CN101115769A - 干扰素-α多肽和偶联物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了干扰素－α多肽和偶联物，以及编码这些多肽的核酸。本发明还提供了含有这些多肽、偶联物和核酸的组合物；含有或表达所述多肽、偶联物和核酸的细胞；制备所述多肽、偶联物和核酸的方法；以及所述多肽、偶联物和核酸的使用方法。

Description

干扰素-α多肽和偶联物
相关申请的参考
根据35 U.S.C.§119(e)，本申请要求2004年5月19日提交的美国临时专利申请流水号60/572,504的优先权，所述申请公开的全部内容为所有目的而包含在本文中作为参考。
发明领域
本发明一般地涉及多核苷酸及其编码的多肽，多肽的偶联物，以及载体，细胞，抗体和使用及制备该多核苷酸，多肽和偶联物的方法。
发明背景
干扰素-α是多种细胞因子基因螺旋束超家族的成员(Sprang，S.R.等(1993)Curr.Opin.Struct.Biol.3：815-827)。人干扰素-α由含有20多个串联复制的非等位基因以及假基因的家族编码，这些人干扰素-α在氨基酸水平上有85-98％的序列同一性(Henco，K.等(1985)J.Mol.Biol.185：227-260)。表达活性干扰素-α蛋白质的基因可根据基因座分为13个家族。已知表达的人干扰素-α蛋白质及其等位基因变体公开于Allen G.and Diaz M.O.(1996)J.InterferonAnd Cytokine Res.16：181-184中。
干扰素-α可抑制多种类型的细胞增生，具体可用于治疗多种细胞增生性疾病，这些疾病常常与癌症，具体是血液学恶性疾病诸如白血病相关。这些蛋白质显示出对以下疾病的抗增生活性：多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病、低级淋巴瘤、卡波西肉瘤、慢性髓性白血病、肾细胞癌、尿道膀胱肿瘤和卵巢癌(Bonnem，E.M.等(1984)J.Biol.Response Modifiers 3：580；Oldham，R.K(1985)Hospital Practice 20：71)。
干扰素-α也可用于抗多种类型的病毒感染(Finter，N.B等(1991)Drugs42(5)：749)。干扰素-α还显示出抗人乳头瘤病毒感染，乙肝病毒和丙肝病毒感染的活性(Finter，N.B.等，1991，文献同上；Kashima，H等(1988)Laryngoscope 98：334；Dusheiko，G.M.等(1986)J.Hematology 3(增刊2)：S199；Davis，GL等(1989)N.England J.Med.321：1501)。另外，还研究了干扰素和干扰素受体在一些自身免疫和炎性疾病的发病机理中的作用(Benoit，P.等(1993)J.Immunol.150(3)：707)。
尽管这些蛋白质对多种疾病都有治疗价值，但尚未使它们最优化以用作药物。例如，剂量限制性毒性、受体交叉反应性和短的血清半寿期显著减少了多种此类细胞因子的临床应用(Dusheiko，G.(1997)Hepatology 26：112S-121S；Vial，T.and Descotes，J.(1994)Drug Experience 10：115150；Funke，I.等(1994)Ann.Hematol.68：49-52；Schomburg，A.等(1993)J.Cancer Res.Clin.Oncol.1 19：745-755)。与施用干扰素相伴的多种多样的严重副作用谱(profile)包括流感样症状，疲劳，幻觉，发热，肝酶升高和白细胞减少(Pontzer，C.H.等(1991)Cancer Res.51：5304；Oldham，1985，文献同上)。
丙型肝炎病毒(HCV)是非宿主整合型RNA病毒，其具有非常高的复制率，因此其伴随高度遗传多样性。已经鉴定了HCV RNA的至少六种基因型和超过30种亚型。HCV基因型是IFN-α治疗的预测物。已经发现感染HCV基因型2和3的患者通常对干扰素治疗反应良好。感染基因型4，5和6的患者倾向于反应较差。感染HCV基因型1的患者倾向于对干扰素治疗反应非常差，大约50％的基因型1患者被归类为对IFN-α治疗的“无反应者”。基因型1是丙型肝炎目前最普遍的形式，在美国的感染患者中占大约为70％而在欧洲为50％。很明显，迫切需要对HCV，特别是基因型1种型感染的更有效治疗。
遗传和生物化学证据显示基因型1HCV(和其它亚型)通过抑制关键IFN反应性蛋白质诸如dsRNA活化的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PKR而主动地减弱IFN-α信号通路(Katze M.G.，等，(2002)Nat.Rev.Immunol.2(9)：675-687)。作为该遗传多样性和抗病毒反应的主动抑制的可能结果，HCV(具体是基因型1)具有逃脱宿主免疫监视的能力，这导致高比率的慢性感染。HCV的广泛遗传异质性存在严重的诊断和临床问题，可能导致临床过程的改变，疫苗发展中的困难，以及缺乏对治疗的反应。
本发明说明了对表现增强的抗病毒和/或免疫调节效力的干扰素-α分子的需要。本发明提供了新的干扰素-α多肽和多肽偶联物，编码所述多肽的核酸，和使用所述分子的方法。所述分子将在多种应用中有益，包括例如，治疗性和预防性处理，具体是针对病毒感染以及与病毒感染有关的疾病。
本发明满足这些及其它需要。
发明简述
本发明提供了新的多肽，包括其变体和含有所述多肽的融合蛋白。本发明还提供了包含本发明多肽的偶联物，所述多肽与一个或多个非多肽部分共价连接。本发明还提供了编码本发明任何多肽的核酸，以及包含所述核酸的载体和宿主细胞。此外，本发明提供了制备和使用所述多肽、偶联物和核酸的方法，以及根据进一步描述而显而易见的其它特征。
一方面，本发明提供了分离的或重组的多肽，该多肽包含被鉴定为SEQID NO：2-35和SEQ ID NO：37-44之一的序列(诸如SEQ ID NO：2，SEQ IDNO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ IDNO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ IDNO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQID NO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ IDNO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：31，SEQID NO：32，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：41，SEQ IDNO：42，SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44之一)。本发明还提供了含有上述任何一种多肽的融合蛋白和偶联物，编码所述多肽的核酸以及制备和使用所述多肽的方法。
本发明还提供了分离的或重组的多肽，其各包含这样的序列，所述序列(a)与SEQ ID NO：1在1-16个氨基酸位置中不同，并且(b)相对于SEQ IDNO：1而言，含有选自下列的一个或多个取代：F48A/L；V5 1P；F5 5A；F65A；F68P；L111A和V114P。一些这样的多肽含有与SEQ ID NO：1在1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或16个氨基酸位置中不同的序列，例如在1-15个氨基酸位置，1-14个氨基酸位置，1-13个氨基酸位置，1-12个氨基酸位置，1-11个氨基酸位置，1-10个氨基酸位置，1-9个氨基酸位置，1-8个氨基酸位置，1-7个氨基酸位置，1-6个氨基酸位置，1-5个氨基酸位置，1-4个氨基酸位置，1-3个氨基酸位置或1-2个氨基酸位置中不同的序列。在一些情况下，该多肽相对于SEQ ID NO：1而言，还含有选自下列的一个或多个取代：H47Q；V51A；Q52P/E；A53T；F55S；L56V；F57L；Y58H；M61I；N113K；V114E和E160D。在一些情况下，该多肽表现出干扰素-α活性(诸如抗病毒活性，TH1分化活性和/或抗增殖活性)。本发明还提供了含有上述任何一种多肽的融合蛋白和偶联物，编码所述多肽的核酸以及制备和使用所述多肽的方法。
本发明还提供了分离的或重组的多肽，其各包含这样的序列，所述序列(a)与SEQ ID NO：13在0-16个氨基酸位置中不同，并且(b)含有下述氨基酸中的一个或多个：第48位的Ala或Leu；第5 1位的Pro；第55位的Ala；第65位的Ala；第68位的Pro；第111位的Ala和第114位的Pro(相对于SEQ ID NO：13的位置编号)。一些这样的多肽含有与SEQ ID NO：13在0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或16个氨基酸位置中不同的序列，例如在0-15个氨基酸位置，0-14个氨基酸位置，0-13个氨基酸位置，0-12个氨基酸位置，0-11个氨基酸位置，0-10个氨基酸位置，0-9个氨基酸位置，0-8个氨基酸位置，0-7个氨基酸位置，0-6个氨基酸位置，0-5个氨基酸位置，0-4个氨基酸位置，0-3个氨基酸位置，0-2个氨基酸位置或0-1个氨基酸位置中不同的序列。一些这样的多肽在第48位含有Ala或Leu。一些这样的多肽在第48位含有Ala。在一些情况下，该多肽相对于SEQ ID NO：13而言，还含有选自下列的一个或多个取代：H47Q；V51A；Q52P/E；A53T；F55S；L56V；F57L；Y58H；M61I；N113K；V114E和E160D。在一些情况下，该多肽表现出干扰素-α活性(诸如抗病毒活性，TH1分化活性和/或抗增殖活性)。一些这样的多肽还含有一个或多个其它的氨基酸，例如添加至N-末端的甲硫氨酸。本发明还提供了含有所述多肽的融合蛋白和偶联物，以及编码所述多肽的分离或重组的核酸。
本发明还提供了分离的或重组的多肽，其各包含这样的序列，所述序列(a)与SEQ ID NO：36在1-16个氨基酸位置中不同，并且(b)相对于SEQ IDNO：36而言，含有选自下列的一个或多个取代：M21A；I24P；F48A/L；T51P；S55A；F65A；F68P；F90A；M93P；L111A；V114P；F124A；I127P和E160D。一些这样的多肽含有与SEQ ID NO：36在1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或16个氨基酸位置中不同的序列，例如在1-15个氨基酸位置，1-14个氨基酸位置，1-13个氨基酸位置，1-12个氨基酸位置，1-11个氨基酸位置，1-10个氨基酸位置，1-9个氨基酸位置，1-8个氨基酸位置，1-7个氨基酸位置，1-6个氨基酸位置，1-5个氨基酸位置，1-4个氨基酸位置，1-3个氨基酸位置或1-2个氨基酸位置中不同的序列。在一些情况下，该多肽相对于SEQ ID NO：36而言，还含有选自下列的一个或多个取代：P26L；H47Q；T5 1V；S55P/F；V56L；H58Y；L60M；F90Y；M93L；N95D；N113K；V114E；R125Q；T132K和L154F。在一些情况下，该多肽表现出干扰素-α活性(诸如抗病毒活性，TH1分化活性和/或抗增殖活性)。本发明还提供了含有上述任何一种多肽的融合蛋白和偶联物，编码所述多肽的核酸以及制备和使用所述多肽的方法。
本发明还提供了分离的或重组的多肽，其各包含这样的序列，所述序列(a)与SEQ ID NO：38在0-16个氨基酸位置中不同，并且(b)含有下述氨基酸中的一个或多个：第21位的Ala；第24位的Pro；第48位的Ala或Leu；第5 1位的Pro；第55位的Ala；第65位的Ala；第68位的Pro；第90位的Ala；第93位的Pro；第111位的Ala；第114位的Pro；第124位的Ala；第127位的Pro；和第160位的Glu(相对于SEQ ID NO：38的位置编号)。一些这样的多肽含有与SEQ ID NO：38在0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或16个氨基酸位置中不同的序列，例如在0-15个氨基酸位置，0-14个氨基酸位置，0-13个氨基酸位置，0-12个氨基酸位置，0-11个氨基酸位置，0-10个氨基酸位置，0-9个氨基酸位置，0-8个氨基酸位置，0-7个氨基酸位置，0-6个氨基酸位置，0-5个氨基酸位置，0-4个氨基酸位置，0-3个氨基酸位置，0-2个氨基酸位置或0-1个氨基酸位置中不同的序列。一些这样的多肽在第48位含有Ala或Leu。一些这样的多肽在第48位含有Ala。在一些情况下，该多肽相对于SEQ ID NO：38而言，还含有选自下列的一个或多个取代：P26L；H47Q；V51T；F55P/S；L56V；Y58H；L60M；F90Y；M93L；N95D；N113K；V114E；R125Q；T132K和F154L。在一些情况下，该多肽表现出干扰素-α活性(诸如抗病毒活性，TH1分化活性和/或抗增殖活性)。一些这样的多肽还含有一个或多个其它的氨基酸，例如添加至N-末端的甲硫氨酸。本发明还提供了含有所述多肽的融合蛋白和偶联物，编码所述多肽的核酸以及制备和使用所述多肽的方法。
本发明还提供了偶联物，其包含本发明的多肽，诸如上述任何本发明的多肽以及至少一种与所述多肽的连接基团相连接的非多肽部分，其中所述偶联物表现出干扰素-α活性。在一些情况下，非多肽部分是聚合物(诸如聚环氧烷分子，如聚乙二醇(PEG)，如单甲氧基聚乙二醇(mPEG))，或糖部分。例如，所述至少一种非多肽部分可与半胱氨酸、赖氨酸、所述多肽的N-末端氨基或所述多肽的体内糖基化位点连接。本发明还提供了制备和使用所述偶联物的方法。
本发明还提供了分离的或重组的核酸，该核酸编码本发明的任何多肽。本发明还提供了包含所述核酸的载体和宿主细胞，以及制备本发明多肽的方法，所述方法包括培养含有所述核酸的宿主细胞。
另一方面，本发明提供了抑制感染了病毒的细胞中的病毒复制的方法，该方法包括将感染了病毒的细胞与本发明的多肽或偶联物相接触。本发明还提供了降低感染了病毒的细胞中的病毒拷贝数量的方法，该方法包括将感染了病毒的细胞与本发明的多肽或偶联物相接触。
另一方面，本发明提供了治疗对干扰素-α有反应的疾病的方法，所述方法包括给受疾病折磨的受试者施用有效量的能缓解疾病相关症状的组合物，所述组合物含有本发明的多肽或本发明的偶联物。所述疾病包括慢性丙型肝炎感染、慢性乙型肝炎感染、多毛细胞白血病、恶性黑素瘤、滤泡性淋巴瘤、尖锐湿疣、与AIDS-相关的卡波西肉瘤、非何杰金氏淋巴瘤、慢性髓性白血病、基细胞癌、多发性骨髓瘤、类癌瘤、膀胱癌、节段性回肠炎、皮肤T细胞淋巴瘤、肾细胞癌、多发性硬化和AIDS。
以下详细的描述联同附图将更为清楚地显示本发明的这些以及其它目的和特征。
附图说明
图1A和1B显示了IFN-α治疗后感染了HCV的细胞的病毒清除二相时程(biphasic timecourse)(A.无反应者(Nonresponder)动力学；B.反应者(responder)动力学)。
图2显示了本发明多肽的序列(SEQ ID NO：13)与以下人干扰素-α(huIFN-α)多肽序列的比对：huIFN-α1a(SEQ ID NO：45)，huIFN-α2b(SEQ IDNO：46)，huIFN-α4b(SEQ ID NO：48)，huIFN-α5(SEQ ID NO：49)，huIFN-α6(SEQ ID NO：50)，huIFN-α7(SEQ ID NO：51)，huIFN-α8b(SEQ ID NO：52)，huIFN-α10a(SEQ ID NO：53)，huIFN-α14a(SEQ ID NO：54)，huIFN-αl6(SEQID NO：55)，huIFN-α17b(SEQ ID NO：56)和huIFN-α21b(SEQ ID NO：57)。huIFN-α序列的命名原则参照Allen G.和Diaz M.O.(1996)J.Interferon andCytokine Res.16：181-184。SEQ ID NO：45-46和48-57中与SEQ ID NO：13相同的氨基酸残基位置用点(.)标示，而序列中的缺口用短线(-)标示。
图3显示了本发明多肽的序列(SEQ ID NO：38)与人干扰素-α多肽序列SEQ ID NO：45-46和48-57的比对。SEQ ID NO：45-46和48-57中与SEQ IDNO：38相同的氨基酸残基位置用点(.)标示，而序列中的缺口用短线(-)标示。
图4显示了BLOSUM62取代矩阵。
图5A，5B和5C显示了计算用于测定最佳序列比对的比对评分实例，其中采用如下参数：BLOSUM62矩阵，缺口开放罚分＝11，缺口延伸罚分＝1。
图6和7显示了分别被称为OripBR-URA3-lacI_14epi18-mut2和OripBR-URA3-lacI_25epi19-mut的大肠杆菌表达载体。
图8显示了经由阳离子交换HPLC分离例举的PEG化干扰素-α偶联物的位置异构体。
图9显示了图8阳离子交换HPLC分离级分的SDS PAGE凝胶。
发明详述
定义
除非本说明书其余部分的上下文中另有定义，本文所用的所有技术和科学术语都与本发明所属领域的普通技术人员一般理解的含义相同。
根据上下文，“多肽序列”(例如蛋白质，多肽，肽等)是氨基酸的聚合物，其中包含天然的氨基酸或人工氨基酸类似物，或代表氨基酸聚合物的字符串。根据遗传密码的简并性，编码具体多肽序列的一种或多种核酸，或其互补核酸可从该多肽序列来确定。
根据上下文，“多核苷酸序列”(例如，核酸，多核苷酸，寡核苷酸等)是核苷酸的聚合物，其中包含核苷酸A，C，T，U，G，或者是其它天然核苷酸或人工核苷酸类似物，或代表核酸的字符串。由任何具体的多核苷酸序列可确定给定的核酸或其互补核酸。
当任何给定聚合物组分(如氨基酸，核苷酸，也在类属上称为“残基”)的位置通过参照选定氨基酸或核酸聚合物中的相同或等效位置，而不是给定聚合物中的组分的实际编号位置来命名时，给定氨基酸聚合物或核苷酸聚合物的编号“相应于”或“对应于”选定氨基酸聚合物或核酸聚合物的编号。因此，例如给定多肽序列中给定位置氨基酸的编号对应于用作参照序列的选定多肽序列中的相同或等效氨基酸位置。
“等效位置(equivalent position)”(例如，“等效氨基酸位置”或“等效核酸位置”或“等效残基位置”)在本文中被定义为受试多肽(或受试多核苷酸)序列中的位置(诸如，氨基酸位置或核酸位置或残基位置)，当采用本文所述的比对算法进行最佳比对时，其与参照多肽(或参照多核苷酸)序列的相应位置相对应。受试多肽的等效氨基酸位置无须具有与参照多肽的相应位置相同的位置编号；类似地，受试多核苷酸的等效核酸位置无须具有与参照多核苷酸的相应位置相同的位置编号。作为实例，图2显示了与多种已知人干扰素-α多肽序列最佳对应的本发明多肽的序列(SEQ ID NO：13)。在该实例中，SEQ ID NO：13的氨基酸位置48被认为是SEQ ID NO：46(huIFN-α2b)的氨基酸位置47的等效氨基酸位置(即“与其等效”)，因为SEQ ID NO：13的第48位氨基酸与SEQ ID NO：46的第47位氨基酸相对应。换言之，SEQID NO：13的第48位氨基酸“对应于”SEQ ID NO：46的第47位氨基酸。类似地，SEQ ID NO：13中的残基A48(Ala48)被认为对应于例如SEQ ID NO：1中的残基F48(Phe48)，由此例如相对于SEQ ID NO：13的取代A48L被认为对应于相对于例如，SEQ ID NO：1中的取代F48L(等等)。
当使用限定的参数，即限定的氨基酸取代矩阵、缺口存在罚分(也被称为缺口开放罚分)和缺口延伸罚分比对两个多肽序列，以至于达到序列配对所可能达到的最高相似性评分时，即可认为这两个序列被“最佳比对”。在多肽序列比对算法(如BLASTP)中，BLOSUM62矩阵(Henikoffand Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(22)：10915-10919)常被用作缺省评分取代矩阵。在一个被比对的序列中导入单个氨基酸缺口应加上缺口存在罚分，缺口中的每个残基位置都要加上缺口延伸罚分。除非另有说明，本文所用的比对参数是：BLOSUM62评分矩阵、缺口存在罚分＝11和缺口延伸罚分＝1。比对评分由每个序列中比对开始和结束处的氨基酸位置(例如比对窗口)限定，任选由一个或两个序列中一个或多个缺口的插入限定，以至于达到可能的最高相似性评分，下文题为“序列同一性百分比”的小节中将对此进行更详细的描述。
用于鉴定氨基酸位置和氨基酸取代的命名方法描述如下：F48表示参照氨基酸序列例如SEQ ID NO：1中第48位被苯丙氨酸(Phe)残基占据。F48A表示第48位苯丙氨酸残基被丙氨酸(Ala)残基取代。可选的取代用“/”表示，例如，F48A/L是指这样的氨基酸序列，其中第48位的苯丙氨酸残基被丙氨酸或亮氨酸残基取代。多重取代有时可用“+”表示，例如H47Q+F48A/L是指这样的氨基酸序列，其中包含第47位组氨酸残基被谷氨酰胺残基取代以及第48位的苯丙氨酸残基被丙氨酸或亮氨酸残基取代。缺失用星号表示，例如，H47*表示第47位组氨酸残基缺失。两个或多个连续氨基酸的缺失可如下表示，例如，R161*-E166*表示残基R161-E166包含性(inclusive)缺失(即，残基161，162，163，164，164和166缺失)。插入按如下方式表示：将在第47位组氨酸残基后其它丝氨酸残基的插入表示为H47HS。联合取代和插入按如下方式表示：第47位组氨酸残基被丝氨酸残基的取代且第47位氨基酸残基后丙氨酸残基的插入表示为H47SA。
除非另有所述，本文所述氨基酸残基的位置编号均相对于氨基酸序列SEQ ID NO：1。应当理解虽然亲本多肽的实例和修饰通常在本文中相对序列SEQ ID NO：1(或相对于其它具体序列)给出，关于本文所述本发明的其它多肽的实例和修饰可在本文所述任何其它多肽的等效氨基酸位置中进行。因此，例如相对于SEQ ID NO：1的取代F48L被认为对应于SEQ ID NO：13中的取代A48L，等等。
术语“表现出(例如表现或具有)干扰素-α活性”意指本发明的多肽或偶联物具有至少一种由参照干扰素-α多肽(诸如人干扰素-α多肽，例如，在本文中鉴定为SEQ ID NO：46的huIFN-α2b，在本文中鉴定为SEQ ID NO：47的huIFN-α 2a，在本文中鉴定为SEQ ID NO：51的hIFN-α8b，或本领域中已知的任何其它干扰素α多肽，例如，Allen G.和Diaz M.O.(1996，文献同上)所列的那些多肽)表现出的活性。所述活性包括通过干扰素-α受体产生信号的能力，如，例如以下一或多种活性所证明的：抑制感染了病毒的细胞中的病毒复制(“抗病毒活性”)；增强初始T细胞至TH1表型的分化和/或抑制初始T细胞至TH2表型的分化(“TH1分化活性”)；或抑制细胞增殖(“抗增殖活性”)。一种或多种干扰素-α活性可采用本领域已知的和/或实施例中所述的测定法进行测定。
表现出干扰素-α活性的多肽或偶联物被认为当其显示可检测活性(例如，可检测的抗病毒活性，抗增殖活性，或TH1分化活性)时其具有所述活性(例如，如本领域已知的和/或实施例中所述的测定法所测定的)。本领域技术人员应能理解可检测活性的构成依赖于采取的测定法的特性，但作为一般指导，可检测的活性是这样的活性，其中在存在受试化合物(例如，本发明的多肽)时产生的测定信号的定量与不存在该受试化合物时产生的测定信号的定量不同。应当理解本发明的多肽或偶联物无须表现出具体参照干扰素-α的所有已知活性，或表现出与参照干扰素-α相同程度的活性。在一些情况下，本发明的多肽或偶联物所表现出的活性(例如由EC50，比活，或其它与活性相关的值所呈现的)可大约等于，低于，或高于参照干扰素-α表现出的具体活性。
“变体”是包含一种序列的多肽，所述序列在一个或多个氨基酸位置中与亲本多肽序列不同。例如，变体可包括这样的序列，该序列与亲本多肽序列在该亲本多肽序列高达10％的残基总数，诸如在高达8％残基，例如，在该亲本多肽序列高达6％，5％，4％，3％，2％或1％的残基总数中存在不同。例如，SEQ ID NO：1的变体可包括与SEQ ID NO：1在1-16个氨基酸位置(诸如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或16个氨基酸位置)，例如在1-15个氨基酸位置，1-14个氨基酸位置，1-13个氨基酸位置，1-12个氨基酸位置，1-11个氨基酸位置，1-10个氨基酸位置，1-9个氨基酸位置，1-8个氨基酸位置，1-7个氨基酸位置，1-6个氨基酸位置，1-5个氨基酸位置，1-4个氨基酸位置，1-3个氨基酸位置，或1-2个氨基酸位置中不同的序列。
术语“亲本多肽”或“亲本干扰素-α”意指将根据本发明而进行修饰的多肽序列。亲本多肽序列可以是天然的IFN-α的序列(诸如哺乳动物IFN-α，例如，灵长类IFN-α，诸如人IFN-α，诸如在本文中被鉴定为SEQ IDNO：45-57的huIFN-α多肽，或本文所述和/或在Allen G.和Diaz M.O.(1996)，文献同上中所述的其它huIFN-α序列)。亲本多肽序列可以是非天然的(即“合成的”)干扰素-α的序列，诸如IFN-α Con1(SEQ ID NO：58)。在一些情况下，待修饰的亲本多肽自身可以是本发明的多肽，诸如，SEQ ID NO：2-35和SEQID NO：37-44的任一个。
用于对象(object)的“天然的”是指如下事实，天然的该对象与人工制备的不同。例如，存在于生物体(包括病毒，细菌，原生动物，昆虫，植物或哺乳动物组织)中的多肽或多核苷酸序列，如果可从天然来源中分离并且尚未在实验室中经过有意的人工修饰则是天然的。用于对象的“非天然的”(也称为“合成的”或“人工的”)是指该对象不是天然的，即不能在自然界中发现该对象不同于人工合成形式的形式。
“片段”或“亚序列”是完整序列的任意部分，最多为但不包括完整序列。因此，片段或亚序列是指包括较长的氨基酸(例如，多肽)或核酸(例如，多核苷酸)的部分的氨基酸或核酸的序列。
本发明所涉及的一类片段是这样的片段，其中从亲本多肽的N末端或C末端(或二者)去除氨基酸残基的片段；所述多肽被分别称为“N末端截短的”或“C末端截短的”。已知从N末端缺失至少四个氨基酸不会显著影响干扰素-α活性(Lydon，N.B.，(1985)Biochemistry 24：4131-41)。此外，保留干扰素-α活性的变体已得到描述，其中7-11个氨基酸已从C末端缺失(Cheetham B.F.，(1991)Antiviral Res.15(1)：27-39；Chang N.T.，(1983)Arch.Biochem Biophys.221(2)：585-589；Franke A.E.，(1982)DNA 1(3)：223-230)。
“受体”例如，“干扰素-α受体”(也称为“I型干扰素受体”)是细胞中被干扰素-α活化的受体，例如，与干扰素-α结合并起动细胞内信号发生，诸如包含亚单位IFNAR-2和IFNAR-1的I型干扰素受体(Domanski等，(1998)J.Biol.Chem.273(6)：3144-3147；Mogensen等，(1999)Journal of Interferon andCytokine Research，19：1069-1098)。在本文中，受体还意在包括全长受体分子的截短形式，例如缺少膜结合部分的受体分子，诸如包含细胞外结合域的受体分子可溶形式(也称为“可溶性受体”)，所述细胞外结合域结合干扰素-α，但无须结合膜和/或起动细胞内信号发生。
两种分子，例如配体和受体之间的“特异性结合亲和力”是指在一种分子优先与分子混合物中的另一种分子结合。如果结合亲和力约为1×104M-1至约1×109M-1或更高(即，KD约为10-4至10-9M或更低)，则分子的结合通常被认为是特异性的。配体和受体的结合亲和力可通过本领域技术人员已知的标准技术进行检测。检测结合亲和力的众所周知的技术的非限制性实例包括Biacore技术(Biacore AB，Sweden)，等温滴定微量热法(isothermal titration microcalorimetry)(MicroCal LLC，Northampton，MAUSA)，ELISA和FACS。例如，FACS或其它分选法可用于选择分子群(诸如，细胞表面呈现的配体)，所述分子群特异性与相关结合对成员(诸如受体，例如，可溶性受体)结合。配体-受体复合物可通过例如，荧光(例如，通过将复合物与识别复合物的荧光抗体反应)进行检测和分选。收集与相关结合对(例如，受体)结合的有意义的分子，然后在存在较低浓度受体的情况下进行再分选。通过在存在浓度渐增(示例性浓度数量级范围为10-6M至10-9M，即，1微摩尔(μM)至1毫微摩尔(nM)，或更低，这依赖于配体-受体相互作用的性质)的受体的情况下实施多次分选，可分离出对受体表现出特异性结合亲和力的有意义的分子群。
当多肽、核酸或其它组分与天然状态下与其通常相结合的组分(其它肽、多肽、蛋白质(包括复合物，例如与天然序列相伴随的聚合酶和核糖体)、核酸、细胞、合成试剂、细胞杂质、细胞组分等)，例如与其所来源的细胞中通常与其相结合的其它组分部分或完全分开时，即可认为它们是“分离的”。当多肽、核酸或其它组分与其天然环境中的其它组分部分或完全分离或从中部分或完全回收，使得它们在组合物，混合物或组分收集物中作为占优势的种类存在(即以摩尔数计，它们比组合物中的任何其它各个种类的含量更高)时，所述多肽、核酸或其它组分是分离的。在一些情况下，制备物由大于约60％、70％或75％，一般大于约80％，或优选大于约90％的分离的种类组成。
“基本上纯的”或“分离的”核酸(例如RNA或DNA)、多肽、蛋白质或组分也指目标种类(例如核酸或多肽)占所存在的所有大分子种类之重量(以摩尔计)的至少约50，60或70％。基本上纯的或分离的组分也可以占组合物中所存在的所有大分子种类之重量的至少约80，90或95％。分离的目标种类也可以被纯化成基本上为均质(通过常规的检测方法检测不到组分中的杂质种类)，其中所述组分基本由单一大分子种类的衍生物组成。术语“纯化的”通常是指在电泳凝胶中通常基本上产生一条带的核酸，多肽，或蛋白质。其通常是指核酸，多肽，或蛋白质的纯度为至少约50％，60％，70％，75％，更优选至少约85％，最优选至少约99％。
术语“分离的核酸”可以指这样的核酸(如DNA或RNA)，其不与衍生出本发明核酸的生物体的天然基因组中与该核酸紧邻的两个编码序列(即一个在5’末端，一个在3’末端)相紧邻。因此，该术语包括例如通过聚合酶链反应(PCR)或限制性内切核酸酶处理而产生的cDNA或基因组DNA片段，而不论该cDNA或基因组DNA片段是被掺入载体，整合至与其所来源的生物体相同或不同物种(包括例如病毒)的基因组中，还是与其它编码序列连接形成编码嵌合多肽的杂合基因，或者是不依赖于任何其它DNA序列。DNA可以是双链或单链，有义或反义。
“重组多核苷酸”或“重组多肽”是非天然的多核苷酸或多肽，其可分别包含来自一种以上来源核酸或多肽的核酸或氨基酸序列，所述来源核酸或多肽可以是天然的核酸或多肽，或其自身可经过诱变或其它类型的修饰。当核酸或多肽为合成的或人工的或经改造的，或者衍生自合成的或人工的或改造的蛋白质或核酸时，可以说它们是“重组的”。术语“重组核酸”(例如DNA或RNA)分子指的是例如非天然的核苷酸序列，或通过至少两个一般不同时出现，彼此不相关，或者要不然彼此是分开的序列片段的组合(例如人工组合)而制备的核苷酸序列。重组核酸可含有通过将不同来源的和/或人工合成的核酸片段连接在一起或组合起来而形成的核酸分子。“重组多肽”通常分别指由克隆的或重组的基因或核酸产生的多肽。例如，衍生出不同核酸或氨基酸序列的来源多核苷酸或多肽有时具有同源性(即，具有，或编码具有相同或相似结构和/或功能的多肽)，其通常来自于生物体的不同分离物、血清型、品系、物种或来自不同的疾病状态。
当用于谈及例如细胞、多核苷酸、载体、蛋白质或多肽时，术语“重组”一般表示已通过导入异源(或外源)核酸或改变天然核酸来修饰所述细胞、多核苷酸或载体，或者表示已通过导入异源氨基酸来修饰蛋白质或多肽，或者表示细胞源自经所述修饰的细胞。重组细胞表达在细胞的天然(非-重组)形式中未曾发现过的核酸序列，或者表达可能会被异常表达、少量表达或根本不表达的天然核酸序列。当涉及细胞时，术语“重组”是指复制异源核酸或表达由异源核酸编码的多肽的细胞。重组细胞可包含在天然(非重组)形式的细胞中未被发现的编码序列。重组细胞还可包含在天然形式的细胞中发现的编码序列，其中编码序列被修饰并通过人工手段而被再导入细胞中。该术语还包括含有核酸的细胞，所述核酸对已经过修饰且未从细胞中去除该核酸的细胞而言是内源的；所述修饰包括通过基因取代、定点突变、重组以及相关技术获得的那些。
术语“重组产生的”指的是通常通过以下方法即可实现的人工组合，所述方法包括化学合成方法，核酸区段的循环(recursive)序列重组或其它核苷酸多样性的生成方法(例如改组(shuffling))，或通过例如本领域技术人员已知的基因工程技术对分离的核酸区段进行操作。“重组表达的”一般指这样的技术，其在体外产生重组核酸，在体内，体外或离体将重组核酸转移至细胞中，使该核酸在所述细胞中表达或增殖。
“重组表达盒”或简称“表达盒”是一种核酸构建体，其由重组或合成方法产生，并具有能影响与所述序列相容的宿主中结构基因的表达的核酸元件。表达盒至少包括启动子以及任选地包括转录终止信号。通常，重组表达盒包括要被转录的核酸(例如，编码所需多肽的核酸)和启动子。影响表达的其它必需或辅助性的因子也可如本文所述进行使用。例如，表达盒还可包括编码信号序列的核苷酸序列，所述信号序列可指导所表达的蛋白质从宿主细胞的分泌。转录终止信号、增强子和其它可影响基因表达的核酸序列也可被包含在表达盒中。
“免疫原”指的是能引起免疫应答的物质。免疫原的例子包括例如抗原，在诱导自身免疫病中起作用的自身抗原，和癌细胞上表达的肿瘤-相关抗原。免疫反应通常是指针对试剂，诸如抗原或其片段或编码所述试剂的核酸产生细胞或抗体介导的反应。在一些情况下，所述反应包括产生CTL、B细胞或多种类型的T细胞(其可特异性针对表达有意义抗原的抗原呈递细胞)中的至少一种或其组合。
“抗原”是这样一种物质，它能在宿主中引发抗体形成，或者能产生与所述物质反应的特异性淋巴细胞群体。抗原一般为对宿主而言为外源的大分子(例如蛋白质和多糖)。
“佐剂”是指能够增强抗原的免疫刺激特性或药物的药理学作用的物质。佐剂可以非特异性地增强针对抗原的免疫反应。例如，“弗氏完全佐剂”是一种油和水的乳剂，其包含免疫原，乳化剂和分枝杆菌(mycobacteria)。另一实例，“弗氏不完全佐剂”与之相同，但不含分枝杆菌。
载体是便于由选定核酸进行细胞转导或转染，或在细胞中表达该核酸的成分或组合物。载体包括例如质粒、粘粒、病毒、YAC、细菌、多聚-赖氨酸等。“表达载体”是重组或合成产生的核酸构建体或序列，它具有一系列允许在宿主细胞中转录特定核酸的特定核酸元件。表达载体可以是质粒、病毒或核酸片段的一部分。表达载体一般包括与启动子可操作相连的待转录核酸。要被转录的核酸通常处于启动子的指导或控制下。
“基本上多核苷酸序列的全长”或“基本上多肽序列的全长”指多核苷酸序列或多肽序列长度的至少50％，一般至少约为60％，70％或75％，一般至少约为80％，或通常至少约为85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％或更长。
术语“免疫测定法”包括使用抗体或免疫原来结合或特异性结合抗原的检测法。免疫测定法的常见特征在于利用具体抗体的特异性结合特性来分离、靶向和/或定量抗原。
本文所用术语“受试者”包括但不限于生物体；哺乳动物，包括例如人、非人灵长类动物(如狒狒、猩猩、猴)、小鼠、猪、牛、山羊、兔、大鼠、豚鼠、仓鼠、马、猴、绵羊或其它非人哺乳动物；非-哺乳动物，包括例如非-哺乳类脊椎动物，如鸟类(如鸡或鸭)或鱼；和非-哺乳类无脊椎动物。
术语“药物组合物”指的是适于给予包括动物或人的受试者以用作药物的组合物。药物组合物一般包含有效量的活性剂和载体，包括例如可药用的载体。
术语“有效量”指的是足以产生所需效果的剂量或量。所需效果包括在所述剂量或量的受体中产生的客观或主观的改善。
“预防性治疗”是这样的治疗，其被给予未显示出疾病、病理或医学病症的体征或症状，或仅显示出疾病、病理或医学病症的早期体征或症状的受试者，由此该治疗的目的在于减轻，防止疾病、病理或医学病症或减少患疾病、病理或医学病症的可能性。预防性治疗的作用是预防性地治疗疾病或病症。“预防活性”指诸如核酸、载体、基因、多肽、蛋白质、物质或其组合物的药剂在施用于未显示出疾病、病理或医学病症的体征或症状，或仅显示出疾病、病理或医学病症的早期体征或症状的受试者时，能减轻，防止疾病、病理或医学病症或减少受试者患疾病、病理或医学病症的可能性的活性。“预防上有用的”药剂或化合物(如核酸或多肽)指的是可用于减轻，防止，治疗疾病、病理或医学病症或减少疾病、病理或医学病症的发生的药剂或化合物。
“治疗性治疗”是对显示出疾病、病理或医学病症的症状或体征的受试者所施用的治疗，其中对所述受试者施用该治疗的目的是减轻或消除所述疾病、病理或医学病症的体征或症状。“治疗活性”指诸如核酸、载体、基因、多肽、蛋白质、物质或其组合物的药剂施用于显示出疾病、病理或医学病症的体征或症状的受试者时，能消除或减弱疾病、病理或医学的体征或症状的活性。“治疗上有用的”药剂或化合物(如核酸或多肽)指的是可用于减弱，治疗或消除疾病、病理或医学病症的所述体征或症状的药剂或化合物。
术语“基因”广义地指任何与生物学功能相关的DNA片段。基因包括其表达所需的编码序列和/或调控序列。基因也包括非-表达型的DNA核酸片段，例如形成其它蛋白质的识别序列的片段(例如启动子、增强子或其它调节区)。基因可获自多种来源，包括由感兴趣的来源所克隆的或由已知或预测的序列信息合成的基因，且可包括被设计为具有所需参数的序列。
一般说来，下文所用的术语和下文所述的细胞培养、分子遗传学、分子生物学、核酸化学和蛋白质化学的实验室方法都是本领域技术人员众所周知的和常用的那些术语和方法。如Sambrook等，分子克隆-实验室手册(第2版)，Vol.1-3，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989(下文简称为“Sambrook”)和Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等编，Current Protocols，Greene Publishing Associates，Inc和John Wiley & Sons，Inc(1999年增补)(下文简称为“Ausubel”)中所述的标准技术可用于重组核酸方法、核酸合成、细胞培养方法和转基因掺入，如电穿孔、注射、基因枪、透皮加压(impressing through the skin)和脂质转染法。一般情况下，根据说明书进行寡核苷酸合成和纯化步骤。一般根据本领域的常规方法和本文中提供的多篇普通参考文献进行技术和方法的操作。其中的方法据信是本领域技术人员众所周知的，为了方便读者，提供了这些方法。
本文所用的“抗体”指的是蛋白质，其含有一种或多种基本上或部分地由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段所编码的多肽。术语抗体用于意指完整抗体及其结合片段。公知的免疫球蛋白基因包括κ，λ，α，γ，δ，ε和μ恒定区基因，以及各种免疫球蛋白可变区基因。轻链被分为κ或λ。重链被分为γ，μ，α，δ或ε，它们反过来也将免疫球蛋白的类型分别限定为IgG，IgM，IgA，IgD和IgE。常见的免疫球蛋白(如抗体)结构单位含有四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对多肽链具有一条“轻链”(约25kD)和一条“重链”(约50-70kD)。每条链的N-末端限定约100至110或更多个氨基酸的可变区，所述可变区主要负责抗原识别。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指的是这些轻链和重链。
抗体包括单克隆抗体、单链抗体(包括单链Fv(sFv)抗体，其中可变重链和可变轻链(直接或通过肽接头)连接在一起，形成连续的多肽)以及双抗体(diabody)、三抗体(tribody)、四抗体(tetrabody)(Pack等，(1995)J Mol Biol246：28；Biotechnol 11：1271；和Biochemistry 31：1579)。所述抗体是例如多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、Fab片段、通过Fab表达文库产生的片段等。
术语“表位”是指能够特异性结合抗体的蛋白质决定簇。表位通常由分子的化学活性表面簇诸如氨基酸或糖侧链组成，并通常具有独特的三维结构特性以及独特的电荷特性。构象表位和非构象表位的区别在于：存在变性溶剂时，与前者的结合丧失，而与后者的结合不丧失。
抗体的“抗原-结合片段”是抗体中与抗原结合的肽或多肽片段。抗体中有益于、参与、或影响与抗原的结合的那些氨基酸形成了抗原-结合位点。参见Scott，T.A和Mercer，E.I.，Concise Encyclopedia：Biochemistry andMolecular Biology(de Gruyter，第3版，1997)和Watson，J.D等，RecombinantDNA(第2版，1992)[下文简称为“Watson，Recombinant DNA”]，各文献均全文引入本文作为参考。
术语“筛选”通常是指鉴定本发明最优分子，例如本发明的多肽，和包含其的相关融合多肽，和编码所有所述分子的核酸的过程。各种分子的数种特性可用于选择和筛选中，例如：各分子结合配体或受体的能力，抑制细胞增殖的能力，抑制感染了病毒的细胞中的病毒复制的能力，诱导或抑制细胞细胞因子产生的能力，改变免疫反应的能力，例如，在受试系统或体外，离体或体内应用中诱导或抑制所需免疫反应。在抗原的情况下，抗原的数种特性可用于选择和筛选中，包括抗原表达、折叠、稳定性、免疫原性和对数种相关抗原表位的呈递。
“选择”是一种筛选方式，其中鉴定和物理分离同时进行，例如，通过表达选择标志，该标志在一些遗传环境下能使细胞表达该标志而存活但其它细胞则死亡(或反之)。筛选标记物包括，例如萤光素酶、β-半乳糖苷酶和绿色荧光蛋白等。选择标志包括药物和抗毒素性基因等。其它形式的选择包括的基于可检测事件的物理分选，所述事件诸如配体与受体的结合，底物与酶的反应，或任何其它直接(例如，通过使用显色型底物或配体)或间接(例如，通过与显色性第二抗体反应)产生可检测信号的物理过程。通过物理分选的选择可通过多种方法实现，例如通过在全细胞或微滴形式中的FACS。
本文所使用的“外源核酸”、“外源DNA区段”、“异源序列”或“异源核酸”来自于具体宿主细胞以外的来源，或如果来自相同来源，是由其原始形式修饰而来的。因此，宿主细胞中的异源基因包括对具体宿主细胞内源的，但未经修饰的基因。本文所述在应用中对异源序列的修饰通常通过使用重复序列重组发生。术语是指这样的DNA片段，其是对细胞外源或异源的，或是对细胞同源但位于宿主细胞核酸中通常无该元件的位置。外源DNA片段被表达以生成外源多肽。
术语“核酸”是指是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。除非有具体限制，该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述核苷酸具有与参照核酸相似的结合特性并以与天然的核苷酸相似的方式进行代谢。除非另有所示，具体核酸序列还隐含地包括其保守性修饰变体(例如，简并密码子取代)和互补序列以及明确指示的序列。具体而言，简并密码子取代可通过产生这样的序列来实现，所述序列中一个或多个选定的(或全部)密码子的第三个位点被混合的碱基和/或脱氧次黄苷残基取代(Batzer，(1991)Nucleic Acid Res 19：5081；Ohtsuka，(1985)J BiolChem 260：2605-2608；Cassol，(1992)；Rossolini，(1 994)Mol Cell Probes8：91-98)。术语核酸可与基因、cDNA和由基因编码的mRNA互换使用。
“来源于基因的核酸”是指其合成最终以基因或其亚序列作为模板的核酸。因此，mRNA、从mRNA反转录的cDNA、从该cDNA转录的RNA、从cDNA扩增的DNA、从扩增的DNA转录的RNA等全都来源于该基因，且检测所述来源产物可指示样品中存在和/或有大量原始基因和/或基因转录物。
当核酸与另一核酸序列发生功能关系时，该核酸被“可操作地连接”。例如，如果启动子或增强子增加编码序列的转录，则启动子或增强子可操作地连接于编码序列。可操作地连接是指被连接的DNA序列通常是连续的，并且当需要连接两个蛋白编码区时，所述DNA序列是连续的且在读框内。然而，因为增强子在与启动子被数千碱基隔开时通常发挥作用，且内含子序列可以具有可变的长度，一些多核苷酸元件可以是可操作地连接但不连续。
术语“细胞因子”包括，例如，白细胞介素、干扰素、趋化因子、造血生长因子，肿瘤坏死因子和转化生长因子。一般来说，它们是低分子量蛋白质，其可调节免疫系统的细胞的成熟、活化、增殖和分化。
在本发明的说明书和权利要求中，任何涉及“一种”组分(例如在有关非多肽部分、氨基酸残基、取代、缓冲液、阳离子等的内容中)的内容意指一种或多种所述组分，除非另有所述或除非从具体上下文中清楚地得出并非该情况。例如，术语“选自A，B和C组成的组的组分”意指包括A，B和C的所有组合，例如，A，B，C，A+B，A+C，B+C或A+B+C。
多种其它术语在此处给出定义或进行定性。
本发明的分子和方法
本发明的分子(例如本发明的多肽、本发明的偶联物和编码所述多肽的核酸)可用于治疗对干扰素-α治疗有反应的疾病，特别是与病毒感染相关的疾病，例如HCV感染。
慢性HCV感染患者在治疗前通常具有104-107拷贝的HCV RNA/ml血清的病毒载量。通过用IFN-α治疗，这些患者中的病毒载量特征性地历经两个不同的对数线性衰减期(图1B；Neumann A.U.，(1998)Science282：103-107)。IFN-α治疗的前两日中发生的病毒载量的起始快速下降，被认为是由于干扰素-α介导的病毒在被感染肝细胞中的生成减少及原始细胞对抗感染的伴随保护。在约二日时，病毒产生的速率达到新的稳定状态，此时可观测到病毒清除率的第二个快速对数线性期(速率较低)。病毒清除率的该第二期通常被认为部分由于T细胞介导的对感染的肝细胞的杀伤(Neumann等，文献同上)。IFN-α被认为在该生物反应中通过刺激抗原特异性T细胞分化为TH1细胞而发挥关键性作用。此外，利巴韦林的作用模式被认为是由于TH1反应的放大，且被认为是其与IFN-α治疗联合效力的机理基础。对目前使用的干扰素-α治疗无反应的感染了HCV的患者(通常被称为“无反应者”)表现出更浅的(shallow)病毒载量清除图(图1A)。
虽然本发明并非意在受潜在机制的具体理论的限制，应当理解替代(surrogate)测定系统(诸如本文更详细描述的那些系统)中的抗病毒活性可作为干扰素-α分子效力(例如在病毒清除率第一相)的预测物。示例性抗病毒测定法(实施例章节中所述)监测IFN-α保护HuH7人肝来源细胞，使其免受脑心肌炎病毒(EMCV)的致细胞病变效应的有效性，其可作为抗人肝细胞中HCV的有效性的替代系统。其它有用的病毒/细胞测定系统包括EMCV在WISH人羊膜-衍生细胞中、EMCV在HeLa人宫颈癌细胞中、水泡性口炎病毒(VSV)在HuH7细胞中、痘苗病毒(VV)在HeLa细胞中、黄热病毒(YFV)在HepG2人肝癌细胞中以及人类免疫缺陷病毒(HIV)在原代CD4+T细胞中。实施例2显示了本发明的代表性多肽在EMCV/HuH7和EMCV/HeLa抗病毒活性测定中的抗病毒活性。
其它可用于在感染肝细胞中监测抗HCV的有效性的替代测定系统包括HCV复制子系统，例如Lohmann V.等，(1999)Science 285(5424)：285-3；Randall G.和Rice C.M.(2001)Curr Opin Infect Dis 14(6)：743-7；和Bartenschlager，R.(2002)Nature Reviews/Drug Discovery 1：911中所述。可用于监测HCV抗病毒效力的体内宿主系统的实例是嵌合人肝SCID小鼠，如Mercer，(2001)Nature Medicine 7(8)：927-933中所述。
不受理论的限制，还认为由IFN-α导致的TH1分化增强和/或TH2分化的抑制可以是干扰素-α效力的促成因素，例如在病毒清除率第二阶段中。根据该理论，预计这些生物活性(即，TH1分化的增强和/或TH2分化的抑制)方面的效力增强的改进型IFN-α具有相对例如目前批准的治疗性干扰素-α分子(以相同剂量施用)而言增加的效力。示例性测定法(实施例章节中所述)借助ELISA或借助细胞内染色及FACS分选来测定与TH1-表型(例如，IFN-γ)和/或TH2-表型(例如，IL-5，IL4)相关的细胞因子的产生，从而监测IFN-α对THO细胞的TH1分化的增强和/或TH2分化的抑制。实施例3显示了本发明的代表性多肽的TH1分化活性。
IFN-α分子的治疗效果会部分由于剂量限制性毒性(dose-limitingtoxicity)，例如血小板减少和中性白细胞减少而出现降低。虽然本发明并非意在受潜在机制的具体理论的限制，应当理解所述毒性或许与IFN-α对血小板和中性白细胞前体的抗增殖作用相关，而在替代测定系统(诸如本文所述的那些系统)中的抗增殖活性可作为干扰素-α分子的相对毒性的预测物。因此，与IFN-α治疗相关的剂量限制性毒性可在IFN-α分子中减少，所述分子表现出相对于例如目前批准的治疗性干扰素-α分子诸如ROFERON-A(干扰素α-2a，重组；Hoffmann-La Roche Inc.)、INTRONA(干扰素-α-2b，重组；Schering Corporation)和INFERGEN(干扰素α con-1；InterMune，Inc.)而言减低的抗增殖活性。示例性抗增殖活性测定法(实施例章节中所述)监测IFN-α对人Daudi淋巴细胞增殖的作用。可选地，或此外，施用更具治疗活性的分子可产生剂量限制性毒性，所述分子的给药浓度或频率可低于目前批准的分子的给药浓度或频率。实施例4显示了本发明的代表性多肽的Daudi抗增殖活性。
本发明的一个目的是提供新的干扰素-α多肽，和编码该多肽的核酸。本发明的多肽可用于治疗对干扰素-α治疗有反应的疾病，特别是与病毒感染相关的疾病，例如HCV感染。一些本发明的多肽表现出干扰素-α活性，例如，抗病毒活性，抗增殖活性，和/或TH1分化活性。一些本发明的多肽表现出以下特性的一种或多种：与参照IFN-α多肽相比抗病毒活性增加或降低；与参照IFN-α多肽相比TH1分化活性增加或降低；与参照IFN-α多肽相比抗增殖活性增加或降低。参照IFN-α多肽可包括非天然的干扰素-α的序列，诸如IFN-α Con1(SEQ ID NO：58)，或可包含天然的(即，野生型)干扰素-α多肽的序列。天然的干扰素-α多肽的序列的实例包括人IFN-α多肽的序列，例如，huIFN-α2b(SEQ ID NO：46)，huIFN-α2a(SEQ ID NO：47)，huIFN-α2c(34位＝Arg的SEQ ID NO：46)，huIFN-α8b(SEQ ID NO：52)，huIFN-α8a(98位＝Val，99位＝Leu，100位＝Cys，和101位＝Asp的SEQ IDNO：52)，huIFN-α8c(161位＝Asp且162-166位氨基酸缺失的SEQ ID NO：52)，huIFN-α14a(SEQ ID NO：54)，huIFN-α14c(152位＝Leu的SEQ ID NO：54)，或任何其它天然的人干扰素α多肽的序列，诸如Allen G.和Diaz M.O.(1996)，文献同上中所列。
另一方面，本发明提供了干扰素-α多肽，与参照干扰素-α分子，诸如目前用作治疗剂的参照干扰素-α分子(例如，ROFERON-A，INTRON A或INFERGEN)相比，该多肽从被病毒感染的细胞中清除病毒的效力增强。例举的病毒包括但不限于：黄病毒科家族的病毒，例如丙肝病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、日本脑炎病毒、登革病毒和牛病毒性腹泻病毒；嗜肝DNA病毒科家族的病毒，例如，乙肝病毒；小RNA病毒科家族的病毒，例如脑心肌炎病毒、人鼻病毒和甲肝病毒；反录病毒科家族的病毒，例如人类免疫缺陷病毒、猴免疫缺损病毒、人T-嗜淋巴性病毒和劳斯肉瘤病毒；冠状病毒科家族的病毒，例如SARS冠状病毒；弹状病毒科家族的病毒，例如狂犬病病毒和水泡性口炎病毒；副粘病毒科家族的病毒，例如呼吸道合胞病毒和副流感病毒；乳头状瘤病毒科家族的病毒，例如人乳头状瘤病毒以及疱疹病毒科家族的病毒，例如单纯疱疹病毒。所述增强的效力可来自相对参照分子增强的抗病毒活性、增强的TH1-分化活性或这两者。例如，本发明的一些干扰素-α多肽特别适用于清除对目前使用的干扰素-α分子治疗反应较弱的病毒或病毒株，所述毒株例如是，HCV基因型1。
一些本发明的多肽表现出与参照IFN-α分子相比增高的(抗病毒活性/抗增殖活性)比率，和/或与参照IFN-α分子相比增高的(TH1分化活性/抗增殖活性)比率。表现出所述特性的多肽对于治疗病毒感染，诸如上述病毒的感染特别有效。例如，一些所述多肽在双阶段病毒清除图谱的一个或两个二阶段中在对HCV的治疗中的治疗效力高于目前批准的干扰素-α分子，和/或可表现出降低的毒性。一些所述多肽在对HCV基因型1的治疗中的治疗效力超过现今批准的干扰素-α分子的治疗效力。
本发明的另一目的是提供偶联物，所述偶联物包含一个或多个与本发明的多肽连接的非多肽部分，所述偶联物表现出干扰素-α活性(诸如上述活性的一种或多种)，并任选地表现出其它所需特性，诸如相对于非偶联型多肽增强的血清半寿期和/或功能性体内半寿期，和/或降低的抗原性。一些所述偶联物在从被病毒感染的细胞中清除病毒方面的效力比参照干扰素-α分子的所述效力更强，所述参照干扰素-α分子诸如目前用作治疗剂的干扰素-α偶联物(例如，PEGASYS(Peg化的干扰素α-2a；Hoffmann-La Roche，Inc.)或PEG-INTRON(Peg化的干扰素α-2b；Schering Corporation)。例举的病毒包括但不限于：黄病毒科家族的病毒，例如丙肝病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、日本脑炎病毒、登革病毒和牛病毒性腹泻病毒；嗜肝DNA病毒科家族的病毒，例如，乙肝病毒；小RNA病毒科家族的病毒，例如脑心肌炎病毒、人鼻病毒和甲肝病毒；反录病毒科家族的病毒，例如人类免疫缺陷病毒、猴免疫缺损病毒、人T-嗜淋巴性病毒和劳斯肉瘤病毒；冠状病毒科家族的病毒，例如SARS冠状病毒；弹状病毒科家族的病毒，例如狂犬病病毒和水泡性口炎病毒；副粘病毒科家族的病毒，例如呼吸道合胞病毒和副流感病毒；乳头状瘤病毒科家族的病毒，例如人乳头状瘤病毒以及疱疹病毒科家族的病毒，例如单纯疱疹病毒。所述增强的效力可来自相对参照分子而言增强的抗病毒活性、增强的TH1-分化活性或这两者。例如，本发明的一些干扰素-α偶联物特别适用于清除对目前使用的干扰素-α分子治疗反应较弱的病毒或病毒株，所述毒株例如是HCV基因型1。
一些本发明的偶联物表现出与参照IFN-α分子相比增高的(抗病毒活性/抗增殖活性)比率，和/或与参照IFN-α分子相比增高的(TH1分化活性/抗增殖活性)比率。表现出所述特性的偶联物对于治疗病毒感染诸如上述病毒，如HCV的感染特别有效。例如，一些所述偶联物在双阶段病毒清除图谱的一或两个二阶段中对HCV的治疗效力高于目前批准的干扰素-α分子，和/或可表现出降低的毒性。一些所述偶联物在对HCV基因型1的治疗中的治疗效力超过现今批准的干扰素-α分子的治疗效力。
本发明的另一目的是提供抑制感染了病毒的细胞中的病毒复制的方法，该方法包括对感染了病毒的细胞施用本发明的多肽或偶联物，所述多肽或偶联物的量能有效抑制所述细胞中的病毒复制。本发明还提供了降低感染了病毒的细胞中病毒拷贝数的方法，该方法包括对感染了病毒的细胞本发明的多肽或偶联物，所述多肽或偶联物的量能有效降低所述细胞中病毒的拷贝数。病毒可以是黄病毒科家族的病毒，例如丙肝病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、日本脑炎病毒、登革病毒或牛病毒性腹泻病毒；嗜肝DNA病毒科家族的病毒，例如，乙肝病毒；小RNA病毒科家族的病毒，例如脑心肌炎病毒、人鼻病毒或甲肝病毒；反录病毒科家族的病毒，例如人类免疫缺陷病毒、猴免疫缺损病毒、人T-嗜淋巴性病毒或劳斯肉瘤病毒；冠状病毒科家族的病毒，例如SARS冠状病毒；弹状病毒科家族的病毒，例如狂犬病病毒或水泡性口炎病毒；副粘病毒科家族的病毒，例如呼吸道合胞病毒或副流感病毒；乳头状瘤病毒科家族的病毒，例如人乳头状瘤病毒；或疱疹病毒科家族的病毒，例如单纯疱疹病毒。例如，所述病毒可以是RNA病毒，诸如HCV，DNA病毒，诸如HBV，或反录病毒，诸如HIV。所述细胞可在培养物中或从哺乳动物中分离(即，体外或离体)，或可以在体内，例如，在哺乳动物(例如SCID小鼠模型，如Mercer，(2001)Nature Medicine.7(8)：927-933所述)、灵长类或人中。
本发明还提供了增强TH0细胞的TH1分化的方法，该方法包括对包含TH0细胞的细胞群施用本发明的多肽或偶联物，所述多肽或偶联物的量能有效增加在所述细胞群中与TH1-表型相关的细胞因子(例如，IFN-γ)的产生和/或降低与TH2-表型相关的细胞因子(例如，IL-4或IL-5)的产生。所述细胞可在培养物中或从哺乳动物中分离(即，体外或离体)，或可以在体内，例如在哺乳动物，灵长类或人中。
本发明还提供了抑制细胞群增殖的方法，包括将该细胞群与本发明的多肽，变体，或偶联物接触，所述多肽，变体或偶联物的量可有效地降低细胞群的增殖。该细胞群可在培养物中的或从哺乳动物中分离(即，体外或离体)，或可以在体内，例如，在哺乳动物，灵长类或人中。
以下将对本发明的这些和其它目的进行详细描述。
本发明的多肽
本发明提供了新的干扰素-α多肽，在本文中统称为“本发明的多肽”。“本发明的多肽”通篇意指包括本文所述的多肽序列的变体。本发明还包括包含本发明多肽的融合蛋白，和包含本发明多肽的偶联物。
多种干扰素-α编码序列的片段被循环重组以便形成包含重组多核苷酸的文库，从中产生本发明的多肽。获得重组多核苷酸文库的方法和/或在用作循环序列重组基质的核酸中得到多样性的方法同样描述如下。
示例性本发明的多肽包括含有如下序列的多肽，所述序列在本文中被鉴定为SEQ ID NO：2-35和SEQ ID NO：37-44(即SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ IDNO：23，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：37，SEQ IDNO：38，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：42，SEQID NO：43和SEQ ID NO：44)。一些所述多肽还包括一个或多个其它氨基酸，例如添加至N-末端的甲硫氨酸。本发明还提供了包含这些多肽的融合蛋白和偶联物，和编码这些多肽的分离的或重组的核酸。
本发明还提供了分离的或重组的多肽，其各包含这样的序列，所述序列(a)与SEQ ID NO：1在1-16个氨基酸位置中不同，并且(b)相对于SEQ IDNO：1而言，含有选自下列的一个或多个取代：F48A/L；V51P；F55A；F65A；F68P；L111A和V114P。一些这样的多肽含有与SEQ ID NO：1在1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或16个氨基酸位置中不同的序列，例如在1-15个氨基酸位置，1-14个氨基酸位置，1-13个氨基酸位置，1-12个氨基酸位置，1-11个氨基酸位置，1-10个氨基酸位置，1-9个氨基酸位置，1-8个氨基酸位置，1-7个氨基酸位置，1-6个氨基酸位置，1-5个氨基酸位置，1-4个氨基酸位置，1-3个氨基酸位置或1-2个氨基酸位置中不同的序列。在一些情况下，该多肽相对于SEQ ID NO：1而言，还含有选自下列的一个或多个取代：H47Q；V51A；Q52P/E；A53T；F55S；L56V；F57L；Y58H；M61I；N113K；V114E和E160D。在一些情况下，该多肽表现出干扰素-α活性(诸如抗病毒活性，TH1分化活性和/或抗增殖活性)。一些所述多肽还包括一个或多个其它氨基酸，例如添加至N-末端的甲硫氨酸。本发明还提供了含有这些多肽的融合蛋白和偶联物，编码所述多肽的分离的或重组的核酸。
本发明还提供了分离的或重组的多肽，其各包含这样的序列，所述序列(a)与SEQ ID NO：1在1-16个氨基酸位置中不同，并且(b)相对于SEQ IDNO：1而言，含有取代F48A/L。一些这样的多肽含有与SEQ ID NO：1在1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或16个氨基酸位置中不同的序列，例如在1-15个氨基酸位置，1-14个氨基酸位置，1-13个氨基酸位置，1-12个氨基酸位置，1-11个氨基酸位置，1-10个氨基酸位置，1-9个氨基酸位置，1-8个氨基酸位置，1-7个氨基酸位置，1-6个氨基酸位置，1-5个氨基酸位置，1-4个氨基酸位置，1-3个氨基酸位置或1-2个氨基酸位置中不同的序列。一些所述多肽相对于SEQ ID NO：1而言，含有取代F48A。一些情况下，该多肽相对于SEQ ID NO：1而言，还含有选自下列的一个或多个取代：H47Q；V51A/P；Q52P/E；A53T；F55A/S；L56V；F65A；F57L；Y58H；M61I；F68P；L111A；N113K；V114E/P和E160D。在一些情况下，该多肽表现出干扰素-α活性(诸如抗病毒活性，TH1分化活性和/或抗增殖活性)。一些所述多肽还包括一个或多个其它氨基酸，例如添加至N-末端的甲硫氨酸。本发明还提供了含有这些多肽的融合蛋白和偶联物，编码所述多肽的分离的或重组的核酸。
本发明还提供了分离的或重组的多肽，其各包含这样的序列，所述序列(a)与SEQ ID NO：1在1-16个氨基酸位置中不同，并且(b)相对于SEQ IDNO：1而言，含有取代F55A。一些这样的多肽含有与SEQ ID NO：1在1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或16个氨基酸位置中不同的序列，例如在1-15个氨基酸位置，1-14个氨基酸位置，1-13个氨基酸位置，1-12个氨基酸位置，1-11个氨基酸位置，1-10个氨基酸位置，1-9个氨基酸位置，1-8个氨基酸位置，1-7个氨基酸位置，1-6个氨基酸位置，1-5个氨基酸位置，1-4个氨基酸位置，1-3个氨基酸位置或1-2个氨基酸位置中不同的序列。一些情况下，该多肽相对于SEQ ID NO：1而言，还含有选自下列的一个或多个取代：H47Q；F48A/L；V51A/P；Q52P/E；A53T；L56V；F65A；F57L；Y58H；M61I；F68P；L111A；N113K；V114E/P和E160D。在一些情况下，该多肽表现出干扰素-α活性(诸如抗病毒活性，TH1分化活性和/或抗增殖活性)。一些所述多肽还包括一个或多个其它氨基酸，例如添加至N-末端的甲硫氨酸。本发明还提供了含有这些多肽的融合蛋白和偶联物，编码所述多肽的分离的或重组的核酸。
本发明还提供了分离的或重组的多肽，其各包含这样的序列，所述序列(a)与SEQ ID NO：1在1-16个氨基酸位置中不同，并且(b)相对于SEQ IDNO：1而言，含有取代F65A。一些这样的多肽含有与SEQ ID NO：1在1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或16个氨基酸位置中不同的序列，例如在1-15个氨基酸位置，1-14个氨基酸位置，1-13个氨基酸位置，1-12个氨基酸位置，1-11个氨基酸位置，1-10个氨基酸位置，1-9个氨基酸位置，1-8个氨基酸位置，1-7个氨基酸位置，1-6个氨基酸位置，1-5个氨基酸位置，1-4个氨基酸位置，1-3个氨基酸位置或1-2个氨基酸位置中不同的序列。一些情况下，该多肽相对于SEQ ID NO：1而言，还含有选自下列的一个或多个取代：H47Q；F48A/L；V51A/P；Q52P/E；A53T；F55A/S；L56V；F57L；Y58H；M6 1I；F68P；L111A；N113K；V114E/P和E160D。在一些情况下，该多肽表现出干扰素-α活性(诸如抗病毒活性，TH1分化活性和/或抗增殖活性)。一些所述多肽还包括一个或多个其它氨基酸，例如添加至N-末端的甲硫氨酸。本发明还提供了含有这些多肽的融合蛋白和偶联物，编码所述多肽的分离的或重组的核酸。
本发明还提供了分离的或重组的多肽，其各包含这样的序列，所述序列(a)与SEQ ID NO：1在1-16个氨基酸位置中不同，并且(b)相对于SEQ IDNO：1而言，含有取代L111A。一些这样的多肽含有与SEQ ID NO：1在1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或16个氨基酸位置中不同的序列，例如在1-15个氨基酸位置，1-14个氨基酸位置，1-13个氨基酸位置，1-12个氨基酸位置，1-11个氨基酸位置，1-10个氨基酸位置，1-9个氨基酸位置，1-8个氨基酸位置，1-7个氨基酸位置，1-6个氨基酸位置，1-5个氨基酸位置，1-4个氨基酸位置，1-3个氨基酸位置或1-2个氨基酸位置中不同的序列。一些所述多肽相对于SEQ ID NO：1而言，含有取代F48A。一些情况下，该多肽相对于SEQ ID NO：1而言，还含有选自下列的一个或多个取代：H47Q；F48A/L；V51A/P；Q52P/E；A53T；F55A/S；L5V6；F65A；F57L；Y58H；M61I；F68P；N113K；V114E/P和E160D。在一些情况下，该多肽表现出干扰素-α活性(诸如抗病毒活性，TH1分化活性和/或抗增殖活性)。一些所述多肽还包括一个或多个其它氨基酸，例如添加至N-末端的甲硫氨酸。本发明还提供了含有这些多肽的融合蛋白和偶联物，编码所述多肽的分离的或重组的核酸。
本发明还提供了分离的或重组的多肽，其各包含这样的序列，所述序列(a)与SEQ ID NO：13在0-16个氨基酸位置中不同，并且(b)含有下述氨基酸中的一个或多个：第48位的Ala或Leu；第51位的Pro；第55位的Ala；第65位的Ala；第68位的Pro；第111位的Ala和第114位的Pro(相对于SEQ ID NO：13的位置编号)。一些这样的多肽含有与SEQ ID NO：13在0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或16个氨基酸位置中不同的序列，例如在0-15个氨基酸位置，0-14个氨基酸位置，0-13个氨基酸位置，0-12个氨基酸位置，0-11个氨基酸位置，0-10个氨基酸位置，0-9个氨基酸位置，0-8个氨基酸位置，0-7个氨基酸位置，0-6个氨基酸位置，0-5个氨基酸位置，0-4个氨基酸位置，0-3个氨基酸位置，0-2个氨基酸位置或0-1个氨基酸位置中不同的序列。一些这样的多肽在第48位含有Ala或Leu。一些这样的多肽在第48位含有Ala。在一些情况下，该多肽相对于SEQ ID NO：13而言，还含有选自下列的一个或多个取代；H47Q；V51A；Q52P/E；A53T；F55S；L56V；F57L；Y58H；M61I；N113K；V114E和E160D。在一些情况下，该多肽表现出干扰素-α活性(诸如抗病毒活性，TH1分化活性和/或抗增殖活性)。一些这样的多肽还含有一个或多个其它的氨基酸，例如添加至N-末端的甲硫氨酸。本发明还提供了含有所述多肽的融合蛋白和偶联物，以及编码所述多肽的分离或重组的核酸。
本发明还提供了分离的或重组的多肽，其各包含这样的序列，所述序列(a)与SEQ ID NO：36在1-16个氨基酸位置中不同，并且(b)相对于SEQ IDNO：36而言，含有选自下列的一个或多个取代：M21A；I24P；F48A/L；T51P；S55A；F65A；F68P；F90A；M93P；L111A；V114P；F124A；I127P和E160D。一些这样的多肽含有与SEQ ID NO：36在1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或16个氨基酸位置中不同的序列，例如在1-15个氨基酸位置，1-14个氨基酸位置，1-13个氨基酸位置，1-12个氨基酸位置，1-11个氨基酸位置，1-10个氨基酸位置，1-9个氨基酸位置，1-8个氨基酸位置，1-7个氨基酸位置，1-6个氨基酸位置，1-5个氨基酸位置，1-4个氨基酸位置，1-3个氨基酸位置或1-2个氨基酸位置中不同的序列。在一些情况下，该多肽相对于SEQ ID NO：36而言，还含有选自下列的一个或多个取代：P26L；H47Q；T51V；S55P/F；V56L；H58Y；L60M；F90Y；M93L；N95D；N113K；V114E；R125Q；T132K和L154F。在一些情况下，该多肽表现出干扰素-α活性(诸如抗病毒活性，TH1分化活性和/或抗增殖活性)。一些这样的多肽还含有一个或多个其它的氨基酸，例如添加至N-末端的甲硫氨酸。本发明还提供了含有所述多肽的融合蛋白和偶联物，以及编码所述多肽的分离或重组的核酸。
本发明还提供了分离的或重组的多肽，其各包含这样的序列，所述序列(a)与SEQ ID NO：36在1-16个氨基酸位置中不同，并且(b)相对于SEQ IDNO：36而言，含有取代F48A/L。一些这样的多肽含有与SEQ ID NO：36在1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或16个氨基酸位置中不同的序列，例如在1-15个氨基酸位置，1-14个氨基酸位置，1-13个氨基酸位置，1-12个氨基酸位置，1-11个氨基酸位置，1-10个氨基酸位置，1-9个氨基酸位置，1-8个氨基酸位置，1-7个氨基酸位置，1-6个氨基酸位置，1-5个氨基酸位置，1-4个氨基酸位置，1-3个氨基酸位置或1-2个氨基酸位置中不同的序列。一些所述多肽相对于SEQ ID NO：36而言，含有取代F48A。在一些情况下，该多肽相对于SEQ ID NO：36而言，还含有选自下列的一个或多个取代：M21A；I24P；P26L；H47Q；T51V/P；S55P/F/A；V56L；H58 Y；L60M；F65A；F68P；F90Y/A；M93L/P；N95D；L111A；N113K；V114E/P；F124A；R125Q；I127P；T132K；L154F和E160D。在一些情况下，该多肽表现出干扰素-α活性(诸如抗病毒活性，TH1分化活性和/或抗增殖活性)。一些这样的多肽还含有一个或多个其它的氨基酸，例如添加至N-末端的甲硫氨酸。本发明还提供了含有所述多肽的融合蛋白和偶联物，以及编码所述多肽的分离或重组的核酸。
本发明还提供了分离的或重组的多肽，其各包含这样的序列，所述序列(a)与SEQ ID NO：36在1-16个氨基酸位置中不同，并且(b)相对于SEQ IDNO：36而言，含有取代F90A。一些这样的多肽含有与SEQ ID NO：36在1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或16个氨基酸位置中不同的序列，例如在1-15个氨基酸位置，1-14个氨基酸位置，1-13个氨基酸位置，1-12个氨基酸位置，1-11个氨基酸位置，1-10个氨基酸位置，1-9个氨基酸位置，1-8个氨基酸位置，1-7个氨基酸位置，1-6个氨基酸位置，1-5个氨基酸位置，1-4个氨基酸位置，1-3个氨基酸位置或1-2个氨基酸位置中不同的序列。在一些情况下，该多肽相对于SEQ ID NO：36而言，还含有选自下列的一个或多个取代：M21A；I24P；P26L；H47Q；F48A/L；T51V/P；S55P/F/A；V56L；H58Y；L60M；F65A；F68P；M93L/P；N95D；L111A；N113K；V114E/P；F124A；R125Q；I127P；T132K；L154F和E160D。在一些情况下，该多肽表现出干扰素-α活性(诸如抗病毒活性，TH1分化活性和/或抗增殖活性)。一些这样的多肽还含有一个或多个其它的氨基酸，例如添加至N-末端的甲硫氨酸。本发明还提供了含有所述多肽的融合蛋白和偶联物，以及编码所述多肽的分离或重组的核酸。
本发明还提供了分离的或重组的多肽，其各包含这样的序列，所述序列(a)与SEQ ID NO：36在1-16个氨基酸位置中不同，并且(b)相对于SEQ IDNO：36而言，含有取代E160D。一些这样的多肽含有与SEQ ID NO：36在1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或16个氨基酸位置中不同的序列，例如在1-15个氨基酸位置，1-14个氨基酸位置，1-13个氨基酸位置，1-12个氨基酸位置，1-11个氨基酸位置，1-10个氨基酸位置，1-9个氨基酸位置，1-8个氨基酸位置，1-7个氨基酸位置，1-6个氨基酸位置，1-5个氨基酸位置，1-4个氨基酸位置，1-3个氨基酸位置或1-2个氨基酸位置中不同的序列。在一些情况下，该多肽相对于SEQ ID NO：36而言，还含有选自下列的一个或多个取代：M21A；I24P；P26L；H47Q；F48A/L；T51V/P；S55P/F/A；V56L；H58 Y；L60M；F65A；F68P；F90Y/A；M93L/P；N95D；L111A；N113K；V114E/P；F124A；R125Q；I127P；T132K和L154F。在一些情况下，该多肽表现出干扰素-α活性(诸如抗病毒活性，TH1分化活性和/或抗增殖活性)。一些这样的多肽还含有一个或多个其它的氨基酸，例如添加至N-末端的甲硫氨酸。本发明还提供了含有所述多肽的融合蛋白和偶联物，以及编码所述多肽的分离或重组的核酸。
本发明还提供了分离的或重组的多肽，其各包含这样的序列，所述序列(a)与SEQ ID NO：38在0-16个氨基酸位置中不同，并且(b)含有下述氨基酸中的一个或多个：第2 1位的Ala；第24位的Pro；第48位的Ala或Leu；第51位的Pro；第55位的Ala；第65位的Ala；第68位的Pro；第90位的Ala；第93位的Pro；第111位的Ala；第114位的Pro；第124位的Ala；第127位的Pro；和第160位的Glu(相对于SEQ ID NO：38的位置编号)。一些这样的多肽含有与SEQ ID NO：38在0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或16个氨基酸位置中不同的序列，例如在0-15个氨基酸位置，0-14个氨基酸位置，0-13个氨基酸位置，0-12个氨基酸位置，0-11个氨基酸位置，0-10个氨基酸位置，0-9个氨基酸位置，0-8个氨基酸位置，0-7个氨基酸位置，0-6个氨基酸位置，0-5个氨基酸位置，0-4个氨基酸位置，0-3个氨基酸位置，0-2个氨基酸位置或0-1个氨基酸位置中不同的序列。一些这样的多肽在第48位含有Ala或Leu。一些这样的多肽在第48位含有Ala。在一些情况下，该多肽相对于SEQ ID NO：38而言，还含有选自下列的一个或多个取代：P26L；H47Q；V51T；F55P/S；L56V；Y58H；L60M；F90Y；M93L；N95D；N113K；V114E；R125Q；T132K和F154L。在一些情况下，该多肽表现出干扰素-α活性(诸如抗病毒活性，TH1分化活性和/或抗增殖活性)。一些这样的多肽还含有一个或多个其它的氨基酸，例如添加至N-末端的甲硫氨酸。本发明还提供了含有所述多肽的融合蛋白和偶联物，以及编码所述多肽的分离或重组的核酸。
本发明多肽的其它修饰包括下文和题目为“干扰素-α偶联物”的章节中所述的那些修饰。
应当理解虽然本文提供的实施例和对亲本多肽的修饰是相对于序列SEQ ID NO：1而言的(或相对于SEQ ID NO：36或相对于一些其它特定序列而言)，所公开的修饰还可在本文所述本发明的任何其它多肽(例如包含选自SEQ ID NO：2-35和SEQ ID NO：37-44的序列的多肽)的等效氨基酸位置上进行。因此，作为实例，相对于SEQ ID NO：1的取代F48L应被理解为对应于SEQ ID NO：13中的取代A48L，等等。
下表提供了本发明一些干扰素-α多肽的序列。为了清楚地描述，所述序列相对于SEQ ID NO：1(表1)或SEQ ID NO：36(表2)进行显示。一些所述多肽显示干扰素-α活性，诸如抗病毒活性，TH1分化活性和/或抗增殖活性。
表1
    多肽序列(相对于SEQ ID NO：1) 克隆名称  SEQ ID
 SEQ ID NO：1   B9x14EC4  SEQ ID NO：1
 SEQ ID NO：1 F55P   14epi07  SEQ ID NO：2
    多肽序列(相对于SEQ ID NO：1) 克隆名称 SEQ ID
 SEQ ID NO：1 V51A Q52P F55S L56V F57L Y58H     14epi08  SEQ ID NO：3
 SEQ ID NO：1 V51A Q52E A53T F55P L56V F57L Y58H     14epi09  SEQ ID NO：4
 SEQ ID NO：1 V51A Q52E F55S L56V F57L Y58H     14epi10  SEQ ID NO：5
 SEQ ID NO：1 V51A F55S L56A Y58H     14epi11  SEQ ID NO：6
 SEQ ID NO：1 F48L E160D     14epi12d  SEQ ID NO：7
 SEQ ID NO：1 H47Q     14epi13  SEQ ID NO：8
 SEQ ID NO：1 M61I     14epi14  SEQ ID NO：9
 SEQ ID NO：1 F48L     14epi15  SEQ ID NO：10
 SEQ ID NO：1 F48L F55A     14epi16  SEQ ID NO：11
 SEQ ID NO：1 F48L F55S     14epi17  SEQ ID NO：12
 SEQ ID NO：1 F48A     14epi18  SEQ ID NO：13
 SEQ ID NO：1 F48A F55A     14epi19  SEQ ID NO：14
 SEQ ID NO：1 F48A F55S     14epi20  SEQ ID NO：15
 SEQ ID NO：1 F55A     14epi21  SEQ ID NO：16
 SEQ ID NO：1 F55S     14epi22  SEQ ID NO：17
 SEQ ID NO：1 F48A F55S L111A     14epi23  SEQ ID NO：18
 SEQ ID NO：1 F48A F55S N113K V114E     14epi24  SEQ ID NO：19
 SEQ ID NO：1 F48L F55S L111A     14epi25  SEQ ID NO：20
 SEQ ID NO：1 F48L F55S N113K V114E     14epi26  SEQ ID NO：21
 SEQ ID NO：1 F48A F55S F65A L111A     14epi27  SEQ ID NO：22
 SEQ ID NO：1 F48A F55S F65A N113K V114E     14epi28  SEQ ID NO：23
 SEQ ID NO：1 F48A F55S F65A L111A     14epi29  SEQ ID NO：24
 SEQ ID NO：1 F48A F55A L111A     14epi30  SEQ ID NO：25
 SEQ ID NO：1 F48A F55A N113K V114E     14epi31  SEQ ID NO：26
 SEQ ID NO：1 F48L Q52P F55S N113K V114E     14epi32  SEQ ID NO：27
 SEQ ID NO：1 Q52P F55S N113K V114E     14epi33  SEQ ID NO：28
 SEQ ID NO：1 Q52P F55S N113K V114E     14epi34  SEQ ID NO：29
 SEQ ID NO：1 F48L V51A Q52P F55S L56V F57L Y58HN113K V114E 14epi35 SEQ ID NO：30
 SEQ ID NO：1 V51A Q52E A53T F55P L56V F57L Y58HN113K V114E 14epi36 SEQ ID NO：31
 SEQ ID NO：1 V51A F55S L56V F57L Y58H N113KV114E 14epi37 SEQ ID NO：32
 SEQ ID NO：1 V51A Q52P F55S L56V F57L Y58HN113K V114E 14epi38 SEQ ID NO：33
 SEQ ID NO：1 H47Q F48A F55S     14epi39  SEQ ID NO：34
 SEQ ID NO：1 H47Q F48A F55S L56V Y58H     14epi42  SEQ ID NO：35
表2
    多肽序列(相对于SEQ ID NO：36) 克隆名称   SEQ ID
    SEQ ID NO：36     25epi08   SEQ ID NO：36
    SEQ ID NO：36 F48A L154F     25epi18   SEQ ID NO：37
    SEQ ID NO：36 F48A T51V S55F V56L H58Y L154F     25epi19   SEQ ID NO：38
    SEQ ID NO：36 F48A T51V V56L H58Y L154F     25epi20   SEQ ID NO：39
    SEQ ID NO：36 F48A T51V L154F     25epi25   SEQ ID NO：40
    SEQ ID NO：36 F48A T51V F90Y M93L N95D L154F     25epi26   SEQ ID NO：41
    SEQ ID NO：36 F48A T51V F90A R125Q L154F     25epi27   SEQ ID NO：42
    SEQ ID NO：36 F48A T51V F90Y M93L N95D R125QL154F 25epi28 SEQ ID NO：43
    SEQ ID NO：36 L154F E160D     25epi29   SEQ ID NO：44
序列变异
如上所述，本发明的多肽包括含有这样的序列的多肽，所述序列与SEQID NO：1在1-16个氨基酸位置中不同，并且相对于SEQ ID NO：1还含有一个或多个选自下列的取代：F48A/L；V51P；F55A；F65A；F68P；L111A和V114P。本发明的多肽还包括含有这样的序列的多肽，所述序列与SEQ IDNO：36在1-16个氨基酸位置中不同，并且相对于SEQ ID NO：36还含有一个或多个选自下列的取代：M21A；I24P；F48A/L；T51P；S55A；F65A；F68P；F90A；M93P；L111A；V114P；F124A；I127P和E160D。一些所述多肽表现出干扰素-α活性。
例如，一些本发明的所述多肽包含长度约为151个氨基酸，诸如约151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164或165个氨基酸的序列，对应相对于亲本多肽序列(例如，SEQ ID NO：2-3 5或37-44)的1-15个氨基酸的缺失。在一些情况下，从C末端去除1-11个氨基酸，例如，1-10，诸如1-7，例如1-5，诸如1-3个氨基酸，即多肽与亲本多肽序列之一(例如，SEQ ID NO：2-35或37-44之一)相比，前者在C末端截短了1-11个氨基酸残基(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或11个氨基酸残基)，诸如1-10，1-7个，例如，1-5或1-3个氨基酸残基。可选或此外，一些所述多肽是与亲本多肽序列(诸如，SEQ ID NO：2-35或37-44之一)相比在N末端截短1-4个氨基酸残基(例如1，2，3或4个氨基酸残基)，例如，从N末端去除1-4，1-3，1-2或1个氨基酸残基。一些所述多肽还包括位于N末端的甲硫氨酸。一些所述多肽表现出干扰素-α活性。
再例如，一些本发明的多肽包括这样的序列，其相对于SEQ ID NO：1含有1-16个氨基酸取代(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或16个氨基酸取代)，诸如1-14或1-12或1-10或1-8或1-6或1-5或1-4或1-3或1-2个氨基酸取代，其中至少一个取代选自F48A/L；V51P；F55A；F65A；F68P；L111A和V114P。本发明的其它多肽包括这样的序列，其相对于SEQID NO：36含有1-16个氨基酸取代(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或16个氨基酸取代)，诸如1-14或1-12或1-10或1-8或1-6或1-5或1-4或1-3或1-2个氨基酸取代，其中至少一个取代选自M21A；I24P；F48A/L；T51P；S55A；F65A；F68P；F90A；M93P；L111A；V114P；F124A；I127P和E160D。可根据例如取代基(如保守的取代基)，例如下文所列之一，在多肽序列中进行一个或多个其它的氨基酸取代。或者，或另外，可在多肽序列中进行一个或多个其它的氨基酸取代，所述取代导入或除去了包含非-多肽部分连接基团的氨基酸残基。实例包括导入一个或多个N-糖基化位点，导入一个或多个半胱氨酸残基或赖氨酸残基，除去一个或多个N-糖基化位点，和/或除去一个或多个赖氨酸或组氨酸。一些所述多肽表现出干扰素-α活性。
作为非限制性的实例，本发明的多肽可含有这样的序列，该序列与SEQID NO：1在总共多达16个位置中有所不同(其可以是氨基酸取代、缺失和/或插入的组合，包括上述的那些)。在一些情况下，没有、部分或全部取代是根据下文限定的取代基的取代。
根据本发明的氨基酸取代可包括但不限于一个或多个保守的氨基酸取代。提供功能相似氨基酸的保守取代表是本领域众所周知的。下表(表3)中提供了一个实例，表中列出了包含氨基酸的六组示例性基团，所述氨基酸可被认为互为“保守取代”。
表3
保守取代基团
  1   丙氨酸(A)   甘氨酸(G)   丝氨酸(S)   苏氨酸(T)
  2   天冬氨酸(D)   谷氨酸(E)
  3   天冬酰胺(N)   谷氨酰胺(Q)
  4   精氨酸(R)   赖氨酸(K)   组氨酸(H)
  5   异亮氨酸(I)   亮氨酸(L)   甲硫氨酸(M)   缬氨酸(V)
  6   苯丙氨酸(F)   酪氨酸(Y)   色氨酸(W)
可推定氨基酸的其它取代基团。例如，氨基酸可根据相似的功能或化学结构或组成进行分类(例如，酸性、碱性、脂肪族、芳香族、含硫的)。例如，脂肪族的组包括：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)。包含被认为互为保守取代的氨基酸的其它类别包括：芳香族：苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫的：甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)；碱性：精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；酸性：天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)。对于其它氨基酸组，还可参见Creighton(1984)Proteins，W.H.Freeman和Company。本文的多肽序列列表，联合上述取代基团，提供了所有保守性取代的多肽序列的明确列表。
序列同一性百分比
一方面，本发明提供了分离的或重组的多肽，其各自包含这样的序列，该序列具有与SEQ ID NO：1-35中的任一个至少90％的序列同一性(例如，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，或至少约99％氨基酸序列同一性)，其中，该序列包括以下的一种或多种氨基酸：第48位的Ala或Leu；第5 1位的Pro；第55位的Ala；第65位的Ala；第68位的Pro；第111位的Ala；和第114位的Pro，其中氨基酸位置是相对于SEQ ID NO：1而言的。在一些情况下，所述多肽表现出干扰素-α活性。
本发明还提供了分离的或重组的多肽，其各自包含这样的序列，该序列具有与SEQ ID NO：36-44中的任一个至少90％的序列同一性(例如，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，或至少约99％氨基酸序列同一性)，其中，该序列包括以下的一种或多种氨基酸：第21位的Ala；第24位的Pro；第48位的Ala或Leu；第51位的Pro；第55位的Ala；第65位的Ala；第68位的Pro；第90位的Ala；第93位的Pro；第111位的Ala；第114位的Pro；第124位的Ala；第127位的Pro；和第160位的Asp；其中氨基酸位置是相对于SEQ ID NO：36而言的。在一些情况下，所述多肽表现出干扰素-α活性。
一个序列(多肽或核酸)与另一序列的相似程度提供了两个序列相似结构和功能特性的指示。因此，在本发明的上下文中，具有与任何给定示例序列相似的序列的那些序列是本发明的特征。具体，具有下述百分序列同一性的序列是本发明的特征。
可以使用多种测定序列关系的方法，包括人工比对和计算机辅助的序列比对以及分析。多种用于执行序列比对的计算机程序是可得到的，或可以按下文所述由专业技术人员人工进行比对。
如上所述，本发明中使用的核酸和多肽的序列无需是相同的，而可以与本发明的多肽或本发明的核酸的相应序列基本相同。例如，可对本发明的多肽实施多种改变，诸如一个或多个氨基酸插入、缺失和/或取代，其可为保守或非保守的，包括这样的情况，例如所述改变可为所述多肽的诸如治疗或预防用途或给药或诊断应用提供一些优势。还可对本发明的核酸实施多种改变，诸如，一个或多个核酸的一个或多个密码子中的一种或多种取代，以便具体密码子编码相同或不同氨基酸，导致沉默变异(如本文所定义的)或非沉默变异，或序列中一个或多个核酸(或密码子)的一种或多种缺失。核酸也可被修饰为包含使其在表达系统(例如，细菌或哺乳动物)中最优表达的一个或多个密码子，若有需要，所述一个或多个密码子仍然编码相同氨基酸。所述核酸改变可为其治疗或预防用途或给药或诊断应用提供一些优势。核酸和多肽可用多种方式进行修饰，只要其包含与本发明的各个核酸或多肽中的序列基本相同的序列(如下面的定义)即可。
在两个或多个核酸或多肽序列的情况中，术语“相同的”或“同一性”是指当比较或比对两个或多个序列的最大相似性时，所述序列是相同的或具有一定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸，如利用下文所述的序列比对算法或通过观察(visual inspection)所测定。
受试序列与参照(即查询)序列的“百分比序列同一性(％同一性)”是指，受试序列在比较长度上，具有与查询序列一定百分比的同一性(即，对于多肽序列以氨基酸-对-氨基酸(amino acid-by-amico acid)为基础，或对于多核苷酸序列以核苷酸-对-核苷酸为基础)。
受试序列与查询序列的百分序列同一性计算如下。首先，采用具体的比对参数，以序列比较算法确定两序列的最佳比对。该最佳比对的测定可以用计算机实施，或可以人工计算，如下所述。然后，在比较长度中比较两个最佳比对的序列，并测定最佳比对中两个序列出现相同残基的位置的数目，由此提供了匹配位置的数目。然后用匹配位置的数目除以比较长度(除非另有说明，其为查询序列的长度)中的位置总数，然后将结果乘以100，得出受试序列对查询序列的百分序列同一性。
关于多肽序列，通常将一个序列作为“查询序列”(例如，本发明的多肽序列)，相对于该序列比较对一个或多个其它序列，即，“受试序列”(例如，存在于序列数据库中的序列)。序列比较算法使用指定的比对参数来测定查询序列和受试序列之间的最佳比对。当将比较查询序列与序列数据库例如GENBANK(Genetic Sequence Data Bank；U.S.Department of Healthand Human Services)或GENESEQ(Thomson Derwent；also available asDGENEon STN)时，通常仅将查询序列和比对参数输入计算机；通常，对于达到所需数目的受试序列，将返回输入查询序列和数据库中存在的各受试序列之间的最佳比对。
当使用确定的参数(即，确定的氨基酸取代矩阵，缺口存在罚分(也称为缺口开放罚分)和缺口延伸罚分)对两个多肽序列进行比对时(以便取得该序列对的最高可能相似性得分)，这两个多肽序列是“最佳比对的”。BLOSUM62矩阵(Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89(22)：10915-10919)通常被用作多肽序列比对算法(诸如下面描述的BLASTP)中的默认评分取代矩阵。为在一个被对比的序列中导入单个氨基酸缺口，加上缺口存在罚分，对于缺口中的各个残基位置，加上缺口延伸罚分。除非另有说明，在本文中采用的比对参数是：BLOSUM62评分矩阵，缺口存在罚分＝11，和缺口延伸罚分＝1。通过各序列在对比开始和结束(例如对比窗口)处的氨基酸位置，以及任选地通过在一个或两个序列中插入缺口或多个缺口，以便取得最高可能相似性得分，来确定比对得分。
虽然两个或多个序列之间最佳比对可以人工测定(如下所述)，该过程可通过如下过程而得以简化：通过使用计算机执行的比对算法诸如BLAST(National Library of Medicine)，例如，对于多肽序列的BLASTP和对于核酸序列的BLASTN(Altschul等，(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402中所述，并通过不同来源诸如Naional Center for BiotechnologyInformation(NCBI)使得公众可得。在使用计算机化的BLAST界面时，如果存在使用“低复杂性滤器(low complexity filter)”的选项，应将该选项关掉(即，无滤器)。
两个多肽序列之间的最佳比对也可以通过BLASTP算法的人工计算(即，不用计算机帮助)，使用与上述具体的比对参数相同的参数(矩阵＝BLOSUM62，缺口开放罚分＝11，和缺口延伸罚分＝1)进行测定。开始，两个序列开始通过观察进行比对。然后如下计算初始比对得分：对于比对的各个位置(即，对于每对被比对的残基)，根据BLOSUM62矩阵赋予数值(图4)。在比对中对每对残基所赋的值的总和是初始比对得分。如果被比对的两个序列高度相似，该初始比对通常提供了最高可能比对得分。具有最高可能比对得分的比对是根据使用的比对参数的最佳比对。图5A显示了两个序列的比对得分的示例性计算，“查询”序列，在此处被鉴定为SEQ ID NO：1(上)的残基29-50，和“受试”序列，在此处被鉴定为SEQ ID NO：8(下)的残基30-52。通过观察比对序列，并且通过BLOSUM62矩阵对每对被比对的氨基酸所赋的数值显示在所述比对中的各位置下方(为了帮助观察，在比对中每个相同的氨基酸对用黑体字显示)。在这个实例中，该初始比对提供了最高可能比对得分(每个被比对的位置下方所示数值的和)；这两个序列的任何其它比对(有或没有缺口)，将得到较低的比对得分。
在一些情况下，通过在比对中引入一个或多个缺口可获得较高的比对得分。每当在比对中引入缺口时，给定缺口开放罚分，此外评估该缺口内每个残基位置的另外的缺口延伸罚分。因此，使用上述比对参数(包括缺口开放罚分＝11和缺口延伸罚分＝1)，比对中一个残基的缺口符合赋予缺口的值-(11+(1×1))＝-12；三个残基的缺口符合赋予缺口的值-(11+(3×1))＝-14，等等。对于在比对中引入的各缺口，重复所述计算。图5B和5C显示了一个实例，说明无论缺口罚分为何值，在比对中引入缺口如何得到较高的比对得分。图5B显示了SEQ ID NO：1(上，查询)的残基29-50和SEQ IDNO：46(下，受试)的残基30-50通过目测得到的初始对比，其初始比对得分为67。图5C显示了在SEQ ID NO：46中导入一个残基缺口对比对得分影响；尽管缺口罚分为-12，两个序列的总比对得分增加到88。在这个实例中，图5C中所示比对提供了最高可能比对得分，因此是这两个序列的最佳比对；这两个序列的任何其它比对(有或没有缺口)将得到较低的比对得分。
应当理解，上述序列比对计算的实例(使用相对短的序列)仅以说明的目的提供；实际上，采用的比对参数(BLOSUM62矩阵，缺口开放罚分＝11，和缺口延伸罚分＝1)对于85个或更长氨基酸的多肽序列一般是最理想的。NCBI网站为其它长度的序列(适用于计算机辅助的以及人工比对计算，使用如上述相同的步骤)提供了下列比对参数。长度为50-85个氨基酸的序列，最佳的参数是BLOSUM80矩阵(Henikoff和Henikoff，文献同上)，缺口开放罚分＝10，和缺口延伸罚分＝1。对于长度为35-50个氨基酸的序列，最佳的参数是PAM70矩阵(Dayhoff，M.O.，Schwartz，R.M.& Orcutt，B.C.(1978)“Amodel of evolutionary change in proteins.”In Atlas of Protein Sequence andStructure，vol.5，suppl.3，M.O.Dayhoff(ed.)，pp.345-3 52，Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，DC.)，缺口开放罚分＝10，和缺口延伸罚分＝1。长度少于35个氨基酸的序列，最佳的参数是PAM30矩阵(Dayhoff，M.O.，文献同上)，缺口开放罚分＝9，和缺口延伸罚分＝1。
序列一经最佳对比，通过计算最佳的比对中包含相同残基对的位置数来计算受试序列相对于查询序列的百分比同一性，用其除以比较长度(除非另有说明，是查询序列中残基的数目)中残基的数目，然后用所得数值乘以100。参考图5中所示实例，在各个实例中，指定为查询序列的序列长度为22个氨基酸。参考图5A的比对，在查询序列(上)与受试序列(下)的最佳的比对中，20个被比对的氨基酸残基对(黑体字显示)是相同的。因此，该具体受试序列具有与查询序列(20/22)×100＝91.1％的同一性；换句话说，图5A所示比对中的受试序列具有与查询序列至少为91％的氨基酸序列同一性。在图5C中显示的比对中，在最佳的比对中有18对氨基酸残基(黑体字显示)是相同的；因此该具体受试序列具有与查询序列(18/22)×100＝81.8％的同一性；换句话说，图5C所示比对中的受试序列具有与查询序列至少为81％的氨基酸序列同一性。
当应用于多肽时，术语“基本上的同一性”(或“基本上相同的”)通常是指，当使用上述适当的参数、采用BLASTP算法(人工或通过计算机)两个氨基酸序列(即查询序列和受试序列)为最佳比对时，受试序列具有与查询序列至少约60％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高百分比的氨基酸序列同一性。在一些情况下，基本上的同一性存在与至少约100个氨基酸残基，诸如，至少约110，120，125，130，135，140，145，150，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165或166个氨基酸残基的比较长度。
相似地，如在两个核酸序列的上下文中使用的，术语基本上的同一性(或基本上相同)是指当采用适当的下述参数、使用BLASTN算法(人工或通过计算机)为两个核酸序列(即查询序列和受试序列)为最佳比对时，受试序列具有与查询序列至少约60％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高百分比的核酸序列同一性。用于核酸序列比对的参数是：匹配奖分1，错配罚分-3，缺口存在罚分5，缺口延伸罚分2(取代矩阵不用于BLASTN算法中)。在一些情况下，基本上的同一性存在与至少约300个核苷酸，诸如，至少大约330，360，375，390，405，420，435，450，465，480，483，486，489，492，495或498个核苷酸的比较长度。
其它方面
本发明的任何多肽可以作为较大多肽序列例如融合蛋白而存在，诸如在加入一个或多个结构域或亚序列以稳定或检测或纯化多肽的情况下存在。多肽纯化亚序列可包含例如，表位标记、FLAG标记、多组氨酸序列、GST融合物或本领域已知的任何其它检测/纯化亚序列或“标记”。这些其它区域或亚序列对本发明多肽活性的影响很小或没有影响，或可以通过后合成处理步骤，诸如通过用蛋白酶包括内蛋白(intein)等处理而被去除。
本发明包括含有本发明多肽，例如本文所述多肽的融合蛋白以及编码所述融合蛋白的核苷酸序列，其中所述多肽与Ig分子，例如人IgG Fc(“可结晶片段”，或能与补体结合的片段)绞链、CH2结构域和CH3结构域融合。Fc是负责与细胞上的抗体受体和补体的Clq组分结合的抗体部分。这些融合蛋白及其编码核酸可用作预防和/或治疗药物或用作诊断工具(参见例如Challita-Eid，P.et al.(1998)J.Immunol 160：3419-3426；Sturmhoefel，K.et al.(1999)Cancer Res 59：4964-4972)。本发明还包括含有本发明多肽的融合蛋白以及编码所述融合蛋白的核苷酸序列，其中所述多肽与白蛋白分子，如人血清白蛋白(HSA)融合，参见例如美国专利5,876,969。Ig和白蛋白融合蛋白可表现出增加的多肽血清半寿期和/或功能性的体内半寿期，降低的多肽抗原性，增加的多肽储存稳定性或增加的生物利用度，例如增加的AUCsc，因此，可用作预防和/或治疗药物。
任何本发明的多肽也可以包含一个或多个经过修饰的氨基酸。经过修饰的氨基酸可以是，例如，糖基化的氨基酸、PEG化的氨基酸、法尼基化的氨基酸、乙酰化的氨基酸、生物素化的氨基酸、与脂质部分偶联的氨基酸或与有机衍生试剂偶联的氨基酸。存在经修饰的氨基酸有益于，例如，(a)增加多肽血清半寿期和/或功能性的体内半寿期，(b)降低多肽抗原性，(c)增加多肽储存稳定性，或(d)提高生物利用度，例如增加AUCsc。例如，氨基酸在重组制备期间例如在共翻译时或翻译后进行修饰(例如，哺乳动物细胞中表达期间N-X-S/T基序上的N-连接糖基化)或用合成方法进行修饰。这方面在本文中题目为“干扰素-α偶联物”的章节中被更详细地描述。
本发明还提供了一种组合物，其包含至少一种本发明的多肽，和赋形剂或载体。该组合物可以是包含可药用赋形剂或载体的组合物。示例性组合物和赋形剂和载体如下述。
制备多肽
本文描述了生产和分离本发明多肽的重组方法。除了重组生产以外，可通过使用固相技术的直接肽合成来生产多肽(参见Stewart等(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，W.H.Freeman Co，San Francisco；Merrifield，J.(1963)J.Am.Chem.Soc.85：2149-2154)。可使用人工技术或通过自动化来进行肽合成。例如，根据厂商提供的说明使用Applied Biosystems 431A PeptideSynthesizer(Perkin Elmer，Foster City，Calif.)即可进行自动合成。例如，可以分别化学合成亚序列，并使用化学方法将它们组合在一起以提供全长多肽或其片段。可选地，所述序列可从专门制备多肽的任何公司定购。更为通常地，本发明的多肽可通过表达编码核酸和回收多肽来制备，例如下述。
本发明还包括制备本发明多肽的方法。一种所述方法包括，在细胞群体中导入本发明所述的任何核酸(其与有效产生编码多肽的调节序列可操作地相连)，在培养基中培养细胞以表达该多肽，和从细胞或培养基中分离所述多肽。可使用足以促进被细胞摄取(转染)和/或多肽表达的量的核酸。可通过本文所述任何递送方法将该核酸导入所述细胞中，所述方法包括例如，注射、基因枪、被动摄取等。核酸可以是载体(诸如重组表达载体包括DNA质粒载体，或本文所述任何载体)的一部分。核酸或包含本发明的核酸的载体可按本文上述进行制备和配制。所述核酸或表达载体可在体内导入哺乳动物细胞群，或选定的哺乳动物细胞(例如，肿瘤细胞)可自哺乳动物取出，并将所述核酸表达载体以足以导致所编码多肽被摄取和表达的量在体外导入所述细胞中。或者，核酸或包含本发明核酸的载体采用在体外培养的细胞进行制备。一方面，制备本发明多肽的方法包括将重组表达载体导入细胞群中，所述重组表达载体包含本文所述本发明的任何核酸，其量和配制将可导致载体的摄取和所编码多肽的表达；通过本文所述任何导入/递送方式将该表达载体施用于哺乳动物体内；和从该哺乳动物或从该哺乳动物的副产品中分离所述多肽。
抗体
在本发明的另一方面，使用本发明的多肽(或其抗原性片段)生产抗体，所述抗体具有例如诊断、预防和治疗用途，例如与所述多肽及其片段的活性，分布和表达相关。通过本领域众所周知的方法可以产生针对本发明多肽的抗体。所述抗体包括但不限于：多克隆、单克隆、嵌合的，人源化的、单链、Fab片段和通过Fab表达文库产生的片段。对治疗或预防用途而言，抗体例如阻断受体结合的抗体是特别优选的。
用于诱导抗体的多肽无需具有生物活性；然而，所述多肽或肽必须具备抗原性。用于诱导特定抗体的肽可具有由至少约10个氨基酸，优选至少约1 5或20个氨基酸或至少25或30个氨基酸组成的氨基酸序列。多肽的短片段可与另一种蛋白质，如匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)融合，并产生抗嵌合分子抗体。
产生多克隆和单克隆抗体的方法是本领域技术人员已知的，很多抗体是可以得到的。参见例如Coligan(1991)Current Protocols in ImmunologyWiley/Greene，NY；and Harlow and Lane(1989)Antibodies：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Press，NY；Stites等(编)Basic and ClinicalImmunology(4th ed.)Lange Medical Publications，Los Altos，CA和其中提及的参考文献；Goding(1986)Monoclonal Antibodies：Principles and Practice(2ded.)Academic Press，New York，NY；以及Kohler and Milstein(1975)Nature256：495-497。其它适当的抗体制备技术包括在噬菌体或类似载体中选择重组抗体文库，参见Huse等(1989)Science 246：1275-1281和Ward等(1989)Nature 341：544-546。特异性的单克隆和多克隆抗体及抗血清通常以至少约为0.1μM，优选至少约为0.01μM或更好，最常见并优选为0.001μM或更好的KD结合。
制备嵌合(人源化)抗体的详细方法可见于美国专利5,482,856。有关人源化和其它抗体制备和改造技术的其它细节可参见Borrebaeck(编)(1995)Antibody Engineering，2nd Edition，Freeman and Company，NY(Borrebaeck)；McCafferty等(1996)Antibody Engineering，A Practical Approach，IRL atOxford Press，Oxford，England(McCafferty)和Paul(1995)AntibodyEngineering Protocols，Humana Press，Towata，NJ(Paul)。
一方面，本发明提供了完全人源化的抗本发明多肽或其片段的抗体。在抗体被用作人患者的体内预防剂和/或治疗剂的应用中，人源化抗体特别合乎需要。人抗体的特征为由人免疫球蛋白序列组成。可以使用很多种方法生产本发明的人抗体(参见例如Larrick等，美国专利5,001,065以及Borrebaeck McCafferty与Paul，文献同上，综述)。一方面，起初在三元杂交瘤细胞中生产本发明的人抗体。然后将编码该抗体的基因克隆至其它细胞如非人哺乳动物细胞，并在其中表达。通过三元杂交瘤技术生产人抗体的一般方法描述于Ostberg等(1983)，Hybridoma 2：361367，Ostberg，美国专利4,634,664和Engelman等，美国专利4,634,666。通过此方法获得的产抗体细胞系被称为三元杂交瘤，因为它们是三个细胞即两个人型细胞和一个小鼠细胞的后代。已发现与制备自人细胞的普通杂交瘤相比，三元杂交瘤能更加稳定地生产抗体。
本说明书通篇给出本发明多肽的其它用途。
干扰素-α偶联物
另一方面，本发明涉及偶联物，所述偶联物包含表现出干扰素-α活性、含SEQ ID NO：2-35和SEQ ID NO：37-44中任一氨基酸序列的多肽以及至少一个与多肽连接的非多肽部分，诸如与多肽连接的1-6，1-5，1-4，1-3，例如1或2个非多肽部分。应当理解所述偶联物也可表现出干扰素-α活性(诸如，抗病毒活性、TH1分化活性和/或抗增殖活性)。
另一方面，偶联物包含表现出干扰素-α活性的多肽，所述多肽包含这样的氨基酸序列，该序列与SEQ ID NO：1在1至16个氨基酸位置中不同，并且，相对于SEQ ID NO：1而言，含有一个或多个选自下列的取代：F48A/L；V51P；F55A；F65A；F68P；L111A和V114P；所述偶联物还含有至少一个与多肽连接的非多肽部分，诸如与多肽连接的1-6，1-5，1-4，1-3，例如1或2个非多肽部分。在一些情况下，氨基酸序列还包含一个或多个取代，所述取代导入了非多肽部分的连接基团(例如，通过用包含非多肽部分的连接基团的不同残基取代氨基酸残基，或通过插入包含非多肽部分的连接基团的其它氨基酸残基)。应当理解偶联物也表现出干扰素-α活性(诸如，抗病毒活性、TH1分化活性和/或抗增殖活性)。
本发明还提供了偶联物，其各包含这样的多肽，所述多肽包含的序列(a)与SEQ ID NO：1在1-16个氨基酸位置中不同，并且(b)相对于SEQ ID NO：1而言，含有取代F48A/L，所述偶联物还包含至少一个与多肽连接的非多肽部分，诸如与多肽连接的1-6，1-5，1-4，1-3，例如1或2个非多肽部分。一些这样的偶联物含有与SEQ ID NO：1在1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或16个氨基酸位置中不同的多肽序列，例如在1-15个氨基酸位置，1-14个氨基酸位置，1-13个氨基酸位置，1-12个氨基酸位置，1-11个氨基酸位置，1-10个氨基酸位置，1-9个氨基酸位置，1-8个氨基酸位置，1-7个氨基酸位置，1-6个氨基酸位置，1-5个氨基酸位置，1-4个氨基酸位置，1-3个氨基酸位置或1-2个氨基酸位置中不同的序列。一些所述偶联物相对于SEQ ID NO：1而言，含有取代F48A。一些情况下，该偶联物的多肽部分相对于SEQ ID NO：1而言，还含有选自下列的一个或多个取代：H47Q；V51A/P；Q52P/E；A53T；F55A/S；L56V；F65A；F57L；Y58H；M61I；F68P；L111A；N113K；V114E/P和E160D。一些所述偶联物表现出干扰素-α活性(诸如抗病毒活性、TH1分化活性和/或抗增殖活性)。一些所述偶联物还包括一个或多个其它氨基酸，例如添加至多肽N-末端的甲硫氨酸。
本发明还提供了偶联物，其各包含这样的多肽，所述多肽包含的序列(a)与SEQ ID NO：1在1-16个氨基酸位置中不同，并且(b)相对于SEQ ID NO：1而言，含有取代F55A，所述偶联物还包含至少一个与多肽连接的非多肽部分，诸如与多肽连接的1-6，1-5，1-4，1-3，例如1或2个非多肽部分。一些这样的偶联物含有与SEQ ID NO：1在1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或16个氨基酸位置中不同的多肽序列，例如在1-15个氨基酸位置，1-14个氨基酸位置，1-13个氨基酸位置，1-12个氨基酸位置，1-11个氨基酸位置，1-10个氨基酸位置，1-9个氨基酸位置，1-8个氨基酸位置，1-7个氨基酸位置，1-6个氨基酸位置，1-5个氨基酸位置，1-4个氨基酸位置，1-3个氨基酸位置或1-2个氨基酸位置中不同的序列。一些情况下，该偶联物的多肽部分相对于SEQ ID NO：1而言，还含有选自下列的一个或多个取代：H47Q；F48A/L；V51A/P；Q52P/E；A53T；L56V；F65A；F57L；Y58H；M61I；F68P；L111A；N113K；V114E/P和E160D。一些所述偶联物表现出干扰素-α活性(诸如抗病毒活性、TH1分化活性和/或抗增殖活性)。一些所述偶联物还包括一个或多个其它氨基酸，例如添加至多肽N-末端的甲硫氨酸。
本发明还提供了偶联物，其各包含这样的多肽，所述多肽包含的序列(a)与SEQ ID NO：1在1-16个氨基酸位置中不同，并且(b)相对于SEQ ID NO：1而言，含有取代F65A，所述偶联物还包含至少一个与多肽连接的非多肽部分，诸如与多肽连接的1-6，1-5，1-4，1-3，例如1或2个非多肽部分。一些这样的偶联物含有与SEQ ID NO：1在1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或16个氨基酸位置中不同的多肽序列，例如在1-15个氨基酸位置，1-14个氨基酸位置，1-13个氨基酸位置，1-12个氨基酸位置，1-11个氨基酸位置，1-10个氨基酸位置，1-9个氨基酸位置，1-8个氨基酸位置，1-7个氨基酸位置，1-6个氨基酸位置，1-5个氨基酸位置，1-4个氨基酸位置，1-3个氨基酸位置或1-2个氨基酸位置中不同的序列。一些情况下，该偶联物的多肽部分相对于SEQ ID NO：1而言，还含有选自下列的一个或多个取代：H47Q；F48A/L；V51A/P；Q52P/E；A53T；F55A/S；L56V；F57L；Y58H；M61I；F68P；L111A；N113K；V114E/P和E160D。一些所述偶联物表现出干扰素-α活性(诸如抗病毒活性、TH1分化活性和/或抗增殖活性)。一些所述偶联物还包括一个或多个其它氨基酸，例如添加至多肽N-末端的甲硫氨酸。
本发明还提供了偶联物，其各包含这样的多肽，所述多肽包含的序列(a)与SEQ ID NO：1在1-16个氨基酸位置中不同，并且(b)相对于SEQ ID NO：1而言，含有取代L111A，所述偶联物还包含至少一个与多肽连接的非多肽部分，诸如与多肽连接的1-6，1-5，1-4，1-3，例如1或2个非多肽部分。一些这样的偶联物含有与SEQ ID NO：1在1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或16个氨基酸位置中不同的多肽序列，例如在1-15个氨基酸位置，1-14个氨基酸位置，1-13个氨基酸位置，1-12个氨基酸位置，1-11个氨基酸位置，1-10个氨基酸位置，1-9个氨基酸位置，1-8个氨基酸位置，1-7个氨基酸位置，1-6个氨基酸位置，1-5个氨基酸位置，1-4个氨基酸位置，1-3个氨基酸位置或1-2个氨基酸位置中不同的序列。一些情况下，该偶联物的多肽部分相对于SEQ ID NO：1而言，还含有选自下列的一个或多个取代：H47Q；F48A/L；V51A/P；Q52P/E；A53T；F55A/S；L56V；F65A；F57L；Y58H；M61I；F68P；N113K；V114E/P和E160D。一些所述偶联物表现出干扰素-α活性(诸如抗病毒活性、TH1分化活性和/或抗增殖活性)。一些所述偶联物还包括一个或多个其它氨基酸，例如添加至多肽N-末端的甲硫氨酸。
本发明还提供了偶联物，其各包含这样的多肽，所述多肽包含的序列(a)与SEQ ID NO：13在0-16个氨基酸位置中不同，并且(b)含有下述氨基酸中的一个或多个：第48位的Ala或Leu；第5 1位的Pro；第55位的Ala；第65位的Ala；第68位的Pro；第11 1位的Ala和第114位的Pro(相对于SEQ ID NO：13的位置编号)，所述偶联物还包含至少一个与多肽连接的非多肽部分，诸如与多肽连接的1-6，1-5，1-4，1-3，例如1或2个非多肽部分。一些这样的偶联物含有与SEQ ID NO：13在0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或16个氨基酸位置中不同的多肽序列，例如在0-15个氨基酸位置，0-14个氨基酸位置，0-13个氨基酸位置，0-12个氨基酸位置，0-11个氨基酸位置，0-10个氨基酸位置，0-9个氨基酸位置，0-8个氨基酸位置，0-7个氨基酸位置，0-6个氨基酸位置，0-5个氨基酸位置，0-4个氨基酸位置，0-3个氨基酸位置，0-2个氨基酸位置或0-1个氨基酸位置中不同的序列。一些这样的偶联物包含的多肽序列在第48位含有Ala或Leu。一些这样的偶联物包含的多肽序列在第48位含有Ala。在一些情况下，该偶联物的多肽部分相对于SEQ ID NO：13而言，还含有选自下列的一个或多个取代：H47Q；V51A；Q52P/E；A53T；F55S；L56V；F57L；Y58H；M61I；N113K；V114E和E160D。一些所述偶联物表现出干扰素-α活性(诸如抗病毒活性、TH1分化活性和/或抗增殖活性)。一些所述偶联物还含有一个或多个其它的氨基酸，例如添加至N-末端的甲硫氨酸。
另一方面，偶联物包含表现出干扰素-α活性的多肽，所述多肽包含这样的氨基酸序列，该序列与SEQ ID NO：36在1至16个氨基酸位置中不同，并且，相对于SEQ ID NO：36而言，含有一个或多个选自下列的取代：M21A；I24P；F48A/L；T51P；S55A；F65A；F68P；F90A；M93P；L111A；V114P；F124A；I127P和E160D；所述偶联物还含有至少一个与多肽连接的非多肽部分，诸如与多肽连接的1-6，1-5，1-4，1-3，例如1或2个非多肽部分。在一些情况下，氨基酸序列还包含一个或多个取代，所述取代导入了非多肽部分的连接基团(例如，通过用包含非多肽部分的连接基团的不同残基取代氨基酸残基，或通过插入包含非多肽部分的连接基团的其它氨基酸残基)。
本发明还提供了偶联物，其各包含这样的多肽，所述多肽包含的序列(a)与SEQ ID NO：36在1-16个氨基酸位置中不同，并且(b)相对于SEQ IDNO：36而言，含有取代F48A/L，所述偶联物还包含至少一个与多肽连接的非多肽部分，诸如与多肽连接的1-6，1-5，1-4，1-3，例如1或2个非多肽部分。一些这样的偶联物含有与SEQ ID NO：36在1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或16个氨基酸位置中不同的多肽序列，例如在1-15个氨基酸位置，1-14个氨基酸位置，1-13个氨基酸位置，1-12个氨基酸位置，1-11个氨基酸位置，1-10个氨基酸位置，1-9个氨基酸位置，1-8个氨基酸位置，1-7个氨基酸位置，1-6个氨基酸位置，1-5个氨基酸位置，1-4个氨基酸位置，1-3个氨基酸位置或1-2个氨基酸位置中不同的序列。一些所述偶联物相对于SEQ ID NO：36而言，含有取代F48A。一些情况下，该偶联物的多肽部分相对于SEQ ID NO：36而言，还含有选自下列的一个或多个取代：M21A；I24P；P26L；H47Q；T51V/P；S55P/F/A；V56L；H58Y；L60M；F65A；F68P；F90Y/A；M93L/P；N95D；L111A；N113K；V114E/P；F124A；R125Q；I127P；T132K；L154F和E160D。一些所述偶联物表现出干扰素-α活性(诸如抗病毒活性、TH1分化活性和/或抗增殖活性)。一些所述偶联物还包括一个或多个其它氨基酸，例如添加至多肽N-末端的甲硫氨酸。
本发明还提供了偶联物，其各包含这样的多肽，所述多肽包含的序列(a)与SEQ ID NO：36在1-16个氨基酸位置中不同，并且(b)相对于SEQ IDNO：36而言，含有取代F90A，所述偶联物还包含至少一个与多肽连接的非多肽部分，诸如与多肽连接的1-6，1-5，1-4，1-3，例如1或2个非多肽部分。一些这样的偶联物含有与SEQ ID NO：36在1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或16个氨基酸位置中不同的多肽序列，例如在1-15个氨基酸位置，1-14个氨基酸位置，1-13个氨基酸位置，1-12个氨基酸位置，1-11个氨基酸位置，1-10个氨基酸位置，1-9个氨基酸位置，1-8个氨基酸位置，1-7个氨基酸位置，1-6个氨基酸位置，1-5个氨基酸位置，1-4个氨基酸位置，1-3个氨基酸位置或1-2个氨基酸位置中不同的序列。一些情况下，该偶联物的多肽部分相对于SEQ ID NO：36而言，还含有选自下列的一个或多个取代：M21A；I24P；P26L；H47Q；F48A/L；T5 1V/P；S55P/F/A；V56L；H58Y；L60M；F65A；F68P；M93L/P；N95D；L111A；N113K；V114E/P；F124A；R125Q；I127P；T132K；L154F和E160D。一些所述偶联物表现出干扰素-α活性(诸如抗病毒活性、TH1分化活性和/或抗增殖活性)。一些所述偶联物还包括一个或多个其它氨基酸，例如添加至多肽N-末端的甲硫氨酸。
本发明还提供了偶联物，其各包含这样的多肽，所述多肽包含的序列(a)与SEQ ID NO：36在1-16个氨基酸位置中不同，并且(b)相对于SEQ IDNO：36而言，含有取代E160D，所述偶联物还包含至少一个与多肽连接的非多肽部分，诸如与多肽连接的1-6，1-5，1-4，1-3，例如1或2个非多肽部分。一些这样的偶联物含有与SEQ ID NO：36在1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或16个氨基酸位置中不同的多肽序列，例如在1-15个氨基酸位置，1-14个氨基酸位置，1-13个氨基酸位置，1-12个氨基酸位置，1-11个氨基酸位置，1-10个氨基酸位置，1-9个氨基酸位置，1-8个氨基酸位置，1-7个氨基酸位置，1-6个氨基酸位置，1-5个氨基酸位置，1-4个氨基酸位置，1-3个氨基酸位置或1-2个氨基酸位置中不同的序列。一些情况下，该偶联物的多肽部分相对于SEQ ID NO：36而言，还含有选自下列的一个或多个取代：M21A；I24P；P26L；H47Q；F48A/L；T51V/P；S55P/F/A；V56L；H58Y；L60M；F65A；F68P；F90Y/A；M93L/P；N95D；L111A；N113K；V114E/P；F124A；R125Q；I127P；T132K和L154F。一些所述偶联物表现出干扰素-α活性(诸如抗病毒活性、TH1分化活性和/或抗增殖活性)。一些所述偶联物还包括一个或多个其它氨基酸，例如添加至多肽N-末端的甲硫氨酸。
本发明还提供了偶联物，其各包含这样的多肽，所述多肽包含的序列(a)与SEQ ID NO：38在0-16个氨基酸位置中不同，并且(b)含有下述氨基酸中的一个或多个：第2 1位的Ala；第24位的Pro；第48位的Ala或Leu；第5 1位的Pro；第5 5位的Ala；第65位的Ala；第68位的Pro；第90位的Ala；第93位的Pro；第111位的Ala；第114位的Pro；第124位的Ala；第127位的Pro；和第160位的Glu(相对于SEQ ID NO：38的位置编号)，所述偶联物还包含至少一个与多肽连接的非多肽部分，诸如与多肽连接的1-6，1-5，1-4，1-3，例如1或2个非多肽部分。一些这样的偶联物含有与SEQ IDNO：38在0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或16个氨基酸位置中不同的多肽序列，例如在0-15个氨基酸位置，0-14个氨基酸位置，0-13个氨基酸位置，0-12个氨基酸位置，0-11个氨基酸位置，0-10个氨基酸位置，0-9个氨基酸位置，0-8个氨基酸位置，0-7个氨基酸位置，0-6个氨基酸位置，0-5个氨基酸位置，0-4个氨基酸位置，0-3个氨基酸位置，0-2个氨基酸位置或0-1个氨基酸位置中不同的序列。一些这样的偶联物包含的多肽序列在第48位含有Ala或Leu。一些这样的偶联物包含的多肽序列在第48位含有Ala。在一些情况下，该偶联物的多肽部分相对于SEQ ID NO：38而言，还含有选自下列的一个或多个取代：P26L；H47Q；V51T；F55P/S；L56V；Y58H；L60M；F90 Y；M93L；N95D；N113K；V114E；R125Q；T132K和F154L。一些所述偶联物表现出干扰素-α活性(诸如抗病毒活性、TH1分化活性和/或抗增殖活性)。一些所述偶联物包含的多肽序列还含有一个或多个其它的氨基酸，例如添加至N-末端的甲硫氨酸。
术语“偶联物”(或可互换的“多肽偶联物”或“偶联的多肽”)意指由一个或多个本发明的多肽共价连接到一个或多个非多肽部分上形成的异源(就组合物而言(in the sense of composite))分子。术语“共价连接”的意思是多肽和非多肽部分直接彼此共价连接，或者通过诸如桥接(bridge)，间隔物(spacer)，或连接部分等的一个或多个间插部分(intervening moiety)间接彼此共价连接。优选的是，偶联的多肽在有关浓度和条件下是可溶的，即在诸如血液等生理学液体中是可溶的。本发明偶联的多肽的例子包括糖基化和/或PEG化多肽。对于偶联的多肽的多肽部分可使用术语“非偶联型多肽”。
术语“非多肽部分”意指能与多肽的连接基团偶联的分子。非肽部分的优选例子包括聚合物分子，亲脂性化合物，或有机衍生物，具体是聚合物分子或糖部分。应当理解非多肽部分经由多肽的连接基团而与该多肽连接。除非在与多肽连接的非多肽部分，诸如聚合物分子的数量被指明的情况，对与多肽连接的或本发明中使用的其它“非多肽部分”的每一个指称均应指与多肽连接的一个或多个非多肽部分。
术语“聚合物分子”定义为由两个或多个单体共价连接形成的分子，其中没有一个单体是氨基酸残基。术语“聚合物”可与术语“聚合物分子”互换使用。
术语“糖部分”意指通过体内或体外糖基化，诸如N-或O-糖基化连接的碳水化合物分子。
“N-糖基化位点”具有序列N-X-S/T/C，其中X是除了脯氨酸以外的任何氨基酸，N是天冬酰胺，S/T/C是丝氨酸、苏氨酸或半胱氨酸，优选丝氨酸或苏氨酸，最优选苏氨酸。
“O-糖基化位点”是丝氨酸或苏氨酸残基的-OH基。
术语“连接基团”意指能偶联到诸如聚合物分子或糖部分的有关非多肽部分上的氨基酸残基基团。下表4中提供了有用的连接基团及一些相应非多肽部分的非限制性实例。
表4
有用的连接基团和相应非多肽部分的实例
连接基团 氨基酸 非多肽部分的实例 偶联方法/活化PEG 参考文献
-NH2 N末端，Lys 聚合物，例如PEG mPEG-SPAmPEG2-NHSmPEG2-butryALD Nektar Inc.2003产品目录
-COOH C末端，Asp，Glu 聚合物，例如PEG糖部分 mPEG-Hz体外偶联 Nektar Inc.2003产品目录
-SH Cys 聚合物，例如PEG，糖部分 mPEG-VSmPEG2-MAL体外偶联 Nektar Inc.2003产品目录；Delgado et al，CriticalReviews in TherapeuticDrug Carrier Systems9(3，4)：249-304(1992)
-OH Ser，Thr，OH-，Lys 糖部分 体内O连接的糖基化
-CONH2 Asn作为N-糖基化位点的一部分 糖部分 体内糖基化
芳香族残基 Phe，Tyr，Trp 糖部分 体外偶联
-CONH2 Gln 糖部分 体外偶联 Yan和Wold，Biochemistry，1984，Jul31；23(16)：3759-65
醛酮 氧化的糖 聚合物，例如PEG，PEG-酰肼 PEG化 Andresz等，1978，Makromol. Chem.179：301；WO 92/16555，WO 00/23114
连接基团 氨基酸 非多肽部分的实例 偶联方法/活化PEG 参考文献
胍 Arg 糖部分 体外偶联 Lundblad和Noyes，Chemical Reagents forProtein Modification，CRC Press Inc.BocaRaton，FI
咪唑环 His 糖部分 体外偶联 与胍相同
对于体内N-糖基化而言，术语“连接基团”以非常规的方式使用，指组成N-糖基化位点(具有序列N-X-S/T/C，其中X是除脯氨酸外的任意氨基酸残基，N是天冬酰胺，S/T/C是丝氨酸，苏氨酸或半胱氨酸，优选丝氨酸或苏氨酸，且最优选苏氨酸)的氨基酸残基。尽管N-糖基化位点的天冬酰胺残基是糖部分在糖基化期间所连接的残基，但除非存在N-糖基化位点的其它氨基酸残基，否则将不能实现该连接。因此，当非多肽部分是糖部分，且偶联是通过N-糖基化实现时，与本发明多肽的氨基酸序列改变关联使用的术语“含有非多肽部分连接基团的氨基酸残基”应理解为，组成N-糖基化位点的一个，两个或所有氨基酸残基将以这样的方式改变，即将功能性N-糖基化位点引入氨基酸序列或从所述序列中去掉该位点，或在所述氨基酸序列中保留了功能性N-糖基化位点(例如，通过用苏氨酸残基取代作为部分N-糖基化位点的丝氨酸残基，反之亦然)。
术语“引入”(即，“引入的”氨基酸残基，氨基酸残基的“引入”)主要是指现有氨基酸残基被取代为另一氨基酸残基，但也可指插入其它的氨基酸残基。
术语“去除”(即，“去除的”氨基酸残基，“氨基酸残基的去除”)主要是指待去除的氨基酸残基被另一氨基酸残基取代，但也指待去除的氨基酸残基的缺失(没有取代)。
术语“含有非多肽部分连接基团的氨基酸残基”是与非多肽部分结合的氨基酸残基(对于引入的氨基酸残基而言)，或可与该非多肽部分结合的氨基酸残基(对于去除的氨基酸残基而言)。
术语“功能性体内半寿期”使用其通常的含义，即多肽在体内/靶器官中仍具有50％生物活性的时间，或者多肽的活性为最初活性的50％的时间。功能性体内半寿期可在受试动物，诸如大鼠，小鼠，兔，犬或猴中测定。优选地，功能性体内半寿期在非人灵长类，诸如猴中测定。此外，可对测定已通过静脉内或皮下施用的样品的功能性体内半寿期。
作为测定功能性体内半寿期的可选方式，可测定“血清半寿期”，即，50％的多肽在被清除之前在血浆或血流中循环的时间。血清半寿期的测定常常比功能性体内半寿期的测定简单，并且血清半寿期的量级通常可以很好地指示功能性体内半寿期的量级。血清半寿期的其它可替换术语包括“血浆半寿期”、“循环半寿期”、“血清清除”、“血浆清除”和“清除半寿期”。血清半寿期可按照上述与功能性体内半寿期测定相关的内容进行测定。
术语“血清”使用其通常的含义，即不含纤维蛋白原和其它凝血因子的血浆。
涉及功能性体内半寿期或血清半寿期的术语“增加”用于指，本发明的偶联物的相关半寿期相对于参照分子的所述半寿期而言有统计学上显著的增加，所述参照分子诸如野生型干扰素-α，例如，人干扰素-α，诸如SEQID NO：45-SEQ ID NO：56之一(或如本文和/或Allen G.和Diaz M.O.(1996)，文献同上所述的其它huIFN-α序列)或相应的非偶联型的多肽。因此，本发明的兴趣偶联物包括与上述参照分子相比，其功能性体内半寿期或血清半寿期增加的偶联物。
术语“AUCsc”或“皮下给药时的曲线下面积”用其常规含义，即血清干扰素-α活性-时间曲线以下的面积，这里所述的偶联分子经皮下给药受试动物。一旦测定了实验干扰素-α活性-时间点，就可利用计算机程序，诸如GraphPad Prism 3.01常规计算AUCsc。
涉及AUCsc的术语“增加”用于指，当静脉给药并且在可比条件下测定时，本发明偶联物的曲线下面积相对于参照分子的所述面积有统计学显著的增加，所述参照分子诸如野生型干扰素-α，例如人干扰素-α，诸如SEQID NO：45-SEQ ID NO：56之一(或如本文和/或Allen G.和Diaz M.O.(1996)，文献同上所述的其它huIFN-α序列)，或相应非偶联型多肽。显然，本发明偶联物与参照分子所用的干扰素-α活性量应该相同。结果是，为了直接比较不同的干扰素-α分子，可将AUCsc值标准化，即它们可表示为AUCsc/施用剂量。
术语“Tmax，sc”用于指血清干扰素-α活性-时间曲线中，观察到血清中最高水平干扰素-α活性的时间。
应当理解虽然本文提供的实施例和对亲本多肽的修饰是相对于序列SEQ ID NO：1而言的，所公开的修饰还可在本文所述本发明的任何其它多肽(包括SEQ ID NO：2-35和37-44和其变体)的等效氨基酸位置进行。
通过去除和/或引入包含偶联非多肽部分的连接基团的氨基酸残基，可以特异性地改造多肽，以便使得该分子更易于与所选非多肽部分偶联，以便最优化偶联模式(例如确保干扰素-α分子的表面非多肽部分的最优分布，由此例如有效地保护(shield)表位和多肽的其它表面部分而不会显著地破坏其功能)。例如，通过引入连接基团，干扰素-α多肽中与非多肽部分所结合的具体氨基酸残基的含量改变，由此实现更有效、特异和/或广泛的偶联。通过去除一个或多个连接基团，可以避免与其中该偶联是不利的部分多肽中的非多肽部分发生偶联，例如与位于多肽功能位点上或附近的氨基酸残基(因为在所述位点的偶联会导致合成的偶联物的干扰素-α活性失活或降低，这是由于受体识别被破坏)。更进一步，去除位于其它连接基团附近的连接基团是有利的。
应当理解，包含非多肽部分的连接基团的氨基酸残基(无论被去除或是引入)基于非多肽部分的性质选出且，在一些情况下基于使用的偶联方法。例如，当非多肽部分是聚合物分子时，诸如聚乙二醇或聚烯基氧化物衍生的分子，能作为连接基团发挥功能的氨基酸残基可选自半胱氨酸、赖氨酸(和/或多肽的N末端氨基)、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸或精氨酸。当非多肽部分是糖部分时，连接基团是体内或体外N-糖基化位点或O-糖基化位点，优选N-糖基化位点。
在一些情况下，当非多肽部分的连接基团要引入到干扰素-α多肽或从干扰素-α多肽去除时，要被修饰的干扰素-α多肽的位置可如下方便地选择：
被修饰的位置可以位于干扰素-α多肽的表面，诸如被一种氨基酸残基占据的位置，所述氨基酸残基大于25％的侧链暴露于溶剂，诸如其大于50％的侧链暴露于溶剂。以人干扰素-α2a分子3D结构的分析为基础鉴定所述位置，如在本文“材料和方法”章节中所述。
为了测定连接基团的最佳分布，以干扰素-α多肽的3D结构为基础，计算位于干扰素-α分子表面的氨基酸残基间的距离。更具体地，包含所述连接基团的氨基酸残基的CB间的距离，或测定一个氨基酸残基的官能团(赖氨酸的NZ，天冬氨酸的CG，谷氨酸的CD，半胱氨酸的SG)和包含连接基团的另一氨基酸残基的CB间的距离。在甘氨酸的情况中，用CA代替CB。在本发明偶联物的干扰素-α多肽部分中，为了避免或减少异源偶联并提供连接基团的均匀分布，例如为了表位保护的目的，任何所述距离可大于8，诸如大于10。
此外，在本发明偶联物的干扰素-α多肽部分中，在一些情况下，位于干扰素-α的受体结合部位或其附近的连接基团被去除，诸如通过包含所述基团的氨基酸残基的取代。在一些情况下，包含非多肽部分的连接基团的氨基酸残基，诸如半胱氨酸或赖氨酸，不常被引入到干扰素α分子的受体结合部位或附近。
修饰干扰素-α多肽的其它方式是通过与非多肽部分的偶联，保护并由此修饰或破坏或灭活存在于亲本干扰素-α中的表位。干扰素-α多肽的表位可使用本领域已知方法鉴定，也称为表位作图，参见例如Romagnoli等，J.BiolChem.，1999，380(5)：553-9，DeLisser HM，Methods Mol Biol，1999，96：11-20，Van de Water等，Clin Immunol Immunopathol，1997，85(3)：229-35，Saint-RemyJM，Toxicology，1997，119(1)：77-81，和Lane DP和Stephen CW，Curr OpinImmunol，1993，5(2)：268-71。一种方法是建立噬菌体展示文库，其表达例如，9氨基酸残基的任意寡肽。通过免疫沉淀纯化来自特异性抗血清的抗人干扰素-αIgG1抗体，通过免疫印迹识别活性噬菌体。通过对纯化的活性噬菌体DNA的序列测定，然后将该序列定位于干扰素-α的3D结构，可以测定寡肽的序列。可选地，依照美国专利5,041,376描述的方法可以鉴定表位。由此鉴定的该结构上的区构成表位，其可被选出作为用于引入偶联非多肽部分的连接基团的靶区。优选地，干扰素-α的至少一个表位，诸如两个，三个或四个表位可被根据本发明的非多肽部分保护。因此，在一个方面中，与野生型人干扰素-α(包括任何商业上可以得到的干扰素-α)相比，本发明的偶联物具有至少一个受到保护的表位。这可以通过将非多肽部分的连接基团引入至位于给定表位邻近的位置(即在初始序列中4个氨基酸残基之内或在三级序列中约10之内)来实现。在CB(在甘氨酸的情况下为CA)之间测定10。以下章节中描述了所述具体引入。
在去除连接基团的情况下，包括所述基团并占据上述位置的相关氨基酸残基可被不包含用于偶联目的非多肽部分的连接基团的不同氨基酸残基取代，或可被缺失。N-糖基化基团的去除也可通过插入或去除基序N-X-S/T/C中的氨基酸残基而实现。
在引入连接基团的情况下，将包含所述基团的氨基酸残基引入所述位置中，诸如通过取代占据所述位置的氨基酸残基。
可用于偶联并存在于干扰素-α多肽中的连接基团的准确数目依赖于需要通过偶联来实现的效果。例如，欲得到的效果例如依赖于偶联的性质和程度(例如非多肽部分的鉴定，需要或可能与多肽偶联的非多肽部分的数量，其应被偶联或应避免所述偶联的情况等)。例如，如果需要降低的免疫原性，连接基团的数量(和位置)应足以保护大多数或全部表位。这通常在保护较大比例的干扰素-α多肽时实现。表位的有效保护通常在可用于偶联的连接基团的总数为1-6个连接基团，例如，1-5个，诸如1-3个，诸如1，2，或3个连接基团时得以实现。
功能性体内半寿期依赖于偶联物的分子量，提供增加的半寿期所需的连接基团的数量，由此依赖于目的非多肽部分的分子量。一些所述偶联物包含1-6，例如，1-5，诸如1-3，例如1，2或3个非多肽部分，其各自的MW为约2-40kDa，诸如约2kDa，约5kDa，约12kDa，约15kDa，约20kDa，约30kDa或约40kDa。
在本发明的偶联物中，一些、大多数、和基本上全部可偶联的连接基团可被相关的非多肽部分占据。
本发明的偶联物可表现出一种或多种以下改善的特性：
例如，与人干扰素-α(诸如在本文中被确定为SEQ ID NO：45-57的任何多肽，或本文和/或如上文Allen G.和Diaz M.O.(1996)，文献同上所述的任何其它huIFN-α)或相应的非偶联型的多肽相比，所述偶联物表现出降低的免疫原性，例如与非偶联型的多肽或人干扰素-α相比，降低了至少10％，诸如降低了至少25％，诸如降低了至少50％，例如降低了至少75％。
另一方面，偶联物可表现出与来自用人干扰素-α(诸如在本文中被确定为SEQ ID NO：45-57的任何多肽，或本文和/或如上文Allen G.和Diaz M.O.(1996)，文献同上所述的任何其它huIFN-α)或与相应非偶联型的多肽所治疗患者的中和抗体的反应降低或无反应，例如中和降低至少10％，诸如至少25％，诸如至少50％，例如至少75％。
在本发明的另一方面，与参照分子诸如人干扰素-α(诸如在本文中被确定为SEQ ID NO：45-57的任何多肽，或本文和/或如上文Allen G.和Diaz M.O.(1996)，文献同上所述的任何其它huIFN-α)或相应的非偶联型多肽相比，所述偶联物可表现出增加的体内半寿期和/或增加的血清半寿期。具体优选的偶联物是这样的偶联物，所述偶联物的功能性体内半寿期(或血清半寿期)与所述参照分子的功能性体内半寿期(或血清半寿期)之间的比率为至少1.25，诸如至少1.50，诸如至少1.75，诸如至少2，诸如至少3，诸如至少4，诸如至少5，诸如至少6，诸如至少7，诸如至少8。如上所述，半寿期可在受试动物诸如大鼠或猴中方便地测定，且基于静脉内或皮下给药。
另一方面，与参照分子诸如人干扰素-α(诸如在本文中被确定为SEQ IDNO：45-57的任何多肽，或本文和/或如上文Allen G.和Diaz M.O.(1996)，文献同上所述的任何其它huIFN-α)或相应的非偶联型多肽相比，所述偶联物可表现出增加的生物利用度。例如，与参照分子诸如人干扰素-α或相应的非偶联型多肽相比，偶联物可表现出增高的AUCsc。因此，示例性偶联物这样的偶联物，当经皮下施用时，具体是经皮下施用于受试动物诸如大鼠或猴时，所述偶联物的AUCsc与所述参照分子的AUCsc之间的比率为至少1.25，诸如至少1.5，诸如至少2，诸如至少3，诸如至少4，诸如至少5或至少6，诸如至少7，诸如至少8，诸如至少9或至少10，诸如至少12，诸如至少14，例如至少16，至少18或至少20。类似地，当经皮下施用时，具体是经皮下施用于受试动物诸如大鼠或猴时，本发明的一些偶联物是这样的偶联物，所述偶联物的Tmax与所述参照分子诸如人干扰素-α或相应的非偶联型多肽的Tmax之间的比率为至少1.2，诸如至少1.4，例如至少1.6，诸如至少1.8，诸如至少2，例如至少2.5，诸如至少3，诸如至少4，例如至少5，诸如至少6，诸如至少7，例如至少8，诸如至少9，诸如至少10。
在一些情况下，本发明偶联物的抗病毒活性量级(magnitude)与人干扰素-α(诸如在本文中被确定为SEQ ID NO：45-57的任何多肽，或本文和/或如上文Allen G.和Diaz M.O.(1996)，文献同上所述的任何其它huIFN-α)或相应的非偶联型多肽的所述活性相比降低(例如降低至少约75％，至少约50％，至少约25％，至少约10％)或增加(例如增加至少约10％)或是大约相等(例如在约+/-10％或约+/-5％之内)。在一些情况下，与本发明偶联物的抗增殖活性相比，抗病毒活性的程度(degree)可有所变化，由此可高于、低于或大约等于人干扰素-α或相应非偶联型多肽的程度。
本发明的偶联物，其中非多肽部分与赖氨酸残基或N-末端的胺结合
一方面，本发明涉及这样的偶联物，其表现出干扰素-α活性且包括至少一个非多肽部分，该非多肽部分与干扰素-α多肽的至少一个赖氨酸残基和/或N-末端氨基偶联，所述干扰素-α多肽含有选自SEQ ID NO：2-35和37-44的序列。一些所述偶联物含有与赖氨酸残基连接的非多肽部分，所述赖氨酸残基选自K31，K50，K71，K84，K122，K134，K135和K165；例如选自K31，K122，K135和K165。一些所述偶联物含有与选自K31，K122和K135的赖氨酸残基连接的非多肽部分。一些所述偶联物含有与选自K122和K135的赖氨酸残基连接的非多肽部分。一些所述偶联物含有与选自K31和K122；或K31和K135的赖氨酸残基连接的非多肽部分。
另一方面，本发明涉及这样的偶联物，其表现出干扰素-α活性且包括至少一个非多肽部分，该非多肽部分与干扰素-α多肽的至少一个赖氨酸残基，或与N-末端氨基偶联，所述干扰素-α多肽包含的序列(a)与SEQ ID NO：1在1-16个氨基酸位置中不同(例如在1-15个氨基酸位置，1-14个氨基酸位置，1-13个氨基酸位置，1-12个氨基酸位置，1-11个氨基酸位置，1-10个氨基酸位置，1-9个氨基酸位置，1-8个氨基酸位置，1-7个氨基酸位置，1-6个氨基酸位置，1-5个氨基酸位置，1-4个氨基酸位置，1-3个氨基酸位置或在1-2个氨基酸位置中存在不同)，(b)相对于SEQ ID NO：1含有一个或多个选自下列的取代：F48A/L；V51P；F55A；F65A；F68P；L111A和V114P。一些所述偶联物包含的多肽序列还含有一个或多个其它的氨基酸，例如添加至N-末端的甲硫氨酸。一些根据此方面的偶联物含有至少一个被去除的赖氨酸残基和/或至少一个被去除的组氨酸残基，和/或至少一个被引入的赖氨酸残基。
另一方面，本发明涉及这样的偶联物，其表现出干扰素-α活性且包括至少一个非多肽部分，该非多肽部分与干扰素-α多肽的至少一个赖氨酸残基，或与N-末端氨基偶联，所述干扰素-α多肽包含的序列(a)与SEQ IDNO：13在0-16个氨基酸位置中不同(例如在0-15个氨基酸位置，0-14个氨基酸位置，0-13个氨基酸位置，0-12个氨基酸位置，0-11个氨基酸位置，0-10个氨基酸位置，0-9个氨基酸位置，0-8个氨基酸位置，0-7个氨基酸位置，0-6个氨基酸位置，0-5个氨基酸位置，0-4个氨基酸位置，0-3个氨基酸位置，0-2个氨基酸位置或0-1个氨基酸位置中存在不同)，并且(b)含有下述氨基酸中的一个或多个：第48位的Ala或Leu；第51位的Pro；第55位的Ala；第65位的Ala；第68位的Pro；第111位的Ala和第114位的Pro(相对于SEQ ID NO：13的位置编号)。一些这样的偶联物包含的多肽序列在第48位含有Ala或Leu。一些这样的偶联物包含的多肽序列在第48位含有Ala。在一些情况下，该偶联物的多肽部分相对于SEQ ID NO：13而言，还含有选自下列的一个或多个取代：H47Q；V51A；Q52P/E；A53T；F55S；L56V；F57L；Y58H；M61I；N113K；V114E和E160D。一些所述偶联物包含的多肽序列还含有一个或多个其它的氨基酸，例如添加至N-末端的甲硫氨酸。一些根据此方面的偶联物含有至少一个被去除的赖氨酸残基和/或至少一个被去除的组氨酸残基，和/或至少一个被引入的赖氨酸残基。
另一方面，本发明涉及这样的偶联物，其表现出干扰素-α活性且包括至少一个非多肽部分，该非多肽部分与干扰素-α多肽的至少一个赖氨酸残基，或与N-末端氨基偶联，所述干扰素-α多肽包含的序列(a)与SEQ IDNO：36在1-16个氨基酸位置中不同(例如在1-15个氨基酸位置，1-14个氨基酸位置，1-13个氨基酸位置，1-12个氨基酸位置，1-11个氨基酸位置，1-10个氨基酸位置，1-9个氨基酸位置，1-8个氨基酸位置，1-7个氨基酸位置，1-6个氨基酸位置，1-5个氨基酸位置，1-4个氨基酸位置，1-3个氨基酸位置或在1-2个氨基酸位置中存在不同)，(b)相对于SEQ ID NO：36含有一个或多个选自下列的取代：M21A；I24P；F48A/L；T51P；S55A；F65A；F68P；F90A；M93P；L111A；V114P；F124A；I127P和E160D。一些所述偶联物包含的多肽序列还含有一个或多个其它的氨基酸，例如添加至N-末端的甲硫氨酸。一些根据此方面的偶联物含有至少一个被去除的赖氨酸残基和/或至少一个被去除的组氨酸残基，和/或至少一个被引入的赖氨酸残基。
本发明还提供了这样的偶联物，其表现出干扰素-α活性且包括至少一个非多肽部分，该非多肽部分与干扰素-α多肽的至少一个赖氨酸残基，或与N-末端氨基偶联，所述干扰素-α多肽包含的序列(a)与SEQ ID NO：38在0-16个氨基酸位置中不同(例如在0-15个氨基酸位置，0-14个氨基酸位置，0-13个氨基酸位置，0-12个氨基酸位置，0-11个氨基酸位置，0-10个氨基酸位置，0-9个氨基酸位置，0-8个氨基酸位置，0-7个氨基酸位置，0-6个氨基酸位置，0-5个氨基酸位置，0-4个氨基酸位置，0-3个氨基酸位置，0-2个氨基酸位置或0-1个氨基酸位置中存在不同)，并且(b)含有下述氨基酸中的一个或多个：第21位的Ala；第24位的Pro；第48位的Ala或Leu；第51位的Pro；第55位的Ala；第65位的Ala；第68位的Pro；第90位的Ala；第93位的Pro；第111位的Ala；第114位的Pro；第124位的Ala；第127位的Pro；和第160位的Glu(相对于SEQ ID NO：38的位置编号)。一些这样的偶联物包含的多肽序列在第48位含有Ala或Leu。一些这样的偶联物包含的多肽序列在第48位含有Ala。在一些情况下，该偶联物的多肽部分相对于SEQ ID NO：38而言，还含有选自下列的一个或多个取代：P26L；H47Q；V51T；F55P/S；L56V；Y58H；L60M；F90Y；M93L；N95D；N113K；V114E；R125Q；T132K和F154L。一些所述偶联物包含的多肽序列还含有一个或多个其它的氨基酸，例如添加至N-末端的甲硫氨酸。一些根据此方面的偶联物含有至少一个被去除的赖氨酸残基和/或至少一个被去除的组氨酸残基，和/或至少一个被引入的赖氨酸残基。
本发明的一些偶联物包含的多肽序列含有氨基酸残基对不同氨基酸残基的取代或氨基酸残基的缺失，所述取代或缺失从本发明的多肽，例如SEQID NO：2-35和37-44之一中去除了一个或多个赖氨酸，例如K31，K50，K71，K84，K122，K133，K134，K135和/或K165中的一个或多个。被去除的一个或多个赖氨酸残基可被任何其它氨基酸所取代，可被Arg(R)或Gln(Q)所取代，或可被缺失。
在使用胺反应性偶联化学时，避免或将与组氨酸残基偶联的可能性最小化是有益的。因此，一些本发明的偶联物包括一种多肽序列，该多肽序列含有从任何本发明的多肽中去除一个或多个组氨酸例如H7，H11，H34和/或H47(相对于SEQ ID NO：1)的取代或缺失，所述本发明的多肽序列例如为SEQ ID NO：2-35和37-44之一。要被去除的一个或多个组氨酸残基可以被任何其它氨基酸取代，可被Arg(R)或Gln(Q)取代，或被缺失。一些所述偶联物包含取代H34Q；H47Q；或H34Q+H47Q。
可选地，或此外，一些本发明的偶联物包括含有修饰的多肽序列，所述修饰将赖氨酸引入亲本序列(例如，SEQ ID NO：2-35和37-44之一)，引入位置是被暴露于该分子表面的氨基酸残基所占据的位置，所述氨基酸残基例如是至少25％，诸如至少50％的侧链暴露于表面的氨基酸残基。一些所述偶联物包括这样的多肽序列，该多肽序列包含一种或多种以下取代(相对于SEQ ID NO：1)，其将赖氨酸残基引入据预测会暴露于该分子表面且具有超过25％分数ASA的位置：D2K，L3K，P4K，Q5K，T6K，H7K，S8K，L9K，G10K，R12K，R13K，M16K，A19K，Q20K，R22K，R23K，I24K，S25K，L26K，F27K，S28K，L30K，R33K，H34K，D35K，R37K，Q40K，E41K，E42K，D44K，N46K，H47K，Q49K，V51K，Q52K，E59K，Q62K，Q63K，N66K，S69K，T70K，D72K，S74K，A75K，D78K，E79K，T80K，L81K，E83K，I87K，F90K，Q91K，N94K，D95K，E97K，A98K，V100K，M101K，Q102K，E103K，V104K，G105K，E107K，E108K，T109K，P110K，L111K，M112K，N113K，V114K，D115K，L118K，R121K，Q125K，R126K，T128K，L129K，T132K，E133K，Y136K，S137K，P138K，A146K，M149K，R150K，S153K，F154K，N157K，Q159K，E160K，S161K，L162K，R163K，S164K和E166K，所述氨基酸残基位置相对于SEQ ID NO：1。
本发明的一些所述偶联物包括这样的多肽序列，该多肽序列包含一种或多种以下取代(相对于SEQ ID NO：1)，其将赖氨酸残基引入据预测会暴露于该分子表面且具有超过50％分数ASA的位置：D2K，L3K，P4K，Q5K，T6K，H7K，S8K，L9K，R12K，R13K，M16K，A19K，S25K，F27K，S28K，R33K，H34K，D35K，R37K，E4 1K，D44K，N46K，H47K，Q49K，N66K，A75K，D78K，E79K，T80K，E83K，I87K，F90K，Q91K，N94K，D95K，M101K，Q102K，E103K，G105K，E107K，E108K，T109K，P110K，L111K，V114K，D115K，L118K，R121K，Q125K，R126K，L129K，T132K，E133K，P138K，R150K，E160K，L162K，R163K，S164K和E166K，所述氨基酸残基位置相对于SEQ ID NO：1。
应当理解，虽然在本文中对亲本多肽修饰的实例通常相对于序列SEQID NO：1(或相对于一些其它特定序列)给出，所公开的修饰还可在本文所述本发明任何其它多肽(包括SEQ ID NO：2-35和37-44及其变体)的等效氨基酸位置实施。因此，作为实例，相对于SEQ ID NO：1的取代H47K被认为对应于SEQ ID NO：37中的Q47K，等等。
在本发明的该方面中涉及的非多肽部分包含聚合物分子，诸如在题目为“与聚合物分子偶联”的章节中描述的任何分子，诸如PEG或mPEG或mPEG2。包含赖氨酸的多肽和聚合物分子之间的偶联可以用任何适当的方法完成，例如题目为“与聚合物分子偶联”的章节中所述，例如使用所述章节描述的一步法或逐步法。PEG化干扰素-α多肽的示例性方法是如本文实施例5所述，采用赖氨酸反应性PEG将PEG与赖氨酸残基共价连接。许多高特异性赖氨酸反应性PEG(琥珀酰亚胺丙酸酯(SPA)，琥珀酰亚胺丁酸酯(SBA)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和醛(例如ButyrALD))以及大小不同的线性或分枝PEG(例如2-40kDa，诸如2kDa，5kDa，12kDa，15kDa，20kDa，30kDa或40kDa)可购得，例如获自Nektar Therapeutics Inc.，Huntsville，AL，USA或SunBio，Anyang City，South Korea。
另一方面，本发明包括含有偶联物群体的组合物，其中所述群体中的大多数偶联物各含有与多肽的单个赖氨酸残基或N-末端氨基共价连接的单个非多肽部分(例如单个聚合物分子，如单个PEG，如线性PEG或分枝PEG)。例如，本发明的“单偶联的”(如“单PEG化的”)组合物含有所述偶联物的一个或多个“位置异构体”，其中每个位置异构体含有与多肽的单个赖氨酸残基共价连接的单个非多肽部分(如单个PEG分子)。
本发明包括含有偶联物群体的单PEG化组合物，其中所述群体中的大多数偶联物是位置异构体，所述异构体各含有与本发明多肽的单个赖氨酸残基共价连接的单个PEG分子(如线性或分枝PEG，如2kDa，5kDa，12kDa，15kDa，20kDa，30kDa或40kDa mPEG或mPEG2分子)。
一些所述位置异构体含有与选自K31，K50，K71，K84，K122，K134，K135和K165的赖氨酸残基共价连接的单个PEG分子。一些所述位置异构体含有与选自K31，K122，K135和K165的赖氨酸残基共价连接的单个PEG分子。一些所述位置异构体含有与选自K31，K122和K135的赖氨酸残基共价连接的单个PEG分子，例如与选自K31和K122；K31和K135；或K122和K135的赖氨酸残基共价连接的单个PEG分子。
本文实施例5描述了本发明的单PEG化组合物的制备。根据实施例5的方法，被鉴定为14epi18(SEQ ID NO：13)的本发明多肽与40kDa分枝PEG(mPEG2-NHS)反应得到单PEG化组合物，所述组合物主要含有两个位置异构体，一个具有与Lys122共价连接的单个PEG部分，另一个具有与Lys135共价连接的单个PEG部分。因此，本发明包括组合物(如单PEG化组合物)，所述组合物包括含有序列SEQ ID NO：13的多肽偶联物，其中PEG部分与Lys122或Lys135共价连接。本发明还包括组合物(如单PEG化组合物)，所述组合物包括含有序列SEQ ID NO：13的多肽偶联物，其中40kDaPEG部分(如40kDa分枝PEG部分)与Lys122或Lys135共价连接。
当根据实施例5的方法，另一例被鉴定为25epi19(SEQ ID NO：38)的本发明多肽与40kDa分枝PEG(mPEG2-NHS)反应得到单PEG化组合物，所述组合物主要含有三个位置异构体，一个具有与Lys31共价连接的单个PEG部分，另一个具有与Lys122共价连接的单个PEG部分，另一个具有与Lys135共价连接的单个PEG部分。因此，本发明包括组合物(如单PEG化组合物)，所述组合物包括含有序列SEQ ID NO：38的多肽偶联物，其中PEG部分与Lys31，Lys122或Lys135共价连接。本发明还包括组合物(如单PEG化组合物)，所述组合物包括含有序列SEQ ID NO：38的多肽偶联物，其中40kDaPEG部分(如40 kDa分枝PEG部分)与Lys31，Lys122或Lys135共价连接。
本发明的偶联物，其中非多肽部分与半胱氨酸残基结合
一方面，本发明涉及这样的偶联物，其表现干扰素-α活性并包含至少一个非多肽部分，所述非多肽部分与干扰素-α多肽的至少一个半胱氨酸残基偶联，所述多肽包含的序列(a)与SEQ ID NO：1在1至16个氨基酸位置上不同(如在1-15个氨基酸位置，1-14个氨基酸位置，1-13个氨基酸位置，1-12个氨基酸位置，1-11个氨基酸位置，1-10个氨基酸位置，1-9个氨基酸位置，1-8个氨基酸位置，1-7个氨基酸位置，1-6个氨基酸位置，1-5个氨基酸位置，1-4个氨基酸位置，1-3个氨基酸位置或1-2个氨基酸位置上不同)和(b)相对于SEQ ID NO：1，含有一个或多个选自F48A/L；V51P；F55A；F65A；F68P；L111A和V114P的取代。根据此方面的一些偶联物含有至少一个引入的半胱氨酸残基。
另一方面，本发明涉及这样的偶联物，其表现干扰素-α活性并包含至少一个非多肽部分，所述非多肽部分与干扰素-α多肽的至少一个半胱氨酸残基偶联，所述多肽包含的序列(a)与SEQ ID NO：36在1至16个氨基酸位置上不同(如在1-15个氨基酸位置，1-14个氨基酸位置，1-13个氨基酸位置，1-12个氨基酸位置，1-11个氨基酸位置，1-10个氨基酸位置，1-9个氨基酸位置，1-8个氨基酸位置，1-7个氨基酸位置，1-6个氨基酸位置，1-5个氨基酸位置，1-4个氨基酸位置，1-3个氨基酸位置或1-2个氨基酸位置上不同)和(b)相对于SEQ ID NO：36，含有一个或多个选自M21A；I24P；F48A/L；T5 1P；S55A；F65A；F68P；F90A；M93P；L111A；V114P；F124A；I127P和E160D的取代。根据此方面的一些偶联物含有至少一个引入的半胱氨酸残基。
例如，一些本发明的偶联物包含的多肽序列相对于SEQ ID NO：1还含有一个或多个下列取代，所述取代将半胱氨酸残基引入据预测会暴露于分子表面并具有超过25％分数ASA的位置：D2C，L3C，P4C，Q5C，T6C，H7C，S8C，L9C，G10C，R12C，R13C，M16C，A19C，Q20C，R22C，R23C，I24C，S25C，L26C，F27C，S28C，L30C，K31C，R33C，H34C，D35C，R37C，Q40C，E41C，E42C，D44C，N46C，H47C，Q49C，K50C，V51C，Q52C，E59C，Q62C，Q63C，N66C，S69C，T70C，K71C，D72C，S74C，A75C，D78C，E79C，T80C，L81C，E83C，K84C，I87C，F90C，Q91C，N94C，D95C，E97C，A98C，V100C，M101C，Q102C，E103C，V104C，G105C，E107C，E108C，T109C，P110C，L111C，M112C，N113C，V114C，D115C，L118C，R121C，K122C，Q125C，R126C，T128C，L129C，T132C，E133C，K134C，K135C，Y136C，S137C，P138C，A146C，M149C，R150C，S153C，F154C，N157C，Q159C，E160C，S161C，L162C，R163C，S164C，K165C和E166C，其中所述氨基酸残基位置是相对于SEQ IDNO：1而言的。
一些本发明的偶联物包含的多肽序列相对于SEQ ID NO：1还含有一个或多个下列取代，所述取代将半胱氨酸残基引入据预测会暴露于分子表面并具有超过50％分数ASA的位置：D2C，L3C，P4C，Q5C，T6C，H7C，S8C，L9C，R12C，R13C，M16C，A19C，S25C，F27C，S28C，K31C，R33C，H34C，D35C，R37C，E41C，D44C，N46C，H47C，Q49C，K50C，N66C，K71C，A75C，D78C，E79C，T80C，E83C，K84C，I87C，F90C，Q91C，N94C，D95C，M101C，Q102C，E103C，G105C，E107C，E108C，T109C，P110C，L111C，V114C，D115C，L118C，R121C，K122C，Q125C，R126C，L129C，T132C，E133C，K135C，P138C，R150C，E160C，L162C，R163C，S164C，K165C和E166C，其中所述氨基酸残基位置是相对于SEQ ID NO：1而言的。
应当理解，虽然在本文中对亲本多肽修饰的实例通常相对于序列SEQID NO：1(或相对于一些其它特定序列)给出，所公开的修饰还可在本发明其它多肽(包括SEQ ID NO：2-35和37-44及其变体)的等效氨基酸位置实施。因此，作为实例，相对于SEQ ID NO：1的取代H47C被认为对应于SEQ IDNO：37中的Q47C，等等。
在一些情况下，为了避免两个或多个引入的半胱氨酸残基之间形成二硫桥，仅引入单个半胱氨酸残基。
在干扰素-α中，在1/99位和29/139位的半胱氨酸之间形成二硫键。二硫键29/139对生物活性是必要的，而减少1/99键不会显著影响生物学活性(Beilharz M.W.等，(1986)J.InterferonRes.6(6)：677-685)。因此，在本发明的另一方面中，优选通过取代去除C1或C99之一，例如C1S或C99S，从而保留可用于与非多肽部分偶联的其它半胱氨酸残基。
在本发明的该方面中预期的非多肽部分包含聚合物分子，诸如在题目为“与聚合物分子偶联”的章节中描述的任何分子，诸如PEG或mPEG。包含半胱氨酸的多肽和聚合物分子之间的偶联可以用任何适当的方法完成，例如题目为“与聚合物分子偶联”的章节中所述，例如使用所述章节描述的一步法或逐步法。PEG化干扰素-α多肽的示例性方法是采用半胱氨酸反应性PEG将PEG与半胱氨酸残基共价连接。许多具有不同基团(例如正吡啶基-二硫化物(OPSS)、马来酰亚胺(MAL)和乙烯砜(VS))的高特异性，半胱氨酸反应性PEG以及大小不同的线性或分枝PEG(例如2-40kDa，诸如2kDa，5kDa，12kDa，15kDa，20kDa，30kDa或40kDa)可购得，例如获自Nektar Therapeutics Inc.，Huntsville，AL，USA或SunBio，Anyang City，SouthKorea。
本发明偶联物的非多肽部分
如上所述，本发明偶联物的非多肽部分一般选自聚合物分子、亲脂化合物、糖部分(例如通过体内糖基化)和有机衍生试剂。所有这些试剂可赋予该偶联物的多肽部分所需的特性，诸如降低的免疫原性，增加的功能性体内半寿期，增加的血清半寿期，增加的生物利用度和/或增加AUCsc。偶联物的多肽部分一般仅偶联一种类型的非多肽部分，但也可偶联两种或多种不同类型的非多肽部分，例如偶联聚合物分子和糖部分等。与两个或多个不同非多肽部分的偶联可同时或依次进行。非多肽部分/多个部分的选择具体依赖于需要通过偶联实现的效果。例如，发现糖部分具体适用于降低免疫原性，而聚合物分子诸如PEG具体适用于增加功能性体内半寿期和/或血清半寿期。采用聚合物分子和糖部分的组合可增强免疫原性的降低以及功能性体内或血清半寿期的增加。
在以下章节“与亲脂化合物的偶联”，“与聚合物分子的偶联”，“与糖部分的偶联”和“与有机衍生试剂的偶联”中，描述与具体类型的非多肽部分的偶联。
与亲脂化合物的偶联
为了与亲脂化合物偶联，以下多肽基团可发挥连接基团的功能：多肽的N末端或C末端、氨基酸残基Ser，Thr或Tyr的羟基、Lys的ε-氨基、Cys的巯基或Asp和Glu的羧基。所述多肽和亲脂化合物可直接或者通过使用接头互相偶联。亲脂化合物可以是天然化合物，例如饱和或不饱和脂肪酸、脂肪酸二酮、萜烯(terpene)、前列腺素、维生素、类胡萝卜素或类固醇，或者是合成的化合物，例如具有一个或多个烷基、芳香基、链烯基或其它多个不饱和化合物的碳素酸(carbon acid)、醇、胺和磺酸。所述多肽和亲脂化合物之间任选通过接头的偶联可按照本领域已知的方法进行，例如，Bodanszky在Peptide Synthesis，John Wiley，纽约，1976和在WO 96/12505中所述。
与聚合物分子的偶联
与多肽偶联的聚合物分子可以是任意合适的聚合物分子，诸如天然或合成的同聚物或杂聚物，一般具有的分子量范围是约300-100,000Da，例如约1000-50,000Da，更优选约1000-40,000Da。更具体地，聚合物分子，诸如PEG具体是mPEG，通常具有约2，5，10，12，15，20，30，40或50kDa的分子量，尤其是约5kDa，约10kDa，约12kDa，约15kDa，约20kDa，约30kDa或约40kDa的分子量。PEG分子可以是支化的(例如，mPEG2)，或可以是非支化的(即线性的)。
当与本文中聚合物分子有关时，术语“约”是指大约的平均分子量且反映出这样的事实，给定聚合物制备物中通常有一定的分子量分布。
同聚物的例子包括多元醇(即poly-OH)、多胺(即poly-NH2)和聚羧酸(即poly-COOH)。杂聚物是一种聚合物，它包含一个或多个不同的偶联基团，诸如羟基和胺基。
合适的聚合物分子的例子包括选自下组的聚合物分子：聚环氧烷(PAO)，包括聚亚烷基二醇(PAG)，例如聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG)，支化的PEG，聚乙烯醇(PVA)，聚羧酸酯，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙烯-共-马来酸酐，聚苯乙烯-共-马来酸酐，葡聚糖，包括羧甲基葡聚糖，或者适合于降低免疫原性和/或增加功能性体内半寿期和/或血清半寿期的任何其它生物聚合物。一般来说，聚亚烷基二醇衍生的聚合物是生物相容性的，无毒，无抗原性，无免疫原性的，具有不同水溶性特性，且容易从活生物体排泄掉。
PEG是优选的待用聚合物分子，因为它与例如，诸如葡聚糖等的多糖相比仅具有较少的能交联的反应基团。具体来说，单功能性PEG，例如单甲氧基聚乙二醇(mPEG)是令人感兴趣的，因为其偶联的化学反应相对简单(仅一个反应基团可用于与多肽上的连接基团偶联)。因此，消除了交联的风险，所得的多肽偶联物均一性更好且聚合物分子与多肽的反应更易于控制。
为了实现聚合物分子与多肽的共价连接，聚合物分子的羟基末端基团必须以活化形式提供，即，具有反应性官能团(该基团的例子包括伯胺基团、酰肼(HZ)、巯基、琥珀酸酯(SUC)、琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(SS)、琥珀酰亚胺基琥珀酰胺(SSA)、琥珀酰亚胺基丙酸酯(SPA)、羧甲基化琥珀酰亚胺(SCM)、苯并三唑碳酸酯(BTC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、醛、硝基苯碳酸酯(NPC)和tresylate(TRES))。适当活化的聚合物分子是商业上可获得的，例如从Shearwater Polymer，Inc.，Huntsville，AL，USA；PolyMASCPharmaceuticals plc，UK或SunBio Corporation，Anyang City，South Korea获得。另外，聚合物分子可通过本领域已知的常规方法活化，例如按WO90/13540公开的方法。用于本发明的活化的线性或支化聚合物分子的具体例子在Nektar Therapeutics，Inc.2003年产品目录(“Nektar MoleculeEngineering：Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation”，将其引入此处作为参考)中描述。活化的PEG聚合物的具体例子包括下列线性PEG：NHS-PEG，SPA-PEG，SSPA-PEG，SBA-PEG，SS-PEG，SSA-PEG，SC-PEG，SG-PEG，SCM-PEG，NOR-PEG，BTC-PEG，EPOX-PEG，NCO-PEG，NPC-PEG，CDI-PEG，ALD-PEG，TRES-PEG，VS-PEG，OPSS-PEG，IODO-PEG和MAL-PEG，以及分枝PEG，例如PEG2-NHS，PEG2-MAL和在US5,932,462和US 5,643,575中公开的那些分子，将这两篇文献引入此处作为参考。另外，本文作为参考文献引用的下列文献公开了有用的聚合物分子和/或PEG连接的化学性质：US 5,824,778，US 5,476,653，WO 97/32607，EP229,108，EP 402,378，US 4,902,502，US 5,281,698，US 5,122,614，US 5,219,564，WO 92/16555，WO 94/04193，WO 94/14758，WO 94/17039，WO 94/18247，WO94/28024，WO 95/00162，WO 95/11924，WO 95/13090，WO 95/33490，WO96/00080，WO 97/18832，WO 98/41562，WO 98/48837，WO 99/32134，WO99/32139，WO 99/32140，WO 96/40791，WO 98/32466，WO 95/06058，EP 439508，WO 97/03106，WO 96/21469，WO 95/13312，EP 921 131，US 5,736,625，WO 98/05363，EP 809 996，US 5,629,384，WO 96/41813，WO 96/07670，US5,473,034，US 5,516,673，EP 605 963，US 5,382,657，EP 510 356，EP 400 472，EP 183 503和EP 154 316。
多肽与活化的聚合物分子的偶联经过使用任何常规方法进行，例如按下列文献所述的方法(它们也描述了用于活化聚合物分子的合适方法)：Harris和Zalipsky，Eds.，Poly(ethylene glycol)Chemistry and BiologicalApplications，AZC，华盛顿；R.F.Taylor，(1991)，“Protein immobilisation.Fun-damental and applications”，Marcel Dekker，N.Y；S.S.Wong，(1992)，“Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking”，CRC出版社，BocaRaton；G.T.Hermanson等，(1993)，“Immobilized Affinity Ligand Techniques”，学术出版社，纽约)。
对于半胱氨酸残基的PEG化，通常要在PEG化之前将多肽与还原剂诸如二硫苏糖醇(DDT)反应。随后通过任何常规方法，诸如通过脱盐去除还原剂。PEG与半胱氨酸的偶联通常在以下条件实施：适宜的缓冲液中，pH6-9，温度4℃-25℃，时间大约为16小时。用于偶联半胱氨酸残基的活化PEG聚合物的实例包括以下线性和支化PEG：乙烯砜-PEG(PEG-VS)，诸如乙烯砜-mPEG(mPEG-VS)；邻吡啶基-二硫-PEG(PEG-OPSS)，诸如邻吡啶基-二硫-mPEG(mPEG-OPSS)；和马来酰亚胺-PEG(PEG-MAL)，诸如马来酰亚胺-mPEG (mPEG-MAL)和支化马来酰亚胺-mPEG2(mPEG2-MAL)。
赖氨酸的PEG化通常采用PEG-N-羟基琥珀酰亚胺(例如，mPEG-NHS或mPEG2-NHS)，或酯诸如PEG琥珀酰亚胺丙酸酯(例如，mPEG-SPA)或PEG琥珀酰亚胺丁酸酯(例如，mPEG-SBA)。如果混合等摩尔量的PEG和蛋白质，可将一个或多个PEG可在30分钟内、pH8-9.5、室温连接至蛋白质。通常PEG与蛋白质氨基的摩尔比率是1-5-1即可满足。升高pH可提高反应速率，而降低pH则减低反应速率。这些强反应性酯可在生理pH条件下发生偶联，但低反应性衍生物通常需要较高pH。如果使用不稳定的蛋白质，则还可采用低温。在低温条件，可采用较长的反应时间。
N末端氨基酸的α-氨基(～7.6 to 8.0)和赖氨酸的ε-氨基(～10)的pKa差异可促进N末端PEG化。N末端氨基的PEG化通常采用PEG-醛(诸如mPEG-丙醛或mPEG-丁醛)，其具有对胺的更高的选择性，因此与组氨酸的咪唑基团的反应的可能性较低；此外，用于赖氨酸偶联的PEG试剂(诸如mPEG-SPA、mPEG-SBA或mPEG-NHS)还可用于N末端胺的偶联。PEG-醛与N末端氨基的偶联通常如下实施：在适宜的缓冲液(诸如，100mM醋酸钠或100mM二磷酸钠缓冲液与20mM氰基硼氢化钠)中pH～5.0，于约4℃-25℃的温度过夜。可用的N末端PEG化方法和化学还公开于美国专利5,985,265和美国专利6,077,939中，其均引入此处作为参考。
通常，线性PEG或mPEG聚合物的分子量为约5kDa，约10kDa，约12kDa，约15kDa，约20kDa，或约30kDa。支化PEG(PEG2或mPEG2)聚合物通常具有的分子量为约10kDa，约20kDa，或约40kDa。在一些情况下，可使用较高分子量的支化PEG2试剂，诸如20kDa或40kDa PEG2，例如包括用于赖氨酸PEG化的mPEG2-NHS，用于半胱氨酸PEG化的mPEG2-MAL，或用于N末端PEG化的MPEG2-醛(所有试剂均获自NektarTherapeutics，Inc，Huntsville AL)。PEG2化合物的支化结构导致相对大的分子体积，因此很少有连接的分子(或，一个连接的分子)可赋予PEG化分子的所需特性。
技术人员将明白所用的活化方法和/或偶联化学依赖于干扰素-α多肽的连接基团以及聚合物的官能团(例如，是氨基、羟基、羧基、醛或巯基)。PEG化可针对与多肽上所有可获得的连接基团(即暴露于多肽表面的连接基团)的偶联或者可针对具体连接基团，例如半胱氨酸残基、赖氨酸残基或N-末端氨基(US 5,985,265)。另外，偶联可用一步法或者以逐步方式实现(例如按WO 99/55377所述)。
在一些情况下，在意图使尽可能多的聚合物连接基团与聚合物分子反应的条件下进行聚合物的偶联。这可通过使与多肽相关聚合物的摩尔数适宜地过量实现。通常，活化型聚合物分子与多肽的摩尔比是1000-1，诸如200-1，优选100-1。然而，在一些情况下，该比率可更低，诸如最低至约50-1，10-1或5-1。然而，也可使用等摩尔比率。
本发明还涉及通过接头偶联聚合物分子与多肽。合适的接头是技术人员熟知的。优选的例子是氰尿酰氯(Abuchowski等，(1977)，J.Biol.Chem，252，3578-3581；US 4,179,337；Shafer等，(1986)，J.Polym.Sci.Polym.Chem，Ed.，24，375-378)。
偶联后，按照本领域已知的方法，例如，通过向反应混合物中加入伯胺封闭残余的活化型聚合物分子，并通过合适的方法去除所得的失活型聚合物分子。
可使用糖苷与干扰素-α的氨基酸残基的共价体外偶联来修饰或增加糖组分的数目或特性。根据使用的偶联方式，糖类可连于a)精氨酸和组氨酸(Lundblad和Noyes，Chemical Reagents for Protein Modification，CRC PressInc.Boca Raton，FI)，b)游离羧基(例如C末端氨基酸残基，天冬酰胺或谷氨酰胺的游离羧基)，c)游离巯基，例如半胱氨酸的游离巯基，d)游离羟基，例如丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸或羟脯氨酸的游离羟基，e)芳香族残基，例如苯丙氨酸或色氨酸的芳香基或者f)谷氨酰胺的酰胺基。这些氨基酸残基组成糖部分的连接基团的例子，可在本发明偶联物的干扰素-α多肽中引入和/或去除所述残基。体外偶联的合适方法在例如，WO 87/05330和Aplin等，CRCCrit Rev.Biochem，第259-306页，1981中描述。糖部分或PEG与蛋白质和肽结合的Gln-残基的体外偶联可通过转谷氨酰胺酶(TGases)实现，例如，按Sato等，1996，Biochemistry，35，13072-13080或在EP 725 145中所述。
与糖部分的偶联
为了实现通过引入一个或多个体内糖基化位点修饰的干扰素-α多肽(见“本发明的偶联物，其中非多肽部分是糖部分”章节)的体内糖基化，将编码该偶联物的多肽部分的核苷酸序列插入糖基化真核表达宿主中。表达宿主细胞可选自真菌(丝状真菌或酵母)，昆虫，哺乳动物细胞，来自转基因植物细胞或来自转基因动物。另外，当在基因治疗中使用编码本发明的偶联物的多肽部分或本发明多肽的核苷酸序列时可在人体内实现糖基化。在一个方面中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞，例如CHO细胞，BHK或者HEK细胞，例如HEK293，或昆虫细胞，例如SF9细胞，或者酵母细胞，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，毕赤酵母(Pichia pastoris)或者任何其它合适的糖基化型宿主，例如如下所述。任选，通过体内糖基化连接到干扰素-α多肽的糖部分可通过使用糖基转移酶，例如，使用Neose，Horsham，PA，USA上市的GlycoAdvanceTM技术进一步修饰。从而可以增加，例如表达后糖基化的IFNG多肽的唾液酸化以及CHO细胞的体内糖基化。
与有机衍生试剂的偶联
干扰素-α多肽的共价修饰可通过将多肽的连接基团与有机衍生试剂反应来进行。合适的衍生试剂和方法是本领域熟知的。例如，最常见的半胱氨酰残基与α-卤代乙酸(和相应的胺)，诸如氯乙酸或氯乙酰胺反应以产生羧甲基或羧基酰胺基甲基衍生物。半胱氨酰残基也通过与溴三氟丙酮、α-溴-β-(4-咪唑基)丙酸、氯乙酰基磷酸酯、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、对氯汞基苯甲酸、2-氯汞基-4-硝基酚或氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑反应而得以衍生化。组氨酰残基经过与焦碳酸二乙酯在pH5.5-7.0反应而得以衍生化，因为该试剂对组氨酸侧链具有相对特异性。对溴苯甲酰甲基溴化物(Para-bromophenacyl bromide)也是有用的；反应优选在0.1M卡可酸钠中在pH6.0下进行。赖氨酰和氨基末端残基与琥珀酸或其它羧酸酐反应。与这些试剂的衍生化具有逆转赖氨酰残基的电荷的效应。用于衍生含α-氨基的残基的其它合适试剂包括亚氨酸酯，例如甲基吡啶亚酰胺；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯代硼氢化物；三硝基苯磺酸；O-甲基异脲；2，4-戊二酮；和转氨酶催化的与乙醛酸的反应。精氨酰残基通过与苯基乙二醛，2，3-丁二酮，1，2-环己二酮和茚三酮中的一种或数种常规试剂反应得以修饰。精氨酸残基的衍生化需要在碱性条件下进行反应，因为胍官能团具有高pKa。另外，这些试剂可与赖氨酸以及精氨酸胍基反应。通过与碳二亚胺(R-N＝C＝N-R′)反应可选择性修饰羧基侧基团(天冬氨酰或谷氨酰)，其中R和R′是不同的烷基基团，例如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4，4-二甲基戊基)碳二亚胺。另外，天冬氨酰和谷氨酰残基通过与铵离子反应转变成天冬酰胺酰基和谷氨酰胺酰基。
功能性位点的封闭
因为过量聚合物偶联可导致与聚合物偶联的干扰素-α多肽活性丧失，故此去掉位于功能性位点的连接基团或者通过在偶联前封闭功能性位点是有益的。后一种策略组成本发明的其它方面(第一种策略在上文举例说明，例如通过去掉靠近功能性位点的赖氨酸残基来进行)。更具体的说，根据第二种策略，干扰素-α多肽和非多肽部分之间的偶联在多肽的功能性位点被能与多肽功能性位点结合的辅助分子封闭的条件下进行。可选，辅助分子是特异性识别多肽的功能性位点的分子，例如受体，具体是I型干扰素受体。另外，辅助分子可以是抗体，具体是识别干扰素-α多肽的单克隆抗体。具体地说，辅助分子可以是中和型单克隆抗体。
实现偶联前使得多肽与辅助分子相互作用。这样保证多肽的功能性位点被保护或保护且随后不被诸如聚合物等的非多肽部分衍生化。其从辅助分子洗脱后，可回收具有至少部分受保护的功能性位点的非多肽部分与多肽之间的偶联物。
随后，具有已被封闭的功能性位点的多肽与聚合物，亲脂化合物，糖部分，有机衍生试剂或任意其它化合物以正常方式偶联，例如，按标题为“与......偶联”的上述章节所述进行。
无论用于防止多肽的功能性位点发生偶联的辅助分子的性质如何，都需要该辅助分子不含或仅包含很少用于连接所选非多肽部分的连接基团，其在该分子的一部分中，其中与所述基团的偶联将妨碍已偶联的多肽从辅助分子脱附。因此，可获得与多肽未受保护的部分中存在的连接基团的选择性偶联，且可以再将辅助分子用于偶联的重复循环中。例如，如果非多肽部分是聚合物分子诸如PEG，其具有赖氨酸或N末端氨基酸残基的ε氨基作为连接基团，则需要辅助分子基本上不含可结合的ε氨基，优选不含任何ε氨基。因此，在一些情况下，辅助分子是能结合多肽的功能性位点的蛋白质或肽，所述蛋白质或肽不含用于偶联所选非多肽部分的任何可偶联的连接基团。
在另一方面中，辅助分子首先共价连接到诸如柱填充材料，例如交联葡聚糖或琼脂糖珠的固相或者表面例如反应器表面。随后，将多肽上样到携带辅助分子的柱材料上且按照本领域已知的方法进行偶联，例如，按标题为“与......偶联”的上述章节所述进行。该方法允许通过洗脱从辅助分子分离多肽偶联物。在不导致多肽偶联物大量降解的物理化学条件下以常规技术洗脱该多肽偶联物。含有多肽偶联物的液相从与辅助分子保持共价连接的固相分离。分离可用其它方式实现：例如，用可被特异性结合剂(例如链霉抗生物素蛋白)识别的第二分子(例如生物素)衍生化该辅助分子。特异性结合剂可连接到固相上，从而允许通过第二辅助固相柱而从辅助分子-第二分子复合物中分离多肽偶联物，所述柱在随后洗脱时滞留辅助分子-第二分子复合物而不是多肽偶联物。可用任何合适的方式从辅助分子释放多肽偶联物。通过提供辅助分子从其结合的干扰素-α功能性位点解离的条件实现去保护。例如，偶联聚合物的抗体与抗独特型抗体间的复合物可通过将pH调到酸性或碱性pH来解离。
标记的干扰素-α多肽的偶联
另一方面，干扰素-α多肽以具有标记的融合蛋白被表达，即一般由1-30个，例如1-20或1-15或1-10或1-5个氨基酸残基(例如加至多肽的N末端或C末端)组成的氨基酸序列或肽链。除了允许快速且容易的纯化外，标记是实现标记的多肽与非多肽部分之间的偶联的一种常规工具。具体地说，标记可用于在通过标记固定化经标记的多肽的微量滴定板或其它载体例如顺磁珠(paramagnetic bead)中实现偶联。在例如微量滴定板中与标记的多肽偶联的优势在于标记的多肽可直接分离自液体培养基而在微量滴定板中固定化(原则上不需任何纯化)和进行偶联。因此，减少了加工步骤(从表达到偶联)的总数。另外，标记可充当间隔分子以保证提高待偶联的固定化多肽的可用性。标记的多肽可与本文公开的任意非多肽部分偶联，例如，诸如于PEG的聚合物分子偶联。
使用的特异性标记特性(identity)并不重要，只要该标记能与多肽一起表达且能被固定化在合适的表面或载体材料上。许多合适的标记是商业上可获得的，例如从丹麦，Unizyme实验室获得。针对所述标记的抗体可从商业获得，例如从ADI，Aves Lab和Research Diagnostics获得。
本发明的多核苷酸
本发明提供了分离的或重组的核酸(本文也称为多核苷酸)，统称为“本发明的核酸(或多核苷酸)”，其编码本发明的多肽。本发明的多核苷酸可用于多种用途。如上所述，多核苷酸可用于制备本发明的多肽。此外，本发明的多核苷酸可掺入用于基因治疗、DNA疫苗接种和免疫治疗的表达载体中，如下更详细的描述。
一方面，本发明提供了分离的或重组的多核苷酸，其各包含编码含有选自SEQ ID NO：2-35和37-44的氨基酸序列的多肽的核酸序列，或其互补核酸序列。根据本发明此方面的核酸序列的例子包括但不限于SEQ IDNO：59-61，其各编码含有序列SEQ ID NO：10的多肽；SEQ ID NO：62-64和89，其各编码含有序列SEQ ID NO：13的多肽；  SEQ ID NO：65-67，其各编码含有序列SEQ ID NO：15的多肽；SEQ ID NO：68-70，其各编码含有序列SEQ ID NO：23的多肽；SEQ ID NO：71-73，其各编码含有序列SEQ ID NO：27的多肽；SEQ ID NO：74-76，其各编码含有序列SEQ ID NO：30的多肽；SEQID NO：77-79，其各编码含有序列SEQ ID NO：37的多肽；SEQ ID NO：80-82和90，其各编码含有序列SEQ ID NO：38的多肽；SEQ ID NO：83-85，其各编码含有序列SEQ ID NO：41的多肽；和SEQ ID NO：86-88，其各编码含有序列SEQ ID NO：44的多肽。
本发明还提供了分离的或重组的多核苷酸，其各包含编码含有氨基酸序列的多肽的核酸序列，或其互补核酸序列，其中所述氨基酸序列(a)与SEQ ID NO：1在1至16个氨基酸位置上不同(例如在1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或16个氨基酸位置，如在1-15个氨基酸位置，1-14个氨基酸位置，1-13个氨基酸位置，1-12个氨基酸位置，1-11个氨基酸位置，1-10个氨基酸位置，1-9个氨基酸位置，1-8个氨基酸位置，1-7个氨基酸位置，1-6个氨基酸位置，1-5个氨基酸位置，1-4个氨基酸位置，1-3个氨基酸位置或1-2个氨基酸位置上不同)和(b)相对于SEQ ID NO：1，含有一个或多个选自F48A/L；V51P；F55A；F65A；F68P；L111A和V114P的取代。一些由本发明的多核苷酸编码的多肽还含有一个或多个其它的氨基酸，如添加至N-末端的甲硫氨酸。在一些情况下，所编码的多肽表现出干扰素-α活性。
本发明还提供了分离的或重组的多核苷酸，其各包含编码含有氨基酸序列的多肽的核酸序列，或其互补核酸序列，其中所述氨基酸序列(a)与SEQ ID NO：36在1至16个氨基酸位置上不同(例如在1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或16个氨基酸位置，如在1-15个氨基酸位置，1-14个氨基酸位置，1-13个氨基酸位置，1-12个氨基酸位置，1-11个氨基酸位置，1-10个氨基酸位置，1-9个氨基酸位置，1-8个氨基酸位置，1-7个氨基酸位置，1-6个氨基酸位置，1-5个氨基酸位置，1-4个氨基酸位置，1-3个氨基酸位置或1-2个氨基酸位置上不同)和(b)相对于SEQ ID NO：36，含有一个或多个选自M21A，I24P，F48A/L，T51P，S55A，F65A，F68P，F90A，M93P，L111A，V114P，F124A，I127P和E160D的取代。一些由本发明的多核苷酸编码的多肽还含有一个或多个其它的氨基酸，如添加至N-末端的甲硫氨酸。在一些情况下，所编码的多肽表现出干扰素-α活性。
本发明还提供了分离的或重组的多核苷酸，其各包含编码含有氨基酸序列的多肽的核酸序列，或其互补核酸序列，其中所述氨基酸序列与SEQ IDNO：1-35中的任一个具有至少90％的序列同一性(例如至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％或至少约99％的氨基酸序列同一性)，其中氨基酸序列含有下述氨基酸中的一个或多个：第48位的Ala或Leu；第51位的Pro；第55位的Ala；第65位的Ala；第68位的Pro；第111位的Ala和第114位的Pro(相对于SEQ ID NO：1的位置编号)。一些由本发明的多核苷酸编码的多肽还含有一个或多个其它的氨基酸，如添加至N-末端的甲硫氨酸。在一些情况下，所编码的多肽表现出干扰素-α活性。
本发明还提供了分离的或重组的多核苷酸，其各包含编码含有氨基酸序列的多肽的核酸序列，或其互补核酸序列，其中所述氨基酸序列与SEQ IDNO：36-44中的任一个具有至少90％的序列同一性(例如至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％或至少约99％的氨基酸序列同一性)，其中氨基酸序列含有下述氨基酸中的一个或多个：第21位的Ala；第24位的Pro；第48位的Ala或Leu；第51位的Pro；第55位的Ala；第65位的Ala；第68位的Pro；第90位的Ala；第93位的Pro；第111位的Ala；第114位的Pro；第124位的Ala；第127位的Pro；和第160位的Asp(相对于SEQ ID NO：36的位置编号)。一些由本发明的多核苷酸编码的多肽还含有一个或多个其它的氨基酸，如添加至N-末端的甲硫氨酸。在一些情况下，所编码的多肽表现出干扰素-α活性。
其它方面
本发明的任何多核苷酸(包括上述那些多核苷酸)可编码包含至少一种其它氨基酸序列的融合蛋白，例如，分泌/定位序列，用于增溶或固定多肽的序列(例如，为了细胞表面展示)，用于检测和/或纯化多肽的序列(例如，多肽纯化序列，诸如表位标记，聚组氨基序列等)。另一方面，本发明提供了包含一种或多种本发明的多核苷酸的细胞。所述细胞可以表达由本发明的多核苷酸编码的一种或多种多肽。
本发明还提供了包含本发明任何多核苷酸的载体。所述载体可包含质粒、粘粒、噬菌体、病毒或病毒片段。所述载体可包含表达载体，如有需要，核酸可操作地连接于启动子，包括此处或以下描述的。此外，另一方面，本发明提供了包含赋形剂或载体和至少一种本发明的任何多核苷酸，或载体，细胞，或包含所述核酸的宿主的组合物。所述组合物可以是药学组合物，赋形剂或载体可以是可药用的赋形剂或载体。
本发明还包括包含两种或多种本发明的核酸，或其片段(例如，作为重组底物)的组合物。该组合物可包含重组核酸的文库，其中文库包含至少2种，至少3种，至少5种，至少10种，至少20种，至少50种，或至少100种或更多种上述核酸。所述核酸可任选地克隆至表达载体中，来提供表达文库。
本发明的多核苷酸及其片段，以及包含所述多核苷酸的载体可与适宜的载体，诸如药用载体联用而用于治疗性或预防性用途。所述组合物包含治疗上和/或预防上有效量的化合物，以及可药用的载体或赋形剂。所述载体或赋形剂包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其组合。配制方式应与给药模式相适应。施用核酸、多肽和蛋白质的方法是本领域众所周知的，并在下文中进一步讨论。
本发明还包括通过用限制性内切核酸酶，RNA酶或DNA酶消化一种或多种本发明的核酸(在上述一些重组形式中进行)而产生的组合物；以及通过用机械方式(例如超声处理，涡旋等)片段化或剪切一种或多种本发明的核酸而产生的组合物，该组合物也可提供在上述方法用于重组的底物。本发明还提供了通过切割至少一种本发明的核酸而产生的组合物。所述剪切包括机械性，化学性，和酶切割，酶切割包括用限制性内切核酸酶，RNA酶或DNA酶的切割。
本发明还包括通过在核糖核苷酸或脱氧核糖核苷三磷酸和核酸聚合酶的存在下保温一种或多种片段化的核酸组而产生的组合物。所得组合物形成重组混合物，可用于上述多种重组形式。核酸聚合酶可以是RNA聚合酶，DNA聚合酶或RNA-指导导的DNA聚合酶(例如“逆转录酶”)；聚合酶可以是例如热稳定的DNA聚合酶(例如VENT，TAQ等)。
类似地，含有多组对应于一种以上本发明核酸的寡核苷酸的组合物也可用作重组底物，并且也是本发明的特征。为了方便起见，将这些经片段化，经剪切的或寡核苷酸合成的混合物称为片段化的核酸组。
本发明还提供了编码多肽的分离的或重组的核酸，所述多肽表现出干扰素-α活性，其通过突变或重组至少一种本发明的核酸产生。
制备多核苷酸
可根据已知的合成方法，通过标准的固相方法制备本发明的多核苷酸、寡核苷酸和核酸片段。一般说来，单独合成长约100个核苷酸碱基的片段，然后(通过例如酶促或化学连接法，或聚合酶介导的重组方法)将它们连接起来，以形成基本上任何所需的连续序列。例如，本发明的多核苷酸和寡核苷酸可通过化学合成制备，其使用Beaucage等，(1981)Tetrahedron Letters 22：1859-69所述的经典亚磷酰胺法，或Matthes等，(1984)EMBO J，3：801-05所述的方法(例如，这些方法一般在自动合成方法中实施)。根据亚磷酰胺法，在例如自动化的DNA合成仪中合成寡核苷酸，然后进行纯化，退火，连接，并克隆入适当的载体。
另外，基本上任何核酸都可从多个商家中的任何一家订购得到，诸如Operon Technologies Inc.(Alameda，CA)和很多其它的公司。类似地，肽和抗体也可从多个商家中的任何一家订购得到，例如Celtek Peptides(Nashville，TN)；Washington Biotechnology，Inc.(Baltimore MD)；Global Peptide Services(Ft.Collin CO)和很多其它的公司。
也可通过使用寡核苷酸探针筛选cDNA文库(例如通过如常规重复序列重组法中那样通过重组同源核酸而产生的文库)得到本发明的某些多核苷酸，其中所述寡核苷酸探针能与编码干扰素α多肽及其片段的多核苷酸杂交或PCR-扩增编码干扰素α多肽及其片段的多核苷酸。筛选和分离cDNA克隆的方法是本领域技术人员众所周知的。该技术描述于例如：Berger andKimmel，Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymol.Vol.152，Acad.Press，Inc.，San Diego，CA(“Berger”)；Sambrook，文献同上，和CurrentProtocols in Molecular Biology，Ausubel，文献同上。一些本发明的多核苷酸可通过改变(例如通过诱变，重复序列重组(例如改组)，或寡核苷酸重组)天然的序列而获得。在其它情况下，所述多核苷酸可通过in silico方法制备或通过寡核苷酸重组方法，按其中所引用的参考文献所述进行制备。
如本文所详述，本发明的多核苷酸包括编码本发明多肽的多核苷酸序列，与这些多核苷酸序列互补的多核苷酸序列，和在至少严紧条件下与本文定义的序列杂交的多核苷酸。编码序列是指编码具体多肽或所述多肽的结构域、区域或片段的多核苷酸序列。编码序列可编码(编码)表现出如上述干扰素α活性的本发明的多肽。本发明的多核苷酸可以是RNA的形式，或者是DNA的形式，包括mRNA，cRNA，合成RNA和DNA，和cDNA。多核苷酸可以是双链或单链，如果是单链，则可以是编码型链或非-编码型(反义，互补)链。本发明的多核苷酸包括本发明多肽的编码序列的(i)分离形式，(ii)与其它编码序列联合以编码例如融合蛋白，前-蛋白质，前原-蛋白质(prepro-protein)等，(iii)与能在适宜宿主中有效表达编码序列的非-编码型序列，如启动子，终止元件，或5’和/或3’非翻译区联合，和/或(iv)在载体、细胞或宿主环境中，其中编码序列是异源基因。
本发明的多核苷酸还可与核酸常见组合制剂联合，包括与载体、缓冲液、佐剂、赋形剂等组合，这一点是本领域技术人员所已知的。多核苷酸片段通常包含至少约200个核苷酸碱基，诸如至少约250，300，350，400，450，460，470或更多个碱基。本发明的多核苷酸的核苷酸片段可在高严紧条件下与本文所述多核苷酸序列杂交和/或编码具有本发明多肽的至少一种特性的氨基酸序列。
修饰的编码序列
本领域技术人员应懂得，修饰编码序列以增强其在具体宿主中的表达是有利的。遗传密码是丰余的，它具有64个可能的密码子，但大多数生物偏好使用这些密码子中的一部分(subset)。在物种中最常使用的密码子被称为最佳密码子，那些不常使用的密码子被分为稀有或不常用密码子(例见Zhang S.P.等(1991)Gene 105：61-72)。可取代密码子以反映宿主的优选密码子使用情况，该方法被称为“密码子最优化”或“物种密码子偏向(speciescodon bias)的控制”。
可以制备出含有具体原核或真核宿主所偏好的密码子(参见Murray，E.等(1989)Nuc Acids Res 17：477-508)的修饰的编码序列，例如使与未经最优化的序列所产生的转录物相比，能提高翻译速率，或产生具有所需特性如较长半寿期的重组RNA转录物。也可以修饰翻译终止密码子以反映出宿主的偏好。例如，酿酒酵母和哺乳动物的优选终止密码子分别为UAA和UGA。单子叶植物的优选终止密码子是UGA，而昆虫和大肠杆菌优选使用UAA作为终止密码子(Dalphin M.E.等(1996)Nuc Acids Res 24：216-218)。
为了多种原因，可对本发明的多核苷酸序列进行改造以改变本发明的编码序列，所述改变包括但不限于：修饰基因产物的克隆，加工和/或表达的改变。例如，可使用本领域众所周知的技术，例如定点诱变引入改变，以插入新的限制性位点，改变糖基化模式，引入或去除连接基团(例如，用于聚乙二醇化或其它结合)，改变密码子的偏好，引入拼接位点等。
沉默变异
因为遗传密码的简并性，大量功能性相同的核酸编码任何给定多肽。例如，下述密码子表(表5)显示了密码子AGA，AGG，CGA，CGC，CGG和CGU均编码氨基酸精氨酸。因此，在核酸序列中编码精氨酸的密码子的每个位置上，密码子可被改变为任何上述相应的密码子而不会改变所编码的多肽。所述核苷酸变异为“沉默变异”。应当理解RNA序列中的U对应于DNA序列中的T。
表5
密码子表
氨基酸  密码子
丙氨酸    Ala  A半胱氨酸  Cys  C天冬氨酸  Asp  D谷氨酸    Glu  E苯丙氨酸  Phe  F甘氨酸    Gly  G组氨酸    His  H异亮氨酸  Ile  I赖氨酸    Lys  K亮氨酸    Leu  L甲硫氨酸  Met  M天冬酰胺  Asn  N脯氨酸    Pro  P谷氨酰胺  Gln  Q精氨酸    Arg  R丝氨酸    Ser  S苏氨酸    Thr  T缬氨酸    Val  V色氨酸    Trp  W酪氨酸    Tyr  Y  GCA    GCC  GCG  GCUUGC    UGUGAC    GAUGAA    GAGUUC    UUUGGA    GGC  GGG  GGUCAC    CAUAUA    AUC  AUUAAA    AAGUUA    UUG  CUA  CUC  CUG  CUUAUGAAC    AAUCCA    CCC  CCG  CCUCAA    CAGAGA    AGG  CGA  CGC  CGG  CGUAGC    AGU  UCA  UCC  UCG  UCUACA    ACC  ACG  ACUGUA    GUC  GUG  GUUUGGUAC    UAU
本领域技术人员应懂得：由于遗传密码的简并性，可产生很多种编码本发明多肽的核酸序列，其中的一些与本文清楚公开的核酸序列有最小序列同源性。本领域技术人员会认识到：可通过标准技术修饰核酸中的每一个密码子(除了AUG和UGC，其通常分别是甲硫氨酸和色氨酸唯一的密码子)以编码功能相同的多肽。因此，编码多肽的核酸的每一种沉默变异可见于任何所述序列。本发明提供了编码本发明多肽的核酸序列的任何可能变异，它们可通过选择基于可能的密码子选择的组合而产生。根据编码本发明多肽的核酸序列所用的标准三联体(密码子)遗传密码(如表5所示)制备这些组合。通过考虑序列以及遗传密码，具体提供并描述了本文每一种核酸的所有上述变异体。本领域技术人员完全能够产生本文所列序列的任何沉默取代。
应用多核苷酸
本发明的多核苷酸具有多种用途，例如，本发明多肽的重组制备(即表达)，其通常通过包含编码所述多肽或其片段的序列的质粒表达载体的表达来进行；作为治疗剂；作为预防剂；作为诊断工具；作为免疫原；作为佐剂；作为诊断存在互补或部分互补核酸(包括检测野生型干扰素-α核酸)的诊断性探针，作为进一步反应的底物，所述反应例如重复序列重组反应或制备新和/或改良变体的突变反应等。
载体、启动子和表达系统
本发明还包括重组构建体，其含有一种或多种本文所宽泛描述的核酸序列。所述构建体包括载体，例如质粒、粘粒、噬菌体、病毒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)等，其中以正向或反向插入了本发明的核酸序列。在一些情况下，构建体还含有调节序列，包括例如与该核酸序列可操作连接的启动子。大量适当的载体和启动子是本领域技术人员已知的，也可以购得。
描述本文所用分子生物学技术，包括载体、启动子的利用和很多其它相关论题的普通教科书包括Berger，文献同上；Sambrook(1989)，文献同上，和Ausubel，文献同上。足以教导熟练技术人员进行体外扩增方法，包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、Qβ-复制酶扩增和其它RNA聚合酶介导的技术(例如NASBA)，例如为了产生本发明的同源核酸的技术的实例可参见例如Berger，Sambrook和Ausubel，以及Mullis等(1987)，美国专利4,683,202；1997年7月28日公开的美国专利4,683,195；PCR Protocols：AGuide to Methods and Applications(Innis等编)Academic出版公司，San Diego，CA(1990)(Innis)；Amheim & Levinson(1990年10月1日)C&EN 36-47；TheJournal Of NIH Research(1991)3，81-94；Kwoh等，(1989)Proc.Natl Acad.Sci.USA 86，1173-1177；Guatelli等，(1990)Proc.Natl Acad.Sci.USA87，1874-1878；Lomell等，(1989)J Clin Chem，35，1826-1831；Landegren等，(1988)Science 241，1077-1080；Van Brunt(1990)Biotechnology 8，291-294；Wu和Wallace(1989)Gene 4，560-569；Barringer等，(1990)Gene 89，117-122以及Sooknanan和Malek (1995)Biotechnology 13：563-564。克隆经体外扩增的核酸的改良方法描述于Wallace等，美国专利5,426,039。通过PCR扩增大核酸的改良方法简述于Cheng等，(1994)Nature 369：684-685和其中的参考文献，其中产生了长至40kb的PCR扩增子。本领域技术人员应懂得：实质上使用逆转录酶和聚合酶可将任何RNA转变为适于限制性消化，PCR扩展和测序的双链DNA。参见Ausubel，Sambrook和Berger，文献同上。
本发明还涉及由本发明的载体转导的宿主细胞，和通过重组技术生产本发明的多肽。用本发明的载体对宿主细胞进行基因改造(即转导，转化或转染)，所述载体可以是例如克隆载体或表达载体。载体可以是例如质粒、病毒颗粒、噬菌体等形式。经改造的宿主细胞可在常规营养培养基中培养，所述培养基经修饰而适于活化启动子，选择转化子或扩增基因。如温度，pH等的培养条件与被选择用于表达的宿主细胞先前所用的相同，它们对于本领域技术人员而言是显而易见的，也可参见本文提及的参考文献，包括例如Freshney(1994)Culture ofAnimal Cells，a Manual of Basic Technique，第3版，Wiley-Liss，纽约和其中提及的参考文献。
也可在非-动物细胞，如植物，酵母，真菌，细菌等中生产本发明的多肽。除了Sambrook，Berger和Ausubel外，有关细胞培养的详细资料可参见Payne等，(1992)Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems，John Wiley&Sons，Inc.纽约，NY；Gamborg和Phillips(编)(1995)Plant Cell，Tissue andOrgan Culture；Fundamental Methods Springer Lab Manual，Springer-Verlag(Berlin Heidelberg New York)以及Atlas和Parks(编)，The Handbook ofMicrobiological Media(1993)，CRC出版社，Boca Raton，FL。
可将本发明的多核苷酸和其片段包含在多个表达载体的任一个中以表达多肽。所述载体包括染色体，非染色体和合成的DNA序列，如SV40的衍生物；细菌质粒；噬菌体DNA；杆状病毒；酵母质粒；衍生自质粒和噬菌体DNA，病毒DNA，如痘苗病毒，腺病毒，禽痘病毒，假狂犬病毒，腺伴随病毒，逆转录病毒和很多其它病毒之组合的载体。可以使用任何能将遗传物质转导至细胞，并且当需要复制时可以复制并在相关宿主中能存活的载体。
表达载体中的核酸序列与适当的转录控制序列(启动子)可操作相连以介导mRNA合成。所述启动子的例子包括：LTR或SV40启动子，大肠杆菌lac或trp启动子，噬菌体λPL启动子和其它已知能控制原核或真核细胞或其病毒中的基因表达的启动子。表达载体还含有用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。载体任选包括用于扩增表达的适当序列。另外，表达载体还任选含有一种或多种选择标记基因以提供表型性状，用于选择经转化的宿主细胞，如针对真核细胞培养的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或针对大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
可使用含有编码本发明多肽的适宜DNA序列，以及适当启动子或控制序列的载体转化适当宿主，以使宿主表达多肽。适当表达宿主的例子包括：细菌细胞，如大肠杆菌，链霉菌属(Streptomyces)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；真菌细胞，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)和粗糙链孢霉(Neurospora crassa)；昆虫细胞，如果蝇(Drosophila)和草地夜蛾(Spodoptera frugioerda)；哺乳动物细胞，如CHO，COS，BHK，HEK293或Bowes黑素瘤；植物细胞等。应理解不是所有细胞或细胞系都需要能够产生完全功能性的本发明的多肽或其片段；例如，可在细菌或其它表达系统中产生多肽的抗原性片段。本发明并不受所用宿主细胞的限制。
在细菌系统中，可根据多肽或其片段的预期用途来选择多种表达载体。例如，当需要大量多肽或其片段以诱导抗体时，则需要能指导高水平表达易于纯化的融合蛋白的载体。所述载体包括但不限于多功能的大肠杆菌克隆和表达载体，诸如BLUESCRIPT(Stratagene)，其中核苷酸编码序列被连接至载体中，与氨基末端的Met序列和随后的β-半乳糖苷酶的7个残基位于同一读码框内，从而产生杂合蛋白；pIN载体(Van Heeke & Schuster(1989)J Biol Chem 264：5503-5509)；pET载体(Novagen，Madison WI)等。
类似地，在酵母酿酒酵母中，可使用多种含有组成型或诱导型启动子，如α因子，醇氧化酶和PGH的载体来生产本发明的多肽。有关评述可参见Ausubel等，(文献同上)和Grant等，(1987；Methods in Enzymology 153：516-544)。
在哺乳动物宿主细胞中，可利用多种表达系统，如基于病毒的系统。当使用腺病毒作为表达载体时，任选将编码序列连接至腺病毒转录/翻译复合物中，所述复合物由晚期启动子和三联前导序列组成。插入病毒基因组中非必需的E1或E3区域会导致产生能在被感染的宿主细胞中表达本发明多肽的存活病毒(Logan和Shenk(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.81：3655-3659)。另外，可使用转录增强子，如Rous肉瘤病毒(RSV)增强子来增强哺乳动物宿主细胞中的表达。宿主细胞、培养基、表达系统和制备方法包括已知用于克隆和表达多种哺乳动物干扰素-α(例如，人干扰素-α)的那些内容。
其它表达元件
具体的起始信号有助于本发明多核苷酸编码序列和/或其片段的有效翻译。这些信号包括例如ATG起始密码子和邻接的序列。当将编码序列，其起始密码子和上游序列被插入适当表达载体时，无需其它的翻译控制信号。然而，当仅插入编码序列(如成熟蛋白质的编码序列)或其部分时，必须提供外源转录控制信号，包括ATG起始密码子。另外，起始密码子必须位于正确的读码框内以确保完整插入物的转录。外源转录元件和起始密码子可以是不同的来源，可以是天然的和合成的。通过包含适于所用细胞系统的增强子，可以增强表达效力(Scharf，D.等(1994)Results Probl.Cell Differ.20：125-62；Bittner等(1987)Methods in Enzymol，153：516-544)。
分泌/定位序列
本发明编码多肽的多核苷酸也可以与编码分泌/定位序列的核酸发生融合例如框内融合，从而将多肽表达靶向至所需的细胞区室，膜或细胞器，或者介导多肽分泌至周质间隙或细胞培养基中。所述序列是本领域技术人员已知的，其包括分泌前导肽，细胞器靶向序列(例如核定位序列，ER滞留信号，线粒体转位序列，叶绿体转位序列)，膜定位/锚着(anchor)序列(如终止转移序列，GPI锚着序列)等。
表达宿主
在其它方面中，本发明涉及含有任何上述核酸、载体或本发明的构建体的宿主细胞。宿主细胞可以是真核细胞，如哺乳动物细胞，酵母细胞或植物细胞，或宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞。通过磷酸钙转染、DEAE-Dextran介导的转染、电穿孔、基因或疫苗枪、注射或其它用于体内、离体或体外方法的普通技术(Davis，L.，Dibner，M和Battey，I.(1986)BasicMethods in Molecular Biology)，可将构建体引入宿主细胞。
任选根据细胞调节插入序列的表达或按所需方式加工经表达的蛋白质的能力来选择宿主细胞株。蛋白质的所述修饰包括但不限于：乙酰基化、羧基化、糖基化、磷酸化、脂质化和酰基化。裂解蛋白质的“前”或“前原”形式的翻译后加工对于正确插入，折叠和/或行使功能是重要的。对于这种翻译后的活性而言，诸如CHO、HeLa、BHK、MDCK、293、WI38等的不同宿主细胞具有具体的细胞器和特征性的机制，可选择所述宿主细胞以确保正确修饰和加工引入的外源蛋白质。
稳定的表达可用于长期、高产地生产重组蛋白质。例如，可使用表达载体转导能稳定表达本发明多肽的细胞系，所述表达载体含有病毒复制起点或内源性表达元件和选择标记基因。引入载体之后，使细胞在加料的培养基中培养1至2天，然后转移至选择培养基中。选择性标记的目的是赋予抗性以进行选择，它的存在允许对可成功表达所引入序列的细胞的培养和回收。例如，使用适于所述细胞类型的组织培养技术可使被稳定转化的细胞的抗性群(resistant clump)增殖。
任选在适于表达并从细胞培养物中回收编码蛋白质的条件下，培养被编码本发明多肽的核苷酸序列转化的宿主细胞。根据所用序列和/或载体的不同，由重组细胞产生的蛋白质或其片段可被分泌，与膜结合或包含在细胞内。本领域技术人员应懂得：可设计含有编码本发明多肽的多核苷酸的表达载体，所述载体具有指导成熟多肽通过原核或真核细胞膜的分泌的信号序列。
其它序列
本发明的多核苷酸任选地包含与标记序列(例如便于纯化所编码多肽的序列)在框内融合的编码序列。所述纯化亚序列包括但不限于：允许在固定化的金属上纯化的金属螯合肽如组氨酸-色氨酸组件(module)，与谷胱甘肽结合的序列(如GST)，血凝素(HA)标记(对应于流感病毒血凝素蛋白的表位；Wilson，I.等(1984)Cell 37：767)，麦芽糖结合蛋白序列，FLAGS延伸/亲和纯化系统(Immunex Corp.，Seattle，WA)中所用的FLAG表位等。在纯化结构域和多肽序列之间包含可被蛋白酶裂解的多肽接头序列有利于纯化。
例如，可用于本文所述组合物和方法中的一种表达载体提供了融合蛋白的表达，所述融合蛋白含有与多聚组氨酸区域融合的本发明多肽，它们之间被肠激酶裂解位点隔开。组氨酸残基促进在IMIAC(固定化金属离子亲和层析，如Porath等(1992)Protein Expression and Purification 3：263-281)上纯化，而肠激酶裂解位点提供了从多组氨酸区域分离出所需多肽的方法。pGEX载体(Promega；Madison，WI)可被任选地用于将外源多肽表达成与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。通常，所述融合蛋白是可溶性的，通过吸附至配体-琼脂糖珠(例如，当与GST融合时为谷胱甘肽-琼脂糖)，接着在游离配体的存在下进行洗脱，可以容易地从裂解的细胞中纯化出融合蛋白。
本文所述组合物和方法的其它构建体用于蛋白质，及其编码核酸，例如包括与Ig分子，例如，人IgG Fc(“可结晶片段”或与补体结合的片段)铰链，CH2区和CH3区(和编码它们的核苷酸序列)融合的本文所述本发明的多肽(或其一个或多个片段)。Fc是抗体的一部分，负责结合细胞上的抗体受体和补体的Clq组分。这些融合蛋白或其片段及其编码核酸任选地可用于预防性和/或治疗性药物或作为诊断工具(同样参见，例如，Challita-Eid，P.，(1998)J Immunol 160：3419-3426；Sturmhoefel，K.，(1999)Cancer Res59：4964-4972).
多肽生产和回收
转导适当的宿主株并将宿主株培养至适当的细胞密度之后，通过适当的方式(例如温度转变或化学试剂诱导)诱导选定的启动子，将细胞再培养一段时间。一般通过离心收集细胞，用物理或化学方法破坏细胞，保留所得粗提取物以进行进一步纯化。可通过任何便利的方法破坏表达蛋白质所用的真核或细菌细胞，包括反复冻融，超声处理，机械破碎或使用细胞裂解剂或其它方法，所述方法是本领域技术人员众所周知的。
如上所述，很多篇参考文献可用于培养和生产很多种细胞，包括源自细菌，植物，动物(具体是哺乳动物)和古细菌的细胞。参见例如Sambrook，Ausubel和Berger(文献同上)，以及Freshney(1994)Culture of Animal Cells，aManual of Basic Technique，第3版，Wiley-Liss，纽约和其中提及的参考文献，Doyle和Griffiths(1997)Mammalian Cell Culture：Essential Techniques，John Wiley和Sons，纽约；Humason(1979)Animal Tissue Techniques，第4版，W.H.Freeman和Company；和Ricciardelli等(1989)In vitro Cell DevBiol，25：1016-1024。关于植物细胞培养和再生，可参见Payne等(1992)Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems，JohnWiley & Sons，Inc.，纽约，NY；Gamborg和Phillips(编)(1995)Plant Cell，Tissue and Organ Culture；Fundamental Methods Springer Lab Manual，Springer-Verlag(Berlin HeidelbergNew York)和Plant Molecular Biology(1993)R.R.D.Croy编，Bios ScientificPublishers，Oxford，U.K.ISBN 0 12 198370 6。细胞培养基通常可参见Atlas和Parks(编)The Handbook of Microbiological Media(1993)CRC出版社，Boca Raton，FL。有关细胞培养的其它资料可参见商家提供的文献，例如Sigma-Aldrich公司(St.Louis，MO)提供的生命科学研究，细胞培养目录(“Sigma-LSRCCC”)，和例如Sigma-Aldrich公司(St.Louis，MO)提供的植物培养目录和增补本(“Sigma-PCCS”)。
也可通过本领域众所周知的多种方法中的任一种，从重组细胞培养物中回收和纯化本发明的多肽，所述方法包括：硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析(如使用本文所述的任何标记系统)、羟基磷灰石层析和凝集素层析。需要时，在完成成熟蛋白质或其片段的构型时，可以利用蛋白质重折叠步骤。最终，在最后的纯化步骤中可以使用高效液相层析(HPLC)。除了上文提及的参考文献外，多种纯化方法是本领域众所周知的，包括例如Sandana(1997)Bioseparation of Proteins，Academic出版公司；和Bollag等(1996)ProteinMethods，第2版，Wiley-Liss，纽约；Walker(1996)The Protein ProtocolsHandbook，Humana出版社，NJ，Harris和Angal(1990)Protein PurificationApplications：A Practical Approach，牛津IRL出版社，牛津，英国；Harris和Angal，Protein Purification Methods：A Practical Approach，牛津IRL出版社，牛津，英国；Scopes(1993)Protein Purification：Principles and Practice，第3版，Springer Verlag，纽约；Janson和Ryden(1998)Protein Purification：Principles，High Resolution Methods and Applications，第2版，Wiley-VCH，纽约；和Walker(1998)Protein Protocols on CD-ROM，Humana出版社，NJ。
体外表达系统
也可使用本发明的多核苷酸，利用无细胞转录/翻译系统生产本发明的多肽。几种这样的系统可以购得。体外转录和翻译方法的一般性指南可参见Tymms(1995)In vitro Transcription and Translation Protocols：Methods inMolecular Biology，第37卷，Garland Publishing，纽约。
体内用途和应用
编码本发明多肽的多核苷酸，或该多核苷酸的互补序列(包括例如，反义或核酶分子)任选地施用于细胞以便完成治疗上有用的过程或表达治疗上有用的产物。这些体内应用，包括基因治疗，包括多种技术，通过这些技术可改变细胞中的基因表达。例如，所述方法包括引入基因，其用于表达例如在治疗性和/或预防性上有用的多肽诸如本发明的多肽。
体内多肽表达
使用本领域技术人员众所周知的技术，编码本发明多肽的多核苷酸特别适用于体内治疗应用。例如，用至少一种本发明的多核苷酸(DNA或RNA)或/和其它编码例如至少一种抗原、细胞因子、其它共刺激分子，佐剂等的多核苷酸等对所培养的细胞在离体条件下进行改造，然后将经改造的细胞返回至患者体内。也可在体内对细胞进行改造，以便在体内表达一种或多种多肽，所述多肽包括本发明的多肽和/或抗原性肽。
已知多种病毒载体适于生物体的体内转导和表达。所述载体包括逆转录病毒载体(参见Miller(1992)Curr Top Microbiol Immunol 158：1-24；Salmons和Gunzburg(1993)Human Gene Therapy 4：129-141；Miller等(1994)Methods in Enzymology 217：581-599)和腺-伴随病毒载体(参见Carter(1992)Curr Opinion Biotech 3：533-539；Muzcyzka(1992)Curr Top MicrobiolImmunol 158：97-129)。可以使用的其它病毒载体包括腺病毒载体，疱疹病毒载体和新培斯病毒载体，一般描述于例如Jolly(1994)Cancer Gene Therapy1：51-64；Latchman(1994)Molec Biotechnol 2：179-195；和Johanning等(1995)Nucl Acids Res 23：1495-1501。
一方面，可使用痘病毒载体。用编码本发明的多肽(诸如eIL-2多肽)的多核苷酸序列转染痘病毒载体，且所述痘病毒载体可用于需要改善免疫反应，诸如增加或改善T细胞增殖的预防性，治疗性和诊断性的应用中。参见例如，Berencsi等，J Infect Dis(2001)183(8)：1171-9；Rosenwirth等，Vaccine 2001 Feb 8；19(13-14)：1661-70；Kittlesen等，J Immunol(2000)164(8)：4204-11；Brown等，Gene Ther 2000 7(19)：1680-9；Kanesa-thasan等，Vaccine(2000)19(4-5)：483-91；Sten(2000)Drug 60(2)：249-71中所公开的病毒载体。包含所述载体和可接受赋形剂的组合物也是本发明的特征。
基因治疗和基因疫苗提供了多种方法用于抵抗慢性传染病(例如HIV感染，病毒性肝炎)，以及非-传染性疾病，包括癌症和一些形式的先天性缺陷，如酶缺陷，所述方法可使用本发明的多核苷酸，包括，例如，包含所述多核苷酸的载体和细胞。已使用了数种方法在体内，离体和体外条件下将本发明的核酸引入细胞，所述方法可使用本发明的多核苷酸和包含所述多核苷酸的载体。这些方法包括：基于脂质体的基因传递(Debs和Zhu(1993)WO 93/24640和美国专利5,641,662；Mannino和Gould-Fogerite(1988)BioTechniques 6(7)：682-691；Rose，美国专利5,279,833；Brigham(1991)WO91/06309；和Felgner等(1987)Proc.Natl Acad.Sci.USA 84：7413-7414)；Brigham等(1989)Am J Med Sci 298：278-281；Nabel等(1990)Science249：1285-1288；Hazinski等(1991)Am.J.Resp.Cell Molec.Biol 4：206-209；以及Wang和Huang(1987)Proc.Natl Acad.Sci.(USA)84：7851-7855)；腺病毒载体介导的基因传递，例如用于治疗癌症(参见例如Chen等(1994)Proc.Natl Acad.Sci.USA 91：3054-3057；Tong等(1996)Gynecol.Oncol.61：175-179；Clayman等(1995)Cancer Res 5：1-6；O′Malley等(1995)CancerRes 55：1080-1085；Hwang等(1995)Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.13：7-16；Haddada等(1995)Curr Top Microbiol Immunol 199(Pt.3)：297-306；Addison等(1995)Proc.Natl Acad.Sci.USA 92：8522-8526；Colak等(1995)Brain Res691：76-82；Crystal(1995)Science 270：404-410；Elshami等(1996)HumanGene Ther 7：141-148；Vincent等(1996)J Neurosurg 85：648-654)，和很多其它的。另外，已使用复制-缺陷型逆转录病毒载体，其含有治疗性的多核苷酸序列作为逆转录病毒基因组的一部分，其中具体应提及简单的MuLV载体，参见例如Miller等(1990)Mol Cell Biol 10：4239(1990)；Kolberg(1992)JNIH Res 4：43，和Cornetta等(1991)Hum Gene Ther 2：215)。另外，还使用了与配体-特异性的，基于阳离子的转运系统相偶联的核酸转运(Wu和Wu(1988)J Biol Chem 263：14621-14624)。也已描述了裸露的DNA表达载体(Nabel等(1990)，文献同上；Wolff等(1990)Science 247：1465-1468)。通常，通过将编码本发明多肽核酸掺入适当载体，可以使这些方法适应于本发明。
描述基因治疗方法，通过将本发明的核酸引入患者而适应于本发明的普通教科书包括：Robbins(1996)Gene Therapy Protocols，Humana出版社，NJ，和Joyner(1993)Gene Targeting：A Practical Approach，IRL出版社，牛津，英国。
反义技术
除了表达本发明的核酸作为基因替代核酸外，一旦或当细胞中不再需要表达所述核酸时，所述核酸还可用于有义和反义地抑制表达，例如下调本发明核酸的表达。类似地，也可使用本发明的核酸，或其亚序列或反义序列阻断天然的同源性核酸的表达。多种有义和反义技术是本领域已知的，例如可参见Nellen(1997)Antisense Technology：A Practical Approach，IRL出版社，牛津大学，牛津，英国和Agrawal(1996)Antisense Therapeutics，Humana出版社，NJ和其中提及的参考文献。
用作探针
本文还预期了一般具有至少12个碱基，优选至少15个碱基，更优选至少20，至少30或至少50个碱基的多核苷酸(本文也称之为寡核苷酸)的用途，所述多核苷酸能在至少高度严紧的条件下与本发明的多核苷酸，或其片段杂交。根据上述文献中所述的方法，所述多核苷酸可用作探针、引物、有义和反义试剂等。
核酸杂交
当核酸相互结合(一般在溶液中进行)时即为“杂交”。核酸杂交是由于多种已确定的物理-化学力，如氢键，溶剂排斥，碱基堆积等。有关核酸杂交的详尽指导可参见Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistryand Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes，第I部分，第2章，“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidprobe assays”，以及Ausubel，文献同上。Hames和Higgins(1995)Gene Probes1，牛津大学出版社的IRL出版社，牛津，英国(Hames和Higgins 1)和Hames与Higgins(1995)Gene Probes 2，牛津大学出版社的IRL出版社，牛津，英国(Hames和Higgins 2)提供了有关合成、标记、检测和定量DNA和RNA包括寡核苷酸的细节。
两种核酸序列基本上相同的指标是两种分子在至少严紧条件下彼此杂交。术语“特异性杂交”是指当序列存在于(例如，总细胞)DNA或RNA复合混合物中时，在严紧条件下，分子仅于具体核苷酸序列结合，形成双链，或杂交。“基本上结合”是指探针核酸和靶核酸之间的互补杂交，且包含可通过降低杂交介质的严紧度以便实现靶多核苷酸序列所需检测而进行调节的较小错配。
在核酸杂交实验，如Southern和Northern杂交的上下文中“严紧杂交洗涤条件”和“严紧杂交条件”取决于序列，在不同的环境参数下也是不同的。有关核酸杂交的详尽指导可参见Tijssen(1993)，文献同上和Hames和Higgins 1与Hames和Higgins 2，文献同上。
为了本发明的目的，通常将“高度严紧的”杂交和洗涤条件选定为在确定的离子强度和pH下比具体序列的热解链温度(Tm)低约5℃或更低(如下文所述，也可以用相当的术语描述高度严紧的条件)。Tm是50％的受试序列与精确匹配的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和pH下)。换言之，Tm是核酸双链体在给定条件下其50％发生变性的温度，该温度可代表对核酸杂合体稳定性的直接测定。因此，Tm相当于从螺旋到随机卷曲的转变中点所对应的温度；对于长的核苷酸序列片段而言，它取决于长度，核苷酸组成和离子强度。一般而言，在“严紧条件”下，探针将与其靶序列杂交，而不与其它序列杂交。“非常严紧的条件”被选定为与具体探针的Tm相等。
杂交之后，可通过一系列的洗涤去除未杂交的核酸物质，可根据所需结果调整洗涤的严紧度。低严紧度的洗涤条件(例如使用较高的盐浓度和较低的温度)增加敏感性，但可产生非特异性杂交信号和较强的背景信号。较高严紧度的条件(例如使用较低的盐浓度和接近杂交温度的较高温度)能降低背景信号，一般仅留下特异性信号。参见Rapley，R和Walker，J.M编，Molecular Biomethods Handbook(Humana出版公司1998)(下文称之为“Rapley和Walker”)，其全文列入本文作为参考。
使用公式(1)可估计DNA-DNA双链体的Tm：
Tm(℃)＝81.5℃+16.6(log10M)+0.41(％G+C)-0.72(％f)-500/n，其中M是单价阳离子(通常是Na+)的重量摩尔浓度，(％G+C)是鸟苷(G)和胞苷(C)核苷酸的百分比，％f是甲酰胺的百分比，n是杂合体的核苷酸碱基数目(即长度)，参见Rapley和Walker，文献同上。
采用公式(2)可估计RNA-DNA双链体的Tm：
Tm(℃)＝79.8℃+18.5(log10M)+0.58(％G+C)-11.8(％G+C)2-0.56(％f)-820/n，其中M是单价阳离子(通常是Na+)的重量摩尔浓度，(％G+C)是鸟苷(G)和胞苷(C)核苷酸的百分比，％f是甲酰胺的百分比，n是杂合体的核苷酸碱基数目(即长度)，同上。等式1和2一般仅对长于100-200个核苷酸的杂合双链体准确，同上。
可按下式估计短于50个核苷酸的核酸序列的Tm：
Tm(℃)＝4(G+C)+2(A+T)，
其中A(腺嘌呤)，C，T(胸腺嘧啶)和G是相应核苷酸的数目。
在Southern或Northern印迹中的滤膜上使具有100个以上互补残基的互补核酸杂交的严紧杂交条件例子是：在含1mg肝素的50％福尔马林中，42℃杂交过夜。严紧洗涤条件的例子是：0.2×SSC，65℃洗涤15分钟(有关SSC缓冲液的描述可参见Sambrook，文献同上)。经常先用低严紧度的洗涤然后以高严紧度的洗涤，去除背景探针信号。低严紧度洗涤的例子是2×SSC，40℃洗涤15分钟。高严紧度洗涤的例子是0.15M NaCl，72℃洗涤15分钟。双链体例如超过100个核苷酸的中等严紧度洗涤的例子是1×SSC，45℃洗涤15分钟。对于双链体(例如，大于100个核苷酸)的低严紧洗涤的实例是4-6×SSC，40℃15分钟。对于短探针(例如，约10个-50个核苷酸)而言，严紧条件通常包括，盐浓度小于约1.0M Na+离子，通常是约0.01-1.0M Na+离子浓度(或其它盐)，pH7.0-8.3，和温度通常至少约30℃.严紧条件还可通过加入去稳定剂诸如甲酰胺而实现。
通常，在具体的杂交受试中，如果利用不相关探针时观察到2.5×-5×(或更高)的信号噪声比，则表明检测到特异性杂交。在本发明的上下文中，检测到两个序列之间至少严紧的杂交则表明：与例如本文序列表中提供的本发明的核酸相比具有相对较高的结构相似性或同源性。
如上所述，将“高度严紧的”条件选定为比具体序列在确定的离子强度和pH下的热解链温度(Tm)低约5℃或更低。可在高度严紧的条件下鉴定与感兴趣的核苷酸序列(例如“探针”)密切相关或相同的靶序列。较低严紧度的条件适用于互补性较差的序列，参见例如Raoley和Walker，同上。
可使用比较性杂交(comparative hybridization)来鉴定本发明的核酸，这种比较性杂交法是区分本发明核酸的优选方法。在本发明的上下文中，检测到两个序列之间高度严紧的杂交表明：与例如本文序列表中提供的核酸相比具有相对较高的结构相似性/同源性。两个核苷酸序列之间高度严紧的杂交表明了比通过严紧杂交条件检测到的更高的结构、核苷酸碱基组成、排列或顺序的相似性或同源性水平。具体是，在本发明的上下文中，检测到高度严紧的杂交表明：与例如本文序列表中提供的核酸相比具有较高的结构相似性或结构同源性(例如核苷酸结构，碱基组成，排列或顺序)。例如，需要鉴定能在严紧条件下与本文所例举的核酸杂交的受试核酸。
因此，对严紧条件的一个衡量标准是：能在高度严紧的条件(或很严紧的条件，或超-高度严紧的杂交条件，或超-超-高度严紧的杂交条件)下，与本发明所列核酸(例如核酸序列SEQ ID NO：59-88，及其互补多核苷酸序列)之一杂交。对任何受试核酸而言，都可凭经验容易地确定严紧条件(包括例如高度严紧，超-高度严紧或超-超-高度严紧的杂交条件)和洗涤条件。
例如，在确定高度严紧的杂交和洗涤条件时，可逐渐提高杂交和洗涤条件(例如通过在杂交或洗涤过程中升高温度，降低盐浓度，提高去污剂浓度和/或提高有机溶剂如福尔马林的浓度)，直至达到一套选定的标准。例如，逐渐提高杂交和洗涤条件，直至探针(包含一种或多种选自SEQ ID NO：59-88的核酸序列，和其互补多核苷酸序列)能结合精确匹配的互补靶(该靶核酸同样含有一种或多种选自SEQ ID NO：59-88及其互补多核苷酸序列的核酸序列)，此时的信号噪声为所述探针与不匹配的靶杂交时的相应数值的至少2.5×，任选5×于或更高倍。此时，不匹配的靶是对应于已知α干扰素核酸序列(例如递交本申请时，如GenBankTM的公共数据库中存在的α干扰素核酸序列)的核酸。
在如下情况下可以说受试核酸与探针核酸特异性杂交：当受试核酸与探针核酸的杂交程度为探针与精确匹配的互补靶的杂交程度的至少1/2，即信号噪声比探针与所述靶在一定条件下杂交时的至少1/2时，其中在所述杂交的条件下，精确匹配的探针与精确匹配的互补靶结合，其信号噪声为该探针与任何不匹配的靶核酸诸如上述已知的干扰素-α核酸序列杂交时所观测到的相应数值的至少约2.5倍-10倍，一般5倍-10倍。对于一些所述核酸而言，选择严紧条件以便使与编码寡核苷酸精确互补的寡核苷酸与该编码寡核苷酸杂交时的信号噪声比与完全互补性寡核苷酸与对应于上述已知干扰素-α序列的对照核酸杂交时的信号噪声比相比高至少5倍。
超-高度严紧的杂交和洗涤条件是如下所述的条件，其中提高杂交和洗涤条件的严紧度，直至探针与精确匹配的互补靶核酸结合的信号噪声比为该探针与任何不匹配的靶核酸诸如上述已知的干扰素-α核酸序列杂交时所观测到的相应数值的至少10倍。如果靶核酸能在这种条件下与探针杂交，且信号噪声比为至少为精确匹配的互补靶核酸的1/2，即可以说该靶核酸与探针能在超-高度严紧的条件下结合。
类似地，通过逐渐提高相关杂交受试的杂交和/或洗涤条件，可以确定甚至更高的严紧水平。例如，那些其中杂交和洗涤条件的严紧度被提高直至探针与精确匹配的互补靶核酸结合的信号噪声比为探针与任何不匹配的靶核酸诸如上述已知的干扰素-α核酸序列杂交时所观测到的相应数值的至少10倍，20倍，50倍，100倍或500倍或更高倍。如果靶核酸能在这种条件下与探针杂交，且信号噪声比为精确匹配的互补靶核酸的至少1/2，即可以说该靶核酸与探针能在超-超-高度严紧的条件下结合。
能在高度，超-高度和超-超-高度严紧条件下与SEQ ID NO：59-88所示核酸杂交的靶核酸是本发明的特征。所述核酸的例子包括与给定核酸序列相比，具有一个或一些沉默或保守核酸取代的核酸。
治疗用途
多种干扰素-α多肽和干扰素-α偶联物已被批准或正处于临床开发阶段，它们可用于治疗多种疾病，例如慢性丙型肝炎、慢性乙型肝炎、多毛细胞白血病、恶性黑素瘤、滤泡性淋巴瘤、尖锐湿疣、与AIDS-相关的卡波西肉瘤、非何杰金氏淋巴瘤、慢性髓性白血病、基细胞癌、多发性骨髓瘤、类癌瘤、膀胱癌、节段性回肠炎、皮肤T细胞淋巴瘤、肾细胞癌、多发性硬化和AIDS。因此，本发明包括治疗对干扰素-α有反应的疾病，如上述疾病的方法，所述方法包括给受疾病折磨的受试者施用含有本发明多肽或本发明偶联物的组合物，所述组合物的量能有效减轻与疾病相关的症状。本发明还包括含有本发明多肽或本发明偶联物的组合物(即“本发明的组合物”)用于治疗对干扰素-α有反应的疾病，如上述疾病或任何其它对本发明的多肽或本发明的偶联物有反应的疾病的用途。
治疗病毒感染和与病毒感染相关的疾病
一方面，本发明提供了治疗被病毒感染的受试者的方法，所述方法包括给受试者施用本发明的组合物，所述组合物的量能有效降低受试者体内的病毒水平和/或减轻与病毒感染相关的症状或病情。本发明的治疗方法欲包括的病毒感染的实例包括但不限于下述病毒的感染：黄病毒科家族的病毒，例如丙肝病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、日本脑炎病毒、登革病毒或牛病毒性腹泻病毒；嗜肝DNA病毒科家族的病毒，例如，乙肝病毒；小RNA病毒科家族的病毒，例如脑心肌炎病毒、人鼻病毒或甲肝病毒；反录病毒科家族的病毒，例如人类免疫缺陷病毒、猴免疫缺损病毒、人T-嗜淋巴性病毒或劳斯肉瘤病毒；冠状病毒科家族的病毒，例如SARS冠状病毒；弹状病毒科家族的病毒，例如狂犬病病毒或水泡性口炎病毒；副粘病毒科家族的病毒，例如呼吸道合胞病毒或副流感病毒；乳头状瘤病毒科家族的病毒，例如人乳头状瘤病毒以及疱疹病毒科家族的病毒，例如单纯疱疹病毒。
下文提供了使用本发明的多肽和偶联物治疗例举的病毒感染和与所述感染相关的疾病的非限制性例子，其中包括建议的本发明多肽和偶联物的剂量方案，以及监测所述治疗效力的方法。由此，本领域技术人员能够确定本发明的多肽或偶联物用于治疗其它病毒感染和与之相关的疾病时的剂量方案，以及监测所述治疗效力的方法。
丙型肝炎病毒
在本发明的一个方面中，提供了治疗丙型肝炎病毒(HCV)感染患者的方法，包括对患者施用有效量的本发明的组合物，该组合物包括一种或多种本发明的多肽或偶联物。本发明还提供了用于治疗HCV感染患者的组合物，其包括一种或多种本发明的多肽或偶联物和可药用的载体或赋形剂。诊断为HCV感染的患者包括其血液中显示HCV RNA的和/或血清中显示抗HCV抗体的患者。
包含本发明多肽的组合物的施用剂量和频率通常与采用临床批准的干扰素-α多肽的HCV治疗方案中所使用的相似，所述临床批准的干扰素-α多肽是例如ROFERONA(干扰素α-2a，重组；Hoffmann-La Roche Inc.)、INTRONA(干扰素α-2b，重组；Schering Corporation)和INFERGEN(干扰素αcon-1；InterMune，Inc.)。ROFERON或INTRON A治疗慢性HCV的示例性推荐剂量方案是3百万IU(大约15微克(mcg))每周三次，皮下注射，例如，24-48周。INFERGEN治疗慢性HCV的示例性推荐剂量方案是9mcg每周三次，皮下注射，例如，24-48周。根据多种因素(包括但不限于本发明多肽的活性和药代动力学以及患者的体型和健康)，多肽可采用比上述更低的剂量(例如，约2，3，4，5，6，7或8mcg)和/或更低的频率(诸如每周一次或每周两次)进行施用。
同样地，包含本发明的偶联物的组合物的施用剂量和频率通常与采用临床批准的干扰素-α偶联物的HCV治疗方案中所使用的相似，所述临床批准的干扰素-α偶联物例如为，PEGASYS(Peg化干扰素α-2a；Hoffmann-LaRoche，Inc.)或PEG-INTRON(peg化干扰素α-2b；Schering Corporation)。PEGASYS治疗慢性HCV的示例性推荐剂量方案是180mcg每周一次，皮下注射，例如，24-48周。根据多种因素(包括但不限于本发明的偶联物的分子量、活性和药代动力学以及患者的体型和健康)，偶联物可采用比上述更低的剂量(例如，约25，50，75，100，125或150mcg)和/或更低的频率(诸如每10日一次，或每两周一次)进行施用。
在一些情况下，本发明的多肽或偶联物联合一种或多种其它治疗剂进行施用。例如，本发明的多肽或偶联物可与小分子抗病毒药诸如Ribavirin(其商品名为COPEGUS(Hoffmann-La Roche，Inc)和REBETOL(ScheringCorporation))联合施用。或者，或除了小分子抗病毒药外，本发明的多肽或偶联物可联合一种或多种其它细胞因子进行施用，例如IFN-γ(其商品名为Actimmune(干扰素γ-1b；InterMune，Inc.))、IL-2(其商品名为PROLEUKINIL-2(aldesleukin重组人白介素-2(rhIL-2)；Chiron Corp.)或IL-12(白介素-12)。
本发明的多肽或偶联物的精确施用量和频率应依赖于多种因素诸如多肽或偶联物的比活性和药代动力学特性，以及需要治疗的病症的特性(诸如，被治疗的丙型肝炎病毒的基因型)，以及本领域技术人员已知的其它因素。一般情况下，剂量应能预防或减轻要治疗症状的严重度或扩散。所述剂量可称为“有效的”或“治疗上有效的”量。对本领域技术人员显而易见的是本发明的多肽，偶联物或组合物的有效量要依赖于(尤其是)要治疗的病症，剂量，给药方案，多肽或偶联物或组合物是单独或与其它治疗剂联合施用，血清半寿期和多肽，偶联物或组合物的其它药代动力学特性，以及患者的体型，年龄，和一般健康状况。本领域技术人员采用已知技术可确定给药剂量和频率。
治疗有效性可通过以下方法确定：采用本领域已知的方法，例如通过使用基于PCR的定量检测，诸如COBAS AMPLICORHCV Test，v2.0或COBAS AMPLICOR HCV MONITORTest，v2.0(均获自Roche Diagnostics)监测病毒RNA水平，检测病毒载量，例如测定血清或血浆中的病毒滴度或水平。在一些情况下，本发明的组合物的有效量是这样的量，其足以实现在治疗过程中，与治疗前的病毒载量(对于慢性HCV患者，其一般是105-107拷贝HCV RNA/ml)相比，将病毒载量降低至少2对数单位，至少3对数单位，至少4对数单位，至少5对数单位，至少6对数单位或至少7对数单位。在一些情况下，本发明的组合物的有效量是足以将病毒载量降至基本上不可检测的水平，例如，小于约500拷贝/ml血清或小于约100拷贝/ml血清的量。本发明包括降低感染了HCV的患者血清中HCV RNA水平的方法，其包括对患者施用本发明的组合物，与治疗开始前存在的HCV RNA水平相比，所述组合物的量能有效降低HCV RNA水平。
通过检测指示HCV感染伴随症状例如肝损伤的参数可以可选地或另外地测定治疗效果。例如，血清丙氨酸转氨酶(ALT)的水平可采用标准测定法进行检测。一般而言，ALT水平小于约50国际单位/ml(IU/ml)血清被认为是正常的。较高的ALT水平可作为存在肝损伤的指征。在一些情况下，本发明的组合物的有效量是能在具有高于正常ALT水平的患者中将ALT水平有效降至小于约50IU/ml血清的量。因此，本发明包括降低HCV感染的患者的血清ALT水平的方法，所述患者表现出起始ALT水平高于50IU/ml，所述方法包括对患者施用本发明的组合物，所述组合物的量能有效地将ALT水平降至小于约50IU/ml。
人类免疫缺陷病毒
在本发明的另一个方面中，提供了治疗人类免疫缺陷病毒(HIV)，如HIV-1或HIV-2感染患者或与HIV感染相关之疾病，如与AIDS-相关的卡波西肉瘤的方法，包括给患者施用有效量的本发明的组合物，该组合物包括一种或多种本发明的多肽或偶联物，所述组合物任选与下述的其它抗病毒治疗剂联合使用。本发明还提供了用于治疗HIV感染患者或与HIV感染相关之疾病的组合物，其包括一种或多种本发明的多肽或偶联物和可药用的载体或赋形剂。诊断为HIV感染的患者包括其血液中显示出可测水平的HIVRNA或原病毒DNA和/或血清中显示出可测水平的p24抗原或抗HIV抗体的患者。
包含本发明多肽的组合物的施用剂量和频率通常与采用干扰素-α多肽的HIV治疗方案中所使用的相似，所述干扰素-α多肽是例如ROFERONA(干扰素α-2a，重组；Hoffmann-La Roche Inc.)、INTRONA(干扰素α-2b，重组；Schering Corporation)和INFERGEN(干扰素αcon-1；InterMune，Inc.)。如上所述，ROFERON或INTRON A治疗慢性HCV的示例性推荐剂量方案是3百万IU(大约15微克(mcg))每周三次，皮下注射，例如，24-48周。INFERGEN治疗慢性HCV的示例性推荐剂量方案是9 mcg每周三次，皮下注射，例如，24-48周。ROFERON治疗与AIDS-相关的卡波西肉瘤的示例性推荐剂量方案是每天3千6百万单位用10至12周，然后每周三次，每天用3千6百万单位。INTRON A治疗与AIDS-相关的卡波西肉瘤的示例性推荐剂量方案是3千万IU/m2，每周三次，皮下注射。所述剂量方案提供了本发明多肽的有用的剂量范围，所述剂量范围可治疗HIV或与HIV感染有关的疾病。根据多种因素(包括但不限于本发明多肽的活性和药代动力学以及患者的体型、年龄和健康)，本发明多肽可采用比上述更低的剂量和/或更低的频率进行施用。
同样地，包含本发明的偶联物的组合物的施用剂量和频率通常与采用干扰素-α偶联物的HIV治疗方案中所使用的相似，所述干扰素-α偶联物例如为，PEGASYS(Peg化干扰素α-2a；Hoffmann-La Roche，Inc.)或PEG-INTRON(peg化干扰素α-2b；Schering Corporation)。PEG-INTRON治疗HIV的示例性剂量方案是约1.0mcg/kg/周至3.0mcg/kg/周，皮下注射，例如，24-48周。所述剂量方案提供了本发明的偶联物用于治疗HIV的有用剂量范围。根据多种因素(包括但不限于本发明的偶联物的分子量、活性和药代动力学以及患者的体型、年龄和健康状况)，偶联物可采用比上述更低的剂量(例如，约0.1，0.25，0.50或0.75mcg/kg/周)和/或更低的频率(诸如每10日一次，或每两周一次)进行施用。
在一些情况下，本发明的多肽或偶联物联合一种或多种其它治疗剂进行施用。目前对人HIV-1感染的临床治疗包括多种药物联合疗法，一般称之为高活性抗逆转录病毒疗法(“HAART”)。因此，本发明的多肽或偶联物可与HAART或其它抗病毒治疗性化合物联合使用。HAART的典型组分包括核苷逆转录酶抑制剂(“NRTI”)、非-核苷逆转录酶抑制剂(“NNRTI”)和HIV蛋白酶抑制剂(“PI”)的多种组合，其描述于例如A.M.Vandamme et al.(1998)Antiviral Chemistry & Chemotherapy，9：187-203；“Drugs for HIV Infection”inThe Medical Letter Vol.39(Issue 1015)December 5，1997，pages 111-116；和已公开的美国专利申请US 20020182179 A1；所述文献各列入本文作为参考。如果HIV-感染患者也感染了HCV，本发明的多肽或偶联物可与抗病毒药诸如Ribavirin(其商品名为COPEGUS(Hoffmann-La Roche，Inc)和REBETOL(Schering Corporation))以及HAART联合施用。
本发明的多肽或偶联物的精确施用量和频率，以及其它治疗剂，如HAART和/或Ribavirin的精确施用量和频率应依赖于多种因素诸如多肽或偶联物的比活性和药代动力学特性，以及需要治疗的病症的特性(诸如，其它病毒感染，如HCV的存在)，以及本领域技术人员已知的其它因素。一般情况下，剂量应能预防或减轻要治疗症状的严重度或扩散。所述剂量可称为“有效的”或“治疗上有效的”量。对本领域技术人员显而易见的是本发明的多肽，偶联物或组合物的有效量要依赖于(尤其是)要治疗的病症、剂量、给药方案，多肽或偶联物或组合物是单独或与其它治疗剂联合施用，血清半寿期和多肽，偶联物或组合物的其它药代动力学特性，以及患者的体型、年龄和一般健康状况。本领域技术人员采用已知技术可确定给药剂量和频率。
除了上述一般性用途外，本发明的多肽或偶联物可施用给下述HIV感染患者亚群：作为例如上述HAART的辅助疗法；在病毒载量一般较高的早期患者中作为单一疗法或联合疗法；在经受结构性治疗中断(STI)或“药物假期”的患者中作为联合抗病毒和免疫调制剂；在HAART选择受限的患者中作为抢救疗法；作为无需启动HAART疗法即能控制病毒载量的抗病毒治疗方法，以延迟HAART抗性病毒的出现。
治疗有效性可通过以下方法确定：采用本领域已知的方法，例如通过使用基于RT-PCR的定量检测，诸如AMPLICOR HIV-1 MONITORTest，v1.5(Roche Diagnostics)监测HIV-1病毒RNA水平，检测病毒载量，例如测定血清或血浆中的病毒滴度或水平。在一些情况下，本发明的组合物的有效量是这样的量，其足以实现在治疗过程中，与治疗前的病毒载量相比，将病毒载量降低至少0.5对数单位，至少1对数单位，至少2对数单位，至少3对数单位，至少4对数单位，至少5对数单位，至少6对数单位或至少7对数单位。在一些情况下，本发明的组合物的有效量是足以将病毒载量降至基本上不可检测的水平，例如，小于约50-100拷贝HIV-1 RNA/ml血清的量。本发明包括降低感染了HIV的患者血清中HIV-1 RNA水平的方法，其包括对患者施用本发明的组合物，与治疗开始前存在的HIV RNA水平相比，所述组合物的量能有效降低HIV RNA水平。
或者，或另外，通过血液中HIV复制的血清标记物，如HIV p24抗原的存在可测定治疗的效力。在一些情况下，本发明组合物的有效量是足以将血液中p24抗原的水平降低为开始治疗前存在的水平的50％，25％，10％或5％的量。在一些情况下，本发明组合物的有效量是足以将p24抗原的水平降低为实质上不可测的水平的量。本发明包括降低HIV感染患者血清中的p24抗原水平的方法，所述方法包括给患者施用有效量的本发明的组合物，以使p24抗原的水平与治疗开始前存在的p24抗原水平相比有所降低。
乙型肝炎病毒
另一方面，本发明提供了治疗乙型肝炎病毒(HBV)感染患者的方法，包括对患者施用有效量的本发明的组合物，该组合物包括一种或多种本发明的多肽或偶联物。本发明还提供了用于治疗HBV感染患者的组合物，其包括一种或多种本发明的多肽或偶联物以及可药用的载体或赋形剂。
诊断为HBV感染的患者包括血清中表现出可检测的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)。慢性HBV感染还可进一步分类为“复制型”或“非复制型”。在复制型感染中，患者通常具有相对高的病毒DNA血清浓度和可检测的HBeAg，其是HBV前核心基因的可选经加工的蛋白，其在高病毒复制的条件下合成。然而，在具有前核心基因突变的罕见HBV株中，复制型感染可在不存在可见的血清HBeAg时出现。慢性乙型肝炎和复制型感染患者与无HBeAg的患者相比，通常具有较差的预后且发生肝硬化和/或肝细胞癌的可能性较高。在非复制型感染中，肝中的病毒复制速率低，血清HBV DNA浓度一般低且检测不到肝炎Be抗原(HBeAg)。
包含本发明多肽的组合物的施用剂量和频率通常与采用临床批准的干扰素-α多肽的HBV治疗方案中所使用的相似，所述临床批准的干扰素-α多肽是例如INTRONA(干扰素α-2b，重组；Schering Corporation)。INTRON A治疗成年人中慢性HBV的示例性推荐剂量方案是30-35百万IU每周，皮下或肌内注射，或以5百万IU每日(qd)或以10百万IU每周三次(tiw)，16周。根据多种因素(包括但不限于本发明多肽的活性和药代动力学，以及患者的体型和健康)，本发明的多肽可采用比上述更低的剂量(例如，约5，10，15，20或25百万IU每周)和/或更低的频率(诸如每周一次或每周两次)进行施用。
同样地，包含本发明的偶联物的组合物的施用剂量和频率通常与采用目前处于临床受试中的干扰素-α偶联物的HBV治疗方案中所使用的相似，所述临床批准的干扰素-α偶联物例如为，PEGASYS(Peg化干扰素α-2a；Hoffmann-La Roche，Inc.)。PEGASYS治疗慢性HBV的示例性推荐剂量方案是90mcg-270mcg，每周注射一次，总共24周。根据多种因素(包括但不限于本发明的偶联物的分子量、活性和药代动力学以及患者的体型和健康)，偶联物可采用比上述更低的剂量(例如，约25，50，75，100，125，150或200mcg)和/或更低的频率(诸如每10日一次，或每两周一次)进行施用。
在一些情况下，本发明的多肽或偶联物联合一种或多种其它治疗剂进行施用。例如，本发明的多肽或偶联物可与抗病毒药诸如拉米夫定(lamivudine)称为3TC)，其商品名为Epivir-HBV(Glaxo SmithKline)，或阿德福韦二匹伏酯(adefovir dipivoxil)，其商品名为Hepsera(Gilead Sciences)联合施用。
本发明的多肽或偶联物的精确施用量和频率应依赖于多种因素诸如多肽或偶联物的比活性和药代动力学特性，以及需要治疗的病症的特性(诸如，在HBV感染的情况下，感染是否是复制型或非复制型)，以及本领域技术人员已知的其它因素。一般情况下，剂量应能预防或减轻要治疗症状的严重度或扩散。所述剂量可称“有效的”或“治疗上有效的”量。对本领域技术人员显而易见的是本发明的多肽，偶联物或组合物的有效量要依赖于(尤其是)要治疗的病症，剂量，给药方案，多肽或偶联物或组合物是单独或与其它治疗剂联合施用，血清半寿期和多肽，偶联物或组合物的其它药代动力学特性，以及患者的体型，年龄，和一般健康状况。本领域技术人员采用已知技术可确定给药剂量和频率。
可采用本领域已知的方法，例如通过检测病毒载量，例如血清或血浆中的病毒DNA的水平测定治疗效果。检测HBV DNA水平的方法包括基于PCR的定量检测，诸如COBAS AMPLICORHCV Test，v2.0或COBASAMPLICOR HCV MONITORTest，v2.0(均获自Roche Diagnostics)。在一些情况下，本发明的组合物的有效量是足以将病毒DNA降至，例如小于约500,000拷贝/m1血清或小于约100,000拷贝/ml血清或小于约10,000拷贝/ml血清，或至基本上不可检测的水平(例如，小于约1000拷贝/ml血清，小于约500拷贝/ml血清，或小于约200拷贝/ml血清)的量。本发明包括降低HBV感染患者血清中HBV RNA水平的方法，其包括对患者施用本发明的组合物，与治疗开始前存在的HBV DNA水平相比，所述组合物的量能有效降低HBV DNA水平。
或者，或另外，通过检测HBV复制的其它血清标记物，诸如HBeAg可以测定治疗效果。在一些情况下，本发明组合物的有效量是足以将血清中HBeAg的水平降低为开始治疗前存在的水平的50％，25％，10％或5％的量。在一些情况下，本发明的组合物的有效量是将HBeAg降至基本上不可检测的水平的量。本发明包括降低感染了HBV的患者的血清HBeAg水平的方法，所述方法包括对患者施用本发明的组合物，与治疗开始前的HBeAg水平相比，所述组合物的量能有效减低HBeAg水平。
如上所述，指示HBV感染的其它血清标记是HBsAg。因此，或者或另外，通过检测血清中HBsAg的水平可以测定治疗效果。在一些情况下，本发明组合物的有效量是足以将血清中HBsAg的水平降低为开始治疗前存在的水平的50％，25％，10％或5％的量。在一些情况下，在一些情况下，本发明的组合物的有效量是足以将HBsAg降至实质上不可检测的水平的量。本发明包括降低HBV感染的患者的血清HBsAg水平的方法，所述方法包括对患者施用本发明的组合物，与治疗开始前的HBsAg水平相比，所述组合物的量能有效减低HBsAg水平。
通过检测指示HBV感染伴随症状例如肝损伤的参数可以可选地或另外地测定治疗效果。例如，血清丙氨酸转氨酶(ALT)的水平可采用标准测定法进行检测。一般而言，ALT水平小于约50国际单位/ml(IU/ml)血清被认为是正常的。较高的ALT水平可作为存在肝损伤的指征。在一些情况下，在一些情况下，本发明的组合物的有效量是能在具有高于正常ALT水平的患者中将ALT水平有效降至小于约50IU/ml血清的量。因此，本发明包括降低HBV感染的患者的血清ALT水平的方法，所述患者表现出起始ALT水平高于50IU/ml，所述方法包括对患者施用本发明的组合物，所述组合物的量能有效地将ALT水平降至小于约50IU/ml。
人T-嗜淋巴性病毒1型
在本发明的另一个方面中，提供了治疗人T-嗜淋巴性病毒1型(HTLV-1)感染患者或与HTLV-1感染相关之疾病，如成人T-细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、与HTLV-1相关的脊髓病(HAM)、热带痉挛性下肢轻瘫(TSP)、眼色素层炎或关节病的方法。所述方法包括给患者施用有效量的本发明的组合物，该组合物包括一种或多种本发明的多肽或偶联物。本发明还提供了用于治疗HTLV-1感染患者或与HTLV-1感染相关之疾病的组合物，所述组合物包括一种或多种本发明的多肽或偶联物和可药用的载体或赋形剂。诊断为HTLV-1感染的患者包括其血液中显示出HTLV-1原病毒DNA和/或血清中显示出抗HTLV-1抗原的抗体的患者。
包含本发明多肽的组合物的施用剂量和频率通常与采用临床批准的干扰素-α多肽的HCV或肿瘤学治疗方案中所使用的相似，所述临床批准的干扰素-α多肽是例如ROFERONA(干扰素α-2a，重组；Hoffmann-La RocheInc.)和INTRONA(干扰素α-2b，重组；Schering Corporation)。ROFERON或INTRONA治疗慢性HCV的示例性推荐剂量方案是3百万IU(大约15微克(mcg))每周三次，皮下注射，例如，24-48周。ROFERON治疗多毛细胞白血病的示例性推荐剂量方案是每天3-5百万单位，皮下注射16-24周，然后3百万单位每周三次以维持剂量。INTRON A治疗多毛细胞白血病的示例性推荐剂量方案是2百万IU/m2(体表的平方米数)，皮下给药，每周3次，共6个月。所述剂量方案提供了本发明的多肽用于治疗HTLV-1感染或与HTLV-1感染相关之疾病，如成人T-细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、与HTLV-1相关的脊髓病(HAM)或热带痉挛性下肢轻瘫(TSP)的有用剂量范围。根据多种因素(包括但不限于本发明多肽的活性和药代动力学以及患者的体型、年龄和健康状况)，多肽可采用比上述更低的剂量和/或更低的频率进行施用。
同样地，包含本发明的偶联物的组合物的施用剂量和频率通常与采用临床批准的干扰素-α偶联物的HCV治疗或肿瘤学治疗方案中所使用的相似，所述临床批准的干扰素-α偶联物例如为，PEGASYS(Peg化干扰素α-2a；Hoffmann-La Roche，Inc.)或PEG-INTRON(peg化干扰素α-2b；Schering Corporation)。PEGASYS治疗慢性HCV的示例性推荐剂量方案是180mcg每周一次，皮下注射，例如，24-48周。PEG-INTRON治疗慢性髓性白血病的示例性推荐剂量方案是6mcg/kg体重，每周一次，皮下注射，例如，52周。所述剂量方案提供了本发明的偶联物用于治疗HTLV-1感染或与HTLV-1感染相关之疾病，如成人T-细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、与HTLV-1相关的脊髓病(HAM)或热带痉挛性下肢轻瘫(TSP)的有用剂量范围。根据多种因素(包括但不限于本发明偶联物的分子量、活性和药代动力学以及患者的体型、年龄和健康状况)，偶联物可采用比上述更低的剂量和/或更低的频率进行施用。
在一些情况下，本发明的多肽或偶联物联合一种或多种其它治疗剂进行施用。例如，本发明的多肽或偶联物可与抗逆转录病毒药诸如叠氮胸苷(AZT)和/或拉米夫定(lamivudine)(3TC)联合使用。也可以与外周血干细胞移植、常规化学疗法或伴随自体或同种异体骨髓移植的高剂量化学疗法联合使用。或者，本发明的多肽或偶联物可与其它免疫疗法联合使用，例如与抗-白介素-2受体单克隆抗体或注射针对病毒抗原的细胞毒T-细胞联合使用。
本发明的多肽或偶联物的精确施用量和频率应依赖于多种因素诸如多肽或偶联物的比活性和药代动力学特性，以及需要治疗的病症的特性，以及本领域技术人员已知的其它因素。一般情况下，剂量应能预防或减轻要治疗症状的严重度或扩散。所述剂量可称“有效的”或“治疗上有效的”量。对本领域技术人员显而易见的是本发明的多肽，偶联物或组合物的有效量要依赖于(尤其是)要治疗的病症，剂量，给药方案，多肽或偶联物或组合物是单独或与其它治疗剂联合施用，血清半寿期和多肽，偶联物或组合物的其它药代动力学特性，以及患者的体型，年龄，和一般健康状况。本领域技术人员采用已知技术可确定给药剂量和频率。
治疗有效性可通过以下方法确定：采用本领域已知的方法，例如通过使用Saito等，(2004)J.Infect Dis.189(1)：29-40所述的定量PCR检测HTLV-1病毒载量，例如检测血液中的HTLV-1原病毒DNA水平。在一些情况下，本发明的组合物的有效量是这样的量，其足以实现在治疗过程中，与治疗前的病毒载量相比，将病毒载量降低至少0.5对数单位，如至少1对数单位，至少2对数单位，至少3对数单位，至少4对数单位，至少5对数单位，至少6对数单位或至少7对数单位。在一些情况下，本发明的组合物的有效量是足以将病毒载量降至实质上不可检测的水平的量。本发明包括降低感染了HTLV-1的患者血液中HTLV-1原病毒DNA水平的方法，其包括对患者施用本发明的组合物，与治疗开始前存在的HTLV-1原病毒DNA水平相比，所述组合物的量能有效降低HTLV-1原病毒DNA水平。
或者，或另外，通过使用本领域已知的方法，例如通过可商购的试验，如INNO-LIATM HTLV I/II(Innogenetics；Gent Belgium)和Abbott HTLV-I/HTLV-II EIA(Abbott Laboratories；Abbott Park，IL)测定血清中抗-HTLV-1抗体的滴度，即可测定治疗的效力。在一些情况下，本发明组合物的有效量是足以将血清中抗-HTLV-1抗体的滴度降低为开始治疗前存在的滴度的50％，25％，10％或5％的量。在一些情况下，本发明组合物的有效量是足以将血清中抗-HTLV-1抗体的滴度降低为实质上不可测的水平的量。本发明包括降低HTLV-1感染患者血清中的抗-HTLV-1抗体的滴度的方法，所述方法包括给患者施用有效量的本发明的组合物，以使血清中的抗-HTLV-1抗体的滴度与治疗开始前存在的滴度相比有所降低。
人乳头状瘤病毒
在本发明的另一个方面，提供了治疗人乳头状瘤病毒(HPV)感染患者或与HPV感染相关之疾病，如手足疣以及口腔、肛门和生殖腔粘膜损害的方法。尽管很多种HPV是相对无害的，但很多其它类型的HPV通过性接触传播，造成生殖器或性病湿疣(被称为尖锐湿疣)，所述湿疣可导致宫颈癌和其它生殖器癌。所述方法包括给HPV感染患者施用有效量的本发明的组合物，该组合物包括一种或多种本发明的多肽或偶联物。本发明还提供了用于治疗HPV感染患者或与HPV感染相关之疾病的组合物，所述组合物包括一种或多种本发明的多肽或偶联物和可药用的载体或赋形剂。诊断为HPV感染的患者包括其活检生殖器组织中显示出HPV病毒DNA，有时(但不总是)显示出可见的生殖器组织损害的患者。
包含本发明多肽的组合物的施用剂量和频率通常与采用临床批准的干扰素-α多肽的HPV治疗方案中所使用的相似，所述临床批准的干扰素-α多肽是例如INTRONA(干扰素α-2b，重组；Schering Corporation)。INTRON A治疗尖锐湿疣的推荐剂量是使用结核菌素或类似的注射器和25-至30-号针头，每周3次，每隔一天在每个损害处注射1.0百万IU，可多达5个损害，共3周。患有6至10个湿疣的患者可按上述剂量方案接受第二(相继的)疗程，每个疗程治疗多达5个其它的湿疣。患有10个以上湿疣的患者可继续接受另一疗程，这取决于多个湿疣的大小。或者，或另外，干扰素可以局部使用，例如以乳剂或软膏的形式使用(如Stentella等.(1996)Clin.Exp.Obstet.Gynecol.23(1)：29-36所述)。所述剂量方案提供了本发明的多肽用于治疗HPV感染或与HPV感染相关之疾病，如尖锐湿疣的有用剂量范围。根据多种因素(包括但不限于本发明多肽的活性和药代动力学以及患者的体型、年龄和健康状况)，本发明多肽可采用比上述更低的剂量和/或更低的频率进行施用。类似地，含有本发明偶联物的组合物一般可以例如在损害内或局部使用，使用的剂量能有效降低受影响组织中的HPV病毒DNA的量，或减少受感染个体生殖器损害的大小和/或数目。
在一些情况下，本发明的多肽或偶联物联合一种或多种其它治疗剂进行施用。例如，本发明的多肽或偶联物可与抗-HPV治疗剂诸如Podofilox(Condylox)和/或鬼臼素(Pododerm，Podocon-25)联合使用。
本发明的多肽或偶联物的精确施用量和频率应依赖于多种因素诸如多肽或偶联物的比活性和药代动力学特性，以及需要治疗的病症的特性，以及本领域技术人员已知的其它因素。一般情况下，剂量应能预防或减轻要治疗症状的严重度或扩散。所述剂量可称“有效的”或“治疗上有效的”量。对本领域技术人员显而易见的是本发明的多肽，偶联物或组合物的有效量要依赖于(尤其是)要治疗的病症，剂量，给药方案，多肽或偶联物或组合物是单独或与其它治疗剂联合施用，血清半寿期和多肽，偶联物或组合物的其它药代动力学特性，以及患者的体型，年龄，和一般健康状况。本领域技术人员采用已知技术可确定给药剂量和频率。
通过检测HPV病毒载量，例如检测活检组织中HPV病毒DNA的水平，即可测定治疗的有效性。在一些情况下，本发明的组合物的有效量是这样的量，其足以实现在治疗过程中，与治疗前的病毒载量相比，将病毒载量降低至少0.5对数单位，如至少1对数单位，至少2对数单位，至少3对数单位，至少4对数单位，至少5对数单位，至少6对数单位或至少7对数单位。在一些情况下，本发明的组合物的有效量是足以将病毒载量降至实质上不可检测的水平的量。本发明包括降低感染了HPV的患者组织中HPV病毒DNA水平的方法，其包括给患者施用本发明的组合物，与治疗开始前存在的水平相比，所述组合物的量能有效降低HPV病毒DNA水平。
或者，或另外，通过观察被感染个体中生殖器损害(湿疣)的大小或数目，可以测定治疗的有效性。在一些情况下，本发明的组合物的有效量是足以降低被感染个体中湿疣的大小或数目的量。本发明包括降低HPV感染患者的湿疣大小或数目的方法，其包括给患者施用本发明的组合物，与治疗开始前存在的湿疣的大小或数目相比，所述组合物的量能有效降低湿疣的大小或数目。
制剂和给药途径
本发明的多肽或偶联物的治疗性制剂通常在包括一种或多种可药用的载体或赋形剂的组合物中施用。所述组合物可采用本领域本身已知的方法进行制备，从而导致具有足够的贮存稳定性并适宜施用于人类或动物的多肽药物。
剂型
本发明的多肽或偶联物可以是其盐形式和/或在其盐形式中。适宜的盐包括(但不限于)碱金属或碱土金属，诸如钠、钾、钙和镁的盐，以及锌盐。这些盐或复合物可具有晶体和/或无定形结构。
赋形剂
“可药用”是指载体或赋形剂的施用剂量和浓度不会在其所给药患者中导致任何不良作用。所述可药用的载体和赋形剂是本领域众所周知的(参见Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th edition，A.R.Gennaro，Ed.，MackPublishing Company(1990)；Pharmaceutical Formulation Development ofPeptides和Proteins，S.Frokjaer和L Hovgaard，Eds.，Taylor & Francis(2000)；和Handbook of Pharmaceutical Excipients，3rd edition，A.Kibbe，Ed.，Pharmaceutical Press(2000)).
药物的混合
本发明的药物组合物可单独或与其它治疗剂联合施用。例如，利巴韦林经常与IFN-α共同施用，并已显示出可以增高抗病毒治疗，如HCV治疗的效果。正在开发针对病毒靶(病毒蛋白酶，病毒聚合酶，病毒复制复合物的组装)和宿主靶(病毒加工需要的宿主蛋白酶，病毒靶磷酸化需要的宿主激酶诸如NS5A和有效利用病毒IRES的宿主因子的抑制剂)的多种小分子。可共同施用其它细胞因子，诸如IL-2，IL-12，IL-23，IL-27，或IFN-γ。这些药剂可被掺入作为相同药物组合物的部分或可与本发明的多肽或偶联物分开施用(同时或或根据其它治疗方案)。此外，本发明的多肽，偶联物或药物组合物可用作其它治疗的佐剂。
患者
用于本发明目的的“患者”包括人和其它哺乳动物。因此所述方法适用于人类治疗和兽医应用。
组合物类型和给药途径
包含本发明的多肽或偶联物的药物组合物可被制成多种形式，例如液体、凝胶、冻干或压缩固体。优选的形式应根据要治疗的具体病症且对本领域技术人员而言是显而易见的。
本发明的制剂的给药可用多种方法实施，所述方法包括但不限于口服、经皮下、经静脉内、经脑内、经鼻内、经皮、经腹膜内、经肌内、经肺内、经阴道、经直肠、经眼内或其它可接受的方式。虽然弹丸推注是可接受的，所述制剂可通过输注连续地施用，其采用本领域众所周知的技术诸如泵(例如，皮下渗透泵)或植入)。在一些情况下，所述制剂可采用溶液或喷雾剂直接施用。
非肠道给药(Parenterals)
药物组合物的实例是设计成非肠道给药的溶液剂。尽管在很多情况下，药物溶液剂可以以适用于立即使用的液体制剂形式提供，但所述非肠道制剂也可以以冷冻或冻干形式提供。在前者情况下，所述组合物在使用前必须解冻。后一剂型通常用于增强组合物中所包含的活性组分在各种贮存条件下的稳定性，正如本领域技术人员已知的那样，冻干制剂通常比其液体相应物更稳定。所述冻干制剂在使用前通过加入一种或多种适宜的可药用稀释剂如灭菌注射用水或灭菌生理盐水溶液重新配制。
在非肠道给药的情况下，制成冻干制剂或水溶液备用，如通过将具有所需纯度的多肽与一种或多种本领域常用的可药用载体、赋形剂或稳定剂(统称为“赋形剂”)适当混合来制备，赋形剂如缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂、非离子去污剂、抗氧化剂和/或其它各种添加剂。
缓冲剂有助于将pH保持在接近生理条件的范围中。它们通常以大约2mM-50mM的浓度范围存在。本发明使用的合适缓冲剂包括有机和无机酸及其盐如柠檬酸盐缓冲剂(如，柠檬酸一钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸一钠混合物等)、琥珀酸盐缓冲剂(如，琥珀酸-琥珀酸一钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)、酒石酸盐缓冲剂(如，酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、富马酸盐缓冲剂(如，富马酸-富马酸-钠混合物、富马酸-富马酸二钠混合物、富马酸-钠-富马酸二钠混合物等)、葡萄糖酸(gluconate)盐缓冲剂(如，葡糖酸-葡糖酸钠混合物、葡糖酸-氢氧化钠混合物、葡糖酸-葡糖酸钾混合物等)、草酸盐缓冲剂(如，草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸盐缓冲剂(如，乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)和乙酸盐缓冲剂(如，乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)。其它可能的缓冲剂是磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂和三甲胺盐如Tris。
加入防腐剂来阻滞微生物生长，加入的量通常约为0.2％-1％(w/v)。本发明使用的合适防腐剂包括酚、苯甲醇、间甲酚、羟苯甲酸甲酯(methylparaben)、羟苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苯甲基铵氯化物、苯亚甲基卤化物(如苯亚甲基氯化物、溴化物或碘化物)、氯化六甲季铵(hexamethoniumchloride)、羟苯甲酸烷基酯(alkyl paraben)如甲酯或丙酯、儿茶酚(catechol)、间苯二酚(resorcinol)、环己醇和3-戊醇。
可以加入等渗剂来确保液体组合物的等渗性，等渗剂包括多羟糖醇，优选三羟或更高级糖醇，如甘油、赤藓醇(erythritol)、阿拉伯糖醇(arabitol)、木糖醇(xylitol)、山梨糖醇和甘露糖醇。多羟基醇的量可为0.1％-25％重量比，通常为1％-5％，以其它组分的相对量计算。
稳定剂涉及-大类赋形剂，其功能范围从膨胀剂到溶解治疗剂的或有助于防止变性或与容器壁粘合的添加剂。通常的稳定剂可以是多羟糖醇(上文列举的)；氨基酸如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、omithine、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等，有机糖或糖醇，如乳糖、海藻糖(trehalose)、水苏糖(stachyose)、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇，甘油等，包括环醇如环己六醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂，如脲，谷胱甘肽、硫辛酸(thiocticacid)、巯基乙酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(即＜10个残基)；蛋白质如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；单糖如木糖，甘露糖，果糖和葡萄糖；二糖如乳糖、麦芽糖和蔗糖；三糖如棉子糖(raffinose)，和多糖如葡聚糖。基于活性蛋白质重量计算，稳定剂通常的存在范围为0.1-10000重量份。
可以存在非离子表面活性剂或清洁剂(也称作“湿润剂”)以有助于溶解治疗剂以及保护治疗性多肽来避免搅拌诱导的聚集，其也允许配方剂暴露于剪切表面应力而没有引起多肽变性。合适的非离子表面活性剂包括聚山梨酸酯(polysorbate)(20，80等)、polyoxamer(184，188等)、Pluronic多元醇、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单醚(吐温20、吐温80等)。
其它各种赋形剂包括膨胀剂或填充剂(如淀粉)、螯合剂(如EDTA)、抗氧化剂(如抗坏血酸、蛋氨酸、维生素E)和共溶剂。
活性组分也可以被包裹在制备的微囊中，例如通过coascervation技术或通过界面聚合(interfacial polymerization)制备的，例如羟甲基纤维素、明胶或聚(甲基甲丙烯酸酯)微囊，包裹在胶体状药物释放体系(例如脂质体、白蛋白微球、微乳剂(microemulsion)、纳米颗粒和纳米胶囊)中或包裹在大乳剂(macroemulsion)中。在Remington′s Pharmaceutical Sciences(文献同上)中公开了这些技术。
在本发明的一个方面中，组合物是液体组合物，诸如含水组合物，且包含下式的磺烷基醚环糊精(sulfoalkyl ether cyclodextrin)衍生物
Figure A20058002414701151
其中
n是4，5或6；R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，和R9各自独立地是，-O-或-O-(C2-C6烷基)-SO3-基团，其中至少一个R1，R2或R3独立地为-O-(C2-C6烷基)-SO3-基团；而S1，S2，S3，S4，S5，S6，S7，S8，和S9各自独立地是可药用的阳离子，包括H+。
应当注意的是，当n＝4时，磺烷基醚环糊精还可被称为α-磺烷基醚环糊精。以相似的方式，但n＝5时，可使用术语β-磺烷基醚环糊精而当n＝6时，磺烷基醚环糊精还可被称为γ-磺烷基醚环糊精。
在其它实施方案中，n是5或6。在优选实施方案中，n＝6。
而在其它实施方案中，R1，R2或R3独立地选自-OCH2CH2CH2SO3-，-OCH2CH2CH2CH2SO3-或-OCH2CH2CH2CH2CH2SO3-。最优选地，R1，R2或R3独立地是-OCH2CH2CH2CH2SO3-。
在其它实施方案中，S1，S2，S3，S4，S5，S6，S7，S8和S9各自独立地是可药用的阳离子，其选自H+，碱金属(例如Li+，a+，K+)，碱土金属(例如，Ca+2，Mg+2)，铵离子和胺阳离子诸如(C1-C6)烷基胺，哌啶，吡嗪，(C1-C6)烷醇胺或(C4-C8)环烷醇胺的阳离子。最优选地，S1，S2，S3，S4，S5，S6，S7，S8，和S9各自独立地是可药用的阳离子，其选自H+，Li+，Na+或K+，具体是Na+。
磺烷基醚环糊精可包括1-18个磺烷基(当n＝4时)，1-21个磺烷基(当n＝5时)或1-21个(当n＝6时)。在本发明优选的实施方案中，n＝5且磺烷基醚衍生物平均包含，2-20个磺烷基(尤其是磺丁基)，诸如3-10个磺烷基(尤其是磺丁基)，更优选4-9个磺烷基(尤其是磺丁基)，更优选5-9个磺烷基(尤其是磺丁基)，诸如6-8个磺烷基(尤其是磺丁基)，例如7个磺烷基(尤其是磺丁基)。
在一些情况下，磺烷基醚环糊精衍生物是β-环糊精磺丁基醚(即n＝5)的盐，具体是钠盐，其平均包含7个磺丁基。该磺烷基醚环糊精衍生物还被命名为SBE7-β-CD且可以作为Captisol(Cydex，Overland Park，Kansas)获得。
术语“C1-C6烷基”表示具有1-6个碳原子的支化的或直链烷基。常见的C1-C6烷基包括(但不限于)甲基乙基，n-丙基，异-丙基，n-丁基，异-丁基，仲-丁基，叔-丁基，n-戊基，异-戊基，n-己基和异-己基。
术语“C2-C6烷基”表示具有2-6个碳原子的分枝或直链烷基。典型的C2-C6烷基包括(但不限于)乙基，n-丙基，异-丙基，n-丁基，异-丁基，仲-丁基，叔-丁基，n-戊基，异-戊基，n-己基和异-己基。
关于本文所述多肽和磺烷基醚环糊精衍生物的组合物的进一步细节可见于WO 03/002152，尤其是题目为“磺烷基醚环糊精衍生物”的章节，37-49页，该文件引入此处作为参考。用于体内施用的胃肠外制剂必须是无菌的。其可通过，例如经过过滤膜的过滤而便易地获得。
持续释破制剂
持续释放制剂的合适例子包括含有多肽或偶联物的固体疏水聚合物半渗透材料、具有合适形式如膜或微囊的材料。持续释放材料的例子包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟基乙基甲丙烯酸酯(2-hydroxyethyl-methacrylate))或聚(乙烯醇))、聚交酯(polylactide)、L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如ProLease技术或Lupron Depot(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)构成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。聚合物如乙烯乙酸乙酯和乳酸-乙醇酸能够长时间释放分子如长达或超过100天，一些水凝胶在较短时间内释放蛋白质。包囊化的多肽长时间保留在体内时，它们因暴露于37℃潮湿的环境而变性或聚集，导致丧失生物活性并且其免疫原性可能改变。合理的稳定策略可根据所涉及的机理设计。例如，如果发现聚集机理是通过硫代二硫化物相互交换形成分子内S-S键，那么可通过修饰巯基，从酸性溶液冻干、控制含湿量、使用适宜的添加剂和开发特异性聚合物型组合物来达到稳定。
口服给药
对于口服用药，药用组合物可以是固体或液体形式，例如，以胶囊、片剂、悬液、乳剂或溶液的形式。药用组合物优选制备为含有给定量活性成分的剂量单位的形式。用于人或其它哺乳动物的合适的每日剂量可根据病人的疾病以及其它因素大幅度变化，但本领域的技术人员可使用常规方法测定。
口服用药的固体剂型可包括胶囊、片剂、栓剂、粉末和颗粒。在该固体剂型中，活性化合物可与至少一种惰性稀释剂，例如蔗糖、乳糖或淀粉混合。该剂型也可包括，如正常实践中的添加物质，例如润滑剂如硬脂酸镁。对于胶囊、片剂和丸剂，剂型也可包括缓冲剂。片剂和九剂还可具有肠衣。
多肽或偶联物可与诸如乳糖、蔗糖、淀粉粉末、链烷酸的纤维素酯、硬脂酸、滑石、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸和硫酸的钠和钙盐、阿拉伯胶、明胶、藻酸钠、聚乙烯-吡咯烷和/或聚乙烯醇的佐剂混合，并作成片剂或包成胶囊用于常规用药。可选地，它们可溶于盐水、水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇、油类(例如玉米油、花生油、棉籽油或芝麻油)、黄芪胶(tragacanth gum)和/或各种缓冲液中。其它佐剂和用药方式是制药领域熟知的。载体或稀释剂可包括时间延迟材料(time delay material)，例如单独或与石蜡一起的甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯，或者本领域熟知的其它材料。
可对药用组合物进行诸如灭菌的常规制药操作和/或药用组合物可含有常规佐剂，例如防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、缓冲液、填充物等，例如，如在本文别处所述。
口服用药的液体剂型可包括可药用的乳剂、溶液、悬液、糖浆和酏剂，其含有诸如水等本领域常用惰性稀释剂。该组合物也可包括佐剂，例如润湿剂、甜味剂、调味剂和香味剂。
肺部递送
适合于喷射或者超声喷雾器的配制剂一般包含以，例如每mL溶液大约0.01到25mg偶联物，优选大约0.1到10mg/mL的浓度溶于水中的多肽或偶联物。配制剂也可包括缓冲液和简单糖类(例如，用于蛋白质稳定化和渗透压调节)，和/或浓度范围从0.1到10mg/ml的人血清白蛋白。可使用的缓冲液的例子是乙酸钠，柠檬酸盐和甘氨酸。优选的是，缓冲液具有适合于将溶液调到pH为3至9范围的组成成分和体积摩尔浓度。一般来说，从1mM到50mM的缓冲液摩尔浓度适合于该目的。可使用的糖类的例子是乳糖，麦芽糖，甘露糖醇，山梨糖醇，海藻糖，和木糖，通常的含量范围是配制剂重量的1％到10％。
喷雾配制剂也可含有表面活性剂以降低或防止在形成气溶胶时由溶液的雾化引起的表面诱导的蛋白质聚集。可使用各种常规表面活性剂，例如聚氧化乙烯脂肪酸酯和醇，聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯。其含量范围一般为配制剂重量的0.001％和4％之间。用于本发明目的的特别优选的表面活性剂是聚氧化乙烯山梨聚糖单油酸酯(polyoxyethylene sorbitan monooleate)。
具体配制剂和产生合适分散的本发明的液体颗粒的方法在WO94/20069，US 5,915,378，US 5,960,792，US 5,957,124，US 5,934,272，US5,915,378，US 5,855,564，US 5,826,570和US 5,522,385中描述，在此引用以供参考。
用于带有剂量刻度的吸入器装置的配制剂一般包含磨碎的(finelydivided)粉末。该粉末可通过冻干并然后磨制液体偶联物配制剂来生产且也可含有稳定剂，例如人血清白蛋白(HSA)。一般来说，加入超过0.5％(w/w)的HAS。另外，如果需要可向该制剂中加入一种或多种糖或糖醇。其例子包括乳糖，麦芽糖，甘露糖醇，山梨糖醇，山梨糖，海藻糖，木糖醇，和木糖。加入配制剂中的该偶联物的量的范围从大约0.01到200％(w/w)，优选从大约1到50％。然后冻干该配制剂并磨制成所需的颗粒大小。
然后将合适大小的颗粒借助于表面活性剂悬浮于推进剂中。推进剂可以是用于该目的的任何常规材料，例如含氯氟烃，氢氯氟碳，氢氟碳，或碳氢化合物，包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1，1，1，2-四氟乙烷或其组合。合适的表面活性剂包括山梨聚糖三油酸酯和大豆卵磷脂。油酸也可用作表面活性剂。然后将该混合物装入递送装置中。适用于本发明的商业上可获得的计量型吸入器(metered inhaler)例子是由Glaxo Inc.，Research Triangle Park，NC，USA生产的Ventolin计量型吸入器。
用于粉末吸入器的配制剂包含含有偶联物的磨碎的干粉且也可包括膨胀剂，例如乳糖、山梨糖醇、蔗糖或甘露糖醇，其含量可帮助粉末从装置中散布，例如，占配制剂重量的50％到90％。粉末的颗粒在肺中应具有相当于一种颗粒的空气动力学特性，所述颗粒密度大约1g/cm2、中值直径小于10微米，优选在0.5和5微米之间，最优选在1.5和3.5微米之间。根据本文的教导适用的粉末吸入器的例子是由Fisons Corp.，Bedford，MA，USA生产的Spinhaler粉末吸入器。
以US 5,997,848，US 5,993,783，US 5,985,248，US 5,976,574，US5,922,354，US 5,785,049和US 5,654,007公开的方法可产生和/或递送这些装置中的粉末。
设计用于治疗产品的肺部递送的机械装置包括但不限于喷雾器，计量型吸入器，和粉末吸入器，所有这些都是本领域的技术人员所熟悉的。适用于本发明实践的商业上可获得的装置的具体例子是由Mallinckrodt，Inc.，St.Louis，MO，USA生产的Ultravent喷雾器；由Marquest Medical Products，Englewood，CO.，USA生产的Acorn II喷雾器；由Glaxo Inc.，Research TrianglePark，NC，USA生产的Ventolin计量型吸入器；由Fisons Corp.，Bedford，MA，USA生产的Spinhaler粉末吸入器；Inhale Therapeutic Systems，Inc.，SanCarlos，CA，USA的“静置云(standing cloud)”装置；Alkermes，Cambridge，MA，USA生产的AIR吸入器；和Aradigm Corporation，Hayward，CA，USA生产的AERx肺部药物递送系统。
试剂盒
本发明还提供了包括本发明的多肽、偶联物、多核苷酸、表达载体、细胞、方法、组合物，系统和装置的试剂盒。本发明的试剂盒任选包括至少一种以下本发明的内容：(1)本文所述的装置，系统，系统组件或装置组件；(2)包括本发明的多肽或偶联物或多核苷酸的至少一种试剂盒组分；编码本发明多肽的质粒表达载体；表达本发明多肽的细胞；或包含至少一种任何所述组分的组合物；(3)实施本文所述任何方法(包括治疗性或预防性方法)的说明，使用(2)中确定的任何组分或所述组分的任何组合的说明，和/或操作本文所述任何装置、系统或组分的说明；(4)放置保持所述至少一种所述组分或组合的容器；和(5)包装材料。
另一方面，本发明提供了本文所述的任何装置，组件，组合物或试剂盒用于实施本文所述的任何方法或测定法的用途，和/或任何装置或试剂盒用于实施本文所述的任何测定法或方法的用途。
实施例
以下实施例用以举例说明本发明，而并非以任何形式限制本发明的精神和范围。
材料和方法
I.确定表面可及的残基
可接近表面区(ASA)
用计算机程序Access(B.Lee和F.M.Richards，J.Mol.Biol.55：379-400(1971))版本2(1983 Yale University)计算该结构中各原子的可接近表面区(ASA)。该方法一般使用1.4大小的探针且可将可接近表面区(ASA)定义为由探针中心形成的区域。在该计算前，从坐标系中去除所有水分子，氢原子和与该蛋白质不直接相关的其它原子。
侧链的分数ASA
通过用侧链中该原子的ASA总和除以代表延伸ALA-x-ALA三肽中该残基类型的侧链原子ASA值来计算侧链原子的分数ASA。参见Hubbard，Campbell & Thornton(1991)J.Mol.Biol.220，507-530。在该实施例中，将CA原子视为甘氨酸残基侧链的一部分但不视为其余残基的一部分。下表用作侧链的标准100％ASA(表6)：
Ala    69.23  2    Leu    140.762
Arg    200.35 2    Lvs    162.502
Asn    106.25 2    Met    156.082
Asp    102.06 2    Phe    163.902
Cys    96.69  2    Pro    119.652
Gln    140.58 2    Ser    78.162
Glu    134.61 2    Thr    101.672
Gly    32.28  2    Trp    210.892
His    147.00 2    Tyr    176.612
Ile    137.91 2    Val    114.142
在该结构中未检测到的残基定义为100％暴露，因为其被认为位于弹性区域。在分析NMR结构系统的情况下，使用总体平均ASA值。
当不可获得三维结构时表面暴露残基的测定：
当无不可获得三维结构或如果该结构描述不详细而不足以确定表面可接近性时(例如如果仅已知CA原子的位置)，表面可接近性可从如下构建的序列比对中推断出：
A：如果结构已知但描述不详细而不足以确定表面可接近性时：
采用可从Molecular Simulations，Inc.获得的MODELER程序，将详细度较低的结构与该序列家族的已知结构进行基于结构的序列比对。
B：如果结构未知：
将序列与预先确定的序列比对进行比对，包括该序列家族的已知
结构的序列，其可采用程序ClustalW的“图谱/结构对比”选项制备(Thompson，(1994)Nucleic Research 22：4673-4680)。
通过A或B所得的序列比对中，序列中位于与至少一个具有已知结构的其它序列中暴露的残基等效的位置上的待分析残基被确定为暴露的。暴露程度为其它序列中等效残基的最大值。在待分析的序列为插入的情况下(即其它序列中无等效残基)，该残基被确定为完全暴露，因为其最可能位于转角/环区。在存在详细度低的结构的情况下，该结构中未检测到的那些残基被确定为完全暴露，因为其被认为位于柔性区域。
测定原子间的距离：
使用分子图形软件，例如获自Molecular Simulations，Inc的InsightII98.0测定原子间的距离。
II.蛋白质的表达和纯化
A.从CHO细胞的表达和纯化
一些本发明的多肽在中国仓鼠卵巢(CHO)K1细胞(ATCC：CCL-61)中制备，所述细胞被稳定转染并用G418选择以建立克隆的细胞系。
1.CHO表达构建体：
编码本发明多肽的核酸被克隆至CHO表达载体中，处于SV40启动子的控制之下，且与编码N-末端前导序列的序列以及任选一个或两个C-末端标记序列置于同一读框内。前导序列可以是普通的前导序列，IFNα6前导序列或经修饰的IFN α6前导序列，C-末端标记包括E-标记(AmershamBiosciences)和/或His-标记。在XL1-Blue细胞中产生质粒。
2.选择表达IFN-α多肽的稳定亚克隆：
材料：
培养基：含有G418，FBS和青霉素，链霉素和谷氨酰胺[PSG]的DMEM-F 12(PSG；Gibco/Invitrogen)；
1×PBS(Gibco/Invitrogen)；
胰蛋白酶/EDTA
抗E-Tag抗体-HRP偶联物(Amersham BioSciences)
ECL Plus Western印迹检测试剂(Amersham BioSciences)
步骤：在用G418选择的条件下，在含有FBS和青霉素的DMEM/F-12培养基中生成稳定转化体。将细胞分装至含有50ml选择培养基的T175瓶中，然后在CO2温箱中，于37℃保温～24小时或直至细胞达到80％铺满。通过PBS洗涤，然后加入2.5ml胰蛋白酶/EDTA和于37℃保温3-5分钟，收获细胞。通过使用Beckman Model台式离心机以1000g离心30分钟来收集并回收细胞。细胞在PBS中洗涤一次，然后在含有1％FBS的3ml PBS中重悬浮。测定细胞密度然后用PBS/FBS调至1×106细胞/ml。对于各IFN-α多肽，将细胞在DakoCytomation MoFlo分选器中分入包含200ml选择培养基的2-5个96孔板中。将培养板在37℃温箱中保温10-14日以便使经分选的细胞生长。首先通过点印迹分析选择高水平表达每种IFN-α多肽的两个亚克隆，随后采用抗-E标记抗体-HRP偶联物和化学发光检测，通过Westem印迹分析来验证所述亚克隆。
3.蛋白质表达：
材料：
DMEM-F12培养基(Gibco/Invitrogen)
Ultra CHO培养基(BioWhittaker)
CHO III A培养基(Gibco/Invitrogen)
Ex-Cyte生长增强培养基补充剂(Serologicals Proteins)
ITSA(胰岛素、运铁蛋白、用于贴壁培养的硒补充剂；Gibco/Invitrogen)
青霉素/链霉素(P/S)
FBS，PBS，胰蛋白酶
步骤：
第1日：将来自一个T-175瓶的细胞转移至一个摇瓶(1700cm2)，所述摇瓶中有300ml含10％FBS和1×P/S的DMEM-F12，然后在37℃CO2温箱中生长。
第3日：将培养基换为300ml新鲜DMEM-F12-FBS-P/S。
第5日：将培养基换为300ml含有1/1000 Ex-Cyte和P/S的Ultra CHO。
第7日：用300ml CHO III A+P/S生产培养基替换培养基。
在第8，9和10日收集上清。使用Beckman Coulter Allegra 6R台式离心机，以2000g离心上清20分钟，然后用0.2μ PES bottle top无菌滤器过滤，保存于4℃以备纯化。
4.蛋白质纯化：
一些本发明的多肽被表达为包含位于C末端的13个氨基酸E-tag序列的融合蛋白。所述多肽用E-tag亲和层析柱进行纯化，方法如下。
材料：重组噬菌体抗体系统纯化组件(Amersham BioSciences，Cat.No.17-1362-01)。纯化试剂盒包含直径16mm×高25mm(5ml柱床体积)的抗E-Tag柱和相关缓冲液。
步骤：采用2800×g离心20分钟并联用0.2μ PES bottle top滤器组件过滤澄清从摇瓶中的CHO-HK1细胞收集的上清。将上清以150cm/h(5ml/分钟)加载于用RPAS结合缓冲液平衡过的E-标记柱上。用5CV(柱体积)的结合缓冲液洗柱，然后用RPAS洗脱缓冲液以75cm/h(2.5ml/分钟)洗脱蛋白质。洗脱级分用0.05体积的1M Tris-CL pH8.0中和，透析入PBS，浓缩至0.1-1.5mg/ml并将等分试样冷冻保存于-80℃。在含有0.5％BSA的PBS中将用于测定的样品配制成50μg/ml，然后将等分试样冷冻保存于-80℃。通过SDS-PAGE，然后通过采用获自INVITROGEN的材料、试剂和操作步骤进行考马斯染色，从而对样品进行常规分析。
通过BCA测定，采用IFN-α标准(其浓度已通过氨基酸分析进行证实)常规测定蛋白质浓度。
B.从大肠杆菌中的表达和纯化
一些本发明的多肽作为包涵体在大肠杆菌中制备，其按下述进行纯化和重折叠。
1a.大肠杆菌表达构建体
在一些情况下，对编码本发明多肽的核酸进行修饰以使在大肠杆菌中的表达得以改善。所述修饰包括各用大肠杆菌偏好的Arg-Arg密码子对，如CGTCGC取代稀有的Arg-Arg密码子对AGGAGG(位于核苷酸位置34-39)和AGGAGA(位于核苷酸位置64-69)(所述位置编号是相对于SEQ ID NO：59而言的)，或用大肠杆菌偏好的Arg密码子CGC或CGT取代编码序列中的大多数或所有罕见的Arg密码子AGA和AGG。还在编码序列的5’末端添加甲硫氨酸密码子(ATG)。按照此方式修饰的编码序列的实例包括SEQ IDNO：60-61，63-64，66-67，69-70，72-73，75-76，78-79，81-82，84-85和87-88。将编码序列插入含有卡那霉素选择标记的pET-42表达载体(Novagen)，置于T7启动子的控制之下，或插入含有卡那霉素选择标记的pQE80-Kan表达载体(Qiagen)，置于T5启动子的控制之下
1b.蛋白质表达
采用标准方法将包含干扰素编码序列的pET-42载体转化至大肠杆菌菌株，如BL21(DE3)中，然后铺于包含50μg/ml卡那霉素的琼脂平板上，然后于37℃保温。18-24小时后，选取三个单独的菌落，将其转入包含含有50μg/ml卡那霉素的5ml 2×YT的试管中，于37℃保温过夜。用过夜培养物接种2组包含含有50μg/ml卡那霉素的100ml 2×YT的烧瓶中。于OD600监测培养物在37℃的生长。当OD600为0.5-0.8时，用1mM IPTG在37℃诱导所述培养物3小时。采用SDS-PAGE通过在SDS样品缓冲液中裂解沉淀的细胞来分析IPTG诱导的培养物的表达。通过加入25％甘油并于-80℃以1ml等分试样冷冻细胞，将相应的未经诱导的培养物组制备成冷冻贮存物。将含有干扰素编码序列的pQE80-Kan载体转化至大肠杆菌菌株W3110或W3 110-fhuA。按上述方法证实表达。
通过用25ml过夜培养物接种4×1L 2×YT培养基+卡那霉素来进行较大规模的摇瓶表达。以OD600监测培养物，达到0.5-0.8 OD单位时用1mM IPTG诱导培养物。诱导3小时后，以5000g离心以收集细胞，并于-80℃冷冻储存。通过2-3次穿过French压榨机或10,000psi的APV 1000匀浆器来破碎细胞，按“IB的分离”和随后的章节所述进行处理。
以10L的规模在B.Braun生物反应器中进行补料分批发酵，培养基为添加有微量元素溶液和40mg/L卡那霉素的Terrific Broth(TB)培养基。通过将400ml过夜培养物接种至生物反应器内的TB培养基中以开始发酵。在最初的生长期，通过改变搅拌速率将溶解氧(DO)维持在50％。当培养物的OD600达到5.0时，开始以0.5ml/分钟补加甘油/氨基酸料，将搅拌速率设置为1000rpm。调整补料速率以将剩余发酵过程的DO维持在40％。当OD600达到25时，通过加入终浓度为1mM的IPTG来诱导培养物。诱导3小时后，通过用Beckman离心机以10000×g离心收集细胞，将细胞膏状物储存于-60C。收集细胞时的OD600一般为35-40左右。
2a.大肠杆菌表达构建体(用于高水平表达)
以下实施例显示出两例本发明多肽的表达，所述多肽的编码序列被克隆至能在大肠杆菌中高水平表达真核基因的大肠杆菌表达系统(如EP0972838所述)。根据密码子-使用和mRNA二级结构(Griswold et al.，ProteinExpr Purif.2003 Jan；27(1)：134-42)，使用序列分析程序GCG(GeneticComputer Group，Inc.，Wisconsin USA，Version 7.1，March 1992)，用功能“backtranslate”/“EcoHigh-database”防止出现稀有的密码子，  用功能MFold/Plotfold(-menu＝f或-menu＝g)预测和预防可能对基因表达不利的二级结构，从而最优化对应于14epi18(SEQ ID NO：13)和25epi19(SEQ ID NO：38)的氨基酸序列(它们的N-末端都另外含有Met)的编码序列。按照此方式最优化的编码序列分别为SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：90。
将最优化的DNA序列克隆至具有另外的lacI基因的OripBR-URA3。将被称为OripBR-URA3-lacI_14epi18-mut2(图6)和OripBR-URA3-lacI_25epi19-mut(图7)的所得载体转化至感受态的大肠杆菌UT5600(ΔpyrF)细胞(如EP 0972838所述)。在未加尿嘧啶的基本M9-培养基琼脂平板上选择转化细胞。
M9-琼脂平板：
无菌的琼脂糖贮液(终浓度为15g/l)430ml
M9-盐溶液                      50ml
1M MgSO4                       0.5ml
1M CaCl2                       0.05ml
20％葡萄糖                     5ml
维生素B1(c＝1mg/ml)            2.5ml
10％酪蛋白氨基酸               25ml
L-色氨酸(c＝5mg/ml)            5ml
L-亮氨酸(c＝5mg/ml)            5ml
L-脯氨酸(c＝5mg/ml)            2.5ml
2b.蛋白质表达
将根据上文2a.的转化细胞接种至摇瓶中，并于37℃培养。通过加入1mM IPTG，在OD578＝1时进行诱导。7小时后收集细胞，在SDS-PAGE凝胶上分析细胞沉淀物。所用培养基如下：
酪蛋白氨基酸        120g
NH4Cl               3.9g
色氨酸              5.5g
亮氨酸              5.5g
脯氨酸              5.5g
甘油                85g
溶解于4300ml        H2O
和
K2HPO4*3H2O         91.5g
柠檬酸              8.0g
溶解于600ml H2O
和
维生素B1(5mg/ml)    17.5ml
MgSO4×7H2O(1M)     17.5ml
PH＝7.0
用水调整至5000ml
3.包涵体(IB)的分离、溶解、磺化和重折叠
为了分离IB，在1×PBS中以10ml PBS/克细胞湿重重悬浮融化的细胞膏状物，混合，直至获得均一的悬浮液。在微型流化器中，以17,000-19,000psi、使细胞通过仪器2次而使细胞破碎。将细胞裂解物调整至1％TritonX-100，混合10分钟，于2-8℃以10,000g离心60分钟以回收IB。通过在含有1％TritonX-100的PBS中重悬浮将IB沉淀物洗涤一次，按上述离心回收IB，于-80℃冷冻储存。
3a.溶解/重折叠方法1：
为了溶解IB，以每克细胞膏状物10ml缓冲液的量将IB沉淀物重悬浮于脲缓冲液(50mM Tris-Cl，200mM NaCl，8M urea，2mM DTT，1mM EDTA，pH8.0)。将悬浮液混合30分钟，于2-8℃以10,000g离心30分钟。通过用不含DTT的脲缓冲液重悬浮将沉淀物洗涤一次，按上述进行离心，用水洗涤两次。以每克沉淀物10ml缓冲液的量用胍缓冲液(50mM Tris-Cl，200mMNaCl，8M胍-HCl，1mM EDTA，pH8.0)溶解经洗涤的沉淀物，混合30-60分钟，于2-8℃以10,000g离心30分钟。将含有溶解的IFN的上清液调整至10mg/ml亚硫酸钠和5mg/ml连四硫酸钠中以启动磺化过程，所述磺化过程在2-8℃进行16小时。磺化后，用水将IFN溶液稀释2倍。于2-8℃以10,000g离心以回收IFN沉淀物。用水将沉淀物洗涤两次，将沉淀物重悬浮于上述的胍缓冲液中。通过280nm下的光吸收值测定磺化IFN的蛋白质浓度。
于2-8℃，用重折叠缓冲液(50mM Tris-Cl，20mM NaCl，2mM还原的谷胱甘肽，1mM氧化的谷胱甘肽)将溶于胍缓冲液中的磺化IFN稀释至终浓度为100mg/ml，从而启动重折叠过程。于2-8℃，缓慢混合以进行重折叠达6-8小时，接着加入CuSO4至终浓度为2μM，然后再进行重折叠达16-20小时。通过SDS-PAGE和反相HPLC监测重折叠反应的进程。
3b.溶解/重折叠方法2：
为了溶解14epi18，以每克IB膏状物4ml缓冲液的量将IB沉淀物重悬浮于胍缓冲液(7M胍，20mM Na2HPO4，10mM DTE，pH8.0)。将悬浮液混合2小时，溶解后，于室温下，使用10kDa截留膜，对着至少8倍体积的含有7 M胍缓冲液和20mM NaH2PO4 pH5.0的缓冲液进行渗滤。
为了进行重折叠，将溶解的蛋白质稀释至含有20mM Na2HPO4，0.8M精氨酸和2μM CuSO4，pH7.5的折叠缓冲液中。于2-8℃，以最终的蛋白质浓度约为0.5mg/ml蛋白质，缓慢混合以进行重折叠达72小时。通过反相HPLC监测重折叠反应的进程。
3c.溶解/重折叠方法3：
为了溶解25epi19，将IB浆状物重悬浮于溶解缓冲液(8M盐酸胍，100mM DTT，50mM Tris pH8.3)。室温下将悬浮液混合30分钟。随后用HCl将pH调整至4.5。使用5K膜进一步浓缩溶解液，并对着10倍体积的已用HCl调整至pH4.5的7.2M盐酸胍进行渗滤。
为了进行重折叠，将溶解的蛋白质稀释至折叠缓冲液(0.8M精氨酸，50mM磷酸钾，2mM GSH，1mM GSSG pH7.8)。于2-8℃，以最终的蛋白质浓度约为1mg/ml蛋白质进行重折叠过夜。
4.纯化
4a.纯化方法1：
使用三个层析步骤纯化重折叠的IFN。将重折叠溶液调整至80％(重量/体积)饱和浓度的硫酸铵中，通过0.2μM滤器进行过滤，以200cm/h加载于20ml用Equil缓冲液(50mM Tris-Cl，0.8M硫酸铵，pH8.0)平衡过的ButylSepharose Fast Flow疏水作用层析(HIC)柱(Amersham Biosciences)。先用8倍柱体积(CV)的Equil缓冲液，再用8CV的洗涤缓冲液(50mM Tris-Cl，0.5M硫酸铵，pH8.0)洗涤HIC柱。用含或不含15％饱和浓度硫酸铵的50mMTris-Cl，pH8.0洗脱IFN。
使用0.5M醋酸钠，pH4.5贮液将HIC收集液调整至50mM醋酸钠并稀释2倍。以90cm/h将调整过的收集液加载于5ml用50mM醋酸钠，100mM NaCl，pH5.0平衡过的HiTrap CM Sepharose Fast Flow柱(AmershamBiosciences)。加载后，在平衡条件下用5CV缓冲液洗涤柱，使用20CV梯度为100-650mM的NaCl洗脱IFN。根据280nm下的光吸收值收集含有IFN的峰级分。
使用2M 1，3二氨基丙烷，pH～10贮液将CM Sepharose收集液调整至20mM 1，3二氨基丙烷。以200cm/h将样品加载于5ml用50mM 1，3二氨基丙烷，100mM NaCl，pH10.0平衡过的HiTrap Q Sepharose Fast Flow柱(Amersham Biosciences)。加载后，在平衡条件下用5CV缓冲液洗涤柱，使用20CV梯度为100-650mM的NaCl或100-1000mM的NaCl洗脱IFN。根据280nm下的光吸收值收集含有IFN的级分，立即对着250-500体积50mM醋酸钠，150mM NaCl，pH5.0或50mM硼酸钠，pH9.0进行透析。透析后，在有生物研究安全性的橱柜中，使用0.2μM滤器无菌过滤IFN样品，根据280nm下的光吸收值测定浓度，将样品储存于2-8℃长达1周，或分成等分试样储存于-80℃以延长储存期。为了测定活性，一般将样品在0.5％BSA，PBS pH7.4中配制成5，20和50ug/ml，分成等分试样在-80℃冷冻贮存。
4b.纯化方法2：
使用两个层析步骤纯化重折叠的14epi18。用KCl将重折叠溶液调整至pH8.0和约190mS/cm，通过5μm滤器进行过滤，以75cm/h加载于用由2.0M KCl，20mM K2HPO4，0.8M精氨酸，pH8.0组成的平衡缓冲液平衡过的Butyl-Sepharose Fast Flow疏水作用层析(HIC)柱(General ElectricHealthcare)。用5倍柱体积(CV)的2.0M KCl，20mM K2HPO4，0.8M精氨酸，pH8.0洗涤HIC柱。用0.4M KCl，20mM K2HPO4，pH8.0洗脱14epi18。通过反相HPLC监测洗脱液。
用蒸馏水稀释洗脱液，使传导率约为3mS/cm。将pH调整至6.8。以50cm/h将调整过的收集液加载于用25mM醋酸铵，pH6.8平衡过的Q-Sepharose Fast Flow柱(GE Healthcare)。加载后，用平衡缓冲液洗涤柱。用直至pH4.0的线性梯度洗脱14epi18。根据反相HPLC分析收集含有折叠的14epi18的峰级分。
4c.纯化方法3：
使用两个层析步骤纯化重折叠的25epi19。将重折叠溶液调整至1.3MNaCl，通过两个滤器的组合(先是0.8/0.3μm，接着是0.45/0.2μm)过滤溶液。以50-150cm/h将蛋白质加载于用平衡缓冲液(0.8M精氨酸，1.3M氯化钠，50mM磷酸钾，pH8.0)平衡过的Butyl Sepharose Fast Flow柱(GeneralElectric Healthcare)。将样品上样后，用3CV平衡缓冲液和3CV洗涤缓冲液(20mM磷酸钾，2M氯化钠，pH7.5)洗涤柱。通过以50-100cm/h的流速使用洗脱缓冲液(20mM磷酸钾，pH7.5)以进行洗脱步骤。根据UV280测定结果收集峰。
在确定传导率低于10mS/cm后，以50-75cm/h，将收集液加载于用30mM醋酸铵，pH5.9平衡过的Q-Sepharose Fast Flow柱(GE Healthcare)。加载后，用平衡缓冲液洗涤柱，直至到达基线值(UV280)。用直至pH3.5的线性梯度洗脱25epi19。根据反相HPLC分析和SDS-PAGE收集含有折叠的25epi19的峰级分。
III.活性测定
A1.HuH7-EMCV抗病毒测定
以下提供了本发明的干扰素-α多肽和偶联物的抗病毒活性的示例性测定法。该测定法是基于细胞的剂量-反应测定法，用于评估药物的抗病毒效力，其有时被称为“保护免受细胞病变效应”(或PCPE)测定法，也被称为抑制细胞病变效应(CPE)测定法。简言之，用药物与细胞一起保温，然后暴露于病毒。在不存在药物时，暴露于病毒的细胞死亡。随着药物浓度的增加，存活细胞的比率增加。可直接(例如，通过肉眼计数)或间接地通过估计代谢率检测存活细胞的数量。例如，代谢染料诸如MTT或WST-1可被用作细胞存活的间接检测。存活细胞代谢所述染料而生成代谢产物，该产物可通过分光光度法(光密度)进行定量。
材料和试剂：
HuH7细胞：人肝瘤细胞系(得自Michael Lai医生，USC-外科，LosAngeles，CA)。该细胞系也可得自Japanese Collection of ResearchBioresources(JCRB)/Health Science Research Resources Bank(HSRRB)，Osaka，Japan的细胞库。HuH7细胞系最初是在J.Sato医生(Okayama大学医学院)的实验室中从患有良好分化的肝细胞癌的57岁日本男性中建立的(Nakabayashi，H.，et al.(1982)Cancer Res.42(9)：3858-63)。该细胞系的乙型肝炎表面抗原为阴性。
VERO细胞：非洲绿猴肾细胞系(ATCC#CCL-81)。1962年，日本千叶的千叶大学由正常成年非洲绿猴的肾中获得了此细胞系。1964年，#93代VERO细胞系被转移至国立卫生研究院(NIH)。
脑心肌炎病毒(EMCV)：组织培养适应株(ATCC#VR-129B)。脑心肌炎病毒(EMCV)的组织培养适应株购自ATCC(#VR-129B)。为了进行HuH7抗病毒测定法，在VERO非洲绿猴肾细胞中产生高滴度病毒原液。通过在L929细胞上进行的噬斑试验测定出的由VERO产生的EMCV原液的病毒滴度为1.1×108PFU/ml。
完全DMEM：
Dulbecco氏改良Eagle培养基(DMEM，Gibco货号11965-092)
10％胎牛血清(FBS，Hyclone货号SH30071.03)
1×青霉素-链霉素(PS，Gibco货号15140-122)
减少血清的DMEM：
Dulbecco氏改良Eagle培养基(DMEM，Gibco货号11965-092)
2％胎牛血清(FBS，Hyclone货号SH30071.03)
1×青霉素-链霉素(PS，Gibco货号15140-122)
胰蛋白酶/EDTA(Gibco货号25300-054)
WST-1(Roche；货号1644 807)
将HuH7细胞在5％CO2温箱中，于37℃保持在完全DMEM中。用胰蛋白酶收集细胞并每周两次在铺满时于T175瓶中分成终密度1-2×106个细胞每25ml。测定的前一天，用胰蛋白酶处理细胞然后以4.5×106个细胞每25ml的密度接种于新T175瓶中以便确保在测定前所述细胞处于对数期。
HuH7-EMCV抗病毒测定法的步骤：
在VERO细胞中扩增高滴度的EMCV病毒原液。通过HuH7单层细胞的EMCV病毒杀伤曲线测定95％的细胞被杀死的致死浓度(LC95)。简言之，在第一日将HuH7细胞以6×104细胞/孔铺于96孔微量滴定板。在DMEM+2％FBS中以10个稀释点按1∶3连续稀释所述病毒，然后在第二日将其加至细胞。感染后24小时，通过四唑盐代谢测定法WST-1(Roche)来测定细胞存活。HuH7-EMCV测定法所测定的LC95对应于0.034的MOI(PFU/细胞)。通过L929细胞的标准噬斑试验测定病毒原液的滴度。
在测定的第一日，用胰蛋白酶收集对数期HuH7细胞，在减少了血清的DMEM中重悬浮然后通过离心浓缩。细胞沉淀物(对应于5个T175瓶的细胞)在10ml减少了血清的DMEM中重悬浮，经40微米尼龙细胞滤器(Nylon cell strainer)过滤然后用血细胞仪(hemocytometer)计数。通过台盼蓝染色排除法测定细胞生存力。细胞在减少了血清的DMEM中重悬浮至终密度为6×105细胞/ml。将100μl稀释的细胞加入96孔测定板的各孔中(6×104细胞/孔)，然后将测定板在潮湿的5％CO2温箱中于37℃保温4小时。
采用剂量反应分析测定“参照”干扰素α和本发明的干扰素-α多肽(也称为“受试样品”)的效力。每板中通常存在一种受试样品和一种参照IFN-α，各具有IFN-α处理的/EMCV攻击的细胞的三条重复型曲线和单独用IFN-α处理的细胞的两条重复型曲线。测定后者作为IFN-α对HuH7细胞的潜在抗增殖效应的对照。参照IFN-α的剂量反应曲线通常由100ng/ml-0.05ng/ml的8个三倍稀释度组成。对于IFN-α实验样品，所述三倍稀释度通常为5ng/ml-0.002ng/ml。各自包含用病毒处理且无IFN-α处理的细胞以及仅包含细胞的八个孔也作为对照。
采用减少了血清的DMEM制备IFN-α稀释液。将100μl稀释的IFN-α制品转移至测定板中。然后将测定板在潮湿的5％CO2温箱中于37℃保温12小时。
在第二日，用EMC病毒攻击细胞。从测定板的各孔中吸出培养液。在DMEM+2％FBS中以1∶5400稀释EMCV原液。将100μl稀释的病毒(相当于0.034病毒颗粒/最初接种的细胞)加入各孔中。然后将细胞在潮湿的5％CO2温箱中于37℃与病毒一同保温24小时。
在第三日，通过WST-1对各孔中存活细胞的数量进行定量。从测定板的各孔中吸出培养液。在减少了血清的DMEM中以1∶20稀释WST-1试剂，将100μl稀释的WST-1试剂加入各孔中然后将细胞在潮湿的5％CO2温箱中于37℃保温60分钟。通过在读板器上检测450nm的OD来对各孔中存活细胞的数量进行定量。
分析：
采用以下公式计算IFN-α参照物和受试样品的抗病毒效力：
抗病毒效力＝(存活细胞C+I+V-存活细胞C+V)/(存活细胞C+I-存活细胞C+V)*100％
其中C+V＝HuH7细胞+EMCV，C+I＝HuH7细胞+IFN-α，而C+I+V＝HuH7细胞+IFN-α+EMCV
采用GraphPad Prism 4(GraphPad Software Inc.)通过非线性回归分析剂量反应曲线。将以下公式用于曲线拟合：
Y = Bottom + ( Top - Bottom ) 1 + 10 ( LogEC 50 - X ) · HillSlope
其中Bottom是位于底部平台(bottom plateau)的Y值；Top是位于顶部平台(top plateau)的Y值，LogEC50是当反应在Bottom和Top中间的X值。将Levenberg-Marquardt法用作优化算法。
A2.HeLa-EMCV和WISH-EMCV抗病毒测定
抑制EMCV对HeLa(人宫颈癌衍生的细胞系)和WISH(人羊膜组织衍生的细胞系)细胞的细胞病变效应还提供了有用的替代测定法，可用于评价本发明的干扰素-α多肽和偶联物的抗病毒效力。按照类似于上述HuH7-EMCV测定法的方式进行这些测定法，方法的改动之处如下。
材料和试剂：
HeLa细胞：人宫颈癌细胞系(ATCC#CCL-2)。HeLa细胞系衍生自35岁女性的宫颈腺癌。据报道HeLa细胞含有人乳头状瘤病毒(HPV-18)序列。第107代细胞系被ATCC接收。
WISH细胞：人上皮细胞系(ATCC#CCL-25)。WISH细胞系是由培养35天后原代人羊膜细胞传代培养物中出现的有所改变的集落建立的。WISH细胞系含有HeLa标记染色体。#170代细胞被ATCC接收。
L-929细胞：鼠成纤维细胞系(ATCC#CCL-1)。L-929细胞系是1948年分离自亲本株L株第95代的单细胞克隆。L株分离自正常的100天龄雄性C[3]H/An小鼠的皮下蜂窝和脂肪组织。
EMCV：组织培养适应株(ATCC#VR-129B)。脑心肌炎病毒(EMCV)的组织培养适应株购自ATCC(#VR-129B)。为了进行HeLa和WISH抗病毒测定法，在L929细胞中产生高滴度EMCV原液。根据在L929细胞上进行的噬斑试验的结果，由L929产生的病毒原液的病毒滴度为4.0×108PFU/ml。
完全MEM：
极限必需培养基(MEM，Gibco货号10370-021)
10％胎牛血清(FBS，Hyclone货号SH30071.03)
1×青霉素-链霉素-谷氨酰胺(PSG，Gibco货号10378-016)
1mM丙酮酸钠(Gibco货号#11360-070)
减少血清的MEM：
极限必需培养基(MEM，Gibco货号10370-021)
2％胎牛血清(FBS，Hyclone货号SH30071.03)
1×青霉素-链霉素-谷氨酰胺(PSG，Gibco货号10378-016)
1mM丙酮酸钠(Gibco货号#11360-070)
将HeLa细胞在潮湿的5％CO2温箱中，于37℃保持在完全MEM中。用胰蛋白酶收集细胞并每周两次在铺满时于T175瓶中分成终密度2-4×106个细胞每25ml。测定的前一天，用胰蛋白酶处理细胞然后以6×106个细胞每25ml的密度接种于新T175瓶中以便确保在测定前所述细胞处于对数期。
将WISH细胞在潮湿的5％CO2温箱中，于37℃保持在完全MEM中。用胰蛋白酶收集细胞并每周两次在铺满时于T175瓶中分成终密度5-6×106个细胞每25ml。测定的前一天，用胰蛋白酶处理细胞然后以10×106个细胞每25ml的密度接种于新T175瓶中以便确保在测定前所述细胞处于对数期。
HeLa-EMCV抗病毒试验的方法：
在测定的第一日，用胰蛋白酶收集对数期HeLa细胞，在减少了血清的MEM中重悬浮然后通过离心浓缩。细胞沉淀物(对应于5个T175瓶的细胞)在10ml减少了血清的MEM中重悬浮，经40微米尼龙细胞滤器(Nylon cellstrainer)过滤然后用Coulter计数器计数。通过用血细胞仪(hemocytometer)进行台盼蓝染色排除法测定细胞生存力。细胞在减少了血清的MEM中重悬浮至终密度为1×105细胞/ml。将100μl稀释的细胞加入96孔测定板的各孔中(1×104细胞/孔)，然后将测定板在潮湿的5％CO2温箱中于37℃保温24小时。
采用剂量反应分析测定“参照”干扰素α和本发明的干扰素-α多肽(也称为“受试样品”)的效力。每板中通常存在一种受试样品和一种参照IFN-α，各具有IFN-α处理的/EMCV攻击的细胞的三条重复型曲线和单独用IFN-α处理的细胞的两条重复型曲线。测定后者作为IFN-α对HeLa细胞的潜在抗增殖效应的对照。参照IFN-α的剂量反应曲线通常由60ng/ml-0.0008ng/ml的8个五倍稀释度组成。对于IFN-α实验样品，所述五倍稀释度通常为5ng/ml-0.00006ng/ml。各自包含用病毒处理且无IFN-α处理的细胞以及仅包含细胞的八个孔也作为对照。
采用减少了血清的MEM制备IFN-α稀释液。将100μl稀释的IFN-α制品转移至测定板中。然后将测定板在潮湿的5％CO2温箱中于37℃保温12小时。
在第三日，用EMC病毒攻击细胞。从测定板的各孔中吸出培养液。在MEM+2％FBS中以1∶133稀释EMCV原液。将100μl稀释的病毒(相当于3×105个病毒颗粒)加入各孔中。然后将细胞在潮湿的5％CO2温箱中于37℃与病毒一同保温24小时。
在第四日，通过WST-1对各孔中存活细胞的数量进行定量。从测定板的各孔中吸出培养液。在减少了血清的MEM中以1∶20稀释WST-1试剂，将100μl稀释的WST-1试剂加入各孔中然后将细胞在潮湿的5％CO2温箱中于37℃保温60分钟。通过在读板器上检测450nm的OD来对各孔中存活细胞的数量进行定量。
WISH-EMCV抗病毒试验的方法：
在测定的第一日，用胰蛋白酶收集对数期WISH细胞，在减少了血清的MEM中重悬浮然后通过离心浓缩。细胞沉淀物(对应于5个T175瓶的细胞)在10ml减少了血清的MEM中重悬浮，经40微米尼龙细胞滤器(Nyloncell strainer)过滤然后用Coulter计数器计数。通过用血细胞仪(hemocytometer)进行台盼蓝染色排除法测定细胞生存力。细胞在减少了血清的MEM中重悬浮至终密度为3×105细胞/ml。将100μl稀释的细胞加入96孔测定板的各孔中(3×104细胞/孔)，然后将测定板在潮湿的5％CO2温箱中于37℃保温4小时。
采用剂量反应分析测定“参照”干扰素α和本发明的干扰素-α多肽(也称为“受试样品”)的效力。每板中通常存在一种受试样品和一种参照IFN-α，各具有IFN-α处理的/EMCV攻击的细胞的三条重复型曲线和单独用IFN-α处理的细胞的两条重复型曲线。测定后者作为IFN-α对HeLa细胞的潜在抗增殖效应的对照。参照IFN-α的剂量反应曲线通常由100ng/ml-0.0001ng/ml的8个十倍稀释度组成。对于IFN-α实验样品，所述五倍稀释度通常为5ng/ml-0.00006ng/ml。各自包含用病毒处理且无IFN-α处理的细胞以及仅包含细胞的八个孔也作为对照。
采用减少了血清的MEM制备IFN-α稀释液。将100μl稀释的IFN-α制品转移至测定板中。然后将测定板在潮湿的5％CO2温箱中于37℃保温16小时。
在第二日，用EMC病毒攻击细胞。从测定板的各孔中吸出培养液。在MEM+2％FBS中以1∶267稀释EMCV原液。将100μl稀释的病毒(相当于MOI约为5)加入各孔中。然后将细胞在潮湿的5％CO2温箱中于37℃与病毒一同保温24小时。
在第三日，通过WST-1对各孔中存活细胞的数量进行定量。从测定板的各孔中吸出培养液。在减少了血清的MEM中以1∶20稀释WST-1试剂，将100μl稀释的WST-1试剂加入各孔中然后将细胞在潮湿的5％CO2温箱中于37℃保温60分钟。通过在读板器上检测450nm的OD来对各孔中存活细胞的数量进行定量。
B.TH1分化测定法
以下提供了本发明的干扰素-α多肽和偶联物的TH1分化活性的示例性测定法。
测定步骤：
在测定起始日(测定日的前一天)，在斯坦福血库(Stanford Blood Bank)收集从500ml血中制备的包含粒细胞和红细胞的人血沉棕黄层(Humanbuffy coat)(25-30ml)，于室温保存过夜。将各血沉棕黄层小心地转移至T75瓶中，然后用PBS稀释至100ml。对于各血沉棕黄层，将13mlHistopaque/Ficoll(Sigma H8889)移液至四个50ml的离心管中，然后在Histopaque/Ficoll顶部小心地覆盖25ml稀释的血液样品而不破坏其界面。然后将所述管离心(20℃，2500rpm)20分钟。采用3ml塑料移液管，将含PBMC的单核细胞层转移至两个50ml锥形管(将来自2个Histopaque/Ficoll/血沉棕黄层管的细胞置于一个管中)。然后用PBS将PBMC稀释至50ml/管，然后离心(20℃，1000rpm)10分钟以便去除血小板。去除PBS后，混合PBMC和剩余的RBC以防止聚集。加入10ml RBC裂解缓冲液(氯化铵缓冲液)，然后将两个管的细胞合并至一个管。将各管(现在包含来自从一个供体分离的总PBMC和RBC)在室温保温10分钟。通过用细胞过滤器(70um，Falcon货号2350)过滤细胞去除可能的血细胞凝块。加入PBS至总体积为50ml，然后离心(20℃，1000rpm)10分钟。最后采用血细胞计数器计数细胞数目。
然后，对各个PBMC制品的一部分进行预染并通过FACS分析以选择初始TH0细胞百分比大于15％的PBMC制品。用20μl FITC偶联的抗人CD45RA(Pharmigen，货号555488)，20μl Cy-铬偶联的抗人CD4(Pharmigen，货号555348)，5μl PE-偶联的抗人CD8(Pharmigen，货号555367)，5μl PE-偶联的抗人CD14(Pharmigen，货号555398)，和5μl PE-偶联的抗人CD20(Pharmigen，货号555623)染色300μl PBMC，然后在冰上保温45分钟。用PBS洗涤细胞，在1ml PBS中重悬浮，然后用40μm细胞过滤器(Falcon，货号2340)过滤。通过FACS定量初始TH0细胞(CD4和CD45RA阳性而CD8，CD14，CD20阴性)的百分数，然后选择含有超过15％初始TH0细胞的PBMC进行测定。
选择的PBMC制品用500μl FITC偶联的抗人CD45RA，500μl Cy-铬偶联的抗人CD4，200μl PE-偶联的抗人CD8，50μl PE-偶联的抗人CD14，和50μl PE-偶联的抗人CD20进行染色，然后在冰上保温60分钟。用PBS洗涤细胞，加入PI，用10ml PBS稀释细胞，然后用40μm细胞过滤器过滤。通过FACS分选该细胞，将1×104初始TH0细胞(CD4和CD45RA阳性而CD8、CD14、CD20阴性)通过MOFLO转移至96孔圆底板的各孔中，所述孔中包含160μl DMEM加青霉素-链霉素加2mM谷氨酰胺和10％胎牛血清(Hyclone货号SH30071.03)。
在每孔中加入1.7μl Dynabeads CD3/CD28 T细胞膨胀剂(Dynal，货号111.32)。在受试前校准Dynabeads的刺激效应以避免批与批之间的差异。然后，在测定板中加入20μl/孔的蛋白质样品。通常，IL-4和IL-12标准物(获自R&D Systems)的浓度范围是0.04pg/ml-10ng/ml，而IFN-α受试样品和IFN-α参照样品的浓度范围是0.76pg/ml-200ng/ml。
在潮湿的5％CO2温箱中于37℃保温所述细胞6日。从各孔收集上清，通过采用标准ELISA(R&D Systems，Cat.#DIF50)定量IFN-γ的含量来测定TH1分化程度。
分析：
反应＝IFN-γ浓度，pg/ml。
将以下公式用于曲线拟合：
Y = Bottom + ( Top - Bottom ) 1 + 10 ( LogEC 50 - X ) · HillSlope
变量Bottom是位于底部平台的Y值；Top是位于顶部平台的Y值，LogEC50是当反应在Bottom和Top中间时的X值。将Levenberg-Marquardt法用作优化算法。
C.Daudi抗增殖测定法
以下提供了本发明的干扰素-α多肽和偶联物抗增殖活性的示例性测定法。
材料：
Daudi细胞：人伯杰特淋巴瘤细胞(ATCC号：#CCL-213)。1967年，Daudi细胞系衍生自患有伯杰特淋巴瘤的16岁黑人男性。该细胞系为Epstein-Barr病毒阳性。
完全RPMI：
RPMI 1640(RPMI，Gibco货号11875-143)
10％胎牛血清(FBS，Hyclone货号SH30071.03)
1×青霉素-链霉素-谷氨酰胺(PSG，Gibco货号10378-016)
于37℃在潮湿的5％CO2温箱中，将混悬液中生长的Daudi伯杰特淋巴瘤细胞保持在T175组织培养瓶中(包含50ml完全RPMI)。当铺满时，将细胞以1∶10分离。
测定步骤：
将Daudi细胞旋转沉降并用1×PBS洗涤。将细胞数量调整为105细胞/ml。在96孔圆底测定板的每个孔中加入80μl培养基，然后将100μl细胞转移至各孔(104细胞/孔)。
利用培养基在稀释板中制备11个稀释度的IFN-α参照物和IFN-α受试样品(200ng/ml-0.2pg/ml(4倍稀释度)。然后将20μl稀释的IFN-α制品转移至测定板。
在潮湿的5％CO2温箱中于37℃保温细胞。48小时后，在每孔中加入1μCi甲基-3H胸苷(Amersham Pharmacia，货号TRK758)，然后在潮湿的5％CO2温箱中于37℃保温24小时。次日收集细胞，然后测定胸苷的掺入。
或者，根据经干扰素处理后，培养物孔中存在的ATP量测定存活的有代谢活性的Daudi细胞的数目，以进行Daudi抗增殖测定法。在此方法中，将8000个Daudi细胞铺于96孔圆底测定板的每个孔中(体积为50μl)。然后在5％CO2温箱中于37℃保温细胞2小时，再加入干扰素稀释液。一般从5-10ng/ml开始将干扰素稀释6倍(9-点)。加入干扰素之后，在潮湿的5％CO2温箱中于37℃保温细胞72小时。然后通过加入100μl CellTiter-GloTM(Promega，Cat#G7572)测定每孔中存活细胞的数目。将细胞与CellTiter-GloTM试剂混合2分钟，室温下于暗处保温30-60分钟。使用AnalystHT仪器测定每孔中的发光信号的量。
分析：
采用以下公式计算IFN-α参考物和样品的EC50：
Y = Bottom + ( Top - Bottom ) 1 + 10 ( LogEC 50 - X ) · HillSlope
其中Bottom是位于底部平台的Y值；Top是位于顶部平台的Y值，LogEC50是当反应在Bottom和Top中间的X值。将Levenberg-Marquardt法用作优化算法。
实施例1：测定干扰素-α的表面可及残基
人干扰素-α2a残基的表面暴露：
根据Klaus等，J.Mol.Biol.，274：661-675(1997)报道的人干扰素-α2a的24 NMR结构，计算侧链的分数ASA。以下使用的序列编号基于人干扰素-α2a蛋白质的成熟序列(在本文中被鉴定为SEQ ID NO：47)。应当注意该结构包含两个分别包含Cys1-Cys98和Cys29-Cys138的二硫桥。通过计算ASA和分数ASA并取24个结构的平均值，对于(focusing on)侧链的ASA，以下残基被测定为具有大于25％分数ASA：D2，L3，P4，Q5，T6，H7，S8，L9，G10，R12，R13，M16，A19，Q20，R22，K23，I24，S25，L26，F27，S28，L30，K31，R33，H34，D35，G37，Q40，E41，E42，G44，N45，Q46，Q48，K49，A50，E51，E58，Q61，Q62，N65，S68，T69，K70，D71，S73，A74，D77，E78，T79，L80，D82，K83，T86，Y89，Q90，N93，D94，E96，A97，V99，I100，Q101，G102，V103，G104，T106，E107，T108，P109，L110，M111，K112，E113，D114，L117，R120，K121，Q124，R125，T127，L128，K131，E132，K133，K134，Y135，S136，P137，C138，A145，M148，R149，S152，L153，N156，Q158，E159，S160，L161，R162，S163，K164和E165，所述位置相对于在本文中被鉴定为SEQ ID NO：47的干扰素-α2a序列编号。
以下残基被测定为其侧链平均具有大于50％分数ASA：D2，L3，P4，Q5，T6，H7，S8，L9，R12，R13，M16，A19，S25，F27，S28，K31，R33，H34，D35，G37，E41，G44，N45，Q46，Q48，K49，N65，K70，A74，D77，E78，T79，D82，K83，T86，Y89，Q90，N93，D94，I100，Q101，G102，G104，T106，E107，T108，P109，L110，E113，D114，L117，R120，K121，Q124，R125，L128，K131，E132，K134，P137，R149，E159，L161，R162，S163，K164和E165，所述位置相对于在本文中被鉴定为SEQ ID NO：47的干扰素-α2a序列编号。
与SEQ ID NO：1相应的残基的表面暴露
由于在很多干扰素α序列(包括所有已知人干扰素α序列(除IFN-α2亚型外)和本发明的具体多肽)中，一个氨基酸在人干扰素-α2亚型(例如，干扰素-α2b(SEQ ID NO：46)和干扰素-α2a(SEQ ID NO：47))第44位后的插入，所述表面暴露的残基的位置编号相对于hIFNα 2b(SEQ ID NO：46)所示序列的编号将在例如比对图2中所示序列中的第44位以后产生一个残基的位移。
根据上述分析，以下位置(相对于SEQ ID NO：1编号)被认为包含这样的氨基酸残基，其具有大于25％分数ASA：位置2，3，4，5，6，7，8，9，10，12，13，16，19，20，22，23，24，25，26，27，28，30，31，33，34，35，37，40，41，42，44，46，47，49，50，51，52，59，62，63，66，69，70，71，72，74，75，78，79，80，81，83，84，87，90，91，94，95，97，98，100，101，102，103，104，105，107，108，109，110，111，112，113，114，115，118，121，122，125，126，128，129，132，133，134，135，136，137，138，139，146，149，150，153，154，157，159，160，161，162，163，164，165，和166。
同样地，以下位置(同样相对于SEQ ID NO：1编号)被认为包含这样的氨基酸残基，所述残基的侧链具有平均大于50％分数ASA：2，3，4，5，6，7，8，9，12，13，16，19，25，27，28，31，33，34，35，37，41，44，46，47，49，50，66，71，75，78，79，80，83，84，87，90，91，94，95，101，102，103，105，107，108，109，110，111，114，115，118，121，122，125，126，129，132，133，135，138，150，160，162，163，164，165和166。
实施例2干扰素-α多肽的抗病毒活性
慢性HCV感染患者的起始病毒载量为104-107拷贝的HCV RNA/ml。通过用IFN-α治疗，病毒载量特征性地历经两个不同的对数线性衰减期，这反映了两种不同的机制(图1B)。病毒载量在大约第一个两日中出现首次下降，其被认为是由于感染的肝细胞对干扰素-α治疗作出反应而导致的病毒生成速率降低。
HCV造成的主要技术挑战是该病毒不能在体外生长，仅仅最近能在驯顺的动物模型中进行培养。然而，一些能在体外复制的病毒被认为可用作HCV病毒复制的替代品。认为可预测体内HCV抗病毒活性的体外替代测定法包括上文“材料和方法”一节中所述的测定法，其通过在人细胞系HuH7(来源于肝癌)、HeLa(来源于宫颈癌)和WISH(来源于羊膜组织)中使用脑心肌炎病毒(EMCV)来检测受试分子保护细胞使其免受病毒感染的致细胞病变效应(CPE)的能力。
下表7提供了多种IFN-α多肽在按照上文“材料和方法”一节所述进行的代表性CPE测定法中的相对抗病毒活性。通过TwoWay ANOVA(因素：样品，实验)(α＝0.05)，接着通过Bonferroni’s post-hoc test进行平均值比较(α＝0.05)或进行Fisher’s post-hoc test，从而测定活性的显著差异。符号(+/-)表示在统计学上与参照干扰素不可区分的抗病毒活性；ND表示未测定。
表7
样品名称 SEQ ID NO HuH7/EMCV相对于huIFN-α2b的抗病毒活性 HeLa/EMCV相对于huIFN-α2b的抗病毒活性
 B9X14EC4  SEQ ID NO：1     ＞8x     ＞8x
 14EPI15  SEQ ID NO：10     ＞8x     ＞8x
 14EPI16  SEQ ID NO：11     ＞8x     ＞8x
 14EPI17  SEQ ID NO：12     ＞8x     ＞8x
样品名称 SEQ ID NO HuH7/EMCV相对于huIFN-α2b的抗病毒活性 HeLa/EMCV相对于huIFN-α2b的抗病毒活性
  14EPI18   SEQ ID NO：13     ＞8x     ＞8x
  14EPI19   SEQ ID NO：14     ＞8x     ＞8x
  14EPI20   SEQ ID NO：15     ＞8x     ＞8x
  14EPI21   SEQ ID NO：16     ＞8x     ＞8x
  14EPI25   SEQ ID NO：20     ＞8x     ＞8x
  14EPI32   SEQ ID NO：27     ＞8x     ＞8x
  14EPI33   SEQ ID NO：28     ＞8x     ＞8x
  14EPI34   SEQ ID NO：29     ＞8x     ＞8x
  25EPI19   SEQ ID NO：38     ＞8x     ＞8x
  14EPI22   SEQ ID NO：17     4x至8x     ＞8x
  14EPI26   SEQ ID NO：21     4x至8x     ＞8x
  14EPI29   SEQ ID NO：24     4x至8x     ＞8x
  14EPI31   SEQ ID NO：26     4x至8x     ＞8x
  14EPI23   SEQ ID NO：18     4x至8x     4x至8x
  14EPI24   SEQ ID NO：19     4x至8x     4x至8x
  25EPI08   SEQ ID NO：36     4x至8x     4x至8x
  25EPI26   SEQ ID NO：41     4x至8x     4x至8x
  14EPI42   SEQ ID NO：35     4x至8x     2x至4x
  25EPI18   SEQ ID NO：37     4x至8x     2x至4x
  25EPI25   SEQ ID NO：40     4x至8x     2x至4x
  14EPI30   SEQ ID NO：25     2x至4x     4x至8x
  25EPI28   SEQ ID NO：43     2x至4x     2x至4x
  14EPI27   SEQ ID NO：22     2x至4x     2x至4x
  14EPI35   SEQ ID NO：30     2x至4x     ND
  14EPI36   SEQ ID NO：31     2x至4x     ND
  14EPI37   SEQ ID NO：32     2x至4x     ND
  14EPI38   SEQ ID NO：33     2x至4x     ND
  25EPI20   SEQ ID NO：39     2x至4x     0.5x至2x
  14EPI28   SEQ ID NO：23     0.5x至2x     0.5x至2x
  25EPI27   SEQ ID NO：42     0.1x至0.5x     0.1x至0.5x
  IFN-αCon1   SEQ ID NO：58     2x至4x     4x至8x
  IFN-α2a   SEQ ID NO：47     0.5x至2x     0.5x至2x
  IFN-α2b   SEQ ID NO：46     1(参照)     1(参照)
实施例3干扰素-α多肽的TH1活性
设计TH1测定法以监测通过在培养物上清液中检测到的IFN-γ的量测定的IFN-α对初始T细胞分化成TH1细胞的增强作用。表8提供了按上文“材料和方法”章节中所述测定的多种IFN-α多肽的相对TH1活性。
表8
样品     SEQ ID NO 超出IFN-α2a的倍数
14Epi18     SEQ ID NO：13     ＞30x
25Epi19     SEQ ID NO：38     ＞30x
IFN-αCon1     SEQ ID NO：58     10x至15x
IFN-α2a     SEQ ID NO：47     1(参照)
实施例4干扰素-α多肽的抗增殖活性
IFN-α可抑制多种细胞类型的增殖，虽然该抗增殖作用通常在高于抗病毒反应所需的剂量下发生。Daudi细胞是人来源的EVB所转化的B细胞系，其对IFN-α敏感。该IFN-α反应性细胞系可用作本发明的IFN-α的抗增殖作用的探针。此外，高剂量的IFN-α对巨核细胞和嗜中性细胞的抗增殖活性被认为可分别促使血小板减少(thrombocytopenia)、和中性粒细胞减少(neutropenia)。Daudi抗增殖测定可用作对这些其它淋巴样细胞类型的抗增殖作用的替代测定法。
下表9提供了按照上文“材料和方法”一节所述测定的多种IFN-α多肽的相对抗增殖活性，其被表示为相对于huIFN-α2a的抗增殖活性倍数(EC50huIFN-α2a/EC50样品)。在所用检测条件下，可检测到至少约为参照干扰素的0.01倍的抗增殖活性。
表9
样品名称 SEQ ID NO：  相对于IFNα-2a活性的倍数
    B9X14EC4     SEQ ID NO：1  0.8x至0.5x
    14Epi15     SEQ ID NO：10  0.25x至0.1x
    14Epi17     SEQ ID NO：12  0.25x至0.1x
    14Epi18     SEQ ID NO：13   0.8x至0.5x
    14Epi19     SEQ ID NO：14  0.5x至0.25x
    14Epi20     SEQ ID NO：15  0.5x至0.25x
    14Epi21     SEQ ID NO：16  0.25x至0.1x
    14Epi22     SEQ ID NO：17  0.25x至0.1x
    14Epi23     SEQ ID NO：18  0.25x至0.1x
    14Epi24     SEQ ID NO：19  0.5x至0.25x
    14Epi25     SEQ ID NO：20  0.5x至0.25x
    14Epi26     SEQ ID NO：21  0.5x至0.25x
样品名称 SEQ ID NO： 相对于IFNα-2a活性的倍数
    14Epi27     SEQ ID NO：22   0.5x至0.25x
    14Epi28     SEQ ID NO：23   0.8x至0.5x
    14Epi29     SEQ ID NO：24   0.25x至0.1x
    14Epi30     SEQ ID NO：25   0.5x至0.25x
    14Epi31     SEQ ID NO：26   0.5x至0.25x
    14Epi32     SEQ ID NO：27   1.2x至0.8x
    14Epi33     SEQ ID NO：28   0.8x至0.5x
    14Epi34     SEQ ID NO：29   0.8x至0.5x
    14Epi35     SEQ ID NO：30   0.8x至0.5x
    14Epi36     SEQ ID NO：31   0.5x至0.25x
    14Epi37     SEQ ID NO：32   0.8x至0.5x
    14Epi38     SEQ ID NO：33   0.8x至0.5x
    14Epi42     SEQ ID NO：35   0.5x至0.25x
    25Epi08     SEQ ID NO：36   0.5x至0.25x
    25Epi18     SEQ ID NO：37   0.25x至0.1x
    25Epi19     SEQ ID NO：38   0.8x至0.5x
    25Epi20     SEQ ID NO：39   0.25x至0.1x
    25Epi25     SEQ ID NO：40   0.25x至0.1x
    25Epi26     SEQ ID NO：41   0.25x至0.1x
    25Epi27     SEQ ID NO：42   0.5x至0.25x
    25Epi28     SEQ ID NO：43   0.5x至0.25x
    25Epi29     SEQ ID NO：44   0.8x至0.5x
    IFN-αCon1     SEQ ID NO：58   1.2x至0.8x
    IFN-α2a     SEQ ID NO：47   1x(参照)
实施例5：干扰素-α多肽的PEG化
下文提供了制备本发明的偶联物的示例性步骤。
Cys-PEG化
包含游离半胱氨酸的本发明多肽可以按下述被半胱氨酸-PEG化。首先于4℃，在50mM MES，100mM NaCl，pH6.0中，用等摩尔浓度的TCEP(三羧乙基膦)对该多肽进行部分还原30分钟。然后于4℃，在相同条件下使被还原的多肽与过量四倍摩尔量的mPEG-MAL试剂(具有PEG部分诸如20kDa或30kDa线性mPEG，或40kDa支化mPEG2)反应1小时。将PEG化反应混合物加样至用50mM MES，pH6.0，100mM NaCl平衡过的SP-Sepharose HP柱。在10 CV(柱体积)洗涤步骤后，用0-600mM NaCl的梯度来对PEG化和未PEG化的级分进行分级。收集级分然后通过SDS-PAGE分析等分试样。集中包含单PEG化种类(monoPEGylated species)的级分，对其配制以便进行上述干扰素-α活性测定。
N末端PEG化
采用mPEG-丁醛(具有PEG部分诸如20kDa或30kDa线性mPEG，或40kDa支化mPEG2)的N末端PEG化可在以下条件下进行：4℃，用过量5倍摩尔量的PEG试剂：多肽，在50mM MES，pH5.5，100mM NaCl和20mM氰基硼氢化钠，或在50mM醋酸钠，pH5.5，100mM NaCl和20mM氰基硼氢化钠中实施反应4-8小时。采用50mM MES，pH5.5中的100-600mM NaCl梯度，通过利用在50mM MES pH5.5，100mM NaCl中平衡过的SP-Sepharose HP进行层析来分离偶联物。集中包含单PEG化种类的级分，进行配制以便实施上述干扰素-α活性测定，并通过例如使用分析性HPLC、氨基酸分析和/或MALDI-TOF质谱分析法进一步鉴定所述级分。
赖氨酸PEG化
通常采用实质上如Foser，(2003)Protein Expression & Purification 30：78-87所述的方法可进行赖氨酸-PEG化。简言之，于4℃，将多肽与40kDamPEG-NHS试剂以mPEG-NHS∶多肽的摩尔比约为3∶1至5∶1在50mM硼酸盐缓冲液，pH9.0中反应约1小时至过夜。通过阳离子交换层析分离偶联物。集中包含单PEG化种类的级分，进行配制以便进行上述干扰素-α活性测定。根据上述方法制备的单PEG化IFN-α偶联物在HeLa-EMCV测定法中表现出抗病毒活性，但所述活性低于亲代未经PEG化的多肽的活性。
在一些情况下，使用Polysulfoethyl A柱(2.1mmID×200mmL，5m，1000A°，得自PolyLC)进行阳离子交换HPLC，以进一步分析按上述方法获得的单PEG化收集物，从而鉴定出PEG-异构体分布图。移动相是缓冲液A：5mMKH2PO4，40％1-丙醇，1％二甘醇，pH3.0和缓冲液B：与含200mM NaCl的缓冲液A相同。于20℃，在80分钟内使用以0.1ml/分钟的速度流动的50％-75％移动相B梯度分离PEG位置异构体，在214nm处进行检测。
图8显示了经由阳离子交换HPLC分离单PEG化收集物，所述收集物是根据上述方法由干扰素-α多肽B9x14EC4与40kDa mPEG2-NHS反应获得的。收集峰并在SDS-PAGE上进行分析(图9)。图9的泳道2和9显示出上样至HPLC柱之前的样品主要包含单PEG化蛋白质。峰1-4(图9的泳道3-6)对应于单PEG化收集物中少部分的双PEG化IFN。弱峰5(图9的泳道7)含有大致相同比例的双PEG化、单PEG化和较小分子量的种类。峰6-11(图9的泳道10-15)对应于单PEG化IFN多肽的位置异构体。
按下述使多肽14epi18(SEQ ID NO：13)赖氨酸-PEG化。将Q-Sepharose层析步骤的洗脱液(根据上文“材料和方法”一节所述获得)浓缩至c＜2mg/ml。为了进行PEG化，将缓冲液换成50mM硼酸钠，pH9.0。基本上如Foser等(2003；Protein Expression & Purification 30：78-87)所述，以PEG试剂与蛋白质的摩尔比为4∶1或5∶1，使多肽与40kDa mPEG2-NHS反应。于4℃将PEG化反应进行1.5小时。通过阳离子交换层析从反应混合物中纯化单PEG化14epi18。使用盐浓度逐步增加至1M的NaCl，分三步进行洗脱以分离寡PEG化、单PEG化和未-PEG化的种类。将单PEG化14epi18峰配制成浓度为0.33mg/ml以供进一步分析。所得单PEG化14epi18组合物产生一群主要在Lys122和Lys135单PEG化的位置异构体。
按下述使多肽25epi19(SEQ ID NO：38)赖氨酸-PEG化。将Q-Sepharose层析步骤的洗脱液(根据上文“材料和方法”一节所述获得)浓缩至c＜2mg/ml。为了进行PEG化，将缓冲液换成50mM硼酸钠，pH9.0。基本上如Foser等(2003；Protein Expression & Purification 30：78-87)所述，以PEG试剂与蛋白质的摩尔比为4∶1，使多肽与40kDa mPEG2-NHS反应。于4℃将PEG化反应过夜进行。通过阳离子交换层析从反应混合物中纯化单PEG化25epi19。使用盐浓度逐步增加至750mM的NaCl，分三步进行洗脱以分离寡PEG化、单PEG化和未-PEG化的种类。将单PEG化25epi19峰在洗脱缓冲液中浓缩至＜2mg/ml，并进行配制以供进一步分析。所得单PEG化25epi19组合物产生一群主要在Lys31，Lys122和Lys135单PEG化的位置异构体。
在HeLa-EMCV抗病毒测定法中，按上述制备的单PEG化14epi18和单PEG化25epi19都表现出比单PEG化IFN-α 2a高10倍以上的抗病毒活性。
实施例6：差示扫描量热术
进行差示扫描量热术(DSC)实验以估计本发明的一些多肽的稳定性。将浓度为100至325μg/ml的蛋白质样品中的缓冲液换成磷酸缓冲盐水(PBS)，使用MicroCal VP-DSC(MicroCal，Northampton，MA)进行DSC。由热容(Cp)对温度的作图估计解链温度(Tm)。估计出的Tm为B9X14EC4(SEQ ID NO：1)58.4℃；14epi16(SEQ ID NO：11)64.2℃和14epi18(SEQ ID NO：13)59.5℃。用第48位隐蔽的苯丙氨酸残基(SEQ ID NO：1)取代亮氨酸(SEQ ID NO：11)或丙氨酸(SEQ ID NO：13)似乎对多肽的稳定性没有不利的影响。
实施例7：体内测定
检测本发明多肽或偶联物的药代动力学(PK)和药物动力学(PD)分布图
按文献中记载的多种方法检测生物学或血清半寿期。例如，可采用ELISA法测定生物学半寿期来检测在例如皮下或肌内施用后干扰素-α的血清水平。使用ELISA法检测皮下施用的干扰素-α的药代动力学在例如Rostaing等，(1998)，J.Am.Soc.Nephrol.9(12)：2344-48中描述。Merimsky等，(1991)，Cancer Chemother.Pharmacol.27(5)：406-8描述了测定肌内施用的干扰素-α的血清水平。
例如，可根据下述方法，在猕猴(Macaca fascicularis)中研究本发明偶联物的药代动力学(PK)和药物动力学(PD)分布图。研究中使用了平均体重为5-6kg的3至4岁雌性动物。在到达后和开始治疗前这段时间，动物至少需用6周时间来适应新环境，最少需要3周来适应研究地的居住条件。动物被单独圈养在不锈钢网笼中(至少540×810×760mm)，食用膨胀的完全商业化的灵长类动物饲料(100g/动物/天)，经分析，所述饲料不含化学药品和细菌污染物。另外，动物每天都摄取水果(苹果或香蕉)。在所有需要麻醉的步骤之前，给动物禁食。
在开始研究之前的3天和开始研究的当天施用化合物之前，从所有动物体内采集血液样品。在研究过程中，从未经麻醉、用手固定的动物的股血管或头/隐血管抽取血液样品(1ml全血)。在采血过程中，维持正常的饲喂方案。将血样采集至不加抗凝剂的管内，接着，于4℃，以3000rpm(约1760g)离心10分钟。然后将血清样品分成两个等分试样(各约为200μl)，储存于-20℃。
开始研究之前，在20mM醋酸钠(pH6.0)和140mM氯化钠中配制本发明的偶联物。研究开始时，先用酒精水溶液局部消毒，再使用皮下导入的无菌注射器和针头，以30mcg偶联物/kg动物体重(4只动物)或300mcg/kg(4只动物)的量给每只动物施用一次偶联物。在施用偶联物之后的下述时间点采集血样：4小时，8小时，12小时，24小时，48小时，72小时，144小时，240小时，336小时，456小时，552小时，600小时，624小时，648小时，672小时，696小时，720小时和744小时。
每天观察动物以检测任何临床病征或对治疗的反应。每天凭肉眼观察评价注射位点以评价局部耐受性。开始治疗前和研究结束时进行详细的临床检查。
完成研究之后，使用ELISA测定法测定分离的血清样品中的偶联物浓度。然后，基于特定时间点化合物的血清浓度测定偶联物在猕猴体内的半寿期。
分别使用商购的RIA(Eiken Chemical Co.，Tokyo)和商购的ELISA(IBLImmuno Biological Laboratories，Hamburg.)，测定每个血清样品中的2’，5’-寡腺苷酸合成酶和新蝶呤水平，从而评价猕猴对本发明偶联物治疗的药物动力学反应。根据在血清样品中测定的这两个干扰素活性生物标记物的浓度，测定曲线下的面积(AUC)，以定量取这两个剂量中的每个剂量的每种化合物的体内活性。
测定体外免疫原性
本发明的多肽或偶联物相对于参照分子的降低的免疫原性可通过使用ELISA法测定，所述ELISA法检测分子相对于参照分子或制剂(一般是已知的干扰素-α蛋白质)的免疫反应性。该ELISA法基于来自用参照蛋白质治疗的患者的抗体。当本发明的多肽或偶联物在该测定中的反应在统计学上显著低于参照分子或制剂的所述反应时，前者免疫原性被认为是降低的。
尽管为了阐明和理解的目的，已较详细描述了上述发明，但本领域技术人员通过阅读此公开内容可以清楚地知道：对形式和细节的多种改变并不背离本发明真正的范围。应当理解的是本文所述的实施例和实施方案仅作为例举说明的目的，且本领域技术人员应能理解其中的多种修饰和改变，而且其被包含在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围内。例如，可以以多种组合方式使用上文所述的所有技术、方法、组合物、装置和系统。为了所有的目的，本申请中提及的所有出版物，专利，专利申请或其它文件都全文列入本文作为参考，就象每个单独的出版物，专利，专利申请或其它文件为了所有目的被单独地提到需列入本文作为参考一样。
                              序  列  表
<110>马克西根公司(Maxygen，Inc.)
霍夫曼-拉罗奇有限公司(F.Hoffmann-LaRoche AG)
<120>干扰素-α多肽和偶联物
<130>0280.310WO
<150>US60/572,504
<151>2004-05-19
<160>90
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>166
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体B9x14EC4
<400>1
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met
 1               5                  10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Phe
        35                  40                  45
Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
            100                 105                 110
Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>2
<211>166
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi07
<400>2
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met
 1               5                  10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Phe
        35                  40                  45
Gln Lys Val Gln Ala Ile Pro Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
            100                 105                 110
Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>3
<211>166
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi08
<400>3
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met
 1               5                  10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Phe
        35                  40                  45
Gln Lys Ala Pro Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Met Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
            100                 105                 110
Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>4
<211>166
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi09
<400>4
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met
 1               5                  10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Phe
            35                  40              45
Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Met Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
            100                 105                 110
Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>5
<211>166
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi10
<400>5
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met
 1               5                  10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Phe
        35                  40                  45
Gln Lys Ala Glu Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Met Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
            100                 105                 110
Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>6
<211>166
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi11
<400>6
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met
 1               5                  10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Phe
        35                  40                  45
Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Ala Phe His Glu Met Met Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
            100                 105                 110
Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>7
<211>166
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi12d
<400>7
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met
 1               5                  10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
             20                 25                  30
Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Leu
        35                  40                  45
Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
    65                  70                  75              80
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
            100                 105                 110
Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Asp
145                 150                 155                 160
Ser Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>8
<211>166
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi13
<400>8
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met
 1               5                  10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe
        35                  40                  45
Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
            100                 105                 110
Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>9
<211>166
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi14
<400>9
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met
 1               5                  10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Phe
        35                  40                  45
Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Phe Tyr Glu Met Ile Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
            100                 105                 110
Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>10
<211>166
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi15
<400>10
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met
 1               5                  10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Leu
        35                  40                  45
Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
            100                 105                 110
Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>11
<211>166
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi16
<400>11
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met
 1               5                  10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Leu
        35                  40                  45
Gln Lys Val Gln Ala Ile Ala Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
            100                 105                 110
Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>12
<211>166
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi17
<400>12
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met
 1               5                  10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Leu
        35                  40                  45
Gln Lys Val Gln Ala Ile Ser Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
            100                 105                 110
Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>13
<211>166
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi18
<400>13
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met
 1               5                  10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
            100                 105                 110
Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>14
<211>166
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi19
<400>14
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met
 1               5                  10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Val Gln Ala Ile Ala Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
            100                 105                 110
Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>15
<211>166
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi20
<400>15
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met
 1               5                  10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Val Gln Ala Ile Ser Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
            100                 105                 110
Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>16
<211>166
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi21
<400>16
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met
 1               5                  10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Phe
        35                  40                  45
Gln Lys Val Gln Ala Ile Ala Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
            100                 105                 110
Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>17
<211>166
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi22
<400>17
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met
 1               5                  10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Phe
        35                  40                  45
Gln Lys Val Gln Ala Ile Ser Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
            100                 105                 110
Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>18
<211>166
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi23
<400>18
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met
 1               5                  10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Val Gln Ala Ile Ser Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Ala Met
            100                 105                 110
Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>19
<211>166
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi24
<400>19
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met
 1               5                  10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Val Gln Ala Ile Ser Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
            100                 105                 110
Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>20
<211>166
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi25
<400>20
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met
 1               5                  10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Leu
        35                  40                  45
Gln Lys Val Gln Ala Ile Ser Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Ala Met
            100                 105                 110
Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>21
<211>166
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi26
<400>21
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met
 1               5                  10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Leu
        35                  40                  45
Gln Lys Val Gln Ala Ile Ser Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
            100                 105                 110
Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>22
<211>166
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi27
<400>22
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met
 1               5                  10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Val Gln Ala Ile Ser Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Ala Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Ala Met
            100                 105                 110
Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>23
<211>166
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi28
<400>23
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met
 1               5                  10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Val Gln Ala Ile Ser Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Ala Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
            100                 105                 110
Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>24
<211>166
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi29
<400>24
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met
 1               5                  10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Val Gln Ala Ile Ser Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Ala Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
            100                 105                 110
Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>25
<211>166
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi30
<400>25
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met
 1               5                  10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Val Gln Ala Ile Ala Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Ala Met
            100                 105                 110
Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>26
<211>166
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi31
<400>26
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met
 1               5                  10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Val Gln Ala Ile Ala Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
            100                 105                 110
Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>27
<211>166
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi32
<400>27
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met
 1               5                  10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Leu
        35                  40                  45
Gln Lys Val Pro Ala Ile Ser Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
            100                 105                 110
Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>28
<211>166
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi33
<400>28
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met
 1               5                  10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Phe
        35                  40                  45
Gln Lys Val Pro Ala Ile Ser Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
            100                 105                 110
Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>29
<211>166
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi34
<400>29
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met
 1               5                  10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Phe
        35                  40                  45
Gln Lys Val Pro Ala Ile Ser Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
            100                 105                 110
Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>30
<211>166
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi35
<400>30
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met
 1               5                  10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Leu
        35                  40                  45
Gln Lys Ala Pro Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Met Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
            100                 105                 110
Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>31
<211>166
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi36
<400>31
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met
 1               5                  10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Phe
        35                  40                  45
Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Met Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
            100                 105                 110
Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145                 150               155                 160
Ser Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>32
<211>166
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi37
<400>32
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met
 1               5                  10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Phe
        35                  40                  45
Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Met Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
            100                 105                 110
Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>33
<211>166
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi38
<400>33
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met
 1               5                  10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Phe
        35                  40                  45
Gln Lys Ala Pro Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Met Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
            100                 105                 110
Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>34
<211>166
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi39
<400>34
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met
 1               5                  10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Val Gln Ala Ile Ser Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
            100                 105                 110
Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>35
<211>166
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi42
<400>35
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met
 1               5                  10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Val Gln Ala Ile Ser Val Phe His Glu Met Met Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
            100                 105                 110
Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>36
<211>166
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体25Epi08
<400>36
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met
 1               5                  10                  15
Leu Met Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His Gln Phe
        35                  40                  45
Gln Lys Thr Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asn Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met
            100                 105                 110
Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>37
<211>166
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体25Epi18
<400>37
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met
 1               5                  10                  15
Leu Met Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His Gln Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Thr Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asn Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met
            100                 105                 110
Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>38
<211>166
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体25Epi19
<400>38
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met
 1               5                  10                  15
Leu Met Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His Gln Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Leu Tyr Glu Leu Ile Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asn Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met
            100                 105                 110
Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>39
<211>166
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体25Epi20
<400>39
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met
 1               5                  10                  15
Leu Met Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His Gln Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Val Gln Ala Ile Ser Leu Leu Tyr Glu Leu Ile Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asn Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met
            100                 105                 110
Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>40
<211>166
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体25Epi25
<400>40
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met
 1               5                  10                  15
Leu Met Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His Gln Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Val Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asn Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met
            100                 105                 110
Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>41
<211>166
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体25Epi26
<400>41
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met
 1               5                  10                  15
Leu Met Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His Gln Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Val Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp A sp Glu Thr
65                  70                  75                   80
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met
            100                 105                 110
Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>42
<211>166
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体25Epi27
<400>42
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met
 1               5                  10                  15
Leu Met Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His Gln Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Val Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Ala Gln Gln Met Asn Asn Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met
            100                 105                 110
Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Leu Arg Ser Lys Glu
                  165
<210>43
<211>166
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体25Epi28
<400>43
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met
 1               5                  10                  15
Leu Met Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His Gln Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Val Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met
            100                 105                 110
Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>44
<211>166
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体25Epi29
<400>44
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met
 1               5                  10                  15
Leu Met Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His Gln Phe
        35                  40                  45
Gln Lys Thr Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asn Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met
            100                 105                 110
Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Asp
145                 150                 155                 160
Ser Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>45
<211>166
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>45
Cys Asp Leu Pro Glu Thr His Ser Leu Asp Asn Arg Arg Thr Leu Met
 1               5                  10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Ser Arg Ile Ser Pro Ser Ser Cys Leu Met Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe
        35                  40                  45
Gln Lys Ala Pro Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Ile
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Thr Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Asp
65                  70                  75                  80
Leu Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu Met
            100                 105                 110
Asn Ala Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
Arg Leu Arg Arg Lys Glu
                165
<210>46
<211>165
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>46
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met
 1               5                  10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln
        35                  40                  45
Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe
    50                  55                  60
Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu
65                  70                  75                  80
Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu
                85                  90                  95
Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys
            100                 105                 110
Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu
        115                 120                 125
Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg
    130                 135                 140
Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser
145                 150                 155                  160
Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>47
<211>165
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>47
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met
 1               5                  10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln
        35                  40                  45
Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe
    50                  55                  60
Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu
65                  70                  75                  80
Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu
                85                  90                  95
Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys
            100                 105                 110
Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu
        115                 120                 125
Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg
    130                 135                 140
Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser
145                 150                 155                 160
Leu Arg Ser Lys  Glu
                 165
<210>48
<211>166
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>48
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile
 1               5                  10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser His Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His Gln Phe
        35                  40                  45
Gln Lys Thr Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Glu Asp Ser Ser Ala Ala Trp Glu Gln Ser
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
            100                 105                 110
Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys
145                 150                 155                 160
Arg Leu Arg Arg Lys Asp
                165
<210>49
<211>166
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>49
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met
 1               5                  10                  15
Ile Met Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe
        35                  40                  45
Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Thr Trp Asp Glu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Met Met Gln Glu Val Gly Val Glu Asp Thr Pro Leu Met
            100                 105                 110
Asn Val Asp Ser Ile Leu Thr Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Ala Asn Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
Arg Leu Arg Arg Lys Glu
                165
<210>50
<211>166
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>50
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met
 1               5                  10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe
        35                  40                  45
Gln Lys Ala Glu Ala Ile Ser Val Leu His Glu Val Ile Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Val Ala Trp Asp Glu Arg
65                  70                  75                  80
Leu Leu Asp Lys Leu Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Trp Val Gly Gly Thr Pro Leu Met
            100                 105                 110
Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Ser Ser Arg Asn Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
Arg Leu Arg Arg Lys Glu
                165
<210>51
<211>166
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>51
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Arg Asn Arg Arg Ala Leu Ile
 1               5                  10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Glu Phe Arg Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His Gln Phe
        35                  40                  45
Gln Lys Thr Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Glu Asp Ser Ser Ala Ala Trp Glu Gln Ser
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
            100                 105                 110
Asn Glu Asp Phe Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Met Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Lys Lys
145                 150                 155                 160
Gly Leu Arg Arg Lys Asp
                165
<210>52
<211>166
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>52
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile
 1               5                  10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Glu Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Asp Lys Gln Phe
        35                  40                  45
Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Leu Asp Glu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Leu Asp Glu Phe Tyr Ile Glu Leu Asp Gln Gln Leu Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Glu Ser Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Ile Glu Ser Pro Leu Met
            100                 105                 110
Tyr Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Ser Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Ile Asn Leu Gln Lys
145                  150                 155                 160
Arg Leu Lys  Ser Lys Glu
                 165
<210>53
<211>166
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>53
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile
 1               5                  10                  15
Leu Leu Gly Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Arg Ile Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe
        35                  40                  45
Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Glu Asp Ser Ser Ala Ala Trp Glu Gln Ser
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
            100                 105                 110
Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Ile Glu Arg Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys
145                 150                 155                 160
Arg Leu Arg Arg Lys Asp
                165
<210>54
<211>166
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>54
Cys Asn Leu Ser Gln Thr His Ser Leu Asn Asn Arg Arg Thr Leu Met
 1               5                  10                  15
Leu Met Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Glu Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe
        35                  40                  45
Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Met Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asn Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
            100                 105                 110
Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Met Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys
145                 150                 155                 160
Arg Leu Arg Arg Lys Asp
                165
<210>55
<211>166
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>55
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile
 1               5                  10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser His Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg Tyr Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Val Phe Asp Gly Asn Gln Phe
        35                  40                  45
Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Ala Phe His Glu Met Ile Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Leu Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Thr Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met
            100                 105                 110
Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Met Gly Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys
145                 150                 155                 160
Gly Leu Arg Arg Lys Asp
                165
<210>56
<211>166
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>56
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile
 1               5                  10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Gly Leu Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe
        35                  40                  45
Gln Lys Thr Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Glu Asp Ser Ser Ala Ala Trp Glu Gln Ser
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asn Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Met Glu Glu Thr Pro Leu Met
            100                 105                 110
Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys
145                 150                 155                 160
Ile Leu Arg Arg Lys Asp
                          165
<210>57
<211>166
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>57
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly asn Arg Arg Ala Leu Ile
 1               5                  10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe
        35                  40                  45
Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Thr Trp Glu Gln Ser
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Asn Gln Gln Leu Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
            100                 105                 110
Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Lys Ile Phe Gln Glu
145                 150                 155                 160
Arg Leu Arg Arg Lys Glu
                165
<210>58
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体IFN-alpha Con1
<400>58
Met Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu
 1               5                  10                  15
Ile Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys
            20                  25                  30
Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln
        35                  40                  45
Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln
    50                  55                  60
Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu
65                  70                  75                  80
Ser Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp
                85                  90                  95
Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu
            100                 105                 110
Met Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Gln Arg Ile
        115                 120                 125
Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val
    130                 135                 140
Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln
145                 150                 155                 160
Glu Arg Leu Arg Arg Lys Glu
                165
<210>59
<211>498
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi15c1
<400>59
tgtgatctgc ctcagaccca cagcctgggt cacaggagga ccatgatgct cctggcacaa 60
atgaggagaa tctctctttt ctcctgtctg aaggacagac atgacttcag atttccccag 120
gaggagtttg atggcaacca cctccagaag gttcaagcta tcttcctttt ctatgagatg 180
atgcagcaga ccttcaacct cttcagcaca aaggactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240
ctcctagaaa aattctacat tgaacttttc cagcaaatga atgacctgga agcctgcgtg 300
atgcaggagg ttggagtgga agagactccc ctgatgaatg tggactccat cctggctgtg 360
aggaaatact ttcaaagaat cactctttat ctgacagaga agaagtatag cccttgtgcc 420
tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaagaa 480
agct tacgca gcaaggaa                                              498
<210>60
<211>501
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi15c2
<400>60
atgtgtgatc tgcctcagac ccacagcctg ggtcaccgtc gcaccatgat gctcctggca 60
caaatgcgtc gcatctctct tttctcctgt ctgaaggacc gccatgactt ccgctttccc 120
caggaggagt ttgatggcaa ccacctccag aaggttcaag ctatcttcct tttctatgag 180
atgatgcagc agaccttcaa cctcttcagc acaaaggact catctgctgc ttgggatgag 240
accctcctag aaaaattcta cattgaactt ttccagcaaa tgaatgacct ggaagcctgc 300
gtgatgcagg aggttggagt ggaagagact cccctgatga atgtggactc catcctggct 360
gtgcgtaaat actttcaacg catcactctt tatctgacag agaagaagta tagcccttgt 420
gcctgggagg ttgtccgcgc agaaatcatg cgctctttct ctttttcaac aaacttgcaa 480
gaaagcttac gcagcaagga a                                           501
<210>61
<211>501
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi15c3
<400>61
atgtgtgatc tgcctcagac ccacagcctg ggtcaccgtc gcaccatgat gctcctggca 60
caaatgcgtc gcatctctct tttctcctgt ctgaaggaca gacatgactt cagatttccc 120
caggaggagt ttgatggcaa ccacctccag aaggttcaag ctatcttcct tttctatgag 180
atgatgcagc agaccttcaa cctcttcagc acaaaggact catctgctgc ttgggatgag 240
accctcctag aaaaattcta cattgaactt ttccagcaaa tgaatgacct ggaagcctgc 300
gtgatgcagg aggttggagt ggaagagact cccctgatga atgtggactc catcctggct 360
gtgaggaaat actttcaaag aatcactctt tatctgacag agaagaagta tagcccttgt 420
gcctgggagg ttgtcagagc agaaatcatg agatctttct ctttttcaac aaacttgcaa 480
gaaagcttac gcagcaagga a                                           501
<210>62
<211>498
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi18c1
<400>62
tgtgatctgc ctcagaccca cagcctgggt cacaggagga ccatgatgct cctggcacaa 60
atgaggagaa tctctctttt ctcctgtctg aaggacagac atgacttcag atttccccag 120
gaggagtttg atggcaacca cgcccagaag gttcaagcta tcttcctttt ctatgagatg 180
atgcagcaga ccttcaacct cttcagcaca aaggactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240
ctcctagaaa aattctacat tgaacttttc cagcaaatga atgacctgga agcctgcgtg 300
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aggaaatact ttcaaagaat cactctttat ctgacagaga agaagtatag cccttgtgcc 420
tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaagaa 480
agcttacgca gcaaggaa                                               498
<210>63
<211>501
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi18c2
<400>63
agttgtgatc tgcctcagac ccacagcctg ggtcaccgtc gcaccatgat gctcctggca 60
caaatgcgtc gcatctctct tttctcctgt ctgaaggacc gccatgactt ccgctttccc 120
caggaggagt ttgatggcaa ccacgcccag aaggttcaag ctatcttcct tttctatgag 180
atgatgcagc agaccttcaa cctcttcagc acaaaggact catctgctgc ttgggatgag 240
accctcctag aaaaattcta cattgaactt ttccagcaaa tgaatgacct ggaagcctgc 300
gtgatgcagg aggttggagt ggaagagact cccctgatga atgtggactc catcctggct 360
gtgcgtaaat actttcaacg catcactctt tatctgacag agaagaagta tagcccttgt 420
gcctgggagg ttgtccgcgc agaaatcatg cgctctttct ctttttcaac aaacttgcaa 480
gaaagcttac gcagcaagga a                                           501
<210>64
<211>501
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi18c3
<400>64
agttgtgatc tgcctcagac ccacagcctg ggtcaccgtc gcaccatgat gctcctggca 60
caaatgcgtc gcatctctct tttctcctgt ctgaaggaca gacatgactt cagatttccc 120
caggaggagt ttgatggcaa ccacgcccag aaggttcaag ctatcttcct tttctatgag 180
atgatgcagc agaccttcaa cctcttcagc acaaaggact catctgctgc ttgggatgag 240
accctcctag aaaaattcta cattgaactt ttccagcaaa tgaatgacct ggaagcctgc 300
gtgatgcagg aggttggagt ggaagagact cccctgatga atgtggactc catcctggct 360
gtgaggaaat actttcaaag aatcactctt tatctgacag agaagaagta tagcccttgt 420
gcctgggagg ttgtcagagc agaaatcatg agatctttct ctttttcaac aaacttgcaa 480
gaaagcttac gcagcaagga a                                           501
<210>65
<211>498
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi20c1
<400>65
tgtgatctgc ctcagaccca cagcctgggt cacaggagga ccatgatgct cctggcacaa 60
atgaggagaa tctctctttt ctcctgtctg aaggacagac atgacttcag atttccccag 120
gaggagtttg atggcaacca cgcccagaag gttcaagcta tctctctttt ctatgagatg 180
atgcagcaga ccttcaacct cttcagcaca aaggactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240
ctcctagaaa aattctacat tgaacttttc cagcaaatga atgacctgga agcctgcgtg 300
atgcaggagg ttggagtgga agagactccc ctgatgaatg tggactccat cctggctgtg 360
aggaaatact ttcaaagaat cactctttat ctgacagaga agaagtatag cccttgtgcc 420
tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaagaa 480
agcttacgca gcaaggaa                                               498
<210>66
<211>501
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi20c2
<400>66
atgtgtgatc tgcctcagac ccacagcctg ggtcaccgtc gcaccatgat gctcctggca 60
caaatgcgtc gcatctctct tttctcctgt ctgaaggacc gccatgactt ccgctttccc 120
caggaggagt ttgatggcaa ccacgcccag aaggttcaag ctatctctct tttctatgag 180
atgatgcagc agaccttcaa cctcttcagc acaaaggact catctgctgc ttgggatgag 240
accctcctag aaaaattcta cattgaactt ttccagcaaa tgaatgacct ggaagcctgc 300
gtgatgcagg aggttggagt ggaagagact cccctgatga atgtggactc catcctggct 360
gtgcgtaaat actttcaacg catcactctt tatctgacag agaagaagta tagcccttgt 420
gcctgggagg ttgtccgcgc agaaatcatg cgctctttct ctttttcaac aaacttgcaa 480
gaaagcttac gcagcaagga a                                           501
<210>67
<211>501
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi20c3
<400>67
atgtgtgatc tgcctcagac ccacagcctg ggtcaccgtc gcaccatgat gctcctggca 60
caaatgcgtc gcatctctct tttctcctgt ctgaaggaca gacatgactt cagatttccc 120
caggaggagt ttgatggcaa ccacgcccag aaggttcaag ctatctctct tttctatgag 180
atgatgcagc agaccttcaa cctcttcagc acaaaggact catctgctgc ttgggatgag 240
accctcctag aaaaattcta cattgaactt ttccagcaaa tgaatgacct ggaagcctgc 300
gtgatgcagg aggttggagt ggaagagact cccctgatga atgtggactc catcctggct 360
gtgaggaaat actttcaaag aatcactctt tatctgacag agaagaagta tagcccttgt 420
gcctgggagg ttgtcagagc agaaatcatg agatctttct ctttttcaac aaacttgcaa 480
gaaagcttac gcagcaagga a                                           501
<210>68
<211>498
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi28c1
<400>68
tgtgatctgc ctcagaccca cagcctgggt cacaggagga ccatgatgct cctggcacaa 60
atgaggagaa tctctctttt ctcctgtctg aaggacagac atgacttcag atttccccag 120
gaggagtttg atggcaacca cgcccagaag gttcaagcta tctctctttt ctatgagatg 180
atgcagcaga ccgctaacct cttcagcaca aaggactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240
ctcctagaaa aattctacat tgaacttttc cagcaaatga atgacctgga agcctgcgtg 300
atgcaggagg ttggagtgga agagactccc ctgatgaagg aggactccat cctggctgtg 360
aggaaatact ttcaaagaat cactctttat ctgacagaga agaagtatag cccttgtgcc 420
tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaagaa 480
agcttacgca gcaaggaa                                               498
<210>69
<211>501
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi28c2
<400>69
atgtgtgatc tgcctcagac ccacagcctg ggtcaccgtc gcaccatgat gctcctggca 60
caaatgcgtc gcatctctct tttctcctgt ctgaaggacc gccatgactt ccgctttccc 120
caggaggagt ttgatggcaa ccacgcccag aaggttcaag ctatctctct tttctatgag 180
atgatgcagc agaccgctaa cctcttcagc acaaaggact catctgctgc ttgggatgag 240
accctcctag aaaaattcta cattgaactt ttccagcaaa tgaatgacct ggaagcctgc 300
gtgatgcagg aggttggagt ggaagagact cccctgatga aggaggactc catcctggct 360
gtgcgtaaat actttcaacg catcactctt tatctgacag agaagaagta tagcccttgt 420
gcctgggagg ttgtccgcgc agaaatcatg cgctctttct ctttttcaac aaacttgcaa 480
gaaagcttac gcagcaagga a                                           501
<210>70
<211>501
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi28c3
<400>70
atgtgtgatc tgcctcagac ccacagcctg ggtcaccgtc gcaccatgat gctcctggca 60
caaatgcgtc gcatctctct tttctcctgt ctgaaggaca gacatgactt cagatttccc 120
caggaggagt ttgatggcaa ccacgcccag aaggttcaag ctatctctct tttctatgag 180
atgatgcagc agaccgctaa cctcttcagc acaaaggact catctgctgc ttgggatgag 240
accctcctag aaaaattcta cattgaactt ttccagcaaa tgaatgacct ggaagcctgc 300
gtgatgcagg aggttggagt ggaagagact cccctgatga aggaggactc catcctggct 360
gtgaggaaat actttcaaag aatcactctt tatctgacag agaagaagta tagcccttgt 420
gcctgggagg ttgtcagagc agaaatcatg agatctttct ctttttcaac aaacttgcaa 480
gaaagcttac gcagcaagga a                                           501
<210>71
<211>498
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi32c1
<400>71
tgtgatctgc ctcagaccca cagcctgggt cacaggagga ccatgatgct cctggcacaa 60
atgaggagaa tctctctttt ctcctgtctg aaggacagac atgacttcag atttccccag 120
gaggagtttg atggcaacca cctccagaag gttccagcta tctctctttt ctatgagatg 180
atgcagcaga ccttcaacct cttcagcaca aaggactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240
ctcctagaaa aattctacat tgaacttttc cagcaaatga atgacctgga agcctgcgtg 300
atgcaggagg ttggagtgga agagactccc ctgatgaagg aggactccat cctggctgtg 360
aggaaatact ttcaaagaat cactctttat ctgacagaga agaagtatag cccttgtgcc 420
tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaagaa 480
agcttacgca gcaaggaa                                               498
<210>72
<211>501
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi32c2
<400>72
atgtgtgatc tgcctcagac ccacagcctg ggtcaccgtc gcaccatgat gctcctggca 60
caaatgcgtc gcatctctct tttctcctgt ctgaaggacc gccatgactt ccgctttccc 120
caggaggagt ttgatggcaa ccacctccag aaggttccag ctatctctct tttctatgag 180
atgatgcagc agaccttcaa cctcttcagc acaaaggact catctgctgc ttgggatgag 240
accctcctag aaaaattcta cattgaactt ttccagcaaa tgaatgacct ggaagcctgc 300
gtgatgcagg aggttggagt ggaagagact cccctgatga aggaggactc catcctggct 360
gtgcgtaaat actttcaacg catcactctt tatctgacag agaagaagta tagcccttgt 420
gcctgggagg ttgtccgcgc agaaatcatg cgctctttct ctttttcaac aaacttgcaa 480
gaaagcttac gcagcaagga a                                           501
<210>73
<211>501
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi32c3
<400>73
atgtgtgatc tgcctcagac ccacagcctg ggtcaccgtc gcaccatgat gctcctggca 60
caaatgcgtc gcatctctct tttctcctgt ctgaaggaca gacatgactt cagatttccc 120
caggaggagt ttgatggcaa ccacctccag aaggttccag ctatctctct tttctatgag 180
atgatgcagc agaccttcaa cctcttcagc acaaaggact catctgctgc ttgggatgag 240
accctcctag aaaaattcta cattgaactt ttccagcaaa tgaatgacct ggaagcctgc 300
gtgatgcagg aggttggagt ggaagagact cccctgatga aggaggactc catcctggct 360
gtgaggaaat actttcaaag aatcactctt tatctgacag agaagaagta tagcccttgt 420
gcctgggagg ttgtcagagc agaaatcatg agatctttct ctttttcaac aaacttgcaa 480
gaaagcttac gcagcaagga a                                           501
<210>74
<211>498
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi35c1
<400>74
tgtgatctgc ctcagaccca cagcctgggt cacaggagga ccatgatgct cctggcacaa 60
atgaggagaa tctctctttt ctcctgtctg aaggacagac atgacttcag atttccccag 120
gaggagtttg atggcaacca cctccagaag gctccagcca tctctgtcct ccatgagatg 180
atgcagcaga ccttcaacct cttcagcaca aaggactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240
ctcctagaaa aattctacat tgaacttttc cagcaaatga atgacctgga agcctgcgtg 300
atgcaggagg ttggagtgga agagactccc ctgatgaagg aggactccat cctggctgtg 360
aggaaatact ttcaaagaat cactctttat ctgacagaga agaagtatag cccttgtgcc 420
tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaagaa 480
agcttacgca gcaaggaa                                               498
<210>75
<211>501
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi35c2
<400>75
atgtgtgatc tgcctcagac ccacagcctg ggtcaccgtc gcaccatgat gctcctggca 60
caaatgcgtc gcatctctct tttctcctgt ctgaaggacc gccatgactt ccgctttccc 120
caggaggagt ttgatggcaa ccacctccag aaggctccag ccatctctgt cctccatgag 180
atgatgcagc agaccttcaa cctcttcagc acaaaggact catctgctgc ttgggatgag 240
accctcctag aaaaattcta cattgaactt ttccagcaaa tgaatgacct ggaagcctgc 300
gtgatgcagg aggttggagt ggaagagact cccctgatga aggaggactc catcctggct 360
gtgcgtaaat actttcaacg catcactctt tatctgacag agaagaagta tagcccttgt 420
gcctgggagg ttgtccgcgc agaaatcatg cgctctttct ctttttcaac aaacttgcaa 480
gaaagcttac gcagcaagga a                                           501
<210>76
<211>501
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi35c3
<400>76
atgtgtgatc tgcctcagac ccacagcctg ggtcaccgtc gcaccatgat gctcctggca 60
caaatgcgtc gcatctctct tttctcctgt ctgaaggaca gacatgactt cagatttccc 120
caggaggagt ttgatggcaa ccacctccag aaggctccag ccatctctgt cctccatgag 180
atgatgcagc agaccttcaa cctcttcagc acaaaggact catctgctgc ttgggatgag 240
accctcctag aaaaattcta cattgaactt ttccagcaaa tgaatgacct ggaagcctgc 300
gtgatgcagg aggttggagt ggaagagact cccctgatga aggaggactc catcctggct 360
gtgaggaaat actttcaaag aatcactctt tatctgacag agaagaagta tagcccttgt 420
gcctgggagg ttgtcagagc agaaatcatg agatctttct ctttttcaac aaacttgcaa 480
gaaagcttac gcagcaagga a                                           501
<210>77
<211>498
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体25epi18c1
<400>77
tgtgatctgc ctcagaccca cagcctgagt aacaggagga ctctgatgct catggcacaa 60
atgaggagaa tctctccttt ctcctgcctg aaggacagac atgatttcgg attccccgag 120
gaggagtttg atggccacca ggcccagaag actcaagcca tctccgttct ccatgagctg 180
atccagcaga ccttcaatct cttcagcaca aaggactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240
ctcctagaaa aattctacat tgaacttttc cagcaaatga ataacctgga agcatgtgtg 300
atacaggagg ttggggtgga agagattgcc ctgatgaatg tggactccat cctggctgtg 360
aggaaatact tccgtcgcat cactctctat ctgacagaga agaaatacag cccttgtgcc 420
tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaagaa 480
agcttacgca gcaaggaa                                               498
<210>78
<211>501
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体25epi18c2
<400>78
atgtgtgatc tgcctcagac ccacagcctg agtaaccgtc gcactctgat gctcatggca 60
caaatgcgtc gcatctctcc tttctcctgc ctgaaggacc gccatgattt cggattcccc 120
gaggaggagt ttgatggcca ccaggcccag aagactcaag ccatctccgt tctccatgag 180
ctgatccagc agaccttcaa tctcttcagc acaaaggact catctgctgc ttgggatgag 240
accctcctag aaaaattcta cattgaactt ttccagcaaa tgaataacct ggaagcatgt 300
gtgatacagg aggttggggt ggaagagatt gccctgatga atgtggactc catcctggct 360
gtgcgtaaat acttccgtcg catcactctc tatctgacag agaagaaata cagcccttgt 420
gcctgggagg ttgtccgcgc agaaatcatg cgctctttct ctttttcaac aaacttgcaa 480
gaaagcttac gcagcaagga a                                           501
<210>79
<211>501
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体25epi18c3
<400>79
atgtgtgatc tgcctcagac ccacagcctg agtaaccgtc gcactctgat gctcatggca 60
caaatgcgtc gcatctctcc tttctcctgc ctgaaggaca gacatgattt cggattcccc 120
gaggaggagt ttgatggcca ccaggcccag aagactcaag ccatctccgt tctccatgag 180
ctgatccagc agaccttcaa tctcttcagc acaaaggact catctgctgc ttgggatgag 240
accctcctag aaaaattcta cattgaactt ttccagcaaa tgaataacct ggaagcatgt 300
gtgatacagg aggttggggt ggaagagatt gccctgatga atgtggactc catcctggct 360
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gaaagcttac gcagcaagga a                                           501
<210>80
<211>498
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体25epi19c1
<400>80
tgtgatctgc ctcagaccca cagcctgagt aacaggagga ctctgatgct catggcacaa 60
atgaggagaa tctctccttt ctcctgcctg aaggacagac atgatttcgg attccccgag 120
gaggagtttg atggccacca ggcccagaag gttcaagcca tcttccttct ctatgagctg 180
atccagcaga ccttcaatct cttcagcaca aaggactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240
ctcctagaaa aattctacat tgaacttttc cagcaaatga ataacctgga agcatgtgtg 300
atacaggagg ttggggtgga agagattgcc ctgatgaatg tggactccat cctggctgtg 360
aggaaatact tccgtcgcat cactctctat ctgacagaga agaaatacag cccttgtgcc 420
tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaagaa 480
agcttacgca gcaaggaa                                               498
<210>81
<211>501
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体25epi19c2
<400>81
atgtgcgacc tgccgcagac ccactccctg tccaaccgtc gcaccctgat gctgatggct 60
cagatgcgtc gcatttcccc gttctcctgc cttaaggacc gtcacgactt cggtttcccg 120
gaagaggaat ttgacggtca ccaggctcag aaagttcagg ctatcttcct gctgtacgag 180
ctcatccagc aaaccttcaa cctgttctcc accaaagact cttccgcggc ttgggacgaa 240
accctgctgg agaaatttta catcgaactg ttccagcaaa tgaacaatct agaagcatgt 300
gttatccagg aagttggtgt tgaagagatc gctctgatga acgttgactc catcctggct 360
gttcgtaaat acttccgtcg catcaccctg tacctgaccg aaaaaaagta ctccccgtgc 420
gcttgggaag ttgtacgtgc tgaaatcatg agatctttct ccttctccac caacctgcag 480
gaatccctgc gttccaaaga a                                           501
<210>82
<211>501
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体25epi19c3
<400>82
atgtgtgatc tgcctcagac ccacagcctg agtaaccgtc gcactctgat gctcatggca 60
caaatgcgtc gcatctctcc tttctcctgc ctgaaggaca gacatgattt cggattcccc 120
gaggaggagt ttgatggcca ccaggcccag aaggttcaag ccatcttcct tctctatgag 180
ctgatccagc agaccttcaa tctcttcagc acaaaggact catctgctgc ttgggatgag 240
accctcctag aaaaattcta cattgaactt ttccagcaaa tgaataacct ggaagcatgt 300
gtgatacagg aggttggggt ggaagagatt gccctgatga atgtggactc catcctggct 360
gtgaggaaat acttccgtcg catcactctc tatctgacag agaagaaata cagcccttgt 420
gcctgggagg ttgtcagagc agaaatcatg agatctttct ctttttcaac aaacttgcaa 480
gaaagcttac gcagcaagga a                                           501
<210>83
<211>498
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体25epi26c1
<400>83
tgtgatctgc ctcagaccca cagcctgagt aacaggagga ctctgatgct catggcacaa 60
atgaggagaa tctctccttt ctcctgcctg aaggacagac atgatttcgg attccccgag 120
gaggagtttg atggccacca ggcccagaag gttcaagcca tctccgttct ccatgagctg 180
atccagcaga ccttcaatct cttcagcaca aaggactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240
ctcctagaaa aattctacat tgaactttac cagcaactga atgacctgga agcatgtgtg 300
atacaggagg ttggggtgga agagattgcc ctgatgaatg tggactccat cctggctgtg 360
aggaaatact tccgtcgcat cactctctat ctgacagaga agaaatacag cccttgtgcc 420
tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaagaa 480
agcttacgca gcaaggaa                                               498
<210>84
<211>501
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体25epi26c2
<400>84
atgtgtgatc tgcctcagac ccacagcctg agtaaccgtc gcactctgat gctcatggca 60
caaatgcgtc gcatctctcc tttctcctgc ctgaaggacc gccatgattt cggattcccc 120
gaggaggagt ttgatggcca ccaggcccag aaggttcaag ccatctccgt tctccatgag 180
ctgatccagc agaccttcaa tctcttcagc acaaaggact catctgctgc ttgggatgag 240
accctcctag aaaaattcta cattgaactt taccagcaac tgaatgacct ggaagcatgt 300
gtgatacagg aggttggggt ggaagagatt gccctgatga atgtggactc catcctggct 360
gtgcgtaaat acttccgtcg catcactctc tatctgacag agaagaaata cagcccttgt 420
gcctgggagg ttgtccgcgc agaaatcatg cgctctttct ctttttcaac aaacttgcaa 480
gaaagct tac gcagcaagga a                                          501
<210>85
<211>501
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体25epi26c3
<400>85
atgtgtgatc tgcctcagac ccacagcctg agtaaccgtc gcactctgat gctcatggca 60
caaatgcgtc gcatctctcc tttctcctgc ctgaaggaca gacatgattt cggattcccc 120
gaggaggagt ttgatggcca ccaggcccag aaggttcaag ccatctccgt tctccatgag 180
ctgatccagc agaccttcaatctcttcagc acaaaggact catct gctgc ttgggatgag 240
accctcctag aaaaattcta cattgaactt taccagcaac tgaatgacct ggaagcatgt 300
gtgatacagg aggttggggt ggaagagatt gccctgatga atgtggactc catcctggct 360
gtgaggaaat acttccgtcg catcactctc tatctgacag agaagaaata cagcccttgt 420
gcctgggagg ttgtcagagc agaaatcatg agatctttct ctttttcaac aaacttgcaa 480
gaaagcttac gcagcaagga a                                           501
<210>86
<211>498
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体25epi29c1
<400>86
tgtgatctgc ctcagaccca cagcctgagt aacaggagga ctctgatgct catggcacaa 60
atgaggagaa tctctccttt ctcctgcctg aaggacagac atgatttcgg attccccgag 120
gaggagtttg atggccacca gttccagaag actcaagcca tctccgttct ccatgagctg 180
atccagcaga ccttcaatct cttcagcaca aaggactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240
ctcctagaaa aattctacat tgaacttttc cagcaaatga ataacctgga agcatgtgtg 300
atacaggagg ttggggtgga agagattgcc ctgatgaatg tggactccat cctggctgtg 360
aggaaatact tccgtcgcat cactctctat ctgacagaga agaaatacag cccttgtgcc 420
tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaagat 480
agcttacgca gcaaggaa                                               498
<210>87
<211>501
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体25epi29c2
<400>87
atgtgcgacc tgccgcagac ccactccctg tccaaccgtc gtaccctgat gctgatggct 60
cagatgcgca gaatctcccc gttctcctgc cttaaggacc gtcacgactt cggtttccca 120
gaagaagaat ttgacggtca ccagttccag aaaacccagg ctatctccgt tcttcatgaa 180
ctgatccagc agaccttcaa cctgttctcc accaaagact cctccgcggc ttgggacgaa 240
accctgctgg aaaaattcta catcgaactg tttcagcaga tgaacaacct agaggcatgt 300
gttatccagg aagtaggtgt tgaggaaatc gctctgatga acgttgactc catcctggct 360
gtccggaaat acttccgtcg catcaccctg tacctgaccg aaaaaaaata ctccccgtgc 420
gcttgggaag ttgtgcgcgc tgaaatcatg cgttccttct ccttctccac caacctgcag 480
gactccctgc gttccaaaga a                                           501
<210>88
<211>501
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体25epi29c3
<400>88
atgtgtgatc tgcctcagac ccacagcctg agtaaccgtc gcactctgat gctcatggca 60
caaatgcgtc gcatctctcc tttctcctgc ctgaaggaca gacatgattt cggattcccc 120
gaggaggagt ttgatggcca ccagttccag aagactcaag ccatctccgt tctccatgag 180
ctgatccagc agaccttcaa tctcttcagc acaaaggact catctgctgc ttgggatgag 240
accctcctag aaaaattcta cattgaactt ttccagcaaa tgaataacct ggaagcatgt 300
gtgatacagg aggttggggt ggaagagatt gccctgatga atgtggactc catcctggct 360
gtgaggaaat acttccgtcg catcactctc tatctgacag agaagaaata cagcccttgt 420
gcctgggagg ttgtcagagc agaaatcatg agatctttct ctttttcaac aaacttgcaa 480
gatagcttac gcagcaagga a                                           501
<210>89
<211>579
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体14epi18m2
<220>
<221>CDS
<222>(57)...(560)
<400>89
caattgtgag cggataacaa tttcacacag aattcattaa agaggagaaa ttaact atg 59
                                                              Met
                                                               1
tgc gac ctg ccg cag acc cac tcc ctt gga cac cgt cgg acc atg atg   107
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met
             5                   10                  15
ctg cta gct cag atg cgt aga ata tcc ctg ttc tcc tgc ctt aag gac   155
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
         20                  25                  30
cgt cac gac ttc cgt ttc ccc cag gaa gaa ttt gat ggt aac cac gct   203
Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Ala
     35                  40                  45
cag aaa gtt cag gct atc ttc ctg ttt tac gaa atg atg cag caa acc   251
Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr
 50                  55                  60                  65
ttc aac ctg ttc tcc acc aaa gac tcc tcc gcg gct tgg gac gaa acc  299
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
                 70                  75                  80
ctg ctg gaa aaa ttc tac atc gaa ctg ttc cag cag atg aac gat cta  347
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu
            85                  90                  95
gaa gca tgc gtt atg cag gaa gta ggt gtt gaa gag acc cca ctg atg  395
Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
        100                 105                 110
aac gtt gac tcc atc ctg gct gtc cgg aaa tac ttc cag cgt atc acc  443
Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
    115                 120                 125
ctg tac ctg act gaa aaa aaa tac tcc ccg tgc gct tgg gaa gtt gtg  491
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130                 135                 140                 145
cgc gct gaa atc atg cgt tcc ttc tcc ttc tcc acc aac ctg cag gaa  539
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu
                150                 155                 160
tcc ctg cgt tcc aaa gaa taa taagcttaat tagctgagc                 579
Ser Leu Arg Ser Lys Glu*
            165
<210>90
<211>579
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体25epi19m
<220>
<221>CDS
<222>(57)...(560)
<400>90
caattgtgag cggataacaa tttcacacag aattcattaa agaggagaaa ttaact atg 59
                                                              Met
                                                               1
tgc gac ctg ccg cag acc cac tcc ctt tct aac cgt aga acc ctg atg   107
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met
             5                   10                  15
ctg atg gct cag atg cgt cgt att tct ccg ttc tct tgc ctt aag gat   155
Leu Met Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
         20                  25                  30
cgt cac gac ttc ggt ttc cca gaa gag gaa ttt gac ggt cac cag gct   203
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His Gln Ala
     35                  40                  45
cag aaa gtt cag gct atc ttc ctg ctg tac gag ctc atc cag caa acc  251
Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Leu Tyr Glu Leu Ile Gln Gln Thr
 50                  55                  60                  65
ttc aac ctg ttc tct acc aaa gac tct tcc gcg gct tgg gac gaa acc    299
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
                 70                  75                  80
ctg ctg gag aaa ttt tac atc gaa ctg ttc cag caa atg aac aat cta    347
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asn Leu
             85                  90                  95
gaa gca tgt gtt atc cag gaa gtt ggt gtt gaa gag atc gct ctg atg    395
Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met
        100                 105                 110
aac gtt gac tcc atc ctg gct gtt cgt aaa tac ttc cgt cgc atc acc    443
Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr
    115                 120                 125
ctg tac ctg acc gaa aaa aag tac tcc ccg tgc gct tgg gaa gtt gta    491
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130                 135                 140                 145
cgt gct gaa atc atg aga tct ttc tcc ttc tcc acc aac ctg cag gaa    539
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu
                150                 155                 160
tcc ctg cgt tcc aaa gaa taa taagcttaat tagctgagc                   579
Ser Leu Arg Ser Lys Glu  *
            165

Claims (79)

1.分离的或重组的多肽，其包含的序列
(a)与SEQ ID NO：1在1-16个氨基酸位置中不同和
(b)相对于SEQ ID NO：1，含有一个或多个选自F48A/L；V51P；F55A；F65A；F68P；L111A和V114P的取代；
所述多肽表现出抗病毒活性。
2.权利要求1的多肽，其包含与SEQ ID NO：1在1-10个氨基酸位置中不同的序列。
3.权利要求1的多肽，其包含与SEQ ID NO：1在1-8个氨基酸位置中不同的序列。
4.权利要求1的多肽，其还包含一个或多个选自H47Q；V5 1A；Q52P/E；A53T；F55S；L56V；F57L；Y58H；M61I；N113K；V114E和E160D的取代。
5.权利要求1的多肽，其包含选自SEQ ID NO：2-35的序列。
6.权利要求1的多肽，其序列相对于SEQ ID NO：1含有取代F48A/L。
7.权利要求6的多肽，其含有选自SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ IDNO：23，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQID NO：30，SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35的序列。
8.分离的或重组的多肽，其包含的序列
(a)与SEQ ID NO：13在0-16个氨基酸位置中不同和
(b)含有下述的一个或多个氨基酸：第48位的Ala或Leu；第51位的Pro；第55位的Ala；第65位的Ala；第68位的Pro；第111位的Ala；和第114位的Pro；
所述多肽表现出抗病毒活性。
9.权利要求8的多肽，其序列的第48位含有Ala或Leu。
10.权利要求8的多肽，其包含与SEQ ID NO：13在0-8个氨基酸位置中不同的序列。
11.分离的或重组的多肽，其含有序列SEQ ID NO：13，任选还在N-末端含有甲硫氨酸，所述多肽表现出抗病毒活性。
12.分离的或重组的多肽，其包含的序列
(a)与SEQ ID NO：36在1-16个氨基酸位置中不同和
(b)相对于SEQ ID NO：36，含有一个或多个选自M21A，I24P，F48A/L，T51P，S55A，F65A，F68P，F90A，M93P，L111A，V114P，F124A，I127P和E160D的取代；
所述多肽表现出抗病毒活性。
13.权利要求12的多肽，其包含与SEQ ID NO：36在1-10个氨基酸位置中不同的序列。
14.权利要求12的多肽，其包含与SEQ ID NO：36在1-8个氨基酸位置中不同的序列。
15.权利要求12的多肽，其还包含一个或多个选自P26L，H47Q，T51V，S55P/F，V56L，H58Y，L60M，F90Y，M93L，N95D，N113K，V114E，R125Q，T132K和L154F的取代。
16.权利要求12的多肽，其包含选自SEQ ID NO：37-44的序列。
17.权利要求12的多肽，其序列相对于SEQ ID NO：36含有取代F48A/L。
18.权利要求17的多肽，其含有选自SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：42和SEQ IDNO：43的序列。
19.权利要求12的多肽，其含有序列SEQ ID NO：44。
20.分离的或重组的多肽，其包含的序列
(a)与SEQ ID NO：38在0-16个氨基酸位置中不同和
(b)含有下述的一个或多个氨基酸：第21位的Ala；第24位的Pro；第48位的Ala或Leu；第51位的Pro；第55位的Ala；第65位的Ala；第68位的Pro；第90位的Ala；第93位的Pro；第111位的Ala；第114位的Pro；第124位的Ala；第127位的Pro；和第160位的Glu；
所述多肽表现出抗病毒活性。
21.权利要求20的多肽，其序列的第48位含有Ala或Leu。
22.权利要求20的多肽，其包含与SEQ ID NO：38在0-8个氨基酸位置中不同的序列。
23.分离的或重组的多肽，其含有序列SEQ ID NO：38，任选还在N-末端含有甲硫氨酸，所述多肽表现出抗病毒活性。
24.权利要求1至23的多肽，其中所述多肽的抗病毒活性等于或大于huIFN-α2b或huIFN-α2a的抗病毒活性。
25.权利要求24的多肽，其中所述多肽的抗病毒活性比huIFN-α2b或huIFN-α2a的抗病毒活性大至少两倍。
26.权利要求1至23的多肽，其中所述多肽所表现出的抗病毒活性/抗增殖活性比率比huIFN-α2b或huIFN-α2a所表现出的抗病毒活性/抗增殖活性比率大至少两倍。
27.偶联物，其包含
(a)权利要求1至26的多肽；和
(b)与该多肽共价连接的非多肽部分。
28.权利要求27的偶联物，其包含至少两种非多肽部分。
29.权利要求27的偶联物，其包含与半胱氨酸残基共价连接的非多肽部分。
30.权利要求27的偶联物，其包含与赖氨酸残基或与N末端氨基共价连接的非多肽部分。
31.权利要求27的偶联物，其包含与赖氨酸残基共价连接的非多肽部分。
32.权利要求27的偶联物，其包含与N末端氨基共价连接的非多肽部分。
33.权利要求27的偶联物，其中所述非多肽部分是聚合物。
34.权利要求33的偶联物，其中所述聚合物是聚乙二醇。
35.权利要求34的偶联物，其中所述聚乙二醇是与赖氨酸残基共价连接的40kDa mPEG2。
36.权利要求27的偶联物，其中所述非多肽部分是糖。
37.权利要求36的偶联物，其中所述糖连接于多肽的N-糖基化位点。
38.偶联物，其含有
(a)含有序列SEQ ID NO：13的多肽，任选还在N-末端含有甲硫氨酸；
和
(b)与所述多肽的赖氨酸残基共价连接的PEG部分，所述偶联物表现出抗病毒活性。
39.权利要求38的偶联物，其中PEG部分是40kDa mPEG2部分。
40.权利要求39的偶联物，其中40kDa mPEG2部分与选自Lys122和Lys135的赖氨酸残基共价连接。
41.偶联物，其含有
(a)含有序列SEQ ID NO：38的多肽，任选还在N-末端含有甲硫氨酸；和
(b)与所述多肽的赖氨酸残基共价连接的PEG部分，所述偶联物表现出抗病毒活性。
42.权利要求41的偶联物，其中PEG部分是40kDa mPEG2部分。
43.权利要求42的偶联物，其中40kDa mPEG2部分与选自Lys31，Lys122和Lys135的赖氨酸残基共价连接。
44.组合物，其含有
(a)偶联物，其包含含有序列SEQ ID NO：13的多肽以及与Lys122共价连接的40kDa mPEG2部分，所述多肽任选还在N-末端含有甲硫氨酸；和
(b)偶联物，其包含含有序列SEQ ID NO：13的多肽以及与Lys135共价连接的40kDa mPEG2部分，所述多肽任选还在N-末端含有甲硫氨酸；所述组合物表现出抗病毒活性。
45.组合物，其含有
(a)偶联物，其包含含有序列SEQ ID NO：38的多肽以及与Lys31共价连接的40kDa mPEG2部分，所述多肽任选还在N-末端含有甲硫氨酸；
(b)偶联物，其包含含有序列SEQ ID NO：38的多肽以及与Lys122共价连接的40kDa mPEG2部分，所述多肽任选还在N-末端含有甲硫氨酸；
和
(c)偶联物，其包含含有序列SEQ ID NO：38的多肽以及与Lys135共价连接的40kDa mPEG2部分，所述多肽任选还在N-末端含有甲硫氨酸；所述组合物表现出抗病毒活性。
46.组合物，其包含权利要求1至26的多肽以及可药用的赋形剂。
47.组合物，其包含权利要求27至43的偶联物以及可药用的赋形剂。
48.权利要求44至45的组合物，还含有可药用的赋形剂。
49.分离的或重组的多核苷酸，其包含编码权利要求1至26的多肽的核酸序列。
50.权利要求49的多核苷酸，其包含编码含有序列SEQ ID NO：13的多肽的核酸序列。
51.权利要求50的多核苷酸，其包含选自SEQ ID NO：62，SEQ IDNO：63，SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：89的核酸序列。
52.权利要求49的多核苷酸，其包含编码含有序列SEQ ID NO：38的多肽的核酸序列。
53.权利要求52的多核苷酸，其包含选自SEQ ID NO：80，SEQ IDNO：81，SEQ ID NO：82和SEQ ID NO：90的核酸序列。
54.宿主细胞，其包含权利要求49的多核苷酸。
55.载体，其包含权利要求49的多核苷酸。
56.权利要求55的载体，其是表达载体，包含与启动子可操作地连接的多核苷酸。
57.宿主细胞，其包含权利要求56的载体。
58.组合物，其包含权利要求49的多核苷酸以及赋形剂。
59.制备权利要求1至26的多肽的方法，该方法包括：
提供包含宿主细胞的培养物，所述宿主细胞包含表达载体，所述表达载体包含与多核苷酸可操作地连接的启动子，所述多核苷酸包含编码所述多肽的核酸序列，
在允许该多肽表达的条件下培养所述培养物，和回收该多肽。
60.权利要求59的方法，其中宿主细胞是糖基化宿主细胞。
61.权利要求59的方法，其中宿主细胞是细菌宿主细胞。
62.权利要求59的方法，其中细菌宿主细胞是大肠杆菌。
63.权利要求62的方法，其中回收多肽的步骤包括：
(a)分离含有多肽的包涵体(IB)；
(b)溶解IB，从而获得未折叠的多肽；
(c)重折叠未折叠的多肽，从而获得重折叠的多肽；和
(d)纯化重折叠的多肽。
64.制备偶联物的方法，所述方法包括
(i)提供权利要求1至26的多肽，和
(ii)将至少一种非多肽部分与所述多肽相连，其中得到的偶联物表现出抗病毒活性。
65.权利要求64的方法，其中提供多肽的步骤包括：
提供包含宿主细胞的培养物，所述宿主细胞包含表达载体，所述表达载体包含与多核苷酸可操作地连接的启动子，所述多核苷酸包含编码所述多肽的核酸序列，
在允许该多肽表达的条件下培养所述培养物，和回收该多肽。
66.权利要求65的方法，其中所述宿主细胞是糖基化宿主细胞或细菌宿主细胞。
67.权利要求66的方法，其中细菌宿主细胞是大肠杆菌。
68.权利要求67的方法，其中回收多肽的步骤包括：
(a)分离含有多肽的包涵体(IB)；
(b)溶解IB，从而获得未折叠的多肽；
(c)重折叠未折叠的多肽，从而获得重折叠的多肽；和
(d)纯化重折叠的多肽。
69.权利要求64的方法，其中使至少一种非多肽部分与所述多肽相连的步骤包括：
于4℃，pH9的条件下，以mPEG2-NHS：多肽的摩尔比约为3∶1至5∶1使多肽与40kDa mPEG2-NHS反应1小时至过夜。
70.降低感染了病毒的细胞中的病毒拷贝数的方法，所述方法包括：给细胞施用其用量能有效降低细胞中病毒拷贝数的权利要求1至26的多肽，权利要求27至43的偶联物，或权利要求44至48的组合物，由此降低所述细胞中的病毒拷贝数。
71.降低感染了HCV的患者血清中的HCV RNA水平的方法，所述方法包括：给患者施用权利要求1至26的多肽，权利要求27至43的偶联物，或权利要求44至48的组合物，与开始治疗前存在的HCV RNA水平相比，其用量能有效降低HCV RNA水平。
72.降低感染了HBV的患者血清中的HBV DNA水平的方法，所述方法包括：给患者施用权利要求1至26的多肽，权利要求27至43的偶联物，或权利要求44至48的组合物，与开始治疗前存在的HBV DNA水平相比，其用量能有效降低HBV DNA水平。
73.降低感染了HIV的患者血清中的HIV RNA水平的方法，所述方法包括：给患者施用权利要求1至26的多肽，权利要求27至43的偶联物，或权利要求44至48的组合物，与开始治疗前存在的HIV RNA水平相比，其用量能有效降低HIV RNA水平。
74.权利要求1至26的多肽，权利要求27至43的偶联物，或权利要求44至48的组合物，其用作药物。
75.权利要求1至26的多肽，权利要求27至43的偶联物，或权利要求44至48的组合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途。
76.权利要求1至26的多肽，权利要求27至43的偶联物，或权利要求44至48的组合物在制备用于治疗病毒疾病的药物中的用途。
77.权利要求1至26的多肽，权利要求27至43的偶联物，或权利要求44至48的组合物在制备用于降低感染了病毒的细胞中该病毒拷贝数的药物中的用途。
78.权利要求1至26的多肽，权利要求27至43的偶联物，或权利要求44至48的组合物在制备用于降低感染了病毒的患者血清中的病毒水平的药物中的用途。
79.根据权利要求61-63中任一项的用途，其中所述病毒是HCV，HBV或HIV。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102358897A (zh) * 2011-10-31 2012-02-22 北京三元基因工程有限公司 重组人寡腺苷酸合成酶-1的制备方法

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040005673A1 (en) 2001-06-29 2004-01-08 Kevin Jarrell System for manipulating nucleic acids
JP2002537762A (ja) * 1999-01-05 2002-11-12 トラスティーズ オブ ボストン ユニバーシティ 改良型核酸クローニング
AU2001277014A1 (en) * 2000-07-21 2002-02-05 Trustees Of Boston University Modular vector systems
US7435562B2 (en) 2000-07-21 2008-10-14 Modular Genetics, Inc. Modular vector systems
JP2008500750A (ja) * 2004-05-12 2008-01-10 フュージョンワン インコーポレイテッド 高度な連絡先識別システム
WO2006053131A1 (en) * 2004-11-11 2006-05-18 Modular Genetics, Inc. Ladder assembly and system for generating diversity
KR101329878B1 (ko) * 2005-03-09 2013-11-22 광웬 위 재조합 슈퍼 화합물 인터페론의 용도
AU2006299901A1 (en) * 2005-05-18 2007-04-19 Maxygen, Inc. Evolved interferon-alpha polypeptides
AR078117A1 (es) * 2006-06-20 2011-10-19 Protech Pharma S A Una muteina recombinante del interferon alfa humano glicosilado, un gen que codifica para dicha muteina, un metodo de produccion de dicho gen, un metodo para obtener una celula eucariota productora de dicha muteina, un metodo para producir dicha muteina, un procedimiento para purificar dicha muteina
WO2008008808A2 (en) * 2006-07-11 2008-01-17 Modular Genetics Inc. Methods of introducing targeted diversity into nucleic acid molecules
US20100009908A1 (en) * 2006-07-25 2010-01-14 Nozomu Nishi Galectin 9-Polymer Conjugates
US7808342B2 (en) * 2006-10-02 2010-10-05 Skyworks Solutions, Inc. Harmonic phase tuning filter for RF switches
WO2008124086A2 (en) 2007-04-05 2008-10-16 President And Fellows Of Harvard College Chimeric activators: quantitatively designed protein therapeutics and uses thereof
US7625555B2 (en) 2007-06-18 2009-12-01 Novagen Holding Corporation Recombinant human interferon-like proteins
WO2009006579A1 (en) * 2007-07-05 2009-01-08 Pharmaessentia Corp. Peptide-polymer conjugates
PL2195338T3 (pl) * 2007-10-01 2014-05-30 Pharmaessentia Corp Interferon alfa zmodyfikowany na końcu N
CN107033233A (zh) 2008-01-18 2017-08-11 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 非糖基化蛋白质的纯化
US7954022B2 (en) * 2008-01-30 2011-05-31 Alcatel-Lucent Usa Inc. Apparatus and method for controlling dynamic modification of a scan path
EP2358395A4 (en) * 2008-11-17 2013-11-20 Hoffmann La Roche METHOD AND FORMULATION FOR REDUCING THE AGGREGATION OF A MACROMOLECULUM UNDER PHYSIOLOGICAL CONDITIONS
US8940501B2 (en) 2009-01-30 2015-01-27 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods for ligation and uses thereof
RU2606262C2 (ru) 2011-06-02 2017-01-10 Ханми Сайенс Ко., Лтд. Мультимер непептидильный полимер-инсулин и способ его получения
CN103764665A (zh) 2011-06-28 2014-04-30 怀特黑德生物医学研究所 使用分选酶安装用于蛋白质连接的点击化学柄
WO2015168474A1 (en) * 2014-04-30 2015-11-05 President And Fellows Of Harvard College Fusion proteins for treating cancer and related methods
DK3006045T3 (en) * 2014-10-07 2017-07-17 Cyprumed Gmbh Pharmaceutical formulations for oral administration of peptide or protein drugs
SG11201804961UA (en) 2015-12-30 2018-07-30 Genentech Inc Formulations with reduced degradation of polysorbate
RU2650755C1 (ru) * 2017-05-24 2018-04-17 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России (ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России) Способ очистки лекарственного средства пролонгированного действия на основе рекомбинантного аналога интерферона альфа-17 для лечения вирусного гепатита С
JP2023511946A (ja) * 2020-01-24 2023-03-23 アルカームス ファーマ アイルランド リミテッド 精製方法

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6610830B1 (en) 1980-07-01 2003-08-26 Hoffman-La Roche Inc. Microbial production of mature human leukocyte interferons
US4414150A (en) 1980-11-10 1983-11-08 Genentech, Inc. Hybrid human leukocyte interferons
ES8302778A1 (es) 1980-11-10 1983-02-01 Genentech Inc Un procedimiento para producir un polipeptido antiviral.
EP0098876A1 (en) 1982-01-19 1984-01-25 Cetus Corporation Multiclass hybrid interferons
US6936694B1 (en) 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
JPS60152058A (ja) * 1984-01-20 1985-08-10 Toshiba Corp 半導体記憶装置
ATE78262T1 (de) 1985-06-11 1992-08-15 Ciba Geigy Ag Hybrid-interferone.
US4695626A (en) * 1986-07-29 1987-09-22 Pfizer Inc. 1-aza-4,5-dithiabicyclo [4.2.0] oct-2-en-8-one-2 carboxylate esters
US5372808A (en) 1990-10-17 1994-12-13 Amgen Inc. Methods and compositions for the treatment of diseases with consensus interferon while reducing side effect
EP0553294B1 (en) 1990-10-17 1998-12-23 Amgen Inc. The manufacture of compositions for the treatment of cell proliferation disorders
US5595732A (en) 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
US5382657A (en) 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
US5574138A (en) 1993-03-08 1996-11-12 Immunex Corporation Epithelium-derived T-cell factor
US6335160B1 (en) 1995-02-17 2002-01-01 Maxygen, Inc. Methods and compositions for polypeptide engineering
AU1854695A (en) 1994-03-07 1995-09-25 Imperial College Of Science, Technology And Medicine The use of interferon subtypes in the preparation of medicaments to treat viral infections
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
TW517067B (en) 1996-05-31 2003-01-11 Hoffmann La Roche Interferon conjugates
ATE375363T1 (de) 1997-07-14 2007-10-15 Bolder Biotechnology Inc Derivate des wachstumshormons und verwandte proteine
US7306931B2 (en) 2000-05-16 2007-12-11 Bolder Biotechnology, Inc. Method for refolding proteins containing free cysteine residues
IL144259A0 (en) 1999-01-14 2002-05-23 Bolder Biotechnology Inc Methods for making proteins containing free cysteine residues
AU3725600A (en) * 1999-03-02 2000-09-21 Maxygen, Inc. Surrogate orphan ligands for orphan receptors
DE60035871T2 (de) 1999-05-19 2008-06-05 Merck Patent Gmbh Expression und export von interferon-alpha proteinen als fc fusionsproteine
US20040002474A1 (en) 1999-10-07 2004-01-01 Maxygen Inc. IFN-alpha homologues
AU8001300A (en) 1999-10-07 2001-05-10 Maxygen, Inc. Ifn-alpha homologues
CA2390292A1 (en) * 1999-11-12 2001-05-25 Maxygen Holdings Ltd. Interferon gamma conjugates
WO2002044197A2 (en) 2000-12-01 2002-06-06 Fish Eleanor N Cytokine receptor binding peptides
KR100459105B1 (ko) 2001-02-15 2004-12-03 선바이오(주) 변형된 인터페론-알파 2ａ 및 2ｂ, 그리고 이들과 ＰＥＧ유도체와의 배합체
EP1562634B1 (en) 2002-11-15 2006-08-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Positional isomers of pegylated interferon alpha 2a
BR0316324A (pt) * 2002-11-18 2005-09-27 Maxygen Inc Polipeptìdeos e conjugados de interferon-alfa

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102358897A (zh) * 2011-10-31 2012-02-22 北京三元基因工程有限公司 重组人寡腺苷酸合成酶-1的制备方法

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