KR20150128849A - 인터페론 알파 및 오메가 항체 길항제 - Google Patents

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루 루
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Abstract

광범위 중화 인터페론-α 및 인터페론-ω 항체 길항제, 항체 또는 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 전술한 것들의 제조 및 사용 방법은 IFNα 및 IFNω의 증가된 생성과 연계된 질환의 치료에 유용하다. 유형 I IFN은 보편적으로 발현되는 이종이량체성 수용체(IFNAR)를 통해 모든 신호가 항바이러스, 항증식, 및 면역조절 효과를 유발하는 사이토카인의 계열이다.

Description

인터페론 알파 및 오메가 항체 길항제 {INTERFERON ALPHA AND OMEGA ANTIBODY ANTAGONISTS}
본 발명은 광범위 중화 인터페론-α 및 인터페론-ω 항체 길항제, 항체 또는 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 전술한 것들의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.
유형 I IFN은 보편적으로 발현되는 이종이량체성 수용체(IFNAR)를 통해 모든 신호가 항바이러스, 항증식, 및 면역조절 효과를 유발하는 사이토카인의 계열이다. 인간에서, 유형 I IFN은 12개 이상의 IFNα 단백질 하위유형 및 IFNβ, IFNε, IFNκ, 및 IFNω에 대한 각각 1개의 하위유형으로 구성된다. 유형 I IFN의 유도는 무균성 및 세균성 리간드 양자 모두에 반응하여 일어난다. 감염성 질환 및 종양학적 적응증에 대한 클리닉에서 유형 I IFN의 항바이러스 및 항-증식 효과가 활용되어 왔으나, 면역-매개 염증성 적응증을 위해 유형 I IFN의 길항제가 개발되고 있다.
다중 면역-매개 염증성 질환, 예를 들어 SLE, 유형 I 당뇨병, 건선, 원발성 쇼그렌 증후군(
Figure pct00001
), 전신 경화증, 및 류머티스 관절염은, 전혈 및/또는 조직 내에 존재하는 통상적으로 IFN-시그니처(signature)라고 불리는 IFN-유도성 유전자 전사체의 과잉에 의해 결정되는 바와 같이, 다양한 정도로 상승된 유형 IFN의 증거를 나타낸다.
현재 루푸스를 위해 임상 개발 중인 유형 I IFN 길항제 접근법은, 미국 특허 제7,087,726호, 미국 특허 제8,025,882호, 및 미국 특허 출원 공개 제US2008/0160030호에 기재된 것들과 같은 항-IFNα 항체를 사용하여 IFNα 하위유형을 중화하고 다른 유형 I IFN(β, ε, κ, ω)은 중화하지 않는 다중 접근법을 포함한다. 제5,932,448호; 미국 특허 No. 8,025,882 and U.S. Pat. Appl. 공개 US2008/01047호에 기재된 계통적 이중 조합 접근법을 사용하여, 파지 디스플레이 스크리닝 방법에 의해 달성할 수 있다. 임상 시험 데이터는, 항-IFNα 항체로 치료한 환자에서 유형 I IFN 시그니처의 부분적 감소(Merrill et al., Ann Rheum Dis 70:1905-1913, 2011; Yao et al., Arthritis Rheum 60:1785-1796, 2009), 및 측정 인터페론 시그니처(ISM: Interferon Signature Metric)-낮은 중간 내지 중증 활성 루푸스 대상의 사전-특정된 생체표지자로 정의된 군에서 제24주에 SLE의 징후 및 증상, 플레어 속도(flare rate), 및 스테로이드 부담(steroid burden)의 개선을 시사한다. ISM-높음으로 사전-정의된 환자에서는 효능이 나타나지 않았다(Kalunian et al., 2012 ACR/ARHP Annual Meeting; Abstract # 2622, 2012).
항-IFNAR1 항체는 루푸스를 치료하기 위한 대안이다(Wang et al., 2013; Clinical Pharmacology & Therapeutics accepted article preview 14 February 2013; doi: 10.1038/clpt.2013.35). IFNAR1 차단은 IFNβ를 포함하는 모든 유형 I IFN에 의해 유도되는 IFN 신호를 소멸시킬 것으로 예측될 것이다. IFNβ를 암호화하는 유전자의 특이적 결실은 작용성 IFNβ를 갖는 유사하게 노출된 마우스에 비교할 때 바이러스의 숙주에 실질적인 감수성을 초래하므로, IFNβ는 항바이러스 방어에서 더 결정적인 역할을 할 수 있다(Lazear et al., J Virol 85:7186-7194, 2011; Deonarain et al., J Virol 74: 3404-340, 2000; Deonarain et al., Circulation 110: 3540-3543, 2004; Gerlach, et al., J Virol 80: 3438-3444, 2006]에서 검토).
그러므로, 루푸스 및 다른 면역-매개 염증성 질환의 치료를 위한 부가적 항체에 대한 필요성이 존재한다.
본 발명의 일 태양은 인간 인터페론 오메가(IFNω) 및 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 인간 인터페론 알파(IFNα) 하위유형에 결합하고 그의 활성을 중화하는 단리된 단클론 항체이다.
본 발명의 다른 태양에서 단리된 항체는, 인간 IFNω 및 인간 IFNα 하위유형 IFNαB2, IFNαF, IFNαG, 및/또는 IFNαJ1에 대한 결합에 대해,
서열 번호 23의 중쇄 가변 영역(VH) 아미노산 서열 및 서열 번호 24의 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열; 또는
서열 번호 27의 VH 아미노산 서열 및 서열 번호 28의 VL 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체와 경쟁한다.
본 발명의 추가의 태양에서, 단리된 항체는 서열 번호 1의 하나 이상의 잔기 F27, L30, 및 R33에서 IFNω에 결합하고; 단리된 항체는 서열 번호 19의 하나 이상의 잔기 F27, L30, 및 R33에서 IFNα4a에 결합하며; 단리된 항체는 전신 홍반 루푸스(SLE) 면역 복합체-유도 IFN의 활성을 저해한다.
본 발명의 부가적 태양은, 본 발명의 항체를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드; 및 본 발명의 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다.
본 발명의 추가의 태양은, 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 시간 동안 본 발명의 단리된 항체의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, IFNα 및 IFNω의 증가된 생성과 연계된 질환의 치료 또는 예방 방법이다. 본 발명의 부가적 태양에서, IFNα 및 IFNω의 증가된 생성과 연계된 질환은 전신 홍반 루푸스(SLE)이다.
본 발명의 다른 태양은, IFNω 및 IFNα 하위유형 IFNαB2, IFNαC, IFNαF, IFNαG, 및/또는 IFNαJ1과 IFNAR의 상호작용을 방지하기에 충분한 시간 동안 본 발명의 단리된 항체를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에서 IFNω 및 IFNα 하위유형 IFNαB2, IFNαF, IFNαG, 및/또는 IFNαJ1과 IFNAR의 상호작용을 저해하는 방법이다.
도 1은, 특정된 농도에서 도 1a) 100 U/ml 내인성 백혈구 IFN(바이러스 유도) 또는 도 1b) 250 U/ml 재조합 인간 IFNω 에 의해 유도된 전혈에서의 IP-10 방출의 저해를 나타낸다.
도 2는, 표시된 바와 같이 다양한 항체에 의한 전신 홍반 루푸스(SLE: systemic lupus erythematosus) 환자-유래의 면역 복합체에 의해 유도된 유형 I IFN의 저해를 나타낸다. 항-IFNα1 및 항-IFNω, 항-IFNα2 및 항-IFNω, 또는 항-IFNα3 및 항-IFNω의 조합은 항-IFNα 항체 단독에 비교할 때 더 확연한 저해를 제공한다. 광범위 중화 항-IFNα/IFNω 항체(M43)는 총 활성의 추가의 억제를 입증했다.
도 3은, 항-IFNω, 항-IFNα 항체, 또는 2가지의 조합을 이용한, 상승된 SLE 유전자 시그니처의 퍼센트(%) 저해를 나타낸다. 항체 치료의 부재 하의 기준선 상승된 IFN-유도성 유전자 발현을 100%로 정규화한다.
도 4는, IFNω/FabM43 복합체의 전체적 분자 구조를 나타낸다. 표지된 H는 VH이고; 표지된 L은 VL이며, 좌상단은 IFNω이다.
도 5는, 도 5a) IFNα4A/Fab357 및 도 5b) IFNω/Fab357 복합체의 전체적 분자 구조를 나타낸다. Fab에 대해서는 Fv 부분만 나타낸다. Fab537은 C2595의 Fab이다.
도 6 a)는 IFNα4A/FabM88 복합체의 전체적 분자 구조를 나타낸다. 도 6b)는 항원 결합 부위 내의 에피토프 영역의 부분 주위의 대표적인 전자 밀도(1.5σ에서 2mFo-DFc)이다. 표지된 H는 VH이고; 표지된 L은 VL이며; 좌상단은 IFNα4A이다.
도 7은, IFNα4A 구조 및 IFNω 및 IFNα와의 비교를 나타낸다. 도 7a)는 IFNα4A이다. 5개의 주요 나선이 표지되어 있다. 짧은 나선형 세그먼트 다음에 긴 연결 루프 AB 또한 표지되어 있다. 도 7b)는 IFNω(pdb 코드 3se4)이고, 도 7c)는 IFNβ(pdb id 1au1)이다. 도 7d)는 IFNβ와의 구조적 비교이다. AB 나선형 세그먼트 주위의 주요 차이는 타원으로 표시되어 있다.
도 8은, M88에 의한 중화의 방식이다. IFNω/IFNΑR1/IFNΑR2 구조(pdb id 3se4) 및 M88/IFNα4가 IFN 상에 오버레이(overlay)되어 있다.
본 명세서에 인용된, 특허 및 특허 출원을 포함하지만 이에 한정되지 않는 모든 간행물은 마치 완전히 기재되는 것처럼 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 단지 특정 실시 형태들을 설명하기 위한 것이며, 한정하는 것으로 의도되지 않음을 이해해야 한다. 달리 정의되지 않으면, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 숙련자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 또는 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 시험 실시에 사용될 수 있지만, 예시적인 방법 및 재료가 본 명세서에 기재되어 있다. 본 발명을 개시하고 청구함에 있어서, 하기 용어가 사용될 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하다" 또는 "결합하다"는, 다른 항원에 대한 것보다 더 큰 친화도를 가진, 소정의 항원에 대한 항체 결합을 지칭한다. 전형적으로 항체는, 1x10-7 M 이하, 예를 들어 1x10-8 M 이하, 1x10-9 M 이하, 1x10-10 M 이하, 1x10-11 M 이하, 또는 1x10-12 M 이하의 해리 상수(KD)로, 전형적으로 비-특이적 항원 또는 에피토프(예를 들어, BSA, 카제인)에 대한 결합에 대한 그의 KD보다 10배 이상 더 작은 KD로, 소정의 항원에 결합한다. 해리 상수는 표준 절차를 사용하여 측정할 수 있다. 그러나 소정의 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 다른 관련 항원, 예를 들어, 인간 또는 원숭이, 예를 들어 마카카 파시쿨라리스 ( Macaca fascicularis )(시노몰구스(cynomolgus), 시아노(cyno)) 또는 판 트로글로디테스 (Pan troglodytes)(침팬지, 침프(chimp))와 같은 다른 종으로부터의 동일한 소정의 항원(동족체)에 대한 교차-반응성을 가질 수 있다. 소정의 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 인터페론 알파(IFNα) 및 인터페론 오메가(IFNω)와 같은 2가지 이상의 별개의 항원 사이에 공유되는 에피토프에 추가로 결합할 수 있다(즉, 항체가 IFNα 및 IFNω와 교차-반응함).
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "중화" 또는 "중화하다" 또는 "중화 항체" 또는 "항체 길항제"는, 인터페론 알파(IFNα) 및/또는 인터페론 오메가(IFNω) 생물학적 활성을 임의의 기전에 의해 부분적으로 또는 완전히 저해하는 항체 또는 항체 단편을 지칭한다. 하기 기재된 바와 같이 IFNα 및/또는 IFNω 생물학적 활성에 대한 어세이를 사용하여 중화 항체를 동정할 수 있다. IFNα 및/또는 IFNω 중화 항체는 측정된 IFNα 및 IFNω 생물학적 활성을 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 만큼 저해할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "인터페론-α"(IFNα)는 인간 알파 인터페론의 모든 천연 하위유형을 지칭한다. 천연 IFNα는, 고도의 구조적 상동성을 가진 별개의 유전자에 의해 암호화되는 23개 초과의 밀접하게 관련된 단백질 하위유형으로 구성된다(Weissmann and Weber, Prog. Nucl. Acid. Res. Mol. Biol., 33: 251, 1986; Roberts et al., J. Interferon Cytokine Res. 18: 805-816, 1998]에서 검토). 인간 IFNα 하위유형은 적어도 IFNαA(IFNα2)(서열 번호 5), IFNαB2(IFNα8)(서열 번호 6), IFNαC(IFNα10)(서열 번호 7), IFNαD(IFNα1)(서열 번호 8), IFNαF(IFNα21)(서열 번호 9), IFNαG(IFNα5)(서열 번호 10), 및 IFNαH(IFNα14)(서열 번호 11), P34H 치환을 가진 IFNαI(IFNα17)(서열 번호 12), IFNαJ1(IFNα7)(서열 번호 14), IFNαK(IFNα6)(서열 번호 14), IFNα4b(IFNα4)(서열 번호 15), 및 IFNαWA(IFNα6)(서열 번호 16). 인간 인터페론에 대한 명명법은 하기에서 확인된다: http://www_genenames_org/genefamilies/_IFN.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 IFNω는 서열 번호 1 및 유니프롯(UniProt) 등록 번호 P05000에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 인간 IFNω를 지칭한다.
용어 "유형 I 인터페론"은 인간 인터페론-α의 모든 천연 하위유형 및 인터페론-β, 인터페론-ε, 인터페론-ω, 및 인터페론-κ의 하나의 하위유형을 지칭하며, 이는 공통 인터페론 수용체 IFNAR에 결합한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "IFNAR"은 이종이량체 또는 IFNAR1 및 IFNAR2인 주지의 인터페론 수용체를 지칭한다. IFNAR1 및 IFNAR2 단백질 서열은 각각 서열 번호 31 및 32에 나타낸다. IFNAR1 성숙 세포외 도메인은 서열 번호 31의 잔기 28 내지 436에 걸쳐 이어지며 IFNAR2 성숙 세포외 도메인은 서열 번호 32의 잔기 27 내지 243에 걸쳐 이어진다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 넓은 의미를 의미하며, 다클론 항체, 뮤린, 인간, 인간-적응화(human-adapted), 인간화, 및 키메라 단클론 항체를 포함하는 단클론 항체, 항체 단편, 2개 이상의 온전한 항체 또는 항체 단편으로부터 형성된 이중특이적 또는 다중특이적 항체, 이량체성, 사량체성, 또는 다량체성 항체, 및 단일쇄 항체를 포함하는 면역글로불린 분자를 포함한다.
면역글로불린은 중쇄 불변 도메인 아미노산 서열에 따라, 5개의 주요 분류, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 정해질 수 있다. IgA 및 IgG는 동형 IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로 추가로 하위-분류된다. 임의의 척추동물 종의 항체 경쇄는 그들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 명확하게 별개의 2개의 유형, 즉 카파(κ) 및 람다(λ) 중 하나로 정해질 수 있다.
용어 "항체 단편"은 중쇄 및/또는 경쇄 항원 결합 부위를 보유하는 면역글로불린 분자의 부분, 예를 들어 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 2, 및 3, 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 2, 및 3, 중쇄 가변 영역(VH), 또는 경쇄 가변 영역(VL)을 지칭한다. 항체 단편은 주지의 Fab, F(ab')2, Fd, 및 Fv 단편과 더불어 하나의 VH 도메인으로 구성된 도메인 항체(dAb)를 포함한다. VH 및 VL 도메인은 합성 링커를 통해 함께 연결되어 다양한 유형의 단일쇄 항체 설계를 형성할 수 있으며, 여기서 VH/VL 도메인은 VH 및 VL 도메인이 별도의 단일쇄 항체 작제물에 의해 발현되는 경우에 분자내, 또는 분자간에 쌍을 이루어 1가 항원 결합 부위, 예를 들어 단일쇄 Fv(scFv) 또는 이중항체(diabody)를 형성하며, 이는, 예를 들어 국제 특허 공개 제WO1998/44001호, 국제 특허 공개 제WO1988/01649호; 국제 특허 공개 제WO1994/13804호; 국제 특허 공개 WO1992/01047호에 기재된 계통적 이중 조합 접근법을 사용하여, 파지 디스플레이 스크리닝 방법에 의해 달성할 수 있다.
항체 가변 영역은 3개의 "항원 결합 부위"가 개재된 "프레임워크(framework)" 영역으로 구성된다. 항원 결합 부위는 하기의 다양한 용어를 사용하여 정의한다: (i) 상보성 결정 영역(CDR)(VH 내의 3개(HCDR1, HCDR2, HCDR3), 및 VL 내의 3개(LCDR1, LCDR2, LCDR3))은 서열 가변성에 기초한다(Wu and Kabat, J Exp Med 132:211-50, 1970; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991]). (ii) "초가변 영역", "HVR", 또는 "HV"(VH 내의 3개(H1, H2, H3) 및 VL 내의 3개(L1, L2, L3))는, 초티아(Chothia) 및 레스크(Lesk)에 의해 정의된 바와 같이 구조 내에서 초가변성인 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다(Chothia and Lesk, Mol Biol 196:901-17, 1987). 다른 용어는 "IMGT-CDR"(Lefranc et al., Dev Comparat Immunol 27:55-77, 2003) 및 "특이성 결정 잔기 용법"(SDRU: Specificity Determining Residue Usage)(Almagro, Mol Recognit 17:132-43, 2004)을 포함한다. 인터내셔널 이뮤노진틱스(International ImMunoGeneTics, IMGT) 데이터베이스(http://www_imgt_org)는 항원-결합 부위의 표준화된 넘버링과 정의를 제공한다. CDR, HV, 및 IMGT 도해 사이의 관련성은 문헌[Lefranc et al., Dev Comparat Immunol 27:55-77, 2003]에 기재되어 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "초티아 잔기"는 알-라지카니(Al-Lazikani)에 따라 번호화된 항체 VL 및 VH 잔기이다(Al-Lazikani et al., J Mol Biol 273:927-48, 1997).
"프레임워크" 또는 "프레임워크 서열"은 항원 결합 부위인 것으로 정의된 것들 이외의 가변 영역의 나머지 서열이다. 상기 기재된 바와 같은 다양한 용어에 의해 항원 결합 부위가 정의될 수 있으므로, 프레임워크의 정확한 아미노산 서열은 항원-결합 부위가 어떻게 정의되었는지에 따라 달라진다.
"인간 항체" 또는 "완전 인간 항체"는 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역 및 불변 영역 서열을 함유하는 항체를 지칭한다. 본 발명의 인간 항체는 치환을 포함할 수 있으므로, 그들은 발현된 인간 면역글로불린 또는 생식세포계열 유전자 서열의 정확한 카피가 아닐 수 있다. 그러나, 항원 결합 부위가 비-인간 종으로부터 유래되는 항체는 "인간 항체"의 정의에 포함되지 않는다.
"인간-적응화" 항체 또는 "인간 프레임워크 적응화(HFA)" 항체는 미국 특허 공개 제US2009/0118127호에 기재된 방법에 따라 적응화된 항체를 지칭하며, 또한 비-인간 종으로부터 유래된 항원-결합 부위 서열이 인간 프레임워크 상에 이식된 항체를 지칭한다.
"인간화 항체"는 항원 결합 부위가 비-인간 종으로부터 유래되고 가변 영역 프레임워크가 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 항체를 지칭한다. 인간화 항체는 프레임워크 영역 내에 치환을 포함할 수 있으므로, 프레임워크는 발현된 인간 면역글로불린 또는 생식세포계열 유전자 서열의 정확한 카피가 아닐 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "단일클론 항체"는 단일 분자 조성의 항체 분자의 제조를 지칭한다. 모노클로널 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타낸다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "실질적으로 동일한"은 비교하는 2개의 항체 가변 영역 아미노산 서열이 동일하거나 "미미한(insubstantial) 차이"를 갖는 것을 의미한다. 미미한 차이는, 항체 특성에 불리한 영향을 주지 않는, 항체 또는 항체 가변 영역 서열 내의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개 아미노산의 치환이다 본 명세서에 개시된 가변 영역 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열은 본 출원의 범주 내에 있다. 일부 실시형태에서, 서열 동일성은 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상일 수 있다. 예를 들어 벡터(Vector) NTI v.9.0.0의 얼라인X(AlignX) 모듈(캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로젠(Invitrogen))의 기본 설정을 사용하는 쌍 정렬(pairwise alignment)에 의해 퍼센트 동일성을 결정할 수 있다. 본 발명의 단백질 서열을 질의 서열(query sequence)로 사용하여, 예를 들어 관련 서열을 확인하기 위해 공개 데이터베이스 또는 특허 데이터베이스에 대한 검색을 수행할 수 있다. 이러한 검색을 수행하기 위해 사용되는 예시적인 프로그램은, 기본 설정을 사용하는 XBLAST 또는 BLASTP 프로그램(http_//www_ncbi_nlm/nih_gov), 또는 게놈퀘스트(GenomeQuest)(상표)(메사추세츠주 웨스트보로 소재의 게놈퀘스트) 스위트이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "에피토프"는 항체가 특이적으로 결합하는 항원의 부분을 의미한다. 에피토프는 통상 아미노산 또는 다당류 측쇄와 같은 모이어티(moiety)의 화학적으로 활성(이를 테면, 극성, 비극성 또는 소수성)인 표면 그룹화(grouping)로 이루어지며, 특이적인 3차원 구조 특징뿐만 아니라 특이적인 전하 특징을 가질 수 있다. 에피토프는 입체구조 공간 단위(conformational spatial unit)를 형성하는 연속 및/또는 불연속 아미노산으로 구성될 수 있다. 불연속 에피토프의 경우, 항원의 선형 서열의 상이한 부분으로부터의 아미노산이 단백질 분자의 접힘을 통해 3차원 공간에서 아주 근접하게 된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "파라토프"는 항원이 특이적으로 결합하는 항체의 부분을 의미한다. 파라토프는 천연에서 선형이거나, 선형의 일련의 아미노산보다는 항체의 비-연속 아미노산 사이의 공간 관계에 의해 형성되어 불연속일 수 있다. "경쇄 파라토프" 및 "중쇄 파라토프" 또는 "경쇄 파라토프 아미노산 잔기" 및 "중쇄 파라토프 아미노산 잔기"는 각각 항체와 접촉하고 있는 항체 경쇄 및 중쇄 잔기를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "이중특이적"은 2가지 별개의 항원 또는 항원 내의 2가지 별개의 에피토프에 결합하는 항체를 지칭한다. 이중특이적 항체가 IFNα 및 IFNω와 교차-반응하는 경우에는, 이중특이적 항체가 2가지 이상의 별개의 항원에 결합할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "단일특이적"은 하나의 항원 또는 하나의 에피토프에 결합하는 항체를 지칭한다. 단일특이적 항체가 IFNα 및 IFNω와 교차-반응하는 경우에는 단일특이적 항체가 2가지 이상의 별개의 항원에 결합할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "병용하여"는 기재된 약제가 혼합물 중에 함께, 단일 약제로서 동시에, 또는 단일 약제로서 임의의 순서로 순차적으로, 동물에게 투여될 수 있음을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "IFNα 생물학적 활성" 및 "IFNω 생물학적 활성"은, 각각 IFNα 및 IFNω이 그의 수용체 IFNAR에 결합한 결과로서 발생하는 임의의 활성을 지칭한다. 하나의 IFNα 및 IFNω 생물학적 활성은, 신호 변환기 및 전사 활성제 2(STAT2), 인터페론 조절 인자 9(IRF9), 및 분비 배아 알칼라인 포스파타아제(SEAP: secreted embryonic alkaline phosphatase)를 안정적으로 발현시키는 HEK293 세포에서 ISG54와 같은 인터페론 유도성 프로모터 하에 표준 방법을 사용하여 IFNα 및 IFNω가 SEAP 발현을 유도하는 능력이다. 다른 IFNα 및 IFNω 생물학적 활성은, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 말초 혈액 단핵구(PBMC: peripheral blood mononuclear cell) 또는 전혈로부터의 케모카인 IP-10(CXCL10) 생성의 유도이다.
[표 1]
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용어 "벡터"는, 생물학적 시스템 내에서 복제될 수 있는 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 시스템들 사이에서 이동할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 전형적으로 벡터 폴리뉴클레오티드는 생물 시스템에서 이들 폴리뉴클레오티드의 복제 또는 유지를 돕는 기능을 하는 복제 기점, 폴리아데닐화 신호 또는 선발 마커와 같은 요소들을 포함한다. 그러한 생물 시스템의 예는 벡터를 복제할 수 있는 생물 구성요소들을 이용하는 세포 시스템, 바이러스 시스템, 동물 시스템, 식물 시스템 및 재구성된 생물 시스템을 포함할 수 있다. 벡터를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA 분자 또는 이들의 혼성체일 수 있다.
용어 "발현 벡터"는, 발현 벡터 내에 존재하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 번역을 유도하기 위하여 생물학적 시스템 또는 재구성된 생물학적 시스템에서 이용될 수 있는 벡터를 의미한다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 당-인산 골격 또는 기타 등가의 공유 결합적 화학적 특성에 의해 공유 결합된 뉴클레오티드의 쇄를 포함하는 분자를 의미한다. 이중 가닥 및 단일 가닥 DNA 및 RNA가 폴리뉴클레오티드의 전형적인 예이다.
용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은, 폴리펩티드를 형성하도록 펩티드 결합에 의해 연결된 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 분자를 의미한다. 50개 미만의 아미노산의 작은 폴리펩티드는 "펩티드"로 지칭될 수 있다.
표 1에 나타낸 바와 같이 통상적인 1-문자 및 3-문자 아미노산 코드를 본 명세서에 사용한다.
물질의 조성물
본 발명은 인간 인터페론 오메가(IFNω) 및 다중 인간 인터페론 알파(IFNα) 하위유형(IFNα/ω 항체)에 결합하고 그의 활성을 중화하는 단클론 항체를 제공한다. 본 발명은, 적어도 부분적으로, 본 발명의 IFNα/ω 항체가 결합하는, IFNω 및 다중 IFNα 하위유형에 의해 공유되는 최소 중화 에피토프의 동정에 기초한다. 본 발명의 IFNα/ω 항체는, 유형 I IFN 및 IFN 시그니처의 중화 SLE-관련 제제에서, IFNα 하위유형은 중화하지만 IFNω는 중화하지 않는 항체보다 더 강력하므로, 면역-매개 염증성 질환과 같이 IFNα 및 IFNω의 증가된 생성과 연계된 임의의 질환의 치료에 더 효과적일 수 있다. 본 발명의 IFNα/ω 항체는 IFNβ를 중화하지 않으므로, 모든 유형 I IFN을 차단할 것으로 예상되는 항-IFNAR 요법에 비교할 때, 그들은 더 유리한 안전성 및 PK 프로파일을 가질 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "IFNα/ω 항체"는, 본 명세서에 예시된 바와 같이 INFω 및 다중 IFNα 하위유형에 결합하고 그를 중화하는 항체를 지칭한다.
본 발명의 일 실시 형태는 인간 인터페론 오메가(IFNω) 및 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 인간 인터페론 알파(IFNα) 하위유형에 결합하고 그의 활성을 중화하는 단클론 항체이다.
본 발명의 항체는 IFNα 하위유형 IFNαB2, IFNαF, IFNαG, 및 IFNαJ1을 중화할 수 있다. 본 발명의 항체는 IFNα 하위유형 IFNαB2, IFNαC, IFNαF, IFNαG, 및 IFNαJ1을 중화할 수 있다. 본 발명의 항체는 IFNα 하위유형 IFNαB2, IFNαC, IFNαF, IFNαG, IFNαJ1, 및 IFNαA를 중화할 수 있다. 본 발명의 항체는 IFNα 하위유형 IFNαB2, IFNαC, IFNαF, IFNαG, IFNαJ1, IFNαA, 및 IFNαH2를 중화할 수 있다. 본 발명의 항체는 IFNα 하위유형 IFNαB2, IFNαC, IFNαF, IFNαG, IFNαJ1, IFNαA, IFNαH2, 및 IFNαK를 중화할 수 있다. 본 발명의 항체는 IFNα 하위유형 IFNαB2, IFNαC, IFNαF, IFNαG, IFNαJ1, IFNαA, IFNαH2, IFNαK, 및 IFNαWA를 중화할 수 있다. 본 발명의 항체는 IFNα 하위유형 IFNαB2, IFNαC, IFNαF, IFNαG, IFNαJ1, IFNαA IFNαH2, IFNαK, IFNαWA, 및 IFNα4a를 중화할 수 있다.
인터페론 반응성 프로모터 하에 리포터 유전자를 발현하는 세포주를 사용하고 다양한 IFNα 하위유형 및/또는 IFNω로 세포를 자극하는 리포터 유전자 어세이에서 본 발명의 항체를 IFNα 및 IFNω를 중화하는 그들의 능력에 대해 시험할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이 완전 활성 유형 I IFN 신호 경로를 발현하도록 조작되고(STAT2 및 IRF9를 안정적으로 발현함) IFNα/β 유도성 ISG54 프로모터의 제어 하에 SEAP 리포터 유전자로 형질감염된 HEK-블루(HEK-Blue)(상표) IFN-α/β 세포(캘리포니아주 산디에고 소재의 인비보젠(InvivoGen))를 사용할 수 있다. 주지의 시약을 사용하여 알칼라인 포스파타아제로부터의 신호를 검출할 수 있으며, 분광광도계 상에서 신호를 판독하고 표준 방법을 사용하여 저해에 대한 IC50을 계산할 수 있다.
일 실시 형태에서 본 발명의 항체는, 인간 IFNω 및 인간 IFNα 하위유형의 활성이 신호 변환기 및 전사 활성제 2(STAT2), 인터페론 조절 인자 9(IRF9), 및 분비 배아 알칼라인 포스파타아제(SEAP)를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포에서 인터페론 유도성 ISG54 프로모터 하에 SEAP 발현의 저해인 경우, 약 5x10-8 M 이하, 약 1x10-8 M 이하, 약 1x10-9 M 이하, 약 1x10-10 M 이하, 약 1x10-11 M 이하, 또는 약 1x10-12 M 이하의 IC50 값으로 인간 IFNω의 활성을 저해하고, 약 5x10-8 M 이하, 약 1x10-8 M 이하, 약 1x10-9 M 이하, 약 1x10-10 M 이하, 약 1x10-11 M 이하, 또는 약 1x10-12 M 이하의 IC50 값으로 인간 IFNα 하위유형 IFNαB2, IFNαF, IFNαG, 또는 IFNαJ1의 활성을 저해한다. 본 명세서에서 실시예 3에 기재된 바와 같은 어세이 "ISRE 리포터 유전자 어세이"에서 IC50 값이 약 5x10-8 이하, 예를 들어 약 1x10-8 M 이하, 약 1x10-9 M 이하, 약 1x10-10 M 이하, 약 1x10-11 M 이하, 또는 약 1x10-12 M 이하인 경우, 본 발명의 항체는 IFNω 및/또는 임의의 IFNα 하위유형을 "중화"한다.
본 발명의 항체는 또한, IFN-유도 말초 혈액 단핵구(PBMC) 또는 전혈로부터의 IP-10 방출과 같은 IFN-유도 사이토카인 방출을 저해하는 그들의 능력을 평가함으로써 그들의 IFNα 및 IFNω 중화 능력에 대해 시험할 수 있다. 예를 들어, 표준 프로토콜을 사용하여 건강한 지원자로부터의 헤파린 첨가 전혈로부터 PBMC를 단리하고, 시험하고자 하는 항체와 IFN의 사전형성된 복합체로 처리하고, 밀리플렉스(Milliplex) 사이토카인/케모카인 키트(밀리포어(Millipore), 프리믹스드 39 플렉스(Premixed 39 plex))와 같은 표준 방법을 사용하여 IP-10 방출을 측정한다. IFNα 및 IFNω를 중화하는 항체는, 항체의 부재 하의 IFN-유도 IP-10 방출에 비교할 때, IP-10 방출을 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 이상 만큼 저해할 수 있다.
본 발명의 항체는, IFNω의 중화에 부가하여, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 IFNα 하위유형에 결합하고 그를 중화할 수 있다. IFNα 하위유형 및 IFNω는 표준 방법을 사용하는 재조합 발현에 의해 생성될 수 있다. 분비를 유도하기 위해 사용할 수 있는 예시적인 신호 서열은 서열 번호 17 내지 21을 참조하라.
본 발명의 항체는 약 5x10-9 M 이하, 약 1x10-9 M 이하, 약 5x10-10 M 이하, 약 1x10-10 M 이하, 약 5x10-11 M 이하, 약 1x10-11 M 이하, 약 5x10-12 M 이하, 또는 약 1x10-12 M 이하의 해리 상수(KD)로 인간 IFNω에 결합하고, 약 5x10-9 M 이하, 약 1x10-9 M 이하, 약 5x10-10 M 이하, 약 1x10-10 M 이하, 약 5x10-11 M 이하, 약 1x10-11 M 이하, 약 5x10-12 M 이하, 또는 약 1x10-12 M 이하의 KD로 인간 IFNα 하위유형 IFNαB2, IFNαF, IFNαG, 또는 IFNαJ1에 결합한다.
IFNω 또는 IFNα 하위유형에 대한 항체의 친화도는 임의의 적합한 방법을 사용하여 실험적으로 결정할 수 있다. 이러한 방법은 당업자에게 공지된 프로테온(ProteOn) XPR36, 바이아코어(Biacore) 3000, 또는 KinExA 기기, ELISA, 또는 경쟁적 결합 어세이를 이용할 수 있다. 상이한 조건(예를 들어, 삼투성, pH) 하에 측정될 경우, 특정 항체/ IFNω 또는 IFNα 하위유형 상호작용의 측정된 친화도는 변동될 수 있다. 따라서, 바람직하게는, 표준화된 조건 및 본 명세서에 기재된 완충액과 같은 표준화된 완충액을 이용하여 친화도 및 다른 결합 파라미터(예를 들어, KD, Kon, Koff)의 측정을 실행한다. 예를 들어 바이아코어 3000 또는 프로테온을 사용하는 친화도 측정에 대한 내부 오차(표준편차, SD로서 측정됨)는, 전형적인 검출 한계 내에서의 측정에 대해 전형적으로 5 내지 33%일 수 있음을, 당업자는 인정할 것이다. 그러므로 용어 "약"은 어세이에서의 전형적인 표준편차를 반영한다. 예를 들어, 1x10-9 M의 KD에 대한 전형적인 SD는 최대 ±0.33x10-9 M이다.
원하는 친화도 및 중화 프로파일로 인간 IFNω 및 IFNα 하위유형에 결합하는 항체는, 인간 IFNω 및 IFNα 하위유형을 이용하는 패닝(panning) 및 임의로 추가의 항체 친화도 성숙에 의해 변이체 또는 단편의 라이브러리로부터 선택될 수 있다. 예시적인 패닝 캠페인에서는, 침팬지 IFNω, 및 인간 IFNα 하위유형 IFNα2, IFNα1, IFNαH2, IFNαG, 및 IFNαF의 혼합물을 사용하여, 또는 순차적으로 파아지 라이브러리를 패닝할 수 있다. 대안적으로, 침팬지 및 시노몰구스 IFNω, 인간 IFNα 하위유형 IFNαD, IFNαJ1, IFNαC, IFNαB2, IFNαH2, IFNαA, IFNα4a, IFNαG, IFNαF, IFNαWA, 및 IFNαI로 마우스를 면역화하고 표준 방법을 사용하여 하이브리오마를 스크리닝함으로써 본 발명의 항체를 제조할 수 있다.
본 명세서에 기재된 임의의 적합한 방법 및 방법들을 사용하여, 항체의 IFNω 및 IFNα 생물학적 활성 저해에 기초하여 항체를 동정할 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태는 인간 인터페론 오메가(IFNω) 및 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 인간 인터페론 알파(IFNα) 하위유형에 결합하고 그의 활성을 중화하는 단리된 단클론 항체이며, 여기서 항체는, 인간 IFNω 및 인간 IFNα 하위유형 IFNαB2, IFNαF, IFNαG, 또는 IFNαJ1에 대한 결합에 대해,
서열 번호 23의 중쇄 가변 영역(VH) 아미노산 서열 및 서열 번호 24의 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열; 또는
서열 번호 27의 VH 아미노산 서열 및 서열 번호 28의 VL 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체와 경쟁한다.
소정의 VH 및 VL 서열을 포함하는 본 발명의 항체와 인간 IFNω 및 인간 IFNα 하위유형 IFNαB2, IFNαF, IFNαG, 및/또는 IFNαJ1에 대한 특이적 결합 사이의 경쟁은, 주지의 방법을 사용하여 시험관내에서 어세이할 수 있다. 예를 들어, MSD 설포-태그(Sulfo-Tag)(상표) NHS-에스테르-표지 항체의 인간 IFNω 및 인간 IFNα 하위유형 IFNαB2, IFNαF, IFNαG, 또는 IFNαJ1에 대한 결합을 표지되지 않은 항체의 존재 하에 ELISA에 의해 평가할 수 있거나, 바이오아코어(Bioacore) 분석 또는 유세포 분석을 사용하여 본 발명의 항체와의 경쟁을 입증할 수 있다. 대안적으로, 본 명세서에 기재된 바와 같이 옥테트(Octet)(캘리포니아주 먼로 파크 소재의 포르테바이오(ForteBio))를 사용하는 실시간 무표지 경쟁적 결합 어세이를 사용할 수 있다. 서열 번호 23의 VH 및 서열 번호 24의 VL 또는 서열 번호 27의 VH 및 서열 번호 28의 VL을 포함하는 항체의 인간 IFNω 및 인간 IFNα 하위유형 IFNαB2, IFNαF, IFNαG, 및/또는 IFNαJ1에 대한 결합을 저해하는 시험 항체의 능력은, 시험 항체가 인간 IFNω 및 인간 IFNα 하위유형 IFNαB2, IFNαF, IFNαG, 및/또는 IFNαJ1에 대한 결합에 대해 이들 항체와 경쟁한다는 것을 입증한다.
다른 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 1의 하나 이상의 잔기 F27, L30, 및 R33에서 IFNω에 결합한다.
다른 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 19의 하나 이상의 잔기 F27, L30, 및 R33에서 IFNα4a에 결합한다.
IFNω 및 IFNα4a 양자 모두에서 잔기 F27, L30, 및 R33은 본 발명의 IFNα/ω 항체의 광범위 중화 활성에 필요한 최소 에피토프를 정의한다. 몇몇 항체/IFNα 또는 항체/IFNω 복합체의 결정 구조는 상기 3개의 잔기가 항체 결합에 뚜렷한 기여를 제공함을 규명했다. 인간 IFNα4a는 다른 인간 IFNα와 83% 이상의 동일성을 공유하고 인간 IFNω와 59%의 동일성을 공유한다. F27 잔기는 IFNαD(α1)를 제외한 모든 인간 IFNα에서 보존되어 있다. F27 또한 인간 IFNω에서 보존되어 있다. L30 및 R33은 양자 모두 모든 인간 IFNα와 더불어 인간 IFNω에서 보존되어 있다.
본 발명의 다른 실시 형태에서, 인간 인터페론 오메가(IFNω) 및 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 인간 인터페론 알파(IFNα) 하위유형에 결합하고 그의 활성을 중화하는 본 발명의 단클론 항체는 IFNαD에 결합하지 않고 그를 중화하지 않는다.
특이적 IFNω 및 IFNα 잔기에 결합하는 본 발명의 항체는, 인간 면역글로불린 유전자좌를 발현하는 마우스(Lonberg et al., Nature 368:856-9, 1994; Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51, 1996; Mendez et al., Nature Genetics 15:146-56, 1997, 미국 특허 제5,770,429호, 제7,041,870호, 및 제5,939,598호) 또는 Balb/c 마우스를 에피토프 접촉 잔기를 포함하는 펩티드, 예를 들어 IFNω의 AB 루프(서열 번호 1의 FNω의 아미노산 잔기 22 내지 34) 또는 IFNα4a의 AB 루프(서열 번호 19의 IFNα4a의 아미노산 잔기 22 내지 34)의 아미노산 서열을 갖는 펩티드, 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 IFNω 및 IFNα 하위유형의 혼합물로 면역화하고 문헌[Kohler et al., Nature 256:495-97, 1975]의 하이브리도마 방법을 사용함으로써 제조할 수 있다. 생성되는 항체를, 서열 번호 23의 VH 및 서열 번호 24의 VL을 갖는 항체와 같은 본 발명의 항체와 경쟁하는 그들의 능력에 대해 시험하고, 표준 방법을 사용하여 에피토프에 대한 그들의 결합에 대해 시험한다. 예를 들어, 개별 구성요소 양자 모두의 구조가 공지되어 있는 경우에, 컴퓨터 모의실험(in silico) 단백질-단백질 도킹(docking)을 실행하여, 상호작용의 상용성 부위를 동정할 수 있다. 항원 및 항체 복합체를 사용하여 수소-중수소(H/D) 교환을 수행하여, 항체에 의해 결합될 수 있는 항원 상의 영역을 맵핑할 수 있다. 항원의 세그먼트 및 점 돌연변이유발을 사용하여, 항체 결합에 중요한 아미노산의 위치를 찾을 수 있다. 항체-항원 복합체의 공동-결정 구조를 사용하여, 에피토프 및 파라토프에 기여하는 잔기를 동정할 수 있다. 문헌[Queen et al., Proc Natl Acad Sci (USA) 86:10029-32, 1989] 및 문헌[Hodgson et al., Bio/Technology 9:421, 1991]에 개시된 것들과 같은 기술에 의해, 결합 친화도를 보존하기 위해 변경된 프레임워크 지지 잔기를 혼입함으로써, 동정된 mAb를 추가로 개질할 수 있다.
다른 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 잔기 F27, L30, 및 R33에서 IFNω에 결합하며, 서열 번호 1의 잔기 P26, K31, 및 R34로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 IFNω 잔기에 추가로 결합한다.
다른 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 잔기 F27, L30, 및 R33에서 IFNω에 결합하며, 서열 번호 1의 잔기 R22, R23, I24, S25, P26, K31, D32, R34, D35, Q40, K134, M146, E147, M149, K150, F153, 및 L154로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 IFNω 잔기에 추가로 결합한다.
다른 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 잔기 R22, P26, F27, L30, K31, D32, R33, R34, D35, Q40, K134, M146, E147, M149, K150, F153, 및 L154에서 서열 번호 1의 IFNω에 결합한다.
다른 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 잔기 R23, I24, S25, P26, F27, L30, K31, R33, R34, M146, E147, M149, 및 K150에서 서열 번호 1의 IFNω에 결합한다.
다른 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 잔기 F27, L30, 및 R33에서 IFNα4a에 결합하며, 서열 번호 19의 잔기 H26, K31, 및 R34로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 IFNα4a 잔기에 추가로 결합한다.
다른 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 잔기 F27, L30, 및 R33에서 IFNα4a에 결합하며, 서열 번호 19의 A19, H26, F27, L30, K31, D32, R33, H34, D35, V143, A146, E147, M149, R150, 및 S153으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 IFNα4a 잔기에 추가로 결합한다.
다른 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 19의 하나 이상의 잔기 A19, H26, F27, L30, K31, D32, R33, H34, D35, V143, A146, E147, M149, R150, 및 S153에서 서열 번호 19의 IFNα4a에 결합한다.
다른 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 19의 하나 이상의 잔기 G22, R23, I24, S25, H26, F27, C29, L30, K31, R33, H34 V143, A146, E147 및 R150 및 S153에서 서열 번호 19의 IFNα4a에 결합한다
다른 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 바이러스-유도 백혈구 인터페론의 활성을 저해한다.
일부 실시 형태에서, 바이러스-유도 백혈구 인터페론의 활성은 100 U/ml의 인터페론에 의해 유도된 전혈에서의 IP-10 방출이다.
본 발명의 항체는, 본 명세서에 기재된 바와 같이 100 U/ml 인터페론에 의해 유도된 전혈에서 IP-10 방출을 저해하는 그들의 능력에 의해 평가되는 바와 같이, 활성화된 백혈구에 의해 생성된 인터페론을 중화할 수 있다. 본 발명의 항체는, 활성화된 백혈구에 의해 생성된 인터페론의 효과를 50 ㎍/ml 항체의 존재 하에 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 이상 만큼 중화할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 50 ㎍/ml 항체의 존재 하에 전혈에서 IP-10 방출을 50% 초과 만큼 저해한다.
다른 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 SLE 면역 복합체-유도 IFN 생성을 저해한다. SLE 면역 복합체는 SLE에 존재하는 유형 I IFN 환경을 나타낸다. IFN 생성은 본 명세서에 기재된 바와 같이 리포터 유전자 어세이를 사용하여 측정할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 SLE 면역 복합체-유도 인터페론 생성을 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 이상 만큼 저해할 수 있다.
본 발명의 항체는 인간 항체이거나, 인간화 항체이거나, 인간-적응화 항체일 수 있다.
본 발명의 항체는 IgA, IgD, IgE, IgG, 또는 IgM 유형의 것일 수 있다. 본 발명의 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 유형의 것일 수 있다.
본 발명의 다른 실시 형태는,
서열 번호 23의 중쇄 가변 영역(VH) 아미노산 서열 및 서열 번호 24의 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열;
서열 번호 25의 VH 아미노산 서열 및 서열 번호 26의 VL 아미노산 서열; 또는
서열 번호 27의 VH 아미노산 서열 및 서열 번호 28의 VL 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체와 경쟁한다.
임의의 비-인간 서열이 결여된 인간 mAb는, 예를 들어, 문헌[Knappik et al., J Mol Biol 296:57-86, 2000]; 및 문헌[Krebs et al., J Immunol Meth 254:67-84 2001]에 인용된 기술에 의해 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 제조하고 최적화할 수 있다. 예시적인 방법에서, 본 발명의 항체는 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 발현하는 라이브러리로부터 박테리오파아지 pIX 코트 단백질을 가진 융합 단백질로서 단리된다. 항체 라이브러리를 인간 IFNω 및 IFNα에 대한 결합에 대해 스크리닝하고, 얻어진 양성 클론을 추가로 특성화하고, 클론 용해물로부터 Fab를 단리하고, 전체 길이 IgG로서 발현시킨다. 예시적인 항체 라이브러리 및 스크리닝 방법은 문헌[Shi et al., J Mol Biol 397:385-96, 2010]; 국제 특허 공개 제WO2009/085462호, 및 미국 특허 제12/546850호; 미국 특허 제5,223,409호, 제5,969,108호, 및 제5,885,793호에 기재되어 있다.
생성되는 mAb를 그들의 프레임워크 영역에서 추가로 개질하여 소정의 프레임워크 잔기를 상응하는 인간 생식세포계열에 존재하는 것들로 변경할 수 있다.
당업자에게 공지된 기술에 의한 Fc 변형을 통해 본 발명의 항체의 면역 효과 특성을 증진하거나 억제할 수 있다. 예를 들어, Fc 효과기 작용, 예를 들어 C1q 결합, 보체 의존성 세포독성(CDC: complement dependent cytotoxicity), 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC: antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity), 식작용, 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등을, 이들 활성을 담당하는 Fc 내의 잔기를 개질함으로써 제공 및/또는 제어할 수 있다. 항체 반감기를 연장하는 Fc 도메인 내의 잔기를 돌연변이시킴으로써 약물 동태학적 특성 또한 증진될 수 있을 것이다(Strohl Curr Opin Biotechnol 20:685-91, 2009).
부가적으로, 본 발명의 항체는 글리코실화, 이성체화, 탈글리코실화(deglycosylation), 또는 비-자연 발생 공유적 변형, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 부분의 첨가(페길화(pegylation)) 및 지질화와 같은 과정에 의해 번역-후 변형될 수 있다. 이러한 개질은 생체내 또는 시험관내에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 폴리에틸렌 글리콜에 컨쥬게이트되어(PEG화), 이들의 약동학적 프로파일을 개선시킬 수 있다. 컨쥬게이션은 당업자에게 알려져 있는 기술에 의해 수행될 수 있다. 치료적 항체와 PEG의 컨쥬게이션은, 작용을 방해하지 않으면서 약력학적 특성을 향상시키는 것으로 나타났다(Knigh et al., Platelets 15:409-18, 2004; Leong et al., Cytokine 16:106-19, 2001; Yang et al., Protein Eng 16:761-70, 2003).
안정성, 선택성, 교차-반응성, 친화도, 면역원성, 또는 다른 바람직한 생물학적 특성 또는 생물리학적 특성을 개선하기 위해 개질된 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 본 발명의 범주 내에 있다. 항체의 안정성은, (1) 그들의 본래 안정성에 영향을 미치는 개별 도메인의 코어 패킹(core packing), (2) HC 및 LC 페어링(pairing)에 영향력을 갖는 단백질/단백질 계면 상호작용, (3) 극성 잔기 및 하전된 잔기의 매몰(burial), (4) 극성 잔기 및 하전된 잔기에 대한 H-결합 네트워크; 및 (5) 다른 분자내 및 분자간 힘 중의 표면 전하 및 극성 잔기 분포를 포함하는 다수의 인자에 의해 영향을 받는다(Worn et al., J Mol Biol 305:989-1010, 2001). 유력한 구조 불안정화 잔기는 항체의 결정 구조에 기초하여 또는 특정 경우에 분자 모델링에 의하여 동정할 수 있으며, 동정된 잔기 내에 돌연변이를 갖는 변이체를 생성하고 평가함으로써, 항체 안정성에 대한 잔기의 영향을 시험할 수 있다. 항체 안정성을 증가시키는 방법 중 하나는 시차 주사 열량법(DSC)에 의해 측정되는 열 전이 중간점(Tm)을 상승시키는 것이다. 일반적으로, 단백질 Tm은 그의 안정성과 상관관계를 가지며, 용액 중에서의 언폴딩(unfolding) 및 변성, 및 단백질이 언폴딩되는 경향에 따라 달라지는 분해 과정에 대한 그의 감수성과 역 상관관계를 가진다(Remmele et al., Biopharm., 13:36-46, 2000). 다수의 연구에서, DSC에 의해 열 안정성으로서 측정된 제형의 물리적 안정성과 다른 방법에 의해 측정된 물리적 안정성의 순위 사이의 상관관계가 확인되었다(Gupta et al., AAPS PharmSci 5E8, 2003; Zhang et al., J Pharm Sci 93:3076-89, 2004; Maa et al., Int J Pharm 140:155-68, 1996; Bedu-Addo et al., Pharm Res 21:1353-61, 2004; Remmele et al., Pharm Res 15:200-8, 1997). 제제 연구는 Fab Tm이 상응하는 mAb의 장기간 물리적 안정성에 대한 영향을 갖는 것을 시사한다. 프레임워크 또는 CDR 내의 아미노산의 차이는 Fab 도메인의 열 안정성 상에 현저한 영향을 가질 수 있다(Yasui et al., FEBS Lett 353:143-6, 1994).
본 발명의 IFNα/ω 항체는 이중특이적 항체로 조작할 수 있으며, 이 또한 본 발명의 범주 내에 포함된다. 공개된 방법을 사용하여 본 발명의 항체의 VL 및/또는 VH 영역을, TandAb(등록상표) 설계와 같은 구조로서의 단일쇄 이중특이적 항체로 조작하거나(국제 특허 공개 제WO1999/57150호; 미국 특허 공개 제US2011/0206672호), 미국 특허 제5,869,620호; 국제 특허 공개 제WO1995/15388A호, 국제 특허 공개 제WO1997/14719호, 또는 국제 특허 공개 제WO2011/036460호에 개시된 것들과 같은 구조로서의 이중특이적 scFV로 조작할 수 있다.
본 발명의 항체의 VL 및/또는 VH 영역을 이중특이적 전체 길이 항체로 조작할 수 있으며, 여기서 각각의 항체 팔은 별개의 항원 또는 에피토프에 결합한다. 이러한 이중특이적 항체는, 미국 특허 제7,695,936호; 국제 특허 공개 제WO04/111233호; 미국 특허 공개 제US2010/0015133호; 미국 특허 공개 제US2007/0287170호; 국제 특허 공개 제WO2008/119353호; 미국 특허 공개 제US2009/0182127호; 미국 특허 공개 제US2010/0286374호; 미국 특허 공개 제US2011/0123532호; 국제 특허 공개 제WO2011/131746호; 국제 특허 공개 제WO2011/143545호; 또는 미국 특허 공개 제US2012/0149876호에 기재된 것들과 같은 기술을 사용하여, 2개의 항체 중쇄 사이의 CH3 상호작용을 조절하여 이중특이적 항체를 형성함으로써 전형적으로 제조된다. 본 발명의 항체의 VL 및/또는 VH 영역이 혼입될 수 있는 부가적 이중특이적 구조는, 예를 들어 이중 가변 도메인 면역글로불린(국제 특허 공개 제WO2009/134776호), 또는 상이한 특이성을 가진 2개의 항체 팔을 연결하기 위한 다양한 이량체화 도메인, 예를 들어 류신 지퍼(leucine zipper) 또는 콜라겐 이량체화 도메인을 포함하는 구조(국제 특허 공개 제WO2012/022811호, 미국 특허 제5,932,448호; 미국 특허 6,833,441)를 사용하여 결정하였다.
본 발명의 다른 태양은, 본 발명의 항체 중쇄 가변 영역 또는 항체 경쇄 가변 영역 또는 그의 단편 또는 그들의 보체 중 임의의 것을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드이다. 주어진 발현 시스템 내에서 유전자 코드의 축퇴성 또는 코돈 선호도를 고려하여, 본 발명의 항체 길항제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또한 본 발명의 범주 내에 있다.
본 발명의 다른 실시 형태는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터이다. 이들 벡터는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 배큘로바이러스(baculovirus) 발현용 벡터, 트랜스포존(transposon) 기반의 벡터, 또는 임의의 수단에 의한 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 주어진 유기체 또는 유전자 백그라운드(genetic background)로의 도입에 적합한 임의의 다른 벡터일 수 있다.
본 발명의 다른 실시 형태는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포이다. 이들 숙주 세포는 진핵 세포, 박테리아 세포, 식물 세포 또는 고세균(archeal) 세포일 수 있다. 예시적인 진핵 세포는 포유동물, 곤충, 조류 또는 다른 동물 기원의 것일 수 있다. 포유류 진핵 세포는 불멸화 세포주, 예를 들어 하이브리도마 또는 골수종 세포주, 예를 들어 SP2/0(버지니아주 머내서스 소재의 미국 미생물 보존 센터(ATCC: American Type Culture Collection), CRL-1581), NS0(영국 윌트셔주 솔즈베리 소재의 유럽 세포 배양 센터(ECACC: European Collection of Cell Cultures), ECACC No. 85110503), FO(ATCC CRL-1646), 및 Ag653(ATCC CRL-1580) 뮤린 세포주를 포함한다. 예시적인 인간 골수종 세포주는 U266(ATTC CRL-TIB-196)이다. 다른 유용한 세포주는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 이를 테면 CHO-K1SV(론자 바이올로직스(Lonza Biologics), Walkersville, MD), CHO-K1(ATCC CRL-61) 또는 DG44로부터 유래된 것을 포함한다.
본 발명의 다른 실시 형태는, 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 숙주 세포에 의해 생성되는 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 항체를 생성하는 방법이다. 항체의 제조 방법 및 이들의 정제 방법은 해당 분야에 잘 알려져 있다.
본 발명의 다른 실시 형태는, 인간 IFNω 및 인간 IFNα 하위유형 IFNαB2, IFNαF, IFNαG, 및/또는 IFNαJ1에 대한 결합에 대해, 서열 번호 23의 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 24의 경쇄 가변 영역(VL); 또는 서열 번호 27의 VH 및 서열 번호 28의 VL을 포함하는 단리된 항체와 경쟁하는 단리된 항체를, IFNω 및 IFNα 하위유형 IFNαB2, IFNαF, IFNαG, 및/또는 IFNαJ1과 IFNAR의 상호작용을 방지하기에 충분한 시간 동안 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에서 IFNω 및 IFNα 하위유형 IFNαB2, IFNαF, IFNαG, 및/또는 IFNαJ1과 IFNAR의 상호작용을 저해하는 방법이다. 항체와 IFNAR 사이의 경쟁은, 예를 들어 IFNAR1(서열 번호 31) 및 IFNAR2 (서열 번호 32) 또는 그들의 Fc 융합 단백질의 세포외 부분을 사용하여 표준 방법 및 본 명세서에 기재된 것들을 사용하여 어세이할 수 있다.
치료 방법
본 발명의 IFNα/ω 항체를 이용하여 IFNα 및 IFNω의 증가된 생성과 연계된 임의의 질환을 치료 또는 예방할 수 있다. 본 발명의 방법에는, 본 발명의 임의의 IFNα/ω 항체를 사용할 수 있다. 대안적으로, 인간 IFNω 및 인간 IFNα 하위유형 IFNαB2, IFNαF, IFNαG, 및/또는 IFNαJ1에 대한 결합에 대해, 서열 번호 23의 중쇄 가변 영역(VH) 아미노산 서열 및 서열 번호 24의 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열; 또는 서열 번호 27의 VH 아미노산 서열 및 서열 번호 28의 VL 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체와 경쟁하는 항체를, 사용할 수 있다. 추가로, 서열 번호 1의 하나 이상의 잔기 F27, L30, 및 R33에서 IFNω에 결합하고 서열 번호 19의 하나 이상의 잔기 F27, L30, 및 R33에서 IFNα4a에 결합하는 임의의 항체를 사용할 수 있다.
본 발명의 방법은 임의의 분류에 속하는 동물 환자를 치료하기 위해 사용할 수 있다. 이들 동물의 예에는 포유동물, 이를 테면 인간, 설치류, 개, 고양이 및 가축이 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 면역-매개 염증성 질환, 예를 들어 전신 홍반 루푸스(SLE), 유형 I 당뇨병, 건선, 원발성 쇼그렌 증후군, 전신 경화증, 류머티스 관절염, 염증성 장 질환(IBD; 크론 병(Crohn's Disease), 궤양성 대장염, 및 복강 질환을 포함함), 면역-매개 염증성 갑상선염, 및 사구체신염의 예방 및 치료에 유용하다. 추가로, 본 발명의 항체 조성물은 이식 거부의 저해 또는 예방을 위해, 또는 이식편 대 숙주 질환(GVHD: graft versus host disease)의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 항체는 또한, 이러한 치료를 위한 의약품의 제조에 유용하며, 여기서 의약품은 본 명세서에 정의된 투여량으로 투여하기 위해 제조된다.
임의의 특정 이론에 구애되고자 하는 것은 아니지만, SLE 트리거(SLE trigger), 예를 들어 면역 복합체가 IFNα 및 IFNω를 포함하나 IFNβ는 포함하지 않는 유형 I IFN 반응을 야기하는 것을 시사한다. 그러므로 본 발명의 IFNα/ω 항체는, 항바이러스 방어에서 더 결정적인 역할을 할 수 있는 IFNβ 작용을 손상시키지 않으면서 이들 병원성 유형 I IFN을 광범위하게 저해하는 더 효과적인 SLE 치료를 제공할 수 있다. 본 발명에서는, IFNα 및 IFNω가 항원적으로 고유하다는 의견(Adolf, J Gen Virol 68:1669-1676, 1987)을 고려할 때의 문제점에도 불구하고, 광범위 중화 IFNα/ω 항체가 생성되었으며 IFNα 및 IFNω 상에 존재하는 고유한 중화 에피토프가 동정되었다.
IFNα와 SLE 사이의 관계는, 1979년에 SLE 환자의 혈청에서 이 사이토카인이 상승되는 것으로 입증되었을 때 최초로 기재되었다(Hooks et al., N Engl J Med 301:5-8, 1979; Preble et al., Science 216:429-431, 1982). 더 최근에는, SLE 환자의 하위군에서 유형 I IFN 유전자 시그니처가 널리 기재되었으며 IFN 시그니처 발현의 정도는 질환의 임상적 특징 및 혈청학적 특징 양자 모두와 양성 상관관계를 가지는 것으로 보고되었다(Karageorgas et al., J Biomed Biotechnol 273907, 2011; Baechler et al., Proc Natl Acad Sci USA 100:2610-2615, 2003; Bennett et al., J Exp Med 197:711-723, 2003; Dall'era et al., Ann Rheum Dis 64: 1692-1697, 2005; Niewold et al., Genes Immun 8: 492-502,2007])의발현에 대하여 유세포 분석법으로 분석하였다. 몇몇 유전자 연계 연구는 일부 루푸스 환자에서 질환의 매개에 있어서 유형 I IFN 경로의 잠재적 역할을 시사했다(Delgado-Vega et al., Arthritis Res Ther 12 Suppl 1 S2; Elkon and Stone; J Interferon Cytokine Res 11:803-812, 2011). 추가의 연구는 IFNα가 SLE에서 병원성 기전과 관련된 유전자 산물의 스위트의 발현을 조절한다는 것을 규명했다. 예를 들어 IFNα는, 중요한 B 세포 생존 인자이며 또한 벤리스타(Benlysta)(등록상표)(벨리무마브)의 표적인 BLyS의 발현을 유도할 수 있다. SLE 환자에서 유형 I IFN 활성과 가용성 BLyS의 수준에는 양성 상관관계가 존재하며(Ritterhouse et al., Arthritis Rheum 63:3931-3941, 2011), 조직이 수집된 소수의 SLE 환자의 피부 병변 생검에서 SLE 환자에서 IFNα의 차단은 BLyS의 유전자 발현의 감소를 유발했다(Yao et al., Arthritis Rheum 60:1785-1796, 2009). IL-6과 함께, IFNα 또한 Ig-분비 혈장 세포의 생성을 위해 중요한 것으로 나타났다(Jego et al., Curr Dir autoimmune 8:124-139, 2005). B-세포 구획에 대한 직접적 효과 외에, IFNα는 루푸스 병인의 다른 중요한 매개체에 대한 효과를 나타낸다. 블랑코 등은 IFNα가 단핵구의 항원-제시 DC로의 분화를 유도할 수 있다는 것을 입증하였다(Blanco et al., Science 294:1540-1543, 2001). SLE 혈청 샘플 내에 존재하는 IFNα의 중화는 단핵구를 DC 분화로 유도하는 SLE 혈청의 능력을 현저하게 감소시켰으며, 이는 일부 SLE 환자에서 자가 항원에 대한 용인성을 감소시킴에 있어서 이 사이토카인의 중요한 역할을 입증한다. 감염성 또는 종양학적 적응증에 대한 IFNα 요법은 일부 환자에서 SLE-유사 질환을 유도하는 것으로 나타났으며, 이는 요법이 중단된 후에 진정된다(Burdick et al., Expert Opin Drug Saf 8:459-472, 2009; Biggioggero et al., Autoimmunity 43:248-254, 2010).
IFN은 바이러스와 같은 감염원에 반응하여 신속하게 생성되어 감염 제어를 보조한다. 핵산 리간드에 결합된 자가항체는 SLE에서 유형 I IFN의 뚜렷한 유도인자인 것으로 생각된다. 자가항체의 우세는 자가항원의 저하된 제거율과 함께 IFN 생성의 피드백 주기를 유발하며, 여기서 면역 복합체의 형질세포형 수지상 세포(pDC: plasmacytoid dendritic cell) 내로의 Fc 수용체-의존성 내재화는 증가된 양의 IFN, 및 따라서 IFN 시그니처의 확립을 유발한다. 톨-유사 수용체(TLR: toll-like receptor) 7 및 TLR9와 같은 핵산 수용체는 pDC의 엔도좀 구획 내에 풍부하며, 유형 I IFN 방출로 이어지는 연속단계를 개시하는 이들 핵산-함유 면역 복합체의 뚜렷한 전초(sentinel)인 것으로 생각된다. 그 목적을 위하여, TLR 7 및 9의 다중 저해제가 SLE를 위한 임상 개발 중이다.
SLE에서는 IFNα 및 IFNω 양자 모두가 상승하며 유사한 면역조절 효과를 유도할 수 있다. SLE 환자에서, 합성 리간드를 사용하는 TLR7 및 TLR9(Gibson et al., Cell Immunol 218:74-86, 2002) 또는 SLE 환자-유래의 면역 복합체(본 명세서에 기재된 바와 같음)의 효현작용(agonism)은 IFNα 및 IFNω 단백질 IFNω 전사체 양자 모두를 유도하였으며(Han et al., Genes Immun 4:177-186, 2003), 단백질(데이터는 나타내지 않음)이 상향조절된다.
유형 I IFN에 대한 자가항체 또한 SLE 환자에서 확인되며, 이는 이들 환자에서 과도하게 왕성한 체액성 면역 반응과 커플링된 상승된 IFN의 결과일 가능성이 있다. 조사된 SLE 코호트에서 IFNω에 대한 자가항체는 IFNα에 대한 것들보다 더 우세한 것으로 확인된 반면에, IFNβ에 대한 자가항체는 미량으로만 검출되었다(Slavikova et al., J Interferon Cytokine Res 23:143-147, 2003). IFNω에 의해 부여되는 일반적 활성은 IFNα 효과와 유사하며, 이는 SLE 환자에서 상승된 IFNω가 질환 병인에 기여할 수 있다는 것을 시사한다(Adolf et al.,J Biol Chem 265:9290-9295, 1990; Adolf, Mult Scler 1 Suppl 1:S44-47, 1995; Kubes et al., J Interferon Res 14:57-59, 1994; Tiefenthaler et al., J Interferon Cytokine Res 17:327-329, 1997). SLE에서 IFNβ의 존재 및 역할은 덜 확실하다. SLE 환자 혈청을 자극으로서 사용하는 IFNα의 특이적 중화는 유형 I IFN 활성의 실질적 감소를 유발한 반면에, 시험한 환자 혈청 샘플을 사용하는 IFNβ 중화는 무시할만한 효과를 부여했으며, 이는 질환 병인에 대한 IFNβ의 경미한 관련성을 시사한다(Hua et al., Arthritis Rheum 54:1906-1916, 2006).
임상 개발에서 현재의 유형 I IFN 길항제 접근법은, 다른 유형 I IFN(β, ε, κ, ω)이 아닌 IFNα 하위유형의 스펙트럼의 중화, 인터페론 수용체의 IFNAR1 쇄의 중화에 의한 모든 유형 I IFN의 신호 전달의 차단, 또는 IFNα에 대해 특이적인 백신접종 접근법의 이용(Merrill et al., Ann Rheum Dis 70:1905-1913, 2011; Zagury et al., Proc Natl Acad Sci USA 106:5294-5299, 2009)에 집중되어 있다. 임상 시험에서, SLE 환자 내의 항- IFNα 항체는, IFN 시그니처를 나타내는 환자에서의 유형 I IFN 시그니처의 부분적 감소, 및 탐색적 분석에서의 약간의 효능을 입증했다(Merrill et al., Ann Rheum Dis 70:1905-1913, 2011). 제2상 연구에서, 면역억제제의 부재 하의 항-INFα 치료는, 측정 인터페론 시그니처(ISM)-낮은 중간 내지 중증 활성 루푸스 대상의 사전-특정된 생체표지자로 정의된 군에서 제24주에, SLE의 징후 및 증상, 플레어 속도, 및 스테로이드 부담의 개선과 연계되었다. 흥미롭게도, ISM-높음으로 사전-정의된 환자에서는 효능이 나타나지 않았다(Kalunian et al., 2012 ACR/ARHP Annual Meeting; Abstract # 2622, 2012).
IFNAR1에 대한 단클론 항체는 IFNβ를 포함하는 모든 유형 I IFN에 의해 유도되는 IFN 신호를 소멸시키는 것으로 예측될 것이다. SLE 병인에서 IFNβ의 현저한 역할을 지지하는 데이터가 없음에도 불구하고, IFNβ는 항바이러스 방어에서 더 결정적인 역할을 할 수 있다. IFNβ를 암호화하는 유전자의 특이적 결실은, 작용성 IFNβ를 갖는 유사하게 노출된 마우스에 비교할 때, 바이러스의 숙주에 실질적인 감수성을 초래한다(Lazear et al., J Virol 85:7186-94; Deonarain et al., J Virol 74:3403-09, 2000; Deonarain et al., Circulation 110:3540-3543, 2004; Gerlach et al., J Virol 80:3438-3444, 2006; Koerner et al., J Virol 81:2025-2030, 2007).
본 발명의 일 실시 형태는, 인간 인터페론 오메가(IFNω) 및 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 인간 인터페론 알파(IFNα) 하위유형에 결합하고 그의 활성을 중화하는 단리된 항체, 또는 인간 IFNω 및 인간 IFNα 하위유형 IFNαB2, IFNαF, IFNαG, 또는 IFNαJ1에 대한 결합에 대해, 서열 번호 23의 중쇄 가변 영역(VH) 아미노산 서열 및 서열 번호 24의 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열; 또는 서열 번호 27의 VH 아미노산 서열 및 서열 번호 28의 VL 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체와 경쟁하는 항체의 치료적 유효량을, 질환을 치료하거나 예방하기에 충분한 시간 동안 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, IFNα 및 IFNω의 증가된 생성과 연계된 질환의 치료 또는 예방 방법이다.
본 발명의 다른 실시 형태는, 인간 인터페론 오메가(IFNω) 및 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 인간 인터페론 알파(IFNα) 하위유형에 결합하고 그의 활성을 중화하는 단리된 항체, 또는 인간 IFNω 및 인간 IFNα 하위유형 IFNαB2, IFNαF, IFNαG, 및/또는 IFNαJ1에 대한 결합에 대해, 서열 번호 23의 중쇄 가변 영역(VH) 아미노산 서열 및 서열 번호 24의 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열; 또는 서열 번호 27의 VH 아미노산 서열 및 서열 번호 28의 VL 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체와 경쟁하는 항체를, IFNω 및 IFNα 하위유형 IFNαB2, IFNαF, IFNαG, 및/또는 IFNαJ1과 IFNAR의 상호작용을 방지하기에 충분한 시간 동안 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에서 IFNω 및 IFNα 하위유형 IFNαB2, IFNαF, IFNαG, 또는 IFNαJ1과 IFNAR의 상호작용을 방지하는 방법이다.
다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 항체는, 서열 번호 1의 하나 이상의 잔기 F27, L30, 및 R33에서 IFNω에 결합하고 서열 번호 19의 하나 이상의 잔기 F27, L30, 및 R33에서 IFNα4a에 결합하는 항체를 포함한다.
루푸스-취약 마우스, 및 다양한 약제를 사용하여 루푸스-유사 표현형이 유도되거나 가속되는 마우스의 변종을 포함하는 루푸스의 동물 모델에서, 본 발명의 항체를 그들의 효능에 대해 시험할 수 있다(Perry, et al., J Biomed Biotechnol, 2011:271694, 2011). 예를 들어, NZB/NZW F1 마우스는 사구체신염을 포함하는 인간 루푸스의 몇몇 특징을 갖는 시간-의존성이며 자성-편향적인 질환을 나타낸다. 인간에 비교할 때 마우스에서는 다중이며 별개인 IFNα 하위유형이 생성되고(van Pesch, et al., J Virol, 78:8219-28, 2004) 마우스에서는 IFNω 발현이 결여되므로, 질환 관련 IFN 제제를 사용하는 질환 관련 세포에서의 시험관내 시험을 사용하여 본 발명의 항체의 효능 및 질환 조절 잠재력(disease modifying potential)을 평가할 수 있다. 이러한 시험관내 어세이는, 예를 들어 전혈에서 SLE 면역 복합체에 의해 유도된 IFN 생성의 저해의 평가, 또는 본 명세서에 기재된 바와 같이 IFN 시그니처를 감소시키는 항체의 능력의 평가이다.
본 발명의 IFNα/ω 항체의 VH 및 VL 도메인을 본 명세서에 기재된 이중특이적 항체 및 분자 내로 혼입시킬 수 있으며, 여기서 이중특이적 항체는 IFNω 및 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 인간 인터페론 알파(IFNα) 하위유형, 예를 들어 IFNαB2, IFNαF, IFNαG, 및 IFNαJ1, 및 제2 항원, 예를 들어 BLyS, CD40L, IL-6, CD27, BDCA2(CLEC4C, C-유형 렉틴 도메인 계열 4, 구성원 C), 또는 IL-12 및 IL-23의 p40 서브유닛에 특이적으로 결합하고 그를 중화한다. 대안적으로, 인간 IFNω 및 인간 IFNα 하위유형 IFNαB2, IFNαF, IFNαG, 및/또는 IFNαJ1에 대한 결합에 대해, 서열 번호 23의 중쇄 가변 영역(VH) 아미노산 서열 및 서열 번호 24의 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열; 또는 서열 번호 27의 VH 아미노산 서열 및 서열 번호 28의 VL 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체와 경쟁하는 임의의 항체의 VH 및 VL 도메인을 사용할 수 있다. 추가로, 서열 번호 1의 하나 이상의 잔기 F27, L30, 및 R33에서 IFNω에 결합하고 서열 번호 19의 하나 이상의 잔기 F27, L30, 및 R33에서 IFNα4a에 결합하는 임의의 항체의 VH 및 VL 도메인을 사용할 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법, 예를 들어 인간 면역글로불린 유전자좌를 발현하는 마우스(Lonberg et al., Nature 368:856-9, 1994; Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51, 1996; Mendez et al., Nature Genetics 15:146-56, 1997, 미국 특허 제5,770,429호, 제7,041,870호, 및 제5,939,598호) 또는 상응하는 단백질 또는 단백질의 세포외 도메인을 가진 Balb/c 마우스의 면역화를 사용하여, 또는 본 명세서에 기재된 바와 같이 파아지 디스플레이 라이브러리를 사용하여, BLyS, CD40L, IL-6, CD27, BDCA2(CLEC4C, C-유형 렉틴 도메인 계열 4, 구성원 C), 또는 IL-12 및 IL-23의 p40 서브유닛 결합 항체를 생성할 수 있다. 대안적으로, BLyS, CD40L, IL-6, CD27, BDCA2(CLEC4C, C-유형 렉틴 도메인 계열 4, 구성원 C), 또는 IL-12 및 IL-23의 p40 서브유닛에 대한 기존 항체를 사용하여 이중특이적 분자를 생성할 수 있다.
투여/약제학적 조성물
IFNα 및 IFNω의 증가된 생성과 연계된 병태의 치료에 효과적인 본 발명의 IFNα/ω 항체의 "치료적 유효량"은 표준 연구 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, SLE와 같은 면역-매개 염증성 질환의 치료에 효과적일 본 발명의 IFNα/ω 항체의 투여량은, 당업계에 주지된 관련 동물 모델에 IFNα/ω 항체를 투여함으로써 결정할 수 있다.
시험관 내 분석을 임의로 채용하여, 최적 투여량 범위의 동정을 보조할 수 있다. 특정 유효 용량의 선택은 당업자가 몇몇 인자의 고려에 기초하여 결정할 수 있다(예를 들어, 임상 시험을 통해). 이러한 인자는 치료 또는 예방될 질환, 연루된 증후, 환자의 체중, 환자의 면역 상태 및 당업자가 알고 있는 다른 인자를 포함한다. 제형에 사용되는 정확한 용량은 또한 투여 경로, 및 질환의 중증도에 좌우될 것이며, 전문의의 판단 및 각 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유래된 용량-반응 곡선으로부터 유효 용량을 추정할 수 있다. 본 명세서에 기재된 모델 중 임의의 것을 사용하여 본 발명의 항체를 그들의 효능 및 유효 투여량에 대해 시험할 수 있다.
본 발명의 항체의 치료적 용도를 위한 투여 방식은 약제를 숙주에게 전달하는 임의의 적합한 경로일 수 있다. 이들 항체의 약제학적 조성물은 비경구 투여, 예를 들어, 피부내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 또는 비강내 투여에 특히 유용하다.
본 발명의 항체는 약제학적으로 허용가능한 담체 중의 활성 성분으로서 유효량의 약제를 함유하는 약제학적 조성물로서 제조될 수 있다. 용어 "담체"는 활성 화합물과 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제, 또는 비히클을 지칭한다. 이러한 약제학적 비히클은 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것들, 이를 테면 땅콩유, 대두유, 광물유, 참기름 등을 포함하는 물 및 오일과 같은 액체일 수 있다. 예를 들어, 0.4% 염수 및 0.3% 글리신을 사용할 수 있다. 이들 용액은 무균성이고 일반적으로 입자상 물질이 없다. 그들은 통상적인 주지의 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있다(예를 들어, 여과). 조성물은 pH 조절제 및 완충제, 안정화제, 농후제, 윤활제, 및 착색제 등과 같은 생리학적 조건에 근접시키기 위하여 필요한, 약제학적으로 허용가능한 보조 물질을 함유할 수 있다. 이러한 약제학적 제형에서 본 발명의 항체의 농도는 광범위하게, 즉, 약 0.5 중량% 미만으로부터, 통상적으로 약 1 중량% 이상 내지 15 또는 20 중량% 정도까지 변동될 수 있으며, 선택된 특정 투여 방식에 따라, 일차적으로 필요한 용량, 유체 부피, 점성 등에 기초하여 선택될 것이다.
따라서, 근육내 주사를 위한 본 발명의 약제학적 조성물은 1 ml의 멸균 완충수, 및 약 1 ng 내지 약 100 mg, 예를 들어 약 50 ng 내지 약 30 mg, 또는 더욱 바람직하게는 약 5 mg 내지 약 25 mg의 본 발명의 항체를 함유하도록 제조될 수 있다. 유사하게, 정맥내 주입을 위한 본 발명의 약제학적 조성물은 약 250 ml의 멸균 링거 용액 및 약 1 mg 내지 약 30 mg, 바람직하게는 5 mg 내지 약 25 mg의 본 발명의 길항제를 함유하도록 제조할 수 있다. 비경구적으로 투여할 수 있는 조성물을 제조하기 위한 실제의 방법은 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌["Remington's Pharmaceutical Science", 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA]에 더욱 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 항체는 보관을 위해 동결건조되고, 사용 전에 적합한 담체 중에 재구성될 수 있다. 이 기술은 통상의 면역글로불린 및 단백질 제제에 유효한 것으로 보이며, 해당 업계에 공지된 동결건조 및 재구성 기술을 사용할 수 있다.
본 발명의 추가의 실시 형태
본 명세서의 다른 곳의 개시에 따른 본 발명의 소정의 추가의 번호화된 실시 형태가 하기에 정리되어 있다. 상기 정리된 본 발명의 실시 형태로부터의 특징은 또한, 이들 추가의 번호화된 실시 형태 각각에, 그리고 모두에 관한 것이다.
1) (a) 인간 인터페론 오메가(IFNω) 및 (b) 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 인간 인터페론 알파(IFNα) 하위유형에 결합하고 그의 활성을 중화하는 단리된 단클론 항체.
2) 실시 형태 1에 있어서, 인간 IFNα 하위유형 IFNαB2, IFNαF, IFNαG, 및 IFNαJ1에 결합하고 그의 활성을 중화하는 항체.
3) 실시 형태 1 또는 실시 형태 2에 있어서, 인간 IFNα 하위유형 IFNαB2, IFNαC, IFNαF, IFNαG, 및 IFNαJ1에 결합하고 그의 활성을 중화하는 항체.
4) 실시 형태 1 내지 실시 형태 3 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 인간 IFNα 하위유형 IFNαB2, IFNαC, IFNαF, IFNαG, IFNαJ1, 및 IFNαA에 결합하고 그의 활성을 중화하는 항체.
5) 실시 형태 1 내지 실시 형태 4 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 인간 IFNα 하위유형 IFNαB2, IFNαC, IFNαF, IFNαG, IFNαJ1, IFNαA, 및 IFNαH2에 결합하고 그의 활성을 중화하는 항체.
6) 실시 형태 1 내지 실시 형태 5 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 인간 IFNα 하위유형 IFNαB2, IFNαC, IFNαF, IFNαG, IFNαJ1, IFNαA, IFNαH2, 및 IFNαK에 결합하고 그의 활성을 중화하는 항체.
7) 실시 형태 1 내지 실시 형태 6 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 인간 IFNα 하위유형 IFNαB2, IFNαC, IFNαF, IFNαG, IFNαJ1, IFNαA, IFNαH2, IFNαK, 및 IFNαWA에 결합하고 그의 활성을 중화하는 항체.
8) 실시 형태 1 내지 실시 형태 7 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 인간 IFNα 하위유형 IFNαB2, IFNαC, IFNαF, IFNαG, IFNαJ1, IFNαA IFNαH2, IFNαK, IFNαWA, 및 IFNα4a에 결합하고 그의 활성을 중화하는 항체.
9) 실시 형태 1 내지 실시 형태 8 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 인간 IFNω 및 인간 IFNα 하위유형의 활성이, 신호 변환기 및 전사 활성제 2(STAT2), 인터페론 조절 인자 9(IRF9), 및 분비 배아 알칼라인 포스파타아제(SEAP)를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포에서 인터페론 유도성 ISG54 프로모터 하에 SEAP 발현의 저해인 항체.
10) 실시 형태 1 내지 실시 형태 9 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 실시예 3에서 "친화도 측정" 섹션에 정의된 조건 하에, 약 5x10-8 M 이하, 약 1x10-8 M 이하, 약 1x10-9 M 이하, 약 1x10-10 M 이하, 약 1x10-11 M 이하, 또는 약 1x10-12 M 이하의 IC50 값으로 인간 IFNω의 활성을 저해하고, 약 5x10-8 M 이하, 약 1x10-8 M 이하, 약 1x10-9 M 이하, 약 1x10-10 M 이하, 약 1x10-11 M 이하, 또는 약 1x10-12 M 이하의 IC50 값으로 인간 IFNα 하위유형 IFNαB2, IFNαF, IFNαG, 또는 IFNαJ1의 활성을 저해하는 항체.
11) 실시 형태 1 내지 실시 형태 10 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 약 5x10-9 M 이하, 약 1x10-9 M 이하, 약 5x10-10 M 이하, 약 1x10-10 M 이하, 약 5x10-11 M 이하, 약 1x10-11 M 이하, 약 5x10-12 M 이하, 또는 약 5x10-12 M 이하의 해리 상수(KD)로 인간 IFNω에 결합하고, 약 5x10-9 M 이하, 약 1x10-9 M 이하, 약 5x10-10 M 이하, 약 1x10-10 M 이하, 약 5x10-11 M 이하, 약 1x10-11 M 이하, 약 5x10-12 M 이하, 또는 약 5x10-12 M 이하의 KD로 인간 IFNα 하위유형 IFNαB2, IFNαF, IFNαG, 또는 IFNαJ1에 결합하는(여기서 KD는 실시예 3에서 "친화도 측정" 섹션에 예시된 조건을 사용하여 측정함) 항체.
12) 실시 형태 1 내지 실시 형태 11 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 인간 IFNω 및 인간 IFNα 하위유형 IFNαB2, IFNαF, IFNαG, 및/또는 IFNαJ1에 대한 결합에 대해,
a) 서열 번호 23의 중쇄 가변 영역(VH) 아미노산 서열 및 서열 번호 24의 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열; 또는
b) 서열 번호 27의 VH 아미노산 서열 및 서열 번호 28의 VL 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체와 경쟁하는 항체.
13) 실시 형태 1 내지 실시 형태 12 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 서열 번호 1의 잔기 F27, L30, 및 R33 중 하나 이상에서 IFNω에 결합하는 항체.
14) 실시 형태 1 내지 실시 형태 13 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 서열 번호 1의 잔기 F27, L30, 및 R33에서 IFNω에 결합하는 항체.
15) 실시 형태 1 내지 실시 형태 14 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 서열 번호 1의 잔기 P26, K31, 및 R34로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 IFNω 잔기에 추가로 결합하는 항체.
16) 실시 형태 14 또는 실시 형태 15에 있어서, 서열 번호 1의 잔기 R22, R23, I24, S25, P26, K31, D32, R34, D35, Q40, K134, M146, E147, M149, K150, F153, 및 L154로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 IFNω 잔기에 추가로 결합하는 항체.
17) 실시 형태 1 내지 실시 형태 16 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 서열 번호 19의 잔기 F27, L30, 및 R33 중 하나 이상에서 IFNα4a에 결합하는 항체.
18) 실시 형태 1 내지 실시 형태 17 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 서열 번호 19의 잔기 F27, L30, 및 R33에서 IFNα4a에 결합하는 항체.
19) 실시 형태 17 또는 실시 형태 18에 있어서, 서열 번호 19의 잔기 H26, K31, 및 R34로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 IFNα4a 잔기에 추가로 결합하는 항체.
20) 실시 형태 17 내지 실시 형태 19 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 서열 번호 19의 A19, G22, R23, I24, S25, H26, C29, K31, D32, H34, D35, V143, A146, E147, M149, R150, 및 S153으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 IFNα4a 잔기에 추가로 결합하는 항체.
21) 실시 형태 1 내지 실시 형태 20 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 바이러스-유도 백혈구 인터페론의 활성을 저해하는 항체.
22) 제21항에 있어서, 바이러스-유도 백혈구 인터페론의 활성이 100 U/ml의 인터페론에 의해 유도된 전혈 내의 IP-10 방출인 항체.
23. 제22항에 있어서, 50 ㎍/ml 항체의 존재 하에 활성을 50% 초과 만큼 저해하는 항체.
24) 실시 형태 1 내지 실시 형태 23 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 전신 홍반 루푸스(SLE) 면역 복합체-유도 IFN의 활성을 저해하는 항체.
25) 제24항에 있어서, 활성을 약 50% 초과 만큼 저해하는 항체.
26) 실시 형태 1 내지 실시 형태 25 중 어느 한 실시 형태에 있어서,
a) 서열 번호 23의 중쇄 가변 영역(VH) 아미노산 서열 및 서열 번호 24의 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열; 또는
b) 서열 번호 27의 중쇄 가변 영역(VH) 아미노산 서열 및 서열 번호 28의 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열을 포함하는 항체.
27) 실시 형태 1 내지 실시 형태 26 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 인간 인터페론-β (IFNβ)에 결합 또는 그를 중화하지 않는 항체.
28) 실시 형태 1 내지 실시 형태 27 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 인간 IFNαD에 결합 또는 그를 중화하지 않는 항체.
29) 실시 형태 1 내지 실시 형태 28 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 인간 항체이거나, 인간화 항체이거나, 인간-적응화 항체인 항체.
30) 실시 형태 1 내지 실시 형태 29 중 어느 한 실시 형태에 있어서, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 동형인 항체.
31) 실시 형태 1 내지 실시 형태 30 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 이중특이적인 항체.
32) 실시 형태 31에 있어서, BLyS, CD40L, IL-6, CD27, BDCA2, 또는 IL-12 또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체.
33) 실시 형태 1 내지 실시 형태 32 중 어느 한 실시 형태에 따른 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
34) IFNα 및/또는 IFNω의 증가된 생성과 연계된 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 실시 형태 1 내지 실시 형태 32 중 어느 한 실시 형태에 따른 항체 또는 실시 형태 33에 따른 약제학적 조성물.
35) IFNα 및/또는 IFNω의 증가된 생성과 연계된 질환이 면역-매개 염증성 질환이고, 임의로 여기서 면역-매개 염증성 질환이 전신 홍반 루푸스(SLE), 유형 I 당뇨병, 건선, 원발성 쇼그렌 증후군, 전신 경화증, 또는 류머티스 관절염인, 실시 형태 34에 따라 사용하기 위한 실시 형태 1 내지 실시 형태 32 중 어느 한 실시 형태에 따른 항체 또는 실시 형태 33에 따른 약제학적 조성물.
36) 환자가 유형 I 인터페론 시그니처를 나타내는, 실시 형태 34 또는 실시 형태 35에 따라 사용하기 위한, 실시 형태 1 내지 실시 형태 32 중 어느 한 실시 형태에 따른 항체 또는 실시 형태 33에 따른 약제학적 조성물.
37) 항체가 이중특이적 항체이고, 임의로 여기서 이중특이적 항체가 BLyS, CD40L, IL-6, CD27, BDCA2, 또는 IL-12 또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는, 실시 형태 34 내지 실시 형태 36 중 어느 한 실시 형태에 따라 사용하기 위한, 실시 형태 1 내지 실시 형태 32 중 어느 한 실시 형태에 따른 항체 또는 실시 형태 33에 따른 약제학적 조성물.
38) 환자에서 IFNω 및 IFNα 하위유형 IFNαB2, IFNαC, IFNαF, IFNαG, 및/또는 IFNαJ1과 IFNAR의 상호작용의 저해에 사용하기 위한, 실시 형태 1 내지 실시 형태 32 중 어느 한 실시 형태 또는 실시 형태 37에 따른 항체 또는 실시 형태 33에 따른 약제학적 조성물.
39) 환자가 면역-매개 염증성 질환을 가지며, 임의로 여기서 면역-매개 염증성 질환이 SLE, 유형 I 당뇨병, 건선, 원발성 쇼그렌 증후군, 전신 경화증, 또는 류머티스 관절염인, 실시 형태 38에 따라 사용하기 위한 항체 또는 약제학적 조성물.
40) 환자가 유형 I 인터페론 시그니처를 나타내는, 실시 형태 38 또는 실시 형태 39에 따라 사용하기 위한 항체 또는 약제학적 조성물.
41) 항체가 이중특이적 항체이고, 임의로 여기서 이중특이적 항체가 BLyS, CD40L, IL-6, CD27, BDCA2, IL-12 또는 IL-23의 p40 서브유닛, 또는 BDCA2에 결합하는, 실시 형태 38 내지 실시 형태 40 중 어느 한 실시 형태에 따라 사용하기 위한 항체 또는 약제학적 조성물.
이제 본 발명을 하기의 구체적인 비제한적 실시예를 참고로 하여 설명할 것이다.
실시예 1. 면역화, 파아지 패닝 , 항체 특성화, 및 결정학 연구에 사용된 인간 유형 I IFN 항원의 생성:
서열 번호 17 내지 21과 같은 신호 서열을 사용하는 표준 방법을 사용하여, 알파 A(알파 2a)(서열 번호 5), 알파 B2(알파 8)(서열 번호 6), 알파 C(알파 10)(서열 번호 7), 알파 D(알파 1)(서열 번호 8), 알파 F(알파 21)(서열 번호 9), 알파 G(알파 5)(서열 번호 10), 알파 H2(알파 14)(서열 번호 11), 알파 I(알파 17)(서열 번호 12), 알파 J1(알파 7)(서열 번호 13), 알파 K(알파 6)(서열 번호 14), 알파 4b(알파 4)(서열 번호 15), 알파 WA(알파 16)(서열 번호 16), 및 침팬지 IFN 오메가(침프 IFNω)(서열 번호 3)를 포함하는 12개의 개별 재조합 인간 유형 I IFN 알파를 HEK 293 세포 내에 발현시켰다. 17-21] 참조하라. 발현 수준 및 용해도를 개선하기 위하여, 인간 IFN 오메가 IFN-오메가(T80E)의 위치 80에 단일 아미노산 돌연변이체를 생성시키고 HEK 293 세포 내에 발현시켰다. T80E IFNω 변이체(서열 번호 2)는 야생형 단백질과 유사한 활성을 가지고 있었다.
실시예 2. IFNα 및 IFNω 결합 및 중화 항체의 생성
마우스 면역화
C2595의 생성
인간 IFN-알파, 침팬지 IFN-오메가, 및 시노몰구스 IFN-오메가의 혼합물로 BALB/c 마우스를 여러 번 복강내 면역화하였다. 제0일에, 침팬지 IFN-오메가로 마우스를 면역화하였다. 제14일에, 침팬지 및 시노몰구스 IFN오메가, 인간 IFNαD, IFNαJ1, IFNαC, IFNαB2, IFNαH2, IFNαA, IFNα4a, IFNαG, IFNαF, IFNαWA, 및 IFNαI의 혼합물로 동일한 마우스를 면역화하였다. 제208일에, 시노몰구스 IFN-오메가, 인간 IFNα4b, IFNαA, IFNαD, 및 IFNαK의 혼합물로 동일한 마우스를 면역화하였다. 제221일에, 시노몰구스 IFN-오메가, 인간 IFNαJ, IFNαI, IFNα4a, IFNαA, 및 IFNαF의 혼합물로 동일한 마우스를 면역화하였다. 면역화 후에 특이적 IgG 역가(titer)를 평가하였다. 일단 충분한 역가가 얻어졌으면, 비장세포를 단리하고 FO 세포와 융합시켰다. 생성된 하이브리도마를 96 웰 플레이트에 플레이팅하고 10 일 동안 배양하였다. ELISA를 이용하여 침팬지 IFN-오메가의 결합, 및 인간 IFNαA, IFNαH2, IFNαD, 및 IFNα4a의 혼합물의 결합에 대한 1차 스크리닝에 의해 먼저 항원 특이적 클론을 동정하였다. IFN-알파 및/또는 IFN-오메가에 대한 하이브리도마 결합을 루미넥스(Luminex) 다중 어세이에 의해 추가로 스크리닝하였다. 추가의 연구를 위해, 대부분의 IFN 알파 및 인간 및 시아노 IFN 오메가에 광범위하게 결합하는 클론을 선택하였다.
파아지 디스플레이 라이브러리
문헌[Shi et al., J. Mol. Biol. 397:385-396, 2010]; 국제 특허 공개 제WO2009/085462호; 미국 특허 공개 제US2010/0021477호; 미국 특허 공개 제US2012/0108795호에 기재된 신생(de novo) pIX 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 인간 유형 I IFN 결합 Fab를 선택하였다.
IFWM43의 선택
인간 야생형 IFN-알파 A 서열 C-말단 폴리-히스티딘 태그의 발현으로부터 생성된 정제된 유형 I IFN 알파 A(IFNα2)에 대해 pIX 파아지 디스플레이 라이브러리를 패닝하고 고정화 금속 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 3회의 패닝을 사용하였다. 제1회, 제2회, 및 제3회 패닝에 각각 100 nM, 10 nM, 및 1 nM의 바이오틴화 항원을 사용하였다. 3회의 패닝 후에 수확한 파아지미드 클론으로부터 유래된 단클론 Fab를, 그들의 침프 IFN 오메가, 인간 IFNα2, IFNα1, IFNαH2, IFNαG, IFNα F, 및 아비딘 결합에 대해 표준 ELISA로 1차 스크리닝하였다. ELISA에서 IFN 알파 및 IFN-오메가에 특이적으로 결합한 Fab 단편(Fab)을 서열분석하고, 그들이 상이한 V 영역 서열을 갖는 경우에 고유한 IFN 결합제로서 동정하였다. Fab를 인간 IgG1 mAb로 전환하고 항-염증성 활성의 동정에 관련된 다양한 세포-기반 어세이에서 그들의 중화 활성을 추가로 시험한 후에 IFN 결합제로서 동정하였다.
IFWM88의 동정
인간 야생형 IFN-알파 A 서열 C-말단 폴리-히스티딘 태그의 발현으로부터 생성된 정제된 유형 I IFN 알파 G(a5)에 대해 pIX 파아지 디스플레이 라이브러리를 패닝하고 고정화 금속 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 3회의 패닝을 사용하였다. 제1회, 제2회, 및 제3회 패닝에 각각 100 nM, 10 nM, 및 1 nM의 바이오틴화 항원을 사용하였다. 3회의 패닝 후에 수확한 파아지미드 클론으로부터 유래된 단클론 Fab를, 그들의 침프 IFN 오메가, 인간 IFNα2, IFNα1, IFNαH2, IFNαG, IFNαF, 및 아비딘 결합에 대해 표준 ELISA로 1차 스크리닝하였다. ELISA에서 IFN 알파 및 IFN-오메가에 특이적으로 결합한 Fab 단편(Fab)을 서열분석하고, 그들이 상이한 V 영역 서열을 갖는 경우에 고유한 IFN 결합제로서 동정하였다. Fab를 인간 IgG1 mAb로 전환하고 항-염증성 활성의 동정에 관련된 다양한 세포-기반 어세이에서 그들의 중화 활성을 추가로 시험한 후에 IFN 결합제로서 동정하였다.
생성된 항체의 가변 영역의 아미노산 서열은 하기와 같다: IFWM43 VH: 서열 번호 23; IFWM43 VL: 서열 번호 24; 및 IFWM88 VH: 서열 번호 25; IFWM88 VL: 서열 번호 26; C2595 VH: 서열 번호 27, C2494 VL: 서열 번호 28. C2595 가변 영역을 인간 IgG1 불변 영역에 전달하고 생성된 항체를 M3239라고 명명하였다. IFWM43은 또한 M43으로 지칭되고 IFWM88은 M88로 지칭된다.
실시예 3. IFN -α and IFN -ω 결합 및 중화 항체의 특성화
방법
친화도 측정
프로테온(캘리포니아주 허큘리스 소재의 바이오-라드(Bio-Rad))을 이용하는 SPR 기술을 사용하여 항체의 결합 친화도를 수행하였다. 제조자가 권장한 바와 같이 표준 NHS/EDC 화학을 사용하여 염소 항-인간 Fc 항체(제조)를 GLC 칩(캘리포니아주 허큘리스 소재의 바이오-라드)에 아민-커플링하였다. 이어서, 항체 커플링된 칩 상에 항-IFN mAb를 30 μl/min의 유속에서 2 분 동안 로딩하였다. 50 μl/ml의 유속에서 2 분 동안 러닝 완충액(running buffer)(완충액의 조성물)으로 세척한 후, 1:3 희석으로 100 nM 내지 1.23 nM 범위의 5가지 상이한 농도에서 재조합 IFN 항원을 3 분 동안 결합시키고 10 분 동안 해리시켰다(양자 모두 50 μl/ml의 유속에서). 상이한 항원의 러닝 사이에 각각의 방향으로 100 mM 인산을 이용하여 칩을 생성시켰다. 프로테온 매니저(ProteOn manager)(캘리포니아주 허큘리스 소재의 바이오-라드)를 사용하여 데이터 분석을 수행하였다. mAb에 의해 센서그램(sensorgram)을 분류하였다. 정렬 및 참조 보정(reference correction)(인터스팟(interspot) 또는 블랭크 채널 참조(blank channel referencing)를 사용함)을 적용한 후에, SPR 데이터를 동역학 속도 상수(KD = koff/kon, 여기서 KD는 평형 해리 상수이며, kon은 결합 속도 상수이고, koff는 해리 속도 상수임)에 대해 랭뮤어(Langmuir) 모델에 포괄적으로 적합시켰다.
ISRE 리포터 유전자 어세이("ISRE 리포터 유전자 어세이")
완전 활성 유형 I IFN 신호 경로를 발현하도록 조작되고(STAT2 및 IRF9를 안정적으로 발현함) IFN-α/β 유도성 ISG54 프로모터의 제어 하에 SEAP 리포터 유전자로 형질감염된 HEK-블루(상표) IFN-α/β 세포(캘리포니아주 산디에고 소재의 인비보젠)를 사용하였다. 콜라겐 유형 I로 코팅된 T150 플라스크에서 10% 우태아 혈청, 100 ug/ml 블라스티시딘, 및 30 ug/ml 제오신을 가진 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified eagle media) 중에 37℃, 5% CO2에서 세포를 성장시켰다. 세포를 수확하고 50 μl/웰에서 50,000 세포/ml로 384-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 플레이팅한 세포를 37℃, 5% CO2에서 24 hr 동안 인큐베이션하였다. 시험 인터페론 샘플을 제조하여 사용 후의 HEK ISRE 무혈청 배지에 희석하고, 50 μl의 IFN 샘플을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이팅한 세포를 37℃, 5% CO2에서 20 hr 동안 인큐베이션하였다. 여과된 물에 재현탁된 60 μl/웰의 퀀티-블루(QUANTI-Blue)(상표)를 이용하여 실온에서 20 min 동안 인큐베이션한 후에 20 μl의 플레이팅된 세포 상등액으로부터 알칼라인 포스파타아제를 검출하였다. 바이오텍 시너지(Biotek Synergy) 플레이트 판독기 상에서 650 nm에서 광학 밀도를 판독하였다.
일부 ISRE 리포터 유전자 어세이는 96-웰 플레이트에서 하기와 같이 실행되었다: HEK-블루(상표) IFN-α/β 세포(캘리포니아주 산디에고 소재의 인비보젠)를 50,000 세포/웰로 100 μl의 무선택 배지(selection free media)(DMEM + 글루타맥스(Glutamax)/10% FBS, 깁코(Gibco)) 중에 플레이팅하고 37℃에서 밤새 인큐베이션되게 하였다. 다음 날에, 유형 I IFN 저해제가 있거나 없는 유형 I IFN 자극제를 별도의 96 웰 U-바닥 전달 플레이트(U-bottom transfer plate)(BD 팔콘(BD Falcon))에 제조하고(즉, 재조합 인터페론, 백혈구 IFN, IC 유도 IFN 제제, 혈청 등) 37℃에서 10 분 동안 예열하였다. 인큐베이터로부터 1 플레이트의 세포를 수거하여 배지를 제거하고 96 웰 U-바닥 전달 플레이트에 제조한 적절한 처리제 100 μl로 대체하였다. 세포를 다시 37℃에 24 시간 동안 두었다. 다음 날에, 160 μl의 퀀티-블루(상표) SEAP 기질(인비보젠)을 함유하는 96 웰 평면 바닥 플레이트(BD 팔콘)에 40 μl의 상등액을 전달하였다. 약 15 분 동안 플레이트를 전개시키고 그 시간에 분광계를 사용하여 650 nm의 흡광도에서 그것을 판독하였다.
IP-10 방출 어세이:
몇몇 상이한 유형 I IFN 저해제를 동형 대조군과 함께 함유하는 96 웰 U-바닥 플레이트에 건강한 지원자로부터의 헤파린 첨가 전혈을 플레이팅하였다. 저해제 및 적절한 동형 대조군을 10% FBS를 가진 RPMI 배지에 희석하였다. IFN 및 저해제 또는 동형 대조군을 10% FBS를 함유하는 30 μl 부피의 RPMI 배지에 희석하였다. 샘플을 15 내지 20 분 동안 사전-인큐베이션한 후에 희석액을 함유하는 플레이트에 240 μl의 헤파린 첨가 전혈을 첨가하여 270 μl의 최종 부피가 되게 하였다. 샘플을 혼합하고 37℃에서 20 내지 22 시간 동안 인큐베이션되게 하였다. 인큐베이션 후에, 400Xg에서 5 분 동안 샘플을 회전시키고 이후의 분석을 위해 혈장을 수집하여 냉동하였다. 밀리플렉스 사이토카인/케모카인 키트(밀리포어, 프리믹스드 39 플렉스)에 의해 IP-10 프로파일링을 실행하였다. 바이오라드 모델(바이오플렉스(상표) 200) 시스템 및 바이오플렉스 매니저(Bioplex manager)(상표) 소프트웨어 4.1을 사용하여 제조자의 권장에 따라 샘플 제조 및 어세이를 수행하여 데이터를 얻었다. 그래프 패드 프리즘 V.5 소프트웨어에 의해 통계적 분석을 실행하였다. 일부 경우에는, 퀴아젠(Qiagen)으로부터의 단일 분석물 ELISA 키트를 사용하여 IP-10을 정량하였다.
SLE 전혈 유전자 시그니처 어세이:
SLE 공여자 전혈은 애스터랜드(Asterand)를 통해 구매하였다. IFN-자극 유전자(ISG: IFN-stimulated gene)에 대해 보강된 프라이머 및 탐침을 함유하는 주문제작 택맨 저밀도 어레이 카드(custom TaqMan low density array card)를 사용하여 전혈 유전자 발현 분석을 수행하였다. 어레이 상에 포함된 유전자는 하기와 같았다: ACTB, IL6, IL10, IL13, FAS, IL15, IL21, IL17A, EIF2AK2, OASL, 18S, STAT1, LY6E, PLSCR1, MX1, IFIT1, IFI44, IFI44L, IFI27, ISG15, RSAD2, CXCL10, LAG3, 및 TNFSF10. ABI 프리즘 7900 HT(ABI Prism 7900 HT) 서열 검출 시스템(미국 캘리포니아주 소재의 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)) 상에서 제조자의 지침에 따라 RT-PCR 증폭을 수행하였다. 비교 역치 주기(comparative threshold cycle)(Ct) 방법을 사용하여 상대적 발현 값을 계산하였다. 약술하면, 이 기술은 수학식 2-ΔΔCt를 사용하여 보정군(calibrator group)(정상적인 건강한 비처리 전혈)에 대해 정규화된 표적 유전자의 발현을 계산한다. 내인성 대조군으로서 베타 액틴(ACTB)을 선택하였다. 역치 주기(Ct)는 증폭된 표적의 양이 고정된 역치에 도달하는 주기 수를 나타낸다. 모든 인터페론-유도 표적 유전자 및 ACTB에 대한 Ct 데이터를 사용하여 ΔCt 값[ΔCt = Ct(표적 유전자)-Ct(ACTB)]를 생성하였다. 대조군(5명의 정상적인 건강한 비처리 전혈 공여자)의 평균을 각각의 표적의 ΔCt 값으로부터 감산함으로써 ΔΔCt 값을 계산하였다. 방정식 2-ΔΔC를 사용하여 상대적 발현 값을 계산하였다. 이 실험에서 3명의 SLE 공여자가 저밀도 어레이 상에서 ISG 중 9개에 대해 대조군보다 최소 2배 더 높은 유전자 발현을 가지고 있었다. 3명의 공여자 모두에 걸쳐 유형 I IFN 저해제의 효과를 비교하기 위해, 모든 치료/저해제에 대해 하기의 수학식을 사용하여 %저해를 먼저 결정하였다:
(2-ΔΔCt SLE 비처리 혈액 - 2-ΔΔCt 저해제 / 2-ΔΔCt SLE 비처리 혈액) x 100 = %저해. 그 다음에, 3명의 공여자 모두에 걸쳐 각각의 처리에 대한 %기준선을 하기의 수학식에 의해 계산하였다: 100 - %저해 = %기준선.
이어서, 치료군에 의해 분류된 3명의 공여자 모두의 평균 %기준선을 9개 유전자 각각에 대해 결정하였다. 비처리 SLE 군("SLE 혈액 단독")을 100으로 설정하여 이 군이 기준선으로부터 100%임을 표시하였다. 기준선은 0% IFN-유도 유전자 발현이 존재함을 표시한다. 최종적으로, 9개 유전자 모두에 걸쳐 각각의 치료군의 평균 및 표준편차를 결정하고 플로팅하였다. 스튜던트 T-검정을 수행함으로써 통계적 유의성을 결정하였다.
SLE 면역 복합체 제조:
SLE 환자 혈장은 사이팩(SCIPAC)(영국 켄트주 소재)으로부터 입수하였다. ISRE-기반의 리포터 유전자 어세이에 의해 결정할 때 유형 I IFN 활성을 갖는 혈장 샘플을 IgG 정제에 추가로 이용하였다. NAB(상표) 프로틴 A/G 스핀(Protein A/G Spin) 컬럼을 사용하여 제조자(써모 사이언티픽(Thermo SCIENTIFIC))가 권장하는 바와 같이 IgG를 정제하고 단백질 어세이를 실행하여 농도를 결정하였다(피어스 BCA(Pierce BCA)). 1X 인산 완충 식염수(PBS) 중에 5x107 세포/ml로 현탁된 HEK293T 세포를 사용하여 자가항원 용해물을 제조하였다. Hek293T 세포를 파쇄하기 위해, 30 분 이상의 초기 냉동을 제외하고는, -80℃에서의 10 분 이상 냉동 및 37℃에서의 해동의 4 주기 동안 냉동-해동을 수행하였으며; 냉동-해동 후에 원심분리(5 분 동안 400 g)에 의해 세포 잔해를 제거하고 단백질 어세이에 의해 가용성 항원 양을 정량하였다. 1:1 비율에서, 정제된 IgG 및 괴사성 세포 용해물을 RT에서 30 분 동안 함께 인큐베이션하여 면역 복합체를 형성하였다. 이어서, 웰 당 총 부피 4 ml의 PBMC 배지 중에 최종 농도 400 ㎍/ml의 면역 복합체를 6 웰 플레이트의 3개 웰에 첨가하였다. 건강한 공여자 IgG를 정제하고, 방금 기재된 것과 동일한 방식으로 "복합체화"하고, 대조군으로서 작용하는 PBMC를 자극하기 위해 사용하였다. 이들 연구로부터 조건화된 배지를 분액화하고 저해 실험을 위한 내인성 IFN의 공급원으로서 사용하였다. 건강한 지원자로부터 단리된 IgG로부터 제조된 제제에서는 IFN 활성이 나타나지 않았다.
결과
재조합 유형 I IFN에 대한 친화도 및 그의 중화
표 2는 개별 재조합 인간 유형 I 인터페론(IFN)에 대한 항체 M43, M88, 및 M3239의 해리 상수(KD)를 나타낸다. M43, M88, 및 C2595는 하기 4가지 이상의 IFNα 분자를 중화했다: 알파B2, 알파F, 알파G, 및 알파J1. 알파D에 대해서는 결합이 관찰되지 않았다.
표 3은 리포터 유전자 어세이에서 측정된 개별 재조합 인간 유형 I IFN에 대한 항체 M43, M88, 및 M3239(C2595)의 IC50 값을 나타낸다. M43은 10가지 이상의 IFNα 분자를 광범위하게 중화하고 저해했다. M3239는 pM 이하의 IC50으로 IFNω를 중화한 반면에, M43은nM 범위의 IC50으로 IFNω를 중화했다. M88은 그의 매우 약한 결합으로 인해 특이적 어세이에서 IFNω에 대한 중화 활성이 입증되지 않았다. 그러나, 친화도 성숙 후에는, M88로부터 유래된 항체는 그들의 광범위한 IFNα 중화 활성을 보유하면서 강력한 IFNω 중화 활성을 나타냈다(데이터는 나타내지 않음). 항체 중 어느 것도 IFNβ에 결합 또는 그를 중화하지 않았다.
[표 2]
Figure pct00003
[표 3]
Figure pct00004
내인성 유형 I IFN의 중화
내인성 백혈구 IFN(바이러스 유도) 또는 재조합 IFNω으로 자극한 인간 전혈로부터 케모카인 IP-10(CXCL10)의 방출을 평가하는 어세이에서 항체가 내인성 유형 I IFN을 중화하는 능력을 평가하였다. M43 및 C2595에서는 백혈구 IFN(도 1a) 및 재조합 IFNω(도 1b) 양자 모두의 용량-의존성 저해가 나타났으며, 이는 바이러스로 유도된 백혈구에 의해 생성된 것들과 같은 넓은 스펙트럼의 유형 I의 활성을 중화하는 항체의 능력을 시사한다. 내인성 백혈구 IFN은 시그마(Sigma)(카탈로그 번호 # I4784-1MU)로부터 구입하였다.
질환 연계 IFN 환경의 중화
SLE에 존재하는 유형 I IFN 환경을 더 잘 나타내기 위하여, 자극으로서의 SLE 면역 복합체-유도 IFN을 감소시키는 항체의 능력에 대해 항체를 시험하였다. 인간 PBMC를 SLE 환자-유래의 면역 복합체로 자극함으로써 SLE 면역 복합체-유도 IFN을 제조하고 이러한 조건화된 배지를 저해제 mAb 및 대조군 mAb의 존재 하에 유형 I IFN-유도성 리포터 유전자 어세이(상기 기재된 바와 같은 ISRE 리포터 유전자 어세이)에 이용하였다. 3가지의 상이한 IFNα 길항제 mAb와 병용하여 선택적 IFNω 중화 mAb를 첨가하는 것은 등가 양의 동형 대조군 mAb의 존재 하의 항 IFNα mAb에 비교하여 면역 복합체-유도 IFN의 총 활성을 추가로 감소시켰다(도 2). 추가로, 항 IFNα/ω mAb M43은 IFNα 저해제 mAb에 비교하여 추가의 활성 억제를 입증하였으며, 이는 IFNα 및 IFNω의 이중 차단이 IFNα 중화 단독보다 더 많은 총 IFN 활성을 감소시킬 수 있다는 것을 시사한다(도 2).
IFNω는 SLE 연계 IFN 환경에 기여한다
9가지의 IFN-유도 유전자의 조합을 이용하여 상기 기재된 바와 같이 SLE 유전자 시그니처에 대한 어세이를 개발하였다. 유전자 시그니처를 저해하는 다양한 항체의 능력을 시험하였다. IFNω 특이적 길항제 mAb(항-ω)는 등가 농도의 동형 대조군 mAb에 비교하여 IFN 시그니처를 하향조절하였으며, 이는 IFN-ω가 SLE에서 IFN 시그니처를 유도하는 활성 유형 I IFN 환경의 일부임을 시사한다. IFNω 항체와 IFNα 항체의 조합은 IFNα 또는 IFNω 저해제 단독보다 이들 환자의 혈액 내에 영속하는 IFN 시그니처의 더 확연한 억제를 유발했다(도 3).
실시예 4. 경쟁적 에피토프 맵핑
옥테트(캘리포니아주 먼로 파크 소재의 포르테바이오)를 사용하는 실시간 무표지 경쟁적 결합 어세이를 사용하여 에피토프 결합 실험을 수행하였다. 하기의 2가지 어세이 체제를 사용하였다: 직렬 어세이 체제(in tandem assay format) 및 고전적 샌드위치 어세이 체제(classic sandwich assay format).
직렬 어세이 체제에서는 실시간 동역학 신호를 측정하는 동안 스트렙타비딘 바이오센서 팁(캘리포니아주 먼로 파크 소재의 포르테바이오)을 0.5 ㎍/ml의 바이오틴화 재조합 인터페론 내에 5 분 동안 침지시켰다. 이어서, 팁을 제1 세트의 mAb(10 ㎍/ml) 내에 15 분 동안 침지시켰다. 그 후에 팁을 제2 세트의 mAb(10 ㎍/ml) 내에 추가의 10 분 또는 15 분 동안 침지시켰다. 제2 세트의 mAb 내에 침지된 팁으로부터의 양성 결합 신호는 제1 세트의 mAb로부터의 상이한 에피토프에 대한 그들의 결합을 나타내고, 음성 신호는 동일한 에피토프에 대한 그들의 결합을 나타낸다. 2개 세트의 mAb의 친화도 차이로 인한 오류 결과를 제거하기 위하여, 역순으로 실험을 반복하였다(즉, 팁을 제2 세트의 mAb 내에 먼저 침지시킨 후에 제1 세트의 mAb에 침지시킴). 1 mg/ml BSA 및 0.02% 트윈(Tween) 20을 가진 PBS에 모든 항체 및 항원을 희석하였다.
고전적 샌드위치 어세이 체제에서는, 표준 NHS/EDC-매개 화학을 사용하여 제조자의 프로토콜(캘리포니아주 먼로 파크 소재의 포르테바이오)에 따라 제1 세트의 mAb를 아민 반응성 바이오센서 팁 상에 커플링하였다. 에탄올아민 중에 5 분 동안 켄칭(quenching)한 후에, 팁을 재조합 인터페론(2 ㎍/ml) 내에 10 분 동안 침지시킨 후, 그들을 제2 세트의 mAb(15 ㎍/ml) 내에 10 분 또는 15 분 동안 침지시켰다. 커플링 mAb는 MES 완충액 6.0에 희석한 반면에, 비닝(binning) mAb 및 항원은 1 mg/ml BSA 및 0.02% 트윈 20을 가진 PBS에 희석하였다.
하기의 항체를 사용하는 양자 모두의 어세이 체제를 사용하여 3가지 에피토프 비닝 실험을 수행하였다: M43, M88, 및 C2595(다중 IFNα 하위유형 및 IFNω에 결합함), C2601 및 M42(IFNω에 결합하나 IFNα 하위유형에는 약하게 결합함), 및 C2605(다중 IFNα 하위유형에 결합하나 IFNω에는 결합하지 않음). 경쟁 어세이에서 다양한 IFN-α 분자를 시험하였다(인간 IFNα 하위유형 IFNαA, IFNαB, IFNαC, IFNαF, IFNαG, IFNαH, IFNαJ, IFNα2, IFNα4a와 더불어, 침프 IFNω 및 인간 IFNAR2-Fc 분자).
표 4는 M43의 존재 하의 경쟁의 결과를 나타내고, 표 5는 IFNAR2-Rc의 존재 하의 경쟁을 나타낸다. M43과 M88은 모든 시험 IFNα 분자 및 침프 IFNω에 대한 결합에 대해 서로 경쟁하였다. IFNω에 결합하지 않는 M42는 시험 IFN- 분자에 대한 결합에 대해 M43과 경쟁하지 않았다. M43은 침프 IFNω 및 다양한 IFNα 분자에 대한 결합에 대해 C2595 및 IFNAR-Fc와 경쟁하였다. C2605는 대부분의 IFNα에 대한 결합에 대해 M43과 경쟁하지 않았으며, 이는 2가지 항체가 상이한 에피토프에 결합한다는 것을 시사한다. 강력한 IFNω 결합제이지만 약한 IFNα 결합제인 C2601은, IFNω에 대한 M43과의 결합에 대해 M43과 경쟁하지 않았으며, 이는 2개 항체가 별개의 에피토프에 결합한다는 것을 시사한다. C2595는 침프 IFNω 및/또는 IFNαA에 대한 결합에 대해 IFNAR2-Fc와 경쟁하였으나, C2601 또는 C2605는 그렇지 않았다. IFNω 및 다중 IFNα 하위유형에 결합하므로 별개의 에피토프 빈(bin)을 정의하는 항체는 하기와 같다: 빈A: mab M43, M88, C2595. IFNα 또는 IFNω에만 결합하는 항체는 별개의 에피토프 빈(들)을 형성한다.
[표 4]
Figure pct00005
[표 5]
Figure pct00006
실시예 5. IFNω T80E 돌연변이체와의 복합체 내의 항- IFNα /ω 항체 M43의 결정 구조로부터 유래된 M43의 에피토프
IFWM43(이하, mAb 및 Fab에 대해 각각 M43 및 FabM43)은 인간 IFNα 분자 및 IFNω를 광범위하게 중화하며 다수의 IFNα 하위유형 및 인간 IFNω에 대한 결합을 나타낸다. IFNα 하위유형 및 IFNω에 대한 그의 특이성에 대한 구조적 기반을 규명하기 위하여, FabM43과의 복합체 내의 IFN-ω의 결정 구조를 결정하였다.
재료 및 방법
단백질
His-태깅된 FabM43(IgG1/κ 동형) 및 T80E 돌연변이를 가진 인간 IFNω(본 실시예에서 IFNω와 IFNωT80E는 동의어임)를 HEK293F 세포에서 발현시키고 친화도 및 크기-배제 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 단백질은 20 mM 트리스 pH 7.4, 50 mM NaCl 중에 있었다.
IFNω/FabM43 복합체의 결정화
IFNω와 FabM43을 1.05:1.0의 몰 비율(과량의 IFNω)로 혼합함으로써 복합체를 제조하고, 20 mM Na 아세테이트, pH 5.5, 0.1 M NaCL, 및 10% 글리세롤로 평형시킨 수퍼덱스(Superdex) 200 컬럼 상에서 정제하였다. 아미콘-울트라(Amicon-Ultra) 10 kDa 컷오프를 사용하여, 정제된 복합체를 10.24 mg/ml로 농축하였다. 기재된 바와 같이 MMS 시딩을 가진 0.1 M MES, pH 6.5, 26% PEG 3350, 1 M LiCL, 0.7% 1-부탄올로부터 시팅 드롭(sitting drop) 내에, X-회절에 적합한 결정을 얻었다(Obmolova et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66:927-33, 2010).
X-선 데이터 수집 및 구조 결정
X-선 데이터 수집을 위하여, 20% 글리세롤로 보충된 합성 모액(0.1 MES pH 6.5, 20% PEG 3350, 1 M LiCL) 중에 수초 동안 결정을 침지시키고, 액체 질소 중에 급속 냉동하였다. 스위스 광원에서 X-선 회절 데이터를 수집하였다. 프로그램 XDS(Kabsch, Acta Crystallographica 66:125-132, 2010)으로 X-선 데이터를 처리하였다. X-선 데이터 통계는 표 6에 제공되어 있다.
페이저(Phaser)를 이용하는 분자 대체(MR: molecular replacement)에 의해 구조를 해석하였다(문헌[Acta Crystallogr D Bio Crystallogr 57:1373-82, 2001]을 참조한다). MR을 위한 검색 모델은 Fab15(PDB ID 3NCJ; Luo et al., J Mol Biol 402:708-719, 2010) 및 IFN-α2(PDB ID 1RH2; Radhakrishnan et al., Structure 4:1453-1463, 1996)의 결정 구조였으며, 그의 Cα 모델은 PDB에서 입수가능했다. MR에 사용하기 위하여, PDB 내의 Cα 좌표 및 반사 데이터(reflection data)와 함께 페이저를 사용하는 MR에 의해 IFN-α2의 완전한 분자 모델을 얻고, 피닉스(PHENIX)로 정밀화하였다(Adams et al., J Syncrhrotron Radiat 11:53-55, 2004). 피닉스를 사용하여 IFN-ω/FabM43 구조를 정밀화하고, COOT를 사용하여 모델 조정을 실행하였다(Emsley and Cowtan, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 60:2126-2132, 2004). 모든 다른 결정학적 계산은 CCP4 프로그램 스위트를 이용하여 수행하였다(Collaborative Computational project, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 53:240-255, 1994). 가변 도메인과 불변 도메인 사이의 관절각(elbow angle)은 프로그램 RBOW를 이용하여 계산하였다(Stanfield et al., J Mol Biol 357:1566-1574, 2006). 분자 그래픽은 파이몰(PyMol)을 이용하여 생성하였다(DeLano, Palo Alto, CA, USA, Delano-Scientific). 구조 정밀화 통계는 표 6에 제공되어 있다.
[표 6]
Figure pct00007
Figure pct00008
결과
전체적 구조
비대칭 단위 내에는 6개의 IFNω/FabM43 복합체가 존재한다. 이들 복합체 모두는 매우 유사하다. IFNω/FabM43 복합체의 대표적인 전체적 분자 구조를 도 4에 나타낸다. 도면에서, 표시된 H는 VH이고; 표시된 L은 VL이며, 좌상단은 IFNω이다.
IFNω 분자는 0.35 Å 미만의 평균 Cα rmsd로 본질적으로 동일한 입체형태를 갖는다. IFNω의 분자 구조는 0.53 Å의 평균 Cα rmsd로 IFN-α2와 매우 유사하고 공개된 IFN-ω(pdb id 3se4)(0.47 Å의 Cα rmsd를 가짐) 및 IFNβ(94개 잔기에 대해 Cα rmsd 0.85 Å)와 거의 동일한 나선 번들이다. 그러나, IFNβ AB 루프가 1개 잔기 만큼 더 짧기 때문에 IFNα/ω와 IFN-β 사이에는 일부 현저한 차이가 존재한다. 약간 상이한 골격 입체형태를 취하는 CDR-H1(G26GTF29)(서열 번호 33) 내의 짧은 연장부를 제외하고는, Fab 분자 또한 동일한 구조를 갖는다.
에피토프, 파라토프, 및 Ab/Ag 상호작용
M43은 AB 루프의 잔기(R22와 Q40 사이) 및 나선 E의 잔기 K134, M146, M149, K150, F153, 및 L154로 구성된 입체형태 에피토프를 인식한다(표 7). 파라토프는 6개 CDR 중 5개로부터의 잔기로 구성된다. 파라토프 잔기는 주로 소수성이며, 이는 일련의 포켓을 형성하고 그 안에 짧은 AB 나선의 잔기 F27, L30, K31, 및 R33의 측쇄를 도킹한다. 항체 및 항원 상호작용은 주로 vdw 및 소수성 패킹인 것으로 보인다. 항체와 항원 사이에는 단지 적은 수의 H 결합이 존재하고, 그들 중 대부분이 골격-골격 또는 측쇄-골격 상호작용을 수반한다. AB 나선의 몇몇 잔기 F27, L30, K31, 및 R33은 대다수의 Ab/Ag 상호작용을 설명한다. 따라서, IFNω의 이러한 영역은 에피토프의 주요 부분을 구성하는 것으로 보인다.
[표 7]
Figure pct00009
Figure pct00010
결합 파트너의 3.9 Å 이내에 있는 모든 잔기는 접촉 잔기로 간주된다. 항체 VL 및 VH 잔기는 순차적으로 번호화된다.
항체 중화의 방식
IFNΑR1 및/또는 IFNΑR2와의 복합체 내의 IFNα/ω의 결정 구조가 최근에 보고되었다(Thomas et al., Cell 146:621-632, 2011). M43/IFNα4 구조와 IFNω/IFNΑR1/IFNΑR2 복합체의 비교는 M43 중쇄와 IFNΑR2가 중첩될 것임을 명확하게 시사한다. 따라서, M43은 IFNΑR2/IFN 상호작용을 차단함으로써 중화한다.
실시예 6. IFNωT80E 또는 IFNα4A와의 복합체 내의 Fab357(C2595의 Fab)의 결정 구조로부터의 C2595의 에피토프
C2595(이하, mAb 및 Fab에 대해 각각 C2595 및 Fab357)는 다중 인간 IFN-α 분자 및 마우스 하이브리도마로부터 얻어진 IFNω를 중화하는 항체이다. V 영역을 클로닝하고 인간 중쇄 및 경쇄(IgG1κ 동형) 상에 키메라화(chimerize)하여 재조합 Fab357을 생성하였다. IFN-ω/Fab357 및 IFN-α4A/Fab357 복합체의 결정 구조를 결정하였다.
재료 및 방법
단백질
His-태깅된 Fab357(IgG1/κ 동형) 및 T80E 돌연변이를 가진 인간 IFNω(이하, 본 실시예에서 IFNωT80E, IFNω, 및 T80E를 가진 IFNω는 동의어임)를 HEK293F 세포에서 발현시키고 친화도, 및 크기-배제 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 단백질은 20 mM 트리스 pH 7.4, 50 mM NaCl 중에 있었다.). IFNα4A는 크라운 바이오사이언스 인코포레이티드(Crown Bioscience Inc.)로부터 20 mM 트리스 pH 7.4, 50 mM NaCl 중에 입수되었다.
FNα4A/Fab357 및 IFNω/Fab357 복합체의 결정화
IFNα4A와 Fab357을 1.05:1.0의 몰 비율로 혼합함으로써 IFNα4A/Fab357 복합체를 제조하고, 0.1 M NaCL을 가진 20 mM MES pH 6.5 중에 수퍼덱스 200 컬럼 상에서 정제하였다. 정제된 복합체를 5.5 mg/ml로 농축하였다. 시딩을 가진 단백질 용액 및 20% PEG 3350 및 0.2 M 암모늄 시트레이트의 동등 혼합물(equal mixture)로 구성된 시팅 드롭 내에서 회절 품질 결정(diffraction quality crystal)을 성장시켰다.
IFNω와 Fab357을 1.17:1.0의 몰 비율(과량의 IFNω)로 혼합함으로써 IFNω/Fab357 복합체를 제조하고, 4℃에서 2 시간 동안 인큐베이션하고, 20 mM HEPES pH 7.5, 0.1 M NaCL로 평형시킨된 수퍼덱스 200 컬럼(GE 헬스케어(GE Healthcare)) 상에서 IFNω/Fab357 복합체를 정제하고, 6.8 mg/ml로 농축하였다. 시딩을 가진 단백질 복합체 및 100 mM MES pH 6.5, 18% PEG 3K, 0.2 M LiCl의 동등 혼합물로 구성된 시팅 드롭으로부터 X-회절에 적합한 결정을 얻었다.
X-선 데이터 수집 및 구조 결정
X-선 데이터 수집을 위하여, 20% 글리세롤로 보충된 합성 모액(각각 20% PEG 3350, 0.2 M 암모늄 시트레이트, 플레이트 10/20/11-MMS-A10; 0.1 MES pH 6.5, 18% PEG 3350, 0.2 M LiCL, 플레이트 12/21/2011-B11(R)) 중에 IFNα4A/Fab357 및 IFNω/Fab357의 결정을 수초 동안 침지시키고, 액체 질소 중에 급속 냉동하였다. 각각 아르곤 국립 연구소(Argonne National Lab)의 첨단 광자원(Advance Photon Source) 및 스위스 광원에서 X-선 회절 데이터를 수집하였다. 프로그램 XDS로 X-선 데이터를 처리하였다. X-선 데이터 통계는 표 8에 제공되어 있다.
페이저를 이용하는 분자 대체(MR)에 의해 구조를 해석하였다. MR을 위한 검색 모델은 M43과의 복합체 내의 Fab15(PDB ID 3NCJ) 및 IFNω의 결정 구조였다. 피닉스5를 사용하여 구조를 정밀화하였으며, COOT를 사용하여 모델 조정을 실행하였다. 다른 모든 결정학적 계산은 CCP4 프로그램 스위트를 이용하여 수행하였다. 분자 그래픽은 파이몰을 이용하여 생성하였다. 구조 정밀화 통계는 표 8에 제공되어 있다.
[표 8]
Figure pct00011
Figure pct00012
결과
전체적 구조
양자 모두의 결정 구조에서 비대칭 단위 내에 하나의 항원/항체 복합체가 존재한다. 대표적인 전체적 분자 구조를 도 5에 나타낸다. 양자 모두의 결정에서 Fab 분자는 매우 유사하다. IFNα4A 입체형태는 IFNα4A/FabM88에서의 것과 매우 유사하다. IFNω/Fab357 구조의 경우, IFNω 모델은 잔기 R22 내지 P39 및 L118 내지 L154만을 포함한다. IFNω의 누락 잔기는 결정 내의 무질서의 결과가 아니며, 이는 결정 패킹이 그들의 존재를 방해하기 때문이다. 분명하게 결정화 중에 IFNω의 단백질 가수분해성 절단이 발생한 것으로 보인다. 결정 내에서 동정된 것과 패턴이 동일하지는 않았지만, 콜드 박스 내에서 동일한 복합체 시팅의 일부가 약간의 프로테아제 분해를 겪었다는 증거가 있었다(데이터는 나타내지 않음). 그럼에도 불구하고, IFNω의 결합 영역이 잘 정리되었다.
에피토프, 파라토프, 및 Ab/Ag 상호작용
C2595는 AB 루프의 잔기(R/G22와 R/H34 사이) 및 나선 E의 잔기 V143, M/A146, E147, 및 R/K150으로 구성된 IFNα4A 및 IFNω 양자 모두 상의 거의 동일한 입체형태 에피토프를 인식한다(표 9). 파라토프는 6개 CDR 중 4개(CDR-L1, L3, H2, 및 H3)로부터의 잔기로 구성된다. 파라토프 잔기는 주로 소수성이며, 이는 일련의 포켓을 형성하고 그 안에 짧은 AB 나선의 잔기 F27, L30, K31, 및 R33의 측쇄를 도킹한다. 항체 및 항원 상호작용은 주로 vdw 및 소수성 패킹인 것으로 보인다. 항체와 항원 사이에는 단지 적은 수의 H 결합이 존재하고, 그들 중 대부분이 골격-골격 또는 측쇄-골격 상호작용을 수반한다. AB 나선의 몇몇 잔기 F27, L30, K31, 및 R33은 대다수의 Ab/Ag 상호작용을 설명한다. 따라서, IFNω의 이러한 영역은 에피토프의 주요 부분을 구성하는 것으로 보인다.
[표 9]
Figure pct00013
결합 파트너의 3.9 Å 이내에 있는 모든 잔기는 접촉 잔기로 간주된다. 항체 VL 및 VH 잔기는 순차적으로 번호화된다.
항체 중화의 방식
C2595 는 IFNΑR2/IFN 상호작용을 차단함으로써 중화한다.
실시예 7. IFNα4A와의 복합체 내의 항- IFNα 항체 M88의 결정 구조로부터 유래된 M88의 에피토프
IFNα4A와의 복합체 내의 항-IFN 항체 M88의 결정 구조를 2.5 Å까지 결정하였다. 주요 에피토프는 IFN의 AB 루프의 나선형 요소 A19 내지 D35이다. M88의 결합은 IFNAR2 상호작용을 방지할 것이다. 따라서, M88은 IFNΑR2 차단제이다. 그 구조는 M88 결합 교차-반응성을 설명한다.
IFWM88(이하, mAb 및 Fab에 대해 각각 M88 및 FabM88)은 인간 IFNα를 중화하는 항체이다. M88 mAb는 다수의 IFNα 하위유형에 대한 결합을 나타내나, 인간 IFNω에 대한 결합은 거의 나타내지 않는다.
재료 및 방법
단백질
His-태깅된 FabM88(IgG1/카파 동형)을 클로닝하여 HEK293F 세포에서 발현시키고 친화도, 및 크기-배제 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. Fab는 20 mM 트리스 pH 7.4, 50 mM NaCl 중에 수용되었다. IFNα4A는 크라운 바이오사이언스 인코포레이티드로부터 입수되었다(20 mM 트리스 pH 7.4, 50 mM NaCl 중에).
IFNα4A/FabM88 복합체의 결정화
IFNα4A와 FabM88을 1.05:1.0의 몰 비율(과량의 FNα4A)로 혼합함으로써 복합체를 제조하고, 4 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하고, 20 mM 트리스 pH 8.0, 10% 글리세롤, 0.1M NaCl로 20배 희석한 후, 아미콘-울트라 10 kDa 컷오프를 사용하여 9.25 mg/ml까지 농축하였다. IH1, IH2, 및 PEG 스위트(퀴아젠)로 초기 결정화를 시작하였다. 오릭스4 로봇(더글라스 인스트루먼츠(Douglas Instruments))를 사용하여 20℃에서 증기-확산 방법에 의해 복합체의 결정화를 실행하였다. IH2#E12- 25% PEG 3K, 0.2 M 암모늄 시트레이트로부터 결정이 생겼다. 이들 초기 결정을 사용하여 결정화 시드를 제조하였다. 결정 품질을 개선하기 위하여, 20 mm MES pH 6.5, 0.1 M NaCl, 10% 글리세롤로 평형시킨 수퍼덱스 200 컬럼(GE 헬스케어) 상에서 IFNα4A/FabM88 복합체를 정제하고 8.16 mg/ml로 농축하였다. 기재된 바와 같이 MMS 시딩을 가진 28% PEG 3K, 0.2 M 암모늄 시트레이트로부터 X-회절에 적합한 결정을 얻었다(Obmolova et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66:927-935, 2010).
X-선 데이터 수집 및 구조 결정
X-선 데이터 수집을 위하여, 20% 글리세롤로 보충된 모액 중에 수초 동안 1개의 결정을 침지시키고, 95 K에서 질소 스트림 중에 급속 냉동하였다. 오스믹(Osmic)(상표) 배리맥스(VariMax)(상표) 공초점 광학계, 새턴(Saturn) 944 CCD 검출기, 및 X-스트림(X-stream)(상표) 2000 극저온냉동 시스템(텍사스주 소재의 리가쿠(Rigaku))이 장착된 리가쿠 마이크로맥스(Rigaku MicroMax)(상표)-007HF 미세초점 X-선 발생기를 사용하여 X-선 회절 데이터를 수집하였다. 235° 결정 회전에 걸쳐 0.5 도 영상(half-degree image)으로 회절 강도를 검출하였다. 프로그램 XDS로 X-선 데이터를 처리하였다. X-선 데이터 통계는 표 10에 제공되어 있다.
페이저를 이용하는 분자 대체(MR)에 의해 구조를 해석하였다. MR을 위한 검색 모델은 Fab15(PDB ID 3NCJ) 및 IFNα2(PDB ID 1RH2)의 결정 구조였으며, 그의 Cα 모델은 PDB에서 입수가능했다. MR에 사용하기 위하여, PDB 내의 Cα 좌표 및 반사 데이터와 함께 페이저를 사용하는 MR에 의해 IFNα2의 완전한 분자 모델을 얻고, 피닉스로 정밀화하였다. 피닉스를 사용하여 IFNα4A/FabM88 구조를 정밀화하였으며, COOT를 사용하여 모델 조정을 실행하였다. 다른 모든 결정학적 계산은 CCP4 프로그램 스위트를 이용하여 수행하였다. 가변 도메인과 불변 도메인 사이의 관절각은 프로그램 RBOW를 이용하여 계산하였다. 모든 분자 그래픽은 파이몰을 이용하여 생성하였다. 구조 정밀화 통계는 표 10에 제공되어 있다.
[표 10]
Figure pct00014
Figure pct00015
결과
전체적 구조
IFNα4A/FabM88 복합체의 전체적 분자 구조를 도 6에 나타낸다. 비대칭 단위 내에는 2개의 이들 복합체가 존재한다. 2개의 독립적인 IFNα4A 분자에 대한 분자 모델은, 하나에 대해서는 잔기 7 내지 102 및 113 내지 160을 포함하고, 다른 하나에 대해서는 12 내지 102 및 113 내지 160을 포함한다. 양자 모두의 분자에서 잔기 103과 112 사이의 연결 루프는 무질서화된다. 2개의 Fab 분자는 경쇄에 대해서는 1 내지 212의 잔기를 함유하고 중쇄에 대해서는 1 내지 221의 잔기를 함유한다. C-말단 6xHis 태그 및 쇄간(inter-chain) 다이설파이드 결합은 무질서화된다.
2개의 IFNα4A 분자는 122개 Cα 원자에 대해 0.132 Å의 평균 rmsd로 본질적으로 동일한 입체형태를 갖는다. 2개의 Fab 분자는 또한, 전체 Fab에 대해 0.5 Å 미만의 평균 rmsd로 동일한 구조를 갖는다. 흥미롭게도, 2개의 Fab는 RBOW에 따른 관절각(172 도 및 174 도)이 거의 동일하다.
IFNα 구조
IFNα4A의 분자 구조(도 7a)는 0.5 내지 0.7 Å의 평균 Cα rmsd로 IFNα2와 매우 유사하다. 그것은 또한 IFNω(도 7b, 112개 잔기에 대해 0.61 Å의 Cα rmsd) 및 IFNβ(도 7c, 94개 잔기에 대해 0.85 Å의 Cα rmsd)와 매우 유사하다. IFNα/ω와 IFNβ 사이에는, IFNβ AB 루프에서 1개 잔기가 더 짧음으로 인한 일부 현저한 차이가 있다(도 7d).
에피토프, 파라토프, 및 Ab/Ag 상호작용
M88은 AB 루프의 잔기(A19와 D35 사이) 및 나선 E의 잔기 V143, A146, E147, 및 R150으로 구성된 입체형태 에피토프를 인식한다(표 11). 파라토프는 6개 CDR 모두로부터의 잔기로 구성된다. 파라토프 잔기는 주로 소수성이며, 이는 일련의 포켓을 형성하고 그 안에 짧은 AB 나선의 잔기 F27, L30, K31, 및 R33의 측쇄를 도킹한다. 항체 및 항원 상호작용은 주로 vdw 및 소수성 패킹인 것으로 보인다. 항체와 항원 사이에는 단지 적은 수의 H 결합이 존재하고, 그들 중 대부분이 골격-골격 또는 측쇄-골격 상호작용을 수반한다. AB 나선의 몇몇 잔기 F27, L30, K31, 및 R33은 대다수의 Ab/Ag 상호작용을 설명한다. 따라서, IFNα4A의 이 영역은 에피토프의 주요 부분을 구성한다. 구조 내에서 VL의 F50은 항원과 직접 접촉되어 있지 않다. 그러나 그의 측쇄는 결합에 관련된 Y32(VL) 및 P105(VH)의 부근에 있다. 아마도 이 잔기는 결합을 지원하기 위한 그의 CDR-H3 국소 구조 지지로 인해 선택되었을 것이다.
[표 11]
Figure pct00016
결합 파트너의 3.9 A 이내에 있는 모든 잔기는 접촉 잔기로 간주된다. 항체 VL 및 VH 잔기는 순차적으로 번호화된다. LHI 및 ABJ는 2개의 복합체를 나타낸다.
교차-반응성 및 친화도에 대해 개선하기 위한 라이브러리의 구조-기반 설계
M88은 다수의 IFNα 하위유형에 강력하게 결합하나, IFNω에는 약하게 결합한다. 현재의 복합체 구조와 더불어 IFNω 구조를 사용하는 분자 모델링에 기초하여 2가지 전략이 가능하다. 하나의 전략은 IFNα4A/M88 구조 내의 현재의 접촉 모두를 유지하면서 부가적 Ab/Ag 상호작용을 생성함으로써 CDR-L1을 연장하는 것이다(extL1 라이브러리). 구조적 비교 및 서열 비교는, 5개 잔기 표면 패치(surface patch)(D32, H34, D35, Y130, 및 K134)가 모든 IFNα 하위유형 사이에 100% 보존됨을 나타낸다(표 12).
[표 12]
Figure pct00017
IFNω에 H34 대신에 R34가 있는 점을 제외하고는, 이들 5개 잔기 중 4개가 또한 보존된다. CDR-L1은 이러한 잘 보존된 표면 패치로부터 멀리 있다. 따라서, 예를 들어, 3-1-1 표준 구조로 부가적 6개 잔기를 갖는 생식세포계열 IGKV4-1(B3)의 것과 같은 더 긴 CDR-L1은 이 패치에 접촉할 만큼 충분히 길 것이라는 가설이 성립한다. 더 긴 CDR-L1은 모든 IFNα 하위유형 및 IFNω에 대한 부가적 상호작용을 제공함으로써 친화도 및 특이성 확장 양자 모두를 개선할 것이다. 라이브러리로부터의 파아지 디스플레이에 의해 연장된 CDR-L1의 서열을 최적화할 수 있다. 파아지 디스플레이 라이브러리 상의 설계는 표 13에 나타낸다. 항원으로부터 다른 쪽을 면하는 extL1의 위치는 무작위화되지 않는다. VL의 위치 F50은 유일한 비-인간 생식세포계열 잔기이다. 구조적으로 그것은 CDR-L3에 대한 지지를 제공하는 것으로 보인다. 따라서, 그의 연장된 CDR-L1 지지를 최적화하기 위하여, 이 위치 또한 무작위화된다.
[표 13]
Figure pct00018
항체 중화의 방식
IFNΑR1 및/또는 IFNΑR2와의 복합체 내의 IFNα/ω의 결정 구조가 최근에 보고되었다(Thomas et al., Cell 146:621-632, 2011). 도 8은 IFNω/IFNΑR1/IFNΑ2 복합체 상의 M88/IFNα4의 오버레이를 나타낸다. HC 및 IFNΑR2가 중첩될 것임이 명확하다. 따라서, M88은 IFNΑR2/IFN 상호작용을 차단함으로써 중화한다.
실시예 8. IFNα 및 IFNω 상의 최소 에피토프는 광범위 IFNα / IFNω 중화 활성을 제공한다
IFNωT80E/FabM43, IFNα4A/FabM88, IFNα4A/Fab357(c2595), 및 IFNω/Fab357의 결정 구조는 IFNω 및 다중 IFNα 하위유형의 광범위 중화에 필요한 최소 공통 에피토프를 정의한다(표 14). 4개 결정 구조의 항체/항원 상호작용의 분석은, IFNα4a(서열 번호 19) 및 IFNω(서열 번호 1) 내의 AB 루프 내의 3개 잔기, F27, L30, 및 R33이 항체와 광범위한 접촉을 형성한다는 것을 시사한다. 이들 잔기는 항체 결합에 뚜렷한 기여를 제공할 것으로 예상된다. 따라서, F27, L30, 및 R33은 IFNω/IFNα 교차-중화 에피토프의 중심 요소이다.
입체형태 에피토프는 짧은 나선형 세그먼트(27 내지 29)를 가진 AB 루프로부터의 잔기(서열 번호 1의 IFNω 및 서열 번호 19의 IFNα4a의 잔기 22 내지 34) 및 나선형 E 내의 잔기(134 내지 154는 IFNα2(이는 133 내지 153임)를 제외한 모든 IFNα 하위유형 및 IFNω에 대한 나선형 E 동일 잔기임)로 구성된다. 특히, 서열 번호 1의 IFNω의 위치 P26, F27, L30, K31, R33, 및 H34 및 서열 번호 19의 IFNα4a의 잔기 H26, F27, L30, K31, R33, 및 H34가 중화 항체에 의해 인식된다. 그들이 상이한 공급원으로부터 유래함에도 불구하고, 이들 잔기는 다양한 IFNα 하위유형과 IFNω 사이에 대체로 보존되므로, 이들 항체의 교차-반응성 및 차별적 특이성(differential specificity)을 설명한다. 부가적 에피토프 잔기는 IFNω의 R22, R23, I24, S25, D32, D35, M149, K150, 또는 L154 및 IFNα4a의 잔기 A19, G22, R23, I24, S25, H26, F27, C29, L30, K31, D32, R33, H34, D35, V143, A146, E147, M149, R150, 또는 S153이다.
[표 14]
Figure pct00019
SEQUENCE LISTING <110> Janssen Biotech, Inc. Chi, Ellen Connor, Judith Huang, Chichi Jordan, Jarrat Lin-Schmidt, Xiefang Luo, Jinquan Lu, Lu Martinez, Christian Obmolova, Galina Swanson, Ronald <120> Interferon Alpha and Omega Antibody Antagonists <130> JBI5025WOPCT <140> To Be Assigned <141> 2014-03-13 <150> 61788302 <151> 2013-03-15 <160> 40 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 172 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 1 Cys Asp Leu Pro Gln Asn His Gly Leu Leu Ser Arg Asn Thr Leu Val 1 5 10 15 Leu Leu His Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Leu Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg Arg Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Met Val Lys Gly Ser Gln Leu 35 40 45 Gln Lys Ala His Val Met Ser Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ile 50 55 60 Phe Ser Leu Phe His Thr Glu Arg Ser Ser Ala Ala Trp Asn Met Thr 65 70 75 80 Leu Leu Asp Gln Leu His Thr Gly Leu His Gln Gln Leu Gln His Leu 85 90 95 Glu Thr Cys Leu Leu Gln Val Val Gly Glu Gly Glu Ser Ala Gly Ala 100 105 110 Ile Ser Ser Pro Ala Leu Thr Leu Arg Arg Tyr Phe Gln Gly Ile Arg 115 120 125 Val Tyr Leu Lys Glu Lys 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166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser His Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg Tyr Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Val Phe Asp Gly Asn Gln Phe 35 40 45 Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Ala Phe His Glu Met Ile Gln Gln Thr 50 55 60 Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr 65 70 75 80 Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Leu Asn Asp Leu 85 90 95 Glu Ala Cys Val Thr Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met 100 105 110 Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr 115 120 125 Leu Tyr Leu Met Gly Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val 130 135 140 Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys 145 150 155 160 Gly Leu Arg Arg Lys Asp 165 <210> 17 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> signal sequence <400> 17 Met Ala Leu Thr Phe Tyr Leu Leu Val Ala Leu Val Val Leu Ser Tyr 1 5 10 15 Lys Ser Phe Ser 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30 Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln 35 40 45 Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln 50 55 60 Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn 65 70 75 80 Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn 85 90 95 His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr 100 105 110 Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg 115 120 125 Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr 130 135 140 Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu 145 150 155 160 Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 165 <210> 23 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ser Trp Gly Ser Tyr Tyr Ala Ala Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 24 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ser Phe Asp Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 25 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Leu Glu Tyr Ala Phe Pro Asp Lys Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 26 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 27 <211> 123 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 27 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Asp Trp Val 35 40 45 Ser Ile Ile Thr Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Ala Glu Gly Gly Gly Asn Tyr Asp Tyr Ala Met Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 28 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 28 Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Ile Asp Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ala Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 29 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 29 Glu Phe Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Asn 20 25 30 Asn Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Trp Val Val Ala Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 30 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 30 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn His 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Thr Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Arg Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 31 <211> 557 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Met Met Val Val Leu Leu Gly Ala Thr Thr Leu Val Leu Val Ala Val 1 5 10 15 Ala Pro Trp Val Leu Ser Ala Ala Ala Gly Gly Lys Asn Leu Lys Ser 20 25 30 Pro Gln Lys Val Glu Val Asp Ile Ile Asp Asp Asn Phe Ile Leu Arg 35 40 45 Trp Asn Arg Ser Asp Glu Ser Val Gly Asn Val Thr Phe Ser Phe Asp 50 55 60 Tyr Gln Lys Thr Gly Met Asp Asn Trp Ile Lys Leu Ser Gly Cys Gln 65 70 75 80 Asn Ile Thr Ser Thr Lys Cys Asn Phe Ser Ser Leu Lys Leu Asn Val 85 90 95 Tyr Glu Glu Ile Lys Leu Arg Ile Arg Ala Glu Lys Glu Asn Thr Ser 100 105 110 Ser Trp Tyr Glu Val Asp Ser Phe Thr Pro Phe Arg Lys Ala Gln Ile 115 120 125 Gly Pro Pro Glu Val His Leu Glu Ala Glu Asp Lys Ala Ile Val Ile 130 135 140 His Ile Ser Pro Gly Thr Lys Asp Ser Val Met Trp Ala Leu Asp Gly 145 150 155 160 Leu Ser Phe Thr Tyr Ser Leu Val Ile Trp Lys Asn Ser Ser Gly Val 165 170 175 Glu Glu Arg Ile Glu Asn Ile Tyr Ser Arg His Lys Ile Tyr Lys Leu 180 185 190 Ser Pro Glu Thr Thr Tyr Cys Leu Lys Val Lys Ala Ala Leu Leu Thr 195 200 205 Ser Trp Lys Ile Gly Val Tyr Ser Pro Val His Cys Ile Lys Thr Thr 210 215 220 Val Glu Asn Glu Leu Pro Pro Pro Glu Asn Ile Glu Val Ser Val Gln 225 230 235 240 Asn Gln Asn Tyr Val Leu Lys Trp Asp Tyr Thr Tyr Ala Asn Met Thr 245 250 255 Phe Gln Val Gln Trp Leu His Ala Phe Leu Lys Arg Asn Pro Gly Asn 260 265 270 His Leu Tyr Lys Trp Lys Gln Ile Pro Asp Cys Glu Asn Val Lys Thr 275 280 285 Thr Gln Cys Val Phe Pro Gln Asn Val Phe Gln Lys Gly Ile Tyr Leu 290 295 300 Leu Arg Val Gln Ala Ser Asp Gly Asn Asn Thr Ser Phe Trp Ser Glu 305 310 315 320 Glu Ile Lys Phe Asp Thr Glu Ile Gln Ala Phe Leu Leu Pro Pro Val 325 330 335 Phe Asn Ile Arg Ser Leu Ser Asp Ser Phe His Ile Tyr Ile Gly Ala 340 345 350 Pro Lys Gln Ser Gly Asn Thr Pro Val Ile Gln Asp Tyr Pro Leu Ile 355 360 365 Tyr Glu Ile Ile Phe Trp Glu Asn Thr Ser Asn Ala Glu Arg Lys Ile 370 375 380 Ile Glu Lys Lys Thr Asp Val Thr Val Pro Asn Leu Lys Pro Leu Thr 385 390 395 400 Val Tyr Cys Val Lys Ala Arg Ala His Thr Met Asp Glu Lys Leu Asn 405 410 415 Lys Ser Ser Val Phe Ser Asp Ala Val Cys Glu Lys Thr Lys Pro Gly 420 425 430 Asn Thr Ser Lys Ile Trp Leu Ile Val Gly Ile Cys Ile Ala Leu Phe 435 440 445 Ala Leu Pro Phe Val Ile Tyr Ala Ala Lys Val Phe Leu Arg Cys Ile 450 455 460 Asn Tyr Val Phe Phe Pro Ser Leu Lys Pro Ser Ser Ser Ile Asp Glu 465 470 475 480 Tyr Phe Ser Glu Gln Pro Leu Lys Asn Leu Leu Leu Ser Thr Ser Glu 485 490 495 Glu Gln Ile Glu Lys Cys Phe Ile Ile Glu Asn Ile Ser Thr Ile Ala 500 505 510 Thr Val Glu Glu Thr Asn Gln Thr Asp Glu Asp His Lys Lys Tyr Ser 515 520 525 Ser Gln Thr Ser Gln Asp Ser Gly Asn Tyr Ser Asn Glu Asp Glu Ser 530 535 540 Glu Ser Lys Thr Ser Glu Glu Leu Gln Gln Asp Phe Val 545 550 555 <210> 32 <211> 331 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Met Leu Leu Ser Gln Asn Ala Phe Ile Phe Arg Ser Leu Asn Leu Val 1 5 10 15 Leu Met Val Tyr Ile Ser Leu Val Phe Gly Ile Ser Tyr Asp Ser Pro 20 25 30 Asp Tyr Thr Asp Glu Ser Cys Thr Phe Lys Ile Ser Leu Arg Asn Phe 35 40 45 Arg Ser Ile Leu Ser Trp Glu Leu Lys Asn His Ser Ile Val Pro Thr 50 55 60 His Tyr Thr Leu Leu Tyr Thr Ile Met Ser Lys Pro Glu Asp Leu Lys 65 70 75 80 Val Val Lys Asn Cys Ala Asn Thr Thr Arg Ser Phe Cys Asp Leu Thr 85 90 95 Asp Glu Trp Arg Ser Thr His Glu Ala Tyr Val Thr Val Leu Glu Gly 100 105 110 Phe Ser Gly Asn Thr Thr Leu Phe Ser Cys Ser His Asn Phe Trp Leu 115 120 125 Ala Ile Asp Met Ser Phe Glu Pro Pro Glu Phe Glu Ile Val Gly Phe 130 135 140 Thr Asn His Ile Asn Val Met Val Lys Phe Pro Ser Ile Val Glu Glu 145 150 155 160 Glu Leu Gln Phe Asp Leu Ser Leu Val Ile Glu Glu Gln Ser Glu Gly 165 170 175 Ile Val Lys Lys His Lys Pro Glu Ile Lys Gly Asn Met Ser Gly Asn 180 185 190 Phe Thr Tyr Ile Ile Asp Lys Leu Ile Pro Asn Thr Asn Tyr Cys Val 195 200 205 Ser Val Tyr Leu Glu His Ser Asp Glu Gln Ala Val Ile Lys Ser Pro 210 215 220 Leu Lys Cys Thr Leu Leu Pro Pro Gly Gln Glu Ser Glu Ser Ala Glu 225 230 235 240 Ser Ala Lys Ile Gly Gly Ile Ile Thr Val Phe Leu Ile Ala Leu Val 245 250 255 Leu Thr Ser Thr Ile Val Thr Leu Lys Trp Ile Gly Tyr Ile Cys Leu 260 265 270 Arg Asn Ser Leu Pro Lys Val Leu Arg Gln Gly Leu Ala Lys Gly Trp 275 280 285 Asn Ala Val Ala Ile His Arg Cys Ser His Asn Ala Leu Gln Ser Glu 290 295 300 Thr Pro Glu Leu Lys Gln Ser Ser Cys Leu Ser Phe Pro Ser Ser Trp 305 310 315 320 Asp Tyr Lys Arg Ala Ser Leu Cys Pro Ser Asp 325 330 <210> 33 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 fragment of M43 antibody <400> 33 Gly Gly Thr Phe 1 <210> 34 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fragment of IFNalpha <400> 34 Asp Arg His Asp 1 <210> 35 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fragment of IFNomega <400> 35 Asp Arg Arg Asp 1 <210> 36 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fragment of IFNa <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> Xaa is any amino acid <400> 36 Tyr Leu Xaa Glu Lys 1 5 <210> 37 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fragment of IFNw <400> 37 Tyr Leu Lys Glu Lys 1 5 <210> 38 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M88 LCDR1 fragment <400> 38 Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu 1 5 <210> 39 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M43extendedLCDR1 <400> 39 Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 <210> 40 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1 library <220> <221> VARIANT <222> (6)..(6) <223> X1 is any amino acid <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> X2 is any amino acid <220> <221> VARIANT <222> (9)..(9) <223> X3 is any amino acid <220> <221> VARIANT <222> (11)..(11) <223> X4 is any amino acid <400> 40 Ser Gln Ser Val Leu Xaa Ser Xaa Xaa Asn Xaa Asn Tyr Leu 1 5 10

Claims (45)

  1. (a) 인간 인터페론 오메가(IFNω) 및 (b) 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 인간 인터페론 알파(IFNα) 하위유형에 결합하고 그의 활성을 중화하는 단리된 단클론 항체.
  2. 제1항에 있어서, 인간 IFNα 하위유형 IFNαB2, IFNαF, IFNαG, 및 IFNαJ1에 결합하고 그의 활성을 중화하는 항체.
  3. 제1항에 있어서, 인간 IFNα 하위유형 IFNαB2, IFNαC, IFNαF, IFNαG, 및 IFNαJ1에 결합하고 그의 활성을 중화하는 항체.
  4. 제1항에 있어서, 인간 IFNα 하위유형 IFNαB2, IFNαC, IFNαF, IFNαG, IFNαJ1, 및 IFNαA에 결합하고 그의 활성을 중화하는 항체.
  5. 제1항에 있어서, 인간 IFNα 하위유형 IFNαB2, IFNαC, IFNαF, IFNαG, IFNαJ1, IFNαA, 및 IFNαH2에 결합하고 그의 활성을 중화하는 항체.
  6. 제1항에 있어서, 인간 IFNα 하위유형 IFNαB2, IFNαC, IFNαF, IFNαG, IFNαJ1, IFNαA, IFNαH2, 및 IFNαK에 결합하고 그의 활성을 중화하는 항체.
  7. 제1항에 있어서, 인간 IFNα 하위유형 IFNαB2, IFNαC, IFNαF, IFNαG, IFNαJ1, IFNαA, IFNαH2, IFNαK, 및 IFNαWA에 결합하고 그의 활성을 중화하는 항체.
  8. 제1항에 있어서, 인간 IFNα 하위유형 IFNαB2, IFNαC, IFNαF, IFNαG, IFNαJ1, IFNαA IFNαH2, IFNαK, IFNαWA, 및 IFNα4a에 결합하고 그의 활성을 중화하는 항체.
  9. 제1항에 있어서, 인간 IFNω 및 인간 IFNα 하위유형의 활성이, 신호 변환기 및 전사 활성제 2(STAT2), 인터페론 조절 인자 9(IRF9), 및 분비 배아 알칼라인 포스파타아제(SEAP: secreted embryonic alkaline phosphatase)를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포에서 인터페론 유도성 ISG54 프로모터 하에 SEAP 발현의 저해인 항체.
  10. 제9항에 있어서, 실시예 3에서 "친화도 측정" 섹션에 정의된 조건 하에, 약 5x10-8 M 이하, 약 1x10-8 M 이하, 약 1x10-9 M 이하, 약 1x10-10 M 이하, 약 1x10-11 M 이하, 또는 약 1x10-12 M 이하의 IC50 값으로 인간 IFNω의 활성을 저해하고, 약 5x10-8 M 이하, 약 1x10-8 M 이하, 약 1x10-9 M 이하, 약 1x10-10 M 이하, 약 1x10-11 M 이하, 또는 약 1x10-12 M 이하의 IC50 값으로 인간 IFNα 하위유형 IFNαB2, IFNαF, IFNαG, 또는 IFNαJ1의 활성을 저해하는 항체.
  11. 제1항에 있어서, 약 5x10-9 M 이하, 약 1x10-9 M 이하, 약 5x10-10 M 이하, 약 1x10-10 M 이하, 약 5x10-11 M 이하, 약 1x10-11 M 이하, 약 5x10-12 M 이하, 또는 약 5x10-12 M 이하의 해리 상수(KD)로 인간 IFNω에 결합하고, 약 5x10-9 M 이하, 약 1x10-9 M 이하, 약 5x10-10 M 이하, 약 1x10-10 M 이하, 약 5x10-11 M 이하, 약 1x10-11 M 이하, 약 5x10-12 M 이하, 또는 약 5x10-12 M 이하의 KD로 인간 IFNα 하위유형 IFNαB2, IFNαF, IFNαG, 또는 IFNαJ1에 결합하는(여기서 KD는 실시예 3에서 "친화도 측정" 섹션에 예시된 조건을 사용하여 측정함) 항체.
  12. 제1항에 있어서, 인간 IFNω 및 인간 IFNα 하위유형 IFNαB2, IFNαF, IFNαG, 및/또는 IFNαJ1에 대한 결합에 대해,
    a) 서열 번호 23의 중쇄 가변 영역(VH) 아미노산 서열 및 서열 번호 24의 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열; 또는
    b) 서열 번호 27의 VH 아미노산 서열 및 서열 번호 28의 VL 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체와 경쟁하는 항체.
  13. 제12항에 있어서, 서열 번호 1의 잔기 F27, L30, 및 R33 중 하나 이상에서 IFNω에 결합하는 항체.
  14. 제13항에 있어서, 서열 번호 1의 잔기 F27, L30, 및 R33에서 IFNω에 결합하는 항체.
  15. 제13항에 있어서, 서열 번호 1의 잔기 P26, K31, 및 R34로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 IFNω 잔기에 추가로 결합하는 항체.
  16. 제13항에 있어서, 서열 번호 1의 잔기 R22, R23, I24, S25, P26, K31, D32, R34, D35, Q40, K134, M146, E147, M149, K150, F153, 및 L154로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 IFNω 잔기에 추가로 결합하는 항체.
  17. 제13항에 있어서, 서열 번호 19의 잔기 F27, L30, 및 R33 중 하나 이상에서 IFNα4a에 결합하는 항체.
  18. 제17항에 있어서, 서열 번호 19의 잔기 F27, L30, 및 R33에서 IFNα4a에 결합하는 항체.
  19. 제17항에 있어서, 서열 번호 19의 잔기 H26, K31, 및 R34로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 IFNα4a 잔기에 추가로 결합하는 항체.
  20. 제16항에 있어서, 서열 번호 19의 A19, G22, R23, I24, S25, H26, C29, K31, D32, H34, D35, V143, A146, E147, M149, R150, 및 S153으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 IFNα4a 잔기에 추가로 결합하는 항체.
  21. 제12항에 있어서, 바이러스-유도 백혈구 인터페론의 활성을 저해하는 항체.
  22. 제21항에 있어서, 바이러스-유도 백혈구 인터페론의 활성이 100 U/ml의 인터페론에 의해 유도된 전혈 내의 IP-10 방출인 항체.
  23. 제22항에 있어서, 50 ㎍/ml 항체의 존재 하에 활성을 50% 초과 만큼 저해하는 항체.
  24. 제12항에 있어서, 전신 홍반 루푸스(SLE: systemic lupus erythematosus) 면역 복합체-유도 IFN의 활성을 저해하는 항체.
  25. 제24항에 있어서, 활성을 약 50% 초과 만큼 저해하는 항체.
  26. 제12항에 있어서,
    a) 서열 번호 23의 중쇄 가변 영역(VH) 아미노산 서열 및 서열 번호 24의 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열; 또는
    b) 서열 번호 27의 중쇄 가변 영역(VH) 아미노산 서열 및 서열 번호 28의 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열을 포함하는 항체.
  27. 제12항에 있어서, 인간 인터페론-β(IFNβ)에 결합 또는 그를 중화하지 않는 항체.
  28. 제12항에 있어서, 인간 IFNαD에 결합 또는 그를 중화하지 않는 항체.
  29. 제12항에 있어서, 인간 항체이거나, 인간화 항체이거나, 인간-적응화 항체인 항체.
  30. 제29항에 있어서, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 동형인 항체.
  31. 제29항에 있어서, 이중특이적인 항체.
  32. 제31항에 있어서, BLyS, CD40L, IL-6, CD27, BDCA2, 또는 IL-12 또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체.
  33. 제1항 또는 제12항의 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  34. 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 시간 동안 제12항의 단리된 항체의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, IFNα 및 IFNω의 증가된 생성과 연계된 질환의 치료 또는 예방 방법.
  35. 제34항에 있어서, 질환이 면역-매개 염증성 질환인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 면역-매개 염증성 질환이 전신 홍반 루푸스(SLE), 유형 I 당뇨병, 건선, 원발성 쇼그렌 증후군(primary Sjㆆgren's disease), 전신 경화증, 또는 류머티스 관절염인 방법.
  37. 제34항에 있어서, 환자가 유형 I 인터페론 시그니처(signature)를 나타내는 방법.
  38. 제34항에 있어서, 제12항의 항체가 이중특이적 항체인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 이중특이적 항체가 BLyS, CD40L, IL-6, CD27, BDCA2, 또는 IL-12 또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 방법.
  40. IFNω 및 IFNα 하위유형 IFNαB2, IFNαC, IFNαF, IFNαG, 및/또는 IFNαJ1과 IFNAR의 상호작용을 방지하기에 충분한 시간 동안 제12항의 단리된 항체를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에서 IFNω 및 IFNα 하위유형 IFNαB2, IFNαC, IFNαF, IFNαG, 및/또는 IFNαJ1과 IFNAR의 상호작용을 저해하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 환자가 면역-매개 염증성 질환을 갖는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 면역-매개 염증성 질환이 SLE, 유형 I 당뇨병, 건선, 원발성 쇼그렌 증후군, 전신 경화증, 또는 류머티스 관절염인 방법.
  43. 제40항에 있어서, 환자가 유형 I 인터페론 시그니처를 나타내는 방법.
  44. 제40항에 있어서, 항체가 이중특이적 항체인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 이중특이적 항체가 BLyS, CD40L, IL-6, CD27, BDCA2, IL-12 또는 IL-23의 p40 서브유닛, 또는 BDCA2에 결합하는 방법.
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