JP4601163B2 - Ifnar2/ifn複合体 - Google Patents
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Description
発明の分野
本発明はヒトインターフェロンα/βレセプター(IFNAR2)細胞外ドメインのポリペプチド配列、及びI型インターフェロン(IFNα、IFNβ及びIFNω)より構成されるI型インターフェロン複合体に関する。これら複合体はインビボに於ける遊離型IFNの抗ウイルス、抗ガン及び免疫変調活性に関する安定性を改善し、作用を増強し、そして薬物動態を延長する。より特定すれば、複合体はI型インターフェロン(IFNα、IFNβ及びIFNω)又は生物学的に活性であるその亜分画と複合している、IFNARの全細胞外ドメイン又はそのインターフェロン結合亜分画のポリペプチド配列を含む、融合蛋白質、または共有結合複合体、または非共有結合複合体である。
発明の背景
インターフェロンは白血球及び繊維芽細胞由来のI型インターフェロン、又は突然変異誘発剤誘導型あるいは”免疫”型のII型インターフェロンのいずれかに分類される(Pestkaら、1987)。配列の同一性及び共通生物活性の分析より、I型インターフェロンはインターフェロンアルファ(IFNα)、インターフェロンベータ(IFNβ)及びインターフェロンオメガ(IFNω)を、一方II型インターフェロンはインターフェロンγ(IFNγ)を含む。IFNα、IFNβ及びIFNω遺伝子は第9染色体短腕上にクラスターを形成している(Lengyl、1982)。少なくとも25個の非対立性のIFNα遺伝子と6個の非対立性IFNω遺伝子、そして1個のIFNβ遺伝子が存在する。いずれもが単一の共通先祖遺伝子より進化したものと信じられている。種内ではIFNα遺伝子はそれぞれの間で少なくとも80%の配列同一性を持っている。IFNβ遺伝子はIFNαとおよそ50%の配列同一性を持ち;又IFNω遺伝子はIFNαと70%の相同性を持っている(Weissmanら、1986;Dronら1992)。IFNαは分子量域17−23kDa(165−166アミノ酸)で、IFNβは〜23kDa(166アミノ酸)であり、又IFNωは〜24kDa(172アミノ酸)である。
【0002】
I型インターフェロンはウイルスや寄生性の感染に対する宿主防御活性、抗ガンサイトカインとしての活性、及び免疫変調としての活性を持つ多面発現性のサイトカインである(Baronら、1994;Baronら、1991)。I型インターフェロンの生理反応には、正常及び形質転換細胞に対する抗増殖活性;リンパ細胞、ナチュラルキラー細胞及び貪色細胞中の細胞毒性活性の促進;細胞分化の変調;クラスIMHC抗原の発現促進;クラスIIMHCの阻害;及び各種細胞表面レセプターの変調が含まれる。正常生理条件下では、IFNα及びIFNβ(IFNα/β)は、その発現を感染体(ウイルス、細菌、マイコプラズマ及び原虫)、dsDNA及びサイトカイン(M−CSF、IL−1α、IL−2、TNFα)を含む各種インデューサーの添加によりアップレギュレートを受けるながら大部分の細胞から低レベルで持続性に分泌されている。I型インターフェロンのインビボでの作用は、代理マーカーであるネオプテリン、2’,5’オリゴアデニレート合成酵素、及びβ2ミクログロブリンを用いモニターできる(Alamら、1997;Fierlbeckら、1996;Salmonら、1996)。
【0003】
I型インターフェロン(IFNα/β/ω)は、細胞表面レセプター複合体を介して作用し、抗ウイルス、抗ガン、及び免疫変調といった特異的な生物効果を誘導する。I型IFNレセプター(IFNAR)は少なくとも2種類のポリペプチド鎖より構成されるヘテロ多量体レセプター複合体である(Colamoniciら、1992;Colamoniciら、1993;P;ataniasら、1993)。これら鎖に関する遺伝子は第21染色体上に発見されており、又その蛋白質は多くの細胞上に表現される(Tanら、1973)。レセプター鎖は一般に、モノクローナル抗体IFNαR3及びIFNaRβ1でそれぞれ認識されることからアルファ及びベータと命名される。ごく最近、これらアルファサブユニットはIFNAR1と、ベータサブユニットはIFNAR2と命名し直された。大部分の細胞では、IFNAR1(アルファ鎖、Uzeサブユニット)(Uzeら、1990)は分子量100−130kDaであり、一方IFNAR2(ベータ鎖、BL、IFNα/βR)は分子量100kDaである。特定のタイプの細胞(単球細胞株及び正常骨髄細胞)では、IFNAR2サブユニット(βS)は分子量51kDaの末端切断されたレセプターとして発現される、変形レセプター複合体が同定されている。IFNAR1及びIFNAR2βS及びβLサブユニットはクローン化されている(Novickら、1994;Domaskiら、1995)。IFNAR2βS及びβLサブユニットは同一の細胞外及び膜貫通ドメインを持つが、しかし、細胞質ドメインは最初の15アミノ酸のみ同一であるに過ぎない。IFNAR2サブユニットは単独でIFNα/βに結合できるが、一方IFNAR1サブユニットはIFNα/βに結合できない。ヒトIFNAR1レセプターサブユニットだけをマウスL−929繊維芽細胞内にトランスフェクトすると、IFNα8/IFNαBを除きヒトIFNαsは細胞に結合できなかった(Uzeら、1990)。ヒトIFNAR1サブユニットが無い状態でL細胞にトランスフェクトされたヒトIFNAR2サブユニットは、結合Kdおよそ0.45nMでヒトIFNα2に結合する。ヒトIFNAR2サブユニットをヒトIFNAR1サブユニット存在状態でトランスフェクトすると、Kd0.026−0.114nMの高い親和結合が観察された(Novickら、1994;Domanskiら、1995)。多くの細胞では500−20,000の高親和性IFN結合部位及び2,000−100,000の低親和性IFN結合部位が存在すると考えられる。IFNAR1/2複合体(α/βSまたはα/βL)サブユニットはIFNαと高い親和性で結合するが、α/βLペアのみが機能的なシグナルレセプターであるらしい。
【0004】
マウスL−929細胞へのIFNAR1及びIFNAR2βLサブユニットのトランスフェクション、続くIFNα2とのインキュベーションは、抗ウイルス状態を誘導し、細胞内の蛋白質のリン酸化を開始し、続いて細胞内キナーゼ(いJak1及びTyk2)及び転写因子(STAT1、2、及び3)の活性化を引き起こす(Novickら、1994;Domanskiら、1995)。対応する実験において、IFNAR2βSサブユニットのトランスフェクションは同様の反応を開始できなかった。即ち、機能活性(抗ウイルス反応)にはIFNAR2βLサブユニットが必要とされ、IFNAR1サブユニットとの結合において最大の誘導を伴う。
【0005】
膜結合型細胞表面IFNARに加え、可溶性IFNARがヒト尿及び血清中に見つかっている(Novickら、1994;Novickら、1995;Novickら、1992;Lutfallaら、1995)。血清より単離された可溶性IFNARはSDS−PAGE上では55kDaの見かけ上の分子量を有するが、尿に由来する可溶性IFNARは40−45kDaの見かけ上の分子量を有する(p40)。可溶性p40 IFNAR2に関する転写体はmRNAレベルで存在しており、又カルボキシル末端に2個の新規アミノ酸を持つIFNAR2サブユニットの全細胞外ドメインの大部分を含む。可溶性IFNAR2レセプター上には5ヶ所のグリコシル化可能部位がある。可溶性p40 IFNAR2はIFNα2及びIFNβと結合し、インビトロにてIFNα種混合体(”白血球IFN”)及び個々のI型IFNの抗ウイルス活性を阻害することが示されている(Novickら、1995)。組換え体IFNAR2サブユニットIg融合蛋白質は、Daui細胞及びα/βSサブユニットを二重トランスフェクトしたCOS細胞への各種I型IFN種(IFNα、IFNαβ、IFNαD、IFNβ、IFNα Conl及びIFNω)の結合を阻害することが示された。
【0006】
I型IFNのシグナル伝達経路が最近特定された(Plataniasら、1996;Yanら、1996;Qureshiら、1996;Duncanら、1996;Sharfら、1995;Yangら、1996)。シグナル伝達に至る最初の事象は、IFNα/β/ωのIFNAR2サブユニットへの結合と、それに続くIFNAR1サブユニット結合によるIFNAR1/2複合体の形成により起こると考えられる(Plataniasら1994)。IFNα/β/ωのIFNAR1/2複合体への結合により、IFNAR1及びIFNAR2サブユニット上のリン酸化特異的チロシンと信じられている2種類のヤヌスキナーゼ(Jak1及びTyk2)の活性化が起こる。これらサブユニットがリン酸化されると、STAT分子(STAT1、2及び3)がリン酸化され、その結果STAT転写複合体の2量体化が起こり、続いて転写複合体の核への移動と特異的IFN誘導遺伝子の活性化が起こる。
【0007】
I型IFNの薬物動態又は薬力学作用は、ヒトにて検証されている(Alanら、1997;Fierlbeckら、1996;Salmonら、1996)。TFNβの排泄は極めて迅速であり、IFNβの生物有効性はほとんどのサイトカインに期待されるものより低い。IFNβの薬力学作用はヒトで検証されているが、IFNβの生物有効性と臨床上の有用性との間の相関は確立されていない。正常健康人ボランティアでは、組換え体CHO由来IFNβの単数回静脈(iv)大量投与(6MIU)は、5分間の迅速な分布期と〜5時間の最終半減期をもたらした(Alamら、1997)。IFNβの皮下(sc)または筋肉内(im)投与後、血清レベルは全身投与量のほんの〜15%で一定になる。iv、im又はsc投与後のIFNβの薬物動態(PBMCs中の2’5’−オリゴアデニレート合成酵素(3’,5’−AS)活性の変化として測定した)は最初の24時間上昇し、その後4日間にわたりゆっくりとベースラインまで減少した。生物学的作用の強さと長さは、投与経路に関係なく同じであった。
【0008】
2社(REBIF−SeronoとAVONEX−Biogen)が製造したIFNβの薬物動態(PK)と薬力学作用(PD)について、6MIUの単一投薬量の組換え体IFNβをim注射し検討されている(Salmon,1996)。IFNβ及びIFNβ代理マーカーであるネオプテリンの血清濃度が時間を追ってモニターされた。いずれのIFNβ薬も同様のPKプロフィールを示し、〜12〜15時間で血清IFNβ値は最高に達したが、REBIFの方が低い最大値を示した。REBIF及びAVONEXは共にim注射後36時間までこの高いIFNβ値を保ち、48時間のうちにベースラインより若干高い値まで低下した。ネオプテリンレベルはREBIFとAVONEX間で極めてよく似たプロフィールを示し、注射後〜44−50時間で最高ネオプテリンレベルに達し、注射後72時間まで上昇したままであり、144のうちに漸次ベースラインまで減少した。
【0009】
IFNβを多数回投与した場合の薬力作用研究は、ヒトメラノーマ患者を対象に、6ヶ月間にわたり、週3回、IFNβをsc経路で3MIU/投与して実施されている(Fierlbeckら、1996)。薬力作用マーカーである2’,5’−合成酵素、β2−ミクログロブリン、ネオプテリン及びNK細胞活性化は、2回目の注射後(4日目)にピークに達し、28日目までに低下し、6ヶ月めまで殆ど評価できないレベルに維持された。
【0010】
要約すると、ヒトに於けるI型インターフェロンの排泄は迅速である。長期作用型インターフェロン剤は臨床上の利点を改善すると思われる。
発明の要約
今回、可溶性IFNARとI型インターフェロン(IFN)が結合したI型インターフェロン複合体は抗ウイルス、抗ガン及び免疫変調活性に関し、遊離型IFNに比べて優れた安定性と増強された効果、及び長いインビボでの薬物動態を持つことが判明した。
【0011】
即ち本発明は、抗ウイルス、抗ガン及び免疫変調活性に関し、遊離型IFNに比べて優れた安定性と増強された効果、及びインビボに於ける長い薬物動態を持ち、ヒト型インターフェロンα/βレセプター(IFNAR)サブユニット細胞外ドメインのポリペプチド配列とI型インターフェロンを含むI型インターフェロン(IFN)複合体を提供する。好ましくは、該複合体はIFNAR2サブユニット細胞外ドメインといずれかのI型インターフェロンの複合体、又はIFNAR1サブユニットとIFNαの複合体である。
【0012】
より特定すれば、該複合体はIFNα又はIFNβ又はIFNω、又はそれらの生物学的に活性であるいずれかの亜分画と結合し、かつIFNAR、特にIFNAR2の全細胞外ドメイン又はそのインターフェロン結合亜分画のポリペプチド配列を含む、融合蛋白質または共有結合複合体、または非共有結合複合体である。
【0013】
IFNARは上記の既知細胞外IFNARレセプターのいずれか、ならびにその活性断片のいずれかを包含することを意図する。IFNARは別の蛋白質、例えばIgGの様な免疫グロブリンと随意融合させることができる。IFN、IFNα、IFNβ及びIFNωは現段階で同定されている20以上あるI型インターフェロン、又は将来同定されるであろう別のI型インターフェロンの一つとして意図される。
【0014】
本発明の実施態様の1つでは、複合体は化学結合を介してIFNAR2に共有結合により結合したIFNαまたはIFNβより成る。
【0015】
別の実施態様では、IFNAR2と非共有結合的に結合したIFNα又はIFNβから成る複合体を含む。この別の実施態様はI型IFN及びIFNAR2をいずれかの比率で含む組成物も含む。I型IFNと過剰の上記IFNAR2よりなる配合もまた本出願の”複合体”の定義に含まれる。2つの成分は別々に投与され、インビボにて複合体を形成させてもよい。即ち、別の実施態様では、複合体はIFNα又はIFNβ及び可溶性IFNAR2の同時、又は逐次的な同時投与により得られるIFNAR2とIFNの混合体である。更にIFNARは、IFNの併用投与なしに投与し、内因性の血中IFNと複合体を形成させ、それによって内因性IFNの作用を活性化させてよい。
【0016】
特定の実施態様として、複合体は組換え体蛋白質としてIFNAR2と融合したIFNα又はIFNβ又はIFNωからなるが、該IFN及びIFNAR2成分はフレキシブルなペプチドリンカー分子を介して随意融合される。このペプチドリンカーはインビボで切断可能でも、または切断可能でなくても良い。
【0017】
本発明は更にこれら融合蛋白質、これらDNAを含むベクター、融合蛋白質を発現させる様式にこれらベクターで形質転換された宿主細胞、及びこれら宿主細胞を培養し、それにより発現した融合蛋白質を分離することでこれら融合蛋白質を生産する方法にも関する。
【0018】
本発明の別の観点は、IFNのインビボ作用を延長するための本発明の複合体の使用であり、これはIFNにより治療可能ないずれかの病気または状態の処置に有用である。
【0019】
本発明の別の観点は、IFN処方剤の安定化剤としてのIFNARの使用に関する。遊離型IFNβはオリゴマー化する傾向を有する。これはIFNAR、特にIFNAR2と複合体化することで防がれる。今日、組換え体IFNβの処方剤は酸性pHを持たねばならず、これが投与時にいくらかの局所性の刺激の原因となるかもしれない。もしIFNARを安定化剤に使用すれば、非酸性組成物を処方することができる。
最適実施態様の詳細な説明
本発明のIFNAR/IFN複合体、及び本複合体の製造に必要とされる可能な技術を以下に詳細記述する。結果の多くについては、IFNβを非限定例として選んでいる。
【0020】
融合蛋白質. IFNAR2のC末端、又はそのインターフェロン結合サブ配列を、IFNβ、又はその生物学的に活性な断片のN末端に結合したが、これは2つの分子間を架橋するために最短の距離を要求するからである。IFNβのC末端又はその断片をIFNAR2のN末端、又はそのサブ配列に結合した逆の構築体も製造することができる。
【0021】
IFNAR2/IFNβ複合体の分子モデルより、活性複合体モデルに於けるIFNAR2の束縛された(constrained)C末端細胞外ドメインとIFNβのN末端の間の推定距離は〜80オングストロームである。活性型複合体が維持されるのを可能にするIFNAR2/IFNβ複合体を工作するために、例えばGly−Gly−Gly−Gly−Ser(GGGGS)(配列番号1)リピートの様なフレキシブルリンカーを用いてよい。あるいは、リンカーはフレキシブルであり、かつ血清、膜結合、及び/又は細胞プロテアーゼにより蛋白質分解性切断のための標的であってよい。血清プロテアーゼ切断部位の例としては、工作されたIFNAR2/IFNβ複合融合体は第Xa因子切断部位を持ってよい。第Xa因子はプロトロンビンをArg273及びArg322の2ヶ所で切断し、そしてテトラペプチド認識シグナルIle−Glu−Glu−Arg(配列番号2)(Nagaiら、1984)を持つ。第Xa因子自体は、組織因子を含む様々な活性化因子により内因性及び外因性経路により生成され、血管内皮細胞、マクロファージおよび好中球により放出される。
【0022】
第Xa因子は、第Xa因子認識配列をリンカードメインに含むsIFNAR2/IFN融合蛋白質に作用し、非共有結合型複合体として機能できるようなIFNAR2/IFN複合体を放出できる。
【0023】
あるいは、IFNAR2/IFNβ複合融合体は細胞膜プロテアーゼ(例えばヘプシン)切断部位を持ってよい。へプシンは肝臓組織において高いレベルで発現している51kDaの膜結合セリンプロテアーゼチモーゲンであるが、腎臓、膵臓、肺、甲状腺、脳下垂体及び精巣にも見いだされる。へプシンにより切断されることが分かっている配列の一つは第VII因子中のArg152−Ile153ペプチド結合である。ヘプシンは腫瘍細胞に於けるトロンビンの形成において結び付けられてきた(Kazamら、1995)。
【0024】
へプシンはリンカードメイン中にへプシン認識配列を含むsIFNAR2/IFN融合蛋白質に作用し、非共有結合型複合体として機能できるようなIFNAR2/IFN複合体を放出できる。
【0025】
あるいは、IFNAR2/IFNβ融合複合体は細胞内プロテアーゼ切断部位を持ってよい。様々なプロテアーゼが細胞の壊死又はアポトーシスにより放出される。これらにはカスパーゼ類(インターロイキン1ベータ−変換酵素様プロテアーゼ)、メタロプロテアーゼ類、ライソゾーマルプロテアーゼ類(例えばカテプシンB)及びエラスターゼが含まれる。エラスターゼは疾患状態(例えば敗血症)に於いて顆粒細胞より放出され、アミノ酸切断配列に関し広範な特異性を持ち、トリプシンのそれに類似している(Ertelら、1994;Szilagyiら、1995)。
【0026】
細胞内プロテアーゼは、リンカードメイン内に細胞内プロテアーゼ配列を持つsIFNAR2/IFN融合蛋白質に作用し、非共有結合型複合体として機能できるIFNAR2/IFN複合体を放出できる。
【0027】
実際に、sIFNAR2(P40−ESEFS)のC末端がフレキシブルリンカーを介してIFNβのN末端(MSY)と結合した融合蛋白質構築体例が幾つか製造されている。ペプチドリンカーの例は以下のとおりである:ESEFS(GGGGS)nMSYで、式中のnは5(配列番号3)、4(配列番号4)、3(配列番号5)、2(配列番号6)又は1(配列番号7)である;ESEFS(hCCTP)MSYで、式中のhCG−CTPはSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(配列番号8)である;ESEFS(EFM)nMSYで式中のnは5(配列番号9)、4(配列番号10)又は3(配列番号11)である;ESEFS(EFGAGLVLGGQFM)nMSYで、式中のnは1(配列番号12)又は2(配列番号13)、および複合体モデル内のIFNAR2結合部位とIFNβ間の距離のスパンを持ち、インターフェロンとレセプター成分間に免疫原性エピトープを形成しないいずれかの他の適当なリンカーである。好ましくは、これらリンカーの長さは約30アミノ酸までである。
【0028】
共有結合複合体.化学的架橋分子作製の1例は、ポリエチレングリコール(PEG)の様な生体分解性リンカーをシステイン存在下に反応させIFNAR2を部位特異的に変化させるか、又はSer210からCys、又はAsn89からCys部位の様なアミノ酸置換を利用してIFNAR内に作製するものである(部位特異的変異導入)。以下の構築体が作製できるだろう:式中のnが2000、5000又は10,000ドルトンであるIFNAR(S210C)−PEGn−IFNβ(Cys17)、又はIFNAR(N89C)−PEGn−IFNβ(Cys17)である。
【0029】
2つの異なる(任意に工作された)部分のCysの間の共有ジスルフィド結合の形成も本発明の範囲内である。
【0030】
非共有結合複合体.ヒト型IFNAR2は、活性複合体の生成が最大になる条件下にてIFNβと複合体を形成する。インビトロでは、実施例に報告の如く、最大活性複合体を得るために、IFNβ1国際単位(IU)に対し2.5ngのIFNAR2の最適比が求められる。インビボ活性に関する活性複合体の生成を最大化するIFNβに対するIFNAR2の最適比率は、IFNβの濃度に依存すると考えられるが、ここに決定されたものである。即ち、例えばIFNβ104IU/マウス/日に於ける抗腫瘍活性促進に関するIFNAR2:IFNβの最適比率は2.5ngIFNAR2/pgIFNβであるが、一方5×104IU/マウス/日IFNβの濃度では0.3ngIFNAR2/pgIFNβが最適である。同じ比率をインビトロに於ける活性複合体の生成を最大化するために用いると、インビボに於けるIFNの薬理動態は延長する。
【0031】
好ましくは、複合体作製に用いるIFNAR2及びIFNβは組換え体分子である。インビトロに於ける抗ウイルスアッセイでは、インターフェロン/レセプター複合体はIFNβ単独の活性に比べ高い活性を有する。一定濃度のIFNβを各種濃度の組換え体sIFNAR2と混合し、この混合体(IFNAR2/IFN複合体)をWISH細胞(ヒト羊膜細胞)に加えた。続いてこれらWISH細胞に水疱性口腔炎ウイルス(VSV)を攻撃させ、IFNの抗ウイルス活性を48時間インキュベーション後の生存細胞の程度としてモニターした。各実験では、一定量のIFNβに対するIFNAR2の添加により、用量依存的にVSVで攻撃した細胞の生存率が増加し、最適なIFNAR2対IFN比を示した。これらの結果は、IFNAR2とIFNβの複合体が抗ウイルスアッセイでは遊離型IFNβに比べ高い活性を持つことを証明する。これの事実上の意味は、IFN自体が活性である各種治療応用に於いて、IFNAR2/IFNβ複合体は遊離型IFNに比べ大きな効力と高い活性を持つということである。これらの兆候は、遊離型IFNが抗ウイルス、抗ガン及び免疫変調活性等のいくらかの治療活性を示す場合の兆候を含む。IFNAR2/IFN複合体は、その高い効力により活性を高め、及び/又は薬物動態を改善し(例えば半減期)、ウイルス、発がん及び免疫疾患の治療により効果的となることが期待される。
【0032】
インビボで投与した場合、インターフェロンレセプター複合体はIFNの生物利用度、薬物動態及び/又は薬力作用、換言すればIFNの抗ウイルス、抗ガン及び免疫変調特性を高める。
【0033】
複合体により促進されたIFNの生物利用度は、IFN/IFNAR非共有結合型複合体の前形成、遊離型IFNとIFNARの同時投与、IFN又はIFNAR成分の連続投与、IFN/IFNAR共有結合型複合体の投与、又はIFNAR/IFN融合蛋白質の投与により得られる。
【0034】
別の実施態様では、この様な促進された生物利用度はIFNの付加無しに、IFNAR成分の単独投与によっても達成できる。IFNARはインビボに於いて内因性のIFNと”複合体”を形成し、そして即ち内因性IFNの生物利用度、薬物動態及び/又は薬力作用を高めることになる。これは特に天然のIFNを自然に誘導する病気又は状態、即ちIFNが既にそれら病気や状態と戦うために循環している患者の治療に有用である。加えられたIFNARは天然IFNの効果を増強する。
【0035】
本発明の複合体の利用に関する好適分子は、天然IFNとIFNARの配列を有する。天然配列とは、ヒト型IFN又はIFNARに自然状態で存在する配列である。これら配列は公知であり、文献中に容易に見いだすことができる。天然に存在する対立遺伝子変異も天然配列と考えられる。
【0036】
本発明はさらに、天然のIFNAR2及びIFNの配列を本質的に有する複合体と同一の生物学的活性を本質的に保持している、本発明の上記IFNAR2/IFN複合体の類縁体にも関係する。この様な類縁体は、複合体のIFNAR2及び/IFN成分中約30アミノ酸残基までが欠失され、付加され、または別のものに置換されたものであって、この様な変更が複合体そのものと比べて該キメラ蛋白質の生物学的活性を本質的に変化させないようにしてよい。各種類縁体は、大部分が複合体中2つの成分が結合するリンカーペプチド部位について相互に、また基本の複合体分子(本質的に天然に生じるIFNAR2とIFN配列のみ)と異なっていてよい。上記の如く、この様なリンカーは長さが約30アミノ酸であり、複合体中のIFNAR2とIFN成分を相互に分離するものであるものが好ましい。この様なリンカーに関しては、例えば複合体を不活性化したり、又は活性を高めなかったり、あるいは複合体類縁体に免疫原性を付与し治療対象の患者に於いて類縁体に対する抗体を惹起し、その結果少なくとも中期又は長期作用薬として無効に成るような不正確な折りたたみが複合体に生じない様に配列を選択することに(従って、同時に適当な標準的アッセイ方法で各類縁体を生物学的に試験することにも)注意を払うべきである。本発明の複合体の上記類縁体に関しては、これら類縁体は本発明の基本複合体と比較して得られた産物の活性が大きく変化しない状態で、本発明の基本複合体のアミノ酸残基の1またはそれ以上、および約30アミノ酸残基までが別のアミノ酸残基に交換され、欠失され、あるいは1またはそれ以上約30までのアミノ酸残基が本発明の複合体の本来の配列(本質的に天然のIFNAR2/IFN配列のみ)に加えられたものである。これら類縁体は公知合成法及び/又は特定部位突然変異誘導技術、またはその他の好適技術により製造される。
【0037】
この様な類縁体のいずれもが基本のIFNAR2/IFN複合体の配列の十分な複製物であるアミノ酸配列を有することにより、例えば実質それに類似の活性を有することが好ましい。即ち、これら類縁体それぞれを下記実施例2−7に記す生物学的活性試験および安定性試験にかけることを含む通常の実験的手段によって、問題の類縁体が本発明の基本複合体と本質同一の活性及び/又は安定性を持つか否かを決定することができる。
【0038】
本発明に従い使用可能な複合体の類縁体又はそれをコードする核酸配列には、ここに示された教示及び指導を基に実験することなく当業者により日常的に得ることのできる置換ペプチド又はポリペプチドである、実質対応配列の有限セットが含まれる。蛋白質化学及び構造の詳細な説明については、ここに参照され取り込まれているSchulzら、蛋白質構造の原理(Principles of Protein Structure)、Springer−Verlag、New York(1978);及びCreighton,T.E.,蛋白質:構造と分子特性(Proteins:Structure and Molec ular Properties)、W.H.Freeman&Co,San Francisco(1983)を、コドンの選択についてはAusubelら(1987,1992)、§§A.1.I−A.1.24及びSambrookら(1987,1992)、§§6.3及び6.4、添付資料C及びDを参照せよ。
【0039】
本発明による類縁体に関し好適な変化は、”保存的”置換として知られるものである。実質的に天然に存在するIFNAR2及びIFN配列を含む複合体の中の保存的アミノ酸置換は、グループメンバー間の置換が分子の生物学的機能を保存するのに十分類似した物理化学的特性を持ったグループ内の同類アミノ酸を含んでよい(Grantham,1974)。それらの機能を変えることなく上記配列内にアミノ酸の挿入及び欠失が可能であること、特に挿入又は欠失が例えば30、好ましくは10以下である少数のアミノ酸に限定され、機能的立体構造に重要なアミノ酸、例えばシステイン残基を除去、または置換しない場合には明瞭である(Anfinsen,1973)。この様な欠失、及び/又は挿入により生成された類縁体は本発明の範囲内である。
【0040】
好ましくは、同類アミノ酸グループは表1に定義される。より好ましい同類アミノ酸グループは表IIに定義される;及び最も好ましい同類アミノ酸グループは表IIIに定義される。
【0041】
【表1】
【0042】
【表2】
【0043】
【表3】
【0044】
本発明で使用するための複合IFNAR2/IFN同類体を獲得するのに使用可能な、蛋白質内にアミノ酸置換を作る例は、Markらの米国特許第RE33,653号;第4,959,314号;第4,588,585号及び第4,737,462号、Kothsらの第5,116,943号、Namenらの第4,965,195号;及びLeeらの5,017,691号記述されている様ないずれかの公知方法、及び米国特許第4,904,584号(Shawら)記述のリジン置換蛋白質を含む。
【0045】
本発明の別の好適実施態様では、本発明への利用のための複合体類縁体は、本発明の上記基本複合体のアミノ酸配列に本質的に対応するアミノ酸配列を持つ。”本質的に対応する”という語は、特に例えば癌細胞増殖を阻害する能力、又は骨髄移植を促進する能力に関する場合に、基本複合体の基本特性に影響しない程度に塩基性複合体の配列に微細な変化を持つ類縁体を包括することを意図する。”本質的に対応”するという語に該当すると一般的に考えられるタイプの変化は、保存的変異誘導技術により本発明の複合体をコードするDNAに生じせしめ、微細な変更を生じさせ、そして上記開示方法によって所望活性に関しスクリーニングされたものである。
【0046】
好ましくは、複合体のIFNAR2部分は、天然配列又はその生物学的に活性な断片と同一なコア配列を持つか、又は天然のアミノ酸配列に少なくとも70%同一であるアミノ酸配列を持ち、天然配列の生物学的活性を保持するその変異体である。より好ましくは、これら配列は少なくとも天然配列に対し85%の同一性を、少なくとも90%の同一性を、あるいは最も好ましくは少なくとも95%の同一性を持つ。
【0047】
複合体のIFN部分に関しては、利用可能なコア配列は天然配列、または生物学的に活性なその断片、又はそれに対し少なくとも70%の同一である、より好ましくは少なくとも85%または少なくとも90%同一である、及び最も好ましくは少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を持つその変異体である。これら類縁体は天然IFN配列又はその断片の生物学的活性を保持しているか、又は下記論ずる拮抗活性をもっていなければならない。
【0048】
ここに用いられる”配列同一性”という語は、配列を以下の如く比較することを意味する。配列を遺伝子計算グループ(Genetic Computing Group)のGAP(グローバルアラインメントプログラム)のバージョン9を、ギャップオープペナルティーが−12(ギャップの第1ヌルに関し)でギャップエクステンションペナルティーが−4(ギャップ内に加える連続ヌル当たり)であるデフォルト(BLOSUM62)マトリックスで利用して並べた。配列後、クレームされている配列内のアミノ酸数のパーセンテージとして一致した数を表し、同一%を計算する。
【0049】
本発明による類縁体は、以下の手順に従って決定してもよい。複合体のIFNAR部分、又は複合体のIFN部分のいずれについても、天然配列のDNAは当業者公知であり、また本明細書の従来技術の部分内に引用された文献内に発見することも、又は当業者により容易に探し出すことも可能である。DNA又はRNAの様な、極めて又は適度にストリンジェントな条件下に天然のDNA又はRNAとハイブリダイズできるいずれかの核酸にコードされたポリペプチドであって、該ポリペプチドが天然配列の生物学的活性を維持するもの、あるいはIFNの場合には生物学的活性を維持するか、又は拮抗活性を保有するものは全て本発明の範囲である。
【0050】
ストリンジェントな条件はハイブリダイズ実験に使用する温度、ハイブリダイゼーション液の1価カチオンのモル濃度及びフォルムアミドの%の関数である。特定の条件セットのストリンジェンシーの程度を決めるためには、まずDNA−DNAハイブリッドの融解温度Tmとして表される、100%同一なバイブリッドの安定性を決定するためのMeinkothらの式(1984)を当てはめる:Tm=81.5℃+16.6(LogM)+0.41(%QC)−0.61(%form)−500/L、式中のMは1価カチオンのモル濃度であり、%GCはDNA中のG及びCのパーセンテージであり、%formはハイブリダイゼーション中のフォルムアミドのパーセンテージであり、又Lはハイブリッドの塩基対長である。100%同一性のハイブリッドについて計算されたTm値よりTmを1℃減じる毎に、許容ミスマッチ数は約1%増える。即ち、特定の塩濃度とフォルムアミド濃度で行うハイブリダイゼーション実験のTmが同一性100%のハイブリッドについてMeinkothの式により計算されたTmより10℃低い場合には、ミスマッチが約10%まで存在した状態でもハイブリダイゼーションが起こる。
【0051】
本明細書で用いる、極めて(highly)ストリンジェントな条件とは、約15%までの配列変動が許容される条件であり、適度に(moderately)ストリンジェント条件とは約20%までの配列変動が許容される条件である。特に限定しない限り、極めてストリンジェントな条件(ハイブリッドのTm計算値より12−15℃低い)及び適度なストリンジェント条件(ハイブリッドのTm計算値より15−20℃低い)では、ハイブリッドのTm計算値より低い適切な温度で2×SSC(標準クエン酸生理食塩水)及び0.5%SDSの洗浄液を用いる。条件の最終的なストリンジェンシーは、特に使用するハイブリダイゼーション条件がより安定性の低いハイブリッドが安定したハイブリッドと共に形成できる場合には一次的には洗浄条件によって決まる。この場合、ストリンジェンシーの高い洗浄条件は安定の低いハイブリッドを除く。上記の極めてストリンジェントな洗浄条件から適度にストリンジェントな洗浄条件で利用可能な一般的なハイブリダイゼーション条件とは、6×SSC(又は6×SSPE)、5×デンハルト試薬、0.5%SDS、100μg/mlの変性、断片化されたサケの精子DNAを含む溶液内、Tmより約20ないし25℃低い温度でのハイブリダイゼーションである。混合プローブを用いる場合、SSCの代わりにテトラメチル塩化アンモニウム(TMAC)を使用することが好ましい(Ausubel,1987,1998)。
【0052】
本明細書に用いる”機能的誘導体”とは、公知の手段により残基又は、N−又はC−末端基上に側鎖として存在する官能基から製造される誘導体を包含しており、それらが薬物学的に許容されるかぎり、即ちそれらが本書記載の複合体の該当部分の生物学的活性を破壊せず、それを含む化合物又はそのための複合体に毒性を付与しないかぎり、本発明に含まれる。誘導体は同一の生物活性を有し、薬物的な許容性を保持する様な分画を提供する炭化水素塩又はリン酸塩残基の様な化学成分を有する。
【0053】
例えば、誘導体はカルボキシル基のカルボキシルの脂肪族エステル、アンモニア又は1級又は2級アミンと反応させたカルボキシル基のアミド、アシル成分(例えば、アルカノイル又はカルボサイクリックアロイル基)と共に形成されたアミノ酸残基のN−アシル誘導体または遊離アミノ基、またはアシル成分と共に形成された遊離型ヒドロキシル基のO−アシル誘導体(例えばセリル又はスレオニル残基の誘導体)を含んでよい。この様な誘導体、例えば抗原性部位をマスクし、体液内での複合体又はその一部の耐性を拡大するポリエチレングリコール側鎖を含んでもよい。
【0054】
本明細書中の用語”誘導体”という語は、あるアミノ酸を天然に存在する20種類アミノ酸の別のものに変更しない誘導体のみを含むことを意図する。
【0055】
本明細書中の用語”塩”とは、本発明の複合体又はその類縁体のカルボキシル基塩、及びアミノ基の酸付加塩の両方を指す。カルボキシル基の塩には、公知方法によって形成することができ、無機塩、例えば、ナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄又は亜鉛塩等、及び例えばトリエタノールアミン、アルギニンまたはリジンの様なアミン、ピペラジン、プロカイン等と形成される有機塩基を持つ塩が含まれる。酸付加塩には、例えば塩化水素酸又は硫酸の様な鉱酸、及び例えば酢酸又はシュウ酸の様な有機酸の塩が含まれる。当然、この様な塩のいずれもが本発明の複合体またはその類縁体と実質的に同様な生物活性を持っていなければならない。
【0056】
本明細書中での”生物学的活性”という用語は、以下のように解釈される。複合体のIFNAR2部分を考える場合、重要な生物学的活性とはI型インターフェロンに対する結合能力である。即ち、このインターフェロン結合能を保持する様に類縁体または変異体、塩及び機能的誘導体を選択しなければならない。これは、通常の結合アッセイ実験にて試験することができる。さらに、IFNAR2の断片、又はその類縁体がそのインターフェロン−結合活性を保持する限り利用することができる。断片は、インターフェロン結合ポリペプチドいずれかの末端よりアミノ酸を除去し、得られた産物についてインターフェロン結合特性を試験することで容易に製造してよい。ポリペプチドのN末端またはC末端のいずれかより1度に1アミノ酸を除くプロテアーゼは公知であり、またインターフェロン結合能を保持する断片を決定することは通常の実験に含まれる。
【0057】
更に、この様なインターフェロン結合活性を持つポリペプチド、IFNAR2、sINFAR2、類縁体または変異体、塩、機能的誘導体またはその断片は、インターフェロン結合ポリペプチドを周辺に有する追加のアミノ酸残基を含むこともできる。得られた分子がコアポリペプチドのインターフェロン結合能を持つ限り、これら周辺残基がコアペプチドの基本的かつ新規特性、例えばそのインターフェロン結合特性に影響をおよぼすか、通常の実験により決定することができる。”から本質的になる(essentially consisting of)”という語は、特定な配列を指し示す場合には、追加の周辺残基が特定配列の基本的かつ新規特性に影響しない状態で存在できることを意味する。この語は特定配列内の置換、欠失または付加を包含しない。
【0058】
IFNAR2またはsIFNAR2が本明細書中、また実施例中に利用されているが、これは単に好ましい例であり、IFNAR2が参照される本発明開示の箇所についてはIFNAR2をIFNAR1サブユニット、特にその細胞外ドメインに変えてよいことは理解されるべきである。IFNAR1はそれが結合するインターフェロンと組み合わせた形でのみ使用できる。IFNARはIFNαに結合することが知られている。IFNAR1を用いたいずれの複合体も、IFNAR1が結合する種類のインターフェロンの種、好ましくはIFNαの種を伴わなければならない。
【0059】
本発明の複合体のインターフェロン部分に関して、いずれの類縁体又は変異体、塩、機能的誘導体または断片中に保持される生物活性は、目的とする利用に合致したインターフェロンの活性でなければならない。多くの例では、これは天然の細胞表面レセプターに結合し、レセプターを介したシグナル生成能力である。即ち、この様な類縁体、誘導体または断片は、この様な本発明の利用にして有用である、これらレセプターアゴニスト活性を保持しなければならない。一方、レセプターに対し拮抗活性を持つ分子を有し、その結果天然インターフェロンの生物活性を阻止することも時に有用である。この様な拮抗剤もまた、本発明の複合体の手法による有益作用を延長するのに利用できる。インターフェロンの持つ不要の作用を除くことを期待したこの様な利用に関して、レセプター及び複合体のIFNAR部分とは結合したまま、しかしシグナル伝達はせず、また受容体上にある天然インターフェロンにより作られるシグナルは阻止する類縁体も、本発明に於いて生物学的に活性であり、本発明の複合体に対し用いられる場合に於いてはインターフェロンという語の中に包含される。直接アッセイは、これら類縁体がこの様なレセプターアゴニスト活性を持つか、又はレセプター拮抗活性を持つか決定でき、従って本発明の有用性の一つとして有益であろう。
【0060】
本発明は本発明の上記複合体及びその類縁体、ならびに好適な原核生物又は真核生物宿主細胞中での発現を目的とした、これらDNA配列を持つDNAベクターにも関する。組換え体蛋白質発現システムを用いて異種蛋白質が大量に生産できる能力により、各種治療薬、例えばt−PAやEPO(Edington,1995)が開発された。組換え体蛋白質が生成できる各種発現宿主は、原核生物に始まり(例えば細菌)(Olins,1993)から、下等真核生物(例えば酵母)(Ratner,1989)、そしてより高等な真核生物種(例えば昆虫や哺乳動物細胞(Reuveny,1993;Reff,1993)へと広がった。これらシステムはいずれも同一原理−所望蛋白質のDNA配列を選択した細胞に導入(組み込まれるか、エピゾーマルエレメントとして一過性、または安定的に)され、宿主の転写、翻訳、移送機序を使って導入されたDNA配列を異種蛋白質として過剰発現させる−に拠っている(Keown,1990)。
【0061】
天然遺伝子配列の発現に加え、ヌクレオチドレベルでDNAを操作する能力は天然の蛋白質をベースにするものの一次蛋白質構造中の変化の結果として新規活性を持つ、新規構築配列の開発に好都合である(Grazia,1997)。
【0062】
更に、DNAの選択配列は物理的に連結し、本来独立している蛋白質を1つのポリペプチドユニットとして発現される新規融合蛋白質にする転写体を作ることができる(Curtis,1991)。
【0063】
ヒトIFNβは哺乳動物であるチャイニーズハムスターの卵巣細胞(CHO)を用いた製造工程より得られる。1型インターフェロンは細菌(Utsumi、1987)、昆虫(Smith,1983)及びヒト(Christofinis,1981)を含む各種宿主細胞で発現できる。ヒトsIFNAR2もCHO宿主細胞を利用し発現できる。あるいはsIFNAR2の様な可溶性レセプターもまた細菌発現システムで良好に発現された(Terlizzese,1995)。各遺伝子のDNAはトランスフェクション法を利用しCHOゲノム内に導入され、その結果組換え、及び発現ベクターの組み込みが起こる。その後、当業者公知の通常の産業手段により所望蛋白質を発現する細胞を単離し、培養し、蛋白質を回収し、精製した。
【0064】
本発明は更に活性成分として、IFNAR2/IFN複合体またはその類縁体、あるいはその混合体、又はその塩、及び医薬品として許容される担体、希釈体または添加物を含む医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物の実施態様は、ウイルス疾患、抗癌治療、免疫変調治療及びその他それらに関するインターフェロン及びサイトカインの応用に於ける、増強されたIFN型の作用に関する医薬品組成物を含む。
【0065】
本発明の医薬品組成物は、複合体またはその類縁体を生理学的に許容される担体、及び/又は安定化剤、及び/又は添加剤と混合して製造し、投与形状に製造し、例えば投与バイアル中に凍結乾燥される。投与方法は、同様の薬剤の投与について受け入れられている様式のいずれでも良く、又治療対象である状態に依存し、例えば静脈、筋肉内、皮下により、局所注射または塗布、または点滴により連続的に投与することができる。投与される活性化合物両は投与経路、治療対象の病気、及び患者の状態に依存する。例えば局所注射は、静脈注射に比べ体重ベースでより少量の蛋白質を必要とする。
【0066】
遊離型IFNβは多量体化する傾向がある。この傾向を抑えるために、現在のIFNβ剤は酸性のpHを有しているが、これが投与時のいくらかの局所刺激の原因になるかもしれない。IFNARはIFNβの安定化因子としても機能でき、これによって多量体化を阻止することから、IFNβ剤中に利用することでIFNβを安定化させ、酸性処方の必要性を無くすことができる。従って、その他の通常の医薬品として許容される添加物と共にIFNβ、及びIFNARを含む非酸性の医薬品組成物も本発明の一部である。
【0067】
本発明は更に本発明の複合体又はその類縁体、その混合体の、抗ウイルス、抗ガン及び免疫変調治療への利用に関する。具体的には、本発明のインターフェロンレセプター−インターフェロン複合体は、慢性肉芽腫病、尖形コンジローム、若年性咽頭パピローマ症、A型肝炎、及びB型及びC型肝炎ウイルスの慢性感染といった治療適用症於ける抗ウイルス治療に有用である。
【0068】
特に、本発明のインターフェロンレセプター−インターフェロン複合体は、ヒアリー細胞白血病、カポジ肉腫、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫及びメラノーマの様な治療適用症の抗ガン治療に有用である。
【0069】
本発明のインターフェロンレセプター−インターフェロン複合体は、多発性硬化症、リューマチ関節炎、重症筋無力症、グラヴィス、糖尿病、AIDS、ループス等の免疫変調治療にも有用である。
【0070】
同様に、本発明は上記病気治療用の医薬品の調整に利用するため、または上記適用に利用するための複合体、又はその類縁体、又はその混合体に関する。
【0071】
以下、本発明を非限定的実施例及び添付資料により詳細に説明する。
実施例
材料と方法
抗ウイルスWISHバイオアッセイ及び複合体の生成
WISHアッセイはNovickら(1982)のプロトコールに基づき開発した。
【0072】
材料
・WISH細胞(ATCC CCL 25)
・水疱性口内炎ウイルス保存株(ATCC V−520−001−522)、−70℃にて保管。
・IFNβ、ヒト型組換え体、InterPharm Laboratories LTD 90×106IU/ml、比活性:264.5×106IU/mg。
・可溶性ヒト型IFNAR2、373μg/mlPBS中保存濃度。
・WISH増殖培地(Earls塩入りMEM高グルコース+10%FBS+1.0%L−グルタミン+ペニシリン/ストレプトマイシン(100U/ml,100μg/ml))
・WISHアッセイ培地(Earls塩入りMEM高グルコース+5%FBS+1.0%L−グルタミン+ペニシリン/ストレプトマイシン(100U/ml,100μg/ml)、MTT5mg/mlPBS、−70℃保存。
【0073】
方法
・組換え体ヒト型IFNβをWISHアッセイ培地で19IU/ml(前もって測定されたEC50投与量の4倍)に希釈する。
・90μg/mlより開始し、WISHアッセイ培地を用いてエッペンドルフチューブ内にヒト型組換え体sIFNAR2の3倍希釈体を11作製する。12番目のチューブはWISHアッセイ培地のみを含む。
・平底型96ウエルプレートの各ウエルにIFNβを25μl加える(IFNβを含まない、IFNAR2の効果を見るための3×12ウエルのコントロールには、WISHアッセイ培地のみを25μl加える)。
・96ウエルプレートの12行に、3重形式にてsIFNAR2(又は12番目の行にはアッセイ培地のみを)の各希釈液25μlを加える。
・WISH細胞を加える前に、IFNβとsIFNAR2を37℃のインキュベーターの中で1−4時間前インキュベーションさせる。
・対数増殖期にあるWISH細胞をトリプシン/EDTA液で集め、WISHアッセイ培地で洗浄、最終濃度を0.8×106細胞/mlに調整した。
・WISH細胞懸濁液50μlを各ウエルに加えた(4×104細胞/ウエル)。IFNβ及びIFNAR2の最終濃度は細胞が暴露される濃度であり、IFNβは4.75IU/ml(1×)であり、また第1行めのsIFNAR2の最終濃度は22.5μg/mlである。
・5%CO2加湿インキュベーター内で24時間インキュベーション後、1:10希釈液50μl(WISHアッセイ培地による)またはVSV保存液(48時間以内にWISH細胞を100%溶解するために前もって決められた用量)をウイルスの入っていないコントロールウエル(これらには当量のアッセイ培地のみが加えられた)以外の全てのウエルに加えた。
・さらに48時間後、25μlのMTT液を全ウエルに加え、その後プレートはインキュベーター内でさらに2時間インキュベートさせた。
・プレートを逆さまにして、ウエル内容物を除去し、100%エタノールを200μlウエルに加えた。
・1時間後、Soft max Proソフトウエアーパッケージ及びSpectramax 分光光度計システム(Molecular Devices)を用いプレートを595nmで測定した。
【0074】
全ての配列反応はThermoSequenaseTM放射標識ターミネーターサイクルシークエンシングキット(Amersham Life Science;Cleveland,OH)を用いて行った。メーカー提供のプロトコールを用いた。全てのシークエンシング反応は、6%ポリアクリルアミド及び7M尿素を含むCastAwayTMプレキャストシークエンシングゲル(Stratagene;LaJolla、CA)で分析した。シークエンシング反応はA−C−G−Tの順番でおこなった。シークエンシングゲルのオートラジオグラフは手動で判読した。DNA配列分析にはGenetic Computer Group Sequence Analysisソフトウエアーパッケージ及びUNIXワークステーションを用いた。
実施例1
ヒト型IFNAR2/IFNβ複合体及びヒト型IFNAR2Ig−IFNβ複合体の抗ウイルス活性を調べるために、一定濃度のIFNβ(4.75IU/ml)を各種濃度(0.25−30000ng/ml)のヒト型IFNAR2(組換え体p40)またはヒト型IFNAR2Igと3時間、37℃で前インキュベートし、続いてWISH−VSV細胞変性アッセイで試験した。IFNが無い状態では、抗ウイルス防御は認められなかった(データ未提示)。
【0075】
およそ30ng/mlのsIFNAR2が存在する状態でのI型インターフェロンの抗ウイルス活性(事前に測定したEC50濃度)は、IFNβとともにある時最適なアゴニスト活性を示したが、単独では示さなかった。抗ウイルス活性はVSVを作用させた48時間後にMTT転換法により測定された。
【0076】
IFNが推定ED50濃度存在する時、防御が観察された(図1参照;吸光度は0.45に等しく、防御なしの吸光度は〜0.0に等しく、完全に防御された時の吸光度は〜1.8である)。IFNAR2又はIFNAR2Igを各種濃度で力価測定した場合、32ng/mlのIFNAR2及びIFNAR2Igまででは〜4×のIFNβの活性の増強が認められた(実施例2及び図2も参照せよ)。32ng/ml以上のIFNAR又はIFNAR2IgではIFNβの活性は予想通り低下したが、これは、IFNβを巡るsIFNARと膜ベースのIFNARとの競合によると思われる。即ち、本実験より、IFNAR2/IFN複合体に於いてIFNβの効果が上昇し、又活性が増強されることが支持された。
実施例2
sIFNAR2/IFN複合体に対するIFNβ濃度の変更の効果を、各種濃度のIFNβをED50に加え検証した。図2に見られるように、4.75IU/mlのIFNβでは、〜32ng/ml濃度のIFNAR2との1時間の前インキュベーションによりIFNβの活性は〜2×増強された。さらに高いIFNβ濃度では、IFNβの抗ウイルス活性は既に最大値となっていたため、それ以上の増強は認められなかった。これらの結果も、IFNAR2/IFNβ複合体が増強されたIFN活性を持つことを支持している。
実施例3
IFNAR2/IFNβ複合体形成の動態を、各種濃度のIFNAR2と様々な時間前インキュベーションさせた時の半有効濃度のIFNβ(0.95IU/ml)の抗ウイルス活性を調べ検討した。図3に示すように、半有効用量のIFNβの抗ウイルス活性を増強するには、4時間の前インキュベーションが必要であった。即ち、それのみでは不活性であるIFNβのレベルでは、IFNAR2の追加により複合体が形成されることで有意なIFN抗ウイルス活性が生まれる。この実験は、IFNAR2/IFNβ複合体がIFNの活性を増強することを更に支持する。
実施例4
IFNβの生物活性は37℃でインビトロにて再調整(生理学的食塩緩衝液、pH7.4)された後に急速に減少することが知られている。少なくともその一部は、活性を低下させるIFNβ多量体構造の形成に拠るものである。IFNAR2が生理学的pHに於いてIFNβの安定性を増加させるか試験するために、各種濃度のIFNβを単独、または一定のIFNAR2対IFNβ比でIFNAR2が存在する(2.5ng/IU)培地中でインキュベートさせる実験を行った。IFNβ(500IU/ml)を当量のsIFNAR2(1.25μg/ml)またはRPMIのみのいずれかと3時間、37℃で前インキュベートした。WISH細胞を加える前に、96ウエルのプレート中、WISHのアッセイ培地中で両方のIFNβ液の力価測定を行った。VSVを24時間後に加え、さらに48時間培養した後MTT転換により測定した。
【0077】
図4に見られるように、IFNβ単独ではED50は〜104IU/mlであったが、IFNβと可溶性IFNAR2を前インキュベーションさせると有意にED50は増加し〜7IU/mlになった。IFNβ単独での高値ED50は、溶液中でのIFNβの多量体化に拠ると考えられる。上記結果も、IFNβがIFNAR2と複合体を形成すると安定性が増すことを示している。
実施例5
IFNAR2存在下でのIFNβの活性増強がsIFNARによる特異的保護によるものであるか検証するために、IFNAR2又はその他無関係な蛋白質(ヒトIgG、ウシ血清アルブミン(BSA))を同一濃度組み合わせた後にIFNβの活性を調べた。
【0078】
図5に示すように、IFNβ(500IU.ml)を当量の上記蛋白質(1.25μg/ml)又はRPMIのみと4時間、37℃で前インキュベートした。これらIFNβ液のWISHアッセイ培地中での力価を、WISH細胞を加える前の96ウエルプレート内で測定した。新たに調整したIFNβを加え、IFNβ活性に及ぼす前インキュベーションの効果を調べた。VSVを24時間後に加え、さらに48時間培養した後MTT転換により測定した。
【0079】
IFNβと非特異的蛋白質2.5ng/IU IFNβ(例えばBSA又はヒトIgG)との前インキュベーションは、再構成後のIFNβの活性を保護しなかった。本アッセイに於けるIFNAR2/IFNβ複合体の活性は、新たに加えたIFNβ時の活性に類似しており、sIFNAR2がIFNβの活性を安定化するという所見を支持した。
実施例6
IFNAR2/IFNβ複合体は、ELISA及びバイオアッセイ分析によればマウスに於いてIFNβの薬物動態プロフィールを大きく延長した(図6及び7)。
【0080】
B6D2F1株のマウスにヒト型IFNβ(2.5×106IU/kg)またはヒト型IFNAR2(2.5μg/IU IFN)と1時間4℃で前インキュベートした同濃度のIFNβのいずれかを単数回静脈投与した。投薬後0.05から48時間にかけて尾静脈より血清を採取し、IFNβ濃度とIFNβの抗ウイルス活性をそれぞれELISA(図6)又はWISHバイオアッセイ(図7)にて測定した。ELISAアッセイのアッセイ感度(7.55IU/ml)以下になった血清濃度はプロットしなかった。
【0081】
複合体は薬物動態プロフィールを延長しただけでなく、WISHによる抗ウイルスアッセイによればマウスでは生物学的に活性なIFNβのレベルも時間と共に大きく増加し、IFNβ単独に比べ本発明のIFNAR2/IFNβ複合体は高い安定性と延長された血漿半減期を示し。
実施例7
IFNAR2/IFNα2a複合体は、ELISA及びバイオアッセイ分析によればマウスに於けるIFNα2aの薬物動態プロフィールを大きく延長した(図8及び9)。
【0082】
B6D2F1株のマウスにヒト型IFNα(1.25×106IU/kg)またはヒト型IFNAR2(2.5μg/IU IFN)と1時間4℃で前インキュベートした同濃度のIFNαのいずれかを単回静脈投与した。投薬後、指定時間に尾静脈より血清を採取し、IFNα濃度とIFNαの抗ウイルス活性をそれぞれELISA(図8)又はWISHバイオアッセイ(図9)にて測定した。
【0083】
IFNαはヒト型IFNαに特異的なELISAにより測定した。ELISAアッセイのアッセイ感度(7.55IU/ml)以下になった血清濃度はプロットしなかった。
【0084】
複合体は薬物動態プロフィールを延長しただけでなく、WISHによる抗ウイルスアッセイによればマウスでは生物学的に活性なIFNβのレベルも時間と共に大きく増加し、IFNα単独に比べ本発明のIFNAR2/IFNβ複合体は高い安定性と延長された血漿半減期を示した。
実施例8
IFNAR2/IFN融合蛋白質の作製
IFNAR2の細胞外ドメインのC−末端が、G及びSがそれぞれアミノ酸のグリシンとセリンを表す以下のペプチドリンカーを用いて成熟IFNのN−末端に融合した:
IFNAR2細胞外(リンカー)成熟IFNβ
...ESEFS(GGGGS)nMSY...,式中n=0(配列番号5)、1(配列番号7)、2(配列番号6)、3(配列番号5)、4(配列番号4)及び5(配列番号3)
n=2のIFNAR2/IFNβ融合体の完全なアミノ酸配列を図10に示す(配列番号14)。
【0085】
ヒト型組換え体IFNを発現する遺伝子を含む発現ベクターpSVEIFをPCRの鋳型に用いた。合成プライマーをヒト型IFN(MSY...)の成熟蛋白質コーディング域だけを鋳型から増幅する用に設計した。5’プライマーは消化されたSamI部位の配列、少なくとも7個のIFNAR2のアミノ酸(GQESEFS)(配列番号14の残基344−349)及び(GGGGS)1(配列番号1)リンカーを含む。BamHI及びXhoI部位を5’PCRプライマーに導入し、その他のカセットのクローニングを促進することもできる。3’プライマーはhIFNβのTGA停止コドン直後にAvrII部位を含む。PCRは100μlの反応容積中に、およそ1gの鋳型DNAと1gの各PCRプライマー、0.2mMのdATP,dTCP,dGTP及びdTTP、1×のThermoPol反応緩衝液(10mM KCl、20mM Tris−HCl、(25℃pH8.8)、10mM(NH4)2SO4、2mM MgSO4 、0.1%TritonX−100;New England Biolabs;Beverly,MA)、及び3mM MgSO4(5mM MgSO4、最終濃度)を含む。99.9℃30秒間のVENTR初期インキュベーション後、2単位のVENTR DNAポリメラーゼを反応体に加えた。PCRは以下の20サイクルから成る:(a)99.9℃、30秒、(b)65℃−55℃、30秒、サイクル毎に0.5℃づつ下げる、及び(c)75℃、40秒間。さらにアニーリング温度を55℃に固定した上記プロフィールを15サイクル加える。PCR反応体はWizardTMPCRPrepsDNA精製システム(Promega;Madison,WI)を用いて精製した。PCR産物をAvrIIにて消化した後、反応体を低溶解温度アガロースゲルにて精製した。1GSリンカーを持つhIFNβ成熟蛋白質配列を含むゲル精製断片をヒト型組換え体IFNAR2の可溶型をコードする遺伝子を含む(SmaI+AvrII)−消化発現ベクターpCMV−p40に連結した。連結反応を利用し、通常の方法により(Sambrookら、1989)コンピテントE.coliXL−1Blue細胞を形質転換した。pCMV−IFNAR2/IFNAβGSと呼ばれる構築体が正確に組み立てられていることは、”融合体”の制限酵素消化とPCR産物領域の配列を決定して確認した。続く構築体をBamHIオーバーハング、適当な(GGGGS)nリンカー(n=1の時配列番号1)及びXhoIオーバーハングを含むオリゴヌクレオチドカッセットを利用し構築した。0GSカセットはSmaI及びXhoIオーバーハングを含む。pCMV−IFNAR2/IFNAβ1GSベクターを確認した後、これをBamHI及びXhoIで消化し、適当なカセットをこのベクターに接続した。0GS構築体については、カセットを接続するためにベクターをSmaI及びXhoIで消化した。
【0086】
nが0,1,2,3,4,及び5のGGGGS(配列番号1)リンカーユニットを表すpCMV−IFNAR2/IFNβn(GS)ベクターを合計で6個作製した。これらの制限酵素消化の結果は図11に示す。シークエンシングプライマーは、各構築体のカセットが完全に配列決定される様に設計した。構築体の確認の為に、市販キット及びメーカー提供のプロトコール(Qiagen;Chatsworth,CA)を利用して大規模にプラスミッドDNA培養体を製造した。
【0087】
図12はpCMV−IFNAR2/IFNAβ”融合体”発現ベクターの代表的なプラスミッドマップである。IFNAR2/IFNβ融合蛋白質の転写は、ヒト即時型CMVプロモータより行われる。ベクターにより提供されるヒト成長ホルモン(hGH)ポリアデニレーションシグナル配列はIFNAR2/IFNβ転写体の3’加工に利用した。
【0088】
IFNAR2/IFNβ1GS融合体のPCR生成域について配列データを得た;このデータは、該配列が予想通りであることを示していた。その他の構築体のペプチドリンカー域について配列データを得た;該配列も予想通りであった。
【0089】
各構築体をトランスフェクトした細胞についてノーザンブロット分析を行った。IFNAR2プローブ及びIFNβプローブの両方について、IFNAR2/IFNβnGSサンプルを含む全てのレーンには約1.4kbの大きさのバンドが存在した。IFNβプローブについては、更に約0.9kbのバンドが観察された。この大きさのバンドはIFNAR2のアミノ酸を少なくとも6個と、(n)GSリンカー及びhIFN成熟蛋白質をコードする配列を含む、別の形にスプライスされた転写体に対応するものであろう。このことは実施例9に於いて一過性にトランスフェクトしたCHO細胞より分離した総RNAより調製したcDNAの配列を決定し、確認された。
実施例9
一過性トランスフェクション.CHO−DUKX細胞はジヒドロ葉酸還元酵素活性を欠いたチャイニーズハムスター卵巣細胞のクローナル突然変異体である(Urlaubら(1980);Graffら(1982))。細胞はリボヌクレオシド及びデオキシリボヌクレオシドを加え、10%胎児ウシ血清(FBS)と1%L−グルタミンを添加したアルファ最小限定培地(αMEM)(完全培地)中に維持された。一過性トランスフェクションは、LipofectaminePLUSTM試薬(GibcoBRL Life Technologies;Gaithersburg,MD)及びメーカー提供のプロトコールを利用して行った。トランスフェクション約24時間前に、細胞を直径100mmの皿の中に2×106細胞/皿の密度で加えた。トランスフェクションするために、4μgのスーパーコイルしたベクタープラスミドDNA(pCMV−IFNAR2/IFN n GS、式中n=0,1,2,3,4または5)を利用した。メーカー提供の無血清培地を利用し、DNA及びPLUS試薬を希釈した。完全培地中、37℃で48時間培養した後、ELISA(IFNAR2、IFNβ)及びウエスタンブロットゲル用に細胞上清を集めた。
【0090】
RNA抽出及びノーザンブロット分析. 一過性トランスフェクトされたCHO−DUKX細胞より全細胞RNA(Chomczynskiら、1987)を抽出した。レーン当たり10gの全RNAgを変性剤としてフォルムアルデヒドを含むアガロースゲル中に分子量分画した。サンプルは二重に分画にかけた。RNAは10×SSC(1.5M塩化ナトリウム、0.15Mクエン酸ナトリウム)中、キャピラリーブロット法によってGeneScreen Plusナイロン膜(DuPont/NEM Medical Products;Boston、MA)に移した。固定されたRNAをChurchとGilbert(1984)の液を改良液中に32P標識hIFNAR2及びhIFNβPCR断片とハイブリダイズさせた。緩衝液は0.25Mリン酸ナトリウム、pH7.2、0.25M塩化ナトリウム、7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、1mMエチレンジアミンテトラ酢酸及び100μg/mlのE.colitRNAを含んだ。32P−標識プローブは、市販キット(”HIgh Prime”Boehringer Mannheim;Indianapolis,IN)及び、キット中に記載のプロトコールを利用し作製された。非取り込み放射活性はSephadexG−50カラムによるクロマトグラフィーで除去した。ハイブリダイゼーション後、ブロットを洗浄した;使用した最もストリンジェントな条件は65℃、0.2×SSC,0.1%SDSであった。ブロットはオートラジオグラフィーにかけた。
融合蛋白質の発現.
各融合構築体を一過性にトランスフェクトされたCHO細胞の上清について、IFNAR2及びIFN発現レベルをそれぞれIFNAR2特異的ELISA及びIFNβELISA(Toray)を用いて分析した。分析結果は下記表IVに示す。
【0091】
【表4】
【0092】
上記の如く、リンカーの長さを長くするほど検出可能なIFNAR2及びIFNβの減少が観察された。この時点では、これがリンカーの長さが増加することによる発現融合蛋白質量の減少によるものであるか、又はリンカーの長さが長くなったことにりIFNβがIFNAR2結合部位に結合でき、その結果ELISAアッセイによって完全に検出できなくなった事によるか決定することは不可能である。IFNβアッセイが非複合体化IFNβのみ検出することが知られている。
【0093】
IFNAR2/IFNβ融合蛋白質のウエスタンブロット分析.
融合蛋白質が適当な分子量で発現され、又遊離型IFNβは発現されないことを確認するために、トランスフェクトされた細胞の上清を抗IFNβ抗体を用いたウエスタンブロットで分析し、融合体を検出した。この分析の結果は図13に示す。
【0094】
IFNAR2/IFNβ構築体(レーン1−6)又はIFNAR2構築体(レーン7)で一過性にトランスフェクトしたCHO細胞の培養上清、培地(レーン8)又はIFNβ(レーン9)15μlを非還元条件下にSDS−PAGEにかけた後、PVDF膜に電気転写した。膜をウサギ抗IFNβ抗体でプローブし、Western−Star化学発光検出キットを用い、アルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗ウサギ抗体で発光した。
【0095】
いずれの融合構築体の上清についても遊離型IFNβは検出されなかった。同様に各構築体は、各融合体構築体についてウエスタンブロットによりそのMWが適当であった蛋白質を発現した。
実施例10
融合分子の抗ウイルス活性.各融合体を含む培養上清について、WISH細胞(ヒト羊膜細胞)がIFNβ(コントロール)又は融合体添加後にVSVにさらされる細胞変性アッセイにて抗ウイルス活性を試験した。結果は図14に示す。
【0096】
発現された組換え体蛋白質を含む(ELISA及びウエスタンブロットで検出される)CHO細胞上清、またはCHO培養培地のみを二重形式で96ウエル型平底組織培養プレートの最上列に75μl/ウエルづつ加えた。プレートの残りのウエルには50μlのWISH細胞アッセイ培地を加えた。上清を含むウエル(最上列)から25μlを取り、50μlのWISHアッセイ培地を含む次の列のウエルに加え、各サンプルについて3倍希釈列を作製した。陽性コントロールのウエルには、最上列上清の代わりに1000IU/mlのヒト型IFNβを含むWISHアッセイ培地を加え、同様にしてプレート長に沿って3倍希釈系列を作製した。続いて各ウエルにWISH細胞上清50μl(WISHアッセイ培地中0.6×106細胞/ml)を加えたため、REBIFを含む最上列の最終濃度は500IU/mlとなり、CHO細胞上清の出発希釈は1:2である。5%CO2、37℃で24時間培養した後、各ウエル(未感染コントロールウエルに割り当てられたものを除き)に水疱性口内炎ウイルスを含むWISHアッセイ培地(保存液の1:10)50μlを加えた。さらに48時間培養したのち、MTT転換によりWISH細胞の生存率を測定した。
【0097】
融合分子を介した抗ウイルス活性は、EC50が精製されたヒト型IFNβ標準物質について測定されたEC50になるのに必要とされた上清の希釈係数で標準化して求めた。リンカーの長さが長くなるほど、融合構築体の抗ウイルス活性は大きくなった。
実施例11
本実施例は静脈投与されたマウスに於けるヒトIFNβ/sIFNAR2複合体の薬物動態研究である。複合体成分の注射及び、別々の注射について比較した。36匹のD2F1株マウス(6−8週齢)(それぞれおよそ20g)を以下4群に分けた:
グループ1には、50,000IU/mlのヒト型IFNβ溶液200μlを単回投与剤として静脈注射された9匹のマウスを含む(最終投与量10,000IU/マウス)。
【0098】
グループ2には、5,000IU/mlのヒト型IFNβ及び125mg/mlのsIFNAR2の溶液(2.5ng/IU比)200μlを投与されたマウス(9匹)を含む。
【0099】
グループ3は、(1)125mg/mlの液200μl、続いて(2)5,000IU/mlのヒト型IFNβの液200ml(2.5ng/IU比)を投与された(マウス9匹)。
【0100】
グループ4は、(1)625mg/mlの液200μl、続いて(2)5,000IU/mlのヒト型IFNβの液200ml(10ng/IU比)を投与された(マウス9匹)。
【0101】
血液サンプル(およそ200μl/サンプル)を定められた時間に、キャピラリーチューブを使い尾静脈より採取した。各グループ3匹のマウスから、投与後0.05、2及び12時間後に血液サンプルを得た。各グループ3匹のマウスから、投与後0.54及び24時間後に血液サンプルを得、又各グループ3匹のマウスからは投与後1、8及び48時間後に血液サンプルを得た。血液サンプルは約1時間室温に放置し、凝固させ、遠心分離した。それより取り出した血清は、全てのサンプルが採取されるまで−70℃に保管された。血清は、Torayヒト型IFNβELISAキット(TFB,Inc,)を利用し、IFNβ特異的ELISAによりヒト型IFNβの存在についてアッセイし、WISH抗ウイルスアッセイを利用して生物活性をアッセイした。
【0102】
IFNβ特異的ELISAの結果は図15Aに示し、WISH抗ウイルスアッセイの結果は図16Bに示す。
【0103】
IFNAR2複合体として注射されたIFNβの血清半減期は、IFNARを別注射した後に注射されたIFNβのそれに近似していた。これらの結果は、IFNβ/IFNAR2複合体のインビボ形成に伴う半減期の延長と合致した。
実施例12
C57BL/6マウスを”共通”IFN(ヒト型IFNαA/D)及びsIFNAR2の複合体で処理した。各種投与量の共通IFN単独、またはコントロール投与例と比較し、細胞毒性としての防御作用を測定した。第1グループは、5×103IUの共通IFNの投薬を5/ng IUのsIFNAR2と組み合わせ受けた。第2グループは、5×103IUの共通IFNの投薬を受けた。第3グループは5×104IUの共通IFNの投薬を、第4グループはPBS/2%NMSの投薬を受けた。これらマウスそれぞれについて、NK標的細胞YAC−1に対知る脾臓細胞の細胞毒性としてNK活性を測定した。結果は図16に示した。NK活性は、共通IFNのみで処理されたマウスに比べ、共通IFN/sIFNAR2複合体で処理したマウスで有意に増加した
実施例13
上記の如く、薬物動態研究よりIFNレセプターサブユニットの可溶型であるsIFNAR2と複合して投与すると、I型IFNsの血清半減期は劇的に延長することが示された。インビトロの結果は、IFNAR2との物理的不随が通常不安定なIFNを安定化させることを示唆している。IFNAR2の増強されたPKプロフィールと安定化作用がインビボに於けるIFN介在作用の増強と延長をもたらすのか調べるために、重症の複合免疫不全(scid/scid)マウスに致死量のIFN感受性DudiヒトB細胞リンパ腫細胞株を接種するモデルが開発された(Ghetie,1991;Ghetie,1991)。これらマウスは腫瘍細胞注射後14−20日後に拡散したリンパ腫細胞の組織像を伴う麻痺を発症した。毎日ヒト型IFNβを皮下投与すると、明らかに用量依存的にこれらマウスの生存日数が延長された。このモデルをインビボに於ける1型IFNs関連生物活性の増強因子としてIFNAR2を評価するのに利用した。
【0104】
Daudi scidモデルに於ける麻痺発症までの平均時間とIFNβの投与量との関連性を確立するために、4−5週齢、メスのBALB/cByJSmn−scid/scid株マウス5匹よりなる5グループに0日から30日まで毎日ヒト型IFNβを200μl/マウス/日の割合で皮下投与した。凍結保存体より拡張したDudi細胞の標準投与量、5×106細胞/マウスをPBSの形でマウスの首筋に皮下注射した。各グループのマウスは以下の量のIFNを投与された。
グループ1:135×104IU/マウス(675×104IU/ml)
グループ2:45×104IU/マウス(225×104IU/ml)
グループ3:15×104IU/マウス(75×104IU/ml)
グループ4:5×104IU/マウス(25×104IU/ml)
グループ5:2%NMS入りPBS
個別の麻痺に至る時間及びその平均値を表Vに示す。
【0105】
【表5】
即ち、Daudi/scid外殖体モデルでは、麻痺発症までの時間は毎日ヒト型IFNβを皮下注射することで用量依存的に延長されることが示された。
実施例14
IFNβの抗ガン作用が2.5ng/IUのIFNAR2と複合化することで増強できるか調べるために、各グループに対する試験物質量が以下であることを除き実施例13記載のプロトコールに同一なプロトコールで、5匹、7グループのマウスを処理した。
【0106】
個別の麻痺に至る時間及びその平均値を下表に示す。
【0107】
【表6】
*1方向ANOVAによる測定によるペア形式のグループ間比較において、非複合化形式の同一濃度IFNβに比べて統計有意(p値≦0.05)。
【0108】
低用量のIFNβ2×104IU/マウス/日及びDaudi/scid外殖体モデルの抗ガン活性は、IFNAR2と複合化することで有意に増強されることが分かる。
【0109】
追加実験(データ未提示)にて平均麻痺発症時間に及ぼす注射の効果を調べた。Daudi/scid外殖体モデルでは、IFNβ/IFNARG2複合体により処置した場合、注射が週1回の如く低頻度でも遊離型IFNβを1日1回の様に頻繁に注射した場合に比べ有意に増強された抗ガン活性が得られることが判明した。更に、追加実験に於いて(データ未提示)、IFNAR対IFNβ最適比を調べた。単独のIFNβ濃度(2×104/IU/マウス/日)での抗ガン活性増強に関するIFNAR2:IFNβの最適比率は2.5ngIFNAR2/pgIFNβであることが見いだされた。
【0110】
第2実験では、IFNβの濃度が5×104/IU/マウス/日の場合、抗ガン活性増強に於けるIFNAR2:IFNβの最適比率は0.3ngIFNAR2/pgIFNβであることが見いだされた。これら2つの実験より、最適比率はIFNβ濃度に依存し、IFNβ濃度が高いと、必要とされる比率は低くなる様に思える。
【0111】
同一モデルを利用した別の実験に於いて、IFNAR2単独投与は研究中おマウスの生存率を上げないことが判明した。
実施例15
本実施例は単回大量静脈注射されたマウスに於ける、融合体5GSの血清半減期を調べるための薬物動態研究である。21匹のB6D2F1株マウス(6−8週齢)(それぞれおよそ20g)を以下3グループに分けた:
グループ1:100,000IU/mlの融合体5GS溶液200μlを単回大量静脈投与された9匹のマウスを含む(最終投与量20,000IU/マウス又は5×106IU/kg)。
【0112】
グループ2:(マウス9匹)100,000IU/mlのヒト型IFNβ溶液200μlを投与。
【0113】
グループ3:陰性コントロールとす未注射マウス3匹を含む。
およそ血液量を2ml/マウスと仮定すると、理論上のCmax及びTmaxはグループ1及び2については10,000IU/mlである。グループ1及び2それぞれのマウス3匹から投与0.05、2及び12時間後に血液を採取した。グループ1及び2それぞれのマウス3匹から投与0.5、4及び24時間後に血液を採取し、グループ1及び2それぞれのマウス3匹から投与1、8及び48時間後に血液を採取した。血清をWISHアッセイを利用して、生物活性ヒト型IFNβの存在について調べた。
【0114】
結果は図17に示す。TFNβはほぼ即時的に排除されたのに対し、融合対分子は注射後も長期間血清に留まった。このことは、融合蛋白質は所望の安定化作用を持つことを示す。
【0115】
具体的実施例の前記内容は本発明の一般的性質を表したものでり、現在の知識を適用することで、特段の実験なしに、また一般的なコンセプトから逸脱することなしに、各種応用を目的としてこれら具体的実施態様を改良し、及び/又は適用することが可能であり、従ってこれら適用及び改良は開示された実施態様の趣旨及び等価の範囲内に包含されるべきであり、又包含されるものである。ここに使用された語句、または命名法は記述を目的とするものであり、限定を目的としたものではない。開示された各種機能を実施するための手段、材料及び工程は、本発明から逸脱することなしに様々な別の形を取ってよい。換言すれば、”する方法”及び”するための方法”または上記明細書中、及び/又は以下クレーム中に認められる方法工程を表す、機能表現を伴ういずれの語も、上記明細書に開示された実施態様に正確に等価であるか否かに関わらず、即ち同一機能を実施するために利用可能なその他の方法又は工程を問わず、引用された機能を実施する為の現存、または将来存在するであろういずれかの構造的、物理的、化学的又は電気的要素、又は構造、あるいはいずれかの方法工程を、規定し、包含することを意図するものである;又これら表現は広義に解釈されることを意図している。
文献
【0116】
【表7】
【0117】
【表8】
【0118】
【表9】
【0119】
【表10】
【図面の簡単な説明】
本発明は以下の図面と結びつけることでより良く理解される。
【図1】 図1はIFNβ存在下に於けるsIFNAR2又はIFNAR2Ig(ヒトIgG1ヒンジ、CH2及びCH3ドメインと融合したhIFNAR2の細胞外ドメインより構成される)の容量依存的な抗ウイルス活性を示す。
【図2】 図2は準最適用量のIFNβに於けるsIFNAR2及びIFNβの抗ウイルス活性を示す図である。1時間の前インキュベーション後に、中間的IFNβ用量に於いてIFNβ及びsIFNR2の相乗的抗ウイルス活性が認められる。
【図3】 図4は、前インキュベーション時間の関数として表したsIFNAR2及び準有効量のIFNβ(0.95IU/ml)の抗ウイルス活性を示す図である。WISH細胞をIFNβ(0.95IU/ml準有効量)とsIFNAR2に曝し、続いて表示された時間前インキュベーションした。相乗的抗ウイルス活性は前インキュベーション4時間以後にのみ観察された。抗ウイルス活性はVSVチャレンジ48時間後のMTT変換により測定された。IFNβの準治療レベルでは、IFNAR2/IFN複合体の形成により抗ウイルス活性は増強された。
【図4】 図4はsIFNAR2と前インキュベーション後の、ヒト型IFNβの増強抗ウイルス活性を示す図である。
【図5】 図5は、sIFNARに関連したヒト型IFNβの抗ウイルス活性がIFNAR2に特異的であり、他の蛋白質には特異性を持たないことを示す図である。
【図6】 図6は、ELISAで測定されたマウスに於けるヒト型IFNβ、及びIFNβ/IFNAR2複合体の薬力作用の比較を示す図である。
【図7】 図7は、バイオアッセイで測定されたマウスに於けるヒト型IFNβ、及びIFNβ/IFNAR2複合体の薬力作用の比較を示す図である。
【図8】 図8は、ELISAで測定されたマウスに於けるヒト型IFNα、及びIFNα/IFNAR2複合体の薬力作用の比較を示す図である。
【図9】 図9は、バイオアッセイで測定されたマウスに於けるヒト型IFNα、及びIFNα/IFNAR2複合体の薬力作用の比較を示す図である。
【図10】 図10は、n=2のIFNAR2/IFNβ融合蛋白質(配列番号14)のアミノ酸配列を示す、(GGGGS)2(配列番号14の残基240−249)リンカーには下線を付けた。
【図11】 図11はpCMV−IFNAR2/IFNβの制限酵素分析を示すゲルである;10%PAG、レーン3−7:BamHI/XhoI消化;レーン2:SamI/XhoI消化;レーン1;pBR322DNA−MspI消化マーカー;レーン2;pCMV−IFNAR2/IFNβ、0GS;レーン3:1GS;レーン4:2GS;レーン5:3GS;レーン6:4GS;レーン7:5GS;レーン8:φX174 RFDNA HaeIII消化マーカー。
【図12】 図12は、IFNAR2/IFNβ発現ベクターの制限エンドヌクレアーゼマップである。
【図13】 図13は、IFNAR2/IFNβ融合蛋白質のウエスタンブロット分析である。レーン1,リンカーを含まないIFNAR2/IFNβ構築体;レーン2、1Gly4Ser(配列番号1)リンカーを含むIFNAR2/IFNβ構築体;レーン3、2Gly4Ser(配列番号1)リンカーを含むIFNAR2/IFNβ構築体;レーン4、3Gly4Ser(配列番号1)リンカーを含むIFNAR2/IFNβ構築体;レーン5、4Gly4Ser(配列番号1)リンカーを含むIFNAR2/IFNβ構築体;レーン6、5Gly4Ser(配列番号1)リンカーを含むIFNAR2/IFNβ構築体。
【図14】 図14は、CHO細胞上清中のCHO内に発現され、IFNβの標準活性にて基準化した混合分子の抗ウイルス活性を示す図である。
【図15】 図15A−Bは、IFNAR2の静脈内注射後に投与されたIFNβの薬物動態を示す図。IFNβはIFNAR複合体として単独投与され、あるいはsIFNAR2を別にI.V.注射した直後に注射された。血清半減期は、IFNβ特異的ELISA(15A)、及びWISH抗ウイルスアッセイでの生物活性として(図15B)注射後の指定時間に測定された。
【図16】 図16は、汎用IFNを単独投与との、またはコントロールと比較し細胞毒性%で表した場合の、sIFNAR2と複合体形成した”汎用”IFN(ヒト型IFNαA/D)の複合体の各種投与量に於ける保護作用を示す図。
【図17】 図17は、混合体GS5又はhIFNβを単独で単回静脈注射した後の、IFNβの血清濃度の時間経過を示す。
【配列表】
Claims (10)
- I型IFN治療を必要とするヒト以外の動物に対し、I型IFNと、複合体のI型IFNと結合可能なヒトインターフェロンα/βレセプターのIFNAR2サブユニットの可溶性細胞外ドメインとの複合体を、そのようなIFN治療を提供するのに有効な量投与することを含む、I型インターフェロン(IFN)のインビボ作用を延長する方法であって、
該I型IFNが以下の配列
a)天然I型IFN;
b)I型IFNの生物活性を持つa)の断片;
c)a)又はb)と少なくとも90%の配列同一性を持ち、かつI型IFN生物活性を持つa)又はb)の変異体;
d)極めてストリンジェントな条件下にa)またはb)をコードする天然DNA配列の相補体とハイブリダイズするDNA配列によりコードされ、I型IFN生物活性を持つa)またはb)の変異体;又は
e)I型IFN生物活性を持つa)、b)、c)又はd)の塩
からなり;かつ
該IFNAR2サブユニットが以下の配列
f)天然のヒトIFNAR2ポリペプチド鎖;
g)IFNAR2生物活性を持つf)の断片、
h)f)又はg)と少なくとも90%の配列同一性を持ち、かつIFNAR2生物活性を持つf)又はg)の変異体;
i)極めて(highly)ストリンジェントな条件下にf)またはg)をコードする天然DNA配列の相補体とハイブリダイズするDNA配列によりコードされ、IFNAR2生物活性を持つf)またはg)の変異体;又は
j)IFNAR2生物活性を持つf)、g)、h)又はi)の塩
からなる、上記方法。 - 複合体がI型IFN及びIFNAR2の非共有結合型複合体を含む、請求項1の方法。
- I型IFN及びIFNAR2が別々に投与され、複合体がインビボで形成される、請求項2の方法。
- 複合体が、I型IFNがIFNAR2と共有結合により結合されている複合体を含む、請求項1の方法。
- 複合体が、I型IFNがIFNAR2とペプチド結合により結合されている融合蛋白質を含む、請求項1の方法。
- I型IFNがIFNAR2とペプチドリンカーの方法により結合された請求項5の方法。
- I型IFNがIFNα、IFNβ又はIFNωである請求項1の方法。
- I型IFNがIFNβである請求項7の方法。
- I型インターフェロン(IFN)及び、複合体のI型IFNと結合可能なヒトインターフェロンα/βレセプターのIFNAR2サブユニットの可溶性細胞外ドメインとの複合体であって、該I型IFNが該IFNAR2に共有結合又はペプチド結合により結合され、
該I型IFNが以下の配列
a)天然I型IFN;
b)I型IFNの生物活性を持つa)の断片;
c)a)又はb)と少なくとも90%の配列同一性を持ち、かつI型IFN生物活性を持つa)又はb)の変異体;
d)極めてストリンジェントな条件下にa)またはb)をコードする天然DNA配列の相補体とハイブリダイズするDNA配列によりコードされ、I型IFN生物活性を持つa)またはb)の変異体;又は
e)I型IFN生物活性を持つa)、b)、c)又はd)の塩
からなり、さらに
該IFNAR2サブユニットが以下の配列
f)天然のヒトIFNAR2ポリペプチド鎖;
g)IFNAR2生物活性を持つf)の断片、
h)f)又はg)と少なくとも90%の配列同一性を持ち、かつIFNAR2生物活性を持つf)又はg)の変異体;
i)極めて(highly)ストリンジェントな条件下にf)またはg)をコードする天然DNA配列の相補体とハイブリダイズするDNA配列によりコードされ、IFNAR2生物活性を持つf)またはg)の変異体;又は
j)IFNAR2生物活性を持つf)、g)、h)又はi)の塩
からなる、上記複合体
の形態であるか、または
IFNがIFNAR2と非共有結合により結合された複合体
の形態でインターフェロンを保存することを含む、I型インターフェロン保存期間改良法。 - 医薬品として許容される担体、及びI型インターフェロン
(IFN)と複合体のI型IFNと結合可能なヒトインターフェロンα/βレセプターのIFNAR2サブユニットの可溶性細胞外ドメインとの複合体を含む医薬品であって、
該I型IFNが以下の配列
a)天然I型IFN;
b)I型IFNの生物活性を持つa)の断片;
c)a)又はb)と少なくとも90%の配列同一性を持ち、かつI型IFN生物活性を持つa)又はb)の変異体;
d)極めて(highly)ストリンジェントな条件下にa)またはb)をコードする天然DNA配列の相補体とハイブリダイズするDNA配列によりコードされ、I型IFN生物活性を持つa)またはb)の変異体;又は
e)I型IFN生物活性を持つa)、b)、c)又はd)の塩
からなり、さらに
該IFNAR2サブユニットが以下の配列
f)天然のヒトIFNAR2ポリペプチド鎖;
g)IFNAR2生物活性を持つf)の断片、
h)f)又はg)と少なくとも90%の配列同一性を持ち、かつIFNAR2生物活性を持つf)又はg)の変異体;
i)極めてストリンジェントな条件下にf)またはg)をコードする天然DNA配列の相補体とハイブリダイズするDNA配列によりコードされ、IFNAR2生物活性を持つf)またはg)の変異体;又は
j)IFNAR2生物活性を持つf)、g)、h)又はi)の塩
からなる、上記医薬品。
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