JP4641199B2 - Ｒｎａ干渉ポリヌクレオチド混合物の設計装置、ｒｎａ干渉ポリヌクレオチド混合物の作製方法、及びｒｎａ干渉ポリヌクレオチド混合物の設計プログラム - Google Patents
Ｒｎａ干渉ポリヌクレオチド混合物の設計装置、ｒｎａ干渉ポリヌクレオチド混合物の作製方法、及びｒｎａ干渉ポリヌクレオチド混合物の設計プログラム Download PDFInfo
- Publication number
- JP4641199B2 JP4641199B2 JP2005055064A JP2005055064A JP4641199B2 JP 4641199 B2 JP4641199 B2 JP 4641199B2 JP 2005055064 A JP2005055064 A JP 2005055064A JP 2005055064 A JP2005055064 A JP 2005055064A JP 4641199 B2 JP4641199 B2 JP 4641199B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- rna interference
- sequence information
- pathogenic microorganism
- combination
- base sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Management, Administration, Business Operations System, And Electronic Commerce (AREA)
Description
本発明は、高度のゲノム多様性を示す病原性微生物を標的とするＲＮＡ干渉法及びそれを用いた核酸創薬に関する。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、機能阻害したい遺伝子の特定領域と相同なセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡからなる２本鎖ＲＮＡ（double-stranded RNA、以下「ｄｓＲＮＡ」
という）が標的遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡの相同部分を干渉破壊するという現象で、１９９８年に線虫を用いた実験により初めて提唱された。そして、およそ２１〜２３塩基対の短い２本鎖ＲＮＡ（short interfering RNA、ｓｉＲＮＡ）が、哺乳類細胞系でも
細胞毒性を示さずにＲＮＡ干渉を誘導できることが示された。
という）が標的遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡの相同部分を干渉破壊するという現象で、１９９８年に線虫を用いた実験により初めて提唱された。そして、およそ２１〜２３塩基対の短い２本鎖ＲＮＡ（short interfering RNA、ｓｉＲＮＡ）が、哺乳類細胞系でも
細胞毒性を示さずにＲＮＡ干渉を誘導できることが示された。
ＲＮＡ干渉は、生命現象の解析の極めて有力な手段としてだけでなく、様々な感染症やがんなどに対する新しい治療技術として脚光を浴びている。しかし、ＲＮＡ干渉で用いられるｓｉＲＮＡについて、ＲＮＡ干渉効果を示すものは限られている。このため、ＲＮＡ干渉に有効なｓｉＲＮＡの配列規則性の同定が試みられ、この規則性に沿って有効なｓｉＲＮＡ配列を設計する方法が考えられている（例えば、特許文献１参照。）。この特許文献１には、ＲＮＡ干渉の標的遺伝子の塩基配列から、特定の規則に従う配列部位を検索し、検索結果に基づいてＲＮＡ干渉を生じさせるｓｉＲＮＡの設計、合成等を行う方法が開示されている。
一方、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、現在、ＨＩＶ−１型とＨＩＶ−２型の２つの型が知られているＲＮＡウイルスであり、ＨＩＶの配列データベース（http://www.hiv.lanl.gov/）には、全長又はほぼ全長の４００近くのＨＩＶ−１ゲノム配列が登録されており、登録されている配列は、どの配列も少しずつ異なっている。このように、ＨＩＶ−１は高度のゲノム多様性を有している。
国際公開第２００４／０４８５６６号明細書
著しく高いゲノム多様性をもつＨＩＶ等のウイルスを含む病原性微生物をＲＮＡ干渉の標的とする場合、かかるゲノム多様性に対応した網羅的なアプローチを行う必要があるが、このようなアプローチに最適なｓｉＲＮＡをデザインする技術は未だ確立されていない。また、ＨＩＶは、被感染体（宿主）の体内で増殖する際に変異が入る。このため、当初はＨＩＶに対してＲＮＡ干渉効果のあるｓｉＲＮＡ等のＲＮＡ干渉機能分子であっても、ＨＩＶのブレークスルー変異により、効かなくなる場合がある。
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、その目的は、高いゲノム多様性をもち、頻繁に変異が発生する病原性微生物に対して、広汎かつ高い有効性を有するＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の設計方法、ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の設計装置、ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の作製方法、ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の設計プログラム、及びＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物を提供することにある。
上記問題点を解決するために、請求項１に記載の発明は、病原性微生物のゲノム又は転写産物もしくは特定のタンパクをコードする配列に含まれる標的サイトに対してＲＮＡ干渉を生じさせるＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドを複数種類含むＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の設計方法に基づき、当該設計方法によって取得されるＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の組成にしたがってＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドを混合するＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の作製方法であって、前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の設計方法は、前記病原性微生物のゲノムを構成する塩基配列又は転写産物もしくは特定のタンパクをコードする配列についての病原性微生物塩基配列情報を複数取得する病原性微生物塩基配列情報取得工程と、取得した前記病原性微生物塩基配列情報に基づいて、所定のガイドラインに従って前記病原性微生物の前記標的サイトを特定し、当該標的サイトの塩基配列情報を複数取得する標的サイト情報取得工程と、取得した前記標的サイトの複数の塩基配列情報に基づいて、前記所定のガイドラインに従って設計し前記標的サイトに対してＲＮＡ干渉を生じさせるＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報を複数取得するＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド情報取得工程と、取得した前記複数のＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報から、前記病原性微生物のゲノム多様性および変異の発生に対応可能なＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせを選択して、より好ましい組み合わせ情報を取得する組み合わせ選択工程と、を含み、前記組み合わせ選択工程は、ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせが、前記病原性微生物塩基配列情報取得工程で取得した複数の前記病原性微生物塩基配列情報のうちのいくつの前記病原性微生物塩基配列情報と一致するかに関する網羅性と、前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせのうち、前記病原性微生物塩基配列情報のうちの一の情報に対し、前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報と一致する前記病原性微生物塩基配列情報が幾つあるかに関する重複性と、に基づいて、前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせを選択することを要旨とする。
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載のＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の作製方法において、前記組み合わせ選択工程は、前記網羅性と前記重複性とを高めるように前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせを選択することを要旨とする。
請求項３に記載の発明は、請求項１または２に記載のＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の作製方法において、前記組み合わせ選択工程は、前記網羅性を前記重複性よりも優先して前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせを選択することを要旨とする。
請求項４に記載の発明は、請求項１〜３のいずれか１つに記載のＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の作製方法において、前記組み合わせ選択工程は、前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド情報取得工程で取得した前記複数のＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報の各々について、前記病原性微生物延期配列情報の集合全体の中で、前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報と一致する前記病原性微生物塩基配列情報の割合を、前記病原性微生物塩基配列情報の集合におけるＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド単独の網羅率として算出する単独網羅率算出工程と、算出した前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド単独の網羅率に基づいてＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの、より好ましい組み合わせを検討する組み合わせ検討工程と、を含み、前記組み合わせ検討工程は、前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド単独の網羅率が高い前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報を複数選択して組み合わせ候補配列群を形成するとともに、前記組み合わせ候補配列群から所定数の前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報を選択して組み合わせ、組成の異なる複数のＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報の組み合わせを特定する組み合わせ候補特定工程と、特定した前記複数のＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報の組み合わせの各々について、前記病原性微生物塩基配列情報の集合全体の中で、一の組み合わせ中の前記複数のＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報と一致する前記病原性微生物塩基配列情報の割合を、前記病原性微生物塩基配列情報の集合におけるＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの網羅率として算出する網羅率算出工程と、算出した組み合わせの前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの網羅率を前記複数のＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報の組み合わせの間で比較する比較工程と、を含むことを要旨とする。
請求項５に記載の発明は、請求項４に記載のＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の作製方法において、前記組み合わせ検討工程は、前記組み合わせ候補配列群から選択する前記病原性微生物塩基配列情報の数を変化させるとともに、変化させた各々の場合について、前記組み合わせ候補特定工程と、前記網羅率算出工程と、前記比較工程とを実行し、所定の終了条件を満たすまで、前記組み合わせ候補特定工程と、前記網羅率算出工程と、前記比較工程とからなる一連の処理を繰り返し、前記組み合わせ検討工程は、前記病原性微生物塩基配列情報取得工程で複数取得した前記病原性微生物塩基配列情報の各一の病原性微生物塩基配列情報について、前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報と一致する前記病原性微生物塩基配列情報が幾つあるかに関する重複性を算出し、前記組み合わせ候補特定工程で取得した複数の前記組み合わせの各々について、前記病原性微生物塩基配列情報の集合に対する前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報が重複する前記病原性微生物塩基配列情報の割合を示す指標である組み合わせ内重複率を算出する重複率算出工程を含み、前記比較工程は、算出した前記組み合わせ内重複率を前記複数の組み合わせの間で比較する工程をさらに含み、前記所定の終了条件は、前記網羅率及び前記組み合わせ内重複率が連続して増加していない場合に前記一連の処理を終了することを要旨とする。
請求項６に記載の発明は、請求項１〜５のいずれか１つに記載のＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の作製方法において、前記病原性微生物塩基配列情報取得工程は、前記病原性微生物の塩基配列情報のデータベースから前記病原性微生物のゲノム又は転写産物もしくはこれらの特定の部分配列の病原性微生物塩基配列情報を取得することを要旨とする。
請求項６に記載の発明は、請求項１〜５のいずれか１つに記載のＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の作製方法において、前記病原性微生物塩基配列情報取得工程は、前記病原性微生物の塩基配列情報のデータベースから前記病原性微生物のゲノム又は転写産物もしくはこれらの特定の部分配列の病原性微生物塩基配列情報を取得することを要旨とする。
請求項７に記載の発明は、請求項１〜５のいずれか１つに記載のＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の作製方法において、前記病原性微生物塩基配列情報取得工程は、宿主に感染する前記病原性微生物のゲノム解析の結果に基づいて前記病原性微生物のゲノム又は転写産物もしくはこれらの特定の部分配列の病原性微生物塩基配列情報を取得することを要旨とする。
請求項８に記載の発明は、請求項１〜７のいずれか１つに記載のＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の作製方法において、前記病原性微生物がＲＮＡウイルスであることを要旨とする。
請求項９に記載の発明は、請求項１〜７のいずれか１つに記載のＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の作製方法において、前記病原性微生物が、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ＳＡＲＳ、コロナウイルス、マラリア原虫、真菌のいずれか１つであることを要旨とする。
請求項１０に記載の発明は、病原性微生物のゲノム又は転写産物もしくは特定のタンパクをコードする配列に含まれる標的サイトに対してＲＮＡ干渉を生じさせるＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドを複数種類含むＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の設計装置であって、前記設計装置としてのコンピュータは、制御部、入力部、出力部及び記憶部を備え、前記病原性微生物のゲノムを構成する塩基配列又は転写産物もしくは特定のタンパクをコードする配列についての病原性微生物塩基配列情報を、ネットワークを介して病原性微生物塩基配列情報データベースから複数取得して前記記憶部に記録する病原性微生物塩基配列情報取得手段と、前記記憶部に記録された前記病原性微生物塩基配列情報に基づいて、前記制御部で、所定のガイドラインに従って前記病原性微生物の前記標的サイトを特定し、当該標的サイトの塩基配列情報を複数取得する標的サイト情報取得手段と、取得した前記標的サイトの複数の塩基配列情報に基づいて、前記制御部で、前記所定のガイドラインに従って設計し、前記標的サイトに対してＲＮＡ干渉を生じさせるＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報を複数取得して、前記記憶部に記録するＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド情報取得手段と、取得した前記複数のＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報から、前記病原性微生物のゲノム多様性および変異の発生に対応可能なＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせを選択して、より好ましい組み合わせ情報を取得する組み合わせ選択手段と、を備え、前記組み合わせ選択手段は、ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせが、前記病原性微生物塩基配列情報取得手段で取得した複数の前記病原性微生物塩基配列情報のうちのいくつの前記病原性微生物塩基配列情報に対して一致するかに関する網羅性と、前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせのうち、前記病原性微生物塩基配列情報のうちの一の情報に対し、前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報と一致する前記病原性微生物塩基配列情報が幾つあるかに関する重複性と、に基づいて、前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせを選択することを要旨とする。
請求項１１に記載の発明は、病原性微生物のゲノム又は転写産物もしくは特定のタンパクをコードする配列に含まれる標的サイトに対してＲＮＡ干渉を生じさせるＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドを複数種類含むＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物を、コンピュータを用いて設計するためのＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の設計プログラムであって、前記コンピュータは、制御部、入力部、出力部及び記憶部を備え、前記コンピュータを、前記病原性微生物のゲノムを構成する塩基配列又は転写産物もしくは特定のタンパクをコードする配列についての病原性微生物塩基配列情報を、ネットワークを介して病原性微生物塩基配列情報データベースから複数取得して前記記憶部に記録する病原性微生物塩基配列情報取得手段と、前記記憶部に記録された前記病原性微生物塩基配列情報に基づいて、前記制御部で、所定のガイドラインに従って前記病原性微生物の前記標的サイトを特定し、当該標的サイトの塩基配列情報を複数取得する標的サイト情報取得手段と、取得した前記標的サイトの複数の塩基配列情報に基づいて、前記制御部で、前記所定のガイドラインに従って設計し、前記標的サイトに対してＲＮＡ干渉を生じさせるＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報を複数取得して、前記記憶部に記録するＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド情報取得手段と、取得した前記複数のＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報から、前記制御部で、前記病原性微生物のゲノム多様性および変異の発生に対応可能なＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせを選択して、より好ましい組み合わせ情報を取得する組み合わせ選択手段として機能させ、前記組み合わせ選択手段を、ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせが、前記病原性微生物塩基配列情報取得手段で取得した複数の前記病原性微生物塩基配列情報のうちのいくつの前記病原性微生物塩基配列情報に対して一致するかに関する網羅性と、前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせのうち、前記病原性微生物塩基配列情報のうちの一の情報に対し、前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報と一致する前記病原性微生物塩基配列情報が幾つあるかに関する重複性と、に基づいて、前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせを選択する手段として機能させることを要旨とする。
（作用）
請求項１に記載の発明によれば、以下の工程により、病原性微生物のゲノム又は転写産物もしくはこれらの特定の部分配列に含まれる標的サイトに対してＲＮＡ干渉を生じさせるＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドを複数種類含むＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物を作製する。すなわち、前記病原性微生物のゲノム又は転写産物もしくはこれらの特定の部分配列についての病原性微生物塩基配列情報を複数取得し、取得した病原性微生物塩基配列情報に基づいて、前記病原性微生物の前記標的サイトの塩基配列情報を複数取得する。そして、取得した標的サイトの複数の塩基配列情報に基づいて、標的サイトに対してＲＮＡ干渉を生じさせるＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報を複数取得する。そして、取得した複数のＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報から、病原性微生物のゲノム多様性および変異の発生に対応可能なＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせを選択して、より好ましい組み合わせ情報を取得する。組み合わせの選択は、ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせが、前記病原性微生物塩基配列情報取得工程で取得した複数の前記病原性微生物塩基配列情報のうちのいくつの前記病原性微生物塩基配列情報に対してＲＮＡ干渉可能かに関する網羅性と、前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせのうち、前記病原性微生物塩基配列情報のうちの一の情報に対しＲＮＡ干渉可能な前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報が幾つあるかに関する重複性と、に基づいて、前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせを選択することにより行う。これにより、ゲノム多様性をもつ病原性微生物において、広汎なゲノム配列に効くとともに、ブレークスルー変異が出現する確率をより少なくすることができるＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物を作製できる。なお、転写産物とは、ゲノム又はその特定部分配列の転写とかかる転写後のスプライシングにより取得されるものを含む。転写産物では、例えば、スプライシングにより取得される、ゲノム自体には存在しない塩基配列が存在する。ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドはこのような転写産物特有の塩基配列に対してＲＮＡ干渉を起こしてもよい。
請求項２に記載の発明によれば、前記網羅性と前記重複性とを高めるように前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせを選択する。従って、ゲノム多様性をもつ病原性微生物において、広汎なゲノム配列に効くとともに、ブレークスルー変異が出現する確率をより少なくすることができるＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物を作製できる。
請求項１に記載の発明によれば、以下の工程により、病原性微生物のゲノム又は転写産物もしくはこれらの特定の部分配列に含まれる標的サイトに対してＲＮＡ干渉を生じさせるＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドを複数種類含むＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物を作製する。すなわち、前記病原性微生物のゲノム又は転写産物もしくはこれらの特定の部分配列についての病原性微生物塩基配列情報を複数取得し、取得した病原性微生物塩基配列情報に基づいて、前記病原性微生物の前記標的サイトの塩基配列情報を複数取得する。そして、取得した標的サイトの複数の塩基配列情報に基づいて、標的サイトに対してＲＮＡ干渉を生じさせるＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報を複数取得する。そして、取得した複数のＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報から、病原性微生物のゲノム多様性および変異の発生に対応可能なＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせを選択して、より好ましい組み合わせ情報を取得する。組み合わせの選択は、ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせが、前記病原性微生物塩基配列情報取得工程で取得した複数の前記病原性微生物塩基配列情報のうちのいくつの前記病原性微生物塩基配列情報に対してＲＮＡ干渉可能かに関する網羅性と、前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせのうち、前記病原性微生物塩基配列情報のうちの一の情報に対しＲＮＡ干渉可能な前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報が幾つあるかに関する重複性と、に基づいて、前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせを選択することにより行う。これにより、ゲノム多様性をもつ病原性微生物において、広汎なゲノム配列に効くとともに、ブレークスルー変異が出現する確率をより少なくすることができるＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物を作製できる。なお、転写産物とは、ゲノム又はその特定部分配列の転写とかかる転写後のスプライシングにより取得されるものを含む。転写産物では、例えば、スプライシングにより取得される、ゲノム自体には存在しない塩基配列が存在する。ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドはこのような転写産物特有の塩基配列に対してＲＮＡ干渉を起こしてもよい。
請求項２に記載の発明によれば、前記網羅性と前記重複性とを高めるように前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせを選択する。従って、ゲノム多様性をもつ病原性微生物において、広汎なゲノム配列に効くとともに、ブレークスルー変異が出現する確率をより少なくすることができるＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物を作製できる。
請求項３に記載の発明によれば、前記網羅性を前記重複性よりも優先して前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせを選択する。従って、ゲノム多様性をもつ病原性微生物において、広汎なゲノム配列に効くＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物を優先的に作製できる。
請求項４に記載の発明によれば、前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド情報取得工程で取得した前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの複数の塩基配列情報の各々について、前記病原性微生物塩基配列情報の集合におけるＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド単独の網羅率を算出する。そして、算出した前記単独の網羅率に基づいてＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの、より好ましい組み合わせを検討する。組み合わせの検討は、前記単独の網羅率が高い前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報を複数選択して組み合わせ候補配列群を形成するとともに、前記組み合わせ候補配列群から所定数の前記塩基配列情報を選択して組み合わせ、組成の異なる複数の組み合わせを特定する組み合わせ候補特定工程と、特定した前記複数の組み合わせの各々について、一の組み合わせにおける前記病原性微生物塩基配列情報の集合における網羅率を算出する網羅率算出工程と、算出した組み合わせの網羅率を前記複数の組み合わせの間で比較する比較工程とを含む。これにより、広汎なゲノム配列に効くとともに、ブレークスルー変異の出現の確率をより少なくすることができるＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物を構成するＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせを選択できる。
請求項５に記載の発明によれば、前記組み合わせ検討工程は、前記組み合わせ候補配列群から選択する前記塩基配列情報の数を変化させるとともに、変化させた各々の場合について、前記組み合わせ候補特定工程と、前記網羅率算出工程と、前記比較工程とを実行し、所定の終了条件を満たすまで当該一連の処理を繰り返す。これにより、効率的に、広汎なゲノム配列に効くとともに、ブレークスルー変異の出現の確率をより少なくすることができるＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物を構成するＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせを選択できる。
また、前記組み合わせ検討工程は、前記病原性微生物塩基配列情報取得工程で複数取得した前記病原性微生物塩基配列情報の各一の病原性微生物塩基配列情報についての重複性に基づいて、前記組み合わせ候補特定工程で取得した複数の前記組み合わせの各々について、前記病原性微生物塩基配列情報の集合に対する前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドが重複する前記病原性微生物塩基配列情報の割合を示す指標である組み合わせ内重複率を算出する重複率算出工程を含み、前記比較工程は、算出した前記組み合わせ内重複率を前記複数の組み合わせの間で比較する工程をさらに含む。これにより、前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせにおける複数のＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドがＲＮＡ干渉可能であることを示す指標である組み合わせ内重複率にさらに基づいてＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物を構成するＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせを選択できる。従って、ブレークスルー変異の出現の確率をより少なくすることができるＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物を構成するＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせを選択できる。
請求項６に記載の発明によれば、病原性微生物の塩基配列情報のデータベースから前記病原性微生物のゲノム又は転写産物もしくはこれらの特定の部分配列の病原性微生物塩基配列情報を取得する。これにより、病原性微生物の塩基配列情報のデータベースを用いて、広汎なゲノム配列に効くとともに、ブレークスルー変異が出現する確率をより少なくすることができるＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物を作製できる。
請求項４に記載の発明によれば、前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド情報取得工程で取得した前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの複数の塩基配列情報の各々について、前記病原性微生物塩基配列情報の集合におけるＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド単独の網羅率を算出する。そして、算出した前記単独の網羅率に基づいてＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの、より好ましい組み合わせを検討する。組み合わせの検討は、前記単独の網羅率が高い前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報を複数選択して組み合わせ候補配列群を形成するとともに、前記組み合わせ候補配列群から所定数の前記塩基配列情報を選択して組み合わせ、組成の異なる複数の組み合わせを特定する組み合わせ候補特定工程と、特定した前記複数の組み合わせの各々について、一の組み合わせにおける前記病原性微生物塩基配列情報の集合における網羅率を算出する網羅率算出工程と、算出した組み合わせの網羅率を前記複数の組み合わせの間で比較する比較工程とを含む。これにより、広汎なゲノム配列に効くとともに、ブレークスルー変異の出現の確率をより少なくすることができるＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物を構成するＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせを選択できる。
請求項５に記載の発明によれば、前記組み合わせ検討工程は、前記組み合わせ候補配列群から選択する前記塩基配列情報の数を変化させるとともに、変化させた各々の場合について、前記組み合わせ候補特定工程と、前記網羅率算出工程と、前記比較工程とを実行し、所定の終了条件を満たすまで当該一連の処理を繰り返す。これにより、効率的に、広汎なゲノム配列に効くとともに、ブレークスルー変異の出現の確率をより少なくすることができるＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物を構成するＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせを選択できる。
また、前記組み合わせ検討工程は、前記病原性微生物塩基配列情報取得工程で複数取得した前記病原性微生物塩基配列情報の各一の病原性微生物塩基配列情報についての重複性に基づいて、前記組み合わせ候補特定工程で取得した複数の前記組み合わせの各々について、前記病原性微生物塩基配列情報の集合に対する前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドが重複する前記病原性微生物塩基配列情報の割合を示す指標である組み合わせ内重複率を算出する重複率算出工程を含み、前記比較工程は、算出した前記組み合わせ内重複率を前記複数の組み合わせの間で比較する工程をさらに含む。これにより、前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせにおける複数のＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドがＲＮＡ干渉可能であることを示す指標である組み合わせ内重複率にさらに基づいてＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物を構成するＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせを選択できる。従って、ブレークスルー変異の出現の確率をより少なくすることができるＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物を構成するＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせを選択できる。
請求項６に記載の発明によれば、病原性微生物の塩基配列情報のデータベースから前記病原性微生物のゲノム又は転写産物もしくはこれらの特定の部分配列の病原性微生物塩基配列情報を取得する。これにより、病原性微生物の塩基配列情報のデータベースを用いて、広汎なゲノム配列に効くとともに、ブレークスルー変異が出現する確率をより少なくすることができるＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物を作製できる。
請求項７に記載の発明によれば、宿主に感染している前記病原性微生物のゲノム解析の結果に基づいて前記病原性微生物のゲノム又は転写産物もしくはこれらの特定の部分配列の病原性微生物塩基配列情報を取得する。これにより、宿主に感染している病原性微生物のゲノム配列に効くとともに、ブレークスルー変異が出現する確率をより少なくすることができるＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物を作製できる。
請求項８に記載の発明によれば、前記病原性微生物をＲＮＡウイルスとすることができる。
請求項９に記載の発明によれば、前記病原性微生物をヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ＳＡＲＳ、コロナウイルス、マラリア原虫、真菌のいずれか１つとすることができる。
請求項１０に記載の発明によれば、以下の手段を備えた、病原性微生物のゲノム又は転写産物もしくはこれらの特定の部分配列に含まれる標的サイトに対してＲＮＡ干渉を生じさせるＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドを複数種類含むＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の設計装置を提供する。すなわち、前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の設計装置は、前記病原性微生物のゲノム又は転写産物もしくはこれらの特定の部分配列についての病原性微生物塩基配列情報を複数取得する病原性微生物塩基配列情報取得手段と、取得した病原性微生物塩基配列情報に基づいて、前記病原性微生物の前記標的サイトの塩基配列情報を複数取得する標的サイト情報取得手段と、取得した前記標的サイトの複数の塩基配列情報に基づいて、前記標的サイトに対してＲＮＡ干渉を生じさせるＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報を複数取得するＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド情報取得手段と、取得した前記複数のＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報から、前記病原性微生物のゲノム多様性および変異の発生に対応可能なＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせを選択して、より好ましい組み合わせ情報を取得する組み合わせ選択手段と、を備える。そして、前記組み合わせ選択手段は、ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせが、前記病原性微生物塩基配列情報取得手段で取得した複数の前記病原性微生物塩基配列情報のうちのいくつの前記病原性微生物塩基配列情報に対してＲＮＡ干渉可能かに関する網羅性と、前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせのうち、前記病原性微生物塩基配列情報のうちの一の情報に対しＲＮＡ干渉可能な前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報が幾つあるかに関する重複性と、に基づいて、前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせを選択する。これにより、ゲノム多様性をもつ病原性微生物において、広汎なゲノム配列に効くとともに、ブレークスルー変異が出現する確率をより少なくすることができるＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物を設計できる。
請求項８に記載の発明によれば、前記病原性微生物をＲＮＡウイルスとすることができる。
請求項９に記載の発明によれば、前記病原性微生物をヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ＳＡＲＳ、コロナウイルス、マラリア原虫、真菌のいずれか１つとすることができる。
請求項１０に記載の発明によれば、以下の手段を備えた、病原性微生物のゲノム又は転写産物もしくはこれらの特定の部分配列に含まれる標的サイトに対してＲＮＡ干渉を生じさせるＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドを複数種類含むＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の設計装置を提供する。すなわち、前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の設計装置は、前記病原性微生物のゲノム又は転写産物もしくはこれらの特定の部分配列についての病原性微生物塩基配列情報を複数取得する病原性微生物塩基配列情報取得手段と、取得した病原性微生物塩基配列情報に基づいて、前記病原性微生物の前記標的サイトの塩基配列情報を複数取得する標的サイト情報取得手段と、取得した前記標的サイトの複数の塩基配列情報に基づいて、前記標的サイトに対してＲＮＡ干渉を生じさせるＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報を複数取得するＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド情報取得手段と、取得した前記複数のＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報から、前記病原性微生物のゲノム多様性および変異の発生に対応可能なＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせを選択して、より好ましい組み合わせ情報を取得する組み合わせ選択手段と、を備える。そして、前記組み合わせ選択手段は、ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせが、前記病原性微生物塩基配列情報取得手段で取得した複数の前記病原性微生物塩基配列情報のうちのいくつの前記病原性微生物塩基配列情報に対してＲＮＡ干渉可能かに関する網羅性と、前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせのうち、前記病原性微生物塩基配列情報のうちの一の情報に対しＲＮＡ干渉可能な前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報が幾つあるかに関する重複性と、に基づいて、前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせを選択する。これにより、ゲノム多様性をもつ病原性微生物において、広汎なゲノム配列に効くとともに、ブレークスルー変異が出現する確率をより少なくすることができるＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物を設計できる。
請求項１１に記載の発明によれば、コンピュータを用いて、以下のようにして、病原性微生物のゲノム又は転写産物もしくはこれらの特定の部分配列に含まれる標的サイトに対してＲＮＡ干渉を生じさせるＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドを複数種類含むＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物を設計する。すなわち、前記病原性微生物のゲノム又は転写産物もしくはこれらの特定の部分配列についての病原性微生物塩基配列情報を複数取得し、取得した前記病原性微生物塩基配列情報に基づいて、前記病原性微生物の前記標的サイトの塩基配列情報を複数取得する。そして、取得した標的サイトの複数の塩基配列情報に基づいて、標的サイトに対してＲＮＡ干渉を生じさせるＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報を複数取得する。そして、取得した複数のＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報から、病原性微生物のゲノム多様性および変異の発生に対応可能なＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせを選択して、より好ましい組み合わせ情報を取得する。組み合わせの選択は、ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせが、前記病原性微生物塩基配列情報取得手段で取得した複数の前記病原性微生物塩基配列情報のうちのいくつの前記病原性微生物塩基配列情報に対してＲＮＡ干渉可能かに関する網羅性と、前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせのうち、前記病原性微生物塩基配列情報のうちの一の情報に対しＲＮＡ干渉可能な前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報が幾つあるかに関する重複性と、に基づいて、前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせを選択することにより行う。これにより、ゲノム多様性をもつ病原性微生物において、広汎なゲノム配列に効くとともに、ブレークスルー変異が出現する確率をより少なくすることができるＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物を設計できる。
本発明によれば、高いゲノム多様性をもち、頻繁に変異が発生する病原性微生物に対して、広汎かつ高い有効性を有するＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物を提供できる。
以下、本発明を具体化した一実施形態を図１〜図３を用いて説明する。本実施形態では、高いゲノム多様性をもち、頻繁に変異が発生する病原性微生物に対して、広汎かつ高い有効性を有するＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の設計方法、ＲＮＡ干渉ポリヌクレオ
チド混合物の設計装置、ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の作製方法、ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の設計プログラム、及びＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物について説明する。
本実施形態では、ｓｉＲＮＡがＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドに該当する。ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドはＲＮＡ型及びＤＮＡ型のいずれであってよく、例えば、ＲＮＡ型のものとしてはｓｉＲＮＡ、また、ＤＮＡ型のものとしてはｓｈＲＮＡ発現ベクターやｓｉＲＮＡ発現２本鎖ＤＮＡ断片が挙げられる。ここでは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）に対して、広汎かつ高い有効性を有するｓｉＲＮＡ混合物（ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物に相当）を構成するｓｉＲＮＡ混合物の設計方法、設計装置、作製方法、設計プログラム、及び、これらにより取得されるｓｉＲＮＡ混合物について説明する。
本実施形態では、ＨＩＶの配列データベース（http://www.hiv.lanl.gov/）に全長又はほぼ全長のゲノムが登録された４００近くのＨＩＶ−１ゲノム配列を対象として、汎用的なｓｉＲＮＡ混合物（カクテル）を構成するｓｉＲＮＡを選択する場合について説明する。このようにして選択されたｓｉＲＮＡのカクテルは、患者に感染しているＨＩＶ−１のゲノム配列が不明な場合でも、有効であると期待される。
チド混合物の設計装置、ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の作製方法、ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の設計プログラム、及びＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物について説明する。
本実施形態では、ｓｉＲＮＡがＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドに該当する。ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドはＲＮＡ型及びＤＮＡ型のいずれであってよく、例えば、ＲＮＡ型のものとしてはｓｉＲＮＡ、また、ＤＮＡ型のものとしてはｓｈＲＮＡ発現ベクターやｓｉＲＮＡ発現２本鎖ＤＮＡ断片が挙げられる。ここでは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）に対して、広汎かつ高い有効性を有するｓｉＲＮＡ混合物（ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物に相当）を構成するｓｉＲＮＡ混合物の設計方法、設計装置、作製方法、設計プログラム、及び、これらにより取得されるｓｉＲＮＡ混合物について説明する。
本実施形態では、ＨＩＶの配列データベース（http://www.hiv.lanl.gov/）に全長又はほぼ全長のゲノムが登録された４００近くのＨＩＶ−１ゲノム配列を対象として、汎用的なｓｉＲＮＡ混合物（カクテル）を構成するｓｉＲＮＡを選択する場合について説明する。このようにして選択されたｓｉＲＮＡのカクテルは、患者に感染しているＨＩＶ−１のゲノム配列が不明な場合でも、有効であると期待される。
図１に示すように、設計装置２０は、制御部２１、入力部２２、出力部２３及び記憶部２４を備えている。
制御部２１は、図示しない制御手段（ＣＰＵ）、記憶手段（ＲＡＭ、ＲＯＭ等）を有し、ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の設計プログラムを実行することにより、後述する処理を行う。
制御部２１は、図示しない制御手段（ＣＰＵ）、記憶手段（ＲＡＭ、ＲＯＭ等）を有し、ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の設計プログラムを実行することにより、後述する処理を行う。
制御部２１は、ゲノム情報取得手段、標的サイト情報取得手段、ｓｉＲＮＡ情報取得手段、単独網羅率算出手段、組み合わせ候補特定手段、網羅率算出手段、重複率算出手段、比較手段、終了条件判定手段、組み合わせ特定手段を備えている。
ゲノム情報取得手段は、病原性微生物としてのＨＩＶ−１のゲノム情報を取得する。このゲノム情報取得手段は、特許請求の範囲に記載の病原性微生物塩基配列情報取得手段として機能する。
標的サイト情報取得手段は、ＨＩＶ−１のゲノム情報に基づいて、ＨＩＶ−１ゲノムのｓｉＲＮＡの標的サイトの塩基配列情報を取得する。この標的サイト情報取得手段は、特許請求の範囲に記載の標的サイト情報取得手段として機能する。
ゲノム情報取得手段は、病原性微生物としてのＨＩＶ−１のゲノム情報を取得する。このゲノム情報取得手段は、特許請求の範囲に記載の病原性微生物塩基配列情報取得手段として機能する。
標的サイト情報取得手段は、ＨＩＶ−１のゲノム情報に基づいて、ＨＩＶ−１ゲノムのｓｉＲＮＡの標的サイトの塩基配列情報を取得する。この標的サイト情報取得手段は、特許請求の範囲に記載の標的サイト情報取得手段として機能する。
ｓｉＲＮＡ情報取得手段は、取得した標的サイトの塩基配列情報に基づいて、標的サイトに対してＲＮＡ干渉を生じさせるＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報を取得する。このｓｉＲＮＡ情報取得手段は、特許請求の範囲に記載のＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド情報取得手段として機能する。
単独網羅率算出手段は、各ｓｉＲＮＡの単独の網羅率を算出する。組み合わせ候補特定手段は、単独の網羅率が高いｓｉＲＮＡ配列を複数選択して組み合わせ候補配列群を形成するとともに、この候補配列群から所定数の塩基配列情報を選択して組み合わせ、組成の異なる複数の組み合わせを特定する。網羅率算出手段は、特定した複数の組み合わせの各々について、一の組み合わせにおける網羅率を算出する。重複率算出手段は、特定した複数の組み合わせの各々について、一の組み合わせにおける重複率を算出する。比較手段は、算出した組み合わせの網羅率及び重複率を、組み合わせ候補特定手段により特定した複数の組み合わせの間で比較する。終了条件判定手段は、組み合わせ検討処理を終了するかどうかの判定を行う。組み合わせ特定手段は、組み合わせ検討処理の結果に基づいて、ｓｉＲＮＡの組み合わせを選択する。すなわち、単独網羅率算出手段、組み合わせ候補特定手段、網羅率算出手段、重複率算出手段、比較手段、終了条件判定手段及び組み合わせ特定手段は、特許請求の範囲に記載の組み合わせ選択手段として機能する。
制御部２１は、後述する処理を行い、ｓｉＲＮＡの設計を行うとともに、カクテルを構
成する複数のｓｉＲＮＡを選択する。
入力部２２は、キーボード、マウス等で構成され、カクテルを構成するｓｉＲＮＡの個数（ｎ個）を入力する場合等に使用される。
制御部２１は、後述する処理を行い、ｓｉＲＮＡの設計を行うとともに、カクテルを構
成する複数のｓｉＲＮＡを選択する。
入力部２２は、キーボード、マウス等で構成され、カクテルを構成するｓｉＲＮＡの個数（ｎ個）を入力する場合等に使用される。
出力部２３は、ディスプレイ装置等の出力装置に接続される。本実施形態では、カクテル（ｓｉＲＮＡ混合物）を構成する選択されたｓｉＲＮＡに関する情報を表示する。
記憶部２４は、ハードディスク等の記憶装置であって、ＨＩＶ−１配列データ記憶部２５、ＨＩＶ−１配列／ｓｉＲＮＡデータ記憶部２６及びカクテルデータ記憶部２７を備えている。
記憶部２４は、ハードディスク等の記憶装置であって、ＨＩＶ−１配列データ記憶部２５、ＨＩＶ−１配列／ｓｉＲＮＡデータ記憶部２６及びカクテルデータ記憶部２７を備えている。
ＨＩＶ−１配列データ記憶部２５には、ＨＩＶ−１ゲノム配列に関するデータを記録する。このデータは、公的なＨＩＶの配列データベースに登録されたデータ、具体的には、ＨＩＶの配列データベース(http://www.hiv.lanl.gov/)よりダウンロードすることにより入手可能である。本実施形態では、外部システム４０のＨＩＶの配列データベース４５に全長又はほぼ全長のゲノムが登録された、４００近くのＨＩＶ−１ゲノム配列を入手し、ＨＩＶ−１配列データ記憶部２５に記録する。
ＨＩＶ−１配列／ｓｉＲＮＡデータ記憶部２６には、ＨＩＶ−１配列データ記憶部２５に記録されたＨＩＶ−１ゲノム配列について所定のガイドライン、例えば、Ｕｉ−Ｔｅｉらによるガイドライン（Ui-Tei,K., Naito,Y., Takahashi,F., Haraguchi,T., Ohki-Hamazaki,H., Juni,A., Ueda,R. an d Saigo,K., 'Guidelines for the selection of highly
effective siRNA sequences for mammalian and chick RNA interference', Nucleic Acids Research, 2004, Vol. 32, No.3, 936-948）に従って設計されたｓｉＲＮＡ配列に関するデータを記録する。具体的には、（１）アンチセンス鎖の５’末端がＡ又はＵであり、（２）センス鎖の５’末端がＧ又はＣであり、（３）アンチセンス鎖の５’の７塩基中の４塩基以上はＡ又はＵであり、（４）１０塩基以上のＧＣ連続配列が存在しない、という条件を満たすという条件に従ってｓｉＲＮＡ配列を設計し、このｓｉＲＮＡ配列に関するデータを記録する。さらに、各ｓｉＲＮＡが、それぞれ、どのＨＩＶ−１ゲノム配列を標的としうるかについて、ｓｉＲＮＡ配列とＨＩＶ−１ゲノム配列とを関連付けて記録する。具体的には、後述する図２と同様のマトリックスを記録する。なお、ｓｉＲＮＡの設計について用いるガイドラインは上記に限定されるものではない。
effective siRNA sequences for mammalian and chick RNA interference', Nucleic Acids Research, 2004, Vol. 32, No.3, 936-948）に従って設計されたｓｉＲＮＡ配列に関するデータを記録する。具体的には、（１）アンチセンス鎖の５’末端がＡ又はＵであり、（２）センス鎖の５’末端がＧ又はＣであり、（３）アンチセンス鎖の５’の７塩基中の４塩基以上はＡ又はＵであり、（４）１０塩基以上のＧＣ連続配列が存在しない、という条件を満たすという条件に従ってｓｉＲＮＡ配列を設計し、このｓｉＲＮＡ配列に関するデータを記録する。さらに、各ｓｉＲＮＡが、それぞれ、どのＨＩＶ−１ゲノム配列を標的としうるかについて、ｓｉＲＮＡ配列とＨＩＶ−１ゲノム配列とを関連付けて記録する。具体的には、後述する図２と同様のマトリックスを記録する。なお、ｓｉＲＮＡの設計について用いるガイドラインは上記に限定されるものではない。
なお、一般的に、ｓｉＲＮＡは、分解したいｍＲＮＡの一部に対応する２１塩基（もしくは、オーバーハングも考慮して２３塩基）の配列から設計する。ＨＩＶ−１がコードするタンパクのｍＲＮＡに対応する２１塩基を使ってゲノムを分解するものでもよいし、ＨＩＶ−１はゲノム自体がプラス鎖ＲＮＡなので、ゲノム配列の一部に対応する２１塩基を使ってゲノムを分解するものでもよい。
カクテルデータ記憶部２７には、選択された複数のｓｉＲＮＡの配列に関するデータが記録される。
（ｓｉＲＮＡのカクテルの網羅率及び重複率）
次に、本発明におけるｓｉＲＮＡの混合物（カクテル）の網羅率及び重複率について説明する。
（ｓｉＲＮＡのカクテルの網羅率及び重複率）
次に、本発明におけるｓｉＲＮＡの混合物（カクテル）の網羅率及び重複率について説明する。
ＨＩＶ−１に対するｓｉＲＮＡについて効果的なカクテルを作製するためには、「カクテルのＨＩＶ−１の集合に対する網羅率（coverage）」と「各ＨＩＶ−１についての重複性（或いは冗長性）（redundancy）」という２つの指標を考慮する必要がある。
「カクテルのＨＩＶ−１の集合に対する網羅率（coverage）」とは、あるカクテルがＨＩＶ−１の配列の集合のうちのどのくらいの割合に対して効くかということに対する指標
である。ここで言う「効く」とは、カクテルに含まれるｓｉＲＮＡの最低１種類が、ＨＩＶ−１の配列に完全一致している状態をいう。網羅率が高ければ、対象のＨＩＶ−１配列が未知であっても、そのカクテルが有効である確率が高くなると考えられる。
図２を用いて具体的に説明する。図２には、１０種類のＨＩＶ−１配列と１０種類のｓｉＲＮＡから構成される表が示されている。この表において、ｓｉＲＮＡが標的にできるＨＩＶ−１配列について、「×」が示されている。例えば、「ｓｉＲＮＡ＿００１」が標的にできるＨＩＶ−１配列は、「ＨＩＶ＿００１」、「ＨＩＶ＿００４」、「ＨＩＶ＿００７」、「ＨＩＶ＿００９」である。この表の下には、各ｓｉＲＮＡについて、それぞれ標的にできるＨＩＶ−１配列の個数が示されている。例えば、「ｓｉＲＮＡ＿００１」が標的にできるＨＩＶ−１配列の個数は、「４」である。この個数を、対象とするＨＩＶ−１配列の個数で割ったものが、このｓｉＲＮＡの単独の網羅率となる。すなわち、「ＨＩＶ＿００１」〜「ＨＩＶ＿０１０」の１０個のＨＩＶ−１（これが請求項４等における「病原性微生物塩基配列情報の集合」に相当）に対して「ｓｉＲＮＡ＿００１」の単独の網羅率は「０．４」である。
である。ここで言う「効く」とは、カクテルに含まれるｓｉＲＮＡの最低１種類が、ＨＩＶ−１の配列に完全一致している状態をいう。網羅率が高ければ、対象のＨＩＶ−１配列が未知であっても、そのカクテルが有効である確率が高くなると考えられる。
図２を用いて具体的に説明する。図２には、１０種類のＨＩＶ−１配列と１０種類のｓｉＲＮＡから構成される表が示されている。この表において、ｓｉＲＮＡが標的にできるＨＩＶ−１配列について、「×」が示されている。例えば、「ｓｉＲＮＡ＿００１」が標的にできるＨＩＶ−１配列は、「ＨＩＶ＿００１」、「ＨＩＶ＿００４」、「ＨＩＶ＿００７」、「ＨＩＶ＿００９」である。この表の下には、各ｓｉＲＮＡについて、それぞれ標的にできるＨＩＶ−１配列の個数が示されている。例えば、「ｓｉＲＮＡ＿００１」が標的にできるＨＩＶ−１配列の個数は、「４」である。この個数を、対象とするＨＩＶ−１配列の個数で割ったものが、このｓｉＲＮＡの単独の網羅率となる。すなわち、「ＨＩＶ＿００１」〜「ＨＩＶ＿０１０」の１０個のＨＩＶ−１（これが請求項４等における「病原性微生物塩基配列情報の集合」に相当）に対して「ｓｉＲＮＡ＿００１」の単独の網羅率は「０．４」である。
「カクテルのＨＩＶ−１に対する網羅率（coverage)」について、「ｓｉＲＮＡ＿００
６」及び「ｓｉＲＮＡ＿００７」により構成されるカクテルを例にして説明する。「ｓｉＲＮＡ＿００６」及び「ｓｉＲＮＡ＿００７」の少なくともいずれか１つが効くＨＩＶ−１配列は、「ＨＩＶ＿００１」、「ＨＩＶ＿００３」、「ＨＩＶ＿００５」、「ＨＩＶ＿００６」、「ＨＩＶ＿００７」、「ＨＩＶ＿００８」、「ＨＩＶ＿００９」、「ＨＩＶ＿００１０」の合計８個である。すなわち、「ｓｉＲＮＡ＿００６」及び「ｓｉＲＮＡ＿００７」により構成されるカクテルの網羅率は「０．８」である。
「各ＨＩＶ−１についての重複性（或いは冗長性）（redundancy）」とは、ある１つのＨＩＶ−１配列に着目したときに、カクテル中のｓｉＲＮＡのうち、何種類のｓｉＲＮＡが効くか（ＨＩＶ−１の配列に完全に一致するか）ということに関する指標である。特定のＨＩＶ−１について重複性が高ければ、このＨＩＶ−１が耐性を獲得する確率を下げることができる。従って、このＨＩＶ−１が耐性を獲得するまでの時間を引き伸ばすことができる。
６」及び「ｓｉＲＮＡ＿００７」により構成されるカクテルを例にして説明する。「ｓｉＲＮＡ＿００６」及び「ｓｉＲＮＡ＿００７」の少なくともいずれか１つが効くＨＩＶ−１配列は、「ＨＩＶ＿００１」、「ＨＩＶ＿００３」、「ＨＩＶ＿００５」、「ＨＩＶ＿００６」、「ＨＩＶ＿００７」、「ＨＩＶ＿００８」、「ＨＩＶ＿００９」、「ＨＩＶ＿００１０」の合計８個である。すなわち、「ｓｉＲＮＡ＿００６」及び「ｓｉＲＮＡ＿００７」により構成されるカクテルの網羅率は「０．８」である。
「各ＨＩＶ−１についての重複性（或いは冗長性）（redundancy）」とは、ある１つのＨＩＶ−１配列に着目したときに、カクテル中のｓｉＲＮＡのうち、何種類のｓｉＲＮＡが効くか（ＨＩＶ−１の配列に完全に一致するか）ということに関する指標である。特定のＨＩＶ−１について重複性が高ければ、このＨＩＶ−１が耐性を獲得する確率を下げることができる。従って、このＨＩＶ−１が耐性を獲得するまでの時間を引き伸ばすことができる。
例えば、「ｓｉＲＮＡ＿００６」及び「ｓｉＲＮＡ＿００７」により構成されるカクテルは、「ＨＩＶ＿００１」については２種類のｓｉＲＮＡが効くこととなる。
ＨＩＶ−１配列の集合においては、集合を構成する各ＨＩＶ−１における重複性（或いは冗長性）（redundancy）が高いことが好ましい。「各ＨＩＶ−１についての重複性（或いは冗長性）（redundancy）」は、１つのＨＩＶ−１のゲノム配列に注目した場合の値であるため、ＨＩＶ−１配列の集合において、この集合における重複性（或いは冗長性）（redundancy）を定義する必要がある。ここでは、集合における重複性（或いは冗長性）（redundancy）を、網羅率についての概念を拡張した「集合の重複率」（以下、単に「重複率」という。）を用いて判断する。
ＨＩＶ−１配列の集合においては、集合を構成する各ＨＩＶ−１における重複性（或いは冗長性）（redundancy）が高いことが好ましい。「各ＨＩＶ−１についての重複性（或いは冗長性）（redundancy）」は、１つのＨＩＶ−１のゲノム配列に注目した場合の値であるため、ＨＩＶ−１配列の集合において、この集合における重複性（或いは冗長性）（redundancy）を定義する必要がある。ここでは、集合における重複性（或いは冗長性）（redundancy）を、網羅率についての概念を拡張した「集合の重複率」（以下、単に「重複率」という。）を用いて判断する。
すなわち、網羅率についての概念を以下のように拡張する。例えば、「第１の網羅率」を、ＨＩＶ−１配列の集合において、あるカクテルを構成するｓｉＲＮＡのうち最低１つが標的とするＨＩＶ−１配列の割合と定義する。また、「第２の網羅率」を、ＨＩＶ−１配列の集合において、あるカクテルを構成するｓｉＲＮＡのうち２つ以上が標的とするＨＩＶ−１配列の割合と定義する。「第３の網羅率」を、ＨＩＶ−１配列の集合において、あるカクテルを構成するｓｉＲＮＡのうち３つ以上が標的とするＨＩＶ−１配列の割合と定義する。このように、「第ｎの網羅率」を、ＨＩＶ−１配列の集合において、あるカクテルを構成するｓｉＲＮＡのうちｎ個以上が標的とするＨＩＶ−１配列の割合と定義する。
ここで、先に説明した網羅率は、「第１の網羅率」に一致する。一方、重複率について
は、本実施形態では、ＨＩＶ−１配列の集合において、２種類以上のｓｉＲＮＡが効くＨＩＶ−１配列の割合と定義する。すなわち、本実施形態では、重複率は、上記の「第２の網羅率」に該当する。
例えば、「ｓｉＲＮＡ＿００５」、「ｓｉＲＮＡ＿００６」及び「ｓｉＲＮＡ＿００７」により構成されるカクテルにおいて、２つ以上のｓｉＲＮＡが効くＨＩＶ−１配列は、「ＨＩＶ＿００１」，「ＨＩＶ＿００３」，「ＨＩＶ＿００５」，「ＨＩＶ＿００８」，「ＨＩＶ＿００１０」の合計５個である。したがって、「ＨＩＶ＿００１」〜「ＨＩＶ＿０１０」の１０個のＨＩＶ−１（「病原性微生物塩基配列情報の集合」に相当）に対してカクテルの重複率（請求項６における組み合わせ内重複率に相当）は「０．５」である。
なお、ＨＩＶ−１配列の集合における３種類以上のｓｉＲＮＡが効くＨＩＶ−１配列の割合等、ｎ（ｎ≧３）種類以上のｓｉＲＮＡが効く割合を考慮して重複率を定める場合については後述する。
は、本実施形態では、ＨＩＶ−１配列の集合において、２種類以上のｓｉＲＮＡが効くＨＩＶ−１配列の割合と定義する。すなわち、本実施形態では、重複率は、上記の「第２の網羅率」に該当する。
例えば、「ｓｉＲＮＡ＿００５」、「ｓｉＲＮＡ＿００６」及び「ｓｉＲＮＡ＿００７」により構成されるカクテルにおいて、２つ以上のｓｉＲＮＡが効くＨＩＶ−１配列は、「ＨＩＶ＿００１」，「ＨＩＶ＿００３」，「ＨＩＶ＿００５」，「ＨＩＶ＿００８」，「ＨＩＶ＿００１０」の合計５個である。したがって、「ＨＩＶ＿００１」〜「ＨＩＶ＿０１０」の１０個のＨＩＶ−１（「病原性微生物塩基配列情報の集合」に相当）に対してカクテルの重複率（請求項６における組み合わせ内重複率に相当）は「０．５」である。
なお、ＨＩＶ−１配列の集合における３種類以上のｓｉＲＮＡが効くＨＩＶ−１配列の割合等、ｎ（ｎ≧３）種類以上のｓｉＲＮＡが効く割合を考慮して重複率を定める場合については後述する。
（カクテルを構成するｓｉＲＮＡの選択の例）
次に、カクテルの網羅率及び重複率を高めるようにｓｉＲＮＡを選択する場合の具体例を、図２を用いて説明する。
次に、カクテルの網羅率及び重複率を高めるようにｓｉＲＮＡを選択する場合の具体例を、図２を用いて説明する。
この表の例において、３つのｓｉＲＮＡを混合してカクテルを作製する場合について説明する。ここで、単独の網羅率の高いものから順番に２つのｓｉＲＮＡを選択すると、「ｓｉＲＮＡ＿００６」（７つ）と、「ｓｉＲＮＡ＿００９」（６つ）が選択される。ここで、カクテルがすべてのＨＩＶ−１配列に効く（カクテルの網羅率が「１」となる）ようにカクテルを構成するｓｉＲＮＡを選択することを考える。この場合、「ｓｉＲＮＡ＿００６」及び「ｓｉＲＮＡ＿００９」では網羅していない「ＨＩＶ＿００７」について効くｓｉＲＮＡを選択する必要がある。
ここでは、「ｓｉＲＮＡ＿００１」，「ｓｉＲＮＡ＿００７」，「ｓｉＲＮＡ＿０１０」が、「ＨＩＶ＿００７」に効く。このため、カクテルがすべてのＨＩＶ−１配列に効くようにｓｉＲＮＡを選択するためには、さらに、「ｓｉＲＮＡ＿００１」，「ｓｉＲＮＡ＿００７」，「ｓｉＲＮＡ＿０１０」のいずれかを選択すればよい。
ここで、さらに「ｓｉＲＮＡ＿０１０」を選択したとする。このカクテルを用いた場合、各ＨＩＶ−１配列を標的とできるｓｉＲＮＡの数は、以下のようになる。
「ＨＩＶ＿００１」に対しては「ｓｉＲＮＡ＿００６」が有効であり、有効なｓｉＲＮＡの数は「１」になる。「ＨＩＶ＿００２」は「２」、「ＨＩＶ＿００３」は「１」、「ＨＩＶ＿００４」は「２」、「ＨＩＶ＿００５」は「１」、「ＨＩＶ＿００６」は「２」、「ＨＩＶ＿００７」は「１」、「ＨＩＶ＿００８」は「２」、「ＨＩＶ＿００９」は「２」、ＨＩＶ＿０１０は「２」となる。
「ＨＩＶ＿００１」に対しては「ｓｉＲＮＡ＿００６」が有効であり、有効なｓｉＲＮＡの数は「１」になる。「ＨＩＶ＿００２」は「２」、「ＨＩＶ＿００３」は「１」、「ＨＩＶ＿００４」は「２」、「ＨＩＶ＿００５」は「１」、「ＨＩＶ＿００６」は「２」、「ＨＩＶ＿００７」は「１」、「ＨＩＶ＿００８」は「２」、「ＨＩＶ＿００９」は「２」、ＨＩＶ＿０１０は「２」となる。
カクテルの重複率を上げるためには、各ＨＩＶ−１配列を標的とできるｓｉＲＮＡの数について、２以上となるものが多くなるように選択する必要がある。なお、この例では、「ｓｉＲＮＡ＿００１」，「ｓｉＲＮＡ＿００７」，「ｓｉＲＮＡ＿０１０」のいずれを選択した場合も、重複率は「０．６」となる。
なお、実際には、これよりずっと多くのＨＩＶ−１配列やｓｉＲＮＡについて、カクテルを構成するｓｉＲＮＡの組み合わせを選択することとなる。このため、コンピュータを用いて、ｓｉＲＮＡの組み合わせそれぞれについて、カクテルの網羅率や重複率を算出し、最適な組み合わせを選択する。しかし、すべての組み合わせをチェックしようとすると計算に長時間を要する。
例えば、ｓｉＲＮＡの候補が１０個、ＨＩＶ−１の配列が１０個ある場合、ｎ個のｓｉ
ＲＮＡを混合したカクテルは、10Ｃn通り存在する。ｓｉＲＮＡの候補が多くなっており
、ｎが大きくなると、計算に長時間を要する。例えば、ｓｉＲＮＡの候補が１００００、ｎ＝７の場合、10000Ｃ7＝２×１０24通りを計算しなければならない。これは、実際上非常に困難なので、近似を考える。このための処理について、次に説明する。
ＲＮＡを混合したカクテルは、10Ｃn通り存在する。ｓｉＲＮＡの候補が多くなっており
、ｎが大きくなると、計算に長時間を要する。例えば、ｓｉＲＮＡの候補が１００００、ｎ＝７の場合、10000Ｃ7＝２×１０24通りを計算しなければならない。これは、実際上非常に困難なので、近似を考える。このための処理について、次に説明する。
（処理手順）
次に、網羅率及び重複率をより大きくし、オフターゲット効果の低いｓｉＲＮＡの組み合わせを選択する場合の処理手順を説明する。なお、オフターゲット効果とは、ＲＮＡ干渉の対象となるＨＩＶ−１の標的配列以外の遺伝子の発現に影響を与えることをいう。ｓｉＲＮＡにより宿主の遺伝子の発現が抑制されてしまうのは好ましくないため、オフターゲット効果の低いものを選択する必要がある。
本実施形態では、ＨＩＶの配列データベース４５から入手したＨＩＶ−１ゲノム配列について、ｓｉＲＮＡを設計し、ｓｉＲＮＡのカクテルを作製する。
次に、網羅率及び重複率をより大きくし、オフターゲット効果の低いｓｉＲＮＡの組み合わせを選択する場合の処理手順を説明する。なお、オフターゲット効果とは、ＲＮＡ干渉の対象となるＨＩＶ−１の標的配列以外の遺伝子の発現に影響を与えることをいう。ｓｉＲＮＡにより宿主の遺伝子の発現が抑制されてしまうのは好ましくないため、オフターゲット効果の低いものを選択する必要がある。
本実施形態では、ＨＩＶの配列データベース４５から入手したＨＩＶ−１ゲノム配列について、ｓｉＲＮＡを設計し、ｓｉＲＮＡのカクテルを作製する。
具体的には、まず、制御部２１は、病原性微生物塩基配列情報取得工程として、ゲノム情報取得手段により、ネットワーク５０を介してＨＩＶの配列データベース４５からＨＩＶ−１ゲノム配列に関するデータを入手し、ＨＩＶ−１配列データ記憶部２５に記録する。
そして、制御部２１は、標的サイト情報取得工程として、標的サイト情報取得手段により、ＨＩＶ−１配列データ記憶部２５に記録したＨＩＶ−１ゲノム配列について、上記の所定のガイドラインに従ってｓｉＲＮＡの標的サイトを特定し、特定した標的サイトに関する情報を取得する。
そして、制御部２１は、ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド情報取得工程として、ｓｉＲＮＡ情報取得手段により、標的サイトに関する情報に基づいて、ｓｉＲＮＡの配列情報を取得する。具体的には、ＨＩＶ−１ゲノム配列の標的サイトに関する情報に基づいて上述した所定のガイドラインに従って特定された標的サイトに対応するｓｉＲＮＡ配列を設計し、このｓｉＲＮＡ配列に関するデータをＨＩＶ−１配列／ｓｉＲＮＡデータ記憶部２６に記録する。さらに、制御部２１は、ｓｉＲＮＡ情報取得手段により、各ｓｉＲＮＡが、それぞれ、どのＨＩＶ−１ゲノム配列を標的としうるかについて、ｓｉＲＮＡ配列とＨＩＶ−１ゲノム配列とを関連付けてＨＩＶ−１配列／ｓｉＲＮＡデータ記憶部２６に記録する。具体的には、後述する図２と同様のマトリックスを記録する。本実施形態では、このマトリックスを用いて処理を行う。なお、ここでは、図２のマトリックスを用いて説明する。
そして、制御部２１は、標的サイト情報取得工程として、標的サイト情報取得手段により、ＨＩＶ−１配列データ記憶部２５に記録したＨＩＶ−１ゲノム配列について、上記の所定のガイドラインに従ってｓｉＲＮＡの標的サイトを特定し、特定した標的サイトに関する情報を取得する。
そして、制御部２１は、ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド情報取得工程として、ｓｉＲＮＡ情報取得手段により、標的サイトに関する情報に基づいて、ｓｉＲＮＡの配列情報を取得する。具体的には、ＨＩＶ−１ゲノム配列の標的サイトに関する情報に基づいて上述した所定のガイドラインに従って特定された標的サイトに対応するｓｉＲＮＡ配列を設計し、このｓｉＲＮＡ配列に関するデータをＨＩＶ−１配列／ｓｉＲＮＡデータ記憶部２６に記録する。さらに、制御部２１は、ｓｉＲＮＡ情報取得手段により、各ｓｉＲＮＡが、それぞれ、どのＨＩＶ−１ゲノム配列を標的としうるかについて、ｓｉＲＮＡ配列とＨＩＶ−１ゲノム配列とを関連付けてＨＩＶ−１配列／ｓｉＲＮＡデータ記憶部２６に記録する。具体的には、後述する図２と同様のマトリックスを記録する。本実施形態では、このマトリックスを用いて処理を行う。なお、ここでは、図２のマトリックスを用いて説明する。
そして、制御部２１は、組み合わせ選択工程として、以下の処理を行う。この処理を図３に従って説明する。
ユーザは、処理の開始要求を行う際に、カクテルを構成するｓｉＲＮＡ配列の数（ｎ個）の指定を行う。具体的には、ユーザは、入力部２２を用いてｓｉＲＮＡ配列の数を入力する。制御部２１は、このｓｉＲＮＡ配列の数（ｎ個）の入力を受け入れると、これを、選択するｓｉＲＮＡ配列の数として、制御部２１内の記憶手段に記録する。
ユーザは、処理の開始要求を行う際に、カクテルを構成するｓｉＲＮＡ配列の数（ｎ個）の指定を行う。具体的には、ユーザは、入力部２２を用いてｓｉＲＮＡ配列の数を入力する。制御部２１は、このｓｉＲＮＡ配列の数（ｎ個）の入力を受け入れると、これを、選択するｓｉＲＮＡ配列の数として、制御部２１内の記憶手段に記録する。
ｓｉＲＮＡ配列の数の設定が行われ、処理の開始要求が入力されると、制御部２１は、カクテルを構成するｓｉＲＮＡの候補を特定する（ステップＳ１）。具体的には、制御部２１は、まず、ゲノム情報取得手段により、ＨＩＶ−１配列／ｓｉＲＮＡデータ記憶部２６に記録されたＨＩＶ−１配列の中から、対象とするＨＩＶ−１配列の集合を特定し、ｓｉＲＮＡ情報取得手段により、この集合に含まれるＨＩＶ−１ゲノム配列を対象として設計されたｓｉＲＮＡを選択する。ここでは、ＨＩＶ−１の配列データベースに全長又はほぼ全長のゲノムが登録された４００近くのＨＩＶ−１ゲノム配列を対象として、これらのＨＩＶ−１ゲノム配列の標的サイトに対して設計されたｓｉＲＮＡを選択する。
そして、制御部２１は、単独網羅率算出工程として、単独網羅率算出手段により、各ｓ
ｉＲＮＡの単独の網羅率を算出する（ステップＳ２）。なお、単に、各ｓｉＲＮＡについて、標的にできるＨＩＶ−１配列の個数を算出してもよい。そして、算出した網羅率（又は個数）をｓｉＲＮＡの識別情報に関連付けて制御部２１内の記憶手段に記録する。上記の例では、図２のマトリックスの下に記載されたｓｉＲＮＡが標的にできるＨＩＶ−１の個数を、各ｓｉＲＮＡの識別情報に関連付けて記録する。
ｉＲＮＡの単独の網羅率を算出する（ステップＳ２）。なお、単に、各ｓｉＲＮＡについて、標的にできるＨＩＶ−１配列の個数を算出してもよい。そして、算出した網羅率（又は個数）をｓｉＲＮＡの識別情報に関連付けて制御部２１内の記憶手段に記録する。上記の例では、図２のマトリックスの下に記載されたｓｉＲＮＡが標的にできるＨＩＶ−１の個数を、各ｓｉＲＮＡの識別情報に関連付けて記録する。
次に、制御部２１は、組み合わせ検討工程として、以下に説明する組み合わせ検討処理を行う。まず、制御部２１は、初期値として変数ｋに０を代入する（ステップＳ３）。なお、変数ｋは、後述するように、０以上の整数が代入される。本実施形態では、後述するように網羅率及び重複率の増加傾向が飽和するまで繰り返して処理を行うため、検索対象のＨＩＶ−１配列の全体数をＮとすると、繰り返し処理の最大回数は、（Ｎ−ｎ＋１）回となり、ｋの最大値は（Ｎ−ｎ）となる。
そして、制御部２１は、組み合わせ候補特定手段により、組み合わせ候補特定工程を実行する。具体的には、単独の網羅率が上位ｎ＋ｋ個のｓｉＲＮＡを特定する（ステップＳ４）。図２の例を用いて、ｎ＝３として具体的に説明する。単独の網羅率の上位から順番に３個のｓｉＲＮＡ配列を選択すると、「ｓｉＲＮＡ＿００６」（０．７）、「ｓｉＲＮＡ＿００９」（０．６）、「ｓｉＲＮＡ＿００１」（０．４）となる。なお、網羅率が同じ場合、整列順に選択する。ここでは、「ｓｉＲＮＡ＿００１」、「ｓｉＲＮＡ＿００４」、「ｓｉＲＮＡ＿００５」及び「ｓｉＲＮＡ＿００７」が、網羅率が０．４で同じであるため、１番前に並べられている「ｓｉＲＮＡ＿００１」を優先的に選択する。
さらに、制御部２１は、網羅率算出手段により、網羅率算出工程を実行する。具体的には、上位ｎ＋ｋ個のうちの上位ｎ個についての組み合わせのうち、追加された組み合わせについて、それぞれ網羅率を算出する（ステップＳ５）。ここでは、ｋ＝０であり、特定された上位ｎ個の組み合わせが、新規組み合わせに相当するため、これについて網羅率を算出する。上記の例では、「ｓｉＲＮＡ＿００６」、「ｓｉＲＮＡ＿００９」及び「ｓｉＲＮＡ＿００１」の網羅率を算出する。ここで、図２のすべてのＨＩＶ−１配列には少なくとも１つのｓｉＲＮＡが効き、網羅率は「１」となる。
さらに、制御部２１は、重複率算出手段により、重複率算出工程を実行する。具体的には、上位ｎ＋ｋ個のうちの上位ｎ個についての組み合わせのうち、新規組み合わせについて、それぞれ重複率を算出する（ステップＳ６）。ここでは、ｋ＝０であり、特定された上位ｎ個の組み合わせが、新規組み合わせになるため、これについて重複率を算出する。なお、本実施形態では、重複率は、上述のように、ＨＩＶ−１配列の集合において、２種類以上のｓｉＲＮＡが効くＨＩＶ−１配列の割合とする。上記の例では、「ｓｉＲＮＡ＿００６」、「ｓｉＲＮＡ＿００９」及び「ｓｉＲＮＡ＿００１」の重複率を算出する。ここで、２つ以上のｓｉＲＮＡが効くＨＩＶ−１配列は、「ＨＩＶ＿００１」、「ＨＩＶ＿００４」、「ＨＩＶ＿００６」、「ＨＩＶ＿００８」、「ＨＩＶ＿００９」、「ＨＩＶ＿０１０」であり、重複率は「０．６」となる。
さらに、制御部２１は、網羅率算出手段により、網羅率算出工程を実行する。具体的には、上位ｎ＋ｋ個のうちの上位ｎ個についての組み合わせのうち、追加された組み合わせについて、それぞれ網羅率を算出する（ステップＳ５）。ここでは、ｋ＝０であり、特定された上位ｎ個の組み合わせが、新規組み合わせに相当するため、これについて網羅率を算出する。上記の例では、「ｓｉＲＮＡ＿００６」、「ｓｉＲＮＡ＿００９」及び「ｓｉＲＮＡ＿００１」の網羅率を算出する。ここで、図２のすべてのＨＩＶ−１配列には少なくとも１つのｓｉＲＮＡが効き、網羅率は「１」となる。
さらに、制御部２１は、重複率算出手段により、重複率算出工程を実行する。具体的には、上位ｎ＋ｋ個のうちの上位ｎ個についての組み合わせのうち、新規組み合わせについて、それぞれ重複率を算出する（ステップＳ６）。ここでは、ｋ＝０であり、特定された上位ｎ個の組み合わせが、新規組み合わせになるため、これについて重複率を算出する。なお、本実施形態では、重複率は、上述のように、ＨＩＶ−１配列の集合において、２種類以上のｓｉＲＮＡが効くＨＩＶ−１配列の割合とする。上記の例では、「ｓｉＲＮＡ＿００６」、「ｓｉＲＮＡ＿００９」及び「ｓｉＲＮＡ＿００１」の重複率を算出する。ここで、２つ以上のｓｉＲＮＡが効くＨＩＶ−１配列は、「ＨＩＶ＿００１」、「ＨＩＶ＿００４」、「ＨＩＶ＿００６」、「ＨＩＶ＿００８」、「ＨＩＶ＿００９」、「ＨＩＶ＿０１０」であり、重複率は「０．６」となる。
そして、制御部２１は、比較工程として、比較手段により、単独の網羅率が上位ｎ＋ｋ個のｓｉＲＮＡのうちのｎ個の組み合わせについての網羅率及び重複率に基づいて、より好ましいｓｉＲＮＡの組み合わせを特定する（ステップＳ７）。具体的には、これまでに制御部２１内の記憶手段に「ｋ−１」に関連付けて記録されている網羅率及び重複率、及び、新規組み合わせについて算出された網羅率及び重複率を比較し、最も網羅率が高く、かつ重複率が高い組み合わせを特定する。本実施形態では、網羅率を優先的に比較し、網羅率が同じ場合、重複率を比較する。そして、網羅率が最も高い組み合わせを特定する。また、網羅率が最も高い組み合わせが複数ある場合には、このうち重複率が最も高い組み合わせを特定する。ここでは、ｋ＝０であるため、これまでに、処理の回数に関連付けて記録されている網羅率及び重複率はない。このため、上位ｎ個の組み合わせが特定される。上記の例では、上位３個の「ｓｉＲＮＡ＿００６」、「ｓｉＲＮＡ＿００９」及び「ｓ
ｉＲＮＡ＿００１」の組み合わせが特定される。
ｉＲＮＡ＿００１」の組み合わせが特定される。
そして、制御部２１は、特定した組み合わせについて、ｓｉＲＮＡの識別情報と網羅率及び重複率とを、変数ｋに関連付けて制御部２１内の記憶手段に記録する（ステップＳ８）。ここでは、ｋ＝０に関連付けてｓｉＲＮＡの識別情報と網羅率及び重複率を記録する。上記の例では、ｋ＝０に関連付けて、「ｓｉＲＮＡ＿００６」、「ｓｉＲＮＡ＿００９」及び「ｓｉＲＮＡ＿００１」と、網羅率「１」及び重複率「０．６」を記録する。
そして、制御部２１は、終了条件判定手段により、変数ｋとの関係において、これまでに記憶手段に記録された組み合わせの網羅率及び重複率の推移を調べる（ステップＳ９）。本実施形態では、連続した所定の回数分の網羅率及び重複率を抽出し、これらの値の増加傾向が飽和しているかどうかを基準として調べる。網羅率及び重複率の増加傾向が飽和している場合、組み合わせが、より網羅率が高く重複率が高いという最適解に収束していることを示す。
そして、制御部２１は、終了条件判定手段により、終了条件を満たしているかどうかの判定を行う（ステップＳ１０）。本実施形態では、網羅率及び重複率がともに、所定の回数、連続して増加していない場合、繰り返し処理を終了する。ここでは、ｋ＝０であるため、終了条件を満たさない。終了条件を満たさない場合（ステップＳ１０においてＮＯの場合）、ｋ＋１をｋに代入する（ステップ１１）。そして、ステップＳ４の処理に戻る。そして、終了条件を満たすまで（ステップＳ１０においてＹＥＳとなるまで）、ステップＳ４〜Ｓ１０、及びステップＳ１１の処理を繰り返す。
ここで、ｋ＝１の場合について、図２を用いて説明する。ここで、ステップＳ４において、「ｓｉＲＮＡ＿００６」、「ｓｉＲＮＡ＿００９」、「ｓｉＲＮＡ＿００１」に加えて、新たに「ｓｉＲＮＡ＿００４」を特定する。そして、ステップＳ５において、新規の組み合わせとして、「ｓｉＲＮＡ＿００６」、「ｓｉＲＮＡ＿００９」及び「ｓｉＲＮＡ＿００４」の組み合わせ、「ｓｉＲＮＡ＿００９」、「ｓｉＲＮＡ＿００１」及び「ｓｉＲＮＡ＿００４」の組み合わせ、「ｓｉＲＮＡ＿００１」、「ｓｉＲＮＡ＿００６」及び「ｓｉＲＮＡ＿００４」の組み合わせについて、それぞれ網羅率を算出する。すなわち、ここで、網羅率を算出する組み合わせの数は、4Ｃ3−3Ｃ3となる。そして、ステップＳ６において、新規の組み合わせとして、これらの組み合わせについて、それぞれ重複率を算出する。
そして、ステップＳ７において、これまでに制御部２１内の記憶手段に「ｋ＝０」に関連付けて記録されている網羅率及び重複率、及び、新規組み合わせについて算出された網羅率及び重複率について、最も網羅率が高く、かつ重複率が高い組み合わせを特定する。すなわち、「ｋ＝０」に関連付けて記録されている「ｓｉＲＮＡ＿００６」、「ｓｉＲＮＡ＿００９」及び「ｓｉＲＮＡ＿００１」の組み合わせ、新規組み合わせである「ｓｉＲＮＡ＿００６」、「ｓｉＲＮＡ＿００９」及び「ｓｉＲＮＡ＿００４」の組み合わせ、「ｓｉＲＮＡ＿００９」、「ｓｉＲＮＡ＿００１」及び「ｓｉＲＮＡ＿００４」の組み合わせ、「ｓｉＲＮＡ＿００１」、「ｓｉＲＮＡ＿００６」及び「ｓｉＲＮＡ＿００４」の組み合わせについて、網羅率及び重複率を比較する。そして、最も網羅率が高く、かつ重複率が高い組み合わせを特定する。そして、このようにして特定した組み合わせについて、ステップＳ８において、ｓｉＲＮＡの識別情報と網羅率及び重複率とを、「ｋ＝１」に関連付けて制御部２１内の記憶手段に記録する。
そして、ステップＳ７において、これまでに制御部２１内の記憶手段に「ｋ＝０」に関連付けて記録されている網羅率及び重複率、及び、新規組み合わせについて算出された網羅率及び重複率について、最も網羅率が高く、かつ重複率が高い組み合わせを特定する。すなわち、「ｋ＝０」に関連付けて記録されている「ｓｉＲＮＡ＿００６」、「ｓｉＲＮＡ＿００９」及び「ｓｉＲＮＡ＿００１」の組み合わせ、新規組み合わせである「ｓｉＲＮＡ＿００６」、「ｓｉＲＮＡ＿００９」及び「ｓｉＲＮＡ＿００４」の組み合わせ、「ｓｉＲＮＡ＿００９」、「ｓｉＲＮＡ＿００１」及び「ｓｉＲＮＡ＿００４」の組み合わせ、「ｓｉＲＮＡ＿００１」、「ｓｉＲＮＡ＿００６」及び「ｓｉＲＮＡ＿００４」の組み合わせについて、網羅率及び重複率を比較する。そして、最も網羅率が高く、かつ重複率が高い組み合わせを特定する。そして、このようにして特定した組み合わせについて、ステップＳ８において、ｓｉＲＮＡの識別情報と網羅率及び重複率とを、「ｋ＝１」に関連付けて制御部２１内の記憶手段に記録する。
そして、終了条件を満たさない場合（ステップＳ１０においてＮＯの場合）、ｋ＋１をｋに代入し（ステップ１１）、ステップＳ４の処理に戻る。ここでは、ｋ＝１であるため、連続した所定の回数分の網羅率及び重複率の増加傾向が飽和しているという終了条件を満たさない。このため、ｋ＋１をｋに代入して「ｋ＝２」について、ステップＳ４以降の
処理を行う。これについて、次に説明する。
ここで、ステップＳ４において、「ｓｉＲＮＡ＿００６」、「ｓｉＲＮＡ＿００９」、「ｓｉＲＮＡ＿００１」、「ｓｉＲＮＡ＿００４」に加えて、新たに「ｓｉＲＮＡ＿００５」を特定する。そして、ステップＳ５において、新規の組み合わせとして、「ｓｉＲＮＡ＿００６」、「ｓｉＲＮＡ＿００９」、「ｓｉＲＮＡ＿００１」、「ｓｉＲＮＡ＿００４」のうちの２個に「ｓｉＲＮＡ＿００５」を加えたｎ個（３個）のｓｉＲＮＡ配列により構成される組み合わせについて、それぞれ網羅率を算出する。すなわち、ここで、網羅率を算出する組み合わせの数は、5Ｃ3−4Ｃ3となる。そして、ステップＳ６において、新規の組み合わせとして、これらの組み合わせについて、それぞれ重複率を算出する。
処理を行う。これについて、次に説明する。
ここで、ステップＳ４において、「ｓｉＲＮＡ＿００６」、「ｓｉＲＮＡ＿００９」、「ｓｉＲＮＡ＿００１」、「ｓｉＲＮＡ＿００４」に加えて、新たに「ｓｉＲＮＡ＿００５」を特定する。そして、ステップＳ５において、新規の組み合わせとして、「ｓｉＲＮＡ＿００６」、「ｓｉＲＮＡ＿００９」、「ｓｉＲＮＡ＿００１」、「ｓｉＲＮＡ＿００４」のうちの２個に「ｓｉＲＮＡ＿００５」を加えたｎ個（３個）のｓｉＲＮＡ配列により構成される組み合わせについて、それぞれ網羅率を算出する。すなわち、ここで、網羅率を算出する組み合わせの数は、5Ｃ3−4Ｃ3となる。そして、ステップＳ６において、新規の組み合わせとして、これらの組み合わせについて、それぞれ重複率を算出する。
そして、ステップＳ７において、これまでに制御部２１内の記憶手段に「ｋ＝１」に関連付けて記録されている網羅率及び重複率、及び、新規組み合わせについて算出された網羅率及び重複率について、最も網羅率が高く、かつ重複率が高い組み合わせを特定する。すなわち、「ｋ＝１」に関連付けて記録されている組み合わせ及び新規組み合わせについて、網羅率及び重複率を比較する。そして、最も網羅率が高く、かつ重複率が高い組み合わせを特定する。そして、このようにして特定した組み合わせについて、ステップＳ８において、ｓｉＲＮＡの識別情報と網羅率及び重複率とを、「ｋ＝２」に関連付けて制御部２１内の記憶手段に記録する。
そして、終了条件を満たさない場合（ステップＳ１０においてＮＯの場合）、ｋ＋１をｋに代入し（ステップ１１）、ステップＳ４の処理に戻る。ここでは、ｋ＝２であるため、上記の終了条件を満たさない。このため、ｋ＋１をｋに代入して「ｋ＝３」について、ステップＳ４以降の処理を行う。
このようにして、終了条件を満たすまで、ｋを増加させながらステップＳ４〜Ｓ１０、及びステップＳ１１の処理を繰り返す。
そして、終了条件を満たす場合（ステップＳ１０においてＹＥＳの場合）、制御部２１は、組み合わせ特定手段により、カクテルを構成するｓｉＲＮＡの組み合わせを特定する（ステップＳ１１）。本実施形態では、網羅率及び重複率がともに増加しない状態になるまで処理を繰り返すため、最後に記録されているｓｉＲＮＡの組み合わせが網羅率及び重複率がより高いため、この組み合わせをカクテルを構成するｓｉＲＮＡの組み合わせとする。
このようにして、終了条件を満たすまで、ｋを増加させながらステップＳ４〜Ｓ１０、及びステップＳ１１の処理を繰り返す。
そして、終了条件を満たす場合（ステップＳ１０においてＹＥＳの場合）、制御部２１は、組み合わせ特定手段により、カクテルを構成するｓｉＲＮＡの組み合わせを特定する（ステップＳ１１）。本実施形態では、網羅率及び重複率がともに増加しない状態になるまで処理を繰り返すため、最後に記録されているｓｉＲＮＡの組み合わせが網羅率及び重複率がより高いため、この組み合わせをカクテルを構成するｓｉＲＮＡの組み合わせとする。
そして、制御部２１は、特定されたｓｉＲＮＡの組み合わせを、カクテルデータ記憶部２７に記録し、表示部３２に出力する。作業者は、この表示部３２に出力されたｓｉＲＮＡの組み合わせに従って、ｓｉＲＮＡを組み合わせてｓｉＲＮＡのカクテルの作製を行う。
以上、本実施形態によれば、以下に示す効果を得ることができる。
・ 上記実施形態では、設計装置２０は、ＨＩＶ−１のゲノムの配列情報を複数取得し、これに基づいて、標的サイトの塩基配列情報を複数取得する。そして、取得した標的サイトの塩基配列情報に基づいて、前記標的サイトに対するｓｉＲＮＡの塩基配列情報を複数取得する。そして、取得したｓｉＲＮＡから、ＨＩＶ−１のゲノム多様性および変異の発生に対応可能なｓｉＲＮＡの組み合わせを選択して、より好ましい組み合わせを特定する。組み合わせの特定は、ｓｉＲＮＡの組み合わせがＨＩＶ−１の配列情報のうちのいくつに対してＲＮＡ干渉可能かに関する網羅性と、ＨＩＶ−１の配列情報のうちの一の情報に対しＲＮＡ干渉可能なｓｉＲＮＡがｓｉＲＮＡの組み合わせのうち幾つあるかに関する重複性と、に基づいて、ｓｉＲＮＡの組み合わせを選択する。そして、この組み合わせのｓｉＲＮＡを混合したｓｉＲＮＡ混合物（ｓｉＲＮＡカクテル）を作製する。
・ 上記実施形態では、設計装置２０は、ＨＩＶ−１のゲノムの配列情報を複数取得し、これに基づいて、標的サイトの塩基配列情報を複数取得する。そして、取得した標的サイトの塩基配列情報に基づいて、前記標的サイトに対するｓｉＲＮＡの塩基配列情報を複数取得する。そして、取得したｓｉＲＮＡから、ＨＩＶ−１のゲノム多様性および変異の発生に対応可能なｓｉＲＮＡの組み合わせを選択して、より好ましい組み合わせを特定する。組み合わせの特定は、ｓｉＲＮＡの組み合わせがＨＩＶ−１の配列情報のうちのいくつに対してＲＮＡ干渉可能かに関する網羅性と、ＨＩＶ−１の配列情報のうちの一の情報に対しＲＮＡ干渉可能なｓｉＲＮＡがｓｉＲＮＡの組み合わせのうち幾つあるかに関する重複性と、に基づいて、ｓｉＲＮＡの組み合わせを選択する。そして、この組み合わせのｓｉＲＮＡを混合したｓｉＲＮＡ混合物（ｓｉＲＮＡカクテル）を作製する。
これにより、ＨＩＶ−１において、広汎なゲノム配列に効くとともに、ブレークスルー
変異が出現する確率をより少なくすることができるｓｉＲＮＡ混合物を提供できる。
・ 上記実施形態では、網羅率と重複率とを高めるように、すなわち、ＨＩＶ−１の集合に対するカクテルの網羅性と、各ＨＩＶ−１における重複性とを高めるようにｓｉＲＮＡの組み合わせを選択する。これにより、ＨＩＶ−１において、広汎なゲノム配列に効くとともに、ブレークスルー変異が出現する確率をより少なくすることができるｓｉＲＮＡ混合物を提供できる。
・ 上記実施形態では、候補として選択されたｓｉＲＮＡのうち、単独の網羅率が高いものを優先的に選択する。これにより、効率的に、広汎なゲノム配列に効くとともに、ブレークスルー変異が出現する確率をより少なくすることができるｓｉＲＮＡ混合物を構成するｓｉＲＮＡの組み合わせを選択できる。
変異が出現する確率をより少なくすることができるｓｉＲＮＡ混合物を提供できる。
・ 上記実施形態では、網羅率と重複率とを高めるように、すなわち、ＨＩＶ−１の集合に対するカクテルの網羅性と、各ＨＩＶ−１における重複性とを高めるようにｓｉＲＮＡの組み合わせを選択する。これにより、ＨＩＶ−１において、広汎なゲノム配列に効くとともに、ブレークスルー変異が出現する確率をより少なくすることができるｓｉＲＮＡ混合物を提供できる。
・ 上記実施形態では、候補として選択されたｓｉＲＮＡのうち、単独の網羅率が高いものを優先的に選択する。これにより、効率的に、広汎なゲノム配列に効くとともに、ブレークスルー変異が出現する確率をより少なくすることができるｓｉＲＮＡ混合物を構成するｓｉＲＮＡの組み合わせを選択できる。
・ 上記実施形態では、候補として選択されたｓｉＲＮＡのうち、単独の網羅率が高いものの組み合わせから順番に、網羅率及び重複率を比較していく処理を、ある程度好ましい組み合わせが得られたことに対応する所定の終了条件になるまで繰り返すことにより、ｓｉＲＮＡの組み合わせを選択する。これによれば、効率的に、広汎なゲノム配列に効くとともに、ブレークスルー変異が出現する確率をより少なくすることができるｓｉＲＮＡ混合物を構成するｓｉＲＮＡの組み合わせを選択できる。
・ 上記実施形態では、ＨＩＶ−１のゲノムの配列を、ＨＩＶのゲノムデータベースから取得する。これにより、ＨＩＶのゲノムデータベースを利用して、ｓｉＲＮＡの組み合わせを選択できる。
なお、上記実施形態は、以下の態様に変更してもよい。
○ 上記実施形態では、複数のｓｉＲＮＡを混合したカクテルについて２種類以上のｓｉＲＮＡが効くＨＩＶ−１の割合を、このカクテルにおける重複率とし、カクテルの網羅率と重複率とを別々に算出して、網羅率及び重複率がともに高くなるようした。つまり、２種のｓｉＲＮＡが効くＨＩＶ−１配列と、３種のｓｉＲＮＡが効くＨＩＶ−１配列とを区別せずに、重複率の評価を行った。これに代えて、重複率の判断において、より多くのｓｉＲＮＡが効くＨＩＶ−１配列の割合を考慮してもよい。具体的には、ｎ個のｓｉＲＮＡを混合する場合に、第１の網羅率（カクテルの網羅率）及び第２の網羅率（カクテルの重複率）に加えて、第３の網羅率、…、第ｎの網羅率を考慮する。
これについて、図２を用いて、具体的に説明する。例えば、「ｓｉＲＮＡ＿００１」、「ｓｉＲＮＡ＿００４」、「ｓｉＲＮＡ＿００６」及び「ｓｉＲＮＡ＿００９」により構成されるカクテルについて説明する。この場合、図２のすべてのＨＩＶ−１配列について、少なくとも１つのｓｉＲＮＡが効く。また、「ＨＩＶ＿００２」及び「ＨＩＶ＿００７」以外には、２以上のｓｉＲＮＡが効く。また、「ＨＩＶ＿００９」及び「ＨＩＶ＿００１０」には、３以上のｓｉＲＮＡが効く。また、「ＨＩＶ＿００９」には、４以上のｓｉＲＮＡが効く。従って、第１の網羅率は「１」、第２の網羅率は「０．８」、第３の網羅率は「０．２」、第４の網羅率は「０．１」となる。
この場合、ステップＳ６において、追加された組み合わせについて、それぞれ、第２の網羅率に加えて、第３の網羅率、…、第ｎの網羅率を算出する。そして、ステップＳ７において、第１の網羅率、第２の網羅率、第３の網羅率、…、第ｎの網羅率に基づいて、より好ましい組み合わせを特定する。さらに、ステップＳ９において、これまでに記録された最上位の組み合わせについて、第１の網羅率、第２の網羅率、第３の網羅率、…、第ｎの網羅率についての推移をそれぞれ調べる。そして、それぞれの推移の結果に基づいて、処理を終了するかどうかを判断する。なお、この場合、終了条件は、第１〜第ｎの網羅率のすべての推移について、所定の回数、連続して増加していない状態となっていなくても、処理を所定の回数実行した場合に処理を終了することとしてもよい。また、第１の網羅率（又は、第１の網羅率及び第２の網羅率）が、所定の値に達した場合や、第１の網羅率（又は、第１の網羅率及び第２の網羅率）の増加傾向が飽和している場合において、処理
を所定の回数実行した場合に、処理を終了してもよい。
○ 上記実施形態では、複数のｓｉＲＮＡを混合したカクテルについて２種類以上のｓｉＲＮＡが効くＨＩＶ−１の割合を、このカクテルにおける重複率とし、カクテルの網羅率と重複率とを別々に算出して、網羅率及び重複率がともに高くなるようした。つまり、２種のｓｉＲＮＡが効くＨＩＶ−１配列と、３種のｓｉＲＮＡが効くＨＩＶ−１配列とを区別せずに、重複率の評価を行った。これに代えて、重複率の判断において、より多くのｓｉＲＮＡが効くＨＩＶ−１配列の割合を考慮してもよい。具体的には、ｎ個のｓｉＲＮＡを混合する場合に、第１の網羅率（カクテルの網羅率）及び第２の網羅率（カクテルの重複率）に加えて、第３の網羅率、…、第ｎの網羅率を考慮する。
これについて、図２を用いて、具体的に説明する。例えば、「ｓｉＲＮＡ＿００１」、「ｓｉＲＮＡ＿００４」、「ｓｉＲＮＡ＿００６」及び「ｓｉＲＮＡ＿００９」により構成されるカクテルについて説明する。この場合、図２のすべてのＨＩＶ−１配列について、少なくとも１つのｓｉＲＮＡが効く。また、「ＨＩＶ＿００２」及び「ＨＩＶ＿００７」以外には、２以上のｓｉＲＮＡが効く。また、「ＨＩＶ＿００９」及び「ＨＩＶ＿００１０」には、３以上のｓｉＲＮＡが効く。また、「ＨＩＶ＿００９」には、４以上のｓｉＲＮＡが効く。従って、第１の網羅率は「１」、第２の網羅率は「０．８」、第３の網羅率は「０．２」、第４の網羅率は「０．１」となる。
この場合、ステップＳ６において、追加された組み合わせについて、それぞれ、第２の網羅率に加えて、第３の網羅率、…、第ｎの網羅率を算出する。そして、ステップＳ７において、第１の網羅率、第２の網羅率、第３の網羅率、…、第ｎの網羅率に基づいて、より好ましい組み合わせを特定する。さらに、ステップＳ９において、これまでに記録された最上位の組み合わせについて、第１の網羅率、第２の網羅率、第３の網羅率、…、第ｎの網羅率についての推移をそれぞれ調べる。そして、それぞれの推移の結果に基づいて、処理を終了するかどうかを判断する。なお、この場合、終了条件は、第１〜第ｎの網羅率のすべての推移について、所定の回数、連続して増加していない状態となっていなくても、処理を所定の回数実行した場合に処理を終了することとしてもよい。また、第１の網羅率（又は、第１の網羅率及び第２の網羅率）が、所定の値に達した場合や、第１の網羅率（又は、第１の網羅率及び第２の網羅率）の増加傾向が飽和している場合において、処理
を所定の回数実行した場合に、処理を終了してもよい。
これにより、１つのＨＩＶ−１が、より多くの標的サイトを有するように、ｓｉＲＮＡを選択することができる。従って、ＨＩＶ−１ゲノムがもつ標的サイトのすべてに変異が入らないと、ｓｉＲＮＡのカクテルが効かないようにならないため、耐性ウイルスの発生の確率をより低くできる。
○ 上記実施形態では、ある１つのＨＩＶ−１配列に着目した場合の「重複性（或いは冗長性）（redundancy）」という指標から派生して、複数のｓｉＲＮＡを混合したカクテルについて２種類以上のｓｉＲＮＡが効くＨＩＶ−１の割合を、このカクテルにおける重複率とした。そして、カクテルの網羅率と重複率とを別々に算出して、網羅率及び重複率がともに高くなるようにしてカクテルに混合するｓｉＲＮＡの組み合わせの選択を行った。これに代えて、カクテルの網羅率と重複率とをまとめて算出し、これを比較することにより、網羅率及び重複率がともに高くなるようにしてカクテルに混合するｓｉＲＮＡの組み合わせの選択を行ってもよい。
例えば、ｎ個のｓｉＲＮＡを混合化する場合、この第１の網羅率、第２の網羅率、…、第ｎの網羅率を用いる所定の関数を用いて、網羅率に加えて、カクテルの重複率がより高くなる組み合わせを求める。例えば、これらの和をとることにより、網羅率に加えて、カクテルの重複率がより高くなる組み合わせを求める。例えば、ｓｉＲＮＡを４つ混合する場合、「重複を考慮した網羅率＝第１の網羅率＋第２の網羅率＋第３の網羅率＋第４の網羅率」を計算する。
例えば、図２において、「ｓｉＲＮＡ＿００１」、「ｓｉＲＮＡ＿００４」、「ｓｉＲＮＡ＿００６」及び「ｓｉＲＮＡ＿００９」により構成されるカクテルについて、重複を考慮した網羅率を計算する。この場合、上記のように、第１の網羅率は「１」、第２の網羅率は「０．８」、第３の網羅率は「０．２」、第４の網羅率は「０．１」である。このため、重複を考慮した網羅率は、「重複を考慮した網羅率＝１＋０．８＋０．２＋０．１」により計算される。
この場合も、網羅率に加えて、カクテルの重複率がより高くなるように、ｓｉＲＮＡの組み合わせを選択することができる。この方法は、対象となるｓｉＲＮＡの集合について、網羅率が１００％、或いは、ほぼ１００％になるｓｉＲＮＡの組み合わせが容易に選択でき、そのうち、さらにカクテルの重複率がより高い組み合わせがあり得る場合に特に有効である。
例えば、図２において、「ｓｉＲＮＡ＿００１」、「ｓｉＲＮＡ＿００４」、「ｓｉＲＮＡ＿００６」及び「ｓｉＲＮＡ＿００９」により構成されるカクテルについて、重複を考慮した網羅率を計算する。この場合、上記のように、第１の網羅率は「１」、第２の網羅率は「０．８」、第３の網羅率は「０．２」、第４の網羅率は「０．１」である。このため、重複を考慮した網羅率は、「重複を考慮した網羅率＝１＋０．８＋０．２＋０．１」により計算される。
この場合も、網羅率に加えて、カクテルの重複率がより高くなるように、ｓｉＲＮＡの組み合わせを選択することができる。この方法は、対象となるｓｉＲＮＡの集合について、網羅率が１００％、或いは、ほぼ１００％になるｓｉＲＮＡの組み合わせが容易に選択でき、そのうち、さらにカクテルの重複率がより高い組み合わせがあり得る場合に特に有効である。
○ 上記実施形態では、カクテルを構成するｓｉＲＮＡの個数のすべてについて、単独の網羅率の高いものから順番にｓｉＲＮＡの組み合わせを求め、この組み合わせについて網羅率及びカクテルにおける重複率を算出して、より好ましい組み合わせを特定した。これに代えて、混合するｓｉＲＮＡの個数のうち、一部についてのみ単独の網羅率の高いものから順番にｓｉＲＮＡの組み合わせを求め、この組み合わせでは網羅していない場合や、１つのＨＩＶ−１配列について複数のｓｉＲＮＡが効かない場合に、これを補足するためのｓｉＲＮＡを選択してもよい。
例えば、４つのｓｉＲＮＡを混合したカクテルを作製する場合、初めに、２つのｓｉＲＮＡの組み合わせを、単独の網羅率の高いものから順番に求める。上記実施形態の場合と同様の処理を、２つのｓｉＲＮＡの組み合わせについて行った後、所定の条件で処理を終了し、その時点で、網羅していないＨＩＶ−１配列（効くｓｉＲＮＡが１つもないもの）や、２つ以上の効くｓｉＲＮＡがないＨＩＶ−１配列について、これを補完するようなｓｉＲＮＡを検索する。そして、合計で４つのｓｉＲＮＡからなる組み合わせを決定する。
例えば、図２において、２つのｓｉＲＮＡの組み合わせについて、上記実施形態の場合と同様の処理を行い、所定の条件（例えば、処理の回数）で処理を終了した場合に、最も
網羅率が高く、同じ網羅率では重複率が最も高い組み合わせとして、「ｓｉＲＮＡ＿００６」及び「ｓｉＲＮＡ＿００９」が特定されていたとする。この場合、さらに２つのｓｉＲＮＡを選択する際に、網羅していないＨＩＶ−１配列（効くｓｉＲＮＡが１つもないもの）や、２つ以上の効くｓｉＲＮＡがないＨＩＶ−１配列について、これを補完するようなｓｉＲＮＡを探す。ここで、網羅率を「１」にするために、「ＨＩＶ＿００７」に効く「ｓｉＲＮＡ＿００１」、「ｓｉＲＮＡ＿００７」、「ｓｉＲＮＡ＿００１０」のいずれかをまず選択し、さらに、重複率を上げるためにもう１つｓｉＲＮＡを選択する。例えば、「ｓｉＲＮＡ＿００１」と、「ｓｉＲＮＡ＿０１０」をさらに選択する。この場合、各ＨＩＶ−１に対して有効なｓｉＲＮＡの数は、「ＨＩＶ＿００１」は「２」、「ＨＩＶ＿００２」は「２」、「ＨＩＶ＿００３」は「１」、「ＨＩＶ＿００４」は「３」、「ＨＩＶ＿００５」は「１」、「ＨＩＶ＿００６」は「２」、「ＨＩＶ＿００７」は「２」、「ＨＩＶ＿００８」は「２」、「ＨＩＶ＿００９」は「３」、ＨＩＶ＿０１０は「２」となる。
このようにしても、網羅率及び重複率が高い組み合わせを選択できる。また、このような方法は、例えば、ｓｉＲＮＡが標的にできるＨＩＶ−１配列の個数が多いものについて、効くｓｉＲＮＡに偏りがある場合に特に有効である。
例えば、図２において、２つのｓｉＲＮＡの組み合わせについて、上記実施形態の場合と同様の処理を行い、所定の条件（例えば、処理の回数）で処理を終了した場合に、最も
網羅率が高く、同じ網羅率では重複率が最も高い組み合わせとして、「ｓｉＲＮＡ＿００６」及び「ｓｉＲＮＡ＿００９」が特定されていたとする。この場合、さらに２つのｓｉＲＮＡを選択する際に、網羅していないＨＩＶ−１配列（効くｓｉＲＮＡが１つもないもの）や、２つ以上の効くｓｉＲＮＡがないＨＩＶ−１配列について、これを補完するようなｓｉＲＮＡを探す。ここで、網羅率を「１」にするために、「ＨＩＶ＿００７」に効く「ｓｉＲＮＡ＿００１」、「ｓｉＲＮＡ＿００７」、「ｓｉＲＮＡ＿００１０」のいずれかをまず選択し、さらに、重複率を上げるためにもう１つｓｉＲＮＡを選択する。例えば、「ｓｉＲＮＡ＿００１」と、「ｓｉＲＮＡ＿０１０」をさらに選択する。この場合、各ＨＩＶ−１に対して有効なｓｉＲＮＡの数は、「ＨＩＶ＿００１」は「２」、「ＨＩＶ＿００２」は「２」、「ＨＩＶ＿００３」は「１」、「ＨＩＶ＿００４」は「３」、「ＨＩＶ＿００５」は「１」、「ＨＩＶ＿００６」は「２」、「ＨＩＶ＿００７」は「２」、「ＨＩＶ＿００８」は「２」、「ＨＩＶ＿００９」は「３」、ＨＩＶ＿０１０は「２」となる。
このようにしても、網羅率及び重複率が高い組み合わせを選択できる。また、このような方法は、例えば、ｓｉＲＮＡが標的にできるＨＩＶ−１配列の個数が多いものについて、効くｓｉＲＮＡに偏りがある場合に特に有効である。
○ 上記実施形態では、終了条件を、網羅率及び重複率についての増加傾向が飽和していることとしたが、設定する終了条件は、これに限られるものではない。例えば、所定の回数、処理を実行した場合に、処理を終了してもよい。また、終了条件として、網羅率のみを考慮してもよい。また、網羅率及び重複率が、それぞれ所定の値になった場合に、処理を終了してもよい。これにより、網羅率及び重複率がある程度高くなった段階で、処理を終了することができ、ある程度適した組み合わせは得られたものの最適な組み合わせがなかなか定まらないような場合に処理時間を短縮できる。
○ 上記実施形態では、カクテルを構成するｓｉＲＮＡの種類数をｎ個に限定して、ｓｉＲＮＡの組み合わせを決定した。これに代えて、カクテルを構成するｓｉＲＮＡの種類数を、カクテルに関する網羅率及び重複率に応じて変更してもよい。例えば、より少ない種類数のｓｉＲＮＡによりカクテルを構成する。この場合、例えば、ｎを所定の値から開始して、ｎ種類のｓｉＲＮＡにより構成されるカクテルの網羅率及び重複率を算出し、網羅率及び重複率がそれぞれ所定の値以上となるまで、ｎを増加させながら、処理を繰り返す。ウイルスの被感染体に投与するｓｉＲＮＡの種類及び全体量は少ない方が好ましいが、これにより、より少ない種類のｓｉＲＮＡによりカクテルを構成することができる。また、全体量を制限してカクテルを作製する場合に、各種類のｓｉＲＮＡの量をより多くすることができる。
○ 上記実施形態では、カクテルを構成するｓｉＲＮＡの種類数をｎ個に限定して、ｓｉＲＮＡの組み合わせを決定した。これに代えて、カクテルを構成するｓｉＲＮＡの種類数を、カクテルに関する網羅率及び重複率に応じて変更してもよい。例えば、より少ない種類数のｓｉＲＮＡによりカクテルを構成する。この場合、例えば、ｎを所定の値から開始して、ｎ種類のｓｉＲＮＡにより構成されるカクテルの網羅率及び重複率を算出し、網羅率及び重複率がそれぞれ所定の値以上となるまで、ｎを増加させながら、処理を繰り返す。ウイルスの被感染体に投与するｓｉＲＮＡの種類及び全体量は少ない方が好ましいが、これにより、より少ない種類のｓｉＲＮＡによりカクテルを構成することができる。また、全体量を制限してカクテルを作製する場合に、各種類のｓｉＲＮＡの量をより多くすることができる。
○ 上記実施形態では、所定のガイドラインにより設計されたｓｉＲＮＡ配列であれば、カクテルを構成するｓｉＲＮＡの組み合わせを決定する際に同様に扱った。これに代えて、ＨＩＶ−１ゲノム配列におけるｓｉＲＮＡの標的サイト同士の関係を考慮して、ｓｉＲＮＡの組み合わせを決定してもよい。例えば、ｓｉＲＮＡが標的とするＨＩＶ−１配列が重なっている場合、網羅率や重複率を算出する際に、これらのｓｉＲＮＡについては同じものとして扱う。そして、標的サイトが重なるｓｉＲＮＡについては、同じカクテルに含めないようにする。ＨＩＶ−１ゲノム配列において、ｓｉＲＮＡの標的サイトが重なりあっている部分に変異が入ると両方のｓｉＲＮＡが効かなくなってしまう場合があるが、このようにすることで、１つの変異でカクテル中の複数のｓｉＲＮＡが効かなくなるのを避けることができる。従って、カクテルに対する耐性ウイルスを生じにくくさせることができる。
○ 上記実施形態では、ＨＩＶの配列データベースに全長又はほぼ全長のゲノムが登録された４００近くのＨＩＶ−１ゲノム配列を対象として、これらのＨＩＶ−１に効くｓｉＲＮＡのカクテルを作製する場合について説明した。対象とするＨＩＶ−１ゲノム配列は、ＨＩＶの配列データベースに登録された４００近くのＨＩＶ−１ゲノム配列のうちの一
部であってもよい。例えば、対象とするＨＩＶ−１ゲノム配列を、アジア型変異体のみに限定することもできる。この場合、ＨＩＶ−１のアジア型変異体に感染している可能性が高い場合に、より効果的なｓｉＲＮＡのカクテルを作製できる。
○ 上記実施形態では、ＨＩＶの配列データベースに全長又はほぼ全長のゲノムが登録された４００近くのＨＩＶ−１ゲノム配列を対象として、これらのＨＩＶ−１に効くｓｉＲＮＡのカクテルを作製する場合について説明した。対象とするＨＩＶ−１ゲノム配列は、ＨＩＶの配列データベースに登録された４００近くのＨＩＶ−１ゲノム配列のうちの一
部であってもよい。例えば、対象とするＨＩＶ−１ゲノム配列を、アジア型変異体のみに限定することもできる。この場合、ＨＩＶ−１のアジア型変異体に感染している可能性が高い場合に、より効果的なｓｉＲＮＡのカクテルを作製できる。
○ 上記実施形態では、患者に感染しているＨＩＶ−１のゲノム配列が不明な場合に、投与するｓｉＲＮＡのカクテルを作製する場合について説明した。本発明のｓｉＲＮＡの組み合わせの選択方法は、患者に感染しているＨＩＶ−１ゲノム配列が解析済の場合にも用いることができる。この場合、患者に感染しているＨＩＶ−１について解析されたＨＩＶ−１ゲノム配列を対象として、同様に、網羅率及び重複率が高い組み合わせを求める。
ＨＩＶ−１に感染している場合、ＨＩＶ−１の高い変異性のため、患者の体内に、準種(quasispecies)と呼ばれる複数の異なるゲノム配列のＨＩＶ−１が存在する。このため、患者に感染している複数のＨＩＶ−１ゲノム配列にそれぞれ標的サイトが存在するｓｉＲＮＡを選択するとともに、解析されたＨＩＶ−１ゲノム配列に変異が入った場合にも効くｓｉＲＮＡカクテルを用意する必要がある。このため、患者に感染しているＨＩＶ−１について解析されたＨＩＶ−１ゲノム配列を対象として、網羅率及び重複率が高い組み合わせを求める。これにより、患者に感染しているＨＩＶ−１のゲノム配列が解析済の場合に、より有効性の高いｓｉＲＮＡカクテルを作製できる。
○ 上記実施形態では、ＨＩＶ−１ゲノムを標的とするｓｉＲＮＡカクテルを作製する場合におけるｓｉＲＮＡの組み合わせの選択について説明した。本発明のｓｉＲＮＡの組み合わせの選択の方法は、ＨＩＶ−１感染症に限らず、他の病原微生物ゲノムを標的とするｓｉＲＮＡカクテルを作製する場合に直接応用が可能である。とりわけ高度のゲノム多様性をもつＲＮＡウイルスやマラリア原虫等、医学的、公衆衛生学的見地から重要性の高い病原性微生物が格好の対象となる。例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−２）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ＳＡＲＳ、コロナウイルス、マラリア原虫、真菌等について、同様の方法により、ｓｉＲＮＡカクテルに混合するｓｉＲＮＡの組み合わせを決定してもよい。
○ 上記実施形態では、ゲノム全体に含まれる標的サイトについてｓｉＲＮＡを設計したが、ゲノムの特定の部分配列、例えば特定のタンパクをコードする配列に含まれる標的サイトについて設計する構成であってもよい。また、転写産物又はその特定の部分配列に含まれる標的サイトについてｓｉＲＮＡを設計してもよい。これにより、スプライシングによって生成する遺伝子産物についてもｓｉＲＮＡの設計が可能となる。
かかる点に鑑み、抗ＨＩＶ−１ｓｉＲＮＡは、標的となる塩基配列の種類から、理論的には次の３種のカテゴリに分けられる。このようなカテゴリによって、ｓｉＲＮＡの設計や組み合わせを適宜決定する。具体的には、ＨＩＶ−１複製制御に関わるcis-領域をＲＮＡ干渉の対象とするカテゴリ、ＨＩＶ−１コーディング領域をＲＮＡ干渉の対象とするカテゴリ、ＨＩＶ−１構造遺伝子の中でＲＮＡスプライシングによって生成する遺伝子産物（tat,rev等）をＲＮＡ干渉の対象としゲノムＲＮＡには標的をもたないカテゴリ、の３
つに分けられる。
○ 上記実施形態では、ゲノム全体に含まれる標的サイトについてｓｉＲＮＡを設計したが、ゲノムの特定の部分配列、例えば特定のタンパクをコードする配列に含まれる標的サイトについて設計する構成であってもよい。また、転写産物又はその特定の部分配列に含まれる標的サイトについてｓｉＲＮＡを設計してもよい。これにより、スプライシングによって生成する遺伝子産物についてもｓｉＲＮＡの設計が可能となる。
かかる点に鑑み、抗ＨＩＶ−１ｓｉＲＮＡは、標的となる塩基配列の種類から、理論的には次の３種のカテゴリに分けられる。このようなカテゴリによって、ｓｉＲＮＡの設計や組み合わせを適宜決定する。具体的には、ＨＩＶ−１複製制御に関わるcis-領域をＲＮＡ干渉の対象とするカテゴリ、ＨＩＶ−１コーディング領域をＲＮＡ干渉の対象とするカテゴリ、ＨＩＶ−１構造遺伝子の中でＲＮＡスプライシングによって生成する遺伝子産物（tat,rev等）をＲＮＡ干渉の対象としゲノムＲＮＡには標的をもたないカテゴリ、の３
つに分けられる。
ＨＩＶ−１複製制御に関わるcis-領域（例：siRNA-521（これはＨＩＶ−１5'-非翻訳領域（untraslated region）のポリA配列を含んでいる）は、ＨＩＶ−１ゲノムＲＮＡ及び
あらゆるクラスのＨＩＶ−１ｍＲＮＡをすべて標的とするという意味で、さらに次善のｓｉＲＮＡを設計しておいた方がよいと考えられる。ＨＩＶ−１コーディング領域は、ゲノムＲＮＡとオバーラップするため、ｓｉＲＮＡの作用点がゲノムＲＮＡであるのか、そのｍＲＮＡであるのか区別できない。ＨＩＶ−１構造遺伝子の中で、ＲＮＡスプライシングによって生成する遺伝子産物（tat、rev等）でゲノムＲＮＡに標的をもたない形でｓｉＲＮＡの設計が可能なものは、スプライス・サイトにｓｉＲＮＡを設計することが考えられる。ｓｉＲＮＡの標的としては、ＨＩＶ−１ゲノムそのものあるいはＨＩＶ−１ｍＲＮＡ
の２者がある。後者のみを標的するためには、スプライス・サイトを利用する方法がある。なお、標的としうるスプライス・メッセージとしてtat, revの他にvif, vpr, vpu/env,
nef ｍＲＮＡが考えられる。
あらゆるクラスのＨＩＶ−１ｍＲＮＡをすべて標的とするという意味で、さらに次善のｓｉＲＮＡを設計しておいた方がよいと考えられる。ＨＩＶ−１コーディング領域は、ゲノムＲＮＡとオバーラップするため、ｓｉＲＮＡの作用点がゲノムＲＮＡであるのか、そのｍＲＮＡであるのか区別できない。ＨＩＶ−１構造遺伝子の中で、ＲＮＡスプライシングによって生成する遺伝子産物（tat、rev等）でゲノムＲＮＡに標的をもたない形でｓｉＲＮＡの設計が可能なものは、スプライス・サイトにｓｉＲＮＡを設計することが考えられる。ｓｉＲＮＡの標的としては、ＨＩＶ−１ゲノムそのものあるいはＨＩＶ−１ｍＲＮＡ
の２者がある。後者のみを標的するためには、スプライス・サイトを利用する方法がある。なお、標的としうるスプライス・メッセージとしてtat, revの他にvif, vpr, vpu/env,
nef ｍＲＮＡが考えられる。
○ 上記実施形態では、特定の病原性微生物、つまりＨＩＶ−１について、配列データベースに登録されたゲノム配列を対象とした。これに代えて、タイプの異なる複数のグループ（病原性微生物群）の間で共通の配列を選択してもよい。これにより、あるグループで有効なｓｉＲＮＡのカクテルを、別のグループにおいても用いることができる。
○ 上記実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡのみから構成されてもよく、また、ＲＮＡとＤＮＡとを含む構成であってもよい。ＲＮＡとＤＮＡとを含む構成としては、２本鎖のうちの一方の鎖がＲＮＡから構成され他方の鎖がＤＮＡから構成されるいわゆるハイブリッド型であってもよく、あるいは、同一鎖内にＲＮＡとＤＮＡとを含むいわゆるキメラ型であってもよい。さらに、ポリヌクレオチドの一部又は全部が修飾されたものであってもよい。
○ 上記実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡのみから構成されてもよく、また、ＲＮＡとＤＮＡとを含む構成であってもよい。ＲＮＡとＤＮＡとを含む構成としては、２本鎖のうちの一方の鎖がＲＮＡから構成され他方の鎖がＤＮＡから構成されるいわゆるハイブリッド型であってもよく、あるいは、同一鎖内にＲＮＡとＤＮＡとを含むいわゆるキメラ型であってもよい。さらに、ポリヌクレオチドの一部又は全部が修飾されたものであってもよい。
また、上記実施形態では、本発明にかかるＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の設計方法を、ｓｉＲＮＡをＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドとして複数種含むｓｉＲＮＡ混合物の設計に適用する場合について説明したが、ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドはｓｉＲＮＡに限定されるものではない。したがって、本発明にかかる方法は、ｓｉＲＮＡ混合物の設計に限らず、ｓｉＲＮＡ以外のＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドを混合する場合全般について適用可能である。
例えば、ゲノム多様性を有する病原性微生物に対して高い汎用性とＲＮＡ干渉効果を示すショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の発現ベクター（又はｓｉＲＮＡ発現ベクター）をＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドとして複数種含む混合物や、あるいは、ＰＣＲフラグメント等として利用されるｓｈＲＮＡ発現２本鎖ＤＮＡ断片（又はｓｉＲＮＡ発現２本鎖ＤＮＡ断片）をＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドとして複数種含む混合物を作製する場合に、網羅性と重複性とを考慮して混合種を選択する本発明を適用してもよい。それにより、ｓｉＲＮＡ混合物の場合において前述した効果と同様の効果が奏される。
（抗ＨＩＶ−１至適汎用ｓｉＲＮＡ設計と抗ウイルス効果の評価）
抗ＨＩＶ−１至適汎用ｓｉＲＮＡを設計し、この抗ＨＩＶ−１至適汎用ｓｉＲＮＡについて、単独での抗ウイルス効果について評価した。
（１）用いた細胞：ＨｅＬａ細胞（トランスフェクション前日に約70%コンフルエント（confluent）で24ウェル・プレートに接種した。）培地と培養条件：DMEM培地（Dulbeco’s
modified Eagle medium）(Gibco)［10% FCS（ウシ胎児血清）(Gibco)、ペニシリン・ス
トレプトマイシン添加］ 炭酸ガス・インキュベーター内で37℃, 炭酸ガス濃度5%で培養した。
（２）用いたＨＩＶ−１感染性分子クローン：
アジアにおけるＨＩＶ／ＡＩＤＳ流行の主要な原因となっている下記の６種のＨＩＶ−１遺伝子型［サブタイプおよび組換え型流行株 (circulating recombinant form, CRF)］の感染性分子クローンを用いた。
抗ＨＩＶ−１至適汎用ｓｉＲＮＡを設計し、この抗ＨＩＶ−１至適汎用ｓｉＲＮＡについて、単独での抗ウイルス効果について評価した。
（１）用いた細胞：ＨｅＬａ細胞（トランスフェクション前日に約70%コンフルエント（confluent）で24ウェル・プレートに接種した。）培地と培養条件：DMEM培地（Dulbeco’s
modified Eagle medium）(Gibco)［10% FCS（ウシ胎児血清）(Gibco)、ペニシリン・ス
トレプトマイシン添加］ 炭酸ガス・インキュベーター内で37℃, 炭酸ガス濃度5%で培養した。
（２）用いたＨＩＶ−１感染性分子クローン：
アジアにおけるＨＩＶ／ＡＩＤＳ流行の主要な原因となっている下記の６種のＨＩＶ−１遺伝子型［サブタイプおよび組換え型流行株 (circulating recombinant form, CRF)］の感染性分子クローンを用いた。
・サブタイプB (pNL432) ：Accession number: M19921
・サブタイプB' (p95MM-yIDU106)
・サブタイプC (p93IN101=pIndieC1) ：Accession number: AB023804
（引用文献： Mochizuki, N., Otsuka, N., Matsuo, K., Shiino, T., Kojima, A., Kurata, T., Sakai, K., Yamamoto, N., Isomura, S., Dhole, TN., Takebe, Y., Matsuda, M., and Tatsumi, M. (1999). An infectious DNA clone of HIV type 1 subtype C. AIDS
Res and Human Retroviruses 14: 1321-1324.）
・CRF01_AE (p93JP-NH1) ：Accession number: AB052995.
（引用文献１： Sato, H., Tomita, Y., Ebisawa, K., Hachiya, A., Shibamura, K., Shiino, T., Yang, R., Tatsumi, M., Gushi, K., Umeyama, H., Oka, S., Takebe, Y., and Nagai, Y. (2001). Augmentation of human immunodeficiency virus type 1 subtype E (CRF01_AE) multiple-drug resistance by insertion of a foreign 11-amino-acid fragment into the reverse transcriptase. J. Virol. 75 (12): 5604-5613 .）
（引用文献２： Kusagawa, S., Sato, H., Tomita, Y., Tatsumi, M., Kato, K., Motomura, K., Yang, R., Nohtomi, K., and Takebe, Y. (2002). Isolation and characterization of replication-competent molecular DNA clone of CRF01_AE with different coreceptor usages. AIDS Res and Human Retroviruses 18 (2): 115-122.）
・CRF07_BC (p97CN013.6)
・CRF08_BC (p00CN-HH040.NX22)
なお、この６種のＨＩＶ−１遺伝子型［サブタイプおよび組換え型流行株 (circulating recombinant form, CRF)］の感染性分子クローンは、代表性を検討することにより決定した。具体的には、国立感染症研究所にクローンが存在するものであって、アジア型変異体で、かつ、共通性が大きいものを選択した。
（３）用いた抗ＨＩＶ−１ｓｉＲＮＡ：ｓｉＲＮＡ設計プログラム（siDirect）（引用文献：Yuki Naito, Tomoyuki Yamada, Kumiko Ui-Tei, Shinichi Morishita and Kaoru Saigo(2004).siDirect: highly effective, target-specific siRNA design software for mammalian RNA interference. Nucleic Acids Research, 2004, Vol. 32, W124-W129)により、上記６つのＨＩＶ−１感染性分子クローンのゲノム配列に共通な塩基配列を認識するｓｉＲＮＡを設計し、このうち、下記の条件を満たす１９個の抗ＨＩＶ−１汎用ｓｉＲＮＡを選択した。
・サブタイプB' (p95MM-yIDU106)
・サブタイプC (p93IN101=pIndieC1) ：Accession number: AB023804
（引用文献： Mochizuki, N., Otsuka, N., Matsuo, K., Shiino, T., Kojima, A., Kurata, T., Sakai, K., Yamamoto, N., Isomura, S., Dhole, TN., Takebe, Y., Matsuda, M., and Tatsumi, M. (1999). An infectious DNA clone of HIV type 1 subtype C. AIDS
Res and Human Retroviruses 14: 1321-1324.）
・CRF01_AE (p93JP-NH1) ：Accession number: AB052995.
（引用文献１： Sato, H., Tomita, Y., Ebisawa, K., Hachiya, A., Shibamura, K., Shiino, T., Yang, R., Tatsumi, M., Gushi, K., Umeyama, H., Oka, S., Takebe, Y., and Nagai, Y. (2001). Augmentation of human immunodeficiency virus type 1 subtype E (CRF01_AE) multiple-drug resistance by insertion of a foreign 11-amino-acid fragment into the reverse transcriptase. J. Virol. 75 (12): 5604-5613 .）
（引用文献２： Kusagawa, S., Sato, H., Tomita, Y., Tatsumi, M., Kato, K., Motomura, K., Yang, R., Nohtomi, K., and Takebe, Y. (2002). Isolation and characterization of replication-competent molecular DNA clone of CRF01_AE with different coreceptor usages. AIDS Res and Human Retroviruses 18 (2): 115-122.）
・CRF07_BC (p97CN013.6)
・CRF08_BC (p00CN-HH040.NX22)
なお、この６種のＨＩＶ−１遺伝子型［サブタイプおよび組換え型流行株 (circulating recombinant form, CRF)］の感染性分子クローンは、代表性を検討することにより決定した。具体的には、国立感染症研究所にクローンが存在するものであって、アジア型変異体で、かつ、共通性が大きいものを選択した。
（３）用いた抗ＨＩＶ−１ｓｉＲＮＡ：ｓｉＲＮＡ設計プログラム（siDirect）（引用文献：Yuki Naito, Tomoyuki Yamada, Kumiko Ui-Tei, Shinichi Morishita and Kaoru Saigo(2004).siDirect: highly effective, target-specific siRNA design software for mammalian RNA interference. Nucleic Acids Research, 2004, Vol. 32, W124-W129)により、上記６つのＨＩＶ−１感染性分子クローンのゲノム配列に共通な塩基配列を認識するｓｉＲＮＡを設計し、このうち、下記の条件を満たす１９個の抗ＨＩＶ−１汎用ｓｉＲＮＡを選択した。
１）上記６種のＨＩＶ−１感染性分子クローンのゲノム配列に共通な塩基配列を認識。
２）良好なＲＮＡ干渉効果が期待されるもの（アンチセンス鎖の5’-領域の7塩基のう
ち４個以上がAあるいはT）。
２）良好なＲＮＡ干渉効果が期待されるもの（アンチセンス鎖の5’-領域の7塩基のう
ち４個以上がAあるいはT）。
３）GCの連続した領域をもたないこと。
４）オフターゲット効果が少ないこと。
具体的には、設計した配列番号１〜配列番号３０のｓｉＲＮＡのうち、下記の条件を満たす、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９のｓｉＲＮＡ（図４に示すセンス鎖の配列のうち、「×」を記載したもの）を選択した。
なお、抗ウイルス効果の評価の結果は、この１９個のｓｉＲＮＡの中から選択したＡ〜Ｆについて示す。Ａは配列番号１、Ｂは配列番号２、Ｃは配列番号６、Ｄは配列番号１１、Ｅは配列番号１９、Ｆは配列番号２６にそれぞれ該当する。
４）オフターゲット効果が少ないこと。
具体的には、設計した配列番号１〜配列番号３０のｓｉＲＮＡのうち、下記の条件を満たす、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９のｓｉＲＮＡ（図４に示すセンス鎖の配列のうち、「×」を記載したもの）を選択した。
なお、抗ウイルス効果の評価の結果は、この１９個のｓｉＲＮＡの中から選択したＡ〜Ｆについて示す。Ａは配列番号１、Ｂは配列番号２、Ｃは配列番号６、Ｄは配列番号１１、Ｅは配列番号１９、Ｆは配列番号２６にそれぞれ該当する。
ここでは、「４３７７Ｄ」（配列番号１１）、「４３７８Ｒ」（配列番号１２）など重なり合っているものを避け、ｓｈＲＮＡ発現用のいわゆる「ＤＮＡ型」のもの（センス鎖5’の第１番目の塩基がG）を選択した（但し、ＨＩＶ−１の5’-非翻訳領域に設計されたHIV-1-521（図面のＡに対応）のみ「ＲＮＡ型」）。なお、ｓｉＲＮＡのうち、発現ベク
ターを用いてｓｈＲＮＡ発現用に用いることができるものを「ＤＮＡ型」と呼ぶ。
用いた抗ＨＩＶ−１ｓｉＲＮＡに関する情報を図４及び図５に示す。
図４は、各ｓｉＲＮＡについて、ｓｉＲＮＡ配列と、各ｓｉＲＮＡについてのＨＩＶ−１ゲノム配列における標的サイトのヌクレオチドポジション等に関する情報を示す。この図４には、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の配列を記載しており、上から順番に配列番号１〜配列
番号３０にそれぞれ対応する。すなわち、図４の最右列の記載と配列番号との関係は、「５２１Ｒ」が配列番号１、「１４９０Ｄ」が配列番号２、「１４９２Ｒ」が配列番号３、「２８１１Ｄ」が配列番号４、「２９９９Ｎ」が配列番号５、「３０００Ｄ」が配列番号６、「３００５Ｄ」が配列番号７、「３００６Ｄ」が配列番号８、「３０１１Ｄ」が配列番号９、「４３７３Ｒ」が配列番号１０、「４３７７Ｄ」が配列番号１１、「４３７８Ｒ」が配列番号１２、「４５３５Ｎ」が配列番号１３、「４７４６Ｄ」が配列番号１４、「４７４７Ｎ」が配列番号１５、「４７５０Ｄ」が配列番号１６、「４７５１Ｒ」が配列番号１７、「４７７９Ｎ」が配列番号１８、「４８４０Ｄ」が配列番号１９、「４８８８Ｒ」が配列番号２０、「４９６０Ｄ」が配列番号２１、「４９６１Ｄ」が配列番号２２、「４９６７Ｄ」が配列番号２３、「６４５１Ｎ」が配列番号２４、「６４５２Ｒ」が配列番号２５、「７６５８Ｄ」が配列番号２６、「７６５９Ｄ」が配列番号２７、「７６６１Ｄ」が配列番号２８、「７６６４Ｄ」が配列番号２９に、「９６０６Ｒ」が配列番号３０に、それぞれ対応する。なお、「９６０６Ｒ」（配列番号３０）は、「５２１Ｒ」（配列番号１）に一致する。
また、図４の最左列のアルファベット表記（Ａ〜Ｆ）は、選択されたＡ〜Ｆに対応する。具体的には、Ａが「５２１Ｒ」（配列番号１）、Ｂが「１４９０Ｄ」（配列番号２）、Ｃが「３０００Ｄ」（配列番号６）、Ｄが「４３７７Ｄ」（配列番号１１）、Ｅが「４８４０Ｄ」（配列番号１９）、Ｆが「７６５８Ｄ」（配列番号２６）にそれぞれ該当する。また、Ｎは「２９９９Ｎ」（配列番号５）に該当する。
図５は、図４に記載されたｓｉＲＮＡの配列の中から選択されたｓｉＲＮＡについて、ＨＩＶ−１組換え実験株（ＨＸＢ２）のゲノム配列に対する相対的なヌクレオチドポジションを示す。なお、図５の下部のアルファベット表記（Ａ〜Ｆ，Ｎ）は、図４の最左列のアルファベット表記（Ａ〜Ｆ，Ｎ）に対応する。また、図５におけるこのアルファベット表記の上の表記（「５２１Ｒ」、「１４９０Ｄ」等）は、図４の最右列の表記に対応する。
（４）抗ウイルス効果の評価法：
ＲＮＡ干渉機能分子の効果は、ＨｅＬａ細胞へのＨＩＶ−１感染性分子クローンとのコトランスフェクション（核酸の共導入）の48時間後の培養上清中の逆転写酵素活性の測定によって評価した。具体的には、以下のように評価した。ＨＩＶ−１感染性分子クローン0.2μｇと抗ＨＩＶ−１ｓｉＲＮＡを50, 5, 0.5ｎＭの各濃度を加えたもの（OPTIMEM無血清培地を加えて50μｌとする）をリポフェクトアミン2000（Invitrogen Cat. No.11668-027）（原液2μｌをOPTIMEM無血清培地50μｌに加えたもの）と混合し、合わせて100μｌ
を、24-ウエル・プレートに前日接種したＨｅＬａ細胞に加え、ＨＩＶ−１感染性分子ク
ローンと抗ＨＩＶ−１ｓｉＲＮＡのコトランスフェクションを行った。
ターを用いてｓｈＲＮＡ発現用に用いることができるものを「ＤＮＡ型」と呼ぶ。
用いた抗ＨＩＶ−１ｓｉＲＮＡに関する情報を図４及び図５に示す。
図４は、各ｓｉＲＮＡについて、ｓｉＲＮＡ配列と、各ｓｉＲＮＡについてのＨＩＶ−１ゲノム配列における標的サイトのヌクレオチドポジション等に関する情報を示す。この図４には、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の配列を記載しており、上から順番に配列番号１〜配列
番号３０にそれぞれ対応する。すなわち、図４の最右列の記載と配列番号との関係は、「５２１Ｒ」が配列番号１、「１４９０Ｄ」が配列番号２、「１４９２Ｒ」が配列番号３、「２８１１Ｄ」が配列番号４、「２９９９Ｎ」が配列番号５、「３０００Ｄ」が配列番号６、「３００５Ｄ」が配列番号７、「３００６Ｄ」が配列番号８、「３０１１Ｄ」が配列番号９、「４３７３Ｒ」が配列番号１０、「４３７７Ｄ」が配列番号１１、「４３７８Ｒ」が配列番号１２、「４５３５Ｎ」が配列番号１３、「４７４６Ｄ」が配列番号１４、「４７４７Ｎ」が配列番号１５、「４７５０Ｄ」が配列番号１６、「４７５１Ｒ」が配列番号１７、「４７７９Ｎ」が配列番号１８、「４８４０Ｄ」が配列番号１９、「４８８８Ｒ」が配列番号２０、「４９６０Ｄ」が配列番号２１、「４９６１Ｄ」が配列番号２２、「４９６７Ｄ」が配列番号２３、「６４５１Ｎ」が配列番号２４、「６４５２Ｒ」が配列番号２５、「７６５８Ｄ」が配列番号２６、「７６５９Ｄ」が配列番号２７、「７６６１Ｄ」が配列番号２８、「７６６４Ｄ」が配列番号２９に、「９６０６Ｒ」が配列番号３０に、それぞれ対応する。なお、「９６０６Ｒ」（配列番号３０）は、「５２１Ｒ」（配列番号１）に一致する。
また、図４の最左列のアルファベット表記（Ａ〜Ｆ）は、選択されたＡ〜Ｆに対応する。具体的には、Ａが「５２１Ｒ」（配列番号１）、Ｂが「１４９０Ｄ」（配列番号２）、Ｃが「３０００Ｄ」（配列番号６）、Ｄが「４３７７Ｄ」（配列番号１１）、Ｅが「４８４０Ｄ」（配列番号１９）、Ｆが「７６５８Ｄ」（配列番号２６）にそれぞれ該当する。また、Ｎは「２９９９Ｎ」（配列番号５）に該当する。
図５は、図４に記載されたｓｉＲＮＡの配列の中から選択されたｓｉＲＮＡについて、ＨＩＶ−１組換え実験株（ＨＸＢ２）のゲノム配列に対する相対的なヌクレオチドポジションを示す。なお、図５の下部のアルファベット表記（Ａ〜Ｆ，Ｎ）は、図４の最左列のアルファベット表記（Ａ〜Ｆ，Ｎ）に対応する。また、図５におけるこのアルファベット表記の上の表記（「５２１Ｒ」、「１４９０Ｄ」等）は、図４の最右列の表記に対応する。
（４）抗ウイルス効果の評価法：
ＲＮＡ干渉機能分子の効果は、ＨｅＬａ細胞へのＨＩＶ−１感染性分子クローンとのコトランスフェクション（核酸の共導入）の48時間後の培養上清中の逆転写酵素活性の測定によって評価した。具体的には、以下のように評価した。ＨＩＶ−１感染性分子クローン0.2μｇと抗ＨＩＶ−１ｓｉＲＮＡを50, 5, 0.5ｎＭの各濃度を加えたもの（OPTIMEM無血清培地を加えて50μｌとする）をリポフェクトアミン2000（Invitrogen Cat. No.11668-027）（原液2μｌをOPTIMEM無血清培地50μｌに加えたもの）と混合し、合わせて100μｌ
を、24-ウエル・プレートに前日接種したＨｅＬａ細胞に加え、ＨＩＶ−１感染性分子ク
ローンと抗ＨＩＶ−１ｓｉＲＮＡのコトランスフェクションを行った。
対照として、（陽性対照）ＨＩＶ−１感染性分子クローン単独あるいはＨＩＶ−１感染性分子クローン＋21塩基のランダムな配列をもつ２重鎖ＲＮＡ（siControl）および（陰
性対照）リポフェクトアミン2000試薬（あるいはそれに陰性対照のｓｉＲＮＡ（siControl）を加えた）のみのmockのトランスフェクションを行った。
性対照）リポフェクトアミン2000試薬（あるいはそれに陰性対照のｓｉＲＮＡ（siControl）を加えた）のみのmockのトランスフェクションを行った。
そして、リポフェクトアミン2000処理３時間後にリポフェクトアミン2000を除き、DMEM培養液を加えた。そして、炭酸ガス・インキュベーター内で37℃, 炭酸ガス濃度5%で培養を継続し、48時間後に培養上清を5μｌ採取し、逆転写酵素アッセイを行った。なお、逆
転写酵素アッセイは、ポリ-A（ポリアデノシン）を鋳型としてオリゴdTプライマーからのγ-32P-dTTPを基質とする37℃、3時間の逆転写反応量をβ-プレートリーダーで測定した
。
（５）抗ウイルス効果の実際：
各ｓｉＲＮＡは対照に対してｓｉＲＮＡ濃度0.5-50ｎＭで>92-95%以上の極めて強力な
増殖抑制効果を示した（図６参照）。なお、図６には、コトランスフェクションするＨＩＶ−１感染性分子クローンとして、サブタイプB (pNL432)を用いた場合について、抗ＨＩ
Ｖ−１至適汎用ｓｉＲＮＡのうちＡ〜Ｆ（図４、図５参照）に関する逆転写酵素活性の測定結果を示す。すなわち、Ａ：「５２１Ｒ」（配列番号１）、Ｂ：「１４９０Ｄ」（配列番号２）、Ｃ：「３０００Ｄ」（配列番号６）、Ｄ：「４３７７Ｄ」（配列番号１１）、Ｅ：「４８４０Ｄ」（配列番号１９）、Ｆ：「７６５８Ｄ」（配列番号２６）に関する逆転写酵素活性の測定結果を示す。また、Ｎは「２９９９Ｎ」（配列番号５）に該当する。
転写酵素アッセイは、ポリ-A（ポリアデノシン）を鋳型としてオリゴdTプライマーからのγ-32P-dTTPを基質とする37℃、3時間の逆転写反応量をβ-プレートリーダーで測定した
。
（５）抗ウイルス効果の実際：
各ｓｉＲＮＡは対照に対してｓｉＲＮＡ濃度0.5-50ｎＭで>92-95%以上の極めて強力な
増殖抑制効果を示した（図６参照）。なお、図６には、コトランスフェクションするＨＩＶ−１感染性分子クローンとして、サブタイプB (pNL432)を用いた場合について、抗ＨＩ
Ｖ−１至適汎用ｓｉＲＮＡのうちＡ〜Ｆ（図４、図５参照）に関する逆転写酵素活性の測定結果を示す。すなわち、Ａ：「５２１Ｒ」（配列番号１）、Ｂ：「１４９０Ｄ」（配列番号２）、Ｃ：「３０００Ｄ」（配列番号６）、Ｄ：「４３７７Ｄ」（配列番号１１）、Ｅ：「４８４０Ｄ」（配列番号１９）、Ｆ：「７６５８Ｄ」（配列番号２６）に関する逆転写酵素活性の測定結果を示す。また、Ｎは「２９９９Ｎ」（配列番号５）に該当する。
なお、Ｎは上記６種の感染性分子クローンに共通する配列であるがｓｉＲＮＡ効果の期待されないものである。Ｎについては弱いｓｉＲＮＡ効果をもつことが明らかになった。
このように、抗ＨＩＶ−１至適汎用ｓｉＲＮＡの抗ウイルス効果が明らかになった。複数の抗ＨＩＶ−１至適汎用ｓｉＲＮＡにより構成されるカクテルについても、各抗ＨＩＶ−１至適汎用ｓｉＲＮＡによる抗ウイルス効果が期待される。
このように、抗ＨＩＶ−１至適汎用ｓｉＲＮＡの抗ウイルス効果が明らかになった。複数の抗ＨＩＶ−１至適汎用ｓｉＲＮＡにより構成されるカクテルについても、各抗ＨＩＶ−１至適汎用ｓｉＲＮＡによる抗ウイルス効果が期待される。
本発明は、複数の標的遺伝子に対して高いＲＮＡ干渉効果を示す、すなわち、高い汎用性と高いＲＮＡ干渉効果とを両立するＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の提供に有用である。例えば、本発明は創薬分野への適用が可能であり、ゲノム多様性を有する病原性微生物によって引き起こされる疾患に有効な治療薬等の研究開発における研究ツールとして有用である。
２０…ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の設計装置としての設計装置、２１…制御部、２５…ＨＩＶ−１配列データ記憶部、２６…ＨＩＶ−１配列／ｓｉＲＮＡデータ記憶部。
Claims (11)
- 病原性微生物のゲノム又は転写産物もしくは特定のタンパクをコードする配列に含まれる標的サイトに対してＲＮＡ干渉を生じさせるＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドを複数種類含むＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の設計方法に基づき、当該設計方法によって取得されるＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の組成にしたがってＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドを混合するＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の作製方法であって、
前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の設計方法は、
前記病原性微生物のゲノムを構成する塩基配列又は転写産物もしくは特定のタンパクをコードする配列についての病原性微生物塩基配列情報を複数取得する病原性微生物塩基配列情報取得工程と、
取得した前記病原性微生物塩基配列情報に基づいて、所定のガイドラインに従って前記病原性微生物の前記標的サイトを特定し、当該標的サイトの塩基配列情報を複数取得する標的サイト情報取得工程と、
取得した前記標的サイトの複数の塩基配列情報に基づいて、前記所定のガイドラインに従って設計し前記標的サイトに対してＲＮＡ干渉を生じさせるＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報を複数取得するＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド情報取得工程と、
取得した前記複数のＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報から、前記病原性微生物のゲノム多様性および変異の発生に対応可能なＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせを選択して、より好ましい組み合わせ情報を取得する組み合わせ選択工程と、を含み、
前記組み合わせ選択工程は、
ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせが、前記病原性微生物塩基配列情報取得工程で取得した複数の前記病原性微生物塩基配列情報のうちのいくつの前記病原性微生物塩基配列情報と一致するかに関する網羅性と、
前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせのうち、前記病原性微生物塩基配列情報のうちの一の情報に対し、前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報と一致する前記病原性微生物塩基配列情報が幾つあるかに関する重複性と、に基づいて、前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせを選択することを特徴とするＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の作製方法。 - 前記組み合わせ選択工程は、前記網羅性と前記重複性とを高めるように前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせを選択することを特徴とする請求項１に記載のＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の作製方法。
- 前記組み合わせ選択工程は、前記網羅性を前記重複性よりも優先して前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせを選択することを特徴とする請求項１または２に記載のＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の作製方法。
- 前記組み合わせ選択工程は、
前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド情報取得工程で取得した前記複数のＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報の各々について、前記病原性微生物延期配列情報の集合全体の中で、前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報と一致する前記病原性微生物塩基配列情報の割合を、前記病原性微生物塩基配列情報の集合におけるＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド単独の網羅率として算出する単独網羅率算出工程と、
算出した前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド単独の網羅率に基づいてＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの、より好ましい組み合わせを検討する組み合わせ検討工程と、を含み、
前記組み合わせ検討工程は、
前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド単独の網羅率が高い前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報を複数選択して組み合わせ候補配列群を形成するとともに、前記組み合わせ候補配列群から所定数の前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報を選択して組み合わせ、組成の異なる複数のＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報の組み合わせを特定する組み合わせ候補特定工程と、
特定した前記複数のＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報の組み合わせの各々について、前記病原性微生物塩基配列情報の集合全体の中で、一の組み合わせ中の前記複数のＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報と一致する前記病原性微生物塩基配列情報の割合を、前記病原性微生物塩基配列情報の集合におけるＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの網羅率として算出する網羅率算出工程と、
算出した組み合わせの前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの網羅率を前記複数のＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報の組み合わせの間で比較する比較工程と、を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１つに記載のＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の作製方法。 - 前記組み合わせ検討工程は、前記組み合わせ候補配列群から選択する前記病原性微生物塩基配列情報の数を変化させるとともに、変化させた各々の場合について、前記組み合わせ候補特定工程と、前記網羅率算出工程と、前記比較工程とを実行し、所定の終了条件を満たすまで、前記組み合わせ候補特定工程と、前記網羅率算出工程と、前記比較工程とからなる一連の処理を繰り返し、
前記組み合わせ検討工程は、
前記病原性微生物塩基配列情報取得工程で複数取得した前記病原性微生物塩基配列情報の各一の病原性微生物塩基配列情報について、前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報と一致する前記病原性微生物塩基配列情報が幾つあるかに関する重複性を算出し、
前記組み合わせ候補特定工程で取得した複数の前記組み合わせの各々について、前記病原性微生物塩基配列情報の集合に対する前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報が重複する前記病原性微生物塩基配列情報の割合を示す指標である組み合わせ内重複率を算出する重複率算出工程を含み、
前記比較工程は、算出した前記組み合わせ内重複率を前記複数の組み合わせの間で比較する工程をさらに含み、
前記所定の終了条件は、前記網羅率及び前記組み合わせ内重複率が連続して増加していない場合に前記一連の処理を終了することを特徴とする請求項４に記載のＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の作製方法。 - 前記病原性微生物塩基配列情報取得工程は、前記病原性微生物の塩基配列情報のデータベースから前記病原性微生物のゲノム又は転写産物もしくはこれらの特定の部分配列の病原性微生物塩基配列情報を取得することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１つに記載のＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の作製方法。
- 前記病原性微生物塩基配列情報取得工程は、宿主に感染する前記病原性微生物のゲノム解析の結果に基づいて前記病原性微生物のゲノム又は転写産物もしくはこれらの特定の部分配列の病原性微生物塩基配列情報を取得することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１つに記載のＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の作製方法。
- 前記病原性微生物がＲＮＡウイルスであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１つに記載のＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の作製方法。
- 前記病原性微生物が、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ＳＡＲＳ、コロナウイルス、マラリア原虫、真菌のいずれか１つであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１つに記載のＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の作製方法。
- 病原性微生物のゲノム又は転写産物もしくは特定のタンパクをコードする配列に含まれる標的サイトに対してＲＮＡ干渉を生じさせるＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドを複数種類含むＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の設計装置であって、
前記設計装置としてのコンピュータは、制御部、入力部、出力部及び記憶部を備え、
前記病原性微生物のゲノムを構成する塩基配列又は転写産物もしくは特定のタンパクをコードする配列についての病原性微生物塩基配列情報を、ネットワークを介して病原性微生物塩基配列情報データベースから複数取得して前記記憶部に記録する病原性微生物塩基配列情報取得手段と、
前記記憶部に記録された前記病原性微生物塩基配列情報に基づいて、前記制御部で、所定のガイドラインに従って前記病原性微生物の前記標的サイトを特定し、当該標的サイトの塩基配列情報を複数取得する標的サイト情報取得手段と、
取得した前記標的サイトの複数の塩基配列情報に基づいて、前記制御部で、前記所定のガイドラインに従って設計し、前記標的サイトに対してＲＮＡ干渉を生じさせるＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報を複数取得して、前記記憶部に記録するＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド情報取得手段と、
取得した前記複数のＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報から、前記病原性微生物のゲノム多様性および変異の発生に対応可能なＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせを選択して、より好ましい組み合わせ情報を取得する組み合わせ選択手段と、を備え、
前記組み合わせ選択手段は、
ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせが、前記病原性微生物塩基配列情報取得手段で取得した複数の前記病原性微生物塩基配列情報のうちのいくつの前記病原性微生物塩基配列情報に対して一致するかに関する網羅性と、
前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせのうち、前記病原性微生物塩基配列情報のうちの一の情報に対し、前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報と一致する前記病原性微生物塩基配列情報が幾つあるかに関する重複性と、に基づいて、前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせを選択することを特徴とするＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の設計装置。 - 病原性微生物のゲノム又は転写産物もしくは特定のタンパクをコードする配列に含まれる標的サイトに対してＲＮＡ干渉を生じさせるＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドを複数種類含むＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物を、コンピュータを用いて設計するためのＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の設計プログラムであって、
前記コンピュータは、制御部、入力部、出力部及び記憶部を備え、
前記コンピュータを、
前記病原性微生物のゲノムを構成する塩基配列又は転写産物もしくは特定のタンパクをコードする配列についての病原性微生物塩基配列情報を、ネットワークを介して病原性微生物塩基配列情報データベースから複数取得して前記記憶部に記録する病原性微生物塩基配列情報取得手段と、
前記記憶部に記録された前記病原性微生物塩基配列情報に基づいて、前記制御部で、所定のガイドラインに従って前記病原性微生物の前記標的サイトを特定し、当該標的サイトの塩基配列情報を複数取得する標的サイト情報取得手段と、
取得した前記標的サイトの複数の塩基配列情報に基づいて、前記制御部で、前記所定のガイドラインに従って設計し、前記標的サイトに対してＲＮＡ干渉を生じさせるＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報を複数取得して、前記記憶部に記録するＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド情報取得手段と、
取得した前記複数のＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報から、前記制御部で、前記病原性微生物のゲノム多様性および変異の発生に対応可能なＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせを選択して、より好ましい組み合わせ情報を取得する組み合わせ選択手段として機能させ、
前記組み合わせ選択手段を、
ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせが、前記病原性微生物塩基配列情報取得手段で取得した複数の前記病原性微生物塩基配列情報のうちのいくつの前記病原性微生物塩基配列情報に対して一致するかに関する網羅性と、
前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせのうち、前記病原性微生物塩基配列情報のうちの一の情報に対し、前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの塩基配列情報と一致する前記病原性微生物塩基配列情報が幾つあるかに関する重複性と、に基づいて、前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドの組み合わせを選択する手段として機能させることを特徴とするＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド混合物の設計プログラム。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005055064A JP4641199B2 (ja) | 2005-02-28 | 2005-02-28 | Ｒｎａ干渉ポリヌクレオチド混合物の設計装置、ｒｎａ干渉ポリヌクレオチド混合物の作製方法、及びｒｎａ干渉ポリヌクレオチド混合物の設計プログラム |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005055064A JP4641199B2 (ja) | 2005-02-28 | 2005-02-28 | Ｒｎａ干渉ポリヌクレオチド混合物の設計装置、ｒｎａ干渉ポリヌクレオチド混合物の作製方法、及びｒｎａ干渉ポリヌクレオチド混合物の設計プログラム |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2006238724A JP2006238724A (ja) | 2006-09-14 |
| JP4641199B2 true JP4641199B2 (ja) | 2011-03-02 |
Family
ID=37045747
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2005055064A Expired - Fee Related JP4641199B2 (ja) | 2005-02-28 | 2005-02-28 | Ｒｎａ干渉ポリヌクレオチド混合物の設計装置、ｒｎａ干渉ポリヌクレオチド混合物の作製方法、及びｒｎａ干渉ポリヌクレオチド混合物の設計プログラム |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4641199B2 (ja) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB0701253D0 (en) | 2007-01-23 | 2007-02-28 | Diagnostics For The Real World | Nucleic acid amplification and testing |
| EP4610368B1 (en) | 2013-08-05 | 2026-02-04 | Twist Bioscience Corporation | De novo synthesized gene libraries |
| WO2016126882A1 (en) | 2015-02-04 | 2016-08-11 | Twist Bioscience Corporation | Methods and devices for de novo oligonucleic acid assembly |
| US9981239B2 (en) | 2015-04-21 | 2018-05-29 | Twist Bioscience Corporation | Devices and methods for oligonucleic acid library synthesis |
| IL258164B (en) | 2015-09-18 | 2022-09-01 | Twist Bioscience Corp | Methods for modulating protein and cellular activity and method for nucleic acid synthesis |
| CN108698012A (zh) | 2015-09-22 | 2018-10-23 | 特韦斯特生物科学公司 | 用于核酸合成的柔性基底 |
| JP6871364B2 (ja) | 2016-09-21 | 2021-05-12 | ツイスト バイオサイエンス コーポレーション | 核酸に基づくデータ保存 |
| EP4556433A3 (en) | 2017-02-22 | 2025-08-06 | Twist Bioscience Corporation | Nucleic acid based data storage |
| CN111566209B (zh) | 2017-06-12 | 2024-08-30 | 特韦斯特生物科学公司 | 无缝核酸装配方法 |
| WO2018231864A1 (en) | 2017-06-12 | 2018-12-20 | Twist Bioscience Corporation | Methods for seamless nucleic acid assembly |
| EP3681906A4 (en) | 2017-09-11 | 2021-06-09 | Twist Bioscience Corporation | GPCR-BINDING PROTEINS AND THEIR SYNTHESIS |
| KR102889470B1 (ko) | 2017-10-20 | 2025-11-21 | 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 | 폴리뉴클레오타이드 합성을 위한 가열된 나노웰 |
| CA3088911A1 (en) | 2018-01-04 | 2019-07-11 | Twist Bioscience Corporation | Dna-based storage device and method for synthesizing polynucleotides using the device |
| WO2019222706A1 (en) | 2018-05-18 | 2019-11-21 | Twist Bioscience Corporation | Polynucleotides, reagents, and methods for nucleic acid hybridization |
| CA3124980A1 (en) | 2018-12-26 | 2020-07-02 | Twist Bioscience Corporation | Highly accurate de novo polynucleotide synthesis |
| CN113785057A (zh) | 2019-02-26 | 2021-12-10 | 特韦斯特生物科学公司 | 用于抗体优化的变异核酸文库 |
| JP2022521551A (ja) | 2019-02-26 | 2022-04-08 | ツイスト バイオサイエンス コーポレーション | Ｇｌｐ１受容体の変異体核酸ライブラリ |
| AU2020298294A1 (en) | 2019-06-21 | 2022-02-17 | Twist Bioscience Corporation | Barcode-based nucleic acid sequence assembly |
| US12091777B2 (en) | 2019-09-23 | 2024-09-17 | Twist Bioscience Corporation | Variant nucleic acid libraries for CRTH2 |
| WO2021061842A1 (en) | 2019-09-23 | 2021-04-01 | Twist Bioscience Corporation | Variant nucleic acid libraries for single domain antibodies |
| BR112022011235A2 (pt) | 2019-12-09 | 2022-12-13 | Twist Bioscience Corp | Bibliotecas de variantes de ácido nucleico para receptores de adenosina |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004048566A1 (ja) * | 2002-11-22 | 2004-06-10 | Bio-Think Tank Co., Ltd. | Ｒｎａ干渉の標的塩基配列検索方法、ｒｎａ干渉を生じさせるポリヌクレオチドの塩基配列設計方法、２本鎖ポリヌクレオチドの作製方法、遺伝子の発現抑制方法、塩基配列処理装置、塩基配列処理方法をコンピュータに実行させるプログラム、記録媒体、および、塩基配列処理システム |
-
2005
- 2005-02-28 JP JP2005055064A patent/JP4641199B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2006238724A (ja) | 2006-09-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4641199B2 (ja) | Ｒｎａ干渉ポリヌクレオチド混合物の設計装置、ｒｎａ干渉ポリヌクレオチド混合物の作製方法、及びｒｎａ干渉ポリヌクレオチド混合物の設計プログラム | |
| Skums et al. | Efficient error correction for next-generation sequencing of viral amplicons | |
| Costas | Characterization of the intragenomic spread of the human endogenous retrovirus family HERV-W | |
| Serrao et al. | Amplification, next-generation sequencing, and genomic DNA mapping of retroviral integration sites | |
| Al-Mawsawi et al. | High-throughput profiling of point mutations across the HIV-1 genome | |
| Baird et al. | Sequence determinants of breakpoint location during HIV-1 intersubtype recombination | |
| Sanchez-Luque et al. | Efficient HIV-1 inhibition by a 16 nt-long RNA aptamer designed by combining in vitro selection and in silico optimisation strategies | |
| Aktar et al. | Structural basis of genomic RNA (gRNA) dimerization and packaging determinants of mouse mammary tumor virus (MMTV) | |
| Kirk et al. | Retroviruses integrate into a shared, non-palindromic DNA motif | |
| Kireev et al. | Evaluating the accuracy and sensitivity of detecting minority HIV-1 populations by Illumina next-generation sequencing | |
| Willerth et al. | Development of a low bias method for characterizing viral populations using next generation sequencing technology | |
| Herrera-Carrillo et al. | Attacking HIV-1 RNA versus DNA by sequence-specific approaches: RNAi versus CRISPR-Cas | |
| Modenini et al. | The coevolution between APOBEC3 and retrotransposons in primates | |
| Suttiprapa et al. | HIV-1 integrates widely throughout the genome of the human blood fluke Schistosoma mansoni | |
| Miyake et al. | Poly-proline motif in HIV-2 Vpx is critical for its efficient translation | |
| Bowen et al. | Determination and comparative analysis of the small RNA genomic sequences of California encephalitis, Jamestown Canyon, Jerry Slough, Melao, Keystone and Trivittatus viruses (Bunyaviridae, genus Bunyavirus, California serogroup) | |
| Hu et al. | Dissecting the dynamics of HIV-1 protein sequence diversity | |
| Jia et al. | Analysis of HIV-1 intersubtype recombination breakpoints suggests region with high pairing probability may be a more fundamental factor than sequence similarity affecting HIV-1 recombination | |
| Romerio | Origin and functional role of antisense transcription in endogenous and exogenous retroviruses | |
| Kartashov et al. | Molecular and genetic characteristics of the multicomponent flavi-like Kindia tick virus (Flaviviridae) found in ixodes ticks on the territory of the Republic of Guinea | |
| Schaack et al. | Experimental approaches to identify host factors important for influenza virus | |
| Chin-inmanu et al. | Feasibility of using 454 pyrosequencing for studying quasispecies of the whole dengue viral genome | |
| Rawson et al. | Single-strand consensus sequencing reveals that HIV type but not subtype significantly impacts viral mutation frequencies and spectra | |
| Roesch et al. | HIV-CRISPR: a CRISPR/Cas9 screening method to identify genes affecting HIV replication | |
| Farinre et al. | Subtype-specific differences in Gag-protease replication capacity of HIV-1 isolates from East and West Africa |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20071130 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100817 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20101018 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20101109 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20101126 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4641199 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131210 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131210 Year of fee payment: 3 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131210 Year of fee payment: 3 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |