CN1282255A - Ifnar2/1fn复合物 - Google Patents

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Abstract

通过给予与人干扰素α/β受体(IFNAR)的IFN结合链之复合物形式的干扰素,可以延长Ⅰ型干扰素(IFN)的体内效果。该复合物还提高了IFN的稳定性,增强了IFN的效力。该复合物可以是非共价的复合物,或是IFN通过共价键或肽键与IFNAR结合形成的复合物。当以融合蛋白形式靠肽键结合时,IFN可以靠肽接头和IFNAR分开。这种融合蛋白可用重组DNA技术产生。以这种复合物的形式保藏IFN可增加IFN的保藏时间,并使得在更温和的条件下保藏成为可能。

Description

IFNAR2/IFN复合物
                             发明领域
本发明涉及I型干扰素复合物，该复合物由人干扰素α/β受体(IFNAR2)胞外结构域和I型干扰素(IFNα，IFNβ和IFNω)的多肽序列组成。该复合物提高了稳定性，增强了效力，并延长了游离IFN在体内抗病毒、抗癌和免疫调节活性的药物动力学。更具体地说，该复合物是一种融合蛋白，或是一种共价复合物或非共价复合物，它含有IFNAR2整个胞外结构域的多肽序列，或其任何能结合干扰素的亚基部分(subfraction)，该多肽序列与I型干扰素(IFNα、IFNβ、IFNω)或其生物活性亚基部分复合。
                              发明背景
干扰素被分类成白细胞和成纤维细胞衍生的I型干扰素，或是促有丝分裂素诱导的或“免疫”II型干扰素(Pestka等人，1987)。通过分析序列身份和共同的生物学活性，I型干扰素包括干扰素α(IFNα)、干扰素β(干扰素β)和干扰素ω(IFNω)，而II型干扰素包括干扰素γ(IFNγ)。IFNα、IFNβ和IFNω基因簇集在9号染色体的短臂上(Lengyl，1982)。其上有至少25个非等位性IFNα基因，6个非等位性IFNω基因和一个IFNβ基因。认为所有这些基因均从一个共同的祖先基因进化而来。在不同的动物种类之间，IFNα基因相互间具有至少80％的序列相同性。IFNβ基因与IFNα有大约50％的序列相同性；IFNω基因与IFNα有70％同源(Weissman等人，1986；Dron等人，1992)。IFNα的分子量在17-23kDa之间(165-166氨基酸)，IFNβ在23kDa左右(166个氨基酸)，IFNω在24kDa左右(172个氨基酸)。
I型干扰素是多效细胞因子，它在宿主抵抗病毒和寄生虫感染的防御机制中有活性，可作为抗癌细胞因子和免疫调节剂(Baron等人，1994；Baron等人，1991)。I型干扰素的生理性反应包括对正常的以及转化的细胞有抗增殖活性；刺激淋巴细胞、天然杀伤细胞和吞噬细胞的细胞毒性活性；调节细胞分化；刺激I类MHC抗原的表达；抑制II类MHC；和调节各种细胞表面受体。在正常的生理条件下，IFNα和IFNβ(IFNα/β)由大多数人细胞低水平组成型分泌，加入各种诱导剂后可以上调其表达，这些诱导剂包括感染性因子(病毒、细菌、支原体和原生动物)、dsRNA和细胞因子(M-CSF、IL-1α、IL-2、TNFα)。I型干扰素的体内活性可用替代标记，新蝶呤，2′，5′寡腺苷合成酶以及β2微球蛋白监测(Alam等人，1997；Fierlbeck等人，1996；Salmon等人，1996)。
I型干扰素(IFNcα/β/ω)是通过一种细胞表面受体复合物来诱导特异性的生物学效应(如抗病毒，抗肿瘤和免疫调节活性)。I型IFN受体(IFNAR)是一种异质多聚受体复合物，由至少两种不同的多肽链组成(Colamonici等人，1992；Colamonici等人，1993；Platanias等人，1993)。发现这些链的基因在第21号染色体上，其蛋白表达在大多数细胞表面(Tan等人，1973)。受体链最初命名为α和β，因为它们能分别被IFNαR3和IFNaRβ1单抗识别。最近，它们被重新命名，α亚基为IFNAR1，β亚基命名为IFNAR2。在大多数细胞中，IFNAR1(α链，Uze亚基)(Uze等人，1990)的分子量为100-130kDa，而IFNAR2(β链，βL，IFNα/βR)的分子量为100kDa。在某些类型的细胞(单核细胞系以及正常的骨髓细胞)中，已经鉴定出另一种受体复合物，即IFNAR2亚基(βS)被表达成分子量为51kDa的截短的受体。IFNAR1和IFNAR2 βS和βL亚基已经被克隆(Novick等人，1994；Domanski等人，1995)。IFNAR2 βS和βL亚基具有相同的胞外和跨膜结构域；然而，在细胞质区域它们只有前15个氨基酸有相同性。IFNAR2亚基单独能结合IFNα/β，而IFNAR1亚基不能结合IFNα/β。当人IFNAR1受体亚基单独转染到鼠L-929成纤维细胞中后，除IFNα8/IFNαB外没有人IFNα能结合细胞(Uze等人，1990)。人IFNAR2亚基在人IFNAR1亚基不存在下转染到L细胞中后，能结合人IFNα2，结合的Kd约为0.45nM。当人IFNAR2亚基在人IFNAR1亚基存在下转染时，可显示出高亲和性结合，其Kd为0.026-0.114nM(Novick等人，1994；Domanski等人，1995)。估计大多数细胞上存在500-20000个高亲和力和2000-100000个低亲和力IFN结合位点。尽管IFNAR1/2复合物(α/βS或α/βL)亚基能以高亲和力结合IFNα，但是只有α/βL对看来是功能性信号传递受体。
将IFNARI和IFNAR2 βL亚基转染到小鼠L-929细胞中，然后和IFNα2一起培育，这诱导了抗病毒状态，启动胞内蛋白磷酸化，并引起胞内激酶(Jak1和Tyk2)和转录因子(STAT1、2和3)激活(Novick等人，1994；Domanski等人，1995)。在相应的实验中，IFNAR2 βS亚基的转染不能启动相似的反应。因此，IFNAR2 βL是在结合IFNAR2亚基时产生最大诱导作用的功能性活性(抗病毒反应)所需要的亚基。
除了膜结合细胞表面IFNAR形式外，在人尿和血清中也鉴定出一种可溶的IFNAR(Novick等人，1994；Novick等人，1995；Novick等人，1992；Lutfalla等人，1995)。从血清中分离出的可溶性IFNAR在SDS-PAGE上的表观分子量为55kDa，而来自尿液的可溶性IFNAR的表观分子量为40-45kDa(p40)。可溶性p40 IFNAR2的转录物以mRNA水平存在，包括IFNAR2亚基的几乎整个胞外结构域，且羧基端有两个新的氨基酸。在可溶性IFNAR2受体上有5个潜在的糖基化位点。可溶性p40IFNAR2显示出结合IFNα2和IFNβ，并在体外抑制IFNα种类(“白细胞IFN”)和个别I型IFN之混合物的抗病毒活性(Novick等人，1995)。重组的IFNAR2亚基Ig融合蛋白显示出能抑制各种I型IFN(IFNαA、IFNαB、IFNαD、IFNβ、IFNα Conl和IFNω)与Daudi细胞以及与α/βS亚基双转染的COS细胞的结合。
I型IFN信号传导通道最近已被鉴定(Platanias等人，1996；Yan等人，1996；Qureshi等人，1996；Duncan等人，1996；Sharf等人，1995；Yang等人，1996)。导致信号传导的最初行为认为是由于IFNα/βω与IFNAR2亚基结合，然后与IFNAR1亚基结合形成IFNAR1/2复合物所致(Platanias等人，1994)。IFNα/β/ω与IFNAR1/2复合物的结合导致激活两种Janus激酶(Jak1和Tyk2)，认为这两种酶使IFNAR1和IFNAR2亚基上的特异性酪氨酸磷酸化。一旦这些亚基磷酸化，STAT分子(STAT1、2和3)即磷酸化，从而导致STAT转录复合物发生二聚反应，然后该转录复合物定位于胞核，激活特异的IFN可诱导基因。
已经评价了I型IFN在人体内的药物动力学和药效学(Alan等人，1997；Fierlbeck等人，1996；Salmon等人，1996)。IFNβ的清除相当快，IFNβ的生物利用率比大多数细胞因子预计的要低。尽管已经在人体内评价了IFNβ的药效学，但是还未建立起IFNβ的生物利用率与临床效果之间的明确关系。在正常的健康志愿者中，单剂静脉内(iv)快速注射重组CHO衍生的IFNβ(6 MIU)，结果导致在5分钟内迅速分配，最终的半衰期约为5小时(Alam等人，1997)。随后皮下(sc)或肌内(im)给予IFNβ，血清水平较平，只占全身剂量的大约15％。静脉内、肌内或皮下给予IFNβ后的药效学(通过PBMC中的2′5′-寡腺苷合成酶(2′，5′-AS)活性的变化来测定)在前24小时内升高，在随后的4天内缓缓降低至基线水平。不论是何给药途径，其生物效应的程度和持续时间是相同的。
已经检查了在肌内注射单剂6 MIU重组IFNβ后，两个不同公司生产的IFNβ(REBIF-Serono和AVONEX-Biogen)的药物动力学(PK)和药效学(PD)(Salmon，1996)。监测IFNβ以及IFNβ替代标记新蝶呤的血清浓度随时间而变的情况。两种IFNβ制剂表现出相似的PK曲线，在12-15小时到达IFNβ的峰值血清水平，但是REBIF最大水平较低。在肌内注射后至少前36小时内，REBIF和AVONEX两者的IFNβ水平维持升高，然后到第48小时降低至稍高于基线水平。新蝶呤的水平与RENBIF和AVONEX的曲线非常相似，在注射后44-50小时达到最大的新蝶呤水平，并维持升高直至注射后72小时，然后逐渐降低，144小时时降低至基线水平。
在人黑色素瘤患者中进行了IFNβ的多剂药效学研究(Fierlbeck等人，1996)，IFNβ通过皮下途径给予，每周以每剂3MIU给予3次，持续6个月。药效学标记，2′，5′-AS合成酶、β2-微球蛋白、新蝶呤和NK细胞的激活在第二次注射(第4天)时达到峰值，在28天内降低并维持稍稍高于6个月时的水平。
总之，人体内I型干扰素的清除是迅速的。一种长期作用的干扰素制剂可能将导致临床效果有所改善。
                             发明概述
现在已经发现，由可溶性IFNAR与I型干扰素(IFN)复合所组成的I型干扰素复合物表现出比游离IFN稳定性提高，效力增强，以及延长的抗病毒、抗癌和免疫调节活性的体内药物动力学。
因此，本发明提供了一种I型干扰素(IFN)复合物，它由人干扰素α/β受体(IFNAR)亚基胞外结构域以及I型干扰素的多肽序列组成，该复合物表现出比游离IFN稳定性提高，效力增强，和/或延长的抗病毒、抗癌和免疫调节活性的体内药物动力学。较佳的，该复合物是IFNAR2亚基胞外结构域与任何I型干扰素或IFNAR1亚基和IFNα的复合物。
更具体地说，该复合物是一种融合蛋白、或一种共价复合物或非共价复合物，它含有IFNAR(尤其是IFNAR2)的整个胞外结构域、或是其任何结合干扰素的亚组分(subfraction)的多肽序列，该多肽序列与IFNα、IFNβ或IFNω或是其任何生物活性亚组分复合。
IFNAR应理解成任何如上所述的已知的胞外IFNAR受体，及其任何活性片段。IFNAR可以任选地与其它蛋白(例如免疫球蛋白如IgG)融合。IFN、IFNα、IFNβ和IFNω指目前确定的20种以上的I型干扰素中的一种，或是将来鉴定的其它任何I型干扰素。
在本发明的一个实施方案中，该复合物由IFNα或IFNβ以及通过化学键与其共价连接的IFNAR2组成。
另一个实施方案包含一种复合物，它由与IFNAR2非共价复合的IFNα或IFNβ组成。另一个实施方案还包括一种组合物，该组合物含有以任何比例存在的I型IFN和IFNAR2。如上所述的I型IFN与过量IFNAR2的制剂也包括在本申请的“复合物”之定义内。这两个组分也可分开给予，从而在体内形成复合物。因此，在另一个实施方案中，该复合物是IFNAR2与IFN的混合物，它通过同时或先后共同给予IFNα或IFNβ以及可溶性IFNAR2来获得。另外，可以给予IFNAR而不伴随给予IFN，这样IFNAR可能会在体内与体源性循环IFN形成复合物，从而增强了内源IFN的效果。
一个具体的实施方案是，该复合物由IFNα或IFNβ或IFNω与IFNAR2融合组成一个重组融合蛋白，IFN和IFNAR2部分可任选地通过一个灵活可屈曲的肽接头分子来融合。该肽接头在体内能断裂或不能断裂。
本发明还涉及编码这种蛋白质的DNA，含有该DNA的载体，被这些载体转化从而表达该融合蛋白的宿主细胞，以及通过培育这些宿主细胞然后分离其表达的融合蛋白来产生这些融合蛋白的方法。
本发明的另一个方面是用本发明的复合物来延长IFN的体内效果的方法，该方法可用来治疗任何IFN能治疗的疾病或状况。
本发明的另一方面涉及IFNAR用作IFN制剂中的稳定剂。游离的IFNβ具有寡聚化的趋势。当其与IFNAR、尤其是IFNAR2复合时，这种趋势被阻止。目前的重组IFNβ制剂必须为酸性pH，这可能会在给药时引起一些局部刺激。如果用IFNAR作为稳定剂的话，则可以配制成非酸性的组合物。
                              附图简述
结合下列附图将能更好地了解本发明，其中：
图1显示了sIFNAR2或IFNAR2Ig(由hIFNAR2的胞外结构域与人IgGl铰链区、CH2和CH3结构域融合组成)在IFNβ存在下依赖于剂量的抗病毒活性。
图2显示了在亚适剂量的IFNβ下sIFNAR2和IFNβ的抗病毒活性。在中等IFNβ剂量下揭示了IFNβ和sIFNAR2预先培育1小时后的协同增效的抗病毒活性。
图3显示了sIFNAR2和亚有效剂量的IFNβ(0.95IU/毫升)的抗病毒活性随预先培育时间变化的情况。使WISH细胞接触IFNβ(0.95IU/毫升亚有效剂量)和sIFNAR2，然后预先培育指定的时间。仅仅在预先培育4小时后就观察到有协同增效的抗病毒活性。抗病毒活性通过VSV攻击48小时后MTT转变来确定。在亚治疗水平的IFNβ下，IFNAR2/IFN复合物的形成导致了增强的抗病毒活性。
图4显示了人IFNβ预先和sIFNAR2培育后增强的抗病毒活性。
图5显示了人IFNβ与sIFNAR结合后增强的抗病毒活性对IFNAR2是特异的，对其它蛋白质没有特异性。
图6显示了经ELISA测得的人IFNβ和IFNβ/IFNAR2复合物在小鼠中的药物动力学比较结果。
图7显示了经生物试验测得的人IFNβ和IFNβ/IFNAR2复合物在小鼠中的药物动力学比较结果。
图8显示了经ELISA测得的人IFNα和IFNα/IFNAR2复合物在小鼠中的药物动力学比较结果。
图9显示了经生物试验测得的人IFNα和IFNα/IFNAR2复合物在小鼠中的药物动力学比较结果。
图10显示了n＝2 IFNAR2/IFNβ融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：14)。(GGGGS)2(SEQ ID NO：14的残基240-249)接头用下划线表示。
图11的凝胶显示了pCMV-IFNAR2/IFNβ的限制性酶切分析；10％PAG，泳道3-7：BamHI/XhoI消化物；泳道2：SmaI/XhoI消化物；泳道1：pBR322 DNA-MspI消化物标记；泳道2：pCMV-IFNAR2/IFNβ，0GS；泳道3：1GS；泳道4：2GS；泳道5：3GS；泳道6：4GS；泳道7：5GS；泳道8：φX174 RFDNA HaeIII消化物标记。
图12是IFNAR2/IFNβ表达载体的限制性内切核酸酶图谱。
图13是IFNAR2/IFNβ融合蛋白的Western印迹分析。泳道1，不含接头的IFNAR2/IFNβ构建物；泳道2，含有一个Gly4Ser(SEQ ID NO：1)接头的IFNAR2/IFNβ构建物；泳道3，含有两个Gly4Ser(SEQ ID NO：1)接头的IFNAR2/IFNβ构建物；泳道4，含有三个Gly4Ser(SEQ ID NO：1)接头的IFNAR/IFNβ构建物；泳道5，含有四个Gly4Ser(SEQ ID NO：1)接头的IFNAR/IFNβ构建物；泳道6，含有五个Gly4Ser(SEQID NO：1)接头的IFNAR/IFNβ构建物；
图14显示了CHO细胞上清液中表达的内部融合(interfusion)分子的抗病毒活性，并标准化成IFNβ标准活性。
图15A-B显示了静脉内注射IFNAR2后所给予的IFNβ的药物动力学。IFNβ单独注射，或作为IFNAR复合物注射，或在分开静脉内注射sIFNAR2后立即注射。在感染后指定时间用IFNβ特异性ELISA(图15A)和WISH抗病毒试验中的生物活性(图15B)来评价血清半衰期。
图16显示了与单独给予通用IFN或对照相比的保护作用，表示成各种剂量的“通用”IFN(人IFNα/D)与sIFNAR2的复合物的细胞毒性百分数。
图17显示了在静脉内快速注射单剂内部融合物GS5或单独的hIFNβ后，IFNβ的血清浓度随时间的变化情况。
较佳实施方案详述
下面将详细描述本发明的IFNAR/IFN复合物以及产生该复合物所需的技术。对于大多数结果而言，选择IFNβ作为非限制性实施例。
融合蛋白。将IFNAR2的C端或其任何与干扰素结合的亚序列与IFNβ的N端或其生物活性片段融合，要求两个分子之间的桥连距离最短。还可制备反构建物，使IFNβ的C端或其片段与IFNAR2的N端或其亚序列融合。
从IFNAR2/IFNβ复合物的分子模型来看，估计在活性复合物模型中受束缚的IFNAR2 C端胞外结构域与IFNβN-端之间的距离约为80埃。为了工程改造一个能维持活性的IFNAR2/IFNβ复合物，可以采用一个柔性的肽接头，例如Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(GGGGS)(SEQ ID NO：1)重复序列。或者，接头可以是可屈曲的，是血清、膜结合和/或细胞蛋白酶蛋白水解的靶。血清蛋白酶断裂位点的一个例子是，经工程改造的IFNAR2/IFNβ复合融合物可以具有Xa因子断裂位点。Xa因子切割凝血酶原的Arg273和Arg322位，它具有四肽识别信号Ile-Glu-Glu-Arg(SEQ ID NO：2)(Nagai等人，1984)。因子Xa本身是由各种激活剂从内在和外在途径产生的，包括组织因子，它由血管内皮细胞、巨噬细胞和中性粒细胞释放。
因子Xa可作用于接头区域中含有Xa因子识别序列的sIFNAR2/IFN融合蛋白，并释放IFNAR2/IFN复合物，使该复合物起非共价复合物的作用。
或者，IFNAR2/IFNβ复合融合物可以具有一个细胞膜蛋白酶(如肝蛋白酶hepsin)断裂位点。肝蛋白酶是一种51kDa的膜结合丝氨酸蛋白酶酶原，在肝组织中高水平表达，但也发现存在肾、胰、肺、甲状腺、垂体和睾丸中。已知被肝蛋白酶断裂的序列是VII因子中的Arg152-Ile153肽键。肝蛋白酶涉及肿瘤细胞上凝血酶的形成(Kazam等人，1995)。
肝蛋白酶可作用于接头区域中含有肝蛋白酶识别序列的sIFNAR2/IFN融合蛋白，并释放IFNAR2/IFN复合物，从而使该复合物能以非共价的方式起作用。
或者，IFNAR2/IFNβ融合复合物也可具有胞内蛋白酶切割位点。坏死和凋亡细胞释放出各种蛋白酶。其中包括蛋白酶类(caspases)(白介素1β转化酶样蛋白酶)、金属蛋白酶、溶酶体蛋白酶(如组织蛋白酶B)和弹性蛋白酶。弹性蛋白酶由粒细胞在疾病状态(如败血症)期间释放，对于氨基酸断裂序列具有宽的特异性，与胰蛋白酶同族(Ertel等人，1994；Szilagyi等人，1995)。
胞内蛋白酶可作用于接头区域内含有胞内蛋白酶识别序列的sIFNAR2/IFN融合蛋白并释放该IFNAR2/IFN复合物，从而使该复合物作为非共价复合物起作用。
实际上，已经制得了融合蛋白构建物的几个例子，其中sIFNAR2(P40-ESEFS)的C端与IFNβ(MSY)的N端通过柔性的接头连接。肽接头的例子如下：ESEFS(GGGGS)nMSY，其中n＝5(SEQ ID NO：3)，4(SEQ ID NO：4)，3(SEQ ID NO：5)，2(SEQ ID NO：6)，或1(SEQ ID NO：7)；ESEFS(hCG-CTP)MSY，其中hCG-CTP＝SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO：8)；ESEFS(EFM)nMSY，其中n＝5(SEQ ID NO：9)，4(SEQ ID NO：10)，或3(SEQ ID NO：11)；ESEFS(EFGAGLVLGGQFM)nMSY，其中n＝I(SEQ ID NO：12)，或2(SEQ ID NO：13)，以及使复合物模型中IFNAR2结合位点和IFNβ之间有一定距离且在干扰素和受体部分之间不形成免疫原性表位的其它接头。较佳的，这些接头的长度可高达约30个氨基酸。
共价复合物。产生化学交联分子的一个例子是使可生物降解的接头(如聚乙二醇(PEG))与IFNAR2中存在的或工程改造入(利用氨基酸替换，例如将Ser210替换成Cys，或将Asn89替换成Cys(定点诱变))的半胱氨酸反应，从而定点修饰该IFNAR2。可以工程改造下列构建物：IFNAR(S210C)-PEGn-IFNβ(Cys17)，其中n＝2000，5000或10000道尔顿，或是IFNAR(N89C)-PEGn-IFNβ(Cys17)。
在两个不同(任选地工程改造)部分的Cys之间形成共价二硫键也在本发明的范围内。
非共价复合物。使人IFNAR2在使活性复合物产生最大化的条件下与IFNβ复合。如实施例中所报道的，在体外，需要2.5毫微克IFNAR2与1个国际单位(IU)的IFNβ的最适比例来产生最大活性的复合物。使具有体内活性的活性复合物产生最大化的IFNAR2与IFNβ的最适比例目前正在确定，但是看来该最适比例取决于IFNβ的浓度。因此，例如，在每天每只小鼠2×104IU IFNβ的浓度下，增强抗肿瘤活性的IFNAR2：IFNβ的最适比例为每皮克IFNβ2.5毫微克IFNAR2，而在每天每只小鼠5×104IUIFNβ的浓度下，每皮克IFNβ0.3毫微克IFNAR2是最适的。用来使体外产生活性复合物最大的同一比例可导致IFN在体内的药物动力学延长。
较佳的，用来产生复合物的IFNAR2和IFNβ是重组分子。在体外抗病毒试验中，与单用IFNβ的活性相比，干扰素/受体复合物表现出增强的活性。使恒定浓度的IFNβ与各种浓度的重组sIFNAR2混合，将该混合物(IFNAR2/IFN复合物)加入WISH细胞(人羊膜细胞)中。然后用疱疹性口腔炎病毒(VSV)攻击这些WISH细胞，监测培育48小时后的细胞存活程度，作为IFN的抗病毒活性。在每个实验中，在恒定量的IFNβ中加入IFNAR2导致在IFNAR2与IFN最适比下对VSV攻击时细胞存活以剂量依赖方式增加。这些结果证实IFNAR2和IFNβ的复合物在抗病毒试验中表现出比游离IFNβ增强的活性。该结果的实践含义是，对于IFN本身具有活性的各种治疗适应症，IFNAR2/IFNβ复合物比游离的IFN具有更高的效力和更强的活性。这些适应症包括游离的IFN能在其中显示出某些治疗活性(如抗病毒、抗癌和免疫调节活性)的适应症。预计IFNAR2/IFN复合物将凭借其更高的效力、增强的活性和/或改进的药物动力学(即半衰期)而在治疗病毒、肿瘤和免疫疾病中更为有效。
在体内给予时，干扰素受体复合物增强了IFN的生物利用率、药物动力学和/或药效学，从而提高了IFN的抗病毒、抗癌和免疫调节性能。
通过预先形成IFN/IFNAR非共价复合物，同时给予游离的IFN和IFNAR，按次序给予IFN或IFNAR组分，给予IFN/IFNAR共价复合物或给予IFNAR/IFN融合蛋白，可以获得由复合物介导的增强的IFN生物利用率。
在另一个实施方案中，还可通过单独给予IFNAR组分而不加任何IFN来增强生物利用率。IFNAR将在体内与内源IFN形成“复合物”，从而增强内源IFN的生物利用率、药物动力学和/或药效学。这特别适合用来治疗患有天然诱导产生天然IFN的疾病或症状的患者，因为IFN早已处于循环中并发挥着其抵抗这些疾病或病症的天然作用。加入的IFNAR将增强该天然IFN的效果。
用于本发明的较佳的分子具有天然IFN和IFNAR的序列。该天然序列是天然存在的人IFN或IFNAR的序列。这些序列是已知的，很容易在文献中找到。天然存在的等位变化也被认为是天然的序列。
本发明还涉及本发明上述IFNAR2/IFN复合物的类似物，这些类似物基本上保留了与该复合物相同的生物活性，基本上具有天然IFNAR2和IFN的序列。这些类似物可以这样制得，除去、加入多达约30个氨基酸残基或用复合物中IFNAR2和/或IFN部分中的其它残基替换，此类修饰基本上没有改变嵌合蛋白类似物相对于复合物本身的生物活性。各种类似物相互之间以及和基础的复合物分子(基本上只具有天然存在的IFNAR2和IFN序列)之间最为不同之处是连接复合物中两个部分的接头肽位点处。如上所述，这种接头的长度宜多达约30个氨基酸，其作用是使复合物中的IFNAR2和IFN部分相互分开。对于这种接头，应当仔细选择其序列(也要在适当的标准试验中用生物学方法测试该类似物)，从而使其(例如)不会导致复合物发生不正确的折叠，这种不正确的折叠会使其灭活或没有增强的活性，或使复合物类似物具有免疫原性，从而在受治疗的患者体内产生针对该接头序列的抗体，结果使该类似物至少在中期或长期药剂治疗中无效。至于本发明复合物的上述类似物，它们是这样一些类似物：在本发明的基础复合物中有一个或多个、最多约30个氨基酸残基被不同的氨基酸残基替代，或缺失，或者，在本发明复合物(基本上只具有天然的IFNAR2/IFN序列)的原始序列中加入一个或多个、最多约30个氨基酸残基而没有显著改变所得产物活性(与本发明的基础复合物相比)。这些类似物可用已知的合成方法和/或定点诱变技术或适用于此的其它任何已知技术来制得。
任何此类类似物所具有的氨基酸序列应足以复制IFNAR2/IFN基础复合物的序列，从而具有与其基本上相似的活性。因此，可以用常规实验来确定任何给定的类似物是否具有与本发明的基础复合物基本相同的活性和/或稳定性，这些实验方法包括对各种此类类似物进行下文实施例2-7所述的生物活性和稳定性测试。
可用于本发明的复合物的类似物或其核酸编码序列，包括一组有限的基本对应的序列作为替换的肽或多核苷酸，它们可由本领域普通技术人员根据本文的指导无需过多实验即可通过常规手段获得。关于蛋白质化学性质和结构的详细描述参见Schulz.等人，《蛋白质结构原理》Springer-Verlag，New York(1978)；和Creighton，T.E.，《蛋白质：结构和分子性质》，W.H.Freeman & Co，San Francisco(1983)，这些文献均纳入本文作参考。关于核苷酸序列替换的描述，例如密码子偏好，参见Ausubel等人(1987，1992)§§A.1.I-A.1.24，和Sambrook等人(1987，1992)，§§6.3和6.4，附录C和D。
本发明的类似物中较佳的变化是称为“保守”替换的那些变化。在具有基本上天然存在的IFNAR2和IFN序列的复合物中，保守性氨基酸替换可包括一组内的同义氨基酸，它们具有足够相似的理化性能，组员之间的替换将保留该分子的生物功能(Grantham，1974)。显然，在上述序列中还可进行氨基酸的插入或缺失而不改变其功能，特别是如果插入和缺失只涉及几个氨基酸(例如低于30个，较佳的低于10个)，且没有除去或替换对功能构象关键的氨基酸(如半胱氨酸残基)(Anfinsen，1973)。这种缺失或插入所产生的类似物也在本发明的范围内。
较佳的，同义氨基酸组是表I中所定义的那些。更佳的，同义氨基酸组是表II中所定义的那些；最佳的，同义氨基酸组是表III中所定义的那些。
                     表I
               较佳的同义氨基酸组
    氨基酸              同义组
    Ser  Ser，Thr，Gly，Asn
    Arg  Arg，Gln，Lys，Glu，His
    Leu  Ile，Phe，Tyr，Met，Val，Leu
    Pro  Gly，Ala，Thr，Pro
    Thr  Pro，Ser，Ala，Gly，His，Gln，Thr
    Ala  Gly，Thr，Pro，Ala
    Val  Met，Tyr，Phe，Ile，Leu，Val
    Gly  Ala，Thr，Pro，Ser，Gly
    Ile  Met，Tyr，Phe，Val，Leu，Ile
    Phe  Trp，Met，Tyr，Ile，Val，Leu，Phe
    Tyr  Trp，Met，Phe，Ile，Val，Leu，Tyr
    Cys  Ser，Thr，Cys
    His  Glu，Lys，Gln，Thr，Arg，His
    Gln  Glu，Lys，Asn，His，Thr，Arg，Gln
    Asn  Gln，Asp，Ser，Asn
    Lys  Glu，Gln，His，Arg，Lys
    Asp  Glu，Asn，Asp
    Glu  Asp，Lys，Asn，Gln，His，Arg，Glu
    Met  phe，Ile，Val，Leu，Met
    Trp  Trp
                表II
          更佳的同义氨基酸组
    氨基酸             同义组
    Ser  Ser
    Arg  His，Lys，Arg
    Leu  Lau，Ile，Phe，Met
    Pro  Ala，Pro
    Thr  Thr
    Ala  Pro，Ala
    Val  Val，Met，Ile
    Gly  Gly
    Ile  Ile，Met，Phe，Val，Leu
    Phe  Met，Tyr，Ile，Leu，Phe
    Tyr  Phe，Tyr
    Cys  Cys，Ser
    His  His，Gln，Arg
    Gln  Glu，Gln，His
    Asn  Asp，Asn
    Lys  Lys，Arg
    Asp  Asp，Asn
    Glu  Glu，Gln
    Met  Met，Phe，Ile，Val，Leu
    Trp  Trp
         表III
   最佳的同义氨基酸组
    氨基酸     同义组
    Ser  Ser
    Arg  Arg
    Leu  Leu，Ile，Met
    Pro  Pro
    Thr  Thr
    Ala  Ala
    Val  Val
    Gly  Gly
    Ile  Ile，Met，Leu
    Phe  Phe
    Tyr  Tyr
    Cys  Cys，Ser
    His  His
    Gln  Gln
    Asn  Asn
    Lys  Lys
    Asp  Glu
    Glu  Glu
    Met  Met，Ile，Leu
    Trp  Met
在蛋白质中产生氨基酸替换用来获得用于本发明的IFNAR2/IFN复合物之类似物的例子包括任何已知的方法步骤，如美国专利RE 33,653；4,959,314；4,588,585和4,737,462(授予Mark等人)；5，116,943(授予Koths等人)；4,965,195(授予Namen等人)和5,017,691(授予Lee等人)中描述的步骤，以及美国专利4,904,584(Shaw等人)中描述的赖氨酸替换的蛋白质。
在本发明的另一个较佳的实施方案中，用于本发明的复合物的任何类似物所具有的氨基酸序列基本上对应于本发明上述的基础复合物的氨基酸序列。术语“基本上对应于”包括相对于基础复合物的序列有少量变化、但不影响其基础性质(尤其是抑制癌细胞增殖或促进骨髓移植能力)的类似物。通常认为在“基本上对应”该术语范围内的变化类型是可用常规诱变技术对编码本发明复合物的DNA产生的那些变化，该技术产生了少量的变化，并以上述方式筛选所需的活性。
较佳的，复合物的IFNAR2部分将具有一个核心序列，该序列与天然序列或其生物活性片段的序列相同，或是其变体，该变体的氨基酸序列与天然氨基酸序列至少有70％相同性、且保留了天然氨基酸序列的生物活性。更佳的，该序列与天然序列的相同性至少为85％，至少为90％，或最佳的，至少为95％。
关于复合物的IFN部分，可采用的核心序列是天然序列、或其生物活性片段，或其变体，该变体的氨基酸序列与其的相同性至少为70％，更佳的至少为85％或至少为90％，最佳的为至少95％。这些类似物必须保留天然IFN序列或其片段的生物活性，或具有下述的拮抗剂活性。
本文所用的术语“序列相同性”指按照以下的方式比较序列。采用GeneticComputing Group′s GAP(全球序列对比程序)第9版进行序列对比，采用默认(BLOSUM62)的矩阵(数值为-4到+11)，敞开空隙罚分为-12(空隙的第一个零值)，延伸空隙罚分为-4(空隙中每个附加连续零值)。序列对比后，将匹配的数目表示成所要求序列中的氨基酸数目的百分数，计算出相同性百分数。
本发明的类似物还可按照下列步骤来测定。对于复合物的IFNAR部分或复合物的IFN部分，其天然序列的DNA是现有技术中已知的，这可在本说明书的背景技术章节中所引用的文献中找到，或很容易由本领域普通技术人员确定。在高度严谨或中度严谨条件下与天然DNA或RNA之互补序列杂交的任何核酸(如DNA或RNA)所编码的多肽也被认为包括在本发明的范围内，只要该多肽保留了天然序列的生物活性，或在IFN情况下保留了生物活性或具有拮抗剂活性。
严谨条件与杂交实验中所用的温度、一价阳离子的摩尔浓度以及杂交溶液中甲酰胺的百分数呈函数关系。为了测定任何一组给定条件涉及的严谨度，首先采用Meinkoth等人，(1984)的方程式来测定100％相同性的杂交物的稳定性，该稳定性表示成DNA-DNA杂交物的解链温度Tm：Tm＝81.5℃+16.6(LogM)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L，其中M是一价阳离子的摩尔浓度，％GC是DNA中G和C核苷酸的百分数，％form是杂交溶液中甲酰胺的百分数，L是杂交物中碱基对的长度。对于Tm从100％相同性的杂交物的计算值每下降1℃，允许错配的量增加约1％。因此，如果对于任何给定杂交实验，在指定的盐和甲酰胺浓度下所用的Tm比根据Meinkoth方程式计算出的100％杂交的Tm低10％，则即使有高达约10％的错配，仍会发生杂交。
在这里，高度严谨的条件能耐受约15％的序列差异，而中等严谨条件能耐受约20％的序列差异。高度严谨(比杂交物计算出的Tm低12-15℃)和中等严谨(比杂交计算出的Tm低15-20℃)条件的非限制性例子是，在低于杂交所计算出的Tm的合适温度下采用2X SSC(标准柠檬酸盐溶液)和0.5％ SDS的洗液。该条件的极限严谨度主要取决于洗涤条件，尤其当所用的杂交条件是允许较不稳定的杂交和稳定的杂交一起形成的杂交条件。然后用较高严谨度的洗涤条件除去较不稳定的杂交物。可以和上述的高度严谨至中等严谨洗涤条件一起使用的常用杂交条件是在6X SSC(或6XSSPE)、5X Denhardt′s试剂、0.5％SDS、100微克/毫升变性的片段化鲑精DNA的溶液中、低于Tm约20-25℃的温度下进行杂交。如果采用混合的探针，则宜采用四甲基氯化铵(TMAC)来代替SSC(Ausubel，1987，1998)。
本文所用的术语“功能性衍生物”包括用本领域已知的方法从残基侧链上的官能团或N-或C-端基团制得的衍生物，它们均包括在本发明的范围内，只要它们是药学上可接受的，即它们如本文所述的那样不破坏复合物相应蛋白的生物活性，且没有赋予含有该衍生物的组合物或由其制得的复合物毒性。衍生物可以具有化学基团，如糖类或磷酸残基，只要这种片段具有相同的生物活性并且是药学上可接受的。
例如，衍生物可包括羧基基团的羧基脂肪族酯，羧基的酰胺(通过与氨或伯氨或仲胺反应获得)，氨基酸残基的游离氨基与酰基部分(例如烷酰基或碳环芳酰基)形成的N-酰基衍生物，或游离的羟基(例如丝氨酰或苏氨酰残基)与酰基部分形成的O-酰基衍生物。这些衍生物还包括，例如，聚乙二醇侧链，它可遮蔽抗原性位点，并延长复合物或其部分在体液中的停留时间。
术语“衍生物”只包括那些没有一个氨基酸变成20种常见的天然氨基酸中的某一种氨基酸的衍生物。
本文的术语“盐”指本发明复合物或其类似物的羧基盐以及氨基的酸加成盐。羧基基团的盐可用本领域已知的技术制得，其包括无机盐，例如钠、钙、铵、铁或锌盐等，以及和有机碱(如胺(三乙醇胺)、精氨酸或赖氨酸、哌啶、普罗卡因等)形成的盐。酸加成盐例如包括与无机酸(如盐酸或硫酸)形成的盐，以及和有机酸(例如乙酸或草酸)形成的盐。当然，任何这些盐必须具有与本发明的复合物或其类似物基本相似的生物活性。
本文所用的术语“生物活性”的解释如下。就复合物的IFNAR2部分而言，其重要的生物活性是能结合I型干扰素。因此，必须选择那些类似物或变体、盐和功能性衍生物，使它们具有这种结合干扰素的能力。这可通过常规的结合测定实验来测试。另外，也可使用IFNAR2的片段或其类似物，只要它们具有结合干扰素的活性。片段很容易这样制得：除去结合干扰素的多肽之任一端的氨基酸，测试产物结合干扰素的性能。一次从多肽的N端或C端除去一个氨基酸的蛋白酶是已知的，因此测定保留结合干扰素能力的片段只涉及常规实验。
另外，具有这种结合干扰素活性的多肽，无论它是IFNAR2、sIFNAR2、其类似物、变体、盐、功能性衍生物还是片段，均可具有附加的氨基酸残基连接在结合干扰素之多肽的侧面。只要所得的分子保留了核心多态结合干扰素的能力，就可以用常规实验来确定这些侧接的残基是否影响核心肽的基本的新特性(即结合干扰素的特性)。术语“基本上由组成”在指特定序列时，指可以存在而不影响指定序列的基本新特性的附加侧接残基。该术语不包括指定序列内的替代、缺失或添加。
尽管在整篇描述和实施例中使用的是IFNAR2或sIFNAR2，但应理解，这只是较佳的实施例，IFNAR1亚基、尤其是它的胞外结构域可代替IFNAR2，无论在本公开中是否称IFNAR2。IFNAR1只能和与其结合的干扰素联合使用。已知IFNAR1结合IFNα。采用IFNAR1的任何复合物必须是一种干扰素、较佳的是一种与IFNAR1结合的IFNα。
对于本发明复合物的干扰素部分，在其任何类似物或变体、盐、功能性衍生物或片段中必须保留的生物活性是取决于预期用途的干扰素的活性。在大多数情况下，该生物活性是结合天然细胞表面受体并由受体产生介导信号的能力。因此，任何这些类似物、衍生物或片段应保留这种受体拮抗活性，以便在本发明中用于这种用途。另一方面，有时需要对受体具有拮抗活性的分子，以阻止天然干扰素的生物活性。利用本发明的复合物，这种拮抗剂也可用来获得延长的有益效应。对于希望消除干扰素不利影响的这些用途，仍与受体结合以及与复合物的IFNAR部分结合、但不介导信号传递并阻断天然干扰素产生信号的类似物可能也被认为具有生物活性，可用于本发明的目的，并且当其以本发明复合物形式使用时，也包括在术语干扰素的范围内。直接的试验能够确定任何此类类似物是否保留了这种受体拮抗活性或具有受体拮抗活性，从而可用于本发明的一种用途。
本发明还涉及编码本发明的上述复合物及其类似物的DNA序列，以及用于在合适的原核或真核宿主细胞中表达、携带这些DNA序列的DNA载体。用重组蛋白表达系统产生大量异源蛋白的能力导致开发出各种治疗剂，例如t-PA和EPO(Edington，1995)。可产生重组蛋白的各种表达宿主范围包括原核生物来源(例如细菌)(Olins，1993)，从低等真核生物(例如酵母)(Ratner，1989)到高等真核动物(如昆虫和哺乳动物细胞)(Reuveny，1993；Reff，1993)。所有这些系统依靠的是相同的原理—将感兴趣蛋白的DNA序列导入所选类型的细胞中(以瞬时或稳定的方式，作为整合的元件或附加的元件)，利用宿主转录、翻译和转运机制将导入的DNA序列过度表达成异源蛋白(Keown，1990)。
除了表达天然的基因序列外，在核苷酸水平上操纵DNA的能力加速了新的工程改造序列的开发，这些序列尽管根据的是天然的蛋白，却因蛋白质一级结构变化而具有新的活性(Grazia，1997)。
而且，可将所选的DNA序列物理连接来产生转录物，该转录物形成新的融合蛋白，现在该独立蛋白可以一个多肽单位表达(Ibanez，1991)。这些融合蛋白的活性可以不同，例如比任何一个单独的蛋白质都更有效(Curtis，1991)。
人IFNβ从采用哺乳动物中国仓鼠卵巢细胞(CHO)的生产过程衍生获得。I型干扰素可以在各种宿主细胞中表达，这些宿主包括细菌(Utsumi，1987)、昆虫(Smith，1983)和人(Christofinis，1981)。人sIFNAR2也用CHO宿主细胞来表达。另外，可溶性受体如sIFNAR2也可在细菌表达系统中成功表达(Terlizzese，1996)。用导致表达载体重组和整合的转染步骤将各基因的DNA导入CHO基因组中。然后，分离表达感兴趣蛋白质的细胞，培育，用本领域熟知的标准工业实践方法回收和纯化蛋白质。
本发明还涉及一种药物组合物，该组合物包含IFNAR2/IFN复合物、或其类似物、或其混合物、或其盐作为活性组分，以及一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。本发明的药物组合物的一个例子包括在病毒性疾病治疗、抗癌治疗、免疫调节治疗以及干扰素及其相关细胞因子的其它适应症中用来增强IFN作用的药物组合物。
本发明的药物组合物可通过将复合物或其类似物与生理上可接受的载体和/或稳定剂和/或赋形剂混合而配制用于给药，并制成剂型，例如在药剂瓶中冻干。给药方法可以是类似试剂的任何可接受的给药方式，这取决于要治疗的病症，例如静脉内、肌内、皮下、局部注射或外用或连续灌输等。活性化合物所给予的量取决于给药途径、待治疗的疾病以及患者的疾病状况。例如，局部注射需要的蛋白质剂量(以体重计)低于静脉内灌输。
游离的IFNβ有寡聚化的趋势。为了阻抑该趋势，目前的IFNβ制剂具有酸性的pH，这可能会在给药时产生一些局部的刺激。由于IFNAR可作为IFNβ的稳定化因素从而阻止寡聚，因此在IFNβ制剂中使用IFNAR能使IFNβ稳定，从而无需使用酸性制剂。因此，本发明的另一部分是一种非酸性的药物组合物，该组合物含有IFNβ和IFNAR，以及其它常规的药学上可接受的赋形剂。
本发明还涉及本发明的复合物或其类似物或其混合物在抗病毒、抗癌以及免疫调节治疗中的应用。具体地说，本发明的干扰素受体-干扰素复合物可用于抗病毒治疗，用于以下这些治疗适应症：慢性肉芽肿疾病、尖锐湿疣、青春期喉乳头状瘤病、甲型肝炎和乙型和丙型肝炎病毒的慢性感染。
具体地说，本发明的干扰素受体-干扰素复合物可在以下这些治疗性适应症中用于抗癌治疗：毛细胞白血病、Kaposi肉瘤、多发性骨髓瘤、慢性骨髓性白血病、非Hodgkin淋巴瘤和黑色素瘤。
本发明的干扰素受体-干扰素复合物还可用于免疫调节治疗例如多发性硬化、类风湿性关节炎、重症肌无力、糖尿病、AIDS、狼疮等。
同样，本发明还涉及该复合物或其类似物或混合物在制备用于治疗上述疾病或用于上述适应症的药剂中的应用。
现在将在下列非限制性实施例和附图中更详细地描述本发明。
实施例
                           材料和方法
                 抗病毒WISH生物试验和复合物的制备
根据Novick等人(1982)的方法设计WISH试验。
                              材料
●WISH细胞(ATCC CCL25)
●疱疹性口腔炎病毒原种(ATCC V-520-001-522)，-70℃保藏
●IFNβ，人重组体，InterPharm Laboratories LTD 90×106IU/毫升，比活：264.5
  ×106IU/毫克。
●可溶性人IFNAR2，373微克/毫升贮存液浓度，PBS配
●WISH生长培养基(高葡萄糖含量的MEM，含有Earls盐+10％FBS+1.0％L-
  谷氨酰胺+青霉素/链霉素(100U/毫升，100微克/毫升))
●WISH试验培养基(高葡萄糖含量的MEM，含有Earls盐+5％FBS+1.0％L-
谷氨酰胺+青霉素/链霉素(100U/毫升，100微克/毫升)，MTT 5毫克/毫升，
PBS配)，-70℃保藏。
                           方法
●将重组人IFNβ用WISH试验培养基稀释至19IU/毫升(4倍于预定的EC50剂
  量)。
●从90微克/毫升起，在Eppindorf管中用WISH试验培养基3倍稀释人重组
  sIFNAR2 11次。第12个管只含有WISH试验培养基。
●在平底96孔板的每个孔中加入25微升IFNβ(在一个3×12孔区域中单独加
  入25微升WISH试验培养基，作为没有IFNβ存在时IFNAR2之效果的对
  照)。
●在96孔板的后面12排一式三份加入25微升各稀释度的sIFNAR2(或在第12
  排只加入试验培养基)。
●在加入WISH细胞前，在37℃培育箱中预先培育IFNβ和sIFNAR2 1-4小时。
●用胰蛋白酶/EDTA溶液收获对数生长阶段的WISH细胞，用WISH试验培
  养基洗涤，至最终浓度为0.8×106细胞/毫升。
●在每个孔中加入50微升WISH细胞悬液(每个孔有4×104细胞)。接触细胞
  的IFNβ和IFNAR2的最终浓度是，IFNβ的最终浓度为4.75IU/毫升(1X)，第
  1排中sIFNAR2的最终浓度为22.5微克/毫升。
●在5％CO2潮湿的培育箱中培育24小时后，将50微升VSV原液的1∶10
  稀释液(该剂量预定能在48小时内裂解100％的WISH细胞)加入除没有病毒
  的对照孔(这些对照孔只加入等体积的试验培养基)之外的所有孔中。
●再过48小时后，将25微升MTT溶液加入所有孔中，然后在培育箱中培育
  平板2小时。
●将板倒置，除去孔中物质，在孔中加入200微升100％乙醇。
●1小时后，用Soft max Pro软件包和Spectramax分光光度计系统(Molecular
  Devices)在595纳米下读取平板的数值。
所有测序反应用ThermoSequenaseTM放射标记的终止循环测序试剂盒(AmershamLife Science；Cleveland，OH)来进行。采用由生产商提供的步骤。所有测序反应物在含有6％聚丙烯酰胺和7M尿素的CastAwayTM Precast测序凝胶(Stratagene；LaJolla，CA)上进行。测序反应物以A-C-G-T的次序上样。人工读取测序凝胶的放射自显影。用Genetics Computer Group Sequence Analysis Software Package和UNIX工作站进行DNA序列分析。
实施例1
为了评价人IFNAR2/IFNβ复合物和人IFNAR2Ig-IFNβ复合物的抗病毒活性，使固定浓度的IFNβ(4.75IU/毫升)和浓度变化(0.25-30000毫微克/毫升)的人sIFNAR2(重组p40)或人IFNAR2Ig 37C预先培育3小时，然后在WISH-VSV致细胞病变试验中测试。在没有IFN时，没有检测到抗病毒保护作用(数据未显示)。
I型干扰素(在预定的EC50浓度下使用)在约30毫微克/毫升sIFNAR2存在下的抗病毒活性显示出和IFNβ一起时有最优的拮抗活性，但是单独使用时没有。通过VSV攻击48小时后的MTT转变来测定抗病毒活性。
当IFN以预计的EC50浓度存在时，观察到有保护作用(见图1；吸收值等于0.45，没有保护的吸收值约等于0.0，完全保护的吸收值约等于1.8)。当在不同浓度下滴定IFNAR2或IFNAR2Ig时，在IFNAR2和IFNAR2Ig升高至32毫微克/毫升期间，IFNβ的活性增强约4倍(另见实施例2和图2)。当IFNAR或IFNAR2Ig高于32毫微克/毫升时，IFNβ活性如所预计的那样降低，这估计是由于sIFNAR与膜结合的IFNAR竞争结合IFNβ而致。因此，本实验为IFNβ在IFNAR2/IFNβ复合物中效力提高、活性增强提供了支持。
实施例2
在除ED50外的不同IFNβ浓度下，测定改变IFNβ浓度对sIFNAR2/IFN复合物活性的影响。从图2可以看出，在4.75IU/毫升的IFNβ下，预先培育IFNAR2 1小时使得IFNβ的活性在约32毫微克/毫升的最大浓度下增高约2倍。在各种IFNβ浓度更高的情况下，不可能检测到IFNβ抗病毒活性的增强，因为此时活性已经是最高的了。这些结果还支持这样一个观点，即IFNAR2/IFNβ复合物具有增强的IFN活性。
实施例3
通过评价亚有效浓度IFNβ(0.95IU/毫升)和不同浓度的IFNAR2预培育不同时间下的抗病毒活性，测定IFNAR2/IFNβ复合物形成的动力学。如图3所示，4小时的预培育时间是在此亚有效剂量下提供增强的IFNβ抗病毒活性所必需的。因此，在本身无活性的IFNβ水平下，加入IFNAR2产生一复合物会产生显著的IFN抗病毒活性。本实验为IFNAR2/IFNβ复合物增强IFN活性提供了另一个证据。
实施例4
已经知道，IFNβ生物活性在体外37℃重建(生理性缓冲盐溶液，pH7.4)后迅速下降。这至少部分是由于形成IFNβ寡聚结构而降低了活性。为了测试IFNAR2是否增强了IFNβ在生理性pH下稳定性，进行一个实验，单独培育不同浓度的IFNβ(在RPMI 1640培养基(Gibco)中)，或在相同培养基中在IFNAR2存在下培育IFNβ(IFNAR2与IFNβ之比恒定(2.5毫微克/IU))。
使IFNβ(500IU/毫升)与等体积的sIFNAR2(1.25微克/毫升)或单独的RPMI 37℃培育3小时。在加入WISH细胞前，在96孔板中WISH试验培养基中进行两种IFNβ溶液的滴定。24小时后加入VSV，再培育48小时后通过测定MTT转变来进行评价。
从图4可以看出，单用IFNβ的ED50约为104IU/毫升，而IFNβ与可溶性IFNAR2预培育后导致ED50明显增强，约为7IU/毫升。单用IFNβ的高ED50可能是由于溶液中IFNβ的寡聚作用。上述结果再次显示了IFNβ与IFNAR2复合后稳定性增强。
实施例5
为了评价IFNβ在有IFNAR2存在时的活性增强是否是受到sIFNAR的特异性保护，在与IFNAR2或其它浓度相同的不相关蛋白(人IgG，牛血清白蛋白(BSA))复合后评价IFNβ的活性。
如图5所示，使IFNβ(500IU/毫升)与等体积的指定蛋白(1.25微克/毫升)或单单RPMI 37℃预先培育4小时。在加入WISH细胞前，在96孔板WISH试验培养基中滴定这些IFNβ溶液。其中还包括新鲜制备的IFNβ，以确定预先培育对IFNβ活性的影响。24小时后加入VSV，再培育48小时后通过测定MTT转变来评价CPE。
2.5毫微克/IU IFNβ与非特异性蛋白质(即BSA或人IgG)的预培育在重建后不保护IFNβ的活性。在该试验中，IFNAR2/IFNβ复合物的活性与新鲜加入的IFNβ相似，这支持了sIFNAR2使IFNβ活性稳定的这样一个发现。
实施例6
根据ELISA和生物试验分析(图6和7)，IFNAR2/IFNβ复合物在小鼠体内显示出大大延长的药物动力学曲线。
对B6D2F1株小鼠静脉内快速注射单剂人IFNβ(2.5×106IU/千克)或与人IFNAR2(2.5毫微克/IU IFN)4℃预培育1小时的相同浓度的IFNβ。在给药后0.05-48小时，从眼眶后血管丛收集血清，分别用ELISA(图6)或WISH生物试验(图7)测定IFNβ浓度和IFNβ抗病毒活性。没有绘出在ELISA试验中低于试验灵敏度(7.55IU/毫升)的IFNβ血清浓度。
该复合物既没有显示出延长的药物动力学曲线，WISH抗病毒试验也没有显示出小鼠体内生物活性IFNβ的水平随时间大大增加，因此显示本发明的IFNAR2/IFNβ复合物相对于单独的IFNβ而言，具有增强的稳定性和延长的血浆半衰期。
实施例7
根据ELISA和生物试验测试(图8和9)，IFNAR2/IFNα2a复合物显示出IFNα2a在小鼠体内具有大大延长的药物动力学曲线。
使B6D2F1株小鼠接受静脉内快速注射单剂人IFNα(1.25×105IU/千克)或与人IFNAR2(14.9毫微克/IU IFN)4℃预培育1小时的相同浓度的IFNα。在指定时间从眼眶后血管丛收集血清，分别用ELISA(图8)或WISH生物试验(图9)测定IFNα2a浓度和IFNα抗病毒活性。
用对人IFNα特异性的ELISA测定IFNα。没有绘出在ELISA试验中低于试验灵敏度(30IU/毫升)的IFNα血清浓度。
该复合物既没有显示出IFNα有延长的药物动力学曲线，WISH抗病毒试验也没有显示出小鼠体内生物活性IFNα的水平随时间大大增加，因此显示本发明的IFNAR2/IFN复合物相对于单独的IFNα而言，具有增强的稳定性和延长的血浆半衰期。
实施例8
                    IFNAR2/IFN融合蛋白的工程改造
工程改造出构建物，用下列肽接头使IFNAR2胞外结构域的C端与成熟IFN的N端融合，其中G和S分别代表氨基酸甘氨酸和丝氨酸：
IFNAR2胞外域(接头)成熟的IFNβ
…ESEFS(GGGGS)nMSY...，其中n＝0(SEQ ID NO：5)、1(SEQ ID NO：7)、2(SEQ IDNO：6)、3(SEQ ID NO：5)、4(SEQ ID NO：4)和5(SEQ ID NO：3)
图10中显示了n＝2的IFNAR2/IFNβ融合物的全部氨基酸序列(SEQ ID NO：14)。
用含有基因表达人重组IFN的表达载体pSVEIF作为PCR的模板。设计合成引物，使得只能从模板上扩增出人IFN的成熟蛋白编码区(MSY...)。5′引物包括消化的SmaI位点的序列，IFNAR2的最后7个氨基酸(GQESEFS)(SEQ ID NO：14的残基344-349)以及(GGGGS)1(SEQ ID NO：1)接头。在5′PCR引物中还导入BamHI和XhoI位点，以便其它弹夹的克隆。3′引物含有一个AvrII位点，其紧跟在hIFNβ的TGA终止密码子后。PCR含有约1克模板DNA，PCR引物各1克，dATP，dCTP，dGTP和dTTP各0.2mM，1X ThermoPol反应缓冲液(10毫摩尔KCI，20毫摩尔Tris-HCl，(25℃时pH8.8)，10毫摩尔硫酸铵，2毫摩尔硫酸镁，0.1％Triton X-100：New EnglandBiolabs；Beverly，MA)和3毫摩尔硫酸镁(硫酸镁最终浓度为5毫摩尔)，反应体积为100微升。在99.9℃下进行VENTR初始培育30秒后，在反应物中加入2单位的VEMTRDNA聚合酶。PCR包括下列20个循环：(a)99.9℃ 30秒，(b)65℃-55℃ 30秒，每一轮循环降低0.5℃，和(c)75℃ 40秒。用上述过程再进行15轮循环，只是退火温度保持在55℃。用WizardTM PCR Preps DNA纯化系统(Promega；Madison，WI)纯化PCR反应物。在用AvrII消化PCR产物后，在低熔点琼脂糖凝胶上纯化反应物。将含有hIFNβ成熟蛋白序列以及1GS接头的凝胶纯化的片段连接到(SmaI+AvrII)消化的表达载体pCMV-p40中，该载体含有编码人重组IFNAR2可溶形式的基因。用标准方法(Sambrook等人，1989)用连接反应物转化感受态大肠杆菌XL-1 Blue细胞。通过PCR产生的“内部融合”区域的限制性内切酶消化和测序来确认称为pCMV-IFNAR2/IFNAβ GS的正确的构建组装件。随后用各自含BamHI突出端、合适的(GGGGS)n接头(SEQ ID NO：1，其中n＝1)和XhoI突出端的寡核苷酸弹夹工程改造构建物。0 GS弹夹含有SmaI和XhoI突出端。在确认了pCMV-IFNAR2/IFNAβ1 GS载体后，用BamHI和XhoI对其进行消化，然后将合适的弹夹连接到该载体中。对于0GS构建物，用SmaI和XhoI消化载体来连接该弹夹。
共产生6个载体，pCMV-IFNAR2/IFNβn(GS)，其中n代表0、1、2、3、4或5个GGGGS(SEQ ID NO：1)接头单元。这些限制性消化结果显示在图11中。设计测序引物，以便能对每个构建物的弹夹全部测序。用商用试剂盒和生产商描述的步骤(Qiagen；Chatsworth，CA)制备每个经确认的构建物的大规模质粒DNA培养物。
图12是pCMV-IFNAR2/IFNβ“内部融合”表达载体的代表性质粒图谱。IFNAR2/IFNβ融合蛋白的转录受人立即早期CMV启动子指导。用载体提供的人生长激素(hGH)聚腺苷酸化信号序列来加工IFNAR2/IFNβ转录物的3′端。
                        载体清单编号        名称               载体例子   GGGGS(SEQ ID
                                       NO：1)接头1   pCMV-IFNAR2-IFNβ，0GS    pCMV.PA4       N/A2   pCMV-IFNAR2-IFNβ，1GS    pCMV.PA4       1个3   pCMV-IFNAR2-IFNβ，2GS    pCMV.PA4       2个4   pCMV-IFNAR2-IFNβ，3GS    pCMV.PA4       3个5   pCMV-IFNAR2-IFNβ，4GS    pCMV.PA5       4个6   pCMV-IFNAR2-IFNβ，5GS    pCMV.PA4       5个获得IFNAR2/IFNβ 1GS融合物的PCR产生区域的序列信息；该信息表明序列如预计的那样。获得其它构建物的肽接头区域的序列信息；此序列也如预计的那样。
在经各构建物转染的细胞上进行Northern印迹分析。对于IFNAR2探针和IFNβ探针，在含有IFNAR2/IFNβn GS样品的所有泳道中均存在约1.4kb的条带。对于IFNβ探针，还发现另一条约0.9kb的条带。如此大小的条带对应于交替剪接的转录物，该转录物含有IFNAR2的最后6个氨基酸，(n)GS肽接头，以及hIFN成熟蛋白编码序列。这可通过对cDNA进行测序来加以确认，该cDNA从分离自实施例9中瞬时转染的CHO细胞的总RNA制得。
实施例9
瞬时转染。CHO-DUKX是中国仓鼠卵巢细胞缺少二氢叶酸还原酶活性的克隆突变株(Urlaub等人(1980)；Graff等人(1982))。该细胞维持在α最低必需培养基(αMEM)加上核糖核苷和脱氧核糖核苷中，还添加了10％胎牛血清(FBS)和1％L-谷氨酰胺(完全培养基)。用Lipofectamine PLUSTM试剂(GibcoBRL Life Technologies；Gaithersburg，MD)和生产商提供的方法进行瞬时转染。转染前约24小时，将细胞以每平皿2×106细胞的密度接种到直径100毫米的平皿中。转染采用4微克超螺旋载体质粒DNA(pCMV-IFNAR2/IFN nGS，其中n＝0、1、2、3、4、或5)。用生产商提供的无血清培养基来稀释DNA和作为PLUS试剂。在完全培养基中37℃培育48小时后，收集细胞上清进行ELISA(IFNAR2、IFNβ)和Western凝胶试验。
RNA抽提和Northern分析。从瞬时转染的CHO-DUKX细胞中抽提出细胞总RNA(Chomczynski等人，1987)。使每条泳道10克总RNA在含有甲醛作为变性剂的琼脂糖凝胶中按大小分级。样品一式两份上样。RNA通过10X SSC(1.5M氯化钠，0.15M柠檬酸钠)中的毛细管印迹转移到GeneScreen Plus尼龙膜(DuPont/NEM MedicalProducts；Boston，MA)上。使固定的RNA在Church和Gilbert(1984)改进的溶液中与32P-标记的hIFNAR2和hIFNβ PCR片段杂交。缓冲液含有0.25M磷酸钠，pH7.2，0.25M氯化钠，7％十二烷基硫酸钠(SDS)，1毫摩尔乙二胺四乙酸和100微克/毫升大肠杆菌tRNA。用商用试剂盒(“High Prime”Boehringer Mannheim；Indianapolis，IN)和其中描述的步骤产生32P标记的探针。在Sephadex G-50柱上层析除去未掺入的放射活性。杂交后，洗去印迹。所用的最严谨的条件为0.2X SSC，0.1SDS，65℃。使印迹进行放射自显影。
内部融合蛋白的表达。分别用IFNAR2特异性ELISA和IFNβ ELISA(Toray)分析瞬时转染入XHO细胞的各内部融合构建物的上清液的IFNAR2和IFNβ表达水平。该分析的结果显示在下表IV中。
                           表IV
                 瞬时转染入CHO细胞的内部构建物
样品鉴定 [hIFNβ]*，(U/ml) [hIFNAR2]，(ng/ml)   [hIFNβ]，(μg/ml)  [hIFNβ]＃(pmol)  [hIFNAR2]§(pmol)  IFN/IFNAR
  0GS   29,175     1094     0.146     6.571    31.802     0.207
  1GS   24,906     994     0.125     5.609    28.895     0.194
  2GS   13,597     600     0.068     3.063    17.442     0.175
  3GS   14,998     718     0.075     3.378    20.857     0.162
  4GS   9,998     535     0.050     2.251    15.538     0.145
  5GS   9,597     540     0.048     2.161    15.698     0.138
  IFNAR2   未发现     1176    34.200
  培养基   未发现     0
*-用TORAY试剂盒测定
-用hIFNAR2 ELISA测定
-根据比活为2.0×105U/毫克(2×108/毫克)
#-根据质量为22,200道尔顿(用MALDI-TOF分析hINFβ的平均质量)
§-根据质量为34,400道尔顿(用MALDI-TOF分析平均质量)
可以看出，随着接头长度的增加，观察到IFNAR2和IFNβ的可检测量减少。这时，不可能确定这是由于内部融合蛋白表达的量随接头长度的增加而减少，还是随着接头长度的增加，IFNβ能结合到IFNAR2结合位点中，从而不能被ELISA试验完全检测到。已知INFβ试验只检测不复合的IFNβ。
IFNAR2/IFNβ融合蛋白的Western印迹分析。为了确认内部融合蛋白以合适的分子量表达且没有游离的IFNβ表达，通过Western印迹，用抗IFNβ抗体来检测内部融合物，分析转染细胞的上清液。该分析的结果显示在图13中。
使15微升瞬时转染了IFNAR2/IFNβ构建物(泳道1-6)、或IFNAR2构建物(泳道7)的CHO细胞培养上清液、培养基(泳道8)或IFNβ(泳道9)在非还原性条件下进行SDS-PAGE，然后电泳转移到PVDF膜上。用家兔抗IFNβ抗体探测此膜，用碱性磷酸酶偶联的山羊抗家兔抗体通过Western-Star发光检测试剂盒来显影。
在任何内部融合构建物的上清液中均未检测到游离的IFNβ。同样，经Western印迹分析，每个构建物表达的蛋白具有每个内部融合构建物的适当分子量。
实施例10
内部融合分子的抗病毒活性。在致细胞病变试验中测试了每个含有内部融合物的培养物上清液的抗病毒活性，其中使WISH细胞(人羊膜细胞)接触VSV，然后加入IFNβ(对照)或内部融合物。结果显示在图14中。
将含有表达的重组蛋白的CHO细胞上清液(经ELISA和Western印迹测得)、或单用CHO培养基一式两份加入96孔平底组织培养板的顶排，每个孔中加入75微升。在板的其余孔内加入50微升WISH细胞试验培养基。从含有上清液(顶排)的孔中取出25微升加入含有50微升WISH试验培养基的下排孔中，如此对各样品作三倍系列稀释。在阳性对照孔中，用含有1000IU/毫升人IFNβ的WISH试验培养基代替顶排中的上清液，同样也沿板长度方向向下作三倍系列稀释。然后在每个孔中加入50微升WISH细胞悬液(0.6×106细胞/毫升，以WISH试验培养基配)，使得含有REBIF的顶排中的最终浓度为500IU/毫升，CHO细胞上清液的起始稀释度为1∶2。在5％CO2下37℃培育24小时后，在每个孔(除了标为未感染的对照孔外)中加入50微升含有疱疹性口腔炎病毒(1∶10的原种液)的WISH试验培养基。再培育48小时后，根据MTT转变测定WISH细胞的存活。
将达到EC50所需的上清液稀释倍数标准化成纯化的人IFNβ标准品所测得的EC50，测定内部融合分子所介导的抗病毒活性。随着接头长度的增加，内部融合构建物的抗病毒活性也随之增加。
实施例11
本实施例是在静脉内给药时小鼠体内的人IFNβ/sIFNAR2复合物的药物动力学研究。在预先进行的和分开注射的复合物组分之间进行比较。将36只D2F1株小鼠(6-8周龄)(每只约20克)分成下列4组：
组1有9只小鼠，静脉内快速注射单剂200微升50000IU/毫升人IFNβ的溶液(最终剂量为10,000IU/小鼠)。
组2(9只小鼠)接受5000IU/毫升人IFNβ和125毫克/毫升sIFNAR2(2.5毫微克/IU比)的200微升溶液。
组3(9只小鼠)接受(1)200微升125毫克/毫升的sIFNAR2溶液，然后接受(2)200毫升50000IU/毫升的人IFNβ(2.5毫微克/IU比)溶液。
组4(9只小鼠)接受(1)200微升的625毫克/毫升sIFNAR2溶液，然后接受(2)200毫升50000IU/毫升人的IFNβ(10毫微克/IU比)溶液。
在指定时间用毛细管破坏眼眶后静脉血管丛，收集血样(每份样品约200微升)。每组3只小鼠在给药后0.05、2和12小时时取血样。每组的3只小鼠在给药后0.54和24小时后取血样，每组的3只小鼠在给药后1、8和48小时后取血样。使血样在室温下凝集1小时，显出边缘(rimmed)并微量离心。将从中取出的血清-70C保藏，直至收集了所有的样品。用Toray人IFNβ ELISA试剂盒(TFB，Inc.)，通过IFNβ特异性ELISA测定血清中人IFNβ的存在，用WISH抗病毒试验测定生物活性。
IFNβ特异性ELISA试验的结果显示在图15A中，WISH抗病毒试验的结果显示在图15B中。
可以看出，以IFNAR2复合物形式注射入的IFNβ的血清半衰期与在分开注射IFNAR后注射IFNβ的血清半衰期相似。这些结果与半衰期增加的IFNβ/IFNAR2复合物的体内形成相符。
实施例12
用“通用”IFN(人IFNαA/D)和sIFNAR2的复合物处理C57BL/6小鼠。与单独给予各种剂量的通用IFN或对照相比，测定细胞毒性方面的保护作用。第1组接受5×103IU通用IFN，其与5/毫微克IU sIFNAR2复合。第2组接受5×103IU通用IFN。第3组接受5×104IU通用IFN，第4组接受PBS/2％NMS。对于每一只小鼠，测定脾细胞对抗NK靶细胞YAC-1的细胞毒性作为NK活性。结果显示在图16中。与单用通用IFN处理的小鼠相比，经通用IFN/sIFNAR2复合物处理的小鼠中的NK活性明显较高。
实施例13
如上所述，药物动力学研究已经证实，当I型IFN以与sIFNAR2(IFN受体亚基的可溶形式)的复合物形式给药时，显著增加了其血清半衰期。体外结果提示，与IFNAR2的物理结合导致通常不稳定的IFN稳定化。为了确定增加的PK曲线和IFNAR2的稳定化作用是否在体内增加和延长了IFN介导的效果，开发了一个模型，系采用致死剂量的IFN-敏感型Daudi人B细胞淋巴瘤细胞系(Ghetie，1991；Ghetie，1990)攻击重度联合免疫缺陷(scid/scid)的小鼠。这些小鼠在注射肿瘤细胞后14-20天之间产生瘫痪，并伴随有扩散性淋巴瘤的组织学证据。值得注意的是，通过每天皮下给予人IFNβ，这些小鼠的存活可以依赖于剂量的方式延长。用该模型来评价IFNAR2作为体内I型IFN相关生物活性的增效剂。
为了确定在Daudi scid模型中瘫痪平均时间与IFNβ剂量之间的关系，使5组5只4-5周龄的BALB/cByJSmn-scid/scid株小鼠接受人IFNβ的皮下给药，每只小鼠每天接受200微升，从第0天到第30天。从冷冻原种扩大的标准Daudi细胞剂量为第0天每只小鼠颈背皮下注射PBS配的5×106个细胞。各组小鼠接受下列量的IFN：
组1：每只小鼠135×104IU(675×104IU/毫升)。
组2：每只小鼠45×104IU(225×104IU/毫升)。
组3：每只小鼠15×104IU(75×104IU/毫升)。
组4：每只小鼠5×104IU(25×104IU/毫升)。
瘫痪时间个体值和平均值显示在表V中。
                         表V
                    瘫痪天数                  平均值(±SD)
组1    26，    31，    35，    37，    40，    33.8(5.4)
组2    20，    23，    23，    23，    26，    23.0(2.1)
组3    20，    20，    22，    22，    23，    21.4(1.3)
组4    17，    18，    18，    18，    18，    17.8(0.5)
组5    14，    14，    15，    15，    15，    14.6(0.6)
因此可以看出，在Daudi/scid异体移植模型中，通过每天皮下给予人IFNβ而以依赖于剂量的方式延长了瘫痪的平均时间。
实施例14
为了确定IFNβ的抗肿瘤效果是否能通过和IFNAR2(比例为2.5毫微克/IU)复合来增强，用实施例13讨论的相同程序处理七组每组5只小鼠，给予各组的试验材料如下：
单用IFNβ/小鼠       IFNβ加上sIFNAR2/小鼠
组1    2×102IU     组4    2×102IU加上0.5微克
组2    2×103IU     组5    2×103IU加上5.0微克
组3    2×104IU     组6    2×104IU加上50.0微克
组7接受Daudi细胞，只用稀释剂处理
下表中显示了瘫痪时间的个体值和平均值：
                     表VI
                瘫痪天数             平均值(±SD)
组1    16，  16，  17，  18，  19      17.2(1.3)
组2    17，  18，  18，  19，  19      18.2(0.8)
组3    17，  17，  17，  18，  18    17.6(0.9)
组4    17，  17，  18，  18，  19    17.8(0.8)
组5    17，  18，  19，  20，  20    18.8(1.3)
组6    21，  22，  22，  23，  26    22.8(1.9)*
组7    16，  16，  17，  17，  17    16.6(0.6)
*在配对组比较中，经单向ANVOA测得，与相同浓度的未复合形式的IFNβ明显不同(p值小于等于0.05)。
可以看出，低剂量(2×104IU/小鼠/天)的IFNβ以及Daudi/scid异体移植模型的抗肿瘤活性经与IFNAR2复合后明显增强。
在另一个实验(未显示)中，研究了注射频率对瘫痪时间平均值的影响。结果确定，在Daudi/scid异体移植模型中，与每天一次的经常性注射游离IFNβ相比，每周注射一次IFNβ/IFNAR G2复合物的治疗可以获得明显增强的抗肿瘤活性。另外，在另一个实验(未显示)中，测试了IFNAR与IFNβ的最优比例。发现在单一的IFNβ浓度下(2×104/IU/小鼠/天)增强抗肿瘤活性的IFNAR2：IFNβ最适比为每皮克IFNβ2.5毫微克IFNAR2。
在第二个实验中，发现在IFNβ浓度为5×104IU/小鼠/天时，增强抗肿瘤活性的IFNAR2：IFNβ最适比为每皮克IFNβ0.3毫微克IFNAR2。这两个实验表明最适比取决于IFNβ的浓度，并似乎表明IFNβ的浓度越高，需要的比例越低。
在采用相同模型的另一个实验中，确认在该研究中单独给予IFNAR2不会提高小鼠的存活率。
实施例15
本实施例是在静脉内快速注射单剂后测定小鼠血清中内部融合物5GS分子之血清半衰期的药物动力学研究。将21只雌性B6D2F1株小鼠(6-8周)(每只约20克)分成下列三组：
组1：有9只小鼠，静脉内快速注射单剂200微升的100000IU/毫升内部融合物5GS溶液(最终剂量为20,000IU/小鼠或5×106IU/千克)。
组2：(9只小鼠)接受200微升100000IU/毫升的人IFNβ溶液。
组3：含有三只未经注射的小鼠作为阴性对照。
假定每只小鼠的血液体积约为2毫升，则组1和组2的Cmax和Tmax理论值为10000IU/毫升。在给药后0.05、2和12小时，取组1和组2的三只小鼠的血样。在给药后0.5、4和24小时，取组1和组2的三只小鼠的血样，在给药后1、8和48小时，取组1和组2的三只小鼠的血样。用WISH试验测定血清中生物活性人IFNβ的存在。
结果显示在图17中。尽管IFNβ几乎被立即清除，但是内部融合分子仍在注射后长时间保留在血清中。这表明融合蛋白具有所需的稳定化作用。
前文关于具体实施方案的描述非常全面地揭示了本发明的总体特征，其它人很容易在不脱离本文一般内容下利用现有的知识无需过多试验来修改和/或使这些具体的实施方案适应各种应用，因此，这些修改和适应应包括在本发明所公开实施方案之等效方案的范围和意义内。应理解，本文所用的措辞或术语是为了描述，而不是限制。实施本文公开的各种功能的手段、材料和步骤可以在不脱离本发明的情况下有各种替换形式。因此，在上文的说明书和/或下文的权利要求中可以找到的表述“指”和“意味着”或其后有功能性描述的任何方法步骤的表述定义并涵盖了现在或将来可能存在来实施所述功能的任何结构性、物理、化学或电子元件或结构或任何方法步骤，无论其是否确切地与上文说明书所公开的实施方案等效，即，可采用实现相同功能的其它方法或步骤；这些表述的目的是给出其最宽的解释。
参考文献
Alam等人，＂肌内给予健康男性和女性志愿者两种重组人干扰素β-1(IFNβ-1α)产品的药物动力学和药效学比较＂，Pharmaceutical Research 14：546-549(1997)
Anfinsen，＂控制蛋白链折叠的原理＂，Science 181：223-230(1973)
Ausubel等人，《当代分子生物学方法》，Greene Publications Wiley Interscience(New York，1987-1992)
Baron等人，＂干扰素：在病毒性感染中具有治疗潜力的生物系统＂，Antiviral Res.24：97-110(1994)
Baro，等人，＂干扰素。作用机理和临床应用＂，J.Am.Med.Assoc.266：1375-1383(1991)
Chomczynski等人，Anal.Biochem.162：156-159(1987)
Christofinis，G.J.，＂不同来源的人淋巴母细胞样细胞系的干扰素生产＂，Journal ofGeneral Virology 52：169-171(1981)
Church等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：1991-1995(1984)
Colamonici等人，＂造血细胞上干扰素α受体的多链结构＂，J.Immunol.148：2126-2132(1992)
Colamonici等人，＂位于人染色体21上的I型干扰素受体的新亚基的鉴定＂J.Biol.Chem.268：10895-10899(1993)
Curtis，B.M.，＂人粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子-白介素3融合蛋白的增强的造血活性＂Proc.Natl.Acad.Sci.88：5809-5813(1991)
Domanski等人，＂长形式的干扰素β亚基的克隆和表达，β受体是信号传导所需的＂，The Journal of Biological Chemistry 270：6(1995)
Duncan等人，＂转录因子干扰素调控因子-1是体内天然杀伤细胞功能所必需的＂，J.Exp.Med.184：2043-2048(1996)
Dron等人，＂干扰素α/β基因结构和调节＂，《干扰素：理论和医学应用》，Baron等人编辑，(Unniversity of Texas Medical Branch：Galveston，TX，1992)33-45页
Edignton，S.M.，＂作为领先药物的生物技术制品＂，BioTechnology 13：649(1995)
Ertel等人，Arch.Surg.129：1(1994)
Fierlbeck等人，＂在恶性黑色素瘤的长期治疗期间重组IFNβ的药效学＂，Journal ofInterferon and Cytokine Research 16：777(1996)
Ghetie等人，Cancer Research 51：5876(1991)
Ghetie等人，Blood 80：2315(1990)
Graff等人，Mol Cell.Bio1.2：93-96(1982)
Grantham，Science 185：X62-X64(1974)
Grazia Cusi，M.，＂具有双功能和拮抗活性的花斑粒细胞集落刺激因子白介素6分子＂，Immunotechnology 3：61-69(1997)
Ibanez，C.F.，＂具有多发性神经营养活性的嵌合分子揭示了决定NGF和BDNF特异性的结构元件＂，EMBO Journal 10：2105-2210(1991)
Kazam等人，J.Biol.Chem.270：1(1995)
Keown，W.A.，＂将DNA导入哺乳动物细胞的方法＂，Methods in Enzymology185：527-537(1990)
Lengyl，P.，＂干扰素的生物化学及其作用＂，Ann.Rev.Biochem.51：251-282(1982)
Lutfalla等人，＂突变型U5A细胞与通过交替加工细胞因子受体基因簇新成员而产生的干扰素-α/β受体亚基互补＂，EMBO Journal 14：5100-5108(1995)
Meinkoth等人，Anal.Biochem.138：267-284(1984)
Nagai等人，Nature 309：810(1984)
Novick等人，J.Immunol.129：2244-2247(1982)
Novick等人，＂可溶性干扰素-α受体分子存在于体液中＂FEBS Lett.314：445-448(1992)
Novick等人，＂人干扰素a/b受体：特性分析和分子克隆＂，Cell 77：391-400(1994)
Novick等人，＂人IFN-α/β受体的可溶性和膜锚着形式＂，J.Leuk.Bio.57：712-718(1995)
Olins，P.O.，＂大肠杆菌中异源基因表达的最新进展＂Current Opinion inBiotechnology 4：520-525(1993)
Pestka，等人，＂干扰素及其作用＂，Ann.Rev.Biochem.56：727-777(1987)
Platanias等人，＂干扰素α受体的α亚基的特性分析：N-和O-连接的糖基化与其它表达蛋白结合的证据＂，J.Immunol.150：3382-3388(1993)
Platanias等人，＂I型干扰素受体的α和β亚基的酪氨酸磷酸化＂，J.Biol.Chem.269：17761-17764(1994)
Platanias等人，＂干扰素α和β信号传导的不同＂J.Biol.Chem.271：23630-23633(1996)
Qureshi等人，＂Stat2蛋白在α干扰素的转录激活中的功能＂，Mol.Cell.Bio.16：288-293(1996)
Ratner，M.，＂酵母中的蛋白表达＂Bio/Technology 7：1129-1133(1989)
Reff，M.，＂哺乳动物细胞中重组免疫球蛋白的高水平生产＂，Current Opinion inBiotechnology 4：573-576(1993)
Reuveny，S.，＂高密度昆虫细胞培养物中重组蛋白的产生＂，Biotechnology andBioengineering 42：235-239(1993)
Salmon等人，＂重组人IFNβ在健康男性志愿者中的药物动力学和药效学＂，Journal of Interferon and Cytokine Research 16：759(1996)
Sambrook等人，《分子克隆实验指南》，第2版，Cold Spring Harbor Press(ColdSpring Harbor，NY，1989)
Sharf等人，＂干扰素共有序列结合蛋白(ICSBP)的功能性结构域分析及其与干扰素调控因子的结合＂，J.Biol.Chem.270：13063-13069(1995)
Smith，G.E.，＂在杆状病毒表达载体感染的昆虫细胞中生产人β干扰素＂，Molecularand Cellular Biology 3：2156-2165(1983)
Szilagyi等人，Biochim.Biophys.Acta 1251：1(1995)
Tan等人，＂人干扰素诱导的抗病毒蛋白与靛酚氧化酶B性状的基因和染色体G-21相连＂，J.Exp.Med.137：317-330(1973)
Terlizzese，M.＂可溶性TNF受体p75(TBPII)与可溶性TNF受体p55(TBPI)对TNF-α和TNF-β的抑制能力的体外比较＂，Journal of Interferon and Cytokine Research16：1047-1053(1996)
Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220(1980)
Utsumi，J.，＂大肠杆菌衍生获得的重组人干扰素-β的特性分析与成纤维细胞人干扰素-β的比较＂，Journal of Biochemistry 101：1199-1208(1987)
Uze等人，＂功能型人干扰素α受体基因转移到小鼠细胞中：其cDNA的克隆和表达＂，Cell 60：225-234(1990)
Weissmann等人，＂干扰素基因＂Prog.Nucleic Acid Res.33：251-302(1986)
Yan等人，＂TYK2结合和信号转导所需的α干扰素受体1亚基(IFNaR1)结构域的分子特性分析＂，Mol.Cell.Bio.16：2074-2082(1996)
Yang等人，＂STAT3与人I型干扰素受体IFNAR-1链的直接结合＂，J.Biol.Chem.271：8057-8061(1996)
                  序列表<110>TEPPER，Mark
 CUNNINGHAM，Mark
 SHERRIS，David
 EL TAYAR，Nabil
 McKENNA，Sean<120>IFNAR2/IFN复合物<130>TEPPER1A.SEQ<140>未收到<141>1998-12-18<150>60/068，295<151>1997-12-19<160>14<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>5<212>PRT<213>未知<220><223>未知生物体的描述：肽<400>lGly Gly Gly Gly Ser1               5<210>2<211>4<212>PRT<213>未知<220><223>未知生物体的描述：肽<400>2Ile Glu Glu Arg1<210>3<211>33<212>PRT<213>未知<220><223>未知生物体的描述：肽<400>3Glu Ser Glu Phe Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly1               5                  10                  15Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ser
         20                  25                  30Tyr<210>4<211>28<212>PRT<213>未知<220><223>未知生物体的描述：肽<400>4Glu Ser Glu Phe Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly1               5                  10                  15Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ser Tyr
         20                  25<210>5<211>23<212>PRT<213>未知<220><223>未知生物体的描述：肽<400>5Glu Ser Glu Phe Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly1               5                  10                  15Gly Gly Gly Ser Met Ser Tyr<210>6<211>18<212>PRT<213>未知<220><223>未知生物体的描述：肽<400>6Glu Ser Glu Phe Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met1               5                  10                  15Ser Tyr<210>7<211>13<212>PRT<213>未知<220><223>未知生物体的描述：肽<400>7Glu Ser Glu Phe Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ser Tyr1               5                  10<210>8<211>36<212>PRT<213>未知<220><223>未知生物体的描述：肽<400>8Glu Ser Glu Phe Ser Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu1               5                  10                  15Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro
         20                  25                  30Gln Met Ser Tyr<210>9<211>23<212>PRT<213>未知<220><223>未知生物体的描述：肽<400>9Glu Ser Glu Phe Ser Glu Phe Met Glu Phe Met Glu Phe Met Glu phe1               5                  10                  15Met Glu phe Met Met Ser Tyr
         20<210>10<211>20<212>PRT<213>未知<220><223>未知生物体的描述：肽<400>10Glu Ser Glu Phe Ser Glu Phe Met Glu Phe Met Glu Phe Met Glu Phe1               5                  10                  15Met Met Ser Tyr
         20<210>11<211>17<212>PRT<213>未知<220><223>未知生物体的描述：肽<400>11Glu Ser Glu Phe Ser Glu Phe Met Glu Phe Met Glu phe Met Met Ser1               5                  10                  15Tyr<210>12<211>21<212>PRT<213>未知<220><223>未知生物体的描述：肽<400>12Glu Ser Glu Phe Ser Glu Phe Gly Ala Gly Leu Val Leu Gly Gly Gln1               5                  10                  15Phe Met Met Ser Tyr
         20<210>13<211>34<212>PRT<213>未知<220><223>未知生物体的描述：肽<400>13Glu Ser Glu Phe Ser Glu Phe Gly Ala Gly Leu Val Leu Gly Gly Gln1               5                  10                  15Phe Met Glu Phe Gly Ala Gly Leu Val Leu Gly Gly Gln Phe Met Met
         20                  25                  30Ser Tyr<210>14<211>400<212>PRT<213>未知<220><223>未知生物体的描述：肽400>14Met Leu Leu Ser Gln Asn Ala Phe Ile Val Arg Ser Leu Asn Leu Val  1               5                  10                  15Leu Met Val Tyr Ile Ser Leu Val Phe Gly Ile Ser Tyr Asp Ser Pro
         20                  25                  30Asp Tyr Thr Asp Glu Ser Cys Thr Phe Lys Ile Ser Leu Arg Asn Phe
     35                  40                  45Arg Ser Ile Leu Ser Trp Glu Leu Lys Asn His Ser Ile Val Pro Thr
 50                  55                  60His Tyr Thr Leu Leu Tyr Thr Ile Met Ser Lys Pro Glu Asp Leu Lys65                  70                  75                  80Val Val Lys Asn Cys Ala Asn Thr Thr Arg Ser Phe Cys Asp Leu Thr
             85                  90                  95Asp Glu TrP Arg Ser Thr His Glu Ala Tyr Val Thr Val Leu Glu Gly
        100                 105                 110Phe Ser Gly Asn Thr Thr Leu Phe Ser Cys Ser His Asn Phe Trp Leu
    115                 120                 125Ala Ile Asp Met Ser Phe Glu Pro Pro Glu Phe Glu Ile Val Gly Phe
130                 135                 140Thr Asn His Ile Asn Val Met Val Lys phe Pro Ser Ile Val Glu Glu145                 150                 155                 160Glu Leu Gln Phe AsP Leu Ser Leu Val Ile Glu Glu Gln Ser Glu Gly
            165                 170                 175Ile Val Lys Lys His Lys pro Glu Ile Lys Gly Asn Met Ser Gly Asn
        180                 185                 190Phe Thr Tyr Ile Ile Asp Lys Leu Ile Pro Asn Thr Asn Tyr Cys Val
    195                 200                 205Ser Val Tyr Leu Glu His Ser Asp Glu Gln Ala Val Ile Lys Ser Pro
210                 215                 220Leu Lys Cys Thr Leu Leu Pro Pro Gly Gln Glu Ser Glu Phe Ser Gly225                 230                 235                 240Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly
            245                 250                 255Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln
        260                 265                 270Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp
    275                 280                 285Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala
290                 295                 300Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg305                 310                 315                 320Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu
            325                 330                 335Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu
        340                 345                 350Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser
    355                 360                 365Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala
370                 375                 380Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu385                 390                 395                 400

Claims (33)

1.一种延长I型干扰素IFN体内作用的方法，该方法包括：
给予需要I型IFN治疗的患者I型IFN和人干扰素α/β受体IFNAR之亚基的复合物，其中所述受体亚基能与复合物中的I型IFN结合，复合物给予的量能有效地提供这种IFN治疗，
其中所述I型IFN具有的序列基本上由以下物质的序列组成：
a)天然的I型IFN；
b)具有I型IFN生物活性的a)的片段；
c)a)或b)的变体，它们与a)或b)有至少70％的序列相同性，且具有I型IFN的生物活性；
d)a)或b)的变体，它们由一DNA序列编码，该DNA序列在中等严谨条件下与编码a)或b)的天然DNA序列的互补序列杂交，且该变体具有I型IFN的生物活性；或
e)a)，b)，c)或d)的功能性衍生物的盐，它具有I型IFN的生物活性；和
其中所述IFNAR的序列基本上由下列物质的序列组成：
f)天然人IFNAR多肽链；
g)具有IFNAR生物活性的f)的片段；
h)f)或g)的变体，它们与f)或g)有至少70％的序列相同性，且具有IFNAR的生物活性；
i)f)或g)的变体，它们由一DNA序列编码，该DNA序列在中等严谨条件下与编码f)或g)的天然DNA序列的互补序列杂交，且该变体具有IFNAR的生物活性；或
j)f)，g)，h)或i)的功能性衍生物的盐，它具有IFNAR的生物活性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述复合物包含所述I型IFN和所述IFNAR的非共价复合物。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述I型IFN和所述IFNAR是分开给予的，所述复合物在体内形成。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述复合物包含一种复合物，在该复合物中所述I型IFN通过共价键与所述IFNAR连接。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述复合物包含一种融合蛋白，在该融合蛋白中所述I型IFN通过肽键与所述IFNAR连接。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述I型IFN通过肽接头与所述IFNAR连接。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述I型IFN是IFNα、IFNβ或IFNω。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述I型IFN是IFNβ。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述IFNAR是人干扰素α/β受体的β亚基IFNAR2。
10.一种分子，它包含I型干扰素IFN与人干扰素α/β受体IFNAR之亚基的复合物，所述受体亚基能结合复合物中的I型IFN，其中所述I型IFN通过共价键或肽键与所述IFNAR连接，
其中所述I型IFN具有的序列基本上由以下物质的序列组成：
a)天然的I型IFN；
b)具有I型IFN生物活性的a)的片段；
c)a)或b)的变体，它们与a)或b)有至少70％的序列相同性，且具有I型IFN的生物活性；
d)a)或b)的变体，它们由一DNA序列编码，该DNA序列在中等严谨条件下与编码a)或b)的天然DNA序列的互补序列杂交，且该变体具有I型IFN的生物活性；或
e)a)，b)，c)或d)的功能性衍生物的盐，它具有I型IFN的生物活性；和
其中所述IFNAR的序列基本上由下列物质的序列组成；
f)天然人IFNAR多肽链；
g)具有IFNAR生物活性的f)的片段；
h)f)或g)的变体，它们与f)或g)有至少70％的序列相同性，且具有IFNAR的生物活性；
i)f)或g)的变体，它们由一DNA序列编码，该DNA序列在中等严谨条件下与编码f)或g)的天然DNA序列的互补序列杂交，且该变体具有IFNAR的生物活性；或
j)f)，g)，h)或i)的功能性衍生物的盐，它具有IFNAR的生物活性。
11.根据权利要求10所述的分子，其中所述I型IFN通过共价键与所述IFNAR连接。
12.根据权利要求10所述的分子，其中所述I型IFN通过肽键与所述IFNAR连接。
13.根据权利要求12所述的分子，其中所述I型IFN通过肽接头与所述IFNAR连接。
14.根据权利要求13所述的分子，其中所述肽接头是(GGGGS)n，其中n＝1-5。
15.根据权利要求10所述的分子，其中所述I型IFN是IFNα、IFNβ或IFNω。
16.根据权利要求15所述的分子，其中所述I型IFN是IFNβ。
17.根据权利要求10所述的分子，其中所述IFNAR是人干扰素α/β受体的β亚基IFNAR2。
18.一种编码权利要求12所述分子的融合蛋白的DNA。
19.一种宿主细胞，其被携带权利要求18所述的DNA的载体转化，该转化方式允许所述融合蛋白表达。
20.一种制备融合蛋白的方法，该方法包括培育权利要求19所述的宿主细胞，并回收其表达的融合蛋白。
21.一种增加I型干扰素半衰期的方法，该方法包括以权利要求10所述的复合物形式或所述IFN与所述IFNAR通过非共价键结合形成的复合物形式保藏所述干扰素。
22.一种药物组合物，它包含药学上可接受的载体以及I型干扰素IFN与人干扰素α/β受体IFNAR之亚基的复合物，所述受体亚基能结合复合物中的I型IFN，
其中所述I型IFN具有的序列基本上由以下物质的序列组成：
a)天然的I型IFN；
b)具有I型IFN生物活性的a)的片段；
c)a)或b)的变体，它们与a)或b)有至少70％的序列相同性，且具有I型IFN的生物活性；
d)a)或b)的变体，它们由一DNA序列编码，该DNA序列在中等严谨条件下与编码a)或b)的天然DNA序列的互补序列杂交，且该变体具有I型IFN的生物活性；或
e)a)，b)，c)或d)的功能性衍生物的盐，它具有I型IFN的生物活性；和
其中所述IFNAR的序列基本上由下列物质的序列组成：
f)天然人IFNAR多肽链；
g)具有IFNAR生物活性的f)的片段；
h)f)或g)的变体，它们与f)或g)有至少70％的序列相同性，且具有IFNAR的生物活性；
i)f)或g)的变体，它们由一DNA序列编码，该DNA序列在中等严谨条件下与编码f)或g)的天然DNA序列的互补序列杂交，且该变体具有IFNAR的生物活性；或
j)f)，g)，h)或i)的功能性衍生物的盐，它具有IFNAR的生物活性。
23.人干扰素α/β受体IFNAR在生产用于增强I型干扰素IFN之生物作用的药剂中的应用，其中所述IFNAR的序列基本上由下列物质的序列组成：
a)天然人IFNAR多肽链；
b)具有IFNAR生物活性的a)的片段；
c)a)或b)的变体，它们与a)或b)有至少70％的序列相同性，且具有IFNAR的生物活性；
d)a)或b)的变体，它们由一DNA序列编码，该DNA序列在中等严谨条件下与编码a)或b)的天然DNA序列的互补序列杂交，且该变体具有IFNAR的生物活性；或
e)a)，b)，c)或d)的功能性衍生物的盐，它具有IFNAR的生物活性。
24.I型干扰素IFN和人干扰素α/β受体IFNAR之亚基的复合物在生产用于延长I型IFN之体内效果的药剂中的应用，其中所述受体的亚基能结合复合物中的I型IFN，
其中所述I型IFN具有的序列基本上由以下物质的序列组成：
a)天然的I型IFN；
b)具有I型IFN生物活性的a)的片段；
c)a)或b)的变体，它们与a)或b)有至少70％的序列相同性，且具有I型IFN的生物活性；
d)a)或b)的变体，它们由一DNA序列编码，该DNA序列在中等严谨条件下与编码a)或b)的天然DNA序列的互补序列杂交，且该变体具有I型IFN的生物活性；或
e)a)，b)，c)或d)的功能性衍生物的盐，它具有I型IFN的生物活性；和
其中所述IFNAR的序列基本上由下列物质的序列组成：
f)天然人IFNAR多肽链；
g)具有IFNAR生物活性的f)的片段；
h)f)或g)的变体，它们与f)或g)有至少70％的序列相同性，且具有IFNAR的生物活性；
i)f)或g)的变体，它们由一DNA序列编码，该DNA序列在中等严谨条件下与编码f)或g)的天然DNA序列的互补序列杂交，且该变体具有IFNAR的生物活性；或
j)f)，g)，h)或i)的功能性衍生物的盐，它具有IFNAR的生物活性。
25.权利要求10所述的分子作为药剂的应用。
26.根据权利要求24所述的应用，其中所述复合物包含所述I型IFN和所述IFNAR的非共价复合物。
27.根据权利要求25所述的应用，其中所述I型IFN和所述IFNAR是分开给予的，所述复合物在体内形成。
28.根据权利要求24所述的应用，其中所述复合物包含一种复合物，该复合物中所述I型IFN通过共价键与所述IFNAR连接。
29.根据权利要求24所述的应用，其中所述复合物包含一种融合蛋白，在该融合蛋白中所述I型IFN通过肽键与所述IFNAR连接。
30.根据权利要求29所述的应用，其中所述I型IFN通过肽接头与所述IFNAR连接。
31.根据权利要求24所述的应用，其中所述I型IFN是IFNα、IFNβ或IFNω。
32.根据权利要求31所述的应用，其中所述I型IFN是IFNβ。
33.根据权利要求24所述的应用，其中所述IFNAR是人干扰素α/β受体的β亚基IFNAR2。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105358575A (zh) * 2013-03-15 2016-02-24 詹森生物科技公司 干扰素α和ω抗体拮抗剂

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL122818A0 (en) * 1997-07-10 1998-08-16 Yeda Res & Dev Chimeric interleukin-6 soluble receptor/ligand protein analogs thereof and uses thereof
AUPP670698A0 (en) * 1998-10-23 1998-11-19 Monash University A method of regulation
US7138379B2 (en) * 2000-07-26 2006-11-21 Schering Aktiengesellschaft Use of the interferon receptor 2c polypeptide chain to enhance the anti-growth effects of type I interferons
IL147414A0 (en) 2001-12-31 2002-08-14 Yeda Res & Dev Ifnar2 mutants, their production and use
US20040175359A1 (en) * 2002-11-12 2004-09-09 Desjarlais John Rudolph Novel proteins with antiviral, antineoplastic, and/or immunomodulatory activity
CN101880326B (zh) * 2003-08-25 2018-02-16 东丽株式会社 干扰素‑β复合物
CN100400664C (zh) * 2005-09-06 2008-07-09 中国人民解放军第四军医大学 肿瘤血管导向肽与人干扰素α-2b的融合蛋白的制备方法
US8920808B2 (en) 2006-10-31 2014-12-30 East Carolina University Cytokine-based fusion proteins for treatment of multiple sclerosis
GB0715383D0 (en) * 2007-08-08 2007-09-19 Asterion Ltd Interferon
GB0815216D0 (en) * 2008-08-21 2008-09-24 Asterion Ltd Interleukin
EP3348275A3 (en) 2009-03-31 2018-10-24 East Carolina University Cytokines and neuroantigens for treatment of immune disorders
KR101293363B1 (ko) * 2011-02-28 2013-08-05 성균관대학교산학협력단 인터페론 수용체 유전자를 포함하는 조류독감 예방용 조성물
LT6164B (lt) 2013-10-15 2015-06-25 Uab Biotechnologinės Farmacijos Centras "Biotechpharma" Sulieti interferono-alfa 5 baltymai su kitu citokinu ir jų gamybos būdas
JP7308034B2 (ja) 2016-07-01 2023-07-13 リゾルブ セラピューティクス， エルエルシー 最適化二重ヌクレアーゼ融合物および方法
KR20200015742A (ko) * 2017-06-20 2020-02-12 더 보드 오브 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 암 치료를 위한 인터페론 전구약물
BR112020003670A2 (pt) 2017-08-22 2020-09-01 Sanabio, Llc receptores de interferon solúveis e usos dos mesmos
CN112646783B (zh) * 2020-12-30 2023-12-01 广州医科大学附属市八医院 表达基因、经基因修饰的受精卵的构建方法和小鼠模型的构建方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL106591A (en) 1992-09-03 2008-03-20 Yeda Res & Dev Interferon alpha/beta binding protein, its preparation and pharmaceutical compositions containing it
US5821078A (en) * 1992-09-03 1998-10-13 Yeda Research And Development Co. Ltd. Nucleic acid encoding interferon-α/β binding protein
IL107378A (en) * 1993-10-24 2005-05-17 Yeda Res & Dev SOLUBLE INTERFERON alpha-RECEPTOR, ITS PREPARATION AND USE

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105358575A (zh) * 2013-03-15 2016-02-24 詹森生物科技公司 干扰素α和ω抗体拮抗剂
CN105358575B (zh) * 2013-03-15 2020-09-22 詹森生物科技公司 干扰素α和ω抗体拮抗剂

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