторых онколитических вирусов и небольшими молекулами, разработанными как противораковые средства (см., например, Dyer et al., 2016).

Клеточные линии, реагенты и среды. Клетки А431 (эпидермоидная карцинома человека), ММ649 (меланома человека), B16-OVA (клеточная линия меланомы мышей B16-F10, стабильно трансфицированная куриным овальбумином), ММ415 (меланома человека) и FaDu (гипофарингеальный рак человека) культивируют с RPMI-1640, 10% FCS (полная среда), при 37°С, 5% CO₂, во влажном инкубаторе. Все клеточные линии, используемые в этом исследовании, подтверждают как отрицательные на микоплазму с использованием MycoAlert (Lonza). Также выполняют анализ профиля STR для того, чтобы подтвердить используемые клеточные линии человека.

Анализ на цитотоксичность с IncuCyte. Четыре раковые клеточные линии (А431, ММ649 (меланома человека), FaDu (HNSCC) и ММ415 (меланома человека) оценивают на их реакцию на обработку эпокстиглианами. Клетки высевают при плотности 10000 клеток на лунку (100 мкл полной среды) в темные 96-луночные планшеты с лунками с прозрачным дном (Corning, #3603). После 24-часовой инкубации среду из каждой лунки аспирируют и заменяют 50 мкл свежей среды, содержащей 1 мкг/мл иодида пропидия (PI). Исходные растворы (20 мг/мл в этаноле) четырех эпокстиглианов (соединения 1, 2, 3 и 4) разводят 2х до конечной концентрации для анализа (1 мМ) в идентичных средах и включают в 96-луночный планшет с U-образными лунками в препарате для переноса. Разведение (50 мкл) добавляют в соответствующие лунки, и полученные планшеты вставляют в Essen Biosciences IncuCyte при подготовке для визуализации. Получают изображения в различные моменты времени (30 мин, 1 ч и через часовые диапазоны) в целом в течение 24 ч.

Анализы на высвобождение лактатдегидрогеназы (LDH). Измерение высвобождения LDH является хорошо известным анализом для оценки пермеабилизации к плазматической мембране и обнаружения гибели клеток через некроз (Chan et al., 2013). В этих анализах используют три клеточные линии (А431, ММ649 и B16-OVA). Клетки высевают при плотности 10000 клеток на лунку (100 мкл полной среды) в прозрачные 96-луночные планшеты (Corning, #3595; 100 мкл полной среды), и полученные планшеты инкубируют в течение ночи, как подробно описано ранее. На следующий день среду из каждой лунки аспирируют и добавляют 50 мкл свежей среды. Исходные растворы соединения 1 разводят 2х до конечных концентраций для анализа (1 мМ и 600 мкМ), и 50 мкл таких разведений добавляют в соответствующие лунки. Также составляют и включают контрольные растворы только этанола. В указанные моменты времени извлекают 50 мкл среды и анализируют на высвобождение LDH с использованием набора для анализа на цитотоксичность Pierce LDH (ThermoFisher Scientific). Регистрируют показания OD 490 нм и OD690 нм для каждого образца с использованием планшет-ридера Hybrid Synergy H4. Показатели поглощения обработанных лекарством образцов нормализуют к контролям, обработанным детергентом, для определения % высвобождения LDH на лунку.

Анализ на внутриклеточный АТФ. Используют наборы для анализа CellTiter-Glo® 2.0 (Promega Corporation) для количественного определения на основе люминесценции АТФ, присутствующего в клетках, для определения уровней внутриклеточного АТФ в культурах А431 и ММ649, подвергнутых воздействию двух концентраций (300 мкМ и 500 мкМ) соединения 1. Снова клетки высевают при плотности 10000 клеток на лунку в темные 96-луночные планшеты с лунками с прозрачным дном (в 100 мкл полной среды) и инкубируют при 37°С, 5% CO2, в течение ночи. Во время анализа среду из каждой лунки аспирируют, и добавляют 50 мкл свежей среды. Исходные растворы соединения 1 разводят 2х до конечных концентраций для анализа (1 мМ и 600 мкМ), и 50 мкл таких разведений добавляют в соответствующие лунки. Также составляют и включают контрольные растворы только этанола. В указанные мо- 14 044756 менты времени среду аккуратно извлекают, чтобы не разрушить клетки, и добавляют 100 мкл реагента CellTiter-Glo® 2.0. Полученный планшет помещают на орбитальный шейкер на 2 мин для того, чтобы вызвать лизис клеток, после чего его инкубируют в темноте в течение 10 мин. После этого определяют сигнал люминесценции в каждой лунке. Сигналы люминесценции из лунок, обработанных соединением, нормализуют к лункам, обработанным средой, и выражают в виде % внутриклеточного АТФ против времени.

Изображения, полученные из IncuCyte, показывают сильное окрашивание в красный цвет через 120 мин в большинстве клеток всех четырех клеточных линий, обработанных 500 мкМ соединения 1, 2, 3 и 4 (А431, FaDu, MM649 и ММ415). Не окрашиваются клетки, обработанные только средой, подтверждая, что утрата целостности плазматической мембраны ограничена клетками, обработанными соединением 1. Кроме того, также наблюдают значительное набухание цитоплазмы и образование пузырьков во всех клетках, обработанные соединением 1, 2, 3 и 4, хотя в различной степени и с различной кинетикой появления.

Результаты анализов на высвобождение LDH и оценки уровней внутриклеточного АТФ приводятся на фиг. 3А и 3В, соответственно. При сравнении с контролем имеется существенное высвобождение LDH из трех раковых клеточных линий при обеих концентрациях соединения 1, которые испытывали (300 мкМ и 500 мкМ) (фиг. 3А). Уровни внутриклеточного АТФ очень быстро уменьшаются после обработки 500 мкМ соединения 1, и через 60 мин почти не определяются (фиг. 3В). При 300 мкМ соединения 1 внутриклеточный АТФ спадает медленнее и менее катастрофично, чем в случае концентрации соединения 1 500 мкМ, составляя приблизительно 50% от уровня до обработки через 120 мин (фиг. 3В). Истощение АТФ ранее ассоциировалось с индукцией онкозиса (Kim et al., 2003).

Такие результаты показывают, что эпокситиглиановые соединения вызывают онкозис в терапевтически релевантных концентрациях (т.е. концентрациях, которые являются эффективными для того, чтобы вызвать геморрагический некроз in vivo).

Пример 4. Онкозис, вызванный соединением 1 и другими эпокситиглиановыми соединениями, показывает характеристики иммуногенной гибели клеток.

Иммуногенная гибель клеток (ICD) является специфическим типом регулируемой гибели клеток, которая приводит к высвобождению или экстернализации медиаторов, называемых молекулярными фрагментами, ассоциированными с повреждениями (DAMP), которые взаимодействуют с рецепторами, экспрессируемыми дендритными клетками/макрофагами для промотирования их рекрутмента и стимуляции поглощения/презентации опухолевых антигенов Т-клеткам. ICD является известным путем для активации иммунной системы против рака. Биохимические признаки ICD включают выставление кальретикулина (CALR) и других белков эндоплазматического ретикулума/митохондриальных белков на поверхность погибающих клеток и высвобождение больших количеств АТФ и бокса 1 группы белков с высокой подвижностью (HMGB1) во внеклеточную среду (Kroemer et al., 2013). Эти параметры используют для точного прогнозирования способности химиотерапевтических средств (включая доксорубицин, митоксантрон, оксалиплатин и бортезомиб) индуцировать ICD (Kroemer et al., 2013; Galluzzi et al., 2017). Способность эпокситиглианов индуцировать такие характеристики описана подробно ниже.

Клеточные линии, реагенты и среды. Клетки А431 (эпидермоидная карцинома человека), ММ649 (меланома человека) и B16-OVA (клеточная линия меланомы мышей B16-F10, стабильно трансфицированная куриным овальбумином) культивируют с RPMI-1640, 10% FCS (полная среда), при 37°С, 5% CO₂, во влажном инкубаторе. BMDC культивируют в среде R10 (RPMI, 10% FCS, 2 мМ глутамина, 50 мкМ бета-меркаптоэтанола, Pen/Strep). Все клеточные линии, используемые в этом исследовании, подтверждают как отрицательные на микоплазму с использованием MycoAlert (Lonza). Также выполняют анализ профиля STR для того, чтобы подтвердить используемые клеточные линии человека.

Анализы на высвобождение АТФ. Клетки высевают при плотности 10000 клеток на лунку (100 мкл полной среды) в прозрачные 96-луночные планшеты (Corning, #3595; 100 мкл полной среды), и полученные планшеты инкубируют в течение ночи, как подробно описано ранее. На следующий день среду из каждой лунки аспирируют и добавляют 50 мкл свежей среды. Исходные растворы соединений 1, 2, 3 и 4 разводят 2х до конечных концентраций для анализа (1 мМ и 600 мкМ), и 50 мкл таких разведений добавляют в соответствующие лунки. Также составляют и включают контрольные растворы только этанола. В указанные моменты времени извлекают 80 мкл среды, центрифугируют при 1200 об/мин в течение 4 мин для оседания клеточного дебриса, и 50 мкл анализируют на АТФ с использованием набора для анализа на АТФ на основе биолюминесценции (FLAA, Sigma-Aldrich). Регистрируют люминесценцию в относительных единицах для каждого образца, используя планшет-ридер Hybrid Synergy Н4 (BioTek).

Анализы на высвобождение HMGB1. Клеточные линии (А431, ММ649 и B16-OVA) высевают в Т75-см² колбы (Nunc) в 10 мл полной среды и культивируют при 37°С, 5% СО₂, до тех пор, пока не достигнут 90% слияния. Соединения 1, 2, 3 и 4 разводят в 5 мл идентичных сред до конечной концентрации 500 и 300 мкМ и затем вводят в клетки. Готовят несколько колб с тем, чтобы можно было получить кинетическую кривую высвобождения HMGB1 в ответ на обработку лекарством. Также получают контроль только с этанолом. В нужный момент времени среду извлекают из колбы в 10-мл полипропиленовую

- 15 044756 пробирку, которую помещают на лед на 5 мин. Супернатанты клеточных культур центрифугируют при 1200 об/мин в течение 4 мин для удаления клеточного дебриса, после чего 4,5 мл супернатанта загружают во вращающуюся колонку концентратора (Amicon® Ultra, мембрана, отсекающая 50 кДа, Merck) для удаления FCS. Затем поток из этой колонки загружают в другую колонку концентратора (Amicon® Ultra, мембрана, отсекающая 10 кДа, Merck) и центрифугируют при 3500 об/мин для концентрирования HMGB1 перед анализом ELISA (SEA399Hu/SEA399Mu, Cloud-Clone Corp). Определяют величины OD 450 нм с использованием планшет-ридера Hybrid Synergy H4 (BioTek). Величины поглощения образцов, обработанных лекарством, нормализуют к образцам, обработанным носителем, для определения кратности возрастания высвобождения HMGB1 в ответ на обработку эпокситиглианами.

Анализы на экстернализацию кальретикулина. Экстернализацию кальретикулина определяют так, как описано ранее (Gomez-Cadena et al., 2016). Коротко, клетки (А431, ММ649, B16-OVA), культивированные в полной среде при 37°С, 5% CO₂, разъединяют через трипсинизацию, центрифугируют при 1200 об/мин и промывают х2 свежей средой. После дополнительного цикла центрифугирования полученный клеточный осадок ресуспендируют в концентрации 1x106 клетки/мл, после чего добавляют эпокситиглиан в конечной концентрации 500 или 300 мкМ. Также выполняют контроль только с этанолом. Клеточные суспензии инкубируют при 37°С, 5% CO2, и в указанные моменты времени извлекают 200 мкл образца и инкубируют с красителем LIVE/DEAD far red в течение 5 мин на льду. После этого клетки осаждают при 1200 об/мин в течение 4 мин и промывают x1 PBS. Затем к каждому осадку добавляют 500 мкл PBS, 0,25% формальдегида, для выполнения легкой фиксации, не ставя под угрозу целостность плазматической мембраны. После этого клетки промывают x1 PBS и добавляют 100 мкл PBS, 1% BSA, 2 мМ ЭДТК (буфер FACs), содержащего анти-кальретикулин (ab2907, Abcam; разведение 1:50). После 1-часовой инкубации при комнатной температуре клетки центрифугируют при 1200 об/мин в течение 4 мин и промывают x1 буфером FACs перед инкубацией со 100 мкл буфера FACs, содержащего актикроличий Alexa488 в 1:750, в течение еще часа при комнатной температуре. Клетки снова осаждают и затем ресуспендируют в 500 мкл буфера FACs для подготовки к проточной цитометрии.

Образцы, сначала закрывают FSC-H v FSC-A для идентификации отдельных клеток, после чего анализируют популяцию отрицательных (интактных) клеток к красителю LIVE/DEAD (экст. 640 нм, исп.670/14) на зеленую флуоресценцию (экст. 488 нм, эм. 530/30; экстернализация кальретикулина). Затем определяют средние величины интенсивности флуоресценции и строят график зависимости от времени.

Результаты показывают, что быстрый онкозис, вызванный эпокситиглиановыми соединениями, также индуцирует характеристики иммуногенной гибели клеток с высвобождением/экстернализацией критических DAMP, включая АТФ (фиг. 4А и 4В), FIMBG1 (фиг. 4С) и кальретикулин (фиг. 4D). Имеет место значительное высвобождение АТФ в пределах 60 мин во всех трех раковых клеточных линиях, обработанных как двумя концентрациями соединения 1 (фиг. 4А), так и соединений 2, 3 и 4 (фиг. 4В). Эти соединения также промотируют высвобождение HMGB1 из раковых клеточных линий. После анализа ELISA величины для обработанных клеток нормализуют к клеткам, обработанным носителем, для определения кратности возрастания, показано, что соединение 1 повышает высвобождение HMBG1 в пределах 120 мин на 40% для клеток А341 и ММ649 (фиг. 4Ci и 4Cii) и более, чем в 3 раза для клеток B16-OVA (фиг. 4Сш). Соединения 2, 3 и 4, которые также анализировали на клетках B16-OVA, показывают минимум 2-кратное возрастание высвобождения HMBG1 из этой клеточной линии через 120 мин (фиг. 4Civ). Данные для экстернализации кальретикулина после обработки 3 клеточных линий соединением 1 показывают значительное возрастание средней интенсивности флуоресценции в пределах 60 мин после обработки (фиг. 4D). Известно, что такие высвобождение/экстернализация DAMP промотируют рекрутмент антигенпредставляющих клеток, стимулируют эффективное поглощение антигенов, ассоциированных с раковыми клетками, и стимулируют презентацию подмножеств Т-клеток (Kolaczkowska & Kubes, 2013).

Пример 5. Фрагменты обработанных эпокситигланом раковых клеток проглатываются популяциями клеток CD11c⁺, полученными из костного мозга.

CD11c является хорошо описанным маркером DC/макрофагов (Merad et al., 2013). Один путь для исследования потенциала противораковых средств (и индуцируемых ими ассоциированных с гибелью процессов) для промотирования развития иммуногенных реакций включает определение того, ведут ли они к поглощению клеточных компонентов CD11c⁺ дендритными клетками/макрофагами и их последующему созреванию в bone fide антигенпредставляющие клетки (АРС) (Guermonprez et al., 2002). В настоящем примере авторы демонстрируют, что онкозис, индуцированный соединением 1 и родственными эпокситиглианами, ведет к поглощению компонентов погибающих раковых клеток такими клетками.

Выделение и культивирование клеток, полученных из костного мозга (BMDC). Сначала у 7-8недельных мышей С57В1/6 в стерильных условиях хирургически удаляют большие и малые берцовые кости. Мозг вымывают из костной полости 10 мл охлажденной на льду среды R10 (с использованием иглы 27G/шприца в 50-мл полипропиленовую пробирку). Клетки осаждают при 1500 об/мин в течение 5 мин и промывают x2 охлажденной на льду средой R10. После ресуспендирования осадка в 10 мл охла- 16 044756 жденной на льду среды R10 клетки считают с использованием усовершенствованного гемоцитометра и высевают при плотности 2х10⁶ клеток на планшет (чашка Петри) в 10 мл R10 с добавлением 20 нг/мл мышиного GM-CSF. Все чашки инкубируют при 37°С, 5% CO₂, и в день 3 добавляют еще 10 мл R10 с нг/мл GM-CSF. Клетки снова подкармливают в день 6 и используют в последующих анализах в день

7.

Эксперименты по поглощению BMDC. Перед совместной инкубацией с BMDC клетки B16-OVA трипсинизируют, центрифугируют при 1200 об/мин в течение 4 мин для осаждения клеток и промывают х2 полной средой. Затем клетки окрашивают 2 мкМ Cell Tracker Green в полной среде в течение 45 мин, после чего их осаждают и промывают х2, как описано выше. Затем меченные клетки B16-OVA обрабатывают соединениями 1, 2, 3 и 4 в двух концентрациях (500 или 300 мкМ) в среде при плотности 1х10⁶клетки/мл в течение 30 и 60 мин, после чего клетки осаждают центрифугированием, супернатант удаляют аспирацией, и клеточный осадок промывают х1 полной средой. После промывки обработанные клетки ресуспендируют в среде R10, загружают в лунки 6-луночного планшета (Corning, #3471, ультраслабое прикрепление к поверхности), и добавляют BMDC. Совместные культуры инкубируют в течение 4 ч, после чего клеточные суспензии переносят в микроцентрифужную пробирку и центрифугируют при 1500 об/мин в течение 5 мин. Осадки ресуспендируют в 100 мкл буфера FACs, содержащего анти-CD11cAPC, и инкубируют в течение 10 мин при 4°С. Клетки снова осаждают, промывают х1 буфером FACs и затем фиксируют, используя PBS, 1% формальдегида, в течение 10 мин. После центрифугирования и удаления супернатанта клетки ресуспендируют в 500 мкл буфера FACs при подготовке для проточной цитометрии.

Образцы сначала закрывают FSC-H v FSC-A, затем SSC-H v SS-A для идентификации отдельных клеток. Затем определяют долю клеток CD11c⁺ (экст. 640 нм, исп.670/14) с CMFDAmid (экст. 488 нм, исп. 530/30) для обработанных и необработанных клеток, как процент от всех клеток CD11c⁺.

Результаты (фиг. 5А и 5В) показывают, что онкозис, вызванный соединением 1, промотирует поглощение (т.е. эффективное проглатывание) фрагментов погибающих раковых клеток CD11c⁺ дендритными клетками/макрофагами. Оказывается, что такое поглощение зависит как от концентрации соединения 1, так и от времени обработки, так что при 500 мкМ соединения 1 поглощение антигена происходит в большей степени за более короткий период времени по сравнению с применением 300 мкМ. Это согласуется с кинетикой онкозиса, наблюдаемой в примере 3. Фиг. 5 С показывает, что соединения 2, 3 и 4 также способны индуцировать реакцию гибели клеток, которая является иммуногенной in vitro, т.е. промотируют поглощение CD11c⁺ BMDC.

Пример 6. Комбинация соединения 1 с ингибиторами контрольных точек иммунитета.

Виды терапии с ингибиторами контрольных точек иммунитета, в частности точек, таргетирующих рецепторы, вовлеченные в Т-клеточную иммуносупрессию (например, цитотоксический Тлимфоцитассоциированный белок 4 (CTLA-4) или белок запрограммированной гибели 1 (PD-1) и его лиганд PD-L1), значительно улучшили результаты пациентов при некоторых типах рака на поздней стадии, включая меланому, почечно-клеточный рак, рак мочевого пузыря и плоскоклеточный рак головы и шеи (HNSCC) (Msaouel & Massarelli, 2016; Sharma & Allison, 2015). Однако первичная и de novo резистентность к таким ICI лекарствам является значительной клинической проблемой. Кроме того, широкое клиническое изучение отдаленных результатов показывает, что у некоторых пациентов с меланомой развивается резистентность к лечению и происходят рецидивы заболевания (O'Donnell et al., 2017). Терапии, комбинирующие ICI с соединениями, которые могут действовать как адъюванты путем промотирования гибели иммуногенных клеток (в частности, в результате повышенной инфильтрации иммунных клеток в паренхиму опухоли и поглощения/презентации антигена), дают надежду на преодоление некоторых ограничений ICI и улучшение общих клинических результатов (Workenhe et al., 2014; Ribas et al., 2017). В этом примере и в примере 7 проверяют результаты комбинаций ICI и инъекции в очаг поражения соединения 1.

Схему экспериментального подхода можно видеть на фиг. 6А. Коротко, 6-7 недельным мышам C57BL/6 инъецируют подкожно (s.c.) в оба бока клетки мышиной меланомы B16-F10-OVA (2х 105 клеток на место в 100 мкл). Опухолям позволяют развиваться до приблизительно 5-50 мм³, после чего инъецируют i.p. 200 мкг анти-PD-1 (RMP1-14, BioXCell), анти-CTLA-4 (9Н10, BioXCell) или изотип контрольного антитела (2А3 и IgG сирийского хомячка, BioXCell) на мышь (день -2). В день 0 в обе опухоли инъецируют I.T. или соединение 1 (15 мкг в 50 мкл) или только носитель (носит.). Каждая мышь получает дополнительную i.p. инъекцию того же антитела, которое вводили в день -2 (снова 200 мкг). Антитела вводят еще 3 раза i.p. инъекцией каждые 2 дня. Измеряют объем обработанных опухолей с использований штангенциркулей, как описано ранее (Boyle et al., 2014), и определяют выживание мышей со временем.

Результаты, представленные на фиг. 6В и 6С, показывают, что соединение 1 можно комбинировать с анти-PD-1 и анти-CTLA-4 для ограничения роста опухоли и улучшения выживания мышей до более высокой степени, чем при лечении одним агентом. Оказывается, что этот эффект зависит от концентрации для каждой комбинации соединение 1/ICI. Например, инъекция 30 мкг соединения 1 вместе с анти- 17 044756

PD-1 ведет к улучшению выживания/уменьшенному росту опухоли по сравнению с применением 30 мкг одного соединения 1 (фиг. 6Biii, iv). Этого не наблюдают, когда используют 15 мкг соединения 1 в тех же комбинациях, т.е. не происходит улучшения в выживании или росте опухоли (фиг. 6Bi, ii). Ситуация обратная, когда используют анти-CTLA4, где 15 мкг соединения 1 в комбинированной обработке (фиг. 6Ci, ii) дают оптимальную реакцию, а 30 мкг соединения 1 не дают (фиг. 6Ciii, iv).

Пример 7. Наблюдение абскопального эффекта при использовании соединения 1 в комбинации с ингибиторами контрольных точек иммунитета.

Схему экспериментального подхода можно видеть на фиг. 7А. Коротко, 6-7 недельным мышам C57BL/6 инъецируют s.c. в оба бока клетки мышиной меланомы B16-F10-OVA (2x105 клеток на место в 100 мкл). Опухолям позволяют развиваться до приблизительно 5-50 мм³, после чего инъецируют i.p. 200 мкг анти-PD-1 (RMP1-14, BioXCell), анти-CTLA-4 (9Н10, BioXCell) или изотип контрольного антитела (2А3, BioXCell) на мышь (день -2). В день 0 в самую большую из двух опухолей (приблизит. 50-75 мм³) инъецируют I.T. или соединение 1 (15 мкг в 50 мкл) или только носитель (носит.). Оставшуюся опухоль оставляют необработанной, и каждая мышь получает дополнительную i.p. инъекцию того же антитела, которое вводили в день -2 (снова 200 мкг). Антитела вводят еще 3 раза i.p. инъекцией каждые 2 дня. В ходе эксперимента измеряют объем как обработанных, так и необработанных опухолей, как подробно описано ранее.

Результаты показаны на фиг. 7В. Результаты показывают, что эффективно удаляются не только опухоли, обработанные комбинацией антител и соединения 1, но что некоторые необработанные соседние опухоли также показывают реакцию на комбинированную терапию, которую не наблюдают с любым одним средством.

Пример 8. Супрессорные клетки миелоидного происхождения влияют на эффективность низкой дозы соединения 1.

Супрессорные клетки миелоидного происхождения (MDSC) являются незрелыми миелоидными клетками, которые могут подавлять иммунный ответ хозяина на опухоли несколькими путями (Qu et al., 2016). Авторы изобретения использовали нокаутированных мышей C57BL/6 с гранулоцитарным колониестимулирующим фактором (GCSF) для получения модели для оценки будущего потенциала для возможных комбинированных терапий, включающих соединение 1 с молекулами, которые ингибируют или блокируют белки (например, индолеамин-2,3-диоксигеназу (IDO)), ассоциированные с рекрутментом и функцией MDSC. GCSF - основной регулятор продуцирования и движения нейтрофилов также играет критическую роль в миграции и пролиферации MDSC (Li et al., 2016). С использованием GCSFR нокаутированной модели, предложенной авторами изобретения, проверяют возможную роль гранулоцитарных MSDC в ограничении эффективности монотерапии (в субоптимальной дозе) соединения 1 против колоректальной аденокарциномы МС38.

Коротко, 6-7 недельным мышам дикого типа C57BL/6 и gcsfr’/’ инъецируют s.c. в оба бока клетки мышиного колоректального рака МС38 (1x106 клеток на место в 100 мкл). Опухолям позволяют развиваться до приблизительно 5-50 мм³, после чего инъецируют I.T. 15 мкг соединения 1 или носитель (носит.) (50 мкл). Объем обработанных опухолей отслеживают так, как описано ранее в примерах 6 и 7. Сравнение размера опухолей и выживания между инъецированными соединением 1 опухолями у дикого типа (wt) и нокаутированных мышей с GCSFR можно видеть на фиг. 8.

С учетом роли GCSFR в рекрутменте гранулоцитов эти данные предполагают, что такая инфильтрация клеток иммунной системы может ограничиваться противораковой эффективностью соединения 1 в известной субоптимальной дозе (15 мкг). Комбинации соединения 1 или аналогов с соединениями, которые предотвращают развитие таких иммуносупрессивных клеточных популяций (например, ингибиторами IDO), таким образом могут привести к более хорошей противораковой эффективности и улучшить выживание пациентов.

Специалистам в области техники, к которой относится изобретение, следует иметь в виду, что возможны многочисленные его модификации, не выходящие за пределы сущности и объема изобретения.

Ссылки

Следует иметь в виду, что если в настоящем описании дается ссылка на любую публикацию из уровня техники, эта ссылка не является признанием того, что эта публикация образует часть общих знаний в данной области техники, будь то в Австралии или любой другой стране.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ лечения опухоли, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, эпокситиглианового соединения и ингибитора контрольной точки иммунитета; где эпокситиглиановое соединение вводят локально в опухоль; где эпокситиглиановое соединение представляет собой соединение формулы (I)

или его геометрический изомер или стереоизомер или фармацевтически приемлемую соль, где R₁ представляет собой водород или C_1-6-алкил;

R2 представляет собой -OH или -OR9;

R3 представляет собой -OH или -OR9;

R4 и R₅ выбирают независимо из водорода и C_1-6-алкила;

R6 представляет собой водород или -R₁₀;

R₇ представляет собой гидрокси или OR₁₀;

R₈ представляет собой водород или C_1-6-алкил;

R9 представляет собой -C_1-20-αлкил, -С_2-20-алкенил, -С_2-20-алкинил, -C(O)C_1-20-aлкил, -С(О)С_2-20-алкенил, -С(O)С_2-20-aлкинил, -С(О)-C_3-6-циклоалкил, -С(O)C_1-10-алкил-C_3-6-циклоалкил; -С(О)C_2-10-αлкенил-C_3-6циклоалкил, -С(О)C_2-10-алкинил-C_3-6-циклоалкил, -С(О)-арил, -С(O)C_1-10-αлкиларил, -С(O)C_2-10-алкениларил,

- 21 044756

-С(О)С_2-10-алкиниларил, -С(O)C_1-1o-алкил-С(O)R₁₁, -C(O)C_2-10-алкенил-C(O)R₁₁, -С(O)C_2-10-алкинил-C(O)R₁₁,

-C(O)C1-10-алкил-CH(OR1 i)(ORi 1), -С(О)C2-10-алкенил-CH(OR1 i)(ORi 1), -C(O)C2-10-алкинил-CH(OR1 i)(ORii), -C(O)C1-10-алкил-SR11, -С(O)C2-10-алкенил-SR11, -С(О)C2-10алкииил-SR11, -С(O)C1-10-алкил-С(O)OR11, -QO^nr алкенил-C(O)OR_{1 к}, -С(O)C_2-1ϋ-алкинил-С(O)OR_{1 к}, —СЮЮ-мпалкил-C(O)С_2-1o-алкинил-C(O)SR₁₁, О —С(0)С2-1оалкинил——Rn I

-C(O)C_1-1o-алкил-C(O)SR₁₁, -С(O)C_2-1o-алкенил-C(O)SR₁₁,

О о

R11 —С(0)С2-1оалкенил— или

R₁₀ представляет собой -С_1-6-алкил, -С_2-6-алкенил, -С_2-6-алкинил, -С(О)С_1-6-алкил, -С(О)С_2-6-алкенил, -С(О)С_2-б-алкинил, -С(О)-арил, -С(О)С_1-б-алкиларил, -С(О)С_2-6-алкепиларил или -С(О)С_2-б-алкиниларил и

R_n представляет собой водород, -С_1-10-алкил, -С_2-6-алкенил, -С_2-1о-алкинил, С_3-6-циклоалкил или арил;

где термин арил при использовании в вышеуказанных значениях радикалов означает С₆-С₁₄членную моноциклическую, бициклическую или трициклическую карбоциклическую систему, имеющую до 7 атомов в каждом цикле, причем по меньшей мере один цикл является ароматическим;

ингибитор контрольной точки иммунитета представляет собой антитело против белка запрограммированной гибели 1 (PD-1) или антитело против цитотоксического Т-лимфоцитассоциированного белка 4 (CTLA-4) и опухоль является опухолью с врожденной и приобретенной резистентностью по отношению к монотерапии ингибитором контрольной точки иммунитета.
2. Способ лечения или предупреждения одной или нескольких сторонних опухолей у субъекта, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, эпокситиглианового соединения и ингибитора контрольной точки иммунитета, причем указанное эпокситиглиановое соединение вводят локально в опухоль, отличную от указанной одной или нескольких сторонних опухолей; где эпокситиглиановое соединение представляет собой соединение формулы (I)

или его геометрический изомер или стереоизомер или фармацевтически приемлемую соль, где R₁ представляет собой водород или С_1-6-алкил;

R2 представляет собой -OH или -OR9;

R3 представляет собой -OH или -OR9;

R4 и R5 выбирают независимо из водорода и С_1-6-алкила;

R6 представляет собой водород или -R₁₀;

R₇ представляет собой гидрокси или OR₁₀;

R₈ представляет собой водород или С_1-б-алкил;

R9 представляет собой -С_1-20-алкил, -С_2-20-алкенил, -С_2-2о-алкинил, -С(О)С_1-20-алкил, -С(О)С_2-20-алкенил, -С(0)С_2-2о-алкинил, -С(О)-С_3-6-циклоалкил, -С(О)С_1-10-алкил-С_3-6-циклоалкил; -С(0)С_2-1о-алкенил-С_3-6циклоалкил, -С(О)С_2-1о-алкинил-С_3-6-циклоалкил, -С(О)-арил, -С(О)С_1-10-алкиларил, -С(О)С_2-10-алкениларил, -С(О)С_2-1о-алкиниларил, -C(O)C_1-1o-алкил-C(O)R₁₁, -C(O)C_2-1ϋ-алкенил-C(O)R₁₁, -С(O)C_2-1o-алкинил-С(О)R₁₁,

-C(O)C1-10-алкил-CH(OR11)(OR11), -С(О)C2-10-алкенил-CH(OR11)(OR11), -C(O)C₂-10-алкинил-CH(OR11)(OR_n), -c(o)c_1-1o-алкил-SR₁₁, -C(O)С_2-1o-алкенил-SR₁₁, -C(O)C_2-1ϋ-алкинил-SR₁₁, -C(O)C_1-1ϋ-алкил-C(O)OR₁₁, -С(0)С_2-10алкенил-C(O)OR₁₁, -С(O)C_2-1o-алкинил-С(O)OR₁₁, -C(O)C_1-1o-алкил-C(O)SR₁₁, -С(O)C_2-1o-алкенил-c(o)SR₁₁,

О О гипс о —С(О)С1.юалкил Rn —С(О)С₂.₁₀алкенил—^-^Rn

-C(O)C_2-1o-алкинил-C(O)SR₁₁, ’ или

О —С(О)С2-юалкинил——Rn I

- 22 044756

R1o представляет собой -С_1-б-алкил, -С_2-б-алкенил, -С_2-б-алкинил, -С(О)С_1-б—алкил, -С(О)С_2-б-алкенил,

-С(О)С_2-б-алкинил, -С(О)-арил, -С(О)С_1-б-алкиларил, -С(О)С_2-б-алкениларил или -С(О)С_2-б-алкиниларил и

R11 представляет собой водород, -С_1-10-алкил, -С₂_₆-алкенил, -С_2-10-алкинил, С₃_₆-циклоалкил или арил;

где термин арил при использовании в вышеуказанных значениях радикалов означает С₆-С₁₄членную моноциклическую, бициклическую или трициклическую карбоциклическую систему, имеющую до 7 атомов в каждом цикле, причем по меньшей мере один цикл является ароматическим;

ингибитор контрольной точки иммунитета представляет собой антитело против белка запрограммированной гибели 1 (PD-1) или антитело против цитотоксического Т-лимфоцитассоциированного белка 4 (CTLA-4);

сторонняя опухоль представляет собой опухоль, отличную от той опухоли, в которую вводят эпокситиглиановое соединение;

сторонняя опухоль представляет собой другую первичную опухоль или метастатическую опухоль и опухоль, в которую вводят эпокситиглиановое соединение, является опухолью с врожденной и приобретенной резистентностью по отношению к монотерапии ингибитором контрольной точки иммунитета.
3. Способ по п.1 или 2, в котором эпокситиглиановое соединение или его фармацевтически приемлемую соль вводят посредством интратуморальной инъекции.
4. Способ по любому из пп.1-3, в котором ингибитор контрольной точки иммунитета вводят системно.
5. Способ по п.4, в котором ингибитор контрольной точки иммунитета вводят посредством парентеральной инъекции.
6. Способ по любому из пп.1-5, в котором применяется одно или несколько из следующих определений:

(i) R1 представляет собой -CH₃;

(ii) R2 и R₃ выбирают независимо из -ОС(O)С₁.₂₀-αлkилα, -ОС(O)С₂.₂₀-алкенила, -ОС(О)С₂_₂₀алкинила, -ОС(О)-C₃.₆-циклоалкила, -ОС(O)C₁.₁₀-алкил-C₃.₆-циклоалкила; -ОС(О)С₂_₁₀-алкенил-С₃_₆циклоалкила, -ОС(О)C₂.₁₀-алкинил-C₃.₆-циклоалкила, -ОС(О)арила, -ОC(O)C₁.₁₀-алкиларила, -ОС(О)С₂_₁₀алкениларила, -OC(O)C₂.₁₀-алкиниларила, -ОС(O)C₁.₁₀-αлkил-С(O)R₁₁, -OC(O)C₂.₁₀-алкенил-С(O)R₁₁, -OC(O)C₂.₁₀-алкинил-С(O)R₁₁, -ОС(O)C₁.₁₀-алκил-Cн(OR₁₁)(OR₁₁), -0c(O)C₂.₁₀-алкенил-СН(OR₁₁)(OR₁₁), -Оc(o)c₂.₁₀-алкинил-CH(OR₁₁)(OR₁₁), -OC(O)C₁.₁₀-αлkил-SR₁₁, -OC(O)C₂.₁₀-алкенил-SR₁₁, -ОС(О)С₂-₁₀алκинил-SR₁₁, -OC(O)C₁.₁₀-алкил-C(O)OR₁₁, -OC(O)C₂.₁₀-алкенил-C(O)OR₁₁, -ОС(О)С₂—₁₀-алкинилC(O)OR11, -OC(O)C₁.₁₀-алкил-C(O)SR₁₁, -OC(O)С₂.₁₀-алкенил-C(O)SR₁₁ и -OC(O)C₂.₁₀-алкенил-C(O)SR₁₁;

(iii) R₄ и R₅ выбирают, каждый независимо, из Н и -CH₃;

(iv) R₆ представляет собой водород, -С(О)С1-₆-алкил, -С(О)С₂—₆-алкенил, -С(О)С₂—₆-алкинил или -С(О)арил;

(v) R₇ представляет собой гидроксил, -ОС(О)С1-₆-алкил, -ОС(О)С₂—₆-алкенил или -ОС(О)С₂—₆алкинил и (vi) R₈ представляет собой Н или -CH₃;

где термин арил при использовании в вышеуказанных значениях радикалов означает С₆-С₁₄членную моноциклическую, бициклическую или трициклическую карбоциклическую систему, имеющую до 7 атомов в каждом цикле, причем по меньшей мере один цикл является ароматическим.
7. Способ по п.6, в котором R2 и R₃ выбирают независимо из -ОC(O)C₁.₂₀-алкила, -ОС(О)С₂_₂₀алкенила, -ОС(О)С₂—₂₀-алкинила, -ОС(О)-С₃—₆-циклоалкила, -ОC(O)C₁.₁₀-алкил-C₃.₆-циkлоалкила; -ОС(О)С₂_₁₀-алкенил-С₃_₆-циклоалкила, -ОC(O)C₂.₁₀-алкинил-C₃.₆-циkлоалкила и -ОС(О)арила;

где термин арил при использовании в вышеуказанных значениях радикалов означает С₆-С₁₄членную моноциклическую, бициклическую или трициклическую карбоциклическую систему, имеющую до 7 атомов в каждом цикле, причем по меньшей мере один цикл является ароматическим.
8. Способ по п.6 или 7, в котором R2 и R₃ выбирают независимо из -OC(O)C₁.₂₀-алкила, -ОС(О)С₂_₂₀алкенила и -ОС(О)С₂_₂₀-алкинила.

- 23 044756
9. Способ по п.1 или 2, в котором соединение формулы (I) представляет собой соединение формулы (II)

или его геометрический изомер или стереоизомер или фармацевтически приемлемую соль;

где R6, R7 и R9 имеют значения, указанные в п.1.
10. Способ по любому из пп.1-9, в котором эпокситиглиановое соединение формулы (I) выбирают из группы, включающей

12-тиглоил-13-(2-метилбутаноил)-6,7-эпокси-4,5,9,12,13,20-гексагидрокси-1-тиглиен-3-он;

12,13 -ди(2-метилбутаноил)-6,7-эпокси-4,5,9,12,13,20-гексагидрокси-1 -тиглиен-3-он;

12-гексаноил-13 -(2-метилбутаноил)-6,7-эпокси-4,5,9,12,13,20-гексагидрокси-1 -тиглиен-3 -он и

12,13 -дигексаноил-6,7-эпокси-4,5,9,12,13,20-гексагидрокси-1 -тиглиен-3-он;

или их фармацевтически приемлемых солей.
11. Способ по любому из пп.1-10, в котором ингибитор контрольной точки иммунитета вводят в виде нескольких доз.
12. Способ по п.11, в котором несколько доз вводят до, одновременно и/или после введения эпокситиглианового соединения или его фармацевтически приемлемой соли.
13. Набор для использования в способе по любому из пп.1-12, включающий композицию, содержащую эпокситиглиановое соединение, и композицию, содержащую ингибитор контрольной точки иммунитета; где эпокситиглиановое соединение представляет собой соединение формулы (I)

или его геометрический изомер или стереоизомер или фармацевтически приемлемую соль, где R1 представляет собой водород или C₁.₆-алкил;

R₂ представляет собой -OH или -OR9;

R3 представляет собой -OH или -OR9;

R₄ и R₅ выбирают независимо из водорода и C₁.₆-алкила;

R6 представляет собой водород или -R₁₀;

R7 представляет собой гидрокси или OR₁₀;

R8 представляет собой водород или C₁.₆-алкил;

R9 представляет собой -C₁.₂₀-αлкил, -С₂-₂₀-алкенил, -С₂-₂₀-алкинил, -C(O)C₁.₂₀-алкил, -С(О)С₂-₂₀-алкенил, -С(O)С₂.₂₀-алкинил, -С(О)-G3.₆-циклоалкил, -С(O)Cl.lo-алкил-Cз.₆-циклоалkил; -С(O)C₂.₁₀-алкенил-C₃.₆циклоалкил, -С(О)C₂.₁₀-алкинил-G₃.₆-циклоалкил, -С(О)-арил, -С(O)C₁.₁₀-алкиларил, -С(O)C₂.₁₀-алкениларил, -С(О)C₂.₁₀-алкиниларил, -C(O)C₁.₁₀-алкил-C(O)R₁₁, -C(O)C₂.₁₀-алкенил-C(O)R₁₁, -С(O)C₂.₁₀-алкинил-С(О)R₁₁,

- 24 044756

-C(O)C1-10-алкил-CH(OR1 i)(ORi 1), -С(О)C2-10-алкенил-CH(OR1 i)(ORi 1), -C(O)C2-10-алкинил-CH(OR1 i)(OR_n),

-C(O)C1-10-алкил-SR11, -C(O)С2-10-алкенил-SR11, -C(O)C2-10алкинил-SR11, -C(O)C1-10-алкил-C(O)OR11, -С(О)С2—кг алкенил-C(O)OR11, -С(O)C2-10-алкинил-С(O)OR11, -ОДСцо-алкил-ОДБ^ь -С(O)C2-10-алкенил-C(O)SR11,

О О _Γι(]ίΓ гюст ~ С^Смоалкил —С(О)С₂.1₀алкенил—

-C(O)C_2-1o-алкинил-C(O)SR₁₁, ’ / ш и или

О —С(О)С₂.юалкинил——Ri 1 I

R₁₀ представляет собой -С_1-6-алкил, -С_2-6-алкенил, -С_2-6-алкинил, -С(О)С_1-6-алкил, -С(О)С_2-6-алкенил, -С(О)С_2-6-алкинил, -С(О)-арил, -С(О)С_1-6-алкиларил, -С(О)С_2-6-алкепиларил или -С(О)С_2-6-алкиниларил и

R₁₁ представляет собой водород, -С_1-1о-алкил, -С_2-6-алкенил, -С_2-1о-алкинил, С_3-6-циклоалкил или арил;

где термин арил при использовании в вышеуказанных значениях радикалов означает С₆-С₁₄членную моноциклическую, бициклическую или трициклическую карбоциклическую систему, имеющую до 7 атомов в каждом цикле, причем по меньшей мере один цикл является ароматическим;

ингибитор контрольной точки иммунитета представляет собой антитело против белка запрограммированной гибели 1 (PD-1) или антитело против цитотоксического Т-лимфоцитассоциированного белка 4 (CTLA-4).
14. Набор по п.13, включающий одну или несколько доз эпокситиглианового соединения и одну или несколько доз ингибитора контрольной точки иммунитета.
15. Набор по п.13 или 14, включающий:

(i) одну или несколько доз эпокситиглианового соединения в составе для топического введения и одну или несколько доз ингибитора контрольной точки иммунитета в составе для введения посредством инъекции или (ii) одну дозу эпокситиглианового соединения в составе для интратуморальной инъекции и одну или несколько доз ингибитора контрольной точки иммунитета в составе для введения посредством инъекции.