CN105358575B

CN105358575B - 干扰素α和ω抗体拮抗剂

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Publication number: CN105358575B
Application number: CN201480015798.5A
Authority: CN
Inventors: E.基; J.康诺尔; C.黄; J.乔丹; X.林-施米德特; J.罗; L.卢; C.马丁内斯; G.奥布莫洛娃; R.斯万森
Original assignee: Janssen Biotech Inc
Current assignee: Janssen Biotech Inc
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-13
Publication date: 2020-09-22
Anticipated expiration: 2034-03-13
Also published as: US20180002418A1; US20140271648A1; CA2906526C; MX366124B; AU2019200589A1; KR20150128849A; JP2016518330A; US9902770B2; WO2014151422A1; CN105358575A; EA038502B1; US10155809B2; EP2970461A4; EP2970461A1; AU2014235003A1; CA2906526A1; IL241052B; JP2019081766A; ZA201507659B; BR112015022988A2

Abstract

本发明提供了广泛中和的干扰素‑α和干扰素‑ω抗体拮抗剂、编码所述抗体或片段的多核苷酸以及制备和使用上述物质的方法，所述物质和方法可用于治疗与IFNα和IFNω的生成增加相关联的疾病。I型IFN是一类细胞因子，所述细胞因子均通过遍在表达的异二聚体受体(IFNAR)进行信号传导，从而产生抗病毒、抗增殖和免疫调节的效应。

Description

干扰素α和ω抗体拮抗剂

技术领域

本发明涉及广泛中和的干扰素-α和干扰素-ω抗体拮抗剂，编码抗体或片段的多核苷酸、以及制造和使用上述物质的方法。

背景技术

I型IFN是一类细胞因子，该细胞因子均通过遍在表达的异二聚体受体(IFNAR)进行信号传导，从而产生抗病毒、抗增殖和免疫调节的效应。在人体中，I型IFN由至少12个IFNα蛋白亚型以及IFNβ、IFNε、IFNκ和IFNω各一个亚型进一步结合。I型IFN的诱导响应于无菌和微生物配体而发生。尽管I型IFN的抗病毒和抗增殖效果已经在临床中用于治疗感染性疾病和肿瘤适应症，但I型IFN的拮抗剂正被开发以用于免疫介导的炎性适应症。

许多免疫介导的炎性疾病，诸如SLE、I型糖尿病、牛皮癣、原发性干燥病、系统性硬化病和类风湿性关节炎，均证明I型IFN可升高到不同的程度，如通过存在于全血和/或组织中的通常称为IFN-特征的IFN诱导基因转录物的过量所确定。

目前用于狼疮的临床开发的I型IFN拮抗剂方法包括使用抗IFNα抗体中和IFNα亚型而非其他I型IFN(β,ε,κ,ω)的多种方法，所述抗体诸如在以下专利中所述的那些：美国专利7,087,726、美国专利8,025,882和美国专利申请公布US2008/0160030。临床实验数据表明，用抗IFNα抗体治疗过的患者中I型IFN特征部分减少(Merrill等人，Ann Rheum Dis70:1905-1913,2011；Yao等人，Arthritis Rheum 60:1785-1796,2009)，并且在干扰素特征度量标准(ISM)-低中到严重活性狼疮受试者的预先指定的生物标记定义组中，在第24周，SLE的病征和症状、发斑速率和类固醇负担均得以改善。在预定义为ISM高的患者中没有观察到任何功效(Kalunian等人，2012ACR/ARHP Annual Meeting；Abstract#2622，2012)。

抗IFNAR1抗体是治疗狼疮的另一个选择(Wang等人，2013；ClinicalPharmacology&Therapeutics accepted article preview 14February2013；doi:10.1038/clpt.2013.35)。IFNAR1阻断预计将破坏由所有I型IFN(包括IFNβ)诱导的IFN信号传导。由于编码IFNβ的基因的特异性缺失引发病毒宿主相比于相似暴露的具有功能性IFNβ的小鼠而言易感性显著，所以IFNβ可在抗病毒防御中发挥更关键的作用(Lazear等人，JVirol 85:7186-7194,2011；Deonarain等人，J Virol 74:3404-340,2000；Deonarain等人，Circulation 110:3540-3543,2004；Gerlach等人，J Virol 80:3438-3444,2006)。

因此，需要另外的抗体来治疗狼疮和其他免疫介导的炎性疾病。

附图说明

图1示出了由图1A)100U/ml内源白细胞IFN(病毒诱导)或图1B)250U/ml重组人IFNω在特定浓度下诱导的对全血中IP-10释放的抑制。

图2示出了对I型IFN的抑制，该抑制是由来自系统性红斑狼疮(SLE)患者的免疫复合物诱导的，该复合物由所示的不同抗体构成。与单独的抗IFNα抗体相比，抗IFNα1和抗IFNω的组合、抗IFNα2和抗IFNω的组合、或抗IFNα3和抗IFNω的组合提供更显著的抑制。广泛中和抗IFNα/IFNω抗体(M43)显示出对总活性的进一步抑制。

图3示出了使用抗IFNω、抗IFNα抗体或两者的组合，升高的SLE基因特征的抑制百分比(％)。将未经抗体处理的情况下基线升高的IFN诱导基因表达归一化为100％。

图4示出了IFNω/FabM43复合物的总体分子结构。标记为H的是VH；标记为L的是VL，左上方是IFNω。

图5示出了图5A)的IFNα4A/Fab357复合物和图5B)的IFNω/Fab357复合物的总体分子结构。对于Fab仅示出Fv部分。Fab537是C2595的Fab。

图6A)示出了IFNα4A/FabM88复合物的总体分子结构。图6B)示出围绕抗原结合位点的表位区域的一部分的代表性电子密度(2mFo-DFc为1.5σ)。标记为H的是VH；标记为L的是VL；左上方是IFNα4A。

图7示出了IFNα4A的结构及其与IFNω和IFNα的比较。图7A)示出了IFNα4A。标记了五个主要的螺旋。还标记了紧挨着短螺旋片段的长连接环AB。图7B)示出了IFNω(pdb代码3se4)并且图7C)示出了IFNβ(pdb id 1au1)。图7D)示出了与IFNβ的结构比对。椭圆框表示AB螺旋片段周围的主要差异。

图8.通过M88中和的模式。IFNω/IFNΑR1/IFNΑR2结构(pdb id 3se4)和M88/IFNα4在IFN上重叠。

发明内容

本发明的一个方面是分离的单克隆抗体，该单克隆抗体结合至人干扰素ω(IFNω)和至少四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种人干扰素α(IFNα)亚型并中和其活性。

在本发明的其他方面，该分离的抗体竞争结合到人IFNω和人IFNα亚型IFNαB2、IFNαF、IFNαG和/或IFNαJ1上，其中所述分离的抗体包含：

SEQ ID NO:23的重链可变区(VH)氨基酸序列和SEQ ID NO:24的轻链

可变区(VL)氨基酸序列；或

SEQ ID NO:27的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:28的VL氨基酸序列。

在本发明的另外方面，该分离的抗体在SEQ ID NO:1的一个或多个残基F27、L30和R33处结合IFNω4a；该分离的抗体在SEQ ID NO:19的一个或多个残基F27、L30和R33处结合至IFNα4a；该分离的抗体抑制系统性红斑狼疮(SLE)免疫复合物诱导的IFN的活性。

本发明的另外的方面是编码本发明的抗体的分离的多核苷酸以及药物组合物，该药物组合物包含本发明的抗体和药学上可接受的载体。

本发明的另一方面是一种治疗或预防与IFNα和IFNω生成增加相关联的疾病的方法，该方法包括将治疗有效量的本发明的分离抗体向对其有需求的患者施用足以治疗或预防该疾病的时间。在本发明的一个另外的方面，与IFNα和IFNω生成增加相关联的疾病是系统性红斑狼疮(SLE)。

本发明的另一方面是在对其有需求的患者体内抑制IFNω和IFNα亚型IFNαB2、IFNαF、IFNαG和/或IFNαJ1与IFNAR的相互作用的方法，该方法包括将本发明的分离抗体向患者施用足以预防IFNω和IFNα亚型IFNαB2、IFNαC、IFNαF、IFNαG和/或IFNαJ1与IFNAR的相互作用的时间。

具体实施方式

本说明书中所引用的所有出版物(包括但不限于专利和专利申请)均以引用方式并入本文，如同在本文中完整给出。

应当了解，本文所用的术语只是为了描述具体实施例的目的，并非旨在进行限制。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。

虽然与本文所述的那些方法和材料相似或等效的任意方法和材料都可以用于检验本发明的实践中，然而本文中描述示例性材料和方法。在描述和要求保护本发明时，将使用以下术语。

如本文所用，术语“特异性结合”或“特异性地结合”或“结合”是指抗体以比针对其他抗原更高的亲和力结合于预定的抗原。通常，抗体以1×10^-7M或更小，例如1×10^-8M或更小、1×10^-9M或更小、1×10^-10M或更小、1×10^-11M或更小、或1×10^-12M或更小的解离常数(K_D)结合于预定的抗原，通常K_D为其结合至非特异性抗原或表位(例如BSA、酪蛋白)的K_D的至少十倍。可以使用标准程序来测量解离常数。然而，特异性结合至预定抗原的抗体可能对其他相关的抗原具有交叉反应性，例如对于来自其他物种(同源)的相同预定抗原，诸如人或猴，例如食蟹猕猴(Macaca fascicularis)(cynomolgus,cyno)或黑猩猩(Pan troglodytes)(chimpanzee,chimp)具有交叉反应性。特异性结合至预先确定的抗原的抗体可进一步结合在两个或多个不同抗原诸如干扰素α(IFNα)和干扰素ω(IFNω)之间共享的表位；即抗体与IFNα和IFNω交叉反应。

如本文所用，术语“中和”或“中和抗体”或“抗体拮抗剂”意指通过任意机制部分抑制或完全抑制干扰素α(IFNα)和/或干扰素ω(IFNω)的生物活性的抗体或抗体片段。中和抗体可使用如下所述对IFNα和/或IFNω的生物活性的测定来鉴定。IFNα和/或IFNω中和抗体可使所测量的IFNα和/或IFNω生物活性抑制20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

如本文所用，术语“干扰素-α”(IFNα)意指人α干扰素的所有天然亚型。天然的IFNα由多于23种紧密相关的蛋白亚型组成，这些蛋白亚型由具有高度结构同源性的不同基因编码(Weissmann和Weber，Prog.Nucl.Acid.Res.Mol.Biol.,33:251,1986；Roberts等人，J.Interferon Cytokine Res.18:805-816,1998)。人IFNα亚型为至少IFNαA(IFNα2)(SEQID NO:5)、IFNαB2(IFNα8)(SEQ ID NO:6)、IFNαC(IFNα10)(SEQ ID NO:7)、IFNαD(IFNα1)(SEQ ID NO:8)、IFNαF(IFNα21)(SEQ ID NO:9)、IFNαG(IFNα5)(SEQ ID NO:10)和IFNαH(IFNα14)(SEQ ID NO:11)、具有P34H取代的IFNαI(IFNα17)(SEQ ID NO:12)、IFNαJ1(IFNα7)(SEQ ID NO:14)、IFNαK(IFNα6)(SEQ ID NO:14)、IFNα4b(IFNα4)(SEQ ID NO:15)和IFNαWA(IFNα6)(SEQ ID NO:16)。人干扰素的命名详见：http://www_genenames_org/genefamilies/_IFN。

如本文所用的，术语IFNω意指具有一定氨基酸序列的人IFNω，该氨基酸序列如SEQ ID NO:1和UniProt登录号P05000所示。

术语“I型干扰素”意指人干扰素-α的所有天然亚型以及干扰素-β、干扰素-ε、干扰素-ω和干扰素-κ的一个亚型，这些干扰素都结合至通用干扰素受体IFNAR上。

如本文所用，术语“IFNAR”意指熟知的异二聚体干扰素受体，即IFNAR1和IFNAR2。IFNAR1和IFNAR2蛋白序列分别如SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32所示。IFNAR1成熟的胞外域跨SEQ ID NO:31的第28-436位残基，而IFNAR2成熟的胞外域跨SEQ ID NO:32的第27-243位残基。

如本文所用，术语“抗体”含义广泛且包括：免疫球蛋白分子，包括多克隆抗体；单克隆抗体，包括鼠、人、人适应性、人源化和嵌合单克隆抗体；抗体片段；由至少两个完整抗体或抗体片段所形成的双特异性或多特异性抗体；二聚体、四聚体或多聚体抗体；以及单链抗体。

免疫球蛋白可根据重链恒定域氨基酸序列被指定为五种主要种类，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgA和IgG进一步亚分类为同种型IgA₁、IgA₂、IgG₁、IgG₂、IgG₃和IgG₄。任何脊椎动物物种的抗体轻链可基于其恒定域的氨基酸序列被指定至两种明显不同类型中的之一，即κ(κ)和λ(λ)。

术语“抗体片段”是指免疫球蛋白分子的一部分，其保留重链和/或轻链抗原结合位点，诸如重链互补决定区(HCDR)1、2和3，轻链互补决定区(LCDR)1、2和3，重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)。抗体片段包括熟知的Fab、F(ab')2、Fd和Fv片段以及由一个VH域组成的域抗体(dAb)。VH域和VL域可经由合成接头连接在一起以形成各种类型的单链抗体设计，其中在VH域和VL域由单独的单链抗体构建体表达的情况下，VH/VL域在分子内或分子间配对，以形成单价抗原结合位点，诸如单链Fv(scFv)或双价抗体(diabody)；例如在国际专利公布WO1998/44001，国际专利公布WO1988/01649，国际专利公布WO1994/13804，国际专利公布WO1992/01047中有所描述。

抗体可变区由被3个“抗原结合位点”中断的“构架”区组成。使用多个术语来定义抗原结合位点：(i)三个在VH(HCDR1、HCDR2、HCDR3)中且三个在VL(LCDR1、LCDR2、LCDR3)中的互补决定区(CDR)，基于序列变异性(Wu和Kabat，J Exp Med 132:211-50,1970；Kabat等人，Sequences ofProteins ofImmunological Interest，第5版。Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.,1991)。(ii)三个在VH(H1、H2、H3)中且三个在VL(L1、L2、L3)中的“超变区”、“HVR”或“HV”，是指抗体可变域中的在结构上超变的区域，如Chothia和Lesk所定义(Chothia和Lesk，Mol Biol 196:901-17,1987)。其他术语包括“IMGT-CDR”(Lefranc等人，Dev Comparat Immunol 27:55-77,2003)和“特异性决定残基用途”(SDRU)(Almagro,Mol Recognit17:132-43,2004)。国际ImMunoGeneTics(IMGT)数据库(http://www_imgt_org)提供了抗原结合位点的标准化编号和定义。CDR、HV与IMGT划分之间的对应性描述于Lefranc等人，Dev Comparat Immunol 27:55-77,2003。

如本文所用，“Chothia残基”是抗体VL和VH残基，其根据Al-Lazikani来编号(Al-Lazikani等人，JMol Biol 273:927-48,1997)。

“框架”或“框架序列”是可变区的除了被定义为抗原结合位点的那些序列之外的其余序列。因为抗原结合位点可以由如上所述的不同术语定义，所以框架的精确氨基酸序列取决于如何定义抗原结合位点。

“人抗体”或“完全人抗体”是指包含来源于人免疫球蛋白序列的可变区和恒定区序列的抗体。本发明的人抗体可包括替换，因此其可能不是表达的人免疫球蛋白或种系基因序列的精确拷贝。然而，“人抗体”的定义并不包括抗原结合位点来源于非人物种的抗体。

“人适应性”抗体或“人框架适应性(HFA)”抗体是指根据美国专利公布US2009/0118127中所描述的方法适应化的抗体，并且也指将来源于非人物种的抗原结合位点序列移植到人框架的抗体。

“人源化抗体”是指其中抗原结合位点来源于非人物种且可变区框架来源于人免疫球蛋白序列的抗体。人源化抗体在框架区中可包括替换，因此该框架可能不是表达的人免疫球蛋白或种系基因序列的精确拷贝。

如本文所用，术语“单克隆抗体”是指单分子组合物的抗体分子制剂。单克隆抗体组合物对特定表位呈现出单一的结合特异性和亲和力。

如本文所用，术语“基本上相同”意指被比较的两个抗体可变区氨基酸序列是相同的或具有“非显著性差异”。非显著性差异是指抗体或抗体可变区域序列中有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸被替换，这些替换不会对抗体的性质造成不利影响。与本文所公开的可变区序列基本上相同的氨基酸序列在本申请范围内。在一些实施例中，所述序列同一性可为约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。同一性百分数可以例如通过使用Vector NTI v.9.0.0(Invitrogen,Carslbad,CA)的AlignX模块的默认设置的配对比对而确定。本发明的蛋白质序列可以用作查询序列以针对公共或专利数据库进行检索，以例如鉴定相关序列。用来进行此类检索的示例性程序是使用默认设置的XBLAST或BLASTP程序(http_//www_ncbi_nlm/nih_gov)或GenomeQuest^TM(GenomeQuest,Westborough,MA)软件包。

如本文所用，术语“表位”意指抗原的与抗体特异性结合的部分。表位通常由部分(moiety)(如氨基酸或多糖侧链)的化学活性(例如，极性、非极性或疏水性)表面定群(grouping)构成，并且可以具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。表位可由形成构象空间单元的连续和/或不连续氨基酸构成。对于不连续表位，来自抗原的线性序列中不同部分的氨基酸因蛋白质分子的折叠而在三维空间上靠近。

如本文所用的“互补位”意指抗体的与抗原特异性结合的部分。互补位可以是本质上线性的，或者可以是不连续的，通过抗体的非邻近氨基酸之间的空间关系形成，而非通过线性系列的氨基酸的空间关系形成。“轻链互补位”和“重链互补位”或“轻链互补位氨基酸残基”和“重链互补位氨基酸残基”分别指与抗原接触的抗体轻链和重链残基。

如本文所用，“双特异性”是指结合两个不同抗原或抗原内的两个不同表位的抗体。在双特异性抗体与IFNα和IFNω交叉反应的情况下，双特异性抗体可结合两个或更多个不同抗原。

如本文所用，“单特异性”是指结合一个抗原或一个表位的抗体。在单特异性抗体与IFNα和IFNω交叉反应的情况下，单特异性抗体可结合两个或更多个不同抗原。

如本文所用，术语“与...组合”意指所述的各试剂可以在混合物中一起、作为单一试剂同时地或作为各单一试剂以任何顺序依次地施用至动物。

如本文所用，术语“IFNα生物活性”和“IFNω生物活性”是指由于IFNα和IFNω分别结合至其受体IFNAR而产生的任何活性。一种IFNα和IFNω生物活性是IFNα和IFNω在HEK293细胞中在诸如ISG54的干扰素诱导启动子作用下诱导分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)表达的能力，该HEK293细胞能运用标准方法稳定地表达信号传导子及转录激活子2(STAT2)、干扰素调节因子9(IRF9)和SEAP。另一种IFNα和IFNω生物活性是诱导从外周血单核细胞(PBMC)或如本文所述的全血产生趋化因子IP-10(CXCL10)。

表1.

氨基酸	三字母代码	单字母代码
			丙氨酸	ala	A
精氨酸	arg	R
			天冬酰胺	asn	N
天冬氨酸	asp	D
			半胱氨酸	cys	C
谷氨酸	glu	E
			谷氨酰胺	gln	Q
甘氨酸	gly	G
			组氨酸	his	H
异亮氨酸	ile	I
			亮氨酸	leu	L
赖氨酸	lys	K
			甲硫氨酸	met	M
苯丙氨酸	phe	F
			脯氨酸	pro	P
丝氨酸	ser	S
			苏氨酸	thr	T
色氨酸	trp	W
			酪氨酸	tyr	Y

缬氨酸

val

V

术语“载体”是指能够在生物系统内复制或可以在此类系统间移动的多核苷酸。载体多核苷酸通常含有诸如复制起点、聚腺苷酸化信号或选择标记的元件，其功能是促进这些多核苷酸在生物系统中的复制或保持。此类生物系统的例子可包括细胞、病毒、动物、植物和用能够复制载体的生物组分再造的生物系统。包含载体的多核苷酸可为DNA或RNA分子或这些分子的杂合分子。

术语“表达载体”是指可用于在生物系统或再造生物系统中指导由存在于表达载体中的多核苷酸序列所编码的多肽的翻译的载体。

术语“多核苷酸”是指包含由糖-磷酸主链或其他等同的共价化学方式所共价连接的核苷酸链的分子。双链DNA和单链DNA以及双链RNA和单链RNA是多核苷酸的典型例子。

术语“多肽”或“蛋白质”是指包含至少两个由肽键连接以形成多肽的氨基酸残基的分子。少于50个氨基酸的小多肽可以称作“肽”。

本文使用如表1中所示的常规单字母和三字母氨基酸代码。

物质的组成

本发明提供结合至人干扰素ω(IFNω)和多种人干扰素α(IFNα)亚型(IFNα/ω抗体)并中和其活性的单克隆抗体。本发明至少部分地基于对IFNω和多种IFNα亚型所共享的最小中和表位的鉴定，其中本发明的IFNα/ω结合至该表位上。本发明的IFNα/ω抗体在中和I型IFN和IFN特征的SLE相关制剂方面比中和IFNα亚型而非IFNω的抗体更有力，因而在治疗与IFNα和IFNω生成增加相关联的任何疾病诸如免疫介导的炎性疾病上更有效。由于本发明的IFNα/ω抗体不中和IFNβ，所以当与预期能够阻断所有I型IFN的抗IFNAR治疗相比时，它们可具有更好的安全性和PK分布。如本文所用，“IFNα/ω抗体”是指能够结合并中和如本文所列举的INFω和多种IFNα亚型的抗体。

本发明的一个实施例是单克隆抗体，该单克隆抗体结合至人干扰素ω(IFNω)和至少四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种人干扰素α(IFNα)亚型并中和其活性。

本发明的抗体可中和的IFNα亚型是IFNαB2、IFNαF、IFNαG和IFNαJ1。本发明的抗体可中和的IFNα亚型是IFNαB2、IFNαC、IFNαF、IFNαG和IFNαJ1。本发明的抗体可中和的IFNα亚型是IFNαB2、IFNαC、IFNαF、IFNαG、IFNαJ1和IFNαA。本发明的抗体可中和的IFNα亚型是IFNαB2、IFNαC、IFNαF、IFNαG、IFNαJ1、IFNαA和IFNαH2。本发明的抗体可中和的IFNα亚型是IFNαB2、IFNαC、IFNαF、IFNαG、IFNαJ1、IFNαA、IFNαH2和IFNαK。本发明的抗体可中和的IFNα亚型是IFNαB2、IFNαC、IFNαF、IFNαG、IFNαJ1、IFNαA、IFNαH2、IFNαK和IFNαWA。本发明的抗体可中和的IFNα亚型是IFNαB2、IFNαC、IFNαF、IFNαG、IFNαJ1、IFNαA、IFNαH2、IFNαK、IFNαWA和IFNα4a。

本发明的抗体可在报告基因测定中测试其中和IFNα和IFNω的能力，在该报告基因测定中采用在干扰素应答性启动子作用下表达报告基因的细胞系，并且用不同IFNα亚型和/或IFNω刺激细胞。例如，可如本文所述使用HEK-Blue^TM IFN-α/β细胞(InvivoGen,SanDiego,CA)，该细胞经工程改造以表达具有完整活性的I型IFN信号传导通路(稳定表达STAT2和IRF9)并且在IFNα/β诱导型ISG54启动子的调控下用SEAP报告基因转染。可用熟知的试剂检测来自碱性磷酸酶的信号并在分光光度计上读取信号，然后可用标准方法计算出抑制的IC₅₀。

在一个实施例中，当在HEK293细胞中，人IFNω和人IFNα亚型在干扰素诱导型ISG54启动子作用下抑制分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)的活性时，本发明的抗体抑制IC₅₀值为约5×10^-8M或更小、约1×10^-8M或更小、约1×10^-9M或更小、约1×10^-10M或更小、约1×10^- ¹¹M或更小、约1×10^-12M或更小的人IFNω活性，抑制IC₅₀值为约5×10^-8M或更小、约1×10^-8M或更小、约1×10^-9M或更小、约1×10^-10M或更小、约1×10^-11M或更小、约1×10^-12M或更小的人IFNα亚型IFNαB2、IFNαF、IFNαG或IFNαJ1活性，其中该HEK293细胞能够稳定地表达信号传导子及转录激活子2(STAT2)、干扰素调节因子9(IRF9)和SEAP。在如本文实例3所述的测定“ISRE报告基因测定”中，当IC₅₀值为约5×10^-8M或更小时，例如，约1×10^-8M或更小、约1×10^-9M或更小、约1×10^-10M或更小、约1×10^-11M或更小、约1×10^-12M或更小时，本发明的抗体“中和”IFNω和/或任何IFNα亚型。

本发明的抗体也可通过评估它们抑制IFN诱导的细胞因子释放诸如IP-10从IFN诱导的外周血单核细胞(PBMC)或全血释放的能力来检测它们中和IFNα和IFNω的能力。例如，采用标准方案从健康志愿者的肝素化全血中分离出PBMC，然后用IFN与待测试抗体的预先形成的复合物处理PBMC，并且用标准方法诸如Milliplex细胞因子/趋化因子试剂盒(Millipore，预混合39plex)测定IP-10释放。与没有抗体时IFN诱导的IP-10释放相比，中和IFNα和IFNω的抗体可抑制IP-10释放达至少30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

本发明的抗体除了中和IFNω之外，还可结合并中和至少四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种IFNα亚型。IFNα亚型和IFNω可使用标准方法通过重组表达制备。可用于引导分泌的示例性信号序列在SEQ ID NO:17-21中示出。

本发明的抗体结合人IFNω，解离常数(K_D)为约5×10^-9M或更小、约1×10^-9M或更小、约5×10^-10M或更小、约1×10^-10M或更小、约5×10^-11M或更小、约1×10^-11M或更小、约5×10^-12M或更小、约1×10^-12M或更小，并且结合人IFNα亚型IFNαB2、IFNαF、IFNαG或IFNαJ1，K_D为约5×10^-9M或更小、约1×10^-9M或更小、约5×10^-10M或更小、约1×10^-10M或更小、约5×10^-11M或更小、约1×10^-11M或更小、约5×10^-12M或更小、约1×10^-12M或更小。

抗体对IFNω或IFNα亚型的亲和力可使用任何合适的方法通过实验测定。这类方法可以采用本领域技术人员已知的ProteOn XPR36、Biacore3000或KinExA仪器、ELISA或竞争结合测定。如果在不同的条件(例如，同渗容摩、pH)下测量，特定抗体/IFNω或IFNα亚型相互作用的测量亲和力可变化。因此，亲和力和其他结合参数(如，K_D、K_on、K_off)的测量优选地用标准化条件和标准化缓冲液诸如本文所述的缓冲液进行。本领域技术人员将会知道，使用例如Biacore 3000或ProteOn进行亲和力测量的内部误差(测量为标准偏差，SD)通常可在典型检出限内的测量值的5-33％内。因此术语“约”反映测定中的典型标准偏差。例如，1×10^-9M的K_D的典型SD为至多±0.33×10^-9M。

结合人IFNω和IFNα亚型的具有所需亲和力和中和分布的抗体可选自通过人IFNω和IFNα亚型筛选并且可选地通过进一步抗体亲和力成熟的变体或片段文库。在示例性的筛选活动中，噬菌体文库筛选可按顺序筛选或使用黑猩猩IFNω和人IFNα亚型IFNα2、IFNα1、IFNαH2、IFNαG和IFNαF的混合物筛选。或者，本发明的抗体可用黑猩猩和食蟹猕猴IFNω、人IFNα亚型IFNαD、IFNαJ1、IFNαC、IFNαB2、IFNαH2、IFNαA、IFNα4a、IFNαG、IFNαF、IFNαWA和IFNαI免疫小鼠然后用标准方法筛选杂交瘤而制备。

抗体可根据其对IFNω和IFNα生物活性的抑制使用任何合适的方法和本文所述的方法来鉴定。

本发明的一个实施例是分离的单克隆抗体，该抗体结合至人干扰素ω(IFNω)和至少四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种人干扰素α(IFNα)亚型并中和其活性，其中该抗体竞争结合至人IFNω和人IFNα亚型IFNαB2、IFNαF、IFNαG或IFNαJ1上，其中所述分离的抗体包含：

SEQ ID NO:23的重链可变区(VH)氨基酸序列和SEQ ID NO:24的轻链可变区(VL)氨基酸序列；或

SEQ ID NO:27的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:28的VL氨基酸序列。

本发明的抗体特异性地结合至人IFNω和人IFNα亚型IFNαB2、IFNαF、IFNαG和/或IFNαJ1的竞争可使用熟知的方法在体外测定，其中本发明抗体包含特定VH和VL序列。例如，MSD Sulfo-Tag^TM NHS酯标记抗体在未标记抗体存在下对人IFNω和人IFNα亚型IFNαB2、IFNαF、IFNαG或IFNαJ1的结合可通过ELISA评估，或可使用Biacore分析法或流式细胞术证实与本发明抗体的竞争作用。或者，可如本文所述使用采用Octet(ForteBio,Menlo Park,CA)的实时无标记竞争结合测定。对于包含SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:24的VL，或者SEQ IDNO:27的VH和SEQ ID NO:28的VL的抗体而言，测试抗体抑制其结合至人IFNω和人IFNα亚型IFNαB2、IFNαF、IFNαG和/或IFNαJ1证明测试抗体与这些抗体竞争结合至人IFNω和人IFNα亚型IFNαB2、IFNαF、IFNαG和/或IFNαJ1上。

在另一个实施例中，本发明的抗体在SEQ ID NO:1的一个或多个残基F27、L30和R33处与IFNω结合。

在另一个实施例中，本发明的抗体在SEQ ID NO:19的一个或多个残基F27、L30和R33处与IFNα4a结合。

IFNω和IFNα4a中的残基F27、L30和R33限定本发明IFNα/ω抗体的广泛中和活性所需的最小表位。几种抗体/IFNα或抗体/IFNω复合物的晶体结构显示该三个残基为抗体结合作出主要贡献。人IFNα4a与其他人IFNα共享至少83％的同一性，与人IFNω共享至少59％的同一性。F27残基在除IFNαD(α1)外的所有人IFNα中都是保守的。F27在人IFNω中也是保守的。L30和R33在所有人IFNα以及人IFNω中都是保守的。

在本发明的另一个实施例中，结合至人干扰素ω(IFNω)和至少四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种人干扰素α(IFNα)亚型并中和其活性的本发明单克隆抗体不结合也不中和IFNαD。

可以通过以下方式制备结合特定IFNω和IFNα残基的本发明抗体：对表达人免疫球蛋白基因座的小鼠(Lonberg等人，Nature 368:856-9,1994；Fishwild等人，NatureBiotechnology 14:845-51,1996；Mendez等人，Nature Genetics 15:146-56,1997，美国专利5,770,429、7,041,870和5,939,598)或者Balb/c小鼠免疫，该小鼠具有包含表位接触残基的肽，例如具有IFNω的AB环的氨基酸序列(SEQ ID NO:1的IFNω的第22-34位氨基酸残基)或者具有IFNα4a的AB环的氨基酸序列(SEQ ID NO:19的IFNα4a的第22-34位氨基酸残基)的肽，或者如本文所述的IFNω和IFNα亚型的混合物，并且使用Kohler等人，Nature256:495-97,1975中所述的杂交瘤方法。对所得的抗体测试它们与本发明的抗体竞争的能力，其中本发明抗体诸如具有SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:24的VL的抗体，并且使用标准方法对所得的抗体测试它们与所述表位的结合。例如，当两个个体组分的结构已知时，可以执行硅片蛋白-蛋白对接以鉴定相容的相互作用位点。可以通过抗原和抗体复合物进行氢-氘(H/D)交换，以对抗原上的可被抗体结合的区域进行定位。抗原的区段诱变和点诱变可以用来定位对抗体结合重要的氨基酸。可使用抗体-抗原复合物的共晶体结构来鉴定对表位和互补位有贡献的残基。所鉴定的单克隆抗体可进一步通过诸如Queen等人，ProcNatl Acad Sci(USA)86:10029-32,1989和Hodgson等人，Bio/Technology 9:421,1991中所公开的技术，结合经改变的框架支撑残基而修饰以保留结合亲和力。

在另一个实施例中，本发明的抗体在一个或多个残基F27、L30和R33处结合IFNω，并且进一步结合选自由SEQ ID NO:1的残基P26、K31和R34组成的组中的至少一个IFNω残基。

在另一个实施例中，本发明的抗体在一个或多个残基F27、L30和R33处结合IFNω，并且进一步结合选自由SEQ ID NO:1的残基R22、R23、I24、S25、P26、K31、D32、R34、D35、Q40、K134、M146、E147、M149、K150、F153和L154组成的组中的至少一个IFNω残基。

在另一个实施例中，本发明的抗体在一个或多个残基R22、P26、F27、L30、K31、D32、R33、R34、D35、Q40、K134、M146、E147、M149、K150、F153和L154处结合SEQ ID NO:1的IFNω。

在另一个实施例中，本发明的抗体在一个或多个残基R23、I24、S25、P26、F27、L30、K31、R33、R34、M146、E147、M149和K150处结合SEQ ID NO:1的IFNω。

在另一个实施例中，本发明的抗体在一个或多个残基F27、L30和R33处结合IFNα4a，并且进一步结合选自由SEQ ID NO:19的残基H26、K31和R34组成的组中的至少一个IFNα4a残基。

在另一个实施例中，本发明的抗体在一个或多个残基F27、L30和R33处结合IFNα4a，并且进一步结合选自由SEQ ID NO:19的A19、H26、F27、L30、K31、D32、R33、H34、D35、V143、A146、E147、M149、R150和S153组成的组中的至少一个IFNα4a残基。

在另一个实施例中，本发明的抗体在SEQ ID NO:19的一个或多个残基A19、H26、F27、L30、K31、D32、R33、H34、D35、V143、A146、E147、M149、R150和S153处结合SEQ ID NO:19的IFNα4a。

在另一个实施例中，本发明的抗体在SEQ ID NO:19的一个或多个残基G22、R23、I24、S25、H26、F27、C29、L30、K31、R33、H34、V143、A146、E147和R150和S153处结合SEQ IDNO:19的IFNα4a。

在其他实施例中，本发明的抗体抑制病毒诱导的白细胞干扰素的活性。

在一些实施例中，病毒诱导的白细胞干扰素的活性是由100U/ml干扰素诱导的IP-10在全血中的释放。

本发明的抗体可中和由激活的白细胞产生的干扰素，如由它们对IP-10在全血中的释放的抑制能力来评估，其中IP-10在全血中的释放由本文所述的100U/ml干扰素诱导。在50μg/ml的抗体存在下，本发明抗体可中和由激活的白细胞所产生干扰素的效果达至少30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

在一些实施例中，本发明的抗体在50μg/ml的抗体存在下抑制IP-10在全血中的释放超过50％。

在另一个实施例中，本发明的抗体抑制SLE免疫复合物诱导的IFN产量。SLE免疫复合物代表存在于SLE中的I型IFN。IFN的生成可通过如本文所述的报告基因测定法来测量。

在一些实施例中，本发明的抗体可抑制SLE免疫复合物诱导的干扰素产量达至少30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

本发明的抗体可为人、人源化或人适应性的。

本发明的抗体可为IgA、IgD、IgE、IgG或IgM型。本发明的抗体可为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4型。

本发明的另一个实施例是分离的抗体，该抗体包含：

SEQ ID NO:23的重链可变区(VH)氨基酸序列和SEQ ID NO:24的轻链可变区(VL)氨基酸序列；

SEQ ID NO:25的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:26的VL氨基酸序列；或

SEQ ID NO:27的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:28的VL氨基酸序列。

缺少任何非人序列的人单克隆抗体可通过例如Knappik等人，J Mol Biol 296:57-86,2000；和Krebs等人，J Immunol Meth 254:67-842001中引用的技术从噬菌体展示文库制备并且优化。在一个示例性方法中，本发明的抗体分离自将抗体重链和轻链可变区作为与噬菌体pIX外壳蛋白的融合蛋白表达的文库。筛选抗体文库中结合至人IFNω和IFNα的那些，并进一步表征所得的阳性克隆，从克隆裂解物分离Fab，并表达为全长IgG。示例性抗体文库和筛选方法描述于Shi等人，J Mol Biol 397:385-96,2010；国际公布WO2009/085462和美国专利序列号12/546850；美国专利5,223,409、5,969,108和5,885,793。

所得的单克隆抗体可进一步在其框架区进行修饰，以将某些框架残基改变为相匹配的人种系中存在的残基。

本发明的抗体的免疫效应子特性可通过本领域技术人员已知的技术经由Fc修饰得到增强或沉默。例如，Fc效应子功能例如C1q结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、吞噬作用、细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调等，可通过修饰Fc中负责这些活性的残基进行提供和/或得到控制。药代动力学特性还可通过使Fc域中延长抗体半衰期的残基突变得到增强(Strohl Curr Opin Biotechnol 20:685-91,2009)。

另外，本发明的抗体可通过诸如糖基化、异构化、去糖基化或非天然存在的共价修饰(例如添加聚乙二醇部分(聚乙二醇化)和脂质化)等过程进行翻译后修饰。此类修饰可在体内或体外进行。例如，本发明的抗体可以与聚乙二醇缀合(聚乙二醇化)以改善其药代动力学性质。缀合可通过本领域技术人员已知的技术来执行。治疗抗体与PEG的缀合已显示增强药效动力学，同时不干扰功能(Knight等人，Platelets15:409-18,2004；Leong等人，Cytokine16:106-19,2001；Yang等人，Protein Eng16:761-70,2003)。

经修饰以改善稳定性、选择性、交叉反应性、亲和力、免疫原性或其他所需生物学或生物物理学特性的本发明抗体或其片段处于本发明的范围内。抗体的稳定性受多种因素的影响，包括(1)影响各个域固有稳定性的各个域的核心堆积(core packing)；(2)影响HC和LC配对的蛋白质/蛋白质界面相互作用；(3)极性和带电残基的掩埋；(4)极性和带电残基的H键网络；和(5)表面电荷及极性残基分布连同其他的分子内和分子间力(Worn等人，J.Mol Biol 305:989-1010,2001)。潜在的结构不稳定残基可根据该抗体的晶体结构或在某些情况下通过分子建模来鉴定，并且所述残基对于抗体稳定性的影响可通过产生并评估在所鉴定残基中携带突变的变体来测试。一种增加抗体稳定性的方法是升高由差示扫描量热法(DSC)测得的热转变中间点(Tm)。一般来讲，蛋白质的Tm与其稳定性相关联并且与其对溶液中的解折叠和变性以及依赖于该蛋白质解折叠倾向的降解过程的易感性成反向相关(Remmele等人，Biopharm 13:36-46,2000)。许多研究已经发现在所测得的制剂物理稳定性(如通过DSC测得的热稳定性和通过其他方法测得的物理稳定性)的排序之间存在相关性(Gupta等人，AAPS PharmSci 5E8,2003；Zhang等人，J Pharm Sci 93:3076-89,2004；Maa等人，Int J Pharm140:155-68,1996；Bedu-Addo等人，Pharm Res 21:1353-61,2004；Remmele等人，Pharm Res 15:200-8,1997)。制剂研究提示，Fab Tm对相应mAb的长期物理稳定性有影响。框架或CDR之内的氨基酸差别对于Fab域的热稳定性可具有显著影响(Yasui等人，FEBS Lett 353:143-6,1994)。

本发明的IFNα/ω抗体可工程改造成双特异性抗体，该双特异性抗体也涵盖于本发明的范围内。本发明的抗体的VL区和/或VH区，可使用已公布的方法工程改造成结构如

设计(国际专利公布WO1999/57150；美国专利公布US2011/0206672)的单链双特异性抗体，或工程改造成结构如公开于美国专利5,869,620、国际专利公布WO1995/15388A、国际专利公布WO1997/14719或国际专利公布WO2011/036460中的结构的双特异性scFV。

本发明的抗体的VL区和/或VH区，可工程改造成双特异性全长抗体，其中每个抗体臂结合不同的抗原或表位。通常通过调节这两条抗体重链之间的CH3相互作用制备此类双特异性抗体，以使用诸如美国专利7,695,936、国际专利公布WO04/111233、美国专利公布US2010/0015133、美国专利公布US2007/0287170、国际专利公布WO2008/119353、美国专利公布US2009/0182127、美国专利公布US2010/0286374、美国专利公布US2011/0123532、国际专利公布WO2011/131746、国际专利公布WO2011/143545或美国专利公布US2012/0149876中描述的那些技术形成双特异性抗体。可在其中结合本发明的抗体的VL区和/或VH区的另外的双特异性结构，是例如双可变域免疫球蛋白(国际专利公布WO2009/134776)，或包括多种二聚域的结构以连接具有不同特异性的两个抗体臂，诸如亮氨酸拉链或胶原二聚域(国际专利公布WO2012/022811、美国专利5,932,448、美国专利6,833,441)。

本发明的另一个方面是分离的多核苷酸，其编码本发明的任何抗体重链可变区或抗体轻链可变区或其片段，或它们的互补序列。鉴于在给定表达系统中的遗传密码简并性或密码子优先性，编码本发明抗体拮抗剂的多核苷酸也在本发明的范围内。

本发明的另一个实施例是包含本发明的多核苷酸的载体。此类载体可以是质粒载体、病毒载体、用于杆状病毒表达的载体、基于转座子的载体或任何其他适于通过任何手段将本发明的多核苷酸引入给定生物体或遗传背景的载体。

本发明的另一个实施例是包含本发明多核苷酸的宿主细胞。此类宿主细胞可以是真核细胞、细菌细胞、植物细胞或古菌细胞。示例性真核细胞可以是哺乳动物、昆虫、禽类或其他动物来源。哺乳动物真核细胞包括永生细胞系，例如杂交瘤或骨髓瘤细胞系，如SP2/0(美国典型培养物保藏中心(ATCC),Manassas,VA,CRL-1581)、NS0(欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC),Salisbury,Wiltshire,UK,ECACC No.85110503)、FO(ATCC CRL-1646)和Ag653(ATCC CRL-1580)鼠细胞系。一种示例性人骨髓瘤细胞系是U266(ATTC CRL-TIB-196)。其他可用的细胞系包括衍生自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的那些细胞系，诸如CHO-K1SV(LonzaBiologics,Walkersville,MD)、CHO-K1(ATCC CRL-61)或DG44。

本发明的另一个实施例是制备本发明抗体的方法，该方法包括培养本发明的宿主细胞，以及回收由所述宿主细胞产生的抗体。制备抗体并将其纯化的方法是本领域所熟知的。

本发明的另一个实施例是在对其有需求的患者体内抑制IFNω和IFNα亚型IFNαB2、IFNαF、IFNαG和/或IFNαJ1与IFNAR的相互作用的方法，该方法包括对患者施用竞争结合至人IFNω和人IFNα亚型IFNαB2、IFNαF、IFNαG和/或IFNαJ1的分离的抗体，其中所述分离的抗体包含：SEQ ID NO:23的重链可变区(VH)和SEQ ID NO:24的轻链可变区(VL)；或SEQ IDNO:27的VH和SEQ ID NO:28的VL，施用时间足以预防IFNω和IFNα亚型IFNαB2、IFNαF、IFNαG和/或IFNαJ1与IFNAR的相互作用。可使用标准方法和本文所述的那些方法，使用例如IFNAR1(SEQ ID NO:31)和IFNAR2(SEQ ID NO:32)的细胞外部分或它们的Fc融合蛋白测定抗体与IFNAR之间的竞争。

治疗方法

本发明的IFNα/ω抗体可用于治疗或预防与IFNα和IFNω的生成增加相关联的任何疾病。在本发明的方法中，可以使用本发明的任何IFNα/ω抗体。或者，可以使用竞争结合至人IFNω和人IFNα亚型IFNαB2、IFNαF、IFNαG和/或IFNαJ1的任何抗体，其中所述分离的抗体包含：SEQ ID NO:23的重链可变区(VH)氨基酸序列和SEQ ID NO:24的轻链可变区(VL)氨基酸序列；或SEQ ID NO:27的VH氨基酸序列以及SEQ ID NO:28的VL氨基酸序列。另外，可以使用在SEQ ID NO:1的一个或多个残基F27、L30和R33处结合IFNω并且在SEQ ID NO:19的一个或多个残基F27、L30和R33处结合IFNα4a的任何抗体。

本发明的方法可用于治疗属于任何分类的动物患者。此类动物的例子包括哺乳动物，诸如人、啮齿动物、犬类、猫类和农畜。例如，本发明的抗体可用于预防和治疗免疫介导的炎性疾病，诸如系统性红斑狼疮(SLE)、I型糖尿病、牛皮癣、原发性干燥病、系统性硬化病、类风湿性关节炎、炎性肠疾病(IBD；包括克罗恩氏病、溃疡性结肠炎和乳糜泻)、免疫介导的炎性甲状腺炎以及肾小球肾炎。此外，本发明的抗体组合物可用于抑制或预防移植排斥或者用于治疗移植物抗宿主病(GVHD)。

本发明的抗体也用于制备用于此类治疗的药物，其中制备所述药物以按照本文定义的剂量施用。

不希望受到任何特定理论的约束，建议SLE触发物(诸如免疫复合物)引发I型IFN响应，包括IFNα和IFNω，但不包括IFNβ。因此，本发明的IFNα/ω抗体可以提供更有效的SLE治疗，从而广泛地抑制这些病原性I型IFN，同时保留IFNβ功能，这可以在抗病毒防御中发挥更关键的作用。在本发明中，已生成广泛中和的IFNα/ω抗体并且鉴定了存在于IFNα和IFNω上的独特中和表位，然而建议IFNα和IFNω具有抗原独特性仍存在挑战性(Adolf,J GenVirol 68:1669-1676,1987)。

IFNα和SLE之间的关系首次描述于1979年，当时证实该细胞因子在SLE患者的血清中升高(Hooks等人，N Engl J Med 301:5-8,1979；Preble等人，Science 216:429-431,1982)。最近，SLE患者亚群中的I型IFN基因特征已得到广泛描述，并且已报道IFN特征表达的程度与疾病的临床和血清学特征正相关(Karageorgas等人，J Biomed Biotechnol273907,2011；Baechler等人，Proc Natl Acad Sci USA 100:2610-2615,2003；Bennett等人，J Exp Med 197:711-723,2003；Dall'era等人，Ann Rheum Dis 64:1692-1697,2005；Niewold等人，Genes Immun 8:492-502,2007)。若干基因相关性研究已表明I型IFN途径在介导一些狼疮患者的疾病中的潜在作用(Delgado-Vega等人，Arthritis Res Ther 12增补版1S2；Elkon和Stone；J Interferon Cytokine Res 11:803-812,2011)。更多研究显示，IFNα调节涉及SLE的发病机制的一系列基因产物的表达。例如，IFNα可诱导BLyS(一种重要的B细胞存活因子并且也是

(贝利单抗)的靶标)的表达。SLE患者体内的可溶性BLyS与I型IFN活性和水平存在正相关(Ritterhouse等人，Arthritis Rheum 63:3931-3941,2011)，并且SLE患者体内的IFNα阻断导致少量SLE患者的皮肤病灶活组织检查(其中收集了组织)中BLyS的基因表达降低(Yao等人，Arthritis Rheum 60:1785-1796,2009)。与IL-6一致，IFNα也显示出对分泌Ig的浆细胞的生成非常重要(Jego等人，Curr Dirautoimmune 8:124-139,2005)。除直接作用于B细胞小室外，IFNα还表现出对狼疮发病的其他重要介导物的作用。Blanco等人证实，IFNα可诱导单核细胞分化成抗原呈递的DC(Blanco等人，Science294:1540-1543,2001)。存在于SLE血清样品中的IFNα的中和显著降低了SLE血清诱导单核细胞DC分化的能力，显示出该细胞因子在一些SLE患者中降低对自身抗原的耐受性方面的突出作用。用于感染性适应症和肿瘤适应症的IFNα治疗已显示在一些患者中诱导SLE样疾病，这种疾病在停止治疗后消退(Burdick等人，Expert Opin Drug Saf 8:459-472,2009；Biggioggero等人，Autoimmunity 43:248-254,2010)。

IFN响应于感染原(诸如病毒)而快速产生，以帮助控制感染。结合到核酸配体的自身抗体被认为是SLE中的I型IFN的主要诱导物。自身抗体的优势结合受损的自身抗原清除导致IFN生成的反馈循环，其中免疫复合物的Fc受体依赖性内化成浆细胞样树突状细胞(pDC)导致IFN量增加，从而建立IFN特征。诸如toll样受体(TLR)7和TLR9的核酸受体富集于pDC的内涵体小室中，并且被认为是这些含核酸的免疫复合物的主要标记，所述免疫复合物引发导致I型IFN释放的级联。为此，针对SLE的多种TLR7和TLR 9抑制剂处于临床开发中。

IFNα和IFNω两者均在SLE患者体内升高并且可以诱导类似的免疫调节效应。使用合成配体(Gibson等人，Cell Immunol 218:74-86,2002)或来自SLE患者的免疫复合物(如本文所述)激动TLR7和TLR9诱导了IFNα和IFNω蛋白IFNω转录物两者(Han等人，GenesImmun 4:177-186,2003)并且蛋白质(数据未示出)在SLE患者体内上调。

在SLE患者体内还发现了抗I型IFN的自身抗体，这可能是由于在这些患者体内IFN升高以及过度旺盛的体液免疫应答。已发现，在被检查的SLE群组中，抗IFNω的自身抗体比抗IFNα的那些自身抗体更普遍，同时仅检测到痕量的抗IFNβ的自身抗体(Slavikova等人，JInterferon Cytokine Res 23:143-147,2003)。由IFNω赋予的一般活性类似于IFNα效应，表明SLE患者体内升高的IFNω可促使疾病发病(Adolf等人，J Biol Chem265:9290-9295,1990；Adolf,Mult Scler 1增补版1:S44-47,1995；Kubes等人，J Interferon Res 14:57-59,1994；Tiefenthaler等人，J Interferon Cytokine Res 17:327-329,1997)。SLE中IFNβ的存在和作用尚不十分确定。用SLE患者血清作为刺激物特异性中和IFNα导致I型IFN活性显著降低，而用测试过的患者血清样品进行的IFNβ中和则得到可以忽略的效应，表明IFNβ对疾病发病的参与程度最小(Hua等人，Arthritis Rheum 54:1906-1916,2006)。

临床开发中现有的I型IFN拮抗剂方法聚焦于中和IFNα亚型而非其他I型IFN(β,ε,κ,ω)的光谱，聚焦于中和干扰素受体的IFNAR1链从而阻断所有I型IFN的信号转导，或利用对IFNα具有特异性的接种疫苗方法(Merrill等人，Ann Rheum Dis 70:1905-1913,2011；Zagury等人，Proc Natl Acad Sci USA 106:5294-5299,2009)。在临床试验中，SLE患者体内的抗IFNα抗体证实，在探索性分析中表现出IFN特征和轻微功效的患者体内I型IFN特征部分减少(Merrill等人，Ann Rheum Dis 70:1905-1913,2011)。在第二阶段研究中，在干扰素特征度量标准(ISM)-低中到严重活性狼疮受试者的预先指定的生物标记定义组中，在不存在免疫抑制剂的情况下的抗INFα治疗与第24周的SLE的病征和症状、发斑速率和类固醇负担的改善相关联。有趣的是，在预定义为ISM-高的患者中没有观察到任何功效(Kalunian等人，2012ACR/ARHP Annual Meeting；Abstract#2622,2012)。

抗IFNAR1的单克隆抗体预计将破坏由所有I型IFN(包括IFNβ)诱导的IFN信号传导。虽然缺乏数据支撑IFNβ在SLE发病中的重要作用，但IFNβ可以在抗病毒防御中发挥更关键的作用。编码IFNβ的基因的特异性缺失引发病毒宿主相比于相似暴露的具有功能性IFNβ的小鼠而言易感性显著(Lazear等人，JVirol 85:7186-94；Deonarain等人，JVirol 74:3403-09,2000；Deonarain等人，Circulation 110:3540-3543,2004；Gerlach等人，J Virol80:3438-3444,2006；Koerner等人，JVirol 81:2025-2030,2007)。

本发明的一个实施例是治疗或预防与IFNα和IFNω的生成增加相关联的疾病的方法，该方法包括向对其有需求的患者施用治疗有效量的结合至人干扰素ω(IFNω)和至少四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种人干扰素α(IFNα)亚型并中和其活性的分离的抗体，或竞争结合至人IFNω和人IFNα亚型IFNαB2、IFNαF、IFNαG或IFNαJ1的抗体，其中所述分离的抗体包含：SEQ ID NO:23的重链可变区(VH)氨基酸序列和SEQ ID NO:24的轻链可变区(VL)氨基酸序列；或SEQ ID NO:27的VH氨基酸序列以及SEQ ID NO:28的VL氨基酸序列，施用时间足以治疗或预防该疾病。

本发明的另一个实施例是在对其有需求的患者体内预防IFNω和IFNα亚型IFNαB2、IFNαF、IFNαG或IFNαJ1与IFNAR的相互作用的方法，该方法包括对患者施用结合至人干扰素ω(IFNω)和至少四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种人干扰素α(IFNα)亚型并中和其活性的分离的抗体，或竞争结合至人IFNω和人IFNα亚型IFNαB2、IFNαF、IFNαG和/或IFNαJ1的抗体，其中所述分离的抗体包含：SEQ ID NO:23的重链可变区(VH)氨基酸序列和SEQ ID NO:24的轻链可变区(VL)氨基酸序列；或SEQ ID NO:27的VH氨基酸序列以及SEQ IDNO:28的VL氨基酸序列，施用时间足以预防IFNω和IFNα亚型IFNαB2、IFNαF、IFNαG和/或IFNαJ1与IFNAR的相互作用。

在其他实施例中，可用于本发明方法的抗体包括在SEQ ID NO:1的一个或多个残基F27、L30和R33处结合IFNω并且在SEQ ID NO:19的一个或多个残基F27、L30和R33处结合IFNα4a的抗体。

可以测试本发明的抗体在狼疮动物模型中的功效，该模型包括狼疮性小鼠种类以及在其中使用多种试剂诱导或促进狼疮样表型的小鼠种类(Perry等人，J BiomedBiotechnol,2011:271694,2011)。例如，NZB/NZW F1小鼠表现出时间依赖性和偏雌性疾病，其具有若干人狼疮特征，包括肾小球肾炎。由于与人相比，小鼠中产生多种不同的IFNα亚型(van Pesch等人，J Virol,78:8219-28,2004)并且小鼠中缺乏IFNω表达，所以使用疾病相关IFN制剂进行的疾病相关细胞的体外测试可用于评估改变本发明抗体的潜能的功效和疾病。此类体外测定是例如在全血中由SLE免疫复合物诱导的IFN生产的抑制的评价，或抗体降低如本文所述的IFN特征的能力的评估。

本发明的IFNα/ω抗体的VH域和VL域可结合至如本文所述的双特异性抗体和分子中，其中双特异性抗体特异性结合并中和IFNω以及至少四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种人干扰素α(IFNα)亚型，例如IFNαB2、IFNαF、IFNαG和IFNαJ1，以及另一个抗原，诸如BLyS、CD40L、IL-6、CD27、BDCA2(CLEC4C、C型凝集素结构域家族4成员C)或IL-12和IL-23的p40亚基。或者，可以使用竞争结合至人IFNω和人IFNα亚型IFNαB2、IFNαF、IFNαG和/或IFNαJ1的任何抗体的VH区和VL区，其中所述分离的抗体包含：SEQ ID NO:23的重链可变区(VH)氨基酸序列和SEQ ID NO:24的轻链可变区(VL)氨基酸序列；或SEQ ID NO:27的VH氨基酸序列以及SEQ ID NO:28的VL氨基酸序列。另外，可以使用在SEQ ID NO:1的一个或多个残基F27、L30和R33处结合IFNω并且在SEQ ID NO:19的一个或多个残基F27、L30和R33处结合IFNα4a的任何抗体的VH域和VL域。

可使用本文所述的方法生成BLyS、CD40L、IL-6、CD27、BDCA2(CLEC4C，C型凝集素结构域家族4成员C)或结合IL-12和IL-23的抗体的p40亚基，所述方法诸如对表达人免疫球蛋白基因座的小鼠(Lonberg等人，Nature 368:856-9,1994；Fishwild等人，NatureBiotechnology 14:845-51,1996；Mendez等人，Nature Genetics 15:146-56,1997；美国专利5,770,429、No.7,041,870和5,939,598)或具有对应蛋白或蛋白质的胞外域的Balb/c小鼠免疫，或使用如本文所述的噬菌体展示文库。或者，可使用现有的抗BLyS、CD40L、IL-6、CD27、BDCA2的抗体(CLEC4C，C型凝集素结构域家族4成员C)或IL-12和IL-23的p40亚基生成双特异性分子。

给药/药物组合物

有效用于治疗与IFNα和IFNω的生成增加相关联的病症的本发明的IFNα/ω抗体的“治疗有效量”可通过标准研究技术确定。例如，有效用于治疗免疫介导的炎性疾病(诸如SLE)的本发明的IFNα/ω抗体的剂量可通过对本领域熟知的相关动物模型施用IFNα/ω抗体来确定。

体外测定可任选地用来帮助鉴定最佳剂量范围。对具体的有效剂量的选择可由本领域的技术人员根据对多种因素的考量(例如，经由临床试验)来确定。此类因素包括待治疗或预防的疾病、所涉及的症状、患者体重、患者免疫状态以及技术人员已知的其他因素。在制剂中待使用的精确剂量也将取决于给药途径以及疾病的严重程度，并且应该根据医生的判断和每个患者的情况来决定。有效剂量可通过来自体外或动物模型测试体系的剂量响应曲线来推导。可以使用本文所述模型中的任何一个来测试本发明抗体的功效和有效剂量。

本发明的抗体的治疗用途的给药模式可以是将该药剂递送至宿主的任何合适的途经。这些抗体的药物组合物尤其可用于非肠道给药，例如，真皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下或鼻内给药。

本发明的抗体可制备为药物组合物，其含有有效量的药剂作为药学上可接受的载体中的活性成分。术语“载体”是指据以施用该活性化合物的稀释剂、辅助剂、赋形剂或媒介物。此类药学媒介物可以是液体，诸如水和油，包括那些来源于石油、动物、植物的油或合成的油，诸如，花生油、大豆油、矿物油和芝麻油等等。例如，可使用0.4％生理盐溶液和0.3％甘氨酸。这些溶液是无菌的，并且通常不含颗粒物。它们可通过常规的熟知的灭菌技术(例如过滤)进行灭菌。组合物可根据需要含有药用辅助物质，以接近生理条件，诸如pH调节剂和缓冲剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂等。此类药物制剂中的本发明的抗体的浓度可广泛改变，即小于约0.5％，通常为或至少约1％至多达15或20重量％，且将根据所选择的具体给药方式，主要基于所需剂量、流体体积、粘度等进行选择。

因此，本发明的用于肌内注射的药物组合物可经制备以包含1ml的无菌缓冲水，以及介于约1ng至约100mg的本发明的抗体，例如，约50ng至约30mg，或更优选地约5mg至约25mg。相似地，本发明的用于静脉内输注的药物组合物可经制备以包含约250ml的无菌林格氏溶液，以及约1mg至约30mg并且优选地5mg至约25mg的本发明的拮抗剂。用于制备非肠道给药的组合物的实际方法是众所周知的，并且更详细地描述于例如“Remington'sPharmaceutical Science”，第15版，Mack Publishing Company，Easton，PA中。

可将本发明的抗体低压冻干用于贮存，并在使用前在合适的载体中复原。已证实此技术对常规免疫球蛋白和蛋白制剂有效，并且可以采用本领域已知的冻干法和复原技术。

本发明的其他实施例

下文根据本文别处的公开内容陈述了本发明的某些其他带编号的实施例。上文所述的本发明的实施例的特征还涉及这些其他带编号的实施例中的每一个。

1)一种分离的单克隆抗体，其结合至(a)人干扰素ω(IFNω)和(b)至少四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种人干扰素α(IFNα)亚型并且中和其活性。

2)根据实施例1所述的抗体，其中该抗体结合至人IFNα亚型IFNαB2、IFNαF、IFNαG和IFNαJ1并且中和其活性。

3)根据实施例1或2所述的抗体，其中该抗体结合至人IFNα亚型IFNαB2、IFNαC、IFNαF、IFNαG和IFNαJ1并且中和其活性。

4)根据实施例1-3中任一项所述的抗体，其中该抗体结合至人IFNα亚型IFNαB2、IFNαC、IFNαF、IFNαG、IFNαJ1和IFNαA并且中和其活性。

5)根据实施例1-4中任一项所述的抗体，其中该抗体结合至人IFNα亚型IFNαB2、IFNαC、IFNαF、IFNαG、IFNαJ1、IFNαA和IFNαH2并且中和其活性。

6)根据实施例1-5中任一项所述的抗体，其中该抗体结合至人IFNα亚型IFNαB2、IFNαC、IFNαF、IFNαG、IFNαJ1、IFNαA、IFNαH2和IFNαK并且中和其活性。

7)根据实施例1-6中任一项所述的抗体，其中该抗体结合至人IFNα亚型IFNαB2、IFNαC、IFNαF、IFNαG、IFNαJ1、IFNαA、IFNαH2、IFNαK和IFNαWA并且中和其活性。

8)根据实施例1-7中任一项所述的抗体，其中该抗体结合至人IFNα亚型IFNαB2、IFNαC、IFNαF、IFNαG、IFNαJ1、IFNαA、IFNαH2、IFNαK、IFNαWA和IFNα4a并且中和其活性。

9)根据实施例1-8中任一项所述的抗体，其中人IFNω和人IFNα亚型的活性是在稳定表达信号转导子和转录激活子2(STAT2)、干扰素调节因子9(IRF9)和SEAP的HEK293细胞中，在干扰素诱导型ISG54启动子作用下抑制分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)表达。

10)根据实施例1-9中任一项所述的抗体，其中在实例3中的“亲和力测量”部分下定义的条件下，该抗体抑制IC₅₀值为约5×10^-8M或更小、约1×10^-8M或更小、约1×10^-9M或更小、约1×10^-10M或更小、约1×10^-11M或更小、或约1×10^-12M或更小的人IFNω活性，并且抑制IC₅₀值为约5×10^-8M或更小、约1×10^-8M或更小、约1×10^-9M或更小、约1×10^-10M或更小、约1×10^-11M或更小、或约1×10^-12M或更小的人IFNα亚型IFNαB2、IFNαF、IFNαG或IFNαJ1的活性。

11)根据实施例1-10中任一项所述的抗体，其中该抗体结合人IFNω，解离常数(K_D)为约5×10^-9M或更小、约1×10^-9M或更小、约5×10^-10M或更小、约1×10^-10M或更小、约5×10^-11M或更小、约1×10^-11M或更小、约5×10^-12M或更小、或约5×10^-12M或更小，并且结合人IFNα亚型IFNαB2、IFNαF、IFNαG或IFNαJ1，K_D为约5×10^-9M或更小、约1×10^-9M或更小、约5×10^-10M或更小、约1×10^-10M或更小、约5×10^-11M或更小、约1×10^-11M或更小、约5×10^-12M或更小、或约5×10^-12M或更小，其中使用实例3中在“亲和力测量”部分下示例的条件测量K_D。

12)根据实施例1-11中任一项所述的抗体，其中该抗体竞争结合至人IFNω和人IFNα亚型IFNαB2、IFNαF、IFNαG和/或IFNαJ1，其中所述分离的抗体包含：

a)SEQ ID NO:23的重链可变区(VH)氨基酸序列和SEQ ID NO:24的轻链可变区(VL)氨基酸序列；或

b)SEQ ID NO:27的VH氨基酸序列以及SEQ ID NO:28的VL氨基酸序列。

13)根据实施例1-12中任一项所述的抗体，其中该抗体在SEQ ID NO:1的残基F27、L30和R33中的一个或多个处结合IFNω。

14)根据实施例1-13中任一项所述的抗体，其中该抗体在SEQ ID NO:1的残基F27、L30和R33处结合IFNω。

15)根据实施例1-14中任一项所述的抗体，其中该抗体进一步结合选自由SEQ IDNO:1的残基P26、K31和R34组成的组中的至少一个IFNω残基。

16)根据实施例14或15所述的抗体，其中该抗体进一步结合选自由SEQ ID NO:1的残基R22、R23、I24、S25、P26、K31、D32、R34、D35、Q40、K134、M146、E147、M149、K150、F153和L154组成的组中的至少一个IFNω残基。

17)根据实施例1-16中任一项所说的抗体，其中该抗体在SEQ ID NO:19的残基F27、L30和R33中的一个或多个处结合IFNα4a。

18)根据实施例1-17中任一项所述的抗体，其中该抗体在SEQ ID NO:19的残基F27、L30和R33处结合IFNα4a。

19)根据实施例17或18所述的抗体，其中该抗体进一步结合选自由SEQ ID NO:19的残基H26、K31和R34组成的组中的至少一个IFNα4a残基。

20)根据实施例17-19中任一项所说的抗体，其中该抗体进一步结合选自由SEQ IDNO:19的A19、G22、R23、I24、S25、H26、C29、K31、D32、H34、D35、V143、A146、E147、M149、R150和S153组成的组中的至少一个IFNα4a残基。

21)根据实施例1-20中任一项所说的抗体，其中该抗体抑制病毒诱导的白细胞干扰素的活性。

22)根据权利要求21所述的抗体，其中所述病毒诱导的白细胞干扰素的活性是由100U/ml干扰素诱导的IP-10在全血中的释放。

23)根据权利要求22所述的抗体，其中在50μg/ml的抗体存在下，活性被抑制超过50％。

24)根据实施例1-23中任一项所述的抗体，其中该抗体抑制系统性红斑狼疮(SLE)免疫复合物诱导的IFN的活性。

25)根据权利要求24所述的抗体，其中活性被抑制超过约50％。

26)根据实施例1-25中任一项所述的抗体，包含：

b)SEQ ID NO:27的重链可变区(VH)氨基酸序列和SEQ ID NO:28的轻链可变区(VL)氨基酸序列。

27)根据实施例1-26中任一项所述的抗体，其中该抗体不结合或中和人干扰素-β(IFNβ)。

28)根据实施例1-27中任一项所述的抗体，其中该抗体不结合或中和人IFNαD。

29)根据实施例1-28中任一项所述的抗体，其中该抗体为人、人源化或人适应性的。

30)根据实施例1-29中任一项所述的抗体，其中该抗体为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。

31)根据实施例1-30中任一项所述的抗体，其中该抗体为双特异性的。

32)根据实施例31所述的抗体，其中该抗体结合BLyS、CD40L、IL-6、CD27、BDCA2、或者IL-12或IL-23的p40亚基。

33)一种包含根据实施例1-32中任一项身上的抗体的药物组合物以及药学上可接受的载体。

34)根据实施例1-32中任一项所述的抗体或根据实施例33所述的药物组合物，用于治疗或预防与IFNα和/或IFNω的生成增加相关联的疾病。

35)用于根据实施例34使用的根据实施例1-32中任一项所述的抗体或根据实施例33所述的药物组合物，其中与IFNα和/或IFNω的生产增加相关联的疾病是免疫介导的炎性疾病，任选地其中免疫介导的炎性疾病是系统性红斑狼疮(SLE)、I型糖尿病、牛皮藓、原发性干燥病、系统性硬化病或类风湿性关节炎。

36)用于根据实施例34或35使用的根据实施例1-32中任一项所述的抗体或根据实施例33所述的药物组合物，其中患者表现出I型干扰素特征。

37)用于根据实施例34-36使用的根据实施例1-32中任一项所述的抗体或根据实施例33所述的药物组合物，其中该抗体为双特异性抗体，任选地其中该双特异性抗体结合BLyS、CD40L、IL-6、CD27、BDCA2或IL-12或IL-23的p40亚基。

38)根据实施例1-32或37中任一项所述的抗体或根据实施例33所述的药物组合物，用于抑制患者中IFNω和IFNα亚型IFNαB2、IFNαC、IFNαF、IFNαG和/或IFNαJ1与IFNAR的相互作用。

39)用于根据实施例38使用的抗体或药物组合物，其中患者患有免疫介导的炎性疾病，任选地其中免疫介导的炎性疾病为SLE、I型糖尿病、牛皮藓、原发性干燥病、系统性硬化病或类风湿性关节炎。

40)用于根据实施例38或39使用的抗体或药物组合物，其中所述患者表现出I型干扰素特征。

41)用于根据实施例38-40中任一项使用的抗体或药物组合物，其中所述抗体为双特异性抗体，任选地其中所述双特异性抗体结合BLyS、CD40L、IL-6、CD27、BDCA2、IL-12或IL-23的p40亚基、或BDCA2。

本发明现结合以下具体的、非限制性实例进行描述。

实例1用于免疫、噬菌体筛选、抗体表征和晶体学研究的人I型IFN抗原的生成：

使用标准方法，使用诸如SEQ ID NO:17-21的信号序列，将12个单独的重组人I型IFNα，包括αA(α2a)(SEQ ID NO:5)、αB2(α8)(SEQ ID NO:6)、αC(α10)(SEQ ID NO:7)、αD(α1)(SEQ ID NO:8)、αF(α21)(SEQ ID NO:9)、αG(α5)(SEQ ID NO:10)、αH2(α14)(SEQ ID NO:11)、αI(α17)(SEQ ID NO:12)、αJ1(α7)(SEQ ID NO:13)、αK(α6)(SEQ ID NO:14)、α4b(α4)(SEQ ID NO:15)、αWA(α16)(SEQ ID NO:16)以及黑猩猩IFNω(黑猩猩IFNω)(SEQ ID NO:3)表达于HEK 293细胞中。为提高表达水平和溶解性，在人IFNω的第80位IFN-ω(T80E)生成单氨基酸突变体并表达于HEK 293细胞中。T80E IFNω变体(SEQ ID NO:2)具有类似于野生型蛋白质的活性。

实例2.结合并中和抗体的IFNα和IFNω的生成

小鼠免疫

C2595的生成

用人IFN-α、黑猩猩IFN-ω和食蟹猕猴IFN-ω的混合物对BALB/c小鼠多次腹膜内注射免疫。在第0天，用黑猩猩IFN-ω对小鼠免疫。在第14天，用黑猩猩和食蟹猕猴IFNω、人IFNαD、IFNαJ1、IFNαC、IFNαB2、IFNαH2、IFNαA、IFNα4a、IFNαG、IFNαF、IFNαWA和IFNαI的混合物对相同小鼠免疫。在第208天，用食蟹猕猴IFN-ω、人IFNα4b、IFNαA、IFNαD和IFNαK的混合物对相同小鼠免疫。在第221天，用食蟹猕猴IFN-ω、人IFNαJ、IFNαI、IFNα4a、IFNαA和IFNαF的混合物对相同小鼠免疫。在免疫之后评估特异性IgG效价。一旦获得足够的效价，分离脾细胞并与FO细胞融合。将所得的杂交瘤接种于96孔板中并培养10天。首先通过用ELISA对黑猩猩IFN-ω的结合以及人IFNαA、IFNαH2、IFNαD和IFNα4a的混合物的结合进行初筛，来鉴定抗原特异性克隆。通过Luminex多重测定进一步筛选结合至IFN-α和/或IFN-ω的杂交瘤。选择广泛地结合至大多数IFNα以及人和食蟹猕猴IFNω的克隆以供进一步研究。

噬菌体展示文库

结合人I型IFN的Fab选自描述于Shi等人，J.Mol.Biol.397:385-396,2010；国际专利公布WO2009/085462；美国专利公布US2010/0021477；美国专利公布US2012/0108795中的从头pIX噬菌体展示文库。

IFWM43的选择

针对纯化的I型IFNαA(IFNα2)(通过人野生型IFN-αA序列C-端聚组氨酸标签表达生成并通过固定化金属亲和层析纯化)筛选pIX噬菌体展示文库。使用三轮筛选。分别使用100nM、10nM和1nM生物素酰化抗原进行第一轮、第二轮和第三轮筛选。将在三轮筛选后收获的衍生自噬菌粒克隆的单克隆Fab用标准ELISA进行初筛，筛选它们结合黑猩猩IFNω、人IFNα2、IFNα1、IFNαH2、IFNαG、IFNαF和抗生物素蛋白。对在ELISA中特异性结合至IFNα和IFN-ω的Fab片段(Fab)测序，并且如果它们具有不同的V区序列，将其鉴定为独特的IFN结合物。在与鉴定抗炎活性相关的一系列基于细胞的测定中进一步测试其中和活性后，将Fab转变为人IgG1mAb并鉴定为IFN结合物。

IFWM88的鉴定

针对纯化的I型IFNαG(a5)(通过人野生型IFN-αA序列C-端聚组氨酸标签表达生成并通过固定化金属亲和层析纯化)筛选pIX噬菌体展示文库。使用三轮筛选。分别使用100nM、10nM和1nM生物素酰化抗原进行第一轮、第二轮和第三轮筛选。将在三轮筛选后收获的衍生自噬菌粒克隆的单克隆Fab用标准ELISA进行初筛，筛选它们结合黑猩猩IFNω、人IFNα2、IFNα1、IFNαH2、IFNαG、IFNαF和抗生物素蛋白。对在ELISA中特异性结合至IFNα和IFN-ω的Fab片段(Fab)测序，并且如果它们具有不同的V区序列，将其鉴定为独特的IFN结合物。在与鉴定抗炎活性相关的一系列基于细胞的测定中进一步测试其中和活性后，将Fab转变为人IgG1mAb并鉴定为IFN结合物。

所生成抗体的可变区的氨基酸序列如下：IFWM43VH：SEQ ID NO:23；IFWM43VL：SEQID NO:24；以及IFWM88VH：SEQ ID NO:25；IFWM88VL：SEQ ID NO:26；C2595VH：SEQ ID NO:27；C2494VL：SEQ ID NO:28。将C2595可变区转移到人IgG1恒定区并将所得抗体命名为M3239。IFWM43也称为M43并且IFWM88也称为M88。

实例3.结合并中和抗体的IFN-α和IFN-ω的表征

方法

亲和力测量

用ProteOn(Bio-Rad Hercules,CA)，使用SPR技术执行抗体的结合亲和力测量。使用如制造商推荐的标准NHS/EDC化学过程，将山羊抗人Fc抗体(制造商)胺偶联到GLC芯片(Bio-Rad Hercules,CA)。然后将抗IFN mAb上样到抗体偶联芯片上，在30μl/min的流速下保持2分钟。用运行缓冲液(缓冲液组合物)以50μl/ml的流速洗涤2分钟后，使重组IFN抗原在100nM至1.23nM范围内的5个不同浓度下用1:3稀释度缔合3分钟并解离10分钟，缔合和解离均在50μl/ml的流速下进行。在运行不同抗原之间，用100mM磷酸在每个方向生成芯片。使用ProteOn管理器(Bio-Rad Hercules,CA)执行数据分析。通过mAb对传感图分组。在(使用点间参照或空白通道参照)应用定线和参考校正后，将SPR数据全局拟合到动力学速率常数的Langmuir模型(K_D＝k_off/k_on，其中K_D＝平衡解离常数，k_on＝缔合速率常数，并且k_off＝解离速率常数)。

ISRE报告基因测定(“ISRE报告基因测定”)

使用HEK-Blue^TM IFN-α/β细胞(InvivoGen,San Diego,CA)，该细胞被工程化以表达全活性I型IFN信号传导通路(稳定表达STAT2和IRF9)并且在IFN-α/β诱导型ISG54启动子控制下用SEAP报告基因转染。将细胞在胶原I型涂布的T150烧瓶中在具有10％胎牛血清、100μg/ml杀稻瘟菌素和30μg/ml博莱霉素的达尔伯克氏改良伊格尔培养基中在37℃、5％CO₂下生长。收获细胞并以50μl/孔以50,000个细胞/ml接种于384孔板中。将接种的细胞在37℃、5％CO₂下温育24小时。制备测试的干扰素样品并稀释于用过的HEK ISRE无血清培养基中，并向每个孔加入50μl IFN样品。将接种的细胞在37℃、5％CO₂下温育20小时。在室温下温育20分钟后，用重悬于过滤水的60μl/孔QUANTI-Blue^TM从20μl接种的细胞上清液检测碱性磷酸酶。在Biotek Synergy读板器上在650nm下读取光密度。

一些ISRE报告基因测定在96孔板中按如下方式进行：将HEK-Blue^TMIFN-α/β细胞(InvivoGen,San Diego,CA)以50,000个细胞/孔接种于100μl选择自由培养基(DMEM+Glutamax/10％FBS,Gibco)中并使其在37℃下温育过夜。第二天，在存在或不存在I型IFN抑制剂的情况下，在单独的96孔U底转移板(BD Falcon)中制备I型IFN刺激物(即，重组干扰素、白细胞IFN、IC诱导的IFN制剂、血清等)并在37℃下预热10分钟。将细胞板从温育器移除并将培养基移除并替换为100μl在96孔U底转移板中制备的适当处理剂。将细胞重置于37℃下24小时。第二天，将40μl上清液转移到含有160μl QUANTI-Blue^TM SEAP底物(Invivogen)的96孔平底板(BD Falcon)。使板展开约15分钟，这时使用光度计在650nm的吸光度下读数。

IP-10释放测定：

将来自健康志愿者的肝素化全血涂布于含有几种不同I型IFN抑制剂及同种型对照的U型底96孔板中。将抑制剂和适当的同种型对照稀释于含10％FBS的RPMI培养基中。将IFN和抑制剂或同种型对照稀释于体积30μl的含10％FBS的RPMI培养基中。样品预温育15-20分钟后，向含有稀释液的板中加入240μl肝素化全血，使得总体积为270μl。混合样品，在37℃下温育20-22小时。温育后，以400Xg离心样品5分钟，采集血浆并冷冻以供后续分析。IP-10分布图使用Milliplex细胞因子/趋化因子试剂盒(Millipore，预混39plex)来完成。根据制造商建议，使用BioRad模型(Bioplex^TM 200)系统进行样品制备及测定，并使用Bioplex manager^TM软件4.1采集数据。使用Graph pad Prism V.5软件进行统计分析。在某些情况下，使用得自Qiagen的单分析物ELISA试剂盒对IP-10进行定量。

SLE全血基因特征测定：

SLE供体全血从Asterand商购获得。使用含有富集了IFN刺激基因(ISG)的引物和探针的定制TaqMan低密度阵列卡进行全血基因表达分析。该阵列包含的基因如下：ACTB、IL6、IL10、IL13、FAS、IL15、IL21、IL17A、EIF2AK2、OASL、18S、STAT1、LY6E、PLSCR1、MX1、IFIT1、IFI44、IFI44L、IFI27、ISG15、RSAD2、CXCL10、LAG3和TNFSF10。按照制造商说明，在ABI Prism 7900HT序列检测系统(Applied Biosystems,CA,USA)上进行RT-PCR扩增。使用比较阈值循环(C_t)方法计算相对表达值。简单地说，这一技术使用式2^-ΔΔCt计算靶基因的表达，归一化至校准组(正常健康未处理的全血)。选用β肌动蛋白(ACTB)作为分子内标。阈值循环(C_t)表示扩增靶的量达到固定阈值时的循环数。使用所有干扰素诱导的靶基因和ACTB的C_t数据得到ΔC_t值[ΔC_t＝C_t(靶基因)-C_t(ACTB)]。每个靶的ΔC_t值减去对照组(5个正常健康未处理的全血供体)的平均值，计算得到ΔΔC_t的值。使用方程2^-ΔΔC计算得到相对表达值_。该试验中的3个SLE供体对低密度阵列上9个ISG的基因表达比对照组高至少2倍。为了比较I型IFN抑制剂在所有3个供体中的效果，首先使用以下公式测定了每种处理剂/抑制剂的抑制％：

(2^-ΔΔCt未处理的SLE血–2^-ΔΔCt抑制剂/2^-ΔΔCt未处理的SLE血)×100＝抑制％。接下来，根据以下公式计算了所有三个供体中每种处理剂的基线％：100–抑制％＝基线％。

然后针对9个基因中的每一个，测定按处理组分组的所有3个供体的基线％平均值。将未处理的SLE组(“仅含SLE血”)设定为100，代表该组100％来自于基线。基线代表非IFN诱导的基因表达。最后，测定每一处理组在所有9个基因中的平均值和标准偏差并作图。通过进行学生T-检验，确定统计意义上的显著性。

SLE免疫复合物的制备：

SLE患者血浆是从SCIPAC(Kent,UK)获得的。如通过基于ISRE的报告基因测定所确定的具有I型IFN活性的血浆样品进一步用于IgG纯化。根据制造商(Thermo SCIENTIFIC)建议，使用NAB^TM蛋白A/G离心柱纯化IgG，并进行蛋白质测定以确定浓度(Pierce BCA)。使用以5×10⁷个细胞/ml悬浮于1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的HEK293T细胞制备了自身抗原裂解物。为了破裂Hek293T细胞，进行-80℃冷冻和37℃解冻循环4次，除初始冷冻的至少30分钟外，每次冻融至少10分钟；冻融后，通过离心(400g，5分钟)除去细胞碎片，并通过蛋白质测定对可溶性抗原量进行定量。纯化的IgG和坏死细胞裂解液按照1:1比例混合，在室温下一起温育30分钟，形成免疫复合物。然后将终浓度400μg/ml的免疫复合物加至6孔板中的3个孔，每个孔含总体积4ml的PBMC培养基。将健康供体IgG纯化并按照上述相同方式进行“复合”，用于刺激PBMC作为对照。将这些研究中的条件培养基等分并用作抑制试验中内源性IFN的来源。由分离自健康志愿者的IgG制备的制剂中未发现IFN活性。

结果

对重组I型IFN的亲和力及中和

表2示出了抗体M43、M88和M3239对单个重组人I型干扰素(IFN)的解离常数(K_D)。M43、M88和C2595中和了至少四个IFNα分子：α-B2、α-F、α-G和α-J1。未观察到对α-D的结合。

表3示出了报告基因测定中测量的抗体M43、M88和M3239(C2595)对单个重组人I型IFN的IC₅₀值。M43为广泛中和的，抑制至少10个IFNα分子。M3239中和具有亚pM级IC₅₀的IFNω，而M43中和具有nM级IC₅₀的IFNω。在这一具体测定中，由于M88与IFNω结合较弱，M88对IFNω未显示中和活性。然而，亲和力成熟后，衍生自M88的抗体显示出强IFNω中和活性，同时保持其广泛的IFNα中和活性(数据未显示)。无抗体结合或中和IFNβ。

表2.

NB＝未结合

ND：未测出

M3239：衍生自c2595的人/小鼠嵌合的IgG1

表3.

NA：无中和活性

PA：部分中和活性

ND：未测出

内源性I型IFN的中和

在评价用内源性白细胞IFN(病毒诱导的)或重组IFNω刺激的人全血中趋化因子IP-10(CXCL10)释放的试验中，对抗体中和内源性I型IFN的能力进行了评估。观察到白细胞IFN(图1A)和重组IFNω(图1B)对M43和C2595的剂量依赖性抑制，表示抗体中和各种I型IFN(例如由病毒诱导的白细胞产生的)活性的能力。内源性白细胞IFN购于Sigma(产品目录号#I4784-1MU)。

疾病相关IFN环境的中和

测试了抗体降低作为刺激的SLE免疫复合物诱导的IFN的能力，以更好地代表SLE中存在的I型IFN环境。通过使用来自SLE患者的免疫复合物刺激人PBMC制备SLE免疫复合物诱导的IFN，并且这种条件培养基在抑制剂mAb和对照mAb存在的情况下用于I型IFN诱导型报告基因测定(如上所述的ISRE报告基因测定)中。与等量同种型对照mAb存在下抗IFNαmAb相比，中和mAb的选择性IFNω结合3种不同IFNα拮抗剂mAb的添加进一步降低了免疫复合物诱导的IFN的总活性(图2)。另外，抗IFNα/ωmAb M43显示，与IFNα抑制剂mAb相比活性的进一步抑制表明IFNα和IFNω的双重阻断可比单独IFNα中和降低更多总IFN活性(图2)。

IFNω有助于SLE相关的IFN环境

如上文所述，使用九种IFN诱导的基因组合开发了一种SLE基因特征测定法。测试了不同抗体抑制基因特征的能力。与等量浓度同型对照mAb相比，IFNω特异性拮抗剂mAb(抗-ω)下调了IFN特征，表明IFN-ω是在SLE中诱导IFN特征的活性I型IFN环境的一部分。IFNω抗体和IFNα抗体的结合与单独IFNα或IFNω抑制剂相比，对在这些患者血液中延续的IFN特征造成了更为显著的抑制(图3)。

实例4.竞争性表位绘图

使用采用Octet(ForteBio,Menlo Park,CA)的实时无标记竞争结合测定进行表位结合实验。使用两种测定形式：串联测定形式和经典夹层测定形式。

在串联测定形式中，将链霉抗生物素蛋白生物传感器末端(forteBio,MenloPark,CA)浸入0.5μg/ml生物素化的重组干扰素中5分钟，同时测量实时动力学信号。然后将末端浸入到第一组mAb(10μg/ml)中15分钟。随后再将末端浸入到第二组mAb(10μg/ml)中10分钟或15分钟。来自浸入到第二组mAb的末端的阳性结合信号表明其与第一组mAb结合于不同表位，而阴性信号表明它们结合于相同表位。为了消除由于两组mAb亲和力差异造成的错误结果，以相反顺序重复进行该实验，即末端先浸入到第二组mAb中，然后再浸入第一组mAb中。将所有的抗体和抗原稀释到含有1mg/ml BSA和0.02％吐温20的PBS中。

在经典夹层测定形式中，使用标准NHS/EDC介导的化学方法，根据制造商提供的方案(forteBio,Menlo Park,CA)将第一组mAb偶联至胺反应性生物传感器末端。在乙醇胺中骤冷5分钟后，将末端浸入到重组干扰素(2μg/ml)中10分钟，然后将其浸入第二组mAb(15μg/ml)中10分钟或15分钟。偶联mAb在MES缓冲液6.0中进行稀释，而分级mAb和抗原在含有1mg/ml BSA和0.02％吐温20的PBS中进行稀释。

使用以下抗体通过两种测定形式进行了三组表位分级实验：M43、M88和C2595(结合多个IFNα亚型和IFNω)、C2601和M42(结合IFNω但对IFNα亚型结合弱)和C2605(结合多个IFNα亚型，但不结合IFNω)。在竞争性测定中测试了不同的IFN-α分子(人IFNα亚型IFNαA、IFNαB、IFNαC、IFNαF、IFNαG、IFNαH、IFNαJ、IFNα2、IFNα4a以及黑猩猩IFNω和人IFNAR2-Fc分子)。

表4示出了在M43存在下的竞争结果，表5示出了在IFNAR2-Rc存在下的竞争结果。M43和M88相互竞争以结合至所有测试IFNα分子和黑猩猩IFNω。不结合至IFNω的M42不与M43竞争结合至所测试的IFN-分子。M43与C2595和IFNAR-Fc竞争结合至黑猩猩IFNω和不同IFNα分子。C2605不与M43竞争结合至大多数IFNα，表明这两种抗体结合不同的表位。C2601，一种强IFNω结合剂但弱IFNα结合剂，不与M43竞争结合至IFNω，表明这两种抗体结合不同的表位。C2595而非C2601或C2605与IFNAR2-Fc竞争结合至黑猩猩IFNω和/或IFNαA。结合IFNω和多个IFNα亚型的抗体因此定义不同的表位仓如下：仓A：mab M43、M88、C2595。仅结合IFNα或IFNω的抗体形成不同的表位仓。

表4.

“-”表示未结合

“+”或“++”表示结合

NT：未测试

*c2601不以高亲和力结合至IFNaA

**c2605不结合至黑猩猩IFNw

表5.

*c2601不以高亲和力结合至IFNaA

**c2605不结合至黑猩猩IFNw

实例5衍生自具有IFNωT80E突变体的复合物中抗-IFNα/ω抗体M43晶体结构的 M43的表位

IFWM43(其mAb和Fab在下文中分别称为M43和FabM43)广泛中和人IFNα分子和IFNω并显示可结合数种IFNα亚型和人IFNω。为了揭示其对IFNα亚型和IFNω的特异性结构基础，测定了具有FabM43的复合物中IFN-ω的晶体结构。

材料和方法

蛋白质

在HEK293F细胞中表达了His-标记的FabM43(IgG1/κ同种型)和具有T80E突变的人IFNω(在本实例中，IFNω和IFNωT80E是同义的)，并使用亲和色谱和体积排阻色谱对其进行纯化。蛋白质溶于20mM Tris(pH7.4)、50mM NaCl中。

IFNω/FabM43复合物的结晶

将IFNω与FabM43以摩尔比1.05:1.0(过量IFNω)混合制备复合物，在用20mM乙酸钠、pH5.5、0.1M NaCL和10％甘油平衡的Superdex 200柱上进行纯化。使用Amicon-Ultra10kDa截留值将纯化的复合物浓缩至10.24mg/ml。根据(Obmolova等人，Acta CrystallogrD Biol Crystallogr66:927-33,2010)所述，使用坐滴法从MMS接种的0.1M MES、pH6.5、26％PEG 3350、1MLiCL、0.7％1-丁醇中得到适用于X衍射的晶体。

X射线数据采集和结构测定

对于X射线数据采集，将晶体在补充有20％甘油的合成母液(0.1MES pH 6.5、20％PEG 3350、1M LiCL)中浸泡几秒钟，并在液氮中快速冷冻。在Swiss光源采集X射线衍射数据。使用程序XDS对X射线数据进行处理(Kabsch,Acta Crystallographica 66:125-132,2010)。表6中给出了X射线数据统计。

使用Phaser，通过分子置换法(MR)解析结构(Read,Acta Crystallogr D BioCrystallogr 57:1373-82,2001)。MR的搜索模型是Fab15的晶体结构(PDB ID 3NCJ；Luo等人，J Mol Biol 402:708-719,2010)和IFN-α2的晶体结构(PDB ID 1RH2；Radhakrishnan等人，Structure 4:1453-1463,1996)，其Cα模型可在PDB中获取。若要用于MR，通过MR使用Phaser以及Cα坐标和PDB中的反射数据，得到IFN-α2的完整分子模型，并使用PHENIX进行精修(Adams等人，J Syncrhrotron Radiat 11:53-55,2004)。使用PHENIX对IFN-ω/FabM43结构进行精修，并使用COOT进行模型调整(Emsley和Cowtan，Acta Crystallogr D BiolCrystallogr 60:2126-2132,2004)。所有其他晶体计算均使用CCP4套件程序执行(Collaborative Computational project,Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 53:240-255,1994)。使用程序RBOW计算可变域和恒定域之间的肘角(Stanfield等人，J MolBiol 357:1566-1574,2006)。使用PyMol生成分子图形(DeLano,Palo Alto,CA,USA,Delano-Scientific)。表6中给出了结构精修统计。

表6.晶体数据和精修统计。

^aR_merge＝Σ|I-<I>|/ΣI，其中I是测量的反射的强度，<I>是这一反射中所有测量的平均强度。

其中F_obs和F_calc是观察和计算得到的结构因子，R_free是针对精修前一组随机选择的5％反射计算得到的。

^c拉氏图是使用MolProbity计算得到的。

^d根据衍射各向异性规模服务器，a^*、b^*和c^*中的各向异性分辨率极限为

和

(http://_services_mbi_ucla.edu/_anisoscale/)。衍射数据统计是使用这些极限进行各向异性截断和缩放后的数据集。

结果

整体结构

不对称单元中有六个IFNω/FabM43复合物。所有这些复合物都非常相似。图4中示出了IFNω/FabM43复合物的整体代表性分子结构。图中：标记为H的是VH；标记为L的是VL，左上方是IFNω

IFNω分子具有基本相同的构象，平均Cαrmsd小于

IFNω的分子结构为与平均Cαrmsd为

的IFN-α2非常相似的螺旋束，与公布的IFN-ω(pdb id 3se4，Cαrmsd为

)和IFNβ(94个残基的Cαrmsd为

)几乎相同。然而，IFNα/ω和IFN-β之间有一些显著的差异，因为IFNβAB环少一个残基。Fab分子也具有相同的结构，除了CDR-H1中的短拉伸(G₂₆GTF₂₉)(SEQ ID NO:33)，其中采用略微不同的主链构象。

表位、互补位及Ab/Ag相互作用

M43识别了由AB环(R22和Q40之间)残基和螺旋E的残基K134、M146、M149、K150、F153和L154构成的构象表位(表7)。互补位由六个CDR中的五个的残基构成。互补位残基主要为疏水性的，形成一系列袋，与短AB螺旋的残基F27、L30、K31和R33的侧链对接。抗体和抗原的相互作用显示多为范德华力和疏水性堆积(hydrophobic packing)。抗体和抗原之间只存在少数氢键，并且其中大部分涉及主链-主链或侧链-主链相互作用。多数Ab/Ag相互作用是由AB螺旋的若干残基F27、L30、K31和R33造成的。因此，IFNω这一区域看来是构成表位的主要部分。

表7抗体M43的表位和互补位。示出了所有六个复合物的接触残基。根据人IFNω SEQ ID NO:1的残基编号

ABO

CDP

EFQ

GHR

IJX

KJT

VL：

Y31

S33

Y38

F98

D99

Y102

VH：

T28

F29

S30

S31

Y32

A33

G50

I51

I52

I54

F55

T57

A58

N59

D99

W101

Y105

IFN-ω

R22

P26

F27

L30

K31

D32

R33

R34

D35

Q40

K134

M146

M149

K150

F153

L154

结合配偶体中所有

以内的残基考虑为接触残基。对抗体VL和VH残基按顺序编号。

抗体中和的模式

最近报道了具有IFNΑR1和/或IFNΑR2的复合物中的IFNα/ω的晶体结构(Thomas等人，Cell 146:621-632,2011)。M43/IFNα4结构和IFNω/IFNΑR1/IFNΑR2复合物的对比清楚表明M43重链和IFNΑR2将重叠。因此，M43通过阻断IFNΑR2/IFN相互作用进行中和。

实例6来自具有IFNωT80E或IFNα4A的复合物中的Fab357(C2595的Fab)晶体结构的C2595表位

C2595(其mAb和Fab在下文中分别称为C2595和Fab357)是一种中和从小鼠杂交瘤中获得的多种人IFN-α分子和IFNω的抗体。将V区克隆并嵌合到人重链和轻链(IgG1κ同型)，以产生重组Fab357。测定了IFN-ω/Fab357和IFN-α4A/Fab357复合物的晶体结构。

材料和方法

蛋白质

在HEK293F细胞中表达了His-标记的Fab357(IgG1/κ同种型)和具有T80E突变的人IFNω(下文中称为IFNωT80E。在本实例中，IFNω和具有T80E的IFNω是同义的)，并使用亲和色谱和体积排阻色谱对其进行纯化。蛋白质溶于20mM Tris(pH 7.4)、50mM NaCl中。IFNα4A购自Crown Bioscience公司，溶于20mM Tris(pH 7.4)、50mM NaCl中。

IFNα4A/Fab357和IFNω/Fab357复合物的结晶

将IFNα4A和Fab357以摩尔比1.05:1.0混合制备IFNα4A/Fab357复合物，并在SuperDex 200柱上用含0.1M NaCL的20mM MES(pH 6.5)进行纯化。将纯化的复合物浓缩至5.5mg/ml。在由蛋白质溶液和20％PEG 3350及0.2M柠檬酸铵的等量混合物组成的坐滴中接种，生长得到衍射品质的晶体。

将IFNω和Fab357以摩尔比1.17:1.0(过量IFNω)混合制备IFNω/Fab357复合物，在4℃温育2小时，并且在使用20mM HEPES pH 7.5和0.1M NaCL平衡的Superdex 200柱(GEHealthcare)上纯化IFNω/Fab357复合物并浓缩至6.8mg/ml。通过在由蛋白质复合物和100mM MES pH6.5、18％PEG 3K、0.2M LiCl的等量混合物组成的坐滴中接种，得到适用于X衍射的晶体。

X射线数据采集和结构测定

对于X射线数据采集，将IFNα4A/Fab357和IFNω/Fab357晶体浸泡在补充有20％甘油的合成母液(分别为20％PEG 3350、0.2M柠檬酸铵、平板10/20/11-MMS-A10和0.1MES pH6.5、18％PEG 3350、0.2M LiCL、平板12/21/2011-B11(R))中几秒钟，并在液氮中快速冷冻。分别在阿贡国家实验室(Argonne National Lab)的高级光子源和Swiss光源下采集X射线衍射数据。使用程序XDS处理X射线数据。表8中给出了X射线数据统计。

使用Phaser通过分子置换法(MR)解析结构。MR的搜索模型是具有M43的复合物中Fab15(PDB ID 3NCJ)和IFNω的晶体结构。使用PHENIX⁵进行结构精修，并使用COOT进行模型调整。所有其他晶体计算均使用CCP4套件程序执行。使用PyMol生成分子图形。表8中给出了结构精修统计。

表8.晶体数据和精修统计。

其中F_obs和F_calc是观察和计算得到的结构因子，

R_free是针对精修前一组随机选择的5％反射计算得到的。

拉氏图是使用MolProbity计算得到的。

结果

整体结构

两种晶体结构的不对称单元中都有一个抗原/抗体复合物。图5中示出了整体代表性分子结构。两种晶体中的Fab分子非常相似。IFNα4A的构象与IFNα4A/FabM88的构象非常相似。对于IFNω/Fab357结构，IFNω模型只包含残基R22-P39和L118-L154。IFNω的缺失残基不是晶体无序的结果，而是晶体堆积阻止其存在。显然，结晶过程中发生了IFNω的蛋白水解裂解。有证据表明，位于冷箱中的相同复合物的部分发生了一些蛋白酶降解，尽管其形式与在晶体中鉴定到的形式不同(数据未示出)。然而，IFNω的结合区是有序排列的。

表位、互补位及Ab/Ag相互作用

C2595识别了在IFNα4A和IFNω上几乎相同的构象表位，所述表位由AB环(R/G22和R/H34之间)残基和螺旋E的残基V143、M/A146、E147和R/K150构成(表9)。互补位由六个CDR中的四个(CDR-L1、L3、H2和H3)的残基构成。互补位残基主要为疏水性的，形成一系列袋，与短AB螺旋的残基F27、L30、K31和R33的侧链对接。抗体和抗原的相互作用显示多为范德华力和疏水性堆积。抗体和抗原之间只存在少数氢键，并且其中大部分涉及主链-主链或侧链-主链相互作用。多数Ab/Ag相互作用是由AB螺旋的若干残基F27、L30、K31和R33造成的。因此，IFNω这一区域看来是构成表位的主要部分。

表9.抗体C2595的表位和互补位。示出了所有六个复合物的接触残基。根据IFN-ω SEQ ID NO:1和IFN-α4aSEQIDNO:19的残基编号。

结合配偶体中所有

以内的残基考虑为接触残基。对抗体VL和VH残基按顺序编号。

抗体中和的模式

C2595通过阻断IFNΑR2/IFN相互作用进行中和。

实例7衍生自具有IFNα4A的复合物中的抗-IFNα抗体M88的晶体结构的M88表位

具有IFNα4A的复合物中的抗-IFN抗体M88的晶体结构测定为

主要表位是IFN的AB环中的螺旋单体A19-D35。M88的结合会阻止IFNAR2相互作用。因此，M88是一种IFNΑR2阻断剂。该结构阐明了M88结合的交叉反应性。

IFWM88(其mAb和Fab在下文中分别称为M88和FabM88)是一种中和人IFNα的抗体。M88mAb显示可结合至数种IFNα亚型，但很少结合至人IFNω。

材料和方法

蛋白质

在HEK293F细胞中克隆并表达His-标记的FabM88(IgG1/kappa同型)，并使用亲和色谱和体积排阻色谱进行纯化。Fab溶于20mM Tris(pH7.4)、50mM NaCl中。IFNα4A购于Crown Bioscience Inc.(溶于20mM Tris(pH 7.4)、50mMNaCl中)。

IFNα4A/FabM88复合物的结晶

将IFNα4A与FabM88以摩尔比1.05:1.0(过量IFNα4A)混合制备复合物，4℃下温育一小时，使用20mM Tris(pH 8.0)、10％甘油、0.1M NaCl稀释20倍，然后使用Amicon-Ultra10kDa截留值将其浓缩至9.25mg/ml。使用IH1、IH2和PEG套件(Qiagen)建立初步结晶。复合物的结晶使用Oryx4机器人(Douglas Instruments)通过蒸气扩散法在20℃下进行。晶体从IH2#E12-25％PEG 3K、0.2M柠檬酸铵中析出。使用这些初始晶体制备结晶晶种。为了改善晶体质量，在使用20mm MES(pH 6.5)、0.1M NaCl、10％甘油平衡的Superdex 200柱(GEHealthcare)上纯化IFNα4A/FabM88复合物，并将其浓缩至8.16mg/ml。根据(Obmolova等人，Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66:927-935,2010)所述，从MMS接种的28％PEG3K、0.2M柠檬酸铵中得到适用于X衍射的晶体。

X射线数据采集和结构测定

对于X射线数据采集，将一种晶体在补充有20％甘油的母液中浸泡几秒并以95K氮流快速冷冻。使用配备有Osmic^TM VariMax^TM共聚焦光学器件、Saturn 944CCD检测器和X-stream^TM 2000cryo冷却系统(Rigaku,TX)的Rigaku MicroMax^TM-007HF微焦X射线发生器采集X射线衍射数据。通过235°晶体旋转在半度图像中检测衍射强度。使用程序XDS处理X射线数据。表10中给出了X射线数据统计。

使用Phaser通过分子置换法(MR)解析结构。MR的搜索模型是Fab15的晶体结构(PDB ID 3NCJ)和IFNα2的晶体结构(PDB ID 1RH2)，其Cα模型可在PDB中获取。若要用于MR，通过MR使用Phaser以及Cα坐标和PDB中的反射数据，得到IFNα2的完整分子模型，并使用PHENIX进行精修。使用PHENIX对IFNα4A/FabM88结构进行精修，并使用COOT进行模型调整。所有其他晶体计算均使用CCP4套件程序执行。使用程序RBOW计算可变域和恒定域之间的肘角。使用PyMol生成所有分子图形。表10中给出了结构精修统计。

表10.晶体数据和精修统计。

^a括号中为高分辨率层的值。

^b完整度低是因为最高分辨率层仅包含检测器拐角处的反射。

结果

整体结构

图6中示出了IFNα4A/FabM88复合物的整体分子结构。在不对称单元中存在这些复合物中的两种。两个独立IFNα4A分子的分子模型中一个包含第7-102位和第113-160位残基，另一个包含第12-102位和第113-160位残基。两个分子中第103位和第112位残基之间的连接环都是无序的。两个Fab分子的轻链包含从第1位至第212位的残基，重链包含从第1位至第221位的残基。C-端6xHis标签和链间二硫键是无序的。

两个IFNα4A分子具有基本相同的构象，122Cα原子的平均rmsd为

两个Fab分子还具有相同的结构，整个Fab的平均rmsd小于

有趣的是，根据RBOW显示，两个Fab具有几乎相同的肘角(172度和174度)。

IFNα结构

IFNα4A的分子结构(图7A)与IFNα2非常相似，平均Cαrmsd为0.5至

与IFNω(图7B，112个残基的Cαrmsd为

)和IFNβ(图7C，94个残基的Cαrmsd为

)也十分相似。由于IFNβAB环中的一个较短残基，IFNα/ω和IFNβ之间存在一些显著差异(图7D)。

表位、互补位及Ab/Ag相互作用

M88识别了由AB环(A19和D35之间)残基和螺旋E的残基V143、A146、E147和R150构成的构象表位(表11)。互补位由所有六个CDR的残基构成。互补位残基主要为疏水性的，形成一系列袋，与短AB螺旋的残基F27、L30、K31和R33的侧链对接。抗体和抗原的相互作用显示多为范德华力和疏水性堆积。抗体和抗原之间只存在少数氢键，并且其中大部分涉及主链-主链或侧链-主链相互作用。多数Ab/Ag相互作用是由AB螺旋的若干残基F27、L30、K31和R33造成的。因此，IFNα4A这一区域是构成表位的主要部分。VL的F50与结构中的抗原未直接接触。但是其侧链在Y32(VL)和P105(VH)附近，参与结合。可能是由于其支持CDR-H3局部结构进行有利结合，而选择这一残基。

表11.抗体M88的表位和互补位。

结合配偶体中所有

以内的残基考虑为接触残基。对抗体VL和VH残基按顺序编号。LHI和ABJ代表两种复合物。

基于结构的文库设计，以改善交叉反应性和亲和力

M88强力结合数种IFNα亚型，但与IFNω结合较弱。基于当前复合物结构以及使用IFNω结构进行的分子建模，有两种可能的策略。一种策略是通过建立另外的Ab/Ag相互作用并同时保持IFNα4A/M88结构中的所有当前接触，延伸CDR-L1(extL1文库)。结构和序列对比表明，在所有IFNα亚型中，有5个残基表面块(D32、H34、D35、Y130和K134)是100％保守的(表12)。

表12.

在IFNω中，除代替H34的R34外，这5个残基中的四个也是保守的。CDR-L1与这一高度保守的表面块距离较远。因此假设，较长的CDR-L1，例如在3-1-1典型结构中含有另外6个残基的种系IGKV4-1(B3)，将足够长以接触此块。较长的CDR-L1将提供与所有IFNα亚型和IFNω的另外的相互作用，从而改善亲和力并扩大特异性。延伸的CDR-L1的序列可通过噬菌体展示文库进行优化。表13示出了噬菌体展示文库的设计。背向抗原的extL1位置不是随机化的。VL的位置F50是唯一一个非人种系残基。其在结构上看来是为CDR-L3提供支持。因此，这一位置也是随机化的，以优化其对延伸的CDR-L1的支持。

表13.

	序列	SEQIDNO:
			M88	SQSISSYL	38
M32	SQSVLYSSNNKNYL	39
			extL1	SQSVLXSXXNXNYL	40

X为任何氨基酸

抗体中和的模式

最近报道了具有IFNΑR1和/或IFNΑR2的复合物中IFNα/ω的晶体结构(Thomas等人，Cell 146:621-632,2011)。图8示出了M88/IFNα4在IFNω/IFNΑR1/IFNΑ2复合物上的重叠。很明显HC和IFNΑR2也将重叠。因此，M88通过阻断IFNΑR2/IFN相互作用进行中和。

实例8IFNα和IFNω上的最小表位提供广泛的IFNα/IFNω中和活性

IFNωT80E/FabM43、IFNα4A/FabM88、IFNα4A/Fab357(c2595)和IFNω/Fab357的晶体结构限定了广泛中和IFNω和多个IFNα亚型所需的最小共同表位(表14)。对四种晶体结构中抗体/抗原相互作用的分析表明，IFNα4a(SEQ ID NO:19)和IFNω(SEQ ID NO:1)中AB环的三个残基F27、L30和R33与抗体形成广泛接触。这些残基可能为抗体结合提供主要贡献。因此，F27、L30和R33是IFNω/IFNα交叉中和表位的关键元素。

构象表位由具有短螺旋片段(27-29)的AB环残基(SEQ ID NO:1的IFNω及SEQ IDNO:19的IFNα4a中的第22-34位残基)和螺旋E中的残基(第134-154位是螺旋E与IFNω和除IFNα2(其为第133-153位)外的所有IFNα亚型相同的残基)构成。具体地，SEQ ID NO:1的IFNω中位置P26、F27、L30、K31、R33和H34，与SEQ ID NO:19的IFNα4a中残基H26、F27、L30、K31、R33和H34被中和抗体所识别。这些残基在不同IFNα亚型和IFNω之间是高度保守的，因此造成这些抗体的交叉反应性和差分特异性，尽管它们来自不同来源。另外的表位残基为IFNω的R22、R23、I24、S25、D32、D35、M149、K150或L154和IFNα4a的残基A19、G22、R23、I24、S25、H26、F27、C29、L30、K31、D32、R33、H34、D35、V143、A146、E147、M149、R150或S153。

表14.

Claims

1.一种分离的单克隆抗体，其结合至(a)人干扰素ω (IFNω)和(b)至少四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种人干扰素α (IFNα)亚型并且中和其活性，其中所述抗体竞争结合到所述人IFNω和人IFNα亚型IFNαB2、IFNαF、IFNαG和/或IFNαJ1，其中抗体包含：

a) SEQ ID NO: 23的重链可变区(VH)氨基酸序列和SEQ ID NO: 24的轻链可变区(VL)氨基酸序列；或

b) SEQ ID NO: 27的VH氨基酸序列和SEQ ID NO: 28的VL氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体结合至人IFNα亚型IFNαB2、IFNαF、IFNαG和IFNαJ1并且中和其活性。

3.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体结合至人IFNα亚型IFNαB2、IFNαC、IFNαF、IFNαG和IFNαJ1并且中和其活性。

4.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体结合至人IFNα亚型IFNαB2、IFNαC、IFNαF、IFNαG、IFNαJ1和IFNαA并且中和其活性。

5.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体结合至人IFNα亚型IFNαB2、IFNαC、IFNαF、IFNαG、IFNαJ1、IFNαA和IFNαH2并且中和其活性。

6.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体结合至人IFNα亚型IFNαB2、IFNαC、IFNαF、IFNαG、IFNαJ1、IFNαA、IFNαH2和IFNαK并且中和其活性。

7.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体结合至人IFNα亚型IFNαB2、IFNαC、IFNαF、IFNαG、IFNαJ1、IFNαA、IFNαH2、IFNαK和IFNαWA并且中和其活性。

8.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体结合至人IFNα亚型IFNαB2、IFNαC、IFNαF、IFNαG、IFNαJ1、IFNαA、IFNαH2、IFNαK、IFNαWA和IFNα4a并且中和其活性。

9.根据权利要求1所述的抗体，其中所述人IFNω和所述人IFNα亚型的所述活性是在稳定表达信号传导子和转录激活子2 (STAT2)、干扰素调节因子9 (IRF9)和SEAP的HEK293细胞中，在所述干扰素诱导型ISG54启动子作用下抑制分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)表达。

10.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体在SEQ ID NO: 1的残基F27、L30和R33中的一个或多个处结合IFNω。

11.根据权利要求10所述的抗体，其中所述抗体在SEQ ID NO: 1的残基F27、L30和R33处结合IFNω。

12.根据权利要求10所述的抗体，其中所述抗体进一步结合选自由SEQ ID NO: 1的残基P26、K31和R34组成的组中的至少一个IFNω残基。

13.根据权利要求10所述的抗体，其中所述抗体进一步结合选自由SEQ ID NO: 1的残基R22、R23、I24、S25、P26、K31、D32、R34、D35、Q40、K134、M146、E147、M149、K150、F153和L154组成的组中的至少一个IFNω残基。

14.根据权利要求10所述的抗体，其中所述抗体在SEQ ID NO: 19的残基F27、L30和R33中的一个或多个处结合IFNα4a。

15.根据权利要求14所述的抗体，其中所述抗体在SEQ ID NO: 19的残基F27、L30和R33处结合IFNα4a。

16.根据权利要求14所述的抗体，其中所述抗体进一步结合选自由SEQ ID NO: 19的残基H26、K31和R34组成的组中的至少一个IFNα4a残基。

17.根据权利要求13所述的抗体，其中所述抗体进一步结合选自由SEQ ID NO: 19的A19、G22、R23、I24、S25、H26、C29、K31、D32、H34、D35、V143、A146、E147、M149、R150和S153组成的组中的至少一个IFNα4a残基。

18.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体抑制病毒诱导的白细胞干扰素的活性。

19.根据权利要求18所述的抗体，其中所述病毒诱导的白细胞干扰素的活性是由100U/ml干扰素诱导的IP-10在全血中的释放。

20.根据权利要求19所述的抗体，其中在50µg/ml抗体存在下，所述活性被抑制超过50%。

21.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体抑制系统性红斑狼疮(SLE)免疫复合物诱导的IFN的活性。

22.根据权利要求21所述的抗体，其中所述活性被抑制超过50%。

23.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体不结合或中和人干扰素-β(IFNβ)。

24.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体不结合或中和人IFNαD。

25.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体为人、人源化或人适应性的。

26.根据权利要求25所述的抗体，其中所述抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。

27.根据权利要求25所述的抗体，其中所述抗体为双特异性的。

28.根据权利要求27所述的抗体，其中所述抗体结合BLyS、CD40L、IL-6、CD27、BDCA2、或者IL-12或IL-23的p40亚基。

29.一种药物组合物，其包含根据权利要求1所述的抗体以及药学上可接受的载体。

30.治疗有效量的根据权利要求1所述的分离的抗体在制备治疗或预防对其有需求的患者中与IFNα和IFNω生成增加相关联的疾病的药物中的用途。

31.根据权利要求30所述的用途，其中所述疾病为免疫介导的炎性疾病。

32.根据权利要求31所述的用途，其中所述免疫介导的炎性疾病为系统性红斑狼疮(SLE)、I型糖尿病、牛皮癣、原发性干燥病、系统性硬化病或类风湿性关节炎。

33.根据权利要求30所述的用途，其中所述患者表现出I型干扰素特征。

34.根据权利要求30所述的用途，其中根据权利要求1所述的抗体为双特异性抗体。

35.根据权利要求34所述的用途，其中所述双特异性抗体结合BLyS、CD40L、IL-6、CD27、BDCA2、或者IL-12或IL-23的p40亚基。

36.根据权利要求1所述的分离的抗体在制备在对其有需求的患者体内抑制IFNω和IFNα亚型IFNαB2、IFNαC、IFNαF、IFNαG和/或IFNαJ1与IFNAR的相互作用的药物中的用途。

37.根据权利要求36所述的用途，其中所述患者患有免疫介导的炎性疾病。

38.根据权利要求37所述的用途，其中所述免疫介导的炎性疾病为SLE、I型糖尿病、牛皮癣、原发性干燥病、系统性硬化病或类风湿性关节炎。

39.根据权利要求36所述的用途，其中所述患者表现出I型干扰素特征。

40.根据权利要求36所述的用途，其中所述抗体为双特异性抗体。

41.根据权利要求40所述的用途，其中所述双特异性抗体结合BLyS、CD40L、IL-6、CD27、BDCA2、IL-12或IL-23的p40亚基、或BDCA2。