CN101389655B - 新的hcdr3区域集合及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及抗体重链互补决定区3(HCDR3)成员集合的制备和应用，这个集合的多样性是HCDR3成员长度的函数。HCDR3区域集合的多样性大体上代表了人HCDR3谱中天然氨基酸的分布。因此，在编码HCDR3的DNA序列中利用三核苷酸诱变(TRIM)技术偏倚完全随机分布的氨基酸可以描绘这种天然氨基酸的分布。本发明HCDR3集合中的每一个成员，都可以包含在抗体可变区(或者其片段)中，以形成合成的抗体或者抗体片段库。本发明中的合成抗体库可以设计成包含一些模块的特性，例如化学合成的“主宰基因”框架区，这个框架区可能含有一个或多个CDR区域侧翼的独特限制性位点，包括按这里描述制备的HCDR3区域。本发明还提供了编码这种多样化集合的核酸分子，和制备使用所述核酸分子的方法。
Description
本申请要求2005年12月20日提交的序列号为60/751,633的临时申请的优先权，其内容在此全部通过引用并入。
技术领域
本发明涉及新的HCDR3区域集合及其应用。
背景技术
免疫球蛋白重链的第三互补决定区(H-CDR3)构成了典型的抗原结合位点中心，通常在决定抗体的特异性和亲和力中起到主要作用。在所有已知的具有适应性免疫系统的物种中，H-CDR3比其他五个CDR区域(H-CDR1、H-CDR2、L-CDR1、L-CDR2或者L-CDR3)中的任意一个都更为多样化，它们共同构成抗原结合位点的外边界(Tonegawa，1983；Chothia等，1989)。
已知H-CDR3的平均长度和长度范围对物种现有的抗原结合结构的范围和抗体谱(repertoire)的功能具有重要影响(Johnson&Wu，1998；Collis等，2003)，从小鼠到人类到牛，H-CDR3的平均长度和长度范围都是增加的(Wu 等，1993)。同一物种中H-CDR3的多样性也是可以调节的。例如，在人类和小鼠中，H-CDR3的长度范围和多样性会随着个体发育增加(Feeney，1992；Zemlin等，2002)。
因其在抗原结合中的重要作用，H-CDR3区域可以作为载体引入高多样性的合成抗体库，其可用于治疗性抗体工程(Knappik等，2000)。以简并引物随机化该区域产生了大量序列多样性，但是其中至少大部分结构是非正常、没有功能的(Zemlin等，2003)。因此，巨大的合成抗体库需要具有与已知靶点良好的亲和力。
Zemlin提到，按照Zemlin对鼠和人类唯一的、功能性的、发表的 H-CDR3区域的分析，与鼠的H-CDR3区域相比人类H-CDR3区域的长度范围更大。Zemlin还指出，特定氨基酸的频率随H-CDR3区域长度的增加而改变。例如，Zemlin报道随8-14个氨基酸残基序列长度的增加，丝氨酸的频率增加，但是在大于14个氨基酸残基的序列中，却表现出混杂的模式。
近来，Hoet等在Nature Biotech 23：(3)March 2005中阐述了包含可变重链序列(VH)抗体库的构建，这些序列是部分合成的，而且包含人类供体中得到的HCDR3区域。特别的是，不包含HCDR3区域的VH链部分(FR1-H-CDR1-FR2-H-CDR2-FR3)是合成的，并且被并入VH基因中；包含HCDR3区域的VH链部分(H-CDR3-FR4)是从自然发生的人类自身免疫病人获得的。
Hoet以功能库多样性的相似的程度为基础，选择包括了来自人类供体的HCDR3序列，因此其品质不能通过结合合成的HCDR3区域入VH链而达到。这点是不足为奇的，假定其他人采用了产生所谓的集中HCDR3库的方法(见示例，公布的美国专利申请US 2006/0257937A1)，其中通过致力于降低非功能性结合子(binder)的浓度来控制其多样性(通过有限的分析已知的V、D和J片段)，但是根据常识教导要在文库中具有高的浓度才能包含尽量多的多样性，这就使得文库的筛选变得异常繁琐(见专利申请’937A1)。事实上，Hoet提到，在自然产生的人抗体中，HCDR3在4个到大于35个残基间变化，而且具有非随机的序列多样性；而合成像天然H-CDR3谱一样，具有的编码序列和长度都多样的DNA是不可能的。最后，Hoet介绍了选择种系基因D片段来帮助HCDR3库成员正确折叠和结合，和将D片段纳入抗体库是希望的，由此Hoet描述了专利申请’937A1中指导的HCDR3库的使用。因为专利申请’937A1中指导的集中库是由有限的数据集构建的(即已知的V、D和J片段)，所以集中库的一个实际的结果是它没有在每个氨基酸残基处达到最适宜的多样性或变化。
发明内容
相对于Hoet和专利申请’937A1的教导，本发明特别提供了一种合成 的人类或者人源化抗体H-CDR3区域的集合，这些区域具有本质上像天然H-CDR3谱的多样性，而且通过在编码H-CDR3的DNA序列中偏倚(biasing)完全随机的氨基酸分布，模拟了天然氨基酸的分布。从这个角度讲，本发明提供了一种抗体库，它是通过到目前为止被认为不可能构建的方法构建的。
本发明提供了一种氨基酸范围可变的、多样化人类或者人源化抗体H-CDR3区域的集合，其中所述集合的多样性由如下产生：根据第一个多样化因素将长度在第一氨基酸范围内的H-CDR3区域多样化，根据第二个多样化因素将长度在第二氨基酸范围内的H-CDR3区域多样化，其中所述多样化因素是不同的。
本发明的目的是提供一种多样化人类或者人源化抗体H-CDR3区域的集合，其中所述H-CDR3区域中至少有一部分的长度范围为约4到约22个氨基酸。
本发明的另一个目的是提供一种多样化人类或者人源化抗体H-CDR3区域的集合，其中第一氨基酸范围具有约4到约13个氨基酸，第二氨基酸范围具有约14到约22个氨基酸。
一方面，本发明提供了一种多样化人类或者人源化抗体H-CDR3区域的集合，其中所述集合的多样性由如下产生：根据第一个多样化因素将长度在第一氨基酸范围内的H-CDR3区域多样化，根据第二个多样化因素将长度在第二氨基酸范围内的H-CDR3区域多样化，根据第三个多样化因素将长度在第三氨基酸范围内的H-CDR3区域多样化，其中所述多样化因素是不同的。本发明的这个集合可以包含多样化人类或者人源化抗体H-CDR3区域，其中第一氨基酸范围具有约4到约9个氨基酸，第二氨基酸范围具有约10到约16个氨基酸，第三氨基酸范围具有约17到约22个氨基酸。
另一方面，本发明提供了一种多样化人类或者人源化抗体H-CDR3区域的集合，其中所述集合的多样性由如下产生：根据第一个多样化因素将长度在第一氨基酸范围内的H-CDR3区域多样化，根据第二个多样化因素将长度在第二氨基酸范围内的H-CDR3区域多样化，根据第三个多样化因素将长度在第三氨基酸范围内的H-CDR3区域多样化，根据第四个多样化因素将长度在第四氨基酸范围内的H-CDR3区域多样化，根据第五个多样化因素将长度在第五氨基酸范围内的H-CDR3区域多样化，根据第六个多样化因素将长度在第六氨基酸范围内的H-CDR3区域多样化，其中所述多样化因素是不同的。本发明的这个集合可以包含多样化人类或者人源化抗体H-CDR3区域，其中第一氨基酸范围具有约4到约6个氨基酸，第二氨基酸范围具有约7到约9个氨基酸，第三氨基酸范围具有约10到约12个氨基酸，第四氨基酸范围具有约13到约15个氨基酸，第五氨基酸范围具有约16到约18个氨基酸，第六氨基酸范围具有约19到约22个氨基酸。
再一方面，本发明提供了一种多样化人类或者人源化抗体H-CDR3区域的集合，其中所述集合的多样性由如下产生：根据第一个多样化因素将长度在第一氨基酸范围内的H-CDR3区域多样化，根据第二个多样化因素将长度在第二氨基酸范围内的H-CDR3区域多样化，根据第三个多样化因素将长度在第三氨基酸范围内的H-CDR3区域多样化，根据第四个多样化因素将长度在第四氨基酸范围内的H-CDR3区域多样化，根据第五个多样化因素将长度在第五氨基酸范围内的H-CDR3区域多样化，根据第六个多样化因素将长度在第六氨基酸范围内的H-CDR3区域多样化，根据第七个多样化因素将长度在第七氨基酸范围内的H-CDR3区域多样化，根据第八个多样化因素将长度在第八氨基酸范围内的H-CDR3区域多样化，其中所述多样化因素是不同的。本发明的这个集合可以包含多样化人类或者人源化抗体H-CDR3区域，其中第一氨基酸范围具有约4到约5个氨基酸，第二氨基酸范围具有约6到约7个氨基酸，第三氨基酸范围具有约8到约9个氨基酸，第四氨基酸范围具有约10到约11个氨基酸，第五氨基酸范围具有约12到约13个氨基酸，第六氨基酸范围具有约14到约15个氨基酸，第七氨基酸范围具有约16到约17个氨基酸，第八氨基酸范围具有约18到约19个氨基酸，第九氨基酸范围具有约20到约22个氨基酸。
本发明的再一个目的是提供一种多样化人类或者人源化抗体H-CDR3区域的集合，其中第一氨基酸范围具有约4到约8个氨基酸，且其中第一个多样化因素要求：1位上丙氨酸的频率为约80％，2位上精氨酸的频率 为约60％，3位上甘氨酸的频率为约40％，7位上天冬氨酸的频率为约50％，8位上酪氨酸的频率为约40％。
另一方面，本发明提供了一种多样化人类或者人源化抗体H-CDR3区域的集合，其中第一氨基酸范围具有约9到约15个氨基酸，且其中第一个多样化因素要求：1位上丙氨酸的频率为约90％，2位上精氨酸的频率为约70％，10位上酪氨酸的频率为约20％，11位上酪氨酸的频率为约20％，12位上酪氨酸的频率为约30％，13位上苯丙氨酸的频率为约60％，14位上天冬氨酸的频率为约80％，15位上酪氨酸的频率为约40％。
本发明提供了一种多样化人类或者人源化抗体H-CDR3区域的集合，其中第一氨基酸范围具有约16到约22个氨基酸，且其中第一个多样化因素要求：1位上丙氨酸的频率为约90％，2位上精氨酸的频率为约60％，3位上天冬氨酸的频率为约30％，4位上甘氨酸的频率为约20％，5位上精氨酸的频率为约10％，6位上精氨酸的频率为约10％，7位上酪氨酸的频率为约20％，15位上酪氨酸的频率为约40％，16位上酪氨酸的频率为约50％，17位上酪氨酸的频率为约50％，18位上酪氨酸的频率为约60％，19位上酪氨酸的频率为约40％，20位上甲硫氨酸的频率为约50％，21位上天冬氨酸的频率为约95％，22位上缬氨酸的频率为约60％。
另一方面，本发明提供了一种多样化人类或者人源化抗体H-CDR3区域的集合，其中如果抗体H-CDR3区域的氨基酸长度为约9到约15个氨基酸，那么多样化由H-CDR3区域中高含量的甘氨酸和丝氨酸产生。在本发明的上下文中，与氨基酸或者其基团相关的术语“高含量”是指该氨基酸或者其基团的频率大于10％。
再一方面，本发明提供了一种多样化人类或者人源化抗体H-CDR3区域的集合，其中如果抗体H-CDR3区域的氨基酸长度为约16到约22个氨基酸，那么多样化由H-CDR3区域中高含量的丝氨酸、H-CDR3区域末端部分高含量的碱性氨基酸、HCDR3区域前端部分的天冬氨酸和整个H-CDR3区域中高含量的芳香氨基酸产生。
本发明的再一个目的是提供一种多样化人类或者人源化抗体H-CDR3区域的集合，其中如果抗体H-CDR3区域的氨基酸长度是5个氨基酸，那 么氨基酸组成为1位上60％的丙氨酸，20％的苏氨酸和0.58％的除半胱氨酸外所有天然存在氨基酸的混合物，2位上30％的精氨酸，30％的赖氨酸，30％的苏氨酸和0.55％的除半胱氨酸外所有天然存在氨基酸的混合物，3位上40％的天冬氨酸，40％的苯丙氨酸和0.58％的除半胱氨酸外所有天然存在氨基酸的混合物，4位上30％的天冬氨酸，30％的甘氨酸，30％的甲硫氨酸和0.63％的除半胱氨酸外所有天然存在氨基酸的混合物以及5位上30％的酪氨酸，30％的天冬氨酸和0.58％的除半胱氨酸外所有天然存在氨基酸的混合物。
本发明的另一个目的是提供一种多样化人类或者人源化抗体H-CDR3区域的集合，其中如果抗体H-CDR3区域的氨基酸长度是12个氨基酸，那么氨基酸组成为1位上85％的丙氨酸和15％的苏氨酸和缬氨酸的混合物，2位上70％的精氨酸和30％丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸和丙氨酸的混合物，9位上20％的丙氨酸、丝氨酸和酪氨酸的混合物以及0.63％的除半胱氨酸外所有天然存在的氨基酸，10位上60％的苯丙氨酸，10％的甲硫氨酸和0.58％的除半胱氨酸外所有天然存在的氨基酸，11位上80％的天冬氨酸，5％的甘氨酸和0.58％的除半胱氨酸外所有天然存在的氨基酸，以及12位上50％的酪氨酸，10％的缬氨酸和异亮氨酸的混合物和0.63％的除半胱氨酸外所有天然存在的氨基酸。
本发明的另一个目的是提供一种多样化人类或者人源化抗体H-CDR3区域的集合，其中如果抗体H-CDR3区域的氨基酸长度是20个氨基酸，那么氨基酸组成为1位上100％的丙氨酸，2位上50％的精氨酸和50％的赖氨酸，3位上30％的甘氨酸和0.55％的除半胱氨酸外所有天然存在的氨基酸，4位上20％的精氨酸，20％的甘氨酸，20％的亮氨酸和0.63％的除半胱氨酸外所有天然存在的氨基酸，14位上20％的丝氨酸，20％的苏氨酸，20％的半胱氨酸和0.63％的除半胱氨酸外所有天然存在的氨基酸，21位上95％的天冬氨酸以及22位上50％的缬氨酸和0.55％的除半胱氨酸外所有天然存在的氨基酸。
本发明还涉及一种多样化人类或者人源化抗体可变重链的集合，其包含具有不同氨基酸范围的、多样化人类或者人源化抗体H-CDR3区域的集 合，其中所述集合的多样性由如下产生：根据第一个多样化因素将长度在第一氨基酸范围内的H-CDR3区域多样化，根据第二个多样化因素将长度在第二氨基酸范围内的H-CDR3区域多样化。
另一方面，本发明还提供了一种多样化人类或者人源化抗体或者其功能性片段的集合，该片段的集合包含人类或者人源化抗体可变重链的集合，根据本发明，该重链的集合包含不同氨基酸范围的、多样化人类或者人源化抗体H-CDR3区域的集合。
再一方面，本发明还提供了一种合成的人类或者人源化抗体库，其包含多样化人类或者人源化抗体或者其功能性片段的集合，根据本发明，该抗体或其功能性片段的集合包含人类或者人源化抗体可变重链的集合。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种编码多样化人类或者人源化H-CDR3区域的核酸分子集合的制备方法，其包含合成多个DNA分子，其中每个DNA分子编码一个H-CDR3区域，其中所述H-CDR3区域具有不同的范围，其中根据第一个多样化因素，合成编码第一氨基酸范围内H-CDR3区域的DNA分子；并且其中根据第二个多样化因素，合成编码第二氨基酸范围内H-CDR3区域的DNA分子，其中所述多样化因素是不同的。
本发明还涉及一种编码根据本发明的多样化人类或者人源化抗体H-CDR3区域集合的核酸集合。
本发明还涉及一种编码氨基酸范围可变的、多样化人类或者人源化抗体H-CDR3区域集合的核酸集合，其中所述集合的多样性由如下产生：根据第一个多样化因素将长度在第一氨基酸范围内的H-CDR3区域多样化，根据第二个多样化因素将长度在第二氨基酸范围内的H-CDR3区域多样化，其中所述多样化因素是不同的。
本发明的又一个目的是提供一种得到不同长度的、多样化人类或者人源化抗体H-CDR3区域的集合的方法，其包括表达核酸集合。
应理解的是，本发明的上下文中，在其他多样化H-CDR3区域中一个或者多个氨基酸位置是保持恒定的。本领域技术人员应理解：为了在 H-CDR3区域中引入多样性的三核苷酸混合物的合成效率，以及克隆多种多样化H-CDR3区域的效率，在H-CDR3区域中插入一个或多个恒定位点是希望的。
这样，本发明的另一个目的是提供一种多样化人类或者人源化H-CDR3区域的集合，其中如果所述集合中成员的长度是4到8个氨基酸，那么应用于所述长度是4-8个氨基酸的所述成员的多样化因素在具有所述长度的所述成员的H-CDR3区域中定义了0，1，2或3个恒定的氨基酸位点。本发明还涉及一种多样化人类或者人源化H-CDR3区域的集合，其中如果所述集合中成员的长度是9到10个氨基酸，那么应用于所述长度是9到10个氨基酸的所述成员的多样化因素在具有所述长度的所述成员的H-CDR3区域中定义了0，1，2或3个恒定的氨基酸位点。
本发明还涉及一种多样化人类或者人源化H-CDR3区域的集合，其中如果所述集合中成员的长度是11到13个氨基酸，那么应用于所述长度是11到13个氨基酸的所述成员的多样化因素在具有所述长度的所述成员的H-CDR3区域中定义了0，1，2或3个恒定的氨基酸位点。本发明的另一个目的是提供一种多样化人类或者人源化H-CDR3区域的集合，其中如果所述集合中成员的长度是14个氨基酸，那么应用于所述长度是14个氨基酸的所述成员的多样化因素在具有所述长度的所述成员的H-CDR3区域中定义了0，1，2，3，4或5个恒定的氨基酸位点。
本发明还涉及一种多样化人类或者人源化H-CDR3区域的集合，其中如果所述集合中成员的长度是15-16个氨基酸，那么应用于所述长度是15-16个氨基酸的所述成员的多样化因素在具有所述长度的所述成员的H-CDR3区域中定义了0，1，2，3，4，5，6，7或8个恒定的氨基酸位点。
本发明的另一个目的是提供一种多样化人类或者人源化H-CDR3区域的集合，其中如果所述集合中成员的长度是16-17个氨基酸，那么应用于所述长度是16-17个氨基酸的所述成员的多样化因素在具有所述长度的所述成员的H-CDR3区域中定义了0，1，2，3，4，5，6，7或8个恒定的氨基酸位点。
本发明还涉及一种多样化人类或者人源化H-CDR3区域的集合，其中 如果所述集合中成员的长度是18个氨基酸，那么应用于所述长度是18个氨基酸的所述成员的多样化因素在具有所述长度的所述成员的H-CDR3区域中定义了0，1，2，3，4，5，6，7或8个恒定的氨基酸位点。
本发明还涉及一种多样化人类或者人源化H-CDR3区域的集合，其中如果所述集合中成员的长度是19个或更多氨基酸，那么应用于所述长度是19个或更多氨基酸的所述成员的多样化因素在具有所述长度的所述成员的H-CDR3区域中定义了0，1，2，3，4，5，6或7个恒定的氨基酸位点。
附图说明
图1：左侧对齐；图1b所描绘“楼梯”中的每一个台阶代表带有一个定义HCDR3长度的平均380个序列的共有序列。在左侧的对齐中，不同长度通过沿对角线加入另外的氨基酸残基对齐，从左到右长度依次增加。
图2：右侧对齐；图2b所描绘“楼梯”中的每一个台阶代表带有一个定义HCDR3长度的平均380个序列的共有序列。在右侧的对齐中，不同长度通过沿对角线加入另外的氨基酸残基对齐，从右到左长度依次增加。
图3a+3b+3c：中间对齐(侧面区域，环区，混合-中心)；右图所描绘的图中每一层代表带有一个定义HCDR3长度的平均380个序列的共有序列。在侧面区域对齐中，不同长度通过交替地沿对角线加入另外的氨基酸残基对齐，从外面中点到里面(从侧面区域到环区)长度依次增加。
黑灰色的方块示例新加入的残基。
图4：抗体可变区的编号图例。
具体实施方式
一方面，本发明特别提供了一种合成的人类或者人源化抗体H-CDR3区域的集合，这些区域具有本质像天然H-CDR3谱中的多样性，模拟了天然氨基酸的分布，这是通过根据特定的H-CDR区域长度，偏倚在编码 H-CDR3的DNA序列中随机的氨基酸分布而实现的。
对常规的数据库(例如Ig-BLAST)得到的人类抗体序列进行分析并用作决定H-CDR3区域氨基酸分布的基础，而不是仅使用有限的数据集，即已知的V、D和J片段。
从这个角度讲，本发明提供了一种抗体库，它是通过到目前为止被认为不可能构建的方法构建的。
本发明还提供了一种氨基酸长度不同的、多样化人类或者人源化抗体H-CDR3区域的集合，其中所述集合的多样性由如下产生：根据第一个多样化因素将长度在第一氨基酸范围内的H-CDR3区域多样化，以及根据第二个多样化因素将长度在第二氨基酸范围内的H-CDR3区域多样化。
本发明的上下文中，术语“多样化因素”是指对于每一个H-CDR3区域中任何给定范围的氨基酸残基，某个氨基酸在所述H-CDR3区域中一个或多个给定位置出现的频率。本发明的上下文中，一个氨基酸在给定位置的“频率”是指该氨基酸在该位置出现的可能性，根据此处阐明的教导，这个频率是0％-100％。在自然产生的人类抗体中，H-CDR3区域的长度在约4到35个氨基酸范围内变动。因而本发明预期每一个H-CDR3区域中氨基酸残基的长度可能为4到35个氨基酸，优选的是4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，1 8，19，20，21或者22个氨基酸残基长度，正如这里更为详细的描述，应用特定的多样化因素的氨基酸的范围会变化。本发明中人类或人源化的抗体和/或抗体H-CDR3区域能被应用到很多环境下，这里将作更为全面的描述。
一方面，本发明提供了根据二到四个多样化因素将具有不同氨基酸长度的H-CDR3区域多样化。因此，多样化人类或者人源化抗体H-CDR3区域的集合由如下产生：根据第一个多样化因素将长度在第一氨基酸范围内的H-CDR3区域多样化，根据第二个多样化因素将长度在第二氨基酸范围内的H-CDR3区域多样化。本发明的上下文中，第一个和第二个多样化因素是不同的。第一氨基酸范围具有约4到约13个氨基酸，第二氨基酸范围具有约14到约22个氨基酸。多样化人类或者人源化抗体H-CDR3区域集合的多样性的产生可能应用如下规律：第一个多样化因素适用于约4到 约9个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第二个多样化因素适用于约10到约16个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第三个多样化因素适用于约17到约22个氨基酸长度的H-CDR3区域成员。可选择的，多样化人类或者人源化抗体H-CDR3区域集合的多样性的产生，举例说明，应用如下规律：第一个多样化因素适用于约4到约8个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第二个多样化因素适用于约9到约13个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第三个多样化因素适用于约14到约1 8个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第四个多样化因素适用于约19到约22个氨基酸长度的H-CDR3区域成员。
另一方面，本发明提供了根据五到七个多样化因素将具有不同氨基酸长度的H-CDR3区域多样化。多样化人类或者人源化抗体H-CDR3区域集合的多样性的产生可能应用如下规律：第一个多样化因素适用于约4到约7个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第二个多样化因素适用于约8到约11个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第三个多样化因素适用于约12到约15个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第四个多样化因素适用于约16到约19个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第五个多样化因素适用于约20到约22个氨基酸长度的H-CDR3区域成员。多样化人类或者人源化抗体H-CDR3区域集合的多样性的产生也可能应用如下规律：第一个多样化因素适用于约4到约6个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第二个多样化因素适用于约7到约9个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第三个多样化因素适用于约10到约12个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第四个多样化因素适用于约13到约15个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第五个多样化因素适用于约16到约18个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第六个多样化因素适用于约19到约22个氨基酸长度的H-CDR3区域成员。多样化人类或者人源化抗体H-CDR3区域集合的多样性的产生也可能应用如下规律：第一个多样化因素适用于约4到约6个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第二个多样化因素适用于约7到约9个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第三个多样化因素适用于约10到约12个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第四个多样化因素适用于约13到约15个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第五个多样化因素适用于约16到约18个氨基酸长度的H-CDR3 区域成员，第六个多样化因素适用于约19到约20个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第七个多样化因素适用于约21到约22个氨基酸长度的H-CDR3区域成员。
另一方面，本发明提供了根据八到十个多样化因素将具有不同氨基酸长度的H-CDR3区域多样化。多样化人类或者人源化抗体H-CDR3区域集合的多样性的产生可能应用如下规律：第一个多样化因素适用于约4到约6个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第二个多样化因素适用于约7到约8个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第三个多样化因素适用于约9到约11个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第四个多样化因素适用于约12到约14个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第五个多样化因素适用于约15到约16个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第六个多样化因素适用于约17到约18个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第七个多样化因素适用于约19到约20个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第八个多样化因素适用于约21到约22个氨基酸长度的H-CDR3区域成员。可选择的，多样化人类或者人源化抗体H-CDR3区域集合的多样性的产生可能应用如下规律：第一个多样化因素适用于约4到约5个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第二个多样化因素适用于约6到约7个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第三个多样化因素适用于约8到约9个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第四个多样化因素适用于约10到约11个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第五个多样化因素适用于约12到约13个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第六个多样化因素适用于约14到约15个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第七个多样化因素适用于约16到约17个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第八个多样化因素适用于约18到约19个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第九个多样化因素适用于约20到约22个氨基酸长度的H-CDR3区域成员。多样化人类或者人源化抗体H-CDR3区域集合的多样性的产生也可能应用如下规律：第一个多样化因素适用于约4到约5个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第二个多样化因素适用于约6到约7个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第三个多样化因素适用于约8到约9个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第四个多样化因素适用于约10到约11个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第五个多样化因素适用于约12到约13个氨基酸长度的H-CDR3 区域成员，第六个多样化因素适用于约14到约15个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第七个多样化因素适用于约16到约17个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第八个多样化因素适用于约18到约19个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第九个多样化因素适用于约20到约21个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十个多样化因素适用于约22个氨基酸长度的H-CDR3区域成员。
另一方面，本发明提供了根据十一到十四个多样化因素将具有不同氨基酸长度的H-CDR3区域多样化。多样化人类或者人源化抗体H-CDR3区域集合的多样性的产生可能应用如下规律：第一个多样化因素适用于约4到约5个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第二个多样化因素适用于约6到约7个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第三个多样化因素适用于约8个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第四个多样化因素适用于约9到约10个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第五个多样化因素适用于约11个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第六个多样化因素适用于约12到约13个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第七个多样化因素适用于约14到约15个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第八个多样化因素适用于约16到约17个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第九个多样化因素适用于约18到约19个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十个多样化因素适用于约20个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十一个多样化因素适用于约21到约22个氨基酸长度的H-CDR3区域成员。多样化人类或者人源化抗体H-CDR3区域集合的多样性的产生也可能应用如下规律：第一个多样化因素适用于约4到约5个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第二个多样化因素适用于约6个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第三个多样化因素适用于约7个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第四个多样化因素适用于约8到约9个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第五个多样化因素适用于约10个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第六个多样化因素适用于约11到约12个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第七个多样化因素适用于约13个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第八个多样化因素适用于约14到约15个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第九个多样化因素适用于约16到约17个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十个多样化因素适用于约18个 氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十一个多样化因素适用于约19到约20个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十二个多样化因素适用于约21到约22个氨基酸长度的H-CDR3区域成员。多样化人类或者人源化抗体H-CDR3区域集合的多样性的产生可能应用如下规律：第一个多样化因素适用于约4到约5个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第二个多样化因素适用于约6个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第三个多样化因素适用于约7个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第四个多样化因素适用于约8到约9个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第五个多样化因素适用于约10个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第六个多样化因素适用于约11到约12个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第七个多样化因素适用于约13个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第八个多样化因素适用于约14到约15个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第九个多样化因素适用于约16到约17个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十个多样化因素适用于约18个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十一个多样化因素适用于约19到约20个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十二个多样化因素适用于约21个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十三个多样化因素适用于约22个氨基酸长度的H-CDR3区域成员。可选的，多样化人类或者人源化抗体H-CDR3区域集合的多样性的产生可能应用如下规律：第一个多样化因素适用于约4到约5个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第二个多样化因素适用于6个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第三个多样化因素适用于约7个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第四个多样化因素适用于约8个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第五个多样化因素适用于约9个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第六个多样化因素适用于约10到约11个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第七个多样化因素适用于约12个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第八个多样化因素适用于约13到约14个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第九个多样化因素适用于约15到约16个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十个多样化因素适用于约17个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十一个多样化因素适用于约18到约19个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十二个多样化因素适用于约20个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十三个多样化因素适用于约21个氨基酸长度 的H-CDR3区域成员，第十四个多样化因素适用于约22个氨基酸长度的H-CDR3区域成员。
另一方面，本发明提供了根据十五到十七个多样化因素将具有不同氨基酸长度的H-CDR3区域多样化。多样化人类或者人源化抗体H-CDR3区域集合的多样性的产生可能应用如下规律：第一个多样化因素适用于约4到约5个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第二个多样化因素适用于约6个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第三个多样化因素适用于约7个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第四个多样化因素适用于约8个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第五个多样化因素适用于约9个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第六个多样化因素适用于约10到约11个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第七个多样化因素适用于约12个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第八个多样化因素适用于约13个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第九个多样化因素适用于约14到约15个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十个多样化因素适用于约16个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十一个多样化因素适用于约17到约18个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十二个多样化因素适用于约19个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十三个多样化因素适用于约20个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十四个多样化因素适用于约21个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十五个多样化因素适用于约22个氨基酸长度的H-CDR3区域成员。多样化人类或者人源化抗体H-CDR3区域集合的多样性的产生可能应用如下规律：第一个多样化因素适用于约4到约5个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第二个多样化因素适用于约6个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第三个多样化因素适用于约7个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第四个多样化因素适用于约8个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第五个多样化因素适用于约9个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第六个多样化因素适用于约10到约11个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第七个多样化因素适用于约12个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第八个多样化因素适用于约13个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第九个多样化因素适用于约14个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十个多样化因素适用于约15个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十一个多样 化因素适用于约16个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十二个多样化因素适用于约17个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十三个多样化因素适用于约18到约19个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十四个多样化因素适用于约20个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十五个多样化因素适用于约21个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十六个多样化因素适用于约22个氨基酸长度的H-CDR3区域成员。多样化人类或者人源化抗体H-CDR3区域集合的多样性的产生可能应用如下规律：第一个多样化因素适用于约4个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第二个多样化因素适用于约5个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第三个多样化因素适用于约6到约7个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第四个多样化因素适用于约8个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第五个多样化因素适用于约9个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第六个多样化因素适用于约10个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第七个多样化因素适用于约11个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第八个多样化因素适用于约12个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第九个多样化因素适用于约13个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十个多样化因素适用于约14个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十一个多样化因素适用于约15个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十二个多样化因素适用于约16个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十三个多样化因素适用于约17到约18个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十四个多样化因素适用于约19个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十五个多样化因素适用于约20个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十六个多样化因素适用于约21个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十七个多样化因素适用于约22个氨基酸长度的H-CDR3区域成员。
另一方面，本发明提供了根据十八到十九个多样化因素将具有不同氨基酸长度的H-CDR3区域多样化。多样化人类或者人源化抗体H-CDR3区域集合的多样性的产生可能应用如下规律：第一个多样化因素适用于约4个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第二个多样化因素适用于约5个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第三个多样化因素适用于约6个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第四个多样化因素适用于约7个氨基酸长度的 H-CDR3区域成员，第五个多样化因素适用于约8个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第六个多样化因素适用于约9个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第七个多样化因素适用于约10个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第八个多样化因素适用于约11个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第九个多样化因素适用于约12个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十个多样化因素适用于约13个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十一个多样化因素适用于约14个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十二个多样化因素适用于约15个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十三个多样化因素适用于约16到约17个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十四个多样化因素适用于约18个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十五个多样化因素适用于约19个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十六个多样化因素适用于约20个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十七个多样化因素适用于约21个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十八个多样化因素适用于约22个氨基酸长度的H到CDR3区域成员。多样化人类或者人源化抗体H-CDR3区域集合的多样性的产生也可能应用如下规律：第一个多样化因素适用于约4个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第二个多样化因素适用于约5个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第三个多样化因素适用于约6个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第四个多样化因素适用于约7个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第五个多样化因素适用于约8个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第六个多样化因素适用于约9个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第七个多样化因素适用于约10个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第八个多样化因素适用于约11个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第九个多样化因素适用于约12个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十个多样化因素适用于约13个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十一个多样化因素适用于约14个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十二个多样化因素适用于约15个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十三个多样化因素适用于约16个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十四个多样化因素适用于约17个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十五个多样化因素适用于约18个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十六个多样化因素适用于约19个氨基酸长度的 H-CDR3区域成员，第十七个多样化因素适用于约20个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十八个多样化因素适用于约21个氨基酸长度的H-CDR3区域成员，第十九个多样化因素适用于约22个氨基酸长度的H-CDR3区域成员。
本领域技术人员会理解，多样化因素的数目总计可达到具有定义长度的H-CDR3区域成员中氨基酸位置的数目。优选的是，应用多达19个的多样化因素，而且本发明中多样化H-CDR3区域的集合可以联合形成多种多样化H-CDR3区域的集合，其形式是以单独的H-CDR3区域形式或者作为可变重链区或者免疫球蛋白链的全长或实质上的全长的一部分的形式。
实施例
下面非限制的例子通过指定某一多样化因素的参数，更为特定地说明了本发明的多种实施方案，所述多样化因素应用于氨基酸(aa)长度在特定范围内的H-CDR3区域。本领域技术人员会理解，根据下面提到的理论设计方案，只要没有偏离本发明的范围，某些多样性(氨基酸频率)偏离是允许的，因此，举例而言，可能有希望基于或者至少部分基于这样的理论设计，实施某种克隆效率来构建一个库。
为了准备H-CDR3设计，修改和编辑序列：
供分析的数据集来自NCBI服务器上的Ig-BLAST。下载包括Ig-BLAST数据记录的以下文件： ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/db/FASTA/igSeqProt.gz。总共下载了40,808条数据记录，分别是FASTA格式的人类、小鼠或者数据条目的名称标签上没有归属的记录。在名称标签中用MS-Word格式的关键字“人类”过滤数据，关于人类抗体的22,500个条目被提取出来。在关于人类抗体的22,500个条目中，有13,235个归属于重链，5,490个归属于轻链。剩余的抗体进一步归属于hc，lc-κ和lc-λ，因为它们的名称标签中没有关键字被发现。对于重链，在MS-Excel不同工作表中汇编了不同长度的长度依赖的H-CDR3集合。对于H-CDR3的分析，13,235个序列中有8,886个重链的序列可以 用于分析。
长度依赖的H-CDR3设计：
作为一个实例，根据三个多样化因素，得到了下面三个单独的设计：
4aa-7aa
8aa-14aa
15aa-23aa
Kabat中102位上，在8-23个氨基酸的长度中Y含量从50％降到5％，这个位点的V含量从12％升高到65％。另外，101位的D含量从75％升高到100％。为了实施长度范围中的不同氨基酸的发现，但不限制本发明的范围，在基于环区的设计中，决定用2个不同的多样化因素会更好：一个来自8-14个氨基酸，另一个来自15-23个氨基酸，而应用于4-7个氨基酸长度的H-CDR3区域的多样化因素可依照左边的设计。
对齐类型：
为了总结多个氨基酸长度的一种设计，下面对齐类型可作为包含8-14和15-23个氨基酸的库成员设计的典型选择(表1)：左侧对齐，右侧对齐和对称对齐。
表1：对齐类型；前三个和最后一个位点是H-CDR3区域侧翼的框架区的恒定氨基酸位点。
“楼梯”中的每一个台阶代表某一长度的共有序列。前三个位点代表临近框架区的部分：Kabat中92，93和94位的CAR区及位于Kabat中103位的FW4(WGQG)开端的W。
左侧对齐(表1+图1)：
对齐前三个位点(Kabat 96、97和98位)为方块形。这些位点位于V和D片段的边界上，可能是V编码的(即种系基因)。因此这些位点在组成上可能与HCDR3剩余的位点不同，而且保持分离。96位和97位与H-CDR3其他的位点不同，因为它们的Y含量降低，但是96位的D含量是升高的。最后五个位点(Kabat l、m、n、101和102位)包括主要的FDY序列，其也对齐为方块形。101和102位通常是J片段编码的，且由此表现出相似的氨基酸分布。
首先，用aa填充前三个和后五个位置后，左侧对齐从Kabat 99位开始，接连填满Kabat 99和“l”位之间的缺口。
右侧对齐(表1+图2)：
这里同样将Kabat 96、97和98位以及Kabat l、m、n、101和102位对齐为方块形，遵从与针对左侧对齐所描述的同样的考虑因素。首先，用aa填充前三个和后五个位置后，右侧对齐从Kabat“l”位开始，接连填满Kabat“l”和99位之间的缺口。
中间对齐(表1+图3a、3b、3c)：
关于结构方面，对称对齐是对齐的首选类型，另外对称对齐允许进行环中相互作用氨基酸的快速识别。在这里，新的氨基酸对称地加入某些位点。对称对齐在AHO 123位的中间进行，如在“Yet another numbering scheme forimmunoglobulin variable domains：an automatic modeling and analysis tool”(免疫球蛋白可变区的另一种编号方式，一种自动建模和分析工具)(A.Honegger，A.Plückthun，J.Mol.Biol(2001)309，657-670)中所描述。
有两种对称对齐是可能的：一种对齐是，在123位设置一个缺口，将序列转移到框架区，另一种对齐是将序列以123位为对称轴向123位转换，将序列分割成具有相同数目氨基酸的两个部分。第一种对齐描述了侧翼区氨基酸的分布(图3a)，而第二种对齐描述了H-CDR3区域中的环端(图3b)，当然也可以采用同样的序列并以另一种方法排列。对于环来讲，新的氨基酸在环的基础上对称加入。在混合中间对齐中(图3c)，序列朝向AHO 123位对称对齐，但是结合了环和侧翼区的对齐。围绕123位的五个 氨基酸的方块保持恒定，但是其他的序列被安排进侧翼区。可以用于抗体可变区的编号系统的示例如图4所示。
表2显示的是4-7个氨基酸长度H-CDR3区域的中间对齐(侧翼区)结果。“全部”代表半胱氨酸以外的全部19个氨基酸等量分布。
表2：4-7个氨基酸长度H-CDR3区域的中间对齐。
表3显示的是4-7个氨基酸长度H-CDR3区域的中间对齐(环区)结果。“全部”代表半胱氨酸以外的全部19个氨基酸等量分布。所有序列结果
环区，H-CDR3，4aa-7aa
表3：4-7个氨基酸长度H-CDR3区域的中间对齐。
表4显示的是4-7个氨基酸长度H-CDR3区域的左侧对齐结果。“全部”代表半胱氨酸以外的全部19个氨基酸等量分布。
表4：4-7个氨基酸长度H-CDR3区域的左侧对齐。
表5显示的是4-7个氨基酸长度H-CDR3区域的右侧对齐结果。“全部”代表半胱氨酸以外的全部19个氨基酸等量分布。
表5：4-7个氨基酸长度H-CDR3区域的右侧对齐。
表6显示的是8-14个氨基酸长度H-CDR3区域的中间对齐(侧翼区)结果。“全部”代表半胱氨酸以外的全部19个氨基酸等量分布。表7显示的是8-14个氨基酸长度H-CDR3区域的中间对齐(环区)结果。“全部”代表半胱氨酸以外的全部19个氨基酸等量分布。表8显示的是8-14个氨基酸长度H-CDR3区域的中间对齐(混合中间)结果。“全部”代表半胱氨酸以外的全部19个氨基酸等量分布。表9显示的是8-14个氨基酸长度H-CDR3区域的左侧对齐结果。“全部”代表半胱氨酸以外的全部19个氨基酸等量分布。表10显示的是8-14个氨基酸长度H-CDR3区域的右侧对齐结果。“全部”代表半胱氨酸以外的全部19个氨基酸等量分布。表11显示的是15-23个氨基酸长度H-CDR3区域的中间对齐(侧翼区)结果。“全部”代表半胱氨酸以外的全部19个氨基酸等量分布。表12显示的是15-23个氨基酸长度H-CDR3区域的中间对齐(环区)结果。“全部”代表半胱氨酸以外的全部19个氨基酸等量分布。表13显示的是15-23个氨基酸长度H-CDR3区域的中间对齐(混合中间)结果。“全部”代表半胱氨酸以外的全部19个氨基酸等量分布。表14显示的是15-23个氨基酸长度H-CDR3区域的左侧对齐结果。“全部”代表半胱氨酸以外的全部19个氨基酸等量分布。表15显示的是15-23个氨基酸长度H-CDR3区域的右侧对齐结果。“全部”代表半胱氨酸以外的全部19个氨基酸等量分布。
在另一个非限制性的示例中，本发明提供了一种具有不同长度的多样化H-CDR3区域的集合，其中根据第一个多样化因素，H-CDR3区域的多样性由将长度为约4到约8个氨基酸的在第一氨基酸范围内的H-CDR3区域多样化而产生，其中第一个多样化因素要求：1位上丙氨酸的频率为约80％，2位上精氨酸的频率为约60％，3位上甘氨酸的频率为约40％，7位上天冬氨酸的频率为约50％，8位上酪氨酸的频率为约40％(表16)。
表16：该表显示的是将长度为约4到约8个氨基酸的在第一氨基酸范围内的H-CDR3区域多样化的多样化因素示例。
在另一个非限制性的示例中，本发明提供了一种具有不同长度的多样化人类或者人源化抗体H-CDR3区域的集合，其中根据第一个多样化因素，H-CDR3区域的多样性由将长度为约9到约15个氨基酸的在第一氨基酸范围内的H-CDR3区域多样化而产生，其中第一个多样化因素要求：1位上丙氨酸的频率为约90％，2位上精氨酸的频率为约70％，10位上酪氨酸的频率为约20％，11位上酪氨酸的频率为约20％，12位上酪氨酸的频率为约30％，13位上苯丙氨酸的频率为约60％，14位上天冬氨酸的频率为约80％，15位上酪氨酸的频率为约40％。优选的是，氨基酸长度为约9到约15个氨基酸的人类或者人源化H-CDR3区域的多样性由H-CDR3区域中高含量的甘氨酸和丝氨酸产生(表17)。
表17：该表显示的是将长度为约9到约15个氨基酸的在第一氨基酸范围内的H-CDR3区域多样化的多样化因素示例。
在另一个非限制性的示例中，本发明提供了一种具有不同长度的多样 化人类或人源化抗体H-CDR3区域的集合，其中根据第一个多样化因素，H-CDR3区域的多样性由将长度为约16到约22个氨基酸的H-CDR3区域多样化而产生，其中第一个多样化因素要求：1位上丙氨酸的频率为约90％，2位上精氨酸的频率为约60％，3位上天冬氨酸的频率为约30％，4位上甘氨酸的频率为约20％，5位上精氨酸的频率为约10％，6位上精氨酸的频率为约10％，7位上酪氨酸的频率为约20％，15位上酪氨酸的频率为约40％，16位上酪氨酸的频率为约50％，17位上酪氨酸的频率为约50％，18位上酪氨酸的频率为约60％，19位上酪氨酸的频率为约40％，20位上甲硫氨酸的频率为约50％，21位上天冬氨酸的频率为约95％，22位上缬氨酸的频率为约60％(表18)。
表18：该表显示的是将长度为约16到约22个氨基酸的在第一氨基酸范围内的H-CDR3区域多样化的多样化因素示例。
此外，氨基酸长度为约16到约22个氨基酸的人类或者人源化H-CDR3区域集合的多样性由H-CDR3区域中高含量的丝氨酸、H-CDR3区域末端部分(C末端)高含量的碱性氨基酸、H-CDR3区域前端部分(N端)的天冬氨酸和整个H-CDR3区域中高含量的芳香氨基酸产生。
在本发明的上下文中，应理解，对于H-CDR3区域中任意给定的氨基酸位点，指定氨基酸位点上没有指定频率的氨基酸的出现率大致是均等的，或者这种位点上某些氨基酸比其他氨基酸具有更高的频率，在某些情况下，在一个或多个指定氨基酸位置上，某些氨基酸会被排除(例如半胱氨酸)。
在本发明的上下文中，通过在编码H-CDR3的DNA序列中偏倚完全随机的氨基酸分布，来模拟已知天然氨基酸的分布，从而实现了多样化H-CDR3区域的设计。多样化H-CDR3区域的产生利用三核苷酸诱变 (TRIM)技术( 
等，1994)进行，这种技术可以任意在单个位点合成任何需要的混合氨基酸，因此可以在任何位点引入任意的氨基酸偏倚(bias)。一般而言，TRIM技术依靠利用预先装配的三核苷酸作为标准DNA合成的输入物，由此避免了移码、终止密码子或者不需要的氨基酸，从而产生大量的序列多样性。因此，产生足够大的功能序列空间需要非常大的库。相应地，关于长度依赖的氨基酸组成的知识结合TRIM技术，可以设计出具有更高功能含量的更小的H-CDR3区域集合。
另一方面，本发明提供了一种包含多样化H-CDR3区域集合的多样化人类或者人源化抗体可变重链的集合，其中每个H-CDR3区域的多样性由如下产生：根据第一个多样化因素将长度在第一氨基酸范围内的H-CDR3区域多样化，根据第二个多样化因素将长度在第二氨基酸范围内的H-CDR3区域多样化，其中每个多样化因素是每个H-CDR3区域氨基酸长度的函数。而且，本发明提供了一种多样化人类或者人源化抗体或其功能片段的集合，根据本发明，集合中每个成员包含一个人类或者人源化抗体的可变重链。在本发明的上下文中，应理解，为了产生多样化人类或者人源化抗体或其功能片段的集合，本领域技术人员将可以修改多样化H-CDR3区域集合的理论设计。本领域技术人员应理解例如通过加入那些在彼此相同摩尔浓度时表现出低于这种频率的氨基酸的方法，在氨基酸以低频率出现方面(例如氨基酸的频率低于5％或者优选低于3％)修改设计是可以接受的；这样一来，多样化人类或者人源化抗体或其功能片段的集合可以通过包括这个浓度下这些氨基酸的混合物而产生。
另一方面，本发明提供了一种包含多样化人类或者人源化抗体或其功能片段集合的、合成的人类或者人源化抗体库。合成的共有序列可以覆盖人类基因组编码的抗体的结构谱。合成的人类或者人源化抗体库可以基于抗体或抗体片段，优选Fv，二硫化物连接的Fv，单链Fv(scFv)或者Fab片段，这些可以作为对抗新的靶抗原的特异性来源。
在本发明的上下文中，合成的人类或者人源化抗体库建立在计算机设计、合成核酸编码的氨基酸序列的基础上。例如，抗体序列的计算机设计是通过分析人类序列的数据库并用由此得到的数据设计多肽序列而实现 的。通过分析已知基因种系人类免疫球蛋白可变区的氨基酸序列，抗体基因可以根据序列同源性和标准结构分成多个亚家族(Chothia等，1992；Tomlinson等，1995)。由于氨基酸序列的高同源性和属于一个亚家族标准结构，7 VH和7 VL共有序列(主宰基因)可以被设计并结合产生49个主宰框架结合(Knappik等，2000)。主宰基因可以化学合成，从而通过引入所有的功能模块侧翼的独特性限制位点，产生完全模块化的基因结构。
设计和得到计算机创建序列的方法有描述，例如Knappik等，J.Mol.Biol.(2000)296：57；Krebs等，J.Immunol.Methods.(2001)254：67；以及授予Knappik等的美国专利第6,300,064号，在此全部通过引用并入本文。
另一方面，本发明提供了一种编码多样化人类或者人源化H-CDR3区域的核酸分子集合的制备方法。例如，这可通过合成多个DNA分子进行，其中每个DNA分子编码一个H-CDR3区域，且其中所述H-CDR3区域具有不同的范围。为此目的，根据第一个多样化因素，合成编码第一氨基酸范围内H-CDR3区域的DNA分子；根据第二个多样化因素，合成编码第二氨基酸范围内H-CDR3区域的DNA分子，这些多样化因素是不同的。
一方面，本发明提供了一种编码氨基酸范围不同的、多样化人类或者人源化抗体H-CDR3区域集合的核酸集合，其中所述集合的多样性由如下产生：根据第一个多样化因素将长度在第一氨基酸范围内的H-CDR3区域多样化，根据第二个多样化因素将长度在第二氨基酸范围内的H-CDR3区域多样化，其中所述多样化因素是不同的。
本发明还提供了得到多样化人类或者人源化抗体H-CDR3区域的集合的方法。根据本发明，这可以通过表达编码多样化人类或者人源化抗体H-CDR3区域集合的核酸集合来实现。
另一方面，本发明提供了识别一个或多个基因的方法，这些基因编码本发明中的一个或多个H-CDR3区域，而H-CDR3区域结合给定靶点。这可以例如通过表达H-CDR3区域，然后对它们进行筛选以分离出一个或多个结合给定靶分子的H-CDR3区域来实现。H-CDR3区域可以包含在抗体可变重链内。筛选可以利用本领域技术人员熟知的方法之一进行，例如噬菌体展示或者半胱氨酸展示技术(Cysdisplay)(例如美国专利第6,753,136 号中描述)。
在本发明的上下文中，人类或者人源化抗体库可以建立在来自人类供体基因片段和设计合成DNA相结合的基础上。例如，人类供体来源的编码轻链可变区和一系列重链区的片段与合成的DNA结合，这些合成的DNA编码在特定位点引入多样性的人类抗体序列。
正如这里公开的，本发明还提供了来源于抗体或其片段的变异或者优化了的抗体(或其片段)。抗体包含两条肽链，每一条包含一个(轻链)或三个(重链)的恒定区以及一个可变区(VL、VH)，后者在各种情况下均由四个FR区和三个间隔的CDR构成。抗原结合位点由一个或多个CDR形成，而FR区为CDR提供结构框架，并且在抗原结合中也起着重要的作用。通过改变CDR或FR区的一个或多个氨基酸残基，本领域技术人员能够常规地生产出变异或多样化的抗体序列，这些序列可以通过抗原来筛选，例如筛选出新的或改进的特性。
此外，这里提到的“免疫球蛋白”(Ig)定义为隶属IgG，IgM，IgE，IgA或IgD类(或其任何亚类)的一种蛋白质，其包括所有常规已知的抗体和其功能片段。抗体/免疫球蛋白的“功能片段”由此定义为保留抗原结合区的抗体/免疫球蛋白(例如IgG的可变区)的片段。抗体的“抗原结合区”通常位于抗体的一个或多个高变区中，即CDR-1、-2和/或-3区；但是可变“框架区”在抗原结合中也起着重要的作用，例如为CDR提供支架。优选的是，“抗原结合区”包含至少可变轻链(VL)的4-103个氨基酸残基和可变重链(VH)的5-109个氨基酸残基，更优选的是，包含可变轻链(VL)的3-107个氨基酸残基和可变重链(VH)的4-111个氨基酸残基，尤其优选的是，全部的轻链和重链(轻链的氨基酸1-109位和重链的1-113位；根据WO 97/08320编号)。本发明中使用的优选的免疫球蛋白类别为IgG。本发明的“功能片段”包括F(ab’)2片段，Fab片段和scFv的区域。F(ab’)2或Fab可以被改造，用来减小或完全消除CH1和CL域间发生的分子间二硫键相互作用。
这里提到术语“高变区”时，是指负责与抗原结合的、抗体的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基[即轻链可变区中 残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及重链可变区中31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991)]和/或那些来自“高变环”的残基[即轻链可变区中残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重链可变区中26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia & Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987)]。“框架”或“FR”残基是不同于这里定义的高变区残基的可变区残基。
“人类”抗体或功能性人类抗体片段由此定义为非嵌合的(例如非“人源化的”)和(全部或部分)不是来自非人物种的。人类抗体或功能性抗体片段可以来源于人类或者是合成的人类抗体。“合成的人类抗体”在这里定义为具有全部或部分序列来自计算机合成序列的抗体，这些合成序列是在分析已知人类抗体序列的基础上得到的。举例来说，计算机设计人类抗体序列或其片段是通过分析人类抗体或抗体片段序列的数据库并用由此得到的数据设计多肽序列来实现的。人类抗体或功能性抗体片段的另一个例子是，由人源抗体序列库(即这种库建立在人类自然来源提取抗体的基础上)中分离出的核酸编码得来的抗体或功能性片段。
“人源化抗体”或功能性人源化抗体片段在这里定义为：(i)是至少部分来自非人类来源(例如带有异源免疫系统的转基因小鼠)，抗体建立在人类基因种系序列的基础上；或(ii)是嵌合的，其中可变区至少有一部分是非人类来源的，恒定区是人类来源的；或(iii)是CDR移植的，其中可变区CDR至少有一部分是非人类来源的，而一个或多个可变区框架是人类来源的以及恒定区(如果有的话)是人类来源的。
Claims (7)
1.一种长度在4至23个氨基酸的、多样化人类或者人源化抗体H-CDR3区域的集合，其中该集合的多样性由如下产生：根据第一个多样化因素将长度在4至7个氨基酸的第一范围内的H-CDR3区域多样化，根据第二个多样化因素将长度在8至14个氨基酸的第二范围内的H-CDR3区域多样化，以及根据第三个多样化因素将长度在15至23个氨基酸的第三范围内的H-CDR3区域多样化，其中所述多样化因素是不同的，并且其中所述多样化因素是指对于每一个H-CDR3区域中任何给定范围的氨基酸残基，在所述H-CDR3区域中一个或多个给定位置处氨基酸出现的频率，其中所述第一氨基酸范围具有如表4所示的组成，其中所述第二氨基酸范围具有如表9所示的组成，其中所述第三氨基酸范围具有如表14所示的组成。
2.一种多样化人类抗体可变重链的集合，其包含根据权利要求1所述的多样化人类或者人源化抗体H-CDR3区域的集合。
3.一种多样化人类抗体或其功能性片段的集合，其包含根据权利要求2的人类或者人源化抗体可变重链的集合。
4.一种合成的人类抗体库，其包含根据权利要求3的多样化人类或者人源化抗体或其功能性片段的集合。
5.一种编码长度在4至23个氨基酸的多样化人类或者人源化H-CDR3区域的核酸分子集合的制备方法，其包含以下步骤：合成多个DNA分子，其中每个DNA分子编码一个H-CDR3区域，其中所述H-CDR3区域具有4至23个氨基酸的长度，其中根据第一个多样化因素，合成编码4至7个氨基酸的第一范围的H-CDR3区域的DNA分子；其中根据第二个多样化因素，合成编码8至14个氨基酸的第二范围的H-CDR3区域的DNA分子；以及其中根据第三个多样化因素，合成编码15至23个氨基酸的第三范围的H-CDR3区域的DNA分子，并且其中所述多样化因素是不同的，并且其中所述多样化因素是指对于每一个H-CDR3区域中任何给定范围的氨基酸残基，在所述H-CDR3区域中一个或多个给定位置处氨基酸出现的频率，其中所述第一氨基酸范围具有如表4所示的组成，其中所述第二氨基酸范围具有如表9所示的组成，其中所述第三氨基酸范围具有如表14所示的组成。
6.一种编码多样化人类或者人源化抗体H-CDR3区域集合的核酸集合，其根据权利要求5的方法生产。
7.一种编码长度在4至23个氨基酸的、多样化人类或者人源化抗体H-CDR3区域集合的核酸集合，其中所述集合的多样性由如下产生：根据第一个多样化因素将长度在4至7个氨基酸的第一范围内的H-CDR3区域多样化，根据第二个多样化因素将长度在8至14个氨基酸的第二范围内的H-CDR3区域多样化，以及根据第三个多样化因素将长度在15至23个氨基酸的第三范围内的H-CDR3区域多样化，其中所述多样化因素是不同的，并且其中所述多样化因素是指对于每一个H-CDR3区域中任何给定范围的氨基酸残基，在所述H-CDR3区域中一个或多个给定位置处氨基酸出现的频率，其中所述第一氨基酸范围具有如表4所示的组成，其中所述第二氨基酸范围具有如表9所示的组成，其中所述第三氨基酸范围具有如表14所示的组成。
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Achim Knappik et al.Fully Synthetic Human Combinatorial Antibody Libraries (HuCAL) Based on Modular Consensus Frameworks and CDRs Randomized with Trinucleotides.《J.Mol.Biol》.2000,第296卷摘要、第69页右栏第2段，第72页右栏第3段至73页右栏第3段. * |
| Chingwei V. Lee et al.High-affinity Human Antibodies from Phage-displayed Synthetic Fab Libraries with a Single Framework Scaffold.《J. Mol. Biol》.2004,第340卷摘要、第1088页右栏第22-27行. * |
| Michael zemlin et al.Expressed Murine and Human CDR-H3 Intervals of Equal Length Exhibit Distinct Repertoires that Differ in their Amino Acid Composition and Predicted Range of Structures.《J. Mol. Biol》.2003,第334卷全文. * |
| Yvelise Barrios et al.Length of the antibody heavy chain complementarity determining region 3 as a specificity-determining factor.《JOURNAL OF MOLECULAR RECOGNITION》.2004,第17卷全文. * |
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