JP2018537521A - 広域インフルエンザウイルスワクチン - Google Patents

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Abstract

本開示は、インフルエンザウイルスリボ核酸（ＲＮＡ）ワクチン、ならびにそのワクチンの使用方法及びそのワクチンを含む組成物に関する。本ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、感染の蔓延、またはアンメットメディカルニーズの程度もしくはレベルに応じて様々な状況で利用することができる。ＲＮＡワクチンを利用して、様々な遺伝子型、株、及び分離株のインフルエンザウイルスを治療及び／または予防することができる。一般的にＲＮＡワクチンは、市販の抗ウイルス治療薬よりもはるかに高い抗体価を生じさせ、より早く応答を生成する点で優れた特性を有する。
【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１０月２２日出願の米国仮出願第６２／２４５，２２５号、２０１５年１０月２８日出願の米国仮出願第６２／２４７，５０１号、２０１５年１０月２９日出願の米国仮出願第６２／２４８，２４８号、及び２０１５年１０月２２日出願の米国仮出願第６２／２４５，０３１号に対する米国特許法１１９（ｅ）条に基づく利益を主張するものであり、それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科のメンバーであり、核タンパク質（ＮＰ）及びマトリックス（Ｍ）タンパク質の抗原性の違いに基づいて、３種類の異なる型（Ａ、Ｂ、及びＣ）に分類される。オルトミクソウイルスは、直径約１００ｎｍのエンベロープ型動物ウイルスである。インフルエンザビリオンは、一本鎖ＲＮＡゲノムを含む内部のリボ核タンパク質コア（らせん状ヌクレオカプシド）と、内側がマトリックスタンパク質（Ｍ１）に覆われた、外側のリポタンパク質エンベロープから構成される。Ａ型インフルエンザウイルスの分節ゲノムは、数種のポリペプチドをコードする線状で負極性の一本鎖ＲＮＡ分子８個（Ｃ型インフルエンザウイルスの場合は７個）からなる。コードされるポリペプチドには、ヌクレオカプシドを形成するＲＮＡ誘導性ＲＮＡポリメラーゼタンパク質（ＰＢ２、ＰＢ１、及びＰＡ）及び核タンパク質（ＮＰ）；マトリックスタンパク質（Ｍ１、ウイルス膜に埋め込まれた表面露出タンパク質でもあるＭ２）；リポタンパク質エンベロープから突出する２つの表面糖タンパク質、すなわちヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）；ならびに非構造タンパク質（ＮＳ１及びＮＳ２）が含まれる。ゲノムの転写及び複製は核内で行われ、組み立ては形質膜で行われる。
ヘマグルチニンはＡ型及びＢ型インフルエンザウイルスの主要なエンベロープ糖タンパク質であり、Ｃ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニン−エステラーゼ（ＨＥ）はＨＡと相同なタンパク質である。インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質は急速に進化するため、新たな株が恒常的に出現し、宿主の適応免疫応答は新たな感染に対する防御性を部分的にしか果たせない。従来型ワクチンを使用した、インフルエンザ及びその他の感染症に対する治療及び予防にとって最大の課題は、ワクチンの幅に限界があり、密接な関連性のある亜型に対してしか防御性を提供できないことである。加えて、現在の標準的なインフルエンザウイルスワクチンの製造工程は、完了までに長時間を要するため、パンデミック状況下において適応するワクチンを迅速に開発及び生産することは困難である。
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ワクチン接種は、インフルエンザ抗原などの外来抗原に対する体液性及び細胞性の免疫応答を刺激するために使用される一種の技術である。遺伝子操作されたＤＮＡ（例えば、裸のプラスミドＤＮＡ）を生存宿主に直接注射することにより、少数の細胞から抗原を直接産生し、防御性の免疫応答を生じさせる。しかしながら、この技術には、癌遺伝子の活性化または腫瘍抑制遺伝子の阻害をもたらし得る挿入変異誘発の可能性を含めた潜在的な問題がある。
本明細書で提供するリボ核酸（ＲＮＡ）ワクチン（または組成物もしくは免疫原性組成物）は、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））によって身体の細胞機構を安全に誘導し、天然タンパク質から抗体、さらには細胞内外で治療活性を有することができる他の全く新しいタンパク質構築物まで、ほぼいかなる目的とするタンパク質をも産生できるという知見に基づいている。本開示のＲＮＡワクチンを使用すると、例えば、挿入変異誘発のリスクを冒さずに、細胞性免疫と体液性免疫の両方を含む、バランスのとれたインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導することができる。
本ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、感染の蔓延、またはアンメットメディカルニーズの程度もしくはレベルに応じて様々な状況で利用することができる。ＲＮＡワクチンを利用して、様々な遺伝子型、株、及び分離株のインフルエンザウイルスを治療及び／または予防することができる。一般的にＲＮＡワクチンは、市販の抗ウイルス治療薬よりもはるかに高い抗体価を生じさせ、より早く応答を生成する点で優れた特性を有する。理論に束縛されるものではないが、ＲＮＡワクチンは天然の細胞機構を取り入れているため、ｍＲＮＡポリヌクレオチドであるＲＮＡワクチンは、翻訳時に適切なタンパク質の立体構造を生成するように良好に設計されると考えられる。ｅｘ ｖｉｖｏで製造され、望ましくない細胞応答を誘発する可能性のある従来型ワクチンとは異なり、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、より自然な方法で細胞系に提示される。
状況によっては、複数のインフルエンザウイルス株に人が感染する危険性にさらされる場合がある。ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）治療用ワクチンは、混合ワクチン接種方法に特に適しているが、これは、製造の迅速性、認識された地理的脅威に適応するようにワクチンを迅速に調整できることなどを含むが、これらに限定されない多数の要因を理由とする。さらに、ＲＮＡワクチンは人体を利用して抗原タンパク質を産生するため、ヒト対象において適切な折りたたみ、表面発現、抗原提示などが可能である、大型で、より複雑な抗原タンパク質の産生に適している。複数のインフルエンザ株から防御するため、第１のインフルエンザウイルスまたは微生物の少なくとも１つの抗原ポリペプチドタンパク質（またはその抗原性部分）をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）と、第２のインフルエンザウイルスまたは微生物の少なくとも１つの抗原ポリペプチドタンパク質（またはその抗原性部分）をコードするＲＮＡをさらに含む混合ワクチンを投与することができる。ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）は、例えば、単一の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中で合剤にすることも、または別々のＬＮＰで製剤化して共投与することもできる。
本開示のいくつかの実施形態は、少なくとも１つのインフルエンザ抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片（例えば、インフルエンザに対する免疫応答を誘導することができる免疫原性断片）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含む、インフルエンザウイルス（インフルエンザ）ワクチン（または組成物もしくは免疫原性組成物）を提供する。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原ポリペプチドとは、ＨＡ１、ＨＡ２と称されるＨＡの規定された抗原サブドメインの１つ、またはＨＡ１とＨＡ２の組み合わせ、ならびにノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックスタンパク質１（Ｍ１）、マトリックスタンパク質２（Ｍ２）、非構造タンパク質１（ＮＳ１）、及び非構造タンパク質２（ＮＳ２）から選択される少なくとも１つの抗原ポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原ポリペプチドとは、ＨＡ１及び／またはＨＡ２由来の抗原配列を含むＨＡまたはその誘導体、ならびにＮＡ、ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１、及びＮＳ２から選択される少なくとも１つの抗原ポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原ポリペプチドとは、ＨＡ１及び／またはＨＡ２由来の抗原配列を含むＨＡまたはその誘導体、ならびにＮＡ、ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１、及びＮＳ２から選択される少なくとも２つの抗原ポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスタンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、複数のインフルエンザウイルスタンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＨＡタンパク質またはその免疫原性断片（例えば、少なくとも１つのＨＡ１、ＨＡ２、またはその両方の組み合わせ）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＨＡタンパク質またはその免疫原性断片（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７、及び／もしくはＨ１８のうちのいずれか１つ、またはそれらのいずれかもしくはすべての組み合わせの少なくとも１つのＨＡ１、ＨＡ２、またはその両方の組み合わせ）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドと、インフルエンザウイルスから得られる、ＮＰタンパク質、ＮＡタンパク質、Ｍ１タンパク質、Ｍ２タンパク質、ＮＳ１タンパク質、及びＮＳ２タンパク質から選択されるタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つの他のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドと、を含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＨＡタンパク質またはその免疫原性断片（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７、及び／もしくはＨ１８のうちのいずれか１つ、またはそれらのいずれかもしくはすべての組み合わせのうちの少なくとも一方）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドと、インフルエンザウイルスから得られる、ＮＰタンパク質、ＮＡタンパク質、Ｍ１タンパク質、Ｍ２タンパク質、ＮＳ１タンパク質、及びＮＳ２タンパク質から選択される２つのタンパク質をコードする２つのオープンリーディングフレームを有する少なくとも２つの他のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドと、を含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＨＡタンパク質またはその免疫原性断片（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７、及び／もしくはＨ１８のうちのいずれか１つ、またはそれらのいずれかもしくはすべての組み合わせのうちの少なくとも一方）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドと、インフルエンザウイルスから得られる、ＮＰタンパク質、ＮＡタンパク質、Ｍ１タンパク質、Ｍ２タンパク質、ＮＳ１タンパク質、及びＮＳ２タンパク質から選択される３つのタンパク質をコードする３つのオープンリーディングフレームを有する少なくとも３つの他のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドと、を含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＨＡタンパク質またはその免疫原性断片（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７、及び／もしくはＨ１８のうちのいずれか１つ、またはそれらのいずれかもしくはすべての組み合わせのうちの少なくとも一方）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドと、インフルエンザウイルスから得られる、ＮＰタンパク質、ＮＡタンパク質、Ｍ１タンパク質、Ｍ２タンパク質、ＮＳ１タンパク質、及びＮＳ２タンパク質から選択される４つのタンパク質をコードする４つのオープンリーディングフレームを有する少なくとも４つの他のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドと、を含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＨＡタンパク質またはその免疫原性断片（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７、及び／もしくはＨ１８のうちのいずれか１つ、またはそれらのいずれかもしくはすべての組み合わせのうちの少なくとも一方）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドと、インフルエンザウイルスから得られる、ＮＰタンパク質、ＮＡタンパク質、Ｍ１タンパク質、Ｍ２タンパク質、ＮＳ１タンパク質、及びＮＳ２タンパク質から選択される５つのタンパク質をコードする５つのオープンリーディングフレームを有する少なくとも５つの他のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドと、を含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡタンパク質またはその免疫原性断片（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７、及び／もしくはＨ１８のうちのいずれか１つ、またはそれらのいずれかもしくはすべての組み合わせのうちの少なくとも一方）、ＮＰタンパク質またはその免疫原性断片、ＮＡタンパク質またはその免疫原性断片、Ｍ１タンパク質またはその免疫原性断片、Ｍ２タンパク質またはその免疫原性断片、ＮＳ１タンパク質またはその免疫原性断片、及びＮＳ２タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
本開示のいくつかの実施形態は、以下の新規インフルエンザウイルスポリペプチド配列を提供する：Ｈ１ＨＡ１０−Ｆｏｌｄｏｎ＿ΔＮｇｌｙ１；Ｈ１ＨＡ１０ＴＭ−ＰＲ８（Ｈ１ Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４ ＨＡ）；Ｈ１ＨＡ１０−ＰＲ８−ＤＳ（Ｈ１ Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４ ＨＡ；ｐＨ１ＨＡ１０−Ｃａｌ０４−ＤＳ（Ｈ１ Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９ ＨＡ）；Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ０４由来のパンデミック型Ｈ１ＨＡ１０；ｐＨ１ＨＡ１０−フェリチン；ＨＡ１０；Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ０４由来のパンデミック型Ｈ１ＨＡ１０； Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ０４株由来のパンデミック型Ｈ１ＨＡ１０（ｆｏｌｄｏｎなし、Ｋ６８Ｃ／Ｒ７６Ｃ変異による三量体化）；Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４株由来のＨ１ＨＡ１０（ｆｏｌｄｏｎなし、Ｙ９４Ｄ／Ｎ９５Ｌ変異による三量体化）；Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４株由来のＨ１ＨＡ１０（ｆｏｌｄｏｎなし、Ｋ６８Ｃ／Ｒ７６Ｃ変異による三量体化）；Ｈ１Ｎ１ Ａ／Ｖｉｅｔ Ｎａｍ／８５０／２００９；Ｈ３Ｎ２ Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５；Ｈ７Ｎ９（Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３）；Ｈ９Ｎ２ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１０７３／９９；Ｈ１０Ｎ８ Ａ／ＪＸ３４６／２０１３。
本開示のいくつかの実施形態は、上記の新規インフルエンザウイルスポリペプチド配列の少なくとも１つのインフルエンザ抗原ポリペプチドまたは免疫原性断片（例えば、インフルエンザに対する免疫応答を誘導することができる免疫原性断片）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含む、インフルエンザウイルス（インフルエンザ）ワクチンを提供する。いくつかの実施形態では、インフルエンザワクチンは、上記の新規インフルエンザウイルス配列のアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％（例えば、端点を含む７５％〜１００％の間の任意の数、例えば、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、及び１００％）同一である修飾配列を含む少なくとも１つのインフルエンザ抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。修飾配列は、上記の新規インフルエンザウイルス配列のアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％（例えば、端点を含む７５％〜１００％の間の任意の数、例えば、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、及び１００％）同一であり得る。
本開示のいくつかの実施形態は、上記の新規インフルエンザウイルスポリペプチド配列をコードする配列を含む単離された核酸；その核酸を含む発現ベクター；及びその核酸を含む宿主細胞を提供する。本開示はまた、上記の新規インフルエンザウイルス配列のいずれかであるポリペプチドを作製する方法を提供する。方法には、上記の新規インフルエンザウイルス配列の核酸発現を可能にする条件下で宿主細胞を培地中で培養し、培養細胞または細胞培地から新規インフルエンザウイルスポリペプチドを精製することを含み得る。本開示はまた、新規インフルエンザウイルス配列に対する全長抗体及び抗体誘導体を含む抗体分子を提供する。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンのオープンリーディングフレームは、コドン最適化されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１〜４４４、４５８、４６０、４６２〜４７９（表７〜１３も参照）のいずれか１つによって特定されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの抗原ポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンはアジュバントをさらに含む。
表７〜１３には、対象となるＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のアクセッション番号を記載している。語句「表７〜１３のアミノ酸配列」とは、７〜１３に列挙された１つ以上のＮＣＢＩアクセッション番号によって特定されるアミノ酸配列を指すものと理解されるべきである。表７〜１３のアクセッション番号に包含されるアミノ酸配列のそれぞれと９５％超の同一性または９８％超の同一性を有する各アミノ酸配列及び変異体は、本開示の構築物（ポリヌクレオチド／ポリペプチド）の範囲内に含まれる。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号４４７〜４５７、４５９、４６１のいずれか１つによって特定される配列を含み、かつ野生型ｍＲＮＡ配列と８０％未満の同一性を有する核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号４４７〜４５７、４５９、４６１のいずれか１つによって特定される配列を含み、かつ野生型ｍＲＮＡ配列と７５％、８５％、または９５％未満の同一性を有する核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号４４７〜４５７、４５９、４６１のいずれか１つによって特定される配列を含み、かつ野生型ｍＲＮＡ配列と５０〜８０％、６０〜８０％、４０〜８０％、３０〜８０％、７０〜８０％、７５〜８０％、または７８〜８０％未満の同一性を有する核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号４４７〜４５７、４５９、４６１のいずれか１つによって特定される配列を含み、かつ野生型ｍＲＮＡ配列と４０〜８５％、５０〜８５％、６０〜８５％、３０〜８５％、７０〜８５％、７５〜８５％、または８０〜８５％未満の同一性を有する核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号４４７〜４５７、４５９、４６１のいずれか１つによって特定される配列を含み、かつ野生型ｍＲＮＡ配列と４０〜９０％、５０〜９０％、６０〜９０％、３０〜９０％、７０〜９０％、７５〜９０％、８０〜９０％、または８５〜９０％未満の同一性を有する核酸によってコードされる。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号４９１〜５０３のいずれか１つによって特定される配列を含み、かつ野生型ｍＲＮＡ配列と８０％未満の同一性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号４９１〜５０３のいずれか１つによって特定される配列を含む核酸によってコードされ、かつ野生型ｍＲＮＡ配列と７５％、８５％、または９５％未満の同一性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号４９１〜５０３のいずれか１つによって特定される配列を含む核酸によってコードされ、かつ野生型ｍＲＮＡ配列と５０〜８０％、６０〜８０％、４０〜８０％、３０〜８０％、７０〜８０％、７５〜８０％、または７８〜８０％未満の同一性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号４９１〜５０３のいずれか１つによって特定される配列を含む核酸によってコードされ、かつ野生型ｍＲＮＡ配列と４０〜８５％、５０〜８５％、６０〜８５％、３０〜８５％、７０〜８５％、７５〜８５％、または８０〜８５％未満の同一性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号４９１〜５０３のいずれか１つによって特定される配列を含む核酸によってコードされ、かつ野生型ｍＲＮＡ配列と４０〜９０％、５０〜９０％、６０〜９０％、３０〜９０％、７０〜９０％、７５〜９０％、８０〜９０％、または８５〜９０％未満の同一性を有する。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１〜４４４、４５８、４６０、４６２〜４７９（表７〜１３も参照）のいずれか１つによって特定されるアミノ酸配列を含み、かつ野生型ｍＲＮＡ配列と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％）の同一性を有する少なくとも１つの抗原ポリペプチドをコードするが、野生型ｍＲＮＡ配列は含まない。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１〜４４４、４５８、４６０、４６２〜４７９（表７〜１３も参照）のいずれか１つによって特定されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの抗原ポリペプチドをコードし、かつ野生型ｍＲＮＡ配列と９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％未満の同一性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１〜４４４、４５８、４６０、４６２〜４７９（表７〜１３も参照）のいずれか１つによって特定されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの抗原ポリペプチドをコードし、かつ野生型ｍＲＮＡ配列と３０〜８０％、４０〜８０％、５０〜８０％、６０〜８０％、７０〜８０％、７５〜８０％、または７８〜８０％、３０〜８５％、４０〜８５％、５０〜８０５％、６０〜８５％、７０〜８５％、７５〜８５％、または７８〜８５％、３０〜９０％、４０〜９０％、５０〜９０％、６０〜９０％、７０〜９０％、７５〜９０％、８０〜９０％、または８５〜９０％の同一性を有する。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１〜４４４、４５８、４６０、４６２〜４７９（表７〜１３も参照）のいずれか１つによって特定されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する、少なくとも１つの抗原ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１〜４４４、４５８、４６０、４６２〜４７９（表７〜１３も参照）のいずれか１つによって特定されるアミノ酸配列と９５％〜９９％の同一性を有する少なくとも１つの抗原ポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１〜４４４、４５８、４６０、４６２〜４７９（表７〜１３も参照）のいずれか１つによって特定されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有し、かつ膜融合活性を有する少なくとも１つの抗原ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１〜４４４、４５８、４６０、４６２〜４７９（表７〜１３も参照）のいずれか１つによって特定されるアミノ酸配列と９５％〜９９％の同一性を有し、かつ膜融合活性を有する少なくとも１つの抗原ポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、細胞受容体に付着する少なくとも１つのインフルエンザ抗原ポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、ウイルス膜と細胞膜の融合を引き起こす少なくとも１つのインフルエンザ抗原ポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、ウイルスが感染先の細胞へ結合する原因となる少なくとも１つのインフルエンザ抗原ポリペプチドをコードする。
本開示のいくつかの実施形態では、少なくとも１つのインフルエンザ抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、少なくとも１つの５’末端キャップ、及び少なくとも１つの化学修飾を有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含み、脂質ナノ粒子に封入して製剤化されているワクチンを提供する。
いくつかの実施形態では、５’末端キャップは７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐである。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの化学修飾は、シュードウリジン、Ｎ１−メチルシュードウリジン、Ｎ１−エチルシュードウリジン、２−チオウリジン、４’−チオウリジン、５−メチルシトシン、５−メチルウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、４−チオ−シュードウリジン、５−アザ−ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５−メトキシウリジン、及び２’−Ｏ−メチルウリジンから選択される。いくつかの実施形態では、化学修飾はウラシルの５位にある。いくつかの実施形態では、化学修飾はＮ１−メチルシュードウリジンである。いくつかの実施形態では、化学修飾はＮ１−エチルシュードウリジンである。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子には、カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、ステロール、及び非カチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質はイオン性のカチオン性脂質であり、非カチオン性脂質は中性脂質であり、ステロールはコレステロールである。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１、３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、ジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）、（１２Ｚ，１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−ノニルヘンイコサ−１２，１５−ジエン−１−アミン（Ｌ６０８）、及びＮ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘプタデカン−８−アミン（Ｌ５３０）からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、脂質は、
である。
いくつかの実施形態では、脂質は、
である。
本開示のいくつかの実施形態では、少なくとも１つのインフルエンザ抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有し、オープンリーディングフレームのウラシルのうち少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％）が化学修飾を有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含むワクチンを提供し、ここで場合により、該ワクチンは脂質ナノ粒子（例えば、脂質ナノ粒子には、カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、ステロール、及び非カチオン性脂質を含む）で製剤化される。
いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームのウラシルのうち１００％が化学修飾を有する。いくつかの実施形態では、化学修飾はウラシルの５位にある。いくつかの実施形態では、化学修飾はＮ１−メチルシュードウリジンである。いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームのウラシルのうち１００％が、ウラシルの５位にＮ１−メチルシュードウリジンを有する。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームは、少なくとも２つのインフルエンザ抗原ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、少なくとも５個または少なくとも１０個の抗原ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、少なくとも１００個の抗原ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、２〜１００個の抗原ポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、少なくとも２つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含み、それぞれが少なくとも１つのインフルエンザ抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する。いくつかの実施形態では、ワクチンは、少なくとも５個または少なくとも１０個のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含み、それぞれが少なくとも１つの抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する。いくつかの実施形態では、ワクチンは、少なくとも１００個のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含み、それぞれが少なくとも１つの抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する。いくつかの実施形態では、ワクチンは、２〜１００個のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含み、それぞれが少なくとも１つの抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのインフルエンザ抗原ポリペプチドがシグナルペプチドと融合される。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＨｕＩｇＧｋシグナルペプチド（ＭＥＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ；配列番号４８０）；ＩｇＥ重鎖イプシロン−１シグナルペプチド（ＭＤＷＴＷＩＬＦＬＶＡＡＡＴＲＶＨＳ；配列番号４８１）；日本脳炎ＰＲＭシグナル配列（ＭＬＧＳＮＳＧＱＲＶＶＦＴＩＬＬＬＬＶＡＰＡＹＳ；配列番号４８２）、ＶＳＶｇタンパク質シグナル配列（ＭＫＣＬＬＹＬＡＦＬＦＩＧＶＮＣＡ；配列番号４８３）、及び日本脳炎ＪＥＶシグナル配列（ＭＷＬＶＳＬＡＩＶＴＡＣＡＧＡ；配列番号４８４）から選択される。
いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、少なくとも１つの抗原ポリペプチドのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、少なくとも１つの抗原ポリペプチドのＣ末端に融合される。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのインフルエンザ抗原ポリペプチドは、変異型Ｎ結合型グリコシル化部位を含む。
本明細書では、ナノ粒子（例えば、脂質ナノ粒子）で製剤化された、上記段落のいずれか１つのインフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンも提供する。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、５０〜２００ｎｍの平均直径を有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は脂質ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、この脂質ナノ粒子には、カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、ステロール、及び非カチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、モル比約２０〜６０％のカチオン性脂質、０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質、２５〜５５％のステロール、及び２５％の非カチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質はイオン性のカチオン性脂質であり、非カチオン性脂質は中性脂質であり、ステロールはコレステロールである。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１、３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択される。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、値０．４未満（例えば、０．３、０．２、または０．１未満）の多分散度を有する。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、中性ｐＨ値で中性の実効電荷を有する。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは多価である。
本開示のいくつかの実施形態は、対象において抗原特異的免疫応答を誘導する方法を提供し、この方法には、本明細書で提供されるＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンのいずれかを、抗原特異的免疫応答を生じさせるのに有効な量で対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンはインフルエンザワクチンである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、インフルエンザワクチン（広域インフルエンザワクチン）の組み合わせを含む混合ワクチンである。
いくつかの実施形態では、抗原特異的免疫応答には、Ｔ細胞応答またはＢ細胞応答を含む。
いくつかの実施形態では、抗原特異的免疫応答を生じさせる方法には、単回量（ブースター量なし）の本開示のインフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンを対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態では、方法にはさらに、第２の（ブースター）量のインフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンを対象に投与することを含む。追加量のインフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンを投与してもよい。
いくつかの実施形態では、対象は、ワクチンの第１回投与または第２回（ブースター）投与後に少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％）の抗体陽転率を示す。抗体陽転とは、特定の抗体が発現し、血液中で検出可能となる期間である。抗体陽転の発生後、抗体に関する血液検査でウイルスを検出することができる。感染中または免疫中に抗原が血液へ侵入すると、免疫系が応答して抗体を産生し始める。抗体陽転前は、抗原自体が検出される場合もされない場合もあるが、抗体は存在しないと考えられる。抗体陽転中は抗体が存在するが、まだ検出可能ではない。抗体陽転後の任意の時点で、血液中の抗体を検出でき、これは過去または現在の感染を表す。
いくつかの実施形態では、インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、皮内注射、筋肉内注射、または鼻腔内投与によって対象に投与される。いくつかの実施形態では、インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、筋肉内注射によって対象に投与される。
本開示のいくつかの実施形態は、対象において抗原特異的免疫応答を誘導する方法を提供し、この方法には、対象において抗原特異的免疫応答を生じさせる有効量でインフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンを対象に投与することを含む。対象における抗原特異的免疫応答は、いくつかの実施形態では、本開示のインフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンのいずれかを対象に投与した後の抗体価について（インフルエンザ抗原ポリペプチドに結合する抗体の力価について）アッセイすることによって決定することができる。いくつかの実施形態では、対象で生じる抗抗原ポリペプチド抗体価は、対照と比較して少なくとも１ｌｏｇ増加する。いくつかの実施形態では、対象で生じる抗抗原ポリペプチド抗体価は、対照と比較して１〜３ｌｏｇ増加する。
いくつかの実施形態では、対象で生じる抗抗原ポリペプチド抗体価は、対照と比較して少なくとも２倍に増加する。いくつかの実施形態では、対象で生じる抗抗原ポリペプチド抗体価は、対照と比較して少なくとも５倍に増加する。いくつかの実施形態では、対象で生じる抗抗原ポリペプチド抗体価は、対照と比較して少なくとも１０倍に増加する。いくつかの実施形態では、対象で生じる抗抗原ポリペプチド抗体価は、対照と比較して２〜１０倍に増加する。
いくつかの実施形態では、対照とは、本開示のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンが投与されていない対象に生じた抗抗原ポリペプチド抗体価である。いくつかの実施形態では、対照とは、生弱毒化または不活化インフルエンザを投与された対象に生じた抗抗原ポリペプチド抗体価であるか、または対照は、組換えまたは精製インフルエンザタンパク質ワクチンを投与された対象に生じた抗抗原ポリペプチド抗体価である。いくつかの実施形態では、対照とは、インフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）ワクチン（例えば、Ｃｏｘ ＲＧ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１４ Ｊｕｎ；８８（１１）：６３６８−６３７９を参照）が投与された対象に生じた抗抗原ポリペプチド抗体価である。
本開示のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、有効量（免疫応答を誘導するのに有効な量）で対象に投与される。いくつかの実施形態では、有効量は、組換えインフルエンザタンパク質ワクチンの標準の治療量の少なくとも２分の１、少なくとも４分の１、少なくとも１０分の１、少なくとも１００分の１、少なくとも１０００分の１に相当する用量であり、その場合の対象に生じた抗抗原ポリペプチド抗体価が、標準の治療量の組換えインフルエンザタンパク質ワクチン、精製インフルエンザタンパク質ワクチン、生弱毒化インフルエンザワクチン、不活化インフルエンザワクチン、またはインフルエンザＶＬＰワクチンを投与された対照対象に生じた抗抗原ポリペプチド抗体価と同等となる。いくつかの実施形態では、有効量は、組換えインフルエンザタンパク質ワクチンの標準の治療量の２分の１〜１０００分の１に相当する用量であり、その場合の対象に生じた抗抗原ポリペプチド抗体価が、標準の治療量の組換えインフルエンザタンパク質ワクチン、精製インフルエンザタンパク質ワクチン、生弱毒化インフルエンザワクチン、不活化インフルエンザワクチン、またはインフルエンザＶＬＰワクチンを投与された対照対象に生じた抗抗原ポリペプチド抗体価と同等となる。
いくつかの実施形態では、対照とは、インフルエンザの構造タンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）ワクチンが投与された対象に生じた抗抗原ポリペプチド抗体価である。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、対象において抗原特異的免疫応答を生じさせる有効量で製剤化される。
いくつかの実施形態では、有効量は、総投与量２５μｇ〜１０００μｇ、または５０μｇ〜１０００μｇである。いくつかの実施形態では、有効量は、総投与量１００μｇである。いくつかの実施形態では、有効量は、２回合計２５μｇを対象に投与した量である。いくつかの実施形態では、有効量は、２回合計１００μｇを対象に投与した量である。いくつかの実施形態では、有効量は、２回合計４００μｇを対象に投与した量である。いくつかの実施形態では、有効量は、２回合計５００μｇを対象に投与した量である。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの効果（ｅｆｆｉｃａｃｙ）（または有効性（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ））は６０％超である。いくつかの実施形態では、ワクチンのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドは、少なくとも１つのインフルエンザ抗原ポリペプチドを含む。
ワクチンの効果は、標準的な分析を用いて評価することができる（例えば、Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２０１０ Ｊｕｎ １；２０１（１１）：１６０７−１０を参照）。例えば、ワクチンの効果は、二重盲検無作為化比較臨床試験によって測定することができる。ワクチンの効果は、ワクチン非接種（ＡＲＵ）の試験コホートとワクチン接種した（ＡＲＶ）試験コホートとの間の発病率（ＡＲ）の減少比で表すことができ、また以下の式を使用してワクチン接種群間の疾患の相対リスク（ＲＲ）から求めることができる：
効果＝（ＡＲＵ−ＡＲＶ）／ＡＲＵｘ１００；及び
効果＝（１−ＲＲ）ｘ１００。
同様に、ワクチンの有効性を、標準的な分析を用いて評価することができる（例えば、Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２０１０ Ｊｕｎ １；２０１（１１）：１６０７−１０を参照）。ワクチンの有効性とは、（高いワクチン効果を有することがすでに証明されている可能性がある）ワクチンが集団の疾病をどれくらい低下させるかについて評価するものである。この測定では、管理された臨床試験ではなく、自然界の条件下で、ワクチン本体のみならずワクチン接種プログラムの利益と有害作用の収支を評価することができる。ワクチンの有効性はワクチンの効果（力価）に比例するが、集団内の標的群がどの程度良好に免疫化されているか、ならびに入院、外来診察、または費用といった「実際の」結果に影響を与える他のワクチン以外の関連要因にも影響される。例えば、感染症例群と適切な対照群とのワクチン接種率を比較する、後向き症例対照分析を使用することができる。ワクチンを接種したにもかかわらず感染症を発症するオッズ比（ＯＲ）を用いて、ワクチンの有効性を比率の差で表すことができる：
有効性＝（１−ＯＲ）ｘ１００。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの効果（または有効性）は、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、または少なくとも９０％である。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、最大２年間、対象をインフルエンザに対して免疫する。いくつかの実施形態では、ワクチンは、２年超、３年超、４年超、または５〜１０年間、対象をインフルエンザに対して免疫する。
いくつかの実施形態では、対象は約５歳以下である。例えば、対象は、約１歳〜約５歳（例えば、約１歳、約２歳、約３歳、約５歳、または約５歳）、または約６か月齢〜約１歳（例えば、約６か月、約７か月、約８か月、約９か月、約１０か月、約１１か月、約１２か月）であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、約１２か月以下（例えば、１２か月、１１か月、１０か月、９か月、８か月、７か月、６か月、５か月、４か月、３か月、２か月、または１か月）である。いくつかの実施形態では、対象は約６か月以下である。
いくつかの実施形態では、対象は満期産（例えば、約３７〜４２週）であった。いくつかの実施形態では、対象は、例えば、妊娠約３６週以前（例えば、約３６週、約３５週、約３４週、約３３週、約３２週、約３１週、約３０週、約２９週、約２８週、約２７週、約２６週、または約２５週）の早産であった。例えば、対象は、妊娠約３２週以前に生まれた可能性がある。いくつかの実施形態では、対象は、妊娠約３２週〜約３６週の早産であった。そのような対象に、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンを、生後、例えば約６か月齢〜約５歳、またはそれ以上の年齢で投与することができる。
いくつかの実施形態では、対象は、約２０歳〜約５０歳（例えば、約２０歳、約２５歳、約３０歳、約３５歳、約４０歳、約４５歳、または約５０歳）の若年成人である。
いくつかの実施形態では、対象は、約６０歳、約７０歳、またはそれ以上（例えば、約６０歳、約６５歳、約７０歳、約７５歳、約８０歳、約８５歳、または約９０歳）の高齢者対象である。
いくつかの実施形態では、対象がインフルエンザ（例えば、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）に曝露しているか、対象がインフルエンザ（例えば、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）に感染しているか、または対象がインフルエンザ（例えば、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）に感染するリスクがある。
いくつかの実施形態では、対象は免疫不全である（免疫系の障害、例えば免疫異常症または自己免疫障害を有する）。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸ワクチンは化学修飾される。他の実施形態では、核酸ワクチンは修飾されていない。
さらに他の態様は、第１のウイルス抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンを対象に投与することを含む、対象にワクチン接種するための組成物及び方法を提供し、その場合、ＲＮＡポリヌクレオチドは安定化エレメントを含まず、かつアジュバントがワクチンと合剤にされていないか、または共投与されない。
他の態様では、本発明は、対象にワクチン接種するための組成物及び方法であり、第１のウイルス抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンを対象に投与することを含み、その場合、用量１０μｇ／ｋｇ〜４００μｇ／ｋｇの核酸ワクチンを対象に投与する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドの用量は、投与あたり１〜５μｇ、５〜１０μｇ、１０〜１５μｇ、１５〜２０μｇ、１０〜２５μｇ、２０〜２５μｇ、２０〜５０μｇ、３０〜５０μｇ、４０〜５０μｇ、４０〜６０μｇ、６０〜８０μｇ、６０〜１００μｇ、５０〜１００μｇ、８０〜１２０μｇ、４０〜１２０μｇ、４０〜１５０μｇ、５０〜１５０μｇ、５０〜２００μｇ、８０〜２００μｇ、１００〜２００μｇ、１２０〜２５０μｇ、１５０〜２５０μｇ、１８０〜２８０μｇ、２００〜３００μｇ、５０〜３００μｇ、８０〜３００μｇ、１００〜３００μｇ、４０〜３００μｇ、５０〜３５０μｇ、１００〜３５０μｇ、２００〜３５０μｇ、３００〜３５０μｇ、３２０〜４００μｇ、４０〜３８０μｇ、４０〜１００μｇ、１００〜４００μｇ、２００〜４００μｇ、または３００〜４００μｇである。いくつかの実施形態では、核酸ワクチンは、皮内注射または筋肉内注射によって対象に投与される。いくつかの実施形態では、核酸ワクチンは、０日目に対象に投与される。いくつかの実施形態では、第２の投与量の核酸ワクチンが２１日目に対象に投与される。
いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンに、用量２５マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンに、用量１００マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンに、用量５０マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンに、用量７５マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンに、用量１５０マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンに、用量４００マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンに、用量２００マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは遠位リンパ節と比較して局所リンパ節に１００倍高いレベルで蓄積する。他の実施形態では、核酸ワクチンは化学修飾され、他の実施形態では、核酸ワクチンは化学修飾されない。
本発明の態様は、第１の抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンを提供し、その場合のＲＮＡポリヌクレオチドは安定化エレメント、及び薬学的に許容される担体または賦形剤を含まず、アジュバントがワクチンに含まれていない。いくつかの実施形態では、安定化エレメントはヒストンステムループである。いくつかの実施形態では、安定化エレメントは、野生型配列と比較してＧＣ含量が増加している核酸配列である。
本発明の態様は、第１の抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含み、当該ＲＮＡポリヌクレオチドが、宿主にｉｎ ｖｉｖｏ投与される製剤中に存在し、ヒト対象に許容されるパーセント比で、第１の抗原に対する抗体保有率の基準を上回る抗体価を与える核酸ワクチンを提供する。いくつかの実施形態では、本発明のｍＲＮＡワクチンによって生じる抗体価は、中和抗体価である。いくつかの実施形態では、中和抗体価はタンパク質ワクチンよりも大きい。他の実施形態では、本発明のｍＲＮＡワクチンによって生じる中和抗体価は、アジュバント添加タンパク質ワクチンよりも大きい。さらに他の実施形態では、本発明のｍＲＮＡワクチンによって生じる中和抗体価は、１，０００〜１０，０００、１，２００〜１０，０００、１，４００〜１０，０００、１，５００〜１０，０００、１，０００〜５，０００、１，０００〜４，０００、１，８００〜１０，０００、２０００〜１０，０００、２，０００〜５，０００、２，０００〜３，０００、２，０００〜４，０００、３，０００〜５，０００、３，０００〜４，０００、または２，０００〜２，５００である。中和価は一般に、プラーク数の５０％減を達成するために必要とされる最も高い血清希釈倍数で表される。
また、第１の抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含み、当該ＲＮＡポリヌクレオチドが、宿主にｉｎ ｖｉｖｏ投与される製剤中に存在しており、安定化エレメントを有するかまたはアジュバントと合剤にされた、第１の抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡワクチンによって誘発される抗体価よりも長く持続する高い抗体価を誘発する核酸ワクチンを提供する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、単回投与の１週間以内に中和抗体を産生するように製剤化される。いくつかの実施形態では、アジュバントは、カチオン性ペプチド及び免疫刺激性核酸から選択される。いくつかの実施形態では、カチオン性ペプチドはプロタミンである。
態様は、少なくとも１つの化学修飾ヌクレオチドまたは場合により非修飾のヌクレオチドを含むオープンリーディングフレームであって、少なくとも第１の抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含み、当該ＲＮＡポリヌクレオチドが、宿主にｉｎ ｖｉｖｏ投与される製剤中に存在しており、その結果、宿主における抗原発現のレベルが、安定化エレメントを有するかまたはアジュバントと合剤にされた、第１の抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡワクチンによって生じる抗原発現のレベルを有意に上回る核酸ワクチンを提供する。
他の態様は、少なくとも１つの化学修飾ヌクレオチドまたは場合により非修飾のヌクレオチドを含むオープンリーディングフレームであって、少なくとも第１の抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンであって、同等の抗体価を生じさせるために、非修飾ｍＲＮＡワクチンの少なくとも１０分の１のＲＮＡポリヌクレオチドしか必要としないワクチンを提供する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは２５〜１００マイクログラムの用量で存在する。
本発明の態様はまた、少なくとも１つの化学修飾ヌクレオチドまたは場合により非修飾のヌクレオチドを含むオープンリーディングフレームであって、少なくとも第１の抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチド１０ｕｇ〜４００ｕｇと、薬学的に許容される担体または賦形剤を含み、ヒト対象に送達するように製剤化された使用単位のワクチンも提供する。いくつかの実施形態では、ワクチンはカチオン性脂質ナノ粒子をさらに含む。
本発明の態様は、個体または個体集団においてウイルス株に対する抗原記憶を構築、維持、または修復する方法を提供し、これには前記個体または集団に、抗原記憶ブースター核酸ワクチンを投与することを含み、当該核酸ワクチンは（ａ）少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドであって、少なくとも１つの化学修飾ヌクレオチドまたは場合により非修飾のヌクレオチド及び２つ以上のコドン最適化されたオープンリーディングフレームを含み、前記オープンリーディングフレームが一連の標準抗原ポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチドと、（ｂ）場合により薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、筋肉内投与、皮内投与、及び皮下投与からなる群から選択される経路を経て個体に投与される。いくつかの実施形態では、投与ステップは、対象の筋肉組織を組成物の注射に適したデバイスと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、投与ステップは、エレクトロポレーションと併用される、組成物の注射に適したデバイスと対象の筋肉組織とを接触させることを含む。
本発明の態様は、対象にワクチン接種する方法を提供し、この方法は、対象にワクチン接種するのに有効な量の第１の抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む、単回用量２５ｕｇ／ｋｇ〜４００ｕｇ／ｋｇの核酸ワクチンを対象に投与することを含む。
他の態様は、少なくとも１つの化学修飾を含むオープンリーディングフレームであって、第１の抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンであって、同等の抗体価を生じさせるために、非修飾ｍＲＮＡワクチンの少なくとも１０分の１のＲＮＡポリヌクレオチドしか必要としないワクチンを提供する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは２５〜１００マイクログラムの用量で存在する。
他の態様は、ヌクレオチド修飾を含まない（非修飾）オープンリーディングフレームであって、第１の抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するＬＮＰ製剤化されたＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンであって、同等の抗体価を生じさせるために、ＬＮＰで製剤化されていない非修飾ｍＲＮＡワクチンの少なくとも１０分の１のＲＮＡポリヌクレオチドしか必要としないワクチンを提供する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは２５〜１００マイクログラムの用量で存在する。
実施例に示されたデータは、本発明の製剤を使用することで免疫応答が有意に増強されたことを示す。化学修飾ＲＮＡワクチン及び非修飾ＲＮＡワクチンのいずれも本発明に有用である。驚くべきことに、ワクチン製造には担体での製剤化に化学修飾されていないｍＲＮＡの使用が好ましいという先行技術の報告とは対照的に、化学修飾されたｍＲＮＡ−ＬＮＰワクチンは、非修飾のｍＲＮＡよりもはるかに少ない有効量のｍＲＮＡ、すなわちＬＮＰ以外の担体で製剤化された非修飾のｍＲＮＡの１０分の１しか必要としなかったことを本明細書で記載する。本発明の化学修飾ＲＮＡワクチン及び非修飾ＲＮＡワクチンはいずれも、別の脂質担体で製剤化されたｍＲＮＡワクチンよりも良好な免疫応答を生じさせる。
他の態様では、本発明は、有効量のウイルス抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンを対象に投与して、対象にワクチン接種をすることを含む、６０歳以上の高齢者対象を治療する方法を包含する。
他の態様では、本発明は、有効量のウイルス抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンを対象に投与して、対象にワクチン接種をすることを含む、１７歳以下の若年対象を治療する方法を包含する。
他の態様では、本発明は、有効量のウイルス抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンを対象に投与して、対象にワクチン接種をすることを含む、成人対象を治療する方法を包含する。
いくつかの態様では、本発明は、抗原をコードする少なくとも２つの核酸配列を含む混合ワクチンで対象にワクチン接種する方法であって、その場合のワクチン用量は、抗原をコードする個々の各核酸の用量が治療用量以下である、治療用量を合計したものである。いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンの合計用量は、２５マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンの合計用量は、１００マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンの合計用量は、５０マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンの合計用量は、７５マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンの合計用量は、１５０マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンの合計用量は、４００マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、抗原をコードする個々の各核酸の治療量以下の用量は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０マイクログラムである。他の実施形態では、核酸ワクチンは化学修飾され、他の実施形態では、核酸ワクチンはヌクレオチドが修飾されていない。
ＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号４４７〜４５７、４５９、４６１、及び４９１〜５０３のうちの１つであり、少なくとも１つの化学修飾を含む。他の実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号４４７〜４５７、４５９、４６１、及び４９１〜５０３のうちの１つであり、ヌクレオチド修飾をまったく含まないか、または修飾されていない。さらに他の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１〜４４４、４５８、４６０、及び４６２〜４７９のいずれかの抗原タンパク質をコードし、少なくとも１つの化学修飾を含む。他の実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１〜４４４、４５８、４６０、及び４６２〜４７９のいずれかの抗原タンパク質をコードし、ヌクレオチド修飾をまったく含まないか、または修飾されていない。
好ましい態様では、本発明のワクチン（例えば、ＬＮＰカプセル化ｍＲＮＡワクチン）は、ワクチン接種された対象の血液または血清中に、予防的及び／または治療的に有効なレベル、濃度、及び／または力価の抗原特異的抗体を生じさせる。本明細書の定義によれば、抗体価という用語は、対象、例えばヒト対象で産生される抗原特異的抗体の量を指す。例示的な実施形態では、抗体価は、持続的に陽性結果を示す（段階希釈での）最大希釈倍数の逆数で表される。例示的な実施形態では、抗体価は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定または測定される。例示的な実施形態では、抗体価は、中和アッセイ、例えばマイクロ中和アッセイによって決定または測定される。ある特定の態様では、抗体価の測定値は、１：４０、１：１００などの比で表される。
本発明の例示的な実施形態では、効果的なワクチンは、１：４０超、１：１００超、１：４００超、１：１０００超、１：２０００超、１：３０００超、１：４０００超、１：５００超、１：６０００超、１：７５００超、１：１００００超の抗体価を生じさせる。例示的な実施形態では、抗体価は、ワクチン接種の１０日後まで、ワクチン接種の２０日後まで、ワクチン接種の３０日後まで、ワクチン接種の４０日後まで、またはワクチン接種の５０日後以降までに生じるか、または達成される。例示的な実施形態では、抗体価は、単回量のワクチンを対象に投与後に生じるかまたは達成される。他の実施形態では、抗体価は複数回投与、例えば第１回投与と第２回投与（例えば、ブースター投与）後に生じるかまたは達成される。
本発明の例示的な態様では、抗原特異的抗体は、μｇ／ｍｌ単位で測定されるか、またはＩＵ／Ｌ単位（リットルあたりの国際単位）またはｍＩＵ／ｍｌ（ｍｌあたりのミリ国際単位）で測定される。本発明の例示的な実施形態では、効果的なワクチンは、＞０．５μｇ／ｍｌ、＞０．１μｇ／ｍｌ、＞０．２μｇ／ｍｌ、＞０．３５μｇ／ｍｌ、＞０．５μｇ／ｍｌ、＞１μｇ／ｍｌ、＞２μｇ／ｍｌ、＞５μｇ／ｍｌ、または＞１０μｇ／ｍｌを生じさせる。本発明の例示的な実施形態では、効果的なワクチンは、＞１０ｍＩＵ／ｍｌ、＞２０ｍＩＵ／ｍｌ、＞５０ｍＩＵ／ｍｌ、＞１００ｍＩＵ／ｍｌ、＞２００ｍＩＵ／ｍｌ、＞５００ｍＩＵ／ｍｌ、または＞１０００ｍＩＵ／ｍｌを生じさせる。例示的な実施形態では、抗体レベルまたは抗体濃度は、ワクチン接種の１０日後まで、ワクチン接種の２０日後まで、ワクチン接種の３０日後まで、ワクチン接種の４０日後まで、またはワクチン接種の５０日後以降までに生じるか、または達成される。例示的な実施形態では、抗体レベルまたは抗体濃度は、単回量のワクチンを対象に投与後に生じるかまたは達成される。他の実施形態では、抗体レベルまたは抗体濃度は複数回投与、例えば第１回投与と第２回投与（例えば、ブースター投与）後に生じるかまたは達成される。例示的な実施形態では、抗体レベルまたは抗体濃度は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定または測定される。例示的な実施形態では、抗体レベルまたは抗体濃度は、中和アッセイ、例えばマイクロ中和アッセイによって決定または測定される。
本開示の種々の実施形態の詳細を以下の説明に記載する。本開示の他の特長、目的、及び利点は、明細書及び特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
前述及び他の目的、特長、及び利点は、添付の図面に示されるような本発明の具体的な実施形態に関する以下の説明から明らかとなるであろう。図面では、それぞれの図を通じて同一参照符号は同じ部分を指す。図面は必ずしも縮尺通りではなく、本発明の様々な実施形態の原理を例示することに重点が置かれている。
異なる株由来のＨＡステムタンパク質配列をコードするＲＮＡによるワクチン接種が、組換えＨＡ（ｒＨＡ）タンパク質の多様なパネルに結合する血清抗体を誘導することを実証する、ＥＬＩＳＡから得たデータを示す。 第２セットのｍＲＮＡワクチン抗原でワクチン接種したマウスから得た血清抗体価が、組換えＨＡ（ｒＨＡ）タンパク質の多様なパネルに結合する血清抗体を誘導することを実証するデータを示す。 Ｈ１株由来のＨＡステムタンパク質をコードするｍＲＮＡと、Ｈ３株由来のＨＡステムタンパク質をコードするｍＲＮＡとの組み合わせが、いずれのＨＡに対しても免疫応答の妨害をもたらさなかったことを示す。 試験ワクチンでワクチン接種された動物からプールした血清のエンドポイント力価を示す。ｘ軸上に試験されたワクチンを示し、異なるインフルエンザ株それぞれに由来するＨＡへの結合をエンドポイント力価としてプロットする。 試験ワクチンでワクチン接種された動物からプールした血清のエンドポイント力価を示す。ｘ軸上に試験されたワクチンを示し、ＮＰタンパク質に対するエンドポイント力価をプロットする。 血清がＨＡ偽型ウイルスのパネルを中和する能力を評価した機能的抗体応答の試験を示す。 血清濃度に対して、誘導倍率（サンプルの発光量／バックグラウンドの発光量）をプロットしたデータを示す。 ｍＲＮＡワクチン接種後の細胞媒介性免疫応答を表す図である。ワクチン接種したマウスから脾細胞を採取し、重複するＮＰペプチドのプールで刺激した。３種のサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、またはＴＮＦ−α）のうちの１つを分泌するＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞の割合をプロットする。 ｍＲＮＡワクチン接種後の細胞媒介性免疫応答を表す図である。ワクチン接種したマウスから脾細胞を採取し、重複するＨＡペプチドのプールで刺激した。３種のサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、またはＴＮＦ−α）のうちの１つを分泌するＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞の割合をプロットする。 致死量のマウス適合Ｈ１Ｎ１ Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４を攻撃接種後のマウスの体重減少を示す。各動物についてベースラインと比較した体重減少率を算出し、群全体にわたって平均した。日数の時間経過に対して群平均をプロットした。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。ＮＩＨＧｅｎ６ＨＡＳＳ−ｆｏｌｄｏｎ＋ＮＰ混合ワクチンの効果は、ＮＩＨＧｅｎ６ＨＡＳＳ−ｆｏｌｄｏｎまたはＮＰ ｍＲＮＡワクチンいずれか単独の効果よりも良好であった。 評価されたすべてのワクチン投与量、ならびにすべての合剤方法及び同時送達方法でワクチン効果が類似していたことを示す。致死量のマウス適合Ｈ１Ｎ１Ａ／ Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４の攻撃接種後、各動物についてベースラインと比較した体重減少率を算出し、群全体にわたって平均した。日数の時間経過に対して群平均をプロットした。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。 図１１Ａは、試験ワクチンでワクチン接種された動物からプールした血清のエンドポイント力価を示す。図１１Ｂは、試験ワクチン（ＮＩＨＧｅｎ６ＨＡＳＳ−ｆｏｌｄｏｎ及びＮＩＨＧｅｎ６ＨＡＳＳ−ＴＭ２）の効果が類似していることを示す。致死量のマウス適合Ｈ１Ｎ１Ａ／ Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４の攻撃接種後、ベースラインと比較した群の体重減少率を算出し、日数の時間経過に対してプロットした。 図１１Ａは、試験ワクチンでワクチン接種された動物からプールした血清のエンドポイント力価を示す。図１１Ｂは、試験ワクチン（ＮＩＨＧｅｎ６ＨＡＳＳ−ｆｏｌｄｏｎ及びＮＩＨＧｅｎ６ＨＡＳＳ−ＴＭ２）の効果が類似していることを示す。致死量のマウス適合Ｈ１Ｎ１Ａ／ Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４の攻撃接種後、ベースラインと比較した群の体重減少率を算出し、日数の時間経過に対してプロットした。 図１２Ａは、Ｈ１亜型由来のコンセンサスＨＡ抗原をコードするｍＲＮＡで免疫したマウスからの血清がＰＲ８ルシフェラーゼウイルスを検出可能に中和できたことを示す。図１２Ｂは、Ｈ１亜型のコンセンサスＨＡ抗原をコードし、フェリチン融合配列を有するｍＲＮＡで免疫したマウスからの血清は、Ｍｅｒｃｋ＿ｐＨ１＿Ｃｏｎ＿フェリチン ｍＲＮＡを除いて、ＰＲ８ルシフェラーゼウイルスを検出可能に中和できたが、コンセンサスＨ３抗原をコードし、フェリチン融合配列を有するｍＲＮＡでワクチン接種したマウスからの血清はＰＲ８ルシフェラーゼウイルスを中和できなかったことを示す。 図１３Ａ〜１３Ｂは、致死量のマウス適合Ｈ１Ｎ１ Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４を攻撃接種後のマウスの体重減少を示す。ベースラインと比較した群の体重減少率を算出し、日数の時間経過に対してプロットした。 コンセンサスＨＡ抗原によって誘発された血清中和活性の幅を評価するために、偽型ウイルスのパネルで実施した中和アッセイの結果を示す。 図１５Ａは、試験ワクチンでワクチン接種された動物からプールした血清の、ＥＬＩＳＡによるエンドポイント抗ＨＡ抗体価を示す。図１５Ｂは、致死量のマウス適合Ｂ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／１９５４を攻撃接種後のマウスの体重減少を示す。ベースラインと比較した群の体重減少率を算出し、日数の時間経過に対してプロットした。 図１５Ａは、試験ワクチンでワクチン接種された動物からプールした血清の、ＥＬＩＳＡによるエンドポイント抗ＨＡ抗体価を示す。図１５Ｂは、致死量のマウス適合Ｂ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／１９５４を攻撃接種後のマウスの体重減少を示す。ベースラインと比較した群の体重減少率を算出し、日数の時間経過に対してプロットした。 図１６Ａ〜１６Ｃは、ＥＬＩＳＡアッセイ（組換え発現されたＮＩＨＧｅｎ６ＨＡＳＳ−ｆｏｌｄｏｎ［ＨＡステム］またはＮＰタンパク質でプレートをコーティング）によって測定されたＮＩＨＧｅｎ６ＨＡＳＳ−ｆｏｌｄｏｎワクチンの強力な抗体応答を表すデータを示す。図１６Ａは、予めＦＬＵＺＯＮＥ（登録商標）でワクチン接種し、ＮＩＨＧｅｎ６ＨＡＳＳ−ｆｏｌｄｏｎ ｍＲＮＡワクチンで１回追加免疫した４匹のアカゲザルに関する経時的なＨＡステムに対する力価を示す。図１６Ｂは、０日目、２８日目、及び５６日目に同じＮＩＨＧｅｎ６ＨＡＳＳ−ｆｏｌｄｏｎ ＲＮＡワクチンでワクチン接種した４匹のアカゲザルからの経時的なＨＡステムに対する力価を示す。図１６Ｃは、０日目、２８日目、及び５６日目にＮＰ ｍＲＮＡワクチンでワクチン接種した４匹のアカゲザルに関する経時的なＮＰに対する抗体価を示し、このワクチンがＮＰに対して強力な抗体応答を誘発したことを示す。 図１７Ａ〜１７Ｂは、多様なインフルエンザ株由来の組換えヘマグルチニン（ｒＨＡ）に結合することができる抗体の有無を調べるＥＬＩＳＡの結果を示す。図１７Ａは、予めＦＬＵＺＯＮＥ（登録商標）でワクチン接種し、ＮＩＨＧｅｎ６ＨＡＳＳ−ｆｏｌｄｏｎ ｍＲＮＡワクチンで１回追加免疫したアカゲザルの結果を示し、図１７Ｂは、０日目、２８日目、及び５６日目に同じＮＩＨＧｅｎ６ＨＡＳＳ−ｆｏｌｄｏｎ ＲＮＡワクチンでワクチン接種した、未処置アカゲザルの結果を示す。 ｍＲＮＡワクチン接種後の細胞媒介性免疫応答を表す図である。ワクチン接種したマカクから末梢血単核球を採取し、重複するＮＰペプチドのプールで刺激した。３種のサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、またはＴＮＦ−α）のうちの１つを分泌するＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞の割合をプロットする。 赤血球凝集抑制（ＨＡＩ）試験の結果を示す。プラセボ対象（各コホートの２５％を対象とする）が含まれている。データはプロトコルごとに示し、２２日目の注射を受けなかったものは除外する。 プラセボ対象（各コホートの２５％を対象とする）を含む、対象ごとのＨＡＩ試験動態を示す。 プラセボ対象（各コホートの２５％を対象とする）を含む、マイクロ中和（ＭＮ）試験の結果を示す。データはプロトコルごとに示し、２２日目の注射を受けなかったものは除外する。 プラセボ対象（各コホートの２５％を対象とする）を含む、対象ごとのＭＮ試験動態を示す。 ＨＡＩとＭＮとの非常に強い相関を示すグラフである。データにはプラセボ対象（各コホートの２５％を対象とする）を含む。
本開示の実施形態は、インフルエンザウイルス抗原をコードするポリヌクレオチドを含むＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンを提供する。本明細書で提供されるインフルエンザウイルスＲＮＡワクチンを使用すると、ＤＮＡワクチン接種に付随する多くのリスクを伴わずに、細胞性免疫と体液性免疫の両方を含む、バランスのとれた免疫応答を誘導することができる。
いくつかの実施形態では、ウイルスは、Ａ型インフルエンザ株もしくはＢ型インフルエンザ株またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、Ａ型インフルエンザ株またはＢ型インフルエンザ株は、鳥類、ブタ、ウマ、イヌ、ヒト、または非ヒト霊長類に関連する。いくつかの実施形態では、抗原ポリペプチドは、ヘマグルチニンタンパク質またはその免疫原性断片をコードする。いくつかの実施形態では、ヘマグルチニンタンパク質は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７、Ｈ１８、またはその免疫原性断片である。いくつかの実施形態では、ヘマグルチニンタンパク質は頭部ドメインを含まない。いくつかの実施形態では、ヘマグルチニンタンパク質は頭部ドメインの一部を含む。いくつかの実施形態では、ヘマグルチニンタンパク質は細胞質ドメインを含まない。いくつかの実施形態では、ヘマグルチニンタンパク質は細胞質ドメインの一部を含む。いくつかの実施形態では、切断型ヘマグルチニンタンパク質は膜貫通ドメインの一部を含む。いくつかの実施形態では、ヘマグルチニンタンパク質またはその断片のアミノ酸配列は、配列番号１〜４４４、４５８、４６０、４６２〜４７９（表７〜１３も参照）のいずれか１つによって特定されるアミノ酸配列を有するアミノ酸配列のいずれかと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスは、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ７Ｎ９、及びＨ１０Ｎ８からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、抗原ポリペプチドは、配列番号１〜４４４、４５８、４６０、４６２〜４７９（表７〜１３も参照）のいずれか１つによって特定されるアミノ酸配列を有するタンパク質、またはその免疫原性断片から選択される。
いくつかの実施形態は、ヘマグルチニンタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドと、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含み、カチオン性脂質ナノ粒子に封入して製剤化されたインフルエンザワクチンを提供する。いくつかの実施形態では、ヘマグルチニンタンパク質は、Ｈ１、Ｈ７、及びＨ１０から選択される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドはさらにノイラミニダーゼタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ヘマグルチニンタンパク質は、Ａ型インフルエンザウイルス株もしくはＢ型インフルエンザウイルス株またはそれらの組み合わせに由来する。いくつかの実施形態では、インフルエンザウイルスは、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ７Ｎ９、及びＨ１０Ｎ８から選択される。
いくつかの実施形態は、本明細書に記載のワクチンのいずれかを対象に投与することを含む、インフルエンザウイルス感染の予防または治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、抗原特異的免疫応答には、Ｔ細胞応答を含む。いくつかの実施形態では、抗原特異的免疫応答には、Ｂ細胞応答を含む。いくつかの実施形態では、抗原特異的免疫応答には、Ｔ細胞応答とＢ細胞応答の両方を含む。いくつかの実施形態では、抗原特異的免疫応答を生成する方法は、ワクチンの単回投与を伴う。いくつかの実施形態では、ワクチンは、皮内、筋肉内注射、皮下注射、鼻腔内接種、または経口投与によって対象に投与される。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドまたはその一部は、インフルエンザ株の１つ以上のポリペプチドまたはその断片を抗原としてコードすることができる。そのような抗原には、本明細書で提示する表に列挙されたポリヌクレオチドまたはそのポリヌクレオチドの一部によってコードされる抗原が含まれるが、これらに限定されない。表中、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号またはＧＩアクセッション番号は、コードされる抗原の完全なＣＤＳまたは部分的なＣＤＳを表す。ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドは、表に列挙された配列のいずれかの領域、または列挙されたｍＲＮＡの全コード領域を含む場合がある。それには、ハイブリッド領域もしくはキメラ領域、または模倣体もしくは変異体を含み得る。
以下の実施形態では、特定のインフルエンザウイルスタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを指す場合、ポリヌクレオチドは、特定のインフルエンザウイルスタンパク質配列のコード領域またはその特定のインフルエンザウイルスタンパク質配列のｍＲＮＡの全コード領域を含み得る。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＨＡタンパク質またはその免疫原性断片（例えば、Ｈ１〜Ｈ１８の少なくとも１つのＨＡ１、ＨＡ２、またはその両方の組み合わせ）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＨＡタンパク質またはその免疫原性断片（例えば、Ｈ１〜Ｈ１８の少なくとも１つのＨＡ１、ＨＡ２、またはその両方の組み合わせ）と、インフルエンザウイルスから得られるＮＰタンパク質、ＮＡタンパク質、Ｍ１タンパク質、Ｍ２タンパク質、ＮＳ１タンパク質、及びＮＳ２タンパク質から選択される少なくとも１つのタンパク質または免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＨＡタンパク質またはその免疫原性断片（例えば、Ｈ１〜Ｈ１８のうちの少なくとも１つ）と、インフルエンザウイルスから得られるＮＰタンパク質、ＮＡタンパク質、Ｍ１タンパク質、Ｍ２タンパク質、ＮＳ１タンパク質、及びＮＳ２タンパク質から選択される少なくとも２つのタンパク質または免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＨＡタンパク質またはその免疫原性断片（例えば、Ｈ１〜Ｈ１８のうちの少なくとも１つ）と、インフルエンザウイルスから得られるＮＰタンパク質、ＮＡタンパク質、Ｍ１タンパク質、Ｍ２タンパク質、ＮＳ１タンパク質、及びＮＳ２タンパク質から選択される少なくとも３つのタンパク質または免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＨＡタンパク質またはその免疫原性断片（例えば、Ｈ１〜Ｈ１８のうちの少なくとも１つ）と、インフルエンザウイルスから得られるＮＰタンパク質、ＮＡタンパク質、Ｍ１タンパク質、Ｍ２タンパク質、ＮＳ１タンパク質、及びＮＳ２タンパク質から選択される少なくとも４つのタンパク質または免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＨＡタンパク質またはその免疫原性断片（例えば、Ｈ１〜Ｈ１８のうちの少なくとも１つ）と、インフルエンザウイルスから得られるＮＰタンパク質、ＮＡタンパク質、Ｍ１タンパク質、Ｍ２タンパク質、ＮＳ１タンパク質、及びＮＳ２タンパク質から選択される少なくとも５つのタンパク質または免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡタンパク質またはその免疫原性断片（例えば、Ｈ１〜Ｈ１８のうちの少なくとも１つ）、ＮＰタンパク質またはその免疫原性断片、ＮＡタンパク質またはその免疫原性断片、Ｍ１タンパク質またはその免疫原性断片、Ｍ２タンパク質またはその免疫原性断片、ＮＳ１タンパク質またはその免疫原性断片、及びＮＳ２タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡタンパク質またはその免疫原性断片、及びＮＡタンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡタンパク質またはその免疫原性断片、及びＭ１タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡタンパク質またはその免疫原性断片、及びＭ２タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡタンパク質またはその免疫原性断片、及びＮＳ１タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡタンパク質またはその免疫原性断片、及びＮＳ２タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡタンパク質またはその免疫原性断片、ＮＰタンパク質、及びＮＡタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡタンパク質、ＮＰタンパク質、またはその免疫原性断片、及びＭ１タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡタンパク質またはその免疫原性断片、ＮＰタンパク質またはその免疫原性断片、及びＭ２タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡタンパク質またはその免疫原性断片、ＮＰタンパク質またはその免疫原性断片、及びＮＳ１タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡタンパク質またはその免疫原性断片、ＮＰタンパク質またはその免疫原性断片、及びＮＳ２タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡタンパク質またはその免疫原性断片、ＮＡタンパク質及びＭ１タンパク質、またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡタンパク質またはその免疫原性断片、ＮＡタンパク質またはその免疫原性断片、及びＭ２タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡタンパク質またはその免疫原性断片、ＮＡタンパク質またはその免疫原性断片、及びＮＳ１タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡタンパク質またはその免疫原性断片、ＮＡタンパク質またはその免疫原性断片、及びＮＳ２タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡタンパク質またはその免疫原性断片、Ｍ１タンパク質またはその免疫原性断片、及びＭ２タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡタンパク質、Ｍ１タンパク質、またはその免疫原性断片、及びＮＳ１タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡタンパク質またはその免疫原性断片、Ｍ１タンパク質またはその免疫原性断片、及びＮＳ２タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡタンパク質またはその免疫原性断片、Ｍ２タンパク質またはその免疫原性断片、及びＮＳ１タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡタンパク質またはその免疫原性断片、Ｍ２タンパク質またはその免疫原性断片、及びＮＳ２タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡタンパク質またはその免疫原性断片、ＮＳ１タンパク質またはその免疫原性断片、及びＮＳ２タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得た、ＨＡ１タンパク質またはその免疫原性断片、及びＮＡタンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡ１タンパク質またはその免疫原性断片、及びＭ１タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡ１タンパク質またはその免疫原性断片、及びＭ２タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡ１タンパク質またはその免疫原性断片、及びＮＳ１タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡ１タンパク質及びＮＳ２タンパク質、またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡ１タンパク質またはその免疫原性断片、ＮＰタンパク質またはその免疫原性断片、及びＮＡタンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡ１タンパク質またはその免疫原性断片、ＮＰタンパク質またはその免疫原性断片、及びＭ１タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡ１タンパク質またはその免疫原性断片、ＮＰタンパク質またはその免疫原性断片、及びＭ２タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡ１タンパク質またはその免疫原性断片、ＮＰタンパク質またはその免疫原性断片、及びＮＳ１タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡ１タンパク質またはその免疫原性断片、ＮＰタンパク質またはその免疫原性断片、及びＮＳ２タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡ１タンパク質またはその免疫原性断片、ＮＡタンパク質またはその免疫原性断片、及びＭ１タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡ１タンパク質またはその免疫原性断片、ＮＡタンパク質またはその免疫原性断片、及びＭ２タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡ１タンパク質またはその免疫原性断片、ＮＡタンパク質及びＮＳ１タンパク質、またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡ１タンパク質またはその免疫原性断片、ＮＡタンパク質またはその免疫原性断片、及びＮＳ２タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡ１タンパク質またはその免疫原性断片、Ｍ１タンパク質またはその免疫原性断片、及びＭ２タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡ１タンパク質またはその免疫原性断片、Ｍ１タンパク質またはその免疫原性断片、及びＮＳ１タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡ１タンパク質またはその免疫原性断片、Ｍ１タンパク質またはその免疫原性断片、及びＮＳ２タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡ１タンパク質またはその免疫原性断片、Ｍ２タンパク質またはその免疫原性断片、及びＮＳ１タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡ１タンパク質またはその免疫原性断片、Ｍ２タンパク質またはその免疫原性断片、及びＮＳ２タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡ１タンパク質またはその免疫原性断片、ＮＳ１タンパク質またはその免疫原性断片、及びＮＳ２タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡタンパク質（ＨＡ１及び／もしくはＨＡ２由来の抗原配列を含むＨＡまたはその誘導体）及びＮＡタンパク質、またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡタンパク質（ＨＡ１及び／もしくはＨＡ２由来の抗原配列を含むＨＡまたはその誘導体）及びＭ１タンパク質、またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡタンパク質（ＨＡ１及び／もしくはＨＡ２由来の抗原配列を含むＨＡまたはその誘導体）及びＭ２タンパク質、またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡタンパク質（ＨＡ１及び／もしくはＨＡ２由来の抗原配列を含むＨＡまたはその誘導体）及びＮＳ１タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡタンパク質（ＨＡ１及び／もしくはＨＡ２由来の抗原配列を含むＨＡまたはその誘導体）及びＮＳ２タンパク質、またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡタンパク質（ＨＡ１及び／もしくはＨＡ２由来の抗原配列を含むＨＡまたはその誘導体）、ＮＰタンパク質またはその免疫原性断片、及びＮＡタンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡタンパク質（ＨＡ１及び／もしくはＨＡ２由来の抗原配列を含むＨＡまたはその誘導体）、ＮＰタンパク質またはその免疫原性断片、及びＭ１タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡタンパク質（ＨＡ１及び／もしくはＨＡ２由来の抗原配列を含むＨＡまたはその誘導体）、ＮＰタンパク質またはその免疫原性断片、Ｍ２タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡタンパク質（ＨＡ１及び／もしくはＨＡ２由来の抗原配列を含むＨＡまたはその誘導体）、ＮＰタンパク質またはその免疫原性断片、及びＮＳ１タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡタンパク質（ＨＡ１及び／もしくはＨＡ２由来の抗原配列を含むＨＡまたはその誘導体）、ＮＰタンパク質、及びＮＳ２タンパク質、またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡタンパク質（ＨＡ１及び／もしくはＨＡ２由来の抗原配列を含むＨＡまたはその誘導体）、ＮＡタンパク質またはその免疫原性断片、及びＭ１タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡタンパク質（ＨＡ１及び／もしくはＨＡ２由来の抗原配列を含むＨＡまたはその誘導体）、ＮＡタンパク質またはその免疫原性断片、及びＭ２タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡタンパク質（ＨＡ１及び／もしくはＨＡ２由来の抗原配列を含むＨＡまたはその誘導体）、ＮＡタンパク質またはその免疫原性断片、及びＮＳ１タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡタンパク質（ＨＡ１及び／もしくはＨＡ２由来の抗原配列を含むＨＡまたはその誘導体）、ＮＡタンパク質またはその免疫原性断片、及びＮＳ２タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡタンパク質（ＨＡ１及び／もしくはＨＡ２由来の抗原配列を含むＨＡまたはその誘導体）、Ｍ１タンパク質またはその免疫原性断片、及びＭ２タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡタンパク質（ＨＡ１及び／もしくはＨＡ２由来の抗原配列を含むＨＡまたはその誘導体）、Ｍ１タンパク質またはその免疫原性断片、及びＮＳ１タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡタンパク質（ＨＡ１及び／もしくはＨＡ２由来の抗原配列を含むＨＡまたはその誘導体）、Ｍ１タンパク質またはその免疫原性断片、及びＮＳ２タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡタンパク質（ＨＡ１及び／もしくはＨＡ２由来の抗原配列を含むＨＡまたはその誘導体）、Ｍ２タンパク質またはその免疫原性断片、及びＮＳ１タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、Ｈ ＨＡタンパク質（ＨＡ１及び／もしくはＨＡ２由来の抗原配列を含むＨＡまたはその誘導体）、Ｍ２タンパク質またはその免疫原性断片、及びＮＳ２タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡタンパク質（ＨＡ１及び／もしくはＨＡ２由来の抗原配列を含むＨＡまたはその誘導体）、ＮＳ１タンパク質またはその免疫原性断片、及びＮＳ２タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
本開示は、インフルエンザウイルスの特定の株によって限定されるものではないことを理解されるべきである。本明細書で提供される、使用されるインフルエンザウイルス株は、任意のインフルエンザウイルス株であってよい。好ましいインフルエンザウイルス株及び好ましいインフルエンザ抗原の例を以下の表７〜１３に示す。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、Ｈ１／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／１９３４から得られるインフルエンザ抗原ポリペプチド（例えば、ＨＡタンパク質、ＮＰタンパク質、ＮＡタンパク質、Ｍ１タンパク質、Ｍ２タンパク質、ＮＳ１タンパク質、ＮＳ２タンパク質、前述のインフルエンザ抗原のいずれかの免疫原性断片、前述のインフルエンザ抗原のいずれかの変異体もしくはホモログ、または前述のインフルエンザ抗原、変異体、もしくはホモログの２つ以上の任意の組み合わせ）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、Ｈ１／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９から得られるインフルエンザ抗原ポリペプチド（例えば、ＨＡタンパク質、ＮＰタンパク質、ＮＡタンパク質、Ｍ１タンパク質、Ｍ２タンパク質、ＮＳ１タンパク質、ＮＳ２タンパク質、前述のインフルエンザ抗原のいずれかの免疫原性断片、前述のインフルエンザ抗原のいずれかの変異体もしくはホモログ、または前述のインフルエンザ抗原、変異体、もしくはホモログの２つ以上の任意の組み合わせ）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、Ｈ１／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９から得られるインフルエンザ抗原ポリペプチド（例えば、ＨＡタンパク質、ＮＰタンパク質、ＮＡタンパク質、Ｍ１タンパク質、Ｍ２タンパク質、ＮＳ１タンパク質、ＮＳ２タンパク質、前述のインフルエンザ抗原のいずれかの免疫原性断片、前述のインフルエンザ抗原のいずれかの変異体もしくはホモログ、または前述のインフルエンザ抗原、変異体、もしくはホモログの２つ以上の任意の組み合わせ）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、Ｈ５／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４から得られるインフルエンザ抗原ポリペプチド（例えば、ＨＡタンパク質、ＮＰタンパク質、ＮＡタンパク質、Ｍ１タンパク質、Ｍ２タンパク質、ＮＳ１タンパク質、ＮＳ２タンパク質、前述のインフルエンザ抗原のいずれかの免疫原性断片、前述のインフルエンザ抗原のいずれかの変異体もしくはホモログ、または前述のインフルエンザ抗原、変異体、もしくはホモログの２つ以上の任意の組み合わせ）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、Ｈ２／Ｊａｐａｎ／３０５／１９５７から得られるインフルエンザ抗原ポリペプチド（例えば、ＨＡタンパク質、ＮＰタンパク質、ＮＡタンパク質、Ｍ１タンパク質、Ｍ２タンパク質、ＮＳ１タンパク質、ＮＳ２タンパク質、前述のインフルエンザ抗原のいずれかの免疫原性断片、前述のインフルエンザ抗原のいずれかの変異体もしくはホモログ、または前述のインフルエンザ抗原、変異体、もしくはホモログの２つ以上の任意の組み合わせ）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、Ｈ９／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１０７３／９９から得られるインフルエンザ抗原ポリペプチド（例えば、ＨＡタンパク質、ＮＰタンパク質、ＮＡタンパク質、Ｍ１タンパク質、Ｍ２タンパク質、ＮＳ１タンパク質、ＮＳ２タンパク質、前述のインフルエンザ抗原のいずれかの免疫原性断片、前述のインフルエンザ抗原のいずれかの変異体もしくはホモログ、または前述のインフルエンザ抗原、変異体、もしくはホモログの２つ以上の任意の組み合わせ）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、Ｈ３／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８から得られるインフルエンザ抗原ポリペプチド（例えば、ＨＡタンパク質、ＮＰタンパク質、ＮＡタンパク質、Ｍ１タンパク質、Ｍ２タンパク質、ＮＳ１タンパク質、ＮＳ２タンパク質、前述のインフルエンザ抗原のいずれかの免疫原性断片、前述のインフルエンザ抗原のいずれかの変異体もしくはホモログ、または前述のインフルエンザ抗原、変異体、もしくはホモログの２つ以上の任意の組み合わせ）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、Ｈ３／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７から得られるインフルエンザ抗原ポリペプチド（例えば、ＨＡタンパク質、ＮＰタンパク質、ＮＡタンパク質、Ｍ１タンパク質、Ｍ２タンパク質、ＮＳ１タンパク質、ＮＳ２タンパク質、前述のインフルエンザ抗原のいずれかの免疫原性断片、前述のインフルエンザ抗原のいずれかの変異体もしくはホモログ、または前述のインフルエンザ抗原、変異体、もしくはホモログの２つ以上の任意の組み合わせ）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、Ｈ７／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３から得られるインフルエンザ抗原ポリペプチド（例えば、ＨＡタンパク質、ＮＰタンパク質、ＮＡタンパク質、Ｍ１タンパク質、Ｍ２タンパク質、ＮＳ１タンパク質、ＮＳ２タンパク質、前述のインフルエンザ抗原のいずれかの免疫原性断片、前述のインフルエンザ抗原のいずれかの変異体もしくはホモログ、または前述のインフルエンザ抗原、変異体、もしくはホモログの２つ以上の任意の組み合わせ）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、Ｈ１０／Ｊｉａｎｇｘｉ−Ｄｏｎｇｈｕ／３４６／２０１３から得られるインフルエンザ抗原ポリペプチド（例えば、ＨＡタンパク質、ＮＰタンパク質、ＮＡタンパク質、Ｍ１タンパク質、Ｍ２タンパク質、ＮＳ１タンパク質、ＮＳ２タンパク質、前述のインフルエンザ抗原のいずれかの免疫原性断片、前述のインフルエンザ抗原のいずれかの変異体もしくはホモログ、または前述のインフルエンザ抗原、変異体、もしくはホモログの２つ以上の任意の組み合わせ）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、Ｈ３／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５から得られるインフルエンザ抗原ポリペプチド（例えば、ＨＡタンパク質、ＮＰタンパク質、ＮＡタンパク質、Ｍ１タンパク質、Ｍ２タンパク質、ＮＳ１タンパク質、ＮＳ２タンパク質、前述のインフルエンザ抗原のいずれかの免疫原性断片、前述のインフルエンザ抗原のいずれかの変異体もしくはホモログ、または前述のインフルエンザ抗原、変異体、もしくはホモログの２つ以上の任意の組み合わせ）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、Ｈ１／Ｖｉｅｔｎａｍ／８５０／２００９から得られるインフルエンザ抗原ポリペプチド（例えば、ＨＡタンパク質、ＮＰタンパク質、ＮＡタンパク質、Ｍ１タンパク質、Ｍ２タンパク質、ＮＳ１タンパク質、ＮＳ２タンパク質、前述のインフルエンザ抗原のいずれかの免疫原性断片、前述のインフルエンザ抗原のいずれかの変異体もしくはホモログ、または前述のインフルエンザ抗原、変異体、もしくはホモログの２つ以上の任意の組み合わせ）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザＨ７Ｎ９ ＨＡ１タンパク質、フェリチン、及び樹状細胞を標的とするペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む（例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｎ Ｘ ｅｔ ａｌ．Ｅｍｅｒｇ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ２０１３；１９（１１）：１８８１−８４；Ｓｔｅｅｌ Ｊ ｅｔ ａｌ．ｍＢｉｏ ２０１０；１（１）：ｅ０００１８−１０；Ｋａｎｅｋｉｙｏ Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２０１３；４９９：１０２−６を参照）。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、トリインフルエンザＨ７ ＨＡタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザＨ７ ＨＡ１タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む（例えば、Ｓｔｅｅｌ Ｊ ｅｔ ａｌ．ｍＢｉｏ ２０１０；１（１）：ｅ０００１８−１０を参照）。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザＨ７Ｎ９ ＨＡ１タンパク質及びフェリチンをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む（例えば、Ｋａｎｅｋｉｙｏ Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２０１３；４９９：１０２−６を参照）。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザＨ５Ｎ１タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、インフルエンザＨ５Ｎ１タンパク質はヒト株に由来する。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザＨ１Ｎ１タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、ヒトＨ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、Ｈ９Ｎ２、またはＨ３Ｎ２などの、Ａ型インフルエンザ株由来のインフルエンザタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、ナノ足場を有するインフルエンザＨ１Ｎ１ ＨＡをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｌｋｅｒ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ ２０１１：１（５）：１−８を参照）。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、脱グリコシル化インフルエンザＨ１Ｎ１ ＨＡをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈｅｎ Ｊ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ＵＳＡ ２０１４；１１１（７）：２４７６−８１を参照）。
インフルエンザワクチンは、例えば、本明細書で提供されるインフルエンザＨＡ２ステム抗原、例えば、配列番号３９４〜４１２のいずれか１つによって特定されるアミノ酸配列を含む、表１６に列挙されたものから選択される少なくとも１つのインフルエンザＨＡ２ステム抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含み得る。
本開示はまた、例えば、配列番号４９１〜５０３に列挙されたインフルエンザ配列から選択される核酸配列を有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含むインフルエンザワクチンを包含する（Ｍａｌｌａｊｏｓｙｕｌａ ＶＶ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５ Ｊｕｎ ２６；６：３２９．；Ｍａｌｌａｊｏｓｙｕｌａ ＶＶ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１４ Ｊｕｎ ２４；１１１（２５）：Ｅ２５１４−２３．；Ｂｏｍｍａｋａｎｔｉ Ｇ， ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１２ Ｄｅｃ；８６（２４）：１３４３４−４４；Ｂｏｍｍａｋａｎｔｉ Ｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１０ Ａｕｇ ３；１０７（３１）：１３７０１−６及びＹａｓｓｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１５ Ｓｅｐ；２１（９）：１０６５−７０；Ｉｍｐａｇｌｉａｚｚｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１５ Ｓｅｐ １８；３４９（６２５４）も参照）。
国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２７４０号の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のワクチンはコンセンサス配列である。本明細書で使用される場合、「コンセンサス配列」とは、特定のインフルエンザ抗原の複数の亜型のアライメント分析に基づくポリペプチド配列を指す。コンセンサスポリペプチド配列をコードするｍＲＮＡ配列を作成して使用することで、特定のインフルエンザ抗原の複数の亜型または血清型に対して広範囲の免疫を誘導することができる。
本明細書で提供されるインフルエンザ抗原をコードするｍＲＮＡは、ワクチンが、ワクチン接種された哺乳動物に抗体陽転を引き起こし、広範囲のインフルエンザ季節性株及びまたインフルエンザのパンデミック株に対して交差反応性をもつように配列することができる。抗体陽転及び広範囲の交差反応性は、異なるヘマグルチニンのインフルエンザ株に対する抑制力価を測定することによって決定することができる。好ましい組み合わせには、本明細書に記載のインフルエンザ抗原のそれぞれに由来する少なくとも２つの抗原が含まれる。
本明細書に記載のｍＲＮＡワクチンは、現在のワクチンよりもいくつかの点で優れていることが発見されている。第１に、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）送達は、文献に記載されているプロタミン塩基の手法を含む他の製剤より優れており、追加のアジュバントが必須ではない。ＬＮＰの使用は、化学修飾されたまたは修飾されていないｍＲＮＡワクチンの効果的な送達を可能にする。さらに、修飾及び非修飾いずれのＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡワクチンも、従来のワクチンよりも大幅に優れていることが本明細書において実証されている。いくつかの実施形態では、本発明のｍＲＮＡワクチンは、従来のワクチンより少なくとも１０倍、２０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１，０００倍優れている。
ｍＲＮＡワクチン及び自己複製ＲＮＡワクチンを含む機能性ＲＮＡワクチンの製造が試みられているが、これらのＲＮＡワクチンの治療効果はまだ完全に確立されていない。極めて驚くべきことに、本発明者らは、本発明の態様によれば、抗原生成の増強、及び中和能力を有する機能性抗体の産生を含め、免疫応答を有意に、そして多くの点で相乗的に増強させる、ｍＲＮＡワクチンのｉｎ ｖｉｖｏ送達クラスの製剤を見出した。このような結果は、他のクラスの脂質系製剤で使用されるｍＲＮＡ投与量と比較して、大幅に少ない量のｍＲＮＡを投与した場合でも達成することができる。本発明の製剤は、予防薬及び治療薬としての機能的なｍＲＮＡワクチンの効果を立証するに足る予想外の有意なｉｎ ｖｉｖｏ免疫応答を示した。さらに、自己複製ＲＮＡワクチンは、免疫原性応答を生じさせるだけの十分なＲＮＡを細胞に送達するためウイルス複製経路を利用している。本発明の製剤はウイルスの複製を必要とせずに、強力な免疫応答をもたらすのに十分なタンパク質を産生する。したがって、本発明のｍＲＮＡは、自己複製ＲＮＡではなく、ウイルス複製に必要な成分を含まない。
本発明は、いくつかの態様において、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤が、化学修飾ｍＲＮＡワクチン及び非修飾ｍＲＮＡワクチンを含むｍＲＮＡワクチンの有効性を有意に高めるという意外な知見を含む。ＬＮＰで製剤化されたｍＲＮＡワクチンの効果を、いくつかの異なる抗原を使用してｉｎ ｖｉｖｏで試験した。本明細書に示す結果は、ＬＮＰで製剤化されたｍＲＮＡワクチンの効果が他の市販ワクチンよりも予想外に優れていることを実証している。
免疫応答を増強させることに加えて、本発明の製剤は、試験された他のワクチンよりも少ない投与量の抗原で迅速な免疫応答を生じさせる。本発明のｍＲＮＡ−ＬＮＰ製剤はまた、別の担体で製剤化されたワクチンよりも定量的及び定性的に優れた免疫応答を生じさせる。
本明細書に記載のデータは、本発明の製剤が、既存の抗原ワクチンよりも予想外の有意な改善をもたらしたことを示している。加えて、本発明のｍＲＮＡ−ＬＮＰ製剤は、他のワクチンよりもｍＲＮＡ投与量が低い場合でも、他のワクチンより効果が優れている。異なる株由来のＨＡステム配列などのＨＡタンパク質配列をコードするｍＲＮＡが、組換えＨＡ（ｒＨＡ）タンパク質の多様なパネルに結合する血清抗体を誘導することが実証されている。マウスでのワクチンの効果は、評価されたすべてのワクチン投与量、ならびにすべての合剤方法及び同時送達方法で同様であった。
本明細書に記載の試験に使用されたＬＮＰは、以前にも様々な動物モデルならびにヒトにおいてｓｉＲＮＡの送達に使用されてきた。ＬＮＰ製剤のｓｉＲＮＡ送達に関連して行われた観察を考慮すると、ＬＮＰがワクチンに有用であるという事実は非常に驚くべきことである。ＬＮＰで製剤化されたｓｉＲＮＡの治療的送達は、一過性のＩｇＭ応答に伴う望ましくない炎症反応を引き起こし、通常は抗原産生の低下及び免疫応答の低下をもたらすことが観察されている。ｓｉＲＮＡで観察された知見とは対照的に、本発明のＬＮＰ−ｍＲＮＡ製剤は、一過性のＩｇＭ応答ではなく、予防的方法及び治療的方法に十分な、ＩｇＧレベルの増強を生じさせることが本明細書で実証されている。
核酸／ポリヌクレオチド
本明細書で提供されるインフルエンザウイルスワクチンは、少なくとも１つのインフルエンザ抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つ（１つ以上）のリボ核酸（ＲＮＡ）（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。用語「核酸」には、ヌクレオチド（ヌクレオチドモノマー）のポリマーを含む任意の化合物及び／または物質を含む。このようなポリマーはポリヌクレオチドと呼ばれる。したがって、用語「核酸」と「ポリヌクレオチド」は同義に使用される。
核酸は、例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ、例えば、β−Ｄ−リボの立体配置を有するＬＮＡ、α−Ｌ−リボの立体配置を有するα−ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２’−アミノ官能性を有する２’−アミノ−ＬＮＡ、及び２’−アミノ官能性を有する２’−アミノ−α−ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）、またはそれらのキメラもしくは組み合わせであり得るか、またはそれらを含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）として機能する。「メッセンジャーＲＮＡ」（ｍＲＮＡ）とは、（少なくとも１つの）ポリペプチド（天然型、非天然型、または修飾型のアミノ酸ポリマー）をコードし、翻訳されることで、コードされたポリペプチドをｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｓｉｔｕ、またはｅｘ ｖｉｖｏで産生することができる任意のポリヌクレオチドを指す。当業者は理解しているように、特に明記しない限り、本出願に記載のポリヌクレオチド配列は代表的なＤＮＡ配列に「Ｔ」を列挙しているが、その配列がＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）を表す場合、「Ｔ」は「Ｕ」に置き換えられることになる。したがって、特定の配列識別番号によって特定されるＤＮＡがコードするＲＮＡポリヌクレオチドのいずれもまた、ＤＮＡがコードする対応するＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）配列を含むことができ、その場合のＤＮＡ配列の各「Ｔ」は「Ｕ」で置き換えられる。
一般的にｍＲＮＡ分子の基本構成要素には、少なくとも１つのコード領域、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ、５’キャップ、及びポリＡ尾部を含む。本開示のポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡとして機能することができるが、野生型ｍＲＮＡと比べ、機能的及び／または構造的な設計上の特長が顕著であり得、核酸を用いた治療法を使用する際の効果的なポリペプチド発現という現存する課題を克服する役割を果たす。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンのＲＮＡポリヌクレオチドは、２〜１０、２〜９、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、２〜４、２〜３、３〜１０、３〜９、３〜８、３〜７、３〜６、３〜５、３〜４、４〜１０、４〜９、４〜８、４〜７、４〜６、４〜５、５〜１０、５〜９、５〜８、５〜７、５〜６、６〜１０、６〜９、６〜８、６〜７、７〜１０、７〜９、７〜８、８〜１０、８〜９、または９〜１０の抗原ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、インフルエンザワクチンのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドは、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００の抗原ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、インフルエンザワクチンのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドは、少なくとも１００、または少なくとも２００の抗原ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、インフルエンザワクチンのＲＮＡポリヌクレオチドは、１〜１０、５〜１５、１０〜２０、１５〜２５、２０〜３０、２５〜３５、３０〜４０、３５〜４５、４０〜５０、１〜５０、１〜１００、２〜５０、または２〜１００の抗原ポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドはコドン最適化されている。コドン最適化法は当技術分野で既知であり、本明細書で示すように使用することができる。コドン最適化は、いくつかの実施形態では、標的生物と宿主生物のコドン頻度を一致させ、適切な折りたたみを確実にする；ｍＲＮＡの安定性が増加するか、または二次構造が減少するようにＧＣ含量をバイアスする；遺伝子の構築または発現を損なう可能性のあるタンデムリピートコドンまたは塩基ランを最小限にする；転写及び翻訳制御領域をカスタマイズする；タンパク質の輸送配列を挿入または除去する；コードされたタンパク質中の翻訳後修飾部位（例えば、グリコシル化部位）を除去／付加する；タンパク質ドメインを付加、除去、またはシャッフルする；制限部位を挿入または削除する；リボソーム結合部位及びｍＲＮＡ分解部位を変更する；タンパク質の様々なドメインが適切に折りたたまれるように翻訳速度を調節する；またはポリヌクレオチド内の問題となる二次構造を低減または排除するために使用することができる。コドン最適化のツール、アルゴリズム、及びサービスは当技術分野で既知であり、非限定的な例として、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ ＣＡ）、及び／または独自の方法によるサービスが挙げられる。いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列は、最適化アルゴリズムを使用して最適化される。
いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然型または野生型の配列（例えば、目的のポリペプチドまたはタンパク質（例えば、抗原タンパク質または抗原ポリペプチド）をコードする天然型または野生型のｍＲＮＡ配列）と９５％未満の配列同一性、９０％未満の配列同一性、８５％未満の配列同一性、８０％未満の配列同一性、または７５％未満の配列同一性を共有する。
いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然型配列または野生型配列（例えば、目的のポリペプチドまたはタンパク質（例えば、抗原タンパク質またはポリペプチド）をコードする天然型または野生型のｍＲＮＡ配列）と６５％〜８５％（例えば、約６７％〜約８５％、または約６７％〜約８０％）の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然型配列または野生型配列（例えば、目的のポリペプチドまたはタンパク質（例えば、抗原タンパク質またはポリペプチド）をコードする天然型または野生型のｍＲＮＡ配列）と６５％〜７５％、または約８０％の配列同一性を共有する。
いくつかの実施形態では、コドン最適化ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）は、例えば、Ｇ／Ｃのレベルが増強されたものであり得る。核酸分子のＧ／Ｃ含量は、ＲＮＡの安定性に影響を及ぼし得る。グアニン（Ｇ）及び／またはシトシン（Ｃ）残基の量が増加したＲＮＡは、大量のアデニン（Ａ）及びチミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）ヌクレオチドを含む核酸よりも機能的に安定であり得る。ＷＯ０２／０９８４４３は、翻訳領域の配列改変により安定化されたｍＲＮＡを含有する医薬組成物を開示している。遺伝暗号の縮重により、この改変は既存のコドンを、得られるアミノ酸を変更することなくＲＮＡの安定性をより高めるコドンに置換することにより機能する。この手法はＲＮＡのコード領域に限定される。
抗原／抗原ポリペプチド
いくつかの実施形態では、抗原ポリペプチド（例えば、少なくとも１つのインフルエンザ抗原ポリペプチド）は、２５アミノ酸より長く、５０アミノ酸より短い。ポリペプチドには、遺伝子産物、天然型ポリペプチド、合成ポリペプチド、前述のもののホモログ、オルソログ、パラログ、断片及び他の等価物、変異体、ならびに類似体が含まれる。ポリペプチドは単一分子であっても、または二量体、三量体、または四量体などの多分子複合体であってもよい。ポリペプチドはまた、抗体またはインスリンなどの一本鎖ポリペプチドまたは多重鎖ポリペプチドを含み得、互いに会合または連結されていてもよい。一般的に、多重鎖ポリペプチドにはジスルフィド結合が見られる場合が多い。用語「ポリペプチド」はまた、少なくとも１つのアミノ酸残基が、対応する天然型アミノ酸の人工的な化学的類似体であるアミノ酸ポリマーに適用される場合もある。
「ポリペプチド変異体」とは、天然配列または基準配列と比較してそのアミノ酸配列が異なる分子である。アミノ酸配列変異体は、天然配列または基準配列と比較して、アミノ酸配列内の特定の位置に、上記のいずれか２つまたは３つの置換、欠失、挿入、またはそれらの組み合わせを有し得る。通常、変異体は天然配列または基準配列と少なくとも５０％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、変異体は、天然配列または基準配列と少なくとも８０％の同一性または少なくとも９０％の同一性を共有する。
いくつかの実施形態では、「変異模倣体」を提供する。「変異模倣体」は、活性化配列を模倣することになる少なくとも１つのアミノ酸を含む。例えば、グルタミン酸は、リン酸化スレオニン及び／またはリン酸化セリンの模倣体として機能することができる。あるいは、変異模倣体から、模倣体を含有する非活性化産物または不活化産物を得ることもできる。例えば、フェニルアラニンがチロシンを不活化する置換体として作用することも、またはアラニンがセリンを不活化する置換体として作用することもできる。
「オルソログ」とは、種分化によって共通の祖先遺伝子から進化させた、種の異なる遺伝子を指す。通常、オルソログは進化の過程で同じ機能を保持する。オルソログの同定は、新たに配列決定されたゲノムの遺伝子機能を確実に予測する場合に重要となる。
「類似体」とは、１つ以上のアミノ酸の変更、例えば置換、付加、または欠失によって、アミノ酸残基が異なるが、親ポリペプチドまたは出発ポリペプチドの１つ以上の特性を引き続き維持するポリペプチド変異体を含むことを意味する。
本開示は、変異体及び誘導体を含むポリヌクレオチドまたはポリペプチドに基づいた数種の組成物を提供する。これには、例えば、置換型、挿入型、欠失型、及び共有結合型の変異体及び誘導体が含まれる。用語「誘導体」は、用語「変異体」と同義であり、一般に、基準分子または出発分子と比較して任意の方法で修飾及び／または変更された分子を指す。
このように、基準配列、特に本明細書に開示されるポリペプチド配列と比較して置換、挿入及び／または付加、欠失、ならびに共有結合修飾を含むペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本開示の範囲内に含まれる。例えば、配列タグまたはアミノ酸（１つ以上のリジンなど）をペプチド配列（例えば、Ｎ末端またはＣ末端）に付加することができる。配列タグは、ペプチドの検出、精製、または位置特定に使用することができる。リジンは、ペプチド溶解性を増加させるため、またはビオチン化を可能にするために使用することができる。あるいは、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシ末端領域及びアミノ末端領域に位置するアミノ酸残基を必要に応じて欠失させ、切断型配列を提供することができる。あるいは、配列の用途に応じてある特定のアミノ酸（例えば、Ｃ末端残基またはＮ末端残基）を欠失させ、例えば、大きな配列の一部である、可溶性の配列または固体支持体に連結される配列を発現させることができる。
ポリペプチドを指す場合、「置換変異体」とは、天然配列中または出発配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、同じ位置に代わりに別のアミノ酸が挿入されたものである。置換は１箇所、すなわち分子中で１つのアミノ酸のみが置換されていても、または複数箇所、すなわち同一分子内で２つ以上（例えば、３、４、または５個）のアミノ酸が置換されていてもよい。
本明細書で使用される場合、用語「保存的アミノ酸置換」とは、配列中に通常存在するアミノ酸を、サイズ、電荷、または極性の類似する別のアミノ酸で置換することを指す。保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、及びロイシンなどの非極性（疎水性）残基による別の非極性残基の置換が挙げられる。同様に、保存的置換の例としては、アルギニンとリジン間、グルタミンとアスパラギン間、及びグリシンとセリン間などの、ある極性（親水性）残基による別の極性残基の置換が挙げられる。さらに、保存的置換の追加例は、リジン、アルギニン、またはヒスチジンなどの塩基性残基による別の塩基性残基の置換、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸などの、ある酸性残基による別の酸性残基の置換である。非保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、メチオニンなどの非極性（疎水性）アミノ酸残基による、システイン、グルタミン、グルタミン酸、もしくはリジンなどの極性（親水性）残基の置換、及び／または極性残基による非極性残基の置換が挙げられる。
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを指す場合、「特徴（Ｆｅａｔｕｒｅ）」はそれぞれ、分子のアミノ酸配列ベースの構成要素またはヌクレオチドベースの構成要素の違いであると定義される。ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの特徴としては、表面発現、局所立体構造の形状、フォールド、ループ、ハーフループ、ドメイン、ハーフドメイン、部位、末端、及びそれらの任意の組み合わせ（複数可）が挙げられる。
ポリペプチドを指して本明細書で使用される場合、用語「ドメイン」とは、１つ以上の同定可能な構造的または機能的特徴または特性（例えば、タンパク質−タンパク質相互作用の部位として機能する結合能力）を有するポリペプチドのモチーフを指す。
ポリペプチドを指して本明細書で使用される場合、アミノ酸に基づく実施形態に関連する用語「部位」は、「アミノ酸残基」及び「アミノ酸側鎖」と同義に使用される。ポリヌクレオチドを指して本明細書で使用される場合、ヌクレオチドに基づく実施形態に関連する用語「部位」は、「ヌクレオチド」と同義に使用される。部位とは、ポリペプチドベースまたはポリヌクレオチドベースの分子内で修飾、操作、改変、誘導体化、または変異され得るペプチドまたはポリペプチドまたはポリヌクレオチド内の位置を表す。
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを指して本明細書で使用される場合、用語「末端（「ｔｅｒｍｉｎｉ」または「ｔｅｒｍｉｎｕｓ」）」は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドそれぞれの末端を指す。そのような末端は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの最初の部位または最後の部位のみに限定されず、末端領域にあるその他のアミノ酸またはヌクレオチドを含み得る。ポリペプチドベースの分子は、Ｎ末端（遊離アミノ基（ＮＨ２）を有するアミノ酸で終結される）及びＣ末端（遊離カルボキシル基（ＣＯＯＨ）を有するアミノ酸で終結される）の両方を有することを特徴とし得る。場合によってタンパク質は、ジスルフィド結合または非共有結合力によって一体化された複数のポリペプチド鎖で構成されている（多量体、オリゴマー）。このようなタンパク質は、複数のＮ末端及びＣ末端を有する。あるいは、ポリペプチドの末端を、有機コンジュゲートなどの非ポリペプチドベースの部分で、状況に応じて開始または終了するように修飾することができる。
当業者は認識しているように、タンパク質断片、機能的タンパク質ドメイン、及び相同タンパク質もまた、目的のポリペプチドの範囲内であるとみなす。例えば、本明細書では、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または１００超のアミノ酸長を有する基準タンパク質の任意のタンパク質断片（基準となるポリペプチド配列よりも少なくとも１つのアミノ酸残基分短いが、それ以外は同一のポリペプチド配列を意味する）を提供する。別の例では、本明細書に記載される配列のいずれかと４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一である（連続した）アミノ酸２０個、３０個、４０個、５０個、または１００個のストレッチを含む任意のタンパク質を本開示に従って利用することができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、本明細書に提供されるか、または本明細書で参照する配列のいずれかに示されるように、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の突然変異を含む。別の例では、本明細書に記載される配列のいずれかとの同一性が８０％、９０％、９５％を超える、または１００％のアミノ酸２０個、３０個、４０個、５０個、または１００個のストレッチを含む任意のタンパク質であって、本明細書に記載される配列のいずれかとの同一性が８０％、７５％、７０％、６５％、６０％未満までであるアミノ酸５個、１０個、１５、２０個、２５個、または３０個のストレッチを有するタンパク質を本開示に従って利用することができる。
本開示のポリペプチドまたはポリヌクレオチド分子は、基準分子（例えば、基準ポリペプチドまたは基準ポリヌクレオチド）、例えば当技術分野で記載されている分子（例えば、遺伝子操作または設計された分子または野生型分子）と、ある程度の配列類似性または同一性を共有し得る。当技術分野で既知である、用語「同一性」は、配列の比較によって決定される、２つ以上のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列間の関係を指す。当技術分野において、同一性はまた、２つ以上のアミノ酸残基または核酸残基の列間の一致数によって決定される２つの配列間の配列関連性の程度を意味する。同一性は、特定の数学的モデルまたはコンピュータープログラム（例えば、「アルゴリズム」）により処理されるギャップアライメント（存在する場合）を有する２つ以上の配列のうち小さい方の配列間の同一性一致率を測定したものである。関連するペプチドの同一性は、既知の方法によって容易に計算することができる。ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列に適用される「同一性パーセント」は、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して最大同一性パーセントを達成した後に、候補アミノ酸または核酸配列中の残基（アミノ酸残基または核酸残基）が、第２の配列のアミノ酸配列または核酸中の残基と同一となるパーセンテージであると定義される。アライメントのための方法及びコンピュータープログラムは、当技術分野で周知されている。同一性は同一性パーセントの計算によって決まるが、計算に導入されたギャップ及びペナルティによって値が異なる可能性がある。一般に、本明細書に記載され、当業者に既知の配列アライメントプログラム及びパラメーターによって決定したとき、ある特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体は、その特定の基準ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対して、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有する。そのようなアライメント用ツールとして、ＢＬＡＳＴスイートのものが挙げられる（Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）．”Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ： ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ，” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）。別の一般的な局所アライメント技術はＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムに基づくものである（Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ．＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｓ．（１９８１）“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．” Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７）。動的プログラミングに基づく一般的なグローバルアライメント技術は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムである（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ． １９７０）“Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．” Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）。近年、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを含む他の最適化グローバルアライメント方法よりも迅速にヌクレオチド配列及びタンパク質配列のグローバルアライメントを生成するといわれているＦａｓｔ Ｏｐｔｉｍａｌ Ｇｌｏｂａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（ＦＯＧＳＡＡ）が開発された。本明細書では、特に以下の「同一性」の定義に、他のツールを記載している。
本明細書で使用される場合、用語「相同性」とは、ポリマー分子間、例えば核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子）間及び／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。アライメントによる残基の一致によって決定される類似性または同一性の閾値レベルを共有するポリマー分子（例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子）及び／またはポリペプチド分子）は、相同と称される。相同性は、分子間の関係を表す定性的用語であるが、定量的な類似性または同一性に基づいている可能性もある。類似性または同一性は、２つの比較配列間の配列一致の程度を定義する定量的用語である。いくつかの実施形態では、ポリマー分子は、その配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一であるかまたは類似する場合に、互いに「相同」であるとみなされる。用語「相同」は、必然的に、少なくとも２つの配列（ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列）間の比較を指す。２つのポリヌクレオチド配列は、それらがコードするポリペプチドが、少なくとも２０アミノ酸の少なくとも１つのストレッチについて、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはさらには９９％である場合に相同とみなされる。いくつかの実施形態では、相同ポリヌクレオチド配列は、少なくとも４〜５個の一意に特定されるアミノ酸のストレッチをコードできることを特徴とする。長さが６０ヌクレオチド未満のポリヌクレオチド配列の場合、相同性は、少なくとも４〜５個の一意に特定されるアミノ酸のストレッチをコードできるかによって決定される。２つのタンパク質配列は、各タンパク質が、少なくとも２０アミノ酸の少なくとも１つのストレッチについて、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％同一である場合に相同とみなされる。
相同性とは、比較配列が進化時に共通の起源から分岐したことを意味する。用語「ホモログ」とは、共通の祖先配列に由来する第２のアミノ酸配列または核酸配列に関連する第１のアミノ酸配列または核酸配列（例えば、遺伝子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列またはタンパク質配列）を指す。用語「ホモログ」は、種分化現象によって分離された遺伝子及び／またはタンパク質間の関係、または遺伝子複製現象によって分離された遺伝子及び／またはタンパク質間の関係に適用される場合もある。「オルソログ」とは、種分化によって共通の祖先遺伝子（またはタンパク質）から進化した、異なる種の遺伝子（またはタンパク質）である。通常、オルソログは進化の過程で同じ機能を保持する。「パラログ」とは、ゲノム内の重複によって関連性が生じた遺伝子（またはタンパク質）である。オルソログは進化の過程で同じ機能を保持するが、パラログは元の機能と関連性がある場合でも新しい機能を進化させる。
用語「同一性」は、ポリマー分子間、例えば、ポリヌクレオチド分子間（例えば、ＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子間）、及び／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。２つのポリ核酸配列の同一性パーセントの計算は、例えば、最適な比較ができるように２つの配列をアライメントすることによって行うことができる（例えば、第１及び第２の核酸配列の一方または両方にギャップを導入して最適なアライメントにすること、及び比較目的のため同一でない配列を無視することができる）。ある特定の実施形態では、比較目的のためにアライメントされる配列の長さは、基準配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である。アライメント後、対応するヌクレオチド位置のヌクレオチドを比較する。第１の配列のある位置を第２の配列の対応する位置と同じヌクレオチドが占めている場合、分子はその位置に関して同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、各配列が共有する同一位置の数の関数であり、２つの配列を最適なアライメントにするために導入が必要なギャップ数及び各ギャップの長さを考慮に入れる。配列の比較及び２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して実施することができる。例えば、２つの核酸配列間の同一性パーセントは、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ， Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１に記載されるような方法を使用して決定することができる。例えば、２つの核酸配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＭｅｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，１９８９，４：１１−１７）のアルゴリズムを使用して決定することができ、プログラムではＰＡＭ１２０残基重み付け表を用い、ギャップ長ペナルティを１２、及びギャップペナルティを４とする。あるいは、２つの核酸配列間の同一性パーセントは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスを用いたＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを使用して決定することができる。配列間の同一性パーセントの決定によく使用される方法として、参照により本明細書に組み込まれる、Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に開示される方法が挙げられるが、これに限定されない。同一性の決定技術は、公的に利用可能なコンピュータープログラムに体系化されている。２つの配列間の相同性を決定する例示的なコンピューターソフトウエアとしては、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２，３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０））が挙げられるが、これらに限定されない。
多タンパク質及び多成分のワクチン
本開示は、それぞれが単一の抗原ポリペプチドをコードする複数のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含むインフルエンザワクチン、ならびに複数の抗原ポリペプチドを（例えば、融合ポリペプチドとして）コードする単一のＲＮＡポリヌクレオチドを含むインフルエンザワクチンを包含する。したがって、第１の抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドと、第２の抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含むワクチン組成物には、（ａ）第１の抗原ポリペプチドをコードする第１のＲＮＡポリヌクレオチドと、第２の抗原ポリペプチドをコードする第２のＲＮＡポリヌクレオチドを含むワクチン、及び（ｂ）第１及び第２の抗原ポリペプチドを（例えば、融合ポリペプチドとして）コードする単一のＲＮＡポリヌクレオチドを含むワクチンを包含する。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、それぞれが異なる抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する２〜１０（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）またはそれ以上のＲＮＡポリヌクレオチド（または２〜１０、またはそれ以上の異なる抗原ポリペプチドをコードする単一のＲＮＡポリヌクレオチド）を含む。抗原ポリペプチドは、本明細書に記載のインフルエンザ抗原ポリペプチドのいずれかから選択することができる。
いくつかの実施形態では、多成分ワクチンは、シグナルペプチドと融合された少なくとも１つのインフルエンザ抗原ポリペプチドをコードする少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む（例えば、配列番号４８８〜４９０）。シグナルペプチドは、抗原ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合することができる。
シグナルペプチド
いくつかの実施形態では、インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドがコードする抗原ポリペプチドは、シグナルペプチドを含む。タンパク質のＮ末端１５〜６０アミノ酸からなるシグナルペプチドは通常、分泌経路の膜を横断する移行に必要であり、したがって真核生物及び原核生物の両方において大部分のタンパク質の分泌経路への進入を広く制御する。シグナルペプチドは一般に、様々な長さのＮ末端領域（通常、正に荷電したアミノ酸を含む）、疎水性領域、及び短いカルボキシ末端ペプチド領域という３つの領域を含む。真核生物では、新生前駆体タンパク質（プレタンパク質）のシグナルペプチドは、リボソームを粗面小胞体（ＥＲ）膜に誘導し、成長するペプチド鎖を膜透過させてプロセシングを開始する。ＥＲプロセシングにより成熟タンパク質が産生されるが、そのときシグナルペプチドは、一般的に宿主細胞のＥＲ常在性シグナルペプチダーゼによって前駆体タンパク質から切断されるか、または切断されないまま膜アンカーとして機能する。シグナルペプチドはまた、タンパク質の細胞膜に対する標的化を容易にすることができる。ただし、シグナルペプチドは、成熟タンパク質の最終的な目的地には関与しない。配列中に追加のアドレスタグをもたない分泌タンパク質は、デフォルトでは外部環境に分泌される。近年、シグナルペプチドに関して高度な考察が進み、特定のシグナルペプチドの機能及び免疫優性が、以前に予想されていたよりもはるかに多機能であることが示されている。
本開示のインフルエンザワクチンは、例えば、人工シグナルペプチドをコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含み得るが、その場合のシグナルペプチドコード配列は、抗原ポリペプチドのコード配列に機能的に連結され、そのフレーム内にある。したがって、いくつかの実施形態では、本開示のインフルエンザワクチンは、シグナルペプチドと融合された抗原ポリペプチドを産生する。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、抗原ポリペプチドのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、抗原ポリペプチドのＣ末端に融合される。
いくつかの実施形態では、抗原ポリペプチドと融合されるシグナルペプチドは、人工シグナルペプチドである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンによってコードされる抗原ポリペプチドと融合された人工シグナルペプチドは、免疫グロブリンタンパク質、例えばＩｇＥシグナルペプチドまたはＩｇＧシグナルペプチドから得られる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンによってコードされる抗原ポリペプチドと融合されたシグナルペプチドは、配列ＭＤＷＴＷＩＬＦＬＶＡＡＡＴＲＶＨＳ（配列番号４８１）を有するＩｇ重鎖イプシロン−１シグナルペプチド（ＩｇＥ ＨＣ ＳＰ）である。いくつかの実施形態では、（例えば、ｍＲＮＡ）ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンによってコードされる抗原ポリペプチドと融合されるシグナルペプチドは、配列ＭＥＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号４８０）を有するＩｇＧｋ鎖Ｖ−ＩＩＩ領域ＨＡＨシグナルペプチド（ＩｇＧｋ ＳＰ）である。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、以下から選択される：日本脳炎ＰＲＭシグナル配列（ＭＬＧＳＮＳＧＱＲＶＶＦＴＩＬＬＬＬＶＡＰＡＹＳ；配列番号４８２）、ＶＳＶｇタンパク質シグナル配列（ＭＫＣＬＬＹＬＡＦＬＦＩＧＶＮＣＡ；配列番号４８３）、及び日本脳炎ＪＥＶシグナル配列（ＭＷＬＶＳＬＡＩＶＴＡＣＡＧＡ；配列番号４８４）。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）ワクチンによってコードされる抗原ポリペプチドは、配列番号４８０〜４８４のいずれか１つによって特定されるシグナルペプチドと融合される、配列番号１〜４４４、４５８、４６０、４６２〜４７９（表７〜１３も参照）のいずれか１つによって特定されるアミノ酸配列を含む。本明細書で開示する例は限定を意味するものではなく、プロセシングするタンパク質のＥＲへの標的化、及び／またはタンパク質の細胞膜への標的化を容易にすることが当技術分野で知られている任意のシグナルペプチドであれば、本開示に従って使用することができる。
シグナルペプチドは、１５〜６０アミノ酸長を有し得る。例えば、シグナルペプチドは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０アミノ酸長であり得る。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、２０〜６０、２５〜６０、３０〜６０、３５〜６０、４０〜６０、４５〜６０、５０〜６０、５５〜６０、１５〜５５、２０〜５５、２５〜５５、３０〜５５、３５〜５５、４０〜５５、４５〜５５、５０〜５５、１５〜５０、２０〜５０、２５〜５０、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０、４５〜５０、１５〜４５、２０〜４５、２５〜４５、３０〜４５、３５〜４５、４０〜４５、１５〜４０、２０〜４０、２５〜４０、３０〜４０、３５〜４０、１５〜３５、２０〜３５、２５〜３５、３０〜３５、１５〜３０、２０〜３０、２５〜３０、１５〜２５、２０〜２５、または１５〜２０アミノ酸長である。
シグナルペプチドは通常、ＥＲプロセシング中に切断接点で新生ポリペプチドから切断される。本開示のインフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンによって産生される成熟抗原ポリペプチドは通常、シグナルペプチドを含まない。
化学修飾
本開示のインフルエンザワクチンは、いくつかの実施形態では、少なくとも１つの化学修飾を含む少なくとも１つの抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを少なくとも含む。
用語「化学修飾」及び「化学修飾された」とは、リボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオシドのアデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、ウリジン（Ｕ）、チミジン（Ｔ）、またはシチジン（Ｃ）の位置、パターン、パーセント、または集合のうちの少なくとも１つに関する修飾を指す。一般に、これらの用語は、天然型の５’末端ｍＲＮＡキャップ部分におけるリボヌクレオチド修飾を指すものではない。ポリペプチドに関して、用語「修飾」は、２０種の標準アミノ酸群に対する修飾を指す。本明細書で提供されるポリペプチドはまた、アミノ酸の置換、挿入、または置換と挿入の組み合わせを含むことで「修飾された」とみなされる。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、様々な（複数の）異なる修飾を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの特定の領域は、１、２、またはそれ以上の（場合により異なる）ヌクレオシドまたはヌクレオチド修飾を含む。いくつかの実施形態では、細胞または生物に導入された修飾ＲＮＡポリヌクレオチド（例えば、修飾ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、非修飾ポリヌクレオチドと比較して、細胞または生物それぞれにおいて分解の減少を示す。いくつかの実施形態では、細胞または生物に導入された修飾ＲＮＡポリヌクレオチド（例えば、修飾ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、細胞または生物それぞれにおいて免疫原性の減少（例えば、自然応答の減少）を示す場合がある。
ポリヌクレオチドの修飾には、本明細書に記載のものが含まれるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、天然型、非天然型である修飾を含み得るか、またはポリヌクレオチドは、天然型修飾と非天然型修飾の組み合わせを含み得る。ポリヌクレオチドは、例えば、糖、核酸塩基、またはヌクレオシド間結合（例えば、リン酸基、ホスホジエステル結合、またはホスホジエステル骨格との結合）のうち任意の有用な修飾を含み得る。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、ポリヌクレオチドの合成中または合成後に所望の機能または特性を達成するために導入される非天然修飾ヌクレオチドを含む。修飾は、ヌクレオチド間結合、プリン塩基もしくはピリミジン塩基、または糖に存在し得る。修飾は、化学合成またはポリメラーゼ酵素によって鎖の末端または鎖の他の場所に導入することができる。ポリヌクレオチドの任意の領域を化学修飾することができる。
本開示は、ヌクレオシド及びヌクレオチドが修飾されたポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）を提供する。「ヌクレオシド」とは、有機塩基（例えば、プリンまたはピリミジン）またはその誘導体（本明細書では「核酸塩基」とも称する）と組み合わせた糖分子（例えば、ペントースまたはリボース）またはその誘導体を含有する化合物を指す。「ヌクレオチド」とは、リン酸基を含むヌクレオシドを指す。修飾ヌクレオチドは、例えば、化学的方法、酵素による方法、または組換え方法などの任意の有用な方法によって、１つ以上の修飾ヌクレオシドまたは非天然ヌクレオシドを含むように合成することができる。ポリヌクレオチドは、連結されたヌクレオシドの１つまたは複数の領域を含み得る。そのような領域は多様な骨格結合を有し得る。結合は、標準的なホスホジエステル結合であってよく、その場合、ポリヌクレオチドはヌクレオチドの領域を含むことになる。
修飾ヌクレオチド塩基対形成には、標準的なアデノシン−チミン、アデノシン−ウラシル、またはグアノシン−シトシン塩基対だけでなく、ヌクレオチド間及び／または非標準塩基もしくは修飾塩基を含む修飾ヌクレオチド間に形成された塩基対を包含し、その場合、水素結合供与体及び水素結合受容体の配置により、非標準塩基と標準塩基との間または２つの相補的な非標準塩基構造間の水素結合が可能になる。そのような非標準塩基対形成の一例は、修飾ヌクレオチドのイノシンとアデニン、シトシン、またはウラシルとの間の塩基対形成である。塩基／糖の任意の組み合わせまたはリンカーを、本開示のポリヌクレオチドに組み込むことができる。
本開示のワクチンに有用なポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）の修飾としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：２−メチルチオ−Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン；２−メチルチオ−Ｎ６−メチルアデノシン；２−メチルチオ−Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン；Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン；Ｎ６−イソペンテニルアデノシン；Ｎ６−メチルアデノシン；Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン；１，２’−Ｏ−ジメチルアデノシン；１−メチルアデノシン；２’−Ｏ−メチルアデノシン；２’−Ｏ−リボシルアデノシン（リン酸）；２−メチルアデノシン；２−メチルチオ−Ｎ６イソペンテニルアデノシン；２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン；２’−Ｏ−メチルアデノシン；２’−Ｏ−リボシルアデノシン（リン酸）；イソペンテニルアデノシン；Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン；Ｎ６，２’−Ｏ−ジメチルアデノシン；Ｎ６，２’−Ｏ−ジメチルアデノシン；Ｎ６，Ｎ６，２’−Ｏ−トリメチルアデノシン；Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン；Ｎ６−アセチルアデノシン；Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン；Ｎ６−メチル−Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン；２−メチルアデノシン；２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン；７−デアザ−アデノシン；Ｎ１−メチル−アデノシン；Ｎ６，Ｎ６（ジメチル）アデニン；Ｎ６−ｃｉｓ−ヒドロキシ−イソペンテニル−アデノシン；α−チオ−アデノシン；２（アミノ）アデニン；２（アミノプロピル）アデニン；２（メチルチオ）Ｎ６（イソペンテニル）アデニン；２−（アルキル）アデニン；２−（アミノアルキル）アデニン；２−（アミノプロピル）アデニン；２−（ハロ）アデニン；２−（ハロ）アデニン；２−（プロピル）アデニン；２’−アミノ−２’−デオキシ−ＡＴＰ；２’−アジド−２’−デオキシ−ＡＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−アミノアデノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−アジドアデノシンＴＰ；６（アルキル）アデニン；６（メチル）アデニン；６−（アルキル）アデニン；６−（メチル）アデニン；７（デアザ）アデニン；８（アルケニル）アデニン；８（アルキニル）アデニン；８（アミノ）アデニン；８（チオアルキル）アデニン；８−（アルケニル）アデニン；８−（アルキル）アデニン；８−（アルキニル）アデニン；８−（アミノ）アデニン；８−（ハロ）アデニン；８−（ヒドロキシル）アデニン；８−（チオアルキル）アデニン；８−（チオール）アデニン；８−アジド−アデノシン；アザアデニン；デアザアデニン；Ｎ６（メチル）アデニン；Ｎ６−（イソペンチル）アデニン；７−デアザ−８−アザ−アデノシン；７−メチルアデニン；１−デアザアデノシンＴＰ；２’フルオロ−Ｎ６−Ｂｚ−デオキシアデノシンＴＰ；２’−ＯＭｅ−２−アミノ−ＡＴＰ；２’Ｏ−メチル−Ｎ６−Ｂｚ−デオキシアデノシンＴＰ；２’−ａ−エチニルアデノシンＴＰ；２−アミノアデニン；２−アミノアデノシンＴＰ；２−アミノ−ＡＴＰ；２’−ａ−トリフルオロメチルアデノシンＴＰ；２−アジドアデノシンＴＰ；２’−ｂ−エチニルアデノシンＴＰ；２−ブロモアデノシンＴＰ；２’−ｂ−トリフルオロメチルアデノシンＴＰ；２−クロロアデノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’，２’−ジフルオロアデノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−メルカプトアデノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−チオメトキシアデノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−アミノアデノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−アジドアデノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−ブロモアデノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−クロロアデノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−フルオロアデノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−ヨードアデノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−メルカプトアデノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−チオメトキシアデノシンＴＰ；２−フルオロアデノシンＴＰ；２−ヨードアデノシンＴＰ；２−メルカプトアデノシンＴＰ；２−メトキシ−アデニン；２−メチルチオ−アデニン；２−トリフルオロメチルアデノシンＴＰ；３−デアザ−３−ブロモアデノシンＴＰ；３−デアザ−３−クロロアデノシンＴＰ；３−デアザ−３−フルオロアデノシンＴＰ；３−デアザ−３−ヨードアデノシンＴＰ；３−デアザアデノシンＴＰ；４’−アジドアデノシンＴＰ；４’−炭素環式アデノシンＴＰ；４’−エチニルアデノシンＴＰ；５’−ホモ−アデノシンＴＰ；８−アザ−ＡＴＰ；８−ブロモ−アデノシンＴＰ；８−トリフルオロメチルアデノシンＴＰ；９−デアザアデノシンＴＰ；２−アミノプリン；７−デアザ−２，６−ジアミノプリン；７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン；７−デアザ−８−アザ−２−アミノプリン；２，６−ジアミノプリン；７−デアザ−８−アザ−アデニン、７−デアザ−２−アミノプリン；２−チオシチジン；３−メチルシチジン；５−ホルミルシチジン；５−ヒドロキシメチルシチジン；５−メチルシチジン；Ｎ４−アセチルシチジン；２’−Ｏ−メチルシチジン；２’−Ｏ−メチルシチジン；５，２’−Ｏ−ジメチルシチジン；５−ホルミル−２’−Ｏ−メチルシチジン；リシジン；Ｎ４，２’−Ｏ−ジメチルシチジン；Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−メチルシチジン；Ｎ４−メチルシチジン；Ｎ４，Ｎ４−ジメチル−２’−ＯＭｅ−シチジンＴＰ；４−メチルシチジン；５−アザ−シチジン；シュード−イソ−シチジン；ピロロ−シチジン；α−チオ−シチジン；２−（チオ）シトシン；２’−アミノ−２’−デオキシ−ＣＴＰ；２’−アジド−２’−デオキシ−ＣＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−アミノシチジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−アジドシチジンＴＰ；３（デアザ）５（アザ）シトシン；３（メチル）シトシン；３−（アルキル）シトシン；３−（デアザ）５（アザ）シトシン；３−（メチル）シチジン；４，２’−Ｏ−ジメチルシチジン；５（ハロ）シトシン；５（メチル）シトシン；５（プロピニル）シトシン；５（トリフルオロメチル）シトシン；５−（アルキル）シトシン；５−（アルキニル）シトシン；５−（ハロ）シトシン；５−（プロピニル）シトシン；５−（トリフルオロメチル）シトシン；５−ブロモ−シチジン；５−ヨード−シチジン；５−プロピニルシトシン；６−（アゾ）シトシン；６−アザ−シチジン；アザシトシン；デアザシトシン；Ｎ４（アセチル）シトシン；１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン；１−メチル−シュードイソシチジン；２−メトキシ−５−メチル−シチジン；２−メトキシ−シチジン；２−チオ−５−メチル−シチジン；４−メトキシ−１−メチル−シュードイソシチジン；４−メトキシ−シュードイソシチジン；４−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン；４−チオ−１−メチル−シュードイソシチジン；４−チオ−シュードイソシチジン；５−アザ−ゼブラリン；５−メチル−ゼブラリン；ピロロ−シュードイソシチジン；ゼブラリン；（Ｅ）−５−（２−ブロモ−ビニル）シチジンＴＰ；２，２’−アンヒドロ−シチジンＴＰ塩酸塩；２’フルオル−Ｎ４−Ｂｚ−シチジンＴＰ；２’フルオロ−Ｎ４−アセチル−シチジンＴＰ；２’−Ｏ−メチル−Ｎ４−アセチル−シチジンＴＰ；２’Ｏ−メチル−Ｎ４−Ｂｚ−シチジンＴＰ；２’−ａ−エチニルシチジンＴＰ；２’−ａ−トリフルオロメチルシチジンＴＰ；２’−ｂ−エチニルシチジンＴＰ；２’−ｂ−トリフルオロメチルシチジンＴＰ；２’−デオキシ−２’，２’−ジフルオロシチジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−メルカプトシチジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−チオメトキシシチジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−アミノシチジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−アジドシチジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−ブロモシチジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−クロロシチジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−フルオロシチジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−ヨードシチジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−メルカプトシチジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−チオメトキシシチジンＴＰ；２’−Ｏ−メチル−５−（１−プロピニル）シチジンＴＰ；３’−エチニルシチジンＴＰ；４’−アジドシチジンＴＰ；４’−炭素環式シチジンＴＰ；４’−エチニルシチジンＴＰ；５−（１−プロピニル）アラ−シチジンＴＰ；５−（２−クロロ−フェニル）−２−チオシチジンＴＰ；５−（４−アミノ−フェニル）−２−チオシチジンＴＰ；５−アミノアリル−ＣＴＰ；５−シアノシチジンＴＰ；５−エチニルアラ−シチジンＴＰ；５−エチニルシチジンＴＰ；５’−ホモ−シチジンＴＰ；５−メトキシシチジンＴＰ；５−トリフルオロメチル−シチジンＴＰ；Ｎ４−アミノ−シチジンＴＰ；Ｎ４−ベンゾイル−シチジンＴＰ；シュードイソシチジン；７−メチルグアノシン；Ｎ２，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン；Ｎ２−メチルグアノシン；ワイオシン；１，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン；１−メチルグアノシン；２’−Ｏ−メチルグアノシン；２’−Ｏ−リボシルグアノシン（リン酸）；２’−Ｏ−メチルグアノシン；２’−Ｏ−リボシルグアノシン（リン酸）；７−アミノメチル−７−デアザグアノシン；７−シアノ−７−デアザグアノシン；アーケオシン；メチルワイオシン；Ｎ２，７−ジメチルグアノシン；Ｎ２，Ｎ２，２’−Ｏ−トリメチルグアノシン；Ｎ２，Ｎ２，７−トリメチルグアノシン；Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン；Ｎ２，７，２’−Ｏ−トリメチルグアノシン；６−チオ−グアノシン；７−デアザ−グアノシン；８−オキソ−グアノシン；Ｎ１−メチル−グアノシン；α−チオ−グアノシン；２（プロピル）グアニン；２−（アルキル）グアニン；２’−アミノ−２’−デオキシ−ＧＴＰ；２’−アジド−２’−デオキシ−ＧＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−アミノグアノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−アジドグアノシンＴＰ；６（メチル）グアニン；６−（アルキル）グアニン；６−（メチル）グアニン；６−メチル−グアノシン；７（アルキル）グアニン；７（デアザ）グアニン；７（メチル）グアニン；７−（アルキル）グアニン；７−（デアザ）グアニン；７−（メチル）グアニン；８（アルキル）グアニン；８（アルキニル）グアニン；８（ハロ）グアニン；８（チオアルキル）グアニン；８−（アルケニル）グアニン；８−（アルキル）グアニン；８−（アルキニル）グアニン；８−（アミノ）グアニン；８−（ハロ）グアニン；８−（ヒドロキシル）グアニン；８−（チオアルキル）グアニン；８−（チオール）グアニン；アザグアニン；デアザグアニン；Ｎ（メチル）グアニン；Ｎ−（メチル）グアニン；１−メチル−６−チオ−グアノシン；６−メトキシ−グアノシン；６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン；６−チオ−７−デアザ−グアノシン；６−チオ−７−メチル−グアノシン；７−デアザ−８−アザ−グアノシン；７−メチル−８−オキソ−グアノシン；Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアノシン；Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシン；１−Ｍｅ−ＧＴＰ；２’フルオロ−Ｎ２−イソブチル−グアノシンＴＰ；２’Ｏ−メチル−Ｎ２−イソブチル−グアノシンＴＰ；２’−ａ−エチニルグアノシンＴＰ；２’−ａ−トリフルオロメチルグアノシンＴＰ；２’−ｂ−エチニルグアノシンＴＰ；２’−ｂ−トリフルオロメチルグアノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’，２’−ジフルオログアノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−メルカプトグアノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−チオメトキシグアノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−アミノグアノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−アジドグアノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−ブロモグアノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−クロログアノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−フルオログアノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−ヨードグアノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−メルカプトグアノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−チオメトキシグアノシンＴＰ；４’−アジドグアノ
シンＴＰ；４’−炭素環式グアノシンＴＰ；４’−エチニルグアノシンＴＰ；５’−ホモ−グアノシンＴＰ；８−ブロモ−グアノシンＴＰ；９−デアザグアノシンＴＰ；Ｎ２−イソブチル−グアノシンＴＰ；１−メチルイノシン；イノシン；１，２’−Ｏ−ジメチルイノシン；２’−Ｏ−メチルイノシン；７−メチルイノシン；２’−Ｏ−メチルイノシン；エポキシキューオシン；ガラクトシル−キューオシン；マンノシルキューオシン；キューオシン；アリルアミノ−チミジン；アザチミジン；デアザチミジン；デオキシ−チミジン；２’−Ｏ−メチルウリジン；２−チオウリジン；３−メチルウリジン；５−カルボキシメチルウリジン；５−ヒドロキシウリジン；５−メチルウリジン；５−タウリノメチル−２−チオウリジン；５−タウリノメチルウリジン；ジヒドロウリジン；シュードウリジン；（３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン；１−メチル−３−（３−アミノ−５−カルボキシプロピル）シュードウリジン；１−メチルシュードウリジン；１−メチル−シュードウリジン；２’−Ｏ−メチルウリジン；２’−Ｏ−メチルシュードウリジン；２’−Ｏ−メチルウリジン；２−チオ−２’−Ｏ−メチルウリジン；３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン；３，２’−Ｏ−ジメチルウリジン；３−メチル−シュード−ウリジンＴＰ；４−チオウリジン；５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン；５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル；５，２’−Ｏ−ジメチルウリジン；５，６−ジヒドロ−ウリジン；５−アミノメチル−２−チオウリジン；５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン；５−カルバモイルメチルウリジン；５−カルボキシヒドロキシメチルウリジン；５−カルボキシヒドロキシメチルウリジンメチルエステル；５−カルボキシメチルアミノメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン；５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン；５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン；５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン；５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン；５−カルバモイルメチルウリジンＴＰ；５−メトキシカルボニルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン；５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン；５−メトキシカルボニルメチルウリジン；５−メトキシウリジン；５−メチル−２−チオウリジン；５−メチルアミノメチル−２−セレノウリジン；５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン；５−メチルアミノメチルウリジン；５−メチルジヒドロウリジン；５−オキシ酢酸−ウリジンＴＰ；５−オキシ酢酸−メチルエステル−ウリジンＴＰ；Ｎ１−メチル−シュード−ウリジン；ウリジン５−オキシ酢酸；ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル；３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）−ウリジンＴＰ；５−（イソ−ペンテニルアミノメチル）−２−チオウリジンＴＰ；５−（イソ−ペンテニルアミノメチル）−２’−Ｏ−メチルウリジンＴＰ；５−（イソ−ペンテニルアミノメチル）ウリジンＴＰ；５−プロピニルウラシル；α−チオ−ウリジン；１（アミノアルキルアミノ−カルボニルエチレニル）−２（チオ）−シュードウラシル；１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−２，４−（ジチオ）シュードウラシル；１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−４（チオ）シュードウラシル；１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−シュードウラシル；１（アミノカルボニルエチレニル）−２（チオ）−シュードウラシル；１（アミノカルボニルエチレニル）−２，４−（ジチオ）シュードウラシル；１（アミノカルボニルエチレニル）−４（チオ）シュードウラシル；１（アミノカルボニルエチレニル）−シュードウラシル；１置換２（チオ）−シュードウラシル；１置換２，４−（ジチオ）シュードウラシル；１置換４（チオ）シュードウラシル；１置換シュードウラシル；１−（アミノアルキルアミノ−カルボニルエチレニル）−２−（チオ）−シュードウラシル；１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）シュードウリジンＴＰ；１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）シュード−ＵＴＰ；１−メチル−シュード−ＵＴＰ；２（チオ）シュードウラシル；２’デオキシウリジン；２’フルオロウリジン；２−（チオ）ウラシル；２，４−（ジチオ）シュードウラシル；２’メチル，２’アミノ，２’アジド，２’フルロ−グアノシン；２’−アミノ−２’−デオキシ−ＵＴＰ；２’−アジド−２’−デオキシ−ＵＴＰ；２’−アジド−デオキシウリジンＴＰ；２’−Ｏ−メチルシュードウリジン；２’デオキシウリジン；２’フルオロウリジン；２’−デオキシ−２’−ａ−アミノウリジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−アジドウリジンＴＰ；２−メチルシュードウリジン；３（３アミノ−３カルボキシプロピル）ウラシル；４（チオ）シュードウラシル；４−（チオ）シュードウラシル；４−（チオ）ウラシル；４−チオウラシル；５（１，３−ジアゾール−１−アルキル）ウラシル；５（２−アミノプロピル）ウラシル；５（アミノアルキル）ウラシル；５（ジメチルアミノアルキル）ウラシル；５（グアニジニウムアルキル）ウラシル；５（メトキシカルボニルメチル）−２−（チオ）ウラシル；５（メトキシカルボニル−メチル）ウラシル；５（メチル）２（チオ）ウラシル；５（メチル）２，４（ジチオ）ウラシル；５（メチル）４（チオ）ウラシル；５（メチルアミノメチル）−２（チオ）ウラシル；５（メチルアミノメチル）−２，４（ジチオ）ウラシル；５（メチルアミノメチル）−４（チオ）ウラシル；５（プロピニル）ウラシル；５（トリフルオロメチル）ウラシル；５−（２−アミノプロピル）ウラシル；５−（アルキル）−２−（チオ）シュードウラシル；５−（アルキル）−２，４（ジチオ）シュードウラシル；５−（アルキル）−４（チオ）シュードウラシル；５−（アルキル）シュードウラシル；５−（アルキル）ウラシル；５−（アルキニル）ウラシル；５−（アリルアミノ）ウラシル；５−（シアノアルキル）ウラシル；５−（ジアルキルアミノアルキル）ウラシル；５−（ジメチルアミノアルキル）ウラシル；５−（グアニジニウムアルキル）ウラシル；５−（ハロ）ウラシル；５−（１，３−ジアゾール−１−アルキル）ウラシル；５−（メトキシ）ウラシル；５−（メトキシカルボニルメチル）−２−（チオ）ウラシル；５−（メトキシカルボニル−メチル）ウラシル；５−（メチル）２（チオ）ウラシル；５−（メチル）２，４（ジチオ）ウラシル；５−（メチル）４（チオ）ウラシル；５−（メチル）−２−（チオ）シュードウラシル；５−（メチル）−２，４（ジチオ）シュードウラシル；５−（メチル）−４（チオ）シュードウラシル；５−（メチル）シュードウラシル；５−（メチルアミノメチル）−２（チオ）ウラシル；５−（メチルアミノメチル）−２，４（ジチオ）ウラシル；５−（メチルアミノメチル）−４−（チオ）ウラシル；５−（プロピニル）ウラシル；５−（トリフルオロメチル）ウラシル；５−アミノアリル−ウリジン；５−ブロモ−ウリジン；５−ヨード−ウリジン；５−ウラシル；６（アゾ）ウラシル；６−（アゾ）ウラシル；６−アザ−ウリジン；アリルアミノ−ウラシル；アザウラシル；デアザウラシル；Ｎ３（メチル）ウラシル；シュード−ＵＴＰ−１−２−エタン酸；シュードウラシル；４−チオ−シュード−ＵＴＰ；１−カルボキシメチル−シュードウリジン；１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン；１−プロピニル−ウリジン；１−タウリノメチル−１−メチル−ウリジン；１−タウリノメチル−４−チオ−ウリジン；１−タウリノメチル−シュードウリジン；２−メトキシ−４−チオ−シュードウリジン；２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン；２−チオ−１−メチル−シュードウリジン；２−チオ−５−アザ−ウリジン；２−チオ−ジヒドロシュードウリジン；２−チオ−ジヒドロウリジン；２−チオ−シュードウリジン；４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン；４−メトキシ−シュードウリジン；４−チオ−１−メチル−シュードウリジン；４−チオ−シュードウリジン；５−アザ−ウリジン；ジヒドロシュードウリジン；（±）１−（２−ヒドロキシプロピル）シュードウリジンＴＰ；
（２Ｒ）−１−（２−ヒドロキシプロピル）シュードウリジンＴＰ；（２Ｓ）−１−（２−ヒドロキシプロピル）シュードウリジンＴＰ；（Ｅ）−５−（２−ブロモ−ビニル）アラ−ウリジンＴＰ；（Ｅ）−５−（２−ブロモ−ビニル）ウリジンＴＰ；（Ｚ）−５−（２−ブロモ−ビニル）アラ−ウリジンＴＰ；（Ｚ）−５−（２−ブロモ−ビニル）ウリジンＴＰ；１−（２，２，２−トリフルオロエチル）−シュード−ＵＴＰ；１−（２，２，３，３，３−ペンタフルオロプロピル）シュードウリジンＴＰ；１−（２，２−ジエトキシエチル）シュードウリジンＴＰ；１−（２，４，６−トリメチルベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（２，４，６−トリメチル−ベンジル）シュード−ＵＴＰ；１−（２，４，６−トリメチル−フェニル）シュード−ＵＴＰ；１−（２−アミノ−２−カルボキシエチル）シュード−ＵＴＰ；１−（２−アミノ−エチル）シュード−ＵＴＰ；１−（２−ヒドロキシエチル）シュードウリジンＴＰ；１−（２−メトキシエチル）シュードウリジンＴＰ；１−（３，４−ビス−トリフルオロメトキシベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（３，４−ジメトキシベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）シュード−ＵＴＰ；１−（３−アミノ−プロピル）シュード−ＵＴＰ；１−（３−シクロプロピル−プロプ−２−イニル）シュードウリジンＴＰ；１−（４−アミノ−４−カルボキシブチル）シュード−ＵＴＰ；１−（４−アミノ−ベンジル）シュード−ＵＴＰ；１−（４−アミノ−ブチル）シュード−ＵＴＰ；１−（４−アミノ−フェニル）シュード−ＵＴＰ；１−（４−アジドベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（４−ブロモベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（４−クロロベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（４−フルオロベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（４−ヨードベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（４−メタンスルホニルベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（４−メトキシベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（４−メトキシ−ベンジル）シュード−ＵＴＰ；１−（４−メトキシ−フェニル）シュード−ＵＴＰ；１−（４−メチルベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（４−メチル−ベンジル）シュード−ＵＴＰ；１−（４−ニトロベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（４−ニトロ−ベンジル）シュード−ＵＴＰ；１（４−ニトロ−フェニル）シュード−ＵＴＰ；１−（４−チオメトキシベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（４−トリフルオロメトキシベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（４−トリフルオロメチルベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（５−アミノ−ペンチル）シュード−ＵＴＰ；１−（６−アミノ−ヘキシル）シュード−ＵＴＰ；１，６−ジメチル−シュード−ＵＴＰ；１−［３−（２−｛２−［２−（２−アミノエトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−プロピオニル］シュードウリジンＴＰ；１−｛３−［２−（２−アミノエトキシ）−エトキシ］−プロピオニル｝シュードウリジンＴＰ；１−アセチルシュードウリジンＴＰ；１−アルキル−６−（１−プロピニル）−シュード−ＵＴＰ；１−アルキル−６−（２−プロピニル）−シュード−ＵＴＰ；１−アルキル−６−アリル−シュード−ＵＴＰ；１−アルキル−６−エチニル−シュード−ＵＴＰ；１−アルキル−６−ホモアリル−シュード−ＵＴＰ；１−アルキル−６−ビニル−シュード−ＵＴＰ；１−アリルシュードウリジンＴＰ；１−アミノメチル−シュード−ＵＴＰ；１−ベンゾイルシュードウリジンＴＰ；１−ベンジルオキシメチルシュードウリジンＴＰ；１−ベンジル−シュード−ＵＴＰ；１−ビオチニル−ＰＥＧ２−シュードウリジンＴＰ；１−ビオチニルシュードウリジンＴＰ；１−ブチル−シュード−ＵＴＰ；１−シアノメチルシュードウリジンＴＰ；１−シクロブチルメチル−シュード−ＵＴＰ；１−シクロブチル−シュード−ＵＴＰ；１−シクロヘプチルメチル−シュード−ＵＴＰ；１−シクロヘプチル−シュード−ＵＴＰ；１−シクロヘキシルメチル−シュード−ＵＴＰ；１−シクロヘキシル−シュード−ＵＴＰ；１−シクロオクチルメチル−シュード−ＵＴＰ；１−シクロオクチル−シュード−ＵＴＰ；１−シクロペンチルメチル−シュード−ＵＴＰ；１−シクロペンチル−シュード−ＵＴＰ；１−シクロプロピルメチル−シュード−ＵＴＰ；１−シクロプロピル−シュード−ＵＴＰ；１−エチル−シュード−ＵＴＰ；１−ヘキシル−シュード−ＵＴＰ；１−ホモアリルシュードウリジンＴＰ；１−ヒドロキシメチルシュードウリジンＴＰ；１−イソ−プロピル−シュード−ＵＴＰ；１−Ｍｅ−２−チオ−シュード−ＵＴＰ；１−Ｍｅ−４−チオ−シュード−ＵＴＰ；１−Ｍｅ−アルファ−チオ−シュード−ＵＴＰ；１−メタンスルホニルメチルシュードウリジンＴＰ；１−メトキシメチルシュードウリジンＴＰ；１−メチル−６−（２，２，２−トリフルオロエチル）シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−（４−モルホリノ）−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−（４−チオモルホリノ）−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−（置換フェニル）シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−アミノ−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−アジド−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−ブロモ−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−ブチル−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−クロロ−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−シアノ−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−ジメチルアミノ−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−エトキシ−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−エチルカルボキシレート−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−エチル−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−フルオロ−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−ホルミル−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−ヒドロキシアミノ−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−ヒドロキシ−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−ヨード−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−イソ−プロピル−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−メトキシ−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−メチルアミノ−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−フェニル−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−プロピル−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−ｔｅｒｔ−ブチル−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−トリフルオロメトキシ−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−トリフルオロメチル−シュード−ＵＴＰ；１−モルホリノメチルシュードウリジンＴＰ；１−ペンチル−シュード−ＵＴＰ；１−フェニル−シュード−ＵＴＰ；１−ピバロイルシュードウリジンＴＰ；１−プロパルギルシュードウリジンＴＰ；１−プロピル−シュード−ＵＴＰ；１−プロピニル−シュードウリジン；１−ｐ−トリル−シュード−ＵＴＰ；１−ｔｅｒｔ−ブチル−シュード−ＵＴＰ；１−チオメトキシメチルシュードウリジンＴＰ；１−チオモルホリノメチルシュードウリジンＴＰ；１−トリフルオロアセチルシュードウリジンＴＰ；１−トリフルオロメチル−シュード−ＵＴＰ；１−ビニルシュードウリジンＴＰ；２，２’−アンヒドロ−ウリジンＴＰ；２’−ブロモ−デオキシウリジンＴＰ；２’−Ｆ−５−メチル−２’−デオキシ−ＵＴＰ；２’−ＯＭｅ−５−Ｍｅ−ＵＴＰ；２’−ＯＭｅ−シュード−ＵＴＰ；２’−ａ−エチニルウリジンＴＰ；２’−ａ−トリフルオロメチルウリジンＴＰ；２’−ｂ−エチニルウリジンＴＰ；２’−ｂ−トリフルオロメチルウリジンＴＰ；２’−デオキシ−２’，２’−ジフルオロウリジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−メルカプトウリジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−チオメトキシウリジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−アミノウリジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−アジドウリジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−ブロモウリジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−クロロウリジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−フルオロウリジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−ヨードウリジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−メルカプトウリジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−チオメトキシウリジンＴＰ；２−メトキシ−４−チオ−ウリジン；２−メトキシウリジン；２’−Ｏ−メチル−５−（１−プロピニル）ウリジンＴＰ；３−アルキル−シュード−ＵＴＰ；４’−アジドウリジンＴＰ；４’−炭素環式ウリジンＴＰ；４’−エチニルウリジンＴＰ；５−（１−プロピニル）アラ−ウリジンＴＰ；５−（２−フラニル）ウリジンＴＰ；５−シアノウリジンＴＰ；５−ジメチルアミノウリジンＴＰ；５’−ホモ−ウリジンＴＰ；５−ヨード−２’−フルオロ−デオキシウリジンＴＰ；５−フェニルエチニルウリジンＴＰ；５−トリデューテロメチル−６−デューテロウリジンＴＰ；５−トリフルオロメチル−ウリジンＴＰ；５−ビニルアラウリジンＴＰ；６−（２，２，２−トリフルオロエチル）−シュード−ＵＴＰ；６−（４−モルホリノ）−シュード−ＵＴＰ；６−（４−チオモルホリノ）−シュード−ＵＴＰ；６−（置換−フェニル）−シュード−ＵＴＰ；６−アミノ−シュード−ＵＴＰ；６−アジド−シュード−ＵＴＰ；６−ブロモ−シュード−ＵＴＰ；６−ブチル−シュード−ＵＴＰ；６−クロロ−シュード−ＵＴＰ；６−シアノ−シュード−ＵＴＰ；６−ジメチルアミノ−シュード−ＵＴＰ；６−エトキシ−シュード−ＵＴＰ；６−エチルカルボキシレート−シュード−ＵＴＰ；６−エチル−シュード−ＵＴＰ；６−フルオロ−シュード−ＵＴＰ；６−ホルミル−シュード−ＵＴＰ；６−ヒドロキシアミノ−シュード−ＵＴＰ；６−ヒドロキシ−シュード−ＵＴＰ；６−ヨード−シュード−ＵＴＰ；６−イソ−プロピル−シュード−ＵＴＰ；６−メトキシ−シュード−ＵＴＰ；６−メチルアミノ−シュード−ＵＴＰ；６−メチル−シュード−ＵＴＰ；６−フェニル−シュード−ＵＴＰ；６−フェニル−シュード−ＵＴＰ；６−プロピル−シュード−ＵＴＰ；６−ｔｅｒｔ−ブチル−シュード−ＵＴＰ；６−トリフルオロメトキシ−シュード−ＵＴＰ；６−トリフルオロメチル−シュード−ＵＴＰ；アルファ−チオ−シュード−ＵＴＰ；シュードウリジン１−（４−メチルベンゼンスルホン酸）ＴＰ；シュードウリジン１−（４−メチル安息香酸）ＴＰ；シュードウリジンＴＰ１−［３−（２−エトキシ）］プロピオン酸；シュードウリジンＴＰ１−［３−｛２−（２−［２−（２−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ）−エトキシ｝］プロピオン酸；シュードウリジンＴＰ１−［３−｛２−（２−［２−｛２（２−エトキシ）−エトキシ｝−エトキシ］−エトキシ）−エトキシ｝］プロピオン酸；シュードウリジンＴＰ１−［３−｛２−（２−［２−エトキシ］−エトキシ）−エトキシ｝］プロピオン酸；シュードウリジンＴＰ１−［３−｛２−（２−エトキシ）−エトキシ｝］プロピオン酸；シュードウリジンＴＰ１−メチルホスホン酸；シュードウリジンＴＰ１−メチルホスホン酸ジエチルエステル；シュード−ＵＴＰ−Ｎ１−３−プロピオン酸；シュード−ＵＴＰ−Ｎ１−４−ブタン酸；シュード−ＵＴＰ−Ｎ１−５−ペンタン酸；シュード−ＵＴＰ−Ｎ１−６−ヘキサン酸；シュード−ＵＴＰ−Ｎ１−７−ヘプタン酸；シュード−ＵＴＰ−Ｎ１−メチル−ｐ−安息香酸；シュード−ＵＴＰ−Ｎ１−ｐ−安息香酸；ワイブトシン；ヒドロキシワイブトシン；イソワイオシン；ペルオキシワイブトシン；不完全修飾（ｕｎｄｅｒｍｏｄｉｆｉｅｄ）ヒドロキシワイブトシン；４−デメチルワイオシン；２，６−（ジアミノ）プリン；１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル：１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノチアジン−１−イル；１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル；１，３，５−（トリアザ）−２，６−（ジオキサ）−ナフタレン；２（アミノ）プリン；２，４，５−（トリメチル）フェニル；２’メチル，２’アミノ，２’アジド，２’フルロ−シチジン；２’メチル，２’アミノ，２’アジド，２’フルロ−アデニン；２’メチル，２’アミノ，２’アジド，２’フルロ−ウリジン；２’−アミノ−２’−デオキシリボース；２−アミノ−６−クロロ−プリン；２−アザ−イノシニル；２’−アジド−２’−デオキシリボ
ース；２’フルオロ−２’−デオキシリボース；２’−フルオロ−修飾塩基；２’−Ｏ−メチル−リボース；２−オキソ−７−アミノピリドピリミジン−３−イル；２−オキソ−ピリドピリミジン−３−イル；２−ピリジノン；３ニトロピロール；３−（メチル）−７−（プロピニル）イソカルボスチリリル（ｉｓｏｃａｒｂｏｓｔｙｒｉｌｙｌ）；３−（メチル）イソカルボスチリリル；４−（フルオロ）−６−（メチル）ベンゾイミダゾール；４−（メチル）ベンゾイミダゾール；４−（メチル）インドリル；４，６−（ジメチル）インドリル；５ニトロインドール；５置換ピリミジン；５−（メチル）イソカルボスチリリル；５−ニトロインドール；６−（アザ）ピリミジン；６−（アゾ）チミン；６−（メチル）−７−（アザ）インドリル；６−クロロ−プリン；６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル；７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノチアジン−１−イル；７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル；７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル；７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノチアジン−１−イル；７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル；７−（アザ）インドリル；７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン１−イル；７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノチアジン−１−イル；７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル；７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル；７−（グアニジニウムアルキル−ヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノチアジン−１−イル；７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル；７−（プロピニル）イソカルボスチリリル；７−（プロピニル）イソカルボスチリリル，プロピニル−７−（アザ）インドリル；７−デアザ−イノシニル；７−置換１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル；７−置換１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル；９−（メチル）−イミジゾピリジニル；アミノインドリル；アントラセニル；ビス−オルト−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル；ビス−オルト−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル；ジフルオロトリル；ヒポキサンチン；イミジゾピリジニル；イノシニル；イソカルボスチリリル；イソグアニシン（Ｉｓｏｇｕａｎｉｓｉｎｅ）；Ｎ２−置換プリン；Ｎ６−メチル−２−アミノ−プリン；Ｎ６−置換プリン；Ｎ−アルキル化誘導体；ナフタレニル；ニトロベンゾイミダゾリル；ニトロイミダゾリル；ニトロインダゾリル；ニトロピラゾリル；ヌバラリン（Ｎｕｂｕｌａｒｉｎｅ）；Ｏ６−置換プリン；Ｏ−アルキル化誘導体；オルト−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル；オルト−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル；オキソホルマイシンＴＰ；パラ−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル；パラ−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル；ペンタセニル；フェナントラセニル（Ｐｈｅｎａｎｔｈｒａｃｅｎｙｌ）；フェニル；プロピニル−７−（アザ）インドリル；ピレニル；ピリドピリミジン−３−イル；ピリドピリミジン−３−イル，２−オキソ−７−アミノ−ピリドピリミジン−３−イル；ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル；ピロロピリミジニル；ピロロピリジニル；スチルベンジル；置換１，２，４−トリアゾール；テトラセニル；ツベルシジン；キサンチン；キサントシン−５’−ＴＰ；２−チオ−ゼブラリン；５−アザ−２−チオ−ゼブラリン；７−デアザ−２−アミノ−プリン；ピリジン−４−オンリボヌクレオシド；２−アミノ−リボシド−ＴＰ；ホルマイシンＡＴＰ；ホルマイシンＢＴＰ；ピロロシンＴＰ；２’−ＯＨ−アラ−アデノシンＴＰ；２’−ＯＨ−アラ−シチジンＴＰ；２’−ＯＨ−アラ−ウリジンＴＰ；２’−ＯＨ−アラ−グアノシンＴＰ；５−（２−カルボメトキシビニル）ウリジンＴＰ；及びＮ６−（１９−アミノ−ペンタオキサノナデシル）アデノシンＴＰ。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、少なくとも２つ（例えば、２、３、４またはそれ以上）の上記の修飾核酸塩基の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）中の修飾核酸塩基は、シュードウリジン（Ψ）、Ｎ１−メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ）、２−チオウリジン、Ｎ１−エチルシュードウリジン、４’−チオウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、４−チオ−シュードウリジン、５−アザ−ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５−メトキシウリジン、及び２’−Ｏ−メチルウリジンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、少なくとも２つ（例えば、２、３、４またはそれ以上）の上記の修飾核酸塩基の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）中の修飾核酸塩基は、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１ψ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、シュードウリジン（ψ）、α−チオ−グアノシン、及びチオアデノシンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、少なくとも２つ（例えば、２、３、４またはそれ以上）の上記の修飾核酸塩基の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、シュードウリジン（Ψ）及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１Ψ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１Ψ）及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、２−チオウリジン及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、２’−Ｏ−メチルウリジンを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、２’−Ｏ−メチルウリジン及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、特定の修飾のため均一に修飾（例えば、完全に修飾、すなわち全配列にわたり修飾）される。例えば、ポリヌクレオチドは５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）で均一に修飾することができ、これはｍＲＮＡ配列中のすべてのシトシン残基が５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）で置換されることを意味する。同様に、上述のような修飾残基による置換によって、配列中に存在する任意の型のヌクレオシド残基について、ポリヌクレオチドを均一に修飾することができる。
修飾シトシンを有する例示的な核酸塩基及びヌクレオシドとして、Ｎ４−アセチル−シチジン（ａｃ４Ｃ）、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、５−ハロ−シチジン（例えば５−ヨード−シチジン）、５−ヒドロキシメチル−シチジン（ｈｍ５Ｃ）、１−メチル−シュードイソシチジン、２−チオ−シチジン（ｓ２Ｃ）、及び２−チオ−５−メチル−シチジンが挙げられる。
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は修飾ウリジンである。修飾ウリジンを有する例示的な核酸塩基及びヌクレオシドとして、５−シアノウリジン及び４’−チオウリジンが挙げられる。いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は修飾シトシンである。
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は修飾アデニンである。修飾アデニンを有する例示的な核酸塩基及びヌクレオシドとして、７−デアザ−アデニン、１−メチル−アデノシン（ｍ１Ａ）、２−メチル−アデニン（ｍ２Ａ）、及びＮ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は修飾グアニンである。修飾グアニンを有する例示的な核酸塩基及びヌクレオシドとして、イノシン（Ｉ）、１−メチル−イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、７−デアザ−グアノシン、７−シアノ−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７−アミノメチル−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ１）、７−メチル−グアノシン（ｍ７Ｇ）、１−メチル−グアノシン（ｍ１Ｇ）、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシンが挙げられる。
本開示のポリヌクレオチドは、分子の全長に沿って部分的にまたは完全に修飾することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドにおいて、またはその所与の所定の配列領域において（例えば、ポリＡ尾部を含むかまたは除外したｍＲＮＡにおいて）、１つ以上もしくはすべてのヌクレオチドまたは所与の種類のヌクレオチド（例えば、プリンもしくはピリミジン、またはＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのうちのいずれか１つ以上もしくはすべて）を均一に修飾することができる。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（またはその所与の配列領域）において、Ｘが、ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのうちのいずれか１つ、またはＡ＋Ｇ、Ａ＋Ｕ、Ａ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ、Ｇ＋Ｃ、Ｕ＋Ｃ、Ａ＋Ｇ＋Ｕ、Ａ＋Ｇ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ＋Ｃ、もしくはＡ＋Ｇ＋Ｃのうちのいずれか１つの組み合わせであり得る場合に、ヌクレオチドＸがすべて修飾ヌクレオチドである。
ポリヌクレオチドは、（全体的なヌクレオチド含量に対して、または１種類以上のヌクレオチド、すなわちＡ、Ｇ、Ｕ、またはＣのいずれか１つ以上に対して）約１％〜約１００％の修飾ヌクレオチドまたは任意の介入率（例えば、１％〜２０％、１％〜２５％、１％〜５０％、１％〜６０％、１％〜７０％、１％〜８０％、１％〜９０％、１％〜９５％、１０％〜２０％、１０％〜２５％、１０％〜５０％、１０％〜６０％、１０％〜７０％、１０％〜８０％、１０％〜９０％、１０％〜９５％、１０％〜１００％、２０％〜２５％、２０％〜５０％、２０％〜６０％、２０％〜７０％、２０％〜８０％、２０％〜９０％、２０％〜９５％、２０％〜１００％、５０％〜６０％、５０％〜７０％、５０％〜８０％、５０％〜９０％、５０％〜９５％、５０％〜１００％、７０％〜８０％、７０％〜９０％、７０％〜９５％、７０％〜１００％、８０％〜９０％、８０％〜９５％、８０％〜１００％、９０％〜９５％、９０％〜１００％、及び９５％〜１００％）の修飾ヌクレオチドを含み得る。非修飾Ａ、Ｇ、Ｕ、またはＣの存在量によっては、それ以外の任意のパーセンテージを占める。
ポリヌクレオチドは、最低１％及び最大１００％の修飾ヌクレオチド、または少なくとも５％の修飾ヌクレオチド、少なくとも１０％の修飾ヌクレオチド、少なくとも２５％の修飾ヌクレオチド、少なくとも５０％の修飾ヌクレオチド、少なくとも８０％の修飾ヌクレオチド、もしくは少なくとも９０％の修飾ヌクレオチドなどの任意の介入率を含み得る。例えば、ポリヌクレオチドは、修飾ウラシルまたは修飾シトシンなどの修飾ピリミジンを含み得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド中のウラシルの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％が、修飾ウラシル（例えば、５置換ウラシル）で置換される。修飾ウラシルは、単一の固有な構造を有する化合物で置換することができるか、または異なる構造（例えば、２、３、４、またはそれ以上の固有な構造）を有する複数の化合物で置換することができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド中のシトシンの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％が、修飾シトシン（例えば、５置換シトシン）で置換される。修飾シトシンは、単一の固有な構造を有する化合物で置換することができるか、または異なる構造（例えば、２、３、４、またはそれ以上の固有な構造）を有する複数の化合物で置換することができる。
したがって、いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、５’ＵＴＲエレメント、場合によりコドン最適化されたオープンリーディングフレーム、及び３’ＵＴＲエレメント、ポリ（Ａ）配列及び／またはポリアデニル化シグナルを含み、その場合のＲＮＡは化学修飾されていない。
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は修飾ウラシルである。修飾ウラシルを有する例示的な核酸塩基及びヌクレオシドとして、シュードウリジン（Ψ）、ピリジン−４−オンリボヌクレオシド、５−アザ−ウリジン、６−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ウリジン（ｓ２Ｕ）、４−チオ−ウリジン（Ｓ４Ｕ）、４−チオ−シュードウリジン、２−チオ−シュードウリジン、５−ヒドロキシ−ウリジン（ｈｏ５Ｕ）、５−アミノアリル−ウリジン、５−ハロ−ウリジン（例えば、５−ヨード−ウリジンまたは５−ブロモ−ウリジン）、３−メチル−ウリジン（ｍ３Ｕ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５−カルボキシメチル−ウリジン（ｃｍ５Ｕ）、１−カルボキシメチル−シュードウリジン、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５−アミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−ウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−セレノ−ウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５−カルバモイルメチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−シュードウリジン、５−タウリノメチル−ウリジン（τｍ５Ｕ）、１−タウリノメチル−シュードウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、１−タウリノメチル−４−チオ−シュードウリジン、５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ、すなわち核酸塩基デオキシチミンを有する）、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１Ψ）、５−メチル−２−チオ−ウリジン（ｍ５ｓ２Ｕ）、１−メチル−４−チオ−シュードウリジン（ｍ１ｓ４Ψ）、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、３−メチル−シュードウリジン（ｍ３Ψ）、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロシュードウリジン、５，６−ジヒドロウリジン、５−メチル−ジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−メトキシ−ウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、Ｎ１−メチル−シュードウリジン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）シュードウリジン（ａｃｐ３Ψ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ５Ｕ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２−チオ−ウリジン（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、α−チオ−ウリジン、２’−Ｏ−メチル−ウリジン（Ｕｍ）、５，２’−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２’−Ｏ−メチル−シュードウリジン（Ψｍ）、２−チオ−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５−メトキシカルボニルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２’−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ３Ｕｍ）、及び５−（イソペンテニルアミノメチル）−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１−チオ−ウリジン、デオキシチミジン、２’−Ｆ−アラ−ウリジン、２’−Ｆ−ウリジン、２’−ＯＨ−アラ−ウリジン、５−（２−カルボメトキシビニル）ウリジン、及び５−［３−（１−Ｅ−プロペニルアミノ）］ウリジンが挙げられる。
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は修飾シトシンである。修飾シトシンを有する例示的な核酸塩基及びヌクレオシドとして、５−アザ−シチジン、６−アザ−シチジン、シュードイソシチジン、３−メチル−シチジン（ｍ３Ｃ）、Ｎ４−アセチル−シチジン（ａｃ４Ｃ）、５−ホルミル−シチジン（ｆ５Ｃ）、Ｎ４−メチル−シチジン（ｍ４Ｃ）、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、５−ハロ−シチジン（例えば、５−ヨード−シチジン）、５−ヒドロキシメチル−シチジン（ｈｍ５Ｃ）、１−メチル−シュードイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−シュードイソシチジン、２−チオ−シチジン（ｓ２Ｃ）、２−チオ−５−メチル−シチジン、４−チオ−シュードイソシチジン、４−チオ−１−メチル−シュードイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン、１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シチジン、２−メトキシ−５−メチル−シチジン、４−メトキシ−シュードイソシチジン、４−メトキシ−１−メチル−シュードイソシチジン、リシジン（ｋ２Ｃ）、α−チオ−シチジン、２’−Ｏ−メチル−シチジン（Ｃｍ）、５，２’−Ｏ−ジメチル−シチジン（ｍ５Ｃｍ）、Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−メチル−シチジン（ａｃ４Ｃｍ）、Ｎ４，２’−Ｏ−ジメチル−シチジン（ｍ４Ｃｍ）、５−ホルミル−２’−Ｏ−メチル−シチジン（ｆ５Ｃｍ）、Ｎ４，Ｎ４，２’−Ｏ−トリメチル−シチジン（ｍ４２Ｃｍ）、１−チオ−シチジン、２’−Ｆ−アラ−シチジン、２’−Ｆ−シチジン、及び２’−ＯＨ−アラーシチジンが挙げられる。
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は修飾アデニンである。修飾アデニンを有する例示的な核酸塩基及びヌクレオシドとして、２−アミノ−プリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−ハロ−プリン（例えば、２−アミノ−６−クロロ−プリン）、６−ハロ−プリン（例えば、６−クロロ−プリン）、２−アミノ−６−メチル−プリン、８−アジド−アデノシン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザ−アデニン、７−デアザ−２−アミノ−プリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノ−プリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチル−アデノシン（ｍ１Ａ）、２−メチル−アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン（ｉ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｉｏ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６−グリシニルカルバモイル−アデノシン（ｇ６Ａ）、Ｎ６−スレオニルカルバモイル−アデノシン（ｔ６Ａ）、Ｎ６−メチル−Ｎ６−スレオニルカルバモイル−アデノシン（ｍ６ｔ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−スレオニルカルバモイル−アデノシン（ｍｓ２ｇ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６−ジメチル−アデノシン（ｍ６２Ａ）、Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン（ｈｎ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６−アセチル−アデノシン（ａｃ６Ａ）、７−メチル−アデニン、２−メチルチオ−アデニン、２−メトキシ−アデニン、α−チオ−アデノシン、２’−Ｏ−メチル−アデノシン（Ａｍ）、Ｎ６，２’−Ｏ−ジメチル−アデノシン（ｍ６ＡＭ）、Ｎ６，Ｎ６，２’−Ｏ−トリメチル−アデノシン（ｍ６２ＡＭ）、１，２’−Ｏ−ジメチル−アデノシン（ｍ１Ａｍ）、２’−Ｏ−リボシルアデノシン（リン酸）（Ａｒ（ｐ））、２−アミノ−Ｎ６−メチル−プリン、１−チオ−アデノシン、８−アジド−アデノシン、２’−Ｆ−アラ−アデノシン、２’−Ｆ−アデノシン、２’−ＯＨ−アラ−アデノシン、及びＮ６−（１９−アミノ−ペンタオキサノナデシル）−アデノシンが挙げられる。
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は修飾グアニンである。修飾グアニンを有する例示的な核酸塩基及びヌクレオシドとして、イノシン（Ｉ）、１−メチル−イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、４−デメチル−ワイオシン（ｉｍＧ−１４）、イソワイオシン（ｉｍＧ２）、ワイブトシン（ｙＷ）、ペルオキワイブトシン（ｏ２ｙＷ）、ヒドロキシワイブトシン（ＯｈｙＷ）、不完全修飾ヒドロキシワイブトシン（ＯｈｙＷ＊）、７−デアザ−グアノシン、キューオシン（Ｑ）、エポキシキューオシン（ｏＱ）、ガラクトシル−キューオシン（ｇａｌＱ）、マンノシル−キューオシン（ｍａｎＱ）、７−シアノ−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７−アミノメチル−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ１）、アーケオシン（Ｇ＋）、７−デアザ−８−アザ−グアノシン、６−チオ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン、７−メチル−グアノシン（ｍ７Ｇ）、６−チオ−７−メチル−グアノシン、７−メチル−イノシン、６−メトキシ−グアノシン、１−メチル−グアノシン（ｍ１Ｇ）、Ｎ２−メチル−グアノシン（ｍ２Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−グアノシン（ｍ２２Ｇ）、Ｎ２，７−ジメチル−グアノシン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，７−ジメチル−グアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、１−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアノシン、α−チオ−グアノシン、２’−Ｏ−メチル−グアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２−メチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２Ｇｍ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２２Ｇｍ）、１−メチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ１Ｇｍ）、Ｎ２，７−ジメチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２，７ＧＭ）、２’−Ｏ−メチル−イノシン（ＩＭ）、１，２’−Ｏ−ジメチル−イノシン（ｍ１ＩＭ）、２’−Ｏ−リボシルグアノシン（リン酸）（Ｇｒ（ｐ））、１−チオ−グアノシン、Ｏ６−メチル−グアノシン、２’−Ｆ−アラ−グアノシン、及び２’−Ｆ−グアノシンが挙げられる。
ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写
本開示のインフルエンザウイルスワクチンは、ｍＲＮＡ（例えば、修飾ｍＲＮＡ）などの少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含む。例えば、「ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写鋳型」と呼ばれる鋳型ＤＮＡからｉｎ ｖｉｔｒｏでｍＲＮＡを転写する。いくつかの実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写鋳型は、５’非翻訳（ＵＴＲ）領域をコードし、オープンリーディングフレームを含み、３’ＵＴＲ及びポリＡ尾部をコードする。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写鋳型の特定の核酸配列組成及び長さは、鋳型がコードするｍＲＮＡに依存することになる。
「５’非翻訳領域」（５’ＵＴＲ）とは、開始コドン（すなわち、リボソームによって翻訳されるｍＲＮＡ転写産物の最初のコドン）のすぐ上流（すなわち、５’側）にあり、ポリペプチドをコードしないｍＲＮＡの領域を指す。
「３’非翻訳領域」（３’ＵＴＲ）とは、終止コドン（すなわち、翻訳の終結をシグナル伝達する、ｍＲＮＡ転写産物のコドン）のすぐ下流（すなわち、３’側）にあり、ポリペプチドをコードしないｍＲＮＡの領域を指す。
「オープンリーディングフレーム」とは、開始コドン（例えば、メチオニン（ＡＴＧ））から始まり、終止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧ、またはＴＧＡ）で終わる、ポリペプチドをコードするＤＮＡの連続するストレッチである。
「ポリＡ尾部」とは、複数の連続するアデノシン一リン酸を含む３’ＵＴＲの下流、例えば、すぐ下流（すなわち、３’側）にあるｍＲＮＡの領域である。ポリＡ尾部は、１０〜３００個のアデノシン一リン酸を含み得る。例えば、ポリＡ尾部は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、または３００個のアデノシン一リン酸を含み得る。いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は、５０〜２５０個のアデノシン一リン酸を含む。関連する生物学的環境（例えば、細胞内、ｉｎ ｖｉｖｏ）において、ポリ（Ａ）尾部は、例えば、細胞質においてｍＲＮＡを酵素分解から保護するように機能し、転写終結、核からのｍＲＮＡの輸送、及び翻訳を補助する。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは２００〜３，０００個のヌクレオチドを含む。例えば、ポリヌクレオチドは、２００〜５００、２００〜１０００、２００〜１５００、２００〜３０００、５００〜１０００、５００〜１５００、５００〜２０００、５００〜３０００、１０００〜１５００、１０００〜２０００、１０００〜３０００、１５００〜３０００、または２０００〜３０００個のヌクレオチドを含み得る。
フラジェリンアジュバント
フラジェリンは、重合して、細菌の運動と関連する鞭毛を形成する約５００アミノ酸のモノマータンパク質である。フラジェリンは、様々な鞭毛細菌（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）に加え、非鞭毛細菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）で発現する。自然免疫系（樹状細胞、マクロファージなど）の細胞によるフラジェリンの感知は、Ｔｏｌｌ様受容体５（ＴＬＲ５）ならびにＮｏｄ様受容体（ＮＬＲ）Ｉｐａｆ及びＮａｉｐ５によって媒介される。ＴＬＲ及びＮＬＲは、自然免疫応答及び適応免疫応答の活性化を担うことが同定されている。そのため、フラジェリンはワクチンにおいてアジュバント作用を提供する。
既知のフラジェリンポリペプチドをコードするヌクレオチド及びアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋデータベースに公開されている。特に、Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｈ．Ｐｙｌｏｒｉ、Ｖ．Ｃｈｏｌｅｒａ、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｅｎｓ、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｔ．Ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｅｉ、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｒ．ｌｕｐｉｎｉ、Ｂ．ｃｌａｒｒｉｄｇｅｉａｅ、Ｐ．Ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｕｓ、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、及びＥ．ｃｏｌｉ由来のフラジェリン配列が知られている。
本明細書で使用される場合、フラジェリンポリペプチドは、全長フラジェリンタンパク質、その免疫原性断片、及びフラジェリンタンパク質またはその免疫原性断片に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するペプチドを指す。例示的なフラジェリンタンパク質として、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ（ＵｎｉＰｒｏエントリ番号：Ｑ５６０８６）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（Ａ０Ａ０Ｃ９ＤＧ０９）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ（Ａ０Ａ０Ｃ９ＢＡＢ７）、及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ（Ｑ６Ｖ２Ｘ８）由来のフラジェリン、ならびに配列番号１〜４４４、４５８、４６０、４６２〜４７９（表７〜１３も参照）のいずれか１つによって特定されるアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。いくつかの実施形態では、フラジェリンポリペプチドは、フラジェリンタンパク質またはその免疫原性断片に対して少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、フラジェリンポリペプチドは免疫原性断片である。免疫原性断片は、免疫応答を引き起こすフラジェリンタンパク質の一部である。いくつかの実施形態では、免疫応答はＴＬＲ５免疫応答である。免疫原性断片の例は、ヒンジ領域のすべてまたは一部が欠失しているか、または他のアミノ酸で置換されているフラジェリンタンパク質である。例えば、抗原ポリペプチドをヒンジ領域に挿入することができる。ヒンジ領域は、フラジェリンの超可変領域である。フラジェリンのヒンジ領域は、「Ｄ３ドメインまたはＤ３領域」、「プロペラドメインまたはプロペラ領域」、「超可変ドメインまたは超可変領域」、及び「可変ドメインまたは可変領域」とも呼ばれる。本明細書で使用される場合、「ヒンジ領域の少なくとも一部」とは、フラジェリンのヒンジ領域の任意の部分、またはヒンジ領域の全体を指す。他の実施形態では、フラジェリンの免疫原性断片は、フラジェリンの２０、２５、３０、３５、または４０アミノ酸のＣ末端断片である。
フラジェリンモノマーはドメインＤ０〜Ｄ３で形成される。ステムを形成するＤ０及びＤ１は、タンデムの長いアルファヘリックスから構成され、異なる細菌間で高度に保存される。Ｄ１ドメインは、ＴＬＲ５の活性化に有用なアミノ酸からなるいくつかのストレッチを含む。Ｄ１ドメイン全体またはＤ１ドメイン内の１つ以上の活性領域が、フラジェリンの免疫原性断片である。Ｄ１ドメイン内の免疫原性領域の例として、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＦｌｉＣフラジェリン中の残基８８〜１１４及び残基４１１〜４３１が挙げられる。８８〜１００領域の１３アミノ酸の範囲では、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａフラジェリンと他のフラジェリンとの間で少なくとも６個が置換されてもＴＬＲ５活性の保存が可能である。したがって、フラジェリンの免疫原性断片には、ＴＬＲ５を活性化し、ＦｌｉＣの８８〜１００（ＬＱＲＶＲＥＬＡＶＱＳＡＮ；配列番号５０４）のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ配列と５３％以上同一である１３アミノ酸のモチーフを含むフラジェリン様配列が含まれる。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、フラジェリンと１つ以上の抗原ポリペプチドとの融合タンパク質をコードするＲＮＡを含む。本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」とは、２成分が連結された構築物を指す。いくつかの実施形態では、抗原ポリペプチドのカルボキシ末端は、フラジェリンポリペプチドのアミノ末端に融合または連結される。他の実施形態では、抗原ポリペプチドのアミノ末端は、フラジェリンポリペプチドのカルボキシ末端に融合または連結される。融合タンパク質は、例えば、１、２、３、４、５、６、またはそれ以上の抗原ポリペプチドに連結された、１、２、３、４、５、６またはそれ以上のフラジェリンポリペプチドを含み得る。２つ以上のフラジェリンポリペプチド及び／または２つ以上の抗原ポリペプチドが連結される場合、そのような構築物を「多量体」と呼ぶ場合がある。
融合タンパク質の各成分は、互いに直接結合していても、リンカーを介して結合していてもよい。例えば、リンカーはアミノ酸リンカーであり得る。ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンによってコードされ、融合タンパク質の成分を連結するアミノ酸リンカーは、例えば、リジン残基、グルタミン酸残基、セリン残基、及びアルギニン残基からなる群から選択される少なくとも１つの要素を含み得る。いくつかの実施形態では、リンカーは１〜３０、１〜２５、１〜２５、５〜１０、５、１５、または５〜２０のアミノ酸長である。
他の実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、少なくとも２つの別々のＲＮＡポリヌクレオチドを含み、１つは１つ以上の抗原ポリペプチドをコードし、もう１つはフラジェリンポリペプチドをコードする。少なくとも２つのＲＮＡポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子などの担体中で合剤にすることができる。
治療方法
本明細書では、ヒト及び他の哺乳動物におけるインフルエンザウイルスの予防及び／または治療のための組成物（例えば、医薬組成物）、方法、キット、及び試薬を提供する。インフルエンザウイルスＲＮＡワクチンは、治療薬または予防薬として使用することができる。このワクチンは、医療において感染性疾患の予防及び／または治療に使用することができる。例示的な態様では、本開示のインフルエンザウイルスＲＮＡワクチンは、インフルエンザウイルスからの予防的な防御を可能にするために使用される。インフルエンザウイルスからの予防的な防御は、本開示のインフルエンザウイルスＲＮＡワクチンの投与後に達成することができる。ワクチンは、１回、２回、３回、４回、またはそれ以上投与することができる。あまり望ましくないが、感染した個体にワクチンを投与して治療反応を得ることが可能である。それに応じて投与量を調節することが必要な場合がある。
いくつかの実施形態では、本開示のインフルエンザウイルスワクチンは、対象においてインフルエンザウイルス感染を予防する方法として使用することができ、その方法には、本明細書で提供される少なくとも１種のインフルエンザウイルスワクチンを前記対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、本開示のインフルエンザウイルスワクチンは、対象においてインフルエンザウイルスの一次感染を抑制する方法として使用することができ、その方法には、本明細書で提供される少なくとも１種のインフルエンザウイルスワクチンを前記対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、本開示のインフルエンザウイルスワクチンは、対象においてインフルエンザウイルス感染症を治療する方法として使用することができ、その方法には、本明細書で提供される少なくとも１種のインフルエンザウイルスワクチンを前記対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、本開示のインフルエンザウイルスワクチンは、対象においてインフルエンザウイルス感染の発生率を低下させる方法として使用することができ、その方法には、本明細書で提供される少なくとも１種のインフルエンザウイルスワクチンを前記対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、本開示のインフルエンザウイルスワクチンは、インフルエンザウイルスに感染した第１の対象からインフルエンザウイルスに感染していない第２の対象へのインフルエンザウイルスの拡散を抑制する方法として使用することができ、その方法には、本明細書で提供される少なくとも１種のインフルエンザウイルスワクチンを前記第１の対象及び前記第２の対象の少なくとも一方に投与することを含む。
インフルエンザウイルスに対する免疫応答を対象に誘導する方法が、本発明の態様で提供される。この方法は、少なくとも１つのインフルエンザウイルス抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含むインフルエンザウイルスＲＮＡワクチンを対象に投与し、それによりインフルエンザウイルス抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片に特異的な免疫応答を対象に誘導することを含み、その場合に、インフルエンザウイルスに対する予防有効量の従来型ワクチンをワクチン接種された対象における抗抗原ポリペプチド抗体価と比較して、対象における抗抗原ポリペプチド抗体価がワクチン接種後に増加する。「抗抗原ポリペプチド抗体」とは、抗原ポリペプチドに特異的に結合する血清抗体である。
予防有効量とは、臨床的に許容されるレベルでウイルスによる感染を予防する治療有効量である。いくつかの実施形態では、治療有効量とは、ワクチンの添付文書に列挙された投与量である。本明細書で使用される場合、従来型ワクチンとは、本開示のｍＲＮＡワクチン以外のワクチンを指す。例えば、従来型ワクチンには、生きた微生物ワクチン、死滅した微生物ワクチン、サブユニットワクチン、タンパク質抗原ワクチン、ＤＮＡワクチン、ＶＬＰワクチンなどが含まれるが、これらに限定されない。例示的な実施形態では、従来型ワクチンは、米国の食品医薬品局（ＦＤＡ）または欧州医薬品庁（ＥＭＡ）などの、国の医薬品規制機関による規制認可を取得している、及び／または各機関に登録されているワクチンである。
いくつかの実施形態では、インフルエンザウイルスに対する予防有効量の従来型ワクチンでワクチン接種された対象における抗抗原ポリペプチド抗体価と比較して、対象における抗抗原ポリペプチド抗体価は、ワクチン接種後に１ｌｏｇ〜１０ｌｏｇ増加する。
いくつかの実施形態では、インフルエンザに対する予防有効量の従来型ワクチンでワクチン接種された対象における抗抗原ポリペプチド抗体価と比較して、対象における抗抗原ポリペプチド抗体価は、ワクチン接種後に１ｌｏｇ、２ｌｏｇ、３ｌｏｇ、５ｌｏｇ、または１０ｌｏｇ増加する。
インフルエンザウイルスに対する免疫応答を対象に誘導する方法が、本開示の他の態様で提供される。この方法は、少なくとも１つのインフルエンザウイルス抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含むインフルエンザウイルスＲＮＡワクチンを対象に投与し、それによりインフルエンザウイルス抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片に特異的な免疫応答を対象に誘導することを含み、その場合に、対象における免疫応答が、インフルエンザウイルスに対する従来型ワクチンを本ＲＮＡワクチンと比較して２倍〜１００倍の用量レベルでワクチン接種された対象における免疫応答と同等である。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答が、従来型ワクチンを本インフルエンザワクチンと比較して２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍の用量レベルでワクチン接種された対象における免疫応答と同等である。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答が、従来型ワクチンを本インフルエンザワクチンと比較して１０〜１００倍、または１００〜１０００倍の用量レベルでワクチン接種された対象における免疫応答と同等である。
いくつかの実施形態では、免疫応答は、対象における［タンパク質］抗体価を決定することにより評価される。
いくつかの実施形態は、少なくとも１つのインフルエンザ抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含むインフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンを対象に投与し、それにより抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片に特異的な免疫応答を対象に誘導することによって免疫応答を対象に誘導する方法であって、対象における免疫応答が、インフルエンザに対する予防有効量の従来型ワクチンをワクチン接種された対象に誘導される免疫応答と比較して、２日〜１０週早く誘導される方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象における免疫応答が、従来型ワクチンを本インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンと比較して２倍〜１００倍の用量レベルの予防有効量でワクチン接種された対象に誘導されるものである。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答が、従来型ワクチンを本インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンと比較して２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍の用量レベルでワクチン接種された対象における免疫応答と同等である。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答が、予防有効量の従来型ワクチンをワクチン接種された対象に誘導される免疫応答と比較して、２日早く、または３日早く誘導される。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答が、予防有効量の従来型ワクチンをワクチン接種された対象に誘導される免疫応答と比較して、１週、２週、３週、５週、または１０週早く誘導する。
治療組成物及び予防組成物
本明細書では、例えば、ヒト及び他の哺乳動物におけるインフルエンザの予防、治療、または診断のための組成物（例えば、医薬組成物）、方法、キット、及び試薬を提供する。インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、治療薬または予防薬として使用することができる。このワクチンは、医療において感染性疾患の予防及び／または治療に使用することができる。いくつかの実施形態では、本開示の呼吸器ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは免疫エフェクター細胞の初回刺激に使用され、例えば、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）をｅｘ ｖｉｖｏで活性化した後、対象に注入（再注入）する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含有するインフルエンザワクチンは、対象（例えば、ヒト対象などの哺乳動物対象）に投与することができ、ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｖｏで翻訳されて抗原ポリペプチドを産生する。
インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、細胞、組織、または生物においてポリペプチド（例えば、抗原または免疫原）の翻訳を誘導することができる。いくつかの実施形態では、そのような翻訳はｉｎ ｖｉｖｏで起こるが、そのような翻訳がｅｘ ｖｉｖｏ、培養中、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで起こる場合もある。いくつかの実施形態では、細胞、組織、または生物を、抗原ポリペプチドをコードする少なくとも１つの翻訳可能領域を有するポリヌクレオチドを含むインフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンを含有する有効量の組成物と接触させる。
インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの「有効量」は、少なくとも部分的に、標的組織、標的細胞型、投与手段、ポリヌクレオチドの物理的特性（例えば、サイズ及び修飾ヌクレオシドの頻度）、及びワクチンの他の成分、ならびに他の決定要因に基づいて定められる。一般に、有効量のインフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチン組成物は、好ましくは同じ抗原またはペプチド抗原をコードする対応する非修飾ポリヌクレオチドを含有する組成物よりも効率的に、細胞における抗原産生に応じて免疫応答の誘導またはブーストをもたらす。抗原産生の増加は、細胞のトランスフェクション（ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡワクチンでトランスフェクトされた細胞の比率）の増加、ポリヌクレオチドからのタンパク質翻訳の増加、核酸分解の減少（例えば、修飾ポリヌクレオチドからのタンパク質翻訳の持続時間の増加によって示される）、または宿主細胞の抗原特異的免疫応答の変化により実証することができる。
いくつかの実施形態では、本開示によるＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチン（ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む）をインフルエンザの治療に使用することができる。
インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、健康な個体に対する活性免疫手法の一貫として予防的にまたは治療的に投与しても、または潜伏段階期、もしくは症状発現後の活動性感染期間の感染早期に投与してもよい。いくつかの実施形態では、細胞、組織、または対象に与えられる本開示のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの量は、免疫予防に有効な量であり得る。
インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、他の予防化合物または治療化合物と共に投与することができる。非限定的な例として、予防化合物または治療化合物は、アジュバントまたはブースターであり得る。本明細書で使用される場合、ワクチンなどの予防組成物を指すとき、用語「ブースター」とは、予防（ワクチン）組成物の追加投与を指す。ブースター（またはブースターワクチン）は、それより前の予防組成物の投与後に投与することができる。予防組成物の初回投与からブースター投与までの期間は、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１５分、２０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、１日、３６時間、２日、３日、４日、５日、６日、１週、１０日、２週、３週、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１年，１８か月、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、１１年、１２年、１３年、１４年、１５年、１６年、１７年、１８年、１９年、２０年、２５年、３０年、３５年、４０年、４５年、５０年、５５年、６０年、６５年、７０年、７５年、８０年、８５年、９０年、９５年、または９９年超であり得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、予防組成物の初回投与からブースター投与までの期間は、１週、２週、３週、１か月、２か月、３か月、６か月、または１年であり得るが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、当技術分野で既知の不活化ワクチンの投与と同様に、筋肉内、皮内、または鼻腔内に投与することができる。いくつかの実施形態では、インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、筋肉内に投与される。
インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、感染の蔓延、またはアンメットメディカルニーズの程度もしくはレベルに応じて様々な状況で利用することができる。非限定的な例として、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、様々なインフルエンザを治療及び／または予防するために利用することができる。ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、市販の抗ウイルス薬／組成物よりもはるかに高い抗体価を生じさせ、より早く応答を生成する点で優れた特性を有する。
本明細書では、インフルエンザＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）ワクチン及びＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）ワクチン組成物、ならびに／または場合により１種以上の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせた複合体を含む医薬組成物を提供する。
インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、単独で、または１種以上の他の成分と組み合わせて製剤化または投与することができる。例えば、インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチン（ワクチン組成物）は、アジュバントを含むがこれに限定されない他の成分を含むことができる。
いくつかの実施形態では、インフルエンザ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、アジュバントを含まない（アジュバント非含有である）。
インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、１種以上の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて製剤化または投与することができる。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、例えば治療に有効な物質、予防に有効な物質、またはその両方の組み合わせなどの、少なくとも１種の追加の有効物質を含む。ワクチン組成物は、滅菌されていても、パイロジェンフリーであっても、または滅菌され、かつパイロジェンフリーであってもよい。ワクチン組成物などの医薬品の製剤化及び／または製造に関する一般的な考慮事項は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２１ｓｔ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）で参照することができる。
いくつかの実施形態では、インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、ヒト、ヒト患者、またはヒト対象に投与される。本開示の目的では、語句「活性成分」は、一般に、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンまたはそれに含有されるポリヌクレオチド、例えば抗原ポリペプチドをコードするＲＮＡポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）を指す。
本明細書に記載のインフルエンザワクチン組成物の製剤は、薬理学の分野で既知であるか、または今後開発される任意の方法によって調製することができる。一般に、そのような調製方法には、活性成分（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）を賦形剤及び／または１種以上の他の補助成分と混合された状態にし、次いで、必要な場合及び／または望ましい場合には、所望する単回投与単位または複数回投与単位に製品を分割、成形、及び／または包装する工程を含む。
本開示による医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容される賦形剤、及び／または任意の追加成分の相対量は、処置される対象の同一性、サイズ、及び／または状態に応じて、さらには組成物が投与される経路に応じて決定されることになる。一例として、組成物は、０．１％〜１００％、例えば０．５〜５０％、１〜３０％、５〜８０％、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。
インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、１種以上の賦形剤を使用して製剤化することで、安定性を増加させる；細胞トランスフェクションを増加させる；持続放出または遅延放出を可能にする（例えば、デポー製剤による）；生体内分布を変化させる（例えば、特定の組織または細胞型への標的化）；コードされたタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ翻訳を増加させる；及び／またはコードされたタンパク質（抗原）のｉｎ ｖｉｖｏでの放出プロファイルを変化させることができる。あらゆる溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散助剤または懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、防腐剤などの従来的な賦形剤に加え、賦形剤には、これに限定されないが、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コア−シェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンでトランスフェクトされた細胞（例えば、対象への移植用）、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣体、及びそれらの組み合わせを含むことができる。
安定化エレメント
天然型の真核生物ｍＲＮＡ分子は、安定化エレメントを含むことが見出されており、これには、限定されないが、５’キャップ構造または３’ポリ（Ａ）尾部などの他の構造的特徴に加えて、５’末端（５’ＵＴＲ）及び／または３’末端（３’ＵＴＲ）の非翻訳領域（ＵＴＲ）が含まれる。一般的に５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲはいずれも、ゲノムＤＮＡから転写される、未成熟なｍＲＮＡのエレメントである。５’キャップ及び３’ポリ（Ａ）尾部のような成熟ｍＲＮＡの特徴的な構造的特徴は、通常、ｍＲＮＡのプロセシング中に、転写された（未成熟）ｍＲＮＡに付加される。３’ポリ（Ａ）尾部は一般的に、転写されたｍＲＮＡの３’末端に付加されたアデニンヌクレオチドのストレッチである。これは、最大約４００のアデニンヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、３’ポリ（Ａ）尾部の長さは、個々のｍＲＮＡの安定性に関して重要なエレメントであり得る。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、１つ以上の安定化エレメントを含み得る。安定化エレメントには、例えば、ヒストンステムループを含み得る。３２ｋＤａタンパク質であるステムループ結合タンパク質（ＳＬＢＰ）が同定されている。これは、核と細胞質の両方においてヒストンメッセンジャーの３’末端でヒストンステムループに結合する。その発現レベルは、細胞周期によって制御され、Ｓ期にピークとなり、そのときヒストンのｍＲＮＡレベルも上昇する。このタンパク質は、Ｕ７ ｓｎＲＮＰによるヒストンのプレｍＲＮＡの効率的な３’末端プロセシングに不可欠であることが示されている。プロセシング完了後、ＳＬＢＰはステムループに結合したままであり、次いで細胞質における成熟ヒストンｍＲＮＡのヒストンタンパク質への翻訳を刺激する。ＳＬＢＰのＲＮＡ結合ドメインは、後生動物及び原生動物を通じて保存される。ヒストンステムループへのその結合は、ループの構造に依存する。最小結合部位は、ステムループに対して少なくとも５’側３ヌクレオチド及び３’側２ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、コード領域、少なくとも１つのヒストンステムループ、及び場合によりポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナルを含む。ポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナルは一般に、コードされるタンパク質の発現レベルを増強するはずである。いくつかの実施形態では、コードされるタンパク質は、ヒストンタンパク質、レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、β−ガラクトシダーゼ、ＥＧＦＰ）、またはマーカータンパク質もしくは選択タンパク質（例えば、アルファ−グロビン、ガラクトキナーゼ及びキサンチン：グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＧＰＴ））ではない。
いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナルと少なくとも１つのヒストンステムループとの組み合わせは、両方が本質的に別の機構を示す場合でも、相乗的に作用して、個々のエレメントのいずれかで観察されるレベルを超えてタンパク質発現を増加させる。ポリ（Ａ）と少なくとも１つのヒストンステムループとの組み合わせの相乗効果は、エレメントの順序またはポリ（Ａ）配列の長さに依存しないことが見出されている。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、ヒストン下流エレメント（ＨＤＥ）を含まない。「ヒストン下流エレメント」（ＨＤＥ）は、ヒストンのプレｍＲＮＡの成熟ヒストンｍＲＮＡへのプロセシングに関与するＵ７ ｓｎＲＮＡの結合部位を表す、天然型のステムループの３’側約１５〜２０ヌクレオチドのプリンリッチなポリヌクレオチドストレッチを含む。理想的には、本発明の核酸はイントロンを含まない。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、エンハンサー配列及び／またはプロモーター配列を含んでも含まなくてもよく、この配列は、修飾されていても非修飾でもよく、または活性化されていても不活化されていてもよい。いくつかの実施形態では、ヒストンステムループは一般に、ヒストン遺伝子に由来し、この構造のループを形成する短い配列を含む（例えば、それからなる）スペーサーによって分離された２つの隣接する部分的にまたは完全に逆相補的な配列の分子内塩基対形成を含む。対形成されていないループ領域は一般的に、ステムループエレメントのいずれとも塩基対を形成することができない。これは、多くのＲＮＡ二次構造の重要な構成要素と同様、ＲＮＡで頻繁に起こるが、一本鎖ＤＮＡでも存在する場合がある。ステムループ構造の安定性は一般に、長さ、ミスマッチまたはバルジの数、及び対となる領域の塩基組成に依存する。いくつかの実施形態では、ウォブル塩基対形成（非ワトソン−クリック塩基対形成）が生じる可能性がある。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒストンステムループ配列は、１５〜４５ヌクレオチドの長さを含む。
他の実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、１つ以上のＡＵリッチ配列が除去されている場合がある。ＡＵＲＥＳと呼ばれる場合もあるこの配列は、３’ＵＴＲに見られる不安定化配列である。ＡＵＲＥＳをＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンから除去することができる。あるいは、ＡＵＲＥＳがＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンに残っていてもよい。
ナノ粒子製剤
いくつかの実施形態では、インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、ナノ粒子で製剤化される。いくつかの実施形態では、インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、脂質ナノ粒子で製剤化される。いくつかの実施形態では、インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、カチオン性脂質ナノ粒子と呼ばれる脂質−ポリカチオン複合体で製剤化される。非限定的な例として、ポリカチオンには、カチオン性ペプチド、または限定されないが、ポリリジン、ポリオルニチン、及び／またはポリアルギニンなどのカチオン性ポリペプチドを含み得る。いくつかの実施形態では、インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、これに限定されないが、コレステロールまたはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）などの非カチオン性脂質を含む脂質ナノ粒子で製剤化される。
脂質ナノ粒子製剤は、これに限定されないが、カチオン性脂質成分の選択、カチオン性脂質飽和度、ＰＥＧ化の性質、全成分の比、及びサイズなどの生物物理学的パラメーターの影響を受ける可能性がある。Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１０ ２８：１７２−１７６）による一例では、脂質ナノ粒子製剤は、５７．１％のカチオン性脂質、７．１％のジパルミトイルホスファチジルコリン、３４．３％のコレステロール、及び１．４％のＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡで構成される。別の例として、カチオン性脂質の組成を変更することにより、様々な抗原提示細胞にｓｉＲＮＡを効果的に送達することができる（Ｂａｓｈａ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１１ １９：２１８６−２２００）。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、３５〜４５％のカチオン性脂質、４０％〜５０％のカチオン性脂質、５０％〜６０％のカチオン性脂質、及び／または５５％〜６５％のカチオン性脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子中の脂質対ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）比は、５：１〜２０：１、１０：１〜２５：１、１５：１〜３０：１、及び／または少なくとも３０：１であり得る。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤中のＰＥＧ比を増減すること、及び／またはＰＥＧ脂質の炭素鎖長をＣ１４からＣ１８に変更することで、脂質ナノ粒子製剤の薬物動態及び／または生体内分布を変化させることができる。非限定的な例として、脂質ナノ粒子製剤は、カチオン性脂質、ＤＳＰＣ、及びコレステロールと比較して、０．５％〜３．０％、１．０％〜３．５％、１．５％〜４．０％、２．０％〜４．５％、２．５％〜５．０％、及び／または３．０％〜６．０％の脂質モル比のＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ（Ｒ−３−［（ω−メトキシ−ポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル）］−１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−アミン）（本明細書でＰＥＧ−ＤＯＭＧとも称する）を含有し得る。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧを、これに限定されないが、ＰＥＧ−ＤＳＧ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロール，メトキシポリエチレングリコール）、ＰＥＧ−ＤＭＧ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロール）、及び／またはＰＥＧ−ＤＰＧ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロール，メトキシポリエチレングリコール）などのＰＥＧ脂質に置き換えることができる。カチオン性脂質は、これに限定されないが、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、Ｃ１２−２００、及びＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡなどの当技術分野で既知の任意の脂質から選択することができる。
いくつかの実施形態では、インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチン製剤は、少なくとも１種の脂質を含むナノ粒子である。脂質は、これに限定されないが、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、９８Ｎ１２−５、Ｃ１２−２００、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ化脂質、及びアミノアルコール脂質から選択することができる。いくつかの実施形態では、脂質は、これに限定されないが、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｄ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、及びアミノアルコール脂質などのカチオン性脂質であり得る。アミノアルコールカチオン性脂質は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開第ＵＳ２０１３０１５０６２５号に記載された脂質、及び／または記載される方法によって製造された脂質であり得る。非限定的な例として、カチオン性脂質は、２−アミノ−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−２−｛［（９Ｚ，２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］メチル｝プロパン−１−オール（ＵＳ２０１３０１５０６２５の化合物１）；２−アミノ−３−［（９Ｚ）−オクタデカ−９−エン−１−イルオキシ］−２−｛［（９Ｚ）−オクタデカ−９−エン−１−イルオキシ］メチル｝プロパン−１−オール（ＵＳ２０１３０１５０６２５の化合物２）；２−アミノ−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−２−［（オクチルオキシ）メチル］プロパン−１−オール（ＵＳ２０１３０１５０６２５の化合物３）；及び２−（ジメチルアミノ）−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−２−｛［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］メチル｝プロパン−１−オール（ＵＳ２０１３０１５０６２５の化合物４）；またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体であり得る。
脂質ナノ粒子製剤は一般的に、脂質、特にイオン性のカチオン性脂質、例えば、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、またはジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）を含み、さらに中性脂質、ステロール、及び粒子凝集を減少させることができる分子、例えばＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、（ｉ）２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１、３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）からなる群から選択される少なくとも１種の脂質；（ｉｉ）ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、及びＳＭから選択される中性脂質；（ｉｉｉ）コレステロールなどのステロール；ならびに（ｉｖ）ＰＥＧ脂質、例えばＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ｃＤＭＡから本質的になり、そのモル比は、カチオン性脂質が２０〜６０％、中性脂質が５〜２５％、ステロールが２５〜５５％、ＰＥＧ脂質が０．５〜１５％である。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるカチオン性脂質を、モル基準で２５％〜７５％、例えば、モル基準で３５〜６５％、４５〜６５％、６０％、５７．５％、５０％、または４０％含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、モル基準で０．５％〜１５％、例えば、モル基準で３〜１２％、５〜１０％、または１５％、１０％、または７．５％の中性脂質を含む。中性脂質の例としては、ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、及びＳＭが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、製剤は、モル基準で５％〜５０％、例えば、モル基準で１５〜４５％、２０〜４０％、４０％、３８．５％、３５％、または３１％のステロールを含む。ステロールの非限定的な例はコレステロールである。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、モル基準で０．５％〜２０％、例えば、モル基準で０．５〜１０％、０．５〜５％、１．５％、０．５％、１．５％、３．５％、または５％のＰＥＧ脂質またはＰＥＧ修飾脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質またはＰＥＧ修飾脂質は、平均分子量２，０００ＤａのＰＥＧ分子を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質またはＰＥＧ修飾脂質は、平均分子量２，０００未満、例えば、約１，５００Ｄａ、約１，０００Ｄａ、または約５００ＤａのＰＥＧ分子を含む。ＰＥＧ修飾脂質の非限定的な例としては、ＰＥＧ−ジステアロイルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＭＧ）（本明細書でＰＥＧ−Ｃ１４またはＣ１４−ＰＥＧとも称する）、ＰＥＧ−ｃＤＭＡが挙げられるが、これらに限定されない（Ｒｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１０７，２７６−２８７（２００５）で詳細に考察されており、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、モル基準で、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるカチオン性脂質を２５〜７５％、中性脂質を０．５〜１５％、ステロールを５〜５０％、ならびにＰＥＧ脂質またはＰＥＧ修飾脂質を０．５〜２０％含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、モル基準で、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるカチオン性脂質を３５〜６５％、中性脂質を３〜１２％、ステロールを１５〜４５％、ならびにＰＥＧ脂質またはＰＥＧ修飾脂質を０．５〜１０％含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、モル基準で、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるカチオン性脂質を４５〜６５％、中性脂質を５〜１０％、ステロールを２５〜４０％、ならびにＰＥＧ脂質またはＰＥＧ修飾脂質を０．５〜１０％含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、モル基準で、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるカチオン性脂質を６０％、中性脂質を７．５％、ステロールを３１％、ならびにＰＥＧ脂質またはＰＥＧ修飾脂質を１．５％含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、モル基準で、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるカチオン性脂質を５０％、中性脂質を１０％、ステロールを３８．５％、ならびにＰＥＧ脂質またはＰＥＧ修飾脂質を１．５％含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、モル基準で、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるカチオン性脂質を５０％、中性脂質を１０％、ステロールを３５％、ＰＥＧ脂質またはＰＥＧ修飾脂質を４．５％または５％、ならびに標的化脂質を０．５％含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、モル基準で、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるカチオン性脂質を４０％、中性脂質を１５％、ステロールを４０％、ならびにＰＥＧ脂質またはＰＥＧ修飾脂質を５％含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、モル基準で、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるカチオン性脂質を５７．２％、中性脂質を７．１％、ステロールを３４．３％、ならびにＰＥＧ脂質またはＰＥＧ修飾脂質を１．４％含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、モル基準で、カチオン性脂質を５７．５％、中性脂質を７．５％、ステロールを３１．５％、ならびにＰＥＧ脂質またはＰＥＧ修飾脂質を３．５％含む。ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ−ｃＤＭＡ（ＰＥＧ−ｃＤＭＡは、Ｒｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１０７，２７６−２８７（２００５）で詳細に考察されており、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）から選択される。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、モル比２０〜７０％のカチオン性脂質、５〜４５％の中性脂質、２０〜５５％のコレステロール、０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質の脂質混合物から本質的になる。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、モル比２０〜６０％のカチオン性脂質、５〜２５％の中性脂質、２５〜５５％のコレステロール、０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質の脂質混合物から本質的になる。
いくつかの実施形態では、脂質のモル比は、５０／１０／３８．５／１．５（カチオン性脂質／中性脂質、例えばＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ修飾脂質、例えばＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＤＳＧ、またはＰＥＧ−ＤＰＧのモル％）、５７．２／７．１１／３４．３／１．４（カチオン性脂質／中性脂質、例えばＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ修飾脂質、例えばＰＥＧ−ｃＤＭＡのモル％）、４０／１５／４０／５（カチオン性脂質／中性脂質、例えばＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ修飾脂質、例えばＰＥＧ−ＤＭＧのモル％）、５０／１０／３５／４．５／０．５（カチオン性脂質／中性脂質、例えばＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ修飾脂質、例えばＰＥＧ−ＤＳＧのモル％）、５０／１０／３５／５（カチオン性脂質／中性脂質、例えばＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ修飾脂質、例えばＰＥＧ−ＤＭＧ）、４０／１０／４０／１０（カチオン性脂質／中性脂質、例えばＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ修飾脂質、例えばＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ｃＤＭＡのモル％）、３５／１５／４０／１０（カチオン性脂質／中性脂質、例えばＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ修飾脂質、例えばＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ｃＤＭＡのモル％）、または５２／１３／３０／５（カチオン性脂質／中性脂質、例えばＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ修飾脂質、例えばＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ｃＤＭＡのモル％）である。
脂質ナノ粒子組成物の非限定的な例及びその作製方法は、例えば、Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８：１７２−１７６；Ｊａｙａｒａｍａ ｅｔ ａｌ． （２０１２），Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，５１：８５２９−８５３３；及びＭａｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２１，１５７０−１５７８に記載されている（それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、カチオン性脂質、ＰＥＧ脂質、及び構造脂質を含み得るが、場合により非カチオン性脂質を含む。非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、４０〜６０％のカチオン性脂質、５〜１５％の非カチオン性脂質、１〜２％のＰＥＧ脂質、及び３０〜５０％の構造脂質を含み得る。別の非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、５０％のカチオン性脂質、１０％の非カチオン性脂質、１．５％のＰＥＧ脂質、及び３８．５％の構造脂質を含み得る。さらに別の非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、５５％のカチオン性脂質、１０％の非カチオン性脂質、２．５％のＰＥＧ脂質、及び３２．５％の構造脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、これに限定されないが、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、及びＬ３１９などの本明細書に記載の任意のカチオン性脂質であり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子製剤は、４成分の脂質ナノ粒子であってもよい。この脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、ＰＥＧ脂質、及び構造脂質を含み得る。非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、４０〜６０％のカチオン性脂質、５〜１５％の非カチオン性脂質、１〜２％のＰＥＧ脂質、及び３０〜５０％の構造脂質を含み得る。別の非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、５０％のカチオン性脂質、１０％の非カチオン性脂質、１．５％のＰＥＧ脂質、及び３８．５％の構造脂質を含み得る。さらに別の非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、５５％のカチオン性脂質、１０％の非カチオン性脂質、２．５％のＰＥＧ脂質、及び３２．５％の構造脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、これに限定されないが、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、及びＬ３１９などの本明細書に記載の任意のカチオン性脂質であり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子製剤は、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、ＰＥＧ脂質、及び構造脂質を含み得る。非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、５０％のカチオン性脂質ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、１０％の非カチオン性脂質ＤＳＰＣ、１．５％のＰＥＧ脂質ＰＥＧ−ＤＯＭＧ、及び３８．５％の構造脂質コレステロールを含む。非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、５０％のカチオン性脂質ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、１０％の非カチオン性脂質ＤＳＰＣ、１．５％のＰＥＧ脂質ＰＥＧ−ＤＯＭＧ、及び３８．５％の構造脂質コレステロールを含む。非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、５０％のカチオン性脂質ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、１０％の非カチオン性脂質ＤＳＰＣ、１．５％のＰＥＧ脂質ＰＥＧ−ＤＭＧ、及び３８．５％の構造脂質コレステロールを含む。さらに別の非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、５５％のカチオン性脂質Ｌ３１９、１０％の非カチオン性脂質ＤＳＰＣ、２．５％のＰＥＧ脂質ＰＥＧ−ＤＭＧ、及び３２．５％の構造脂質コレステロールを含む。
ワクチン組成物中の活性成分、薬学的に許容される賦形剤、及び／または任意の追加成分の相対量は、処置される対象の同一性、サイズ、及び／または状態に応じて、さらには組成物が投与される経路に応じて決定することができる。例えば、組成物は、０．１％〜９９％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。一例として、組成物は、０．１％〜１００％、例えば０．５〜５０％、１〜３０％、５〜８０％、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。
いくつかの実施形態では、インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチン組成物は、ＭＣ３、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ２０００−ＤＭＧを含む脂質ナノ粒子、クエン酸三ナトリウム緩衝液、スクロース、ならびに注射用水で製剤化された、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含み得る。非限定的な例として、組成物は、２．０ｍｇ／ｍＬの原薬、２１．８ｍｇ／ｍＬのＭＣ３、１０．１ｍｇ／ｍＬのコレステロール、５．４ｍｇ／ｍＬのＤＳＰＣ、２．７ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ２０００−ＤＭＧ、５．１６ｍｇ／ｍＬのクエン酸三ナトリウム、７１ｍｇ／ｍＬのスクロース、及び１．０ｍＬの注射用水を含む。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、１０〜５００ｎｍ、２０〜４００ｎｍ、３０〜３００ｎｍ、４０〜２００ｎｍの平均直径を有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、５０〜１５０ｎｍ、５０〜２００ｎｍ、８０〜１００ｎｍ、８０〜２００ｎｍの平均直径を有する。
リポソーム、リポプレックス、及び脂質ナノ粒子
本開示のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、１つ以上のリポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子を用いて製剤化することができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの医薬組成物は、リポソームを含む。リポソームは、主として脂質二重層から構成される人工的に調製された小胞であり、栄養素及び医薬製剤を投与するための送達ビヒクルとして使用することができる。リポソームは、直径が数百ナノメートルであり得、かつ狭い水性区画によって分離された一連の同心状二重層を含み得る多重層小胞（ＭＬＶ）、５０ｎｍより小さい直径であり得る、小さい単細胞小胞（ＳＵＶ）、及び直径が５０〜５００ｎｍであり得る大きい単層小胞（ＬＵＶ）など、種々のサイズであり得るが、これらに限定されない。リポソームの設計は、これに限定されないが、オプソニンまたはリガンドを含むことにより、非健常組織に対するリポソームの付着を向上させること、または限定されないがエンドサイトーシスなどの事象を活性化することができる。リポソームは医薬製剤の送達を改善するため、低ｐＨまたは高ｐＨで構成することができる。
リポソームの形成は、封入される医薬製剤及びリポソーム成分、脂質小胞を分散させる媒体の性質、封入物質の有効濃度及びその潜在的毒性、小胞の適用時及び／または送達時に伴う任意の追加プロセス、目的の用途に最適な小胞のサイズ、多分散度、及び有効期間、ならびに安全かつ効率的なリポソーム生成物のバッチ間再現性及び大量生産の可能性などであるが、これに限定されない物理化学的特性に依存し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、これに限定されないが、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）リポソーム、Ｍａｒｉｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）によるＤｉＬａ２リポソーム、１，２−ジリノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、及びＭＣ３（ＵＳ２０１００３２４１２０；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）から形成されるもの、ならびに限定されないが、Ｊａｎｓｓｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｈｏｒｓｈａｍ，ＰＡ）によるＤＯＸＩＬ（登録商標）などの小分子薬を送達することができるリポソームなどのリポソームを含み得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、限定されないが、過去に記載があり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでのオリゴヌクレオチド送達に好適であることが示されている安定化プラスミド−脂質粒子（ＳＰＬＰ）または安定化核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）の合成から形成されるものなどのリポソームを含み得る（すべてその全体が本明細書に組み込まれる、Ｗｈｅｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．１９９９ ６：２７１−２８１；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．１９９９ ６：１４３８−１４４７；Ｊｅｆｆｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．２００５ ２２：３６２−３７２；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５ ２：１００２−１００７；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２００６ ４４１：１１１−１１４；Ｈｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｏｎｔｒ Ｒｅｌ．２００５ １０７：２７６−２８７；Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１０ ２８：１７２−１７６；Ｊｕｄｇｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２００９ １１９：６６１−６７３；ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００８ １９：１２５−１３２；米国特許公開第ＵＳ２０１３０１２２１０４号を参照）。Ｗｈｅｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．よる元の製造方法は界面活性剤透析法であったが、これは後にＪｅｆｆｓ ｅｔ ａｌ．により改良され、自発的小胞形成法と称されている。リポソーム製剤は、ポリヌクレオチドに加えて３〜４種の脂質成分から構成される。一例として、リポソームは、Ｊｅｆｆｓ ｅｔ ａｌによる記載によれば、５５％のコレステロール、２０％のジステロイルホスファチジル（ｄｉｓｔｅｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ）コリン（ＤＳＰＣ）、１０％のＰＥＧ−Ｓ−ＤＳＧ、及び１５％の１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）を含有し得るが、これに限定されない。別の例として、ある種のリポソーム製剤は、これに限定されないが、Ｈｅｙｅｓ ｅｔ ａｌによる記載によれば、４８％のコレステロール、２０％のＤＳＰＣ、２％のＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡ、及び３０％のカチオン性脂質を含有してもよく、その場合のカチオン性脂質は、１，２−ジステアリルオキシ（ｄｉｓｔｅａｒｌｏｘｙ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、または１，２−ジリノレニルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）であり得る。
いくつかの実施形態では、リポソーム製剤は、約２５．０％のコレステロール〜約４０．０％のコレステロール、約３０．０％のコレステロール〜約４５．０％のコレステロール、約３５．０％のコレステロール〜約５０．０％のコレステロール、及び／または約４８．５％のコレステロール〜約６０％のコレステロールを含み得る。いくつかの実施形態では、製剤は、２８．５％、３１．５％、３３．５％、３６．５％、３７．０％、３８．５％、３９．０％、及び４３．５％からなる群から選択されるパーセントのコレステロールを含み得る。いくつかの実施形態では、製剤は、約５．０％〜約１０．０％のＤＳＰＣ、及び／または約７．０％〜約１５．０％のＤＳＰＣを含み得る。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチン医薬組成物は、ＤｉＬａ２リポソーム（Ｍａｒｉｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）、ＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ（登録商標）（Ｍａｒｉｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）、中性のＤＯＰＣ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）系リポソーム（例えば、卵巣癌でのｓｉＲＮＡの送達（Ｌａｎｄｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ＆ Ｔｈｅｒａｐｙ ２００６ ５（１２）１７０８−１７１３）；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、及びヒアルロナン被覆リポソーム（Ｑｕｉｅｔ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｓｒａｅｌ）などを含むが、これに限定されないリポソームで製剤化することができる。
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第２０１３００９０３７２号に記載されるものなどの低分子量カチオン性脂質であってもよい。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、機能化した脂質二重層の間に架橋を有し得る脂質小胞で製剤化することができる。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、脂質−ポリカチオン複合体で製剤化することができる。脂質−ポリカチオン複合体の形成は、当技術分野で既知の方法及び／または米国公開第２０１２０１７８７０２号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載される方法によって行うことができる。非限定的な例として、ポリカチオンには、カチオン性ペプチド、または限定されないが、ポリリジン、ポリオルニチン、及び／またはポリアルギニンなどのカチオン性ポリペプチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、コレステロールまたはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）などであるが、これに限定されない非カチオン性脂質をさらに含み得る脂質−ポリカチオン複合体で製剤化することができる。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤中のＰＥＧ比を増減すること、及び／またはＰＥＧ脂質の炭素鎖長をＣ１４からＣ１８に変更することで、ＬＮＰ製剤の薬物動態及び／または生体内分布を変化させることができる。非限定的な例として、ＬＮＰ製剤は、カチオン性脂質、ＤＳＰＣ、及びコレステロールと比較して、約０．５％〜約３．０％、約１．０％〜約３．５％、約１．５％〜約４．０％、約２．０％〜約４．５％、約２．５％〜約５．０％、及び／または約３．０％〜約６．０％の脂質モル比のＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ（Ｒ−３−［（ω−メトキシ−ポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル）］−１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−アミン）（本明細書でＰＥＧ−ＤＯＭＧとも称する）を含有し得る。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧを、ＰＥＧ−ＤＳＧ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロール，メトキシポリエチレングリコール）、ＰＥＧ−ＤＭＧ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロール）、及び／またはＰＥＧ−ＤＰＧ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロール，メトキシポリエチレングリコール）などであるが、これに限定されないＰＥＧ脂質に置き換えることができる。カチオン性脂質は、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、Ｃ１２−２００、及びＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡなどであるが、これに限定されない当技術分野で既知の任意の脂質から選択することができる。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、脂質ナノ粒子で製剤化することができる。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを含むＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチン製剤は、少なくとも１種の脂質を含み得るナノ粒子である。脂質は、これに限定されないが、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、９８Ｎ１２−５、Ｃ１２−２００、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ化脂質、及びアミノアルコール脂質から選択することができる。別の態様では、脂質は、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｄ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、及びアミノアルコール脂質などであるが、これに限定されないカチオン性脂質であり得る。アミノアルコールカチオン性脂質は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開第ＵＳ２０１３０１５０６２５号に記載された脂質、及び／または記載される方法によって製造された脂質であり得る。非限定的な例として、カチオン性脂質は、２−アミノ−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−２−｛［（９Ｚ，２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］メチル｝プロパン−１−オール（ＵＳ２０１３０１５０６２５の化合物１）；２−アミノ−３−［（９Ｚ）−オクタデカ−９−エン−１−イルオキシ］−２−｛［（９Ｚ）−オクタデカ−９−エン−１−イルオキシ］メチル｝プロパン−１−オール（ＵＳ２０１３０１５０６２５の化合物２）；２−アミノ−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−２−［（オクチルオキシ）メチル］プロパン−１−オール（ＵＳ２０１３０１５０６２５の化合物３）；及び２−（ジメチルアミノ）−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−２−｛［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］メチル｝プロパン−１−オール（ＵＳ２０１３０１５０６２５の化合物４）；またはその任意の薬学的に許容される塩もしくは立体異性体であり得る。
脂質ナノ粒子製剤は一般的に、脂質、特にイオン性のカチオン性脂質、例えば、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、またはジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）を含み、さらに中性脂質、ステロール、及び粒子凝集を減少させることができる分子、例えばＰＥＧ脂質またはＰＥＧ修飾脂質を含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、（ｉ）２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１、３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）からなる群から選択される少なくとも１種の脂質；（ｉｉ）ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、及びＳＭから選択される中性脂質；（ｉｉｉ）コレステロールなどのステロール；ならびに（ｉｖ）ＰＥＧ脂質、例えばＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ｃＤＭＡから本質的になり、そのモル比は、カチオン性脂質が約２０〜６０％、中性脂質が５〜２５％、ステロールが２５〜５５％、ＰＥＧ脂質が０．５〜１５％である。
いくつかの実施形態では、製剤は、モル基準で約２５％〜約７５％、例えば、モル基準で約３５〜約６５％、約４５〜約６５％、約６０％、約５７．５％、約５０％、または約４０％の、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるカチオン性脂質を含む。
いくつかの実施形態では、製剤は、モル基準で約０．５％〜約１５％、例えば、モル基準で約３〜約１２％、約５〜約１０％、または約１５％、約１０％、または約７．５％の中性脂質を含む。中性脂質の例としては、ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、及びＳＭが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、製剤は、モル基準で約５％〜約５０％、例えば、モル基準で約１５〜約４５％、約２０〜約４０％、約４０％、約３８．５％、約３５％、または約３１％のステロールを含む。例示的なステロールはコレステロールである。いくつかの実施形態では、製剤は、モル基準で約０．５％〜約２０％、例えば、モル基準で約０．５〜約１０％、約０．５〜約５％、約１．５％、約０．５％、約１．５％、約３．５％、または約５％のＰＥＧ脂質またはＰＥＧ修飾脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質またはＰＥＧ修飾脂質は、平均分子量２，０００ＤａのＰＥＧ分子を含む。他の実施形態では、ＰＥＧ脂質またはＰＥＧ修飾脂質は、平均分子量２，０００未満、例えば、約１，５００Ｄａ、約１，０００Ｄａ、または約５００ＤａのＰＥＧ分子を含む。ＰＥＧ修飾脂質の例としては、ＰＥＧ−ジステアロイルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＭＧ）（本明細書でＰＥＧ−Ｃ１４またはＣ１４−ＰＥＧとも称する）、ＰＥＧ−ｃＤＭＡが挙げられるが、これらに限定されない（Ｒｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１０７，２７６−２８７（２００５）で詳細に考察されており、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態では、本開示の製剤は、モル基準で、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるカチオン性脂質を２５〜７５％、中性脂質を０．５〜１５％、ステロールを５〜５０％、ならびにＰＥＧ脂質またはＰＥＧ修飾脂質を０．５〜２０％含む。
いくつかの実施形態では、本開示の製剤は、モル基準で、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるカチオン性脂質を３５〜６５％、中性脂質を３〜１２％、ステロールを１５〜４５％、ならびにＰＥＧ脂質またはＰＥＧ修飾脂質を０．５〜１０％含む。
いくつかの実施形態では、本開示の製剤は、モル基準で、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるカチオン性脂質を４５〜６５％、中性脂質を５〜１０％、ステロールを２５〜４０％、ならびにＰＥＧ脂質またはＰＥＧ修飾脂質を０．５〜１０％含む。
いくつかの実施形態では、本開示の製剤は、モル基準で、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるカチオン性脂質を約６０％、中性脂質を約７．５％、ステロールを約３１％、ならびにＰＥＧ脂質またはＰＥＧ修飾脂質を約１．５％含む。
いくつかの実施形態では、本開示の製剤は、モル基準で、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるカチオン性脂質を約５０％、中性脂質を約１０％、ステロールを約３８．５％、ならびにＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を約１．５％含む。
いくつかの実施形態では、本開示の製剤は、モル基準で、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるカチオン性脂質を約５０％、中性脂質を約１０％、ステロールを約３５％、ＰＥＧ脂質またはＰＥＧ修飾脂質を約４．５％または約５％、ならびに標的化脂質を約０．５％含む。
いくつかの実施形態では、本開示の製剤は、モル基準で、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるカチオン性脂質を約４０％、中性脂質を約１５％、ステロールを約４０％、ならびにＰＥＧ脂質またはＰＥＧ修飾脂質を約５％含む。
いくつかの実施形態では、本開示の製剤は、モル基準で、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるカチオン性脂質を約５７．２％、中性脂質を約７．１％、ステロールを約３４．３％、ならびにＰＥＧ脂質またはＰＥＧ修飾脂質を約１．４％含む。
いくつかの実施形態では、本開示の製剤は、モル基準で、カチオン性脂質を約５７．５％、中性脂質を約７．５％、ステロールを約３１．５％、及びＰＥＧ脂質またはＰＥＧ修飾脂質を約３．５％含む。ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ−ｃＤＭＡ（ＰＥＧ−ｃＤＭＡは、Ｒｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１０７，２７６−２８７（２００５）で詳細に考察されており、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）から選択される。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、モル比約２０〜７０％のカチオン性脂質、５〜４５％の中性脂質、２０〜５５％のコレステロール、０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質、より好ましくは、モル比約２０〜６０％のカチオン性脂質、５〜２５％の中性脂質、２５〜５５％のコレステロール、０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質の脂質混合物から本質的になる。
いくつかの実施形態では、脂質のモル比は、約５０／１０／３８．５／１．５（カチオン性脂質／中性脂質、例えばＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ修飾脂質、例えばＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＤＳＧ、またはＰＥＧ−ＤＰＧのモル％）、５７．２／７．１１／３４．３／１．４（カチオン性脂質／中性脂質、例えばＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ修飾脂質、例えばＰＥＧ−ｃＤＭＡのモル％）、４０／１５／４０／５（カチオン性脂質／中性脂質、例えばＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ修飾脂質、例えばＰＥＧ−ＤＭＧのモル％）、５０／１０／３５／４．５／０．５（カチオン性脂質／中性脂質、例えばＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ修飾脂質、例えばＰＥＧ−ＤＳＧのモル％）、５０／１０／３５／５（カチオン性脂質／中性脂質、例えばＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ修飾脂質、例えばＰＥＧ−ＤＭＧ）、４０／１０／４０／１０（カチオン性脂質／中性脂質、例えばＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ修飾脂質、例えばＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ｃＤＭＡのモル％）、３５／１５／４０／１０（カチオン性脂質／中性脂質、例えばＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ修飾脂質、例えばＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ｃＤＭＡのモル％）、または５２／１３／３０／５（カチオン性脂質／中性脂質、例えばＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ修飾脂質、例えばＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ｃＤＭＡのモル％）である。
脂質ナノ粒子組成物の例及びその作製方法は、例えば、Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８：１７２−１７６；Ｊａｙａｒａｍａ ｅｔ ａｌ．（２０１２），Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，５１：８５２９−８５３３；及びＭａｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２１，１５７０−１５７８（それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子製剤は、カチオン性脂質、ＰＥＧ脂質、及び構造脂質を含み得るが、さらに場合により非カチオン性脂質を含む。非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、約４０〜６０％のカチオン性脂質、約５〜１５％の非カチオン性脂質、約１〜２％のＰＥＧ脂質、及び約３０〜５０％の構造脂質を含み得る。別の非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、約５０％のカチオン性脂質、約１０％の非カチオン性脂質、約１．５％のＰＥＧ脂質、及び約３８．５％の構造脂質を含み得る。さらに別の非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、約５５％のカチオン性脂質、約１０％の非カチオン性脂質、約２．５％のＰＥＧ脂質、及び約３２．５％の構造脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、及びＬ３１９などであるが、これに限定されない本明細書に記載の任意のカチオン性脂質であり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子製剤は、４成分の脂質ナノ粒子であってもよい。この脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、ＰＥＧ脂質、及び構造脂質を含み得る。非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、約４０〜６０％のカチオン性脂質、約５〜１５％の非カチオン性脂質、約１〜２％のＰＥＧ脂質、及び約３０〜５０％の構造脂質を含み得る。別の非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、約５０％のカチオン性脂質、約１０％の非カチオン性脂質、約１．５％のＰＥＧ脂質、及び約３８．５％の構造脂質を含み得る。さらに別の非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、約５５％のカチオン性脂質、約１０％の非カチオン性脂質、約２．５％のＰＥＧ脂質、及び約３２．５％の構造脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、及びＬ３１９などであるが、これに限定されない本明細書に記載の任意のカチオン性脂質であり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子製剤は、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、ＰＥＧ脂質、及び構造脂質を含み得る。非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、約５０％のカチオン性脂質ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、約１０％の非カチオン性脂質ＤＳＰＣ、約１．５％のＰＥＧ脂質ＰＥＧ−ＤＯＭＧ、及び約３８．５％の構造脂質コレステロールを含む。非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、約５０％のカチオン性脂質ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、約１０％の非カチオン性脂質ＤＳＰＣ、約１．５％のＰＥＧ脂質ＰＥＧ−ＤＯＭＧ、及び約３８．５％の構造脂質コレステロールを含む。非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、約５０％のカチオン性脂質ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、約１０％の非カチオン性脂質ＤＳＰＣ、約１．５％のＰＥＧ脂質ＰＥＧ−ＤＭＧ、及び約３８．５％の構造脂質コレステロールを含む。さらに別の非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、約５５％のカチオン性脂質Ｌ３１９、約１０％の非カチオン性脂質ＤＳＰＣ、約２．５％のＰＥＧ脂質ＰＥＧ−ＤＭＧ、及び約３２．５％の構造脂質コレステロールを含む。
非限定的な例として、カチオン性脂質は、（２０Ｚ，２３Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−２０，２３−ジエン−１０−アミン、（１７Ｚ，２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキサコサ（ｄｉｍｅｍｙｌｈｅｘａｃｏｓａ）−１７，２０−ジエン−９−アミン、（１Ｚ，１９Ｚ）−Ｎ５Ｎ−ジメチルペンタコサ−１６，１９−ジエン−８−アミン、（１３Ｚ，１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルドコサ−１３，１６−ジエン−５−アミン、（１２Ｚ，１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘンイコサ−１２，１５−ジエン−４−アミン、（１４Ｚ，１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリコサ−１４，１７−ジエン−６−アミン、（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルテトラコサ−１５，１８−ジエン−７−アミン、（１８Ｚ，２１Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサ−１８，２１−ジエン−１０−アミン、（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルテトラコサ−１５，１８−ジエン−５−アミン、（１４Ｚ，１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリコサ−１４，１７−ジエン−４−アミン、（１９Ｚ，２２Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルオクタコサ（ｄｉｍｅｉｈｙｌｏｃｔａｃｏｓａ）−１９，２２−ジエン−９−アミン、（１８Ｚ，２１ Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサ−１８，２１−ジエン−８−アミン、（１７Ｚ，２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキサコサ−１７，２０−ジエン−７−アミン、（１６Ｚ，１９Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルペンタコサ−１６，１９−ジエン−６−アミン、（２２Ｚ，２５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘントリアコンタ−２２，２５−ジエン−１０−アミン、（２１Ｚ，２４Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリアコンタ−２１，２４−ジエン−９−アミン、（１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサ（ｄｉｍｅｔｙｌｈｅｐｔａｃｏｓ）−１８−エン−１０−アミン、（１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキサコサ−１７−エン−９−アミン、（１９Ｚ，２２Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルオクタコサ−１９，２２−ジエン−７−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサン−１０−アミン、（２０Ｚ，２３Ｚ）−Ｎ−エチル−Ｎ−メチルノナコサ−２０，２３−ジエン−１０−アミン、１−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−１−ノニルイコサ−１１，１４−ジエン−１−イル］ピロリジン、（２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサ−２０−エン−１０−アミン、（１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエプタコサ−１５−エン−１０−アミン、（１４Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−１４−エン−１０−アミン、（１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−１７−エン−１０−アミン、（２４Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリトリアコンタ−２４−エン−１０−アミン、（２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−２０−エン−１０−アミン、（２２Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘントリアコンタ−２２−エン−１０−アミン、（１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルペンタコサ−１６−エン−８−アミン、（１２Ｚ，１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−ノニルヘンイコサ−１２，１５−ジエン−１−アミン、（１３Ｚ，１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ノニルドコサ−１３，１６−ジエン−１−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］エプタデカン−８−アミン、１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−ヘキシルシクロプロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナデカン−１０−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ノナデカン−１０−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘンイコサン−１０−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−｛［（１Ｒ，２Ｒ）−２−ペンチルシクロプロピル］メチル｝シクロプロピル］ノナデカン−１０−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘキサデカン−８−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−［（１Ｒ，２Ｓ）−２−ウンデシルシクロプロピル］テトラデカン−５−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−｛７−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘプチル｝ドデカン−１−アミン、１−［（１Ｒ，２Ｓ）−２−ヘプチルシクロプロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチルオクタデカン−９−アミン、１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−デシルシクロプロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチルペンタデカン−６−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ペンタデカン−８−アミン、Ｒ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、Ｓ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、１−｛２−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−１−［（オクチルオキシ）メチル］エチル｝ピロリジン、（２Ｓ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−３−［（５Ｚ）−オクタ−５−エン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、１−｛２−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−１−［（オクチルオキシ）メチル］エチル｝アゼチジン、（２Ｓ）−１−（ヘキシルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−（ヘプチルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−（ノニルオキシ）−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ）−オクタデカ−９−エン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン；（２Ｓ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−６，９，１２−トリエン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−イコサ−１１，１４−ジエン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（ペンチルオキシ）プロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−（ヘキシルオキシ）−３−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−イコサ−１１，１４−ジエン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−２−アミン、１−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−イコサ−１１，１４−ジエン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、１−［（１３Ｚ，１６Ｚ）−ドコサ−１３，１６−ジエン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−［（１３Ｚ，１６Ｚ）−ドコサ−１３，１６−ジエン−１−イルオキシ］−３−（ヘキシルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−［（１３Ｚ）−ドコサ−１３−エン−１−イルオキシ］−３−（ヘキシルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−２−アミン、１−［（１３Ｚ）−ドコサ−１３−エン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、１−［（９Ｚ）−ヘキサデカ−９−エン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、（２Ｒ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｈ（１−メトイルオクチル（ｍｅｔｏｙｌｏ ｃｔｙｌ））オキシ］−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、（２Ｒ）−１−［（３，７−ジメチルオクチル）オキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−（オクチルオキシ）−３−（｛８−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−｛［（１Ｒ，２Ｒ）−２−ペンチルシクロプロピル］メチル｝シクロプロピル］オクチル｝オキシ）プロパン−２−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−｛［８−（２−オクチルシクロプロピル）オクチル］オキシ｝−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、及び（１１Ｅ，２０Ｚ，２３Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−１１，２０，２−トリエン−１０−アミンまたはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体から選択することができる。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンのＬＮＰ製剤は、脂質モル比３％でＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧを含有してもよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンのＬＮＰ製剤は、脂質モル比１．５％でＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧを含有してもよい。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの医薬組成物は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１２０９９７５５号に記載されるＰＥＧ化脂質の少なくとも１種を含み得る。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ−ＤＭＧ ２０００（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００）を含有してもよい。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ−ＤＭＧ ２０００、当技術分野で既知のカチオン性脂質、及び少なくとも１種の他の成分を含有することができる。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ−ＤＭＧ ２０００、当技術分野で既知のカチオン性脂質、ＤＳＰＣ、及びコレステロールを含有することができる。非限定的な例として、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ−ＤＭＧ２０００、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、及びコレステロールを含有してもよい。別の非限定的な例として、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ−ＤＭＧ２０００、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、及びコレステロールをモル比２：４０：１０：４８で含有してもよい（例えば、それぞれの内容全体が参照により明細書に組み込まれる、Ｇｅａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｏｎｖｉｒａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｅｌｆ−ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ＲＮＡ（ｅ．ｇ．，ｍＲＮＡ）ｖａｃｃｉｎｅｓ，ＰＮＡＳ ２０１２；ＰＭＩＤ：２２９０８２９４を参照）。
本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、滅菌環境で作製することができる。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ製剤は、核酸−脂質粒子などのナノ粒子状に製剤化することができる。非限定的な例として、脂質粒子は、１種以上の活性薬または治療薬；粒子中に存在する全脂質の約５０モル％〜約８５モル％を構成する１種以上のカチオン性脂質；粒子中に存在する全脂質の約１３モル％〜約４９．５モル％を構成する１種以上の非カチオン性脂質；及び粒子中に存在する総脂質の約０．５モル％〜約２モル％を構成する、粒子の凝集を抑制する１種以上のコンジュゲート脂質を含み得る。
ナノ粒子製剤は、リン酸コンジュゲートを含み得る。リン酸コンジュゲートは、ｉｎ ｖｉｖｏ循環時間を増加させる、及び／またはナノ粒子の標的送達を増加させることができる。非限定的な例として、リン酸コンジュゲートは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際出願第ＷＯ２０１３０３３４３８号に記載されている式のいずれか１つの化合物を含み得る。
ナノ粒子製剤は、ポリマーコンジュゲートを含み得る。ポリマーコンジュゲートは、水溶性コンジュゲートであってもよい。ポリマーコンジュゲートは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第２０１３００５９３６０号に記載されている構造を有していてもよい。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドとのポリマーコンジュゲートは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第２０１３００７２７０９号に記載されている方法及び／またはセグメント化ポリマー試薬を使用して作製することができる。いくつかの実施形態では、ポリマーコンジュゲートは、環部分を含むペンダント側基を有していてもよく、例えばこれは、限定されないが、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第ＵＳ２０１３０１９６９４８号に記載されているポリマーコンジュゲートなどである。
ナノ粒子製剤は、対象における本開示のナノ粒子の送達を向上させるコンジュゲートを含んでもよい。さらに、コンジュゲートは、対象におけるナノ粒子の食作用クリアランスを抑制することができる。一態様では、コンジュゲートは、ヒト膜タンパク質ＣＤ４７から設計された「自己」ペプチドであってもよい（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＲｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３ ３３９，９７１−９７５）に記載の「自己」粒子）。Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，が示すように、自己ペプチドは、ナノ粒子のマクロファージ媒介性クリアランスを遅延させ、ナノ粒子の送達を向上させた。別の態様では、コンジュゲートは、膜タンパク質ＣＤ４７であってもよい（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＲｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３ ３３９，９７１−９７５を参照）。Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．によれば、「自己」ペプチドと同様に、ＣＤ４７は、スクランブルペプチド及びＰＥＧ被覆したナノ粒子と比較して、対象における粒子循環の比を増加させることができる。
いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、ナノ粒子で製剤化され、対象における本開示のナノ粒子の送達を向上させるコンジュゲートを含む。コンジュゲートは、ＣＤ４７膜であってもよく、またはコンジュゲートは、前述した「自己」ペプチドなどのＣＤ４７膜タンパク質に由来するものであってもよい。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、ＰＥＧ、及びＣＤ４７またはその誘導体のコンジュゲートを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、上記の「自己」ペプチドと膜タンパク質ＣＤ４７の両方を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、「自己」ペプチド及び／またはＣＤ４７タンパク質を本明細書に記載のウイルス様粒子または偽ウイルスにコンジュゲートし、本開示のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンを送達することができる。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチン医薬組成物は、本開示のポリヌクレオチド、及び分解性の結合を有し得るコンジュゲートを含む。コンジュゲートの非限定的な例として、イオン性の水素原子を含む芳香族部分、スペーサー部分、及び水溶性ポリマーが挙げられる。非限定的な例として、分解性の結合を有するコンジュゲートを含む医薬組成物及びそのような医薬組成物を送達する方法は、米国特許公開第ＵＳ２０１３０１８４４４３号に記載されており、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ナノ粒子製剤は、糖担体及びＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンを含む糖ナノ粒子であってよい。非限定的な例として、糖担体には、無水物修飾フィトグリコーゲンまたはグリコーゲン型物質、フィトグリコーゲンオクテニルスクシネート、フィトグリコーゲンベータ−デキストリン、無水物修飾フィトグリコーゲンベータ−デキストリンを含み得るが、これらに限定されない（例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１２１０９１２１号を参照）。
本開示のナノ粒子製剤は、粒子の送達を改善するため、界面活性剤またはポリマーで被覆されていてもよい。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、限定されないが、ＰＥＧコーティング及び／または中性表面電荷を有するコーティングなどの親水性コーティングで被覆することができる。親水性コーティングは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンなどに限定されないペイロードが大きいナノ粒子の中枢神経系内への送達に役立つ場合がある。非限定的な例として、親水性コーティングを含むナノ粒子及びそのようなナノ粒子を作製する方法は、米国特許公開第ＵＳ２０１３０１８３２４４号に記載されており、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本開示の脂質ナノ粒子は、親水性ポリマー粒子であってよい。親水性ポリマー粒子及び親水性ポリマー粒子を作製する方法の非限定的な例は、米国特許公開第ＵＳ２０１３０２１０９９１号に記載されており、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本開示の脂質ナノ粒子は、疎水性ポリマー粒子であってよい。
脂質ナノ粒子製剤は、カチオン性脂質を、急速排出脂質ナノ粒子（ｒｅＬＮＰ、ｒａｐｉｄｌｙ ｅｌｉｍｉｎａｔｅｄ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）として知られる生分解性カチオン性脂質に置き換えることによって改良することができる。限定されないが、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、及びＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡなどのイオン性カチオン性脂質は、経時的に血漿及び組織内に蓄積することが示されており、潜在的な毒性源になる可能性がある。急速排出脂質の迅速な代謝により、脂質ナノ粒子の忍容性及び治療指数を、ラットにおいて１ｍｇ／ｋｇ投与量から１０ｍｇ／ｋｇ投与量へと１桁分改善することができる。酵素分解性のエステル結合を付加すると、ｒｅＬＮＰ製剤の活性を引き続き維持しつつ、カチオン性成分の分解及び代謝プロファイルを改善することができる。エステル結合は、脂質鎖の内部に位置していてもよく、または脂質鎖の末端側の終端に位置していてもよい。内部エステル結合は、脂質鎖中の任意の炭素を置換していてもよい。
いくつかの実施形態では、内部エステル結合が、飽和炭素のいずれかの側に位置していてもよい。
いくつかの実施形態では、ナノ種、ポリマー、及び免疫原を含み得る脂質ナノ粒子を送達することによって免疫応答を誘発することができる。（それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる米国公開第２０１２０１８９７００号及び国際公開第ＷＯ２０１２０９９８０５号）。ポリマーは、ナノ種を封入していても、またはナノ種を部分的に封入していてもよい。免疫原は、本明細書に記載の組換えタンパク質、修飾ＲＮＡ、及び／またはポリヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、限定されないが、病原体などに対するワクチン用に製剤化することができる。
脂質ナノ粒子を、粒子の表面特性を変化させるように操作することで、脂質ナノ粒子が粘膜バリアを透過することができる。粘液は、限定されないが、口腔（例えば、頬側膜及び食道膜ならびに扁桃組織）、眼、胃腸（例えば、胃、小腸、大腸、結腸、直腸）、鼻、呼吸器（例えば、鼻粘膜、咽頭膜、気管膜、及び気管支膜）、生殖器（例えば、膣膜、頸管膜、及び尿道膜）などの粘膜組織に存在する。１０〜２００ｎｍ超のナノ粒子は、薬物封入効率が高く、広範囲の薬物の持続的送達を提供できる点で好ましいが、粘膜バリアを通って迅速に分散するには大きすぎると考えられてきた。粘液は常に分泌され、排出、廃棄、または消化されて再利用されるので、捕捉された粒子の大部分は、数秒以内または数時間以内に粘膜組織から除去される可能性がある。低分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で高密度に被覆された大きなポリマーナノ粒子（直径２００ｎｍ〜５００ｎｍ）は、水中に分散する同じ粒子と比べ、わずか４分の１〜６分の１しか粘液に分散しなかった（それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ２００７ １０４：１４８２−４８７；Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２００９ ６１： １５８−１７１）。ナノ粒子の輸送は、光退色後蛍光回復法（ＦＲＡＰ、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ａｆｔｅｒ ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ）及び高分解能多粒子追跡（ＭＰＴ）を含むがこれらに限定されない、透過率測定及び／または蛍光顕微鏡技術を用いて決定することができる。非限定的な例として、粘膜バリアを透過することができる組成物は、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，２４１，６７０号または国際特許公開第ＷＯ２０１３１１００２８号に記載のように作製することができる。
粘液に浸透するように操作された脂質ナノ粒子には、ポリマー物質（すなわち、ポリマーコア）及び／またはポリマー−ビタミンコンジュゲート及び／またはトリブロックコポリマーを含み得る。ポリマー物質は、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカーバメート、ポリ尿素、ポリカーボネート、ポリ（スチレン）、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリロニトリル、及びポリアリレートを含み得るが、これらに限定されない。ポリマー物質は、生分解性及び／または生体適合性であってもよい。生体適合性ポリマーの非限定的な例は、国際特許公開第ＷＯ２０１３１１６８０４号に記載されており、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。ポリマー物質はさらに、放射線照射されていてもよい。非限定的な例として、ポリマー物質はガンマ線照射されていてもよい（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際出願第ＷＯ２０１２８２１６５号を参照）。具体的なポリマーの非限定的な例としては、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、エチレン酢酸ビニルポリマー（ＥＶＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＬＧＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＡ）、ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−ＰＥＯ−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−ＰＰＯ−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリアルキルシアノアクリレート（ｐｏｌｙａｌｋｙｌ ｃｙａｎｏａｃｒａｌａｔｅ）、ポリウレタン、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ）、ポリエチレングリコール、ポリ−Ｌ−グルタミン酸、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリ（エステルアミド）、ポリアミド、ポリ（エステルエーテル）、ポリカーボネート、ポリエチレン及びポリプロピレンなどのポリアルキレン、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）などのポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリ（エチレンテレフタレート）などのポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルエーテル、ポリ（酢酸ビニル）などのポリビニルエステル、ポリ（塩化ビニル）（ＰＶＣ）などの塩化ポリビニル、ポリビニルピロリドン、ポリシロキサン、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリウレタン、アルキルセルロースなどの誘導体セルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アクリル酸ポリマー、例えば、ポリ（メチル（メタ）アクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリ（エチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ヘキシル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソデシル（メタ）アクリレート）、ポリ（ラウリル（メタ）アクリレート）、ポリ（フェニル（メタ）アクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）、ならびにそのコポリマー及び混合物、ポリジオキサノン及びそのコポリマー、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリプロピレンフマレート、ポリオキシメチレン、ポロキサマー、ポリ（オルト）エステル、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧ、及びトリメチレンカーボネート、ポリビニルピロリドンが挙げられる。脂質ナノ粒子は、ブロックコポリマー（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１３０１２４７６号に記載の分枝状ポリエーテル−ポリアミドブロックコポリマーなど）、及び（ポリ（エチレングリコール））−（ポリ（プロピレンオキシド））−（ポリ（エチレングリコール））トリブロックコポリマー（例えば、それぞれの内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる、米国公開２０１２０１２１７１８及び米国公開２０１００００３３３７及び米国特許第８，２６３，６６５号を参照）などであるが、これに限定されないコポリマーで被覆する、またはそれらと結合させることができる。コポリマーは、一般的に安全と認められる（ＧＲＡＳ、ｇｅｎｅｒａｌｌｙ ｒｅｇａｒｄｅｄ ａｓ ｓａｆｅ）ポリマーであってよく、新しい化学物質が生成されないような方法で脂質ナノ粒子を形成することができる。例えば、脂質ナノ粒子は、新しい化学物質を生成せずに、なおもヒト粘液に迅速に浸透することができる、ポロキサマー被覆ＰＬＧＡナノ粒子を含み得る（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＹａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１１ ５０：２５９７−２６００）。ヒト粘液に浸透することができるナノ粒子を作製するための非限定的でスケーラブルな方法がＸｕ ｅｔ ａｌ．により記載されている（例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ２０１３，１７０：２７９−８６を参照）。
ポリマー−ビタミンコンジュゲートのビタミンは、ビタミンＥであり得る。コンジュゲートのビタミン部分は、ビタミンＡ、ビタミンＥ、他のビタミン、コレステロール、疎水性部分、または他の界面活性剤の疎水性成分（例えば、ステロール鎖、脂肪酸、炭化水素鎖、及びアルキレンオキシド鎖）などであるが、これに限定されない他の好適な成分に置き換えることができる。
粘液に浸透するように操作された脂質ナノ粒子は、ポリヌクレオチド、アニオン性タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）、界面活性剤（例えば、例えばジメチルジオクタデシル−アンモニウムブロミドなどのカチオン性界面活性剤）、糖または糖誘導体（例えば、シクロデキストリン）、核酸、ポリマー（例えば、ヘパリン、ポリエチレングリコール、及びポロキサマー）、粘液溶解剤（例えば、Ｎ−アセチルシステイン、ヨモギ、ブロメライン、パパイン、クレロデンドルム、アセチルシステイン、ブロムヘキシン、カルボシステイン、エプラジノン、メスナ、アンブロキソール、ソブレロール、ドミオドール、レトステイン、ステップロニン、チオプロニン、ゲルゾリン、チモシンβ４ドルナーゼアルファ、ネルテネキシン、エルドステイン）、及びｒｈＤＮａｓｅを含む種々のＤＮａｓｅなどであるが、これらに限定されない表面改質剤を含み得る。表面改質剤は、粒子の表面に埋め込まれているか、もしくは取り込まれていてもよく、または脂質ナノ粒子の表面に（例えば、被覆、吸着、共有結合、または他のプロセスによって）配置されていてもよい。（例えば、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国公開２０１００２１５５８０及び米国公開２００８０１６６４１４及びＵＳ２０１３０１６４３４３を参照）。
いくつかの実施形態では、粘液浸透脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み得る。ポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子に封入されていてもよく、及び／または粒子の表面に配置されていてもよい。ポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子に共有結合していてもよい。粘液浸透脂質ナノ粒子の製剤は、複数のナノ粒子を含むことができる。さらに、製剤は、粘液と相互作用して、周辺粘液の構造特性及び／または接着特性を変化させて粘膜付着を減少させ、粘液浸透脂質ナノ粒子の粘膜組織への送達を増加させることができる粒子を含み得る。
いくつかの実施形態では、粘液浸透脂質ナノ粒子は、粘膜透過性を促進するコーティングを含む低張製剤であり得る。製剤は、送達先の上皮に対して低張であり得る。低張製剤の非限定的な例は、国際特許公開第ＷＯ２０１３１１００２８号で参照することができ、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、粘膜バリアを経由する送達を増強するため、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチン製剤は、低張溶液を含み得るか、または低張溶液であり得る。低張溶液は、限定されないが、粘液浸透粒子などの粘液不活性粒子が膣上皮表面に到達できる速度を増加させることが見出された（例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｅｎｓｉｇｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２０１３ ３４（２８）：６９２２−９を参照）。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、限定されないが、ＡＴＵＰＬＥＸ（商標）システム、ＤＡＣＣシステム、ＤＢＴＣシステム、及びＳｉｌｅｎｃｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｌｏｎｄｏｎ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）の他のｓｉＲＮＡ−リポプレックス技術、ＳＴＥＭＧＥＮＴ（登録商標）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）のＳＴＥＭＦＥＣＴ（商標）、ならびにポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはプロタミンによる核酸の標的化及び非標的化送達などのリポプレックスとして製剤化される（Ａｌｅｋｕ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００８ ６８：９７８８−９７９８；Ｓｔｒｕｍｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１２ ５０：７６−７８；Ｓａｎｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００６ １３：１２２２−１２３４；Ｓａｎｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００６ １３：１３６０−１３７０；Ｇｕｔｂｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｕｌｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１０ ２３：３３４−３４４；Ｋａｕｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ Ｒｅｓ ２０１０ ８０：２８６−２９３Ｗｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００９ ３２：４９８−５０７；Ｗｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００８ ３１：１８０−１８８；Ｐａｓｃｏｌｏ Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．４：１２８５−１２９４；Ｆｏｔｉｎ−Ｍｌｅｃｚｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３４：１−１５；Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５，２３：７０９−７１７；Ｐｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００７ ６；１０４：４０９５−４１００；ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００８ １９：１２５−１３２、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態では、肝細胞、免疫細胞、腫瘍細胞、内皮細胞、抗原提示細胞、及び白血球を含むが、これらに限定されない、ｉｎ ｖｉｖｏの異なる細胞型に受動的または能動的に誘導するように、そのような製剤を構築するか、または組成を変更することができる（Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０ １８：１３５７−１３６４；Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５ ２３：７０９−７１７；Ｊｕｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２００９ １１９：６６１−６７３；Ｋａｕｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ Ｒｅｓ ２０１０ ８０：２８６−２９３；Ｓａｎｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００６ １３：１２２２−１２３４；Ｓａｎｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００６ １３：１３６０−１３７０；Ｇｕｔｂｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｕｌｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１０ ２３：３３４−３４４；Ｂａｓｈａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１１ １９：２１８６−２２００；Ｆｅｎｓｋｅ ａｎｄ Ｃｕｌｌｉｓ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．２００８ ５：２５−４４；Ｐｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００８ ３１９：６２７−６３０；Ｐｅｅｒ ａｎｄ Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１１ １８：１１２７−１１３３、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）。製剤の肝細胞に対する受動的標的化の一例として、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、及びＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ系の脂質ナノ粒子製剤が挙げられ、これらの製剤はアポリポタンパク質Ｅに結合し、ｉｎ ｖｉｖｏでの肝細胞に対する結合及び取り込みを促進することが示されている（Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０ １８：１３５７−１３６４、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）。製剤はまた、例示として、葉酸、トランスフェリン、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、及び抗体を標的とする手法であるが、これらに限定されない様々なリガンドのその表面での発現により選択的に標的化することができる（Ｋｏｌｈａｔｋａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１ ８：１９７−２０６；Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ ａｎｄ Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．２０１１ １６：１３８８−１４１２；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｍｅｍｂｒ Ｂｉｏｌ．２０１０ ２７：２８６−２９８；Ｐａｔｉｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．２００８ ２５：１−６１；Ｂｅｎｏｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１１ １２：２７０８−２７１４；Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．２００８ ５：３０９−３１９；Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０ １８：１３５７−１３６４；Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１２ ８２０：１０５−１１６；Ｂｅｎ−Ａｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１２ ７５７：４９７−５０７；Ｐｅｅｒ ２０１０ Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．２０：６３−６８；Ｐｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００７ １０４：４０９５−４１００；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１１ ７２１：３３９−３５３；Ｓｕｂｒａｍａｎｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０ １８：２０２８−２０３７；Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５ ２３：７０９−７１７；Ｐｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００８ ３１９：６２７−６３０；Ｐｅｅｒ ａｎｄ Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１１ １８：１１２７−１１３３、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、固体脂質ナノ粒子として製剤化される。固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）は、平均直径が１０〜１０００ｎｍの球形であり得る。ＳＬＮは、親油性分子を可溶化することができ、界面活性剤及び／または乳化剤で安定化できる固体脂質コアマトリックスを有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、自己組織化脂質−ポリマーナノ粒子であってもよい（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｎａｎｏ，２００８，２，ｐｐ １６９６−１７０２を参照；その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）。非限定的な例として、ＳＬＮは、国際特許公開第ＷＯ２０１３１０５１０１号に記載されているＳＬＮであってもよく、その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。別の非限定的な例として、ＳＬＮは、国際特許公開第ＷＯ２０１３１０５１０１号に記載されている方法またはプロセスによって作製でき、その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子を使用すると、ポリヌクレオチド誘導性のタンパク質産生の効果を改善することができるが、これは、これらの製剤がＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンによる細胞トランスフェクションを増加させる、及び／またはコードされたタンパク質の翻訳を増加させることが可能なためである。そのような一例には、ポリプレックスプラスミドＤＮＡの効果的な全身送達を可能にする脂質封入の使用を含む（Ｈｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００７ １５：７１３−７２０；その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）。またリポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子を使用すると、ポリヌクレオチドの安定性を増加させることができる。
いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンを、制御放出及び／または標的送達用に製剤化することができる。本明細書で使用される場合、「制御放出」とは、治療結果が得られる特定の放出パターンに適合している医薬組成物または化合物の放出プロファイルを指す。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンを、本明細書に記載の送達剤及び／または当技術分野で既知の送達剤に封入して、制御放出及び／または標的送達することができる。本明細書で使用される場合、用語「封入する」とは、密封する、包囲する、または被包することを意味する。本開示の化合物の製剤化に関連して、封入は、実質的、完全、または部分的であり得る。「実質的に封入される」という用語は、本開示の医薬組成物または化合物の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９％、または９９．９９９％超が、送達剤内部に密封され得る、包囲され得る、または被包され得ることを意味する。「部分的封入」とは、本開示の医薬組成物または化合物の１０未満、１０、２０、３０、４０、５０以下が、送達剤内部に密封され得る、包囲され得る、または被包され得ることを意味する。有利には、蛍光顕微鏡写真及び／または電子顕微鏡写真を使用して、本開示の医薬組成物または化合物の放出または活性を測定することにより、封入を決定することができる。例えば、本開示の医薬組成物または化合物の少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、または９９．９９％超が送達剤に封入される。
いくつかの実施形態では、制御放出製剤は、トリブロックコポリマーを含んでもよいが、これらに限定されない。非限定的な例として、製剤は、異なる２種類のトリブロックコポリマーを含んでもよい（それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１２１３１１０４号及び同第ＷＯ２０１２１３１１０６号）。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、脂質ナノ粒子または急速排出脂質ナノ粒子に封入することができ、さらに脂質ナノ粒子または急速排出脂質ナノ粒子を、本明細書に記載の及び／及び／または当技術分野で既知のポリマー、ヒドロゲル、及び／または手術用シーラント材に封入することができる。非限定的な例として、ポリマー、ヒドロゲル、または手術用シーラント材は、ＰＬＧＡ、エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡｃ）、ポロキサマー、ＧＥＬＳＩＴＥ（登録商標）（Ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．Ａｌａｃｈｕａ，ＦＬ）、ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）（Ｈａｌｏｚｙｍｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）、フィブリノーゲンポリマー（ＥｔｈｉｃｏｎＩｎｃ．Ｃｏｒｎｅｌｉａ，ＧＡ）、ＴＩＳＳＥＬＬ（登録商標）（ＢａｘｔｅｒＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ＩｎｃＤｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）、ＰＥＧ系シーラント材、及びＣＯＳＥＡＬ（登録商標）（ＢａｘｔｅｒＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ＩｎｃＤｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）などの手術用シーラント材であり得る。
いくつかの実施形態では、対象に注射されるとゲルを形成し得る、当技術分野で既知の任意のポリマー中に脂質ナノ粒子を封入してもよい。別の非限定的な例として、生分解性であり得るポリマーマトリックス中に脂質ナノ粒子を封入してもよい。
いくつかの実施形態では、制御放出及び／または標的送達を目的としたＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチン製剤はまた、少なくとも１つの制御放出コーティング剤を含んでもよい。制御放出コーティング剤として、ＯＰＡＤＲＹ（登録商標）、ポリビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ＥＵＤＲＡＧＩＴ ＲＬ（登録商標）、ＥＵＤＲＡＧＩＴ ＲＳ（登録商標）、ならびにエチルセルロース水性分散剤（ＡＱＵＡＣＯＡＴ（登録商標）及びＳＵＲＥＬＥＡＳＥ（登録商標））などのセルロース誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの制御放出製剤及び／または標的送達製剤は、ポリカチオン性側鎖を含有し得る少なくとも１つの分解性ポリエステルを含んでもよい。分解性ポリエステルとしては、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｌ−リジン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、分解性ポリエステルには、ＰＥＧ化ポリマーを形成するためのＰＥＧコンジュゲートを含み得る。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの制御放出製剤及び／または標的送達製剤は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，４０４，２２２号に記載の少なくとも１種のＰＥＧ及び／またはＰＥＧ関連ポリマー誘導体を含み得る。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの制御放出送達製剤は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１３０１３０３４８に記載の制御放出ポリマー系であり得る。
いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、治療用ナノ粒子に封入されてもよく、本明細書でこれを「治療用ナノ粒子ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチン」と称する。治療用ナノ粒子は、本明細書に記載の方法、ならびに限定されないが、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１０００５７４０号、同第ＷＯ２０１００３０７６３号、同第ＷＯ２０１０００５７２１号、同第ＷＯ２０１０００５７２３号、同第ＷＯ２０１２０５４９２３号、米国公開第ＵＳ２０１１０２６２４９１号、同第ＵＳ２０１００１０４６４５号、同第ＵＳ２０１０００８７３３７号、同第ＵＳ２０１０００６８２８５号、同第ＵＳ２０１１０２７４７５９号、同第ＵＳ２０１０００６８２８６号、同第ＵＳ２０１２０２８８５４１号、同第ＵＳ２０１３０１２３３５１、及び同第ＵＳ２０１３０２３０５６７号、ならびに米国特許第８，２０６，７４７号、同第８，２９３，２７６号、同第８，３１８，２０８号、及び同第８，３１８，２１１号などの当技術分野で既知の方法によって製剤化することができる。いくつかの実施形態では、治療用ポリマーナノ粒子は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国公開第ＵＳ２０１２０１４０７９０号に記載されている方法によって特定することができる。
いくつかの実施形態では、治療用ナノ粒子ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、持続放出用に製剤化することができる。本明細書で使用される場合、「持続放出」とは、特定の一定期間にわたって、ある放出速度に適合している医薬組成物または化合物を指す。一定期間とは、数時間、数日間、数週間、数か月間、及び数年間を含み得るが、これらに限定されない。非限定的な例として、持続放出ナノ粒子は、ポリマー、及び本開示のポリヌクレオチドなどであるが、これに限定されない治療薬を含んでもよい（それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１００７５０７２号、ならびに米国公開第ＵＳ２０１００２１６８０４号、同第ＵＳ２０１１０２１７３７７号、及び同第ＵＳ２０１２０２０１８５９号を参照）。別の非限定的な例では、持続放出製剤は、結晶、巨大分子ゲル、及び／または粒子状懸濁液などであるが、これに限定されない、バイオアベイラビリティを持続できる薬剤を含み得る（それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開第ＵＳ２０１３０１５０２９５号を参照）。
いくつかの実施形態では、治療用ナノ粒子ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、標的特異的であるように製剤化することができる。非限定的な例として、治療用ナノ粒子は、コルチコステロイドを含み得る（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１１０８４５１８号を参照）。非限定的な例として、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２００８１２１９４９号、同第ＷＯ２０１０００５７２６号、同第ＷＯ２０１０００５７２５号、同第ＷＯ２０１１０８４５２１号、ならびに米国公開第ＵＳ２０１０００６９４２６号、同第ＵＳ２０１２０００４２９３号、及び同第ＵＳ２０１００１０４６５５号に記載のナノ粒子で、治療用ナノ粒子を製剤化することができる。
いくつかの実施形態では、本開示のナノ粒子は、ポリマーマトリックスを含み得る。非限定的な例として、ナノ粒子は、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフマレート（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｆｕｍｅｒａｔｅ）、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリジン、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｌ−リジン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、またはこれらの組み合わせなどであるが、これらに限定されない２種以上のポリマーを含み得る。
いくつかの実施形態では、治療用ナノ粒子は、ジブロックコポリマーを含む。いくつかの実施形態では、ジブロックコポリマーは、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフマレート（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｆｕｍｅｒａｔｅ）、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリジン、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｌ−リジン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、またはこれらの組み合わせなどであるが、これらに限定されないポリマーと組み合わせたＰＥＧを含み得る。さらに別の実施形態では、ジブロックコポリマーは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第ＷＯ２０１３１２００５２号に記載のものなどの高Ｘのジブロックコポリマーであり得る。
非限定的な例として、治療用ナノ粒子は、ＰＬＧＡ−ＰＥＧブロックコポリマーを含む（それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国公開第ＵＳ２０１２０００４２９３号及び米国特許第８，２３６，３３０号を参照）。別の非限定的な例では、治療用ナノ粒子は、ＰＥＧとＰＬＡ、またはＰＥＧとＰＬＧＡのジブロックコポリマーを含むステルスナノ粒子である（それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，２４６，９６８号及び国際公開第ＷＯ２０１２１６６９２３号を参照）。さらに別の非限定的な例では、治療用ナノ粒子は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開第ＵＳ２０１３０１７２４０６号に記載されているステルスナノ粒子または標的特異的ステルスナノ粒子である。
いくつかの実施形態では、治療用ナノ粒子は、マルチブロックコポリマーを含み得る（例えば、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，２６３，６６５号及び同第８，２８７，９１０号ならびに米国特許公開第ＵＳ２０１３０１９５９８７号を参照）。
さらに別の非限定的な例では、脂質ナノ粒子は、ブロックコポリマーＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧを含む（例えば、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｈｙｄｒｏｇｅｌ ａｓ ａ ＴＧＦ−β１ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｖｅｈｉｃｌｅ Ｅｎｈａｎｃｅｓ Ｄｉａｂｅｔｉｃ Ｗｏｕｎｄ Ｈｅａｌｉｎｇ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３ ２０（１２）：１９９５−２０００でＴＧＦ−ベータ１遺伝子送達ビヒクルとして、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｈｙｄｒｏｇｅｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００３ ２０：８８４−８８８；及びＣｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｏｎ−ｉｏｎｉｃ ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ｒａｔ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ．Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ．２００７ １１８：２４５−２５３で制御性遺伝子送達系として使用された感熱性ヒドロゲル（ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧ）を参照）。本開示のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧブロックコポリマーを含む脂質ナノ粒子で製剤化することができる。
いくつかの実施形態では、治療用ナノ粒子は、マルチブロックコポリマーを含み得る（例えば、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，２６３，６６５号及び同第８，２８７，９１０号ならびに米国特許公開第ＵＳ２０１３０１９５９８７号を参照）。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のブロックコポリマーは、非ポリマーミセル及びブロックコポリマーを含むポリイオン複合体に含まれ得る。（例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国公開第２０１２００７６８３６号を参照）。
いくつかの実施形態では、治療用ナノ粒子は、少なくとも１つのアクリルポリマーを含み得る。アクリルポリマーとしては、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸とメタクリル酸とのコポリマー、メチルメタクリレートコポリマー、エトキシエチルメタクリレート、シアノエチルメタクリレート、アミノアルキルメタクリレートコポリマー、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリシアノアクリレート、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、治療用ナノ粒子は、少なくとも１つのポリ（ビニルエステル）ポリマーを含み得る。ポリ（ビニルエステル）ポリマーは、ランダムコポリマーなどのコポリマーであってもよい。非限定的な例として、ランダムコポリマーは、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際出願第ＷＯ２０１３０３２８２９号または米国特許公開第ＵＳ２０１３０１２１９５４号に記載されるような構造を有し得る。いくつかの実施形態では、ポリ（ビニルエステル）ポリマーは、本明細書に記載のポリヌクレオチドとコンジュゲートすることができる。
いくつかの実施形態では、治療用ナノ粒子は、少なくとも１つのジブロックコポリマーを含み得る。ジブロックコポリマーは、これに限定されないが、ポリ（乳酸）−ポリ（エチレン）グリコールコポリマーであり得る（例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第ＷＯ２０１３０４４２１９号を参照）。非限定的な例として、治療用ナノ粒子は、癌治療に使用することができる（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１３０４４２１９号を参照）。
いくつかの実施形態では、治療用ナノ粒子は、本明細書に記載される及び／または当技術分野で既知である少なくとも１つのカチオン性ポリマーを含み得る。
いくつかの実施形態では、治療用ナノ粒子は、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（アミドアミン）デンドリマー、ポリ（ベータ−アミノエステル）（例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，２８７，８４９号を参照）、及びこれらの組み合わせなどであるが、これらに限定されない少なくとも１つのアミン含有ポリマーを含み得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願第ＷＯ２０１３０５９４９６号に記載されるものなどのアミンカチオン性脂質であってもよい。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、アミノ−アミンまたはアミノ−アミド部分を有し得る。
いくつかの実施形態では、治療用ナノ粒子は、ポリカチオン性側鎖を含有し得る少なくとも１つの分解性ポリエステルを含んでもよい。分解性ポリエステルとしては、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｌ−リジン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、分解性ポリエステルには、ＰＥＧ化ポリマーを形成するためのＰＥＧコンジュゲートを含み得る。
いくつかの実施形態では、合成ナノ担体は、合成ナノ担体の送達による免疫応答を増強する免疫刺激剤を含み得る。非限定的な例として、合成ナノ担体は、免疫系のＴｈ１に基づく応答を増強できるＴｈ１免疫刺激剤を含み得る（それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１０１２３５６９号及び米国公開第ＵＳ２０１１０２２３２０１号を参照）。
いくつかの実施形態では、合成ナノ担体は、標的放出用に製剤化することができる。いくつかの実施形態では、合成ナノ担体は、ポリヌクレオチドを特定のｐＨで及び／または望ましい時間間隔後に放出するように製剤化される。非限定的な例として、合成ナノ粒子は、２４時間後及び／またはｐＨ４．５でＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンを放出するように製剤化することができる（それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１０１３８１９３号及び同第ＷＯ２０１０１３８１９４号、ならびに米国公開第ＵＳ２０１１００２０３８８号及び同第ＵＳ２０１１００２７２１７号を参照）。
いくつかの実施形態では、合成ナノ担体は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを制御放出及び／または持続放出するように製剤化することができる。非限定的な例として、持続放出用の合成ナノ担体は、当技術分野で既知の方法、本明細書に記載の方法、ならびに／またはそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１０１３８１９２号及び米国公開第２０１００３０３８５０号に記載の方法によって製剤化することができる。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンを制御放出用及び／または持続放出用に製剤化することができ、その場合、製剤は結晶性側鎖（ＣＹＳＣ）ポリマーである少なくとも１つのポリマーを含む。ＣＹＳＣポリマーは、米国特許第８，３９９，００７号に記載されており、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、合成ナノ担体は、ワクチンとして使用するために製剤化することができる。いくつかの実施形態では、合成ナノ担体は、少なくとも１つの抗原をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを封入することができる。非限定的な例として、合成ナノ担体は、少なくとも１つの抗原と、ワクチン剤形に応じた賦形剤を含んでもよい（それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１１１５０２６４号及び米国公開第ＵＳ２０１１０２９３７２３号を参照）。別の非限定的な例として、ワクチン剤形には、同じまたは異なる抗原及び賦形剤を有する少なくとも２つの合成ナノ担体を含み得る（それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１１１５０２４９号及び米国公開第ＵＳ２０１１０２９３７０１号を参照）。ワクチン剤形は、本明細書に記載の方法、当技術分野で既知の方法、ならびに／またはそれぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１１１５０２５８号及び米国公開第ＵＳ２０１２００２７８０６号に記載の方法によって選択することができる。
いくつかの実施形態では、合成ナノ担体は、少なくとも１つのアジュバントをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み得る。非限定的な例として、アジュバントには、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムクロリド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムホスフェート、またはジメチルジオクタデシルアンモニウムアセテート（ＤＤＡ）、及びマイコバクテリアの総脂質抽出物の無極性画分または前記無極性画分の一部を含み得る（例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，２４１，６１０号を参照）。いくつかの実施形態では、合成ナノ担体は、少なくとも１つのポリヌクレオチドとアジュバントを含み得る。非限定的な例として、アジュバントを含む合成ナノ担体は、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１１１５０２４０号及び米国公開第ＵＳ２０１１０２９３７００号に記載の方法によって製剤化することができる。
いくつかの実施形態では、合成ナノ担体は、ウイルス由来のペプチド、断片、または領域をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを封入することができる。非限定的な例として、合成ナノ担体には、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１２０２４６２１号、同第ＷＯ２０１２０２６２９号、同第ＷＯ２０１２０２４６３２号、ならびに米国公開第ＵＳ２０１２００６４１１０号、同第ＵＳ２０１２００５８１５３号、及び同第ＵＳ２０１２００５８１５４号に記載のいずれかであるが、これに限定されないナノ担体を含み得る。
いくつかの実施形態では、合成ナノ担体は、体液性及び／または細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を引き起こすことができるポリヌクレオチドに結合されていてもよい（例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１３０１９６６９号を参照）。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、双性イオン性脂質に封入されていても、それと結合されていても、及び／または会合されていてもよい。双性イオン性脂質及び双性イオン性脂質の使用方法の非限定的な例は、米国特許公開第ＵＳ２０１３０２１６６０７号に記載されており、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの態様では、双性イオン性脂質を、本明細書に記載のリポソーム及び脂質ナノ粒子に使用することができる。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第ＵＳ２０１３０１９７１００号に記載されるコロイドナノ担体で製剤化することができる。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子を経口投与に合わせて最適化することができる。ナノ粒子は、キトサンまたはその誘導体などであるが、これに限定されない少なくとも１つのカチオン性バイオポリマーを含んでもよい。非限定的な例として、ナノ粒子は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国公開第２０１２０２８２３４３号に記載の方法によって製剤化することができる。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、脂質ＫＬ５２（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国出願公開第２０１２／０２９５８３２号に開示されるアミノ脂質）を含む。そのような脂質の組み込みによって、ＬＮＰ投与の活性及び／または安全性（例えば、ＡＬＴ／ＡＳＴ、白血球数、及びサイトカイン誘導のうちの１種以上を調べることによって測定される）を改善することができる。ＫＬ５２を含むＬＮＰは、静脈内に、及び／または１回以上の投与で投与することができる。いくつかの実施形態では、ＫＬ５２を含むＬＮＰの投与は、ＭＣ３を含むＬＮＰと比較して同等または改善されたｍＲＮＡ及び／またはタンパク質の発現をもたらす。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、小さいＬＮＰを使用して送達することができる。そのような粒子は、０．１ｕｍ未満〜最大１００ｎｍ、例えば、０．１ｕｍ未満、１．０ｕｍ未満、５ｕｍ未満、１０ｕｍ未満、１５ｕｍ未満、２０ｕｍ未満、２５ｕｍ未満、３０ｕｍ未満、３５ｕｍ未満、４０ｕｍ未満、５０ｕｍ未満、５５ｕｍ未満、６０ｕｍ未満、６５ｕｍ未満、７０ｕｍ未満、７５ｕｍ未満、８０ｕｍ未満、８５ｕｍ未満、９０ｕｍ未満、９５ｕｍ未満、１００ｕｍ未満、１２５ｕｍ未満、１５０ｕｍ未満、１７５ｕｍ未満、２００ｕｍ未満、２２５ｕｍ未満、２５０ｕｍ未満、２７５ｕｍ未満、３００ｕｍ未満、３２５ｕｍ未満、３５０ｕｍ未満、３７５ｕｍ未満、４００ｕｍ未満、４２５ｕｍ未満、４５０ｕｍ未満、４７５ｕｍ未満、５００ｕｍ未満、５２５ｕｍ未満、５５０ｕｍ未満、５７５ｕｍ未満、６００ｕｍ未満、６２５ｕｍ未満、６５０ｕｍ未満、６７５ｕｍ未満、７００ｕｍ未満、７２５ｕｍ未満、７５０ｕｍ未満、７７５ｕｍ未満、８００ｕｍ未満、８２５ｕｍ未満、８５０ｕｍ未満、８７５ｕｍ未満、９００ｕｍ未満、９２５ｕｍ未満、９５０ｕｍ未満、９７５ｕｍ未満、または１０００ｕｍ未満などであるが、これに限定されない直径を含み得る。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、約１ｎｍ〜約１００ｎｍ、約１ｎｍ〜約１０ｎｍ、約１ｎｍ〜約２０ｎｍ、約１ｎｍ〜約３０ｎｍ、約１ｎｍ〜約４０ｎｍ、約１ｎｍ〜約５０ｎｍ、約１ｎｍ〜約６０ｎｍ、約１ｎｍ〜約７０ｎｍ、約１ｎｍ〜約８０ｎｍ、約１ｎｍ〜約９０ｎｍ、約５ｎｍ〜約１００ｎｍ、約５ｎｍ〜約１０ｎｍ、約５ｎｍ〜約２０ｎｍ、約５ｎｍ〜約３０ｎｍ、約５ｎｍ〜約４０ｎｍ、約５ｎｍ〜約５０ｎｍ、約５ｎｍ〜約６０ｎｍ、約５ｎｍ〜約７０ｎｍ、約５ｎｍ〜約８０ｎｍ、約５ｎｍ〜約９０ｎｍ、約１０〜約５０ｎｍ、約２０〜約５０ｎｍ、約３０〜約５０ｎｍ、約４０〜約５０ｎｍ、約２０〜約６０ｎｍ、約３０〜約６０ｎｍ、約４０〜約６０ｎｍ、約２０〜約７０ｎｍ、約３０〜約７０ｎｍ、約４０〜約７０ｎｍ、約５０〜約７０ｎｍ、約６０〜約７０ｎｍ、約２０〜約８０ｎｍ、約３０〜約８０ｎｍ、約４０〜約８０ｎｍ、約５０〜約８０ｎｍ、約６０〜約８０ｎｍ、約２０〜約９０ｎｍ、約３０〜約９０ｎｍ、約４０〜約９０ｎｍ、約５０〜約９０ｎｍ、約６０〜約９０ｎｍ、及び／または約７０〜約９０ｎｍの直径であり得る小さいＬＮＰを使用して送達することができる。
いくつかの実施形態では、そのようなＬＮＰは、マイクロ流体ミキサーを含む方法を使用して合成される。マイクロ流体ミキサーの例には、Ｍｉｃｒｏｉｎｎｏｖａ（Ａｌｌｅｒｈｅｉｌｉｇｅｎ ｂｅｉ Ｗｉｌｄｏｎ，Ａｕｓｔｒｉａ）によって製造されているものを含むがこれに限定されないスリット型交差指状マイクロミキサー、及び／またはスタッガードヘリンボーンマイクロミキサー（ＳＨＭ）（Ｚｈｉｇａｌｔｓｅｖ，Ｉ．Ｖ． ｅｔ ａｌ．，Ｂｏｔｔｏｍ−ｕｐ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｌｉｍｉｔ ｓｉｚｅ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｙｓｔｅｍｓ ｗｉｔｈ ａｑｕｅｏｕｓ ａｎｄ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｃｏｒｅｓ ｕｓｉｎｇ ｍｉｌｌｉｓｅｃｏｎｄ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｍｉｘｉｎｇが公開されている）を含み得るが、これらに限定されない（それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｌａｎｇｍｕｉｒ．２０１２．２８：３６３３−４０；Ｂｅｌｌｉｖｅａｕ，Ｎ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ｐｏｔｅｎｔ ｌｉｍｉｔ−ｓｉｚｅ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．２０１２．１：ｅ３７；Ｃｈｅｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｒａｐｉｄ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｐｏｔｅｎｔ ｓｉＲＮＡ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｅｎａｂｌｅｄ ｂｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２０１２．１３４（１６）：６９４８−５１）。いくつかの実施形態では、ＳＨＭを含むＬＮＰの作製方法は、少なくとも２つの投入ストリームの混合をさらに含み、その場合、混合は、微細構造誘導性カオス的移流（ＭＩＣＡ：ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｈａｏｔｉｃ ａｄｖｅｃｔｉｏｎ）によって起こる。この方法によれば、流体ストリームがヘリンボーンパターンに存在する流路を通過すると、回転流が生じ、各流体が互いに混じり合う。この方法はまた、流体循環中に面方向が変化する流体混合面を含み得る。ＳＨＭを使用したＬＮＰの作製方法としては、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国出願公開第２００４／０２６２２２３号及び同第２０１２／０２７６２０９号に開示されるものが挙げられる。
いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｆｕｒ Ｍｉｋｒｏｔｅｃｈｎｉｋ Ｍａｉｎｚ ＧｍｂＨ，Ｍａｉｎｚ Ｇｅｒｍａｎｙ製のＳｌｉｔ Ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌ Ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ Ｍｉｘｅｒ（ＳＩＭＭ−Ｖ２）またはＳｔａｎｄａｒｄ Ｓｌｉｔ Ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌ Ｍｉｃｒｏ Ｍｉｘｅｒ（ＳＳＩＭＭ）またはＣａｔｅｒｐｉｌｌａｒ（ＣＰＭＭ）またはＩｍｐｉｎｇｉｎｇ−ｊｅｔ（ＩＪＭＭ））などであるが、これに限定されないマイクミキサーを使用して作製した脂質ナノ粒子で製剤化することができる。
いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、マイクロ流体技術を使用して作製された脂質ナノ粒子で製剤化することができる（例えば、Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｇｅｏｒｇｅ Ｍ．Ｔｈｅ Ｏｒｉｇｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ．Ｎａｔｕｒｅ，２００６ ４４２：３６８−３７３；及びＡｂｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｏｔｉｃ Ｍｉｘｅｒ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２ ２９５：６４７−６５１を参照；それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる）。非限定的な例として、制御されたマイクロ流体による製剤化には、低レイノルズ数でマイクロ流路内の定圧駆動流のストリームを混合するための受動的方法を含む（例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ａｂｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｏｔｉｃ Ｍｉｘｅｒ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２ ２９５：６４７−６５１を参照）。
いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）またはＤｏｌｏｍｉｔｅ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ（Ｒｏｙｓｔｏｎ，ＵＫ）製のものなどであるが、これに限定されないマイクロミキサーチップを使用して作製された脂質ナノ粒子で製剤化することができる。マイクロミキサーチップを使用すると、２つ以上の流体ストリームを分割して再結合する機構により迅速に混合することができる。
いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第ＷＯ２０１３０６３４６８号または米国特許第８，４４０，６１４号に記載される薬物封入マイクロスフェアを使用した送達用に製剤化することができる。マイクロスフェアには、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開第ＷＯ２０１３０６３４６８号に記載される式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、または（ＶＩ）の化合物を含み得る。いくつかの実施形態では、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、脂質（ＡＰＰＬ）は、本開示のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンを細胞に送達するのに有用である（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第ＷＯ２０１３０６３４６８号を参照）。
いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、約１０〜約１００ｎｍ、例えば、約１０〜約２０ｎｍ、約１０〜約３０ｎｍ、約１０〜約４０ｎｍ、約１０〜約５０ｎｍ、約１０〜約６０ｎｍ、約１０〜約７０ｎｍ、約１０〜約８０ｎｍ、約１０〜約９０ｎｍ、約２０〜約３０ｎｍ、約２０〜約４０ｎｍ、約２０〜約５０ｎｍ、約２０〜約６０ｎｍ、約２０〜約７０ｎｍ、約２０〜約８０ｎｍ、約２０〜約９０ｎｍ、約２０〜約１００ｎｍ、約３０〜約４０ｎｍ、約３０〜約５０ｎｍ、約３０〜約６０ｎｍ、約３０〜約７０ｎｍ、約３０〜約８０ｎｍ、約３０〜約９０ｎｍ、約３０〜約１００ｎｍ、約４０〜約５０ｎｍ、約４０〜約６０ｎｍ、約４０〜約７０ｎｍ、約４０〜約８０ｎｍ、約４０〜約９０ｎｍ、約４０〜約１００ｎｍ、約５０〜約６０ｎｍ、約５０〜約７０ｎｍ、約５０〜約８０ｎｍ、約５０〜約９０ｎｍ、約５０〜約１００ｎｍ、約６０〜約７０ｎｍ、約６０〜約８０ｎｍ、約６０〜約９０ｎｍ、約６０〜約１００ｎｍ、約７０〜約８０ｎｍ、約７０〜約９０ｎｍ、約７０〜約１００ｎｍ、約８０〜約９０ｎｍ、約８０〜約１００ｎｍ、及び／または約９０〜約１００ｎｍであるがこれに限定されない直径を有する脂質ナノ粒子で製剤化することができる。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約１０〜５００ｎｍの直径を有し得る。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、１００ｎｍ超、１５０ｎｍ超、２００ｎｍ超、２５０ｎｍ超、３００ｎｍ超、３５０ｎｍ超、４００ｎｍ超、４５０ｎｍ超、５００ｎｍ超、５５０ｎｍ超、６００ｎｍ超、６５０ｎｍ超、７００ｎｍ超、７５０ｎｍ超、８００ｎｍ超、８５０ｎｍ超、９００ｎｍ超、９５０ｎｍ超、または１０００ｎｍ超の直径を有し得る。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第ＷＯ２０１３０５９９２２号に記載の制限サイズの脂質ナノ粒子であり得る。制限サイズの脂質ナノ粒子は、水性コアまたは疎水性コアを取り囲む脂質二重層を含み得るが、その場合、脂質二重層は、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、ケファリン、セレブロシド、Ｃ８〜Ｃ２０脂肪酸ジアシルホスファチジルコリン、及び１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）などであるが、これに限定されないリン脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、制限サイズの脂質ナノ粒子は、ＤＬＰＥ−ＰＥＧ、ＤＭＰＥ−ＰＥＧ、ＤＰＰＣ−ＰＥＧ、及びＤＳＰＥ−ＰＥＧなどであるが、これに限定されないポリエチレングリコール脂質を含み得る。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開第ＷＯ２０１３０６３５３０号に記載される送達方法を使用して、特定の位置に送達、局在化、及び／または濃縮されてもよい。非限定的な例として、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンを対象に送達する前に、それと同時に、またはその後に、空のポリマー粒子を対象に投与してもよい。空のポリマー粒子は、ひとたび対象と接触すると容積の変化を受け、対象の特定の位置に滞留、埋め込み、固定化、または捕捉される。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、活性物質放出系で製剤化することができる（例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開第ＵＳ２０１３０１０２５４５号を参照）。活性物質放出系は、１）触媒活性のある核酸とハイブリダイズする阻害性オリゴヌクレオチド鎖に結合された少なくとも１つのナノ粒子と、２）治療に有効な物質（例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチド）に結合された少なくとも１つの基質分子に結合した化合物とを含み、触媒活性のある核酸による基質分子の切断によって、治療に有効な物質を放出することができる。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、非細胞物質を含む内部コアと、細胞膜を含む外側表面とを含むナノ粒子で製剤化することができる。細胞膜は、ウイルスに由来する細胞または膜から誘導することができる。非限定的な例として、ナノ粒子は、国際特許公開第ＷＯ２０１３０５２１６７号に記載されている方法によって作製でき、その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。別の非限定的な例として、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開第ＷＯ２０１３０５２１６７号に記載のナノ粒子を使用して、本明細書に記載のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンを送達することができる。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、多孔質ナノ粒子に担持された脂質二重層（プロトセル）で製剤化することができる。プロトセルは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第ＷＯ２０１３０５６１３２号に記載されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，４２０，１２３号及び同第８，５１８，９６３号ならびに欧州特許第ＥＰ２０７３８４８Ｂ１号に記載するポリマーナノ粒子またはそれらに記載の方法によって作製されたポリマーナノ粒子で製剤化することができる。非限定的な例として、ポリマーナノ粒子は、その内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，５１８，９６３号に記載のナノ粒子、またはそれらに記載の方法によって作製されたナノ粒子のように高いガラス転移温度を有し得る。別の非限定的な例として、経口製剤及び非経口製剤用のポリマーナノ粒子は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる欧州特許第ＥＰ２０７３８４８Ｂ１号に記載されている方法によって作製することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、イメージングに使用されるナノ粒子で製剤化することができる。ナノ粒子は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開第ＵＳ２０１３０１２９６３６号に記載されるものなどのリポソームナノ粒子であり得る。非限定的な例として、リポソームは、ガドリニウム（ＩＩＩ）２−｛４，７−ビス−カルボキシメチル−１０−［（Ｎ，Ｎ−ジステアリルアミドメチル−Ｎ’−アミド−メチル］−１，４，７，１０−テトラ−アザシクロドデカ−１−イル｝酢酸及び中性の完全飽和リン脂質成分を含み得る（例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開第ＵＳ２０１３０１２９６３６号を参照）。
いくつかの実施形態では、本開示に使用することができるナノ粒子は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第ＵＳ２０１３０１３０３４８号に記載の方法によって形成することができる。
本開示のナノ粒子は、欠乏すると貧血から神経管欠損に至る健康被害をもたらし得るものなどであるが、これに限定されない栄養素をさらに含み得る（例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第ＷＯ２０１３０７２９２９号に記載のナノ粒子を参照）。非限定的な例として、栄養素は、第一鉄塩、第二鉄塩、もしくは元素鉄の形態の鉄、ヨウ素、葉酸、ビタミン、または微量栄養素であり得る。
いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、膨潤性ナノ粒子で製剤化することができる。膨潤性ナノ粒子は、限定されないが、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，４４０，２３１号に記載のものなどであり得る。非限定的な実施形態として、膨潤性ナノ粒子を使用して、本開示のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンを肺系統に送達することができる（例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，４４０，２３１号を参照）。
本開示のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，４４９，９１６号に記載のものなどであるが、これに限定されないポリ酸無水物ナノ粒子で製剤化することができる。
本開示のナノ粒子及び微粒子を幾何学的に操作して、マクロファージ及び／または免疫応答を調節することができる。いくつかの実施形態では、幾何学的に操作された粒子は、これに限定されないが、肺送達などの標的送達される本開示のポリヌクレオチドを組み込むため、様々な形状、サイズ、及び／または表面電荷を有してもよい（例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１３０８２１１１号を参照）。幾何学的に操作された粒子が有し得るその他物理的特徴としては、細胞及び組織との相互作用を変化させることができる、開窓、アングルアーム、非対称性、及び表面粗度、電荷が挙げられるが、これに限定されない。非限定的な例として、本開示のナノ粒子は、国際公開第ＷＯ２０１３０８２１１１号に記載されている方法によって作製でき、その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本開示のナノ粒子は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１３０９０６０１号に記載されるものなどであるが、これに限定されない水溶性ナノ粒子であってもよい。ナノ粒子は、良好な水溶性を示すために、小型で双性イオン性の配位子を有する無機ナノ粒子であってもよい。ナノ粒子はまた、小さな流体力学的直径（ＨＤ）、時間、ｐＨ、及び塩分に対する安定性、ならびに低レベルの非特異的タンパク質結合を有してもよい。
いくつかの実施形態では、本開示のナノ粒子は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開第ＵＳ２０１３０１７２４０６号に記載の方法によって開発することができる。
いくつかの実施形態では、本開示のナノ粒子は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第ＵＳ２０１３０１７２４０６号に記載されるものなどであるが、これに限定されないステルスナノ粒子または標的特異的ステルスナノ粒子である。本開示のナノ粒子は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開第ＵＳ２０１３０１７２４０６号に記載の方法によって作製することができる。
いくつかの実施形態では、ステルスナノ粒子または標的特異的ステルスナノ粒子は、ポリマーマトリックスを含み得る。ポリマーマトリックスは、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフマレート（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｆｕｍｅｒａｔｅ）、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリエステル、ポリ無水物、ポリエーテル、ポリウレタン、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリシアノアクリレート、またはこれらの組み合わせなどであるが、これらに限定されない２種以上のポリマーを含み得る。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、高密度核酸層を有する、ナノ粒子−核酸ハイブリッド構造であってもよい。非限定的な例として、ナノ粒子−核酸ハイブリッド構造は、その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第ＵＳ２０１３０１７１６４６号に記載の方法によって作製することができる。ナノ粒子は、本明細書に記載のポリヌクレオチド及び／または当技術分野で既知のポリヌクレオチドなどであるが、これに限定されない核酸を含み得る。
本開示のナノ粒子の少なくとも１つは、コアナノ構造内に埋め込まれてもよく、またはナノ構造内部またはナノ構造表面に、少なくとも１つのペイロードを保持または結合させることができる低密度で多孔質の３Ｄ構造またはコーティングで被覆されていてもよい。少なくとも１つのナノ粒子を含んでいるナノ構造の非限定的な例は、国際特許公開第ＷＯ２０１３１２３５２３号に記載されており、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、プロタミン、ヌクレオリン、スペルミン、もしくはスペルミジンを含む、カチオン性化合物もしくはポリカチオン性化合物、またはポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ポリアルギニンなどの他のカチオン性ペプチドもしくはタンパク質、塩基性ポリペプチド、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）（ＨＩＶ結合ペプチド、ＨＩＶ−１ Ｔａｔ（ＨＩＶ）、Ｔａｔ由来ペプチド、ペネトラチン、ＶＰ２２由来もしくはＶＰ２２アナログペプチド、Ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ Ｅｒｎｓ、ＨＳＶ、ＶＰ２２（単純ヘルペス）、ＭＡＰ、ＫＡＬＡ、またはタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）を含む）、ＰｐＴ６２０、プロリンリッチペプチド、アルギニンリッチペプチド、リジンリッチペプチド、ＭＰＧ−ペプチド（複数可）、Ｐｅｐ−１、Ｌ−オリゴマー、カルシトニンペプチド（複数可）、アンテナペディア由来ペプチド（特にＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ由来）、ｐＡｎｔｐ、ｐＩｓｌ、ＦＧＦ、ラクトフェリン、トランスポータン、ブフォリン−２、Ｂａｃ７１５−２４、ＳｙｎＢ、ＳｙｎＢ、ｐＶＥＣ、ｈＣＴ由来ペプチド、ＳＡＰ、ヒストン、カチオン性多糖類（例えば、キトサン）、ポリブレン、カチオン性ポリマー（例えばポリエチレンイミン（ＰＥＩ））、カチオン性脂質（例えばＤＯＴＭＡ：［１−（２，３−シオレイルオキシ（ｓｉｏｌｅｙｌｏｘｙ））プロピル）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）、ＤＭＲＩＥ、ジ−Ｃ１４−アミジン、ＤＯＴＩＭ、ＳＡＩＮＴ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＢＧＴＣ、ＣＴＡＰ、ＤＯＰＣ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＰＥ：ジオレイルホスファチジルエタノールアミン、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＤＡＢ、ＤＯＩＣ、ＤＭＥＰＣ、ＤＯＧＳ：ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン、ＤＩＭＲＩ：ジミリストオキシプロピルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、ＤＯＴＡＰ：ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン、ＤＣ−６−１４：Ｏ，Ｏ−ジテトラデカノイル−Ｎ−アルファ−トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロリド、ＣＬＩＰ１：ｒａｃ−［（２，３−ジオクタデシルオキシプロピル）（２−ヒドロキシエチル）］−ジメチルアンモニウムクロリド、ＣＬＩＰ６：ｒａｃ−［２（２，３−ジヘキサデシルオキシプロピルオキシメチルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウム、ＣＬＩＰ９：ｒａｃ−［２（２，３−ジヘキサデシルオキシプロピルオキシスクシニルオキシ）エチル］−トリメチルアンモニウム、オリゴフェクトアミン、またはカチオン性もしくはポリカチオン性ポリマー、例えば、ベータ−アミノ酸ポリマーもしくは逆ポリアミドなどの修飾ポリアミノ酸、ＰＶＰ（ポリ（Ｎ−エチル−４−ビニルピリジニウムブロミド））などの修飾ポリエチレン、ｐＤＭＡＥＭＡ（ポリ（ジメチルアミノエチルメチルアクリレート））などの修飾アクリレート、ｐＡＭＡＭ（ポリ（アミドアミン））などの修飾アミドアミン、ジアミン末端修飾１，４ブタンジオールジアクリレート−ｃｏ−５−アミノ−１−ペンタノールポリマーなどの修飾ポリベータアミノエステル（ＰＢＡＥ）、ポリプロピルアミンデンドリマーもしくはｐＡＭＡＭ系デンドリマーなどのデンドリマー、ＰＥＩ：ポリ（エチレンイミン）、ポリ（プロピレンイミン）などのポリイミン（複数可）、ポリアリルアミン、糖骨格系ポリマー（シクロデキストリン系ポリマー、デキストラン系ポリマー、キトサンなど）、ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳコポリマーなどのシラン骨格系ポリマー、１つ以上のカチオン性ブロック（例えば、上記のカチオン性ポリマーから選択される）と１つ以上の親水性もしくは疎水性ブロック（例えば、ポリエチレングリコール）との組み合わせからなるブロックポリマーなどと結合されていてよい。
他の実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、カチオン性化合物またはポリカチオン性化合物と結合されていない。
ワクチン投与様式
インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、治療上有効な結果をもたらす任意の経路によって投与することができる。これには、皮内投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、及び／または皮下投与が含まれるが、これらに限定されない。本開示は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンを、それを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢、及び全身の状態、疾患の重症度、具体的な組成物、その投与様式、その活性様式などに応じて対象ごとに決定することになる。インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチン組成物は通常、投与の容易性及び投与量の均一化のため、単位剤形で製剤化される。ただし、当然ながら、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチン組成物の合計の一日用量は、堅実な医学的判断の範囲内で主治医が決定することができる。任意の特定の患者についての具体的な治療有効量、予防有効量、または適切なイメージング線量のレベルは、様々な要因に依存することになり、これには、治療される障害及び障害の重篤度；使用される具体的な化合物の活性；使用される具体的な組成物；患者の年齢、体重、全身健康状態、性別及び食事；使用される具体的な化合物の投与時間、投与経路、及び排出速度；治療の継続時間；使用される具体的な化合物と組み合わせてまたは同時に使用される薬物；医学分野で周知されている同様の要因が含まれる。
いくつかの実施形態では、インフルエンザ疾患ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチン組成物は、１日、１日１回以上、１週間、１か月などにつき、対象の体重あたり０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ〜０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、または１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇを送達するに足る用量レベルで投与することで、所望する治療効果、診断効果、予防効果、またはイメージング効果を得ることができる（例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１３０７８１９９号に記載の単位投与量の範囲を参照）。１日３回、１日２回、１日１回、隔日、３日ごと、毎週、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、２か月ごと、３か月ごと、６か月ごとなどの所望する用量を送達してもよい。いくつかの実施形態では、所望する用量を複数回投与（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、またはそれ以上の投与）を用いて送達してもよい。複数回投与を用いる場合、本明細書に記載のものなどの分割投与レジメンを用いてもよい。例示的な実施形態では、インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチン組成物は、０．０００５ｍｇ／ｋｇ〜０．０１ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０００５ｍｇ／ｋｇ〜約０．００７５ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０００５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ、約０．００２ｍｇ／ｋｇ、約０．００３ｍｇ／ｋｇ、約０．００４ｍｇ／ｋｇ、または約０．００５ｍｇ／ｋｇを送達するに足る用量レベルで投与することができる。
いくつかの実施形態では、インフルエンザ疾患ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチン組成物は、０．０２５ｍｇ／ｋｇ〜０．２５０ｍｇ／ｋｇ、０．０２５ｍｇ／ｋｇ〜０．５００ｍｇ／ｋｇ、０．０２５ｍｇ／ｋｇ〜０．７５０ｍｇ／ｋｇ、または０．０２５ｍｇ／ｋｇ〜１．０ｍｇ／ｋｇを送達するに足る用量レベルで１回または２回（またはそれ以上）投与することができる。
いくつかの実施形態では、インフルエンザ疾患ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチン組成物は、０．０１００ｍｇ、０．０２５ｍｇ、０．０５０ｍｇ、０．０７５ｍｇ、０．１００ｍｇ、０．１２５ｍｇ、０．１５０ｍｇ、０．１７５ｍｇ、０．２００ｍｇ、０．２２５ｍｇ、０．２５０ｍｇ、０．２７５ｍｇ、０．３００ｍｇ、０．３２５ｍｇ、０．３５０ｍｇ、０．３７５ｍｇ、０．４００ｍｇ、０．４２５ｍｇ、０．４５０ｍｇ、０．４７５ｍｇ、０．５００ｍｇ、０．５２５ｍｇ、０．５５０ｍｇ、０．５７５ｍｇ、０．６００ｍｇ、０．６２５ｍｇ、０．６５０ｍｇ、０．６７５ｍｇ、０．７００ｍｇ、０．７２５ｍｇ、０．７５０ｍｇ、０．７７５ｍｇ、０．８００ｍｇ、０．８２５ｍｇ、０．８５０ｍｇ、０．８７５ｍｇ、０．９００ｍｇ、０．９２５ｍｇ、０．９５０ｍｇ、０．９７５ｍｇ、もしくは１．０ｍｇの総投与量で、またはその総投与量を送達するに足る用量レベルで、２回（例えば、０日目と７日目、０日目と１４日目、０日目と２１日目、０日目と２８日目、０日目と６０日目、０日目と９０日目、０日目と１２０日目、０日目と１５０日目、０日目と１８０日目、０日目と３か月後、０日目と６か月後、０日目と９か月後、０日目と１２か月後、０日目と１８か月後、０日目と２年後、０日目と５年後、または０日目と１０年後）投与してもよい。これよりも高いまたは低い用量及び投与頻度が本開示に包含される。例えば、インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチン組成物は３回または４回投与してもよい。
いくつかの実施形態では、インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチン組成物は、０．０１０ｍｇ、０．０２５ｍｇ、０．１００ｍｇ、もしくは０．４００ｍｇの総投与量で、またはその総投与量を送達するに足る用量レベルで、２回（例えば、０日目と７日目、０日目と１４日目、０日目と２１日目、０日目と２８日目、０日目と６０日目、０日目と９０日目、０日目と１２０日目、０日目と１５０日目、０日目と１８０日目、０日目と３か月後、０日目と６か月後、０日目と９か月後、０日目と１２か月後、０日目と１８か月後、０日目と２年後、０日目と５年後、または０日目と１０年後）投与してもよい。
いくつかの実施形態では、対象にワクチン接種する方法に使用されるインフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、単回用量１０μｇ／ｋｇ〜４００μｇ／ｋｇの核酸ワクチンとして（対象のワクチン接種に有効な量で）対象に投与される。いくつかの実施形態では、対象にワクチン接種する方法に使用されるＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、単回用量１０μｇ〜４００μｇの核酸ワクチンとして（対象のワクチン接種に有効な量で）対象に投与される。いくつかの実施形態では、対象にワクチン接種する方法に使用されるインフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、２５〜１０００μｇの単回用量として対象に投与される。いくつかの実施形態では、インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、または１０００μｇの単回用量として対象に投与される。例えば、インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、２５〜１００、２５〜５００、５０〜１００、５０〜５００、５０〜１０００、１００〜５００、１００〜１０００、２５０〜５００、２５０〜１０００、または５００〜１０００μｇの単回用量として対象に投与することができる。いくつかの実施形態では、対象にワクチン接種する方法に使用されるインフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、２回用量として、その組み合わせが２５〜１０００μｇのインフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンと等しくなるように対象に投与される。
本明細書に記載のインフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチン医薬組成物は、鼻腔内、気管内、または注射可能（例えば、静脈内、眼内、硝子体内、筋肉内、皮内、心臓内、腹腔内、鼻腔内、及び皮下）などの本明細書に記載の剤形に製剤化することができる。
インフルエンザウイルスＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチン製剤及び使用方法
本開示のいくつかの態様は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンが、抗原特異的免疫応答を対象に生じさせる（例えば、インフルエンザ抗原ポリペプチドに特異的な抗体を産生する）有効量で製剤化されているインフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの製剤を提供する。「有効量」とは、抗原特異的免疫応答を生じさせるのに有効なＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの投与量である。対象に抗原特異的免疫応答を誘導する方法も本明細書で提供される。
いくつかの実施形態では、抗原特異的免疫応答は、本明細書で提供されるインフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンを投与された対象に生じる抗インフルエンザ抗原ポリペプチド抗体価を測定することにより特性決定される。抗体価とは、対象内の抗体量、例えば、特定の抗原（例えば、インフルエンザ抗原ポリペプチド）または抗原のエピトープに特異的な抗体の量の測定値である。抗体価は通常、陽性結果を示す最大希釈倍数の逆数で表される。例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、抗体価を決定するための一般的なアッセイである。
いくつかの実施形態では、抗体価は、対象が感染しているかどうかの評価、または免疫が必要であるかどうかの決定に使用される。いくつかの実施形態では、抗体価は、自己免疫応答の強度の決定、ブースター免疫が必要であるかどうかの決定、以前のワクチンが有効であったかどうかの決定、及び何らかの最近または過去の感染の特定に使用される。本開示によれば、抗体価を用いて、インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンによって対象に誘導される免疫応答の強度を決定することができる。
いくつかの実施形態では、対象で生じる抗インフルエンザ抗原ポリペプチド抗体価は、対照と比較して少なくとも１ｌｏｇ増加する。例えば、対象で生じる抗抗原ポリペプチド抗体価は、対照と比較して少なくとも１．５ｌｏｇ、少なくとも２ｌｏｇ、少なくとも２．５ｌｏｇ、または少なくとも３ｌｏｇ増加し得る。いくつかの実施形態では、対象で生じる抗抗原ポリペプチド抗体価は、対照と比較して１ｌｏｇ、１．５ｌｏｇ、２ｌｏｇ、２．５ｌｏｇ、または３ｌｏｇ増加する。いくつかの実施形態では、対象で生じる抗抗原ポリペプチド抗体価は、対照と比較して１〜３ｌｏｇ増加する。例えば、対象で生じる抗抗原ポリペプチド抗体価は、対照と比較して１〜１．５ｌｏｇ、１〜２ｌｏｇ、１〜２．５ｌｏｇ、１〜３ｌｏｇ、１．５〜２ｌｏｇ、１．５〜２．５ｌｏｇ、１．５〜３ｌｏｇ、２〜２．５ｌｏｇ、２〜３ｌｏｇ、または２．５〜３ｌｏｇ増加し得る。
いくつかの実施形態では、対象で生じる抗インフルエンザ抗原ポリペプチド抗体価は、対照と比較して少なくとも２倍に増加する。例えば、対象で生じる抗抗原ポリペプチド抗体価は、対照と比較して少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍に増加し得る。いくつかの実施形態では、対象で生じる抗抗原ポリペプチド抗体価は、対照と比較して２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍に増加する。いくつかの実施形態では、対象で生じる抗抗原ポリペプチド抗体価は、対照と比較して２〜１０倍に増加する。例えば、対象で生じる抗抗原ポリペプチド抗体価は、対照と比較して２〜１０倍、２〜９倍、２〜８倍、２〜７倍、２〜６倍、２〜５倍、２〜４倍、２〜３倍、３〜１０倍、３〜９倍、３〜８倍、３〜７倍、３〜６倍、３〜５倍、３〜４倍、４〜１０倍、４〜９倍、４〜８倍、４〜７倍、４〜６倍、４〜５倍、５〜１０倍、５〜９倍、５〜８倍、５〜７倍、５〜６倍、６〜１０倍、６〜９倍、６〜８倍、６〜７倍、７〜１０倍、７〜９倍、７〜８倍、８〜１０倍、８〜９倍、または９〜１０倍に増加し得る。
いくつかの実施形態では、対照とは、本開示のインフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンが投与されていない対象に生じた抗インフルエンザ抗原ポリペプチド抗体価である。いくつかの実施形態では、対照とは、生弱毒化インフルエンザワクチンが投与された対象に生じた抗インフルエンザ抗原ポリペプチド抗体価である。弱毒化ワクチンとは、生存可能な（生存する）病毒性を低下させることにより産生されるワクチンである。弱毒化ウイルスは、生存する非改変ウイルスと比較して無毒化または弱毒化するように改変される。いくつかの実施形態では、対照とは、不活化インフルエンザワクチンが投与された対象に生じた抗インフルエンザ抗原ポリペプチド抗体価である。いくつかの実施形態では、対照とは、組換えまたは精製インフルエンザタンパク質ワクチンが投与された対象に生じた抗インフルエンザ抗原ポリペプチド抗体価である。通常、組換えタンパク質ワクチンには、異種発現系（例えば、細菌または酵母）で産生されたタンパク質抗原、または多量の病原生物から精製されたタンパク質抗原のいずれをも含む。いくつかの実施形態では、対照とは、インフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）ワクチンが投与された対象に生じた抗インフルエンザ抗原ポリペプチド抗体価である。
いくつかの実施形態では、インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの有効量は、組換えインフルエンザタンパク質ワクチンの標準の治療量と比較して低減された用量である。本明細書で記載される「標準の治療」とは、医学的または心理学的治療ガイドラインを指し、一般的または具体的であり得る。「標準の治療」は、所与の病態の治療に関与する医療専門家間での科学的証拠及び協力に基づいた適切な治療法を規定している。これは、ある特定の種類の患者、疾患、または臨床環境に関して医師／臨床医が従うべき診断プロセス及び治療プロセスである。本明細書で記載される「標準の治療量」とは、医師／臨床医または他の医療専門家が、インフルエンザまたは関連病態を治療または予防するために、インフルエンザまたは関連病態を治療または予防するための標準の治療ガイドラインに従って対象に投与する、組換えもしくは精製インフルエンザタンパク質ワクチン、または生弱毒化もしくは不活化インフルエンザワクチンの用量を指す。
いくつかの実施形態では、有効量のインフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンを投与された対象に生じた抗インフルエンザ抗原ポリペプチド抗体価が、標準の治療量の組換えもしくは精製インフルエンザタンパク質ワクチン、または生弱毒化もしくは不活化インフルエンザワクチンを投与された対照対象に生じた抗インフルエンザ抗原ポリペプチド抗体価と同等となる。
いくつかの実施形態では、インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの有効量は、組換えまたは精製インフルエンザタンパク質ワクチンの標準の治療量の少なくとも２分の１に相当する用量である。例えば、インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの有効量は、組換えまたは精製インフルエンザタンパク質ワクチンの標準の治療量の少なくとも３分の１、少なくとも４分の１、少なくとも５分の１、少なくとも６分の１、少なくとも７分の１、少なくとも８分の１、少なくとも９分の１、または少なくとも１０分の１に相当する用量であり得る。いくつかの実施形態では、インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの有効量は、組換えまたは精製インフルエンザタンパク質ワクチンの標準の治療量の少なくとも１００分の１、少なくとも５００分の１、または少なくとも１０００分の１に少なくとも相当する用量である。いくつかの実施形態では、インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの有効量は、組換えまたは精製インフルエンザタンパク質ワクチンの標準の治療量の２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１、２０分の１、５０分の１、１００分の１、２５０分の１、５００分の１、１０００分の１に相当する用量である。いくつかの実施形態では、有効量のインフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンを投与された対象に生じた抗インフルエンザ抗原ポリペプチド抗体価が、標準の治療量の組換えもしくはタンパク質インフルエンザタンパク質ワクチン、または生弱毒化もしくは不活化インフルエンザワクチンを投与された対照対象に生じた抗インフルエンザ抗原ポリペプチド抗体価と同等となる。いくつかの実施形態では、インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの有効量は、組換えまたは精製インフルエンザタンパク質ワクチンの標準の治療量の２分の１〜１０００分の１（例えば、２分の１〜１００分の１、１０分の１〜１０００分の１）に相当する用量であり、その場合、対象に生じた抗インフルエンザ抗原ポリペプチド抗体価が、標準の治療量の組換えもしくは精製インフルエンザタンパク質ワクチン、または生弱毒化もしくは不活化インフルエンザワクチンを投与された対照対象に生じた抗インフルエンザ抗原ポリペプチド抗体価と同等となる。
いくつかの実施形態では、インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの有効量は、組換えインフルエンザタンパク質ワクチンの標準の治療量の２〜１０００分の１、２〜９００分の１、２〜８００分の１、２〜７００分の１、２〜６００分の１、２〜５００分の１、２〜４００分の１、２〜３００分の１、２〜２００分の１、２〜１００分の１、２〜９０分の１、２〜８０分の１、２〜７０分の１、２〜６０分の１、２〜５０分の１、２〜４０分の１、２〜３０分の１、２〜２０分の１、２〜１０分の１、２〜９分の１、２〜８分の１、２〜７分の１、２〜６分の１、２〜５分の１、２〜４分の１、２〜３分の１、３〜１０００分の１、３〜９００分の１、３〜８００分の１、３〜７００分の１、３〜６００分の１、３〜５００分の１、３〜４００分の１、３〜３〜００分の１、３〜２００分の１、３〜１００分の１、３〜９０分の１、３〜８０分の１、３〜７０分の１、３〜６０分の１、３〜５０分の１、３〜４０分の１、３〜３０分の１、３〜２０分の１、３〜１０分の１、３〜９分の１、３〜８分の１、３〜７分の１、３〜６分の１、３〜５分の１、３〜４分の１、４〜１０００分の１、４〜９００分の１、４〜８００分の１、４〜７００分の１、４〜６００分の１、４〜５００分の１、４〜４００分の１、４〜４〜００分の１、４〜２００分の１、４〜１００分の１、４〜９０分の１、４〜８０分の１、４〜７０分の１、４〜６０分の１、４〜５０分の１、４〜４０分の１、４〜３０分の１、４〜２０分の１、４〜１０分の１、４〜９分の１、４〜８分の１、４〜７分の１、４〜６分の１、４〜５分の１、４〜４分の１、５〜１０００分の１、５〜９００分の１、５〜８００分の１、５〜７００分の１、５〜６００分の１、５〜５００分の１、５〜４００分の１、５〜３００分の１、５〜２００分の１、５〜１００分の１、５〜９０分の１、５〜８０分の１、５〜７０分の１、５〜６０分の１、５〜５０分の１、５〜４０分の１、５〜３０分の１、５〜２０分の１、５〜１０分の１、５〜９分の１、５〜８分の１、５〜７分の１、５〜６分の１、６〜１０００分の１、６〜９００分の１、６〜８００分の１、６〜７００分の１、６〜６００分の１、６〜５００分の１、６〜４００分の１、６〜３００分の１、６〜２００分の１、６〜１００分の１、６〜９０分の１、６〜８０分の１、６〜７０分の１、６〜６０分の１、６〜５０分の１、６〜４０分の１、６〜３０分の１、６〜２０分の１、６〜１０分の１、６〜９分の１、６〜８分の１、６〜７分の１、７〜１０００分の１、７〜９００分の１、７〜８００分の１、７〜７００分の１、７〜６００分の１、７〜５００分の１、７〜４００分の１、７〜３００分の１、７〜２００分の１、７〜１００分の１、７〜９０分の１、７〜８０分の１、７〜７０分の１、７〜６０分の１、７〜５０分の１、７〜４０分の１、７〜３０分の１、７〜２０分の１、７〜１０分の１、７〜９分の１、７〜８分の１、８〜１０００分の１、８〜９００分の１、８〜８００分の１、８〜７００分の１、８〜６００分の１、８〜５００分の１、８〜４００分の１、８〜３００分の１、８〜２００分の１、８〜１００分の１、８〜９０分の１、８〜８０分の１、８〜７０分の１、８〜６０分の１、８〜５０分の１、８〜４０分の１、８〜３０分の１、８〜２０分の１、８〜１０分の１、８〜９分の１、９〜１０００分の１、９〜９００分の１、９〜８００分の１、９〜７００分の１、９〜６００分の１、９〜５００分の１、９〜４００分の１、９〜３００分の１、９〜２００分の１、９〜１００分の１、９〜９０分の１、９〜８０分の１、９〜７０分の１、９〜６０分の１、９〜５０分の１、９〜４０分の１、９〜３０分の１、９〜２０分の１、９〜１０分の１、１０〜１０００分の１、１０〜９００分の１、１０〜８００分の１、１０〜７００分の１、１０〜６００分の１、１０〜５００分の１、１０〜４００分の１、１０〜３００分の１、１０〜２００分の１、１０〜１００分の１、１０〜９０分の１、１０〜８０分の１、１０〜７０分の１、１０〜６０分の１、１０〜５０分の１、１０〜４０分の１、１０〜３０分の１、１０〜２０分の１、２０〜１０００分の１、２０〜９００分の１、２０〜８００分の１、２０〜７００分の１、２０〜６００分の１、２０〜５００分の１、２０〜４００分の１、２０〜３００分の１、２０〜２００分の１、２０〜１００分の１、２０〜９０分の１、２０〜８０分の１、２０〜７０分の１、２０〜６０分の１、２０〜５０分の１、２０〜４０分の１、２０〜３０分の１、３０〜１０００分の１、３０〜９００分の１、３０〜８００分の１、３０〜７００分の１、３０〜６００分の１、３０〜５００分の１、３０〜４００分の１、３０〜３００分の１、３０〜２００分の１、３０〜１００分の１、３０〜９０分の１、３０〜８０分の１、３０〜７０分の１、３０〜６０分の１、３０〜５０分の１、３０〜４０分の１、４０〜１０００分の１、４０〜９００分の１、４０〜８００分の１、４０〜７００分の１、４０〜６００分の１、４０〜５００分の１、４０〜４００分の１、４０〜３００分の１、４０〜２００分の１、４０〜１００分の１、４０〜９０分の１、４０〜８０分の１、４０〜７０分の１、４０〜６０分の１、４０〜５０分の１、５０〜１０００分の１、５０〜９００分の１、５０〜８００分の１、５０〜７００分の１、５０〜６００分の１、５０〜５００分の１、５０〜４００分の１、５０〜３００分の１、５０〜２００分の１、５０〜１００分の１、５０〜９０分の１、５０〜８０分の１、５０〜７０分の１、５０〜６０分の１、６０〜１０００分の１、６０〜９００分の１、６０〜８００分の１、６０〜７００分の１、６０〜６００分の１、６０〜５００分の１、６０〜４００分の１、６０〜３００分の１、６０〜２００分の１、６０〜１００分の１、６０〜９０分の１、６０〜８０分の１、６０〜７０分の１、７０〜１０００分の１、７０〜９００分の１、７０〜８００分の１、７０〜７００分の１、７０〜６００分の１、７０〜５００分の１、７０〜４００分の１、７０〜３００分の１、７０〜２００分の１、７０〜１００分の１、７０〜９０分の１、７０〜８０分の１、８０〜１０００分の１、８０〜９００分の１、８０〜８００分の１、８０〜７００分の１、８０〜６００分の１、８０〜５００分の１、８０〜４００分の１、８０〜３００分の１、８０〜２００分の１、８０〜１００分の１、８０〜９０分の１、９０〜１０００分の１、９０〜９００分の１、９０〜８００分の１、９０〜７００分の１、９０〜６００分の１、９０〜５００分の１、９０〜４００分の１、９０〜３００分の１、９０〜２００分の１、９０〜１００分の１、１００〜１０００分の１、１００〜９００分の１、１００〜８００分の１、１００〜７００分の１、１００〜６００分の１、１００〜５００分の１、１００〜４００分の１、１００〜３００分の１、１００〜２００分の１、２００〜１０００分の１、２００〜９００分の１、２００〜８００分の１、２００〜７００分の１、２００〜６００分の１、２００〜５００分の１、２００〜４００分の１、２００〜３００分の１、３００〜１０００分の１、３００〜９００分の１、３００〜８００分の１、３００〜７００分の１、３００〜６００分の１、３００〜５００分の１、３００〜４００分の１、４００〜１０００分の１、４００〜９００分の１、４００〜８００分の１、４００〜７００分の１、４００〜６００分の１、４００〜５００分の１、５００〜１０００分の１、５００〜９００分の１、５００〜８００分の１、５００〜７００分の１、５００〜６００分の１、６００〜１０００分の１、６００〜９００分の１、６００〜８００分の１、６００〜７００分の１、７００〜１０００分の１、７００〜９００分の１、７００〜８００分の１、８００〜１０００分の１、８００〜９００分の１、または９００〜１０００分の１に相当する用量である。いくつかの実施形態では、対象に生じた抗抗原ポリペプチド抗体価が、標準の治療量の組換えもしくは精製インフルエンザタンパク質ワクチン、または生弱毒化もしくは不活化インフルエンザワクチンを投与された対照対象に生じた抗抗原ポリペプチド抗体価と同等となる。いくつかの実施形態では、有効量は、組換えインフルエンザタンパク質ワクチンの標準の治療量の２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１、２０分の１、３０分の１、４０分の１、５０分の１、６０分の１、７０分の１、８０分の１、９０分の１、１００分の１、１１０分の１、１２０分の１、１３０分の１、１４０分の１、１５０分の１、１６０分の１、１７０分の１、１２８０分の１、１９０分の１、２００分の１、２１０分の１、２２０分の１、２３０分の１、２４０分の１、２５０分の１、２６０分の１、２７０分の１、２８０分の１、２９０分の１、３００分の１、３１０分の１、３２０分の１、３３０分の１、３４０分の１、３５０分の１、３６０分の１、３７０分の１、３８０分の１、３９０分の１、４００分の１、４１０分の１、４２０分の１、４３０分の１、４４０分の１、４５０分の１、４３６０分の１、４７０分の１、４８０分の１、４９０分の１、５００分の１、５１０分の１、５２０分の１、５３０分の１、５４０分の１、５５０分の１、５６０分の１、５７６０分の１、５８０分の１、５９０分の１、６００分の１、６１０分の１、６２０分の１、６３０分の１、６４０分の１、６５０分の１、６６０分の１、６７０分の１、６８０分の１、６９０分の１、７００分の１、７１０分の１、７２０分の１、７３０分の１、７４０分の１、７５０分の１、７６０分の１、７７０分の１、７８０分の１、７９０分の１、８００分の１、８１０分の１、８２０分の１、８３０分の１、８４０分の１、８５０分の１、８６０分の１、８７０分の１、８８０分の１、８９０分の１、９００分の１、９１０分の１、９２０分の１、９３０分の１、９４０分の１、９５０分の１、９６０分の１、９７０分の１、９８０分の１、９９０分の１、または１０００分の１に相当する（または少なくともそれに相当する）用量である。いくつかの実施形態では、対象に生じた抗抗原ポリペプチド抗体価が、標準の治療量の組換えもしくは精製インフルエンザタンパク質ワクチン、または生弱毒化もしくは不活化インフルエンザワクチンを投与された対照対象に生じた抗抗原ポリペプチド抗体価と同等となる。
いくつかの実施形態では、インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの有効量は、総投与量５０〜１０００μｇである。いくつかの実施形態では、インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの有効量は、総投与量５０〜１０００、５０〜９００、５０〜８００、５０〜７００、５０〜６００、５０〜５００、５０〜４００、５０〜３００、５０〜２００、５０〜１００、５０〜９０、５０〜８０、５０〜７０、５０〜６０、６０〜１０００、６０〜９００、６０〜８００、６０〜７００、６０〜６００、６０〜５００、６０〜４００、６０〜３００、６０〜２００、６０〜１００、６０〜９０、６０〜８０、６０〜７０、７０〜１０００、７０〜９００、７０〜８００、７０〜７００、７０〜６００、７０〜５００、７０〜４００、７０〜３００、７０〜２００、７０〜１００、７０〜９０、７０〜８０、８０〜１０００、８０〜９００、８０〜８００、８０〜７００、８０〜６００、８０〜５００、８０〜４００、８０〜３００、８０〜２００、８０〜１００、８０〜９０、９０〜１０００、９０〜９００、９０〜８００、９０〜７００、９０〜６００、９０〜５００、９０〜４００、９０〜３００、９０〜２００、９０〜１００、１００〜１０００、１００〜９００、１００〜８００、１００〜７００、１００〜６００、１００〜５００、１００〜４００、１００〜３００、１００〜２００、２００〜１０００、２００〜９００、２００〜８００、２００〜７００、２００〜６００、２００〜５００、２００〜４００、２００〜３００、３００〜１０００、３００〜９００、３００〜８００、３００〜７００、３００〜６００、３００〜５００、３００〜４００、４００〜１０００、４００〜９００、４００〜８００、４００〜７００、４００〜６００、４００〜５００、５００〜１０００、５００〜９００、５００〜８００、５００〜７００、５００〜６００、６００〜１０００、６００〜９００、６００〜９００、６００〜７００、７００〜１０００、７００〜９００、７００〜８００、８００〜１０００、８００〜９００、または９００〜１０００μｇである。いくつかの実施形態では、インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの有効量は、総投与量５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、または１０００μｇである。いくつかの実施形態では、有効量は、２回合計２５〜５００μｇを対象に投与した量である。いくつかの実施形態では、インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの有効量は、２回合計２５〜５００、２５〜４００、２５〜３００、２５〜２００、２５〜１００、２５〜５０、５０〜５００、５０〜４００、５０〜３００、５０〜２００、５０〜１００、１００〜５００、１００〜４００、１００〜３００、１００〜２００、１５０〜５００、１５０〜４００、１５０〜３００、１５０〜２００、２００〜５００、２００〜４００、２００〜３００、２５０〜５００、２５０〜４００、２５０〜３００、３００〜５００、３００〜４００、３５０〜５００、３５０〜４００、４００〜５００、または４５０〜５００μｇを対象に投与した量である。いくつかの実施形態では、インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの有効量は、２回合計２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００μｇを対象に投与した総量である。
追加実施形態
１．５’末端キャップ、少なくとも１つのインフルエンザ抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、及び３’ポリＡ尾部を有する少なくとも１つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む、インフルエンザウイルスワクチンもしくは組成物または免疫原性組成物。
２．前記少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号４４７〜４５７、４５９、４６１によって特定される配列によってコードされる、項目１のワクチン。
３．前記少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号４９１〜５０３によって特定される配列を含む、項目１のワクチン。
４．前記少なくとも１つの抗原ポリペプチドが、配列番号１〜４４４、４５８、４６０、４６２〜４７９によって特定される配列を含む、項目１のワクチン。
５．前記少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号４５７によって特定される配列によってコードされる、項目１のワクチン。
６．前記少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号５０１によって特定される配列を含む、項目１のワクチン。
７．前記少なくとも１つの抗原ポリペプチドが、配列番号４５８によって特定される配列を含む、項目１のワクチン。
８．前記少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号４５９によって特定される配列によってコードされる、項目１のワクチン。
９．前記少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号５０２によって特定される配列を含む、項目１のワクチン。
１０．前記少なくとも１つの抗原ポリペプチドが、配列番号４６０によって特定される配列を含む、項目１のワクチン。
１１．前記少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号４６１によって特定される配列によってコードされる、項目１のワクチン。
１２．前記少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号５０３によって特定される配列を含む、項目１のワクチン。
１３．前記少なくとも１つの抗原ポリペプチドが、配列番号４６２によって特定される配列を含む、項目１のワクチン。
１４．前記５’末端キャップが７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐであるかまたはそれを含む、項目１〜１３のいずれか１項のワクチン。
１５．前記オープンリーディングフレームのウラシルのうち１００％が修飾され、前記ウラシルの５位にＮ１−メチルシュードウリジンを含む、項目１〜１４のいずれか１項のワクチン。
１６．前記ワクチンが、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ；コレステロール；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）；及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）２０００−ＤＭＧを含む脂質ナノ粒子で製剤化される、項目１〜１５のいずれか１項のワクチン。
１７．前記脂質ナノ粒子が、クエン酸三ナトリウム緩衝液、スクロース、及び水をさらに含む、項目１６のワクチン。
１８．５’末端キャップ７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ、配列番号５０１によって特定される配列、及び３’ポリＡ尾部を有する少なくとも１つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含み、前記配列番号５０１によって特定される配列のウラシルヌクレオチドが修飾され、前記ウラシルヌクレオチドの５位にＮ１−メチルシュードウリジンを含む、インフルエンザウイルスワクチンもしくは組成物または免疫原性組成物。
１９．５’末端キャップ７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ、配列番号５０２によって特定される配列、及び３’ポリＡ尾部を有する少なくとも１つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含み、前記配列番号５０２によって特定される配列のウラシルヌクレオチドが修飾され、前記ウラシルヌクレオチドの５位にＮ１−メチルシュードウリジンを含む、インフルエンザウイルスワクチン。
２０．５’末端キャップ７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ、配列番号５０３によって特定される配列、及び３’ポリＡ尾部を有する少なくとも１つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含み、前記配列番号５０３によって特定される配列のウラシルヌクレオチドが修飾され、前記ウラシルヌクレオチドの５位にＮ１−メチルシュードウリジンを含む、インフルエンザウイルスワクチンもしくは組成物または免疫原性組成物。
２１．ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、コレステロール、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）２０００−ＤＭＧを含む脂質ナノ粒子で製剤化される、項目１８〜２０のいずれか１項のワクチン。
本発明は、その応用にあたり、以下の説明に記載されるかまたは図面に例示される構成要素の構成及び配置の詳細に限定されない。本発明は、他の実施形態が可能であり、様々な方法で実施されるか、または行うことが可能である。また、本明細書で使用される表現及び用語は、説明を目的としており、限定であるとみなされるべきではない。本明細書で使用される「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」、または「ｈａｖｉｎｇ（有する）」、「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（含有する／含む）」、「ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ（含む）」、及びその変形例は、その後に列挙された項目及びその等価物ならびに追加の項目を包含することを意味する。
実施例１：ポリヌクレオチドの製造
本開示によるポリヌクレオチド及び／またはその部分もしくは領域の製造は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１４／１５２０２７号、表題「Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ」に教示された方法を利用して実施することができる。
精製方法には、それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１４／１５２０３０号及び国際公開第ＷＯ２０１４／１５２０３１号に教示されている方法を含み得る。
ポリヌクレオチドの検出方法及び特性決定方法は、全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１４／１４４０３９号に教示されるように実施することができる。
本開示のポリヌクレオチドの特性決定は、ポリヌクレオチドマッピング、逆転写酵素配列決定、電荷分布分析、ＲＮＡ不純物の検出、または前述の２つ以上の任意の組み合わせを用いて達成することができる。「特性決定」には、例えば、ＲＮＡ転写産物配列の決定、ＲＮＡ転写産物の純度の決定、またはＲＮＡ転写産物の電荷不均一性の決定を含む。そのような方法は、例えば、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１４／１４４７１１号及び国際公開第ＷＯ２０１４／１４４７６７号に教示されている。
実施例２：キメラポリヌクレオチド合成
本開示によれば、三リン酸化学反応を用いて、キメラポリヌクレオチドの２つの領域または部分を連結またはライゲーションすることができる。１００ヌクレオチド以下の第１の領域または部分を、例えば、５’一リン酸及び末端の３’脱ＯＨまたはブロックＯＨと化学的に合成する。領域が８０ヌクレオチドより長い場合、それを２つの鎖として合成し、ライゲーションすることができる。
第１の領域または部分を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）を用いて、位置修飾のない領域または部分として合成する場合、５’一リン酸の転化とそれに続く３’末端のキャッピングを伴う場合がある。
一リン酸保護基は、当技術分野で既知のものからいずれかを選択することができる。
キメラポリヌクレオチドの第２の領域または部分は、化学合成法またはＩＶＴ法のいずれかを用いて合成することができる。ＩＶＴ法には、修飾キャップを有するプライマーを利用することができるＲＮＡポリメラーゼを含み得る。あるいは、最大１３０ヌクレオチドのキャップを化学的に合成し、ＩＶＴ領域または部分に連結することができる。
ライゲーション法の場合、ＤＮＡ Ｔ４リガーゼによるライゲーション後にＤＮａｓｅ処理することで、容易に連鎖が回避されるはずである。
キメラポリヌクレオチド全体が、リン酸−糖骨格で製造されている必要はない。領域または部分の１つがポリペプチドをコードする場合、そのような領域または部分がリン酸−糖骨格を含んでいてもよい。
次いで、任意の既知のクリックケミストリー、ｏｒｔｈｏｃｌｉｃｋケミストリー、ｓｏｌｕｌｉｎｋ、または当業者に既知の他のバイオコンジュゲート化学を使用してライゲーションを実施する。
合成経路
キメラポリヌクレオチドは、一連の出発セグメントを使用して作製することができる。そのようなセグメントとして、以下が挙げられる：
（ａ）通常の３’ＯＨを含む、キャップ付加して保護された５’セグメント（ＳＥＧ．１）
（ｂ）ポリペプチドのコード領域及び通常の３’ＯＨを含み得る、５’三リン酸セグメント（ＳＥＧ．２）
（ｃ）コルジセピンを含むかまたは３’ＯＨを含まない、キメラポリヌクレオチドの３’末端（例えば、尾部）に対する５’一リン酸セグメント（ＳＥＧ．３）
合成（化学的またはＩＶＴ）後、セグメント３（ＳＥＧ．３）はコルジセピンで処理され、次にピロホスファターゼで処理されて５’一リン酸を生成することができる。
その後、ＲＮＡリガーゼを使用して、セグメント２（ＳＥＧ．２）をＳＥＧ．３にライゲーションすることができる。次いで、ライゲーションしたポリヌクレオチドを精製し、ピロホスファターゼで処理して二リン酸を切断する。その後、処理したＳＥＧ．２−ＳＥＧ．３構築物を精製することができ、ＳＥＧ．１を５’末端にライゲーションする。キメラポリヌクレオチドの精製工程をさらに実施してもよい。
キメラポリヌクレオチドがポリペプチドをコードする場合、ライゲーションまたは連結されたセグメントは、５’ＵＴＲ（ＳＥＧ．１）、オープンリーディングフレームすなわちＯＲＦ（ＳＥＧ．２）、及び３’ＵＴＲ＋ポリＡ（ＳＥＧ．３）と表すことができる。
各工程の収率は、９０〜９５％程度であり得る。
実施例３：ＰＣＲによるｃＤＮＡ生成
ＰＣＲによりｃＤＮＡを調製する手順を、Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）による２ｘ ＫＡＰＡ ＨＩＦＩ（商標）ＨｏｔＳｔａｒｔ ＲｅａｄｙＭｉｘを使用して行うことができる。このシステムには、２ｘ ＫＡＰＡ ＲｅａｄｙＭｉｘ１２．５μＬ；フォワードプライマー（１０μＭ）０．７５μＬ；リバースプライマー（１０μＭ）０．７５μＬ；鋳型ｃＤＮＡ１００ｎｇ；及び２５．０μＬに希釈したｄＨ２Ｏを含む。反応条件は、９５℃、５分間であってよい。９８℃で２０秒間、次に５８℃で１５秒間、次に７２℃で４５秒間、次に７２℃で５分間、次に４℃で終了までの２５サイクルで、この反応を実施してもよい。
ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＰＵＲＥＬＩＮＫ（商標）ＰＣＲ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を製造業者の指示通りに（最大５μｇ）使用し、反応物を精製することができる。より大規模な反応には、容量の大きい製品を使用した精製が必要な場合がある。精製後、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）を使用してｃＤＮＡを定量し、アガロースゲル電気泳動によって分析して、ｃＤＮＡが予想サイズであることを確認することができる。次に、ｃＤＮＡを配列決定分析にかけた後、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応に進むことができる。
実施例４：ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応によりＲＮＡポリヌクレオチドを生成する。そのようなポリヌクレオチドには、化学修飾ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む、本開示のポリヌクレオチドの領域または部分を含み得る。化学修飾ＲＮＡポリヌクレオチドは、均一に修飾されたポリヌクレオチドであり得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応には、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）のカスタムミックスを利用する。ＮＴＰには、化学修飾ＮＴＰ、または天然ＮＴＰと化学修飾ＮＴＰの混合物、または天然ＮＴＰを含み得る。
一般的なｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応では、
１）１．０μｇの鋳型ｃＤＮＡ
２）２．０μｌの１０倍転写緩衝液
（４００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１９０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭスペルミジン）
３）０．２μＬのカスタムＮＴＰ（各２５ｍＭ）
４）２０ＵのＲＮａｓｅ阻害剤
５）３０００ＵのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ
６）最大２０．０μｌのｄＨ２Ｏを加え、
７）３７℃で３時間〜５時間インキュベートする。
ＩＶＴの粗混合物は、４℃で一晩保存し、翌日に精製してもよい。その後、１ＵのＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅを使用して、元の鋳型を消化することができる。３７℃で１５分間インキュベートした後、製造業者の指示に従ってＡｍｂｉｏｎのＭＥＧＡＣＬＥＡＲ（商標）Ｋｉｔ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を使用してｍＲＮＡを精製することができる。このキットは最大５００μｇのＲＮＡを精製することができる。精製後、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）を使用してＲＮＡポリヌクレオチドを定量し、アガロースゲル電気泳動によって分析し、ＲＮＡポリヌクレオチドが適切なサイズであり、ＲＮＡの分解が生じていないことを確認することができる。
実施例５：酵素によるキャッピング
ＲＮＡポリヌクレオチドのキャッピングを以下の通り実施する。ここで、混合物は６０μｇ〜１８０μｇのＩＶＴ ＲＮＡ及び最大７２μｌのｄＨ２０を含む。混合物を６５℃で５分間インキュベートしてＲＮＡを変性させた後、直ちに氷に移す。
次に、プロトコルには、１０倍キャッピング緩衝液（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６０ｍＭ ＫＣｌ、１２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２）（１０．０μｌ）；２０ｍＭ ＧＴＰ（５．０μｌ）；２０ｍＭ Ｓ−アデノシルメチオニン（２．５μｌ）；ＲＮａｓｅ阻害剤（１００Ｕ）；２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（４００Ｕ）；ワクシニアキャッピング酵素（グアニリルトランスフェラーゼ）（４０Ｕ）；ｄＨ２０（最大２８μＬ）の混合物を含み、ＲＮＡが６０μｇの場合は３７℃で３０分間、またはＲＮＡが１８０μｇの場合は最大２時間のインキュベーションを要する。
製造業者の指示に従ってＡｍｂｉｏｎのＭＥＧＡＣＬＥＡＲ（商標）Ｋｉｔ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を使用してＲＮＡポリヌクレオチドを精製することができる。精製後、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用してＲＮＡを定量し、アガロースゲル電気泳動によって分析し、ＲＮＡポリヌクレオチドが適切なサイズであり、ＲＮＡの分解が生じていないことを確認することができる。ＲＮＡポリヌクレオチド産物はまた、逆転写ＰＣＲを実行して、配列決定のためのｃＤＮＡを生成することにより配列決定することができる。
実施例６：ポリＡテーリング反応
ｃＤＮＡにポリＴがない場合、最終産物を精製する前にポリＡテーリング反応を実施しなければならない。この反応は、キャップ付加ＩＶＴ ＲＮＡ（１００μｌ）；ＲＮａｓｅ阻害剤（２０Ｕ）；１０倍テーリング緩衝液（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２．５Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２）（１２．０μｌ）；２０ｍＭ ＡＴＰ（６．０μｌ）；ポリＡポリメラーゼ（２０Ｕ）；最大１２３．５μlのｄＨ２Ｏを混合し、３７℃で３０分間インキュベートすることにより実施する。転写産物にポリＡ尾部が既に存在する場合、テーリング反応をスキップして、直ちにＡｍｂｉｏｎのＭＥＧＡＣＬＥＡＲ（商標）キット（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）（最大５００μｇ）による精製に進んでよい。ポリＡポリメラーゼは、酵母で発現される組換え酵素であってもよい。
ポリＡテーリング反応の進行性または完全性によっては、必ずしも正確なサイズのポリＡ尾部が得られない場合があることに留意されたい。したがって、約４０〜２００、例えば、約４０、５０、６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１５０〜１６５、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、または１６５ヌクレオチドのポリＡ尾部が本開示の範囲内である。
実施例７：天然の５’キャップ及び５’キャップ類似体
化学的ＲＮＡキャップ類似体、すなわち３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ［ＡＲＣＡキャップ］；Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ；Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ；ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ；ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用し、製造業者のプロトコルに従ってｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応と同時にポリヌクレオチドの５’キャッピングを完了することで５’グアノシンキャップ構造を生成することができる。ワクシニアウイルスキャッピング酵素を使用して、修飾ＲＮＡの５’キャッピングを転写後に完了させ、「Ｃａｐ０」構造：ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を生成することができる。ワクシニアウイルスキャッピング酵素と２’−Ｏメチルトランスフェラーゼの両方を使用して、Ｃａｐ１構造：ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ−２’−Ｏ−メチルを生成することができる。Ｃａｐ１構造に続いて、２’−Ｏ−メチル−トランスフェラーゼを使用して、５’末端から３番目のヌクレオチドを２’−Ｏ−メチル化することによりＣａｐ２構造を生成することができる。Ｃａｐ２構造に続いて、２’−Ｏ−メチル−トランスフェラーゼを使用して、５’末端から４番目のヌクレオチドを２’−Ｏ−メチル化することによりＣａｐ３構造を生成することができる。好ましくは、酵素は組換え供給源に由来する。
哺乳動物細胞にトランスフェクトした場合、修飾ｍＲＮＡは、１２〜１８時間または１８時間超、例えば２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、または７２時間超の安定性を有する。
実施例８：キャッピングアッセイ
タンパク質発現アッセイ
本明細書で教示されるキャップのいずれかを含む、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、等しい濃度で細胞にトランスフェクトすることができる。培養培地に分泌されるタンパク質の量は、トランスフェクションの６時間後、１２時間後、２４時間後、及び／または３６時間後にＥＬＩＳＡによってアッセイすることができる。高レベルのタンパク質が培地に分泌する合成ポリヌクレオチドは、翻訳能力の高いキャップ構造を有する合成ポリヌクレオチドであることを意味する。
純度分析合成
本明細書で教示されるキャップのいずれかを含む、ポリペプチドをコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドの純度を、変性アガロース−尿素ゲル電気泳動またはＨＰＬＣ分析を使用して比較することができる。電気泳動により、一つに集約されたバンドを有するＲＮＡポリヌクレオチドは、複数のバンドまたは縞状バンドを有するポリヌクレオチドと比較して高純度の産物であることを意味する。単一のＨＰＬＣピークを有する化学修飾ＲＮＡポリヌクレオチドもまた、高純度の産物であることを意味する。キャッピング反応の効率が高いほど、純粋なポリヌクレオチド集団が得られる。
サイトカイン分析
本明細書で教示されるキャップのいずれかを含む、ポリペプチドをコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドは、複数の濃度で細胞にトランスフェクトすることができる。培養培地に分泌される、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−βなどの炎症性サイトカインの量は、トランスフェクションの６時間後、１２時間後、２４時間後、及び／または３６時間後にＥＬＩＳＡによってアッセイすることができる。培地に分泌される炎症性サイトカインのレベルが高いＲＮＡポリヌクレオチドは、免疫活性化キャップ構造を含むポリヌクレオチドであることを意味する。
キャッピング反応の効率
本明細書で教示されるキャップのいずれかを含む、ポリペプチドをコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドのキャッピング反応効率を、ヌクレアーゼ処理後のＬＣ−ＭＳによって分析することができる。キャップ付加ポリヌクレオチドのヌクレアーゼ処理により、ＬＣ−ＭＳによって検出可能な、遊離ヌクレオチドとキャップ付加５’−５−三リン酸キャップ構造の混合物が得られる。ＬＣ−ＭＳスペクトル上でのキャップ付加産物の量は、反応で生じる全ポリヌクレオチドに占めるパーセント比で表すことができ、これがキャッピング反応効率に相当する。キャッピング反応効率が高いキャップ構造は、ＬＣ−ＭＳによるキャップ付加産物の量が多い。
実施例９：修飾ＲＮＡまたはＲＴ ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動
製造業者のプロトコルに従って、非変性１．２％アガロースＥ−ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のウェルに個々のＲＮＡポリヌクレオチド（２０μl容積中２００〜４００ｎｇ）または逆転写ＰＣＲ産物（２００〜４００ｎｇ）をロードし、１２〜１５分間泳動させることができる。
実施例１０：ＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）による修飾ＲＮＡの定量及びＵＶスペクトルデータ
ＴＥ緩衝液（１μl）中の化学修飾ＲＮＡポリヌクレオチドを使用してＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）のＵＶ吸光度を読み取り、化学合成またはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応から得た各ポリヌクレオチドの収量を定量化する。
実施例１１：リピドイドを使用した修飾ｍＲＮＡの製剤化
ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドとリピドイドを細胞に添加する前に設定比で混合することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験用に製剤化することができる。ｉｎ ｖｉｖｏ製剤には、全身の循環を促進するために追加成分の添加を必要とする場合がある。ｉｎ ｖｉｖｏ作用に適した粒子を形成するリピドイドの能力を試験するには、ｓｉＲＮＡ−リピドイド製剤に使用される標準的な製剤プロセスを起点として使用することができる。粒子の形成後、ポリヌクレオチドを添加し、複合体と融合させる。封入効率は、標準的な色素排除アッセイを用いて決定する。
実施例１２：マウス免疫原性試験
ＨＡステム抗原の比較
本実施例では、ｍＲＮＡ／ＬＮＰプラットフォームを使用して送達されたインフルエンザウイルスワクチン抗原に対する免疫応答を、タンパク質抗原と比較して評価するアッセイを実施した。本試験では、異なるインフルエンザウイルス株から得られたＨＡステムタンパク質をコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む候補インフルエンザウイルスワクチンのマウスにおける免疫原性を試験することを目的とした。試験した動物は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスであった。試験ワクチンには、ＭＣ３ ＬＮＰで製剤化された以下のｍＲＮＡを含めた：Ｈ１／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４（Ｍａｌｌａｊｏｓｙｕｌａ Ｖ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ２０１４ Ｊｕｎ ２４；１１１（２５）：Ｅ２５１４−２３に基づく）のステム、Ｈ１／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９（Ｍａｌｌａｊｏｓｙｕｌａ Ｖ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ２０１４ Ｊｕｎ ２４；１１１（２５）：Ｅ２５１４−２３に基づく）のステム、Ｈ１／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｍａｌｌａｊｏｓｙｕｌａ Ｖ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ２０１４ Ｊｕｎ ２４；１１１（２５）：Ｅ２５１４−２３に基づく）のステム、Ｈ５／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｍａｌｌａｊｏｓｙｕｌａ Ｖ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ２０１４ Ｊｕｎ ２４；１１１（２５）：Ｅ２５１４−２３に基づく）のステム、Ｈ１０／Ｊｉａｎｇｘｉ−Ｄｏｎｇｈｕ／３４６／２０１３のステム、及び完全長Ｈ１０／Ｊｉａｎｇｘｉ−Ｄｏｎｇｈｕ／３４６／２０１３。
本試験で試験されたタンパク質ワクチンには、Ｍａｌｌａｊｏｓｙｕｌａ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１４；１１１（２５）：Ｅ２５１４−２３に記載のｐＨ１ＨＡ１０−Ｆｏｌｄｏｎタンパク質が含まれていた。追加対照として、ＭＣ３（ＬＮＰの効果を求めるための対照）及びＰＲ８インフルエンザウイルスを加えた。
容積２０μＬを鼻腔内に送達したＰＲ８インフルエンザウイルス対照の投与を除いて、各試験ワクチンを全容積１００μＬで、すなわち５０μＬの免疫注射を各四頭筋に投与してマウスを筋肉内免疫した。その間、動物はケタミンとキシラジンとの混合物で鎮静させた。ワクチン投与量を併記した各試験ワクチンの群番号を以下の表にまとめる：
０週目及び３週目に種々のインフルエンザウイルスＲＮＡワクチン製剤を２回投与してマウスを免疫し、２回目の投与による免疫から２週間後に血清を採取した。
広範囲のインフルエンザ株由来のヘマグルチニン（ＨＡ）に結合できる抗体の存在について血清を試験するにあたり、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．から入手した以下の組換えＨＡ１００ｎｇでＥＬＩＳＡプレートをコーティングした：インフルエンザＡ Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９）、カタログ番号１１６８３−Ｖ０８Ｈ；インフルエンザＡ Ｈ３Ｎ２（Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８）、カタログ番号１１７０７−Ｖ０８Ｈ；インフルエンザＡ Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９）、カタログ番号１１０５５−Ｖ０８Ｈ；インフルエンザＡ Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４）、カタログ番号１１６８４−Ｖ０８Ｈ；インフルエンザＡ Ｈ３Ｎ２（Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７）、カタログ番号１１０５６−Ｖ０８Ｈ；インフルエンザＡ Ｈ２Ｎ２（Ａ／Ｊａｐａｎ／３０５／１９５７）、カタログ番号１１０８８−Ｖ０８Ｈ；インフルエンザＡ Ｈ７Ｎ９（Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３）、カタログ番号４０１０３−Ｖ０８Ｈ；インフルエンザＨ５Ｎ１（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４）、カタログ番号１１０６２−Ｖ０８Ｈ１；インフルエンザＨ９Ｎ２（Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１０７３／９９）、カタログ番号１１２２９−Ｖ０８Ｈ、及びインフルエンザＡ Ｈ１０Ｎ８（Ａ／Ｊｉａｎｇｘｉ−Ｄｏｎｇｈｕ／３４６／２０１３）、カタログ番号４０３５９−Ｖ０８Ｂ。コーティング後、プレートを洗浄し、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）＋３％ミルクを加えたリン酸緩衝生理食塩水でブロックし、免疫マウスから得た１００μＬの対照抗体または血清（ＰＢＳＴ＋３％ミルクで希釈）を各プレートの上部ウェルに添加し、段階希釈した。プレートを密封し、室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰコンジュゲート（Ｎｏｖｅｘ、ＰＢＳＴ／３％ミルクで１：２０００に希釈）を、マウス血清を入れた各ウェルに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートし、洗浄して、ＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とインキュベートした。１０分間、発色させた後、１００μＬの２Ｎ硫酸でクエンチした。マイクロプレートリーダーでプレートの４５０ｎＭの吸光度を読み取った。エンドポイント力価（バックグラウンドの２．５倍高）を算出した。
図１では、ｙ軸上に試験されたワクチンを示し、異なるインフルエンザ株それぞれに由来するＨＡに対するエンドポイント力価をプロットしている。第１群（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ９）のインフルエンザ株由来のＨＡを黒丸で示し、第２群（Ｈ３、Ｈ７、Ｈ１０）のインフルエンザ株由来のＨＡは白丸で示している。図１は、ＭＣ３脂質ナノ粒子に封入された、ＨＡ系の抗原をコードするｍＲＮＡを用いたワクチンがＨＡに対して高い抗体結合価を誘導することを示している。図１はまた、異なるインフルエンザＨ１Ｎ１株またはＨ５Ｎ１株由来のステムドメイン部分を発現するように設計されたｍＲＮＡワクチンが、試験した第１群ＨＡのすべての株に加え、第２群のいくつかの株に結合することができる高抗体価を誘発したことを示している。図１はまた、Ｈ１Ｎ１ Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９のステムドメイン部分を発現するように設計されたｍＲＮＡワクチンが、同じステムドメインのタンパク質ワクチンよりも高い抗体価を誘導したことを示している。
別のマウス免疫原性試験では、ｍＲＮＡ／ＬＮＰプラットフォームを使用して送達された追加のインフルエンザウイルスワクチン抗原に対する免疫応答を評価した。この試験の目的は、第２組のｍＲＮＡワクチン抗原が交差防御免疫応答をマウスに誘発する能力を評価することと、共投与されるインフルエンザＨＡ抗原をコードするｍＲＮＡワクチンの可能性を評価することであった。試験した動物は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスであった。試験ワクチンには、ＭＣ３ ＬＮＰで製剤化された以下のｍＲＮＡを含めた：Ｈ１ＨＡ６（Ｂｏｍｍａｋａｎｔｉ Ｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１２ Ｄｅｃ；８６（２４）：１３４３４−４４に基づく）；Ｈ３ＨＡ６（Ｂｏｍｍａｋａｎｔｉ Ｇ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ２０１０ Ａｕｇ ３；１０７（３１）：１３７０１−６に基づく）；Ｈ１ＨＡ１０−Ｆｏｌｄｏｎ＿ｄｅｌｔａ Ｎｇｌｙ；ｅＨ１ＨＡ（Ｈ１Ｎ１ Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４由来ＨＡのエクトドメイン）；ｅＨ１ＨＡ＿天然シグナル配列（天然シグナル配列を有するｅＨ１ＨＡ）；Ｈ３Ｎ２ Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５ステム；Ｈ３Ｎ２ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８ステム（Ｍａｌｌａｊｏｓｙｕｌａ Ｖ ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５ Ｊｕｎ ２６；６：３２９に基づく）；Ｈ７Ｎ９ Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３ステム；Ｈ１Ｎ１ Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９ステムＲＮＡ（Ｍａｌｌａｊｏｓｙｕｌａ Ｖ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ２０１４ Ｊｕｎ ２４；１１１（２５）：Ｅ２５１４−２３に基づく）；及びＨ１Ｎ１ Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４ステムＲＮＡ（Ｍａｌｌａｊｏｓｙｕｌａ Ｖ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ２０１４ Ｊｕｎ ２４；１１１（２５）：Ｅ２５１４−２３に基づく）。
対照として、ＭＣ３（ＬＮＰの効果を求めるための対照）；未感作（非ワクチン接種動物）；及びＨ１Ｎ１ Ａ／ＰＲ／８／３４及びＨ３Ｎ２ Ａ／ＨＫ／１／６８インフルエンザウイルスによるワクチン接種（陽性対照）を加えた。
容積２０μＬを鼻腔内に送達したＨ１Ｎ１ Ａ／ＰＲ／８／３４及びＨ３Ｎ２ Ａ／ＨＫ／１／６８ウイルスのインフルエンザウイルス対照の投与を除いて、各試験ワクチンを全容積１００μＬで、すなわち５０μＬの免疫注射を各四頭筋に投与してマウスを筋肉内免疫した。その間、動物はケタミンとキシラジンとの混合物で鎮静させた。ワクチン投与量を併記した各試験ワクチンの群番号を以下の表にまとめる：
試験開始日に動物を免疫し、最初の免疫から３週間後に再度免疫した。２回目の投与の２週間後に動物から血清を採取した。広範囲のインフルエンザ株由来のヘマグルチニン（ＨＡ）に結合できる抗体の存在について血清を試験するにあたり、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．から入手した以下の組換えＨＡ１００ｎｇでＥＬＩＳＡプレートをコーティングした：インフルエンザＡ Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９）、カタログ番号１１６８３−Ｖ０８Ｈ；インフルエンザＡ Ｈ３Ｎ２（Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８）、カタログ番号１１７０７−Ｖ０８Ｈ；インフルエンザＡ Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９）、カタログ番号１１０５５−Ｖ０８Ｈ；インフルエンザＡ Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４）、カタログ番号１１６８４−Ｖ０８Ｈ；インフルエンザＡ Ｈ３Ｎ２（Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７）、カタログ番号１１０５６−Ｖ０８Ｈ；インフルエンザＡ Ｈ２Ｎ２（Ａ／Ｊａｐａｎ／３０５／１９５７）、カタログ番号１１０８８−Ｖ０８Ｈ；インフルエンザＡ Ｈ７Ｎ９（Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３）、カタログ番号４０１０３−Ｖ０８Ｈ、及びインフルエンザＡ Ｈ３Ｎ２（Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／９９）、カタログ番号４０１５４−Ｖ０８。ＥＬＩＳＡアッセイを実施し、エンドポイント力価を上記のように算出した。図２及び図３は、試験ワクチンによる２回目の免疫後のエンドポイント抗ＨＡ抗体価を示している。ｘ軸上に試験されたワクチンを示し、異なるインフルエンザ株それぞれに由来するＨＡへの結合をプロットしている。ＨＡステムをコードするｍＲＮＡワクチンはすべて免疫原性であり、一連の多様なＡ型インフルエンザウイルス株由来のＨＡを認識する強力な抗体応答を誘発した。第１群ＨＡのパネル全体ではＨ１ＨＡ６、ｅＨ１ＨＡ、及びｅＨ１ＨＡ＿天然シグナル配列のｍＲＮＡが最大の総結合価を誘発したが、第２群Ｈａ全体ではＨ３ＨＡ６ ＲＮＡが最大の総結合価を誘発した（図２）。ステムｍＲＮＡワクチンの組み合わせの免疫原性もまた試験した。本試験では、個々のｍＲＮＡを混合した後、ＬＮＰで製剤化したか（第９群、合剤）、または個々のｍＲＮＡをＬＮＰで製剤化した後、混合した（第１０群、混合形態）。図３に示すように、Ｈ１とＨ３ステム系のｍＲＮＡを組み合わせても、製剤方法を問わず、いずれの抗原に対しても免疫応答の干渉が生じなかった。
実施例１３：マウス効果試験
Ａ型インフルエンザ攻撃接種＃１
本試験では、候補インフルエンザウイルスワクチンのマウスにおける免疫原性及び効果を試験することを目的とした。試験した動物は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスであった。試験ワクチンには、ＭＣ３ ＬＮＰで製剤化された以下のｍＲＮＡを含めた：ＮＩＨＧｅｎ６ＨＡＳＳ−ｆｏｌｄｏｎ ｍＲＮＡ（Ｙａｓｓｉｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２０１５ Ｓｅｐ；２１（９）：１０６５−７０に基づく）、ならびにＨ３Ｎ２株由来の核タンパク質ＮＰをコードするｍＲＮＡ、またはＮＩＨＧｅｎ６ＨＡＳＳ−ｆｏｌｄｏｎ ｍＲＮＡ及びＮＰ ｍＲＮＡのいくつかの組み合わせの１つ。ワクチン抗原の同時送達方法を複数試験したが、それには、ＬＮＰによる製剤化前に個々のｍＲＮＡを混合する方法（合剤）、混合前に個々のｍＲＮＡを製剤化する方法（個別ＬＮＰ混合）、及び個々にｍＲＮＡを製剤化して遠位部位（反対側の下肢）に注射する方法（個別ＬＮＰ遠位）を含む。対照動物には、Ｈ１Ｎ１ Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４（ｅＨ１ＨＡ、陽性対照）由来のＨＡのエクトドメインをコードするＲＮＡ、または空のＭＣ３ ＬＮＰ（ＬＮＰの効果を求めるための対照）をワクチン接種するか、またはワクチン接種しなかった（未感作）。
０週目及び３週目に、各試験ワクチンを全容積１００μＬで、すなわち５０μＬの免疫注射を各四頭筋に投与して動物を筋肉内（ＩＭ）免疫した。本試験で評価した候補インフルエンザウイルスワクチンは上記の通りであった。これを以下の表にまとめる。２回目の投与の２週間後に全動物から血清を採取した。６週目に、動物の一部（ｎ＝４）から脾臓を採取した。残りの動物（ｎ＝６）は、ケタミンとキシラジンとの混合物で鎮静させながら、致死量のマウス適合インフルエンザウイルス株Ｈ１Ｎ１ Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４を鼻腔内に攻撃接種した。死亡率を記録し、個々のマウスの体重を感染後２０日間毎日測定した。
広範囲のインフルエンザ株由来のヘマグルチニン（ＨＡ）または核タンパク質（ＮＰ）に結合できる抗体の存在について血清を試験するにあたり、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．から入手した以下の組換えタンパク質１００ｎｇでＥＬＩＳＡプレートをコーティングした：インフルエンザＡ Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９）ＨＡ、カタログ番号１１６８３−Ｖ０８Ｈ；インフルエンザＡ Ｈ３Ｎ２（Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８）ＨＡ、カタログ番号１１７０７−Ｖ０８Ｈ；インフルエンザＡ Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９）ＨＡ、カタログ番号１１０５５−Ｖ０８Ｈ；インフルエンザＡ Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４）ＨＡ、カタログ番号１１６８４−Ｖ０８Ｈ；インフルエンザＡ Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７）ＨＡ、カタログ番号１１０５２−Ｖ０８Ｈ；インフルエンザＡ Ｈ２Ｎ２（Ａ／Ｊａｐａｎ／３０５／１９５７）ＨＡ、カタログ番号１１０８８−Ｖ０８Ｈ；インフルエンザＡ Ｈ７Ｎ９（Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３）ＨＡ、カタログ番号４０１０３−Ｖ０８Ｈ、インフルエンザＡ Ｈ３Ｎ２（Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／９９）ＨＡ、カタログ番号４０１５４−Ｖ０８、及びインフルエンザＡ Ｈ３Ｎ２（Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８）核タンパク質、カタログ番号４０２０７−Ｖ０８Ｂ。ＥＬＩＳＡアッセイを実施し、エンドポイント力価を上記のように算出した。図４は、試験ワクチンでワクチン接種された動物からのプールされた血清のエンドポイント力価を示す。図４Ａのｘ軸上に試験されたワクチンを示し、異なるインフルエンザ株それぞれに由来するＨＡへの結合をプロットしている。ＮＩＨＧｅｎ６ＨＡＳＳ−ｆｏｌｄｏｎ ｍＲＮＡワクチンは、試験したＨ１、Ｈ２、及びＨ７のＨＡすべてに結合する高抗体価を誘発した。ＮＩＨＧｅｎ６ＨＡＳＳ−ｆｏｌｄｏｎ ｍＲＮＡとＮＰをコードするｍＲＮＡとを組み合わせても、ｍＲＮＡの合剤方法または同時送達方法を問わず、抗ＨＡ応答への悪影響は観察されなかった。個々の試験の同一群から採取した血清では、ＮＰ単独、またはＮＩＨＧｅｎ６ＨＡＳＳ−ｆｏｌｄｏｎ ｍＲＮＡとの合剤いずれの場合も、ＮＰ ｍＲＮＡ含有ワクチンを接種した動物の血清においてＮＰタンパク質に対する強力な抗体応答が検出された（図４Ｂ）。
機能的抗体応答を調べるために、ＨＡ偽型ウイルスのパネルを中和する血清の能力を評価した（図５）。簡潔には、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、ヒト気道セリンプロテアーゼをコードする発現ベクター、ならびにインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質をコードする発現ベクターを含む複製欠損レトロウイルスベクターと２９３細胞を同時トランスフェクトした。得られた偽ウイルスを培養上清から採取し、ろ過して滴定した。血清の段階希釈物を９６ウェルプレート中で、偽ウイルス株（１ウェルあたり３０，０００〜３００，０００相対発光量）と３７℃で１時間インキュベートした後、各ウェルに２９３細胞を添加した。培養物を３７℃で７２時間インキュベートし、ルシフェラーゼ基質及び細胞溶解試薬を添加し、ルミノメーターで相対発光量（ＲＬＵ）を測定した。中和価は、偽ウイルス感染の５０％を阻害する血清希釈（ＩＣ５０）の逆数で表される。
試験した各サンプル（ｘ軸方向に記載）に関して、各バーは異なるウイルスの偽型を中和するＩＣ５０を表す。未感作マウスまたはＮＰ ＲＮＡワクチン接種マウスからの血清は偽ウイルス感染を阻害できなかったが、１０μｇもしくは５μｇのＮＩＨＧｅｎ６ＨＡＳＳ−ｆｏｌｄｏｎ ｍＲＮＡ、またはＮＩＨＧｅｎ６ＨＡＳＳ−ｆｏｌｄｏｎ ｍＲＮＡとＮＰ ｍＲＮＡの組み合わせでワクチン接種したマウスの血清は、試験されたＨ１及びＨ５ウイルスの偽型をすべて同程度に中和した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）代用活性を媒介するＮＩＨＧｅｎ６ＨＡＳＳ−ｆｏｌｄｏｎ抗血清の能力も評価した。簡潔には、連続滴定したマウス血清サンプルを、Ｈ１Ｎ１ Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４由来のＨＡを細胞表面で安定的に発現するＡ５４９細胞とインキュベートした。続いて、ＡＤＣＣバイオアッセイエフェクター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ、マウスＦｃｇＲＩＶ ＮＦＡＴ−Ｌｕｃエフェクター細胞）を血清／標的細胞混合物に添加した。約６時間後、Ｂｉｏ−ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）をサンプルウェルに加え、発光を測定した。血清濃度に対する誘導倍率（サンプルの発光量／バックグラウンドの発光量）のデータをプロットした（図６）。適切な標的細胞とインキュベートしたとき、ＮＩＨＧｅｎ６ＨＡＳＳ−ｆｏｌｄｏｎ ｍＲＮＡワクチン接種マウスからの血清は、代用ＡＤＣＣエフェクター細胞系を刺激することができたが、これは、このワクチンがｉｎ ｖｉｖｏのＡＤＣＣ活性を媒介できる抗体を誘導し得ることを示唆している。
第２のワクチン投与量の投与から３週間後、各群の動物の一部から脾臓を採取し、その同じ群の動物からの脾細胞をプールした。脾臓リンパ球をＨＡペプチドまたはＮＰペプチドのプールで刺激し、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、またはＴＮＦ−αの産生を細胞内染色及びフローサイトメトリーによって測定した。図７は、ＮＰペプチドのプールで刺激後の応答を示す図であり、図８は、Ｈ１ ＨＡペプチドのプールで刺激後の応答を示す図である。ＮＩＨＧｅｎ６ＨＡＳＳ−ｆｏｌｄｏｎ ｍＲＮＡの存在下または非存在下でのＮＰ ｍＲＮＡによるワクチン接種後、脾臓に抗原特異的ＣＤ４ Ｔ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞が見られた。ＮＩＨＧｅｎ６ＨＡＳＳ−ｆｏｌｄｏｎ ＲＮＡによるワクチン接種後またはＮＩＨＧｅｎ６ＨＡＳＳ−ｆｏｌｄｏｎ ＲＮＡ及びＮＰ ＲＮＡの遠位注射部位（遠位部位）への送達後、ＨＡ特異的ＣＤ４細胞のみが観察された。しかし、ＮＩＨＧｅｎ６ＨＡＳＳ−ｆｏｌｄｏｎ ＲＮＡ及びＮＰ ＲＮＡを同じ注射部位に共投与（合剤、混合）すると、ＨＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答が検出された。
マウス適合Ｈ１Ｎ１ Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４による致死的攻撃接種後、未感作動物はすべて感染後１２日目までに感染により死亡した（図９）。対照的に、ＮＩＨＧｅｎ６ＨＡＳＳ−ｆｏｌｄｏｎ ｍＲＮＡ、ＮＰ ｍＲＮＡ、ＮＩＨＧｅｎ６ＨＡＳＳ−ｆｏｌｄｏｎ ｍＲＮＡとＮＰ ｍＲＮＡの任意の組み合わせ、またはｅＨ１ＨＡ ｍＲＮＡでワクチン接種された動物はすべて攻撃接種後も生存した。図９で明らかなように、Ｈ３Ｎ２ ＮＰ ｍＲＮＡをワクチン接種し、Ｈ１Ｎ１ウイルスを攻撃接種したマウスは、死亡しなかったものの、回復までに体重量が大幅に減少した（約１５％）。ＮＩＨＧｅｎ６ＨＡＳＳ−ｆｏｌｄｏｎ ＲＮＡでワクチン接種したマウスも約５％体重が減少した。対照的に、ＮＩＨＧｅｎ６ＨＡＳＳ−ｆｏｌｄｏｎ ｍＲＮＡとＮＰ ｍＲＮＡの組み合わせでワクチン接種したマウスは、攻撃ウイルス（ｅＨ１ＨＡ）の抗原と相同なＨＡ抗原を発現するｍＲＮＡでワクチン接種したマウス同様、致死的インフルエンザウイルスの攻撃接種から完全に防御されると思われた。評価されたすべてのワクチン投与量、ならびにすべての合剤方法及び同時送達方法でワクチン効果が類似していた（図１０）。
Ａ型インフルエンザ攻撃接種＃２
本試験では、候補インフルエンザウイルスワクチンのマウスにおける免疫原性及び効果を試験することを目的とした。試験した動物は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスであった。試験ワクチンには、ＭＣ３ ＬＮＰで製剤化された以下のｍＲＮＡを含めた：ＮＩＨＧｅｎ６ＨＡＳＳ−ｆｏｌｄｏｎ ｍＲＮＡ（Ｙａｓｓｉｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２０１５ Ｓｅｐ；２１（９）：１０６５−７０に基づく）及びＮＩＨＧｅｎ６ＨＡＳＳ−ＴＭ２ ｍＲＮＡ。対照動物には、Ｈ１Ｎ１ Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４（ｅＨ１ＨＡ、陽性対照）由来のＨＡのエクトドメインをコードするｍＲＮＡをワクチン接種するか、またはワクチン接種しなかった（未感作）。
０週目及び３週目に、各試験ワクチンを全容積１００μＬで、すなわち５０μＬの免疫注射を各四頭筋に投与して動物を筋肉内（ＩＭ）免疫した。本試験で評価した候補インフルエンザウイルスワクチンは上記の通りであった。これを以下の表にまとめる。２回目の投与の２週間後に全動物から血清を採取した。６週目に、ケタミンとキシラジンとの混合物で鎮静させながら、致死量のマウス適合インフルエンザウイルス株Ｈ１Ｎ１ Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４を全動物の鼻腔内に攻撃接種した。死亡率を記録し、マウス群の体重を感染後２０日間毎日測定した。
広範囲のインフルエンザ株由来のヘマグルチニン（ＨＡ）に結合できる抗体の存在について血清を試験するにあたり、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．から入手した以下の組換えＨＡ１００ｎｇでＥＬＩＳＡプレートをコーティングした：インフルエンザＡ Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９）、カタログ番号１１６８３−Ｖ０８Ｈ；インフルエンザＡ Ｈ３Ｎ２（Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８）、カタログ番号１１７０７−Ｖ０８Ｈ；インフルエンザＡ Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９）、カタログ番号１１０５５−Ｖ０８Ｈ；インフルエンザＡ Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４）、カタログ番号１１６８４−Ｖ０８Ｈ；インフルエンザＡ Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７）、カタログ番号１１０５２−Ｖ０８Ｈ；インフルエンザＡ Ｈ２Ｎ２（Ａ／Ｊａｐａｎ／３０５／１９５７）、カタログ番号１１０８８−Ｖ０８Ｈ；インフルエンザＡ Ｈ７Ｎ９（Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３）、カタログ番号４０１０３−Ｖ０８Ｈ、及びインフルエンザＡ Ｈ３Ｎ２（Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／９９）、カタログ番号４０１５４−Ｖ０８。ＥＬＩＳＡアッセイを実施し、エンドポイント力価を上記のように算出した。図１１Ａは、試験ワクチンでワクチン接種された動物からのプールされた血清のエンドポイント力価を示す。ｘ軸上に試験されたワクチンを示し、異なるインフルエンザ株それぞれに由来するＨＡへの結合をプロットしている。ＮＩＨＧｅｎ６ＨＡＳＳ−ｆｏｌｄｏｎ ｍＲＮＡワクチンは、試験したＨ１、Ｈ２、及びＨ７のＨＡすべてに結合する高抗体価を誘発した。ＮＩＨＧｅｎ６ＨＡＳＳ−ＴＭ２ ｍＲＮＡワクチン接種マウスからの結合抗体価は、ＮＩＨＧｅｎ６ＨＡＳＳ−ｆｏｌｄｏｎ ｍＲＮＡワクチン接種マウスからのものと比較して減少した。
マウス適合Ｈ１Ｎ１ Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４による致死的攻撃接種後、未感作動物はすべて感染後１６日目までに感染により死亡した（図１１Ｂ）。対照的に、ＮＩＨＧｅｎ６ＨＡＳＳ−ｆｏｌｄｏｎ ｍＲＮＡ、ＮＩＨＧｅｎ６ＨＡＳＳ−ＴＭ２ ｍＲＮＡ、またはｅＨ１ＨＡ ＲＮＡでワクチン接種された動物はすべて攻撃接種後も生存した。図１１Ｂに示すように、ＮＩＨＧｅｎ６ＨＡＳＳ−ＴＭ２ワクチンの効果は、ＮＩＨＧｅｎ６ＨＡＳＳ−ｆｏｌｄｏｎワクチンの効果と同等であった。
Ａ型インフルエンザ攻撃接種＃３
本実施例では、ｍＲＮＡ／ＬＮＰプラットフォームを使用して送達されたインフルエンザウイルスのコンセンサスヘマグルチニン（ＨＡ）ワクチン抗原に対する免疫応答を評価する２つの動物試験及びアッセイを実施した。この試験の目的は、コンセンサスＨＡ ｍＲＮＡワクチン抗原が交差防御免疫応答をマウスに誘発する能力を評価することであった。
コンセンサスＨＡ配列を作製するために、ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｌｕｄｂ．ｏｒｇ経由で、ＮＩＡＩＤ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＩＲＤ）（Ｓｑｕｉｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｏｔｈｅｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ．２０１２ Ｎｏｖ；６（６）：４０４−４１６．）から２４１５個のＡ型インフルエンザ血清型Ｈ１ ＨＡ配列を入手した。重複配列及び実験室株の排除後、パンデミック性Ｈ１Ｎ１株（ｐＨ１Ｎ１）由来のＨ１配列１７３５個及び季節性Ｈ１Ｎ１株（ｓＨ１Ｎ１）由来６５０個を含む２３８５個のエントリーが残った。パンデミック性Ｈ１配列と季節性Ｈ１配列を別々にアライメントし、Ｍａｔｌａｂ ９．０ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓツールボックス（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）を使用して、群ごとにコンセンサス配列を生成した。改変したＳｅｑ２Ｌｏｇｏプログラム（Ｔｈｏｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１２ Ｊｕｌ；４０（Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒ ｉｓｓｕｅ）：Ｗ２８１−７）を使用して、両群について個別に配列プロファイルを作成した。
試験した動物は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスであった。試験ワクチンには、ＭＣ３ ＬＮＰで製剤化された以下のｍＲＮＡを含めた：ＣｏｎＨ１及びＣｏｎＨ３（Ｗｅｂｂｙ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１５ Ｏｃｔ １５；１０（１０）：ｅ０１４０７０２．に基づく）；Ｃｏｂｒａ＿Ｐ１及びＣｏｂｒａ＿Ｘ３（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１６ Ａｐｒ １４；９０（９）：４７２０−３４に基づく）；ＭＲＫ＿ｐＨ１＿Ｃｏｎ及びＭＲＫ＿ｓＨ１＿Ｃｏｎ（上記のパンデミック性及び季節性のコンセンサス配列）；ならびに粒子形成を可能にするフェリチン融合配列を有する前述の６種の各抗原。
対照として、ＭＣ３（ＬＮＰの効果を求めるための対照）；未感作（非ワクチン接種動物）；及び株Ｈ１Ｎ１ Ａ／ＰＲ／８／３４由来ＨＡのエクトドメインをコードするｅＨ１ＨＡ ＲＮＡによるワクチン接種（ウイルス攻撃の陽性対照）を加えた。
０週目及び３週目に、各試験ワクチンを全容積１００μＬで、すなわち５０μＬの免疫注射を各四頭筋に投与して動物を筋肉内（ＩＭ）免疫した。本試験で評価した候補インフルエンザウイルスワクチンは上記の通りであった。これを以下の表にまとめる。２回目の投与の２週間後（５週目）に全動物から血清を採取した。６週目に、ケタミンとキシラジンとの混合物で鎮静させながら、致死量のマウス適合インフルエンザウイルス株Ｈ１Ｎ１ Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４（ＰＲ８）を動物の鼻腔内に攻撃接種した。死亡率を記録し、群の体重を感染後２０日間毎日測定した。
血清抗体が攻撃ウイルス株を中和する能力を試験するため、ガウシアルシフェラーゼレポーター遺伝子（Ｐａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１３；４：２３６９）で修飾したＰＲ８ウイルスを使用してマイクロ中和アッセイを実施した。簡潔には、ＰＲ８ルシフェラーゼウイルスを、ＴＰＣＫ処理トリプシンを加えたウイルス希釈液で希釈した。血清サンプルを１：１０に希釈し、次いで９６ウェル細胞培養プレート中で３倍に段階希釈した。５０μＬの希釈した各血清サンプルと等量の希釈ウイルスをウェル中で混合し、５％Ｃ０２中、３７℃で１時間インキュベートした後、１００μＬのＭＤＣＫ細胞を１．５×１０＾５細胞／ｍＬで添加した。次いで、プレートを５％ＣＯ２中、３７℃で７２時間インキュベートした。Ｇａｕｓｓｉａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｇｌｏｗ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、ＥｎＶｉｓｉｏｎリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で発光シグナルを読み取った。図１２Ａに示すように、Ｈ１亜型由来のコンセンサスＨＡ抗原をコードするｍＲＮＡで免疫したマウスからの血清は、これらの抗原のＨＡ配列がＰＲ８株のＨＡ配列と８〜１９％異なるにもかかわらず、ＰＲ８ルシフェラーゼウイルスを検出可能に中和できた。ＨＡ配列適合抗原（ｅＨ１ＨＡ）は、このウイルスに対してはるかに高い血清中和抗体応答を誘発した。対照的に、コンセンサスＨ３抗原（ＣｏｎＨ３）をコードするＲＮＡでワクチン接種したマウスからの血清は、ＰＲ８ルシフェラーゼウイルスを中和できず、異なる亜型（例えば、Ｈ１及びＨ３）のコンセンサス配列が交差反応し得ないことが示唆された。同様に、Ｈ１亜型のコンセンサスＨＡ抗原をコードし、フェリチン融合配列を有するｍＲＮＡで免疫したマウスからの血清は、Ｍｅｒｃｋ＿ｐＨ１＿Ｃｏｎ＿フェリチンｍＲＮＡを除いて、ＰＲ８ルシフェラーゼウイルスを検出可能に中和できたが、コンセンサスＨ３抗原をコードし、フェリチン融合配列を有するｍＲＮＡでワクチン接種したマウスからの血清はＰＲ８ルシフェラーゼウイルスを中和できなかった（図１２Ｂ）。血清中和データと符合するが、コンセンサスＨ１ ＨＡ抗原（フェリチン融合の有無を問わない）で免疫したマウスは、致死的ＰＲ８ウイルス攻撃接種後も生存し、Ｍｅｒｃｋ＿ｐＨ１＿Ｃｏｎ＿フェリチンｍＲＮＡ群を除いて体重減少を示さなかったが、ＣｏｎＨ３対照群、未感作対照群、及びＬＮＰのみの対照群のマウスは、攻撃接種時に急速に体重が減少した（図１３）。Ｍｅｒｃｋ＿ｐＨ１＿Ｃｏｎ＿フェリチンｍＲＮＡで免疫したマウスは、致死的ＰＲ８ウイルス攻撃接種後も生存したが、５〜１０％の体重減少を示し、ウイルス中和以外の機構（複数可）によって部分的な防御を媒介できることが示唆された。
コンセンサスＨＡ抗原によって誘発された血清中和活性の幅を評価するために、上記の偽ウイルスのパネルで中和アッセイを実施した（図１４）。予測通り、インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１ Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４で免疫したマウスからの血清（実施例１２に記載の試験のもの）は、一致した偽ウイルス株（ＰＲ８）のみを中和することができた。対照的に、コンセンサスＨ１ ＨＡ抗原、ならびにｅＨ１ＨＡ抗原で免疫したマウスからの血清は、亜型Ｈ１及びＨ５由来の株を含む多様な第１群の偽ウイルスのパネルを中和することができたが、第２群（亜型Ｈ３）の株は中和できなかった。これに符合して、コンセンサスＨ３ ＨＡ抗原で免疫したマウスからの血清は、第２群（亜型Ｈ３）の株を中和することができたが、第１群の偽ウイルスのいずれも中和できなかった。
Ｂ型インフルエンザ攻撃接種
本試験では、候補インフルエンザウイルスワクチンのマウスにおける免疫原性及び効果を試験することを目的とした。試験した動物は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスであった。試験ワクチンには、ＭＣ３ ＬＮＰで製剤化された以下のｍＲＮＡを含めた：Ｂ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３ ｓＨＡ（可溶性ＨＡ）、Ｂ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３ ｍＨＡ（膜アンカーを有する完全長ＨＡ）、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８ ｓＨＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／０２／１９８７ ｓＨＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／０２／１９８７ ｍＨＡ、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／１９８８ ｍＨＡ、またはＢＨＡ１０（ＨＡステム設計）。対照動物には、非致死量のマウス適合Ｂ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／１９５４（陽性対照）または空のＭＣ３ ＬＮＰ（ＬＮＰの効果を求めるための対照）をワクチン接種するか、またはワクチン接種しなかった（未感作）。
０週目及び３週目に、各試験ワクチンを全容積１００μＬで、すなわち５０μＬの免疫注射を各四頭筋に投与して動物を筋肉内（ＩＭ）免疫した。本試験で評価した候補インフルエンザウイルスワクチンは上記の通りであった。これを以下の表にまとめる。２回目の投与の２週間後に全動物から血清を採取した。６週目に、ケタミンとキシラジンとの混合物で鎮静させながら、致死量のマウス適合インフルエンザウイルス株Ｂ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／１９５４を全動物（群あたりｎ＝１０）の鼻腔内に攻撃接種した。死亡率を記録し、マウス群の体重を感染後２０日間毎日測定した。
本明細書に記載の配列はそれぞれ、化学修飾配列またはヌクレオチド修飾を含まない非修飾配列を包含する。
図１５Ａは、試験ワクチンでワクチン接種された動物からのプールされた血清の、ＥＬＩＳＡによるエンドポイント抗ＨＡ抗体価を示している。ｘ軸上に試験されたワクチンを示し、異なるインフルエンザ株それぞれに由来するＨＡへの結合をプロットしている。Ｂ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３に由来するものを除いて、試験されたワクチンはすべて免疫原性であり、血清抗体は、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／１９８８（Ｙａｍａｇａｔａ系統）及びＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６（Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統）両方由来のＨＡに結合した。
マウス適合Ｂ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／１９５４による致死的攻撃接種後、ＭＣ３ワクチン接種動物及び未感作動物の９０％は感染後１６日目までに感染により死亡した（図１５Ｂ）。Ｂ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３ ｓＨＡ及びｍＨＡのｍＲＮＡワクチンは致死的攻撃接種に対して効果を示さず、ＢＨＡ１０ステムｍＲＮＡワクチンは動物の半数のみを防御した。試験された他のワクチンはすべて、マウスの死亡を完全に回避したが（図１５Ｂ）、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／１９８８ ｍＨＡ ＲＮＡワクチンのみが、異種ウイルス株を攻撃接種された動物の致死性及び体重減少を防ぐことができた（図１５Ｂ）。
実施例１４：非ヒト霊長類の免疫原性
本試験では、候補インフルエンザウイルスワクチンのアカゲザルにおける免疫原性を試験することを目的とした。試験ワクチンには、ＭＣ３ ＬＮＰで製剤化された以下のｍＲＮＡを含めた：ＮＩＨＧｅｎ６ＨＡＳＳ−ｆｏｌｄｏｎ ｍＲＮＡ（Ｙａｓｓｉｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２０１５ Ｓｅｐ；２１（９）：１０６５−７０に基づく）、及びＨ３Ｎ２インフルエンザ株由来のＮＰタンパク質をコードするＮＰ ｍＲＮＡ。
第１群の動物に、予め季節性不活化インフルエンザワクチン（ＦＬＵＺＯＮＥ（登録商標））をワクチン接種し、０日目に３００μｇのＮＩＨＧｅｎ６ＨＡＳＳ−ｆｏｌｄｏｎ ｍＲＮＡを筋肉内（ＩＭ）に追加免疫した。第２群及び第３群の動物は試験開始時にインフルエンザに未感作であり、０日目、２８日目、及び５６日目に、それぞれ３００μｇのＮＩＨＧｅｎ６ＨＡＳＳ−ｆｏｌｄｏｎ ｍＲＮＡまたは３００μｇのＮＰ ｍＲＮＡをワクチン接種した。試験開始前（−８日目）ならびに１４日目、２８日目、４２日目、５６日目、７０日目、８４日目、１１２日目、１４０日目、及び１６８日目に、全動物から血清を採取した。
ＥＬＩＳＡアッセイ（組換え発現されたＮＩＨＧｅｎ６ＨＡＳＳ−ｆｏｌｄｏｎ［ＨＡステム］またはＮＰタンパク質でプレートをコーティング）によって測定したところ、ＮＩＨＧｅｎ６ＨＡＳＳ−ｆｏｌｄｏｎワクチンは強力な抗体応答を誘発した。このデータを図１６に示す。図１６Ａは、予めＦＬＵＺＯＮＥ（登録商標）でワクチン接種し、ＮＩＨＧｅｎ６ＨＡＳＳ−ｆｏｌｄｏｎ ｍＲＮＡワクチンで１回追加免疫した４匹のアカゲザルに関する経時的なＨＡステムに対する力価を示す。図１６Ｂは、０日目、２８日目、及び５６日目に同じＮＩＨＧｅｎ６ＨＡＳＳ−ｆｏｌｄｏｎ ＲＮＡワクチンでワクチン接種した４匹のアカゲザルからの経時的なＨＡステムに対する力価を示す。ＮＩＨＧｅｎ６ＨＡＳＳ−ｆｏｌｄｏｎ ＲＮＡワクチンは、予め不活化インフルエンザワクチンでワクチン接種された動物において抗ＨＡステム抗体結合価を上昇させることができ、また未感作動物において強力な応答を誘発した。両群とも、ＨＡステム力価は、少なくとも試験１６８日目までベースラインを上回った状態を維持した。図１６Ｃは、０日目、２８日目、及び５６日目にＮＰ ｍＲＮＡワクチンでワクチン接種した４匹のアカゲザルに関する経時的なＮＰに対する抗体価を示し、このワクチンがＮＰに対して強力な抗体応答を誘発したことを示す。
広範囲のインフルエンザ株由来のヘマグルチニン（ＨＡ）に結合できる抗体の存在について第１群及び第２群の血清を試験するにあたり、上記の一連の多様なインフルエンザ株由来の組換えＨＡでＥＬＩＳＡプレートをコーティングした。ＥＣ１０力価は、最大シグナルの１０％に達した血清希釈の逆数で算出する。第１群の動物では（図１７Ａ）、ＮＩＨＧｅｎ６ＨＡＳＳ−ｆｏｌｄｏｎワクチンの単回投与により、Ｈ１ ＨＡに対する力価が約４０〜６０倍増加し、力価はワクチン接種後約２８日目にピークに達した。力価は２８〜７０日目に減少したが、それでもなお７０日目の力価はワクチン接種前に測定した力価よりも約１０〜３０倍高かった。ＮＩＨＧｅｎ６ＨＡＳＳ−ｆｏｌｄｏｎ ｍＲＮＡワクチンは、Ｈ３またはＨ７インフルエンザ株由来のＨＡに対する力価を上昇させなかった。第２群の動物（図１７Ｂ）では、ＮＩＨＧｅｎ６ＨＡＳＳ−ｆｏｌｄｏｎ ｍＲＮＡワクチンの各投与後にＨ１及びＨ２ ＨＡに対する抗体価が上昇し、２回目の投与後に抗体価が最も大幅に上昇していると思われた。
強力な抗体応答に加えて、ＮＰ ｍＲＮＡワクチンはまた、アカゲザルにおいて細胞媒介性免疫を誘発した。試験０日目、４２日目、７０日目、及び１４０日目に、第３群のＮＰ ｍＲＮＡワクチン接種アカゲザルからＰＢＭＣを収集した。リンパ球をＮＰペプチドのプールで刺激し、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、またはＴＮＦ−αの産生を細胞内染色及びフローサイトメトリーによって測定した。図１８は、ＮＰペプチドのプールで刺激後の応答を表す図である。ＮＰ ｍＲＮＡによるワクチン接種後、末梢血に抗原特異的ＣＤ４ Ｔ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞が見られ、これらの細胞は、少なくとも試験１４０日目までベースラインより上を維持した。
実施例１５：Ｈ７Ｎ９免疫原性試験
本試験では、Ｈ７Ｎ９免疫原性を試験することを目的とした。２５μＭの筋肉内免疫注射を１日目及び２２日目に４０匹の動物に投与し、１日目、８日目、２２日目、及び４３日目に血液を採取した。血液サンプルを使用して、赤血球凝集抑制（ＨＡＩ）及びマイクロ中和試験を実施した。
ＨＡＩ試験は、プラセボ群を含む動物すべてにおいて、４５の幾何平均力価（ＧＭＴ）を示した。応答者のみのＧＭＴは１１６であった（図１９）。個々の対象ごとのＨＡＩ動態を図２０に示す。
マイクロ中和（ＭＮ）試験は、プラセボ群を含む動物すべてにおいて、３６の幾何平均力価（ＧＭＴ）を示した。応答者のみのＧＭＴは８４であった（図２１）。対象ごとのＭＮ試験動態を図２２に示す。
ＨＡＩとＭＮとは、非常に強い相関を示した（図２３）。１つの対象のみ、一方のアッセイで防御力価を有したが、他方のアッセイでは有しなかった。また、１０匹の対象は４３日目にＨＡＩ力価もＭＮ力価も検出されなかった。







表１６に列挙する各アミノ酸配列の最初の下線付き配列は、シグナル配列または分泌配列を示し、これは同一もしくは類似の機能を達成する代替配列で置換されていてもよく、またはシグナル配列もしくは分泌配列が欠失していてもよい。表１６に列挙するアミノ酸配列の２番目の下線付き配列は、自然に三量体化する異種配列であるｆｏｌｄｏｎ配列を示し、これは３つのＨＡステムが融合して三量体になる。そのようなｆｏｌｄｏｎ配列は、同一または類似の機能を達成する代替配列で置換されていてもよい。

各構築物の５’ＵＴＲ：
TCAAGCTTTTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACGACTCACTATAGGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACC（配列番号４４５）
各構築物の３’ＵＴＲ：
TGATAATAGGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGC（配列番号４４６）

表１７に列挙する各アミノ酸配列の最初の下線付き配列は、シグナル配列または分泌配列を示し、これは同一もしくは類似の機能を達成する代替配列によって置換されていてもよく、またはシグナル配列もしくは分泌配列が欠失していてもよい。
各構築物の５’ＵＴＲ：
TCAAGCTTTTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACGACTCACTATAGGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACC（配列番号４４５）
各構築物の３’ＵＴＲ：
TGATAATAGGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGC（配列番号４４６）
表２０に列挙する各アミノ酸配列の下線付き配列は、シグナル配列または分泌配列を示し、これは同一もしくは類似の機能を達成する代替配列によって置換されていてもよく、またはシグナル配列もしくは分泌配列が欠失していてもよい。
等価物
当業者は、本明細書に記載された本開示の特定の実施形態に対する多くの等価物を理解するか、または日常的な実験のみを用いて確認することができる。このような等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されるものとする。
本明細書に開示された、特許文献を含む参考文献はすべて、その全体が参照により組み込まれる。

Claims (66)

  1. インフルエンザウイルスワクチンであって、少なくとも１つのインフルエンザウイルス抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含み、脂質ナノ粒子で製剤化される、前記インフルエンザウイルスワクチン。
  2. 前記少なくとも１つの抗原ポリペプチドが、インフルエンザヘマグルチニン１（ＨＡ１）、ヘマグルチニン２（ＨＡ２）、ＨＡ１もしくはＨＡ２の免疫原性断片、または前記のいずれか２つ以上の組み合わせである、請求項１に記載のインフルエンザワクチン。
  3. 少なくとも１つの抗原ポリペプチドが、ＨＡ１、ＨＡ２、またはＨＡ１とＨＡ２の組み合わせであり、かつ、少なくとも１つの抗原ポリペプチドが、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックスタンパク質１（Ｍ１）、マトリックスタンパク質２（Ｍ２）、非構造タンパク質１（ＮＳ１）、及び非構造タンパク質２（ＮＳ２）からなる群から選択される、請求項１に記載のインフルエンザワクチン。
  4. 少なくとも１つの抗原ポリペプチドがＨＡ２であり、かつ、少なくとも１つの抗原ポリペプチドが、ＮＡ、ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１、及びＮＳ２からなる群から選択される、請求項３に記載のインフルエンザワクチン。
  5. 少なくとも１つの抗原ポリペプチドがＨＡ２であり、かつ、少なくとも１つの抗原ポリペプチドが、ＮＡ、ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１、及びＮＳ２からなる群から選択される、請求項４に記載のインフルエンザワクチン。
  6. 前記少なくとも１つの抗原ポリペプチドが、インフルエンザウイルス株Ｈ１／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／１９３４、Ｈ１／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９、Ｈ１／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９、Ｈ５／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４、Ｈ２／Ｊａｐａｎ／３０５／１９５７、Ｈ９／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１０７３／９９、Ｈ３／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８、Ｈ３／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７、Ｈ７／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３、Ｈ１０／Ｊｉａｎｇｘｉ−Ｄｏｎｇｈｕ／３４６／２０１３、Ｈ３／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５、Ｈ１／Ｖｉｅｔｎａｍ／８５０／２００９、またはそれらの組み合わせに由来する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のインフルエンザワクチン。
  7. 前記少なくとも１つの抗原ポリペプチドが、配列番号１〜４４４、４５８、４６０、４６２〜４７９のいずれか１つによって特定されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のワクチン。
  8. 前記少なくとも１つのＲＮＡポリペプチドが、配列番号４４７〜４５７、４５９、４６１のいずれか１つによって特定される核酸配列によってコードされ、かつ／または前記少なくとも１つのＲＮＡポリペプチドが、配列番号４９１〜５０３のいずれか１つによって特定される核酸配列を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のワクチン。
  9. 前記少なくとも１つの抗原ポリペプチドが、配列番号１〜４４４、４５８、４６０、４６２〜４７９のいずれか１つによって特定されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載のワクチン。
  10. 前記少なくとも１つの抗原ポリペプチドが、配列番号１〜４４４、４５８、４６０、４６２〜４７９のいずれか１つによって特定されるアミノ酸配列に対して９５％〜９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載のワクチン。
  11. 前記少なくとも１つの抗原ポリペプチドが、配列番号１〜４４４、４５８、４６０、４６２〜４７９のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、前記抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片が、膜融合活性を有する、細胞受容体に付着する、ウイルス膜と細胞膜との融合を引き起こす、及び／またはウイルスが感染先の細胞へ結合する原因となる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のワクチン。
  12. 前記少なくとも１つの抗原ポリペプチドが、配列番号１〜４４４、４５８、４６０、４６２〜４７９のアミノ酸配列に対して９０％〜９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、前記抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片が、膜融合活性を有する、細胞受容体に付着する、ウイルス膜と細胞膜との融合を引き起こす、及び／またはウイルスが感染先の細胞へ結合する原因となる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のワクチン。
  13. 前記オープンリーディングフレームがコドン最適化されている、請求項１〜２のいずれか１項に記載のワクチン。
  14. 前記ワクチンが多価である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のワクチン。
  15. 抗原特異的免疫応答を生じさせる有効量で製剤化される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のワクチン。
  16. 対象に免疫応答を誘導する方法であって、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のワクチンを、前記対象に抗原特異的免疫応答を生じさせるのに有効な量で前記対象に投与することを含む、前記方法。
  17. 前記抗原特異的免疫応答が、Ｔ細胞応答またはＢ細胞応答を含む、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記対象に単回量の前記ワクチンを投与する、請求項１６または１７に記載の方法。
  19. 前記対象にブースター量の前記ワクチンを投与する、請求項１６または１７に記載の方法。
  20. 前記ワクチンが、皮内注射または筋肉内注射によって前記対象に投与される、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. 前記対象で生じる抗抗原ポリペプチド抗体価が、対照と比較して少なくとも１ｌｏｇ増加する、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 前記対象で生じる抗抗原ポリペプチド抗体価が、対照と比較して１〜３ｌｏｇ増加する、請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. 前記対象で生じる前記抗抗原ポリペプチド抗体価が、対照と比較して少なくとも２倍に増加する、請求項１６〜２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. 前記対象で生じる前記抗抗原ポリペプチド抗体価が、対照と比較して２〜１０倍に増加する、請求項１６〜２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 前記対照が、前記ウイルスに対するワクチンが投与されていない対象に生じた抗抗原ポリペプチド抗体価である、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. 前記対照が、前記ウイルスに対する生弱毒化ワクチンまたは不活化ワクチンを投与された対象に生じた抗抗原ポリペプチド抗体価である、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記対照が、前記ウイルスに対する組換えタンパク質ワクチンまたは精製タンパク質ワクチンを投与された対象に生じた抗抗原ポリペプチド抗体価である、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
  28. 前記対照が、前記ウイルスに対するＶＬＰワクチンを投与された対象に生じた抗抗原ポリペプチド抗体価である、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
  29. 前記有効量が、前記ウイルスに対する組換えタンパク質ワクチンまたは精製タンパク質ワクチンの標準の治療量の少なくとも２分の１に相当する用量であり、かつ、その場合の前記対象に生じた抗抗原ポリペプチド抗体価が、前記ウイルスに対する前記標準の治療量の組換えタンパク質ワクチンまたは精製タンパク質ワクチンそれぞれを投与された対照対象に生じた抗抗原ポリペプチド抗体価と同等である、請求項１６〜２８のいずれか１項に記載の方法。
  30. 前記有効量が、前記ウイルスに対する生弱毒化ワクチンまたは不活化ワクチンの標準の治療量の少なくとも２分の１に相当する用量であり、かつ、その場合の前記対象に生じた抗抗原ポリペプチド抗体価が、前記ウイルスに対する前記標準の治療量の生弱毒化ワクチンまたは不活化ワクチンそれぞれを投与された対照対象に生じた抗抗原ポリペプチド抗体価と同等である、請求項１６〜２８のいずれか１項に記載の方法。
  31. 前記有効量が、前記ウイルスに対するＶＬＰワクチンの標準の治療量の少なくとも２分の１に相当する用量であり、かつ、その場合の前記対象に生じた抗抗原ポリペプチド抗体価が、前記ウイルスに対する前記標準の治療量のＶＬＰワクチンを投与された対照対象に生じた抗抗原ポリペプチド抗体価と同等である、請求項１６〜２８のいずれか１項に記載の方法。
  32. 前記有効量が総投与量５０μｇ〜１０００μｇである、請求項１６〜３１のいずれか１項に記載の方法。
  33. 前記有効量が、２回合計２５μｇ、１００μｇ、４００μｇ、または５００μｇを前記対象に投与した量である、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記ウイルスに対する前記ワクチンの効果が６５％超である、請求項１６〜３３のいずれか１項に記載の方法。
  35. 前記ワクチンが、最大２年間、前記対象を前記ウイルスに対して免疫する、請求項１６〜３４のいずれか１項に記載の方法。
  36. 前記ワクチンが、２年間超、前記対象を前記ウイルスに対して免疫する、請求項１６〜３４のいずれか１項に記載の方法。
  37. 前記対象が前記ウイルスに曝露しているか、前記対象が前記ウイルスに感染しているか、または前記対象が前記ウイルスに感染するリスクがある、請求項１６〜３６のいずれか１項に記載の方法。
  38. 前記対象が免疫不全である、請求項１６〜３７のいずれか１項に記載の方法。
  39. 対象に抗原特異的免疫応答を誘導する方法に使用される請求項１〜１５のいずれか１項に記載のワクチンであって、前記方法が、前記ワクチンを前記対象に抗原特異的免疫応答を生じさせるのに有効な量で前記対象に投与することを含む、前記ワクチン。
  40. 対象に抗原特異的免疫応答を誘導する方法に使用される医薬品の製造における請求項１〜１５のいずれか１項に記載のワクチンの使用であって、前記方法が、前記ワクチンを前記対象に抗原特異的免疫応答を生じさせるのに有効な量で前記対象に投与することを含む、前記使用。
  41. 請求項１〜１５のいずれか１項に記載のワクチンの少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドをコードする遺伝子操作された核酸。
  42. 請求項１〜１５のいずれか１項に記載のワクチンの少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドをコードする遺伝子操作された核酸を含む発現ベクター。
  43. 請求項１〜１６のいずれか１項に記載のワクチンの少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドをコードする遺伝子操作された核酸を含む宿主細胞。
  44. 前記核酸によってコードされるポリペプチドの発現を可能にする条件下で請求項４３に記載の宿主細胞を培地中で培養し、前記培養細胞または前記細胞培地から前記ポリペプチドを精製することを含む、ポリペプチドの作製方法。
  45. 少なくとも１つのインフルエンザウイルス抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む複合コンセンサス亜型ワクチンであって、前記ワクチンが様々なインフルエンザ株に対して交差反応性をもち、前記ワクチンが少なくとも１つのコンセンサスヘマグルチニン抗原を含む、前記ワクチン。
  46. 前記コンセンサスヘマグルチニン抗原が、インフルエンザヘマグルチニン１（ＨＡ１）、ヘマグルチニン２（ＨＡ２）、ＨＡ１もしくはＨＡ２の免疫原性断片、または前記のいずれか２つ以上の組み合わせからなる群から選択される、請求項４５に記載のワクチン。
  47. 少なくとも１つの抗原ポリペプチドが、ＨＡ１、ＨＡ２、またはＨＡ１とＨＡ２の組み合わせであり、かつ、少なくとも１つの抗原ポリペプチドが、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックスタンパク質１（Ｍ１）、マトリックスタンパク質２（Ｍ２）、非構造タンパク質１（ＮＳ１）、及び非構造タンパク質２（ＮＳ２）からなる群から選択される、請求項４５に記載のワクチン。
  48. 少なくとも１つの抗原ポリペプチドがＨＡ２であり、かつ、少なくとも１つの抗原ポリペプチドが、ＮＡ、ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１、及びＮＳ２からなる群から選択される、請求項４７に記載のワクチン。
  49. 少なくとも１つの抗原ポリペプチドがＨＡ２であり、かつ、少なくとも１つの抗原ポリペプチドが、ＮＡ、ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１、及びＮＳ２からなる群から選択される、請求項４８に記載のワクチン。
  50. 前記少なくとも１つの抗原ポリペプチドが、インフルエンザウイルス株Ｈ１／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／１９３４、Ｈ１／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９、Ｈ１／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９、Ｈ５／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４、Ｈ２／Ｊａｐａｎ／３０５／１９５７、Ｈ９／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１０７３／９９、Ｈ３／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８、Ｈ３／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７、Ｈ７／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３、Ｈ１０／Ｊｉａｎｇｘｉ−Ｄｏｎｇｈｕ／３４６／２０１３、Ｈ３／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５、Ｈ１／Ｖｉｅｔｎａｍ／８５０／２００９、またはそれらの組み合わせに由来する、請求項４５〜４９のいずれか１項に記載のワクチン。
  51. 脂質ナノ粒子で製剤化される、請求項４５〜４９のいずれか１項に記載のワクチン。
  52. 前記ナノ粒子が、５０〜２００ｎｍの平均直径を有する、請求項５１または請求項１〜１５のいずれか１項に記載のワクチン。
  53. 前記脂質ナノ粒子が、カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、ステロール、及び非カチオン性脂質を含む、請求項５１または請求項１〜１５のいずれか１項に記載のワクチン。
  54. 前記脂質ナノ粒子担体が、モル比約２０〜６０％のカチオン性脂質、０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質、２５〜５５％のステロール、及び２５％の非カチオン性脂質を含む、請求項５３に記載のワクチン。
  55. 前記カチオン性脂質がイオン性のカチオン性脂質であり、非カチオン性脂質が中性脂質であり、ステロールがコレステロールである、請求項５４に記載のワクチン。
  56. 前記カチオン性脂質が、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１、３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択される、請求項５４に記載のワクチン。
  57. 前記ナノ粒子が、０．４未満の多分散度を有する、請求項５１〜５６のいずれか１項に記載のワクチン。
  58. 前記ナノ粒子が、中性ｐＨ値で中性の実効電荷を有する、請求項５１〜５７のいずれか１項に記載のワクチン。
  59. 前記少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドが少なくとも１つの化学修飾を含む、請求項１〜１５または４５〜５８のいずれか１項に記載のワクチン。
  60. 前記化学修飾が、シュードウリジン、Ｎ１−メチルシュードウリジン、Ｎ１−エチルシュードウリジン、２−チオウリジン、４’−チオウリジン、５−メチルシトシン、５−メチルウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、４−チオ−シュードウリジン、５−アザ−ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５−メトキシウリジン、及び２’−Ｏ−メチルウリジンから選択される、請求項５９に記載のワクチン。
  61. 様々なインフルエンザ株に対する交差反応性を哺乳動物に誘導する方法であって、請求項１〜１５または４５〜６０のいずれか１項に記載のワクチンを、それを必要とする前記哺乳動物に投与することを含む、前記方法。
  62. それぞれがコンセンサスヘマグルチニン抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも２つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを前記哺乳動物に別々に投与する、請求項６１に記載の方法。
  63. それぞれがコンセンサスヘマグルチニン抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも２つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを前記哺乳動物に同時に投与する、請求項６１に記載の方法。
  64. 対象のワクチン接種に使用される医薬組成物であって、インフルエンザウイルス抗原をコードする有効量のｍＲＮＡを含み、前記有効量が、投与後１〜７２時間で前記対象の血清中で測定したとき検出可能なレベルの抗原を産生するのに十分である、前記医薬組成物。
  65. 前記抗原のカットオフインデックスが１〜２である、請求項６４に記載の組成物。
  66. 対象のワクチン接種に使用される医薬組成物であって、インフルエンザウイルス抗原をコードする有効量のｍＲＮＡを含み、前記有効量が、投与後１〜７２時間で前記対象の血清中で測定したとき、前記抗原に対する抗体を中和することにより、１，０００〜１０，０００の中和価を生じさせるのに十分である、前記医薬組成物。
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