JP5457009B2 - ヒトに適合したモノクローナル抗体における使用法 - Google Patents

Description

本発明は、齧歯類抗体のような非ヒトモノクローナル抗体のヒトへの適合化（ｈｕｍａｎ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ）で使用するためのヒト可変領域のフレームワーク（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）を選択する方法に関する。このフレームワークは、生殖細胞系列または体細胞起源であることができる。

抗体のヒトへの適合化は、異種配列をヒト抗体配列に最大限、置き換えると同時に、それらの抗原結合特異性を保存するための、ヒトの治療標的に対して異種モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を工作することを説明する一般用語である。この目的はこれら抗体の免疫原性を下げてそれらの治療的特性を向上させることにある。また生成する工作された抗体は、ヒト化またはＣＤＲ−移植（ｇｒａｆｔｅｄ）抗体として当該技術分野では知られている。

現在、抗体のヒトへの適合化に最も広く使用されている技術は、「ＣＤＲ移植（ＣＤＲ
ｇｒａｆｔｉｎｇ）」として知られている。この技術の科学的基礎は、抗体の結合特異性が主にその軽および重鎖可変領域（Ｖ−領域）の相補性決定領域（ＣＤＲ）として知られている３つの超可変ループ内に主に存在する一方、より保存されたフレームワーク領域（フレームワーク、ＦＷ；フレームワーク領域、ＦＲ）が構造的な支持機能を提供するとう点にある。ＣＤＲを適切に選択したＦＷに移植することにより、ある程度の、またはすべての抗体結合活性を生成する組換え抗体に移すことができる。ＣＤＲ移植による特異性の転移の最初の証明はハプテンニトロフェノールに関するものであった（非特許文献１）。

ＣＤＲを定める方法は十分に確立されてきたので、ＣＤＲ移植に重要となるのは移植に最適なヒト抗体アクセプターの選択である。ドナーＣＤＲまたはドナーＦＷのアミノ酸配列、あるいはドナー構造に最高の類似性を持つヒト抗体アクセプターを選択するための様々な方法が開発されてきた。これらすべての「ベストフィット（ｂｅｓｔ ｆｉｔ）」法は、大変合理的であるように見えるが、実際には１つの仮定、すなわち元の抗体に対しても最も類似している（アミノ酸配列または構造において）組換え抗体を生成することが、元の抗原結合活性を最高に保存するということに基づいている。これらの方法はすべて治療用の抗体を生成するために成功裏に応用されてきたが（例えば、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）、元になる仮説が真剣に試験されたことはなかった。

ベスト−フィット法の１つの潜在的問題は、ベスト−フィットの基準は数学的であるが、必ずしも生物学的ではないことである。相同性の程度により測定される適応度（ｆｉｔｎｅｓｓ）は、例えば同一、相同的、および類似しないアミノ酸残基または核酸配列に割り当てられた数値の和である。これら割り当てた値は多くの他の相同性評価系で主に確認されてきたが、他の系では重要とならないかもしれないわずかな差異が抗体のヒト適合化におけるベスト−フィットを計算するために重要となる可能性がある。

関連する問題は、ドナーについて同一または大変緊密な全適応度を有する２つのアクセプターが与えられたとしても、異なるＦＲでそれらの場所的な適応度が異なるかもしれないことである。まとめると、数学的モデルが抗体工学におけるドナー−アクセプター関係のベスト−フィットを計算するための要件を満たすとは未だに確証されていない。

さらに複雑なことは、抗体の２つの鎖の間の相互作用に関連する：ベスト−フィットの
重鎖アクセプターおよびベスト−フィットの軽鎖アクセプターは、ドナーの結合活性を最高に保存するためには互いに適応してしないかもしれない。鎖内の適応度を評価するために利用できる道具は無い。研究者は、より良いペアを見いだすために幾つかのエピトープに対して幾つかの抗体の重鎖および軽鎖を対合させた。しかしこれは抗体のヒトへの適合化について試されなかった。

理論的にはすべてのヒト生殖細胞系列配列が配列決定され、そして抗体のＦＷ調査に利用することができる。しかし実際にはこれまでに抗体のヒト化で使用されてきたヒトＶ領域の大部分が成熟抗体遺伝子、しばしばミエローマタンパク質のものに由来した。それらは体細胞突然変異を含む可能性がある。これらの突然変異は個体に独自であり、そこから再配列された遺伝子が派生し、したがって他の個体には外来と見られるだろう。生殖細胞系列のデータベースの配列は、この視点から一般に抗体のヒト化により適している。しかし２、３ダースのＶ遺伝子と、より少ないＪ遺伝子が利用できるだけである。したがって幾つかの文献では、非ヒト配列と高度に適合性がある生殖細胞系列のフレームワークを見いだすことは難しいかもしれない。対照的に、利用可能な成熟ヒト抗体遺伝子配列の数は、ヒト生殖細胞系列配列よりも数オーダーの規模で高い。このようにこのより大きいデータベース中で適合できる配列を得ることができる見込みは、より高い。

アクセプターＦＷに成熟抗体遺伝子を使用する問題は、軽鎖のための潜在的Ｖ−Ｊの組み合わせ、または重鎖のためのＶ−Ｄ−Ｊの組み合わせのすべてが成熟遺伝子で示されるわけではない点である。すなわち、緊密に対合しているＶ遺伝子がうまく対合しないＪセグメントに連結される状況が生じる恐れがある。非特許文献５により記載されたマウス抗−Ｔａｃモノクローナル抗体のヒト化は、その例である。ＮＢＲＦ−ＰＩＲデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｓｃ．ｅｄｕ／ｇｅｎｅｒａｌ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｐａｃｋａｇｅｓ／ｎｂｒｆ−ｐｉｒ／ｎｂｒｆ．ｈｔｍｌ）に対する抗−ＴａｃＶ_Ｈ領域の比較では、ヒトミエローマタンパク質ＥｕのＶ_Ｈ領域が最高度の相同性（ＶＤＪ_Ｈに対して５７％同一）を有することが示された。しかしＥｕ Ｖ_Ｈ領域のフレームワーク４は幾つかのアミノ酸を有し、恐らくＥｕ Ｊ_Ｈセグメントによりコードされているが、これはヒトＪ_Ｈセグメントでは異例である。これによりＥｕフレームワーク４と抗−Ｔａｃのそれとの間に良くないペアを生じた。既知の機能的ヒトＪ_Ｈセグメント（その中には６個ある）のアミノ酸配列に対する抗−ＴａｃＪ_Ｈ領域（フレームワーク４およびフレームワーク４−ＣＤＲ３の近位末端）の別個の比較では、ヒトＪ_Ｈ４がＥｕ Ｊ_Ｈよりも一層よく対合することが示される。この例では、ＶおよびＪ要素の別個の比較が齧歯類とヒト抗体配列との間の全可変領域の比較よりも有利であることを示唆している。現在は、この種の個別比較のための道具を直ちに利用することができない。

ＣＤＲ中のすべてのアミノ酸が抗原結合に関与しているわけではない。すなわち抗原−抗体相互作用に重要なこれら残基のみを移植すること、所謂、特異性決定残基の移植（ＳＤＲ−移植）が、生じる組換え抗体におけるヒト抗体配列の内容（ｃｏｎｔｅｎｔ）をさらに増加させるであろうと提案されてきた（非特許文献６；非特許文献７）。この方法を応用するには抗体構造ならびに抗体−抗原接触残基に関する情報が必要であり、これらは利用できないことが多い。たとえそのような情報を利用できても、ＳＤＲを同定する信頼性のある系統的方法は無く、したがってＳＤＲ−移植はこれまでほとんどが基本的な調査レベルに留まっている。

最近、「ヒトフレイムワークシャフリング（ｈｕｍａｎ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）」と呼ばれる新規方法が開発された（非特許文献８）。この技術はＣＤＲをコードするＤＮＡフラグメントをヒトＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４をコードするＤＮＡフラグメントに連結し、これによりドナーのＣＤＲとヒトＦＲとの間のすべての組み合わせのライブラリーを生成することにより行われる。この方法は成功裏に応用され
てきたが、２つの潜在的問題がある。第１は生じた抗体のＦＲは、すべてヒト起源でも非連続的ＦＷに由来する可能性があり、したがって自然ではない。これはこれらの不自然なＦＷがヒトで免疫原性となるかどうか知ることが残る。第２に、理論的にライブラリーが極端に大きくなる可能性があり、そしてスクリーニングおよびアッセイ能力に対する高い要求を出す。

このようにヒトに適合した抗体を作成するための改善された方法に対する必要性が存在する。

参考文献

Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５，１９８６ Ｔｅｍｐｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：２６６−７１，１９９１ Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：４１８１−４１８５，１９９１ Ｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９６８−７６，１９９４ Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９−１００３３，１９８９ Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５−３４，２００５ Ｇｏｎｚａｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４０：３３７−４９，２００４ Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：４３−６０，２００５

発明の要約
本発明の１つの観点は、ヒトに適合した抗体分子の作成に使用するヒト生殖細胞系列抗体配列の選択法であって、この方法は：
ａ．非ヒト抗体可変領域用のペプチド配列を得；
ｂ．非ヒト抗体可変領域用のペプチド配列の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）の輪郭を描き（ｄｅｌｉｎｅａｔｉｎｇ）：
ｃ．ＶＨ、ＶＫ、Ｖλ、ＪＨ、ＪＫおよびＪλ遺伝子サブ−ライブラリーを含んでなるヒト生殖細胞系列抗体遺伝子ペプチド配列のライブラリーを準備し；
ｄ．非ヒト抗体に対して最大のＣＤＲおよびＦＲ類似性を有するペプチド配列のサブセットを、ヒト生殖細胞系列遺伝子ライブラリーから選択し；
ｅ．工程ｄで選択したヒト生殖細胞系列抗体の重鎖配列のサブセットを：
ｅ１．ＣＤＲ１およびＣＤＲ２ループと非ヒト抗体との長さの適合性の比較；および
ｅ２．ＣＤＲ１およびＣＤＲ２ループと非ヒト抗体との配列の類似性
に基づき選択し：
ｆ．工程ｄで選択したヒト生殖細胞系列抗体の軽鎖配列のサブセットを：
ｆ１．ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ループの一部と非ヒト抗体との長さの適合性の比較；および
ｆ２．ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ループの一部と非ヒト抗体との配列の類似性に基づき選択し：
ｇ．重鎖Ｊ遺伝子のペプチド配列のサブセットを、非ヒト抗体のフレームワーク４とＪＨ遺伝子領域との間の配列類似性に基づきヒト生殖細胞系列ＪＨ遺伝子サブ−ライブラリーから選択し：
ｈ．軽鎖Ｊ遺伝子のペプチド配列のサブセットを、非ヒト抗体のフレームワーク４とＪＫおよびＪλ遺伝子領域との間の配列類似性に基づきヒト生殖細胞系列ＪＫおよびＪλ遺伝子サブ−ライブラリーから選択し：
ｉ．ヒトに適合した抗体の作成に使用するヒト抗体重鎖配列を選択するために、ヒト重鎖に関する工程ｅからのＦＲ１、２および３の選択と工程ｇからのＦＲ４の選択とを合わせ；そして
ｊ．ヒトに適合した抗体の作成に使用するヒト抗体軽鎖配列を選択するために、ヒト軽鎖に関する工程ｆからのＦＲ１、２および３の選択と工程ｈからのＦＲ４の選択とを合わせる、
工程を含んでなる。

本発明の別の観点は、ヒトに適合した抗体分子の作成に使用する体細胞突然変異を含むヒト抗体配列の選択法であって、この方法は：
ａ．非ヒト抗体可変領域用のペプチド配列を得；
ｂ．非ヒト抗体可変領域用のペプチド配列の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）の輪郭を描き：
ｃ．ヒト体細胞抗体遺伝子のペプチド配列のライブラリーを準備し；
ｄ．非ヒト抗体の重および軽鎖に対して最大のＣＤＲおよびＦＲ類似性を有するペプチド配列のサブセットをヒト体細胞遺伝子ライブラリーから選択し；
ｅ．ヒトに適合した抗体の作成に使用するために、工程ｄで選択したヒト体細胞抗体の重鎖配列のサブセットを、：
ｅ１．ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ループと非ヒト抗体との長さの適合性の比較；および
ｅ２．ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ループと非ヒト抗体との配列の類似性
に基づき選択し：そして
ｆ．ヒトに適合した抗体の作成に使用するために、工程ｄで選択したヒト体細胞抗体の軽鎖配列のサブセットを：
ｆ１．ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ループと非ヒト抗体との長さの適合性の比較；および
ｆ２．ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ループと非ヒト抗体との配列の類似性
に基づき選択する
工程を含んでなる。

発明の詳細な説明
限定する訳ではないが、本明細書に引用する特許および特許出願を含むすべての刊行物は完全に説明されているように参照により全部、本明細書に編入する。

本明細書および特許請求の範囲で使用するように、単数形の“ａ”、“ａｎｄ”および“ｔｈｅ”は内容が明白に他を示さない限り複数の指示物を含む。すなわち例えば「ヒトに適合した抗体（ａ ｈｕｍａｎ−ａｄａｐｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という指示は、１もしくは複数のヒトに適合した抗体を指す。

他に定義しない限り、本明細書で使用するすべての技術的および科学的用語は本発明が属する分野の当業者により通常に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載するものに類似または等価の方法を本発明の実施または試験に使用することができるが、例示的方法を本明細書には記載する。

用語「抗体」は、免疫グロブリンまたは抗体分子および抗体フラグメントを意味する。一般に抗体は特異的抗原に対する結合特異性を現すタンパク質またはポリペプチドである。完全（ｉｎｔａｃｔ）な抗体は、２つの同一な軽鎖および２つの同一な重鎖からなるヘ
テロ四量体の糖タンパク質である。典型的には各軽鎖が１つの共有ジスルフィド結合により重鎖に連結されているが、ジスルフィド結合の数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変動する。また各重および軽鎖は、規則的に間隔が空いた鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は１つの末端に可変ドメイン（ＶＨ）、続いて幾つかの定常ドメインを有する。各軽鎖は１つの末端に可変ドメイン（ＶＬ）、およびもう一端に定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第１定常ドメインに並び、そして軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインに並んでいる。脊椎動物種の抗体軽鎖は、２つの明らかに異なる型、すなわちカッパ（κ）およびラムダ（λ）の１つにそれらの定常ドメインのアミノ酸配列により割り当てられる。

免疫グロブリンは５つの主要クラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭに重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に基づき割り当てることができる。ＩｇＡおよびＩｇＧはさらにアイソタイプＩｇＡ_１、ＩｇＡ_２、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３およびＩｇＧ_４のサブクラスに分類される。

抗体は構成的に発現され、そして形質細胞により分泌される分泌タンパク質である。また抗体はハイブリドーマ生成のような標準的方法により不滅化された形質細胞を使用して、あるいは抗体重鎖および／もしくは軽鎖遺伝子をミエローマ細胞のような不滅化Ｂ細胞、またはチャイニーズハムスター卵母（ＣＨＯ）細胞、植物細胞および昆虫細胞のような他の細胞型へトランスフェクションすることにより生産することもできる。

用語「抗体フラグメント」は完全な抗体の一部、一般に完全な抗体の抗原結合または可変領域を意味する。抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２およびＦｖフラグメント、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、可変重鎖および可変軽鎖が１つのポリペプチド鎖としてリンカーにより連結されたｓｃＦｖ分子のような単鎖抗体分子、および少なくとも２つの完全な抗体から形成される多重特異性抗体を含む。

ヒト化された、ヒトに適合した、およびＣＤＲ移植抗体は、非ヒト種からのＣＤＲおよびヒト抗体に由来する可変領域のフレームワーク領域および定常領域を含むキメラモノクローナル抗体である。

本発明は抗体分子のヒト化工学用（ｈｕｍａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）の分子構造、モデリングおよび配列に基づく新規な構造に基づくヒト適合化法を提供する。この方法はその配列がヒトの配列に高度に類似し（免疫原性の可能性を下げるために）、そして抗原に対するその親和性が親の非ヒト、典型的にはマウスの抗体に匹敵するヒト抗体分子を生じる。この方法の工程は、マウスの配列をヒトの配列のデータベースと全配列の全体的相同性について、および異なる場所の領域について比較し、そして候補となるヒトの配列を同定するために幾つかのフィルターにかけることを含んでなる。そのようなフィルターに関する選択基準には、ヒト配列におけるマウスＣＤＲのループ長の保存、ループ中の配列相同性、および任意に抗体の分子モデルを構築することにより決定されるような幾つかの明確かつ誘導可能な認識特性の適用を含む。

非ヒト抗体からＣＤＲをヒトのフレームワークに移すことが、抗原に対する結合の低下をもたらすことはよく知られている。低下した親和性は、抗原とヒト適合化抗体との間の分子認識における損失による。自由エネルギーの損失に関して元となる原因は、改変した抗体−抗原界面での抗体表面における構造的変化である。この界面には、ＶＬおよびＶＨ中に各３つの６種すべてのＣＤＲ、そしてまた新規ＶＬおよびＶＨの改変されたパッキングによりこの領域中で誘導された構造的変化も関与する。失った親和性の幾つかを獲得するために、幾つかのグループはヒトフレームワーク中の残基をマウス残基に変異させ、これは文献では復帰突然変異し呼ばれている。本出願で記載するヒト適合化法は復帰突然変
異の導入を必要としない。ヒトに適合した抗体の親和性の保持は、フレームワークの選択で使用される原理によるものである。フレームワークは全分子にわたる全体的な配列同一性に基づくだけでなく、ＶＬおよびＶＨに各３つの６つのすべてのＣＤＲループのループ長および配列同一性にも基づいて選択される。そのような原理で抗体の認識表面上の混乱（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）は確実に最少となり、そして結果的に抗体の抗原に対する親和性の混乱も非ヒトからヒトに適合した抗体へ移った時に最少となる。

配列および構造に基づく基準の組み合わせが本発明の方法で使用される。本発明の方法は、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｎａｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）でのヒト免疫グロブリンデータベース、およびヒト生殖細胞系列免疫グロブリンデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）およびタンパク質構造データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｐ．ｏｒｇ）のようなデータベース中の配列および構造を抽出し、そして分析する方法を含む。

生殖細胞系列ＶおよびＪの遺伝子配列は、ＶＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）データベースからダウンロードされた。ＶＢａｓｅは、現在リリースされているＧｅｎｂａｎｋおよびＥＭＢＬデータライブラリーにあるものを含め、数千の公開された配列から編集されたすべてのヒト生殖細胞系列可変領域配列の包括的ディレクトリーである。このデータベースは、ヒト抗体遺伝子のシークエンシングおよびマッピングに関する研究の延長としてタンパク質工学に関するＭＲＣセンター（ＭＲＣ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）で、数年にわたり開発されてきた。このデータベースは重および軽鎖ＶおよびＪ遺伝子に関する配列を含む。フレームワークは４つの短いフレームワーク領域（ＦＲ）からなる。図３から分かるように、ＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３はＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の一部と一緒に生殖細胞系列Ｖ遺伝子フラグメントによりコードされ、一方、ＦＲ４は生殖細胞系列Ｊ遺伝子フラグメントによりコードされる。非ヒト配列を体細胞突然変異を含むヒト抗体配列に対して調査するために、ＮＣＢＩに由来するヒト免疫学データベース（ｎａｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を使用することができる。

配列の輪郭を描きる（ｄｅｌｉｎｅａｔｉｏｎ）ために広く使用されている抗体のＣＤＲ割り当てのための２つの体系がある。ＫａｂａｔのＣＤＲ定義（ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ）は、抗体配列の可変性に基づいている。ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲの定義は、抗体の３次元構造およびＣＤＲループのトポロジーに基づく。本発明の方法では、この２つの方法の一致点を使用してＣＤＲを定める。軽鎖ＣＤＲの場合、Ｋａｂａｔの定義を使用する。重鎖ＣＤＲ３の場合は、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの両定義は同一であり、そしていずれも使用することができる。重鎖ＣＤＲ１の場合、Ｋａｂａｔの定義は第１システインから８残基後に始まり、一方、Ｃｈｏｔｈｉａの定義はこのシステインから３残基後に始まる。この場合、Ｃｈｏｔｈｉａの定義を使用した。Ｋａｂａｔの定義はＣＤＲ１の終結パターンに使用し、これはＷにＶ、ＩまたはＡのような疎水性アミノ酸が続く。Ｃｈｏｔｈｉａの定義はこのＣＤＲについて４残基前に終了する。この場合、ＣＤＲ２の終結定義についてＫａｂａｔのパターンを使用した。ＶＨ−ＣＤＲ２の場合、Ｋａｂａｔの定義を使用した。しかしほとんどの抗体構造において、この配列に基づく定義はＣＤＲ２に属するようにＦＲ３の一部に割り当てる。すなわち、このＣＤＲのより短い変更体（これはこのＣＤＲのＣ−末端領域について７残基前に終了する）も使用することができるだろう。場合により、マウス可変領域の分子モデルが構築される。このモデルはＣＤＲループの割り当てに関するガイドとして使用する。表１は本発明の方法に使用できる例示的ＣＤＲの割り当てを示す。

上記のＣＤＲの定義は、非ヒト配列に対して最高の全体的類似性、そしてまた最大の長さの適合性およびＣＤＲループにおける配列類似性を有するヒト配列を同定するために使用する。

ヒト生殖細胞系列の重および軽鎖の選択のための本発明の方法の流れ図を図１および２に示す。

本発明の方法は以下の基準を満たすヒト配列の選択を提供する：
１．ヒトの配列は４つすべてのフレームワークおよび３つのＣＤＲを網羅する全分子長にわたりマウスの配列と有意な同一性を有する。
２．ヒトの配列はＣＤＲ１、２および３の長さを最大に保存し、すなわちヒトおよびマウスの配列のアライメントは、３つのＣＤＲで最少数の欠失および挿入を有する。
３．ヒトのデータベース中の配列の中で、選択された配列はＣＤＲ１、２および３のマウス配列と有意な相同性を有する。

ヒトに適合した抗体分子の作成に使用するヒト抗体配列を選択する方法の１つの態様では以下の工程を含んでなる：
ａ．非ヒト抗体可変領域用のペプチド配列を得、典型的には非ヒト抗体はマウスまたはラットのような齧歯類に由来する。ペプチド配列の情報は、非ヒト抗体可変領域遺伝子のヌクレオチド配列から推論することができる。これらの遺伝子は当業者に周知な技術により単離され、クローン化され、そして配列決定されることができる。
ｂ．非ヒト抗体可変領域のペプチド配列のＣＤＲおよびＦＲの輪郭を描きる。
ｃ．ＶＨ、ＶＫ、Ｖλ、ＪＨ、ＪＫおよびＪλ遺伝子のサブ−ライブラリーを含んでなるヒト生殖細胞系列の抗体遺伝子ペプチド配列のライブラリーを準備する。
ｄ．非ヒト抗体に対して最大のＣＤＲおよびＦＲ類似性を有するペプチド配列のサブセットを、ヒト生殖細胞系列遺伝子ライブラリーから選択する。非ヒト配列はＢＬＡＳＴプログラムを使用して全長について生殖細胞系列遺伝子のデータベースに対する類似性が調査され（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））、そして最高のＢＬＡＳＴスコアを有する最高の候補が選択される。この工程は重および軽鎖について行う。非ヒト重鎖はヒト生殖細胞系列ＶＨ遺伝子に対して調査される；非ヒト軽鎖はヒト生殖細胞系列ＶＫおよびＶλ遺伝子サブライブラリーに対して調査される。
ｅ．工程ｄで選択したヒト抗体の重鎖配列のサブセットを、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２ループと非ヒト抗体との長さの適合性の比較、ならびにＣＤＲ１およびＣＤＲ２ループと非ヒト抗体との配列の類似性に基づき選択し、複合スコアを使用して上記２つの基準を評価する。ＢＬＯＳＵＭ６２置換マトリックスのような標準突然変異マトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９（１９９２））を、非ヒトおよびヒト配列のＣＤＲ領域のアライメントを採点するために使用し、そして挿入および／または欠失がＣＤＲループにある場合、大きなペナルティを適用する。このプロセスはＰｉｐｅｌｉｎｅ Ｐｉｌｏｔ
（商標）プロトコールを使用して自動化された（カリフォルニア州、サンディエゴのＡｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃから利用可能なモジュラーソフトウェア開発環境）。任意に使用者はスコアおよび配列アライメントを見直すことができ、そしてＦＲ１、２および３に使用するための１組のヒト生殖細胞系列遺伝子を選ぶことができる。
ｆ．工程ｄで選択したヒト抗体の軽鎖配列のサブセットを、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ループの一部と非ヒト抗体との長さの適合性の比較、ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ループの一部と非ヒト抗体との配列の類似性に基づき選択し、複合スコアを使用して工程ｅで上に検討した２つの基準を評価する。
ｇ．重鎖Ｊ遺伝子のペプチド配列のサブセットを、非ヒト抗体のフレームワーク４とＪＨ遺伝子領域との間の配列類似性に基づきヒト生殖細胞系列ＪＨ遺伝子サブ−ライブラリーから選択する。
ｈ．軽鎖Ｊ遺伝子ペプチド配列のサブセットを、非ヒト抗体のフレームワーク４とＪＫおよびＪλ遺伝子領域との間の配列類似性に基づきヒト生殖細胞系列ＪＫおよびＪλ遺伝子サブ−ライブラリーから選択する。
ｉ．ヒトに適合した抗体の作成に使用するヒト抗体重鎖配列を選択するために、ヒト重鎖に関する工程ｅからのＦＲ１、２および３の選択と工程ｇからのＦＲ４の選択とを合わせる。
ｊ．ヒトに適合した抗体の作成に使用するヒト抗体軽鎖配列を選択するために、ヒト軽鎖に関する工程ｆからのＦＲ１、２および３の選択と工程ｈからのＦＲ４の選択とを合わせる。

全工程は視覚的な作業の流れの環境でＰｉｐｅｌｉｎｅ Ｐｉｌｏｔ（商標）スクリプトを使用して自動化された。使用者は特定の使用者が定める基準を、スコア、対応するアライメントおよび生殖細胞系列遺伝子の名前の表示、または出力配列数の設定のようなプロセスに対して適用することができる。

本発明の方法はヒト抗体の生殖細胞系列遺伝子データベースまたは体細胞突然変異を含むヒト抗体遺伝子データベースを用いて使用することができる。体細胞突然変異を持つヒト抗体遺伝子データベースの場合、工程ｅ）およびｆ）には３種すべてのＣＤＲの長さの適合性および配列類似性が関与し、そして工程ｇ）およびｈ）には必要ない。得られた可変軽および重鎖配列は、Ｆａｂ（１もしくは幾つか）を生成するために使用することができる。これらＦａｂを適切な定常領域と組み合わせることにより、完全長のモノクローナル抗体配列を得ることができる。

配列に基づく方法に加えて、構造／モデルに基づく取り組みを使用することもできる。非ヒト抗体Ｖ領域の分子モデルは、分子の構造的特徴を引き出すために、したがって目的物の特性を改善するための工作に高度に有用である。モデルの品質は大変重要であり、そして相同的な構造的鋳型に基づくモデルの場合、標的および鋳型配列の信頼性のあるアライメントが高度に重要である。例えばＳａｌｉ ａｎｄ Ｂｌｕｎｄｅｌｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３４：７７９（１９９３）を参照にされたい。図４に示す流れ図は、モデリングのための構造的鋳型を選択するために使用される。この図は鋳型が４種すべてのフレームワークおよび３種すべてのＣＤＲを含むＶＬおよびＶＨの完全配列の全体的相同性に基づき選択され、次いでループ長およびまた３つのＣＤＲの配列類似性に基づき最高位のヒットが順位付けされることを示す。

配列比較との組み合わせにおいて分子モデルを使用することは、配列に基づく方法がそれら自体は最もしばしば配列が離れている空間的に隣接する残基が関与する３次元的特徴による機能的特性を捕捉できないので、有用な選択となる。配列に基づくＫａｂａｔの分類は、ＣＤＲに属するような抗体構造におけるフレームワークの部分を割り当てる。分子モデルはフレームワークおよびＣＤＲ領域の境界を正しく定めるために使用され、すなわ
ちこれが配列に基づく割り当てを補正する。ここで使用する構造的モデリングおよび配列分析法の組み合わせはヒトのフレームワークを選択するために有用であり、そしてまたヒトに適合化した抗体の親和性の成熟にも有用である。

本発明は新規な抗体のヒト適合化法を提供する。この方法はアクセプターＦＷ配列の供給源としてヒトの生殖細胞系列ＶおよびＪ遺伝子を使用し、すべてのアクセプター分子をＦＷの類似性および非ヒト抗体とヒト生殖細胞系列配列との間の他の基準に基づき順位付けし、そして代表的なヒトに適合化された抗体のライブラリーを作成する。

上記定義のアルゴリズムは修飾して、ウェット−ラボ（ｗｅｔ−ｌａｂ）海中実験室のスリーニング能力に合うようにＦＷライブラリーのサイズを変更することができる。齧歯類の抗体の重および軽鎖について、対応するＦＷライブラリーは各々に作成され、そしてすべてのヒトに適合化された重および軽鎖がスクリーニングのために組み合わされる。このように本発明の全ＦＷライブラリー法のアルゴリズムは、親和性の保持に重要となる見込みが高い最適な鎖内相互作用を有するヒト重鎖および軽鎖の好ましいペアを見いだす可能性を上げる。

ヒト重鎖および軽鎖フレームワークの好ましいペアを本発明の方法により選択した後、非ヒト可変領域からの各ＣＤＲ領域、および選択したフレームワークを代表するヒト重鎖および軽鎖の少なくとも１つのメンバーからのフレームワーク領域を含むヒトに適合化した新規分子を構築することができ、ここで新規分子は非ヒト抗体が結合するものと同じ抗原に結合するヒトに適合化した抗体または抗体フラグメントである。当業者に周知な組換えＤＮＡ技法を使用して、ヒトに適合化した分子を構築することができる。次いでこの新規分子は、各分子の抗原に対する結合親和性をスクリーニングし、そして最適なヒトに適合化された抗体または抗体フラグメントを選択することにより選ぶことができる。

本発明の方法は現行のヒト適合化技術に優る多くの利点を提供する。例えばＳＤＲ−移植のようなすべての他の構造に基づく方法とは対照的に、本発明の方法は詳細な抗体または抗体−抗体複合体構造に関する情報を必要としない。また本発明の他の利点は、本発明が同じＣＤＲドナーに関して幾つかの比較可能な、しかし明確に異なるヒト化抗体を提供できる点である。これは治療用抗体の開発に特に有用であり、研究者はリード候補を選択し、そして１もしくは複数の続く、またはバックアップ候補を有することができるようになる。

本発明の方法に関連する別の利点は、それらの明確な配列を持つこれらの比較可能な候補が種々の化学的、生理学的および製薬学的特性を有する可能性がある点である。これは治療用抗体の改善の他の観点で利用することができる。例えば低い溶解性の抗体のＣＤＲは、ヒトフレームワークライブラリーに合わせることができ、そして改善された溶解性を持つ良好なバインダー（ｂｉｎｄｅｒ）を生じた抗体から選択することができる。

本発明は、以下の具体的な非限定的例を参照にしてこれから記載する。

実施例１
キメラモノクローナル抗体のヒト適合化
インフリキシマブ（ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）は約１４９ｋＤａの分子量を持つキメラＩｇＧκモノクローナル抗体である。インフリキシマブはヒトの腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ_α）に特異的に結合し、そしてヒト定常およびマウス可変領域からなり（インフリキシマブのアミノ酸配列（ｃＡ２）に関しては米国特許第５，６５６，２７２号明細書の図１６Ａ＆１６Ｂを参照にされたい）、そしてＲＥＭＩＣＡＤＥ（商標）という登録商標で
販売されている。インフリキシマブは１１９アミノ酸（配列番号１）の重鎖可変領域と、１０７アミノ酸（配列番号２）の軽鎖可変領域を有する。

本発明の方法は、ヒト生殖細胞系列ＶＨおよびＶＬを選択するためにインフリキシマブの重および軽鎖可変領域配列に適用された。選択されたＶＨ領域はヒト生殖細胞系列配列のＶＨ３ ３−７２およびＪＨ４と同一である。これを図５でインフリキシマブのフレームワーク領域と比較する。図６に示す選択したＶＬ領域のフレームワーク部分は、ヒト生殖細胞系列配列ＶＫ１ Ａ１０およびＪＫ３と同一である。選択したＶＨ領域の配列をヒト定常鎖ＩｇＧκ Ｈ、ＣＡＡ７５０３０（Ａ２３６Ｖの置換を持つ）と組み合わせた。選択したＶＬ領域の配列をヒト定常鎖ＩｇＧκ ＣＡＡ０９１８１と組み合わせた。

抗体のヒトＴＮＦ_αへの結合についてＥＬＩＳＡ形式を使用して評価した。簡単に説明すると、ヒトＴＮＦ_αを９６ウェルプレートのウェルに塗布し、そして候補ｍＡｂを種々の濃度（２０〜０．２ｎｇ／ｍｌ）でインキュベーションし、そして結合した抗体をＨＲＰ−標識抗−ヒトカッパ軽鎖ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ，ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）で検出した。完全長クローン（Ｃ７と命名）に関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を図７に示し、そして完全長の合成インフリキシマブ（Ｃ３）およびＲＥＭＩＣＡＤＥ（商標）に対する適合性が示される。

Ｃ７およびＲＥＭＩＣＡＤＥへのＴＮＦ_α結合のＢＩＡＣＯＲ（３対の実験）による結合測定は表２に示し、そしてまた２つの抗体の適合性を証明する。

実施例２
マウスモノクローナル抗体のヒト適合化
本発明の方法は、ヒト生殖細胞系列ＶＨおよびＶＬを選択してヒトに適合化した抗−ＲＳＶ抗体Ｂ２１Ｍを構築するために、抗−ＲＳＶ １０１Ｆと命名されたマウスの中和ＲＳウイルス（ＲＳＶ）Ｆタンパク質抗体に適用した。１０１Ｆ抗体は１２０アミノ酸の重鎖可変領域（配列番号３）、および１１２アミノ酸の軽鎖可変領域（配列番号４）を有する。

選択したＶＨ領域のフレームワークはヒト生殖細胞系列配列ＶＢ ２−０５およびＪＨ４と同一である。これを図８のマウス抗−ＲＳＶ Ｆ１０１フレームワーク領域と比較する。選択したＶＨ領域配列を、ヒト定常鎖Ｐ０１８５７−ＩｇＧ１（Ｖ２３４Ａに置換を持つ）と組み合わせた。選択したＶＬ領域のフレームワークは、ヒト生殖細胞系列配列ＶＢ Ｂ３およびＪＫ１と同一である。これを図９でマウス抗−ＲＳＶ Ｆ１０１フレームワーク領域と比較する。この選択したＶＬ領域の配列を、ヒト定常鎖Ｐ０１８３４−ＩｇＧκ（Ｓ２２７Ｌに置換を持つ）と組み合わせた。 抗体は、組換えで発現したＲＳＶ Ｆタンパク質の細胞外ドメインへの結合についてＥＬＩＳＡ形式を使用して評価した。簡単に説明すると、ヒトＲＳＶ Ｆタンパク質を９６ウェルプレートのウェルに塗布し、そして候補ｍＡｂを種々の濃度（１０〜０．２ｎｇ／ｍｌ）でインキュベーションし、そして結合した抗体をＨＲＰ−標識抗ヒトカッパ軽鎖抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ，ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）で検出した。ヒトに適合化した完全長Ｂ２１Ｍクローンに関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を、１０１Ｆ抗体およびハビリズマブ（ｐａｖｉｌｉｚｍａｂ）の市販品であるＳＹＮＡＧＩＳ（商標）の滴定曲線と一緒に図１０に示す。ヒトに適合化したＢ２１Ｍはマウス１０１Ｆ抗体およびＳＹＮＡＧＩＳ（商標）に対する適合性を示した。ＲＳＶ Ｆタンパク質結合に関するＢＩＡＣＯＲによる結合測定は表３に示し、そしてまた２つの抗体の適合性を証明する。Ｂ２１Ｍもキメラ抗−１０１Ｆ抗体およびＳＹＮＡＧＩＳ（商標）に匹敵するウイルス中和を現す（表３を参照）。

方法の確実性を試験するために、ヒト適合化法で最高位のヒットとして選択されたさらに４種の軽鎖を使用してヒトに適合化した抗−ＲＳＶ抗体を構築した。４つのフレームワークはヒトの配列ＶＢ Ａ１７、ＶＢ Ａ１０、ｇｉ：２０１５０１２８およびＶＢ Ａ３と同一である。最初の２つの配列および４番目の配列はヒト生殖細胞系列のデータベースに由来し、そして３番目の配列はＨｕＩｇ配列である。上記ＶＨと組み合わせたこれら４種のＶＬを、Ｂ２１Ｍ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２６Ｂ、Ｂ２８ＡおよびＢ２８Ｂと呼ぶ。これら４種すべての分子はＢ２１Ｍに対して類似の結合プロフィアルを有する（図１１を参照）。

本発明は今、完全に記載され、当業者が添付する特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱せずに、それに対する多くの変更および修飾を行うことができることは明白である。

ヒト生殖細胞系列重鎖のデータベースを使用した、マウス抗体の重鎖のヒト適合化のための流れ図を示す。 ヒト生殖細胞系列軽鎖のデータベースを使用した、マウス抗体の軽鎖のヒト適合化のための流れ図を示す。 重および軽鎖可変領域のための抗体遺伝子組換えを具体的に説明する。 抗体モデリングアルゴリズムの流れ図を表す。共通構造の鋳型が利用できない場合、鎖は個別にモデル化され、そして組み合わされる。ｐｄｂはタンパク質データバンクデータベース（ｗｗｗ．ｐｄｂ．ｏｒｇ）を表す。 ヒトに適合したＣ７とキメラインフリキシマブとの間のＶＨ領域の比較を表す（マウスＶＨ）。破線は同一残基を表す。 ヒトに適合したＣ７とキメラインフリキシマブとの間のＶＬ領域の比較を表す（マウスＶＬ）。破線は同一残基を表す。 完全長のヒトに適合したＣ７、研究室で合成したインフリキシマブ（Ｃ３）およびインフリキシマブの市販品のＲＥＭＩＣＡＤＥ（商標）に関するＥＬＩＳＡ結合滴定曲線を表す。 ヒトに適合化したＢ２１Ｍおよびマウス抗−ＲＳＶ Ｆ１０１抗体との間のＶＨ領域の比較を表す。破線は同一残基を表す。 ヒトに適合化したＢ２１Ｍおよびマウス抗−ＲＳＶ Ｆ１０１抗体との間のＶＬ領域の比較を表す。破線は同一残基を表す。 キメラ抗−ＲＳＶ Ｆ１０１抗体、パビリズマブの市販品であるＳＹＮＡＧＩＳ（商標）およびヒトに適合化したＢ２１Ｍに関するＦタンパク質結合ＥＬＩＳＡを表す。 ５種のヒトに適合化した分子、Ｂ２６Ａ、Ｂ２６、Ｂ２８Ａ、Ｂ２８ＢおよびＢ２１ＭのＦタンパク質結合ＥＬＩＳＡの比較を表す。

Claims (4)

1. 非ヒト抗体可変領域に対する全体的な類似性に基づきヒトフレームワークを選択することを含んでなるヒトに適合した抗体の作成方法であって：
   ａ．非ヒト抗体可変領域のペプチド配列を取得する工程、
   ｂ．非ヒト抗体可変領域のポリペプチドにおける相補性決定領域１、２および３（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）ならびにフレームワーク領域１、２、３および４（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）の輪郭を描く工程、
   ｃ．ヒト可変領域（Ｖ）および連結領域（Ｊ）生殖細胞系列遺伝子によりコードされるポリペプチド配列のライブラリーを準備する工程、
   ｄ．工程ｃで準備されたポリペプチド配列のライブラリーから、非ヒト抗体可変領域の完全長ポリペプチド全体に対して最大の類似性を有するヒトＶ生殖細胞系列遺伝子によりコードされるポリペプチド配列の第一のサブセットを選択する工程、
   ｅ．前記ポリペプチド配列の第一サブセットから、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２において最も類似するそれらのポリペプチドを、工程ｄで選択されるポリペプチド配列が重鎖可変領域をコードするポリペプチドであるときは非ヒト抗体可変領域に匹敵するＣＤＲ１およびＣＤＲ２のアミノ酸配列および長さに基づいて選択し、かつ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３において最も類似するそれらのポリペプチドを、工程ｄで同定されるポリペプチドが軽鎖可変領域をコードするポリペプチド配列であるときはＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列および長さに基づいて選択する工程、
   ｆ．工程ｃで準備されたポリペプチド配列のライブラリーから、非ヒト抗体可変領域のフレームワーク領域によりコードされるポリペプチド配列に対して最大の類似性を有するヒトＪ生殖細胞系列遺伝子にコードされるポリペプチドの第二のサブセットを選択する工程、
   ｇ．工程ｄで取得される第一のサブセットを工程ｆで取得される第二のサブセットと合わせることにより非ヒト抗体可変領域に最大の相同性を示すヒト抗体可変領域のポリペプチド配列を生じさせる工程、
   ｈ．非ヒト抗体可変領域の複数のＣＤＲを工程ｇで生じたヒト抗体可変領域中に移してヒトに適合した抗体可変領域を形成する工程、および
   ｉ．ヒトに適合した抗体可変領域を発現してヒトに適合した抗体を作製する工程
   を含んでなる上記方法。
2. 可変領域が重鎖可変領域または軽鎖可変領域である、請求項１に記載の方法。
3. ヒト抗体生殖系列遺伝子がＶＨ、ＶＫ、Ｖλ、ＪＨ、ＪＫおよびＪλ配列から選択される、請求項１に記載の方法。
4. ヒトに適合した抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＡ型である、請求項1に記載の方法。