SK9222000A3 - The use of type i - ifn interferon complex and a subunit of human interferon alpha/beta ifnar receptor for the prolongation of in vivo effect of type i ifn, a molecule comprising such a complex, dna encoding fused protein, host cell and pharmaceutical composition comprising such complex - Google Patents
The use of type i - ifn interferon complex and a subunit of human interferon alpha/beta ifnar receptor for the prolongation of in vivo effect of type i ifn, a molecule comprising such a complex, dna encoding fused protein, host cell and pharmaceutical composition comprising such complex Download PDFInfo
- Publication number
- SK9222000A3 SK9222000A3 SK922-2000A SK9222000A SK9222000A3 SK 9222000 A3 SK9222000 A3 SK 9222000A3 SK 9222000 A SK9222000 A SK 9222000A SK 9222000 A3 SK9222000 A3 SK 9222000A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- ifn
- ifnar
- type
- complex
- sequence
- Prior art date
Links
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 title claims abstract description 56
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 title claims abstract description 55
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 52
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 title claims abstract description 46
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 title claims abstract description 13
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 title claims abstract description 13
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims description 7
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 title claims description 6
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 title claims description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title description 48
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title description 33
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 28
- 102000002227 Interferon Type I Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 108010014726 Interferon Type I Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 102000012740 beta Adrenergic Receptors Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 108010079452 beta Adrenergic Receptors Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 101000852865 Homo sapiens Interferon alpha/beta receptor 2 Proteins 0.000 claims description 151
- 102100036718 Interferon alpha/beta receptor 2 Human genes 0.000 claims description 144
- 101000852870 Homo sapiens Interferon alpha/beta receptor 1 Proteins 0.000 claims description 101
- 102100036714 Interferon alpha/beta receptor 1 Human genes 0.000 claims description 93
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 48
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 24
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 21
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 20
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 18
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 14
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 13
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 11
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 8
- 102000054261 human IFNAR1 Human genes 0.000 claims description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 6
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 abstract description 11
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 abstract 1
- 101000959820 Homo sapiens Interferon alpha-1/13 Proteins 0.000 description 114
- 102100040019 Interferon alpha-1/13 Human genes 0.000 description 113
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 64
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 37
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 34
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 34
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 31
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 29
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 27
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 21
- 101001054334 Homo sapiens Interferon beta Proteins 0.000 description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 17
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 16
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 16
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 16
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 14
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 14
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 12
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 12
- 239000012911 assay medium Substances 0.000 description 12
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 230000006870 function Effects 0.000 description 11
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 10
- HKZAAJSTFUZYTO-LURJTMIESA-N (2s)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-aminoacetyl)amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoic acid Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O HKZAAJSTFUZYTO-LURJTMIESA-N 0.000 description 10
- SOEGEPHNZOISMT-BYPYZUCNSA-N Gly-Ser-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SOEGEPHNZOISMT-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 10
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 10
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 10
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 10
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 10
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 10
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 10
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 10
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 10
- -1 less than thirty Chemical class 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N N-alpha-L-glutamyl-L-phenylalanine Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- UIGMAMGZOJVTDN-WHFBIAKZSA-N Ser-Gly-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UIGMAMGZOJVTDN-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 9
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 9
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 9
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 9
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 9
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 9
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 9
- CHDWDBPJOZVZSE-KKUMJFAQSA-N Glu-Phe-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O CHDWDBPJOZVZSE-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 8
- 108010005716 Interferon beta-1a Proteins 0.000 description 8
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 8
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 7
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 7
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 102000052179 human IFNAR2 Human genes 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 108010056582 methionylglutamic acid Proteins 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002832 anti-viral assay Methods 0.000 description 6
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 5
- GMVCSRBOSIUTFC-FXQIFTODSA-N Glu-Ser-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O GMVCSRBOSIUTFC-FXQIFTODSA-N 0.000 description 5
- YWAQATDNEKZFFK-BYPYZUCNSA-N Gly-Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YWAQATDNEKZFFK-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- 108090001101 Hepsin Proteins 0.000 description 5
- 102000004989 Hepsin Human genes 0.000 description 5
- 102000001617 Interferon Receptors Human genes 0.000 description 5
- 108010054267 Interferon Receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000007438 Interferon alpha-beta Receptor Human genes 0.000 description 5
- 108010086140 Interferon alpha-beta Receptor Proteins 0.000 description 5
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- BMQYVXCPAOLZOK-UHFFFAOYSA-N Trihydroxypropylpterisin Natural products OCC(O)C(O)C1=CN=C2NC(N)=NC(=O)C2=N1 BMQYVXCPAOLZOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 5
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N glycyl-glycyl-glycine Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- BMQYVXCPAOLZOK-XINAWCOVSA-N neopterin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)C1=CN=C2NC(N)=NC(=O)C2=N1 BMQYVXCPAOLZOK-XINAWCOVSA-N 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 229940038850 rebif Drugs 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- 102100030852 Run domain Beclin-1-interacting and cysteine-rich domain-containing protein Human genes 0.000 description 4
- YMTLKLXDFCSCNX-BYPYZUCNSA-N Ser-Gly-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O YMTLKLXDFCSCNX-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 125000000998 L-alanino group Chemical group [H]N([*])[C@](C([H])([H])[H])([H])C(=O)O[H] 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- RNAGAJXCSPDPRK-KKUMJFAQSA-N Met-Glu-Phe Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 RNAGAJXCSPDPRK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 3
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 229940003504 avonex Drugs 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 3
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 108010085203 methionylmethionine Proteins 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 102000007445 2',5'-Oligoadenylate Synthetase Human genes 0.000 description 2
- 108010086241 2',5'-Oligoadenylate Synthetase Proteins 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- XMPXVJIDADUOQB-RCOVLWMOSA-N Gly-Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)CNC(=O)C[NH3+] XMPXVJIDADUOQB-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100038069 Interferon regulatory factor 8 Human genes 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- VWHGTYCRDRBSFI-ZETCQYMHSA-N Leu-Gly-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O VWHGTYCRDRBSFI-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 2
- SOAYQFDWEIWPPR-IHRRRGAJSA-N Met-Ser-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O SOAYQFDWEIWPPR-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- OKIZCWYLBDKLSU-UHFFFAOYSA-M N,N,N-Trimethylmethanaminium chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)C OKIZCWYLBDKLSU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- PESQCPHRXOFIPX-UHFFFAOYSA-N N-L-methionyl-L-tyrosine Natural products CSCCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 PESQCPHRXOFIPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100498071 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cys-17 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 2
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- JJHVFCUWLSKADD-ONGXEEELSA-N Phe-Gly-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O JJHVFCUWLSKADD-ONGXEEELSA-N 0.000 description 2
- LYCOGHUNJCETDK-JYJNAYRXSA-N Phe-Met-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N LYCOGHUNJCETDK-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 2
- BONHGTUEEPIMPM-AVGNSLFASA-N Phe-Ser-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BONHGTUEEPIMPM-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- BPCLGWHVPVTTFM-QWRGUYRKSA-N Phe-Ser-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O BPCLGWHVPVTTFM-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DSGYZICNAMEJOC-AVGNSLFASA-N Ser-Glu-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O DSGYZICNAMEJOC-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- IOVBCLGAJJXOHK-SRVKXCTJSA-N Ser-His-His Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 IOVBCLGAJJXOHK-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- KQNDIKOYWZTZIX-FXQIFTODSA-N Ser-Ser-Arg Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N KQNDIKOYWZTZIX-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- NHUHCSRWZMLRLA-UHFFFAOYSA-N Sulfisoxazole Chemical compound CC1=NOC(NS(=O)(=O)C=2C=CC(N)=CC=2)=C1C NHUHCSRWZMLRLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 239000002253 acid Chemical class 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002155 anti-virotic effect Effects 0.000 description 2
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 102000015736 beta 2-Microglobulin Human genes 0.000 description 2
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical class N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 230000007274 generation of a signal involved in cell-cell signaling Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 108010067216 glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 108010051621 interferon regulatory factor-8 Proteins 0.000 description 2
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 2
- 108010044311 leucyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 2
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 2
- LOGFVTREOLYCPF-KXNHARMFSA-N (2s,3r)-2-[[(2r)-1-[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxybutanoic acid Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CCCCN LOGFVTREOLYCPF-KXNHARMFSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- HQJKCXHQNUCKMY-GHCJXIJMSA-N Ala-Ile-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C)N HQJKCXHQNUCKMY-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- MEFILNJXAVSUTO-JXUBOQSCSA-N Ala-Leu-Thr Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O MEFILNJXAVSUTO-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 1
- RUXQNKVQSKOOBS-JURCDPSOSA-N Ala-Phe-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O RUXQNKVQSKOOBS-JURCDPSOSA-N 0.000 description 1
- SFPRJVVDZNLUTG-OWLDWWDNSA-N Ala-Trp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SFPRJVVDZNLUTG-OWLDWWDNSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- NTAZNGWBXRVEDJ-FXQIFTODSA-N Arg-Asp-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O NTAZNGWBXRVEDJ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- PHHRSPBBQUFULD-UWVGGRQHSA-N Arg-Gly-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N PHHRSPBBQUFULD-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- URAUIUGLHBRPMF-NAKRPEOUSA-N Arg-Ser-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O URAUIUGLHBRPMF-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- KMFPQTITXUKJOV-DCAQKATOSA-N Arg-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KMFPQTITXUKJOV-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- FRBAHXABMQXSJQ-FXQIFTODSA-N Arg-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FRBAHXABMQXSJQ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- LRPZJPMQGKGHSG-XGEHTFHBSA-N Arg-Ser-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)O LRPZJPMQGKGHSG-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- GMRGSBAMMMVDGG-GUBZILKMSA-N Asn-Arg-Arg Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)CN=C(N)N GMRGSBAMMMVDGG-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- BZMWJLLUAKSIMH-FXQIFTODSA-N Asn-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BZMWJLLUAKSIMH-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- FBODFHMLALOPHP-GUBZILKMSA-N Asn-Lys-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O FBODFHMLALOPHP-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- ZYPWIUFLYMQZBS-SRVKXCTJSA-N Asn-Lys-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N ZYPWIUFLYMQZBS-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- QYRMBFWDSFGSFC-OLHMAJIHSA-N Asn-Thr-Asn Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O QYRMBFWDSFGSFC-OLHMAJIHSA-N 0.000 description 1
- XAJRHVUUVUPFQL-ACZMJKKPSA-N Asp-Glu-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O XAJRHVUUVUPFQL-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- DGKCOYGQLNWNCJ-ACZMJKKPSA-N Asp-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DGKCOYGQLNWNCJ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- GISFCCXBVJKGEO-QEJZJMRPSA-N Asp-Glu-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O GISFCCXBVJKGEO-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 1
- USNJAPJZSGTTPX-XVSYOHENSA-N Asp-Phe-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O USNJAPJZSGTTPX-XVSYOHENSA-N 0.000 description 1
- MGSVBZIBCCKGCY-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O MGSVBZIBCCKGCY-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- BPAUXFVCSYQDQX-JRQIVUDYSA-N Asp-Tyr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)O BPAUXFVCSYQDQX-JRQIVUDYSA-N 0.000 description 1
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 1
- 101100263837 Bovine ephemeral fever virus (strain BB7721) beta gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 1
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 1
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 1
- 102000004225 Cathepsin B Human genes 0.000 description 1
- 108090000712 Cathepsin B Proteins 0.000 description 1
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- HAYVTMHUNMMXCV-IMJSIDKUSA-N Cys-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CS HAYVTMHUNMMXCV-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- KPENUVBHAKRDQR-GUBZILKMSA-N Cys-His-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O KPENUVBHAKRDQR-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- JTEGHEWKBCTIAL-IXOXFDKPSA-N Cys-Thr-Phe Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N)O JTEGHEWKBCTIAL-IXOXFDKPSA-N 0.000 description 1
- 102100025621 Cytochrome b-245 heavy chain Human genes 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 101100316840 Enterobacteria phage P4 Beta gene Proteins 0.000 description 1
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 1
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 description 1
- CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N Fe2+ Chemical compound [Fe+2] CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JVSBYEDSSRZQGV-GUBZILKMSA-N Glu-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JVSBYEDSSRZQGV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-WDSKDSINSA-N Glu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- ILGFBUGLBSAQQB-GUBZILKMSA-N Glu-Glu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O ILGFBUGLBSAQQB-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- BUZMZDDKFCSKOT-CIUDSAMLSA-N Glu-Glu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BUZMZDDKFCSKOT-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- AUTNXSQEVVHSJK-YVNDNENWSA-N Glu-Glu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O AUTNXSQEVVHSJK-YVNDNENWSA-N 0.000 description 1
- QXDXIXFSFHUYAX-MNXVOIDGSA-N Glu-Ile-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O QXDXIXFSFHUYAX-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 1
- XTZDZAXYPDISRR-MNXVOIDGSA-N Glu-Ile-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N XTZDZAXYPDISRR-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 1
- YBAFDPFAUTYYRW-YUMQZZPRSA-N Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- IVGJYOOGJLFKQE-AVGNSLFASA-N Glu-Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N IVGJYOOGJLFKQE-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- BCYGDJXHAGZNPQ-DCAQKATOSA-N Glu-Lys-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BCYGDJXHAGZNPQ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- ILWHFUZZCFYSKT-AVGNSLFASA-N Glu-Lys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ILWHFUZZCFYSKT-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- XEKAJTCACGEBOK-KKUMJFAQSA-N Glu-Met-Phe Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N XEKAJTCACGEBOK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- JDUKCSSHWNIQQZ-IHRRRGAJSA-N Glu-Phe-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O JDUKCSSHWNIQQZ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- RGJKYNUINKGPJN-RWRJDSDZSA-N Glu-Thr-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N RGJKYNUINKGPJN-RWRJDSDZSA-N 0.000 description 1
- QOOFKCCZZWTCEP-AVGNSLFASA-N Glu-Tyr-Cys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)O QOOFKCCZZWTCEP-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- OVSKVOOUFAKODB-UWVGGRQHSA-N Gly-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N OVSKVOOUFAKODB-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- ZOTGXWMKUFSKEU-QXEWZRGKSA-N Gly-Ile-Met Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O ZOTGXWMKUFSKEU-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- MIIVFRCYJABHTQ-ONGXEEELSA-N Gly-Leu-Val Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O MIIVFRCYJABHTQ-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- JBCLFWXMTIKCCB-VIFPVBQESA-N Gly-Phe Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- HAOUOFNNJJLVNS-BQBZGAKWSA-N Gly-Pro-Ser Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O HAOUOFNNJJLVNS-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- YABRDIBSPZONIY-BQBZGAKWSA-N Gly-Ser-Met Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O YABRDIBSPZONIY-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- WCORRBXVISTKQL-WHFBIAKZSA-N Gly-Ser-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WCORRBXVISTKQL-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- HIAHVKLTHNOENC-HGNGGELXSA-N His-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HIAHVKLTHNOENC-HGNGGELXSA-N 0.000 description 1
- IDXZDKMBEXLFMB-HGNGGELXSA-N His-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CNC=N1 IDXZDKMBEXLFMB-HGNGGELXSA-N 0.000 description 1
- MMFKFJORZBJVNF-UWVGGRQHSA-N His-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 MMFKFJORZBJVNF-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- RNMNYMDTESKEAJ-KKUMJFAQSA-N His-Leu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 RNMNYMDTESKEAJ-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- STGQSBKUYSPPIG-CIUDSAMLSA-N His-Ser-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 STGQSBKUYSPPIG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- CUEQQFOGARVNHU-VGDYDELISA-N His-Ser-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O CUEQQFOGARVNHU-VGDYDELISA-N 0.000 description 1
- CSTDQOOBZBAJKE-BWAGICSOSA-N His-Tyr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N)O CSTDQOOBZBAJKE-BWAGICSOSA-N 0.000 description 1
- 101000959794 Homo sapiens Interferon alpha-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000844245 Homo sapiens Non-receptor tyrosine-protein kinase TYK2 Proteins 0.000 description 1
- QSPLUJGYOPZINY-ZPFDUUQYSA-N Ile-Asp-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N QSPLUJGYOPZINY-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- PHIXPNQDGGILMP-YVNDNENWSA-N Ile-Glu-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N PHIXPNQDGGILMP-YVNDNENWSA-N 0.000 description 1
- DBXXASNNDTXOLU-MXAVVETBSA-N Ile-Leu-His Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N DBXXASNNDTXOLU-MXAVVETBSA-N 0.000 description 1
- AKOYRLRUFBZOSP-BJDJZHNGSA-N Ile-Lys-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N AKOYRLRUFBZOSP-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- NPAYJTAXWXJKLO-NAKRPEOUSA-N Ile-Met-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N NPAYJTAXWXJKLO-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- HQEPKOFULQTSFV-JURCDPSOSA-N Ile-Phe-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)N HQEPKOFULQTSFV-JURCDPSOSA-N 0.000 description 1
- UYNXBNHVWFNVIN-HJWJTTGWSA-N Ile-Phe-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)CC)CC1=CC=CC=C1 UYNXBNHVWFNVIN-HJWJTTGWSA-N 0.000 description 1
- RMJWFINHACYKJI-SIUGBPQLSA-N Ile-Tyr-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N RMJWFINHACYKJI-SIUGBPQLSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108010024121 Janus Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000015617 Janus Kinases Human genes 0.000 description 1
- 208000007766 Kaposi sarcoma Diseases 0.000 description 1
- FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N L-Phenylalanyl-L-lysin Natural products NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 125000000393 L-methionino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])C([H])([H])C(SC([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 description 1
- NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- NEEOBPIXKWSBRF-IUCAKERBSA-N Leu-Glu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O NEEOBPIXKWSBRF-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- CSFVADKICPDRRF-KKUMJFAQSA-N Leu-His-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C([O-])=O)CC1=CN=CN1 CSFVADKICPDRRF-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N Leu-Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- RZXLZBIUTDQHJQ-SRVKXCTJSA-N Leu-Lys-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O RZXLZBIUTDQHJQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- DCGXHWINSHEPIR-SRVKXCTJSA-N Leu-Lys-Cys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N DCGXHWINSHEPIR-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- HDHQQEDVWQGBEE-DCAQKATOSA-N Leu-Met-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O HDHQQEDVWQGBEE-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- WXDRGWBQZIMJDE-ULQDDVLXSA-N Leu-Phe-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O WXDRGWBQZIMJDE-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- MJWVXZABPOKJJF-ACRUOGEOSA-N Leu-Phe-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O MJWVXZABPOKJJF-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 1
- HWMQRQIFVGEAPH-XIRDDKMYSA-N Leu-Ser-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 HWMQRQIFVGEAPH-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N Leu-Thr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 1
- UIIMIKFNIYPDJF-WDSOQIARSA-N Leu-Trp-Met Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)=CNC2=C1 UIIMIKFNIYPDJF-WDSOQIARSA-N 0.000 description 1
- WPIKRJDRQVFRHP-TUSQITKMSA-N Leu-Trp-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O WPIKRJDRQVFRHP-TUSQITKMSA-N 0.000 description 1
- BGGTYDNTOYRTTR-MEYUZBJRSA-N Leu-Tyr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N)O BGGTYDNTOYRTTR-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010071324 Livagen Proteins 0.000 description 1
- GGAPIOORBXHMNY-ULQDDVLXSA-N Lys-Arg-Tyr Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)O GGAPIOORBXHMNY-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- OVIVOCSURJYCTM-GUBZILKMSA-N Lys-Asp-Glu Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O OVIVOCSURJYCTM-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- ODUQLUADRKMHOZ-JYJNAYRXSA-N Lys-Glu-Tyr Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)O ODUQLUADRKMHOZ-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- PRSBSVAVOQOAMI-BJDJZHNGSA-N Lys-Ile-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN PRSBSVAVOQOAMI-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- AIRZWUMAHCDDHR-KKUMJFAQSA-N Lys-Leu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O AIRZWUMAHCDDHR-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- ALGGDNMLQNFVIZ-SRVKXCTJSA-N Lys-Lys-Asp Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N ALGGDNMLQNFVIZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- JQSIGLHQNSZZRL-KKUMJFAQSA-N Lys-Lys-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCCN)N JQSIGLHQNSZZRL-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- QCZYYEFXOBKCNQ-STQMWFEESA-N Lys-Phe Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 QCZYYEFXOBKCNQ-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 1
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 1
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 1
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- SODXFJOPSCXOHE-IHRRRGAJSA-N Met-Leu-Leu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O SODXFJOPSCXOHE-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- ZYTPOUNUXRBYGW-YUMQZZPRSA-N Met-Met Chemical compound CSCC[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CCSC ZYTPOUNUXRBYGW-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- XOFDBXYPKZUAAM-GUBZILKMSA-N Met-Met-Ser Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N XOFDBXYPKZUAAM-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- QTMIXEQWGNIPBL-JYJNAYRXSA-N Met-Met-Tyr Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O)N QTMIXEQWGNIPBL-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- LXCSZPUQKMTXNW-BQBZGAKWSA-N Met-Ser-Gly Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O LXCSZPUQKMTXNW-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- FIZZULTXMVEIAA-IHRRRGAJSA-N Met-Ser-Phe Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 FIZZULTXMVEIAA-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- UYDDNEYNGGSTDW-OYDLWJJNSA-N Met-Trp-Trp Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)N[C@@H](CC3=CNC4=CC=CC=C43)C(=O)O)N UYDDNEYNGGSTDW-OYDLWJJNSA-N 0.000 description 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101000981253 Mus musculus GPI-linked NAD(P)(+)-arginine ADP-ribosyltransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010028372 Muscular weakness Diseases 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 1
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)CN)C(O)=O)=CNC2=C1 AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006051 NK cell activation Effects 0.000 description 1
- BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N Nalpha-L-Leucyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100342977 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 102100032028 Non-receptor tyrosine-protein kinase TYK2 Human genes 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- HWMGTNOVUDIKRE-UWVGGRQHSA-N Phe-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 HWMGTNOVUDIKRE-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- RIYZXJVARWJLKS-KKUMJFAQSA-N Phe-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 RIYZXJVARWJLKS-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- MGECUMGTSHYHEJ-QEWYBTABSA-N Phe-Glu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 MGECUMGTSHYHEJ-QEWYBTABSA-N 0.000 description 1
- NAXPHWZXEXNDIW-JTQLQIEISA-N Phe-Gly-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 NAXPHWZXEXNDIW-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- HGNGAMWHGGANAU-WHOFXGATSA-N Phe-Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 HGNGAMWHGGANAU-WHOFXGATSA-N 0.000 description 1
- APJPXSFJBMMOLW-KBPBESRZSA-N Phe-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 APJPXSFJBMMOLW-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- RTUWVJVJSMOGPL-KKUMJFAQSA-N Phe-Met-Glu Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N RTUWVJVJSMOGPL-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- IIEOLPMQYRBZCN-SRVKXCTJSA-N Phe-Ser-Cys Chemical compound N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O IIEOLPMQYRBZCN-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- MCIXMYKSPQUMJG-SRVKXCTJSA-N Phe-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O MCIXMYKSPQUMJG-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- VGTJSEYTVMAASM-RPTUDFQQSA-N Phe-Thr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O VGTJSEYTVMAASM-RPTUDFQQSA-N 0.000 description 1
- JMCOUWKXLXDERB-WMZOPIPTSA-N Phe-Trp Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 JMCOUWKXLXDERB-WMZOPIPTSA-N 0.000 description 1
- AOKZOUGUMLBPSS-PMVMPFDFSA-N Phe-Trp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O AOKZOUGUMLBPSS-PMVMPFDFSA-N 0.000 description 1
- FRMKIPSIZSFTTE-HJOGWXRNSA-N Phe-Tyr-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O FRMKIPSIZSFTTE-HJOGWXRNSA-N 0.000 description 1
- IPVPGAADZXRZSH-RNXOBYDBSA-N Phe-Tyr-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O IPVPGAADZXRZSH-RNXOBYDBSA-N 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- AIOWVDNPESPXRB-YTWAJWBKSA-N Pro-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@@H]2CCCN2)O AIOWVDNPESPXRB-YTWAJWBKSA-N 0.000 description 1
- GZNYIXWOIUFLGO-ZJDVBMNYSA-N Pro-Thr-Thr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GZNYIXWOIUFLGO-ZJDVBMNYSA-N 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 1
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 102000004265 STAT2 Transcription Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010081691 STAT2 Transcription Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004495 STAT3 Transcription Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017324 STAT3 Transcription Factor Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- WDXYVIIVDIDOSX-DCAQKATOSA-N Ser-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)CCCN=C(N)N WDXYVIIVDIDOSX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- YRBGKVIWMNEVCZ-WDSKDSINSA-N Ser-Glu-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O YRBGKVIWMNEVCZ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- LOKXAXAESFYFAX-CIUDSAMLSA-N Ser-His-Cys Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O)CC1=CN=CN1 LOKXAXAESFYFAX-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- BXLYSRPHVMCOPS-ACZMJKKPSA-N Ser-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO BXLYSRPHVMCOPS-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- VIIJCAQMJBHSJH-FXQIFTODSA-N Ser-Met-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VIIJCAQMJBHSJH-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- HJAXVYLCKDPPDF-SRVKXCTJSA-N Ser-Phe-Cys Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N HJAXVYLCKDPPDF-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N Ser-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- OZPDGESCTGGNAD-CIUDSAMLSA-N Ser-Ser-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CO OZPDGESCTGGNAD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- PURRNJBBXDDWLX-ZDLURKLDSA-N Ser-Thr-Gly Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N)O PURRNJBBXDDWLX-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- GSCVDSBEYVGMJQ-SRVKXCTJSA-N Ser-Tyr-Asp Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N)O GSCVDSBEYVGMJQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 1
- TYVAWPFQYFPSBR-BFHQHQDPSA-N Thr-Ala-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O TYVAWPFQYFPSBR-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 1
- MEJHFIOYJHTWMK-VOAKCMCISA-N Thr-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O MEJHFIOYJHTWMK-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- NDZYTIMDOZMECO-SHGPDSBTSA-N Thr-Thr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NDZYTIMDOZMECO-SHGPDSBTSA-N 0.000 description 1
- QYDKSNXSBXZPFK-ZJDVBMNYSA-N Thr-Thr-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O QYDKSNXSBXZPFK-ZJDVBMNYSA-N 0.000 description 1
- BBPCSGKKPJUYRB-UVOCVTCTSA-N Thr-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BBPCSGKKPJUYRB-UVOCVTCTSA-N 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 1
- 102100030859 Tissue factor Human genes 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- CGDZGRLRXPNCOC-SRVKXCTJSA-N Tyr-Cys-Cys Chemical compound SC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 CGDZGRLRXPNCOC-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- ZAGPDPNPWYPEIR-SRVKXCTJSA-N Tyr-Cys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O ZAGPDPNPWYPEIR-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- PMDWYLVWHRTJIW-STQMWFEESA-N Tyr-Gly-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 PMDWYLVWHRTJIW-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- ZQOOYCZQENFIMC-STQMWFEESA-N Tyr-His Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZQOOYCZQENFIMC-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- QARCDOCCDOLJSF-HJPIBITLSA-N Tyr-Ile-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N QARCDOCCDOLJSF-HJPIBITLSA-N 0.000 description 1
- KSCVLGXNQXKUAR-JYJNAYRXSA-N Tyr-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O KSCVLGXNQXKUAR-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- PRONOHBTMLNXCZ-BZSNNMDCSA-N Tyr-Leu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 PRONOHBTMLNXCZ-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- ANHVRCNNGJMJNG-BZSNNMDCSA-N Tyr-Tyr-Cys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CC=C(C=C2)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O ANHVRCNNGJMJNG-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- CELJCNRXKZPTCX-XPUUQOCRSA-N Val-Gly-Ala Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CELJCNRXKZPTCX-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003435 aroyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009702 cancer cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 125000002837 carbocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 208000016532 chronic granulomatous disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 230000002281 colonystimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 108010004073 cysteinylcysteine Proteins 0.000 description 1
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000005860 defense response to virus Effects 0.000 description 1
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N dipeptide phenylalanyl-tyrosine Natural products C=1C=C(O)C=CC=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000030414 genetic transfer Effects 0.000 description 1
- 108010057083 glutamyl-aspartyl-leucine Proteins 0.000 description 1
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010079547 glutamylmethionine Proteins 0.000 description 1
- 125000003827 glycol group Chemical group 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 108010001064 glycyl-glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010081551 glycylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 201000009277 hairy cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 108010025306 histidylleucine Proteins 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- RSAZYXZUJROYKR-UHFFFAOYSA-N indophenol Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1N=C1C=CC(=O)C=C1 RSAZYXZUJROYKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 108010010648 interferon alfacon-1 Proteins 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 108010045648 interferon omega 1 Proteins 0.000 description 1
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 description 1
- 229940076264 interleukin-3 Drugs 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000000867 larynx Anatomy 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000011866 long-term treatment Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000000504 luminescence detection Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000025036 lymphosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 1
- 108010044348 lysyl-glutamyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010038320 lysylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229940127554 medical product Drugs 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000036473 myasthenia Effects 0.000 description 1
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 208000003154 papilloma Diseases 0.000 description 1
- 208000029211 papillomatosis Diseases 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010070409 phenylalanyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010012581 phenylalanylglutamate Proteins 0.000 description 1
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 1
- 108010083476 phenylalanyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000006461 physiological response Effects 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 230000004983 pleiotropic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N procaine Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004919 procaine Drugs 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000018 receptor agonist Substances 0.000 description 1
- 229940044601 receptor agonist Drugs 0.000 description 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 210000004761 scalp Anatomy 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 108010048818 seryl-histidine Proteins 0.000 description 1
- 108010071207 serylmethionine Proteins 0.000 description 1
- 208000002491 severe combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 102000035025 signaling receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091005475 signaling receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000563 toxic property Toxicity 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000007723 transport mechanism Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003668 tyrosines Chemical class 0.000 description 1
- 108010003137 tyrosyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 150000003751 zinc Chemical class 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/21—Interferons [IFN]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/56—IFN-alpha
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/565—IFN-beta
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Immunology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Vynález sa týka komplexu interferónu typu I, ktorý sa skladá z polypeptidovej sekvencie extracelulárnej domény ľudského interferónového α/β receptora (IFNAR2) a interferónu typu I (IFNa, IFNp a IFNo). Takýto komplex zlepšuje stabilitu, zosilňuje potenciál a predlžuje in vivo farmakokinetiku voľného IFN z hľadiska jeho anti-virusového, protirakovinového a imunomodulačného účinku. Konkrétnejšie je komplex fúzovaný proteín alebo kovalentný komplex alebo nekovalentný komplex, ktorý zahŕňa polypeptidovú sekvenciu celej extracelulárnej domény IFNAR2 alebo jej akúkoľvek, interferón viažucu, menšiu časť, v komplexe s interferónom typu I (IFNa, IFNp, IFNo) alebo jeho akoukoľvek biologicky účinnou menšou časťou.
Doterajší stav techniky
Interferóny sú klasifikované buď ako interferóny typu I odvodené od leukocytov a fibroblastov, alebo ako interferóny typu II indukované mitogénom alebo imunitné interferóny typu II (Pestka a ďalší, 1987). Z hľadiska analýzy zhodnosti sekvencií a spoločných biologických aktivít, rozdeľujú sa interferóny typu I na interferón alfa (IFNa), interferón beta (IFNP) a interferón omega (IFNco), zatiaľ čo interferóny typu II zahŕňajú interferón gama (IFNy). IFNa, IFNp a IFNo gény sa nachádzajú v klastri na krátkom ramene chromozómu 9 (Lengyl, 1982). Existuje najmenej 25 nealelických IFNa génov, 6 nealelických IFNco génov a jeden IFNp gén. Predpokladá sa, že sa vyvinuli z jedného spoločného ancestrálneho génu. V rámci druhov zdieľajú IFNa gény navzájom najmenej 80% sekvenčnú zhodnosť. Sekvencia IFNp génu je približne na 50 % zhodná so sekvenciou IFNa; a IFNco gén
-2zdiel’a z IFNa 70% homológiu (Weissman a ďalší, 1986; Dron a ďalší, 1992). IFNa má molekulovú hmotnosť v rozsahu od 17 do 23 kDa (165 až 166 aminokyselín), IFNp približne 23 kDa (166 aminokyselín) a IFNo približne 24 kDa (172 aminokyselín).
Interferóny typu I sú pleiotropné cytokíny, ktoré účinkujú pri obrane hostiteľa voči vírusovým a parazitárnym infekciám, ako protirakovinové cytokíny a ako imunitné modulátory (Barón a ďalší, 1994; Barón a ďalší, 1991). Fyziologické odpovede na interferóny typu I zahŕňajú anti-proliferačný vplyv na normálne a transformované bunky; stimuláciu cytotoxického účinku v lymfocytoch, prirodzených zabíjačských bunkách a fagocytových bunkách; moduláciu bunkovej diferenciácie; stimuláciu expresie MHC antigénov triedy I; inhibíciu MHC triedy II; a moduláciu rôznych bunkových povrchových receptorov. V normálnych fýziologických podmienkach sú IFNa a IFNp (IFNa/IFNp) konštitutívne vylučované vo väčšine ľudských buniek v nízkych hladinách, pričom expresia sa povzbudzuje pridaním rôznych induktorov, vrátane infekčných činidiel (vírusy, baktérie, mykoplazmy a protozoa), dsRNA a cytokínov (M-CSF, IL-1a, IL-2, TNFa). Účinky interferónu typu I in vivo je možné monitorovať použitím náhradných markerov, neopterínu, 2’,5’oligoadenylát-syntetázy a β2 mikroglobulínu (Alam a ďalší, 1997; Fierlbeck a ďalší, 1996; Salmon a ďalší, 1996).
Interferóny typu I (IFNa/β/ω) účinkujú prostredníctvom bunkového povrchového receptorového komplexu, čím indukujú špecifické biologické účinky, ako anti-vírusový, protirakovinový a imunitný modulačný účinok. IFN receptor typu I (IFNAR) je heteromultimérny receptorový komplex zložený z najmenej dvoch rôznych polypeptidových reťazcov (Colamonici a ďalší, 1992; Colamonici a ďalší, 1993; Platanias a ďalší, 1993). Gény pre tieto reťazce sa nachádzajú na chromozóme 21, a ich proteíny sú exprimované na povrchu väčšiny normálnych buniek (Tan a ďalší, 1973). Pôvodne boli receptorové reťazce označené ako alfa a beta, pretože sú schopné rozoznávať monoklonálne protilátky IFNaR3, respektíve IFNRpi. Neskoršie boli premenované na IFNAR1 pre alfa podjednotku a IFNAR2 pre beta podjednotku. Vo väčšine buniek má IFNAR1 (alfa reťazec, Uze podjednotka) (Uze a ďalší, 1990) molekulovú hmotnosť 100 až 130 kDa, zatiaľ čo
-3IFNAR2 (beta reťazec, B|_, IFNa/pR) má molekulovú hmotnosť 100 kDa. V určitých typoch buniek (monocytové bunkové línie a normálne bunky kostnej drene) bol identifikovaný zmenený receptorový komplex, v ktorom sa IFNAR2 podjednotka (Ps) exprimuje ako skrátený receptor s molekulovou hmotnosťou 51 kDa. IFNAR1 a IFNAR2 Ps a Pl podjednotky boli klonované (Novick a d’laší, 1994; Domanski a ďalší, 1995). IFNAR2 ps a pL podjednotky majú rovnaké extracelulárne a transmembránové domény; avšak v cytoplazmatickej doméne majú spoločných len prvých 15 aminokyselín. Samotná IFNAR2 podjednotka je schopná viazať sa na IFNa/p, zatiaľ čo IFNAR1 podjednotka nie je schopná viazať sa na IFNa/p. Keď sa samotná IFNAR2 podjednotka transfekuje do hlodavčích L-929 fibroblastových buniek, žiadny z ľudských IFNAas s výnimkou IFNa8/IFNaB nie je schopný viazať sa na bunky (Uze a ďalší, 1990). Ľudská IFNAR2 podjednotka transfekovaná do L buniek bez prítomnosti ľudskej IFNAR1 podjednotky, sa viaže na ľudský IFNa2, s Kd približne 0,45 nM. Keď sa ľudské IFNAR2 podjednotky transfekujú v prítomnosti ľudskej IFNAR1 podjednotky, je možné vidieť viazanie s vysokou afinitou s Kd 0,026 až 0,114 nM (Novick a ďalší, 1994; Domanski a ďalší, 1995). Odhaduje sa, že vo väčšine buniek existujú IFN väzobné miesta s vysokou afinitou od 500 do 20 000 a s nízkou afinitou 2 000 až 100 000. Hoci sa IFNAR1/2 komplexové (α/Ps alebo a/pL) podjednotky viažu na IFNa s vysokou afinitou, zdá sa, že len α/Ρι. pár je funkčný signalizačný receptor.
Transfekcia IFNAR1 a IFNAR2 Pl podjednotiek do myších L-929 buniek, nasledovaná inkubovaním s IFNa.2, indukuje anti-vírusový stav, spúšťa fosforyláciu intracelulánych proteínov (Jak1 a Tyk2) a transkripčných faktorov (STAT 1, 2 a 3) (Novick a ďalší, 1994; Domanski a ďalší, 1995). V zodpovedajúcom experimente nie je transfekcia IFNAR2 Ps podjednotky schopná iniciovať podobnú odpoveď. Takže IFNAR2 Pl podjednotka je potrebná na funkčnú aktivitu (anti-vírusovú odpoveď), pričom maximálna indukcia nastáva v spojení s IFNAR1 podjednotou.
Okrem na membránu viazaných bunkových povrchových IFNAR foriem bol identifikovaný aj rozpustný IFNAR, tak v ľudskom moči, ako aj v sére (Novick a ďalší, 1994; Novick a ďalší, 1995; Novick a ďalší, 1992; Lutfalla a ďalší, 1995). Rozpustný IFNAR izolovaný zo séra má zdanlivú molekulovú hmotnosť 55 kDa na
-4SDS-PAGE, zatiaľ čo rozpustný IFNAR z moču má zdanlivú molekulovú hmotnosť 40 až 45 kDa (p40). Transkripty pre rozpustný p40 IFNAR2 sú prítomné v mRNA hladine a zahŕňajú takmer celú extracelulárnu doménu IFNAR2 podjednotky s dvoma novými aminokyselinami na karboxy terminálnom konci. V rozpustnom IFNAR2 receptore je päť potenciálnych glykozylačných miest. Ukázalo sa, že rozpustný p40 IFNAR2 sa viaže na IFNa2 a IFNp a inhibuje in vitro anti-virusovú aktivitu zmesi IFNa druhov (leukocytového IFN) a jednotlivých IFNs typu I (Novick a ďalší, 1995). Ukázalo sa, že rekombinantná IFNAR2 podjednotka Ig fúzovaného proteinu inhibuje viazanie sa rôznych druhov IFN typu I (IFNaA, IFNaB, IFNaD, IFNp, IFNa Con1 a IFNco) na Daudi bunky a na COS bunky dvojnásobne transfekované α/Ps podjednotkou.
V súčasnosti bola identifikovaná signalizačná dráha IFN typu I (Platanias a ďalší, 1996; Yan a ďalší, 1996; Qureshi a ďalší, 1996; Duncan a ďalší, 1996; Sharf a ďalší, 1995; Yang a ďalší, 1996). Predpokladá sa, že počiatočné deje vedúce ku signalizácii sa uskutočňujú viazaním IFNa/β/ω na IFNAR2 podjednotku, nasleduje pripojenie IFNAR1 podjednotky, čím sa vytvorí IFNAR1/2 komplex (Platanias a ďalší, 1994). Výsledkom viazania sa IFNa/β/ω na IFNAR1/2 komplex je aktivácia dvoch Janus kináz (Jak1 a Tyk2), o ktorých sa predpokladá, že fosforylujú špecifické tyrozíny na IFNAR1 a IFNAR2 podjednotkách. Keď sú tieto podjednotky fosforylované, fosforylujú sa STAT molekuly (STAT 1, 2 a 3), čoho výsledkom je dimerizácia STAT transkripčných komplexov, počom nasleduje nukleárna lokalizácia transkripčného komplexu a aktivácia špecifických IFN inducibilných génov.
U ľudí bola stanovená farmakokinetika a farmakodynamika IFNs typu I (Alan a ďalší, 1997; Fierlbeck a ďalší, 1996; Salmon a ďalší, 1996). Vymiznutie IFNp je mierne rýchle, pričom biodostupnosť IFNp je nižšia, ako sa očakáva pre väčšinu cytokínov. Hoci boli stanovené farmakodynamiky IFNp u ľudí, nebola zistená žiadna zrejmá korelácia medzi biologickou dostupnosťou IFNp a klinickou účinnosťou. U normálnych zdravých ľudských dobrovoľníkov je výsledkom podania jednej intravenóznej (iv) bolusovej dávky (6 MIU) rekombinatného CHO odvodeného od IFNp rýchla distribučná fáza s trvaním 5 minút a terminálnym polčasom rozpadu
-5približne 5 hodín (Alam a ďalší, 1997). Po subkutánnom (sc) alebo intramuskulárnom (im) podaní IFNp sú sérové hladiny ploché, pričom je len približne 15 % dávky systémovo dostupných. Farmakodynamiky IFNp po iv, im alebo sc podaní (merané prostredníctvom zmien v 2’,5’-oligoadenylát-syntetázovej (2’,5’-AS) aktivity v PBMCs) sa zvýšili počas prvých 24 hodín a pomaly klesali na základné hladiny počas nasledujúcich 4 dní. Intenzita a trvanie biologického účinku boli rovnaké bez ohľadu na spôsob podávania.
Farmakokinetiky (PK) a farmakodynamiky (PD) IFMp vyrobeného dvoma rozličnými spoločnosťami (REBIF®-Serono a AVONEX®-Biogen) sa skúmali po injekcii jednej dávky 6 MIU rekombinantného IFNp (Salmon, 1996). Sérové koncentrácie IFNp a IFNp náhradného markera, neopterínu, sa monitorovali v čase. Oba IFNp prípravky vykazovali podobné PK profily s vrcholnými sérovými hladinami IFNp v približne 12 až 15 hodine, hoci REBIF® poskytoval nižšie maximálne hladiny. Hladiny IFNp ostávali zvýšené tak pri REBIF®, ako aj pri AVONEX® počas najmenej prvých 36 hodín po im injekcii a potom klesli mierne nad základné hladiny počas 48 hodín. Hladiny neopterínu vykazujú veľmi podobný profil ako REBIF® a AVONEX®, pričom maximálne hladiny neopterínu sa dosiahnu v približne 44 až 50 hodine po injekcii a ostávajú zvýšené do 72 hodín po injekcii a potom postupne klesajú na základnú hladinu počas 144 hodín.
U ľudských pacientov s melanómom sa uskutočnila viacnásobná dávková IFNp farmakodynamická štúdia (Fierlbeck a ďalší, 1996), pričom IFNp bol podávaní sc spôsobom, tri krát týždenne v 3 MlU/dávku v priebehu šiestich mesiacov. Farmakodynamické markery, 2’,5’-AS syntetáza, p2-mikroglobulín, neopterín a aktivácia NK buniek, vrcholili pri druhej injekcii (4. deň) a klesali 28 dní, pričom ostávali len mierne zvýšené počas šiestich mesiacov.
Možno zhrnúť, že vymiznutie interferónov typu I u ľudí je rýchle. Dlho účinkujúci interferónový prípravok by pravdepodobne predstavoval zlepšenie klinického využitia.
V súčasnosti sa zistilo, že komplex interferónu typu I zložený z rozpustného IFNAR v komplexe s interferónmi typu I - IFN má zlepšenú stabilitu, zosilnenú
-6aktivitu a predĺžené farmakokinetiky in vivo v porovnaní s voľným IFN, z hľadiska jeho anti-vírusového, protirakovinového a imunomodulačného účinku.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je komplex interferónu typu I - IFN zložený z polypeptidovej sekvencie extracelulárnej domény ľudskej interferónovej α/β receptorovej (IFNAR) podjednotky a interferónov typu I, ktorý má zlepšenú stabilitu, zosilnený potenciál a/alebo predĺžené farmakokinetiky in vivo v porovnaní s voľným IFN, z hľadiska jeho anti-vírusového, protinádorového a imunomodulačného účinku. Výhodne sa komplex skladá z IFNAR2 podjednotkovej extracelulárnej domény s ktorýmkoľvek interferónom typu I alebo z IFNAR1 podjednotky a IFNa.
Konkrétnejšie je komplex fúzovaný proteín alebo kovalentný komplex alebo nekovalentný komplex, ktorý obsahuje polypeptidovú sekvenciu celej extracelulárnej domény IFNAR, výhodne IFNAR2 alebo akúkoľvek jej menšiu časť, ktorá sa viaže s interferónom, v komplexe s IFNa alebo IFNp alebo IFNro, alebo jeho ktoroukoľvek biologicky účinnou menšou časťou.
Výraz IFNAR zahŕňa ktorýkoľvek zo známych extracelulárnych IFNAR receptorov, ako sú definované vyššie, ako aj ktorýkoľvek z ich aktívnych fragmentov. IFNAR môže byť voliteľne fúzovaný s iným proteínom, napríklad z imunoglobulínom, ako IgG. Výrazy IFN, IFNa, ΙΡΝβ a IFNo sú mienené tak, že zahŕňajú jeden alebo viaceré z doteraz identifikovaných interferónov typu I alebo akýkoľvek interferón typu I, ktorý bude opísaný v budúcnosti.
V jednom uskutočnení vynálezu je komplex zložený z IFNa alebo ΙΡΝβ, ktorý je kovalentne spojený s IFNAR2 prostredníctvom chemickej väzby.
Ďalšie uskutočnenie zahŕňa komplex zložený z IFNa alebo IFNp, ktorý nie je kovalentne spojený s IFNAR2. Toto ďalšie uskutočnenie zahŕňa aj prostriedok obsahujúci IFN typu I a IFNAR2 v akomkoľvek pomere. Definícia komplexu podľa predloženej prihlášky zahŕňa aj prostriedok IFN typu I s nadbytkom IFNAR2, ako je definovaný vyššie. Dve zložky môžu byť podávané aj oddelene, tak, aby vytvorili komplex in vivo. Takže v ďalšom uskutočnení je komplex zmes IFNAR2 a IFN, ktorý
-7sa získa simultánnym alebo následným spolupodávaním IFNa alebo IFNp a rozpustného IFNAR2. Navyše IFNAR môže byť podávaný bez spolupodávania IFN, takže sa komplex môže vytvoriť in vivo s endogénne cirkulujúcim IFN, čím sa zvyšujú účinky endogénneho IFN.
Ako výhodné uskutočnenie je komplex tvorený z IFNa alebo IFNp alebo IFNco fúzovaným s IFNAR2 vo forme rekombinantného fúzovaného proteínu, v ktorom sú IFN a IFNAR2 časť voliteľne fúzované prostredníctvom flexibilnej peptidovej spojovníkovej molekuly. Tento peptidový spojovník môže alebo nemusí byť štiepiteľný in vivo.
Vynález sa ďalej týka DNA, ktorá kóduje takéto fúzované proteíny, vektorov obsahujúcich DNA, hostiteľských buniek transformovaných vektormi takým spôsobom, že exprimujú fúzované proteíny a spôsobov výroby fúzovaných proteínov kultiváciou hostiteľských buniek a izoláciou fúzovaných proteínov, ktoré sa nimi exprimujú.
Ďalším predmetom vynálezu sú spôsoby použitia komplexov podľa vynálezu na predĺženie in vivo účinku IFN, ktoré sú užitočné na liečbu akéhokoľvek ochorenia alebo stavu, ktorý je liečiteľný prostredníctvom IFN.
Ďalší predmet vynálezu sa týka použitia IFNAR ako stabilizátora v IFN prostriedkoch. Voľný IFNp má tendenciu vytvárať oligoméry. Tomuto sa zabráni, keď už vytvorí komplex s IFNAR, najmä IFNAR2. Súčasné prostriedky rekombinantného IFNp musia mať kyslé pH, čo môže spôsobiť určité lokálne podráždenie pri podávaní. Je možné vytvoriť nekyslé prostriedky, keď sa použije IFNAR ako stabilizátor.
Vynález bude lepšie pochopený v spojení s nasledujúcimi obrázkami.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Na obrázku 1 je graf znázorňujúci na dávke závislý anti-vírusový účinok SIFNAR2 alebo IFNAR2lg (skladá sa s extracelulárnej domény hlFNAR2 fúzovanej s ľudskou lgG1 spojovacou časťou, CH2 a CH3 doménami) v prítomnosti IFNp.
-8Na obrázku 2 je graf znázorňujúci anti-vírusový účinok SIFNAR2 a IFNp pri suboptimálnej dávke IFNp. Zistil sa synergický anti-vírusový účinok IFNp a SIFNAR2 po hodinovom predinkubovaní so strednou dávkou IFNp.
Na obrázku 3 je graf znázorňujúci anti-vírusový účinok SIFNAR2 a subúčinnej dávky IFNp (0,95 lU/ml) ako funkcia predinkubačného času. WISH bunky sa vystavili účinku IFNp (0,95 lU/ml sub-účinná dávka) a slFNAR2, po predinkubovaní v uvedených časoch. Synergický anti-vírusový účinok sa pozoruje len po 4 hodinách . predinkubácie. Anti-vírusový účinok sa meral ako MTT konverzia 48 hodín po VSV vybudení. Výsledkom vytvorenia IFNAR2/IFN komplexu pri sub-terapeutických hladinách IFNp, je zosilnený anti-vírusový účinok.
Na obrázku 4 je graf znázorňujúci zosilnený anti-vírusový účinok ľudského IFNp po predinkubovaní s SIFNAR2.
Na obrázku 5 je graf demonštrujúci, že anti-vírusový účinok ľudského IFNp spojeného s sIFNAR je špecifický pre IFNAR2, ale nie pre iné proteíny.
Na obrázku 6 je graf demonštrujúci farmakokinetické porovnanie komplexu ľudského IFNp a IFNp/IFNAR2 u myší, ako bolo stanovené prostredníctvom ELISA.
Na obrázku 7 je graf demonštrujúci farmakokinetické porovnanie komplexu ľudského IFNp a IFNp/IFNAR2 u myší, ako bolo stanovené prostredníctvom biotestu.
Na obrázku 8 je graf demonštrujúci farmakokinetické porovnanie komplexu ľudského IFNa a IFNa/IFNAR2 u myší, ako bolo stanovené prostredníctvom ELISA.
Na obrázku 9 je graf demonštrujúci farmakokinetické porovnanie komplexu ľudského IFNa a IFNa/IFNAR2 u myší, ako bolo stanovené prostredníctvom biotestu.
* Obrázok 10 znázorňuje aminokyselinovú sekvenciu n=2 IFNAR2/IFNP fúzovaného proteínu (sekv. č. 14). (GGGGS)2 (zvyšky 240-249 v sekv. č. 14) spojovník je podčiarknutý.
Na obrázku 11 je znázornený gél demonštrujúci reštrikčnú enzýmovú analýzu pCMV-IFNAR2/IFNp; 10 % PAG, línie 3-7: BamHlIXhol štiepenie; línia 2: Smal/Xhol štiepenie; línia 1: pBR322 DNA-/Wsp/štiepiaci marker; línia 2: pCMV-IFNAR2/IFNp,
-9OGS; Línia 3: 1GS; línia 4: 2GS; línia 5: 3GS; línia 6: 4GS; Línia 7: 5GS; Línia 8: φΧ174 RFDNA Haelll štiepiaci marker.
Na obrázku 12 je reštrikčná endonukleázová mapa IFNAR2/IFNP expresného vektora.
Na obrázku 13 je Western blot analýza IFNAR2/IFNp fúzovaného proteínu. Línia 1: IFNAR2/IFNP konštrukt bez spojovníka; línia 2: IFNAR2/IFNP konštrukt obsahujúci jeden Gly4Ser (sekv. č. 1) spojovník; línia 3: IFNAR2/IFNp konštrukt obsahujúci dva Gly4Ser (sekv. č. 1) spojovníky; línia 4: IFNAR2/IFNp konštrukt obsahujúci tri Gly4Ser (sekv. č. 1) spojovníky; línia 5: IFNAR2/IFNP konštrukt obsahujúci štyri Gly4Ser (sekv. č. 1) spojovníky; línia 6: IFNAR2/IFNP konštrukt obsahujúci päť Gly4Ser (sekv. č. 1) spojovníkov.
Na obrázku 14 je graf znázorňujúci anti-vírusový účinok interfúzovaných molekúl exprimovaných v CHO bunkových supernatantoch, ktorý je normalizovaný vzhľadom k IFNp štandardnému účinku.
Na obrázkoch 15A a B sú znázornené grafy, ktoré ilustrujú farmakokinetiky IFNp podávaného po intravenóznej injekcii IFNAR2. IFNp sa podával injekciou buď samostatne, ako IFNAR komplex, alebo okamžite nasledovala separátna i.v. injekcia slFNAR2. Sérový polčas rozpadu bol stanovený v uvedených časových bodoch po injekcii prostredníctvom IFNp špecifickej ELISA (obrázok 15A) a prostredníctvom biologického WISH antivírusového testu (obrázok 15B).
Na obrázku 16 je graf znázorňujúci ochranný účinok, ako % cytotoxicity, rôznych dávok komplexu Universaľ IFN (ľudský IFNaA(D) v komplexe s SIFNAR2, v porovnaní s podávaním samostatného Universal IFN alebo s kontrolou.
Na obrázku 17 je graf znázorňujúci sérovú koncentráciu IFNp ako funkciu času po jednej bolusovej intravenóznej injekcii buď interfúzovaného GS5 alebo samostatného hIFNp.
Nižšie je podrobne opísaný IFNAR/IFN komplex podľa vynálezu a technológia potrebná na vytvorenie tohto komplexu. Pre väčšinu výsledkov bol ako neobmedzujúci príklad vybraný IFNp.
-10Fúzovaný proteín
C-koniec IFNAR2 alebo jeho ktorejkoľvek interferón viažucej subsekvencie bol fúzovaný s N-koncom IFNp alebo jeho biologicky účinných fragmentov, keďže tak je potrebná najkratšia vzdialenosť, ktorú treba premostiť medzi dvoma molekulami. Je možné pripraviť aj reverzný konštrukt, v ktorom je C-koniec IFNp alebo jeho fragmentov fúzovaný s N-koncom IFNAR2 alebo jeho subsekvencií.
Z molekulárnych modelov IFNAR2/IFNp komplexu je odhadnutá vzdialenosť medzi nutnou C-koncovou extracelulárnou doménou IFNAR2 a N-koncovým IFNp v modeli aktívneho komplexu na približne 80 Angstromov. Na skonštruovanie IFNAR2/IFNP komplexu, ktorý umožňuje udržanie aktívneho komplexu, môže byť použitý flexibilný peptidový spojovník, napríklad Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (GGGGS) (sekv. č. 1) opakovanie. Alternatívne môže byť spojovník flexibilný a môže byť cieľom pre proteolytické štiepenia sérovými, membránovými a/alebo bunkovými proteázami. Ako príklad sérového proteázového štiepiaceho miesta môže skonštruovaná IFNAR2/IFNP komplexová fúzia obsahovať faktor Xa štiepiace miesto. Faktor Xa štiepi protrombín v dvoch polohách, Arg273 a Arg322, a má tetrapeptidový rozoznávací signál Ile-Glu-Glu-Arg (sekv. č. 2) (Nagai a ďalší, 1984). Samotný faktor Xa je generovaný tak vlastnými, ako aj externými dráhami rôznymi aktivátormi vrátane tkanivového faktora, ktorý je vylučovaný vaskulárnymi endoteliálnymi bunkami, makrofágmi a neutrofilmi.
Faktor Xa môže pôsobiť na IFNAR2/IFNP fúzovaný proteín, ktorý obsahuje rozoznávacie miesto pre faktor Xa v spojovníkovej doméne, a môže uvolniť IFNAR2/IFNp komplex tak, že komplex môže fungovať ako nekovalentný komplex.
Alternatívne môže IFNAR2/IFNp komplexová fúzia zahŕňať štiepiace miesto pre bunkovú membránovú proteázu (napr. hepsín). Hepsin je 51 kDa membránový serinový proteázový zymogén, ktorý sa exprimuje vo vysokých hladinách v pečeňovom tkanive, ale nachádza sa aj v obličkách, pankrease, pľúcach, štítnej žľaze, hypofýze a semenníkoch. Jednou sekvenciou, o ktorej je známe, že je štiepená hepsínom, je Arg152-lle153 peptidová väzba vo Faktore VII. Hepsin sa podieľa na formovaní trombínu na nádorových bunkách (Kazam a ďalší, 1995).
-11 Hepsín môže pôsobiť na SIFNAR2/IFN fúzovaný proteín, ktorý obsahuje hepsínom rozoznávanú sekvenciu v spojovníkovej doméne, a môže uvoľniť IFNAR2/IFN komplex, takže komplex môže fungovať nekovalentným spôsobom.
Alternatívne môže IFNAR2/IFNp fúzovaný komplex obsahovať štiepiace miesto pre vnútrobunkovú proteázu. Rôzne proteázy sú vylučované nekrotickými a apoptickými bunkami. Tieto zahŕňajú kaspázy (proteázy podobné enzýmu, ktorý konvertuje interleukín 1 β), metaloproteinázy, lyzozomálne proteázy (napr. katepsín B) a elastázu. Elastáza je vylučovaná granulocytmi pri chorobných stavoch (napr. pri sepse) a má širokú špecificitu čo sa týka aminokyselinovej štiepiacej sek-vencie, ktorá je podobná špecificite trypsínu (Ertel a ďalší, 1994; Szilagyi a ďalší, 1995).
Vnútrobunkové proteázy môžu pôsobiť na SIFNAR2/IFN fúzovaný proteín, ktorý obsahuje rozoznávaciu sekvenciu pre vnútrobunkovú proteázu v spojovníkovej doméne a môžu uvolniť IFNAR2/IFN komplex tak, že komplex môže fungovať ako nekovalentný komplex.
Pripravilo sa niekoľko príkladov fúzovaných proteínových konštruktov, v ktorých je C-koniec SIFNAR2 (P40-ESEFS) spojený s N-koncom ΙΡΝβ (MSY) cez flexibilné spojovníky. Príklady peptidových spojovníkov sú nasledovné: ESEFS(GGGGS)nMSY, kde n = 5 (sekv. č. 3), 4 (sekv. č. 4), 3 (sekv. č. 5), 2 (sekv. č. 6), alebo 1 (sekv. č. 7); ESEFS(hCG-CTP)MSY, kde hCGCTP=SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (sekv. č. 8) ; ESEFS (EFM)nMSY, kde n = 5 (sekv. č. 9), 4 (sekv. č. 10), alebo 3 (sekv. č. 11); SEFSÍEFGAGLVLGGQFMjnMSY, kde n = 1 (sekv. č. 12), alebo 2 (sekv. č. 13) a akýkoľvek iný vhodný spojovník, ktorý preklenuje vzdialenosť medzi IFNAR2 väzobným miestom a ΙΡΝβ v modeli komplexu, a ktorý netvorí imunogénny epitop medzi interferónovou a receptorovou časťou. Výhodne nie sú tieto spojovníky dlhšie ako približne 30 aminokyselín.
Kovalentný komplex
Jedným príkladom generovania chemicky prepojených molekúl je miestne špecifická modifikácia IFNAR2 prostredníctvom reakcie biodegradovateľného spojovníka, ako napríklad polyetylénglykolu (PEG), s cysteínmi, ktoré sa nachádzajú, alebo ktoré sú zavedené do IFNAR2 použitím aminokyselinovej
-12substitúcie, ako Ser2io za Cys alebo Asneg za Cys, (miestne špecifická mutagenéza). Navrhnuté by mohli byť nasledujúce konštrukty: IFNAR(5210C)PEGn-IFNp(Cys17), kde n = 2000, 5000 alebo 10000 Daltonov alebo IFNAR(N89C)-PEGn-IFNp(Cys17).
Do rozsahu vynálezu spadá aj vytvorenie kovalentných disulfidových väzieb medzi Cys (voliteľne zavedenými) dvoch rozličných častí.
Nekovalentný komplex
Ľudský IFNAR2 je v komplexe s ΙΡΝβ v podmienkach, ktoré maximalizujú vytvorenie aktívneho komplexu. Ako je uvedené v príkladoch, je optimálny in vitro pomer IFNAR2 ku 1 medzinárodnej jednotke (IU) ΙΡΝβ, ktorý je potrený na získanie maximálne účinného komplexu, 2,5 ng. Optimálny pomer IFNAR2 voči ΙΡΝβ, ktorý maximalizuje vytvorenie účinného komplexu, z hľadiska jeho in vivo účinku sa v súčasnosti stanovuje, hoci sa zdá, že optimálny pomer bude závisieť na koncentrácii ΙΡΝβ. Takže, napríklad optimálny pomer IFNAR2:IFNp na zosilnenie protinádorového účinku pri koncentrácii 2 x 104 lU/myš/deň ΙΡΝβ bol 2,5 ng IFNAR2 na pg ΙΡΝβ, zatiaľ čo pri koncentrácii 5 x 104 lU/myš/deň ΙΡΝβ bolo optimum 0,3 ng IFNAR2 na pg ΙΡΝβ. Rovnaký pomer ako bol použitý na maximalizáciu generovania aktívneho komplexu in vitro, poskytol predĺžené farmakokinetiky IFN in vivo.
Výhodne sú IFNAR2 a ΙΡΝβ, ktoré sa používajú na generovanie komplexu, rekombinantnými molekulami. V in vitro anti-vírusových testoch vykazuje komplex interferón/receptor zvýšený účinok v porovnaní s účinkom samotného ΙΡΝβ. Konštantná koncentrácia ΙΡΝβ sa miešala s rôznymi koncentráciami rekombinantného SIFNAR2, a táto zmes (IFNAR2/IFN komplex) sa pridala ku WISH bunkám (ľudské amniotické bunky). Na tieto WISH bunky sa potom pôsobilo vezikulárnym stomatitisovým vírusom (VSV), a monitoroval sa anti-vírusový účinok IFN ako stupeň prežívania buniek po 48-hodinovom inkubovaní. V každom experimente bol výsledkom pridania IFNAR2 ku konštantnému množstvu ΙΡΝβ na dávke závislý vzostup prežívania buniek po ošetrení s VSV, pri optimálnom pomere IFNAR2 ku IFN. Tieto výsledky potvrdzujú, že komplex IFNAR2 a ΙΡΝβ má silnejší účinok v porovnaní s účinkom voľného ΙΡΝβ v anti-vírusovom teste. Praktickým dôsledkom
-13týchto výsledkov je, že IFNAR2/IFN komplex má vyšší potenciál a zosilnený účinok v porovnaní s voľným IFN na rôzne terapeutické indikácie, v ktorých je účinný aj samotný IFN. Tieto indikácie zahŕňajú stavy, pri ktorých sa ukázalo, že majú voľné IFNs určitý terapeutický účinok, ako napríklad anti-vírusový, protinádorový a imunomodulačný účinok. Očakáva sa, že IFNAR2/IFN komplex, tým, že má vyššiu potenciu, zosilňuje účinok a/alebo zlepšuje farmakokinetiky (tzn. polčas rozpadu), bude účinnejší na liečbu vírusových, onkologických a imunitných porúch.
Keď sa podáva in vivo, zosilňuje interferónový receptorový komplex biodostupnosť, farmakokinetiky a/alebo farmakodynamiky IFN, takže posilňuje antivírusové, protinádorové a imunomodulačné vlastnosti IFN. Zvýšenú biodostupnosť IFN sprostredkovanú komplexom je možné dosiahnuť, buď vytvorením IFN/IFNAR nekovalentného komplexu vopred, spolupodávaním voľných IFN a IFNAR, následným podávaním IFN alebo IFNAR zložky, podávaním IFN/IFNAR kovalentného komplexu alebo podávaním IFNAR/IFN fúzovaného proteínu.
V ďalšom uskutočnení môže byť takáto zosilnená biodostupnosť zabezpečená aj podávaním samotného IFNAR komponentu, bez pridania IFN. IFNAR vytvorí komplex in vivo s endogénnym IFN, a tak zosilní biodostupnosť, farmakokinetiky a/alebo farmakodynamiky endogénneho IFN. To je užitočné najmä na liečbu pacientov, ktorý majú ochorenie alebo stav, ktorý prirodzene spôsobuje indukciu prirodzeného IFN, takže IFN už bude cirkulovať za účelom zamýšľaného prirodzeného účinku na boj s touto chorobou alebo stavom. Pridanie IFNAR posilní účinky prirodzeného IFN.
Výhodné molekuly na použitie v komplexoch podľa vynálezu majú sekvenciu prirodzeného IFN a IFNAR. Prirodzené sekvencie sú sekvencie, ktoré sa prirodzene vyskytujú v ľudskom IFN alebo IFNAR. Takéto sekvencie sú známe a je možné jednoducho ich nájsť v literatúre. Za prirodzené sekvencie sa považujú aj prirodzene sa vyskytujúce alelické variácie.
Vynález sa týka aj analógov vyššie uvedeného IFNAR2/IFN komplexu podľa vynálezu, pričom tieto analógy si zachovávajú v podstate rovnaký biologický účinok ako komplex, ktorý má v podstate sekvencie prirodzených IFNAR2 a IFN. Takýmito analógmi môžu byť analógy, v ktorých je jeden až približne 30 aminokyselinových zvyškov deletovaných, pridaných alebo substituovaných inými zvyškami v IFNAR2
-14a/alebo IFN časti komplexu, tak, že modifikácie tohto typu v podstate nemenia biologický účinok chimérneho proteínového analógu vo vzťahu k samotnému komplexu. Rôzne analógy sa môžu líšiť navzájom a od základnej komplexnej molekuly (molekula, ktorá obsahuje v podstate len prirodzene sa vyskytujúce IFNAR2 a IFN sekvencie) najviac v mieste spojovníkového peptidu, ktorý spája dve časti komplexu. Ako bolo uvedené vyššie, takýto spojovník má výhodne dĺžku do približne 30 aminokyselín a slúži na vzájomné oddelenie IFNAR2 a IFN častí v komplexe. Čo sa týka takéhoto spojovníka, je potrebné starostlivo vybrať jeho sekvenciu (a teda každý takýto analóg aj biologicky testovať vo vhodných štandardných testoch), tak aby, napríklad nespôsobovala nesprávne poskladanie komplexu, čo môže zapríčiniť, že komplex nie je aktívny, alebo nemá zosilnený účinok, alebo môže spôsobiť, že analóg komplexu je imunogénny, a bude vyvolávať protilátky proti sebe u pacientov, ktorý ním budú ošetrovaný, čoho výsledkom by bolo, že takýto analóg by bol neúčinný najmenej ako strednodobé alebo dlhodobé liečivo. Čo sa týka vyššie uvedených analógov komplexu podľa vynálezu, tieto analógy sú zlúčeniny, ktoré majú jeden alebo do približne 30 aminokyselinových zvyškov základného komplexu podľa vynálezu nahradených rôznymi aminokyselinovými zvyškami, alebo deletovaných alebo je jeden alebo viacero aminokyselinových zvyškov, do približne 30 pridaných do pôvodnej sekvencie komplexu podľa vynálezu (sekvencia, ktorá je v podstate len prirodzenou IFNAR2/IFN sekvenciou) bez toho, aby sa veľmi zmenil účinok výsledných produktov v porovnaní so základným komplexom podľa vynálezu. Tieto analógy sú pripravené známymi syntézami a/alebo technikami miestne špecifickej mutagenézy alebo akoukoľvek vhodnou známou technikou.
Akýkoľvek takýto analóg má výhodne aminokyselinovú sekvenciu, ktorá dostatočne kopíruje sekvenciu základného IFNAR2/IFN komplexu, tak, aby mal v podstate rovnaký účinok. Takže je možné stanoviť, či akýkoľvek daný analóg má v podstate rovnaký účinok a/alebo stabilitu ako základný komplex podľa vynálezu prostredníctvom rutinných pokusov, ktoré zahŕňajú podrobenie každého takéhoto analógu testom na biologický účinok a stabilitu, ktoré sú uvedené v príkladoch nižšie.
-15Analógy komplexu, ktoré môžu byť použité podľa predloženého vynálezu, alebo nukleotidové sekvencie, ktoré ich kódujú, zahŕňajú konečnú sadu v podstate zodpovedajúcich sekvencií, ako sú substitučné peptidy alebo polynukleotidy, ktoré môže priemerný odborník rutinne získať bez prílišného experimentovania na základe tu uvedeného opisu a návodu. Podrobný opis proteínovej chémie a štruktúry je uvedený v Schulz. a ďalší, Principles of Proteín Structure, SpringerVerlag, New York (1978); a Creighton, T.E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co, San Francisco (1983), ktoré sú tu začlenené týmto odkazom. Vyobrazenie nukleotidových sekvenčných substitúcií, ako napríklad kodónových preferencií je uvedené v Ausubel a ďalší (1987, 1992), §§ A.1. l-A. 1.24, a Sambrook a ďalší (1987,1992), §§ 6.3 a 6.4, Prílohy C a D.
Výhodnými zmenami pre analógy podľa predloženého vynálezu sú zmeny, ktoré sú známe ako konzervatívne substitúcie. Konzervatívne aminokyselinové substitúcie aminokyselín v komplexe, ktorý má v podstate prirodzene sa vyskytujúce IFNAR2 a IFN sekvencie, môžu zahŕňať synonymné aminokyseliny, v rámci skupiny, ktorá má dostatočne podobné fýzikálnochemické vlastnosti, takže substitúcie medzi členmi tejto skupiny budú zachovávať biologickú funkciu molekuly (Grantham, 1974). Je zrejmé, že vo vyššie definovaných sekvenciách je možné uskutočniť inzercie a delécie aminokyselín bez toho, aby sa zmenila ich funkcia, najmä ak inzercie alebo delécie zahŕňajú len niekoľko aminokyselín, napr. menej ako tridsať a výhodne menej ako desať, a neodstraňujú alebo neposúvajú aminokyseliny, ktoré sú kritické pre funkčnú konformáciu, napr. cysteinové zvyšky (Anfinsen, 1973). Analógy vytvorené prostredníctvom takýchto delécií alebo inzercií spadajú do rozsahu predloženého vynálezu.
Výhodné synonymné aminokyselinové skupiny sú uvedené v tabuľke 1. Výhodnejšie synonymné aminokyselinové skupiny sú uvedené v tabuľke 2 a najvýhodnejšie synonymné aminokyselinové skupiny sú uvedené v tabuľke 3.
-16Tabuľka 1
Výhodné synonymné aminokyseliny
| Aminokyselina | Synonymná skupina |
| Ser | Ser, Thr, Gly, Asn |
| Arg | Arg, Gin, Lys, Glu, His |
| Leu | lle, Phe, Tyr, Met, Val, Leu |
| Pro | Gly, Ala, Thr, Pro |
| Thr | Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gin, Thr |
| Ala | Gly, Thr, Pro, Ala |
| Val | Met, Tyr, Phe, lle, Leu, Val |
| Gly | Ala, Thr, Pro, Ser, Gly |
| lle | Met, Tyr, Phe, Val, Leu, lle |
| Phe | Trp, Met, Tyr, lle, Val, Leu, Phe |
| Tyr | Trp, Met, Phe, lle, Val, Leu, Tyr |
| Cys | Ser, Thr, Cys |
| His | Glu, Lys, Gin, Thr, Arg, His |
| Gin | Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gin |
| Asn | Gin, Asp, Ser, Asn |
| Lys | Glu, Gin, His, Arg, Lys |
| Asp | Glu, Asn, Asp |
| Glu | Asp, Lys, Asn, Gin, His, Arg, Glu |
| Met | Phe, lle, Val, Leu, Met |
| Trp | Trp |
-17Tabuľka 2
Výhodnejšie skupiny synonymných aminokyselín
| Aminokyselina | Synonymná skupina |
| Ser | Ser |
| Arg | His, Lys, Arg |
| Leu | Leu, lle, Phe, Met |
| Pro | Ala, Pro |
| Thr | Thr |
| Ala | Pro, Ala |
| Val | Val, Met, lle |
| Gly | Gly |
| lle | lle, Met, Phe, Val, Leu |
| Phe | Met, Tyr, lle, Leu, Phe |
| Tyr | Phe, Tyr |
| Cys | Cys, Ser |
| His | His, Gin, Arg |
| Gin | Glu, Gin, His |
| Asn | Asp, Asn |
| Lys | Lys, Arg |
| Asp | Asp, Asn |
| Glu | Glu, Gin |
| Met | Met, Phe, lle, Val, Leu |
| Trp | Trp |
-18Tabuľka 3
Najvýhodnejšie skupiny synonymných aminokyselín
| Aminokyselina | Synonymná skupina |
| Ser | Ser |
| Arg | Arg |
| Leu | Leu, lle, Met |
| Pro | Pro |
| Thr | Thr |
| Ala | Ala |
| Val | Val |
| Gly | Gly |
| lle | lle, Met, Leu |
| Phe | Phe |
| Tyr | Tyr |
| Cys | Cys, Ser |
| His | His |
| Gin | Gin |
| Asn | Asn |
| Lys | Lys |
| Asp | Glu |
| Glu | Glu |
| Met | Met, lle, Leu |
| Trp | Met |
Príklady prípravy aminokyselinových substitúcií v proteínoch, ktoré môžu byť použité na získanie analógov komplexu IFNAR2/IFN na použitie podľa vynálezu, zahŕňajú akékoľvek známe spôsobové kroky, ako bolo uvedené napríklad v US patentoch č. 33 653; 4 959 314; 4 588 585 a 4 737 462, Mark a ďalší; 5 116 943,
Koths a ďalší; 4 965 195, Namen a ďalší; a 5 017 691, Lee a ďalší, a lyzínové substituované proteíny uvedené v US patente č. 4 904 584 (Shaw a ďalší).
- 19V inom výhodnom uskutočnení vynálezu má akýkoľvek analóg komplexu na použitie v predloženom vynáleze aminokyselinovú sekvenciu, ktorá v podstate zodpovedá sekvencii vyššie uvedeného základného komplexu podľa vynálezu. Výraz “v podstate zodpovedajúci je mienený ako výraz, ktorý zahŕňa analógy s minimálnymi zmenami v sekvencii základného komplexu, ktoré neovplyvňujú jeho základné vlastnosti, najmä nie do takej miery, že by to ovplyvnilo jeho schopnosť napríklad inhibovať proliferáciu rakovinových buniek alebo podporiť transplantácie kostnej drene. Typ zmien, ktoré sú vo všeobecnosti pokladané za spadajúce pod výraz “v podstate zodpovedajúci” sú zmeny, ktoré by boli výsledkom bežných techník mutagenézy DNA kódujúcej komplex podľa vynálezu, ktorých výsledkom je niekoľko minoritných modifikácii, a skríningu z hľadiska požadovanej aktivity vyššie opísaným spôsobom.
Výhodne bude mať IFNAR2 časť komplexu jadrovú sekvenciu, ktorá je rovnaká ako prirodzená sekvencia alebo ako sekvencia jej biologicky aktívneho fragmentu, alebo je to jej variant s aminokyselinovou sekvenciou, ktorá je najmenej na 70 % zhodná s prirodzenou aminokyselinovou sekvenciou a zachováva si jej biologickú aktivitu. Výhodnejšie je takáto sekvencia najmenej na 85 %, najmenej na 90 %, alebo najvýhodnejšie najmenej na 95 % zhodná s prirodzenou sekvenciou.
Čo sa týka IFN časti komplexu, jadrovou sekvenciou, ktorá môže byť použitá, je prirodzená sekvencia alebo jej biologicky účinný fragment alebo jej variant s aminokyselinovou sekvenciou, ktorá je zhodná najmenej na 70 %, výhodnejšie najmenej na 85 % alebo najmenej na 90 % a najvýhodnejšie najmenej na 95 %. Takéto analógy si musia zachovávať biologickú účinnosť prirodzenej IFN sekvencie alebo jej fragmentu, alebo musia mať antagonistický účinok ako je diskutované nižšie.
Tu používaný výraz “sekvenčná zhoda znamená, že sekvencie sa porovnávajú nasledovne. Sekvencie sa zoradia použitím Verzie 9 systému Genetic
Computing Group's GAP (globálny zoraďovací program), použitím posunovej (BLOSUM62) matrice (hodnoty -4 až +11) s otvorenou medzerovou penaltou -12 (pri prvej nule medzery) a s medzerovou prebiehajúcou penaltou -4 (pri každej ďalšej nasledujúcej nule v medzere). Po zoradení sa vypočíta percento zhodnosti vyjadrením počtu zhôd ako percento počtu aminokyselín v nárokovanej sekvencii.
-20Analógy podľa predloženého vynálezu môžu byť determinované aj podľa nasledujúceho postupu. S ohľadom buď na IFNAR časť komplexu alebo na IFN časť komplexu je DNA prirodzenej sekvencie známa z doterajšieho stavu techniky, a buď sa nachádza v citovanej literatúre v časti Doterajší stav techniky uvedenej v opise, alebo je pre priemerného odborníka v oblasti jednoduché ju nájsť. Do rozsahu predloženého vynálezu spadajú aj polypeptidy, ktoré sú kódované ktoroukoľvek nukleovou kyselinou, ako DNA alebo RNA, ktorá hybridizuje s komplementom prirodzenej DNA alebo RNA vo veľmi prísnych alebo stredne prísnych podmienkach, pokiaľ si takýto polypeptid zachováva biologický účinok prirodzenej sekvencie, alebo v prípade IFN, pokiaľ si zachováva biologický účinok alebo má antagonistický účinok.
Prísnosť podmienok je funkciou teploty použitej pri hybridizačnom experimente, molarity monovalentných katiónov a percenta formamidu v hybridizačnom roztoku. Na stanovenie stupňa prísnosti daných podmienok je najprv použitá rovnica podľa Meinkoth a ďalší (1984), na stanovenie stability hybridov so 100% zhodou, pričom stupeň prísnosti je vyjadrený teplotou topenia Tm DNA-DNA hybridu:
Tm = 81,5 °C + 16,6(L0gM) + 0,41 (%GC) - 0, 61 (% form) - 500/L, kde M je molarita monovalentných katiónov, %GC je percento G a C nukleotidov v DNA, % form je percento formamidu v hybridizačnom roztoku, a L je dĺžka hybridu v bázových pároch. Každý °C, o ktorý je Tm znížená oproti teplote topenia vypočítanej pre 100% zhodný hybrid, umožňuje zvýšenie nezhodností o približne 1 %. Takže ak je Tm použitá v akomkoľvek danom hybridizačnom experimente pri špecifických koncentráciách soli a formamidu o 10 °C nižšia ako Tm vypočítaná pre 100% hybrid podľa Meinkothovej rovnike, nastane hybridizácia, len ak je medzi sekvenciami maximálne 10 % nezhodností.
Veľmi prísne podmienky, ako sú tu používané, sú podmienky, ktoré tolerujú maximálne približne 15% sekvenčnú divergenciu, pričom stredne prísne podmienky tolerujú maximálne približne 20% divergenciu. Bez obmedzenia, príklady s veľmi prísnymi podmienkami (o 12 až 15 °C nižšia Tm ako Tm vypočítaná pre hybrid) a so stredne prísnymi podmienkami (o 25 až 20 °C nižšia Tm ako Tm vypočítaná pre hybrid) používajú premývací roztok 2 X SSC (štandardný fyziologický citrát) a 0,5 %
-21 SDS pri príslušnej teplote nižšej ako je vypočítaná Tm hybridu. Definitívna prísnosť podmienok je primárne spôsobenia podmienkami vymývania, najmä ak sú použité hybridizačné podmienky také, že umožňujú vytvorenie menej stabilných hybridov spolu so stabilnými hybridmi. Podmienky vymývania s vyššou prísnosťou potom odstraňujú menej stabilné hybridy. Bežnými hybridizačnými podmienkami, ktoré môžu byť použité s veľmi prísnymi alebo so stredne prísnymi premývacími podmienkami opísanými vyššie, je hybridizácia v roztoku 6 X SSC (alebo 6 X SSPE), 5 X Denhardtovo činidlo, 0,5% SDS, 100 pg/ml denaturovanej, fragmentovanej lososovej spermatickej DNA pri teplote približne o 20 °C až 25 °C nižšej ako Tm. Ak sú použité zmiešané sondy, je výhodné použiť tetrametylamóniumchlorid (TMAC) namiesto SSC (Ausubel, 1987,1998).
Tu používaný výraz “funkčné deriváty zahŕňa deriváty, ktoré môžu byť pripravené z funkčných skupín, ktoré sa nachádzajú ako bočné skupiny na zvyškoch alebo ako N- alebo C-koncové skupiny, prostriedkami známymi v oblasti, a sú zahrnuté vynálezom, pokiaľ ostávajú farmaceutický prijateľné, tzn. pokiaľ nerušia biologický účinok zodpovedajúceho proteínu v komplexe, ako tu bolo opísané, a pokiaľ nezavádzajú toxické vlastnosti do prostriedkov, ktoré ich obsahujú alebo do komplexu, ktorý je z nich vyrobený. Deriváty môžu mať chemické časti, ako uhľovodíkové alebo fosfátové zvyšky, s podmienkou, že takáto frakcia má rovnaký biologický účinok a ostáva farmaceutický prijateľná.
Deriváty môžu napríklad zahŕňať alifatické estery karboxylových skupín, amidy karboxylových skupín prostredníctvom reakcie s amoniakom alebo s primárnymi alebo sekundárnymi amínmi, /V-acyl deriváty alebo voľné aminokyselinové zvyšky vytvorené z acylových častí (napr. alkanoylové alebo karbocyklické aroylové skupiny) alebo O-acylové deriváty voľnej hydroxylovej skupiny (napr. serylových alebo treonylových zvyškov) vytvorených sacylovými časťami. Takéto deriváty môžu zahŕňať aj napríklad polyetylénové glykolové bočné reťazce, ktoré môžu maskovať antigénne miesta a môžu predlžovať zotrvanie komplexu alebo jeho častí v telesných tekutinách.
Výraz “deriváty” zahŕňa len také deriváty, ktoré nemajú zamenenú jednu aminokyselinu za inú aminokyselinu z dvadsiatich bežne sa vyskytujúcich prirodzených aminokyselín.
-22Výraz “soli” zahŕňa tak soli karboxylových skupín, ako aj kyslé adičné soli aminoskupín komplexu podľa vynálezu a jeho analógov. Soli karboxylovej skupiny môžu byť vytvorené prostriedkami známymi v oblasti a zahŕňajú anorganické soli, napríklad sodné, vápenaté, amónne, železité a železnaté, alebo zinočnané soli a podobne, a soli s organickými zásadami, ktoré môžu byť vytvorené napríklad s amínmi, ako tretanolamín, arginín alebo lyzín, s piperidínom, prokaínom a podobne. Kyslé adičné soli zahŕňajú napríklad soli anorganických kyselín, ako kyseliny chlorovodíkovej alebo kyseliny sírovej a soli s organickými kyselinami ako napríklad s kyselinovou octovou alebo s kyselinou oxálovou. Je samozrejmé, že akékoľvek soli musia mať v podstate rovnaký biologický účinok ako komplex podľa vynálezu alebo jeho analógy.
Tu používaný výraz “biologický účinok” je interpretovaný nasledovne. V prípadoch týkajúcich sa IFNAR2 časti komplexu je dôležitým biologickým účinkom jeho schopnosť viazať sa na interferón typu I. Takže analógy alebo varianty, soli a funkčné deriváty musia byť vybrané tak, aby si zachovali túto schopnosť viazať interferón. To je možné testovať rutinnými väzobnými experimentami. Okrem toho môžu byť použité aj fragmenty IFNAR2 alebo ich analógy, pokiaľ si zachovávajú svoj interferón viažuci účinok. Fragmenty je možné jednoducho pripraviť odstránením aminokyselín z každého konca interferón viažuceho polypeptidu a testovať výsledný polypeptid z hľadiska interferón viažucich vlastností. Proteázy na odstránenie jednej aminokyseliny v určitom čase buď z Nkonca alebo z C-konca polypeptidu sú známe a takáto determinácia fragmentov, ktoré si zachovávajú schopnosť viazať interferón, zahŕňa len rutinné experimentovanie.
Okrem toho, polypeptid, ktorý má takýto interferón-viažuci účinok, ako IFNAR2, slFNAR2, jeho analóg alebo variant, soľ, funkčný derivát alebo fragment, môže obsahovať aj ďalšie aminokyselinové zvyšky ohraničujúce interferón-viažuci polypeptid. Pokiaľ si výsledná molekula zachováva schopnosť jadrového polypeptidu viazať interferón, je možné stanoviť to, či niektoré ohraničujúce zvyšky ovplyvňujú základné a nové vlastnosti jadrového peptidu, tzn. jeho interferónviažuce vlastnosti, rutinným experimentovaním. Výraz “pozostávajúci v podstate z”, keď sa vzťahuje na špecifickú sekvenciu, znamená, že môžu byť prítomné ďalšie
-23ohraničujúce zvyšky, ktoré neovplyvňujú základné a nové vlastnosti špecifikovanej sekvencie. Tento výraz nezahŕňa substitúcie, delécie alebo adície vo vnútri špecifikovanej sekvencie.
Zatiaľ čo v opise a v príkladoch sú používané IFNAR2 alebo slFNAR2, je potrebné to chápať tak, že ide len o výhodný príklad, a že IFNAR1 podjednotka a najmä jej extracelulárna doména môže byť nahradiť IFNAR2 všade, kde je v predloženom opise uvedený IFNAR2. IFNAR1 môže byť použitý len spolu s interferónmi, na ktoré sa viaže. Je známe, že IFNAR1 sa viaže na IFNa. Akýkoľvek komplex, v ktorom je použitý IFNAR1, musí byť s interferónmi, a výhodne s IFNa druhmi, na ktoré sa IFNAR1 viaže.
Čo sa týka interferónovej časti komplexu podľa predloženého vynálezu, je biologickým účinkom, ktorý musí byť zachovaný v akomkoľvek analógu alebo variante, soli, funkčnom deriváte alebo fragmente, účinok interferónu, ktorý závisí na zamýšľanom využití. Vo väčšine prípadov to bude schopnosť viazať sa na prirodzený bunkový povrchový receptor, a tým sprostredkovať vytvorenie signálu receptorom. Takže akýkoľvek takýto analóg, derivát alebo fragment by si mal zachovať taký receptorový agonistický účinok, aby mal v predloženom vynáleze takýto úžitok. Na druhej strane je niekedy užitočné mať molekulu s antagonistickým účinkom na receptor na zabránenie biologickej aktivite prirodzeného interferónu. Takýto antagonista môže byť použitý aj na predĺženie užitočného účinku prostredníctvom komplexu podľa predloženého vynálezu. Pre takéto využitia, v ktorých je želateľné eliminovať nežiaduci účinok interferónu, je možné považovať za biologicky účinné na účely tohto vynálezu a za také, ktoré sú zahrnuté výrazom interferón, v súvislosti s komplexami podľa predloženého vynálezu, aj analógy, ktoré sú ešte viazané receptorom a IFNAR časťou komplexu, ale ktoré už nesprostredkúvajú signál a blokujú generovanie signálu na tomto receptore prirodzeným interferónom.
Predložený vynález sa týka aj DNA sekvencií, ktoré kódujú vyššie uvedený komplex podľa vynálezu a jeho analógy, ako aj DNA vektorov nesúcich takéto DNA sekvencie na expresiu vo vhodných prokaryotických alebo eukaryotických hostiteľských bunkách. Schopnosť generovať veľké množstvá heterologických proteínov použitím rekombinantného proteínového expresného systému viedla
-24k vývoju rôznych terapeutických činidiel, napr. ŕ-PA a EPO (Edington, 1995). Rôzni expresní hostitelia, v ktorých môžu byť generované rekombinantné proteíny, sú v rozsahu od prokaryotických organizmov (napr. baktérie) (Olins, 1993), cez nižšie eukaryoty (napr. kvasinky) (Ratner, 1989) až vyššie eukaryotické druhy (napr. hmyzie alebo cicavčie bunky (Reuveny,1993; Reff, 1993). Všetky tieto systémy fungujú na rovnakom princípe - zavedenie DNA sekvencie požadovaného proteínu do zvoleného typu bunky (prechodným alebo stabilným spôsobom, vo forme integrovaného alebo epizomálneho elementu) a použitie hostiteľskej transkripcie, translácie a transportného mechanizmu na nadmernú expresiu zavedenej DNA sekvencie vo forme heterologického proteínu (Keown, 1990).
Okrem expresie prirodzených génových sekvencií, urýchlila schopnosť manipulovať DNA na nukleotidovej úrovni vývoj nových skonštruovaných sekvencií, ktoré, hoci sú založené na prirodzených proteínoch, zahŕňajú nové aktivity ako výsledok zmeny v primárnej štruktúre proteínu (Grazia, 1997).
Navyše, výber sekvencií DNA môže byť fyzicky spojený s generovaním transkriptov, ktoré sa vyvinú do nových fúzovaných proteínov, ktoré, keď sa raz stanú nezávislými proteínmi, exprimované ako jedna polypeptidová jednotka (Ibanez, 1991). Účinok týchto fúzovaných proteínov môže byť odlišný, napr. silnejší, ako účinok každého z jednotlivých proteínov (Curtis, 1991).
Ľudský IFNp je odvodený od produkčného procesu, ktorý využíva cicavčie ovariálne bunky čínskeho škrečka (CHO). Interferóny typu I môžu byť exprimované v rôznych hostiteľských bunkách vrátane bakteriálnych (Utsumi, 1987), hmyzích (Smith, 1983) a ľudských (Christofinis, 1981) buniek. Ľudský slFNAR2 môže byť exprimovaný aj použitím CHO hostiteľských buniek. Alternatívne boli rozpustné receptory, ako napríklad SIFNAR2 úspešne exprimované aj v bakteriálnych expresných systémoch (Terlizzese, 1996). DNA pre každý gén sa zaviedla do CHO genómu použitím transfekčného postupu, ktorého výsledkom bola rekombinácia a integrácia expresného vektora. Bunky, ktoré exprimovali požadovaný proteín sa potom izolovali, kultivovali a proteín sa izoloval a purifikoval použitím štandardných priemyselných postupov známych v oblasti.
Vynález sa týka aj farmaceutického prostriedku, ktorý obsahuje ako účinnú zložku IFNAR2/IFN komplex alebo jeho analógy alebo ich zmes alebo ich soli a
-25farmaceuticky prijateľný nosič, riedidlo alebo vehikulum. Uskutočnenie farmaceutického prostriedku podľa vynálezu zahŕňa farmaceutický prostriedok na zosilnenie účinku IFN typu na liečbu vírusových ochorení, v protinádorovej terapii, v imunomodulačnej terapii a pri iných aplikáciách interferónov a cytokínov.
Farmaceutické prostriedky podľa vynálezu sú pripravené na podávanie prostredníctvom zmiešania komplexu alebo jeho analógov s fyziologicky prijateľnými nosičmi a/alebo stabilizátormi a/alebo vehikulami, a sú pripravené v dávkovej forme, napr. lyofilizáciou v dávkovacích liekovkách. Spôsob podávania je možný akýmkoľvek akceptovateľným postupom podávania podobných činidiel a bude závisieť na stave, ktorý sa má liečiť, napr. intravenózne, intramuskulárne, subkutánne, lokálnou injekciou alebo miestnym podaním alebo kontinuálne, infúziou atď. Množstvo účinnej zlúčeniny, ktorá sa má podať bude závisieť od spôsobu podávania, od choroby, ktorá sa má liečiť a od stavu pacienta. Napríklad lokálna injekcia bude vyžadovať nižšie množstvo proteínu, vzhľadom na telesnú hmotnosť, ako intravenózna injekcia.
Voľný IFN p má tendenciu vytvárať oligoméry. Na potlačenie tejto tendencie majú súčasné IFNp prostriedky kyslé pH, čo môže spôsobiť určité lokálne podráždenie pri podávaní. Keďže IFNAR môže slúžiť ako stabilizačný faktor pre IFNp, a tým môže predchádzať oligomerizácii, môže jeho použitie v IFNp prostriedkoch slúžiť na stabilizáciu IFNp, a tak je možné vyhnúť sa nevyhnutnosti kyslých prostriedkov. Z toho vyplýva, že časťou predloženého vynálezu je aj nekyslý farmaceutický prostriedok, ktorý obsahuje IFNp a IFNAR, spolu s inými bežnými farmaceutický prijateľnými vehikulami.
Predložený vynález sa týka aj použití komplexu podľa vynálezu alebo jeho analógov alebo zmesí na anti-vírusovú, protinádorovú a imunomodulačnú liečbu. Konkrétne sú komplexy interferónového receptora a interferónu podľa tohto vynálezu užitočné na anti-vírusovú terapiu takých stavov ako chronická granulomatózna choroba, končistý kondylóm, juvenilná hrtanová papilomatóza, hepatitída A a chronická infekcia s vírusmi hepatitídy B a C.
Komplexy interferónového receptora a interferónu podľa tohto vynálezu sú užitočné najmä na protinádorovú terapiu takých terapeutických indikácií ako
-26leukémia vlasatých buniek, Kaposiho sarkóm, mnohonásobný myelóm, chronická myelogénna leukémia, iné ako Hodgkinsonove lymfómy a melanóm.
Komplexy interferónového receptora a interferónu podľa tohto vynálezu sú užitočné aj na imunomodulačnú terapiu, ako napríklad na liečbu sklerózy multiplex, reumatoidnej artritídy, ťažkej myasténie, cukrovky, AIDS, lupusu, atď.
Predložený vynález sa taktiež týka komplexu alebo jeho analógov alebo zmesí na použitie na prípravu liečiv na liečbu vyššie uvedených chorôb alebo na použitie pri vyššie uvedených indikáciách.
Vynález bude nižšie podrobnejšie opísaný prostredníctvom neobmedzujúcich príkladov a priložených výkresov.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Materiál a metódy
Anti-vírusový WISH biologický test a generovanie komplexu
WISH test bol vyvinutý na základe protokolu podľa Novick a ďalší (1982).
Materiály • WISH bunky (ATCC CCL 25) • Zásobný roztok vezikulárneho vírusu stomatitídy (ATCC V-520-001-522), uskladňovaní pri -70 °C • IFNp, ľudský rekombinant, InterPharm Laboratories LTD 90 x 106 lU/ml, špecifická aktivita: 264,5 x 106 lU/mg • Rozpustný ľudský IFNAR2, 373 pg/ml zásobná koncentrácia v PBS • WISH rastové médium (MEM stupňová glukóza s Earls soľami + 10% FBS +
1,0% L-glutamín + Penicilín/Streptomycín (100 U/ml, 100 pg/ml)) • WISH testovacie médium (MEM stupňová glukóza s Earls soľami + 5% FBS + 1,0% L-glutamín + Penicilín/Streptomycín (100 U/ml, 100 pg/ml), MTT pri 5 mg/ml v PBS, uskladnené pri -70 °C.
Metódy • Nariediť rekombinantný IFNp na 19 lU/ml (4X vopred stanovená EC50 dávka) vo WISH testovacom médiu.
• Vychádzajúc z 90 pg/ml urobiť jedenásť (11) trojnásobných riedení ľudského rekombinantného SIFNAR2 v Ependorfových skúmavkách vo WISH testovacom médiu. Dvanásta skúmavka bude obsahovať len WISH testovacie médium.
• Pridať 25 pi IFNp do každej jamky 96-jamkovej platne s jamkami s rovným dnom (na kontrolu IFNAR2 účinkov bez prítomnosti IFNp pridať 25 μΙ samotného WISH testovacieho média do jednej sekcie jamiek 3 X 12).
• Pridať 25 μΙ každého riedenia SIFNAR2 (alebo samotného testovacieho média v riadku dvanásť) trojmo smerom dolu v dvanástich radoch 96-jamkovej platne.
• Predinkubovať IFNp s SIFNAR2 počas 1 až 4 hodín v 37°C inkubátore pred pridaním WISH buniek.
• Zozbierať WISH bunky v logaritmickej fáze rastu prostredníctvom roztoku trypsín/EDTA, premyť vo WISH testovacom médiu a dať do konečnej koncentrácie 0,8 x 106 buniek/ml.
• Pridať 50 μΙ WISH bunkovej suspenzie (4 x 104 buniek na jamku) do každej jamky. Konečná koncentrácia tak IFNp, ako aj IFNAR2 je taká, že tieto sú vystavené bunkám, tak, že konečná koncentrácia IFNp je 4,75 lU/ml (1X) a konečná koncentrácia SIFNAR2 v riadku jedna je 22,5 pg/ml.
• Po 24 hodinovom inkubovaní v 5% CO2 vlhkostnom inkubátore sa pridá 50 μΙ 1:10 riedenia (vo WISH testovacom médiu) VSV zásobného roztoku (dávka, ktorá je vopred určená ako taká, ktorá lyžuje 100 μΙ WISH buniek do 48 hodín) do všetkých jamiek s výnimkou vírusových kontrolných jamiek (do týchto sa pridá len rovnaký objem testovacieho média).
• Po ďalšom 48 hodinovom inkubovaní sa pridá 25 μΙ MTT roztoku do všetkých jamiek, a potom sa všetky platne inkubujú v inkubátore ďalšie 2 hodiny.
• Obsahy jamiek sa odstránia otočením platne a do jamiek sa pridá 200 μΙ 100% etanolu.
• Po 1 hodine sa platne odčítajú pri 595 nm použitím Soft max Pro software balíka a Spectramax spektrofotometrického systému (Molecular Devices).
Všetky sekvenačné reakcie sa uskutočňovali použitím ThermoSequenaser rádioaktívne značeného terminátorového cyklického sekvenčného kitu (Amersham Life Science; Cleveland, OH). Použil sa protokol poskytnutý výrobcom. Všetky sekvenačné reakcie sa analyzovali na CastAwayT Precast sekvenčných géloch (Stratagene; LaJolla, CA), ktoré obsahujú 6% polyakrylamid a 7M močovinu. Sekvenčné reakčné zmesi sa naniesli v poradí A-C-G-T. Autorádiografy sekvenčných gélov sa čítali manuálne. Na DNA sekvenčnú analýzu bol použitý Genetics Computer Group Sequence Analysis Software balík a UNIX pracovná stanica.
Príklad 1
Na stanovenie anti-vírusového účinku ľudského IFNAR2/IFNp komplexu a ľudského IFNAR2lg-IFNp komplexu sa testovala fixná koncentrácia IFNp (4,75 lU/ml), ktorá sa predinkubovala 3 hodiny pri 37 °C s ľudským SIFNAR2 (rekombinant p40) alebo ľudským IFNAR2lg v rôznych koncentráciách (0,25 až 30000 ng/ml), a potom sa testovali vo WISH-VSV cytopatickom teste. Ak nebol prítomný IFN, nedetegovala sa žiadna anti-vírusová ochrana (údaje nie sú uvedené).
Anti-vírusový účinok interferónov typu I (použitý vo vopred stanovených EC50 koncentráciách) v prítomnosti približne 30 ng/ml SIFNAR2, odhalil optimálny agonistický účinok s IFNp, ale nie samostatne. Anti-vírusový účinok sa meral prostredníctvom MTT konverzie 48 hodín po VSV vybudení.
Keď bol IFN prítomný v očakávanej ED50 koncentrácii, bola pozorovaná ochrana (pozri obrázok 1; absorpcia rovná 0,05, žiadna absorpcia sa nerovná ~0,0, úplná ochranná absorpcia sa rovná -1,8). Keď sa IFNAR2 alebo IFNAR2lg titrovali v rôznych koncentráciách, zistilo sa približne 4 násobné zosilnenie účinku IFNp, do 32 ng/ml, IFNAR2 a IFNAR2lg (pozri aj príklad 2 a obrázok 2). V prípade, že bola koncentrácia IFNAR alebo IFNAR2lg vyššia ako 32 ng/ml účinok poklesol, tak ako sa očakávalo, pravdepodobne kvôli konkurencii IFNp v sIFNAR s membránovým IFNAR. Takže tento experiment podporil zvýšenie potencie a zosilnenie účinku IFNp v IFNAR2/IFN komplexe.
-29Príklad 2
Okrem závislosti na ED50 sa účinok zmeny koncentrácie IFNp na účinok SIFNAR2/IFN komplexu skúmal pri rôznych koncentráciách IFNp. Ako je možné vidieť na obrázku 2, pri 4,75 lU/ml IFNp, IFNAR2 predinkubovanie počas 1 hodiny zosilňuje účinok ΙΡΝβ približne dvojnásobne pri maximálnej koncentrácii približne 32 ng/ml. Pri všetkých vyšších koncentráciách ΙΡΝβ nebolo možné detegovať zosilnenie IFN anti-vírusového účinku, keďže účinok už bol maximálny. Aj tieto výsledky podporujú skutočnosť, že IFNAR2/IF^ komplex má zosilnený IFN účinok.
Príklad 3
Kinetiky vytvárania IFNAR2/IF^ komplexu sa skúmali stanovením antivírusového účinku sub-účinnej koncentrácie IFNp (0,95 lU/ml), pri rôznom trvaní predinkubácie, s rôznymi koncentráciami IFNAR2. Ako je možné vidieť na obrázku 3, sú potrebné 4 hodiny predinkubácie na zosilnenie anti-vírusového účinku IFNp v tejto sub-účinnej dávke. Takže pri hladinách ΙΡΝβ, kedy je samotný ΙΡΝβ neaktívny, je výsledkom pridania IFNAR2 na generovanie komplexu, významný IFN anti-vírusový účinok. Tento experiment poskytuje ďalší podporný dôkaz skutočnosti, že IFNAR2/IF^ komplex zosilňuje IFN účinok.
Príklad 4
Stanovilo sa, že ΙΡΝβ biologický účinok rapídne klesá po in vitro rekonštitúcíi pri 37 °C (fyziologický tlmivý roztok pH 7,4). To sa aspoň čiastočne deje kvôli vytváraniu ΙΡΝβ oligomérnych štruktúr, ktoré majú znížený účinok. Na testovanie toho, či IFNAR2 posilňuje stabilitu ΙΡΝβ pri fýziologickom pH, sa uskutočnil experiment, v ktorom sa samostatne inkubovali rôzne koncentrácie ΙΡΝβ (v RPMI 1640 médiu, Gibco) alebo sa tieto inkubovali v rovnakom médiu v prítomnosti IFNAR2, pričom bol zachovaný konštantný pomer IFNAR2 ku ΙΡΝβ (2,5 ng/IU).
ΙΡ\/β (500 IU/nl) sa predinkubovalo s rovnakým objemom, buď SIFNAR2 (1,25 pg/ml), alebo len RPMI, 3 hodiny pri 37 °C. Titrácia oboch IFNp roztokov sa uskutočňovala vo WISH testovacom médiu v 96-jamkovej platničke pred pridaním
-30WISH buniek. VSV sa pridal po 24 hodinách a po ďalších 48 hodinách inkubácie sa uskutočnilo zhodnotenie pomocou stanovenia MTT konverzie.
Ako je možné vidieť na obrázku 4, samotný IFNp má ED50 približne 104 lU/ml, zatiaľ čo výsledkom predinkubovania IFNp s rozpustným IFNAR2 je významné zosilnenie, ED50 = približne 7 lU/ml. Výška ED50 pre samotné IFNp môže byť spôsobená oligomerizáciou IFNp v roztoku. Vyššie uvedené výsledky znovu potvrdzujú zvýšenie stability IFNp, keď sú v komplexe s IFNAR2.
Príklad 5
Na stanovenie toho, či zosilnenie účinku IFNp v prítomnosti IFNAR2 je spôsobené špecifickou ochranou prostredníctvom sIFNAR, zhodnocoval sa účinok IFNp po vytvorení komplexu s IFNAR2 alebo s inými nepríbuznými proteínmi v rovnakej koncentrácii (ľudský IgG, hovädzí sérový albumín (BSA)).
Ako je znázornené na obrázku 5, IFNp (500 lU/ml) sa predinkuboval s rovnakým objemom, buď uvedeného proteínu (1,25 pg/ml), alebo len s rovnakým objemom RDMI, 4 hodiny pri 37 °C. Titrácia týchto IFNp roztokov vo WISH testovacom médiu sa uskutočňovala v 96-jamkovej platničke pred pridaním WISH buniek. Zahrnutý bol aj čerstvo pripravený IFNp na stanovenie účinku predinkubácie na IFNp účinok. Po 24 hodinách sa pridalo VSV a CPE sa zhodnotilo po ďalšej 48 hodinovej inkubácii prostredníctvom MTT konverzie.
Predinkubovanie IFNp s nešpecifickými proteínmi (tzn. BSA alebo ľudský IgG) v koncentrácii 2,5 ng/IU IFNp nezabezpečilo účinok IFNp po rekonštitúcii. Účinok IFNAR2/IFNP komplexu v tomto teste bol podobný ako účinok čerstvo pridaného IFNp, čo podporuje zistenie, že SÍFNAR2 stabilizuje IFNp účinok.
Príklad 6
Ukázalo sa, že IFNAR2/IFNR komplex značne predlžuje farmakokinetický profil IFNp v myšej ELISA-e a pri biologickej testovacej analýze (obrázky 6 a 7).
Do B6D2F1 kmeňa myši sa zaviedla jedna intravenózna bolusová injekcia buď ľudského IFNp (2,5 x 106 lU/kg) alebo rovnaká koncentrácia IFNp, ktorý sa predinkuboval 1 hodinu pri 4 °C s ľudským IFNAR2 (2,5 ng/IU IFN). Séra sa izolovali
-31 od 0,05 do 48 hodín po podaní, z retroorbitálneho plexusu a stanovila sa koncentrácia IFNp a IFNp anti-vírusový účinok prostredníctvom ELISA (obrázok 6) alebo WISH biologickým testom (obrázok 7). Sérové koncentrácie, ktoré spadali pod úroveň citlivosti testu (7,55 lU/ml) v ELISA teste sa nepočítali.
Nie len komplex vykazoval predĺžený farmakokinetický profil, ale prostredníctvom WISH anti-virusového testu sa ukázalo, že aj hladina biologicky účinného IFNp v myši sa značne zvyšuje v čase, čo dokazuje posilnenie stability a predĺženie plazmatického polčasu rozpadu IFNAR2/IFNP komplexu podľa vynálezu vzhľadom na samotné IFNp.
Príklad 7
IFNAR2/IFNa2a komplex vykazoval značne predĺžený farmakokinetický profil IFNa2a v myši na základe ELISA a biologických testov (obrázky 8 a 9).
Do myší kmeňa B6D2F1 sa zaviedla jedna intravenózna bolusová injekcia buď ľudského IFNa (1,25 x 105 lU/kg), alebo rovnaká koncentrácia IFNa, ktorý sa predinkuboval 1 hodinu pri 4 °C s ľudským IFNAR2 (14,9 ng/IU IFN). V uvedených časoch sa izolovali séra z retrorbitálneho plexusu a stanovila sa koncentrácia IFNa2a a IFNa anti-virusový účinok prostredníctvom ELISA (obrázok 8), respektíve WISH biologického testu (obrázok 9).
IFNa sa zhodnotil prostredníctvom ELISA špecifickej pre ľudský IFNa. Sérové koncentrácie, ktoré spadali pod úroveň citlivosti ELISA testu (30 lU/ml) sa nepočítali.
Nie len komplex vykazoval predĺžený farmakokinetický profil pre IFNa, ale WISH anti-vírusovým testom bolo potvrdené, že aj hladina biologicky účinného IFNa v myši sa značne zvyšuje v čase, čo potvrdzovalo posilnenie stability a predĺženie polčasu rozpadu IFNAR2/IFN komplexu podľa vynálezu v plazme v porovnaní so samotným IFNa.
Príklad 8
Skonštruovanie IFNAR2/IFN fúzovaných proteínov
-32Konštrukty boli navrhnuté tak, aby C-koniec IFNAR2 extracelulárnej domény bol fúzovaný s N-koncom zrelého IFN použitím nasledujúcich peptidových spojovníkov, kde G a S predstavujú aminokyseliny glycín a lyzín:
IFNAR2 extracelulárna doména (spojovník) zrelý IFNp ...ESEFS(GGGGS)nMSY..., kde n = 0 (sekv. č.: 5), 1 (sekv. č.: 7), 2 (sekv. č.: 6), 3 (sekv. č.: 5), 4 (sekv. č.: 4), a 5 (sekv. č.: 3).
Úplná aminokyselinová sekvencia IFNAR2/IFNP fúzie, v ktorej n=2, je uvedená na obrázku 10 (sekv. č.:14).
Expresný vektor pSVElF, ktorý obsahuje gén exprimujúci ľudský rekombinantný IFN, sa použil ako templát pre PCR. Syntetické primery boli navrhnuté tak, aby z templátu mohla byť amplifikovaná len oblasť kódujúca zrelý proteín ľudského IFN (MSY...). 5' primer pozostával zo sekvencie obsahujúcej Smal miesto, posledných siedmich aminokyselín IFNAR2 (GQESEFS) (zvyšky 344 až 349 sekv. č.: 12) a (GGGGS)i (sekv. č.: 1) spojovníka. Do 5' PCR primerovej sekvencie sa zaviedli aj BamHI a Xhol miesta na uľahčenie klonovania iných kaziet. 3' primer obsahoval Avrll miesto, hneď za TGA stop kodónom hIFNp. PCR reakčná zmes obsahovala približne 1 g templátovej DNA, 1 g každého PCR primeru, 0,2 mM každého z dATP, dCTP, dGTP, a dTTP, 1X ThermoPol reakčný tlmivý roztok (10 mM KCI, 20 mM Tris-HCI, (pH 8,8, pri 25 °C), 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0,1% Triton X-100: New England Biolabs; Beverly, Ltd), a 3 mM MgSO4 (5 mM MgSO4 konečná koncentrácia) v reakčnom objeme 100 pl. Po VENTR® počiatočnej inkubácii pri 99,9 °C počas 30 sekúnd, sa do reakčnej zmesi pridali 2 jednotky VENTR® DNA polymerázy. PCR pozostávala z nasledujúcich 20 cyklov: (a) 99,9 °C, 30 sekúnd, (b) 65 °C - 85 °C, 30 sekúnd, pričom sa teplota zvyšovala o 0,5 °C v každom cykle, a (c) 75 °C, 40 sekúnd. Uskutočnilo sa ďalších 15 cyklov s vyššie uvedeným profilom, ale anelačná teplota sa udržiavala na 55 °C. PCR reakčné zmesi sa purifikovali použitím Wizardr PCR Preps DNA purifikačného systému (Promega; Madison, Wl). Po štiepení PCR produktov 3 Avrll sa reakčné zmesi purifikovali na agarózových géloch s nízkou teplotou topenia. Gélovo-purifikované fragmenty, ktoré obsahovali sekvenciu zrelého hIFNp proteínu s 1 GS spojovníkom, sa ligovali do expresného vektora pCMV-p40, ktorý bol poštiepený s (Smal + Avrll),
-33a ktorý obsahoval gén kódujúci rozpustnú formu ľudského rekombinantného IFNAR2. Ligačné reakcie sa použili na transformovanie kompetentných E. coli XL-1 Blue buniek použitím štandardných postupov (Sambrook a ďalší, 1989). Správne zostavenie konštrukcie, s názvom pCMV-IFNAR2/IFNAp GS, sa potvrdilo štiepením reštrikčnými endonukleázami a sekvenovaním prostredníctvom PCR vygenerovanej oblasti, “interfúzie”. Následné konštrukty sa navrhli použitím oligonukleotidových kaziet, z ktorých každá obsahovala BamHI presah, príslušný (GGGGS)n spojovník (sekv. č.: 1 ak n = 1) a Xhol presah. 0 GS kazety obsahovali Smal a Xhol presahy. Po skontrolovaní pCMV-IFNAR2/IFNAp 1 GS vektora sa tento poštiepil s BamHI a Xhol, a ligovali sa doňho príslušné kazety. Pri 0 GS konštrukte sa vektor na ligáciu kazety poštiepil so Smal a Xhol.
Celkovo sa vytvorilo šesť vektorov, pCMV-IFNAR2/IFNp n (GS), kde n znamená 0, 1, 2 ,3, 4, alebo 5 GGGGS (sekv. č.: 1) spojovníkových jednotiek. Na obrázku 11 sú znázornené výsledky reštrikčného štiepenia. Sekvenčné primery boli navrhnuté tak, aby bol úplne osekvenovaný každý konštrukt. Pre každý skontrolovaný konštrukt sa pripravili veľkoobjemové plazmidové DNA kultúry použitím komerčne dostupného kitu a protokolov opísaných výrobcom (Qiagen; Chatsworth, CA).
Obrázok 12 znázorňuje plazmidovú mapu pCMV-IFNAR2/IFNAp Interfúzovaných expresných vektorov. Transkripcia IFNAR2/IFNp fúzovaného proteínu je riadená ľudským stredne skorým CMV promótorom. Na 3' spracovanie IFNAR2/IFNP transkriptov je použitá polyadenylačná signálna sekvencia ľudského rastového hormónu (hGH), ktorú poskytuje vektor.
Zoznam vektorov
| č. | Meno | Exp. vektor | GGGGS (sekv spojovník |
| 1 | pCMV-IFNAR2-IFNp, OGS | pCMV.PA4 | N/A |
| 2 | pCMV-IFNAR2-lFNp, 1GS | pCMV.PA4 | jeden |
| 3 | pCMV-IFNAR2-IFNp, 2GS | pCMV.PA4 | dva |
| 4 | pCMV-IFNAR2-IFNp, 3GS | pCMV.PA4 | tri |
pCMV-IFNAR2-IFNp, 4GS pCMV.PA4 štyri pCMV-IFNAR2-IFNp, 4GS pCMV.PA4 päť
Získali sa sekvenčné údaje pre PCR-generovanú oblasť IFNAR2/IFNP 1GS fúzie; tieto údaje ukázali, že sekvencia bola taká ako sa predpokladalo. Získali sa aj sekvenčné údaje pre peptidovú spojovníkovú oblasť iných konštruktov; sekvencie boli tiež také ako sa predpokladalo.
Na bunkách transfekovaných každým z konštruktov sa uskutočnila Northern blot analýza. Pás s približnou veľkosťou 1,4 kb sa nachádzal vo všetkých dráhach, ktoré obsahovali IFNAR2/IFNP nGS vzorky, tak pre IFNAR2 sondu, ako aj pre IFNp sondu. Pri IFNp sonde bol pozorovaný ďalší pás s veľkosťou približne 0,9 kb. Pás s touto veľkosťou zodpovedá alternatívne zostrihanému transkriptu, ktorý by obsahoval posledných šesť aminokyselín z IFNAR2, (n) GS peptidový spojovník a hlFN zrelú proteínovú sekvenciu. Toto sa potvrdilo sekvenovaním cDNA pripravenej z celkovej RNA izolovanej z prechodne transfekovaných CHO buniek podľa príkladu
9.
Príklad 9
Prechodná transfekcia
CHO-DUKX bunky sú klonovým mutantom ovariálnych buniek čínskeho škrečka, ktoré nemajú dihydrofolátreduktázovú aktivitu (Urlaub a ďalší (1980); Graff a ďalší (1982)). Bunky sa udržiavali v Alfa Minimálnom Esenciálnom médiu (aMEM) s obsahom ribonukleozidov a deoxyribonukleozidov, ktoré bolo doplnené s 10% fetálnym hovädzím sérom (FBS) a 1% L-glutamínom (kompletné médium). Prechodná transfekcia sa uskutočnila použitím Lipofektamínového PLUS Reakčného činidla (GibcoBRL Life Technologies; Gaithersburg, MD) a protokolu, ktorý poskytol výrobca. Približne 24 hodín pred transfekciou sa bunky vysiali na platne s priemerom 100 mm s hustotou 2 x 106 buniek na platňu. Na transfekciu sa použili 4 pg superšpirálovej vektorovej plazmidovej DNA (pCMV-IFNAR2/IFN n GS, kde n = 0, 1, 2, 3, 4 alebo 5). Na riedenie DNA a PLUS reakčného činidla sa použilo médium bez séra, ktoré poskytuje výrobca. Bunkové supernatanty sa zozbierali po
-35inkubovaní počas 48 hodín pri 37 °C v kompletnom médiu, na testovanie použitím
ELISAs (IFNAR2, IFNp) a Western gélov.
RNA extrakcia a Northern analýza
Celková bunková RNA (Chomczynski a ďalší, 1987) sa extrahovala z prechodne transfekovaných CHO-DUKX buniek. Desať gramov celkovej RNA na dráhu sa rozdelilo podľa veľkosti v agarózových géloch, ktoré obsahovali formaldehyd ako denaturant. Vzorky sa nanášali v zdvojených sadách. RNA sa preniesla na GeneScreen Plus nylonové membrány (DuPont/NEN Medical Products; Boston, MA) kapilárnym blotom v 10 X SSC (1,5M chlorid sodný, 0,15M citrát sodný). Imobilizovaná RNA sa hybridizovala na 32P-značené hlFNAR2 a hIFNa PCR fragmenty v roztoku, ktorý je modifikáciou roztoku podľa Churcha a Gilberta (1984). Tlmivý roztok obsahoval 0,25M fosforečnan sodný, pH 7,2, 0.25M chlorid sodný, 7% dodecylsulfát sodný (SDS), 1mM kyselinu etlyléndiamintetraoctovú a 100 pg/ml E. coli tRNA. 32P-značené sondy sa generovali použitím komerčne dostupného kitu (High Prime Boehringer Mannheim; Indianapolis, IV) a v ňom opísaných postupov. Nezačlenená rádioaktivita sa odstránila chromatografiou na Sephadex G-50 kolónach. Po hybridizácii sa bloty premyli; najprísnejším premývaním bolo 0,2 X SSC, 0,1% SDS, pri 65 °C. Bloty sa podrobili autorádiografii.
Expresia interfúzovaných proteínov
Supernatanty každého z interfúzovaných konštruktov prechodne transfekovaných do CHO buniek sa analyzovali z hľadiska IFNAR2 a IFNp hladín expresie použitím IFNAR2 špecifickej ELISA, respektíve IFNp ELISA (Toray). Výsledky tejto analýzy sú uvedené nižšie v tabuľke 4.
-36Tabuľka 4
Interfúzované konštrukty prechodne transfekované do CHO buniek
| Označenie vzorky | [hIFNp]* (U/ml) | [hlFNAR2f (ng/ml) | [hIFNp]* (pg/ml) | [hIFNp]* (pmol) | [hlFNAR2]s (pmol) | IFN/FNAR |
| 0GS | 29 175 | 1094 | 0,146 | 6,571 | 31,802 | 0,207 |
| 1GS | 24 906 | 994 | 0,125 | 5,609 | 28,895 | 0,194 |
| 2GS | 13 597 | 600 | 0,068 | 3,063 | 17,442 | 0,175 |
| 3GS | 14 998 | 718 | 0,075 | 3,378 | 20,857 | 0,162 |
| 4GS | 9 998 | 535 | 0,050 | 2,251 | 15,538 | 0,145 |
| 5GS | 9 597 | 540 | 0,048 | 2,161 | 15,638 | 0,139 |
| IFNAR2 | nezistené | 1176 | 34,200 | |||
| kultivačné médium | nezistené | 0 |
* - Stanovené použitím TORAY kitu * - Stanovené použitím hlFNAR2 ELISA ♦ - vztiahnuté ku špecifickej aktivite 2,0 x 105 U/mg (2 x 108/mg) # - vztiahnuté ku hmotnosti 22 200 daltonov (priemerná hmotnosť prostredníctvom MALDI-TOF analýzy hIFNP) § - vztiahnuté ku hmotnosti 34 400 daltonov (priemerná hmotnosť prostredníctvom MALDI-TOF analýzy
Ako je zrejmé, so zväčšujúcou sa dĺžkou spojovníka bol pozorovaný pokles detekovateľnosti IFNAR2 a IFNp. V súčasnosti nie je možné stanoviť, či je to kvôli poklesu množstva interfúzovaného proteínu exprimovaného so zväčšujúcou sa dĺžkou spojovníka, alebo, či keď sa zväčšuje dĺžka spojovníka môže sa IFNp viazať na IFNAR2 väzobné miesto, a preto nie je úplne detegovateľná ELISA testami. Je známe, že IFNp test deteguje len IFNp, ktorý nie je v komplexe.
-37Western blot analýza IFNAR2/IFNP fúzovaného proteínu
Na stanovenie toho, že interfúzované proteiny majú príslušnú molekulovú hmotnosť, a že sa neexprimoval žiadny voľný IFNp, analyzovali sa supernatanty z transfekovaných buniek prostredníctvom Western blottingu použitím anti-IFNp protilátky na detekciu interfúzie. Výsledky tejto analýzy sú znázornené na obrázku
13.
μΙ kultúrových supernatantov z CHO buniek prechodne transfekovaných s IFNAR2/IFNp konštruktom (dráhy 1-6) alebo IFNAR2 konštruktom (dráha 7), kultivačné médium (dráha 8) alebo IFNp (dráha 9) sa podrobili SDS-PAGE v neredukujúcich podmienkach a nasledoval elektrotransfer na PVDF membránu. Membrána sa sondovala s králičou anti-IFNp protilátkou a vyvinula sa kozou antikráličou protilátkou konjugovanou s alkalickou fosfatázou použitím Western-Star luminiscenčného detekčného kitu.
V supernatantoch žiadneho z interfúzovaných konštruktov sa nedetekoval voľný IFNp. Podobne, každý s konštruktov exprimoval proteín, ktorý mal na Western blote správnu MW pre každý interfúzovaný konštrukt.
Príklad 10
Anti-vírusový účinok interfúzovaných molekúl
Supernatant každej kultúry s obsahom interfúzie sa testoval z hľadiska antivírusového účinku v cytopatickom teste, v ktorom sa WISH bunky (ľudské amniotické bunky) vystavili pôsobeniu VSV po pridaní buď IFNp (kontrola) alebo interfúzií. Výsledky sú uvedené na obrázku 14.
CHO bunkové supernatanty obsahujúce exprimované rekombinantné proteiny (ako sa detegovalo prostredníctvom ELISA a Western blotu) alebo samotné CHO kultivačné médium sa pridali dvojmo do horného radu 96-jamkových platní s rovným dnom na kultiváciu tkanív, v objeme 75 μΙ na jamku. 50 μΙ WISH bunkového testovacieho média sa pridalo do zvyšných jamiek platne. Uskutočnili sa trojnásobné sériové riedenia pre každú vzorku tak, že sa odobralo 25 μΙ z jamiek obsahujúcich supernatanty (horný rad) a tento objem sa pridal do nasledujúceho
-38radu, ktorý obsahoval 50 μΙ WISH testovacieho média. V jamkách na pozitívnu kontrolu sa supernatanty z horného radu nahradili WISH testovacím médiom s obsahom 1000 lU/ml ľudského IFNp, ktorý sa podobne sériovo riedil trojnásobne smerom k spodnej časti platne. Do každej jamky sa potom pridalo 50 μΙ WISH bunkovej suspenzie (0,6 x 106 buniek/ml vo WISH testovacom médiu), takže konečná koncentrácia v hornom rade obsahujúcom REBIF® bola 500 lU/ml, a východzie riedenie pre CHO bunkové supernatanty bolo 1:2. Po 24 hodinách inkubovania v 5% CO2, pri 37 °C, sa do každej jamky (okrem jamiek vyhradených ako neinfikované kontrolné jamky) pridalo 50 μΙ WISH testovacieho média s obsahom vezikulárneho vírusu stomatitídy (1:10 zásobného roztoku). Životaschopnosť WISH buniek sa determinoval po ďalších 48 hodinách kultivácie, prostredníctvom MTT konverzie.
Anti-vírusový účinok, sprostredkovaný interfúzovanými molekulami, sa stanovil normalizáciu riediaceho faktora supernatantov, ktorý bol nevyhnutný na dosiahnutie EC50 voči EC50 ktorý bol stanovený pre purifikovaný ľudský IFNp štandard. So zväčšujúcou sa dĺžkou spojovníka sa zvyšoval aj anti-vírusový účinok interfúzovaných konštruktov.
Príklad 11
Tento príklad je farmakokinetickou štúdiou ľudského IFNp/slFNAR2 komplexu v myši po intravenóznom podaní. Porovnania sa uskutočňujú medzi vopred vytvorenými a oddelene injekčné podanými zložkami komplexu. Tridsaťšesť myší kmeňa D2F1 (6 až 8 týždňové) (každá má hmotnosť približne 20 g) sa nasledovne rozdelí do štyroch skupín:
Skupina 1 zahŕňa deväť myší, ktorým sa má intravenózne podať jedna bolusová injekcia 200 μΙ roztoku 50 000 lU/ml ľudského IFNp (konečná dávka
000 ÍU/myš).
Skupina 2 (deväť myší) obdrží 200 μΙ roztoku 50 000 lU/ml ľudského IFNp a
125 mg/ml SIFNAR2 (2,5 ng/IU pomer).
Skupina 3 (deväť myši) obdrží (1) 200 μΙ roztoku 125 mg/ml, následne (2)
200 ml roztoku 50 000 lU/ml ľudského IFN3 (2,5 ng/IU pomer).
-39Skupina 4 (9 myší) obdrží (1) 200 μΙ roztoku 625 mg/ml, následne (2) 200 ml roztoku 50 000 lU/ml ľudského IFNp (10 ng/IU pomer).
Vzorky krvi (približne 200 ml/vzorku) sa odobrali v stanovených časoch prepichnutím retroorbitálneho venózneho plexusu kapilárnou rúrkou. Trom myšiam z každej skupiny sa odobrali krvné vzorky 0,05, 2 a 12 hodín po podaní. Trom myšiam z každej skupiny sa odobrali vzorky krvi 0,54 a 24 hodín po podaní a trom myšiam z každej skupiny sa odobrali vzorky krvi 1,8 a 48 hodín po podaní. Vzorky krvi sa nechali zrážať jednu hodinu pri laboratórnej teplote, obrúbili sa a mikrocentrifugovali sa. Izolované séra sa uskladnili pri -70 °C pokiaľ sa nezozbierali všetky vzorky. Séra sa testovali z hľadiska prítomnosti ľudského IFNp prostredníctvom IFNp špecifickej ELISA použitím Toray ľudského IFNp ELISA kitu (TFB, Inc.) a testovali sa z hľadiska biologického účinku použitím WISH antivírusového testu.
Výsledky IFNp špecifického ELISA testu sú uvedené na obrázku 15A a výsledky WISH antivírusového testu sú uvedené na obrázku 15B.
Je možné vidieť, že sérový polčas rozpadu IFNp, ktorý sa podal injekciou ako IFNAR2 komplex je podobný sérovému polčasu rozpadu IFNp, ktorý sa podal injekciou po oddelenej IFNAR injekcii. Tieto výsledky sú v súlade s in vivo vytváraním IFNp/IFNAR2 komplexu s predĺženým polčasom rozpadu.
Príklad 12
C57BL/6 myši sa ošetrili komplexom Universaľ IFN (ľudský IFNaA/D) a slFNAR2. Ochranný účinok, monitorovaný vo forme cytotoxicity, sa meral v porovnaní s podaním rôznych dávok samostatného Universal IFN alebo v porovnaní s podaním kontroly. Prvá skupina dostala 5 x 103 IU Universal IFN v komplexe s 5/ng IU SIFNAR2. Druhá skupina dostala 5 x 103 IU Universal IFN. Tretia skupina dostala 5 x I04 IU Universal IFN a štvrtá skupina dostala PBS/2% NMS. Pre každú z týchto myší sa merala NK aktivita ako cytotoxicita slezinových buniek voči NK cieľovým bunkám YAC-1. Výsledky sú uvedené na obrázku 16. Tento účinok bol významne vyšší u myší ošetrených s Universal IFN/slFNAR2 komplexom, v porovnaní s myšami ošetrenými len s Universal IFN.
-40Príklad 13
Ako je uvedené vyššie, farmakokinetické štúdie demonštrovali dramatické predĺženie sérového polčasu rozpadu IFNs typu I, keď sa podáva v komplexe s slFNAR2, čo je rozpustná forma IFN receptorových podjednotiek. In vitro výsledky naznačujú, že fyzické spojenie s IFNAR2 vedie ku stabilizácii normálne labilného IFN. Aby sa zistilo, či predĺženie IFN profilu a stabilizačný účinok IFNAR2 spôsobuje zosilnenie a predĺženie IFN sprostredkovaného účinku in vivo, vyvinul sa model, v ktorom sa na myši s ťažkým kombinovaným imunitným deficitom (scid/scid) pôsobilo letálnou dávkou IFN-citlivou Daudi ľudskou B bunkovou lymfómovou bunkovou líniou (Ghetie, 1991; Ghetie, I990). U týchto myší sa vyvinula paralýza medzi 14 a 20 dňom po bunkovej injekcii spolu s histologickým dôkazom difúzneho lymfómu. Pozoruhodné je, že prežívanie týchto myší je možné predĺžiť, na dávke závislým spôsobom, denným subkutánnym podávaním ľudského IFNp. Tento model sa používa na zhodnotenie IFNAR2 ako zlepšovateľa biologického účinku, ktorý je spojený s IFNs typu I in vivo.
Aby sa stanovil vzťah medzi priemerným časom do paralýzy a dávke IFNs v Daudi scid modeli, subkutánne sa podalo piatim skupinám po 5 samičiek myší kmeňa BALB/cByJSmn-scid/scid, s vekom 4 až 5 týždňov, 200 μΙ na myš na deň, ľudského IFNp, každý deň odo dňa 0 po deň 30. Štandardná Daudi bunková dávka, expandovaná zo zmrazeného zásobného roztoku, bola 5 x 109 buniek na myš, subkutánnou injekcou do kože na zátylku v deň 0 v PBS. Skupiny myší obdržali nasledujúce množstvá IFN.
Skupina 1: 135 x 104 lU/myš (675 x 104 lU/ml). Skupina 2: 45 x 104 IU/ myš (225 x 104 ÍU/ml). Skupina 3 : 15 x 104 IU/ myš (75 x 104 lU/ml). Skupina 4 : 5 x 104 IU/ myš ( 25 x 104 lU/ml). Skupina 5: PBS s 2% NBS
Jednotlivé časy do paralýzy, a priemerné hodnoty sú uvedené v tabuľke 5.
-41 Tabuľka 5
Dni do paralýzy
Priemer (±SD)
Skupina 1 26,31,35,37,40
Skupina 2 20, 23, 23, 23, 26
Skupina 3 20, 20, 22, 22, 23
33,8 (5,4)
23,0(2,1)
21,4(1,3)
Skupina 4 17,18,18,18,18
17,8 (0,5)
Skupina 5 14,14,15,15,15
14,6 (0,6)
Takže je možné vidieť, že priemerný čas do paralýzy v Daudi/scid xenoštepovom modeli je predĺžený na dávke závislým spôsobom denným subkutánnym podávaním ľudského IFNp.
Príklad 14
Aby sa stanovilo, či protinádorový účinok IFNp môže byť zosilnený vytvorením komplexu s IFNAR2, pri 2,5 ng/IU, ošetrilo sa sedem skupín po päť myší rovnakým spôsobom ako bolo uvedené v príklade 13, stým rozdielom, že testovacie materiály boli každej skupine podávané nasledovne:
len IFNp na myš
IFNp plus SIFNAR2 na myš
Skupina 1
Skupina 2
Skupina 3
2x102IU x 103IU x104IU skupina 4 2 x 102 IU plus 0,5 gg skupina 5 2 x 103 IU plus 5,0 gg skupina 6 2 x 104 IU plus 50,0 gg
Skupina 7 obdržala Daudi bunky, ošetrené len riedením
Jednotlivé časy do paralýzy a priemerné hodnoty sú uvedené v nasledujúcej tabuľke:
-42Tabuľka 6
| Dni do paralýzy | Priemer (± SD) | |
| Skupina 1 | 16, 16, 17, 18, 19 | 17,2 (1,3) |
| Skupina 2 | 17, 18, 18, 19, 19 | 18,2 (0,8) |
| Skupina 3 | 17, 17, 17, 18, 18 | 17,6 (0,9) |
| Skupina 4 | 17, 17, 18, 18, 19 | 17,8 (0,8) |
| Skupina 5 | 17, 18, 19, 20, 20 | 18,8(1,3) |
| Skupina 6 | 21,22, 22, 23, 26 | 22,8(1,9)* |
| Skupina 7 | 16, 16, 17, 17, 17 | 16,6 (0,6) |
* Významne odlišná (p hodnota <0,05) ako rovnaká koncentrácia IFNp v nekomplexnej forme pri porovnávaní párov skupín ako bolo stanovené jednocestnou ANOVA.
Je možné vidieť, že protinádorový účinok nízkej dávky IFNp 2 x 104 IU/myš/deň v Daudi/scid xenoštepovom modeli sa významne posilní vytvorením komplexu s IFNAR2.
V ďalšom experimente (nie je ilustrovaný) sa študoval účinok frekvencie podávania injekcií na priemerný čas do paralýzy. Zistilo sa, že je možné získať významne zosilnený protinádorový účinok v Daudi/scid xenoštepovom modeli ošetrením s IFNp/IFNAR2 komplexom, keď sa podáva nepravidelne raz za týždeň, v porovnaní s voľným IFNp, ktorý sa injekčné podáva raz za deň. Navyše, v ďalšom experimente (nie je ilustrovaný) sa testoval optimálny pomer IFNAR ku IFNp. Zistilo sa, že optimálny pomer IFNAR2:IFNp na zosilnenie protinádorového účinku pri jednej koncentrácii IFNp (2 x 104/IU/myš/deň) je 2,5 ng IFNAR2 na pg IFNp.
V druhom experimente sa zistilo, že optimálny pomer IFNAR2:IFNp na zosilnenie protinádorového účinku pri koncentrácii IFNp 5x104 IU/myš/deň je 0,3 ng IFNAR2 na pg IFNp. Z týchto dvoch experimentov vyplýva, že optimálny pomer závisí na koncentrácii IFNp a zdá sa, že vyššia koncentrácia IFNp znižuje potrebný pomer.
V inom experimente využívajúcom rovnaký model sa stanovilo, že podávanie samotného IFNAR2 nezlepšuje prežívanie študovaných myší.
Príklad 15
Tento príklad je farmakokinetickou štúdiou na stanovenie sérového polčasu rozpadu interúzovanej 5GS molekuly v myšom sére po jednej bolusovej intravenóznej injekcii. Do troch skupín sa nasledovne rozdelilo dvadsaťjeden samičiek myší kmeňa B6D2F1 (6-8 týždňové) (každá mala približne 20g):
Skupina 1: obsahuje deväť myší, ktorým sa intravenóznou injekciou podala jedna dávka v množstve 200 μΙ roztoku 100 000 lU/ml Interfúzie 5GS (konečná dávka 20 000 lU/myš alebo 5 x 106 lU/kg).
Skupina 2: (deväť myší) dostala 200 μΙ roztoku 100 000 lU/ml ľudského IFNp.
Skupina 3 obsahuje tri myši, ktorým nebola podaná injekcia a slúžia ako negatívna kontrola.
Za predpokladu, že objem krvi je približne 2 ml na myš, teoretické Cmax a Tmax je 10 000 lU/ml pre skupiny 1 a 2. Trom myšiam každej zo skupín 1 a 2 sa odobrali vzorky krvi 0,05, 2 a 12 hodín po podaní. Trom myšiam každej zo skupín 1 a 2 sa odobrali vzorky krvi 0,5, 4 a 24 hodín po podaní a trom myšiam každej zo skupín 1 a 2 sa odobrali vzorky krvi 1, 8 a 48 hodín po podaní. Séra sa analyzovali z hľadiska prítomnosti biologicky účinného ľudského IFNp použitím WISH testu.
Výsledky sú uvedené na obrázku 17. Zatiaľ čo IFNp zmizne takmer okamžite, ostáva interfúzovaná molekula v sére dlho po injekcii. To potvrdzuje, že fúzovaný protein má požadovaný stabilizačný účinok.
Predchádzajúci opis špecifických uskutočnení tak kompletne odhalil všeobecnú povahu vynálezu, že iný môžu použitím súčasných vedomostí jednoducho modifikovať a/alebo adaptovať rôzne aplikácie takýchto konkrétnych uskutočnení bez zbytočného experimentovania, a bez toho, že by vybočili zo všeobecného konceptu, a preto majú byť takéto adaptácie a modifikácie považované za také, ktoré spadajú do rozsahu ekvivalentov opísaných uskutočnení. Je zrejmé, že tu použitá frazeológia a terminológia plní účely opisu, a nie je obmedzením vynálezu. Prostriedky, materiál a kroky na uskutočňovanie rôznych opísaných funkcií môžu mať rôzne alternatívne formy, bez toho, aby vybočili
-44z rozsahu vynálezu. Takže výrazy “prostriedok na...” a “prostriedok pre...” alebo akékoľvek spôsobové výrazy, ktoré sa môžu nachádzať v opise uvedenom vyššie a/alebo v nárokoch uvedených nižšie, sú zamýšľané tak, že definujú a pokrývajú akýkoľvek štrukturálny, fyzikálny, chemický alebo elektrický element alebo štruktúru, alebo akýkoľvek spôsobový krok, ktorý môže teraz alebo v budúcnosti existovať, a ktorým sa môže uskutočniť citovaná funkcia, bez ohľadu na to, či je alebo nie je presným ekvivalentom uskutočnenia alebo uskutočnení uvedených vyššie, tzn. môžu byť použité iné prostriedky alebo kroky na uskutočňovanie rovnakých funkcií; pričom tieto výrazy sú chápané v ich najširšom význame.
Literatúra
Alam a ďalší, Comparative Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of two recombinant human interferon beta-1 (IFNp-1a) products administered intramuscularly in healthy malé and female volunteers, Pharmaceutical Research 14: 546-549 (1997)
Anfinsen, Principles That Govem The Folding of Proteín Chains, Science 181:223230 (1973)
Ausubel a ďalší, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publications and Wiley Interscience (New York, 1987-1992)
Barón a ďalší, The interferons: A biological systém with therapeutic potential in viral infections, Antiviral Res. 24:97-110 (1994)
Barón a ďalší, The interferons: Mechanisms of action and clinical applications, J. Am. Med. Assoc. 266:1375-1383 (1991)
Chomczynski a ďalší, Anál. Biochem. 162:156-159 (1987)
Christofinis, G.J., Interferon Production by Human Lymphoblastoid Celí Lines of Different Origins, Journal of Generál Virology 52:169-171 (1981)
Church a ďalší, Proc. Natl Acad. Sci USA 81:1991-1995 (1984)
Colamonici a ďalší, Multichain structure of the interferon alpha receptor on hematopoietic celíš, J. Immunol 148:2126-2132 (1992)
Colamonici a ďalší, Identification of a novel subunit of the Type I inrerferon receptor localized to human chromosome 21 J. Biol. Chem. 268:10895-10899 (1993) Curtis, B.M., Enhanced Hematopoietic Activity of a Human Granulocyte/Macrophage Colony-stimulating Factor-lnterleukin 3 Fusion Protein, Proc. Natl. Aca“. Sci. 88:5809-5813(1991)
Domanski a ďalší, Cloning and Expression of a Long Form of the β Subunit of the Interferon a β Receptor That is required for Signaling, The Journal of Biological Chemistry 270:6 (1995)
Duncan a ďalší, 'The transcription factor interferon regulátory factor-1 is essential for natural killer celí function in vivo, J. Exp. Med. 184:2043-2048 (1996)
- teDron a ďalší, Interferon α/β gene structure and regulation in Interferon: Principles and Medical Applications, Barón a ďalší, Editors, (University of Texas Medical Branch: Galveston, TX, 1992) str. 33-45
Edington, S.M., Biotech Products as Drug Leads BioTechnology 13:649 (1995) Ertel a ďalší, Árch. Súra. 129:1 (1994)
Fierlbeck a ďalší, Pharmacodynamics of recombinant IFNp during long-term treatment of malignant melanoma, Journal of Interferon and Cytokine Research 16:777 (1996)
Ghetie a ďalší, Cancer Research 51:5876 (1991)
Ghetie a ďalší, Blood 80:2315 (1990)
Graff a ďalší, Mol Celí. Biol. 2:93-96 (1982)
Grantham, Science 185:X62-X54 (1974)
Grazia Cusi, M., Harlequin Granulocyte-colony Stimulating Factor Interleukin 6 Molecules with Bifunctional and Antagonistic Activities, Immunotechnology 3:61-69 (1997)
Ibanez, C.F., Chimeric Molecules with Multiple Neurotrophic Activities Reveal Structural Elements Determining the Specificities of NGF and BDNF, EMBO Journal 10:2105-2110(1991)
Kazam a ďalší, J. Biol. Chem. 270:1 (1995)
Keown, W.A., Methods for Introducing DNA into Mammalian Celíš, Methods in Enzymology 185: 527-537 (1990)
Lengyl, P., Biochemistry of interferons and their actions, Ann. Rev. Biochem. 51: 251-282 (1982)
Lutfalla a ďalší, Mutant U5A celíš are complemented by an interferon-α/β receptor subunit generated by alternatíve processing of a new member of a cytokine receptor gene cluster, EMBO Journal 14:5100-5108 (1995)
Meinkoth a ďalší, Anál. Biochem. 138: 267-284 (1984)
Nagai a ďalší, Náture 309:810 (1984)
Novick a ďalší, J. Immunol. 129:2244-2247 (1982)
Novick a ďalší, Soluble interferon-alpha receptor molecules are present in body fluids FEBS Lett. 314:445-448 (1992)
-y? Novick a ďalší, 'The human interferon a/b receptor: Characterization and molecular cloning, Celí 77:391-400 (1994)
Novick a ďalší, Soluble and membrane-anchored forms of the human IFN-α/β receptor, J. Leuk. Bio. 57:712-718 (1995)
Olins, P.O., Recent Advances in Heterologous Gene Expression in Escherichia coli, Current Opinion in Biotechnology 4:520-525 (1993)
Pestka a ďalší, Interferons and their actions, Ann. Rev. Biochem. 56:727-777 (1987)
Platanias a ďalší, Characterization of the α-subunit of the interferon a receptor: evidence of N- and O-linked glycosylation and association with other surface proteins, J. Immunol. 150:3382-3388 (1993)
Platanias a ďalší, Tyrosine phosphorylation of the a and β subunits of the Type I interferon receptor J. Biol. Chem. 269:17761-17764 (1994)
Platanias a ďalší, Differences in interferon a and β signaling, J. Biol. Chem. 271:23630-23633(1996)
Qureshi a ďalší, Function of Stat2 proteín in transcriptional activation by alpha interforon, Mol. Celí Bio. 16:288-293 (1996)
Ratner, M., Proteín Expression in Yeast, Bio/Technology 7:1129-1133 (1989)
Reff, M., High-level Production of Recombinant Immunoglobulins in mammalian
Celíš, Current Opinion in Biotechnology 4:573-576 (1993)
Reuveny, S., Production of Recombinant Proteins in High Density Insect Celí Cultures, Biotechnology and Bioengineering 42:235-239 (1993)
Salmon a ďalší, Pharmacekinetics and phamacodynamics of recombinant human IFNp in healthy malé volunteers, Journal of Interferon and Cytokine Research 16:759(1996)
Sambrook a ďalší, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vy d., Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, NY, 1989)
Sharf a ďalší, Functional domain analysis of interferon consensus sequence binding proteín (ICSBP) and its association with interferon regulátory factors, J. Biol. Chem. 270:13063-13069 (1995)
Smith, G.E., Production of Human Beta Interferon in Insect Celíš Infected with a Baculovirus Expression Vector Molecular and Cellular Biology 3:2156-2165 (1983)
-98 Szilagyi a ďalší, Biochem. Biophys. Acta 1251:1 (1995)
Tan a ďalší, The linkage of genes for the human interferon induced antiviral proteín and indophenol oxidase-B traits to chromosome G-21, J. Exp. Med. 137:317-330 (1973)
Terlizzese, M., In vitro comparison of inhibiting ability of soluble TNF receptor p75 (TBPII) vs. Soluble TNF Receptor p55 (TBPI) against TNF-α and TNF-β, Journal of Interferon and Cytokine Research 16:1047-1053 (1996)
Urlaub a ďalší, Prac. Natl. Acad. Sci USA 77:4216-4220 (1980)
Utsumi, J., Characterization of E.coli-derived Recombinant Human Interferon-beta as Compared with Fibroblast Human Interferon-beta, Journal of Biochemistrv 101:1199-1208 (1987)
Uze a ďalší, Genetic transfer of a functional human interferon alpha receptor into mouse celíš: cloning and expression of its cDNA, Celí 60:225-234 (1990) Weissmann a ďalší, The interferon genes, Proc. Nucleic Acid Res 33:251-302; 1986
Yan a ďalší, Molecular characterization of an alpha interferon receptor 1 subunit (IFNaRI) domain reauired for TYK2 binding and signál transduction, Mol. Celí. Bio. 16:2074-2082 (1996)
Yang a ďalší, Direct association of STAT3 with the IFNAR-1 chain of the human Type I interferon receptor, J. Biol Chem. 271:8057-8061 (1996)
-fyZoznam sekvencií <110> Tepper Mark Cunningham Mark Sherris Dávid El Tayar Nabil McKenna Sean <120> IFNAR2/IFN komplex <130> TEPPERIA.SEQ <140 ešte neboli obdržané <141> 1998-12-18 <150 60/068,295 <151> 1997-12-19 <160> 14 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> neznámy <220>
<223> Opis neznámeho organizmu: Peptid <400> 1
Gly Gly Gly Gly Ser
5 <210>2 <211>4 <212> PRT <213> neznámy <220>
<223> Opis neznámeho organizmu: peptid <400> 2
-50íle Glu Glu Arg <210 3 <211 >33 <212> PRT <213> neznámy <220>
<223> Opis neznámeho organizmu: peptid <400>3
Glu Ser Glu Phe Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ser
25 30
Tyr <210>4 <211 >28 <212> PRT <213> neznámy <220 <223> Opis neznámeho organizmu: peptid <400 4
Glu Ser Glu Phe Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ser Tyr
25 <210>5 <211 >23 <212> PRT <213> neznámy
-54<220>
<223> Opis neznámeho organizmu: peptid <400>5
Glu Ser Glu Phe Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
10 15
Gly Gly Gly Ser Met Ser Tyr <210>6 <211> 18 <212> PRT <213> neznámy <220>
<223> Opis neznámeho organizmu: peptid <400>6
Gly Glu Ser Glu Phe Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Met
5 10 15
Ser Tyr <210>7 <211> 13 <212> PRT <213> neznámy <220>
<223> Opis neznámeho organizmu: peptid <400>7
Glu Ser Glu Phe Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ser Tyr
10 <210> 8 <211 >36 <212> PRT
-52<213> neznámy <220>
<223> Opis neznámeho organizmu: peptid <400> 8
| Glu | Ser | Glu | Phe | Ser | Ser | Ser | Ser | Ser Lys | Ala | Pro | Pro | Pro | Ser | Leu |
| 1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||
| Pro | Ser | Pro | Ser | Arg | Leu | Pro | Gly | Pro Ser | Asp | Thr | Pro | íle | Leu | Pro |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| Gin | Met | Ser | Tyr |
<210 9 <211> 23 <212> PRT <213> neznámy <220 <223> Opis neznámeho organizmu: peptid <400 9
Glu Ser Glu Phe Ser Glu Phe Met Glu Phe Met Glu Phe Met Glu Phe
10 15
Met Glu Phe Met Met Ser Tyr <210> 10 <211 >20 <212> PRT <213> neznámy <220 <223> Opis neznámeho organizmu: peptid <400> 10
Glu Phe Glu Ser Glu Phe Ser Glu Phe Met Glu Phe Met Glu Phe
5
Met Met Ser Tyr
-53<210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> neznámy <220>
<223> Opis neznámeho organizmu: peptid <400> 11
Glu Ser Glu Phe Ser Glu Phe Met Glu Phe Met Glu Phe Met Met Ser
10 15
Tyr <210> 12 <211> 21 <212> PRT <213> neznámy <220>
<223> Opis neznámeho organizmu: peptid <400> 12
Glu Ser Glu Phe Ser Glu Phe Gly Ala Gly Leu Val Leu Gly Gly Gin
5 10 15
Phe Met Met Ser Tyr <210> 13 <211 >34 <212> PRT <213> neznámy <220>
<223> Opis neznámeho organizmu: peptid <400> 13
-tfl-
| Glu | Ser | Glu | Phe | Ser Glu Phe Gly Ala Gly | Leu | Val | Leu | Gly | Gly | Gin | |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||
| Phe | Met | Glu | Phe | Gly Ala Gly Leu Val | Leu | Gly | Gly | Gin | Phe | Met | Met |
| 20 | 25 | 30 |
Ser Tyr <210> 14 <211 >400 <212> PRT <213> neznámy <220>
<223> Opis neznámeho organizmu: peptid <400> 14
| Met | Leu | Leu | Ser | Gin | Asn | Ala | Phe | íle | Val | Arg | Ser | Leu | Asn | Leu | Val |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Leu | Met | Val | Tyr | íle | Ser | Leu | Val | Phe | Gly | íle | Ser | Tyr | Asp | Ser | Pro |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Asp | Tyr | Thr | Asp | Glu | Ser | Cys | Thr | Phe | Lys | íle | Ser | Leu | Arg | Asn | Phe |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Arg | Ser | íle | Leu | Ser | Trp | Glu | Leu | Lys | Asn | His | Ser | íle | Val | Pro | Thr |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| His | Tyr | Thr | Leu | Leu | Tyr | Thr | íle | Met | Ser | Lys | Pro | Glu | Asp | Leu | Lys |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Val | Val | Lys | Asn | Cys | Ala | Asn | Thr | Thr | Arg | Ser | Phe | Cys | Asp | Leu | Thr |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Asp | Glu | Trp | Arg | Ser | Thr | His | Glu | Ala | Tyr | Val | Thr | Val | Leu | Glu | Gly |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Phe | Ser | Gly | Asn | Thr | Thr | Leu | Phe | Ser | Cys | Ser | His | Asn | Phe | Trp | Leu |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Ala | íle | Asp | Met | Ser | Phe | Glu | Pro | Pro | Glu | Phe | Glu | íle | Val | Gly | Phe |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Thr | Asn | His | íle | Asn | Val | Met | Val | Lys | Phe | Pro | Ser | íle | Val | Glu | Glu |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Glu | Leu | Gin | Phe | Asp | Leu | Ser | Leu | Val | íle | Glu | Glu | Gin | Ser | Glu | Gly |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| íle | Val | Lys | Lys | His | Lys | Pro | Glu | íle | Lys | Gly | Asn | Met | Ser | Gly | Asn |
-7551Θ0 185 190
| Phe Thr Tyr 195 | íle | íle Asp Lys | Leu íle Pro Asn Thr Asn | Tyr Cys | Val | ||||||||||
| 200 | 205 | ||||||||||||||
| Ser | Val | Tyr | Leu | Glu | His | Ser | Asp | Glu | Gin | Ala | Val | íle | Lys | Ser | Pro |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| Leu | Lys | Cys | Thr | Leu | Leu | Pro | Pro | Gly | Gin | Glu | Ser | Glu | Phe | Ser | Gly |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Gly | Gly | Gly | Ser | Gly | Gly | Gly | Gly | Ser | Met | Ser | Tyr | Asn | Leu | Leu | Gly |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| Phe | Leu | Gin | Arg | Ser | Ser | Asn | Phe | Gin | Cys | Gin | Lys | Leu | Leu | Trp | Gin |
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| Leu | Asn | Gly | Arg | Leu | Glu | Tyr | Cys | Leu | Lys | Asp | Arg | Met | Asn | Phe | Asp |
| 275 | 280 | 285 | |||||||||||||
| íle | Pro | Glu | Glu | íle | Lys | Gin | Leu | Gin | Gin | Phe | Gin | Lys | Glu | Asp | Ala |
| 290 | 295 | 300 | |||||||||||||
| Ala | Leu | Thr | íle | Tyr | Glu | Met | Leu | Gin | Asn | íle | Phe | Ala | íle | Phe | Arg |
| 305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
| Gin | Asp | Ser | Ser | Ser | Thr | Gly | Trp | Asn | Glu | Thr | íle | Val | Glu | Asn | Leu |
| 325 | 330 | 335 | |||||||||||||
| Leu | Ala | Asn | Val | Tyr | His | Gin | íle | Asn | His | Leu | Lys | Thr | Val | Leu | Glu |
| 340 | 345 | 350 | |||||||||||||
| Glu | Lys | Leu | Glu | Lys | Glu | Asp | Phe | Thr | Arg | Gly | Lys | Leu | Met | Ser | Ser |
| 355 | 360 | 365 | |||||||||||||
| Leu | His | Leu | Lys | Arg | Tyr | Tyr | Gly | Arg | íle | Leu | His | Tyr | Leu | Lys | Ala |
| 370 | 375 | 380 | |||||||||||||
| Lys | Glu | Tyr | Ser | His | Cys | Ala | Trp | Thr | íle | Val | Arg | Val | Glu | íle | Leu |
| 385 | 390 | 395 | 400 |
921-2001)
Claims (24)
1. Použitie ľudského interferónového α/β receptora - IFNAR na výrobu liečiva na zvýšenie biologických účinkov interferónu typu I - IFN, pričom IFNAR má sekvenciu, ktorá pozostáva v podstate zo sekvencie:
a) prirodzeného ľudského IFNAR polypeptidového reťazca;
b) fragmentu a), ktorý má IFNAR biologický účinok;
c) variantu a) alebo b), ktorý má najmenej 70% sekvenčnú zhodnosť s a) alebo b), a ktorý má IFNAR biologický účinok;
d) variantu a) alebo b), ktorý je kódovaný DNA sekvenciou, ktorá hybridizuje s komplementom prirodzenej DNA kódujúcej a) alebo b) v stredne prísnych podmienkach, a ktorý má IFNAR biologický účinok; alebo
e) soľ alebo funkčný derivát a), b), c) alebo d), ktoré majú IFNAR biologický účinok.
2. Použitie komplexu interferónu typu I - IFN a podjednotky ľudského interferónového α/β receptora IFNAR, ktorá je schopná viazať sa na IFN typu I v komplexe, na výrobu liečiva na predĺženie in vivo účinku IFN typu I, pričom IFN typu I má sekvenciu, ktorá pozostáva v podstate zo sekvencie:
a) prirodzeného IFN typu I;
b) fragmentu a), ktorý má biologický účinok IFN typu I;
c) variantu a) alebo b), ktorý má najmenej 70% sekvenčnú zhodnosť s a) alebo b), a ktorý má biologický účinok IFN typu I;
d) variantu a) alebo b), ktorý je kódovaný DNA sekvenciou hybridizujúcou s komplementom prirodzenej DNA sekvencie, ktorá kóduje a) alebo b) v stredne prísnych podmienkach, a ktorý má biologický účinok IFN typu I; alebo
e) soľ alebo funkčný derivát a), b), c) alebo d), ktoré majú biologický účinok IFN typu I; a kde IFNAR má sekvenciu, ktorá v podstate pozostáva zo sekvencie:
f) prirodzeného ľudského IFNAR polypeptidového reťazca;
g) fragmentu f), ktorý má IFNAR biologický účinok;
h) variantu f) alebo g), ktorý má najmenej 70% sekvenčnú zhodnosť s f) alebo g), a ktorý má IFNAR biologický účinok;
i) variantu f) alebo g), ktorý je kódovaný DNA sekvenciou, ktorá hybridizuje s komplementom prirodzenej DNA sekvencie kódujúcej f) alebo g) v stredne prísnych podmienkach, a ktorý má IFNAR biologický účinok; alebo
j) soľ alebo funkčný derivát f), g), h) alebo i), ktoré majú IFNAR biologický účinok.
3. Použitie podľa nároku 2, kde komplex zahŕňa nekovalentný komplex IFN typu I a IFNAR.
4. Použitie podľa nároku 3, kde IFN typu I a IFNAR sú podávané oddelene a komplex sa vytvára in vivo.
5. Použite podľa nároku 2, kde komplex zahŕňa komplex, v ktorom je IFN typu I naviazaný na IFNAR kovalentnou väzbou.
6. Použitie podľa nároku 2, kde komplex zahŕňa fúzovaný proteín, v ktorom je IFN typu I viazaný na IFNAR peptidovou väzbou.
7. Použitie podľa nároku 6, kde IFN typu I je spojený s IFNAR prostredníctvom peptidového spojovníka.
8. Použitie podľa nároku 2, kde IFN typu I je IFNa, IFNp alebo IFNo.
9. Použitie podľa nároku 8, kde IFN typu I je IFNp
10. Použitie podľa nároku 2, kde IFNAR je beta podjednotou ľudského interferónového α/β receptora - IFNAR2.
11. Molekula, ktorá zahŕňa komplex interferónu typu I - IFN a podjednotku ľudského interferónového α/β receptora - IFNAR, ktorá je schopná viazať sa na IFN typu I v komplexe, v ktorej je IFN typu I naviazaný na IFNAR kovalentnou väzbou alebo peptidovou väzbou, pričom IFN typu I má sekvenciu, ktorá pozostáva v podstate so sekvencie a) prirodzeného IFN typu I;
b) fragmentu z a), ktorý má biologický účinok IFN typu I;
c) variantu a) alebo b), ktorý je najmenej na 70 % sekvenčne zhodný s a) alebo b), a ktorý má biologický účinok IFN typu I;
d) variantu a) alebo b), ktorý je kódovaný DNA sekvenciu, ktorá hybridizuje s komplementom prirodzenej DNA sekvencie kódujúcej a) alebo b) v stredne prísnych podmienkach, a ktorý má biologický účinok IFN typu I; alebo
e) soľ alebo funkčný derivát a), b), c) alebo d), ktoré majú biologický účinok IFN typu I, pričom IFNAR má sekvenciu, ktorá pozostáva v podstate so sekvencie
f) prirodzeného ľudského IFNAR polypeptidového reťazca;
g) fragmentu z f), ktorý má IFNAR biologický účinok;
h) variantu f) alebo g), ktorý je najmenej na 70 % sekvenčne zhodný s f) alebo g), a ktorý má IFNAR biologický účinok;
i) variantu f) alebo g), ktorý je kódovaný DNA sekvenciou, ktorá hybridizuje s komplementom prirodzenej DNA sekvencie kódujúcej f) alebo g), v stredne prísnych podmienkach, a ktorý má IFNAR biologický účinok; alebo
j) soľ alebo funkčný derivát f), g), h) alebo i), ktoré majú IFNAR biologický účinok.
12. Molekula podľa nároku 11, v ktorej je IFN typu I naviazaný na IFNAR kovalentnou väzbou.
13. Molekula podľa nároku 11, v ktorej je IFN typu I naviazaný na IFNAR peptidovou väzbou.
-5Ί -
14. Molekula podľa nároku 11, v ktorej je IFN typu I spojený s IFNAR prostredníctvom peptidového spojovníka.
15. Molekula podľa nároku 14, v ktorej je peptidovým spojovníkom (GGGGS)n, kde n=1 až 5.
16. Molekula podľa nároku 11, v ktorej je IFN typu I IFNa, IFNp alebo IFNo.
17. Molekula podľa nároku 11, v ktorej je IFN typu I IFNp.
18. Molekula podľa nároku 11, v ktorej je IFNAR beta podjednotou ľudského interferónového α/β receptora - IFNAR2.
19. DNA kódujúca fúzovaný proteín, ktorý je molekulou podľa nároku 13.
20. Hostiteľská bunka transformovaná vektorom nesúcim DNA podľa nároku 19, spôsobom, ktorý umožňuje expresiu fúzovaného proteínu.
21. Spôsob výroby fúzovaného proteínu, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa kultiváciu hostiteľskej bunky podľa nároku 20 a izolovanie fúzovaného proteínu, ktorý táto exprimuje.
22. Spôsob zlepšenia skladovateľnosti interferónu typu I, vyznačujúci sa tým , že zahŕňa skladovanie interferónu vo forme komplexu podľa nároku 11 alebo vo forme komplexu, v ktorom je IFN naviazaný na IFNAR nekovalentnou väzbou.
23. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje farmaceutický prijateľný nosič a komplex interferónu typu I - IFN a podjednotku ľudského interferónového α/β receptora - IFNAR, ktorá je schopná viazať sa na IFN typu I v komplexe, pričom IFN typu I má sekvenciu, ktorá pozostáva v podstate so sekvencie
- íot -
a) prirodzeného IFN typu I;
b) fragmentu z a), ktorý má biologický účinok IFN typu I;
c) variantu a) alebo b), ktorý je najmenej na 70 % sekvenčne zhodný s a) alebo b), a ktorý má biologický účinok IFN typu I;
d) variantu a) alebo b), ktorý je kódovaný DNA sekvenciu, ktorá hybridizuje s komplementom prirodzenej DNA sekvencie kódujúcej a) alebo b) v stredne prísnych podmienkach, a ktorý má biologický účinok IFN typu I; alebo
e) soľ alebo funkčný derivát a), b), c) alebo d), ktoré majú biologický účinok IFN typu I, pričom IFNAR má sekvenciu, ktorá pozostáva v podstate so sekvencie
f) prirodzeného ľudského IFNAR polypeptidového reťazca;
g) fragmentu z f), ktorý má IFNAR biologický účinok;
h) variantu f) alebo g), ktorý je najmenej na 70 % sekvenčne zhodný s f) alebo g), a ktorý má IFNAR biologický účinok;
i) variantu f) alebo g), ktorý je kódovaný DNA sekvenciou, ktorá hybridizuje s komplementom prirodzenej DNA sekvencie kódujúcej f) alebo g) v stredne prísnych podmienkach, a ktorý má IFNAR biologický účinok; alebo
j) soľ alebo funkčný derivát f), g), h) alebo i), ktoré majú IFNAR biologický účinok.
24. Molekula podľa nároku 11 na použitie ako liečivo.
f 1/ 722-2ÍW
1 / 13
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US6829597P | 1997-12-19 | 1997-12-19 | |
| PCT/US1998/026926 WO1999032141A1 (en) | 1997-12-19 | 1998-12-18 | Ifnar2/ifn complex |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK9222000A3 true SK9222000A3 (en) | 2001-01-18 |
Family
ID=22081665
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK922-2000A SK9222000A3 (en) | 1997-12-19 | 1998-12-18 | The use of type i - ifn interferon complex and a subunit of human interferon alpha/beta ifnar receptor for the prolongation of in vivo effect of type i ifn, a molecule comprising such a complex, dna encoding fused protein, host cell and pharmaceutical composition comprising such complex |
Country Status (28)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6372207B1 (sk) |
| EP (1) | EP1037658B1 (sk) |
| JP (1) | JP4601163B2 (sk) |
| KR (1) | KR100593981B1 (sk) |
| CN (1) | CN1241638C (sk) |
| AR (1) | AR020315A1 (sk) |
| AT (1) | ATE218362T1 (sk) |
| AU (1) | AU755078B2 (sk) |
| BG (1) | BG64920B1 (sk) |
| BR (1) | BR9813753A (sk) |
| CA (1) | CA2311648C (sk) |
| DE (1) | DE69805844T2 (sk) |
| DK (1) | DK1037658T3 (sk) |
| EA (1) | EA003635B1 (sk) |
| EE (1) | EE200000355A (sk) |
| ES (1) | ES2174530T3 (sk) |
| HK (1) | HK1032914A1 (sk) |
| HU (1) | HUP0100456A3 (sk) |
| IL (2) | IL136855A0 (sk) |
| NO (1) | NO20002691L (sk) |
| NZ (1) | NZ504771A (sk) |
| PL (1) | PL197568B1 (sk) |
| PT (1) | PT1037658E (sk) |
| SK (1) | SK9222000A3 (sk) |
| TR (1) | TR200001961T2 (sk) |
| UA (1) | UA74132C2 (sk) |
| WO (1) | WO1999032141A1 (sk) |
| ZA (1) | ZA9811634B (sk) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL122818A0 (en) * | 1997-07-10 | 1998-08-16 | Yeda Res & Dev | Chimeric interleukin-6 soluble receptor/ligand protein analogs thereof and uses thereof |
| AUPP670698A0 (en) * | 1998-10-23 | 1998-11-19 | Monash University | A method of regulation |
| US7138379B2 (en) | 2000-07-26 | 2006-11-21 | Schering Aktiengesellschaft | Use of the interferon receptor 2c polypeptide chain to enhance the anti-growth effects of type I interferons |
| IL147414A0 (en) * | 2001-12-31 | 2002-08-14 | Yeda Res & Dev | Ifnar2 mutants, their production and use |
| US20040175359A1 (en) * | 2002-11-12 | 2004-09-09 | Desjarlais John Rudolph | Novel proteins with antiviral, antineoplastic, and/or immunomodulatory activity |
| JP4850514B2 (ja) * | 2003-08-25 | 2012-01-11 | 東レ株式会社 | インターフェロンβ複合体 |
| CN100400664C (zh) * | 2005-09-06 | 2008-07-09 | 中国人民解放军第四军医大学 | 肿瘤血管导向肽与人干扰素α-2b的融合蛋白的制备方法 |
| CA2667637C (en) * | 2006-10-31 | 2021-04-20 | East Carolina University | Fusion proteins comprising an anti-inflammatory cytokine and an antigen for treatment of immune disorders |
| GB0715383D0 (en) * | 2007-08-08 | 2007-09-19 | Asterion Ltd | Interferon |
| GB0815216D0 (en) * | 2008-08-21 | 2008-09-24 | Asterion Ltd | Interleukin |
| WO2010117848A1 (en) | 2009-03-31 | 2010-10-14 | East Carolina University | Cytokines and neuroantigens for treatment of immune disorders |
| KR101293363B1 (ko) * | 2011-02-28 | 2013-08-05 | 성균관대학교산학협력단 | 인터페론 수용체 유전자를 포함하는 조류독감 예방용 조성물 |
| EA038502B1 (ru) * | 2013-03-15 | 2021-09-07 | Янссен Байотек, Инк. | Антитела-антагонисты к интерферону альфа и интерферону омега |
| LT6164B (lt) | 2013-10-15 | 2015-06-25 | Uab Biotechnologinės Farmacijos Centras "Biotechpharma" | Sulieti interferono-alfa 5 baltymai su kitu citokinu ir jų gamybos būdas |
| WO2018236701A1 (en) * | 2017-06-20 | 2018-12-27 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | INTERFERON PRODRUCE FOR THE TREATMENT OF CANCER |
| EP3672986A1 (en) | 2017-08-22 | 2020-07-01 | Sanabio, LLC | Soluble interferon receptors and uses thereof |
| CN112646783B (zh) * | 2020-12-30 | 2023-12-01 | 广州医科大学附属市八医院 | 表达基因、经基因修饰的受精卵的构建方法和小鼠模型的构建方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5821078A (en) * | 1992-09-03 | 1998-10-13 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Nucleic acid encoding interferon-α/β binding protein |
| IL106591A (en) | 1992-09-03 | 2008-03-20 | Yeda Res & Dev | Interferon alpha/beta binding protein, its preparation and pharmaceutical compositions containing it |
| IL107378A (en) * | 1993-10-24 | 2005-05-17 | Yeda Res & Dev | SOLUBLE INTERFERON alpha-RECEPTOR, ITS PREPARATION AND USE |
-
1998
- 1998-12-18 JP JP2000525131A patent/JP4601163B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-12-18 WO PCT/US1998/026926 patent/WO1999032141A1/en active IP Right Grant
- 1998-12-18 US US09/215,212 patent/US6372207B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-18 ES ES98964071T patent/ES2174530T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-18 AR ARP980106515A patent/AR020315A1/es active IP Right Grant
- 1998-12-18 KR KR1020007006160A patent/KR100593981B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-12-18 PT PT98964071T patent/PT1037658E/pt unknown
- 1998-12-18 ZA ZA9811634A patent/ZA9811634B/xx unknown
- 1998-12-18 BR BR9813753-0A patent/BR9813753A/pt not_active Application Discontinuation
- 1998-12-18 HU HU0100456A patent/HUP0100456A3/hu unknown
- 1998-12-18 NZ NZ504771A patent/NZ504771A/xx unknown
- 1998-12-18 CN CNB988123924A patent/CN1241638C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-12-18 SK SK922-2000A patent/SK9222000A3/sk unknown
- 1998-12-18 IL IL13685598A patent/IL136855A0/xx active IP Right Grant
- 1998-12-18 DE DE69805844T patent/DE69805844T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-18 AU AU19269/99A patent/AU755078B2/en not_active Ceased
- 1998-12-18 EE EEP200000355A patent/EE200000355A/xx unknown
- 1998-12-18 TR TR2000/01961T patent/TR200001961T2/xx unknown
- 1998-12-18 EP EP98964071A patent/EP1037658B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-18 CA CA2311648A patent/CA2311648C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-12-18 AT AT98964071T patent/ATE218362T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-12-18 PL PL341423A patent/PL197568B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1998-12-18 UA UA2000074350A patent/UA74132C2/uk unknown
- 1998-12-18 DK DK98964071T patent/DK1037658T3/da active
- 1998-12-18 EA EA200000685A patent/EA003635B1/ru not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-05-25 NO NO20002691A patent/NO20002691L/no not_active Application Discontinuation
- 2000-06-15 BG BG104539A patent/BG64920B1/bg unknown
- 2000-06-18 IL IL136855A patent/IL136855A/en not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-05-23 HK HK01103574A patent/HK1032914A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1037658B1 (en) | Ifnar/ifn complex | |
| Grace et al. | Structural and biologic characterization of pegylated recombinant IFN-α 2b | |
| US20110189131A1 (en) | Active variants of the il-18 binding protein and medical uses thereof | |
| US20100239530A1 (en) | Ifnar2 mutants, their production and use | |
| Antonelli | Biological basis for a proper clinical application of alpha interferons. | |
| US7695710B2 (en) | Antitumor and antiviral combination therapies using low-toxicity, long-circulating human interferon-alpha analogs | |
| US7662370B2 (en) | Low-toxicity, long-circulating human interferon-alpha PEGylated mutants | |
| MXPA00005886A (en) | Ifnar2/ifn complex | |
| US7235232B2 (en) | Interferon alpha hybrids | |
| CZ20002287A3 (cs) | Komplex IFNAR2/IFN | |
| AU2002366976B2 (en) | IFNAR2 mutants, their production and use | |
| AU2007202312A1 (en) | IFNAR2 mutants, their production and use |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FB9A | Suspension of patent application procedure |