CN116917309A - 表达构建体及其用途 - Google Patents

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CN116917309A CN202280018742.XA CN202280018742A CN116917309A CN 116917309 A CN116917309 A CN 116917309A CN 202280018742 A CN202280018742 A CN 202280018742A CN 116917309 A CN116917309 A CN 116917309A
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A·西蒙
J·巴贝里奥
W·赵
A·勒梅尔
A·沙阿
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Abstract

本公开文本涉及包含编码白介素(IL)‑12分子的序列的分离的多核苷酸，以及能够携带所述多核苷酸的递送系统。本公开文本还包括制备所述多核苷酸的方法和使用所述多核苷酸的治疗方法。

Description

表达构建体及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年1月8日提交的美国临时申请号63/135,501的优先权权益，将其通过引用以其整体并入本文。
经由EFS-Web电子递交的序列表的引用
与本申请一起提交的、以ASCII文本文件(名称：4597_005PC01_SequenceListing_ST25.txt；大小：246,918字节；以及创建日期：2022年1月9日)电子递交的序列表的内容通过引用以其整体并入本文。
背景技术
由于IL-12蛋白具有激活NK细胞和细胞毒性T细胞的能力，因此自1994年起它已被视为有前途的抗癌治疗剂。参见Nastala,C.L.等人,J Immunol 153:1697-1706(1994)。尽管对其期望很高，但早期的临床研究并没有产生令人满意的结果。Lasek W.等人,CancerImmunol Immunother 63:419-435,424(2014)。在大多数患者中，反复施用IL12导致适应性反应和血液中IL-12诱导的干扰素γ(IFN-γ)水平的逐步下降。同上。此外，虽然认识到IL-12诱导的抗癌活性主要由IFN-γ的二次分泌介导，但IL-12对IFN-γ与其他细胞因子(例如TNF-α)或趋化因子(IP-10或MIG)的伴随诱导引起严重的毒性。同上。
除了负反馈和毒性外，IL-12疗法在临床环境中的低微疗效还可能是由人体中强烈的免疫抑制环境引起的。同上。为了最大程度地减小IFN-γ毒性并提高IL-12疗效，科学家尝试了不同的方法，如IL-12疗法的不同剂量和时间方案。参见Sacco,S.等人,Blood 90:4473-4479(1997)；Leonard,J.P.等人,Blood 90:2541-2548(1997)；Coughlin,C.M.等人,Cancer Res.57:2460-2467(1997)；Asselin-Paturel,C.等人,Cancer 91:113-122(2001)；以及Saudemont,A.等人,Leukemia 16:1637-1644(2002)。尽管如此，这些方法并未显著影响患者的存活。Kang,W.K.,等人,Human Gene Therapy 12:671-684(2001)。因此，本领域需要一种使用IL12治疗肿瘤的改进的治疗方法。
发明内容
本文提供了分离的多核苷酸，其包含编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的核酸分子。在一些方面，所述核酸分子包含与SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ IDNO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ IDNO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ IDNO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ IDNO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74或SEQ ID NO:75所示序列至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％，至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的核苷酸序列。
在一些方面，编码所述IL-12β的核酸分子包含与51所示序列至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。在一些方面，编码所述IL-12β的核酸分子包含与SEQ ID NO:52所示序列至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。在一些方面，编码所述IL-12β的核酸分子包含与SEQ ID NO:53所示序列至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。在一些方面，编码所述IL-12β的核酸分子包含与SEQID NO:54所示序列至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。在一些方面，编码所述IL-12β的核酸分子包含与SEQ ID NO:55所示序列至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。在一些方面，编码所述IL-12β的核酸分子包含与SEQ ID NO:56所示序列至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。在一些方面，编码所述IL-12β的核酸分子包含与SEQ ID NO:57所示序列至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。在一些方面，编码所述IL-12β的核酸分子包含与SEQ ID NO:58所示序列至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。在一些方面，编码所述IL-12β的核酸分子包含与SEQ IDNO:59所示序列至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。在一些方面，编码所述IL-12β的核酸分子包含与SEQ ID NO:65、69或74所示序列至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。在一些方面，编码所述IL-12β的核酸分子包含与SEQ ID NO:66、70或75所示序列至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。在一些方面，编码所述IL-12β的核酸分子包含与SEQ ID NO:62所示序列至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。在一些方面，编码所述IL-12β的核酸分子包含与SEQ ID NO:63所示序列至少99％或100％相同的核苷酸序列。在一些方面，编码所述IL-12β的核酸分子包含与SEQ ID NO:64所示序列至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
本文还提供了分离的多核苷酸，其包含编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的核酸分子。在一些方面，所述核酸分子包含与SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ IDNO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119、SEQ IDNO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:124或SEQ ID NO:125所示序列至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％，至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的核苷酸序列。
在一些方面，编码所述IL-12α的核酸分子包含与SEQ ID NO:101所示序列至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。在一些方面，编码所述IL-12α的核酸分子包含与SEQ ID NO:102所示序列至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。在一些方面，编码所述IL-12α的核酸分子包含与SEQID NO:103所示序列至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。在一些方面，编码所述IL-12α的核酸分子包含与SEQ ID NO:104所示序列至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。在一些方面，编码所述IL-12α的核酸分子包含与SEQ ID NO:105所示序列至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。在一些方面，编码所述IL-12α的核酸分子包含与SEQ ID NO:106所示序列至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。在一些方面，编码所述IL-12α的核酸分子包含与SEQ ID NO:107所示序列至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。在一些方面，编码所述IL-12α的核酸分子包含与SEQ ID NO:108所示序列至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。在一些方面，编码所述IL-12α的核酸分子包含与SEQ ID NO:109所示序列至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。在一些方面，编码所述IL-12α的核酸分子包含与SEQ ID NO:115、119或124所示序列至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。在一些方面，编码所述IL-12α的核酸分子包含与SEQ ID NO:116、120或125所示序列至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。在一些方面，编码所述IL-12α的核酸分子包含与SEQ ID NO:112所示序列至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。在一些方面，编码所述IL-12α的核酸分子包含与SEQID NO:113所示序列至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。在一些方面，编码所述IL-12α的核酸分子包含与SEQ ID NO:114所示序列至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
本公开文本还提供了分离的多核苷酸，其包含第一核酸分子和第二核酸分子，其中所述第一核酸分子编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)并且包含与SEQ ID NO:51、SEQ IDNO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ IDNO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ IDNO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ IDNO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74或SEQ ID NO:75所示序列至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的核苷酸序列；并且所述第二核酸分子编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)并且包含与SEQ ID NO:101、SEQID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQID NO:113、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQID NO:124或SEQ ID NO:125所示序列至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的核苷酸序列。
在一些方面，所述第一核酸分子包含与SEQ ID NO:51所示序列至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列，和/或所述第二核酸分子包含与SEQ ID NO:101所示序列至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。在一些方面，所述第一核酸分子包含与SEQ ID NO:52所示序列至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列，和/或所述第二核酸分子包含与SEQ ID NO:102所示序列至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。在一些方面，所述第一核酸分子包含与SEQ IDNO:53所示序列至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列，和/或所述第二核酸分子包含与SEQ ID NO:103所示序列至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。在一些方面，所述第一核酸分子包含与SEQ ID NO:54所示序列至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列，和/或所述第二核酸分子包含与SEQ ID NO:104所示序列至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。在一些方面，所述第一核酸分子包含与SEQ ID NO:55所示序列至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列，和/或所述第二核酸分子包含与SEQ ID NO:105所示序列至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。在一些方面，所述第一核酸分子包含与SEQ ID NO:56所示序列至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列，和/或所述第二核酸分子包含与SEQ ID NO:106所示序列至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。在一些方面，所述第一核酸分子包含与SEQID NO:57所示序列至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列，和/或所述第二核酸分子包含与SEQID NO:107所示序列至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。在一些方面，所述第一核酸分子包含与SEQ ID NO:58所示序列至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列，和/或所述第二核酸分子包含与SEQ IDNO:108所示序列至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。在一些方面，所述第一核酸分子包含与SEQID NO:59所示序列至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列，和/或所述第二核酸分子包含与SEQID NO:109所示序列至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。在一些方面，所述第一核酸分子包含与SEQ IDNO:65、69或74所示序列至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列，和/或所述第二核酸分子包含与SEQ ID NO:115、119或124所示序列至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。在一些方面，所述第一核酸分子包含与SEQ ID NO:66、70或75所示序列至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列，和/或所述第二核酸分子包含与SEQ ID NO:116、120或125所示序列至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。在一些方面，所述第一核酸分子包含与SEQ ID NO:62所示序列至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列，和/或所述第二核酸分子包含与SEQ ID NO:112所示序列至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。在一些方面，所述第一核酸分子包含与SEQ ID NO:63所示序列至少99％或100％相同的核苷酸序列，和/或所述第二核酸分子包含与SEQ ID NO:113所示序列至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。在一些方面，所述第一核酸分子包含与SEQ ID NO:64所示序列至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列，和/或所述第二核酸分子包含与SEQ ID NO:114所示序列至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
在一些方面，本文公开的分离的多核苷酸还包含第三核酸分子，所述第三核酸分子编码连接所述第一核酸分子和所述第二核酸分子的接头。在某些方面，所述接头包括至少约2、至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9、至少约10、至少约11、至少约12、至少约13、至少约14、至少约15、至少约16、至少约17、至少约18、至少约19或至少约20个氨基酸的氨基酸接头。在一些方面，所述接头包括(GS)接头。在一些方面中，(GS)接头具有式(Gly3Ser)n或S(Gly3Ser)n，其中n是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80或100的正整数。在一些方面，所述(Gly3Ser)n接头是(Gly3Ser)3或(Gly3Ser)4。在某些方面，编码所述接头的第三核酸分子包含SEQ ID NO:168至170中任一个所示的序列。
在一些方面，本公开文本的分离的多核苷酸还包含编码半衰期延长部分的另外的核酸分子。在某些方面，所述半衰期延长部分包括Fc、白蛋白或其片段、白蛋白结合部分、PAS、HAP、转铁蛋白或其片段、XTEN、或它们的任何组合。
在一些方面，本文所述的分离的多核苷酸还包含编码前导序列的另外的核酸分子。在某些方面，编码前导序列的另外的核酸分子包含SEQ ID NO:26至50所示序列中的任一个。
本文提供了分离的多核苷酸，其包含(从5'到3')(i)编码前导序列的第一核酸分子，(ii)编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的第二核酸分子，(iii)编码第一接头的第三核酸分子，(iv)编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的第四核酸分子，(v)编码第二接头的第五核酸分子，以及(vi)编码人血清白蛋白的第六核酸分子，其中：(a)所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:26所示的序列；(b)所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:51所示的序列；(c)所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:76所示的序列；(d)所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:101所示的序列；(e)所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:126所示的序列；并且(f)所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:147所示的序列。
本文提供了分离的多核苷酸，其包含(从5'到3')(i)编码前导序列的第一核酸分子，(ii)编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的第二核酸分子，(iii)编码第一接头的第三核酸分子，(iv)编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的第四核酸分子，(v)编码第二接头的第五核酸分子，以及(vi)编码人血清白蛋白的第六核酸分子，其中：(a)所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:27所示的序列；(b)所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:52所示的序列；(c)所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:77所示的序列；(d)所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:102所示的序列；(e)所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:127所示的序列；并且(f)所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:148所示的序列。
本文提供了分离的多核苷酸，其包含(从5'到3')(i)编码前导序列的第一核酸分子，(ii)编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的第二核酸分子，(iii)编码第一接头的第三核酸分子，(iv)编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的第四核酸分子，(v)编码第二接头的第五核酸分子，以及(vi)编码人血清白蛋白的第六核酸分子，其中：(a)所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:28所示的序列；(b)所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:53所示的序列；(c)所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:78所示的序列；(d)所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:103所示的序列；(e)所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:128所示的序列；并且(f)所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:149所示的序列。
本文提供了分离的多核苷酸，其包含(从5'到3')(i)编码前导序列的第一核酸分子，(ii)编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的第二核酸分子，(iii)编码第一接头的第三核酸分子，(iv)编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的第四核酸分子，(v)编码第二接头的第五核酸分子，以及(vi)编码人血清白蛋白的第六核酸分子，其中：(a)所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:29所示的序列；(b)所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:54所示的序列；(c)所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:79所示的序列；(d)所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:104所示的序列；(e)所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:129所示的序列；并且(f)所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:150所示的序列。
本文提供了分离的多核苷酸，其包含(从5'到3')(i)编码前导序列的第一核酸分子，(ii)编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的第二核酸分子，(iii)编码第一接头的第三核酸分子，(iv)编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的第四核酸分子，(v)编码第二接头的第五核酸分子，以及(vi)编码人血清白蛋白的第六核酸分子，其中：(a)所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:30所示的序列；(b)所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:55所示的序列；(c)所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:80所示的序列；(d)所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:105所示的序列；(e)所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:130所示的序列；并且(f)所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:151所示的序列。
本文提供了分离的多核苷酸，其包含(从5'到3')(i)编码前导序列的第一核酸分子，(ii)编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的第二核酸分子，(iii)编码第一接头的第三核酸分子，(iv)编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的第四核酸分子，(v)编码第二接头的第五核酸分子，以及(vi)编码人血清白蛋白的第六核酸分子，其中：(a)所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:31所示的序列；(b)所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:56所示的序列；(c)所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:81所示的序列；(d)所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:106所示的序列；(e)所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:131所示的序列；并且(f)所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:152所示的序列。
本文提供了分离的多核苷酸，其包含(从5'到3')(i)编码前导序列的第一核酸分子，(ii)编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的第二核酸分子，(iii)编码第一接头的第三核酸分子，(iv)编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的第四核酸分子，(v)编码第二接头的第五核酸分子，以及(vi)编码人血清白蛋白的第六核酸分子，其中：(a)所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:32所示的序列；(b)所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:57所示的序列；(c)所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:82所示的序列；(d)所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:107所示的序列；(e)所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:132所示的序列；并且(f)所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:153所示的序列。
本文提供了分离的多核苷酸，其包含(从5'到3')(i)编码前导序列的第一核酸分子，(ii)编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的第二核酸分子，(iii)编码第一接头的第三核酸分子，(iv)编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的第四核酸分子，(v)编码第二接头的第五核酸分子，以及(vi)编码人血清白蛋白的第六核酸分子，其中：(a)所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:33所示的序列；(b)所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:58所示的序列；(c)所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:83所示的序列；(d)所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:108所示的序列；(e)所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:133所示的序列；并且(f)所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:154所示的序列。
本文提供了分离的多核苷酸，其包含(从5'到3')(i)编码前导序列的第一核酸分子，(ii)编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的第二核酸分子，(iii)编码第一接头的第三核酸分子，(iv)编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的第四核酸分子，(v)编码第二接头的第五核酸分子，以及(vi)编码人血清白蛋白的第六核酸分子，其中：(a)所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:34所示的序列；(b)所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:59所示的序列；(c)所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:84所示的序列；(d)所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:109所示的序列；(e)所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:134所示的序列；并且(f)所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:155所示的序列。
本文提供了分离的多核苷酸，其包含(从5'到3')(i)编码前导序列的第一核酸分子，(ii)编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的第二核酸分子，(iii)编码第一接头的第三核酸分子，(iv)编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的第四核酸分子，(v)编码第二接头的第五核酸分子，以及(vi)编码人血清白蛋白的第六核酸分子，其中：(a)所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:37所示的序列；(b)所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:62所示的序列；(c)所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:87所示的序列；(d)所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:112所示的序列；(e)所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:137所示的序列；并且(f)所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:158所示的序列。
本文提供了分离的多核苷酸，其包含(从5'到3')(i)编码前导序列的第一核酸分子，(ii)编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的第二核酸分子，(iii)编码第一接头的第三核酸分子，(iv)编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的第四核酸分子，(v)编码第二接头的第五核酸分子，以及(vi)编码人血清白蛋白的第六核酸分子，其中：(a)所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:38所示的序列；(b)所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:63所示的序列；(c)所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:88所示的序列；(d)所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:113所示的序列；(e)所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:138所示的序列；并且(f)所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:159所示的序列。
本文提供了分离的多核苷酸，其包含(从5'到3')(i)编码前导序列的第一核酸分子，(ii)编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的第二核酸分子，(iii)编码第一接头的第三核酸分子，(iv)编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的第四核酸分子，(v)编码第二接头的第五核酸分子，以及(vi)编码人血清白蛋白的第六核酸分子，其中：(a)所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:39所示的序列；(b)所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:64所示的序列；(c)所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:89所示的序列；(d)所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:114所示的序列；(e)所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:139所示的序列；并且(f)所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:160所示的序列。
本文提供了分离的多核苷酸，其包含(从5'到3')(i)编码前导序列的第一核酸分子，(ii)编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的第二核酸分子，(iii)编码第一接头的第三核酸分子，(iv)编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的第四核酸分子，(v)编码第二接头的第五核酸分子，以及(vi)编码人血清白蛋白的第六核酸分子，其中：(a)所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:44所示的序列；(b)所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:69所示的序列；(c)所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:94所示的序列；(d)所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:119所示的序列；(e)所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:140所示的序列；并且(f)所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:161所示的序列。
本文提供了分离的多核苷酸，其包含(从5'到3')(i)编码前导序列的第一核酸分子，(ii)编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的第二核酸分子，(iii)编码第一接头的第三核酸分子，(iv)编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的第四核酸分子，(v)编码第二接头的第五核酸分子，以及(vi)编码人血清白蛋白的第六核酸分子，其中：(a)所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:45所示的序列；(b)所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:70所示的序列；(c)所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:95所示的序列；(d)所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:120所示的序列；(e)所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:141所示的序列；并且(f)所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:162所示的序列。
本文提供了分离的多核苷酸，其包含(从5'到3')(i)编码前导序列的第一核酸分子，(ii)编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的第二核酸分子，(iii)编码第一接头的第三核酸分子，(iv)编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的第四核酸分子，(v)编码第二接头的第五核酸分子，以及(vi)编码人血清白蛋白的第六核酸分子，其中：(a)所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:46所示的序列；(b)所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:71所示的序列；(c)所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:96所示的序列；(d)所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:121所示的序列；(e)所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:142所示的序列；并且(f)所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:163所示的序列。
本文提供了分离的多核苷酸，其包含(从5'到3')(i)编码前导序列的第一核酸分子，(ii)编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的第二核酸分子，(iii)编码第一接头的第三核酸分子，(iv)编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的第四核酸分子，(v)编码第二接头的第五核酸分子，以及(vi)编码人血清白蛋白的第六核酸分子，其中：(a)所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:47所示的序列；(b)所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:72所示的序列；(c)所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:97所示的序列；(d)所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:122所示的序列；(e)所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:143所示的序列；并且(f)所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:164所示的序列。
本文提供了分离的多核苷酸，其包含(从5'到3')(i)编码前导序列的第一核酸分子，(ii)编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的第二核酸分子，(iii)编码第一接头的第三核酸分子，(iv)编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的第四核酸分子，(v)编码第二接头的第五核酸分子，以及(vi)编码人血清白蛋白的第六核酸分子，其中：(a)所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:36所示的序列；(b)所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:61所示的序列；(c)所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:86所示的序列；(d)所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:111所示的序列；(e)所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:136所示的序列；并且(f)所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:157所示的序列。
本文提供了分离的多核苷酸，其包含(从5'到3')(i)编码前导序列的第一核酸分子，(ii)编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的第二核酸分子，(iii)编码第一接头的第三核酸分子，(iv)编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的第四核酸分子，(v)编码第二接头的第五核酸分子，(vi)编码人血清白蛋白的第六核酸分子，(vii)编码第三接头的第七核酸分子；以及(viii)编码光蛋白聚糖蛋白的第八核酸分子，其中：(a)所述第一核酸分子包含SEQ IDNO:48所示的序列；(b)所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:73所示的序列；(c)所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:98所示的序列；(d)所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:123所示的序列；(e)所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:144所示的序列；(f)所述第六核酸分子包含SEQID NO:165所示的序列；(g)所述第七核酸分子包含SEQ ID NO:168所示的序列；并且(h)所述第八核酸分子包含SEQ ID NO:171所示的序列。
本文提供了分离的多核苷酸，其包含(从5'到3')(i)编码前导序列的第一核酸分子，(ii)编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的第二核酸分子，(iii)编码第一接头的第三核酸分子，(iv)编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的第四核酸分子，(v)编码第二接头的第五核酸分子，(vi)编码人血清白蛋白的第六核酸分子，(vii)编码第三接头的第七核酸分子；以及(viii)编码光蛋白聚糖蛋白的第八核酸分子，其中：(a)所述第一核酸分子包含SEQ IDNO:49所示的序列；(b)所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:74所示的序列；(c)所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:99所示的序列；(d)所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:124所示的序列；(e)所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:145所示的序列；(f)所述第六核酸分子包含SEQID NO:166所示的序列；(g)所述第七核酸分子包含SEQ ID NO:169所示的序列；并且(h)所述第八核酸分子包含SEQ ID NO:172所示的序列。
本文提供了分离的多核苷酸，其包含(从5'到3')(i)编码前导序列的第一核酸分子，(ii)编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的第二核酸分子，(iii)编码第一接头的第三核酸分子，(iv)编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的第四核酸分子，(v)编码第二接头的第五核酸分子，(vi)编码人血清白蛋白的第六核酸分子，(vii)编码第三接头的第七核酸分子；以及(viii)编码光蛋白聚糖蛋白的第八核酸分子，其中：(a)所述第一核酸分子包含SEQ IDNO:50所示的序列；(b)所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:75所示的序列；(c)所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:100所示的序列；(d)所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:125所示的序列；(e)所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:146所示的序列；(f)所述第六核酸分子包含SEQID NO:167所示的序列；(g)所述第七核酸分子包含SEQ ID NO:170所示的序列；并且(h)所述第八核酸分子包含SEQ ID NO:173所示的序列。
本文提供了分离的多核苷酸，其包含(从5'到3')(i)编码前导序列的第一核酸分子，(ii)编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的第二核酸分子，(iii)编码第一接头的第三核酸分子，以及(iv)编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的第四核酸分子，其中：(a)所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:40所示的序列；(b)所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:65所示的序列；(c)所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:90所示的序列；并且(d)所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:115所示的序列。
本文提供了分离的多核苷酸，其包含(从5'到3')(i)编码前导序列的第一核酸分子，(ii)编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的第二核酸分子，(iii)编码第一接头的第三核酸分子，以及(iv)编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的第四核酸分子，其中：(a)所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:41所示的序列；(b)所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:66所示的序列；(c)所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:91所示的序列；并且(d)所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:116所示的序列。
本文提供了分离的多核苷酸，其包含(从5'到3')(i)编码前导序列的第一核酸分子，(ii)编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的第二核酸分子，(iii)编码第一接头的第三核酸分子，以及(iv)编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的第四核酸分子，其中：(a)所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:42所示的序列；(b)所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:67所示的序列；(c)所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:92所示的序列；并且(d)所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:117所示的序列。
本文提供了分离的多核苷酸，其包含(从5'到3')(i)编码前导序列的第一核酸分子，(ii)编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的第二核酸分子，(iii)编码第一接头的第三核酸分子，以及(iv)编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的第四核酸分子，其中：(a)所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:43所示的序列；(b)所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:68所示的序列；(c)所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:93所示的序列；并且(d)所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:118所示的序列。
在一些方面，本文所述的分离的多核苷酸还包含5'帽。在某些方面，所述5'帽选自m2 7,2'-OGppspGRNA、m7GpppG、m7Gppppm7G、m2 (7,3'-O)GpppG、m2 (7,2'-O)GppspG(D1)、m2 (7,2'-O)GppspG(D2)、m2 7,3'-OGppp(m1 2'-O)ApG、(m7G-3'mppp-G；其可以等同地称为3'O-Me-m7G(5')ppp(5')G)、N7,2'-O-二甲基-鸟苷-5'-三磷酸-5'-鸟苷、m7Gm-ppp-G、N7-(4-氯苯氧基乙基)-G(5')ppp(5')G、N7-(4-氯苯氧基乙基)-m3'-OG(5')ppp(5')G、7mG(5')ppp(5')N,pN2p、7mG(5')ppp(5')NlmpNp、7mG(5')-ppp(5')NlmpN2 mp、m(7)Gpppm(3)(6,6,2')Apm(2')Apm(2')Cpm(2)(3,2')Up、肌苷、N1-甲基-鸟苷、2'氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷、2-叠氮基-鸟苷、N1-甲基假尿苷、m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG及其组合。
在一些方面，本公开文本的分离的多核苷酸还包含调节元件。在某些方面，所述调节元件选自至少一个翻译增强子元件(TEE)、翻译起始序列、至少一个微小RNA结合位点或其根源(seed)、连接的核苷的3'尾区、富AU元件(ARE)、转录后控制调节子、以及它们的组合。
在一些方面，本文所述的分离的多核苷酸还包含连接的核苷的3'尾区。在某些方面，连接的核苷的3'尾区包含聚A尾、聚A-G四联体或茎环序列。
在一些方面，本公开文本的分离的多核苷酸包含至少一个经修饰的核苷。在某些方面，所述至少一个经修饰的核苷选自6-氮杂-胞苷、2-硫代-胞苷、α-硫代-胞苷、假异胞苷、5-氨基烯丙基-尿苷、5-碘-尿苷、N1-甲基-假尿苷、5,6-二氢尿苷、α-硫代-尿苷、4-硫代-尿苷、6-氮杂-尿苷、5-羟基-尿苷、脱氧胸苷、假尿苷、肌苷、α-硫代-鸟苷、8-氧代-鸟苷、O6-甲基-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、N1-甲基腺苷、2-氨基-6-氯-嘌呤、N6-甲基-2-氨基-嘌呤、6-氯-嘌呤、N6-甲基-腺苷、α-硫代-腺苷、8-叠氮基-腺苷、7-脱氮-腺苷、吡咯并胞苷、5-甲基-胞苷、N4-乙酰基-胞苷、5-甲基-尿苷、5-碘-胞苷及其组合。
在一些方面，本文所述的分离的多核苷酸能够自我复制。在某些方面，所述多核苷酸是自我扩增复制子RNA。在一些方面，所述自我扩增复制子RNA源自甲病毒。在某些方面，所述甲病毒包括委内瑞拉马脑炎病毒、塞姆利基森林病毒、辛德毕斯病毒或其组合。
本公开文本还提供了载体，其包含本文所述的任何分离的多核苷酸。
本公开文本还提供了脂质纳米颗粒(LNP)，其包含(i)本文所述的任何分离的多核苷酸，和(ii)一种或多种类型的脂质。在某些方面，所述一种或多种类型的脂质包括阳离子脂质。在一些方面，所述脂质是可电离脂质。在一些方面，所述脂质是类脂质，例如，N1,N3,N5-三(3-(双十二烷基氨基)丙基)苯-1,3,5-三甲酰胺(TT3)。在一些方面，LNP包含1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、胆固醇、C14-PEG2000或其任何组合。
在一些方面，本文所述的LNP具有约30-500nm的直径。在某些方面，所述LNP具有约50-400nm的直径。在一些方面，所述LNP具有约70-300nm的直径。在一些方面，所述LNP具有约100-200nm的直径。在一些方面，所述LNP具有约100-175nm的直径。在一些方面，所述LNP具有约100-160nm的直径。
在一些方面，所述脂质和所述分离的多核苷酸(例如，经修饰的RNA)具有约1:2至约2:1的质量比。在一些方面，所述脂质和所述分离的多核苷酸(例如，经修饰的RNA)具有1:2、1:1.5、1:1.2、1:1.1、1:1、1.1:1、1.2:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1、5.5:1、6:1、6.5:1、7:1、7.5:1、8:1、8.5:1、9:1、9.5:1、10:1、10.5:1、11:1、11.5:1、12:1、12.5:1、13:1、13.5:1、14:1、14.5:1或15:1的质量比。在一些方面，所述脂质和所述分离的多核苷酸(例如，经修饰的RNA)具有约10:1的质量比。
本文提供了药物组合物，其包含本文所述的任何分离的多核苷酸、载体或LNP以及药学上可接受的载剂。在某些方面，所述药物组合物被配制用于瘤内、鞘内、肌肉内、静脉内、皮下、吸入、皮内、淋巴内、眼内、腹膜内、胸膜内、脊柱内、血管内、鼻、经皮(percutaneous)、舌下、黏膜下、透皮(transdermal)或透黏膜施用。
本文提供了细胞，其包含本文所述的任何分离的多核苷酸、载体或LNP。在一些方面，所述细胞是体外细胞、离体细胞或体内细胞。
本文提供了制备多核苷酸的方法，所述方法包括酶促或化学合成本文所述的任何分离的多核苷酸。本文提供了产生IL-12蛋白的方法，所述方法包括使细胞与本文所述的任何分离的多核苷酸、细胞或LNP接触。在某些方面，所述接触在体内或离体发生。
本公开文本还提供了治疗有需要的受试者的疾病或障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的任何分离的多核苷酸、载体、LNP或药物组合物。在某些方面，所述疾病或障碍包括癌症。在一些方面，所述癌症包括黑色素瘤、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝癌(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepaticcarcinoma)、胃癌、头颈癌或其组合。
在一些方面，治疗本文公开的疾病或障碍的方法还包括向所述受试者施用至少一种另外的治疗剂。在某些方面，所述至少一种另外的治疗剂包括化学治疗药、靶向抗癌疗法、溶瘤药物、细胞毒性剂、基于免疫的疗法、细胞因子、手术、放射手术、共刺激分子的激活剂、免疫检查点抑制剂、疫苗、细胞免疫疗法或其任何组合。在一些方面，所述免疫检查点抑制剂包括抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗LAG-3抗体、抗CTLA-4抗体、抗GITR抗体、抗TIM3抗体或其任何组合。
附图说明
图1A和图1B提供了瘤内单次施用以下各项中的一种而治疗的荷瘤小鼠的肿瘤体积的比较：(i)PBS(对照；空心圆)；(ii)用5'帽类似物进行共转录加帽的repRNA(图1A中的实心圆；图1B中的实线)；以及(iii)通过5'帽的酶促添加进行转录后加帽的repRNA(图1A中的实心正方形；图1B中的虚线)。在施用后的各个时间点(x轴)测量肿瘤体积。图1A显示平均肿瘤体积。图1B显示个体动物的肿瘤体积。
图2提供了用以下各项中的一种治疗的小鼠肿瘤中IL-12蛋白表达的比较：(i)PBS(对照；自左侧起第1列)；(ii)使用A3G+E1载体和帽类似物共转录加帽而制成的repRNA(第2列)；(iii)使用帽类似物共转录加帽而制成的经修饰的mRNA(非自我复制)(第3列)；(iv)使用替代性进化的载体和帽类似物共转录加帽而制成的repRNA(第4列)；以及(v)使用替代性进化的载体和酶促翻译后加帽而制成的repRNA(最后一列)。
图3提供了单次瘤内施用以下各项中的一种而治疗的荷瘤小鼠的卡普兰-迈耶(Kaplan-Meyer)存活分析的比较：(i)PBS(对照；空心圆)；(ii)使用A3G+E1载体和帽类似物共转录加帽而制成的repRNA(空心三角形)；(iii)使用帽类似物共转录加帽而制成的经修饰的mRNA(空心正方形)；(iv)使用替代性进化的载体和帽类似物共转录加帽而制成的repRNA(实心圆)；以及(v)使用替代性进化的载体和酶促翻译后加帽而制成的repRNA(实心正方形)。
图4A提供了本文所述的不同RNA构建体的体外转染效率(如使用FACS分析所测量的)的比较。图4B提供了在用本文所述的不同RNA构建体转染的细胞的上清液中检测到的IL-12蛋白浓度的比较。在图4A和图4B中，测试的RNA构建体包括以下：(i)使用A3G+E1载体和帽类似物共转录加帽而制成的repRNA(实心圆)；(ii)使用A3G+E1载体和酶促翻译后加帽而制成的repRNA(实心正方形)；(iii)使用替代性进化的+E1载体和帽类似物共转录加帽而制成的repRNA(实心三角形)；(iv)使用替代性进化的+E1载体和酶促翻译后加帽而制成的repRNA(实心倒三角形)；(v)使用替代性+E1载体和帽类似物共转录加帽而制成的repRNA(菱形)；(vi)使用A3G+E1进化的载体和帽类似物共转录加帽而制成的repRNA(空心圆)；(vii)使用A3G-E1载体和帽类似物共转录加帽而制成的repRNA(空心正方形)；以及(viii)使用替代性进化的-E1 SGP疤痕(scar)端载体而制成的repRNA(空心三角形)。转染效率显示为在不同组中观察到的IL-12+细胞的频率。x轴表示转染后评估转染效率的小时数。
图5提供了以下RNA构建体的体外转染效率(如使用FACS分析所测量的)的比较：(i)使用帽类似物共转录加帽方法和具有以限制酶疤痕终止的3'端的A3G+E1载体而制成的repRNA(圆)；(ii)使用帽类似物(替代性来源)方法和具有以限制酶疤痕终止的3'端的A3G+E1载体而制成的repRNA，(正方形)；(iii)使用帽类似物共转录加帽方法和具有以规则(clean)聚A序列终止的3'端的A3G+E1载体而制成的repRNA(三角形)；(iv)使用帽类似物(替代性来源)方法和具有以规则聚A序列终止的3'端的A3G+E1载体而制成的repRNA(倒三角形)。将PBS治疗的细胞用作对照(菱形)。转染效率显示为在不同组中观察到的IL-12+细胞的频率。x轴表示转染后评估转染效率的小时数。
图6A和图6B提供了瘤内单次施用RNA构建体而治疗的荷瘤小鼠的肿瘤和血清中观察到的IL-12蛋白浓度的比较，所述RNA构建体编码以下小鼠IL-12蛋白中的一种：(i)单独的mIL-12(“IL-12”)；(ii)与白蛋白缀合的mIL-12(“IL-12-alb”)；以及(iii)与白蛋白和光蛋白聚糖缀合的mIL-12(“IL-12-alb-lum”)。以沿x轴显示的两个剂量之一向动物施用不同的RNA构建体。图6A显示施用后24小时肿瘤(上图)和血清(下图)中的IL-12蛋白浓度。图6B显示施用后96小时肿瘤(上图)和血清(下图)中的IL-12蛋白浓度。
图7A、图7B和图7C提供了瘤内单次施用RNA构建体后24小时，分别在荷瘤小鼠的脾脏、引流淋巴结和非引流淋巴结中观察到的IL-12蛋白浓度的比较，所述RNA构建体编码以下小鼠IL-12蛋白中的一种：(i)单独的mIL-12(“IL-12”)；(ii)与白蛋白缀合的mIL-12(“IL-12-alb”)；以及(iii)与白蛋白和光蛋白聚糖缀合的mIL-12(“IL-12-alb-lum”)。以沿x轴显示的两个剂量之一向动物施用不同的RNA构建体。
图8A、图8B和图8C提供了瘤内单次施用RNA构建体后96小时，分别在荷瘤小鼠的脾脏、引流淋巴结和非引流淋巴结中观察到的IL-12蛋白浓度的比较，所述RNA构建体编码以下小鼠IL-12蛋白中的一种：(i)单独的mIL-12(“IL-12”)；(ii)与白蛋白缀合的mIL-12(“IL-12-alb”)；以及(iii)与白蛋白和光蛋白聚糖缀合的mIL-12(“IL-12-alb-lum”)。以沿x轴显示的两个剂量之一向动物施用不同的RNA构建体。
图9A和图9B提供了瘤内单次施用RNA构建体而治疗的荷瘤小鼠的血清中测量的IL-12蛋白和IFN-γ蛋白浓度的比较，所述RNA构建体编码以下小鼠IL-12蛋白中的一种：(i)单独的mIL-12(三角形)；(ii)与白蛋白缀合的mIL-12(正方形)；以及(iii)与白蛋白和光蛋白聚糖缀合的mIL-12(圆形)。按以下剂量向动物施用RNA构建体：0.25μg(实心符号)或2.5μg(空心符号)。x轴提供测量IL-12和IFN-γ浓度的时间点(施用后)。
图10呈现了对于编码融合蛋白即人轻链前导序列-hIL12p40-GGS(GGGS)3接头-hIL12p35-GSGGGS接头-人血清白蛋白的1137个不同序列(根据实施例5)，最优性相关的数据(平均_密码子_得分)与以kcal/mol计的最小折叠自由能(MFE)的关系的图形表示。示出了L1、L2、L3、M1、M2、M3、H1、H2和H3密码子优化的构建体。如实施例5所描述的，菱形符号表示具有非常高的密码子最优性和MFE的序列。三角形表示在每个氨基酸位置含有最常用的三联体的密码子最优序列。
图11提供了被包含密码子优化的IL-12序列的不同RNA构建体(x轴)转染的细胞的上清液中观察到的IL-12蛋白分泌的比较。如所示，构建体A1-A4的IL-12不与任何其他部分缀合。构建体B1-B4的IL-12与白蛋白缀合。构建体C1-C3的IL-12与白蛋白和光蛋白聚糖缀合。单独的一式三份的测量显示为三角形、正方形、八角形或圆形点，并且水平条显示一式三份的测量的平均值。X轴表示所使用的变体，Y轴表示以ng/ml计的IL-12的浓度。
图12A、图12B和图12C提供了在接受瘤内单次施用RNA构建体的荷瘤小鼠的肿瘤(图12A)、血清(图12B)和脾脏(图12C)中观察到的IL-12蛋白浓度的比较，所述RNA构建体包含(i)与白蛋白和光蛋白聚糖缀合的密码子优化的IL-12序列(在PDX1、PDX2和PDX3的每一个中从左侧起的第1组圆)；(ii)与白蛋白缀合的密码子优化的IL-12序列(在PDX1、PDX2和PDX3的每一个中的第2组圆)；或(iii)单独的密码子优化的IL-12序列(在PDX1、PDX2和PDX3的每一个中的第3组圆)。将未治疗的动物用作对照(在PDX1、PDX2和PDX3的每一个中的最后一组圆)。“PDX1”、“PDX2”和“PDX3”代表从来自三名单独的三阴性乳腺癌(TNBC)患者的肿瘤切除物获得的异种移植物。PDX1和PDX3由原发性切除的ER,PR,HER2阴性病变建立，PDX2由TNBC患者肺部的转移性ER,PR,HER2阴性病变建立。
图13提供了用媒介物对照(空心正方形)或编码IL-12的repRNA(repRNA)治疗(每周总共四个剂量)的TNBC小鼠的肿瘤体积的比较。将repRNA按以下剂量之一施用于动物：(i)5μg(实心圆)，(ii)0.5μg(实心正方形)，或(iii)0.05μg(实心三角形)。
图14提供了用编码rIL-12的repRNA治疗的TNBC小鼠的肿瘤体积的比较，所述repRNA被修饰以包含不同量的经修饰的核苷三磷酸(modNTP)：(i)0％modNTP(即，非修饰的repRNA)(实心圆)；(ii)25％modNTP(实心正方形)；(iii)37.5％modNTP(实心三角形)；或(iv)50％modNTP(实心倒三角形)。将媒介物对照治疗的动物用作对照(空心正方形)。
图15A和图15B分别显示本文所述的repRNA构建体在B16-F10小鼠同系癌症模型中对治疗的和未治疗的肿瘤的作用。如实施例8进一步描述的，向动物的左腹和右腹皮下注射B16-F10肿瘤细胞。一旦达到最佳肿瘤大小，则在左腹(即，治疗的肿瘤)瘤内施用媒介物对照或repRNA(2.5μg)。然后，评估左腹和右腹(即，未治疗的肿瘤)的肿瘤体积。
图16提供了重复给药后在TNBC小鼠模型中的萤光素酶表达(显示为生物发光信号)的比较。如实施例9进一步描述的，给小鼠注射第一剂量的两种萤火虫萤光素酶编码repRNA构建体(mRNA1和mRNA2)中的一种(5μg)(“剂量1”)，然后1周后，注射具有相同repRNA构建体的第二剂量(5μg)(“剂量2”)。在这些动物中的一些中，它们另外每周(两个总剂量)施用抗IFNAR1抗体(10mg/kg)。
图17提供了从用如实施例10所述的重组人IL-12蛋白(rhIL12)或条件培养基治疗的活化人PBMC收集的上清液(即，从被编码IL-12的repRNA转染的BT20细胞收集的上清液)中IFN-γ浓度的比较。将PBMC用以下浓度之一的rhIL12治疗：100ng/mL(“3”)、10ng/mL(“4”)、1ng/mL(“5”)、0.1ng/mL(“6”)或0.01ng/mL(“7”)。条件培养基含有以下量的IL-12之一：1ng/mL(“1”)和10ng/mL(“2”)。将未治疗的细胞用作对照(“8”)。
具体实施方式
定义
除非另外定义，否则本文所用的全部技术和科学术语具有与本公开文本所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。在发生冲突的情况下，将以包括定义在内的本申请为准。除非上下文另外要求，否则单数术语应当包括复数，并且复数术语应当包括单数。
在整个本公开文本中，术语“一个/一种(a)”或“一个/一种(an)”实体是指该实体中的一个/一种或多个/多种；例如，“一种多核苷酸”应理解为代表一种或多种多核苷酸。因此，术语“一个/一种(a或an)”、“一个/一种或多个/多种(one or more)”以及“至少一个/一种(at least one)”在本文中可以互换使用。
此外，在本文中使用时将“和/或”视为对两个指定特征或组分中的每一个具有或不具有另一者的具体公开内容。因此，如在本文中以短语如“A和/或B”使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样，如在短语如“A、B和/或C”中使用的术语“和/或”意图包括以下方面中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独的)；B(单独的)；以及C(单独的)。
术语“约”在本文中用于意指大约、大致、大概或在……左右。当术语“约”结合数值范围使用时，它通过扩展所述数值上下的边界来修改该范围。通常，术语“约”在本文中用于向上或向下(较高或较低)以10％的差异修饰高于和低于所述值的数值，除非另有说明。
在数字或一系列数字之前的术语“至少”应理解为包括与该术语“至少”相邻的数字以及逻辑上可包括的所有后续数字或整数，如从上下文中清楚所见的。例如，核酸分子中核苷酸的数量必须是整数。例如，“21个核苷酸的核酸分子的至少18个核苷酸”意指18、19、20或21个核苷酸具有所示的特性。当至少出现在一系列数字或范围之前时，应理解“至少”可以修饰该系列或范围中的每个数字。“至少”也不限于整数(例如，“至少5％”包括5.0％、5.1％、5.18％，而不考虑有效数字的数量)。
如本文所用的“多核苷酸”或“核酸”意指通过磷酸二酯连接而相连的核苷酸序列。多核苷酸在本文中以从5'到3'的方向呈现。本公开文本的多核苷酸可以是脱氧核糖核酸(DNA)分子或核糖核酸(RNA)分子。核苷酸碱基在本文中由单字母代码表示：腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、肌苷(I)和尿嘧啶(U)。
如本文所用，术语“多肽”涵盖肽和蛋白质，除非另有说明。
术语“编码序列”或序列“编码”在本文中用于意指“编码”特定蛋白质(例如IL-12)的DNA或RNA区(转录区)。当置于适当的调节区域(如启动子)的控制下时，编码序列在体外或体内被转录(DNA)且翻译(RNA)成多肽。编码序列的边界由5'(氨基)末端处的起始密码子和3'(羧基)末端处的翻译终止密码子决定。编码序列可以包括但不限于来自原核生物或真核生物的cDNA、来自原核生物或真核生物的基因组DNA、以及合成DNA序列。转录终止序列可以位于编码序列的3'处。
Kozak共有序列、Kozak共有或Kozak序列已知为出现在真核mRNA上的序列，并且具有共有(gcc)gccRccAUGG(SEQ ID NO:174)，其中R是起始密码子(AUG)的上游三个碱基处的嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)，其后是另一个“G”。在一些方面，所述多核苷酸包含与Kozak共有序列具有至少约95％或更多(例如，至少99％)序列同一性的核酸序列。在一些方面，所述多核苷酸包含Kozak共有序列。
术语“RNA”在本文中用于意指包含至少一个核糖核苷酸残基的分子。“核糖核苷酸”涉及在β-D-呋喃核糖基的2'-位置具有羟基的核苷酸。该术语包含双链RNA、单链RNA、分离的RNA(如部分或完全纯化的RNA、基本上纯的RNA)、合成RNA、重组生成的RNA(如经修饰的RNA，其与天然存在的RNA相差一个或多个核苷酸的添加、缺失、取代和/或改变)。术语“mRNA”意指“信使RNA”，并且涉及通过使用DNA模板产生并编码肽或蛋白质的“转录物”。典型地，mRNA包含5'UTR、蛋白质编码区和3'UTR。mRNA仅在细胞中和体外具有有限的半衰期。在本公开文本的上下文中，可以通过由DNA模板体外转录而生成mRNA。体外转录方法是技术人员已知的。例如，有多种可商购的体外转录试剂盒。在本公开文本的一些方面，将RNA(优选mRNA)用5'帽结构修饰。
术语“序列同一性”在本文中用于意指两个或更多个氨基酸(多肽或蛋白质)序列或者两个或更多个核酸(多核苷酸)序列之间的关系，如通过对序列进行比较所确定的。在某些方面，基于两个给定的SEQ ID NO的全长或其部分来计算序列同一性。其部分可以意指两个SEQ ID NO的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％或者任何其他指定的百分比。术语“同一性”还意指氨基酸或核酸序列(根据具体情况)之间的序列关联度，如通过此类序列串之间的匹配性所确定的。
在某些方面，用于确定同一性的方法被设计为给出所测试序列之间的最大匹配。用于确定同一性和相似性的方法被编纂于可公开获得的电脑程序中。
“基本同源”或“基本相似”意指当提及核酸或其片段时，表示当与另一核酸(或其互补链)在适当的核苷酸插入或缺失方面最佳比对时，在该序列的至少约95％至99％中存在核苷酸序列同一性。
如本文所用，例如包含本文所公开的多核苷酸的组合物的术语“有效量”、“治疗有效量”和“足够量”是指当施用于受试者(包括人)时，足以实现有益的或期望的结果(包括临床结果)的量，并且因此，“有效量”或其同义词取决于其应用的上下文。
给定治疗剂或组合物的量将对应于如下量，该量将根据多种因素而变化，如给定的药剂、药物配制品、施用途径、疾病或障碍的类型、受试者的身份(例如，年龄、性别和/或体重)或正在接受治疗的宿主等。
术语“半衰期”涉及消除分子的活性、量或数量的一半所需的时间。在本公开文本的上下文中，RNA的半衰期指示所述RNA的稳定性。疾病的“发展”或“进展”意指疾病的初始表现和/或随后的进展。可以使用如本领域熟知的标准临床技术来检测和评估疾病的发展。然而，发展也指可能无法预测的进展。如本文所用，发展或进展是指症状的生物学过程。发展包括发生、复发和发作。如本文所用，目标疾病或障碍的发作或发生包括初始发作和/或复发。
表达IL-12的核苷酸
本公开文本涉及多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)，其包含编码IL-12蛋白的核酸分子。如本文所述，本文公开的多核苷酸包含一个或多个特征，使得它们与自然界中存在的参考多核苷酸是不同的(例如，在结构上和/或功能上)。例如，如本公开文本其他地方进一步描述的，例如编码IL-12蛋白(例如，IL-12α亚基和/或IL-12β亚基)的核酸分子已经进行了密码子优化(即，合成的)。
在一些方面，编码IL-12的核苷酸序列包含可翻译区和一个、两个或多于两个修饰。在一些方面，相对于相应的未修饰的核酸，编码IL-12的核苷酸序列在引入该核酸的细胞中展现减少的降解。
在一些方面，修饰可以位于核苷酸的糖部分上。在一些方面，修饰可以位于核苷酸的磷酸骨架上。
在一些方面，例如如果需要精确的蛋白质产生时间，则希望在细胞内降解引入到细胞中的经修饰的核酸。因此，在一些方面，编码IL-12的核苷酸序列包含降解结构域，所述降解结构域能够在细胞内以定向方式发挥作用。
在一些方面，编码IL-12的核苷酸序列包含经修饰的5'帽、半衰期延长部分或调节元件中的至少一种。
在一些方面，当与没有5'帽结构的相同RNA相比时，经修饰的5'帽增加RNA的稳定性，增加RNA的翻译效率，延长RNA的翻译，增加RNA的总蛋白表达。
在一些方面，编码IL-12的核苷酸序列环化或连环化，以生成翻译活性分子，从而辅助聚A结合蛋白和5'端结合蛋白之间的相互作用。环化或连环化的机制可以通过至少3种不同的途径发生：1)化学，2)酶促，以及3)核酶催化。新形成的5'/3'连接可以是分子内或分子间连接。
在第一途径中，核酸的5'端和3'端含有化学反应性基团，当它们靠近在一起时，在分子的5'端和3'端之间形成新的共价连接。5'端可以含有NHS酯反应性基团，3'端可以含有3'-氨基封端核苷酸，因此在有机溶剂中，合成mRNA分子的3'端的3'-氨基封端核苷酸将对5'-NHS酯部分进行亲核攻击，从而形成新的5'/3'酰胺键。
在第二途径中，T4 RNA连接酶可以用于将5'-磷酸化的核酸分子酶促连接到核酸的3'-羟基，从而形成新的磷酸二酯连接。在一个例子反应中，根据制造商的方案，将1μg的核酸分子与1-10个单位的T4 RNA连接酶(New England Biolabs，马萨诸塞州伊普斯维奇市)在37℃孵育1小时。连接反应可以在分离寡核苷酸(a split oligonucleotide)的存在下发生，所述分裂寡核苷酸能够与并置的5'和3'区域进行碱基配对，以辅助酶促连接反应。
在第三途径中，cDNA模板的5'或3'端编码连接酶核酶序列，使得在体外转录期间，所得的核酸分子可以含有能够将核酸分子的5'端与核酸分子的3'端连接的活性核酶序列。连接酶核酶可以源自I型内含子、I型内含子、丙型肝炎病毒、发夹核酶，或者可以通过SELEX(通过指数富集对配体进行系统进化)来选择。在0℃与37℃之间的温度下，核酶连接酶反应可能需要1至24小时。
在一些方面，多个不同的核酸、编码IL-12的核苷酸序列或初级构建体可以使用在3'末端被修饰的核苷酸与3'端连接在一起。化学缀合可以用于控制递送到细胞的化学计量。例如，乙醛酸循环酶、异柠檬酸裂解酶和苹果酸合酶可以以1:1的比例供应到HepG2细胞中，以改变细胞脂肪酸的代谢。该比例可以通过使用编码IL-12的一种核酸或经修饰的RNA种类上的3'-叠氮基封端核苷酸以及相对核酸或核苷酸序列种类上的含C5-乙炔基或炔基的核苷酸化学连接核酸或经修饰的RNA来控制。根据制造商的方案，使用末端转移酶(NewEngland Biolabs，马萨诸塞州伊普斯维奇市)在转录后添加编码IL-12的核苷酸序列。在添加3'-修饰的核苷酸之后，可以在存在或不存在铜的情况下，将编码IL-12的两种核酸或核苷酸序列组合在水溶液中，以经由文献中所述的点击化学机制形成新的共价连接。
在一些方面，可以使用官能化的接头分子将多于两种多核苷酸连接在一起。例如，官能化的糖分子可以被化学修饰以含有多个化学反应性基团(SH-、NH2-、N3等)，从而与3'-官能化(即，3'-马来酰亚胺酯、3'-NHS-酯、炔基)的mRNA分子上的同源部分反应。可以以化学计量方式控制经修饰的糖上的反应性基团的数量，以直接控制缀合的核酸或mRNA的化学计量比。
在一些方面，为了进一步增强蛋白质产生，本公开文本的编码IL-12的核苷酸序列、多核苷酸或初级构建体可以被设计为与其他以下各项缀合：多核苷酸、染料、嵌入剂(例如，吖啶)、交联剂(例如，补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉(TPPC4、泰克萨菲瑞(texaphyrin)、萨普菲瑞(Sapphyrin))、多环芳烃(例如，吩嗪、二氢吩嗪)、人工核酸内切酶(例如，EDTA)、烷基化剂、磷酸盐、氨基、巯基、PEG(例如，PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚氨基、烷基、取代的烷基、放射性标记、酶、半抗原(例如，生物素)、转运/吸收促进剂(例如，阿司匹林、维生素E、叶酸)、合成核糖核酸酶、蛋白质(例如，糖蛋白)或肽(例如，对共配体具有特异性亲和力的分子)或抗体(例如，与特定细胞类型(如癌细胞、内皮细胞或骨细胞)结合的抗体)、激素和激素受体、非肽物质(如脂质、凝集素、碳水化合物、维生素、辅因子或药物)。
缀合可以导致增加的稳定性和/或半衰期，并且可以特别用于将编码IL-12的核苷酸序列或初级构建体靶向细胞、组织或生物体中的特定位点。
在一些方面，所述初级构建体被设计为编码一种或多种目的多肽或其片段。目的多肽可以包括但不限于完整多肽、多种多肽或多肽片段，其独立地可以由一个或多个核酸(one or more nucleic acids)、多个核酸(a plurality of nucleic acids)、核酸片段或前述任一种的变体编码。如本文所用，术语“目的多肽”是指被选择在本公开文本的初级构建体中编码的任何多肽。如本文所用，“多肽”意指最常通过肽键连接在一起的氨基酸残基(天然或非天然)的聚合物。如本文所用，所述术语是指任何大小、结构或功能的蛋白质、多肽和肽。在一些情况下，所编码多肽小于约50个氨基酸，则将所述多肽称为肽。如果所述多肽是肽，其长度将是至少约2、3、4或至少5个氨基酸残基。因此，多肽包括基因产物、天然存在的多肽、合成多肽、同系物、直系同源物、旁系同源物、片段以及前述的其他等效物、变体和类似物。多肽可以是单一分子，或者可以是多分子复合物，如二聚体、三聚体或四聚体。它们还可以包含单链或多链多肽(如抗体或胰岛素)，并且可以缔合或连接。最常见的二硫键是在多链多肽中发现的。术语多肽也可以应用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物。
术语“多肽变体”是指氨基酸序列与天然或参考序列不同的分子。如与天然或参考序列相比，氨基酸序列变体可以在氨基酸序列内的某些位置具有取代、缺失和/或插入。通常，变体将与天然或参考序列具有至少约50％同一性(同源性)，并且优选地，其将与天然或参考序列至少约80％、更优选地至少约90％相同(同源)。
因此，编码相对于参考序列含有取代、插入和/或添加、缺失和共价修饰的目的多肽的多核苷酸被包括在本公开文本的范围内。例如，可以将序列标签或氨基酸(如一个或多个赖氨酸)添加至本公开文本的肽序列(例如，在N末端或C末端)。序列标签可以用于肽纯化或定位。赖氨酸可以用于增加肽溶解度或允许生物素化。可替代地，位于肽或蛋白质的氨基酸序列的羧基和氨基末端区的氨基酸残基可以任选地缺失，从而提供截短的序列。根据序列的用途(例如，作为较大序列的一部分的序列的表达，所述较大序列是可溶的或连接至固体支持物)，某些氨基酸(例如，C末端或N末端残基)可以替代地缺失。
如本领域技术人员所公认的，蛋白质片段、功能性蛋白质结构域和同源蛋白质也被认为在本公开文本的目的多肽的范围内。例如，本文提供了参考蛋白的长度为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或大于100个氨基酸的任何蛋白质片段(意指比参考多肽序列短至少一个氨基酸残基但在其他方面相同的多肽序列)。在另一个例子中，包括约20、约30、约40、约50或约100个氨基酸(与本文所述的任何序列约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约100％相同)的区段的任何蛋白质可以根据本公开文本使用。在某些方面，根据本公开文本使用的多肽包括2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个突变，如本文提供或引用的任何序列所示。
在一些方面，编码IL-12的核苷酸序列包含经修饰的5'帽、半衰期延长部分、调节元件或其组合。
在一些方面，所述经修饰的5'帽选自m2 7,2'-OGppspGRNA、m7GpppG、m7Gppppm7G、m2 (7 ,3'-O)GpppG、m2 (7,2'-O)GppspG(D1)、m2 (7,2'-O)GppspG(D2)、m2 7,3'-OGppp(m1 2'-O)ApG、(m7G-3'mppp-G；其可以等同地称为3'O-Me-m7G(5')ppp(5')G)、N7,2'-O-二甲基-鸟苷-5'-三磷酸-5'-鸟苷、m7Gm-ppp-G、N7-(4-氯苯氧基乙基)-G(5')ppp(5')G、N7-(4-氯苯氧基乙基)-m3'-OG(5')ppp(5')G、7mG(5')ppp(5')N,pN2p、7mG(5')ppp(5')NlmpNp、7mG(5')-ppp(5')NlmpN2mp、m(7)Gpppm(3)(6,6,2')Apm(2')Apm(2')Cpm(2)(3,2')Up、肌苷、N1-甲基-鸟苷、2'氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷、2-叠氮基-鸟苷、N1-甲基假尿苷、m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG及其组合。
本公开文本还包括包含5'帽和本公开文本的编码IL-12的核苷酸序列的多核苷酸(例如，包含编码IL12B多肽、IL12A多肽和/或IL12B和IL12A融合多肽的核苷酸序列的多核苷酸)。
天然mRNA的5'帽结构参与核输出、增加mRNA的稳定性并结合mRNA帽结合蛋白(CBP)，并且通过CBP与聚(A)结合蛋白的缔合而负责细胞中mRNA的稳定性和翻译能力，从而形成成熟的环状mRNA物质。帽在mRNA剪接过程中还帮助去除5'近端内含子。
内源性mRNA分子可以进行5'端加帽，在mRNA分子的末端鸟苷帽残基和5'末端转录的有义核苷酸之间生成5'-ppp-5'-三磷酸连接。然后该5'-鸟苷酸帽可以被甲基化以生成N7-甲基-鸟苷酸残基。mRNA的5'端的末端和/或先前末端(anteterminal)转录的核苷酸的核糖也可以任选地被2'-0-甲基化。通过鸟苷酸帽结构的水解和切割进行的5'-脱帽可以靶向核酸分子(如mRNA分子)，以进行降解。
根据本公开文本，5'末端帽可以包括内源性帽或帽类似物。根据本公开文本，5'末端帽可以包括鸟嘌呤类似物。有用的鸟嘌呤类似物包括但不限于肌苷、N1-甲基-鸟苷、2'氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷和2-叠氮基-鸟苷。
在一些方面，所述5'末端帽结构是CapO、Capl、ARC A、肌苷、Nl-甲基-鸟苷、2'氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷、2-叠氮基鸟苷、Cap2、Cap4、5'甲基G帽或其类似物。
另外的非限制性帽包括2017年11月23日发布的WO/2017/201350中披露的5'帽，将其通过引用并入本文。
在一些方面，所述半衰期延长部分包括Fc、白蛋白或其片段、白蛋白结合部分、PAS序列、HAP序列、转铁蛋白或其片段、XTEN、或它们的任何组合。
在一些方面，所述半衰期延长部分包括Fc。在一些方面，所述半衰期延长部分包括白蛋白或其片段。
在一些方面，所述调节元件选自至少一个翻译增强子元件(TEE)、翻译起始序列、至少一个微小RNA结合位点或其根源、连接的核苷的3'尾区、富AU元件(ARE)、转录后控制调节子、以及它们的组合。
在一些方面，所述调节元件还包含聚A区。在一些方面，本公开文本的编码IL-12的核苷酸序列(例如，包含编码IL12B多肽、IL12A多肽和/或IL12B和IL12A融合多肽的核苷酸序列的多核苷酸)还包含聚A尾。在一些方面，可以掺入聚A尾上的末端基团以进行稳定。在其他方面，聚A尾包含des-3'羟基尾。在RNA加工过程中，可以将长串的腺嘌呤核苷酸(聚A尾)添加到多核苷酸(如mRNA分子)中，以增加稳定性。
转录后，转录物的3'端可以立即被切割以释放3'羟基。然后聚A聚合酶将腺嘌呤核苷酸串添加到RNA上。称为聚腺苷酸化的这一过程添加了聚A尾，所述聚A尾的长度可以在例如大约80至大约250个残基之间，长度包括大约80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240或250个残基。
也可以在构建体从细胞核输出后添加聚A尾。
根据本公开文本，可以掺入聚A尾上的末端基团以进行稳定。本公开文本的多核苷酸可以包括des-3'羟基尾。它们还可以包括结构部分或2'-O甲基修饰，如Junjie Li等人(Current Biology,Vol.15,1501-1507,2005年8月23日，将其内容通过引用以其整体并入本文)所教授的。关于另外的聚A尾，还参见2017年11月23日发布的WO/2017/201350，将其通过引用并入本文。
在一些方面，编码IL-12的核苷酸序列包含本文所述的任何修饰或修饰的组合。末 端架构修饰：非翻译区(UTR)
基因的非翻译区(UTR)被转录但不被翻译。5'UTR从转录起始位点开始，并持续到起始密码子但不包括起始密码子；而3'UTR在终止密码子之后立即开始并持续到转录终止信号。越来越多的证据表明UTR在核酸分子的稳定性和翻译方面发挥调节作用。UTR的调节特征可以掺入本公开文本的RNA(例如，经修饰的RNA)中以增强分子的稳定性。还可以掺入具体特征，以确保在转录物被误导到不希望的器官部位的情况下对转录物进行受控下调。
5'UTR和翻译起始
自然5'UTR具有在翻译起始中发挥作用的特征。它们具有诸如Kozak序列等特征，通常已知Kozak序列参与核糖体启动许多基因的翻译这一过程。Kozak序列具有共有CCR(A/G)CCAUGG，其中R是起始密码子(AUG)的上游三个碱基处的嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)，其后是另一个‘G'。还已知5'UTR形成参与延伸因子结合的二级结构。
参与延伸因子结合的5'UTR二级结构可以与5'UTR或3'UTR中的其他RNA结合分子相互作用，以调节基因表达。例如，与5'UTR中的二级结构化元件结合的延伸因子EIF4A2对于微小RNA介导的抑制是必需的(Meijer H A等人,Science,2013,340,82-85，将其通过引用以其整体并入本文)。5'UTR中的不同二级结构可以掺入侧翼区，以使特定组织或细胞中的mRNA稳定或选择性地脱稳定。
通过使通常在特定靶器官的大量表达基因中发现的特征工程化，可以增强本公开文本的核酸或mRNA的稳定性和蛋白质产生。例如，引入肝脏表达的mRNA(如白蛋白、血清淀粉样蛋白A、载脂蛋白A/B/E、转铁蛋白、甲胎蛋白、促红细胞生成素或因子VIII)的5'UTR可以用于增强核酸分子(如mmRNA)在肝细胞系或肝脏中的表达。同样地，使用来自其他组织特异性mRNA的5'UTR来改善该组织中的表达也是可能的—对于肌肉(MyoD、肌球蛋白、肌红蛋白、肌细胞生成素、生肌因子(Herculin))，对于内皮细胞(Tie-1、CD36)，对于髓样细胞(C/EBP、AML1、G-CSF、GM-CSF、CD11b、MSR、Fr-1、i-NOS)，对于白细胞(CD45、CD18)，对于脂肪组织(CD36、GLUT4、ACRP30、脂联素)，以及对于肺上皮细胞(SP-A/B/C/D)。
其他非UTR序列可以掺入5'(或3'UTR)UTR中。例如，内含子或内含子序列的部分可以掺入本公开文本的核酸或mRNA的侧翼区中。内含子序列的掺入可以增加蛋白质的产生以及mRNA的水平。
在本公开文本的一些方面，来自GTX基因的IRES序列的至少一个片段可以包括在5'UTR中。作为非限制性例子，所述片段可以是来自GTX基因的IRES的18核苷酸序列。作为另一个非限制性例子，来自GTX基因的IRES序列的18核苷酸序列片段可以在本文所述的多核苷酸的5'UTR中串联重复。所述18核苷酸序列可以在5'UTR中重复至少一次、至少两次、至少三次、至少四次、至少五次、至少六次、至少七次、至少八次、至少九次或多于十次。
核苷酸可以从5'(或3')UTR中突变、替代和/或除去。例如，起始密码子上游的一个或多个核苷酸可以被另一个核苷酸替代。要替代的一个或多个核苷酸可以是起始密码子上游的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60或多于60个核苷酸。作为另一个例子，起始密码子上游的一个或多个核苷酸可以从UTR中除去。
5'UTR、3'UTR和翻译增强子元件(TEE)
在一些方面，编码IL-12的核苷酸序列的5'UTR包含至少一种翻译增强子多核苷酸、翻译增强子元件(translation enhancer element)、翻译增强子元件(translationalenhancer elements)(统称为“TEE”)。在一些方面，TEE位于转录启动子和起始密码子之间。在一些方面，在5'UTR中具有至少一个TEE的RNA(例如，经修饰的RNA)包含在5'UTR处的帽。在一些方面，所述至少一个TEE可以位于编码IL-12的核苷酸序列(经历帽依赖性或帽非依赖性翻译)的5'UTR。
术语“翻译增强子元件(translational enhancer element)”或“翻译增强子元件(translation enhancer element)”(本文统称为“TEE”)是指增加由mRNA产生的多肽或蛋白质的量的序列。
在一个方面，TEE是UTR中的保守元件，其可以促进核酸的翻译(例如但不限于帽依赖性或帽非依赖性翻译)活性。这些序列的保守性先前已由Panek等人(Nucleic AcidsResearch,2013,1-10；通过引用以其整体并入本文)在包括人类在内的14个物种中证明。
在一些方面，编码IL-12的核苷酸序列具有至少一个TEE，所述TEE与美国申请号2014/0147454中披露的TEE具有至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％同一性，将该申请通过引用以其整体并入本文。在一些方面，RNA(例如，经修饰的RNA)包含至少一个TEE，所述TEE与以下文献中所述的TEE具有至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％同一性：美国专利公开号US20090226470、US 20070048776、US20130177581和US20110124100，国际专利公开号WO 1999024595、WO 2012009644、WO 2009075886和WO2007025008，欧洲专利公开号EP 2610341A1和EP 2610340A1，美国专利号6,310,197，美国专利号6,849,405，美国专利号7,456,273，美国专利号7,183,395；将这些文献中的每一个通过引用以其整体并入本文。
在一些方面，编码IL-12的核苷酸序列的5'UTR可以包括至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55或多于60个TEE序列。在一些方面，RNA(例如，经修饰的RNA)的5'UTR中的TEE序列是相同或不同的TEE序列。在一些方面，所述TEE序列以诸如ABABAB或AABBAABBAABB或ABCABCABC或其变型的模式重复一次、两次或多于三次。在这些模式中，每个字母A、B或C代表核苷酸水平上不同的TEE序列。
在一些方面，分开两个TEE序列的间隔子包括本领域已知的调节RNA(例如，经修饰的RNA)的翻译的其他序列，例如但不限于本文所述的miR序列(例如，miR结合位点和miR根源序列)。在一些方面，用于分开两个TEE序列的每个间隔子包括不同的miR序列或miR序列的组分(例如，miR根源序列)。
在一些方面，在本公开文本的编码IL-12的核苷酸序列的5'UTR中使用的TEE是IRES序列，例如但不限于美国专利号7,468,275和国际专利公开号WO 2001055369中所述的那些，将这些文献的每一个通过引用以其整体并入本文。
在一些方面，本文所述的TEE位于编码IL-12的核苷酸序列的5'UTR和/或3'UTR中。在一些方面，位于3'UTR中的TEE与位于5'UTR中和/或被描述用于掺入5'UTR中的TEE相同和/或不同。
在一些方面，编码IL-12的核苷酸序列的3'UTR可以包括至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55或多于60个TEE序列。在一些方面，本公开文本的编码IL-12的核苷酸序列的3'UTR中的TEE序列是相同或不同的TEE序列。所述TEE序列以诸如ABABAB或AABBAABBAABB或ABCABCABC或其变型的模式重复一次、两次或多于三次。在这些模式中，每个字母A、B或C代表核苷酸水平上不同的TEE序列。
在一些方面，3'UTR包括间隔子以分开两个TEE序列。在一些方面，所述间隔子是15核苷酸间隔子和/或本领域已知的其他间隔子。在一些方面，3'UTR可以包括在3'UTR中重复至少一次、至少两次、至少3次、至少4次、至少5次、至少6次、至少7次、至少8次和至少9次或多于9次的TEE序列-间隔子模块。
在一些方面，分开两个TEE序列的间隔子包括本领域已知的调节编码IL-12的核苷酸序列的翻译的其他序列，例如但不限于本文所述的miR序列(例如，miR结合位点和miR根源序列)。在一些方面，用于分开两个TEE序列的每个间隔子包括不同的miR序列或miR序列的组分(例如，miR根源序列)。
掺入微小RNA结合位点
在一些方面，编码IL-12的核苷酸序列还包含传感器序列。传感器序列包括例如微小RNA结合位点、转录因子结合位点、结构化mRNA序列和/或基序、人工结合位点(其被工程化以充当内源核酸结合分子的伪受体)。包含至少一个传感器序列的多核苷酸的非限制性例子描述于美国申请号2014/0147454中，该申请通过引用以其整体并入本文。
在一些方面，对靶细胞或组织进行微小RNA(miRNA)分析以确定细胞或组织中miRNA的存在或不存在。
微小RNA(或miRNA)是19-25个核苷酸长的非编码RNA，其与核酸分子的3'UTR结合并通过降低核酸分子的稳定性或抑制翻译来下调基因表达。在一些方面，RNA(例如，经修饰的RNA)包含一个或多个微小RNA靶序列、微小RNA序列或微小RNA根源序列。这样的序列可以对应于任何已知的微小RNA，如在美国公开物US2005/0261218和美国公开物US2005/0059005中教授的那些，将这些公开物的内容通过引用以其整体并入本文。作为非限制性例子，人类基因组中已知的微小RNA、它们的序列和根源序列描述于美国申请号2014/0147454中，将该申请通过引用以其整体并入本文。
微小RNA序列包含“根源”区，即成熟微小RNA的2-8位区域中的序列，所述序列与miRNA靶序列具有完美的沃森-克里克互补性。微小RNA根源序列包含成熟微小RNA的2-8或2-7位。在一些方面，微小RNA根源序列包含7个核苷酸(例如，成熟微小RNA的核苷酸2-8)，其中相应miRNA靶序列中的根源互补位点的侧翼是与微小RNA位置1相对的腺嘌呤(A)。在一些方面，微小RNA根源序列包含6个核苷酸(例如，成熟微小RNA的核苷酸2-7)，其中相应miRNA靶序列中的根源互补位点的侧翼是与微小RNA位置1相对的腺嘌呤(A)。参见例如，GrimsonA,Farh K,Johnston W K,Garrett-Engele P,Lim L P,Bartel D P；Mol Cell.2007年7月6日；27(1):91-105。微小RNA根源序列的碱基与靶序列具有完全的互补性。通过将微小RNA靶序列工程化到本公开文本的核酸或mRNA的3'UTR中，可以使所述分子用于降解或减少翻译，条件是所讨论的微小RNA是可用的。此过程将减少核酸分子递送时脱靶效应的风险。已报道了微小RNA、微小RNA靶区域的鉴定及其表达模式和在生物学中的作用(Bonauer等人,CurrDrug Targets 2010 11:943-949；Anand和Cheresh Curr Opin Hematol 2011 18:171-176；Contreras和Rao Leukemia 2012 26:404-413(2011年12月20日.doi:10.1038/leu.2011.356)；Bartel Cell 2009 136:215-233；Landgraf等人,Cell,2007 129:1401-1414；Gentner和Naldini,Tissue Antigens.2012 80:393-403以及其中的所有引用；将这些文献的每一个通过引用以其整体并入本文)。
例如，如果mRNA无意被递送到肝脏但最终到达那里，那么如果将miR-122的一个或多个靶位点工程化到经修饰的核酸、增强的经修饰的RNA或核糖核酸的3'UTR中，则miR-122(肝脏中丰富的微小RNA)可以抑制目的基因的表达。不同微小RNA的一个或多个结合位点的引入可以被工程化以进一步降低经修饰的核酸、增强的经修饰的RNA或核糖核酸的寿命、稳定性和蛋白质翻译。如本文所用，术语“微小RNA位点”是指微小RNA靶位点或微小RNA识别位点、或微小RNA结合或缔合的任何核苷酸序列。应当理解，“结合”可以遵循传统的沃森-克里克杂交规则，或者可以反映微小RNA与靶序列在微小RNA位点处或附近的任何稳定缔合。
相反地，出于本公开文本的编码IL-12的核苷酸序列的目的，微小RNA结合位点可以从它们天然存在的序列中工程化地除去(即，从其中去除)，以增加特定组织中的蛋白质表达。例如，可以去除miR-122结合位点以改善肝脏中的蛋白质表达。
在一些方面，编码IL-12的核苷酸序列包括在3'UTR中的至少一个miRNA结合位点，以将细胞毒性或细胞保护性mRNA治疗剂引导至特定细胞，例如但不限于正常细胞和/或癌细胞(例如，HEP3B或SNU449)。
已知微小RNA调节mRNA并由此调节蛋白质表达的组织的例子包括但不限于肝脏(miR-122)、肌肉(miR-133、miR-206、miR-208)、内皮细胞(miR-17-92、miR-126)、髓样细胞(miR-142-3p、miR-142-5p、miR-16、miR-21、miR-223、miR-24、miR-27)、脂肪组织(let-7、miR-30c)、心脏(miR-1d、miR-149)、肾脏(miR-192、miR-194、miR-204)和肺上皮细胞(let-7、miR-133、miR-126)。
具体地，已知微小RNA在免疫细胞(也称为造血细胞)中差异表达，所述免疫细胞例如抗原呈递细胞(APC)(例如，树突细胞和巨噬细胞)、巨噬细胞、单核细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、粒细胞、自然杀伤细胞等。免疫细胞特异性微小RNA参与免疫原性，自身免疫，对感染、炎症的免疫应答，以及基因治疗和组织/器官移植后的不良免疫应答。免疫细胞特异性微小RNA还调节造血细胞(免疫细胞)的发育、增殖、分化和凋亡的许多方面。例如，miR-142和miR-146仅在免疫细胞中表达，尤其在髓样树突细胞中大量表达。本领域已证明，通过将miR-142结合位点添加到递送的基因构建体的3'UTR中来阻断对外源核酸分子的免疫应答，从而能够在组织和细胞中实现更稳定的基因转移。miR-142有效地降解抗原呈递细胞中的外源mRNA，并抑制转导细胞的细胞毒性消除(Annoni A等人,blood,2009,114,5152-5161；Brown B D等人,Nat med.2006,12(5),585-591；Brown B D等人,blood,2007,110(13):4144-4152，将这些文献中的每一个通过引用以其整体并入本文)。
本领域进行了多项微小RNA表达研究，以分析微小RNA在各种癌细胞/组织和其他疾病中的差异表达。一些微小RNA在某些癌细胞中异常过表达，而另一些则表达不足。例如，微小RNA在以下各项中差异表达：癌细胞(WO 2008/154098、US2013/0059015、US2013/0042333、WO 2011/157294)；癌干细胞(US2012/0053224)；胰腺癌和胰腺疾病(US2009/0131348、US2011/0171646、US2010/0286232、美国专利号8,389,210)；哮喘和炎症(美国专利号8,415,096)；前列腺癌(US2013/0053264)；肝细胞癌(WO 2012/151212、US2012/0329672、WO 2008/054828、美国专利号8,252,538)；肺癌细胞(WO 2011/076143、WO 2013/033640、WO 2009/070653、US2010/0323357)；皮肤T细胞淋巴瘤(WO 2013/011378)；结直肠癌细胞(WO 2011/0281756、WO 2011/076142)；癌阳性淋巴结(WO 2009/100430、US2009/0263803)；鼻咽癌(EP 2112235)；慢性阻塞性肺病(US2012/0264626、US2013/0053263)；甲状腺癌(WO 2013/066678)；卵巢癌细胞(US2012/0309645、WO 2011/095623)；乳腺癌细胞(WO 2008/154098、WO 2007/081740、US2012/0214699)、白血病和淋巴瘤(WO 2008/073915、US2009/0092974、US2012/0316081、US2012/0283310、WO 2010/018563，将这些文献的每一个的内容通过引用以其整体并入本文)。
至少一个微小RNA位点可以被工程化到编码IL-12的核苷酸序列的3'UTR中。在一些方面，至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个或更多个微小RNA位点可以被工程化到编码IL-12的核苷酸序列的3'UTR中。在一些方面，掺入编码IL-12的核苷酸序列中的微小RNA位点是相同或不同的微小RNA位点。在一些方面，掺入编码IL-12的核苷酸序列中的微小RNA位点靶向体内相同或不同的组织。作为非限制性例子，通过在经修饰的核酸mRNA的3'UTR中引入组织特异性、细胞类型特异性或疾病特异性微小RNA结合位点，可以降低特定细胞类型(例如，肝细胞、髓样细胞、内皮细胞、癌细胞等)中的表达程度。
在一些方面，微小RNA位点在3'UTR的5'末端附近、在3'UTR的5'末端和3'末端之间的大约一半处和/或在3'UTR的3'末端附近被工程化。在一些方面，微小RNA位点在3'UTR的5'末端附近以及在3'UTR的5'末端和3'末端之间的大约一半处被工程化。在一些方面，微小RNA位点在3'UTR的3'末端附近以及在3'UTR的5'末端和3'末端之间的大约一半处被工程化。在一些方面，微小RNA位点在3'UTR的5'末端附近以及在3'UTR的3'末端附近被工程化。
在一些方面，经修饰的信使RNA包含与已知根源序列具有100％同一性或与根源序列具有小于100％同一性的微小RNA结合区位点。根源序列可以部分突变以降低微小RNA结合亲和力，从而导致mRNA转录物的下调减少。本质上，靶mRNA与微小RNA根源序列之间的匹配或错配程度可以充当变阻器，以更精细地调节微小RNA调节蛋白质表达的能力。此外，微小RNA结合位点的非根源区中的突变也可能影响微小RNA调节蛋白质表达的能力。
RNA结合蛋白(RBP)的RNA基序
RNA结合蛋白(RBP)可以调节共转录和转录后基因表达的许多方面，例如但不限于RNA剪接、定位、翻译、转换、聚腺苷酸化、加帽、修饰、输出和定位。RNA结合结构域(RBD)(例如但不限于RNA识别基序(RR)和hnRNP K-同源(KH)结构域)通常调节RBP与其RNA靶标之间的序列缔合(Ray等人Nature 2013.499:172-177；通过引用以其整体并入本文)。在一些方面，典型RBD结合短RNA序列。在一些方面，典型RBD识别RNA结构。
RNA结合蛋白以及相关核酸和蛋白质序列的非限制性例子描述于美国申请号2014/0147454中，将该申请通过引用以其整体并入本文。
在一些方面，为了增加目的mRNA的稳定性，将编码HuR的mRNA与目的mRNA一起共转染或共注射到细胞或组织中。这些蛋白质也可以拴系到体外目的mRNA上，然后一起施用至细胞中。聚A尾结合蛋白(PABP)与真核翻译起始因子eIF4G相互作用，以刺激翻译起始。将编码这些RBP的mRNA与mRNA药物共施用和/或将这些蛋白质拴系到体外mRNA药物上并将蛋白质结合的mRNA施用至细胞中可以提高mRNA的翻译效率。同一概念可以扩展到mRNA与编码各种翻译因子的mRNA和促进剂以及蛋白质本身的共施用，以影响RNA稳定性和/或翻译效率。
在一些方面，编码IL-12的核苷酸序列包含至少一个RNA结合基序，例如但不限于RNA结合结构域(RBD)。
在一些方面，连接的核苷的第一区域和/或至少一个侧翼区包含至少一个RBD。在一些方面，连接的核苷的第一区域包含与剪接因子相关的RBD，并且至少一个侧翼区包含用于稳定性和/或翻译因子的RBD。
3'UTR中的其他调节元件
除了微小RNA结合位点之外，天然mRNA的3'UTR中的其他调节序列(其调节mRNA在不同组织和细胞中的稳定性和翻译)可以被去除或引入RNA(例如，经修饰的信使RNA)中。这样的顺式调节元件可以包括但不限于顺式RNP(核糖核蛋白)/RBP(RNA结合蛋白)调节元件、富AU元件(AUE)、结构化茎环、组成型衰变元件(CDE)、GC丰富度和其他结构化mRNA基序(Parker B J等人,Genome Research,2011,21,1929-1943，将其通过引用以其整体并入本文)。例如，CDE是一类调节基序，其通过与Roquin蛋白相互作用而介导mRNA降解。特别地，在许多mRNA中发现CDE，其编码发育和炎症的调节因子以限制巨噬细胞中细胞因子的产生(Leppek K等人,2013,Cell,153,869-881，将其通过引用以其整体并入本文)。
在一些方面，RNA(例如，经修饰的mRNA)是营养缺陷型的。如本文所用，术语“营养缺陷型”是指包含至少一个特征的mRNA，所述特征响应于空间或时间提示而触发、促进或诱导mRNA的降解或失活，从而基本上阻止或降低蛋白质表达。这种空间或时间线索包括要翻译的mRNA的位置，如特定的组织或器官或细胞环境。还考虑了涉及温度、pH、离子强度、水分含量等的提示。
3'UTR和富AU元件
已知3'UTR中嵌入了腺苷和尿苷段。这些富AU特征在高转换率的基因中特别普遍。基于它们的序列特征和功能特性，富AU元件(ARE)可以分为三类(Chen等人,1995)：I类ARE在富U的区域内含有几个分散的AUUUA基序考贝。C-Myc和MyoD含有I类ARE。II类ARE具有两个或更多个重叠的UUAUUUA(U/A)(U/A)九聚体。含有这种类型的ARE的分子包括GM-CSF和TNF-a。III类ARE的定义不太明确。这些富U区域不含有AUUUA基序。c-Jun和肌细胞生成素是这一类的两个经过充分研究的例子。已知与ARE结合的大多数蛋白质会使信使不稳定，而ELAV家族的成员(最著名的是HuR)已被证明可以增加mRNA的稳定性。HuR结合所有三个类别的ARE。将HuR特异性结合位点工程化到核酸分子的3'UTR中将导致HuR结合，从而稳定体内信使。
3'UTR富AU元件(ARE)的引入、去除或修饰可以用于调节本公开文本的核酸或mRNA的稳定性。当使特异性核酸或mRNA工程化时，可以引入ARE的一个或多个拷贝以使本公开文本的核酸或mRNA不稳定，从而减少翻译并降低所得蛋白质的产生。同样地，可以鉴定并去除或突变ARE以增加细胞内稳定性，从而增加所得蛋白质的翻译和产生。使用本公开文本的核酸或mRNA，转染实验可以在相关细胞系中进行，并且可以在转染后的多个时间点测定蛋白质的产生。例如，可以用不同的ARE工程化分子转染细胞，并通过使用ELISA试剂盒测定转染后约6小时、约12小时、约24小时、约48小时和/或约7天产生的相关蛋白和测定蛋白。
3'UTR和三螺旋
在一些方面，编码IL-12的核苷酸序列包含在经修饰的核酸、编码IL-12的增强的核苷酸序列或核糖核酸的3'端的三螺旋。在一些方面，编码IL-12的核苷酸序列的3'端包括单独的或与聚A尾组合的三螺旋。
在一些方面，编码IL-12的核苷酸序列包含至少第一和第二富U区、在第一和第二富U区之间的保守茎环区、以及富A区。在一些方面，第一和第二富U区与富A区缔合以在核酸的3'端形成三螺旋。这种三螺旋可以使核酸稳定，增强核酸的翻译效率和/或保护3'端免于降解。示例性三螺旋包括但不限于肺腺癌转移相关转录物1(MALAT1)、MEN-β和聚腺苷酸化细胞核(PAN)RNA的三螺旋序列(参见Wilusz等人,Genes&Development 2012 26:2392-2407；通过引用以其整体并入本文)。
茎环
在一些方面，编码IL-12的核苷酸序列包括茎环，例如但不限于组蛋白茎环。在一些方面，茎环是长度为约25或约26个核苷酸的核苷酸序列，例如但不限于SEQ ID NO:7-17，如国际专利公开号WO 2013103659中所述，将其通过引用以其整体并入本文。组蛋白茎环可以位于相对于编码区的3'处(例如，在编码区的3'末端处)。作为非限制性例子，茎环可以位于本文所述的核酸的3'端。
在一些方面，编码IL-12的核苷酸序列(其包含组蛋白茎环)可以通过添加至少一个链终止核苷而被稳定。不希望受理论束缚，添加至少一个链终止核苷可以减缓核酸的降解，从而可以增加核酸的半衰期。
在一些方面，链终止核苷是国际专利公开号WO 2013103659中所述的核苷，将其通过引用以其整体并入本文。在一些方面，链终止核苷是3'-脱氧腺苷(虫草素)、3'-脱氧尿苷、3'-脱氧胞嘧啶、3'-脱氧鸟苷、3'-脱氧胸腺嘧啶、2',3'-双脱氧核苷(如2',3'-双脱氧腺苷、2',3'-双脱氧尿苷、2',3'-双脱氧胞嘧啶、2',3'-双脱氧鸟苷、2',3'-双脱氧胸腺嘧啶)、2'-脱氧核苷或-O-甲基核苷。
在一些方面，编码IL-12的核苷酸序列包括组蛋白茎环、聚A尾序列和/或5'帽结构。在一些方面，组蛋白茎环在聚A尾序列之前和/或之后。包含组蛋白茎环和聚A尾序列的核酸可以包括本文所述的链终止核苷。
在一些方面，编码IL-12的核苷酸序列包含组蛋白茎环和5'帽结构。5'帽结构可以包括但不限于本文所述和/或本领域已知的那些。
5'加帽
mRNA的5'帽结构参与核输出、增加mRNA的稳定性并结合mRNA帽结合蛋白(CBP)，并且通过CBP与聚(A)结合蛋白的缔合而负责细胞中mRNA的稳定性和翻译能力，从而形成成熟的环状mRNA物质。帽在mRNA剪接过程中还帮助去除5'近端内含子。
内源性mRNA分子可以进行5'端加帽，在mRNA的末端鸟苷帽残基和5'末端转录的有义核苷酸之间生成5'-ppp-5'-三磷酸连接。然后该5'-鸟苷酸帽可以被甲基化以生成N7-甲基-鸟苷酸残基。mRNA的5'端的末端和/或先前末端转录的核苷酸的核糖也可以任选地被2'-O-甲基化。通过鸟苷酸帽结构的水解和切割进行的5'-脱帽可以靶向核酸分子(如mRNA分子)，以进行降解。
对本公开文本的RNA的修饰可以产生不可水解的帽结构，从而防止脱帽并因此增加mRNA半衰期。因为帽结构水解需要切割5'-ppp-5'磷酸二酯连接，所以在加帽反应期间可以使用经修饰的核苷酸。例如，来自New England Biolabs(马萨诸塞州伊普斯维奇市)的痘苗病毒加帽酶可以根据制造商的说明与α-硫代-鸟苷核苷酸一起使用，以在5'-ppp-5'帽中产生硫代磷酸连接。可以使用另外的经修饰的鸟苷核苷酸，如α-甲基-膦酸和硒代磷酸核苷酸。
另外的修饰包括但不限于糖环的2'-羟基上的、mRNA的5'末端和/或5'先前末端核苷酸的核糖(如上所述)的2'-O-甲基化。可以使用多个不同的5'帽结构来生成核酸分子(如mRNA分子)的5'帽。
帽类似物(本文也称为合成帽类似物、化学帽、化学帽类似物、或者结构或功能帽类似物)在其化学结构上不同于天然(即内源性、野生型或生理性)5'帽，但保留帽功能。帽类似物可以是化学(即，非酶促)或酶促合成的，并且连接至核酸分子。
例如，抗反向帽类似物(ARCA)帽含有由5'-5'-三磷酸基团连接的两个鸟嘌呤，其中一个鸟嘌呤含有N7甲基以及3'-O-甲基(即，N7,3'-O-二甲基-鸟苷-5'-三磷酸-5'-鸟苷(m7G-3'mppp-G；其可以等效地称为3'O-Me-m7G(5')ppp(5')G))。另一个未修饰的鸟嘌呤的3'-O原子与加帽的核酸分子(例如，mRNA或mmRNA)的5'末端核苷酸连接。N7-和3'-O-甲基化鸟嘌呤提供了加帽的核酸分子(例如，mRNA或mmRNA)的末端部分。
另一示例性帽是mCAP，其类似于ARCA，但在鸟苷上具有2'-β-甲基(即，N7,2'-O-二甲基-鸟苷-5'-三磷酸-5'-鸟苷，m7Gm-ppp-G)。
在一些方面，帽是二核苷酸帽类似物。在一些方面，二核苷酸帽类似物在不同的磷酸位置处被硼酸磷酸盐基团或磷酸硒酸盐基团修饰，如美国专利号8,519,110中所述的二核苷酸帽类似物，将该文献的内容通过引用以其整体并入本文。
在一些方面，帽是帽类似物，是本领域已知和/或本文所述的N7-(4-氯苯氧基乙基)取代的二核苷酸形式的帽类似物。N7-(4-氯苯氧基乙基)取代的二核苷酸形式的帽类似物的非限制性例子包括N7-(4-氯苯氧基乙基)-G(5')ppp(5')G和N7-(4-氯苯氧基乙基)-m3'-OG(5')ppp(5')G帽类似物(参见例如，Kore等人Bioorganic&MedicinalChemistry2013 21:4570-4574中所述的各种帽类似物和合成帽类似物的方法，将该文献的内容通过引用以其整体并入本文)。在一些方面，本公开文本的帽类似物是4-氯/溴苯氧基乙基类似物。
虽然帽类似物允许在体外转录反应中伴随核酸分子的加帽，但多达约20％的转录物保持未加帽。这种情况以及帽类似物与由内源性细胞转录机制产生的核酸的内源性5'帽结构的结构差异可能导致翻译能力降低和细胞稳定性降低。因此，在一些方面，本文提供的方法(参见例如实施例1-3)能够增加本文所述的所产生的表达IL-12的核苷酸的加帽效率。在一些方面，使用本文提供的方法，至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、约100％的多核苷酸被加帽。在一些方面，使用本文提供的方法，至少约50％的多核苷酸被加帽。在一些方面，至少约60％的多核苷酸被加帽。在一些方面，至少约70％的多核苷酸被加帽。在一些方面，至少约80％的多核苷酸被加帽。在一些方面，至少约85％的多核苷酸被加帽。在一些方面，至少约90％的多核苷酸被加帽。在一些方面，至少约95％的多核苷酸被加帽。在一些方面，约100％的多核苷酸被加帽。在一些方面，至少约80％至约100％的多核苷酸被加帽。
在一些方面，提供具有5'帽或5'帽类似物的RNA是通过在所述5'帽或5'帽类似物的存在下体外转录DNA模板来实现的，其中所述5'帽共转录地掺入生成的RNA链中。
在一些方面，RNA可以例如通过体外转录产生，并且5'帽可以使用加帽酶(例如，痘苗病毒的加帽酶)在转录后添加到RNA中。在一些方面，使用酶在转录后对编码IL-12的核苷酸序列进行加帽，以产生更真实的5'帽结构。如本文所用，短语“更真实的”是指在结构上或功能上紧密反映或模仿内源性或野生型特征的特征。也就是说，与现有技术的合成特征或类似物等相比，“更真实的”特征更好地代表内源性、野生型、天然或生理细胞功能和/或结构，或者其在一个或多个方面优于相应的内源性、野生型、天然或生理特征。本公开文本的更真实的5'帽结构的非限制性例子是以下这些，它们与本领域已知的合成5'帽结构相比(或与野生型、天然或生理性5'帽结构相比)，除了其他方面还具有增强的帽结合蛋白的结合、增加的半衰期、降低的对5'核酸内切酶的易感性和/或降低的5'脱帽。例如，重组痘苗病毒加帽酶和重组2'-O-甲基转移酶可以在mRNA的5'末端核苷酸和鸟嘌呤帽核苷酸之间产生典型的5'-5'-三磷酸连接，其中鸟嘌呤帽含有N7甲基化，并且mRNA的5'末端核苷酸含有2'-O-甲基。与本领域已知的例如其他5'帽类似物结构相比，该帽导致更高的翻译能力和细胞稳定性以及降低的细胞促炎细胞因子的活化。帽结构包括7mG(5')ppp(5')N,pN2p、7mG(5')ppp(5')NlmpNp、7mG(5')-ppp(5')NlmpN2 mp和m(7)Gpppm(3)(6,6,2')Apm(2')Apm(2')Cpm(2)(3,2')Up。
在一些方面，5'末端帽包括内源性帽或帽类似物。在一些方面，5'末端帽包括鸟嘌呤类似物。有用的鸟嘌呤类似物包括肌苷、N1-甲基-鸟苷、2'氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷和2-叠氮基-鸟苷。
在一些方面，5'帽包含5'至5'三磷酸连接。在一些方面，5'帽包含包括硫代磷酸酯修饰的5'至5'三磷酸连接。在一些方面，5'帽包含2'-O或3'-O-核糖-甲基化核苷酸。在一些方面，5'帽包含经修饰的鸟苷核苷酸或经修饰的腺苷核苷酸。在一些方面，5'帽包含7-甲基鸟苷酸。示例性帽结构包括m7G(5')ppp(5')G、m7,2`O-mG(5')ppSp(5')G、m7G(5')ppp(5')2`O-mG和m7,3`O-mG(5')ppp(5')2`O-mA。
在一些方面，编码IL-12的核苷酸序列包含经修饰的5'帽。5'帽上的修饰可以增加mRNA的稳定性，增加mRNA的半衰期，并可以提高mRNA的翻译效率。在一些方面，经修饰的5'帽包含以下修饰中的一种或多种：在加帽的三磷酸鸟苷(GTP)的2'和/或3'位置处的修饰，用亚甲基部分(CH2)替代糖环氧(其产生碳环)，帽结构的三磷酸桥部分的修饰，或核碱基(G)部分的修饰。
可以被修饰的5'帽结构包括但不限于美国申请号2014/0147454和WO 2018/160540中所述的帽，将这些文献通过引用以其整体并入本文。
IRES序列
在一些方面，编码IL-12的核苷酸序列包含内部核糖体进入位点(IRES)。IRES最初被鉴定为小核糖核酸病毒(Picorna virus)RNA的特征，在不存在5'帽结构的情况下，其在启动蛋白质合成中起重要作用。IRES可以充当mRNA的唯一核糖体结合位点，或可以充当mRNA的多个核糖体结合位点之一。含有多于一个功能性核糖体结合位点的核酸或mRNA可以编码由核糖体独立翻译的几种肽或多肽(“多顺反子核酸分子”)。当核酸或mRNA与IRES一起提供时，还任选地提供了第二可翻译区。可以根据本公开文本使用的IRES序列的例子包括但不限于来自以下病毒的那些：小核糖核酸病毒(例如，FMDV)、有害生物病毒(CFFV)、脊髓灰质炎病毒(PV)、脑心肌炎病毒(ECMV)、口蹄疫病毒(FMDV)、丙型肝炎病毒(HCV)、经典猪瘟病毒(CSFV)、鼠白血病病毒(MLV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)或蟋蟀麻痹病毒(CrPV)。
末端架构修饰：聚A尾
在RNA加工过程中，通常将长串的腺嘌呤核苷酸(聚A尾)添加到信使RNA(mRNA)分子中，以增加分子的稳定性。转录后，转录物的3'端被立即切割以释放3'羟基。然后聚A聚合酶将腺嘌呤核苷酸串添加到RNA上。这一过程称为聚腺苷酸化，使聚A尾的长度增加到100与250个残基之间。
在一些方面，3'尾的长度大于约30个核苷酸。在一些方面，聚A尾的长度大于约35个核苷酸。在一些方面，所述长度为至少约40个核苷酸。在一些方面，所述长度为至少约45个核苷酸。在一些方面，所述长度为至少约55个核苷酸。在一些方面，所述长度为至少约60个核苷酸。在一些方面，所述长度为至少70个核苷酸。在一些方面，所述长度为至少约80个核苷酸。在一些方面，所述长度为至少约90个核苷酸。在一些方面，所述长度为至少约100个核苷酸。在一些方面，所述长度为至少约120个核苷酸。在一些方面，所述长度为至少约140个核苷酸。在一些方面，所述长度为至少约160个核苷酸。在一些方面，所述长度为至少约180个核苷酸。在一些方面，所述长度为至少约200个核苷酸。在一些方面，所述长度为至少约250个核苷酸。在一些方面，所述长度为至少约300个核苷酸。在一些方面，所述长度为至少约350个核苷酸。在一些方面，所述长度为至少约400个核苷酸。在一些方面，所述长度为至少约450个核苷酸。在一些方面，所述长度为至少约500个核苷酸。在一些方面，所述长度为至少约600个核苷酸。在一些方面，所述长度为至少约700个核苷酸。在一些方面，所述长度为至少约800个核苷酸。在一些方面，所述长度为至少约900个核苷酸。在一些方面，所述长度为至少约1000个核苷酸。在一些方面，所述长度为至少约1100个核苷酸。在一些方面，所述长度为至少约1200个核苷酸。在一些方面，所述长度为至少约1300个核苷酸。在一些方面，所述长度为至少约1400个核苷酸。在一些方面，所述长度为至少约1500个核苷酸。在一些方面，所述长度为至少约1600个核苷酸。在一些方面，所述长度为至少约1700个核苷酸。在一些方面，所述长度为至少约1800个核苷酸。在一些方面，所述长度为至少约1900个核苷酸。在一些方面，所述长度为至少约2000个核苷酸。在一些方面，所述长度为至少约2500个核苷酸。在一些方面，所述长度为至少约3000个核苷酸。
在一些方面，编码IL-12的核苷酸序列被设计为包括聚A-G四联体。G-四联体是具有四个鸟嘌呤核苷酸的环状氢键阵列，可以由DNA和RNA中富含G的序列形成。在这一方面，将G-四联体掺入聚A尾的末端。可以测定所得核酸或mRNA的稳定性、蛋白质产生和其他参数(包括在各个时间点的半衰期)。已经发现，聚A-G四联体导致的蛋白质产生相当于仅使用120个核苷酸的聚A尾看到的蛋白质产生的至少75％。
在一些方面，编码IL-12的核苷酸序列包含聚A尾并且通过添加链终止核苷而被稳定。在一些方面，具有聚A尾的编码IL-12的核苷酸序列还包含5'帽结构。
在一些方面，编码IL-12的核苷酸序列包含聚A-G四联体。在一些方面，具有聚A-G四联体的编码IL-12的核苷酸序列还包含5'帽结构。
在一些方面，通过添加寡核苷酸来稳定编码IL-12的核苷酸序列(其包含聚A尾或聚A-G四联体)，所述寡核苷酸以3'-脱氧核苷、2',3'-双脱氧核苷、3'-0-甲基核苷、3'-0-乙基核苷、3'-阿拉伯糖苷和本领域已知和/或本文所述的其他经修饰的核苷终止。
经修饰的核苷
在一些方面，编码IL-12的核苷酸序列包含一种或多种经修饰的核苷。在一些方面，所述一种或多种经修饰的核苷包括6-氮杂-胞苷、2-硫代-胞苷、α-硫代-胞苷、假异胞苷、5-氨基烯丙基-尿苷、5-碘-尿苷、N1-甲基-假尿苷、5,6-二氢尿苷、α-硫代-尿苷、4-硫代-尿苷、6-氮杂-尿苷、5-羟基-尿苷、脱氧胸苷、假尿苷、肌苷、α-硫代-鸟苷、8-氧代-鸟苷、O6-甲基-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、N1-甲基腺苷、2-氨基-6-氯-嘌呤、N6-甲基-2-氨基-嘌呤、6-氯-嘌呤、N6-甲基-腺苷、α-硫代-腺苷、8-叠氮基-腺苷、7-脱氮-腺苷、吡咯并胞苷、5-甲基-胞苷、N4-乙酰基-胞苷、5-甲基-尿苷、5-碘-胞苷及其组合。
在一些方面，编码IL-12的核苷酸序列中的一个或多个尿苷被经修饰的核苷替代。在一些方面，替代尿苷的经修饰的核苷是假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5U)。
在一些方面，编码IL-12的核苷酸序列包括以下文献中所述的编码IL-12的核苷酸序列：美国申请号2014/0147454、国际申请WO 2018160540、国际申请WO 2015/196118或国际申请WO 2015/089511，将这些文献通过引用以其整体并入本文。
细胞毒性核苷
在一些方面，编码IL-12的核苷酸序列包含一种或多种细胞毒性核苷。例如，可以将细胞毒性核苷掺入多核苷酸(如编码IL-12的双功能核苷酸序列或mRNA)中。细胞毒性核苷抗癌剂包括但不限于腺苷阿拉伯糖苷、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、5-氟尿嘧啶、氟达拉滨、氟尿苷、(替加氟和尿嘧啶的组合)、替加氟((RS)-5-氟-1-(四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮)和6-巯基嘌呤。
许多细胞毒性核苷类似物作为抗癌剂在临床上使用，或已成为临床试验的对象。此类类似物的例子包括但不限于阿糖胞苷(cytarabine)、吉西他滨、曲沙他滨、地西他滨、替扎他滨、2'-脱氧-2'-亚甲基胞苷(DMDC)、克拉屈滨、氯法拉滨、5-氮杂胞苷、4'-硫代-阿糖胞苷(4'-thio-aracytidine)、环戊烯基胞苷和1-(2-C-氰基-2-脱氧-β-D-阿拉伯-戊呋喃糖基)-胞嘧啶。此类化合物的另一个例子是磷酸氟达拉滨。这些化合物可以全身施用，并且可以具有细胞毒性剂的典型副作用，例如但不限于相比于增殖的正常细胞，对肿瘤细胞的特异性很小或无特异性。
本领域还报道了许多细胞毒性核苷类似物的前药。例子包括但不限于N4-山嵛酰基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶、N4-十八烷基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶、N4-棕榈酰基-1-(2-C-氰基-2-脱氧-β-D-阿拉伯-戊呋喃糖基)胞嘧啶和P-4055(阿糖胞苷5'-反油酸酯)。通常，这些前药可以主要在肝脏和体循环中转化为活性药物，并且在肿瘤组织中展示很少的或不展示活性药物的选择性释放。例如，卡培他滨，即5'-脱氧-5-氟胞苷的前药(最终为5-氟尿嘧啶)，在肝脏和肿瘤组织中代谢。含有“在生理条件下易水解的自由基”的一系列卡培他滨类似物已被Fujiu等人(美国专利号4,966,891)公布，并通过引用并入本文。Fujiu所述的系列包括5'-脱氧-5-氟胞苷的N4烷基和芳烷基氨基甲酸酯，并且暗示这些化合物将在正常生理条件下通过水解而被激活以提供5'-脱氧-5-氟胞苷。
Fadl等人(Pharmazie.1995,50,382-7，通过引用以其整体并入本文)报道了一系列阿糖胞苷N4-氨基甲酸酯，其中这些化合物被设计为在肝脏和血浆中转化为阿糖胞苷。WO2004/041203(通过引用以其整体并入本文)披露了吉西他滨的前药，其中一些前药是N4-氨基甲酸酯。这些化合物旨在克服吉西他滨的胃肠道毒性，并旨在通过从胃肠道吸收完整的前药后在肝脏和血浆中水解释放来提供吉西他滨。Nomura等人(Bioorg Med.Chem.2003,11,2453-61，通过引用以其整体并入本文)描述了1-(3-C-乙炔基-β-D-核糖-戊呋喃糖基)胞嘧啶的缩醛衍生物，其在生物还原时产生需要在酸性条件下进一步水解的中间体，以产生细胞毒性核苷化合物。
可以作为化学治疗剂的细胞毒性核苷酸还包括但不限于吡唑并[3,4-d]-嘧啶、别嘌醇醇、硫唑嘌呤、卡培他滨、阿糖胞苷(cytosine arabinoside)、氟尿嘧啶、巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿昔洛韦、阿糖腺苷(ara-adenosine)、利巴韦林、7-脱氮-腺苷、7-脱氮-鸟苷、6-氮杂-尿嘧啶、6-氮杂-胞嘧啶、胸苷核糖核苷酸、5-溴脱氧尿苷、2-氯-嘌呤和肌苷或其组合。
编码序列
在本公开文本的一些方面，编码IL-12的核苷酸序列包含编码白介素(IL)-12分子的序列。在一些方面，IL-12分子包括IL-12、IL-12亚基(例如，IL-12β亚基或IL-12α亚基)或保留免疫调节功能的突变型IL-12分子。
IL-12是一种异二聚体细胞因子，对免疫系统具有多种生物效应。它由两个亚基p35(也称为α亚基)和p40(也称为β亚基)组成，这两个亚基相互作用以产生活性异二聚体(也称为“p70”)。IL-12p35亚基在本领域中也称为：IL-12α；IL-12A；自然杀伤细胞刺激因子1；细胞毒性淋巴细胞成熟因子1；p35；CLMF P35；NKSF1；CLMF；或NFSK。IL-12p40亚基在本领域中也称为：IL-12β；IL-12B；自然杀伤细胞刺激因子2；细胞毒性淋巴细胞成熟因子2；P40；CLMF P40；NKSF2；CLMF2；IMD28；或IMD29。除非另有说明，否则术语“IL-12”(或其语法变形)可以指IL-12p35亚基、IL-12p40亚基或异二聚体IL-12p70。
野生型人IL-12p35蛋白的长度为219个氨基酸。野生型人IL-12p40蛋白的长度为328个氨基酸。野生型人IL-12蛋白的氨基酸提供于更靠下的表1中。
在一些方面，IL-12蛋白(例如，由本文所述的核酸分子编码)包含与SEQ ID NO:182至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。
在一些方面，IL-12分子包含IL-12α和/或IL-12β亚基。在一些方面，IL-12α亚基包含与SEQ ID NO:183至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。
在一些方面，IL-12β亚基包含与SEQ ID NO:184至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。
如本文所述，本公开文本的核酸分子已进行密码子优化。因此，在一些方面，本文公开的编码IL-12蛋白(例如，IL-12p35亚基、IL-12p40亚基或异二聚体IL-12p70)的核苷酸序列与野生型核苷酸序列(例如，SEQ ID NO:185或SEQ ID NO:186)不同。
在一些方面，本文所述的核酸分子编码IL-12β亚基，并且包含与SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ IDNO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ IDNO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74或SEQID NO:75中任一个所示序列至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的核苷酸序列。在某些方面，所述核苷酸序列与表1中提供的任何构建体的IL-12β亚基序列至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同。
在一些方面，编码IL-12p40亚基的核酸分子包含以下核苷酸序列，所述核苷酸序列：(i)与SEQ ID NO:51所示序列至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同；(ii)与SEQ ID NO:52所示序列至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同；(iii)与SEQ ID NO:53所示序列至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同；(iv)与SEQ ID NO:54所示序列至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同；(v)与SEQ ID NO:55所示序列至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同；(vi)与SEQ ID NO:56所示序列至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同；(vii)与SEQ ID NO:57所示序列至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同；(viii)与SEQ ID NO:58所示序列至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同；(ix)与SEQ ID NO:59所示序列至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同；(x)与SEQ ID NO:65、69或74所示序列至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同；(xi)与SEQ ID NO:66、70或75所示序列至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同；(xii)与SEQ ID NO:62所示序列至少97％、至少98％、至少99％或100％相同；(xiii)与SEQ ID NO:63所示序列至少99％或100％相同；或(xiv)与SEQ ID NO:64所示序列至少98％、至少99％或100％相同。
在一些方面，编码IL-12β亚基的核酸分子包含SEQ ID NO:51所示的序列。在一些方面，编码IL-12β亚基的核酸分子包含SEQ ID NO:52所示的序列。在一些方面，编码IL-12β亚基的核酸分子包含SEQ ID NO:53所示的序列。在一些方面，编码IL-12β亚基的核酸分子包含SEQ ID NO:54所示的序列。在一些方面，编码IL-12β亚基的核酸分子包含SEQ ID NO:55所示的序列。在一些方面，编码IL-12β亚基的核酸分子包含SEQ ID NO:56所示的序列。在一些方面，编码IL-12β亚基的核酸分子包含SEQ ID NO:57所示的序列。在一些方面，编码IL-12β亚基的核酸分子包含SEQ ID NO:58所示的序列。在一些方面，编码IL-12β亚基的核酸分子包含SEQ ID NO:59所示的序列。在一些方面，编码IL-12β亚基的核酸分子包含SEQID NO:65所示的序列。在一些方面，编码IL-12β亚基的核酸分子包含SEQ ID NO:66所示的序列。在一些方面，编码IL-12β亚基的核酸分子包含SEQ ID NO:67所示的序列。在一些方面，编码IL-12β亚基的核酸分子包含SEQ ID NO:68所示的序列。在一些方面，编码IL-12β亚基的核酸分子包含SEQ ID NO:69所示的序列。在一些方面，编码IL-12β亚基的核酸分子包含SEQ ID NO:70所示的序列。在一些方面，编码IL-12β亚基的核酸分子包含SEQ ID NO:71所示的序列。在一些方面，编码IL-12β亚基的核酸分子包含SEQ ID NO:72所示的序列。在一些方面，编码IL-12β亚基的核酸分子包含SEQ ID NO:73所示的序列。在一些方面，编码IL-12β亚基的核酸分子包含SEQ ID NO:74所示的序列。在一些方面，编码IL-12β亚基的核酸分子包含SEQ ID NO:75所示的序列。在一些方面，编码IL-12β亚基的核酸分子包含SEQ IDNO:62所示的序列。在一些方面，编码IL-12β亚基的核酸分子包含SEQ ID NO:63所示的序列。在一些方面，编码IL-12β亚基的核酸分子包含SEQ ID NO:64所示的序列。在一些方面，编码IL-12β亚基的核酸分子包含SEQ ID NO:60所示的序列。在一些方面，编码IL-12β亚基的核酸分子包含SEQ ID NO:61所示的序列。
在一些方面，本文所述的核酸分子编码IL-12p35亚基，并且包含与SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:117、SEQID NO:118、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:124或SEQ ID NO:125中任一个所示序列至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的核苷酸序列。在某些方面，所述核苷酸序列与表1中提供的任何构建体的IL-12α亚基序列至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同。
在一些方面，编码IL-12p35亚基的核酸分子包含以下核苷酸序列，所述核苷酸序列：(i)与SEQ ID NO:101所示序列至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同；(ii)与SEQ ID NO:102所示序列至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同；(iii)与SEQ ID NO:103所示序列至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同；(iv)与SEQ ID NO:104所示序列至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同；(v)与SEQ ID NO:105所示序列至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同；(vi)与SEQ ID NO:106所示序列至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同；(vii)与SEQ ID NO:107所示序列至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同；(viii)与SEQ ID NO:108所示序列至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同；(ix)与SEQ ID NO:109所示序列至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同；(x)与SEQ ID NO:115、119或124所示序列至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同；(xi)与SEQ ID NO:116、120或125所示序列至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同；(xii)与SEQ ID NO:112所示序列至少98％、至少99％或100％相同；(xiii)与SEQ ID NO:113所示序列至少98％、至少99％或100％相同；或(xiv)与SEQID NO:114所示序列至少98％、至少99％或100％相同。
在一些方面，编码IL-12α亚基的核酸分子包含SEQ ID NO:101所示的序列。在一些方面，编码IL-12α亚基的核酸分子包含SEQ ID NO:102所示的序列。在一些方面，编码IL-12α亚基的核酸分子包含SEQ ID NO:103所示的序列。在一些方面，编码IL-12α亚基的核酸分子包含SEQ ID NO:104所示的序列。在一些方面，编码IL-12α亚基的核酸分子包含SEQ IDNO:105所示的序列。在一些方面，编码IL-12α亚基的核酸分子包含SEQ ID NO:106所示的序列。在一些方面，编码IL-12α亚基的核酸分子包含SEQ ID NO:107所示的序列。在一些方面，编码IL-12α亚基的核酸分子包含SEQ ID NO:108所示的序列。在一些方面，编码IL-12α亚基的核酸分子包含SEQ ID NO:109所示的序列。在一些方面，编码IL-12α亚基的核酸分子包含SEQ ID NO:115所示的序列。在一些方面，编码IL-12α亚基的核酸分子包含SEQ ID NO:116所示的序列。在一些方面，编码IL-12β亚基的核酸分子包含SEQ ID NO:117所示的序列。在一些方面，编码IL-12β亚基的核酸分子包含SEQ ID NO:118所示的序列。在一些方面，编码IL-12β亚基的核酸分子包含SEQ ID NO:119所示的序列。在一些方面，编码IL-12β亚基的核酸分子包含SEQ ID NO:120所示的序列。在一些方面，编码IL-12β亚基的核酸分子包含SEQID NO:121所示的序列。在一些方面，编码IL-12β亚基的核酸分子包含SEQ ID NO:122所示的序列。在一些方面，编码IL-12β亚基的核酸分子包含SEQ ID NO:123所示的序列。在一些方面，编码IL-12β亚基的核酸分子包含SEQ ID NO:124所示的序列。在一些方面，编码IL-12β亚基的核酸分子包含SEQ ID NO:125所示的序列。在一些方面，编码IL-12α亚基的核酸分子包含SEQ ID NO:112所示的序列。在一些方面，编码IL-12α亚基的核酸分子包含SEQ IDNO:113所示的序列。在一些方面，编码IL-12α亚基的核酸分子包含SEQ ID NO:114所示的序列。在一些方面，编码IL-12β亚基的核酸分子包含SEQ ID NO:110所示的序列。在一些方面，编码IL-12β亚基的核酸分子包含SEQ ID NO:111所示的序列。
在一些方面，编码IL-12p40亚基的核酸分子和编码IL-12p35亚基的核酸分子可以彼此缀合。例如，在一些方面，本公开文本提供了包含第一核酸和第二核酸的分离的多核苷酸，其中所述第一核酸编码IL-12p40亚基并且所述第二核酸编码IL-12p35亚基。在一些方面，所述IL-12α亚基和所述IL-12β亚基通过接头连接。在一些方面，所述接头包括至少约2、至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9、至少约10、至少约11、至少约12、至少约13、至少约14、至少约15、至少约16、至少约17、至少约18、至少约19或至少约20个氨基酸的氨基酸接头。在一些方面，所述接头包括(GS)接头。在一些方面中，所述GS接头具有式(Gly3Ser)n或S(Gly3Ser)n，其中n是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80或100的正整数。在一些方面，所述(Gly3Ser)n接头是(Gly3Ser)3或(Gly3Ser)4。
在一些方面，编码IL-12β亚基的第一核酸分子包含与SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ IDNO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ IDNO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ IDNO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74或SEQ ID NO:75所示序列至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的核苷酸序列；并且编码IL-12α亚基的第二核酸分子包含与SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119、SEQID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:124或SEQ ID NO:125所示序列至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的核苷酸序列。
在一些方面，编码IL-12β亚基的第一核酸分子包含与表1中提供的任何构建体的IL-12β亚基序列至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的核苷酸序列；并且编码IL-12α亚基的第二核酸分子包含与表1中提供的任何构建体的IL-12α亚基序列至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的核苷酸序列。
在一些方面中，(i)所述第一核酸分子包含与SEQ ID NO:51所示序列至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％相同的核苷酸序列，和/或所述第二核酸分子包含与SEQ ID NO:101所示序列至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％相同的核苷酸序列；(ii)所述第一核酸分子包含与SEQ ID NO:52所示序列至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列，和/或所述第二核酸分子包含与SEQ ID NO:102所示序列至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列；(iii)所述第一核酸分子包含与SEQ IDNO:53所示序列至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列，和/或所述第二核酸分子包含与SEQ ID NO:103所示序列至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列；(iv)所述第一核酸分子包含与SEQ ID NO:54所示序列至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列，和/或所述第二核酸分子包含与SEQ ID NO:104所示序列至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列；(v)所述第一核酸分子包含与SEQ ID NO:55所示序列至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列，和/或所述第二核酸分子包含与SEQ ID NO:105所示序列至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列；(vi)所述第一核酸分子包含与SEQ ID NO:56所示序列至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列，和/或所述第二核酸分子包含与SEQ ID NO:106所示序列至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列；(vii)所述第一核酸分子包含与SEQ ID NO:57所示序列至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列，和/或所述第二核酸分子包含与SEQ ID NO:107所示序列至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列；(viii)所述第一核酸分子包含与SEQ ID NO:58所示序列至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列，和/或所述第二核酸分子包含与SEQ ID NO:108所示序列至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列；(ix)所述第一核酸分子包含与SEQ ID NO:59所示序列至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列，和/或所述第二核酸分子包含与SEQ ID NO:109所示序列至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列；(x)所述第一核酸分子包含与SEQ ID NO:65、69或74所示序列至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列，和/或所述第二核酸分子包含与SEQ ID NO:115、119或124所示序列至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列；(xi)所述第一核酸分子包含与SEQ ID NO:66、70或75所示序列至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列，和/或所述第二核酸分子包含与SEQ ID NO:116、120或125所示序列至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列；(xii)所述第一核酸分子包含与SEQ ID NO:62所示序列至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列，和/或所述第二核酸分子包含与SEQ ID NO:112所示序列至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列；(xiii)所述第一核酸分子包含与SEQ ID NO:63所示序列至少99％或100％相同的核苷酸序列，和/或所述第二核酸分子包含与SEQ ID NO:113所示序列至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列；或(xiv)所述第一核酸分子包含与SEQ ID NO:65所示序列至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列，和/或所述第二核酸分子包含与SEQ ID NO:115所示序列至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
在一些方面，所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:51所示的序列，并且所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:101所示的序列。在一些方面，所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:52所示的序列，并且所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:102所示的序列。在一些方面，在一些方面，所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:53所示的序列，并且所述第二核酸分子包含SEQID NO:103所示的序列。在一些方面，在一些方面，所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:54所示的序列，并且所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:104所示的序列。在一些方面，所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:55所示的序列，并且所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:105所示的序列。在一些方面，所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:56所示的序列，并且所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:106所示的序列。在一些方面，所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:57所示的序列，并且所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:107所示的序列。在一些方面，所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:58所示的序列，并且所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:118所示的序列。在一些方面，所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:59所示的序列，并且所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:119所示的序列。在一些方面，所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:65所示的序列，并且所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:115所示的序列。在一些方面，所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:66所示的序列，并且所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:116所示的序列。在一些方面，所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:67所示的序列，并且所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:117所示的序列。在一些方面，所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:68所示的序列，并且所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:118所示的序列。在一些方面，所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:69所示的序列，并且所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:119所示的序列。在一些方面，所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:70所示的序列，并且所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:120所示的序列。在一些方面，所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:71所示的序列，并且所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:121所示的序列。在一些方面，所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:72所示的序列，并且所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:122所示的序列。在一些方面，所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:73所示的序列，并且所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:123所示的序列。在一些方面，所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:74所示的序列，并且所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:124所示的序列。在一些方面，所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:75所示的序列，并且所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:125所示的序列。在一些方面，所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:62所示的序列，并且所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:112所示的序列。在一些方面，所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:63所示的序列，并且所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:113所示的序列。在一些方面，所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:64所示的序列，并且所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:114所示的序列。在一些方面，所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:60所示的序列，并且所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:110所示的序列。在一些方面，所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:61所示的序列，并且所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:111所示的序列。在一些方面，所述第一核酸分子包含表1中提供的任何构建体的IL-12β亚基序列，并且所述第二核酸分子包含表1中提供的任何构建体的IL-12α亚基序列。
表1
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在一些方面，本文所述的分离的多核苷酸(即，包含编码IL-12(例如，IL-12α亚基和/或IL-12β亚基)的核酸分子)包含一个或多个异源部分(例如，实验性和/或治疗性目的基因)。如本文所用，术语“异源部分”是指不同于由本文公开的核酸分子编码的IL-12蛋白(例如，IL-12α亚基和/或IL-12β亚基)的任何分子(化学上或生物学上)。此类异源部分可以与IL-12蛋白基因融合、缀合和/或以其他方式缔合。例如，在一些方面，异源部分可以与IL-12α亚基的3'端融合。在一些方面，异源部分可以经由接头(例如，GS接头)与IL-12α亚基的3'端缀合。在一些方面，异源部分可以与IL-12β亚基的3'端融合。在一些方面，异源部分可以经由接头(例如，GS接头)与IL-12β亚基的3'端缀合。
在一些方面，异源部分包含半衰期延长部分。术语“半衰期延长部分”是指与本公开文本的核酸分子编码的IL-12蛋白(例如，IL-12α亚基和/或IL-12β亚基)共价连接(“缀合”或“融合”)(任选地经由非天然编码的氨基酸、直接或经由接头)的药学上可接受的部分、结构域或分子，其与参考化合物(如IL-12蛋白的非缀合或非融合形式)相比，防止或减小IL-12蛋白的体内蛋白水解降解或其他降低活性的化学修饰，增加半衰期，和/或改善或改变其他药代动力学或生物物理特性(包括但不限于增加吸收速率、降低毒性、提高溶解度、减少蛋白质聚集、增加IL-12蛋白的生物活性和/或靶标选择性、增加可制造性和/或降低IL-12蛋白的免疫原性)。
在本公开文本的上下文中，术语“融合的”或“融合”表示至少两条多肽链(例如，由本文所述的核酸分子编码)已被可操作地连接并重组表达。在一些方面，由于化学合成，两条多肽链可以是“融合的”。在本公开文本的上下文中，术语“缀合物”或“缀合”表示两个分子实体(例如，两种多肽，或多肽和聚合物(如PEG))已经被化学连接。
在一些方面，所述半衰期延长部分包括Fc区、白蛋白、白蛋白结合多肽、脂肪酸、Pro/Ala/Ser(PAS)、富含甘氨酸的同源氨基酸聚合物(HAP)、人绒毛膜促性腺激素的C末端肽(CTP)的β亚基、聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、氨基酸的长非结构化亲水序列(XTEN)、白蛋白结合小分子或其组合。参见例如，WO 2013/041730A1，将其通过引用以其整体并入本文。在某些方面，所述半衰期延长部分是白蛋白(例如，人血清白蛋白)。
在一些方面，异源部分包含光蛋白聚糖。光蛋白聚糖与胶原蛋白结合，胶原蛋白在肿瘤中大量且广泛地表达。在某些方面，使光蛋白聚糖与IL-12蛋白(例如，IL-12α亚基和/或IL-12β亚基)缀合可以改善IL-12蛋白对肿瘤的靶向(例如，通过防止和/或减少IL-12蛋白进入体循环)，从而降低IL-12蛋白的毒性。在本公开文本的其他地方提供了与可使用的光蛋白聚糖(例如，序列)有关的另外的公开内容。
在一些方面，所述异源部分编码细胞因子、趋化因子或除IL-12以外的生长因子。细胞因子是本领域已知的，并且该术语本身是指由免疫系统内的某些细胞分泌并对其他细胞有作用的小蛋白质的广义分组。已知细胞因子可增强细胞免疫应答，并且如本文所用，可以包括但不限于TNFα、IFN-γ、IFN-α、TGFβ、IL-1、IL-2、Il-4、IL-10、IL-13、IL-17、IL-18和趋化因子。趋化因子可用于研究对感染、免疫应答、炎症、创伤、败血症、癌症和生殖等应用的反应。趋化因子是本领域已知的，并且是一种细胞因子，其在附近的应答细胞(典型地是白细胞)中诱导趋化性至感染部位。趋化因子的非限制性例子包括CCL14、CCL19、CCL20、CCL21、CCL25、CCL27、CXCL12、CXCL13、CXCL-8、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL11和CXCL10。生长因子是本领域已知的，并且该术语本身有时可与术语细胞因子互换。如本文所用，术语“生长因子”是指能够在细胞之间发出信号并刺激细胞生长的天然存在的物质。虽然细胞因子可以是生长因子，但某些类型的细胞因子也可以对细胞生长具有抑制作用，从而区分这两个术语。生长因子的非限制性例子包括肾上腺髓质素(AM)、血管生成素(Ang)、自分泌运动因子、骨形态发生蛋白(BMP)、睫状神经营养因子(CNTF)、白血病抑制因子(LIF)、白介素-6(IL-6)、巨噬细胞集落刺激因子(m-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、表皮生长因子(EFG)、肝配蛋白A1、肝配蛋白A2、肝配蛋白A3、肝配蛋白A4、肝配蛋白A5、肝配蛋白B1、肝配蛋白B2、肝配蛋白B3、促红细胞生成素(EPO)、成纤维细胞生长因子-1(FGF1)、成纤维细胞生长因子2(FGF2)、成纤维细胞生长因子3(FGF3)、成纤维细胞生长因子4(FGF4)、成纤维细胞生长因子5(FGF5)、成纤维细胞生长因子6(FGF6)、成纤维细胞生长因子7(FGF7)、成纤维细胞生长因子8(FGF8)、成纤维细胞生长因子9(FGF9)、成纤维细胞生长因子10(FGF10)、成纤维细胞生长因子11(FGF11)、成纤维细胞生长因子12(FGF12)、成纤维细胞生长因子13(FGF13)、成纤维细胞生长因子14(FGF14)、成纤维细胞生长因子15(FGF15)、成纤维细胞生长因子16(FGF16)、成纤维细胞生长因子17(FGF17)、成纤维细胞生长因子18(FGF18)、成纤维细胞生长因子19(FGF19)、成纤维细胞生长因子20(FGF20)、成纤维细胞生长因子21(FGF21)、成纤维细胞生长因子22(FGF22)、成纤维细胞生长因子23(FGF23)、胎牛生长激素(FBS)、胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、神经秩蛋白(Neurturin)、Peresphin、神经鞘胚素(Artemin)、生长分化因子-9(GDF9)、肝细胞生长因子(HGF)、肝癌源性生长因子(HDGF)、胰岛素、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、胰岛素样生长因子-2(IGF-2)、白介素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、角质细胞生长因子(KGF)、迁移刺激因子(MSF)、巨噬细胞刺激蛋白(MSP)、肌肉生长抑制素(GDF-8)、神经调节蛋白1(NRG1)、神经调节蛋白2(NRG2)、神经调节蛋白3(NRG3)、神经调节蛋白4(NRG4)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)、神经营养蛋白-3(NT-3)、神经营养蛋白-4(NT-4)、胎盘生长因子(TCGF)、血小板生成素(TPO)、转化生长因子α(TGF-α)、转化生长因子β(TGF-β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和血管内皮生长因子(VEGF)。
在一些方面，本公开文本的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)还包含编码前导序列的核酸分子。如本文所用，术语“前导序列”是指位于蛋白质前体形式的氨基末端的序列。在成熟过程中，前导序列被切除。在某些方面，前导序列包含信号肽。术语“信号肽”是指确保蛋白质进入分泌途径的前导序列。对前导序列的另外的描述提供于例如US2007/0141666A1中，将其通过引用以其整体并入本文。在一些方面，可以与本公开文本一起使用的前导序列包含氨基酸序列MRVPAQLLGLLLLWLPGARCA(SEQ ID NO:180)。在一些方面，编码这种前导序列的核酸分子包含SEQ ID NO:26至50中任一个所示的序列。在一些方面，编码前导序列的核酸分子包含编码表1中提供的任何构建体的前导序列的序列。
由以上公开内容显而易见的是，在一些方面，本公开文本的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)包含多个核酸分子。例如，在某些方面，多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)包含(从5'到3')：(i)编码前导序列的第一核酸分子；(ii)编码IL-12β亚基的第二核酸分子；(iii)编码接头(例如，GS接头)的第三核酸分子；以及(iv)编码IL-12α亚基的第四核酸分子。如本文所述，在一些方面，这种多核蛋白还包含本文所述的一个或多个另外的特征。例如，在一些方面，本文所述的多核苷酸包含(从5'到3')：(1)5'帽，(2)编码前导序列的第一核苷酸序列，(3)编码IL-12β亚基的第二核苷酸序列，(4)编码接头(例如，GS接头)的第三核苷酸序列，(5)编码IL-12α亚基的第四核苷酸序列，以及(6)聚(A)尾。在一些方面，本文所述的多核苷酸包含(从5'到3')：(1)5'帽，(2)5'UTR，(3)启动子，(4)编码前导序列的第一核苷酸序列，(5)编码IL-12β亚基的第二核苷酸序列，(6)编码接头(例如，GS接头)的第三核苷酸序列，(7)编码IL-12α亚基的第四核苷酸序列，(8)3'UTR，以及(9)聚(A)尾。示例性构建体的另外的描述提供于以下。
在一些方面，(i)所述第一核酸分子(即，编码前导序列)包含SEQ ID NO:40所示的序列；(ii)所述第二核酸分子(即，编码IL-12β亚基)包含SEQ ID NO:65所示的序列；(iii)所述第三核酸分子(即，编码接头)包含SEQ ID NO:90所示的序列；并且(iv)所述第四核酸分子(即，编码IL-12α亚基)包含SEQ ID NO:115所示的序列。因此，在某些方面，本文所述的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)包含SEQ ID NO:15所示的序列。在一些方面，所述多核苷酸包含本文所述的一个或多个另外的特征。例如，在一些方面，本文提供的多核苷酸包含(从5'到3')：(1)5'帽(或帽类似物)，(2)包含SEQ ID NO:40所示序列的第一核苷酸序列(即，编码前导序列)，(3)包含SEQ ID NO:65所示序列的第二核苷酸序列(即，编码IL-12β亚基)，(4)包含SEQ ID NO:90所示序列的第三核苷酸序列(即，编码GS接头)，(5)包含SEQ IDNO:115所示序列的第四核苷酸序列(即，编码IL-12α亚基)，以及(6)聚(A)尾。这种多核苷酸的例子在本文中被描述为“A1构建体”。
在一些方面，(i)所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:41所示的序列；(ii)所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:66所示的序列；(iii)所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:91所示的序列；并且(iv)所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:116所示的序列。因此，在某些方面，本文所述的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)包含SEQ ID NO:16所示的序列。在一些方面，所述多核苷酸包含本文所述的一个或多个另外的特征。例如，在一些方面，本文提供的多核苷酸包含(从5'到3')：(1)5'帽(或帽类似物)，(2)包含SEQ ID NO:41所示序列的第一核苷酸序列(即，编码前导序列)，(3)包含SEQ ID NO:66所示序列的第二核苷酸序列(即，编码IL-12β亚基)，(4)包含SEQ ID NO:91所示序列的第三核苷酸序列(即，编码GS接头)，(5)包含SEQ ID NO:116所示序列的第四核苷酸序列(即，编码IL-12α亚基)，以及(6)聚(A)尾。这种多核苷酸的例子在本文中被描述为“A2构建体”。
在一些方面，(i)所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:42所示的序列；(ii)所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:67所示的序列；(iii)所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:92所示的序列；并且(iv)所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:117所示的序列。因此，在某些方面，本文所述的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)包含SEQ ID NO:17所示的序列。在一些方面，所述多核苷酸包含本文所述的一个或多个另外的特征。例如，在一些方面，本文提供的多核苷酸包含(从5'到3')：(1)5'帽(或帽类似物)，(2)包含SEQ ID NO:42所示序列的第一核苷酸序列(即，编码前导序列)，(3)包含SEQ ID NO:67所示序列的第二核苷酸序列(即，编码IL-12β亚基)，(4)包含SEQ ID NO:92所示序列的第三核苷酸序列(即，编码GS接头)，(5)包含SEQ ID NO:117所示序列的第四核苷酸序列(即，编码IL-12α亚基)，以及(6)poly(A)尾。这种多核苷酸的例子在本文中被描述为“A3构建体”。
在一些方面，(i)所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:43所示的序列；(ii)所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:68所示的序列；(iii)所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:93所示的序列；并且(iv)所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:118所示的序列。因此，在某些方面，本文所述的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)包含SEQ ID NO:18所示的序列。在一些方面，所述多核苷酸包含本文所述的一个或多个另外的特征。例如，在一些方面，本文提供的多核苷酸包含(从5'到3')：(1)5'帽(或帽类似物)，(2)包含SEQ ID NO:43所示序列的第一核苷酸序列(即，编码前导序列)，(3)包含SEQ ID NO:68所示序列的第二核苷酸序列(即，编码IL-12β亚基)，(4)包含SEQ ID NO:93所示序列的第三核苷酸序列(即，编码GS接头)，(5)包含SEQ ID NO:118所示序列的第四核苷酸序列(即，编码IL-12α亚基)，以及(6)poly(A)尾。这种多核苷酸的例子在本文中被描述为“A4构建体”。
在一些方面，本文所述的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)包含(从5'到3')：(i)编码前导序列的第一核酸分子；(ii)编码IL-12β亚基的第二核酸分子；(iii)编码第一接头(例如，第一GS接头)的第三核酸分子；(iv)编码IL-12α亚基的第四核酸分子；(v)编码第二接头(例如，第二GS接头)的第五核酸分子；以及(vi)编码半衰期延长部分(例如，人血清白蛋白)的第六核酸分子。如本文所述，在一些方面，这种多核苷酸还包含本文所述的一个或多个另外的特征。例如，在一些方面，本文所述的多核苷酸包含(从5'到3')：(1)5'帽，(2)编码前导序列的第一核苷酸序列，(3)编码IL-12β亚基的第二核苷酸序列，(4)编码第一接头(例如，GS接头)的第三核苷酸序列，(5)编码IL-12α亚基的第四核苷酸序列，(6)编码第二接头(例如，GS接头)的第五核苷酸序列，(7)编码半衰期延长部分(例如，人血清白蛋白)的第六核苷酸序列，以及(8)聚(A)尾。在一些方面，本文所述的多核苷酸包含(从5'到3')：(1)5'帽，(2)5'UTR，(3)启动子，(4)编码前导序列的第一核苷酸序列，(5)编码IL-12β亚基的第二核苷酸序列，(6)编码第一接头(例如，GS接头)的第三核苷酸序列，(7)编码IL-12α亚基的第四核苷酸序列，(8)编码第二接头(例如，GS接头)的第五核苷酸序列，(9)编码异源部分(例如，白蛋白)的第六核苷酸序列，(10)3'UTR，以及(11)聚(A)尾。这样的示例性构建体的另外的描述提供于以下。
在一些方面，(i)所述第一核酸分子(即，编码前导序列)包含SEQ ID NO:26所示的序列；(ii)所述第二核酸分子(即，编码IL-12β亚基)包含SEQ ID NO:51所示的序列；(iii)所述第三核酸分子(即，编码第一接头)包含SEQ ID NO:76所示的序列；(iv)所述第四核酸分子(即，编码IL-12α亚基)包含SEQ ID NO:101所示的序列；(v)所述第五核酸分子(即，编码第二接头)包含SEQ ID NO:126所示的序列；并且(vi)所述第六核酸分子(即，编码半衰期延长部分)包含SEQ ID NO:147所示的序列。因此，在某些方面，本文所述的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)包含SEQ ID NO:1所示的序列。在一些方面，所述多核苷酸包含本文所述的一个或多个另外的特征。例如，在一些方面，本文提供的多核苷酸包含(从5'到3')：(1)5'帽(或帽类似物)，(2)包含SEQ ID NO:26所示序列的第一核苷酸序列(即，编码前导序列)，(3)包含SEQ ID NO:51所示序列的第二核苷酸序列(即，编码IL-12β亚基)，(4)包含SEQ IDNO:76所示序列的第三核苷酸序列(即，编码第一GS接头)，(5)包含SEQ ID NO:101所示序列的第四核苷酸序列(即，编码IL-12α亚基)，(6)包含SEQ ID NO:126所示序列的第五核苷酸序列(即，编码第二GS接头)，(7)包含SEQ ID NO:147所示序列的第六核苷酸序列(即，编码人血清白蛋白)，以及(8)聚(A)尾。这种多核苷酸的例子在本文中被描述为“L1构建体”。
在一些方面，(i)所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:27所示的序列；(ii)所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:52所示的序列；(iii)所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:77所示的序列；(iv)所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:102所示的序列；(v)所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:127所示的序列；并且(vi)所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:148所示的序列。因此，在某些方面，本文所述的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)包含SEQ ID NO:2所示的序列。在一些方面，所述多核苷酸包含本文所述的一个或多个另外的特征。例如，在一些方面，本文提供的多核苷酸包含(从5'到3')：(1)5'帽(或帽类似物)，(2)包含SEQ ID NO:27所示序列的第一核苷酸序列(即，编码前导序列)，(3)包含SEQ ID NO:52所示序列的第二核苷酸序列(即，编码IL-12β亚基)，(4)包含SEQ ID NO:77所示序列的第三核苷酸序列(即，编码GS接头)，(5)包含SEQ ID NO:102所示序列的第四核苷酸序列(即，编码IL-12α亚基)，(6)包含SEQ ID NO:127所示序列的第五核苷酸序列(即，编码第二GS接头)，(7)包含SEQ IDNO:148所示序列的第六核苷酸序列(即，编码人血清白蛋白)，以及(8)聚(A)尾。这种多核苷酸的例子在本文中被描述为“L2构建体”。
在一些方面，(i)所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:28所示的序列；(ii)所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:53所示的序列；(iii)所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:78所示的序列；(iv)所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:103所示的序列；(v)所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:128所示的序列；并且(vi)所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:149所示的序列。因此，在某些方面，本文所述的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)包含SEQ ID NO:3所示的序列。在一些方面，所述多核苷酸包含本文所述的一个或多个另外的特征。例如，在一些方面，本文提供的多核苷酸包含(从5'到3')：(1)5'帽(或帽类似物)，(2)包含SEQ ID NO:28所示序列的第一核苷酸序列(即，编码前导序列)，(3)包含SEQ ID NO:53所示序列的第二核苷酸序列(即，编码IL-12β亚基)，(4)包含SEQ ID NO:78所示序列的第三核苷酸序列(即，编码GS接头)，(5)包含SEQ ID NO:103所示序列的第四核苷酸序列(即，编码IL-12α亚基)，(6)包含SEQ ID NO:128所示序列的第五核苷酸序列(即，编码第二GS接头)，(7)包含SEQ IDNO:149所示序列的第六核苷酸序列(即，编码人血清白蛋白)，以及(8)poly(A)尾。这种多核苷酸的例子在本文中被描述为“L3构建体”。
在一些方面，(i)所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:29所示的序列；(ii)所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:54所示的序列；(iii)所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:79所示的序列；(iv)所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:104所示的序列；(v)所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:129所示的序列；并且(vi)所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:150所示的序列。因此，在某些方面，本文所述的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)包含SEQ ID NO:4所示的序列。在一些方面，所述多核苷酸包含本文所述的一个或多个另外的特征。例如，在一些方面，本文提供的多核苷酸包含(从5'到3')：(1)5'帽(或帽类似物)，(2)包含SEQ ID NO:29所示序列的第一核苷酸序列(即，编码前导序列)，(3)包含SEQ ID NO:54所示序列的第二核苷酸序列(即，编码IL-12β亚基)，(4)包含SEQ ID NO:79所示序列的第三核苷酸序列(即，编码GS接头)，(5)包含SEQ ID NO:104所示序列的第四核苷酸序列(即，编码IL-12α亚基)，(6)包含SEQ ID NO:129所示序列的第五核苷酸序列(即，编码第二GS接头)，(7)包含SEQ IDNO:150所示序列的第六核苷酸序列(即，编码人血清白蛋白)，以及(8)poly(A)尾。这种多核苷酸的例子在本文中被描述为“M1构建体”。
在一些方面，(i)所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:30所示的序列；(ii)所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:55所示的序列；(iii)所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:80所示的序列；(iv)所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:105所示的序列；(v)所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:130所示的序列；并且(vi)所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:151所示的序列。因此，在某些方面，本文所述的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)包含SEQ ID NO:5所示的序列。在一些方面，所述多核苷酸包含本文所述的一个或多个另外的特征。例如，在一些方面，本文提供的多核苷酸包含(从5'到3')：(1)5'帽(或帽类似物)，(2)包含SEQ ID NO:30所示序列的第一核苷酸序列(即，编码前导序列)，(3)包含SEQ ID NO:55所示序列的第二核苷酸序列(即，编码IL-12β亚基)，(4)包含SEQ ID NO:80所示序列的第三核苷酸序列(即，编码GS接头)，(5)包含SEQ ID NO:105所示序列的第四核苷酸序列(即，编码IL-12α亚基)，(6)包含SEQ ID NO:130所示序列的第五核苷酸序列(即，编码第二GS接头)，(7)包含SEQ IDNO:151所示序列的第六核苷酸序列(即，编码人血清白蛋白)，以及(8)聚(A)尾。这种多核苷酸的例子在本文中被描述为“M2构建体”。
在一些方面，(i)所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:31所示的序列；(ii)所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:56所示的序列；(iii)所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:81所示的序列；(iv)所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:106所示的序列；(v)所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:131所示的序列；并且(vi)所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:152所示的序列。因此，在某些方面，本文所述的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)包含SEQ ID NO:6所示的序列。在一些方面，所述多核苷酸包含本文所述的一个或多个另外的特征。例如，在一些方面，本文提供的多核苷酸包含(从5'到3')：(1)5'帽(或帽类似物)，(2)包含SEQ ID NO:31所示序列的第一核苷酸序列(即，编码前导序列)，(3)包含SEQ ID NO:56所示序列的第二核苷酸序列(即，编码IL-12β亚基)，(4)包含SEQ ID NO:81所示序列的第三核苷酸序列(即，编码GS接头)，(5)包含SEQ ID NO:106所示序列的第四核苷酸序列(即，编码IL-12α亚基)，(6)包含SEQ ID NO:131所示序列的第五核苷酸序列(即，编码第二GS接头)，(7)包含SEQ IDNO:152所示序列的第六核苷酸序列(即，编码人血清白蛋白)，以及(8)聚(A)尾。这种多核苷酸的例子在本文中被描述为“M3构建体”。
在一些方面，(i)所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:32所示的序列；(ii)所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:57所示的序列；(iii)所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:82所示的序列；(iv)所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:107所示的序列；(v)所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:132所示的序列；并且(vi)所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:153所示的序列。因此，在某些方面，本文所述的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)包含SEQ ID NO:7所示的序列。在一些方面，所述多核苷酸包含本文所述的一个或多个另外的特征。例如，在一些方面，本文提供的多核苷酸包含(从5'到3')：(1)5'帽(或帽类似物)，(2)包含SEQ ID NO:32所示序列的第一核苷酸序列(即，编码前导序列)，(3)包含SEQ ID NO:57所示序列的第二核苷酸序列(即，编码IL-12β亚基)，(4)包含SEQ ID NO:82所示序列的第三核苷酸序列(即，编码GS接头)，(5)包含SEQ ID NO:107所示序列的第四核苷酸序列(即，编码IL-12α亚基)，(6)包含SEQ ID NO:132所示序列的第五核苷酸序列(即，编码第二GS接头)，(7)包含SEQ IDNO:153所示序列的第六核苷酸序列(即，编码人血清白蛋白)，以及(8)聚(A)尾。这种多核苷酸的例子在本文中被描述为“H1构建体”。
在一些方面，(i)所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:33所示的序列；(ii)所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:58所示的序列；(iii)所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:83所示的序列；(iv)所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:108所示的序列；(v)所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:133所示的序列；并且(vi)所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:154所示的序列。因此，在某些方面，本文所述的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)包含SEQ ID NO:8所示的序列。在一些方面，所述多核苷酸包含本文所述的一个或多个另外的特征。例如，在一些方面，本文提供的多核苷酸包含(从5'到3')：(1)5'帽(或帽类似物)，(2)包含SEQ ID NO:33所示序列的第一核苷酸序列(即，编码前导序列)，(3)包含SEQ ID NO:58所示序列的第二核苷酸序列(即，编码IL-12β亚基)，(4)包含SEQ ID NO:83所示序列的第三核苷酸序列(即，编码GS接头)，(5)包含SEQ ID NO:108所示序列的第四核苷酸序列(即，编码IL-12α亚基)，(6)包含SEQ ID NO:133所示序列的第五核苷酸序列(即，编码第二GS接头)，(7)包含SEQ IDNO:154所示序列的第六核苷酸序列(即，编码人血清白蛋白)，以及(8)聚(A)尾。这种多核苷酸的例子在本文中被描述为“H2构建体”。
在一些方面，(i)所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:34所示的序列；(ii)所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:59所示的序列；(iii)所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:84所示的序列；(iv)所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:109所示的序列；(v)所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:134所示的序列；并且(vi)所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:155所示的序列。因此，在某些方面，本文所述的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)包含SEQ ID NO:9所示的序列。在一些方面，所述多核苷酸包含本文所述的一个或多个另外的特征。例如，在一些方面，本文提供的多核苷酸包含(从5'到3')：(1)5'帽(或帽类似物)，(2)包含SEQ ID NO:34所示序列的第一核苷酸序列(即，编码前导序列)，(3)包含SEQ ID NO:59所示序列的第二核苷酸序列(即，编码IL-12β亚基)，(4)包含SEQ ID NO:84所示序列的第三核苷酸序列(即，编码GS接头)，(5)包含SEQ ID NO:109所示序列的第四核苷酸序列(即，编码IL-12α亚基)，(6)包含SEQ ID NO:134所示序列的第五核苷酸序列(即，编码第二GS接头)，(7)包含SEQ IDNO:155所示序列的第六核苷酸序列(即，编码人血清白蛋白)，以及(8)聚(A)尾。这种多核苷酸的例子在本文中被描述为“H3构建体”。
在一些方面，(i)所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:37所示的序列；(ii)所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:62所示的序列；(iii)所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:87所示的序列；(iv)所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:112所示的序列；(v)所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:137所示的序列；并且(vi)所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:158所示的序列。因此，在某些方面，本文所述的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)包含SEQ ID NO:12所示的序列。在一些方面，所述多核苷酸包含本文所述的一个或多个另外的特征。例如，在一些方面，本文提供的多核苷酸包含(从5'到3')：(1)5'帽(或帽类似物)，(2)包含SEQ ID NO:37所示序列的第一核苷酸序列(即，编码前导序列)，(3)包含SEQ ID NO:62所示序列的第二核苷酸序列(即，编码IL-12β亚基)，(4)包含SEQ ID NO:87所示序列的第三核苷酸序列(即，编码GS接头)，(5)包含SEQ ID NO:112所示序列的第四核苷酸序列(即，编码IL-12α亚基)，(6)包含SEQ ID NO:137所示序列的第五核苷酸序列(即，编码第二GS接头)，(7)包含SEQ IDNO:158所示序列的第六核苷酸序列(即，编码人血清白蛋白)，以及(8)聚(A)尾。这种多核苷酸的例子在本文中被描述为“vH1构建体”。
在一些方面，(i)所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:38所示的序列；(ii)所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:63所示的序列；(iii)所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:88所示的序列；(iv)所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:113所示的序列；(v)所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:138所示的序列；并且(vi)所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:159所示的序列。因此，在某些方面，本文所述的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)包含SEQ ID NO:13所示的序列。在一些方面，所述多核苷酸包含本文所述的一个或多个另外的特征。例如，在一些方面，本文提供的多核苷酸包含(从5'到3')：(1)5'帽(或帽类似物)，(2)包含SEQ ID NO:38所示序列的第一核苷酸序列(即，编码前导序列)，(3)包含SEQ ID NO:63所示序列的第二核苷酸序列(即，编码IL-12β亚基)，(4)包含SEQ ID NO:88所示序列的第三核苷酸序列(即，编码GS接头)，(5)包含SEQ ID NO:113所示序列的第四核苷酸序列(即，编码IL-12α亚基)，(6)包含SEQ ID NO:138所示序列的第五核苷酸序列(即，编码第二GS接头)，(7)包含SEQ IDNO:159所示序列的第六核苷酸序列(即，编码人血清白蛋白)，以及(8)聚(A)尾。这种多核苷酸的例子在本文中被描述为“vH2构建体”。
在一些方面，(i)所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:39所示的序列；(ii)所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:64所示的序列；(iii)所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:89所示的序列；(iv)所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:114所示的序列；(v)所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:139所示的序列；并且(vi)所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:160所示的序列。因此，在某些方面，本文所述的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)包含SEQ ID NO:14所示的序列。在一些方面，所述多核苷酸包含本文所述的一个或多个另外的特征。例如，在一些方面，本文提供的多核苷酸包含(从5'到3')：(1)5'帽(或帽类似物)，(2)包含SEQ ID NO:39所示序列的第一核苷酸序列(即，编码前导序列)，(3)包含SEQ ID NO:64所示序列的第二核苷酸序列(即，编码IL-12β亚基)，(4)包含SEQ ID NO:89所示序列的第三核苷酸序列(即，编码GS接头)，(5)包含SEQ ID NO:114所示序列的第四核苷酸序列(即，编码IL-12α亚基)，(6)包含SEQ ID NO:139所示序列的第五核苷酸序列(即，编码第二GS接头)，(7)包含SEQ IDNO:160所示序列的第六核苷酸序列(即，编码人血清白蛋白)，以及(8)聚(A)尾。这种多核苷酸的例子在本文中被描述为“vH3构建体”。
在一些方面，(i)所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:44所示的序列；(ii)所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:69所示的序列；(iii)所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:94所示的序列；(iv)所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:119所示的序列；(v)所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:140所示的序列；并且(vi)所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:161所示的序列。因此，在某些方面，本文所述的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)包含SEQ ID NO:19所示的序列。在一些方面，所述多核苷酸包含本文所述的一个或多个另外的特征。例如，在一些方面，本文提供的多核苷酸包含(从5'到3')：(1)5'帽(或帽类似物)，(2)包含SEQ ID NO:44所示序列的第一核苷酸序列(即，编码前导序列)，(3)包含SEQ ID NO:69所示序列的第二核苷酸序列(即，编码IL-12β亚基)，(4)包含SEQ ID NO:94所示序列的第三核苷酸序列(即，编码GS接头)，(5)包含SEQ ID NO:119所示序列的第四核苷酸序列(即，编码IL-12α亚基)，(6)包含SEQ ID NO:140所示序列的第五核苷酸序列(即，编码第二GS接头)，(7)包含SEQ IDNO:161所示序列的第六核苷酸序列(即，编码人血清白蛋白)，以及(8)聚(A)尾。这种多核苷酸的例子在本文中被描述为“B1构建体”。
在一些方面，(i)所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:45所示的序列；(ii)所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:70所示的序列；(iii)所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:95所示的序列；(iv)所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:120所示的序列；(v)所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:141所示的序列；并且(vi)所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:162所示的序列。因此，在某些方面，本文所述的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)包含SEQ ID NO:20所示的序列。在一些方面，所述多核苷酸包含本文所述的一个或多个另外的特征。例如，在一些方面，本文提供的多核苷酸包含(从5'到3')：(1)5'帽(或帽类似物)，(2)包含SEQ ID NO:45所示序列的第一核苷酸序列(即，编码前导序列)，(3)包含SEQ ID NO:70所示序列的第二核苷酸序列(即，编码IL-12β亚基)，(4)包含SEQ ID NO:95所示序列的第三核苷酸序列(即，编码GS接头)，(5)包含SEQ ID NO:120所示序列的第四核苷酸序列(即，编码IL-12α亚基)，(6)包含SEQ ID NO:141所示序列的第五核苷酸序列(即，编码第二GS接头)，(7)包含SEQ IDNO:162所示序列的第六核苷酸序列(即，编码人血清白蛋白)，以及(8)聚(A)尾。这种多核苷酸的例子在本文中被描述为“B2构建体”。
在一些方面，(i)所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:46所示的序列；(ii)所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:71所示的序列；(iii)所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:96所示的序列；(iv)所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:121所示的序列；(v)所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:142所示的序列；并且(vi)所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:163所示的序列。因此，在某些方面，本文所述的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)包含SEQ ID NO:21所示的序列。在一些方面，所述多核苷酸包含本文所述的一个或多个另外的特征。例如，在一些方面，本文提供的多核苷酸包含(从5'到3')：(1)5'帽(或帽类似物)，(2)包含SEQ ID NO:46所示序列的第一核苷酸序列(即，编码前导序列)，(3)包含SEQ ID NO:71所示序列的第二核苷酸序列(即，编码IL-12β亚基)，(4)包含SEQ ID NO:96所示序列的第三核苷酸序列(即，编码GS接头)，(5)包含SEQ ID NO:121所示序列的第四核苷酸序列(即，编码IL-12α亚基)，(6)包含SEQ ID NO:142所示序列的第五核苷酸序列(即，编码第二GS接头)，(7)包含SEQ IDNO:163所示序列的第六核苷酸序列(即，编码人血清白蛋白)，以及(8)聚(A)尾。这种多核苷酸的例子在本文中被描述为“B3构建体”。
在一些方面，(i)所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:47所示的序列；(ii)所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:72所示的序列；(iii)所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:97所示的序列；(iv)所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:122所示的序列；(v)所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:143所示的序列；并且(vi)所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:164所示的序列。因此，在某些方面，本文所述的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)包含SEQ ID NO:22所示的序列。在一些方面，所述多核苷酸包含本文所述的一个或多个另外的特征。例如，在一些方面，本文提供的多核苷酸包含(从5'到3')：(1)5'帽(或帽类似物)，(2)包含SEQ ID NO:47所示序列的第一核苷酸序列(即，编码前导序列)，(3)包含SEQ ID NO:72所示序列的第二核苷酸序列(即，编码IL-12β亚基)，(4)包含SEQ ID NO:97所示序列的第三核苷酸序列(即，编码GS接头)，(5)包含SEQ ID NO:122所示序列的第四核苷酸序列(即，编码IL-12α亚基)，(6)包含SEQ ID NO:143所示序列的第五核苷酸序列(即，编码第二GS接头)，(7)包含SEQ IDNO:164所示序列的第六核苷酸序列(即，编码人血清白蛋白)，以及(8)聚(A)尾。这种多核苷酸的例子在本文中被描述为“B4构建体”。
在一些方面，(i)所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:35所示的序列；(ii)所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:60所示的序列；(iii)所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:85所示的序列；(iv)所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:110所示的序列；(v)所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:135所示的序列；并且(vi)所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:156所示的序列。因此，在某些方面，本文所述的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)包含SEQ ID NO:10所示的序列。在一些方面，所述多核苷酸包含本文所述的一个或多个另外的特征。例如，在一些方面，本文提供的多核苷酸包含(从5'到3')：(1)5'帽(或帽类似物)，(2)包含SEQ ID NO:35所示序列的第一核苷酸序列(即，编码前导序列)，(3)包含SEQ ID NO:60所示序列的第二核苷酸序列(即，编码IL-12β亚基)，(4)包含SEQ ID NO:85所示序列的第三核苷酸序列(即，编码GS接头)，(5)包含SEQ ID NO:110所示序列的第四核苷酸序列(即，编码IL-12α亚基)，(6)包含SEQ ID NO:135所示序列的第五核苷酸序列(即，编码第二GS接头)，(7)包含SEQ IDNO:156所示序列的第六核苷酸序列(即，编码人血清白蛋白)，以及(8)聚(A)尾。这种多核苷酸的例子在本文中被描述为“CO构建体”。
在一些方面，(i)所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:36所示的序列；(ii)所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:61所示的序列；(iii)所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:86所示的序列；(iv)所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:111所示的序列；(v)所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:136所示的序列；并且(vi)所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:157所示的序列。因此，在某些方面，本文所述的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)包含SEQ ID NO:11所示的序列。在一些方面，所述多核苷酸包含本文所述的一个或多个另外的特征。例如，在一些方面，本文提供的多核苷酸包含(从5'到3')：(1)5'帽(或帽类似物)，(2)包含SEQ ID NO:36所示序列的第一核苷酸序列(即，编码前导序列)，(3)包含SEQ ID NO:61所示序列的第二核苷酸序列(即，编码IL-12β亚基)，(4)包含SEQ ID NO:86所示序列的第三核苷酸序列(即，编码GS接头)，(5)包含SEQ ID NO:111所示序列的第四核苷酸序列(即，编码IL-12α亚基)，(6)包含SEQ ID NO:136所示序列的第五核苷酸序列(即，编码第二GS接头)，(7)包含SEQ IDNO:157所示序列的第六核苷酸序列(即，编码人血清白蛋白)，以及(8)聚(A)尾。这种多核苷酸的例子在本文中被描述为“CP构建体”。
在一些方面，本文所述的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)包含(从5'到3')：(i)编码前导序列的第一核酸分子；(ii)编码IL-12β亚基的第二核酸分子；(iii)编码第一接头(例如，第一GS接头)的第三核酸分子；(iv)编码IL-12α亚基的第四核酸分子；(v)编码第二接头(例如，第二GS接头)的第五核酸分子；(vi)编码半衰期延长部分(例如，人血清白蛋白)的第六核酸分子；(vii)编码第三接头(例如，第三GS接头)的第七核酸分子；以及(viii)编码光蛋白聚糖的第八核酸分子。如本文所述，在一些方面，这种多核苷酸还包含本文所述的一个或多个另外的特征。在一些方面，本文所述的多核苷酸包含(从5'到3')：(1)5'帽，(2)编码前导序列的第一核苷酸序列，(3)编码IL-12β亚基的第二核苷酸序列，(4)编码第一接头(例如，GS接头)的第三核苷酸序列，(5)编码IL-12α亚基的第四核苷酸序列，(6)编码第二接头(例如，GS接头)的第五核苷酸序列，(7)编码异源部分(例如，白蛋白)的第六核苷酸序列，(8)编码第三接头(例如，GS接头)的第七核苷酸序列，(9)编码另外的部分(例如，光蛋白聚糖)的第八核苷酸序列，以及(12)聚(A)尾。在一些方面，本文所述的多核苷酸包含(从5'到3')：(1)5'帽，(2)5'UTR，(3)启动子，(4)编码前导序列的第一核苷酸序列，(5)编码IL-12β亚基的第二核苷酸序列，(6)编码第一接头(例如，GS接头)的第三核苷酸序列，(7)编码IL-12α亚基的第四核苷酸序列，(8)编码第二接头(例如，GS接头)的第五核苷酸序列，(9)编码异源部分(例如，白蛋白)的第六核苷酸序列，(10)编码第三接头(例如，GS接头)的第七核苷酸序列，(11)编码另外的部分(例如，光蛋白聚糖)的第八核苷酸序列，(12)3'UTR，以及(13)聚(A)尾。这样的示例性构建体的另外的描述提供于以下。
在一些方面，(i)所述第一核酸分子(即，编码前导序列)包含SEQ ID NO:48所示的序列；(ii)所述第二核酸分子(即，编码IL-12β亚基)包含SEQ ID NO:73所示的序列；(iii)所述第三核酸分子(即，编码第一接头)包含SEQ ID NO:98所示的序列；(iv)所述第四核酸分子(即，编码IL-12α亚基)包含SEQ ID NO:123所示的序列；(v)所述第五核酸分子(即，编码第二接头)包含SEQ ID NO:144所示的序列；(vi)所述第六核酸分子(即，编码半衰期延长部分)包含SEQ ID NO:165所示的核酸序列；(vii)所述第七核酸分子(即，编码第三接头)包含SEQ ID NO:168所示的序列；并且(viii)所述第八核酸分子(即，编码光蛋白聚糖)包含SEQ ID NO:171所示的序列。因此，在某些方面，本文所述的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)包含SEQ ID NO:23所示的序列。在一些方面，所述多核苷酸包含本文所述的一个或多个另外的特征。例如，在一些方面，本文提供的多核苷酸包含(从5'到3')：(1)5'帽(或帽类似物)，(2)包含SEQ ID NO:48所示序列的第一核苷酸序列(即，编码前导序列)，(3)包含SEQID NO:73所示序列的第二核苷酸序列(即，编码IL-12β亚基)，(4)包含SEQ ID NO:98所示序列的第三核苷酸序列(即，编码第一GS接头)，(5)包含SEQ ID NO:123所示序列的第四核苷酸序列(即，编码IL-12α亚基)，(6)包含SEQ ID NO:144所示序列的第五核苷酸序列(即，编码第二GS接头)，(7)包含SEQ ID NO:165所示序列的第六核苷酸序列(即，编码人血清白蛋白)，(8)包含SEQ ID NO:168所示序列的第七核苷酸序列(即，编码第三GS接头)，(9)包含SEQ ID NO:171所示序列的第八核苷酸序列(即，编码光蛋白聚糖)，以及(10)聚(A)尾。这种多核苷酸的例子在本文中被描述为“C1构建体”。
在一些方面，(i)所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:49所示的序列；(ii)所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:74所示的序列；(iii)所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:99所示的序列；(iv)所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:124所示的序列；(v)所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:145所示的序列；(vi)所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:166所示的序列；(vii)所述第七核酸分子包含SEQ ID NO:169所示的序列；并且(viii)所述第八核酸分子包含SEQ ID NO:172所示的序列。因此，在某些方面，本文所述的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)包含SEQ ID NO:24所示的序列。在一些方面，所述多核苷酸包含本文所述的一个或多个另外的特征。例如，在一些方面，本文提供的多核苷酸包含(从5'到3')：(1)5'帽(或帽类似物)，(2)包含SEQ ID NO:49所示序列的第一核苷酸序列(即，编码前导序列)，(3)包含SEQID NO:74所示序列的第二核苷酸序列(即，编码IL-12β亚基)，(4)包含SEQ ID NO:99所示序列的第三核苷酸序列(即，编码第一GS接头)，(5)包含SEQ ID NO:124所示序列的第四核苷酸序列(即，编码IL-12α亚基)，(6)包含SEQ ID NO:145所示序列的第五核苷酸序列(即，编码第二GS接头)，(7)包含SEQ ID NO:166所示序列的第六核苷酸序列(即，编码人血清白蛋白)，(8)包含SEQ ID NO:169所示序列的第七核苷酸序列(即，编码第三GS接头)，(9)包含SEQ ID NO:172所示序列的第八核苷酸序列(即，编码光蛋白聚糖)，以及(10)poly(A)尾。这种多核苷酸的例子在本文中被描述为“C2构建体”。
在一些方面，(i)所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:50所示的序列；(ii)所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:75所示的序列；(iii)所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:100所示的序列；(iv)所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:125所示的序列；(v)所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:146所示的序列；(vi)所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:167所示的序列；(vii)所述第七核酸分子包含SEQ ID NO:170所示的序列；并且(viii)所述第八核酸分子包含SEQ ID NO:173所示的序列。因此，在某些方面，本文所述的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)包含SEQ ID NO:25所示的序列。在一些方面，所述多核苷酸包含本文所述的一个或多个另外的特征。例如，在一些方面，本文提供的多核苷酸包含(从5'到3')：(1)5'帽(或帽类似物)，(2)包含SEQ ID NO:50所示序列的第一核苷酸序列(即，编码前导序列)，(3)包含SEQID NO:75所示序列的第二核苷酸序列(即，编码IL-12β亚基)，(4)包含SEQ ID NO:100所示序列的第三核苷酸序列(即，编码第一GS接头)，(5)包含SEQ ID NO:125所示序列的第四核苷酸序列(即，编码IL-12α亚基)，(6)包含SEQ ID NO:146所示序列的第五核苷酸序列(即，编码第二GS接头)，(7)包含SEQ ID NO:167所示序列的第六核苷酸序列(即，编码人血清白蛋白)，(8)包含SEQ IDNO:170所示序列的第七核苷酸序列(即，编码第三GS接头)，(9)包含SEQ ID NO:173所示序列的第八核苷酸序列(即，编码光蛋白聚糖)，以及(10)poly(A)尾。这种多核苷酸的例子在本文中被描述为“C3构建体”。
脂质纳米颗粒和递送系统
在一些方面，本公开文本涉及向细胞递送生物活性分子(例如，IL-12蛋白)。在某些方面，递送可以在体内发生(例如，通过向受试者施用本文所述的多核苷酸)或离体(例如，通过将本文所述的多核苷酸与细胞一起在体外培养)发生。在一些方面，本文所述的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)的递送可以使用本领域已知的任何合适的递送系统进行。在某些方面，所述递送系统是载体。因此，在一些方面，本公开文本提供了包含本公开文本的多核苷酸的载体。可以使用的合适的载体是本领域已知的。参见例如，Sung等人,Biomater Res 23(8)(2019)。
在一些方面，使用脂质纳米颗粒递送本文所述的多核苷酸(例如，包含编码IL-12蛋白的核酸分子的分离的多核苷酸)。因此，在一些方面，本公开文本涉及由脂质纳米颗粒包封的表达IL-12的多核苷酸(例如，RNA)、其组合物、以及其组合物治疗患有癌症或怀疑患有癌症的受试者的用途。
如本文所用，“脂质纳米颗粒”(LNP)是指具有相连脂质双层的囊泡，如球形囊泡。脂质纳米颗粒可以用于将药物疗法递送到目标位置的方法中。LNP的非限制性例子包括脂质体、双头基两亲分子(bolaamphiles)、固体脂质纳米颗粒(SLN)、纳米结构脂质载剂(NLC)和单层膜结构(例如，古细菌体(archaeosomes)和胶束)。
在一些方面，所述脂质纳米颗粒包含一种或多种类型的脂质。如本文所用，脂质是指一组有机化合物，其包括但不限于脂肪酸的酯，并且在一些方面，其特征在于不溶于水，但可溶于许多有机溶剂。它们通常分为至少三类：(1)“简单脂质”，包括脂肪和油以及蜡；(2)“复合脂质”，包括磷脂和糖脂；以及(3)“衍生脂质”，如类固醇。脂质的非限制性例子包括甘油三酯(例如，三硬脂酸甘油酯)、甘油二酯(例如，山嵛酸甘油酯)、甘油单酯(例如，单硬脂酸甘油酯)、脂肪酸(例如，硬脂酸)、类固醇(例如，胆固醇)和蜡(例如，鲸蜡醇棕榈酸酯)。在一些方面，LNP中的一种或多种类型的脂质包括阳离子脂质。在一些方面，LNP中的一种或多种类型的脂质包括类脂质，例如TT3。因此，在一些方面，本文所述的任何多核苷酸(例如，包含SEQ ID NO:1-25中任一个所示的序列、5'帽(或帽类似物)和聚(A)尾)可以包封在类脂质纳米颗粒(例如，TT3)中。在一些方面，多核苷酸包含SEQ ID NO:1所示的序列、5'帽(或帽类似物)和聚(A)尾，其中将所述多核苷酸包封在类脂质纳米颗粒(例如，TT3)中。在一些方面，多核苷酸包含SEQ ID NO:2所示的序列、5'帽(或帽类似物)和聚(A)尾，其中将所述多核苷酸包封在类脂质纳米颗粒(例如，TT3)中。在一些方面，多核苷酸包含SEQ ID NO:3所示的序列、5'帽(或帽类似物)和聚(A)尾，其中将所述多核苷酸包封在类脂质纳米颗粒(例如，TT3)中。在一些方面，多核苷酸包含SEQ ID NO:4所示的序列、5'帽(或帽类似物)和聚(A)尾，其中将所述多核苷酸包封在类脂质纳米颗粒(例如，TT3)中。在一些方面，多核苷酸包含SEQ ID NO:5所示的序列、5'帽(或帽类似物)和聚(A)尾，其中将所述多核苷酸包封在类脂质纳米颗粒(例如，TT3)中。在一些方面，多核苷酸包含SEQ ID NO:6所示的序列、5'帽(或帽类似物)和聚(A)尾，其中将所述多核苷酸包封在类脂质纳米颗粒(例如，TT3)中。在一些方面，多核苷酸包含SEQ ID NO:7所示的序列、5'帽(或帽类似物)和聚(A)尾，其中将所述多核苷酸包封在类脂质纳米颗粒(例如，TT3)中。在一些方面，多核苷酸包含SEQ ID NO:8所示的序列、5'帽(或帽类似物)和聚(A)尾，其中将所述多核苷酸包封在类脂质纳米颗粒(例如，TT3)中。在一些方面，多核苷酸包含SEQ ID NO:9所示的序列、5'帽(或帽类似物)和聚(A)尾，其中将所述多核苷酸包封在类脂质纳米颗粒(例如，TT3)中。在一些方面，多核苷酸包含SEQ ID NO:10所示的序列、5'帽(或帽类似物)和聚(A)尾，其中将所述多核苷酸包封在类脂质纳米颗粒(例如，TT3)中。在一些方面，多核苷酸包含SEQ ID NO:11所示的序列、5'帽(或帽类似物)和聚(A)尾，其中将所述多核苷酸包封在类脂质纳米颗粒(例如，TT3)中。在一些方面，多核苷酸包含SEQ ID NO:12所示的序列、5'帽(或帽类似物)和聚(A)尾，其中将所述多核苷酸包封在类脂质纳米颗粒(例如，TT3)中。在一些方面，多核苷酸包含SEQ IDNO:13所示的序列、5'帽(或帽类似物)和聚(A)尾，其中将所述多核苷酸包封在类脂质纳米颗粒(例如，TT3)中。在一些方面，多核苷酸包含SEQ ID NO:14所示的序列、5'帽(或帽类似物)和聚(A)尾，其中将所述多核苷酸包封在类脂质纳米颗粒(例如，TT3)中。在一些方面，多核苷酸包含SEQ ID NO:15所示的序列、5'帽(或帽类似物)和聚(A)尾，其中将所述多核苷酸包封在类脂质纳米颗粒(例如，TT3)中。在一些方面，多核苷酸包含SEQ ID NO:16所示的序列、5'帽(或帽类似物)和聚(A)尾，其中将所述多核苷酸包封在类脂质纳米颗粒(例如，TT3)中。在一些方面，多核苷酸包含SEQ ID NO:17所示的序列、5'帽(或帽类似物)和聚(A)尾，其中将所述多核苷酸包封在类脂质纳米颗粒(例如，TT3)中。在一些方面，多核苷酸包含SEQID NO:18所示的序列、5'帽(或帽类似物)和聚(A)尾，其中将所述多核苷酸包封在类脂质纳米颗粒(例如，TT3)中。在一些方面，多核苷酸包含SEQ ID NO:19所示的序列、5'帽(或帽类似物)和聚(A)尾，其中将所述多核苷酸包封在类脂质纳米颗粒(例如，TT3)中。在一些方面，多核苷酸包含SEQ ID NO:20所示的序列、5'帽(或帽类似物)和聚(A)尾，其中将所述多核苷酸包封在类脂质纳米颗粒(例如，TT3)中。在一些方面，多核苷酸包含SEQ ID NO:21所示的序列、5'帽(或帽类似物)和聚(A)尾，其中将所述多核苷酸包封在类脂质纳米颗粒(例如，TT3)中。在一些方面，多核苷酸包含SEQ ID NO:22所示的序列、5'帽(或帽类似物)和聚(A)尾，其中将所述多核苷酸包封在类脂质纳米颗粒(例如，TT3)中。在一些方面，多核苷酸包含SEQ ID NO:23所示的序列、5'帽(或帽类似物)和聚(A)尾，其中将所述多核苷酸包封在类脂质纳米颗粒(例如，TT3)中。在一些方面，多核苷酸包含SEQ ID NO:24所示的序列、5'帽(或帽类似物)和聚(A)尾，其中将所述多核苷酸包封在类脂质纳米颗粒(例如，TT3)中。在一些方面，多核苷酸包含SEQ ID NO:25所示的序列、5'帽(或帽类似物)和聚(A)尾，其中将所述多核苷酸包封在类脂质纳米颗粒(例如，TT3)中。
可用于本公开文本的此类脂质包括但不限于N1,N3,N5-三(3-(双十二烷基氨基)丙基)苯-1,3,5-三甲酰胺(TT3)、N-(2,3-二油酰基氧基)丙基-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)；lipofectamine；1,2-二亚油酰基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)；1,2-二亚麻烯基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)；双十八烷基二甲基铵(DODMA)、二硬脂酰基二甲基铵(DSDMA)、N,N-二油烯基-N,N,-二甲基氯化铵(DODAC)；N-(2,3-二油烯基氧基)丙基-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)；N-N-二硬脂酰基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)；3-(N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基)胆固醇(DC-Chol)和N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟基乙基溴化铵(DMRIE)。
在本公开文本的一些方面，所述脂质(例如，类脂质)是TT3。如本文所用，TT3能够形成脂质纳米颗粒，用于将多种生物活性剂递送到细胞中。此外，本公开文本还表明，未负载的TT3-LNP可以诱导体内和体外癌细胞的免疫原性细胞死亡(ICD)。如本文所述的免疫原性细胞死亡是指可以通过树突细胞(DC)的激活和随后的特异性T细胞应答的激活来诱导有效免疫应答的细胞死亡形式。在本公开文本的一些方面，经历免疫原性细胞死亡的细胞是肿瘤细胞。免疫原性肿瘤细胞死亡可以引发有效的抗肿瘤免疫应答。在本公开文本的一些方面，所述脂质纳米颗粒包含TT3-LNP，所述TT3-LNP包封仅编码报告基因的编码IL-12的核苷酸序列(modRNA)(TT3-LNP-modRNA)。与单独的TT3-LNP相比，编码IL-12的核苷酸序列可以与TT3-LNP协同作用以在肿瘤细胞中诱导更高水平的ICD。在本公开文本的一些方面，所述脂质纳米颗粒包含TT3-LNP，所述TT3-LNP包封编码IL-12分子的modRNA。IL-12是一种免疫调节性细胞因子，可引起针对局部肿瘤的有效免疫应答。TT3-LNP、modRNA和IL-12表达的组合不仅能有效协同抑制原位肿瘤细胞，还能引发全身抗肿瘤免疫应答，以杀伤远端肿瘤细胞并预防肿瘤复发。
在本公开文本的一些方面，所述阳离子脂质是DOTAP。如本文所用，DOTAP也能够形成脂质纳米颗粒。DOTAP可以用于将包括酵母人工染色体(YAC)在内的DNA高效转染到真核细胞中进行瞬时或稳定的基因表达，并且也适用于其他带负电荷分子(如RNA、寡核苷酸、核苷酸、核糖核蛋白(RNP)复合物和蛋白质)高效转移到哺乳动物细胞的研究样品中。
在本公开文本的一些方面，所述阳离子脂质是lipofectamine。如本文所用，Lipfectamine是由Invitrogen生产和销售的、用于分子和细胞生物学的常用转染试剂。它用于通过脂质转染提高RNA(包括mRNA和siRNA)或质粒DNA到体外细胞培养物中的转染效率。Lipofectamine含有脂质亚基，所述脂质亚基可以在水性环境中形成捕获转染有效载荷(例如，modRNA)的脂质体或脂质纳米颗粒。由于脂质体与细胞膜的中性共脂质介导的融合，含有RNA的脂质体(其表面带正电荷)可以与活细胞的带负电荷的质膜融合，从而允许核酸载物分子跨入细胞质中以进行复制或表达。
在本公开文本的一些方面，LNP主要由阳离子脂质以及其他脂质成分组成。这些通常包括属于但不限于以下类别的其他脂质分子：磷脂酰胆碱(PC)类(例如，1,s-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE))，甾醇(例如，胆固醇)，以及聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物(例如，1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[叶酸(聚乙二醇)-2000(DSPE-PEG2000)和C14-PEG2000)。表2显示示例性LNP、TT3-LNP和DOTAP-LNP的配方。
表2.
在一些方面，所述LNP包含C14-PEG2000。在某些方面，C14-PEG2000包括1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DMG-PEG2000)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DMPE-PEG2000)或两者。如本文所述(参见例如，实施例3)，在一些方面，可以在包封多核苷酸之前，将C14-PEG2000(或本文公开的其他脂质成分)嵌入LNP中。在一些方面，可以在包封多核苷酸之后，将C14-PEG2000(或本文公开的其他脂质成分)添加到LNP中。例如，在某些方面，将包含编码IL-12蛋白(例如，IL-12α和/或IL-12β亚基)的核酸分子的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)包封在LNP中，然后使用例如胶束将C14-PEG2000(本文公开的其他脂质成分)附接到LNP上。
脂质纳米颗粒的粒径可能会影响药物释放速率、生物分布、黏膜粘附、细胞对水的吸收以及纳米颗粒内部的缓冲液交换、以及蛋白质扩散。在本公开文本的一些方面，所述LNP的直径在约30至约500nm的范围内。在本公开文本的一些方面，所述LNP的直径在约30至约500nm、约50至约400nm、约70至约300nm、约100至约200nm、约100至约175nm或约100至约160nm的范围内。在本公开文本的一些方面，所述LNP的直径在100-160nm范围内。在本公开文本的一些方面，所述LNP的直径可以是约30nm、约40nm、约50nm、约60nm、约70nm、约80nm、约90nm、约100nm、约101nm、约102nm、约103nm、约104nm、约105nm、约106nm、约107nm、约108nm、约109nm、约110nm、约111nm、约112nm、约113nm、约114nm、约115nm、约116nm、约117nm、约118nm、约119nm、约120nm、约130nm、约140nm、约150nm或约160nm。在某些方面，所述脂质纳米颗粒具有约140nm的直径。
ζ电位是脂质纳米颗粒表面上有效电荷的量度。ζ电位的大小提供了关于颗粒稳定性的信息。在本公开文本的一些方面，所述LNP的ζ电位在约3至约6mv的范围内。在本公开文本的一些方面，所述LNP的ζ电位可以是约3mv、约3.1mv、约3.2mv、约3.3mv、约3.4mv、约3.5mv、约3.6mv、约3.7mv、约3.8mv、约3.9mv、约4mv、约4.1mv、约4.2mv、约4.3mv、约4.4mv、约4.5mv、约4.6mv、约4.7mv、约4.8mv、约4.9mv、约5mv、约5.1mv、约5.2mv、约5.3mv、约5.4mv、约5.5mv、约5.6mv、约5.7mv、约5.8mv、约5.9mv或约6mv。
在一些方面，本公开文本涉及包封的多核苷酸(例如，mRNA)与脂质纳米颗粒(LNP)。在本公开文本的一些方面，LNP的脂质与多核苷酸(例如，mRNA)之间的质量比在约1:2至约15:1的范围内。在一些方面，所述脂质与所述多核苷酸(例如，mRNA)之间的质量比可以是约1:2、约1:1.9、约1:1.8、约1:1.7、约1:1.6、约1:1.5、约1:1.4、约1:1.3、约1:1.2、约1:1.1、约1:1、约1.1:1、约1.2:1、约1.3:1、约1.4:1、约1.5:1、约1.6:1、约1.7:1、约1.8:1、约1.9:1、约2:1、约2.5:1、约3:1、约3.5:1、约4:1、约4.5:1、约5:1、约5.5:1、约6:1、约6.5:1、约7:1、约7.5:1、约8:1、约8.5:1、约9:1、约9.5:1、约10:1、约10.5:1、约11:1、约11.5:1、约12:1、约12.5:1、约13:1、约13.5:1、约14:1、约14.5:1或约15:1。在本公开文本的一些方面，所述脂质与所述多核苷酸(例如，mRNA)之间的质量比为约10:1。
药物组合物
在一些方面，本公开文本涉及药物组合物，其包含本文所述的多核苷酸、载体和/或脂质纳米颗粒。在本公开文本的一些方面，所述药物组合物还包含药学上可接受的载剂(赋形剂)。如本文所用，“可接受的”意指载剂必须与组合物的活性成分相容并且对要治疗的受试者无害。在一些方面，载剂能够稳定活性成分。药学上可接受的赋形剂(载剂)包括本领域熟知的缓冲剂。参见例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy第20版(2000)Lippincott Williams and Wilkoins,K.E.Hoover编辑。
用于体内施用的药物配制品必须是无菌的。这可以例如通过无菌过滤膜进行过滤容易地实现。可以将脂质纳米颗粒放入具有无菌进入口的容器中，例如具有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉溶液袋或小瓶。
在本公开文本的一些方面，所述药物组合物可以被配制用于瘤内、鞘内、肌肉内、静脉内、皮下、吸入、皮内、淋巴内、眼内、腹膜内、胸膜内、脊柱内、血管内、鼻、经皮(percutaneous)、舌下、黏膜下、透皮(transdermal)或透黏膜施用。在本公开文本的一些方面，所述药物组合物可以被配制用于瘤内注射。如本文所用，瘤内注射是指直接注射到肿瘤中。可以在原位达到高浓度的组合物，同时使用少量药物。免疫疗法的局部递送允许多种组合疗法，同时防止明显的系统暴露和脱靶毒性。
在本公开文本的一些方面，所述药物组合物可以被配制用于肌肉内注射、静脉内注射或皮下注射。
在本公开文本的一些方面，所述药物组合物包含冻干配制品或水溶液形式的药学上可接受的载剂、缓冲剂、赋形剂、盐或稳定剂。参见例如，Remington:The Science andPractice of Pharmacy第20版(2000)Lippincott Williams and Wilkins,K.E.Hoover编辑。可接受的载剂和赋形剂或稳定剂在所使用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且包括：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或右旋糖酐；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如，锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
在一些方面，本文所述的药物组合物包含脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒可以通过本领域已知的方法制备，所述方法如在以下文献中所述：Epstein等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688(1985)；Hwang等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4030(1980)；以及美国专利号4,485,045和4,544,545，将这些文献通过引用以其整体特此并入。具有增加的循环时间的脂质体披露于美国专利号5,013,556中，将其通过引用以其整体特此并入。在一些方面，脂质体可以通过反相蒸发方法用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物产生。将脂质体通过具有限定孔径的过滤器挤出，以产生具有所需直径的脂质体。
在本公开文本的一些方面，所述药物组合物以持续释放形式配制。持续释放制剂的合适例子包括含有脂质纳米颗粒的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质呈成型制品(例如，薄膜或微胶囊)的形式。持续释放基质的例子包括但不限于聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和7乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙烯基乙酸酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物(如LUPROM DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球))、乙酸异丁酸蔗糖酯和聚D-(-)-3-羟基丁酸。
在一些方面，合适的表面活性剂包括但不限于非离子试剂，如聚氧乙烯脱水山梨醇(例如，TWEENTM 20、40、60、80或85)和其他脱水山梨醇(例如，SPANTM 20、30、60、80或85)。在一些方面，具有表面活性剂的组合物包含0.05％与5％之间的表面活性剂。在一些方面，所述组合物包含0.1％与2.5％之间的表面活性剂。应当理解，如果需要，可以添加其他成分，例如甘露糖醇或其他药学上可接受的媒介物。
在一些方面，所述药物组合物为单位剂型，如片剂、丸剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、溶液或悬浮液、或栓剂，用于口服、肠胃外或直肠施用，或通过吸入或吹入施用。
为了制备固体组合物(如片剂)，可以将主要活性成分与药物载剂(例如，常规片剂成分，如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸氢钙或树胶)以及其他药物稀释剂(例如，水)混合，以形成含有本公开文本的化合物或其无毒的药学上可接受的盐的均质混合物的固体预配制组合物。当提及这些预配制组合物为均质的时，其意指活性成分均匀分散于整个组合物中，使得所述组合物可以容易地被细分成同样有效的单位剂型，如片剂、丸剂和胶囊。然后将此固体预配制组合物细分为上述类型的单位剂型，其含有约0.1至约500mg的本公开文本的活性成分。所述新型组合物的片剂或丸剂可以被包衣或以其他方式混合，以提供具有延长作用优点的剂型。例如，片剂或丸剂可以包含内剂量组分和外剂量组分，后者呈在前者上的包膜的形式。这两种组分可以被肠溶层分开，所述肠溶层用于抵抗在胃中的崩解并且允许内部组分完整地进入十二指肠中或延迟释放。多种材料可以用于此类肠溶层或包衣，此类材料包括许多聚合酸以及聚合酸与诸如虫胶、鲸蜡醇和乙酸纤维素等材料的混合物。
合适的乳液可以使用可商购的脂肪乳液(如INTRALIPIDTM、LIPOSYNTM、INFONUTROLTM、LIPOFUNDINTM和LIPIPHYSANTM)制备。活性成分可以溶解于预混合的乳液组合物中，或可替代地可以溶解于油(例如，大豆油、红花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)以及与磷脂(例如，卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)和水混合后形成的乳液中。应当理解，可以添加其他成分，例如甘油或葡萄糖，以调节乳液的张力。合适的乳液将典型地含有至多约20％的油，例如约5％与约20％之间的油。脂肪乳液可以包含具有合适尺寸的脂肪滴，并且可以具有约5.5至约8.0范围内的pH。
用于吸入或吹入的药物组合物包括在药学上可接受的水性或有机溶剂或其混合物中的溶液和悬浮液，以及粉剂。液体或固体组合物可以含有如上文所示的合适的药学上可接受的赋形剂。在一些方面，所述组合物通过口或鼻呼吸途径施用，以得到局部或全身性作用。
在药学上可接受的溶剂中的组合物可以通过使用气体而被雾化。雾化溶液可以直接从雾化装置呼吸，或者雾化装置可以连接到面罩、氧气帐(tent)或间歇正压呼吸机上。可以从以适当方式递送配制品的装置施用溶液、悬浮液或粉末组合物。
治疗性应用
在本公开文本的一些方面，本文所述的多核苷酸、载体、脂质纳米颗粒和/或药物组合物(本文也统称为“组合物”)用于治疗疾病或障碍。在某些方面，所述疾病或障碍包括癌症。在本公开文本的其他地方提供了可以治疗的癌症的非限制性例子。
在一些方面，将有效量的本文所述的任何组合物经由合适的途径施用于有需要的受试者，所述途径例如瘤内施用，静脉内施用(例如，作为推注或通过一段时间内连续输注)，通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、吸入或局部途径。用于液体配制品的可商购雾化器(包括喷射雾化器和超声雾化器)可用于施用。液体配制品可以被雾化，并且冻干粉可以在重构后被雾化。在一些方面，本文所述的药物组合物使用碳氟化合物配制品和定量吸入器进行气溶，或作为冻干且研磨的粉末吸入。在一些方面，本文所述的药物组合物被配制用于瘤内注射。在一些方面，将本文所述的药物组合物经由局部途径施用于受试者，例如，注射至局部部位，如肿瘤部位或感染部位。在一些方面，所述受试者是人。
从本公开文本显而易见的是，在一些方面，将本文所述的组合物以有效量单独地或与一种或多种其他活性剂组合地施用于受试者，以实现治疗效果。在一些方面，将所述组合物施用于患有癌症的受试者，并且所述治疗效果包括肿瘤负荷减少、癌细胞减少、免疫活性增加或其组合。所施用的组合物(例如，脂质纳米颗粒)是否达到治疗效果可以使用本领域已知的任何合适的方法(例如，测量肿瘤体积和/或T细胞活性)来确定。如本领域技术人员所公认的，有效量根据以下因素而变化：所治疗的特定病症，病症的严重程度，包括年龄、身体状况、大小、性别和体重在内的个体患者参数，治疗的持续时间，并行疗法(如果有的话)的性质，医疗人员的专业知识范围内的具体施用途径和类似因素。
经验方面的考量(如半衰期)通常将有助于剂量的确定。施用频率可以在治疗过程中确定并调整，并且通常但不一定基于目标疾病/障碍的治疗和/或抑制和/或改善和/或延迟。可替代地，本文所述的组合物(例如，脂质纳米颗粒)的持续连续释放配制品可能是合适的。用于实现持续释放的各种配制品和装置是本领域已知的。
在本公开文本的一些方面，所述治疗是本文公开的组合物的单次注射。在一些方面，将所述单次注射瘤内施用于有需要的受试者。
在本公开文本的一些方面，本文所述的组合物的剂量可以在已经给予所述组合物(例如，本文所述的脂质纳米颗粒)的一次或多次施用的个体中凭经验确定。在一些方面，给所述个体给予本文所述的组合物的递增剂量。为了评估本文的组合物的功效，可以跟踪疾病/障碍的指标。对于几天或更长时间内的重复施用，在一些方面，取决于病症，所述治疗持续到发生期望的症状抑制或持续到达到减轻目标疾病或障碍或其症状的足够治疗水平。
在本公开文本的一些方面，给药频率为约每周一次、约每2周一次、约每3周一次、约每4周一次、约每5周一次、约每6周一次、约每7周一次、约每8周一次、约每9周一次或约每10周一次；或约每月一次、约每2个月一次或约每3个月一次，或更长时间。使用的本文所述的组合物(例如，脂质纳米颗粒)的给药方案(例如，剂量和/或给药频率)可以随时间变化。
在本公开文本的一些方面，所述方法包括向有需要的受试者施用一个或多个剂量的本文所述的组合物。
所述组合物(例如，本文所述的脂质纳米颗粒)的适当剂量将取决于具体的组合物(例如，脂质纳米颗粒)、疾病/障碍(例如，癌症)的类型和严重程度、组合物(例如，脂质纳米颗粒)是否出于预防或治疗目的而施用、先前的治疗、受试者的临床病史和对组合物(例如，脂质纳米颗粒)的响应以及主治医师的判断。在一些方面，临床医生可以施用本文公开的组合物直至达到实现所需结果的剂量为止。在一些方面，所需结果是肿瘤负荷减少、癌细胞减少或免疫活性增加。一种或多种本文所述的组合物的施用可以是连续的或间歇的，这取决于例如接受者的生理状况、施用的目的是治疗性的还是预防性的、以及技术人员已知的其他因素。本文所述的组合物的施用在预选的时间段内可以基本上是连续的，或者可以例如在形成目标疾病或障碍之前、期间或之后是一系列间隔的剂量。
如本文所用，减轻目标疾病/障碍包括延迟疾病的发展或进展，或降低疾病的严重程度。减轻疾病不一定需要治愈性结果。如本文所用，“延迟”目标疾病或障碍的发展意指推迟、阻碍、减缓、延缓、稳定和/或推延疾病的进展。此延迟可以持续不同的时间长度，这取决于疾病病史和/或所治疗的受试者。延迟或减缓疾病的发展或延迟疾病的发作的方法是以下方法，当与不使用所述方法相比时，所述方法在给定时间范围内降低出现疾病的一种或多种症状的概率和/或在给定时间范围内降低症状的程度。这种比较通常基于临床研究，使用足以给出统计学显著结果的大量受试者。
在一些方面，将本文所述的组合物以如下量施用于有需要的受试者，所述量足以减少体内肿瘤负荷或癌细胞生长至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更大。在一些方面，将本文所述的组合物以如下量施用，所述量有效增加免疫活性至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更大。
在一些方面，向受试者施用所述组合物(例如，本文所述的多核苷酸、载体、脂质纳米颗粒或药物组合物)增强受试者中的免疫活性，如T细胞活性。在某些方面，与参考受试者(例如，在施用所述组合物之前的受试者或对施用所述组合物不具有反应性的相应受试者)的免疫活性相比，免疫活性增强或增加至少约0.5倍、至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约50倍或更多。
在一些方面，所述受试者是患有癌症、怀疑患有癌症或有患癌症风险的人。在一些方面，所述癌症选自黑色素瘤、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(livercancer)、膀胱癌、肝癌(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、胃癌以及多种类型的头颈癌(包括鳞状细胞头颈癌)。在一些方面，所述癌症可以是黑色素瘤、肺癌、结直肠癌、肾细胞癌、尿路上皮癌或霍奇金淋巴瘤。
患有目标疾病或障碍的受试者可以通过常规医学检查(例如，实验室检查、器官功能检查、CT扫描或超声波)来鉴定。怀疑患有目标疾病或障碍的受试者可能表现出所述疾病或障碍的一种或多种症状。有患疾病或障碍风险的受试者可以是具有与所述疾病或障碍相关的一个或多个风险因素的受试者。有患疾病或障碍风险的受试者也可以通过常规医疗实践来鉴定。
在一些方面，本文所述的组合物与至少一种另外的合适的治疗剂共同施用。在一些方面，所述至少一种另外的合适的治疗剂包括抗癌剂、抗病毒剂、抗细菌剂或用于增强和/或补充本文所述的组合物(例如，脂质纳米颗粒)的免疫刺激作用的其他药剂。可以与本文所述的组合物组合使用的另外的治疗剂的其他例子包括：化学治疗药、靶向抗癌疗法、溶瘤药物、细胞毒性剂、基于免疫的疗法、细胞因子、手术、放射手术、共刺激分子的激活剂、免疫检查点抑制剂、疫苗、细胞免疫疗法或其任何组合。在一些方面，将本文所述的组合物和所述至少一种另外的治疗剂以顺序方式施用于受试者，即，每种治疗剂在不同的时间施用。在一些方面，将本文所述的组合物和所述至少一种另外的治疗剂以基本上同时的方式施用于受试者。
本领域技术人员将理解，本文所述的组合物和另一种抗癌剂(例如，化疗剂)的任何组合可以以任何顺序使用以治疗癌症。本文所述的组合可以基于多种因素来选择，所述因素包括但不限于有效性或减少肿瘤形成或肿瘤生长、减少癌细胞、增加免疫活性和/或减轻与癌症相关的至少一种症状、或减轻组合中的另一种药剂的副作用的效力。例如，本文所述的组合疗法可以减少与组合中的每个单独成员相关的任何副作用，例如，与抗癌剂相关的副作用。
在一些方面，所述另一种抗癌治疗剂是化学疗法、放射疗法、手术疗法、免疫疗法或其组合。在一些方面，所述化疗剂是卡铂、顺铂、多西他赛、吉西他滨、纳米颗粒白蛋白结合型紫杉醇(nab-paclitexal)、培美曲塞、长春瑞滨或其组合。在一些方面，所述放射疗法是电离辐射、γ辐射、中子束放射疗法、电子束放射疗法、质子疗法、近距离放射疗法、全身放射性同位素、放射增敏剂或其组合。在一些方面，所述手术疗法是根治性手术(例如，肿瘤切除手术)、预防性手术、腹腔镜手术、激光手术或其组合。在一些方面，所述免疫疗法是过继细胞转移、治疗性癌症疫苗或其组合。
在一些方面，所述化疗剂是铂剂，如卡铂、奥沙利铂、顺铂、奈达铂、沙铂、洛铂、四硝酸三铂、吡铂、Prolindac、Aroplatin以及其他衍生物；拓扑异构酶I抑制剂，如喜树碱、拓扑替康、伊立替康/SN38、鲁比替康、贝洛替康以及其他衍生物；拓扑异构酶II抑制剂，如依托泊苷(VP-16)、柔红霉素、阿霉素药剂(例如，阿霉素、HCl阿霉素、阿霉素类似物、或脂质体中的阿霉素及其盐或类似物)、米托蒽醌、阿柔比星、表柔比星、伊达比星、氨柔比星、安吖啶、吡柔比星、戊柔比星、佐柔比星、替尼泊苷以及其他衍生物；抗代谢药，如叶酸家族(甲氨蝶呤、培美曲塞、雷替曲塞、氨基喋呤以及相关物)；嘌呤拮抗剂(硫鸟嘌呤、氟达拉滨、克拉屈滨、6-巯基嘌呤、喷司他丁、氯法拉滨以及相关物)和嘧啶拮抗剂(阿糖胞苷、氟尿苷、阿扎胞苷、替加氟、卡莫福、卡培他滨、吉西他滨、羟基脲、5-氟尿嘧啶(5FU)以及相关物)；烷基化剂，如氮芥(Nitrogen mustard)(例如，环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、氮芥(mechlorethamine)、异环磷酰胺、曲洛磷胺、泼尼莫司汀、苯达莫司汀、乌拉莫司汀、雌莫司汀以及相关物)；亚硝基脲(例如，卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、福莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀、链脲佐菌素以及相关物)；三氮烯(例如，达卡巴嗪、六甲蜜胺、替莫唑胺以及相关物)；烷基磺酸盐(例如，白消安、甘露舒凡、苏消安以及相关物)；丙卡巴肼；二溴甘露醇和氮丙啶(例如，卡波醌、三亚胺醌、噻替派、三亚乙基甲胺以及相关物)；抗生素，如羟基脲、蒽环类药物(例如，阿霉素药剂、柔红霉素、表阿霉素以及其他衍生物)；蒽醌(例如，米托蒽醌以及相关物)；链霉菌属家族(例如，博来霉素、丝裂霉素C、放线菌素、普卡霉素)；紫外线；及其组合。
在一些方面，所述另一种抗癌治疗剂是抗体。抗体(优选单克隆抗体)通过各种机制实现其对癌细胞的治疗作用。它们可以在产生细胞凋亡或细胞程序性死亡方面具有直接的作用。它们可以阻断信号转导途径中的组分(例如，生长因子受体)，从而有效抑制肿瘤细胞的增殖。在表达单克隆抗体的细胞中，所述单克隆抗体可以导致抗独特型抗体的形成。间接作用包括募集具有细胞毒性的细胞，如单核细胞和巨噬细胞。这种抗体介导的细胞杀伤作用被称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。抗体还结合补体，导致直接的细胞毒性，称为补体依赖性细胞毒性(CDC)。将手术方法与免疫治疗性药物或方法组合是一种成功的方法，如例如在Gadri等人2009:Synergistic effect of dendritic cell vaccinationand anti-CD20 antibody treatment in the therapy of murine lymphoma.JImmunother.32(4):333-40中所证明的。以下列表提供了可以与本公开文本组合使用的抗癌抗体和潜在抗体靶标(括号内)的一些非限制性例子：阿巴伏单抗(Abagovomab)(CA-125)、阿昔单抗(CD41)、阿德木单抗(Adecatumumab)(EpCAM)、阿夫土珠单抗(CD20)、培戈-阿拉赛珠单抗(Alacizumab pegol)(VEGFR2)、喷替酸阿妥莫单抗(Altumomab pentetate)(CEA)、阿麦妥单抗(Amatuximab)(MORAb-009)、阿纳图莫单抗(Anatumomab mafenatox)(TAG-72)、阿泊珠单抗(Apolizumab)(HLA-DR)、阿西莫单抗(Arcitumomab)(CEA)、巴维昔单抗(Bavituximab)(磷脂酰丝氨酸)、贝妥莫单抗(Bectumomab)(CD22)、贝利尤单抗(Belimumab)(BAFF)、贝伐单抗(VEGF-A)、比伐珠单抗美坦辛(Bivatuzumab mertansine)(CD44 v6)、贝林妥欧单抗(Blinatumomab)(CD19)、维汀-布仑妥昔单抗(Brentuximabvedotin)(CD30TNFRSF8)、坎妥珠单抗美坦辛(Cantuzumab mertansin)(粘蛋白CanAg)、坎妥珠单抗(Cantuzumab ravtansine)(MUC1)、卡罗单抗喷地肽(Capromab pendetide)(前列腺癌细胞)、卡芦单抗(Carlumab)(CNT0888)、卡妥索单抗(Catumaxomab)(EpCAM、CD3)、西妥昔单抗(EGFR)、泊西他珠单抗(Citatuzumab bogatox)(EpCAM)、西妥木单抗(Cixutumumab)(IGF-1受体)、克劳昔单浪(Claudiximab)(密封蛋白)、泰坦-克利妥珠单抗(Clivatuzumabtetraxetan)(MUC1)、可那木单抗(Conatumumab)(TRAIL-R2)、达塞妥珠单抗(Dacetuzumab)(CD40)、达雷木单抗(Dalotuzumab)(胰岛素样生长因子I受体)、地诺单抗(RANKL)、地莫单抗(B淋巴瘤细胞)、曲齐妥单抗(Drozitumab)(DR5)、依美昔单抗(Ecromeximab)(GD3神经节苷脂)、依决洛单抗(Edrecolomab)(EpCAM)、埃罗妥珠单抗(Elotuzumab)(SLAMF7)、依那妥组单抗(Enavatuzumab)(PDL192)、恩妥昔单抗(Ensituximab)(NPC-1C)、依帕珠单抗(Epratuzumab)(CD22)、厄妥索单抗(Ertumaxomab)(HER2/neu、CD3)、埃达珠单抗(Etaracizumab)(整合素αvβ3)、法妥组单抗(Farletuzumab)(叶酸受体1)、FBTA05(CD20)、菲拉妥珠单抗(Ficlatuzumab)(SCH 900105)、芬妥木单抗(Figitumumab)(IGF-1受体)、法兰妥单抗(Flanvotumab)(糖蛋白75)、非苏木单抗(Fresolimumab)(TGF-β)、加利昔单抗(Galiximab)(CD80)、加尼妥单抗(Ganitumab)(IGF-I)、吉妥珠单抗(Gemtuzumabozogamicin)(CD33)、吉伏组单抗(Gevokizumab)(IL-1β)、吉妥昔单抗(Girentuximab)(碳酸酐酶9(CA-IX))、维汀-格巴妥木单抗(Glembatumumab vedotin)(GPNMB)、替伊莫单抗(Ibritumomab tiuxetan)(CD20)、艾芦库单抗(Icrucumab)(VEGFR-1)、伊戈伏单抗(Igovomab)(CA-125)、英达妥昔单抗(Indatuximab ravtansine)(SDC1)、英妥木单抗(Intetumumab)(CD51)、奥加伊妥珠单抗(Inotuzumab ozogamicin)(CD22)、伊匹单抗(CD152)、伊妥木单抗(Iratumumab)(CD30)、拉贝珠单抗(Labetuzumab)(CEA)、来沙木单抗(Lexatumumab)(TRAIL-R2)、利韦单抗(Libivirumab)(乙型肝炎表面抗原)、林妥珠单抗(Lintuzumab)(CD33)、洛沃妥珠单抗美坦辛(Lorvotuzumab mertansine)(CD56)、卢卡木单抗(Lucatumumab)(CD40)、鲁昔单抗(Lumiliximab)(CD23)、马帕木单抗(Mapatumumab)(TRAIL-R1)、马妥珠单抗(Matuzumab)(EGFR)、美泊利单抗(Mepolizumab)(IL-5)、米拉珠单抗(Milatuzumab)(CD74)、米妥莫单抗(Mitumomab)(GD3神经节苷脂)、莫格利珠单抗(Mogamulizumab)(CCR4)、莫塞妥莫单抗(Moxetumomab pasudotox)(CD22)、他那可单抗(Nacolomab tafenatox)(C242抗原)、埃托-那普妥莫单抗(Naptumomab estafenatox)(5T4)、那呐妥单抗(Narnatumab)(RON)、耐昔妥珠单抗(Necitumumab)(EGFR)、尼妥珠单抗(Nimotuzumab)(EGFR)、纳武单抗(IgG4)、奥法木单抗(CD20)、奥拉单抗(Olaratumab)(PDGF-Rα)、奥那妥珠单抗(Onartuzumab)(人散射因子受体激酶)、莫奥珠单抗(Oportuzumab monatox)(EpCAM)、奥戈伏单抗(Oregovomab)(CA-125)、奥塞芦单抗(Oxelumab)(OX-40)、帕尼单抗(EGFR)、帕瑞妥单抗(Patritumab)(HER3)、培妥莫单抗(Pemtumomab)(MUC1)、帕妥珠单抗(Pertuzuma)(HER2/neu)、平妥莫单抗(Pintumomab)(腺癌抗原)、普立木单抗(Pritumumab)(波形蛋白)、雷妥莫单抗(Racotumomab)(N-羟乙酰神经氨酸)、雷曲妥单抗(Radretumab)(纤连蛋白外结构域-B)、雷夫利珠单抗(Rafivirumab)(狂犬病病毒糖蛋白)、雷莫芦单抗(Ramucirumab)(VEGFR2)、利妥木单抗(Rilotumumab)(HGF)、利妥昔单抗(CD20)、罗妥木单抗(Robatumumab)(IGF-1受体)、萨特利珠单抗(Samalizumab)(CD200)、西罗珠单抗(Sibrotuzumab)(FAP)、司妥昔单抗(Siltuximab)(IL-6)、他贝芦单抗(Tabalumab)(BAFF)、泰坦-他卡妥株单抗(Tacatuzumab tetraxetan)(甲胎蛋白)、他利妥莫单抗(Taplitumomab paptox)(CD19)、替妥莫单抗(Tenatumomab)(固生蛋白C)、替妥木单抗(Teprotumumab)(CD221)、替西木单抗(Ticilimumab)(CTLA-4)、替加珠单抗(Tigatuzumab)(TRAIL-R2)、TNX-650(IL-13)、托西莫单抗(Tositumomab)(CD20)、曲妥珠单抗(HER2/neu)、TRBS07(GD2)、曲美木单抗(CTLA-4)、西莫白介素单抗(Tucotuzumabcelmoleukin)(EpCAM)、乌利妥昔单抗(Ublituximab)(MS4A1)、乌瑞芦单抗(Urelumab)(4-1BB)、伏洛昔单抗(Volociximab)(整合素α5β1)、伏妥莫单抗(Votumumab)(肿瘤抗原CTAA16.88)、扎鲁木单抗(Zalutumumab)(EGFR)、扎木单抗(Zanolimumab)(CD4)。
在一些方面，所述另一种抗癌治疗剂是细胞因子、趋化因子、共刺激分子、融合蛋白或其组合。趋化因子的例子包括但不限于CCR7及其配体CCL19和CCL21，此外还有CCL2、CCL3、CCL5和CCL16。其他例子是CXCR4、CXCR7和CXCL12。此外，共刺激分子或调节分子(例如，B7配体B7.1和B7.2)是有用的。其他细胞因子也是有用的，特别地例如白介素(例如，IL-1至IL17)、干扰素(例如，IFNα1至IFNα8、IFNα10、IFNα13、IFNα14、IFNα16、IFNα17、IFNα21、IFNβ1、IFNW、IFNE1和IFNK)、造血因子、TGF(例如，TGF-α、TGF-β和TGF家族的其他成员)，最后是受体的肿瘤坏死因子家族成员及其配体以及其他刺激分子，包括但不限于41BB、41BB-L、CD137、CD137L、CTLA-4GITR、GITRL、Fas、Fas-L、TNFR1、TRAIL-R1、TRAIL-R2、p75NGF-R、DR6、LT.β.R、RANK、EDAR1、XEDAR、Fn114、Troy/Trade、TAJ、TNFRII、HVEM、CD27、CD30、CD40、4-1BB、OX40、GITR、GITRL、TACI、BAFF-R、BCMA、RELT和CD95(Fas/APO-1)、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白、TNF受体相关的凋亡介导蛋白(TRAMP)和死亡受体-6(DR6)。特别地，由于CD40/CD40L和OX40/OX40L直接影响T细胞的存活和增殖，所以它们是组合免疫疗法的重要靶标。有关综述，参见Lechner等人2011:Chemokines,costimulatory molecules andfusion proteins for the immunotherapy of solid tumors.Immunotherapy 3(11),1317-1340。
在一些方面，所述另一种抗癌疗法是细菌治疗。研究人员一直在使用厌氧细菌(如诺氏梭菌(Clostridium novyi))来消耗缺氧肿瘤的内部。当它们与肿瘤的含氧侧接触时，它们就会死亡，这意味着它们对身体的其余部位是无害的。另一种策略是使用已经被酶转化的厌氧细菌，所述酶可以将无毒前药转化为有毒药物。随着细菌在肿瘤的坏死和缺氧区域的增殖，所述酶仅在肿瘤中表达。因此，全身应用的前药仅在肿瘤中被代谢为有毒药物。已证明非致病性厌氧菌生孢梭菌(Clostridium sporogenes)是有效的。
在一些方面，所述另一种抗癌治疗剂是激酶抑制剂。癌细胞的生长和存活与激酶活性的失调密切相关。为了恢复正常的激酶活性并因此减少肿瘤生长，使用了广泛的抑制剂。靶向性激酶组包括受体酪氨酸激酶(例如，BCR-ABL、B-Raf、EGFR、HER-2/ErbB2、IGF-IR、PDGFR-α、PDGFR-β、c-Kit、Flt-4、Flt3、FGFR1、FGFR3、FGFR4、CSF1R、c-Met、RON、c-Ret、ALK)、细胞质酪氨酸激酶(例如，c-SRC、c-YES、Abl、JAK-2)、丝氨酸/苏氨酸激酶(例如，ATM、Aurora A和B、CDK、mTOR、PKCi、PLK、b-Raf、S6K、STK11/LKB1)和脂质激酶(例如，PI3K、SK1)。小分子激酶抑制剂例如是PHA-739358、尼洛替尼、达沙替尼和PD166326、NSC 743411、拉帕替尼(GW-572016)、卡那替尼(Canertinib)(CI-1033)、司马沙尼(Semaxinib)(SU5416)、瓦他拉尼(Vatalanib)(PTK787/ZK222584)、Sutent(SU11248)、索拉非尼(BAY 43-9006)和来氟米特(SU101)。有关更多信息，参见例如，Zhang等人2009:Targeting cancer with smallmolecule kinase inhibitors.Nature Reviews Cancer 9,28-39。
在一些方面，所述另一种抗癌治疗剂是toll样受体。Toll样受体(TLR)家族的成员是先天免疫和适应性免疫之间的重要纽带，并且许多佐剂的作用依赖于TLR的激活。大量已投入使用的抗癌疫苗都掺有TLR的配体，以增强疫苗的应答。除TLR2、TLR3、TLR4外，特别地TLR7和TLR8已被检验用于被动免疫疗法中的癌症治疗。密切相关的TLR7和TLR8通过影响免疫细胞、肿瘤细胞和肿瘤微环境而促成抗肿瘤应答，并且可以被核苷类似物结构激活。所有TLR已被用作独立的免疫治疗剂或癌症疫苗佐剂，并且可以与本公开文本的配制品和方法协同组合。有关更多信息，参见van Duin等人2005:Triggering TLR signaling invaccination.Trends in Immunology,27(1):49-55。
在一些方面，所述另一种抗癌治疗剂是血管生成抑制剂。血管生成抑制剂阻止肿瘤存活所需的血管广泛生长(血管生成)。例如，可以通过靶向不同的分子来阻断肿瘤细胞促进的、满足其不断增长的营养和氧气需求的血管生成。可以与本公开文本组合的血管生成介导分子或血管生成抑制剂的非限制性例子是可溶性VEGF(VEGF亚型VEGF121和VEGF165，受体VEGFR1、VEGFR2以及共受体神经纤毛蛋白-1和神经纤毛蛋白-2)1和NRP-1、血管生成素2、TSP-1和TSP-2、血管抑素及相关分子、内皮抑素、血管抑制因子、钙网蛋白、血小板因子-4、TIMP和CDAI、Meth-1和Meth-2、IFN-α、IFN-β和IFN-γ、CXCL10、IL-4、IL-12和IL-18、凝血酶原(kringle结构域-2)、抗凝血酶III片段、催乳素、VEGI、SPARC、骨桥蛋白、丝抑蛋白、血管能抑素、增殖蛋白相关蛋白、休眠蛋白以及药物(例如，贝伐单抗、伊曲康唑、羧胺三唑、TNP-470、CM101、IFN-α、血小板因子-4、苏拉明、SU5416、血小板反应蛋白、VEGFR拮抗剂、血管抑制性类固醇+肝素、软骨源性血管生成抑制因子、基质金属蛋白酶抑制剂、2-甲氧基雌二醇、替可加兰(tecogalan)、四硫代钼酸盐、沙利度胺、血小板反应蛋白、催乳素Vβ3抑制剂、三羧氨基喹啉(linomide)、他喹莫德(tasquinimod))。有关综述，参见Schoenfeld和Dranoff2011:Anti-angiogenesis immunotherapy.Hum Vaccin.(9):976-81。
在一些方面，所述另一种抗癌治疗剂是基于病毒的疫苗。存在许多可用的或正在开发的基于病毒的癌症疫苗，其可以与本公开文本的配制品一起用于组合治疗方法中。使用此类病毒载体的一个优点是它们启动免疫应答的内在能力，其中病毒感染(产生免疫激活所必需的危险信号)引起炎症反应发生。理想的病毒载体应该是安全的并且不应引入抗载体免疫应答，以增强抗肿瘤特异性应答。重组病毒(如痘苗病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒和禽痘病毒)已用于动物肿瘤模型中，并且基于其鼓舞人心的结果，已开始进行人体临床试验。特别重要的基于病毒的疫苗是病毒样颗粒(VLP)，即含有来自病毒外壳的某些蛋白质的小颗粒。病毒样颗粒不含有来自病毒的任何遗传物质并且不会引起感染，但是它们可以被构建为在其外壳上呈现肿瘤抗原。VLP可以来源于各种病毒，例如，乙型肝炎病毒或其他病毒家族(包括细小病毒科(例如，腺相关病毒)、逆转录病毒科(例如，HIV)和黄病毒科(例如，丙型肝炎病毒))。有关总体综述，参见Sorensen和Thompsen2007:“Virus-based immunotherapy of cancer:what do we know and where are wegoing？”APMIS115(11):1177-93；抗癌病毒样颗粒综述于以下文献中：Buonaguro等人2011:Developments in virus-like particle-based vaccines for infectious diseasesand cancer.Expert Rev Vaccines 10(11):1569-83；以及Guillén等人2010:Virus-likeparticles as vaccine antigens and adjuvants:application to chronic disease,cancer immunotherapy and infectious disease preventive strategies.Procedia inVaccinology 2(2),128-133。
在一些方面，所述另一种抗癌治疗剂是基于肽的靶向疗法。肽可以与肿瘤周围的细胞表面受体或受影响的细胞外基质结合。如果核素在细胞附近衰变，则附着于这些肽(例如，RGD)的放射性核素最终杀伤癌细胞。特别地，这些结合基序的寡聚体或多聚体引起了极大的兴趣，因为这可以导致肿瘤特异性和亲合力增强。对于非限制性例子，参见Yamada2011:Peptide-based cancer vaccine therapy for prostate cancer,bladder cancer,and malignant glioma.Nihon Rinsho 69(9):1657-61。
在一些方面，本文所述的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)的治疗性应用包括产生编码的IL-12蛋白。因此，在一些方面，本公开文本涉及产生IL-12蛋白的方法。在某些方面，所述方法包括在适于产生编码的IL-12蛋白的条件下，使细胞与本文所述的任何组合物(例如，多核苷酸、载体和/或脂质纳米颗粒)接触。在一些方面，所述方法还包括纯化所产生的IL-12蛋白。在一些方面，所述接触在体内发生(例如，通过向受试者施用所述多核苷酸、载体和/或脂质纳米颗粒)。在一些方面，所述接触离体发生(例如，通过将细胞与所述多核苷酸、载体和/或脂质纳米颗粒一起在体外培养)。包含所述多核苷酸、载体和/或脂质纳米颗粒的细胞(例如，宿主细胞)涵盖在本文中。可以使用的细胞的非限制性例子包括永生杂交瘤细胞、NS/0骨髓瘤细胞、293细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、人羊水来源的细胞(CapT细胞)、COS细胞或其组合。
用于疗法中的试剂盒
本公开文本还提供了用于针对疾病或障碍(如癌症(例如，黑色素瘤、肺癌、结直肠癌或肾细胞癌))的免疫疗法中的和/或治疗或降低疾病或障碍(例如癌症)的风险的试剂盒。在一些方面，所述试剂盒包括包含本文所述的组合物的一个或多个容器。
在一些方面，所述试剂盒包含用于根据本文所述的任何方法使用的说明书。例如，所包含的说明书可以包括对本文所述的药物组合物的施用的描述，以治疗目标疾病、延迟目标疾病发作或减轻目标疾病。在一些方面，所述说明书包括将本文所述的组合物施用于有患目标疾病/障碍(例如，癌症)风险的受试者的描述。
在一些方面，所述说明书包括剂量信息、给药方案和施用途径。在一些方面，所述容器是单位剂量、成批包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。在一些方面，所述说明书是在标签或包装插页(例如，包括在试剂盒中的纸张)上的书面说明。在一些方面，所述说明书是机器可读说明书(例如，在磁存储盘或光存储盘上运载的说明)。
在一些方面，所述标签或包装插页表明本文公开的组合物用于治疗与癌症相关的疾病或障碍(如本文所述的那些)、延迟其发作和/或使其减轻。可以提供用于实践本文所述的任何方法的说明。
在一些方面，本文所述的试剂盒在合适的包装中。在一些方面，合适的包装包括小瓶、瓶、罐、软包装(例如，密封聚酯薄膜(Mylar)或塑料袋)或其组合。在一些方面，所述包装包括用于与特定装置(如吸入器、鼻施用装置(例如，喷雾器)或输注装置(如微型泵))组合使用的包装。在一些方面，所述试剂盒包含无菌进入口(例如，所述容器可以是具有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉溶液袋或小瓶)。在一些方面，所述容器还可以具有无菌进入口(例如，所述容器可以是具有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉溶液袋或小瓶)。在一些方面，至少一种活性剂是如本文所述的组合物。
在一些方面，所述试剂盒还包含另外的组分，如缓冲剂和解释性信息。在一些方面，所述试剂盒包含容器以及在所述容器上或与所述容器相连的标签或一个或多个包装插页。在一些方面，本公开文本提供了包含本文所述试剂盒的内容物的制品。
通用技术
除非另有指示，否则本公开文本的实践将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述技术都在本领域的技术范围内。Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版(Sambrook等人,1989)Cold SpringHarbor Press；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑,1984)；Methods inMolecular Biology,Humana Press；Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis编辑,1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编辑1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998)PlenumPress；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Giffiths和D.G.Newell编辑,1993-8)J.Wiley and Sons；Method of Enzymology(Academic Press,Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑)；GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos编辑,1987)；CurrentProtocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编辑,1987)；PCR:The PolymeraseChain Reaction,(Mullis等人编辑,1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人编辑,1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley andSons,1999)；Immunobiology(C.A.Janeway和P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:a practical approach(D.Catty编辑,IRL Press,1988-1989)；Monoclonal antibodies:a practical approach(P.Shepherd和C.Dean编辑,OxfordUniversity Press,2000)；Using antibodies:a laboratory manual(E.Harlow和D.Lane,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanette和J.D.Capra编辑,Harwood Academic Publishers,1995)。无需进一步详细阐述，相信本领域技术人员可以基于以上描述最大程度地利用本公开文本。将本文引用的所有出版物(包括本公开文本的上文和其他地方列出的那些)通过引用以其整体并入。
实施例
实施例1：编码IL-12S的核苷酸序列的构建
为了构建本文公开的多核苷酸(即，包含编码IL-12蛋白的核酸分子)，使用以下材料和方法：
模板制备
对于复制子RNA，制备了含有有效载荷的VEE复制子载体。使用的VEE复制子载体骨架包括以下修饰中的一种或多种：(i)“A3G”：表示TC-83VEE骨架的5'UTR的变化，所述变化增强表达(参见例如，Kulasegaran-Shylini,R.等人,Virology 287:211-221(2009))；(ii)“+E1”：表示包括VEE“E1”编码区的3'端；(iii)“-E1”：表示不包括VEE“E1”编码区的3'端；(iv)“替代性”：表示VEE复制子骨架序列，描述于例如AddGene目录号58977以及Yoshioka,N.等人,Cell Stem Cell.13(2):246-54(2013)中；(v)“进化的”：表示包括一组被鉴定为增强VEE复制子表达的突变(参见例如，Li,Y.等人,Scientific Reports 9:6932(2019))。
制备此类载体的方法是本领域已知的。如下使用I-SceI进一步将载体质粒线性化。简而言之，将1μg复制子质粒载体用I-SceI在CutSmart缓冲液中在37℃处理1小时。然后，将酶在65℃热灭活20分钟。不同组分的浓度和体积提供于表3(以下)中。
如下制备实施例中使用的另外的载体。通过遵循与VEE载体的I-SceI处理相似的程序和条件，使用MIuI将替代性进化的-E1 SGP疤痕载体线性化。通过遵循与VEE载体的I-SceI处理相似的程序和条件，使用SapI消化A3G+E1(规则端repRNA)。
表3.载体质粒线性化
组分 体积(uL) 浓度
DNA模板 1μg
Cutsmart缓冲液 5 1x
I-SceI 1 5个单位
水 44
对于经修饰的RNA(modRNA)模板，使用复制子质粒生成DNA载体，所述复制子质粒具有含有T7启动子的正向引物(TAA TAC GAC TCA CTA TA ATG GAC TAC GAC ATA GT；SEQID NO:181)和SGP以及3'UTR中的反向引物(GAA ATA TTA AAA ACA AAA TCC GAT TCG GAAAAG AA；SEQ ID NO:185)。正向和反向引物的Tm分别为68℃和64℃。表4和表5(以下)提供了与PCR反应有关的另外的信息。
表4.PCR设置
表5.PCR循环条件
PCR反应中的质粒DNA(模板)被DpnI消化。更具体地，将1μL DpnI/μg初始质粒添加到PCR样品中，并在37℃孵育1小时。
在预铸凝胶上检查PCR(modRNA模板)和I-SceI处理的复制子DNA(repRNA模板)，以确认复制的构建体的纯度(PCR)和完整性(复制子模板)。具体地，将20ng DNA加载到1.2％DNA凝胶上，并在275V下运行7-10分钟。一旦确认，将DNA在20μL的水中洗脱。
体外转录
为了将上述DNA转录成RNA，使用具有本文所述的修饰的HiScribe高产T7试剂盒(New England Biolabs)。对于经修饰的RNA(modRNA)的合成，将试剂盒的UTP组分用N1-甲基假尿苷-5'-三磷酸替代。为了开始体外转录过程，将试剂盒组分在冰上解冻，混合，并在微量离心机(microfuge)中脉冲旋转。将样品放在冰上直至进一步使用。
共转录加帽方法：为了使用帽类似物复制子质粒和modRNA模板进行生产，将表6(以下)中所示的组分混合，在微量离心机中脉冲旋转，然后在37℃在恒温混匀仪(Thermomixer)中以400rpm孵育三小时。出于质量控制的目的，取了1μL等分试样。
表6.共转录加帽组分
组分 体积 最终浓度
无核酸酶水 Xμl
10X反应缓冲液(NEB) 2μl 1X
ATP(100mM) 2μl 10mM最终浓度
GTP(100mM) 2μl 10mM最终浓度
UTP或N1-甲基假UTP(100mM) 2μl 10mM最终浓度
CTP(100mM) 2μl 10mM最终浓度
帽类似物 1μl
模板DNA Xμl 1μg
T7 RNA聚合酶混合物 2μl
SUPERase Inh. 1μl
总反应体积 20μl
转录后酶促加帽方法：除了在IVT之后进行的共转录加帽方法之外，转录后酶促加帽方法也用于在T7启动子中含有末端‘G'的载体。该方法包括在体外转录之后酶促产生‘帽1'mRNA。对于使用酶促复制子质粒进行的生产，在室温下按表7中所示的顺序组装反应。
表7.转录后酶促加帽组分
组分 体积 最终浓度
无核酸酶水 Xμl
10X反应缓冲液 2μl 1X
ATP(100mM) 2μl 10mM最终浓度
GTP(100mM) 2μl 10mM最终浓度
UTP或N1-甲基假UTP(100mM) 2μl 10mM最终浓度
CTP(100mM) 2μl 10mM最终浓度
模板DNA Xμl 1μg
T7 RNA聚合酶混合物 2μl
SUPERase Inh. 1μl
总反应体积 20μl
DNA酶处理：用共转录加帽方法或转录后酶促加帽方法加帽后，使用Turbo DNA酶。由于所述酶在IVT反应中具有活性，因此无需添加10x缓冲液。将反应用无核酸酶水稀释至50μL。然后，将5μL所述酶(2U/μL)添加到20μL IVT反应中。然后，将混合物在37℃孵育30分钟。之后，使用Monarch RNA cleanup试剂盒纯化RNA。出于质量控制的目的，取了1μL等分试样。
加帽和2'-O-甲基化：为了在使用上述转录后加帽方法制成的IVT mRNA的5'端上制备具有2'-O-甲基化(帽1)结构的甲基化鸟嘌呤帽，使用以下方法。首先，将未加帽的RNA和无核酸酶水混合至13μL的最终体积。然后，将混合物在65℃加热5分钟。然后将混合物再放在冰上5分钟。然后，将表8(以下)中提供的组分添加到混合物中，并在37℃孵育60分钟。接下来，使用小Monarch RNA cleanup试剂盒纯化RNA。
表8.加帽和2'-O-甲基化组分
组分 体积
变性的未加帽RNA(来自上文) 13.0μl
10X加帽缓冲液 2.0μl
GTP(10mM) 1.0μl
SAM(4mM，稀释32mM储备液至4mM) 1.0μl
痘苗病毒加帽酶(10U/μl) 1.0μl
mRNA帽2'-O-甲基转移酶(50U/μl) 1.0μl
SUPERase Inh 1.0μl
总计 20uL
聚(a)尾合成：为了将聚(a)尾添加到经修饰的RNA上，将表9(以下)中提供的组分添加到反应管中。然后，将反应在37℃孵育30分钟。然后，通过使用小Monarch cleanup试剂盒直接纯化RNA来停止反应。作为质量控制，在1.2％ RNA凝胶上运行200ng RNA以确认RNA的大小。为此，将RNA用50％甲醛样品缓冲液在65℃变性5分钟，然后立即放在冰上至少一分钟。然后，将变性的RNA加载到凝胶上，并使用透射仪进行可视化。
RNA纯化：从IVT反应杂质中纯化含有聚A的RNA转录物。
表9(以下)提供了在以下实施例中产生并分析的表达IL-12的不同RNA构建体的汇总。构建体#1-#9均具有聚A尾之后的3'端疤痕(即，SGP后用限制酶终止的3'端)。
表9
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实施例2：mRNA组成分析
加帽方法对抗肿瘤功效的比较
为了开始分析上述实施例1中产生的不同RNA构建体，使用小鼠黑色素瘤模型来比较以下各项的抗肿瘤功效：(i)用5'帽类似物(即，表9中的构建体#1)共转录加帽的repRNA，(ii)通过酶促添加5'帽(即，表9中的构建体#2)而转录后加帽的repRNA。简而言之，通过给动物接种B6-F10细胞(经由皮下施用)来诱导黑色素瘤。从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得B16-F10细胞系，并使其在加湿培养箱(37℃和5％ CO2)中在补充有10％胎牛血清、50U/ml青霉素-链霉素和2mM L-谷氨酰胺的DMEM中生长。在约80％汇合时，将细胞在磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)中洗涤，通过在0.25％胰蛋白酶-EDTA中孵育细胞直至分离而从组织培养瓶中收获，在PBS中洗涤两次，并以200万个细胞/ml的浓度重悬于PBS中。将100万个细胞皮下植入从Jackson Laboratory获得的6-8周龄雌性C57BL/6J小鼠的左后腹下方。监测荷瘤小鼠直到肿瘤达到350mm3的平均体积，然后将小鼠随机分组，然后使用27g注射筒通过瘤内注射来递送上述构建体中的任一种。将对照动物用PBS处理。用数字卡尺每周记录三次肿瘤大小，并使用以下公式估算体积：(l×w^2)×0.5，其中l＝肿瘤的长度(最长测量值)，w＝肿瘤的最宽直径(垂直于长度的轴)。
如图1A和图1B所示，与来自其他治疗组的动物相比，用构建体#1(即，使用帽类似物共转录加帽而制成的repRNA)处理的动物具有显著减小的肿瘤体积。与对照组相似，用构建体#2(即，使用酶促翻译后加帽方法制成的repRNA)处理的动物无法控制肿瘤的生长。该数据表明，与构建本文所述的表达IL-12的自我复制构建体时的酶促翻译后加帽方法相比，帽类似物共转录加帽方法更为有利。
VEE复制子骨架对抗肿瘤功效的比较
接下来，为了评估实施例1中所述的不同VEE复制子骨架是否对mRNA构建体的治疗功效有任何影响，再次使用上述黑色素瘤小鼠模型。一旦达到最佳肿瘤大小，则使动物接受以下各项之一的瘤内单次注射：(i)PBS；(ii)使用A3G+E1载体和帽类似物共转录加帽而制成的repRNA(表9中的“构建体#3”)；(iii)使用帽类似物共转录加帽而制成的经修饰的mRNA(非自我复制)(表9中的“构建体#5”)；(iv)使用替代性进化的载体和帽类似物共转录加帽而制成的repRNA(表9中的“构建体#6”)；以及(v)使用替代性进化的载体和酶促翻译后加帽而制成的repRNA(表9中的“构建体#7”)。然后，在施用后第3天评估肿瘤中IL-12蛋白的表达。还评估了经治疗的动物的存活率。
如下进行组织(例如，肿瘤)中IL-12蛋白的定量。解剖组织(例如，在施用后72小时)，称重，快速冷冻，随后在放射免疫沉淀测定缓冲液中裂解。根据制造商(BioLegend)的方案，使用针对鼠IL-12的p70亚基的可商购夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)来确定组织裂解物中IL-12蛋白的浓度。
如图2所示，与接受构建体#5或构建体#6的动物相比，在接受构建体#3(即，使用A3G+E1载体和帽类似物共转录加帽而制成的repRNA)的动物中肿瘤递送位点中的IL-12表达更高。与表达数据一致，用构建体#3(即，使用A3G+E1载体和帽类似物共转录加帽而制成的repRNA)治疗的动物展现最大存活率(参见图3)。
转染效率和IL-12分泌的比较
为了进一步分析实施例1中所述的不同RNA构建体，在体外评估转染效率和IL-12分泌。简而言之，在转染前一天，将B16.F10细胞(100,000个细胞/孔)分配到24孔板中。然后根据制造商的说明，使用Lipofectamine messengerMAX转染细胞。简而言之，用每孔1.5uLLipofectamine试剂转染100ng总RNA，并孵育至所需时间点(即，转染后24和48小时)。测试的具体RNA构建体包括以下：(i)使用A3G+E1载体和帽类似物共转录加帽而制成的repRNA(表9中的“构建体3”)；(ii)使用A3G+E1载体和酶促翻译后加帽而制成的repRNA(表9中的“构建体#4”)；(iii)使用替代性进化的+E1载体和帽类似物共转录加帽而制成的repRNA(表9中的“构建体#5”)；(iv)使用替代性进化的+E1载体和酶促翻译后加帽而制成的repRNA(表9中的“构建体#6”)；(v)使用替代性+E1载体和帽类似物共转录加帽而制成的repRNA(表9中的“构建体#7”)；(vi)使用A3G+E1进化的载体和帽类似物共转录加帽而制成的repRNA(表9中的“构建体#8”)；(vii)使用A3G-E1载体和帽类似物共转录加帽而制成的repRNA(表9中的“构建体#9”)；以及(viii)使用替代性进化的-E1 SGP疤痕端载体而制成的repRNA(表9中的“构建体#10”)。
为了评估RNA构建体的转染效率，使用FACS分析来测量细胞中的IL-12表达。简而言之，通过使用100uL胰蛋白酶将细胞胰蛋白酶化来建立高尔基体转运阻断式孵育。接下来，添加具有布雷菲德菌素A的完全培养基，然后将细胞转移到96孔深孔测定板上。然后将板用石蜡膜(parafilm)覆盖，并将细胞在细胞培养箱中在具有布雷菲德菌素A的完全培养基中孵育4小时。通过以5',400g减速旋转细胞来进行区分死细胞的染色。将细胞在PBS中洗涤，随后转移到V形底96孔板中，然后将其以400x g离心。然后将细胞重悬在稀释于PBS中的Zombie Live/Dead绿色染料中，并在室温在黑暗中孵育10分钟。然后将细胞在FACS缓冲液中洗涤，所述缓冲液包含1X PBS(不含Ca2+和Mg2+)、2mM EDTA、2％BSA和0.1％叠氮化钠。然后通过将细胞重悬于固定缓冲液中来固定细胞，并在室温在黑暗中孵育30分钟。
如下使细胞透化并进行细胞质蛋白染色。将细胞在透化/洗涤缓冲液中洗涤并以800x g离心。将细胞重悬于细胞质抗体混合物中，并在室温在黑暗中孵育。将细胞在透化/洗涤缓冲液中洗涤并以800x g离心，然后用FACS缓冲液洗涤并800x g离心。然后通过将细胞重悬于FACS缓冲液中来制备用于进行流式细胞术的样品。上通过使用Attune流式细胞仪上的红色和蓝色激光对细胞进行FACS分析。在门控细胞碎片和双峰后，在细胞计数器的2个通道上分析单个细胞并对其门控以定量IL-12阳性细胞的百分比。随后将结果绘制在Prism中。
为了测量IL-12分泌，使用了ELISA测定。简而言之，收集细胞培养物的上清液，以随后对各种不同的目的蛋白进行基于ELISA的分析。对于每个上清液样品时间点，将来自适当孔的细胞培养物上清液吸入96孔深孔板中，所述孔板可以在-80℃储存以备将来使用。在收集所有所需物时间点之后，将含有上清液样品的96孔板以500g离心5分钟，以沉淀任何剩余的细胞。离心后，在不干扰细胞沉淀的情况下，将约350-400uL上清液从板吸进新的深孔板中。然后稀释上清液，并在针对小鼠IL-12或人IL-12的ELISA测定中，根据制造商的说明，使用Invitrogen ELISA试剂盒(即，Invitrogen小鼠IL-12p70未包被ELISA试剂盒和Invitrogen人IL-12p70未包被ELISA试剂盒)进行测试。采集ELISA测定数据后，使用4PL方法在Prism中绘制标准曲线，并对所有样品的浓度数据进行内插。
如图4A和图4B所示，与替代性、进化的、-E1构建体或组合相比，A3G和+E1载体构建体通常表现更好。此外，与较早的数据一致，与酶促加帽的构建体相比，帽类似物构建体通常表现更好。此外，在24和48小时，A3G+E1 repRNA(构建体#3)在IL12表达和总蛋白分泌方面比其他测试的repRNA构建体表现更好(分别参见图4A和图4B)。
“规则”和“疤痕”3'端终止的比较
接下来，将具有以“规则”聚A序列终止的3'端的自我复制mRNA的转染效率与具有以限制酶“疤痕”终止的3'端的mRNA的转染效率进行比较。简而言之，如上所述，使用以下构建体转染细胞：(i)使用帽类似物共转录加帽方法和具有以限制酶疤痕终止的3'端的A3G+E1载体制成的repRNA(表10中的“构建体#12”；圆形和正方形)；(ii)使用帽类似物共转录加帽方法和具有以规则聚A序列终止的3'端的A3G+E1载体制成的repRNA(表10中的“构建体#13”；三角形和倒三角形)。然后，如上所述使用FACS分析来评估细胞中的IL-12表达。
如图5所示，以规则聚A序列终止的3'端改善了体外表达。
实施例3：脂质纳米颗粒(LNP)配制品
在本实施例中，制备并分析了包封在LNP配制品中的复制型mRNA，所述LNP配制品包含阳离子脂质、磷脂和PEG脂质以及胆固醇，所述LNP配制品包含阳离子脂质和磷脂以及胆固醇(其中将PEG-脂质胶束作为独立组分而不是LNP本身的一部分添加到溶液中)。所评价的mRNA包括mCherry复制型mRNA，如下：1.TT3-DMG(A3G+E1骨架)；和2.TT3-PEG后(postPEG)胶束(A3G+E1骨架)。
为了制备常规TT3 LNP配制品，使用以下程序。将脂质材料各自称重并溶解于乙醇中。通过根据下表10中的成分重量比混合所有脂质材料来制备乙醇相。通过用20mM柠檬酸盐缓冲液(pH 4.0)、300mM NaCl和水稀释纯化的JK001 mCherry repRNA来制备水相，使得盐的最终组成为10mM柠檬酸盐缓冲液(pH 4.0，150mM NaCl)。通过以3:1(水相:乙醇相)的流速比进行T形结点混合来混合LNP的乙醇相和水相而得到常规TT3LNP。
表10
TT3 LNP组成成分 重量比
mRNA 1.0
TT3 10.0
DOPE 8.0
胆固醇 5.6
DMG-PEG-2K 0.7
为了制备PEG后胶束TT3 LNP配制品，使用以下程序。将脂质材料各自称重并溶解于乙醇中。通过根据下述成分重量比(参见例如，表11a)混合除DMG-PEG-2K之外的所有脂质材料(即，TT3、DOPE和胆固醇)来制备乙醇相。通过用20mM柠檬酸盐缓冲液(pH 4.0)、300mMNaCl和水稀释纯化的JK001 mCherry repRNA(即，mRNA)来制备水相，使得盐的最终组成为10mM柠檬酸盐缓冲液(pH 4.0，150mM NaCl)。通过将相应体积的DMG-PEG-2K添加到TBS缓冲液中并经由涡旋充分混合来制备PEG胶束相。最后，通过以下方式得到PEG后胶束TT3 LNP：首先以3:1(水相:乙醇相)的流速比进行T形结点混合来混合LNP的乙醇相和水相，然后经由以1:1(LNP相:PEG相)的流速比进行T形结点混合而立即用PEG胶束相进行管内稀释。PEG后胶束TT3 LNP的最终脂质组成描述于表11b中。
表11a
表11b
TT3 LNP组成成分 重量比
mRNA 1.0
TT3 10.0
DOPE 8.0
胆固醇 5.6
DMG-PEG-2K 4.2
将上述TT3 LNP配制品如下进行缓冲液交换和冷冻/解冻。将获得的TT3 LNP转移到透析盒中，并在TBS缓冲液中透析2小时。将在TBS储备溶液中的40％蔗糖(W/V)添加到所有制备的TT3 LNP中，以制成TT3 LNP在10％蔗糖中的最终溶液。通过用2％ TE+Triton解离LNP来测量LNP的最终RNA浓度，并进一步用Qubit测定法进行检测。将TT3LNP等分分成50μl/管等分试样，并置于-80℃冷冻。在用LNP处理细胞之前，将TT3 LNP在室温下解冻。
实施例4：体内小鼠IL-12变体分析
在本实施例中，进行测定以评价B16.F10小鼠同系癌症模型中的各种不同小鼠IL-12变体。简而言之，经由瘤内施用RNA构建体来治疗动物，所述RNA构建体编码以下小鼠IL-12蛋白之一：(i)单独的mIL-12；(ii)与白蛋白缀合的mIL-12；以及(iii)与白蛋白和光蛋白聚糖缀合的mIL-12。将RNA构建体以0.25μg或2.5μg的剂量施用于动物。然后，在施用后第1、4和/或7天，使用基于ELISA的测定在以下组织中的一种或多种中测量IL-12和/或IFN-γ的浓度：肿瘤、血清、脾脏、引流淋巴结和非引流淋巴结。
如图6A和图6C所示，在施用后第1天，肿瘤中IL-12蛋白的浓度在不同动物之间是相当的，其中在用编码与白蛋白和光蛋白聚糖缀合的mIL-12的RNA构建体治疗的动物中有适度的降低。在血清(图6B)、脾脏(图7A)、引流淋巴结(图7B)和非引流淋巴结(图7C)中观察到类似的结果。在施用后第4天，用2.5μg编码单独的mIL-12的RNA构建体治疗的动物具有肿瘤中最高的IL-12表达水平(参见图6C)。在分析的其他组织中，IL-12表达水平更加相当，其中在用编码与白蛋白缀合的mIL-12的RNA构建体治疗的动物中观察到稍高的水平(参见图6D、图8A、图8B、图8C和图9A)。IFN-γ的表达水平在用编码与白蛋白缀合的mIL-12的RNA构建体治疗的动物中也是最高的(图9B)。
实施例5：人IL-12密码子优化
在本实施例中，如下优化人IL-12密码子。通过算法产生了编码融合蛋白即人轻链前导序列-hIL12p40-GGS(GGGS)3接头-hIL12p35-GSGGGS接头-人血清白蛋白的20301个不同序列。密码子最优性计算为使用给定编码序列中的每个密码子来编码标准人转录组中给定氨基酸的平均频率。鉴定了1137个代表性序列，并通过ViennaRNA-2.4.14计算了它们的最小折叠自由能(MFE)。具有低、中和高密码子最优性和MFE的代表性序列(L1、L2、L3；M1、M2、M3；H1、H2、H3)被修饰为含有相同的轻链接头并能够进行高效的商业合成和组装，并且对它们进行实验测试。该算法还生成了含有针对每个氨基酸的最常用密码子的序列(CO)。通过相关算法生成了单独的序列(CP)，其含有一组最常用的密码子对。
图10呈现了对于编码融合蛋白即人轻链前导序列-hIL12p40-GGS(GGGS)3接头-hIL12p35-GSGGGS接头-人血清白蛋白的1137个不同序列，最优性相关的数据(平均_密码子_得分)与以kcal/mol计的最小折叠自由能(MFE)的关系。在每个位置处含有最常用的三联体的密码子最优(“CO”)序列显示为三角形。与CO具有>90％和>90％同一性的序列分别显示为深灰色点和浅灰色点。使用圆形符号显示具有低、中和高密码子最优性和MFE的代表性序列(L1、L2、L3；M1、M2、M3；H1、H2、H3)。具有很高密码子最优性和MFE的代表性序列显示为菱形，并且未对其进行实验测试。初步筛选表明，高度结构化和经常使用的密码子给出repRNA的高表达。
在人TNBC细胞系的体外表达测定中，测量了编码hIL-12(A1-A4)、hIL12-白蛋白(B1-B4)和hIL12-白蛋白-光蛋白聚糖(C1-C3)的自我复制变体mRNA的IL-12表达水平。测试了这些构建体中的每一个的IL-12、IL-12-alb和IL-12-alb-lum版本。经由TT3-LNP转染人TNBC BT20细胞，并孵育20小时，之后通过基于ELISA的测定进行表达水平的测量。
图11呈现了在经由TT3-LNP转染到BT-20细胞后20小时，与编码hIL-12(A1-A4)、hIL12-白蛋白(B1-B4)和hIL12-白蛋白-光蛋白聚糖(C1-C3)的自我复制变体mRNA的IL-12表达水平相关的数据。单独的一式三份的测量显示为三角形、正方形、八角形或圆形点，并且水平条显示一式三份的测量的平均值。在随后的TNBC PDX小鼠实验中使用最佳表达的构建体。简而言之，如下进行患者源性异种移植物(PDX)实验：PDX最初是从TNBC(ER、PR、HER2阴性乳腺癌)患者的刚刚手术切除的肿瘤中确定的。将肿瘤标本机械解离成小碎片，与基质胶溶液混合，并将其作为固体碎片使用套管针手术植入NOD.Cg-Prkdc-scid Il2rg-tm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠的皮肤下。在实验开始之前，使PDX组织在体内连续传代。对于所述实验，将PDX肿瘤碎片皮下移植到NSG小鼠中，并在肿瘤达到200-350mm3的平均大小时随机分组。随机分组后立即用指定药剂治疗小鼠，并在24小时后收集血清、脾脏和肿瘤。通过基于ELISA的测定来确定血清、脾脏裂解物和肿瘤裂解物中的人IL-12浓度。
如图12A-图12C所示，在分析的不同组织(肿瘤、血清和脾脏)中，用编码单独的人IL-12(即，不与白蛋白和/或光蛋白聚糖缀合)的mRNA构建体治疗的动物展现最高的IL-12表达水平。这些结果证明了上述密码子优化策略的有效性。
实施例6：乳腺癌小鼠模型的剂量效应分析
再按照以上提供的实施例4，在乳腺癌动物模型中评估本文提供的IL-12构建体的抗肿瘤作用。简而言之，通过给动物接种4T1细胞(经由在乳房脂肪垫中施用)来诱导三阴性乳腺癌(TNBC)。一旦肿瘤达到最佳大小(约150mm3)，则将以下各项之一注射到动物的原发性肿瘤中：(i)媒介物对照；(ii)5ug的编码IL-12的自我复制mRNA(repRNA-IL12)；(iii)0.5ug的编码IL-12的自我复制mRNA(repRNA-IL12)；(iv)0.05ug的编码IL-12的自我复制mRNA(repRNA-IL12)。动物每周接受总共4个剂量。然后，在治疗后的多个时间点评估肿瘤体积。
如图13所示，在repRNA-IL12治疗的动物中，在研究的持续时间内存在对原发性肿瘤生长的剂量依赖性抑制，导致在研究结束时原发性肿瘤的大小减少大约50％。这些结果证实本文公开的自我复制mRNA构建体(例如，编码IL-12)在治疗各种癌症(包括侵袭性乳腺癌和免疫疗法抗性乳腺癌)中是有效的。
实施例7：包含经修饰的核苷三磷酸的IL-12构建体的抗肿瘤作用分析
接下来，为了评估将不同比例的经修饰的核苷三磷酸(modNTP)掺入本文所述的自我复制mRNA中是否对mRNA构建体的治疗功效有任何影响，使用上述TNBC小鼠模型(参见实施例6)。一旦达到最佳肿瘤大小，则动物每周接受以下各项之一的瘤内注射：(i)PBS(媒介物对照)；(ii)5ug用0％modNTP制成的repRNA；(iii)5ug用25％modNTP制成的repRNA；(iv)5ug用37.5％modNTP制成的repRNA；(v)5ug用50％modNTP制成的repRNA。然后在治疗后的多个时间点评估肿瘤体积。
如图14所示，用不同的经修饰的repRNA IL-12构建体治疗的动物与用未修饰的repRNA构建体治疗的动物表现相似(无论量如何)。该数据表明，添加modNTP对repRNA构建体控制肿瘤生长的功效的影响有限。
实施例8：黑色素瘤小鼠模型的远位效应分析
为了评估编码IL-12的repRNA(例如，本文所述)诱导抑制远端未治疗肿瘤病变生长的全身性抗肿瘤免疫应答的能力，使用实施例4中所述的小鼠黑色素瘤模型的改良版。简而言之，为了诱导两个单独的原发性黑色素瘤肿瘤形成，将1x 106个B16-F10细胞皮下植入动物的左后腹，而同时将2x 105个B16-F10细胞植入右后腹。一旦达到最佳肿瘤大小，则动物仅在左腹肿瘤中接受以下各项的瘤内单次注射：(i)PBS(媒介物对照)；和(ii)2.5ug的编码IL-12的repRNA。通过在治疗后的多个时间点测量治疗的(左腹)和未治疗的(右腹)肿瘤的肿瘤体积来评估肿瘤生长。
如图15A和图15B所示，瘤内递送的编码IL-12的repRNA能够控制治疗的肿瘤和未治疗的远端肿瘤的生长。这些数据表明，编码IL-12的repRNA的局部递送可能是转移性癌症的有效疗法。
实施例9：重复给药后有效载荷表达的分析
为了评价本文所述的mRNA构建体的重复给药能力，再次使用实施例6中所述的TNBC小鼠模型。简而言之，将编码报告基因萤火虫萤光素酶的mRNA构建体通过瘤内注射而递送，5ug每周一次，总共递送两个剂量。在一些组中，通过腹膜内注射向动物每周两次共施用10mg/kg小鼠抗IFNAR1抗体(克隆MAR1-5A3)，以抑制IFN-a的活性。在每次给药mRNA构建体24小时后，通过腹膜内注射，动物接受150mg/kg D-萤光素(底物，其通过萤火虫萤光素酶转化为发光信号)，并使用体内成像系统对肿瘤进行实时成像。施用底物后10分钟，对相对生物发光进行定量。
如图16所示，与第一次给药相比，在第二次给药后观察到有效载荷表达稍微降低。当通过抗体阻断抑制了IFN-α受体的活性时，挽救了第二次给药后的有效载荷表达。这些数据表明，本文所述的mRNA构建体可以重复给药，并且在重复给药后观察到的降低的有效载荷表达至少部分地取决于干扰素诱导类型，并且可以通过IFN受体抗体阻断来克服。
实施例10：人PBMC的离体活性分析
为了进一步证明本文提供的IL-12构建体的活性，用编码IL-12的repRNA转染人TNBC细胞系BT20。约24小时后，收集上清液(“条件培养基”)，并使用人IL-12ELISA(Invitrogen)评估IL-12水平。根据IRB批准的方案和制造商的建议(StemCelltechnologies)，从健康人供体的白细胞单采术产物中分离人外周血单个核细胞(PBMC)。将PBMC中的T细胞用IL-2(10ng/mL)和抗CD3/CD28/CD2抗体混合物(StemCell technologies)激活2天。激活后，洗涤培养基，并将细胞用条件培养基(包含已知浓度的hIL12(1或10ng/mL))处理24小时。作为阳性对照，将PBMC用指定浓度的不同剂量(0.01、0.1、1、10或100ng/mL)的重组hIL12(rhIL12)(StemCell technologies)处理相同的持续时间。已知IL-12激活PBMC内的T细胞和NK细胞，这导致干扰素-γ(IFN-g)的产生，其可以从上清液中检测到。从PBMC中收集上清液，并对其进行IFN-g ELISA(Invitrogen)以测定其水平。
如图17所示，本文所述的repRNA构建体能够诱导有效的IL-12产生，进而能够诱T细胞和NK细胞的激活以及随后的IFN-γ产生。以上结果进一步证实了本文所述的IL-12构建体的活性。
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<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<213> 人工序列
<220>
<223> L1 构建体
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<211> 3390
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> CP 构建体
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<211> 3393
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> vH1 构建体
<400> 12
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gagttcaagc ccctggtgga ggagccccag aacctgatca agcagaactg cgagctgttc 2820
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<211> 3393
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> vH2 构建体
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tgctggtggc tgaccaccat cagcaccgac ctgaccttca gcgtgaagag cagcagaggc 480
agcagcgacc cccagggcgt gacatgcggc gccgccaccc tgagcgccga gagagtgaga 540
ggcgacaaca aggagtacga gtacagcgtg gagtgccagg aggactccgc ttgccccgcc 600
gccgaggaga gcttgcccat cgaggtgatg gtggacgccg tgcacaagct caagtacgaa 660
aactacacca gcagcttctt catcagagac atcatcaagc ccgacccccc caagaacctg 720
cagctgaagc ccctgaaaaa cagcagacag gtggaggtga gctgggagta ccccgacacc 780
tggagcaccc cccacagcta cttcagcctg accttctgcg tgcaggtgca gggaaaaagc 840
aagagagaga agaaggacag agtgttcacc gacaagacca gcgccaccgt gatctgcaga 900
aagaacgcca gcatctccgt gagagcccag gacagatact acagcagcag ctggagcgag 960
tgggccagcg tgccctgtag cggcggcagc ggcggcggca gcggcggcgg cagcggcggc 1020
ggcagcagaa acctgcccgt ggccaccccc gaccccggca tgttcccctg cctgcaccac 1080
agccagaacc tgctgagagc cgtgagcaac atgctgcaga aggccagaca gaccctggag 1140
ttctacccct gcaccagcga ggagatcgac catgaggaca tcaccaagga caagaccagc 1200
accgtggagg cctgcctgcc cctggagctg accaagaacg aaagctgcct gaacagcaga 1260
gagaccagct tcatcaccaa cggcagctgt ctggcctcaa gaaagaccag ctttatgatg 1320
gccctgtgcc tgtctagcat ctacgaggat ctgaagatgt accaggtgga gttcaagacc 1380
atgaacgcca agctgctgat ggaccccaag agacagatct tcctggacca gaacatgtta 1440
gccgtgattg acgagctgat gcaggccctg aacttcaata gcgagaccgt gccccagaaa 1500
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gccttcagaa tcagagccgt aaccatcgac agagtgatga gctacctgaa cgccagtggc 1620
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gaggagaact tcaaggccct ggtcctgatc gccttcgccc agtacctgca gcagtgcccc 1740
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accgtggcca ccctgagaga aacctacggg gagatggccg actgctgcgc aaagcaggag 1920
cccgagcgaa acgagtgctt cctgcagcac aaggacgaca accccaactt gcccagactg 1980
gtaagacccg aggtggacgt catgtgcacc gctttccacg acaacgagga gaccttcctg 2040
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ttcttcgcca agcgctacaa ggccgccttc accgagtgct gccaggccgc cgacaaggcc 2160
gcctgcctgc tccccaagct ggacgagctg agagacgaag gcaaggccag cagcgccaag 2220
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gacagagccg acctggccaa gtacatctgc gagaaccagg atagcatcag cagcaagctg 2460
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tgcaagaact acgccgaggc caaggacgtg ttcctgggca tgttcctgta cgagtacgcc 2640
agaagacacc ccgactacag cgtggtgctg ctgctgagac tggccaagac ctacgagact 2700
acccttgaga agtgctgcgc cgccgccgac ccacatgagt gctacgccaa ggtgttcgac 2760
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gagcagctgg gcgagtacaa gttccagaac gcccttctgg tgagatacac caagaaggtg 2880
cctcaggtga gcacccccac ccttgtggag gtgagcagaa acctcggcaa ggtgggcagc 2940
aagtgctgca agcatccaga ggccaagaga atgccctgcg ccgaggacta cctgagcgtg 3000
gtgctgaacc agctgtgcgt gctgcacgag aaaactcccg tgagcgacag agtgaccaag 3060
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gagaagtgct gcaaggccga cgacaaagag acctgcttcg ccgaggaggg caagaagctt 3360
gtggccgcca gccaggccgc cctgggcctg tag 3393
<210> 14
<211> 3393
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> vH3 构建体
<400> 14
atgagagtgc ccgcccagct tctgggcctg ctgctgctgt ggctgcccgg cgccagatgc 60
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ctgctgctgc acaagaagga ggacggcatc tggagcaccg acatcctgaa ggaccagaag 360
gagcctaaga acaagacctt cctgagatgt gaggccaaga actacagcgg cagattcacc 420
tgctggtggc tgaccaccat cagcaccgat ctgaccttca gcgtgaagag cagcagaggc 480
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gccgaggaga gcctgcccat cgaggtgatg gtggacgccg tgcataagct gaagtacgag 660
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cagctgaagc cactgaagaa cagcagacag gtggaggtga gctgggagta ccccgacacc 780
tggagcaccc cccacagcta cttcagcctg accttctgcg tgcaggtgca gggcaagagc 840
aagagagaga agaaggaccg ggtgttcacc gacaagacca gcgccactgt gatctgcaga 900
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cagagactga agtgcgccag cctgcagaag ttcggcgaga gagcctttaa ggcctgggcc 2280
gtggccagac tgagccagag attccccaag gccgagttcg ccgaagtgag caagctggtg 2340
accgacctga cgaaggtgca caccgagtgc tgccacggcg acctgctgga gtgcgccgac 2400
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agaagacacc ccgactacag cgtggtgctg ctgctgagac tggccaagac ctacgagacc 2700
accctggaga agtgctgcgc cgccgccgac ccccacgagt gctacgccaa ggtgttcgac 2760
gagttcaagc ccctggtgga ggagccccag aacctgatca agcagaactg cgaactgttc 2820
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acctacgtgc ccaaggagtt caacgccgag acattcacct tccacgccga tatctgcacc 3180
ctgagcgaga aggagagaca gatcaagaag cagaccgccc tggtggagct ggtgaagcac 3240
aagcccaagg ccaccaagga gcagttgaag gccgtgatgg acgacttcgc cgccttcgtg 3300
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gtggccgcca gccaggccgc cctgggcctg tag 3393
<210> 15
<211> 1617
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A1 构建体
<400> 15
atgagggtcc ccgctcagct cctggggctc ctgctgctct ggctcccagg tgcacgatgt 60
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gagcccaaga acaagacctt tctgagatgt gaggccaaaa actactctgg acgcttcacc 420
tgttggtggc tgaccaccat cagcacagac ctgaccttct cggtgaagtc tagtaggggc 480
agcagtgacc cccagggcgt aacatgcggc gccgctaccc tgagcgccga gagagtgaga 540
ggcgataaca aggagtacga gtactccgtg gagtgccaag aggactcagc ctgccccgcc 600
gccgaggagt cgctgcccat cgaggtgatg gtggatgcag tgcacaagct gaagtacgag 660
aactacacca gtagcttttt catcagagat atcattaaac ccgaccctcc caagaacctg 720
cagctgaagc ccttaaagaa cagccggcag gtggaagtgt catgggagta cccagacacc 780
tggagcactc cgcacagcta cttcagcctg accttctgcg ttcaggtgca gggaaaaagc 840
aagagagaga agaaagacag agtgttcacc gacaagacca gcgcaaccgt gatctgtaga 900
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<210> 16
<211> 1614
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A2 构建体
<400> 16
atgagggtcc ccgctcagct cctggggctc ctgctgctct ggctcccagg tgcacgatgt 60
gccatctggg aactgaagaa ggacgtctac gtggtggagc tggattggta ccccgacgcc 120
cccggcgaga tggtcgtgct gacctgtgac acccctgagg aggacggaat cacatggacc 180
ctggaccaga gcagcgaagt gttgggcagc ggcaagaccc tgaccatcca agtgaaggaa 240
ttcggcgacg cgggccagta tacttgccac aagggcgggg aggttctgag ccacagcctg 300
ctgctgctcc acaagaaaga ggatggcatc tggtctaccg acatcctgaa ggaccaaaag 360
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tgctggtggc tgaccacaat ctccaccgac ctgaccttca gcgtgaaaag cagccgcggc 480
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ggcgataata aggaatacga gtacagcgtg gagtgccagg aagactcagc ctgccccgcc 600
gcagaagaaa gtctgccaat agaggtgatg gttgacgccg tgcacaagct aaagtacgag 660
aactacacca gcagcttctt tatccgggac atcatcaagc cagatccccc caagaacctg 720
cagcttaagc ccctgaagaa cagcagacag gtggaggtgt catgggaata ccccgacacc 780
tggagcaccc cccatagcta cttctcactg accttctgcg tgcaggtgca gggcaagagc 840
aagagagaga agaaggatag ggtattcacg gacaagacct cagccaccgt gatctgccga 900
aagaacgcca gcatcagcgt gagagcccag gacagatact atagctcctc gtggagcgag 960
tgggccagcg taccttgcag cggcgggagc ggcggcggca gcggaggtgg cagtggcgga 1020
ggcagcagaa acctccccgt ggcaacccct gaccccggga tgtttccttg cctgcaccac 1080
tcccagaacc tcctgagagc cgtgtccaac atgctgcaga aagccagaca gaccctcgag 1140
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acagtggaag cctgcctccc gctggagctg actaagaacg agagctgtct gaacagcagg 1260
gagaccagct tcatcaccaa cggcagctgc ctggcgagca gaaaaacctc ctttatgatg 1320
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gccttcagaa tcagagcggt gacgatcgac agagtcatga gctacctcaa cgct 1614
<210> 17
<211> 1617
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A3 构建体
<400> 17
atgagggtcc ccgctcagct cctggggctc ctgctgctct ggctcccagg tgcacgatgt 60
gccatctggg agctgaagaa ggacgtgtac gtggtggagc tggactggta ccccgacgcc 120
cccggcgaga tggtggtgct gacctgcgac acccccgagg aggacggcat cacctggacc 180
ctggaccaga gcagcgaggt gctgggcagc ggcaagaccc tgaccatcca ggtgaaggag 240
ttcggcgacg ccggccagta cacctgccac aagggcggcg aggtgctgag ccacagcctg 300
ctgctgctgc acaagaagga ggacggcatc tggagcaccg acatcctgaa ggaccagaag 360
gagcccaaga acaagacctt cctgagatgc gaggccaaga actacagcgg cagattcacc 420
tgctggtggc tgaccaccat cagcaccgac ctgaccttca gcgtgaaaag cagcagaggc 480
agcagcgacc cccagggcgt gacctgcggc gccgccaccc tgagcgccga gagagtgaga 540
ggcgacaaca aggagtacga gtacagcgtg gagtgccagg aggacagcgc ctgccccgcc 600
gccgaggaga gcctgcccat cgaggtgatg gtggacgccg tgcacaagct gaagtacgag 660
aactacacca gcagcttctt catcagagac atcatcaagc ccgacccccc caagaacctg 720
cagctgaagc ccctgaagaa cagcagacag gtggaggtga gctgggagta ccccgacacc 780
tggagcaccc cccacagcta cttcagcctg accttctgcg tgcaggtgca gggcaagagc 840
aagagagaga agaaggacag agtgttcacc gacaagacca gcgccaccgt gatctgcaga 900
aagaacgcca gcatcagcgt gagagcccag gacagatact acagcagcag ctggagcgag 960
tgggccagcg tgccctgcag cggcggcagc ggcggcggca gcggcggcgg cagcggcggc 1020
ggcagcagaa acctgcccgt ggccaccccc gaccccggca tgttcccctg cctgcaccac 1080
agccagaacc tgctgagagc cgtgagcaac atgctgcaga aggccagaca gaccctggag 1140
ttctacccct gcaccagcga ggagatcgac cacgaggaca tcaccaagga caagaccagc 1200
accgtggagg cctgcctgcc cctggagctg accaagaacg agagctgcct gaacagcaga 1260
gagaccagct tcatcaccaa cggcagctgc ctggccagca gaaagaccag cttcatgatg 1320
gccctgtgcc tgagcagcat ctacgaggac ctgaagatgt accaggtgga gttcaagacc 1380
atgaacgcca agctgctgat ggaccccaag agacagatct tcctggacca gaacatgctg 1440
gccgtgatcg acgagctgat gcaggccctg aacttcaaca gcgagaccgt gccccagaaa 1500
agcagcctgg aggagcccga cttctacaag accaagatca agctgtgcat cctgctgcac 1560
gccttcagaa tcagagccgt gaccatcgac agagtgatga gctacctgaa cgccagc 1617
<210> 18
<211> 1617
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A4 构建体
<400> 18
atgagggtcc ccgctcagct cctggggctc ctgctgctct ggctcccagg tgcacgatgt 60
gccatctggg agctgaagaa ggatgtgtat gtggtggagc tggactggta cccagatgcc 120
cctggagaga tggtggtgct gacctgtgac accccagagg aggatggcat cacctggacc 180
ctggaccaga gcagcgaggt gctgggcagc ggcaagaccc tgaccatcca ggtgaaggag 240
tttggagatg ctggccagta cacctgccac aagggcgggg aggtgctgag ccacagcctg 300
ctgctgctgc acaagaagga ggatggcatc tggagcacag acatcctgaa ggaccagaag 360
gagcccaaga acaagacctt cctgcgctgt gaggccaaga actacagcgg ccgcttcacc 420
tgctggtggc tgaccaccat cagcacagac ctgaccttct ctgtgaaaag cagccggggc 480
agcagtgacc cccagggcgt gacctgtggg gccgccaccc tgtctgctga gcgggtgcgg 540
ggggacaaca aggagtatga gtacagcgtg gagtgccagg aggacagcgc ctgcccagct 600
gctgaggaga gcctgcccat cgaggtgatg gtggatgctg tgcacaagct gaagtatgag 660
aactacacca gcagcttctt catccgggac atcatcaagc cagacccccc caagaacctg 720
cagctgaagc ccctgaagaa cagccggcag gtggaggtgt cctgggagta cccagacacc 780
tggagcaccc cccacagcta cttcagcctg accttctgtg tgcaggtgca gggcaagagc 840
aagcgggaga agaaggacag agtcttcaca gacaagacca gcgccaccgt catctgcagg 900
aagaatgcca gcatctctgt gcgggcccag gaccgctact acagcagctc ctggagcgag 960
tgggcctctg tgccctgcag cggcggcagc ggcggcggca gcggcggcgg cagcggcggc 1020
ggcagcagga acctgcctgt ggccacccca gaccccggca tgttcccctg cctgcaccac 1080
agccagaacc tgctgcgggc tgtgagcaac atgctgcaga aggcccggca gaccctggag 1140
ttctacccct gcaccagcga ggagattgac cacgaggaca tcaccaagga caagaccagc 1200
acagtggagg cctgcctgcc cctggagctg accaagaatg aaagctgcct gaacagccgg 1260
gagaccagct tcatcaccaa cggcagctgc ctggccagca ggaagaccag cttcatgatg 1320
gccctgtgcc tgagcagcat ctatgaggac ctgaagatgt accaggtgga gttcaagacc 1380
atgaatgcca agctgctgat ggaccccaag aggcagatct tcctggacca gaacatgctg 1440
gccgtgattg atgagctgat gcaggccctg aacttcaaca gcgagaccgt gccccagaaa 1500
agcagcctgg aggagccaga cttctacaag accaagatca agctgtgcat cctgctgcac 1560
gccttccgca tccgggctgt gaccatcgac agagtgatga gctacctgaa tgccagc 1617
<210> 19
<211> 3390
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> B1 构建体
<400> 19
atgagggtcc ccgctcagct cctggggctc ctgctgctct ggctcccagg tgcacgatgt 60
gccatctggg agctgaagaa agacgtgtac gtggtggagc ttgactggta ccccgacgcc 120
cccggtgaaa tggtggttct gacctgcgac acaccagagg aggacggcat cacctggacc 180
ctggaccagt ccagcgaggt cctgggatct ggcaagaccc tgaccatcca ggttaaggaa 240
tttggcgacg ccggccagta cacctgccac aaaggcggcg aggtcctttc gcacagtctg 300
ctgctgctgc ataaaaagga ggacggcatt tggagcaccg acattctgaa ggatcagaaa 360
gagcccaaga acaagacctt tctgagatgt gaggccaaaa actactctgg acgcttcacc 420
tgttggtggc tgaccaccat cagcacagac ctgaccttct cggtgaagtc tagtaggggc 480
agcagtgacc cccagggcgt aacatgcggc gccgctaccc tgagcgccga gagagtgaga 540
ggcgataaca aggagtacga gtactccgtg gagtgccaag aggactcagc ctgccccgcc 600
gccgaggagt cgctgcccat cgaggtgatg gtggatgcag tgcacaagct gaagtacgag 660
aactacacca gtagcttttt catcagagat atcattaaac ccgaccctcc caagaacctg 720
cagctgaagc ccttaaagaa cagccggcag gtggaagtgt catgggagta cccagacacc 780
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<210> 21
<211> 3390
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> B3 构建体
<400> 21
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<210> 22
<211> 3390
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> B4 构建体
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acctacgtgc ccaaggagtt caatgctgag accttcacct tccacgccga catctgcacc 3180
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<210> 23
<211> 4374
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C1 构建体
<400> 23
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tgctggtggc tgaccaccat tagcacagac ctgactttca gcgtaaagtc ttcaaggggc 480
agctcagacc cccagggagt aacttgcgga gcggcaacgt tgtctgccga gcgggtcaga 540
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aattacacca gctcattttt tatcagagac attatcaagc cggacccccc gaagaactta 720
cagcttaaac ccctaaagaa cagcaggcag gttgaggtca gctgggaata tcctgacacc 780
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<210> 24
<211> 4374
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C2 构建体
<400> 24
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<211> 4374
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> C3 构建体
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ctgcacatca accacaacaa cttgactgag tctgttggcc ccctaccaaa gagcctggag 3780
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> M2 前导序列
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gca 63
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
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atgagagtgc ccgcccagct gctgggcctg ctgttgctgt ggctgcccgg cgccagatgc 60
gcc 63
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<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CO 前导序列
<400> 35
atgagagtgc ccgcccagct gctgggcctg ctgctgctgt ggctgcccgg cgccagatgc 60
gcc 63
<210> 36
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CP 前导序列
<400> 36
atgagggtcc ccgctcagct cctggggctc ctgctgctct ggctcccagg tgcacgatgt 60
gcc 63
<210> 37
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> vH1 前导序列
<400> 37
atgagagtgc ccgcccagct gctgggcctg ctgctgctgt ggctgcccgg cgccagatgc 60
gcc 63
<210> 38
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> vH2 前导序列
<400> 38
atgagagtgc ccgcccagct gctgggcctg ctgctgctgt ggctgcccgg cgccagatgt 60
gcc 63
<210> 39
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> vH3 前导序列
<400> 39
atgagagtgc ccgcccagct tctgggcctg ctgctgctgt ggctgcccgg cgccagatgc 60
gcc 63
<210> 40
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A1 前导序列
<400> 40
atgagggtcc ccgctcagct cctggggctc ctgctgctct ggctcccagg tgcacgatgt 60
gcc 63
<210> 41
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A2 前导序列
<400> 41
atgagggtcc ccgctcagct cctggggctc ctgctgctct ggctcccagg tgcacgatgt 60
gcc 63
<210> 42
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A3 前导序列
<400> 42
atgagggtcc ccgctcagct cctggggctc ctgctgctct ggctcccagg tgcacgatgt 60
gcc 63
<210> 43
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A4 前导序列
<400> 43
atgagggtcc ccgctcagct cctggggctc ctgctgctct ggctcccagg tgcacgatgt 60
gcc 63
<210> 44
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> B1 前导序列
<400> 44
atgagggtcc ccgctcagct cctggggctc ctgctgctct ggctcccagg tgcacgatgt 60
gcc 63
<210> 45
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> B2 前导序列
<400> 45
atgagggtcc ccgctcagct cctggggctc ctgctgctct ggctcccagg tgcacgatgt 60
gcc 63
<210> 46
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> B3 前导序列
<400> 46
atgagggtcc ccgctcagct cctggggctc ctgctgctct ggctcccagg tgcacgatgt 60
gcc 63
<210> 47
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> B4 前导序列
<400> 47
atgagggtcc ccgctcagct cctggggctc ctgctgctct ggctcccagg tgcacgatgt 60
gcc 63
<210> 48
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C1 前导序列
<400> 48
atgagggtcc ccgctcagct cctggggctc ctgctgctct ggctcccagg tgcacgatgt 60
gcc 63
<210> 49
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C2 前导序列
<400> 49
atgagggtcc ccgctcagct cctggggctc ctgctgctct ggctcccagg tgcacgatgt 60
gcc 63
<210> 50
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C3 前导序列
<400> 50
atgagggtcc ccgctcagct cctggggctc ctgctgctct ggctcccagg tgcacgatgt 60
gcc 63
<210> 51
<211> 918
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L1 IL-12β
<400> 51
atctgggaat taaagaaaga tgtgtacgtg gtggaattgg attggtaccc agatgctccg 60
ggcgaaatgg ttgtactcac atgcgatact ccggaggaag acggtatcac ttggacattg 120
gatcagtcga gtgaggttct cggtagtggt aaaacactaa cgatccaagt caaagaattc 180
ggtgatgcgg ggcaatatac ctgtcataaa ggcggcgaag tactatctca tagcctcctg 240
ctgttacaca agaaggaaga tggcatatgg tccaccgaca tccttaagga tcagaaagaa 300
cccaagaaca aaactttctt gcgttgcgaa gctaagaact actccggccg cttcacatgc 360
tggtggttga caacgatcag tacggatcta accttctctg ttaagtccag tcgggggagt 420
tcggaccccc aaggcgtcac gtgtggagct gccacacttt ccgctgagcg cgtacgtgga 480
gataataaag agtatgaata ctccgttgag tgccaggagg actccgcgtg ccccgctgcc 540
gaggagagtc tccccataga ggtgatggtc gacgctgttc acaaactgaa atatgagaac 600
tatacctcat ccttctttat acgtgacata attaagccag atcccccgaa gaacttacaa 660
ttgaaaccat tgaagaattc acgtcaagtc gaggtatcct gggagtatcc cgacacctgg 720
tccacgccac actcatattt ctctctgacc ttctgtgtgc aggtacaagg caagagcaaa 780
cgagaaaaaa aggacagagt tttcacggat aagactagcg ccacagtgat atgtaggaaa 840
aacgcatcga tctcagtccg cgcgcaagat cggtattact caagcagttg gtcagagtgg 900
gcatcggtgc cctgctcg 918
<210> 52
<211> 918
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L2 IL-12β
<400> 52
atttgggaac ttaagaagga cgtatacgtt gtggaacttg actggtaccc tgatgctcca 60
ggggagatgg tggttttgac gtgtgacacc ccggaagaag atggaattac atggacctta 120
gaccaatcct ccgaggttct tggctcgggc aaaaccttga ccattcaggt caaggaattt 180
ggcgatgctg gccaatacac ctgccataaa ggtggtgaag ttttatctca ctccctactg 240
ttgctccata agaaagaaga cggcatttgg tcgacagaca tattgaagga tcagaaggaa 300
cctaagaata agaccttctt acgatgtgag gccaagaatt attccggacg ttttacgtgt 360
tggtggttga ccacgatctc cactgactta accttctcag tgaaatcctc acgaggtagt 420
tccgatcccc agggtgtgac gtgcggtgcg gccacgttaa gtgctgagag agtacggggc 480
gacaataagg aatacgagta ctcagttgaa tgccaagagg actcggcctg tcccgcggca 540
gaggagagtc tccctatcga agtgatggtg gatgcggtgc acaagctcaa gtatgaaaat 600
tacacatcat cttttttcat cagagacatt ataaagcccg acccaccaaa gaacctccag 660
ttaaagccct taaagaacag tagacaggtt gaagtatcat gggaataccc agacacctgg 720
tccacacccc attcgtattt ttccttgacg ttttgcgtac aagttcaggg aaagtccaaa 780
cgggaaaaga aagaccgcgt ttttacagac aaaacttctg ccactgtcat ctgtagaaag 840
aacgcatcaa ttagcgtgcg agcgcaagac agatactatt caagtagctg gagcgagtgg 900
gccagtgttc catgttct 918
<210> 53
<211> 918
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L3 IL-12β
<400> 53
atatgggagc tcaagaagga cgtttatgtc gttgagctgg attggtaccc tgatgccccg 60
ggcgaaatgg ttgtgcttac gtgcgatacc cccgaggagg atggcataac atggacgtta 120
gatcagtctt ccgaggtcct tggttccggt aagactctta ctatccaggt gaaggagttc 180
ggcgatgccg gccagtacac ttgccataaa ggcggtgaag ttctaagcca ctctctactg 240
cttttgcaca agaaggaaga tggaatatgg tccaccgaca tcttgaagga ccagaaagaa 300
ccaaaaaata agacattttt gaggtgtgag gcaaaaaatt attcgggacg cttcacctgc 360
tggtggttga cgacgatttc aaccgacctc accttctcag taaagagttc gagaggtagt 420
tccgatcccc aaggtgtgac atgtggcgct gcgactctaa gcgctgaacg cgtaagaggt 480
gataacaaag agtacgaata cagtgtggaa tgccaagaag atagcgcgtg tccagccgca 540
gaagaatctt taccaataga ggttatggtt gatgccgttc acaaattgaa atatgagaat 600
tacacctcaa gctttttcat tcgagacata ataaagcccg accctcctaa gaatcttcag 660
ttaaaaccgc tgaagaacag tagacaagtt gaggttagct gggaatatcc tgatacctgg 720
tcaacgccgc actcgtattt ctccctgact ttctgtgttc aggttcaagg aaaatctaaa 780
agggagaaga aagaccgtgt tttcaccgac aagacatctg ccacagtcat atgtaggaag 840
aacgcttcaa tcagcgtgcg agcgcaggac cgatactaca gctctagttg gtccgaatgg 900
gccagcgtac catgctct 918
<210> 54
<211> 918
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> M1 IL-12β
<400> 54
atctgggagc tgaaaaagga cgtgtacgtg gtggaacttg actggtaccc cgacgccccc 60
ggcgagatgg tggtactgac ctgcgacact cccgaggaag acggcattac ctggaccttg 120
gaccagagca gcgaggttct gggctccgga aaaaccttga caatccaagt gaaagaattc 180
ggcgacgctg gccagtacac ctgccacaag ggcggcgagg tgctgtccca cagcctgctg 240
ctgctgcata agaaagaaga cgggatttgg agcaccgata tactgaagga tcagaaggag 300
cccaagaaca agaccttcct gaggtgcgag gccaaaaatt acagcggcag attcacctgc 360
tggtggctga ccaccattag cacagacctg actttcagcg taaagtcttc aaggggcagc 420
tcagaccccc agggagtaac ttgcggagcg gcaacgttgt ctgccgagcg ggtcagaggc 480
gacaataagg agtacgagta ttcagtagag tgtcaggaag atagcgcctg tcccgccgcg 540
gaggagagcc tccccatcga ggtgatggtg gacgccgtgc acaagttaaa gtacgagaat 600
tacaccagct cattttttat cagagacatt atcaagccgg accccccgaa gaacttacag 660
cttaaacccc taaagaacag caggcaggtt gaggtcagct gggaatatcc tgacacctgg 720
tcaacccccc acagctactt ctcccttact ttctgtgtgc aagtgcaggg caagagcaag 780
agagaaaaga aggaccgggt gtttaccgac aagactagcg ccaccgtgat ttgcagaaag 840
aacgccagca ttagtgtgag agcccaggac aggtattact ccagctcatg gtctgagtgg 900
gctagtgtgc cttgctct 918
<210> 55
<211> 918
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> M2 IL-12β
<400> 55
atttgggagt tgaagaagga cgtgtacgtg gtggagctgg actggtaccc ggatgctccc 60
ggcgagatgg tggtactcac ctgcgacaca cctgaggaag acggcatcac ctggaccctc 120
gatcagagca gcgaggttct gggaagcggc aaaaccctga ccatccaagt gaaagagttt 180
ggcgacgccg gtcagtacac ctgccacaag ggaggcgagg tcctgtctca ctctctgctg 240
ctgctccata agaaggagga cggtatttgg agcactgaca tcttgaagga tcaaaaagag 300
ccaaagaata aaacgttcct gaggtgcgaa gctaagaatt actccgggcg ttttacgtgc 360
tggtggctga ccacgatcag caccgatctg accttcagcg tgaagagcag ccggggcagc 420
agcgaccccc aaggcgtgac ttgcggcgct gcgaccctga gcgctgagcg tgtgcgcggc 480
gacaacaagg agtatgagta ttcagtggag tgtcaggagg actccgcctg tcccgcggcc 540
gaagagagtc tgcctattga ggtgatggtg gacgccgtgc acaagctgaa gtacgagaac 600
tacacatcgt cattctttat ccgcgacatc ataaagcccg acccccccaa gaacctgcag 660
ctgaagcctc tcaagaattc ccggcaagtg gaggtgagct gggagtaccc tgatacctgg 720
tctacccctc acagctactt tagcctgacc ttctgcgtcc aggtgcaagg aaagtcgaag 780
cgcgagaaga aagatagagt cttcaccgat aaaaccagtg ccaccgtgat ttgccgcaaa 840
aacgcctcca tcagcgtgcg ggctcaggat agatactact ctagcagctg gagcgaatgg 900
gcctcagttc cttgcagc 918
<210> 56
<211> 918
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> M3 IL-12β
<400> 56
atttgggagc tcaagaagga cgtgtacgtg gtggaacttg actggtaccc ggacgcgccc 60
ggggaaatgg tggtgctaac ctgtgacacc cccgaagagg acggcatcac ctggaccctg 120
gaccagagca gtgaggtgct aggtagtggc aaaacgttaa ccatccaggt caaggagttc 180
ggcgacgccg ggcaatacac ctgtcacaag gggggggagg tactatccca ctccctgctg 240
ctcctgcaca agaaagagga cgggatctgg agcaccgaca ttctgaaaga ccaaaaggag 300
cccaaaaaca aaaccttcct tagatgtgaa gccaagaact acagcggccg tttcacctgc 360
tggtggctga ccaccatatc tacggacctt accttttcgg tgaagagcag cagggggagt 420
tccgacccgc aaggcgtaac ttgcggagcc gcaaccctga gcgccgagag agtgcgcggc 480
gacaacaagg agtacgagta tagcgtggag tgccaagagg acagcgcatg cccagccgcc 540
gaagagagcc tgccaataga ggtcatggta gacgccgtgc acaagctaaa atatgaaaac 600
tacaccagca gctttttcat cagggatatc atcaaacccg acccaccaaa aaacttacag 660
cttaagcctc tgaaaaacag cagacaagtt gaggtcagct gggagtaccc cgacacttgg 720
agcacacccc actcctattt cagtttgaca ttctgcgtgc aggtgcaggg taaaagcaag 780
agagaaaaga aggacagagt gttcacagat aagacctcag ccacagtgat ctgccgtaag 840
aatgccagca tcagcgtccg ggctcaggac aggtactact cttcctcatg gagcgagtgg 900
gcctctgtcc cctgcagc 918
<210> 57
<211> 918
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> H1 IL-12β
<400> 57
atctgggagc tgaagaaaga cgtgtacgtg gtggagctgg actggtaccc cgacgccccc 60
ggtgaaatgg tggttctgac ctgcgacaca ccagaggagg acggcatcac ctggaccctg 120
gaccagtcca gcgaggtcct gggctctggc aagaccctga ccatccaggt taaggaattt 180
ggcgacgccg gccagtacac ctgccacaaa ggcggcgagg tcctttcgca cagtctgctg 240
ctgctgcata aaaaggagga cggcatttgg agcaccgaca ttctgaagga tcagaaagag 300
cccaagaaca agacctttct gagatgtgag gccaaaaact actctggacg cttcacctgt 360
tggtggctga ccaccatcag cacagacctg accttctcgg tgaagtctag taggggcagc 420
agtgaccccc agggcgtaac atgcggcgcc gctaccctga gcgccgagag agtgagaggc 480
gataacaagg agtacgagta ctccgtggag tgccaagagg actcagcctg ccccgccgcc 540
gaggagtcgc tgcccatcga ggtgatggtg gatgcagtgc acaagctgaa gtacgagaac 600
tacaccagta gctttttcat cagagatatc attaaacccg accctcccaa gaacctgcag 660
ctgaagccct taaagaacag ccggcaggtg gaagtgtcat gggagtaccc agacacctgg 720
agcactccgc acagctactt cagcctgacc ttctgcgttc aggtgcaggg aaaaagcaag 780
agagagaaga aagacagagt gttcaccgac aagaccagcg caaccgtgat ctgtagaaag 840
aacgcctcga tcagcgtgag agcccaggac agatactaca gcagcagctg gagcgagtgg 900
gccagtgtac cttgcagc 918
<210> 58
<211> 918
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> H2 IL-12β
<400> 58
atttgggagc tgaagaagga cgtgtacgtg gtggagctgg attggtatcc agacgccccc 60
ggcgagatgg tcgtgttgac ctgcgatact cccgaggagg acggaatcac ctggacactt 120
gaccagagca gcgaggtgct gggcagcggg aagaccctga ctatccaggt gaaggagttt 180
ggcgatgccg gacagtacac ctgccacaag ggcggcgagg tgttatctca tagcctgctg 240
ctgctgcaca aaaaggagga cgggatctgg agcactgaca tcctgaagga ccagaaggag 300
cccaaaaaca agaccttcct gcgttgcgag gccaagaact acagcgggag attcacctgt 360
tggtggctga ccactatcag cactgaccta accttcagcg tgaagagcag ccggggaagc 420
tctgaccccc agggggtgac atgcggcgcc gccacactga gcgccgagag ggtgagaggg 480
gacaataagg aatacgagta tagcgtggag tgtcaggaag attccgcctg ccccgccgcc 540
gaggagagcc tgcctatcga ggtcatggtg gacgccgtcc ataaactgaa gtacgaaaac 600
tatacttcaa gcttcttcat cagagacatc ataaagcccg acccccccaa gaacctgcag 660
ctaaagcccc tgaagaacag cagacaggtc gaagtgagct gggagtaccc cgatacctgg 720
agcaccccgc acagctactt cagcctgacc ttttgcgtcc aggtgcaggg caagagcaag 780
agagagaaga aggacagggt gttcactgac aagacaagcg ccactgttat ctgcagaaag 840
aacgccagta tcagcgtgcg cgcccaagac aggtattact ccagcagctg gtctgaatgg 900
gccagcgtgc cttgcagc 918
<210> 59
<211> 918
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> H3 IL-12β
<400> 59
atctgggaac tgaagaagga cgtctacgtg gtggagctgg attggtaccc cgacgccccc 60
ggcgagatgg tcgtgctgac ctgtgacacc cctgaggagg acggaatcac atggaccctg 120
gaccagagca gcgaagtgtt gggcagcggc aagaccctga ccatccaagt gaaggaattc 180
ggcgacgcgg gccagtatac ttgccacaag ggcggggagg ttctgagcca cagcctgctg 240
ctgctccaca agaaagagga tggcatctgg tctaccgaca tcctgaagga ccaaaaggag 300
ccaaagaaca agaccttcct aagatgcgag gccaagaact actcaggtcg tttcacctgc 360
tggtggctga ccacaatctc caccgacctg accttcagcg tgaagagcag ccgcggcagt 420
agcgacccac agggcgtgac ctgcggggcc gccactctga gcgccgagag agtgcgcggc 480
gataataagg aatacgagta cagcgtggag tgccaggaag actcagcctg ccccgccgca 540
gaagaaagtc tgccaataga ggtgatggtt gacgccgtgc acaagctaaa gtacgagaac 600
tacaccagca gcttctttat ccgggacatc atcaagccag atccccccaa gaacctgcag 660
cttaagcccc tgaagaacag cagacaggtg gaggtgtcat gggaataccc cgacacctgg 720
agcacccccc atagctactt ctcactgacc ttctgcgtgc aggtgcaggg caagagcaag 780
agagagaaga aggatagggt attcacggac aagacctcag ccaccgtgat ctgccgaaag 840
aacgccagca tcagcgtgag agcccaggac agatactata gctcctcgtg gagcgagtgg 900
gccagcgtac cttgcagc 918
<210> 60
<211> 918
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CO IL-12β
<400> 60
atctgggagc tgaagaagga cgtgtacgtg gtggagctgg actggtaccc cgacgccccc 60
ggcgagatgg tggtgctgac ctgcgacacc cccgaggagg acggcatcac ctggaccctg 120
gaccagagca gcgaggtgct gggcagcggc aagaccctga ccatccaggt gaaggagttc 180
ggcgacgccg gccagtacac ctgccacaag ggcggcgagg tgctgagcca cagcctgctg 240
ctgctgcaca agaaggagga cggcatctgg agcaccgaca tcctgaagga ccagaaggag 300
cccaagaaca agaccttcct gagatgcgag gccaagaact acagcggcag attcacctgc 360
tggtggctga ccaccatcag caccgacctg accttcagcg tgaagagcag cagaggcagc 420
agcgaccccc agggcgtgac ctgcggcgcc gccaccctga gcgccgagag agtgagaggc 480
gacaacaagg agtacgagta cagcgtggag tgccaggagg acagcgcctg ccccgccgcc 540
gaggagagcc tgcccatcga ggtgatggtg gacgccgtgc acaagctgaa gtacgagaac 600
tacaccagca gcttcttcat cagagacatc atcaagcccg acccccccaa gaacctgcag 660
ctgaagcccc tgaagaacag cagacaggtg gaggtgagct gggagtaccc cgacacctgg 720
agcacccccc acagctactt cagcctgacc ttctgcgtgc aggtgcaggg caagagcaag 780
agagagaaga aggacagagt gttcaccgac aagaccagcg ccaccgtgat ctgcagaaag 840
aacgccagca tcagcgtgag agcccaggac agatactaca gcagcagctg gagcgagtgg 900
gccagcgtgc cctgcagc 918
<210> 61
<211> 918
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CP IL-12β
<400> 61
atctgggagc tgaagaagga tgtgtatgtg gtggagctgg actggtaccc agatgcccct 60
ggagagatgg tggtgctgac ctgtgacacc ccagaggagg atggcatcac ctggaccctg 120
gaccagagca gcgaggtgct gggcagcggc aagaccctga ccatccaggt gaaggagttt 180
ggagatgctg gccagtacac ctgccacaag ggcggggagg tgctgagcca cagcctgctg 240
ctgctgcaca agaaggagga tggcatctgg agcacagaca tcctgaagga ccagaaggag 300
cccaagaaca agaccttcct gcgctgtgag gccaagaact acagcggccg cttcacctgc 360
tggtggctga ccaccatcag cacagacctg accttctctg tgaaaagcag ccggggcagc 420
agtgaccccc agggcgtgac ctgtggggcc gccaccctgt ctgctgagcg ggtgcggggg 480
gacaacaagg agtatgagta cagcgtggag tgccaggagg acagcgcctg cccagctgct 540
gaggagagcc tgcccatcga ggtgatggtg gatgctgtgc acaagctgaa gtatgagaac 600
tacaccagca gcttcttcat ccgggacatc atcaagccag acccccccaa gaacctgcag 660
ctgaagcccc tgaagaacag ccggcaggtg gaggtgtcct gggagtaccc agacacctgg 720
agcacccccc acagctactt cagcctgacc ttctgtgtgc aggtgcaggg caagagcaag 780
cgggagaaga aggacagagt cttcacagac aagaccagcg ccaccgtcat ctgcaggaag 840
aatgccagca tctctgtgcg ggcccaggac cgctactaca gcagctcctg gagcgagtgg 900
gcctctgtgc cctgcagc 918
<210> 62
<211> 918
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> vH1 IL-12β
<400> 62
atctgggagc tgaagaagga cgtgtacgtg gtggagctgg actggtaccc cgacgccccc 60
ggcgagatgg tggtgctgac ctgcgacacc cccgaggagg acgggatcac ctggaccctg 120
gatcagagca gcgaggtgct gggcagcggc aagaccctga ccatccaggt gaaggagttt 180
ggtgacgccg gccagtacac ctgccacaag ggcggcgagg tgctgagcca ctcactgctg 240
ctgctgcaca agaaggagga cggcatctgg agcaccgaca ttctgaagga tcagaaggag 300
cccaagaaca agaccttcct gagatgcgag gccaagaact acagcggcag attcacctgt 360
tggtggctga ctactatcag cactgatctg accttcagcg tgaagagctc aagaggcagc 420
agcgatcccc agggcgtgac ctgcggcgcc gccaccctga gcgccgagag agtgagaggc 480
gacaacaagg agtacgagta cagcgtggag tgccaggaag acagcgcctg ccccgctgca 540
gaggagtctc tgcccatcga ggtgatggtg gacgccgtgc acaagcttaa gtacgagaac 600
tacaccagct ccttcttcat tagagacatc atcaagcccg acccgcccaa aaacctgcag 660
ctgaagcccc tgaagaacag cagacaggtg gaggtcagct gggagtaccc cgacacctgg 720
agcacccccc acagctactt cagcctgacc ttctgcgtgc aggtgcaggg caagagcaag 780
agagagaaga aggacagagt gttcaccgac aaaaccagcg ccaccgtgat ctgcagaaaa 840
aacgccagca ttagcgtgag agctcaggat agatactaca gcagcagctg gagtgagtgg 900
gccagcgtgc cctgcagc 918
<210> 63
<211> 918
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> vH2 IL-12β
<400> 63
atctgggagc tgaagaagga cgtgtacgtg gtggagctgg actggtaccc cgacgccccc 60
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gaccagagca gcgaggtgct gggcagcggg aagaccctga ccatccaggt gaaggagttc 180
ggcgacgccg gccagtacac ctgtcacaag ggcggcgagg tgctgagcca cagcctgctg 240
ctgctgcaca agaaggagga cggcatatgg agcaccgaca tcctgaagga ccagaaggag 300
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tacaccagca gcttcttcat cagagacatc atcaagcccg acccccccaa gaacctgcag 660
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agcacccccc acagctactt cagcctgacc ttctgcgtgc aggtgcaggg aaaaagcaag 780
agagagaaga aggacagagt gttcaccgac aagaccagcg ccaccgtgat ctgcagaaag 840
aacgccagca tctccgtgag agcccaggac agatactaca gcagcagctg gagcgagtgg 900
gccagcgtgc cctgtagc 918
<210> 64
<211> 918
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> vH3 IL-12β
<400> 64
atctgggagc tgaagaagga cgtgtacgtg gtggagctgg actggtaccc ggacgccccg 60
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gccagcgtgc cctgcagc 918
<210> 65
<211> 918
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A1 IL-12β
<400> 65
atctgggagc tgaagaaaga cgtgtacgtg gtggagcttg actggtaccc cgacgccccc 60
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<210> 66
<211> 918
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A2 IL-12β
<400> 66
atctgggaac tgaagaagga cgtctacgtg gtggagctgg attggtaccc cgacgccccc 60
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A3 IL-12β
<400> 67
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<210> 68
<211> 918
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A4 IL-12β
<400> 68
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<210> 69
<211> 918
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> B1 IL-12β
<400> 69
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<210> 70
<211> 918
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> B2 IL-12β
<400> 70
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<210> 71
<211> 918
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> B3 IL-12β
<400> 71
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ggcgagatgg tggtgctgac ctgcgacacc cccgaggagg acggcatcac ctggaccctg 120
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gccagcgtgc cctgcagc 918
<210> 72
<211> 918
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> B4 IL-12β
<400> 72
atctgggagc tgaagaagga tgtgtatgtg gtggagctgg actggtaccc agatgcccct 60
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gcctctgtgc cctgcagc 918
<210> 73
<211> 918
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C1 IL-12β
<400> 73
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gaggagagcc tccccatcga ggtgatggtg gacgccgtgc acaagttaaa gtacgagaat 600
tacaccagct cattttttat cagagacatt atcaagccgg accccccgaa gaacttacag 660
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gctagtgtgc cttgctct 918
<210> 74
<211> 918
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C2 IL-12β
<400> 74
atctgggagc tgaagaaaga cgtgtacgtg gtggagcttg actggtaccc cgacgccccc 60
ggtgaaatgg tggttctgac ctgcgacaca ccagaggagg acggcatcac ctggaccctg 120
gaccagtcca gcgaggtcct gggatctggc aagaccctga ccatccaggt taaggaattt 180
ggcgacgccg gccagtacac ctgccacaaa ggcggcgagg tcctttcgca cagtctgctg 240
ctgctgcata aaaaggagga cggcatttgg agcaccgaca ttctgaagga tcagaaagag 300
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tacaccagta gctttttcat cagagatatc attaaacccg accctcccaa gaacctgcag 660
ctgaagccct taaagaacag ccggcaggtg gaagtgtcat gggagtaccc agacacctgg 720
agcactccgc acagctactt cagcctgacc ttctgcgttc aggtgcaggg aaaaagcaag 780
agagagaaga aagacagagt gttcaccgac aagaccagcg caaccgtgat ctgtagaaag 840
aacgcctcga tcagcgtgag agcccaggac agatactaca gcagcagctg gagcgagtgg 900
gccagtgtac cttgcagc 918
<210> 75
<211> 918
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C3 IL-12β
<400> 75
atctgggaac tgaagaagga cgtctacgtg gtggagctgg attggtaccc cgacgccccc 60
ggcgagatgg tcgtgctgac ctgtgacacc cctgaggagg acggaatcac atggaccctg 120
gaccagagca gcgaagtgtt gggcagcggc aagaccctga ccatccaagt gaaggaattc 180
ggcgacgcgg gccagtatac ttgccacaag ggcggggagg ttctgagcca cagcctgctg 240
ctgctccaca agaaagagga tggcatctgg tctaccgaca tcctgaagga ccaaaaggag 300
ccaaagaaca agaccttcct aagatgcgag gccaagaact actcaggtcg tttcacctgc 360
tggtggctga ccacaatctc caccgacctg accttcagcg tgaaaagcag ccgcggcagt 420
agcgacccac agggcgtgac ctgcggggcc gccactctga gcgccgagag agtgcgcggc 480
gataataagg aatacgagta cagcgtggag tgccaggaag actcagcctg ccccgccgca 540
gaagaaagtc tgccaataga ggtgatggtt gacgccgtgc acaagctaaa gtacgagaac 600
tacaccagca gcttctttat ccgggacatc atcaagccag atccccccaa gaacctgcag 660
cttaagcccc tgaagaacag cagacaggtg gaggtgtcat gggaataccc cgacacctgg 720
agcacccccc atagctactt ctcactgacc ttctgcgtgc aggtgcaggg caagagcaag 780
agagagaaga aggatagggt attcacggac aagacctcag ccaccgtgat ctgccgaaag 840
aacgccagca tcagcgtgag agcccaggac agatactata gctcctcgtg gagcgagtgg 900
gccagcgtac cttgcagc 918
<210> 76
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L1 第一GS接头
<400> 76
gggggttctg gtgggggcag tggaggagga tcaggtggcg gcagt 45
<210> 77
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L2 第一GS接头
<400> 77
ggcggttcgg gcggagggtc cggcggtggt agcggaggcg ggagc 45
<210> 78
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L3 第一GS接头
<400> 78
ggcggttccg gcgggggctc ggggggcggg agcggtggag gcagc 45
<210> 79
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> M1 第一GS接头
<400> 79
ggcggcagcg gcggcgggag cggcggaggc tccgggggag gtagc 45
<210> 80
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> M2 第一GS接头
<400> 80
ggcggcagcg gtggaggaag cggcggtggc agtgggggcg ggagc 45
<210> 81
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> M3 第一GS接头
<400> 81
ggcggcagcg gcggtggcag cggcggcggt tctggcggcg gttca 45
<210> 82
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> H1 第一GS接头
<400> 82
ggtggcagcg gcggcggctc cggcggcggg agtggcggcg gcagc 45
<210> 83
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> H2 第一GS接头
<400> 83
ggggggagcg gcggtggcag cgggggcggc agcggcgggg gcagc 45
<210> 84
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> H3 第一GS接头
<400> 84
ggcgggagcg gcggcggcag cggcggtggc agtggcgggg gcagc 45
<210> 85
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CO 第一GS接头
<400> 85
ggcggcagcg gcggcggcag cggcggcggc agcggcggcg gcagc 45
<210> 86
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CP 第一GS接头
<400> 86
ggcggcagcg gcggcggcag cggcggcggc agcggcggcg gcagc 45
<210> 87
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> vH1 第一GS接头
<400> 87
ggcggctcag gcggcggctc aggcggcggc agcggcggcg gcagc 45
<210> 88
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> vH2 第一GS接头
<400> 88
ggcggcagcg gcggcggcag cggcggcggc agcggcggcg gcagc 45
<210> 89
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> vH3 第一GS接头
<400> 89
ggcggcagcg gtggcgggag cggcggcggg agcggcggcg gaagc 45
<210> 90
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A1 第一GS接头
<400> 90
ggtggaagcg gcggaggctc tggcggaggg agtggcggag gcagc 45
<210> 91
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A2 第一GS接头
<400> 91
ggcgggagcg gcggcggcag cggaggtggc agtggcggag gcagc 45
<210> 92
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A3 第一GS接头
<400> 92
ggcggcagcg gcggcggcag cggcggcggc agcggcggcg gcagc 45
<210> 93
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A4 第一GS接头
<400> 93
ggcggcagcg gcggcggcag cggcggcggc agcggcggcg gcagc 45
<210> 94
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> B1 第一GS接头
<400> 94
ggtggaagcg gcggaggctc tggcggaggg agtggcggag gcagc 45
<210> 95
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> B2 第一GS接头
<400> 95
ggcgggagcg gcggcggcag cggaggtggc agtggcggag gcagc 45
<210> 96
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> B3 第一GS接头
<400> 96
ggcggcagcg gcggcggcag cggcggcggc agcggcggcg gcagc 45
<210> 97
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> B4 第一GS接头
<400> 97
ggcggcagcg gcggcggcag cggcggcggc agcggcggcg gcagc 45
<210> 98
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C1 第一GS接头
<400> 98
ggaggcagcg gtggcgggag cggcggaggc tccgggggag gtagc 45
<210> 99
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C2 第一GS接头
<400> 99
ggtggaagcg gcggaggctc tggcggaggg agtggcggag gcagc 45
<210> 100
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C3 第一GS接头
<400> 100
ggcgggagcg gcggcggcag cggaggtggc agtggcggag gcagc 45
<210> 101
<211> 591
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L1 IL-12α
<400> 101
cgcaatctac ccgtggcaac accagacccg ggaatgttcc catgtctgca ccacagtcaa 60
aacctcttaa gggccgtgtc aaatatgcta cagaaggcga gacagacttt agaattctac 120
ccttgtacaa gcgaggagat tgaccacgag gacatcacca aagataagac gagcaccgtc 180
gaggcttgcc tgcctctaga actaacaaaa aatgaatcat gcttgaactc gagggagacc 240
agtttcatta ctaacggttc atgtcttgca tcgaggaaga cctcattcat gatggccctg 300
tgcctctcgt ccatttatga agacctaaag atgtaccagg tagagtttaa gaccatgaac 360
gccaagctcc tcatggatcc aaaacggcaa atattcttag atcagaatat gctcgctgtt 420
atcgacgaac tcatgcaggc gcttaacttc aactcagaaa ccgttcccca aaagtcgagt 480
ctagaagaac cggactttta taagaccaaa attaaactgt gtatactact tcacgccttc 540
aggataagag cagtgacgat tgacagggtg atgtcctact tgaatgcatc a 591
<210> 102
<211> 591
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L2 IL-12α
<400> 102
aggaacttgc ccgtggctac tccagaccct ggcatgttcc cctgtttaca ccactcccag 60
aacttattac gtgctgttag caacatgttg caaaaggccc gtcaaaccct cgagttttac 120
ccctgtacta gtgaagaaat cgaccacgaa gacataacaa aagacaagac aagcacagtt 180
gaggcatgct tacccctgga gttaacaaag aacgagagct gtctgaactc tcgagagacg 240
agcttcatca ccaatgggag ttgccttgct tctcgaaaaa cgtcgttcat gatggccctg 300
tgcctgtcgt ctatctatga ggatctgaaa atgtatcagg ttgaattcaa gacaatgaat 360
gccaaactac tcatggatcc aaaacggcag atattcctcg atcagaatat gctcgcagtt 420
attgacgaac taatgcaggc tctgaatttt aacagcgaga ccgttcctca gaagtcaagt 480
ttggaagaac ctgacttcta caaaactaaa ataaaattat gcatcttact gcatgctttc 540
agaattagag ctgtcactat tgatcgagtg atgtcatact tgaatgcttc c 591
<210> 103
<211> 591
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L3 IL-12α
<400> 103
aggaatcttc ctgtcgcgac ccctgatccc ggcatgtttc cttgcctgca ccacagtcag 60
aacttattac gcgccgtttc caatatgtta cagaaggcca gacagacatt agagttttat 120
ccttgcacat cggaggagat cgaccatgaa gatatcacaa aagataaaac atccaccgtt 180
gaggcctgcc tgccacttga acttactaaa aacgagagct gcctgaatag ccgggaaact 240
tctttcatca ctaatggatc gtgtctagca agccgaaaaa ccagcttcat gatggctttg 300
tgcctctcgt ccatctatga agacctgaaa atgtatcaag tagaatttaa aacgatgaat 360
gccaaactgc ttatggatcc caaacgccag atatttctag accagaatat gctggccgtc 420
attgatgagc taatgcaggc tctcaatttt aatagcgaaa cagtgcccca aaaaagctct 480
ttggaagagc cggattttta caaaaccaag attaagctat gtatcctgct gcatgctttc 540
agaattcgag ctgttacaat tgatcgggtt atgagctact taaacgcctc g 591
<210> 104
<211> 591
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> M1 IL-12α
<400> 104
cggaatctgc ctgtcgccac tccagacccc ggcatgttcc catgtctgca tcattctcag 60
aacctgctga gggccgtatc caatatgctg cagaaagcca gacagacctt agagttctat 120
ccctgtacaa gcgaggagat agatcacgag gatattacga aggacaaaac ttctactgtt 180
gaggcgtgtc ttccattaga gctgaccaag aacgaaagct gtctgaatag cagagagact 240
tcatttatca ccaatgggag ttgcttggct agcagaaaga ccagcttcat gatggccctt 300
tgcttgtctt cgatatacga agatcttaag atgtatcaag tggaatttaa gacgatgaac 360
gccaagctgc ttatggatcc caagcgccaa atcttcctgg atcagaacat gttggccgtg 420
attgacgagc tgatgcaagc cctgaatttc aactccgaga ccgtgcctca gaagagcagc 480
ctcgaggagc ccgacttcta caaaacaaag atcaaactct gcatccttct gcacgccttc 540
agaattagag ccgtgaccat cgacagagtt atgagctacc tgaatgccag c 591
<210> 105
<211> 591
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> M2 IL-12α
<400> 105
agaaatctgc ccgtcgccac tccagatcct ggcatgttcc cgtgcctgca tcacagccaa 60
aacctgctgc gggcggtgtc taacatgctg cagaaggcta ggcagacctt ggaattctat 120
ccctgcacaa gcgaggaaat agaccatgag gacatcacca aggataagac cagcacggtc 180
gaagcttgcc tgccactgga actgacaaaa aacgagagtt gcctgaactc ccgcgagaca 240
tccttcatca caaacggcag ctgcctggct agcaggaaga ccagcttcat gatggccctg 300
tgcctgtctt ccatctacga ggacctgaaa atgtaccaag tggagttcaa gactatgaac 360
gccaagctgc taatggatcc caagcgacag atctttctag accagaacat gctggccgtc 420
attgacgagc tgatgcaggc actcaatttt aactcagaga ccgtgccaca gaagtccagc 480
ctggaggagc ctgacttcta taagaccaag attaagctgt gcatcctgct gcatgccttc 540
cgaataagag ccgtgaccat tgaccgagtg atgtcatact tgaacgcaag c 591
<210> 106
<211> 591
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> M3 IL-12α
<400> 106
agaaacctcc cagtcgctac ccccgatccc ggaatgttcc cctgcctgca ccactcccag 60
aatctgctcc gagccgttag caacatgctg caaaaggccc ggcagaccct ggagttctac 120
ccatgcacct cggaagaaat cgatcacgag gacatcacca aggacaagac tagcaccgtc 180
gaggcctgcc tgccgctgga actaaccaag aatgaaagct gcctcaactc gcgggagacc 240
tctttcataa ccaacggctc atgcctggcc agccggaaaa ctagctttat gatggctctg 300
tgcttaagca gcatctacga ggatctgaag atgtaccagg tagagttcaa gaccatgaat 360
gccaagctgc tgatggaccc caagagacaa atcttcctgg accagaacat gctggccgta 420
attgatgaac tgatgcaggc cctgaatttc aacagcgaga ccgtacccca gaaaagctca 480
ctggaggagc ccgactttta taagacgaaa ataaagttgt gcatccttct tcacgctttc 540
cggattagag ccgtgaccat cgatagagtg atgtcatacc tgaacgcatc g 591
<210> 107
<211> 591
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> H1 IL-12α
<400> 107
agaaatctgc ccgtagccac ccccgacccc ggcatgtttc cctgtctgca ccattctcaa 60
aacctgttac gggccgtgag caacatgctg cagaaggcca gacagacact ggagttttac 120
ccctgtacct cagaggagat cgatcatgag gacattacta aggacaagac cagcaccgtg 180
gaagcctgcc tgcccctaga gctaaccaag aacgagagct gcctgaactc tagagagaca 240
agcttcatca cgaacggctc atgcctggcc agtaggaaaa ccagcttcat gatggctctg 300
tgcctgagct ccatatatga ggaccttaag atgtaccagg tggagttcaa aaccatgaac 360
gccaagctgc tgatggaccc aaagagacag atcttccttg accagaacat gctggccgtt 420
atcgatgagc tgatgcaggc cctgaacttc aacagcgaga ccgtgcccca gaagagcagc 480
ctggaggaac ccgacttcta caaaaccaag atcaagctgt gcattctgct gcatgccttc 540
cgcattagag ccgtgaccat cgatagggtg atgagctacc tgaacgccag c 591
<210> 108
<211> 591
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> H2 IL-12α
<400> 108
agaaacctgc ccgtggccac acccgatccc ggcatgttcc cctgtctgca ccacagccaa 60
aacctgctgc gtgccgtgag caacatgctg cagaaggcgc ggcagaccct ggagttctat 120
ccctgcacca gtgaggagat tgaccacgag gatatcacca aagacaagac cagcaccgtg 180
gaggcctgcc tccccctgga gctgaccaag aacgagtcct gcttgaattc aagagagacc 240
agcttcatca ccaacggctc ctgcttagcc agcagaaaga ctagcttcat gatggccttg 300
tgcttgtcta gcatctatga ggatctgaag atgtaccagg tcgagttcaa gactatgaac 360
gccaagctgc tgatggaccc caaaagacag atcttcctgg accagaacat gctggccgtc 420
atcgacgagc tgatgcaggc ccttaatttc aatagcgaga cagtgcccca gaaatcttct 480
ctggaggagc ccgattttta caaaaccaag atcaaactat gcatcctgtt gcacgccttc 540
cggatccgcg ccgtgaccat cgacagagta atgtcctacc tgaacgccag c 591
<210> 109
<211> 591
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> H3 IL-12α
<400> 109
agaaacctgc ccgtggccac ccccgacccc gggatgtttc cttgcctgca ccactcccag 60
aacctcctga gagccgtgtc caacatgctg cagaaagcca gacagaccct cgagttctat 120
ccctgcacaa gcgaggagat cgaccacgag gacatcacta aggacaagac cagcacagtg 180
gaagcctgcc tcccgctgga gctgactaag aacgagagct gtctgaacag cagggagacc 240
agcttcatca ccaacggcag ctgcctggcg agcagaaaaa cctcctttat gatggcgctc 300
tgcctgagct caatctatga ggacctgaag atgtaccagg tggagtttaa aaccatgaat 360
gccaagctgc ttatggaccc taagagacag attttcctgg atcagaacat gctggccgtg 420
attgatgaat taatgcaggc gctgaacttt aacagcgaga ccgtgcccca gaagagcagc 480
ctggaggagc ccgactttta caagaccaag atcaagttgt gcatcctcct gcacgccttc 540
agaatcagag cggtgacgat cgacagagtc atgagctacc tcaacgctag c 591
<210> 110
<211> 591
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CO IL-12α
<400> 110
agaaacctgc ccgtggccac ccccgacccc ggcatgttcc cctgcctgca ccacagccag 60
aacctgctga gagccgtgag caacatgctg cagaaggcca gacagaccct ggagttctac 120
ccctgcacca gcgaggagat cgaccacgag gacatcacca aggacaagac cagcaccgtg 180
gaggcctgcc tgcccctgga gctgaccaag aacgagagct gcctgaacag cagagagacc 240
agcttcatca ccaacggcag ctgcctggcc agcagaaaga ccagcttcat gatggccctg 300
tgcctgagca gcatctacga ggacctgaag atgtaccagg tggagttcaa gaccatgaac 360
gccaagctgc tgatggaccc caagagacag atcttcctgg accagaacat gctggccgtg 420
atcgacgagc tgatgcaggc cctgaacttc aacagcgaga ccgtgcccca gaagagcagc 480
ctggaggagc ccgacttcta caagaccaag atcaagctgt gcatcctgct gcacgccttc 540
agaatcagag ccgtgaccat cgacagagtg atgagctacc tgaacgccag c 591
<210> 111
<211> 591
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CP IL-12α
<400> 111
aggaacctgc ctgtggccac cccagacccc ggcatgttcc cctgcctgca ccacagccag 60
aacctgctgc gggctgtgag caacatgctg cagaaggccc ggcagaccct ggagttctac 120
ccctgcacca gcgaggagat tgaccacgag gacatcacca aggacaagac cagcacagtg 180
gaggcctgcc tgcccctgga gctgaccaag aatgaaagct gcctgaacag ccgggagacc 240
agcttcatca ccaacggcag ctgcctggcc agcaggaaga ccagcttcat gatggccctg 300
tgcctgagca gcatctatga ggacctgaag atgtaccagg tggagttcaa gaccatgaat 360
gccaagctgc tgatggaccc caagaggcag atcttcctgg accagaacat gctggccgtg 420
attgatgagc tgatgcaggc cctgaacttc aacagcgaga ccgtgcccca gaaaagcagc 480
ctggaggagc cagacttcta caagaccaag atcaagctgt gcatcctgct gcacgccttc 540
cgcatccggg ctgtgaccat cgacagagtg atgagctacc tgaatgccag c 591
<210> 112
<211> 591
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> vH1 IL-12α
<400> 112
agaaacctgc ccgtggccac gcccgacccc ggcatgtttc cctgcctgca ccatagccag 60
aatctgctga gagccgtgag caacatgctg cagaaggcca gacagacgct cgagttctac 120
ccctgcacca gcgaggagat tgaccacgag gacatcacca aggacaagac cagcaccgtg 180
gaggcctgcc tgcccctcga gctgaccaag aacgagagct gcctgaacag cagagagacc 240
agcttcatca ccaacggcag ctgcctggcc agcagaaaga ccagcttcat gatggccctg 300
tgcctgagca gcatctacga ggacctgaag atgtaccagg tggagttcaa gacaatgaac 360
gccaagctgc tgatggaccc caagaggcag atttttctgg accagaacat gctggccgtt 420
atcgacgagc tgatgcaggc cctgaatttc aatagcgaaa ccgtgcccca gaagagcagc 480
ctggaggagc ctgacttcta caaaaccaag atcaagcttt gcatcctgct gcacgccttc 540
agaatcagag ccgtgaccat cgacagagtg atgagctacc tgaacgccag c 591
<210> 113
<211> 591
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> vH2 IL-12α
<400> 113
agaaacctgc ccgtggccac ccccgacccc ggcatgttcc cctgcctgca ccacagccag 60
aacctgctga gagccgtgag caacatgctg cagaaggcca gacagaccct ggagttctac 120
ccctgcacca gcgaggagat cgaccatgag gacatcacca aggacaagac cagcaccgtg 180
gaggcctgcc tgcccctgga gctgaccaag aacgaaagct gcctgaacag cagagagacc 240
agcttcatca ccaacggcag ctgtctggcc tcaagaaaga ccagctttat gatggccctg 300
tgcctgtcta gcatctacga ggatctgaag atgtaccagg tggagttcaa gaccatgaac 360
gccaagctgc tgatggaccc caagagacag atcttcctgg accagaacat gttagccgtg 420
attgacgagc tgatgcaggc cctgaacttc aatagcgaga ccgtgcccca gaaaagcagc 480
ctggaggagc ccgacttcta caagaccaag atcaagctgt gcatcctgct gcacgccttc 540
agaatcagag ccgtaaccat cgacagagtg atgagctacc tgaacgccag t 591
<210> 114
<211> 591
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> vH3 IL-12α
<400> 114
agaaacctgc ccgtggccac ccctgacccc ggcatgttcc cctgcctgca ccacagccag 60
aacctgctga gagccgtaag caacatgctg cagaaggcca gacagactct ggagttctac 120
ccctgcacca gcgaggagat cgatcacgag gacatcacca aggacaagac cagtaccgtg 180
gaggcctgcc tgcccctgga gctgaccaag aacgagagct gcctgaacag cagagagacc 240
agctttataa ccaacggcag ctgtctggct agcagaaaga ccagcttcat gatggccctg 300
tgcctgagca gcatctacga ggacttgaag atgtaccagg tggagttcaa gaccatgaac 360
gccaagcttc tgatggaccc caagagacag atctttctgg accagaacat gctggccgtg 420
atcgatgaac tgatgcaggc cctgaacttc aacagcgaga ccgtgcccca gaagagcagt 480
ctggaggagc ccgacttcta caagactaag atcaagctgt gcatcctgct gcacgccttc 540
agaatcagag ccgtgaccat cgacagagtg atgagctacc tgaacgcctc a 591
<210> 115
<211> 591
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A1 IL-12α
<400> 115
agaaatcttc cagtagctac ccccgacccc ggcatgtttc cctgtctgca ccattctcaa 60
aacctgttac gggccgtgag caacatgctg cagaaggcca gacagacact ggagttttac 120
ccctgtacct cagaggagat cgatcatgag gacattacta aggacaagac cagcaccgtg 180
gaagcctgcc tgcccctaga gctaaccaag aacgagagct gcctgaactc tagagagaca 240
agcttcatca cgaacggctc atgcctggcc agtaggaaaa ccagcttcat gatggctctg 300
tgcctgagct ccatatatga ggaccttaag atgtaccagg tggagttcaa aaccatgaac 360
gccaagctgc tgatggaccc aaagagacag atcttccttg accagaacat gctggccgtt 420
atcgatgagc tgatgcaggc cctgaacttc aacagcgaga ccgtgcccca gaaaagcagc 480
ctggaggaac ccgacttcta caaaaccaag atcaagctgt gcattctgct gcatgccttc 540
cgcattagag ccgtgaccat cgatagggtg atgagctacc tgaacgccag c 591
<210> 116
<211> 588
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A2 IL-12α
<400> 116
agaaacctcc ccgtggcaac ccctgacccc gggatgtttc cttgcctgca ccactcccag 60
aacctcctga gagccgtgtc caacatgctg cagaaagcca gacagaccct cgagttctat 120
ccctgcacaa gcgaggagat cgaccacgag gacatcacta aggacaagac cagcacagtg 180
gaagcctgcc tcccgctgga gctgactaag aacgagagct gtctgaacag cagggagacc 240
agcttcatca ccaacggcag ctgcctggcg agcagaaaaa cctcctttat gatggcgctc 300
tgcctgagct caatctatga ggacctgaag atgtaccagg tggagtttaa aaccatgaat 360
gccaagctgc ttatggaccc taagagacag attttcctgg atcagaacat gctggccgtg 420
attgatgaat taatgcaggc gctgaacttt aacagcgaga ccgtgcccca gaaaagcagc 480
ctggaggagc ccgactttta caagaccaag atcaagttgt gcatcctcct gcacgccttc 540
agaatcagag cggtgacgat cgacagagtc atgagctacc tcaacgct 588
<210> 117
<211> 591
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A3 IL-12α
<400> 117
agaaacctgc ccgtggccac ccccgacccc ggcatgttcc cctgcctgca ccacagccag 60
aacctgctga gagccgtgag caacatgctg cagaaggcca gacagaccct ggagttctac 120
ccctgcacca gcgaggagat cgaccacgag gacatcacca aggacaagac cagcaccgtg 180
gaggcctgcc tgcccctgga gctgaccaag aacgagagct gcctgaacag cagagagacc 240
agcttcatca ccaacggcag ctgcctggcc agcagaaaga ccagcttcat gatggccctg 300
tgcctgagca gcatctacga ggacctgaag atgtaccagg tggagttcaa gaccatgaac 360
gccaagctgc tgatggaccc caagagacag atcttcctgg accagaacat gctggccgtg 420
atcgacgagc tgatgcaggc cctgaacttc aacagcgaga ccgtgcccca gaaaagcagc 480
ctggaggagc ccgacttcta caagaccaag atcaagctgt gcatcctgct gcacgccttc 540
agaatcagag ccgtgaccat cgacagagtg atgagctacc tgaacgccag c 591
<210> 118
<211> 591
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A4 IL-12α
<400> 118
aggaacctgc ctgtggccac cccagacccc ggcatgttcc cctgcctgca ccacagccag 60
aacctgctgc gggctgtgag caacatgctg cagaaggccc ggcagaccct ggagttctac 120
ccctgcacca gcgaggagat tgaccacgag gacatcacca aggacaagac cagcacagtg 180
gaggcctgcc tgcccctgga gctgaccaag aatgaaagct gcctgaacag ccgggagacc 240
agcttcatca ccaacggcag ctgcctggcc agcaggaaga ccagcttcat gatggccctg 300
tgcctgagca gcatctatga ggacctgaag atgtaccagg tggagttcaa gaccatgaat 360
gccaagctgc tgatggaccc caagaggcag atcttcctgg accagaacat gctggccgtg 420
attgatgagc tgatgcaggc cctgaacttc aacagcgaga ccgtgcccca gaaaagcagc 480
ctggaggagc cagacttcta caagaccaag atcaagctgt gcatcctgct gcacgccttc 540
cgcatccggg ctgtgaccat cgacagagtg atgagctacc tgaatgccag c 591
<210> 119
<211> 591
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> B1 IL-12α
<400> 119
agaaatcttc cagtagctac ccccgacccc ggcatgtttc cctgtctgca ccattctcaa 60
aacctgttac gggccgtgag caacatgctg cagaaggcca gacagacact ggagttttac 120
ccctgtacct cagaggagat cgatcatgag gacattacta aggacaagac cagcaccgtg 180
gaagcctgcc tgcccctaga gctaaccaag aacgagagct gcctgaactc tagagagaca 240
agcttcatca cgaacggctc atgcctggcc agtaggaaaa ccagcttcat gatggctctg 300
tgcctgagct ccatatatga ggaccttaag atgtaccagg tggagttcaa aaccatgaac 360
gccaagctgc tgatggaccc aaagagacag atcttccttg accagaacat gctggccgtt 420
atcgatgagc tgatgcaggc cctgaacttc aacagcgaga ccgtgcccca gaaaagcagc 480
ctggaggaac ccgacttcta caaaaccaag atcaagctgt gcattctgct gcatgccttc 540
cgcattagag ccgtgaccat cgatagggtg atgagctacc tgaacgccag c 591
<210> 120
<211> 591
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> B2 IL-12α
<400> 120
agaaacctcc ccgtggcaac ccctgacccc gggatgtttc cttgcctgca ccactcccag 60
aacctcctga gagccgtgtc caacatgctg cagaaagcca gacagaccct cgagttctat 120
ccctgcacaa gcgaggagat cgaccacgag gacatcacta aggacaagac cagcacagtg 180
gaagcctgcc tcccgctgga gctgactaag aacgagagct gtctgaacag cagggagacc 240
agcttcatca ccaacggcag ctgcctggcg agcagaaaaa cctcctttat gatggcgctc 300
tgcctgagct caatctatga ggacctgaag atgtaccagg tggagtttaa aaccatgaat 360
gccaagctgc ttatggaccc taagagacag attttcctgg atcagaacat gctggccgtg 420
attgatgaat taatgcaggc gctgaacttt aacagcgaga ccgtgcccca gaaaagcagc 480
ctggaggagc ccgactttta caagaccaag atcaagttgt gcatcctcct gcacgccttc 540
agaatcagag cggtgacgat cgacagagtc atgagctacc tcaacgctag c 591
<210> 121
<211> 591
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> B3 IL-12α
<400> 121
agaaacctgc ccgtggccac ccccgacccc ggcatgttcc cctgcctgca ccacagccag 60
aacctgctga gagccgtgag caacatgctg cagaaggcca gacagaccct ggagttctac 120
ccctgcacca gcgaggagat cgaccacgag gacatcacca aggacaagac cagcaccgtg 180
gaggcctgcc tgcccctgga gctgaccaag aacgagagct gcctgaacag cagagagacc 240
agcttcatca ccaacggcag ctgcctggcc agcagaaaga ccagcttcat gatggccctg 300
tgcctgagca gcatctacga ggacctgaag atgtaccagg tggagttcaa gaccatgaac 360
gccaagctgc tgatggaccc caagagacag atcttcctgg accagaacat gctggccgtg 420
atcgacgagc tgatgcaggc cctgaacttc aacagcgaga ccgtgcccca gaaaagcagc 480
ctggaggagc ccgacttcta caagaccaag atcaagctgt gcatcctgct gcacgccttc 540
agaatcagag ccgtgaccat cgacagagtg atgagctacc tgaacgccag c 591
<210> 122
<211> 591
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> B4 IL-12α
<400> 122
aggaacctgc ctgtggccac cccagacccc ggcatgttcc cctgcctgca ccacagccag 60
aacctgctgc gggctgtgag caacatgctg cagaaggccc ggcagaccct ggagttctac 120
ccctgcacca gcgaggagat tgaccacgag gacatcacca aggacaagac cagcacagtg 180
gaggcctgcc tgcccctgga gctgaccaag aatgaaagct gcctgaacag ccgggagacc 240
agcttcatca ccaacggcag ctgcctggcc agcaggaaga ccagcttcat gatggccctg 300
tgcctgagca gcatctatga ggacctgaag atgtaccagg tggagttcaa gaccatgaat 360
gccaagctgc tgatggaccc caagaggcag atcttcctgg accagaacat gctggccgtg 420
attgatgagc tgatgcaggc cctgaacttc aacagcgaga ccgtgcccca gaaaagcagc 480
ctggaggagc cagacttcta caagaccaag atcaagctgt gcatcctgct gcacgccttc 540
cgcatccggg ctgtgaccat cgacagagtg atgagctacc tgaatgccag c 591
<210> 123
<211> 591
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C1 IL-12α
<400> 123
cggaatctgc ctgtcgccac tccagacccc ggcatgttcc catgtctgca tcattctcag 60
aacctgctga gggccgtatc caatatgctg cagaaagcca gacagacctt agagttctat 120
ccctgtacaa gcgaggagat agatcacgag gatattacga aggacaaaac ttctactgtt 180
gaggcgtgtc ttccattaga gctgaccaag aacgaaagct gtctgaatag cagagagact 240
tcatttatca ccaatgggag ttgcttggct agcagaaaga ccagcttcat gatggccctt 300
tgcttgtctt cgatatacga agatcttaag atgtatcaag tggaatttaa gacgatgaac 360
gccaagctgc ttatggatcc caagcgccaa atcttcctgg atcagaacat gttggccgtg 420
attgacgagc tgatgcaagc cctgaatttc aactccgaga ccgtgcctca gaaaagcagc 480
ctcgaggagc ccgacttcta caaaacaaag atcaaactct gcatccttct gcacgccttc 540
agaattagag ccgtgaccat cgacagagtt atgagctacc tgaatgccag c 591
<210> 124
<211> 591
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C2 IL-12α
<400> 124
agaaatcttc cagtagctac ccccgacccc ggcatgtttc cctgtctgca ccattctcaa 60
aacctgttac gggccgtgag caacatgctg cagaaggcca gacagacact ggagttttac 120
ccctgtacct cagaggagat cgatcatgag gacattacta aggacaagac cagcaccgtg 180
gaagcctgcc tgcccctaga gctaaccaag aacgagagct gcctgaactc tagagagaca 240
agcttcatca cgaacggctc atgcctggcc agtaggaaaa ccagcttcat gatggctctg 300
tgcctgagct ccatatatga ggaccttaag atgtaccagg tggagttcaa aaccatgaac 360
gccaagctgc tgatggaccc aaagagacag atcttccttg accagaacat gctggccgtt 420
atcgatgagc tgatgcaggc cctgaacttc aacagcgaga ccgtgcccca gaaaagcagc 480
ctggaggaac ccgacttcta caaaaccaag atcaagctgt gcattctgct gcatgccttc 540
cgcattagag ccgtgaccat cgatagggtg atgagctacc tgaacgccag c 591
<210> 125
<211> 591
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C3 IL-12α
<400> 125
agaaacctcc ccgtggcaac ccctgacccc gggatgtttc cttgcctgca ccactcccag 60
aacctcctga gagccgtgtc caacatgctg cagaaagcca gacagaccct cgagttctat 120
ccctgcacaa gcgaggagat cgaccacgag gacatcacta aggacaagac cagcacagtg 180
gaagcctgcc tcccgctgga gctgactaag aacgagagct gtctgaacag cagggagacc 240
agcttcatca ccaacggcag ctgcctggcg agcagaaaaa cctcctttat gatggcgctc 300
tgcctgagct caatctatga ggacctgaag atgtaccagg tggagtttaa aaccatgaat 360
gccaagctgc ttatggaccc taagagacag attttcctgg atcagaacat gctggccgtg 420
attgatgaat taatgcaggc gctgaacttt aacagcgaga ccgtgcccca gaaaagcagc 480
ctggaggagc ccgactttta caagaccaag atcaagttgt gcatcctcct gcacgccttc 540
agaatcagag cggtgacgat cgacagagtc atgagctacc tcaacgctag c 591
<210> 126
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L1 第二GS接头
<400> 126
ggatcagggg gaggctcg 18
<210> 127
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L2 第二GS接头
<400> 127
ggatcaggag gtgggagc 18
<210> 128
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L3 第二GS接头
<400> 128
ggtagtggcg gggggagc 18
<210> 129
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> M1 第二GS接头
<400> 129
ggcagcggcg gcggatcc 18
<210> 130
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> M2 第二GS接头
<400> 130
ggctcaggcg gagggagt 18
<210> 131
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> M3 第二GS接头
<400> 131
gggagtggcg gtggcagc 18
<210> 132
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> H1 第二GS接头
<400> 132
ggctctggcg gcggcagt 18
<210> 133
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> H2 第二GS接头
<400> 133
ggcagcggcg gcggtagc 18
<210> 134
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> H3 第二GS接头
<400> 134
ggcagcggtg gcggcagc 18
<210> 135
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CO 第二GS接头
<400> 135
ggcagcggcg gcggcagc 18
<210> 136
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CP 第二GS接头
<400> 136
ggcagcggcg gcggcagt 18
<210> 137
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> vH1 第二GS接头
<400> 137
ggcagcggcg gcggcagc 18
<210> 138
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> vH2 第二GS接头
<400> 138
ggcagcggcg gtggcagc 18
<210> 139
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> vH3 第二GS接头
<400> 139
ggcagcggcg gcgggagc 18
<210> 140
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> B1 第二GS接头
<400> 140
ggctctggcg gcggcagt 18
<210> 141
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> B2 第二GS接头
<400> 141
ggcagcggtg gcggcagc 18
<210> 142
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> B3 第二GS接头
<400> 142
ggcagcggcg gcggcagc 18
<210> 143
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> B4 第二GS接头
<400> 143
ggcagcggcg gcggcagt 18
<210> 144
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C1 第二GS接头
<400> 144
ggcagcggcg gcggatcc 18
<210> 145
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C2 第二GS接头
<400> 145
ggctctggcg gcggcagt 18
<210> 146
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C3 第二GS接头
<400> 146
ggcagcggtg gcggcagc 18
<210> 147
<211> 1758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L1 白蛋白
<400> 147
gacgcccata agagcgaagt cgcccaccgc ttcaaggatt tgggtgagga aaacttcaaa 60
gccctggtcc tgatagcgtt tgcccaatat ttgcagcagt gtccattcga agatcacgtg 120
aaattggtga acgaggtaac agaatttgct aagacttgtg tggctgacga gtcggccgaa 180
aactgtgata agagtcttca tacactgttt ggcgataagc tatgtactgt cgctacactt 240
agggagactt acggtgagat ggccgactgc tgcgccaagc aagagccaga acgaaacgag 300
tgttttctgc aacataagga cgacaatccc aacctgccca gattggttcg ccctgaagtt 360
gatgttatgt gcaccgcatt tcacgacaac gaagaaacct ttcttaaaaa gtatctgtac 420
gagatagctc gacgtcaccc ttacttctac gcgcccgaac ttctgttttt cgccaagcga 480
tacaaagccg ctttcacaga gtgttgccaa gctgccgaca aagccgcttg ccttctacca 540
aagcttgacg agctcagaga tgaagggaaa gctagttcgg caaagcaacg attaaagtgt 600
gcatcactgc aaaaattcgg cgaacgagcc tttaaagcat gggcagttgc caggttatcc 660
caaaggttcc cgaaagctga attcgctgag gtgagcaagt tagtcacgga ccttacgaag 720
gtacataccg aatgctgcca cggggacctc ttggagtgcg ctgacgacag ggcggactta 780
gctaaataca tttgcgagaa tcaggactca atcagttcta aacttaaaga atgctgcgag 840
aaaccgctcc tggaaaaatc acattgcatc gccgaggtgg aaaacgatga gatgccagca 900
gatttaccat ctctagccgc cgacttcgtg gaaagtaagg atgtgtgtaa aaactatgcg 960
gaagcaaaag acgtgttcct cggaatgttt ctatacgaat acgctagaag gcatcctgac 1020
tattctgtcg ttttactgct tagactagcg aagacatatg aaacgacgtt agagaaatgc 1080
tgcgcggccg ctgaccccca cgaatgttac gcgaaggtct ttgatgagtt caagcccctg 1140
gttgaggagc cgcaaaacct tattaaacag aattgtgagc tatttgagca gttaggcgaa 1200
tataaattcc agaatgcact tctagtacga tacaccaaaa aggtccctca agtgagcacc 1260
cccactcttg tggaggtatc cagaaatcta ggaaaggtag gctctaaatg ctgcaagcat 1320
cccgaagcca agagaatgcc atgcgctgaa gactacctta gcgttgttct gaatcagttg 1380
tgtgtccttc acgaaaagac gccggtgagt gatcgtgtca cgaagtgctg tacagagagc 1440
ctcgtcaacc gtaggccatg tttctccgct ctcgaggtgg atgaaacata tgtacctaag 1500
gaatttaatg cggaaacttt cacctttcac gcggacatct gtaccctgag cgagaaggag 1560
aggcagataa aaaagcagac ggctcttgta gagttggtca aacataagcc taaggccact 1620
aaagagcagc taaaggcagt aatggacgac tttgcggctt tcgttgagaa gtgctgcaag 1680
gccgacgata aagagacctg tttcgcggaa gaaggtaaaa agttagtggc cgcctcccag 1740
gcggccctgg gcctgtag 1758
<210> 148
<211> 1758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L2 白蛋白
<400> 148
gacgcgcaca aaagcgaggt agcgcatcgc tttaaagact taggagagga aaactttaag 60
gcgctggtgc tcatcgcatt tgcccaatac ttacagcagt gtccttttga ggaccacgta 120
aagcttgtaa acgaagtcac tgaattcgcc aagacatgtg ttgctgacga aagcgcagag 180
aactgtgaca aaagccttca taccctcttt ggtgacaaac tctgcaccgt ggcaactcta 240
agagaaacct acggggaaat ggcagactgc tgcgcaaagc aggaacccga acgcaatgag 300
tgtttcctgc agcacaagga tgataatccc aatctgccac gacttgtacg gccggaggta 360
gatgttatgt gcactgcttt tcatgacaac gaggaaactt tccttaagaa atatctgtat 420
gagatcgcaa ggcggcaccc ttacttctac gcacccgaac tgttgttttt cgcaaagagg 480
tataaggccg catttaccga gtgttgtcag gccgctgata aagccgcctg tcttttgcca 540
aaattagatg aactaaggga cgaaggcaaa gcgagtagcg ccaaacaaag attaaaatgt 600
gcaagcctcc aaaaattcgg tgaaagagca tttaaggcgt gggctgtcgc ccgactttca 660
caacgcttcc ccaaagctga attcgctgag gtttcgaagc tggttaccga cctaactaaa 720
gtgcatacag agtgctgtca tggggatctc ttagagtgcg cggatgaccg ggcagacctg 780
gctaagtaca tatgtgagaa ccaggacagt atatcatcaa agctgaaaga gtgttgtgag 840
aagccactac tcgagaagag tcactgtatt gccgaggtgg aaaatgatga gatgccagcc 900
gatcttcctt ctttggccgc tgactttgta gagagcaagg atgtctgtaa gaactacgct 960
gaggccaagg atgtcttttt ggggatgttc ctctatgagt acgcccgacg acaccctgac 1020
tatagtgtag tacttttgct tagactggct aaaacatatg agacgactct cgaaaagtgc 1080
tgtgccgctg ccgatccaca cgagtgctac gctaaggtgt ttgatgagtt taagccgctg 1140
gtggaggaac cccagaacct gatcaagcag aactgtgaac tattcgagca actaggggag 1200
tacaaattcc agaacgcact tttagtgcgg tacaccaaaa aagtgccaca ggtcagtaca 1260
ccaacattag tggaagtatc caggaacctg ggcaaagtgg gcagcaaatg ctgcaaacat 1320
ccggaggcta agcggatgcc ctgtgcagag gactacctgt ccgtggtgct taaccagctg 1380
tgtgtgcttc acgagaaaac gcctgtgtcc gaccgggtga ccaagtgctg tacggagtca 1440
ctggtaaatc gacgaccgtg tttttcagca ctagaagttg atgaaactta tgtaccgaaa 1500
gagtttaacg cagagacctt tacattccac gccgacatct gcacgctgtc cgagaaggaa 1560
agacagatta aaaagcagac tgccctagtc gagcttgtca aacacaaacc gaaggcaacc 1620
aaggaacagt taaaagcagt gatggatgat tttgctgcgt tcgtcgaaaa atgttgcaaa 1680
gcggacgaca aggagacttg cttcgcagag gaagggaaga aattggttgc ggcgtcccaa 1740
gcggccttag ggctatag 1758
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<400> 164
gatgcccaca agtctgaggt ggcccaccgc ttcaaggacc tgggggagga gaacttcaag 60
gccctggtgc tgattgcctt tgcccagtac ctgcagcagt gcccctttga ggaccacgtg 120
aagctggtga atgaggtgac agaatttgcc aagacctgtg tggctgatga atctgctgag 180
aactgtgaca agagcctgca caccctgttt ggagacaagc tgtgcaccgt ggccaccctg 240
cgggagacct atggagagat ggctgactgc tgtgccaagc aggagcctga gagaaatgaa 300
tgcttcctgc agcacaagga tgacaacccc aacctgcccc ggctggtgcg gcctgaggtg 360
gatgtgatgt gcacagcctt ccatgacaat gaggagacct tcctgaagaa gtacctgtat 420
gaaattgccc ggcggcaccc ctacttctac gcccctgagc tgctgttctt tgccaagcgc 480
tacaaggccg ccttcacaga gtgctgccag gccgctgaca aggccgcctg cctgctgccc 540
aagctggatg agctgagaga tgagggcaag gccagcagcg ccaagcagag gctgaagtgt 600
gccagcctgc agaagtttgg agagcgggcc ttcaaggcct gggccgtggc ccggctgagc 660
cagcgcttcc ccaaggccga gtttgctgag gtgtccaagc tggtgacaga cctgaccaag 720
gtgcacacag agtgctgcca cggggacctg ctggagtgtg ctgatgacag agctgacctg 780
gccaagtaca tctgtgagaa ccaggacagc atcagcagca agctgaagga gtgctgtgag 840
aagcccctgc tggaaaagag ccactgcatc gccgaggtgg agaatgatga gatgcctgct 900
gacctgccca gcctggccgc tgactttgtg gagagcaagg atgtgtgcaa gaactatgca 960
gaggccaagg atgtgttcct gggcatgttc ctgtatgaat atgcccggcg gcacccagac 1020
tacagcgtgg tgctgctgct gcggctggcc aagacctatg agaccaccct ggagaagtgc 1080
tgtgccgctg ctgaccccca tgaatgttat gccaaggtgt ttgatgagtt caagcccctg 1140
gtggaggagc cccagaacct gatcaagcag aactgtgagc tgtttgagca gctgggggag 1200
tacaagttcc agaatgccct gctggtgcgc tacaccaaga aggtgcccca ggtgtccacc 1260
cccaccctgg tggaggtgtc caggaacctg ggcaaggtgg gcagcaagtg ctgcaagcac 1320
cctgaggcca agaggatgcc ctgtgccgag gactacctgt ctgtggtgct gaaccagctg 1380
tgtgtgctgc acgagaagac ccctgtgtct gacagagtga ccaagtgctg cacagagagc 1440
ctggtgaaca gaagaccctg cttcagcgcc ctggaggtgg atgagaccta cgtgcccaag 1500
gagttcaatg ctgagacctt caccttccac gccgacatct gcaccctgtc tgagaaggag 1560
cggcagatca agaagcagac agccctggtg gagctggtga agcacaagcc caaggccacc 1620
aaggagcagc tgaaggctgt gatggatgac tttgctgcct ttgtggagaa gtgctgcaag 1680
gcagatgaca aggagacctg ctttgctgag gagggcaaga agctggtggc cgccagccag 1740
gccgccctgg gcctg 1755
<210> 165
<211> 1755
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C1 白蛋白
<400> 165
gatgcccata aatctgaggt ggcccataga ttcaaggatc tgggcgaaga aaacttcaaa 60
gccttggtct tgatcgcctt tgcccagtac ctgcagcagt gcccctttga ggaccacgtg 120
aagctggtga atgaagtgac cgagtttgcc aagacgtgcg tggctgatga gagcgccgaa 180
aactgcgaca aaagcctgca caccctgttt ggcgacaagc tgtgcaccgt agccaccctg 240
agagaaactt acggcgagat ggctgactgc tgcgccaagc aggagcccga gagaaacgag 300
tgctttctgc agcacaagga cgacaatccc aacctgccca gactggtgag acccgaagtg 360
gatgttatgt gcaccgcttt ccacgacaat gaagagacat ttctcaagaa gtacttgtac 420
gagattgcaa gaagacaccc ttacttttac gcccccgaat tactgttctt cgctaagagg 480
tataaggcag ccttcactga atgctgccag gctgccgaca aagcagcttg cctgctgcca 540
aagctggatg aactgcgaga cgaaggaaag gcgtcctccg ccaagcagcg tttgaagtgc 600
gccagccttc agaagtttgg cgagcgggcc ttcaaggcat gggccgtggc tcgacttagc 660
cagcgttttc ccaaggctga atttgcagag gtgagtaaac tggttaccga tctgacaaag 720
gtgcacaccg agtgctgtca cggtgacctc ttagagtgcg ccgacgacag agccgacctc 780
gccaagtaca tttgtgaaaa ccaagactca atctcttcaa agttaaagga gtgctgcgaa 840
aagcccctgc ttgaaaagag ccactgcatt gccgaagtcg agaatgatga gatgcctgca 900
gacttgccca gcttggcagc cgacttcgtt gagtctaagg acgtgtgcaa gaattacgcc 960
gaggcaaaag acgtgttcct gggcatgttc ctttatgagt acgctagaag acatcccgac 1020
tacagcgtgg tccttctcct taggctcgct aagacttacg agacgacgtt ggagaagtgt 1080
tgtgccgctg cggaccccca cgagtgctat gccaaagtgt tcgatgagtt taaacccctg 1140
gtggaggaac ctcagaacct tatcaagcag aattgtgagt tgttcgaaca gctaggcgag 1200
tacaagttcc agaatgccct gctggtgaga tacacaaaaa aggtgcccca ggtgtcaacc 1260
ccgaccttag tggaagtgtc cagaaacctg ggcaaggtgg gcagcaagtg ctgcaagcac 1320
cccgaagcta agagaatgcc gtgcgcggag gattacctga gcgtggtgct caaccagctg 1380
tgtgtgcttc acgagaaaac acccgtgagc gacagggtga caaaatgttg cacagaaagc 1440
cttgtgaacc ggagaccttg tttcagcgcc ctggaggttg acgagaccta tgttcctaag 1500
gagttcaacg ctgagacttt cacatttcac gctgatatat gtaccctgag cgagaaagaa 1560
agacagatca agaagcagac cgccctggtc gagctggtga aacacaagcc taaggccacg 1620
aaggagcagc tgaaggccgt catggacgac ttcgcagcct tcgtcgagaa atgctgcaaa 1680
gccgacgaca aggaaacctg cttcgccgaa gagggaaaga agctggtggc cgcctcccag 1740
gccgcccttg ggctc 1755
<210> 166
<211> 1755
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C2 白蛋白
<400> 166
gacgcccaca agtccgaggt cgcccacaga ttcaaggatt tgggcgagga gaacttcaag 60
gccctggtgc tgatcgcctt cgcccagtac ttgcagcagt gtcccttcga ggaccatgtg 120
aagctggtga acgaggtgac cgagttcgcc aagacctgtg tggccgacga gagcgccgag 180
aactgcgata agtctctgca cacccttttt ggcgacaaac tgtgcaccgt ggccaccctg 240
agagagacct acggcgagat ggccgactgc tgtgcgaagc aggagcccga gcgcaatgag 300
tgtttcctgc agcataagga cgacaacccc aacctgccca gactggtgag acccgaggtg 360
gacgtgatgt gcaccgcctt ccacgacaac gaggagacct ttctgaaaaa atacctgtac 420
gagatcgcaa gacgccaccc ctacttctac gcccccgagc tgctgttctt cgccaagcgc 480
tacaaggctg ccttcaccga atgctgccag gccgccgata aggccgcgtg cttactgcca 540
aagctggacg agctgagaga cgaggggaaa gcctctagcg ccaaacagag attgaagtgt 600
gccagcctgc agaaattcgg tgagagagcc ttcaaggcct gggccgtggc cagattatca 660
cagcggttcc ccaaggctga attcgccgag gtgagcaaac ttgtcaccga tctgacaaaa 720
gtgcacaccg agtgctgcca tggcgacctg ctggagtgcg ccgacgaccg ggccgacctg 780
gccaagtaca tctgcgagaa ccaggacagc atctccagca agctgaagga gtgctgcgag 840
aagcccctgc tggagaaaag ccactgcatc gccgaggtgg agaatgacga aatgcccgcc 900
gacctgccca gcctggccgc cgacttcgtg gaaagcaagg acgtgtgcaa aaattacgcc 960
gaagccaagg atgtgttctt gggcatgttc ttgtacgagt acgccagacg ccaccccgac 1020
tacagcgtgg tgctgctgct gcggctggcc aagacctacg agaccaccct ggagaagtgc 1080
tgtgctgccg ccgaccccca cgagtgctac gccaaggtat ttgacgagtt caagcccctg 1140
gtggaggagc ctcagaacct gattaagcag aactgtgagc tgttcgagca gctgggcgag 1200
tacaagttcc agaacgccct cctggtgaga tacaccaaaa aggtgcctca ggtaagcact 1260
cccaccctgg tggaggtgag caggaacctc ggcaaggtgg gcagcaaatg ctgcaagcac 1320
ccagaggcca aaagaatgcc ctgcgcagaa gactacctca gcgtggtcct gaaccagctg 1380
tgcgtgctgc acgaaaagac ccctgtgagc gatagagtga caaagtgctg caccgagagc 1440
ctggtgaaca gaagaccctg ttttagcgcc ctggaggtgg acgagaccta cgtgcccaag 1500
gagttcaacg ccgagacgtt cactttccac gcggacatct gcaccctgag cgagaaggag 1560
agacaaatca agaagcagac cgccctagtc gagctggtaa aacacaagcc caaggccacc 1620
aaggagcagc tgaaggccgt gatggacgac tttgcagcct tcgtggagaa gtgctgcaag 1680
gctgacgaca aggagacctg cttcgccgag gagggcaaga agctcgtagc cgccagccag 1740
gccgctctcg gcctt 1755
<210> 167
<211> 1755
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C3 白蛋白
<400> 167
gacgcccaca agagcgaggt ggcccacaga ttcaaggatc tcggggagga gaacttcaag 60
gccctggtgc tgatcgcctt cgcacagtac ctgcagcagt gccccttcga ggaccacgta 120
aaactggtga acgaggtgac ggagttcgcc aagacctgtg ttgccgacga gtcggccgag 180
aattgcgaca agagcctgca taccctgttc ggcgacaagc tgtgcaccgt ggccaccctg 240
agagagacct acggcgagat ggccgactgc tgcgccaagc aagagcccga gagaaacgag 300
tgcttcctgc agcacaagga cgacaacccc aacctgcccc ggctggtgag acccgaggtg 360
gacgtgatgt gcaccgcctt ccacgacaac gaggagacct tcctgaagaa gtatctgtac 420
gagatcgcca gaagacaccc ttatttttac gcccccgagc tgctgttctt cgctaagaga 480
tataaggcag ccttcaccga gtgttgtcag gccgccgata aggccgcttg cctgctgccc 540
aagttggacg agctcagaga cgagggcaag gcgagcagcg ccaagcagag actgaagtgc 600
gccagcctgc agaagttcgg cgagagggcc ttcaaggcct gggcggtggc cagactgtcc 660
cagagatttc ccaaggccga gttcgccgag gtaagcaagc tggtcaccga cctgaccaag 720
gtgcacaccg agtgttgcca cggcgacctg ctggaatgcg ccgatgaccg tgccgacctg 780
gccaagtaca tctgcgagaa tcaggactcc atcagcagca aactgaagga gtgttgcgag 840
aagcccctgc tggaaaagag ccattgcatc gctgaggtgg aaaacgacga gatgcccgca 900
gacctgccca gcctggccgc agactttgtg gaaagtaagg acgtgtgcaa gaactacgcg 960
gaggccaaag acgtgtttct gggcatgttc ctatacgagt atgccagaag acaccccgac 1020
tacagcgttg tgttattgct gagactggcc aagacctacg agactacctt ggagaagtgc 1080
tgcgccgccg ccgaccccca cgagtgctat gccaaggtgt tcgacgagtt caagcccctg 1140
gtggaggagc cccagaatct gattaagcag aattgcgagc tttttgagca gctgggcgag 1200
tataagttcc agaacgccct gctggtgaga tacaccaaaa aggtacctca ggtgagcacc 1260
cccaccctgg tggaggtgag cagaaatctg ggcaaggtgg gcagcaagtg ctgcaagcac 1320
ccggaggcca agagaatgcc ctgtgccgag gattacctgt cagtggtgct gaaccagctg 1380
tgcgttctgc acgaaaagac gcccgtgtcg gacagagtga ccaagtgctg cacggagagc 1440
ctggtgaaca gaagaccgtg cttcagcgcc ctagaggtgg acgagaccta cgtgcccaag 1500
gagttcaacg ccgagacctt caccttccac gccgacatct gtaccctgtc agagaaggag 1560
agacagatca agaagcagac cgccttagtg gagctggtga agcacaagcc caaggccacc 1620
aaggagcagc tgaaagccgt gatggacgat ttcgcagcct tcgtcgagaa gtgctgcaag 1680
gccgacgaca aggaaacttg cttcgccgag gagggcaaga agctggtggc tgcctcgcag 1740
gccgccctcg gcctg 1755
<210> 168
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C1 第三GS接头
<400> 168
ggtggcgggt ctggtggcgg ttct 24
<210> 169
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C2 第三GS接头
<400> 169
ggtggcgggt ctggtggcgg ttct 24
<210> 170
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C3 第三GS接头
<400> 170
ggtggcgggt ctggtggcgg ttct 24
<210> 171
<211> 960
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C1 光蛋白聚糖
<400> 171
cagtactacg attacgactt ccccctgagt atctacggtc agtcctcacc taactgcgcc 60
ccagagtgta actgccccga aagctacccg agcgccatgt actgcgacga gctgaagttg 120
aagtccgtgc ccatggtgcc cccaggcatc aagtacttat acttgaggaa caaccaaatc 180
gatcatatcg acgagaaggc cttcgaaaac gtaaccgacc tgcagtggct gatactggat 240
cacaatctgc tagagaattc caagatcaag ggcagagtgt tctcgaagct gaaacaactg 300
aagaagctgc acatcaacca taacaatctc accgagagcg tgggtcccct gcccaagtcg 360
ctggaggacc tgcagctgac ccacaacaaa ataaccaaac taggcagctt cgaggggttg 420
gtgaatctga ccttcatcca tttgcagcat aacagactaa aggaggatgc cgtgagcgcc 480
gccttcaaag gcctcaagag ccttgagtac ctggacctga gcttcaacca gatcgcccgg 540
ctgcccagtg ggctgcccgt gagcctgctg acgctgtatc tggacaataa caaaatcagc 600
aacatccccg acgaatactt caaaagattc aacgccttac agtacctgcg actcagccac 660
aatgagctcg ctgacagcgg catccctggc aacagcttca acgtgtcatc cctggtggag 720
ctggacctga gttacaataa gctgaagaac atcccaactg tcaatgagaa tttggaaaac 780
tactacctgg aggtgaacca gctggagaag ttcgacatta agagcttttg caaaatcctg 840
ggcccactgt catatagcaa gatcaagcac ctgcgactgg acggcaaccg aatcagtgaa 900
acttccctac cccctgacat gtacgagtgc ctgagagtag caaatgaggt gaccctgaac 960
<210> 172
<211> 960
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C2 光蛋白聚糖
<400> 172
cagtattacg actacgattt ccccctgagc atctatggcc agagcagccc taactgcgcc 60
ccggagtgca actgccccga aagctaccca agcgccatgt actgcgatga gctgaagctg 120
aagtctgtgc ctatggtgcc tcccggcatc aagtacctgt acctgagaaa caaccagata 180
gaccacatcg atgagaaagc cttcgagaac gtcaccgacc tgcagtggct gattctggac 240
cacaatttac tggagaactc caagatcaag ggcagagtgt tctccaagtt aaagcagctg 300
aagaaactgc acatcaatca caacaacctg accgagagcg tgggcccact gcccaagagc 360
ctagaggatc tgcagctcac ccacaacaag atcactaagt tgggcagctt cgagggcctc 420
gtaaacttga cattcataca tctgcagcac aacagactta aggaagacgc cgtgagtgcg 480
gcctttaagg gtctgaaaag cctggagtac ttagacctga gcttcaacca gatcgcaagg 540
ctgcccagcg gccttccggt cagtctgctg accctgtatc tggacaacaa caagatcagc 600
aacatccccg acgagtactt caagcggttt aacgccctcc agtacctgag actgagccac 660
aacgagttag ctgactcggg catacccggt aacagcttca atgttagcag cctagttgag 720
cttgacttga gctacaacaa gcttaagaac atcccaaccg tgaacgagaa cctcgagaat 780
tactacctgg aagtcaacca gctggagaag ttcgacatta agagcttctg caaaatcctg 840
ggcccactgt cctatagcaa gatcaagcac ctgcgccttg acggaaacag aattagcgag 900
accagccttc caccagacat gtacgagtgc ctgagggtgg ccaacgaggt gaccctgaac 960
<210> 173
<211> 960
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C3 光蛋白聚糖
<400> 173
cagtactacg actacgattt ccccctatcc atctacgggc agagctcgcc taactgcgcc 60
cccgagtgta actgccccga gtcgtacccc agcgccatgt actgtgacga gctgaagctg 120
aaaagcgtgc ccatggtgcc ccccggcatc aagtacctgt acttgagaaa caaccagatc 180
gaccacattg acgaaaaggc cttcgagaac gtaaccgacc tgcagtggct gatcctggac 240
cacaacctgc ttgagaacag caagatcaag ggccgcgtgt tcagcaagct gaagcagctg 300
aagaagctgc acatcaacca caacaacttg actgagtctg ttggccccct accaaagagc 360
ctggaggacc tgcagctgac ccacaataag ataaccaagc tgggctcatt cgagggcctg 420
gtgaacttga cctttattca cctgcagcat aacagactga aggaggacgc cgtgagcgcc 480
gcctttaagg ggctgaaaag cctggagtac ctggacctga gttttaacca gatcgccaga 540
ctgccctcag gcctgcccgt gagtttgctg actctgtacc tggacaacaa taagatcagc 600
aacattcctg acgagtattt caaaagattc aatgctctgc agtacctgag actaagccac 660
aacgagctgg ccgacagcgg aatccccggc aacagcttca acgtgagcag cttggtggag 720
ttggacctga gctacaacaa actgaagaac atccccaccg tcaatgagaa cttggagaat 780
tactacctcg aggttaacca gcttgagaag ttcgacatca agagcttctg caagatcctg 840
ggccccctca gctacagcaa gatcaagcac ttgagactgg acgggaacag aatcagcgaa 900
accagccttc ctcccgacat gtacgagtgc cttagagtgg caaatgaggt gaccctgaac 960
<210> 174
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Kozak序列
<400> 174
gccgccrcca ugg 13
<210> 175
<400> 175
000
<210> 176
<400> 176
000
<210> 177
<400> 177
000
<210> 178
<400> 178
000
<210> 179
<400> 179
000
<210> 180
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前导序列
<400> 180
Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15
Gly Ala Arg Cys Ala
20
<210> 181
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 181
taatacgact cactataatg gactacgaca tagt 34
<210> 182
<211> 547
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 野生型 IL-12
<400> 182
Met Cys Pro Ala Arg Ser Leu Leu Leu Val Ala Thr Leu Val Leu Leu
1 5 10 15
Asp His Leu Ser Leu Ala Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro
20 25 30
Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val
35 40 45
Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys
50 55 60
Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser
65 70 75 80
Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys
85 90 95
Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala
100 105 110
Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr
115 120 125
Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys
130 135 140
Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu
145 150 155 160
Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr
165 170 175
Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys
180 185 190
Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr
195 200 205
Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser Met Cys His Gln Gln
210 215 220
Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu Ala Ser Pro Leu Val
225 230 235 240
Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp
245 250 255
Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu Thr Cys Asp Thr Pro
260 265 270
Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu
275 280 285
Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala
290 295 300
Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val Leu Ser His Ser Leu
305 310 315 320
Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu
325 330 335
Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe Leu Arg Cys Glu Ala
340 345 350
Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Thr Ile Ser
355 360 365
Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro
370 375 380
Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser Ala Glu Arg Val Arg
385 390 395 400
Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu Cys Gln Glu Asp Ser
405 410 415
Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile Glu Val Met Val Asp
420 425 430
Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr Ser Ser Phe Phe Ile
435 440 445
Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln Leu Lys Pro
450 455 460
Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr
465 470 475 480
Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr Phe Cys Val Gln Val
485 490 495
Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg Val Phe Thr Asp Lys
500 505 510
Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala Ser Ile Ser Val Arg
515 520 525
Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Glu Trp Ala Ser Val
530 535 540
Pro Cys Ser
545
<210> 183
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 野生型 IL-12α
<400> 183
Met Cys Pro Ala Arg Ser Leu Leu Leu Val Ala Thr Leu Val Leu Leu
1 5 10 15
Asp His Leu Ser Leu Ala Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro
20 25 30
Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val
35 40 45
Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys
50 55 60
Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser
65 70 75 80
Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys
85 90 95
Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala
100 105 110
Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr
115 120 125
Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys
130 135 140
Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu
145 150 155 160
Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr
165 170 175
Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys
180 185 190
Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr
195 200 205
Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser
210 215
<210> 184
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 野生型 IL-12β
<400> 184
Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu
1 5 10 15
Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val
20 25 30
Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu
35 40 45
Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln
50 55 60
Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys
65 70 75 80
Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val
85 90 95
Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp
100 105 110
Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe
115 120 125
Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp
130 135 140
Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser
165 170 175
Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu
180 185 190
Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile
195 200 205
Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr
210 215 220
Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn
225 230 235 240
Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp
245 250 255
Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr
260 265 270
Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg
275 280 285
Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala
290 295 300
Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser
305 310 315 320
Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser
325
<210> 185
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 185
gaaatattaa aaacaaaatc cgattcggaa aagaa 35

Claims (121)

1.一种分离的多核苷酸，其包含编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的核酸分子，其中所述核酸分子包含与SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ IDNO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ IDNO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ IDNO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ IDNO:73、SEQ ID NO:74或SEQ ID NO:75所示序列至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中编码所述IL-12β的核酸分子包含与SEQID NO:51所示序列至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中编码所述IL-12β的核酸分子包含与SEQID NO:52所示序列至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中编码所述IL-12β的核酸分子包含与SEQID NO:53所示序列至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
5.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中编码所述IL-12β的核酸分子包含与SEQID NO:54所示序列至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
6.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中编码所述IL-12β的核酸分子包含与SEQID NO:55所示序列至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
7.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中编码所述IL-12β的核酸分子包含与SEQID NO:56所示序列至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
8.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中编码所述IL-12β的核酸分子包含与SEQID NO:57所示序列至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
9.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中编码所述IL-12β的核酸分子包含与SEQID NO:58所示序列至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
10.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中编码所述IL-12β的核酸分子包含与SEQ ID NO:59所示序列至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
11.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中编码所述IL-12β的核酸分子包含与SEQ ID NO:65、69或74所示序列至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
12.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中编码所述IL-12β的核酸分子包含与SEQ ID NO:66、70或75所示序列至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
13.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中编码所述IL-12β的核酸分子包含与SEQ ID NO:62所示序列至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
14.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中编码所述IL-12β的核酸分子包含与SEQ ID NO:63所示序列至少99％或100％相同的核苷酸序列。
15.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中编码所述IL-12β的核酸分子包含与SEQ ID NO:64所示序列至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
16.一种分离的多核苷酸，其包含编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的核酸分子，其中所述核酸分子包含与SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQID NO:116、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:124或SEQ ID NO:125所示序列至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的核苷酸序列。
17.根据权利要求16所述的分离的多核苷酸，其中编码所述IL-12α的核酸分子包含与SEQ ID NO:101所示序列至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
18.根据权利要求16所述的分离的多核苷酸，其中编码所述IL-12α的核酸分子包含与SEQ ID NO:102所示序列至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
19.根据权利要求16所述的分离的多核苷酸，其中编码所述IL-12α的核酸分子包含与SEQ ID NO:103所示序列至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
20.根据权利要求16所述的分离的多核苷酸，其中编码所述IL-12α的核酸分子包含与SEQ ID NO:104所示序列至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
21.根据权利要求16所述的分离的多核苷酸，其中编码所述IL-12α的核酸分子包含与SEQ ID NO:105所示序列至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
22.根据权利要求16所述的分离的多核苷酸，其中编码所述IL-12α的核酸分子包含与SEQ ID NO:106所示序列至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
23.根据权利要求16所述的分离的多核苷酸，其中编码所述IL-12α的核酸分子包含与SEQ ID NO:107所示序列至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
24.根据权利要求16所述的分离的多核苷酸，其中编码所述IL-12α的核酸分子包含与SEQ ID NO:108所示序列至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
25.根据权利要求16所述的分离的多核苷酸，其中编码所述IL-12α的核酸分子包含与SEQ ID NO:109所示序列至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
26.根据权利要求16所述的分离的多核苷酸，其中编码所述IL-12α的核酸分子包含与SEQ ID NO:115、119或124所示序列至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
27.根据权利要求16所述的分离的多核苷酸，其中编码所述IL-12α的核酸分子包含与SEQ ID NO:116、120或125所示序列至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
28.根据权利要求16所述的分离的多核苷酸，其中编码所述IL-12α的核酸分子包含与SEQ ID NO:112所示序列至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
29.根据权利要求16所述的分离的多核苷酸，其中编码所述IL-12α的核酸分子包含与SEQ ID NO:113所示序列至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
30.根据权利要求16所述的分离的多核苷酸，其中编码所述IL-12α的核酸分子包含与SEQ ID NO:114所示序列至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
31.一种分离的多核苷酸，其包含第一核酸分子和第二核酸分子，
其中所述第一核酸分子编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)，并且包含与SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ IDNO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ IDNO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74或SEQID NO:75所示序列至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的核苷酸序列；并且
其中所述第二核酸分子编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)，并且包含与SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:117、SEQID NO:118、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:124或SEQ ID NO:125所示序列至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的核苷酸序列。
32.根据权利要求31所述的分离的多核苷酸，其中所述第一核酸分子包含与SEQ IDNO:51所示序列至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列，和/或所述第二核酸分子包含与SEQ ID NO:101所示序列至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
33.根据权利要求31所述的分离的多核苷酸，其中所述第一核酸分子包含与SEQ IDNO:52所示序列至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列，和/或所述第二核酸分子包含与SEQ ID NO:102所示序列至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
34.根据权利要求31所述的分离的多核苷酸，其中所述第一核酸分子包含与SEQ IDNO:53所示序列至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列，和/或所述第二核酸分子包含与SEQ ID NO:103所示序列至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
35.根据权利要求31所述的分离的多核苷酸，其中所述第一核酸分子包含与SEQ IDNO:54所示序列至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列，和/或所述第二核酸分子包含与SEQ ID NO:104所示序列至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
36.根据权利要求31所述的分离的多核苷酸，其中所述第一核酸分子包含与SEQ IDNO:55所示序列至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列，和/或所述第二核酸分子包含与SEQ ID NO:105所示序列至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
37.根据权利要求31所述的分离的多核苷酸，其中所述第一核酸分子包含与SEQ IDNO:56所示序列至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列，和/或所述第二核酸分子包含与SEQ ID NO:106所示序列至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
38.根据权利要求31所述的分离的多核苷酸，其中所述第一核酸分子包含与SEQ IDNO:57所示序列至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列，和/或所述第二核酸分子包含与SEQ IDNO:107所示序列至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
39.根据权利要求31所述的分离的多核苷酸，其中所述第一核酸分子包含与SEQ IDNO:58所示序列至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列，和/或所述第二核酸分子包含与SEQ ID NO:108所示序列至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
40.根据权利要求31所述的分离的多核苷酸，其中所述第一核酸分子包含与SEQ IDNO:59所示序列至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列，和/或所述第二核酸分子包含与109所示序列至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
41.根据权利要求31所述的分离的多核苷酸，其中所述第一核酸分子包含与SEQ IDNO:65、69或74所示序列至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列，和/或所述第二核酸分子包含与SEQ ID NO:115、119或124所示序列至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
42.根据权利要求31所述的分离的多核苷酸，其中所述第一核酸分子包含与SEQ IDNO:66、70或75所示序列至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列，和/或所述第二核酸分子包含与SEQ ID NO:116、120或125所示序列至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
43.根据权利要求31所述的分离的多核苷酸，其中所述第一核酸分子包含与SEQ IDNO:62所示序列至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列，和/或所述第二核酸分子包含与SEQ ID NO:112所示序列至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
44.根据权利要求31所述的分离的多核苷酸，其中所述第一核酸分子包含与SEQ IDNO:63所示序列至少99％或100％相同的核苷酸序列，和/或所述第二核酸分子包含与SEQID NO:113所示序列至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
45.根据权利要求31所述的分离的多核苷酸，其中所述第一核酸分子包含与SEQ IDNO:64所示序列至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列，和/或所述第二核酸分子包含与SEQ ID NO:114所示序列至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
46.根据权利要求31至45中任一项所述的分离的多核苷酸，其还包含第三核酸分子，所述第三核酸分子编码连接所述第一核酸分子和所述第二核酸分子的接头。
47.根据权利要求46所述的分离的多核苷酸，其中所述接头包括至少约2、至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9、至少约10、至少约11、至少约12、至少约13、至少约14、至少约15、至少约16、至少约17、至少约18、至少约19或至少约20个氨基酸的氨基酸接头。
48.根据权利要求46或47所述的分离的多核苷酸，其中所述接头包括(GS)接头。
49.根据权利要求48所述的分离的多核苷酸，其中所述(GS)接头具有式(Gly3Ser)n或S(Gly3Ser)n，其中n是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80或100的正整数。
50.根据权利要求49所述的分离的多核苷酸，其中所述(Gly3Ser)n接头是(Gly3Ser)3或(Gly3Ser)4。
51.根据权利要求46至50中任一项所述的分离的多核苷酸，其中编码所述接头的第三核酸分子包含SEQ ID NO:168至170中任一个所示的序列。
52.根据权利要求1至51中任一项所述的分离的多核苷酸，其还包含编码半衰期延长部分的另外的核酸分子。
53.根据权利要求52所述的分离的多核苷酸，其中所述半衰期延长部分包括Fc、白蛋白或其片段、白蛋白结合部分、PAS、HAP、转铁蛋白或其片段、XTEN、或它们的任何组合。
54.根据权利要求1至53中任一项所述的分离的多核苷酸，其还包含编码前导序列的另外的核酸分子。
55.根据权利要求54所述的分离的多核苷酸，其中所述编码前导序列的另外的核酸分子包含SEQ ID NO:26至50中任一个所示的序列。
56.一种分离的多核苷酸，其包含(从5'到3')(i)编码前导序列的第一核酸分子，(ii)编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的第二核酸分子，(iii)编码第一接头的第三核酸分子，(iv)编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的第四核酸分子，(v)编码第二接头的第五核酸分子，以及(vi)编码人血清白蛋白的第六核酸分子，其中：
a.所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:26所示的序列；
b.所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:51所示的序列；
c.所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:76所示的序列；
d.所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:101所示的序列；
e.所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:126所示的序列；并且
f.所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:147所示的序列。
57.一种分离的多核苷酸，其包含(从5'到3')(i)编码前导序列的第一核酸序列，(ii)编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的第二核酸分子，(iii)编码第一接头的第三核酸分子，(iv)编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的第四核酸分子，(v)编码第二接头的第五核酸分子，以及(vi)编码人血清白蛋白的第六核酸分子，其中：
a.所述第一核酸序列包含SEQ ID NO:27所示的序列；
b.所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:52所示的序列；
c.所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:77所示的序列；
d.所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:102所示的序列；
e.所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:127所示的序列；并且
f.所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:148所示的序列。
58.一种分离的多核苷酸，其包含(从5'到3')(i)编码前导序列的第一核酸序列，(ii)编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的第二核酸分子，(iii)编码第一接头的第三核酸分子，(iv)编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的第四核酸分子，(v)编码第二接头的第五核酸分子，以及(vi)编码人血清白蛋白的第六核酸分子，其中：
a.所述第一核酸序列包含SEQ ID NO:28所示的序列；
b.所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:53所示的序列；
c.所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:78所示的序列；
d.所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:103所示的序列；
e.所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:128所示的序列；并且
f.所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:149所示的序列。
59.一种分离的多核苷酸，其包含(从5'到3')(i)编码前导序列的第一核酸分子，(ii)编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的第二核酸分子，(iii)编码第一接头的第三核酸分子，(iv)编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的第四核酸分子，(v)编码第二接头的第五核酸分子，以及(vi)编码人血清白蛋白的第六核酸分子，其中：
a.所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:29所示的序列；
b.所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:54所示的序列；
c.所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:79所示的序列；
d.所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:104所示的序列；
e.所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:129所示的序列；并且
f.所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:150所示的序列。
60.一种分离的多核苷酸，其包含(从5'到3')(i)编码前导序列的第一核酸序列，(ii)编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的第二核酸分子，(iii)编码第一接头的第三核酸分子，(iv)编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的第四核酸分子，(v)编码第二接头的第五核酸分子，以及(vi)编码人血清白蛋白的第六核酸分子，其中：
a.所述第一核酸序列包含SEQ ID NO:30所示的序列；
b.所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:55所示的序列；
c.所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:80所示的序列；
d.所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:105所示的序列；
e.所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:130所示的序列；并且
f.所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:151所示的序列。
61.一种分离的多核苷酸，其包含(从5'到3')(i)编码前导序列的第一核酸序列，(ii)编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的第二核酸分子，(iii)编码第一接头的第三核酸分子，(iv)编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的第四核酸分子，(v)编码第二接头的第五核酸分子，以及(vi)编码人血清白蛋白的第六核酸分子，其中：
a.所述第一核酸序列包含SEQ ID NO:31所示的序列；
b.所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:56所示的序列；
c.所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:81所示的序列；
d.所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:106所示的序列；
e.所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:131所示的序列；并且
f.所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:152所示的序列。
62.一种分离的多核苷酸，其包含(从5'到3')(i)编码前导序列的第一核酸分子，(ii)编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的第二核酸分子，(iii)编码第一接头的第三核酸分子，(iv)编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的第四核酸分子，(v)编码第二接头的第五核酸分子，以及(vi)编码人血清白蛋白的第六核酸分子，其中：
a.所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:32所示的序列；
b.所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:57所示的序列；
c.所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:82所示的序列；
d.所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:107所示的序列；
e.所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:132所示的序列；并且
f.所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:153所示的序列。
63.一种分离的多核苷酸，其包含(从5'到3')(i)编码前导序列的第一核酸序列，(ii)编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的第二核酸分子，(iii)编码第一接头的第三核酸分子，(iv)编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的第四核酸分子，(v)编码第二接头的第五核酸分子，以及(vi)编码人血清白蛋白的第六核酸分子，其中：
a.所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:33所示的序列；
b.所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:58所示的序列；
c.所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:83所示的序列；
d.所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:108所示的序列；
e.所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:133所示的序列；并且
f.所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:154所示的序列。
64.一种分离的多核苷酸，其包含(从5'到3')(i)编码前导序列的第一核酸分子，(ii)编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的第二核酸分子，(iii)编码第一接头的第三核酸分子，(iv)编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的第四核酸分子，(v)编码第二接头的第五核酸分子，以及(vi)编码人血清白蛋白的第六核酸分子，其中：
a.所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:34所示的序列；
b.所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:59所示的序列；
c.所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:84所示的序列；
d.所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:109所示的序列；
e.所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:134所示的序列；并且
f.所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:155所示的序列。
65.一种分离的多核苷酸，其包含(从5'到3')(i)编码前导序列的第一核酸分子，(ii)编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的第二核酸分子，(iii)编码第一接头的第三核酸分子，(iv)编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的第四核酸分子，(v)编码第二接头的第五核酸分子，以及(vi)编码人血清白蛋白的第六核酸分子，其中：
a.所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:37所示的序列；
b.所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:62所示的序列；
c.所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:87所示的序列；
d.所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:112所示的序列；
e.所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:137所示的序列；并且
f.所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:158所示的序列。
66.一种分离的多核苷酸，其包含(从5'到3')(i)编码前导序列的第一核酸分子，(ii)编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的第二核酸分子，(iii)编码第一接头的第三核酸分子，(iv)编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的第四核酸分子，(v)编码第二接头的第五核酸分子，以及(vi)编码人血清白蛋白的第六核酸分子，其中：
a.所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:38所示的序列；
b.所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:63所示的序列；
c.所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:88所示的序列；
d.所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:113所示的序列；
e.所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:138所示的序列；并且
f.所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:159所示的序列。
67.一种分离的多核苷酸，其包含(从5'到3')(i)编码前导序列的第一核酸序列，(ii)编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的第二核酸分子，(iii)编码第一接头的第三核酸分子，(iv)编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的第四核酸分子，(v)编码第二接头的第五核酸分子，以及(vi)编码人血清白蛋白的第六核酸分子，其中：
a.所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:39所示的序列；
b.所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:64所示的序列；
c.所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:89所示的序列；
d.所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:114所示的序列；
e.所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:139所示的序列；并且
f.所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:160所示的序列。
68.一种分离的多核苷酸，其包含(从5'到3')(i)编码前导序列的第一核酸分子，(ii)编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的第二核酸分子，(iii)编码第一接头的第三核酸分子，(iv)编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的第四核酸分子，(v)编码第二接头的第五核酸分子，以及(vi)编码人血清白蛋白的第六核酸分子，其中：
a.所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:44所示的序列；
b.所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:69所示的序列；
c.所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:94所示的序列；
d.所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:119所示的序列；
e.所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:140所示的序列；并且
f.所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:161所示的序列。
69.一种分离的多核苷酸，其包含(从5'到3')(i)编码前导序列的第一核酸分子，(ii)编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的第二核酸分子，(iii)编码第一接头的第三核酸分子，(iv)编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的第四核酸分子，(v)编码第二接头的第五核酸分子，以及(vi)编码人血清白蛋白的第六核酸分子，其中：
a.所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:45所示的序列；
b.所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:70所示的序列；
c.所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:95所示的序列；
d.所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:120所示的序列；
e.所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:141所示的序列；并且
f.所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:162所示的序列。
70.一种分离的多核苷酸，其包含(从5'到3')(i)编码前导序列的第一核酸分子，(ii)编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的第二核酸分子，(iii)编码第一接头的第三核酸分子，(iv)编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的第四核酸分子，(v)编码第二接头的第五核酸分子，以及(vi)编码人血清白蛋白的第六核酸分子，其中：
a.所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:46所示的序列；
b.所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:71所示的序列；
c.所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:96所示的序列；
d.所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:121所示的序列；
e.所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:142所示的序列；并且
f.所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:163所示的序列。
71.一种分离的多核苷酸，其包含(从5'到3')(i)编码前导序列的第一核酸分子，(ii)编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的第二核酸分子，(iii)编码第一接头的第三核酸分子，(iv)编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的第四核酸分子，(v)编码第二接头的第五核酸分子，以及(vi)编码人血清白蛋白的第六核酸分子，其中：
a.所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:47所示的序列；
b.所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:72所示的序列；
c.所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:97所示的序列；
d.所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:122所示的序列；
e.所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:143所示的序列；并且
f.所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:164所示的序列。
72.一种分离的多核苷酸，其包含(从5'到3')(i)编码前导序列的第一核酸分子，(ii)编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的第二核酸分子，(iii)编码第一接头的第三核酸分子，(iv)编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的第四核酸分子，(v)编码第二接头的第五核酸分子，以及(vi)编码人血清白蛋白的第六核酸分子，其中：
a.所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:36所示的序列；
b.所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:61所示的序列；
c.所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:86所示的序列；
d.所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:111所示的序列；
e.所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:136所示的序列；并且
f.所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:157所示的序列。
73.一种分离的多核苷酸，其包含(从5'到3')(i)编码前导序列的第一核酸分子，(ii)编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的第二核酸分子，(iii)编码第一接头的第三核酸分子，(iv)编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的第四核酸分子，(v)编码第二接头的第五核酸分子，(vi)编码人血清白蛋白的第六核酸分子，(vii)编码第三接头的第七核酸分子；以及(viii)编码光蛋白聚糖蛋白的第八核酸分子，其中：
a.所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:48所示的序列；
b.所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:73所示的序列；
c.所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:98所示的序列；
d.所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:123所示的序列；
e.所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:144所示的序列；
f.所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:165所示的序列；
g.所述第七核酸分子包含SEQ ID NO:168所示的序列；并且
h.所述第八核酸分子包含SEQ ID NO:171所示的序列。
74.一种分离的多核苷酸，其包含(从5'到3')(i)编码前导序列的第一核酸分子，(ii)编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的第二核酸分子，(iii)编码第一接头的第三核酸分子，(iv)编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的第四核酸分子，(v)编码第二接头的第五核酸分子，(vi)编码人血清白蛋白的第六核酸分子，(vii)编码第三接头的第七核酸分子；以及(viii)编码光蛋白聚糖蛋白的第八核酸分子，其中：
a.所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:49所示的序列；
b.所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:74所示的序列；
c.所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:99所示的序列；
d.所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:124所示的序列；
e.所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:145所示的序列；
f.所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:166所示的序列；
g.所述第七核酸分子包含SEQ ID NO:169所示的序列；并且
h.所述第八核酸分子包含SEQ ID NO:172所示的序列。
75.一种分离的多核苷酸，其包含(从5'到3')(i)编码前导序列的第一核酸分子，(ii)编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的第二核酸分子，(iii)编码第一接头的第三核酸分子，(iv)编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的第四核酸分子，(v)编码第二接头的第五核酸分子，(vi)编码人血清白蛋白的第六核酸分子，(vii)编码第三接头的第七核酸分子，以及(viii)编码光蛋白聚糖蛋白的第八核酸分子，其中：
a.所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:50所示的序列；
b.所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:75所示的序列；
c.所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:100所示的序列；
d.所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:125所示的序列；
e.所述第五核酸分子包含SEQ ID NO:146所示的序列；
f.所述第六核酸分子包含SEQ ID NO:167所示的序列；
g.所述第七核酸分子包含SEQ ID NO:170所示的序列；并且
h.所述第八核酸分子包含SEQ ID NO:173所示的序列。
76.一种分离的多核苷酸，其包含(从5'到3')(i)编码前导序列的第一核酸分子，(ii)编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的第二核酸分子，(iii)编码第一接头的第三核酸分子，以及(iv)编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的第四核酸分子，其中：
a.所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:40所示的序列；
b.所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:65所示的序列；
c.所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:90所示的序列；并且
d.所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:115所示的序列。
77.一种分离的多核苷酸，其包含(从5'到3')(i)编码前导序列的第一核酸分子，(ii)编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的第二核酸分子，(iii)编码第一接头的第三核酸分子，以及(iv)编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的第四核酸分子，其中：
a.所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:41所示的序列；
b.所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:66所示的序列；
c.所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:91所示的序列；并且
d.所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:116所示的序列。
78.一种分离的多核苷酸，其包含(从5'到3')(i)编码前导序列的第一核酸分子，(ii)编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的第二核酸分子，(iii)编码第一接头的第三核酸分子，以及(iv)编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的第四核酸分子，其中：
a.所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:42所示的序列；
b.所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:67所示的序列；
c.所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:92所示的序列；并且
d.所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:117所示的序列。
79.一种分离的多核苷酸，其包含(从5'到3')(i)编码前导序列的第一核酸分子，(ii)编码IL-12蛋白的β亚基(“IL-12β”)的第二核酸分子，(iii)编码第一接头的第三核酸分子，以及(iv)编码IL-12蛋白的α亚基(“IL-12α”)的第四核酸分子，其中：
a.所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:43所示的序列；
b.所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:68所示的序列；
c.所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:93所示的序列；并且
d.所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:118所示的序列。
80.根据权利要求1至79中任一项所述的分离的多核苷酸，其还包含5'帽。
81.根据权利要求80所述的分离的多核苷酸，其中所述5'帽选自m2 7,2'-OGppspGRNA、m7GpppG、m7Gppppm7G、m2 (7,3'-O)GpppG、m2 (7,2'-O)GppspG(D1)、m2 (7,2'-O)GppspG(D2)、m2 7,3'- OGppp(m1 2'-O)ApG、(m7G-3'mppp-G；其能够等同地称为3'O-Me-m7G(5')ppp(5')G)、N7,2'-O-二甲基-鸟苷-5'-三磷酸-5'-鸟苷、m7Gm-ppp-G、N7-(4-氯苯氧基乙基)-G(5')ppp(5')G、N7-(4-氯苯氧基乙基)-m3'-OG(5')ppp(5')G、7mG(5')ppp(5')N,pN2p、7mG(5')ppp(5')NlmpNp、7mG(5')-ppp(5')NlmpN2 mp、m(7)Gpppm(3)(6,6,2')Apm(2')Apm(2')Cpm(2)(3,2')Up、肌苷、N1-甲基-鸟苷、2'氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷、2-叠氮基-鸟苷、N1-甲基假尿苷、m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG及其组合。
82.根据权利要求1至81中任一项所述的分离的多核苷酸，其还包含调节元件。
83.根据权利要求82所述的分离的多核苷酸，其中所述调节元件选自至少一个翻译增强子元件(TEE)、翻译起始序列、至少一个微小RNA结合位点或其根源、连接的核苷的3'尾区、富AU元件(ARE)、转录后控制调节子、5'UTR、3'UTR及其组合。
84.根据权利要求1至83中任一项所述的分离的多核苷酸，其还包含连接的核苷的3'尾区。
85.根据权利要求84所述的分离的多核苷酸，其中所述连接的核苷的3'尾区包含聚A尾、聚A-G四联体或茎环序列。
86.根据权利要求1至85中任一项所述的分离的多核苷酸，其包含至少一个经修饰的核苷。
87.根据权利要求86所述的分离的多核苷酸，其中所述至少一个经修饰的核苷选自6-氮杂-胞苷、2-硫代-胞苷、α-硫代-胞苷、假异胞苷、5-氨基烯丙基-尿苷、5-碘-尿苷、N1-甲基-假尿苷、5,6-二氢尿苷、α-硫代-尿苷、4-硫代-尿苷、6-氮杂-尿苷、5-羟基-尿苷、脱氧胸苷、假尿苷、肌苷、α-硫代-鸟苷、8-氧代-鸟苷、O6-甲基-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、N1-甲基腺苷、2-氨基-6-氯-嘌呤、N6-甲基-2-氨基-嘌呤、6-氯-嘌呤、N6-甲基-腺苷、α-硫代-腺苷、8-叠氮基-腺苷、7-脱氮-腺苷、吡咯并胞苷、5-甲基-胞苷、N4-乙酰基-胞苷、5-甲基-尿苷、5-碘-胞苷及其组合。
88.根据权利要求1至87中任一项所述的分离的多核苷酸，其能够自我复制。
89.根据权利要求88所述的分离的多核苷酸，其是自我扩增复制子RNA。
90.根据权利要求89所述的分离的多核苷酸，其中所述自我扩增复制子RNA源自甲病毒。
91.根据权利要求90所述的分离的多核苷酸，其中所述甲病毒包括委内瑞拉马脑炎病毒、塞姆利基森林病毒、辛德毕斯病毒或其组合。
92.一种载体，其包含根据权利要求1至91中任一项所述的分离的多核苷酸。
93.一种脂质纳米颗粒，其包含(i)根据权利要求1至92中任一项所述的分离的多核苷酸，和(ii)一种或多种类型的脂质。
94.根据权利要求93所述的脂质纳米颗粒，其中所述一种或多种类型的脂质包括阳离子脂质或类脂质。
95.根据权利要求93或94所述的脂质纳米颗粒，其中所述一种或多种类型的脂质是N1,N3,N5-三(3-(双十二烷基氨基)丙基)苯-1,3,5-三甲酰胺(TT3)。
96.根据权利要求93至95中任一项所述的脂质纳米颗粒，其包含1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、胆固醇、C14-PEG2000或其任何组合。
97.根据权利要求96所述的脂质纳米颗粒，其中所述C14-PEG2000包括1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DMG-PEG2000)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DMPE-PEG2000)或两者。
98.根据权利要求97所述的脂质纳米颗粒，其中将所述C14-PEG2000嵌入所述LNP中。
99.根据权利要求97所述的脂质纳米颗粒，其中在将所述分离的多核苷酸包封在所述脂质纳米颗粒中之后，添加所述C14-PEG2000。
100.根据权利要求93至99中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒具有约30-500nm的直径。
101.根据权利要求93至100中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒具有约50-400nm的直径。
102.根据权利要求93至101中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒具有约70-300nm的直径。
103.根据权利要求93至102中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒具有约100-200nm的直径。
104.根据权利要求93至103中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒具有约100-175nm的直径。
105.根据权利要求93至104中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒具有约100-160nm的直径。
106.根据权利要求93至105中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质和所述分离的多核苷酸(例如，经修饰的RNA)具有约1:2至约15:1的质量比。
107.根据权利要求106所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质和所述分离的多核苷酸(例如，经修饰的RNA)具有1:2、1:1.5、1:1.2、1:1.1、1:1、1.1:1、1.2:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1、5.5:1、6:1、6.5:1、7:1、7.5:1、8:1、8.5:1、9:1、9.5:1、10:1、10.5:1、11:1、11.5:1、12:1、12.5:1、13:1、13.5:1、14:1、14.5:1或15:1的质量比。
108.根据权利要求107所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质和所述分离的多核苷酸(例如，经修饰的RNA)具有约10:1的质量比。
109.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至91中任一项所述的分离的多核苷酸、根据权利要求92所述的载体或根据权利要求93至108中任一项所述的脂质纳米颗粒、以及药学上可接受的载剂。
110.根据权利要求109所述的药物组合物，其被配制用于瘤内、鞘内、肌肉内、静脉内、皮下、吸入、皮内、淋巴内、眼内、腹膜内、胸膜内、脊柱内、血管内、鼻、经皮、舌下、黏膜下、透皮或透黏膜施用。
111.一种细胞，其包含根据权利要求1至91中任一项所述的分离的多核苷酸、根据权利要求92所述的载体或根据权利要求93至108中任一项所述的脂质纳米颗粒。
112.根据权利要求111所述的细胞，其是体外细胞、离体细胞或体内细胞。
113.一种制备多核苷酸的方法，所述方法包括酶促或化学合成根据权利要求1至91中任一项所述的分离的多核苷酸。
114.一种产生IL-12蛋白的方法，所述方法包括使细胞与根据权利要求1至91中任一项所述的分离的多核苷酸、根据权利要求92所述的载体或根据权利要求93至108中任一项所述的脂质纳米颗粒接触。
115.根据权利要求114所述的方法，其中所述接触在体内或离体发生。
116.一种治疗有需要的受试者的疾病或障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1至91中任一项所述的分离的多核苷酸、根据权利要求92所述的载体、根据权利要求93至108中任一项所述的脂质纳米颗粒或根据权利要求109或110所述的药物组合物。
117.根据权利要求116所述的方法，其中所述疾病或障碍包括癌症。
118.根据权利要求117所述的方法，其中所述癌症包括黑色素瘤、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝癌(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepaticcarcinoma)、胃癌、头颈癌或其组合。
119.根据权利要求116至118中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用至少一种另外的治疗剂。
120.根据权利要求119所述的方法，其中所述至少一种另外的治疗剂包括化学治疗药、靶向抗癌疗法、溶瘤药物、细胞毒性剂、基于免疫的疗法、细胞因子、手术、放射手术、共刺激分子的激活剂、免疫检查点抑制剂、疫苗、细胞免疫疗法或其任何组合。
121.根据权利要求120所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂包括抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗LAG-3抗体、抗CTLA-4抗体、抗GITR抗体、抗TIM3抗体或其任何组合。
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