PL197568B1

PL197568B1 - Kompleks zawierający IFN typu I oraz podjednostkę IFNAR, jego zastosowanie, cząsteczka DNA i wektor ją zawierający, komórka gospodarza transformowana wektorem, kompozycja farmaceutyczna, lek, zastosowanie IFNAR, zastosowanie IFN typu I i podjednostki IFNAR, sposób wytwarzania białka fuzyjnego oraz sposób przedłużania okresu trwałości IFN

Info

Publication number: PL197568B1
Application number: PL341423A
Authority: PL
Inventors: Mark Tepper; Mark Cunningham; David Sherris; Tayar Nabil El; Sean Mckenna
Original assignee: Applied Research Systems
Priority date: 1997-12-19
Filing date: 1998-12-18
Publication date: 2008-04-30
Also published as: JP4601163B2; IL136855A; BG64920B1; BR9813753A; PL341423A1; CA2311648C; EP1037658A1; EA003635B1; ATE218362T1; NZ504771A; AR020315A1; AU1926999A; TR200001961T2; KR100593981B1; AU755078B2; JP2001526242A; HUP0100456A1; UA74132C2; DE69805844T2; PT1037658E

Abstract

1. Kompleks zawieraj acy interferon (IFN) typu I oraz podjednostk e receptora ludzkiego interfe- ronu a/ ß (IFNAR), która jest zdolna do wi azania z IFN typu I kompleksu, przy czym IFN typu I jest: a) natywnym IFN typu I b) fragmentem a), który ma aktywno sc biologiczn a IFN typu I; c) wariantem a) lub b), który ma przynajmniej 70% identyczno sc sekwencji z a) lub b) i który ma aktywnosc biologiczn a IFN typu I; d) wariantem a) lub b), który jest kodowany przez sekwencj e DNA, która hybrydyzuje z se- kwencj a komplementarn a do natywnej sekwencji DNA koduj acej a) lub b) w umiarkowanie ostrych warunkach i który ma aktywno sc biologiczn a IFN typu I; lub e) sol a lub funkcjonaln a pochodn a a), b), c) lub d), która ma aktywnosc biologiczn a IFN typu I; i IFNAR jest: f) lancuchem polipeptydowym natywnego ludzkiego IFNAR; g) fragmentem f), który ma aktywno sc biologiczn a IFNAR; h) wariantem f) lub g), który ma przynajmniej 70% identyczno sc sekwencji z f) lub g) i który ma aktywnosc biologiczn a IFNAR; i) wariantem f) lub g), który jest kodowany przez sekwencj e DNA, która hybrydyzuje z sekwen- cja komplementarn a do natywnej sekwencji DNA koduj acej f) lub g) w umiarkowanie ostrych warunkach i który ma aktywnosc biologiczn a IFNAR; lub j) sol a lub funkcjonaln a pochodn a f ), g), h) lub i), która ma aktywno sc biologiczn a IFNAR. PL PL PL PL PL PL PL

Description

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 197568 (21) Numer zgłoszenia: 341423 (13) B1 (22) Data zgłoszenia: 18.12.1998 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:

18.12.1998, PCT/US98/26926 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

01.07.1999, WO99/32141 PCT Gazette nr 26/99 (51) Int.Cl.

A61K 38/21 (2006.01) A61K 38/17 (2006.01) C07K 14/555 (2006.01) C07K 14/715 (2006.01) C07K 19/00 (2006.01) C12N 15/12 (2006.01) C12N 5/10 (2006.01)

Kompleks zawierający IFN typu I oraz podjednostkę IFNAR, jego zastosowanie, cząsteczka DNA i wektor ją zawierający, komórka gospodarza transformowana (54) wektorem, kompozycja farmaceutyczna, lek, zastosowanie IFNAR,zastosowanie IFN typu I i podjednostki IFNAR, sposób wytwarzania białka fuzyjnego oraz sposób przedłużania okresu trwałości IFN

	(73) Uprawniony z patentu:
	APPLIED RESEARCH SYSTEMS ARS
(30) Pierwszeństwo:	HOLDING N.V.,Curacao,AN
19.12.1997,US,60/068,295	(72) Twórca(y) wynalazku:
(43) Zgłoszenie ogłoszono: 09.04.2001 BUP 08/01	Mark Tepper,Conton,US Mark Cunningham,Waltham,US David Sherris,Jamaican Plain,US Nabil El Tayar,Milton,US
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:	Sean McKenna,Ducksberry,US
30.04.2008 WUP 04/08	(74) Pełnomocnik:
	Janina Kossowska, PATPOL Sp. z o.o.

(57) 1 . Kompleks aawierająyy interferon (IFN) tppu I oraz oodjednostęę reeeptora ludkkiego interferonu α/β (IFNAR), która jest zdolna do wiązania z IFN typu I kompleksu, przy czym IFN typu I jest:

a) natywnym IFN typu I

b) fragmentem a), który ma aktywność biologiczną IFN typu I;

c) wariantem a) lub b), który ma przynajmniej 70% identyczność sekwencji z a) lub b) i który ma aktywność biologiczną IFN typu I;

d) wariantem a) lub b), który jest kodowany przez sekwencję DNA, która hybrydyzuje z sekwencją komplementarną do natywnej sekwencji DNA kodującej a) lub b) w umiarkowanie ostrych warunkach i który ma aktywność biologiczną IFN typu I; lub

e) solą lub funkcjonalną pochodną a), b), c) lub d), która ma aktywność biologiczną IFN typu I; i IFNAR jest:

r) łańcuchem polipeptydowym natywnego ludzkiego IFNAR;

g) fragmentem r), który ma aktywność biologiczną IFNAR;

h) wariantem f) lub g), który ma przynajmniej 70% identyczność sekwencji z r) lub g) i który ma aktywność biologiczną IFNAR;

i) wariantem r) lub g), który jest kodowany przez sekwencję DNA, która hybrydyzuje z sekwencją komplementarną do natywnej sekwencji DNA kodującej r) lub g) w umiarkowanie ostrych warunkach i który ma aktywność biologiczną IFNAR; lub

j) solą lub tunkcjonalną pochodną r ), g), h) lub i), która ma aktywność biologiczną IFNAR.

PL 197 568 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest kompleks zawierający IFN typu I oraz podjednostkę IFNAR, jego zastosowanie, cząsteczka DNA i wektor ją zawierający, komórka gospodarza transformowana wektorem, kompozycja farmaceutyczna, lek, zastosowanie IFNAR, zastosowanie IFN typu I i podjednostki IFNAR, sposób wytwarzania białka fuzyjnego oraz sposób przedłużania okresu trwałości IFN.

Ujawniony został niniejszym kompleks interferonu typu I, złożony z sekwencji polipeptydowej domeny ludzkiego receptora interferonu α/β (IFNAR2) i interferonu typu I (IFNa, IFNp i IFNw). Taki kompleks, w odniesieniu do aktywności przeciwwirusowej, przeciwnowotworowej i modulującej odporność, polepsza stabilność, zwiększa moc i wpływa pozytywnie na farmakokinetykę in vivo wolnego IFN. Bardziej szczegółowo, kompleks jest białkiem fuzyjnym, lub kompleksem kowalencyjnym, lub kompleksem niekowalencyjnym zawierającym sekwencję polipeptydową całkowitej zewnątrzkomórkowej domeny IFNAR2, lub dowolnej jej subfrakcji wiążącej interferon, w kompleksie z interferonem typu I (IFNa, IFNj i IFNCω) lub jego dowolną biologicznie czynną subfrakcję.

Interferony są sklasyfikowane jako interferony typu I pochodzące od leukocytów i fibroblastów, albo jako indukowane przez mitogeny czyli „odpornościowe interferony typu II (Pestka i wsp., 1987). W wyniku analizy identyczności sekwencji i wspólnych aktywności biologicznych, interferony typu I obejmują interferon alfa (IFNa), interferon beta (IFNji) i interferon omega (IFNω), podczas gdy interferon typu II obejmuje interferon gamma (IFNy). Geny IFNa, IFNj i IFNω są skupione na krótkim ramieniu chromosomu 9 (Lengyel, 1982). Jest przynajmniej 25 nieallelicznych genów IFNa, 6 nieallelicznych genów IFNω i pojedynczy gen IFNp. Uważa się, że wszystkie wyewoluowały ze wspólnego genu wyjściowego. W obrębie gatunków geny IFNa mają przynajmniej około 80% identyczność sekwencji. Gen IFN β wykazuje około 50% identyczność sekwencji z IFNa, a gen IFNω wykazuje około 70% identyczność sekwencji z IFNa (Weissman i wsp., 1986; Dron i wsp., 1992). Masa cząsteczkowa IFNa mieści się zakresie od 17-23 kDa (165-166 aminokwasów), IFNj wynosi ok. 23 kDa (166 aminokwasów), a IFNω wynosi ok. 24 kDa (172 aminokwasy).

Interferony typu I są plejotropowymi cytokinami działającymi w układzie obronnym gospodarza przeciwko zakażeniu pasożytami i wirusami, jako cytokiny przeciwnowotworowe i jako modulatory układu odpornościowego (Baron i wsp., 1994; Baron i wsp., 1991). Odpowiedzi fizjologiczne interferonów typu I obejmują aktywność antyproliferacyjną na komórkach prawidłowych i transformowanych; stymulację cytotoksycznej aktywności w limfocytach, komórkach naturalnych zabójcach (NK) i komórkach fagocytujących; modulację różnicowania komórkowego; stymulację ekspresji antygenów MHC klasy I; hamowanie MHC klasy II; oraz modulację szeregu receptorów na powierzchni komórkowej. W prawidłowych warunkach fizjologicznych IFNa i IFN β (IFNa/β) są wydzielane konstytutywnie przez większość komórek ludzkich na niskim poziomie, a ekspresja jest podwyższana przez dodatek szeregu induktorów, w tym czynników zakaźnych (wirusy, bakterie, mikoplazmy i pierwotniaki), dsRNA, i cytokiny (M-CSF, IL-1a, IL-2, TFNa). Działanie interferonu typu I in vivo może być śledzone stosując zastępcze markery, neopterynę, syntetazę 2',5'oligoadenylanową i β 2 mikroglobulinę (Alam i wsp., 1997; Fierlbeck i wsp., 1996; Salmon i wsp. 1996).

Interferony typu I (IFNa/β/ω) działają poprzez kompleks receptora na powierzchni komórek, aby indukować specyficzne efekty biologiczne, takie jak aktywność przeciwwirusowa, przeciwnowotworowa i aktywność modulująca odporność. Receptor IFN typu I (IFNAR) jest heteromultimerycznym kompleksem receptorowym złożonym z przynajmniej dwóch różnych łańcuchów polipeptydowych (Colamonici i wsp., 1992; Colamonici i wsp., 1993; Platanias i wsp., 1993). Geny dla tych łańcuchów znajdują się na chromosomie 21, a ich białka są wyrażane na powierzchni większości komórek (Tan i wsp., 1973). Łańcuchy receptora początkowo określono jako alfa i beta ze względu na ich zdolność do bycia odpowiednio rozpoznawanymi przez przeciwciała monoklonalne IFNa R3 i IFNaRβ 1, odpowiednio. Ostatnio zmieniono ich nazwy na IFNAR1 dla podjednostki alfa i IFNAR2 dla podjednostki beta. W większości komórek IFNAR1 (łańcuch alfa, podjednostka Uze) (Uze i wsp., 1990) ma masę cząsteczkową 100-130 kDa, podczas gdy IFNAR2 (łańcuch beta, B_L, IFNa/β R) ma masę cząsteczkową 100 kDa. W pewnych typach komórek (linie komórkowe monocytów i prawidłowe komórki szpiku kostnego) zidentyfikowano alternatywny kompleks receptora, w którym podjednostka IFNAR2 (β₃) jest wyrażana jako skrócony receptor o masie cząsteczkowej wynoszącej 51 kDa. Podjednostki IFNAR1 oraz IFNAR2 β₃ i βι_ zostały sklonowane (Novick i wsp., 1994; Domanski i wsp., 1995). Podjednostki IFNAR2 β₃ i βι_ mają identyczne zewnątrzkomórkowe i transmembranowe domeny; jednak w domenie cytoplazmatycznej tylko 15 pierwszych aminokwasów jest identycznych. Sama podjednostka IFNAR2

PL 197 568 B1 może wiązać IFNa/β, podczas gdy podjednostka IFNAR1 nie jest zdolna do wiązania IFNa/β. Gdy sama podjednostka ludzkiego receptora IFNAR1 była transfekowana do mysich fibroblastów L-929, żaden ludzki IFNa, z wyjątkiem IRNa 8/IFNa B, nie był zdolny do wiązania się do komórek (Uze i wsp., 1990). Podjednostka ludzkiego IFNAR2, transfekowana do komórek L w nieobecności ludzkiego IFNAR1 wiąże ludzki IFNa2 z Kd wynoszącym około 0,45 nM. Gdy transfekowano ludzkie podjednostki IFNAR2 w obecności ludzkiej podjednostki IFNAR1, można było wykazywać wiązanie z wysokim powinowactwem o Kd wynoszącym 0,026-0,114 nM (Novick i wsp., 1994; Domanski i wsp., 1995). Szacuje się, że na większości komórek istnieje od 500 - 20000 miejsc wiązania IFN o wysokim powinowactwie i 2000 - 1000000 o niskim powinowactwie. Choć podjednostki kompleksu IFNAR1/2 (a/ p_slub α/βι_) wiążą IFNa z wysokim powinowactwem, tylko para a/e_Lwydaje się być funkcjonalnym sygnalizującym receptorem.

Transfekcja podjednostek IFNAR1 i IFNAR2 βι do mysich komórek L-929, a następnie inkubacja z IFNa2 indukuje stan przeciwwirusowy, inicjuje wewnątrzkomórkową fosforylację białek i powoduje aktywację wewnątrzkomórkowych kinaz (Jak1 i Tyk2) oraz czynników transkrypcyjnych (STAT 1,2 i 3) (Novick i wsp., 1994; Domanski i wsp., 1995). W odpowiednim doświadczeniu, transfekcja podjednostki β₃ IFNAR2 nie była zdolna do inicjacji podobnej odpowiedzi. Tak więc do działalności funkcjonalnej (odpowiedzi przeciwwirusowej) wymagana jest podjednostka βι IFNAR2 z maksymalną indukcją zachodzącą w połączeniu z podjednostką IFNAR1.

Oprócz związanych z powierzchnią błony komórkowej postaci IFNAR, zidentyfikowano rozpuszczalny IFNAR zarówno w moczu jak i surowicy ludzkiej (Novick i wsp., 1994; Novick i wsp., 1995; Novick i wsp., 1992; Lutfalla i wsp., 1995). Pozorna masa cząsteczkowa rozpuszczalnego IFNAR izolowanego z surowicy wynosi 55 kDa na SDS-PAGE, podczas gdy rozpuszczalny IFNAR z moczu ma pozorną masę cząsteczkową 40-45 kDa (p40). Transkrypty dla rozpuszczalnego IFNAR p40 są obecne na poziomie mRNA i obejmują nieomal całą zewnątrzkomórkową domenę podjednostki IFNAR2 z dwoma nowymi aminokwasami na końcu karboksylowym. Istnieje pięć potencjalnych miejsc glikozylacji na rozpuszczalnym receptorze IFNAR2. Wykazano, że rozpuszczalny IFNAR2 p40 wiąże się z IFNa2 i IFNji oraz że hamuje in vitro przeciwwirusową aktywność mieszaniny różnorodnych IFNa („leukocytów IFN) i poszczególnych IFN typu I (Novick i wsp., 1995). Wykazano, że zrekombinowana podjednostka IFNAR2 w białku fuzyjnym z Ig hamuje wiązanie szeregu IFN typu I (IFNaA, IFNa B, IFNa D, IFNji IFNa Con1 i IFNω) do komórek Daudi i podwójnie transfekowanych podjednostką a^_skomórek COS.

Niedawno zidentyfikowano szlaki sygnalizacji IFN typu I (Platanias i wsp., 1996; Yan i wsp., 1996; Qureshi i wsp., 1996; Duncan i wsp., 1996; Sharf i wsp., 1995; Yang i wsp., 1996). Uważa się, że początkowe zjawiska prowadzące do sygnalizacji zachodzą przez wiązanie IFNa/β/ω do podjednostki IFNAR2, a następnie asocjację podjednostki IFNAR1 do utworzenia kompleksu IFNAR1/2 (Platanias i wsp., 1994). Wiązanie IFNa/β/ω do kompleksu IRNAR1/2 powoduje aktywację dwóch kinaz Janus (Jak1 i Tyk1), które, jak się uważa, fosforylują specyficzną tyrozynę na podjednostkach IFNAR1 i IFNAR2. Po fosforylacji tych podjednostek cząsteczki STAT (STAT 1, 2 i 3) są fosforylowane, co powoduje dimeryzację kompleksów transkrypcyjnych STAT, a następnie jądrową lokalizację kompleksu transkrypcyjnego i aktywację specyficznych genów indukowanych przez IFN.

Farmakokinetykę i farmakodynamikę IFN typu I oceniano u ludzi (Alan i wsp., 1997; Fierlbeck i wsp., 1996; Salmon i wsp., 1996). Klirens IFNji jest dość szybki, a biodostępność IFNji niższa niż oczekiwana dla większości cytokin. Choć farmakodynamika IFNji była oceniana u ludzi, nie ustalono jasnej korelacji pomiędzy biodostępnością IFNji i skutecznością kliniczną. U prawidłowych zdrowych ochotników, podanie w bolusie pojedynczej dawki dożylnie (iv) (6 MIU) zrekombinowanego IFNji pochodzącego od CHO powodowało szybką fazę dystrybucji wynoszącą 5 minut i końcowy okres półtrwania wynoszący ok. 5 godzin (Alam i wsp., 1997). Po podaniu podskórnym (sc) lub domięśniowym (im) IFNji poziomy w surowicy są płaskie z zaledwie ok. 15% dawki dostępnymi ogólnoustrojowo. Farmakodynamika IFNj po podaniu iv, im lub sc (mierzona przez zmiany w aktywności syntetazy 2'5'-oligoadenylanowej (2'5'-AS) w PBMC) była podwyższona przez pierwsze 24 godziny i powoli spadała do linii podstawowej przez następne 4 dni. Wielkość i czas trwania efektu biologicznego były takie same niezależnie od drogi podawania.

Farmakokinetykę (PK) i farmakodynamikę (PD) IFNj produkowanego przez dwie różne firmy (REBIF®-Serono i AVONEX®-Biogen) badano po wstrzyknięciu im pojedynczej dawki 6 MIU zrekombinowanego IFNj (Salmon, 1996). Stężenia w surowicy IFNji i markera zastępczego IFNji neopteryny, śledzono w czasie. Oba preparaty IFNji wykazywały podobne profile PK ze szczytowymi poziomami

PL 197 568 B1

IFN3 w surowicy osiąganymi po ok. 12-15 godzinach, choć REBIF® dał niższe maksymalne poziomy. Poziomy IFNp pozostawały podwyższone dla zarówno REBIF® i AVONEX® przez przynajmniej pierwsze 36 godzin po wstrzyknięciu im, a następnie przy 48 godzinach spadały nieznacznie poniżej linii podstawowej. Poziomy neopteryny wykazywały bardzo podobny profil pomiędzy REBIF® i AVONEX® z maksymalnymi poziomami neopteryny uzyskiwanymi w ok. 44-50 godzin po wstrzyknięciu, pozostając podwyższone do 72 godzin po wstrzyknięciu, a następnie spadając stopniowo do poziomu podstawowego przy 144 godzinach.

Badania farmakokinetyczne IFNp dla wielokrotnych dawek przeprowadzono u ludzi chorych na czerniaka (Fierlbeck i wsp., 1996) z podawaniem IFNp drogą sc, trzy razy tygodniowo przy 3 MlU/dawkę w okresie 6 miesięcy. Markery farmakodynamiczne, syntetaza 2',5'-AS, β2 mikroglobulina, neopteryna i aktywacja komórek NK osiągnęły szczyt przy drugim wstrzyknięciu (dzień 4) i opadły w ciągu 28 dni, pozostając tylko nieznacznie podwyższone do sześciu miesięcy.

Podsumowując, klirens interferonów typu I u ludzi jest szybki. Prawdopodobne jest, że długo działający preparat interferonu spotęgowałby korzyści kliniczne.

Streszczenie wynalazku

Obecnie stwierdzono, że kompleks interferonu typu I złożony z rozpuszczalnego IFNAR w kompleksie z interferonami typu I (IFN) wykazuje polepszoną stabilność, zwiększoną siłę działania i przedłużoną farmakokinetykę in vivo w porównaniu z wolnym IFN w odniesieniu do aktywności przeciwwirusowej, przeciwnowotworowej i immunomodulującej.

Zatem przedmiotem wynalazku jest kompleks zawierający interferon (IFN) typu I oraz podjednostkę receptora ludzkiego interferonu α/β (IFNAR), która jest zdolna do wiązania z IFN typu I kompleksu, przy czym IFN typu I jest:

a) natywnym IFN typu I

b) fragmentem a), który ma aktywność biologiczną IFN typu I;

f) łańcuchem polipeptydowym natywnego ludzkiego IFNAR;

g) fragmentem f), który ma aktywność biologiczną IFNAR;

h) wariantem f) lub g), który ma przynajmniej 70% identyczność sekwencji z f) lub g) i który ma aktywność biologiczną IFNAR;

i) wariantem f) lub g), który jest kodowany przez sekwencję DNA, która hybrydyzuje z sekwencją komplementarną do natywnej sekwencji DNA kodującej f) lub g) w umiarkowanie ostrych warunkach i który ma aktywność biologiczną IFNAR; lub

j) solą lub funkcjonalną pochodną f), g), h) lub i), która ma aktywność biologiczną IFNAR. Korzystnie IFN typu I w kompleksie według wynalazku jest związany z IFNAR wiązaniem kowalencyjnym. Również korzystnie IFN typu I jest związany z IFNAR wiązaniem peptydowym. Korzystniej IFN typu I jest związany z IFNAR linkerem peptydowym. Najkorzystniej linkerem peptydowym jest (GGGGS)n, przy czym n=1-5. Ponadto korzystnie w kompleksie według wynalazku IFN typu I jest IFNa, IFN3 lub IFNω. Korzystniej IFN typu I jest IFN β. Również korzystnie IFNAR jest podjednostką beta receptora ludzkiego interferonu α/β (IFNAR2).

Kompleks według wynalazku wykazuje polepszoną stabilność, zwiększoną siłę działania i przedłużoną farmakokinetykę in vivo w porównaniu z wolnym IFN w odniesieniu do aktywności przeciwwirusowej, przeciwnowotworowej i modulującej układ odpornościowy.

Kompleks taki może składać się z zewnątrzkomórkowej domeny IFNAR2 w kombinacji z dowolnym interferonem typu I lub podjednostki IFNAR1 z IFNa.

W kompleksie według wynalazku IFNAR może dowolnie być połączony z innym białkiem, na przykład immunoglobuliną taką jak IgG. IFN, IFNa, IFN3 i IFNω, są rozumiane jako jeden z ponad 20 dotychczas zidentyfikowanych interferonów lub dowolnych innych interferonów typu I, które mogą być zidentyfikowane w przyszłości.

Niniejszym opisano zatem kompleks złożony z IFNa lub IFN3 kowalencyjnie związanego z IFNAR2 przez wiązanie chemiczne. Jednakże opisany tutaj kompleks może być złożony z IFNa lub

PL 197 568 B1

IFN3 niekowalencyjnie połączonego z IFNAR2 i w tym przypadku może on obejmować IFN typu I i IFNAR2 w dowolnym stosunku. Zatem formulacja IFN typu I z nadmiarem IFNAR2, jak opisano powyżej, jest także włączona do definicji „kompleksu stosowanej w niniejszym zgłoszeniu.

Opisany tutaj kompleks może składać się też z IFNa lub IFNp lub IFNω połączonego z IFNAR2 w rekombinowane białko fuzyjne, przy czym reszty IFN i IFNAR2 są dowolnie łączone przez elastyczną cząsteczkę linkera peptydowego. Linker ten może ulegać przecinaniu in vivo lub też nie.

Wynalazek dotyczy również kompozycji farmaceutycznej zawierającej farmaceutycznie dopuszczalny nośnik i kompleks według wynalazku. Ponadto przedmiotem wynalazku jest kompleks według wynalazku do zastosowania jako lek, korzystnie do zastosowania w terapii antywirusowej, antynowotworowej lub terapii modulującej układ odpornościowy, a korzystniej do zastosowania w przedłużaniu działania in vivo INF typu I u pacjenta. Zatem przedstawione zostały niniejszym sposoby stosowania kompleksów według wynalazku do przedłużania działania IFN in vivo, pożytecznego w leczeniu dowolnego stanu lub choroby, która może być leczona z użyciem IFN.

Wyżej wskazane dwa składniki mogą być też podawane oddzielnie by tworzyć kompleks in vivo. Tak więc kompleks IFNAR/IFN uzyskuje się przez równoczesne lub kolejne podanie IFNa lub IFNp i rozpuszczalnego IFNAR2. Zatem przedmiotem wynalazku jest lek obejmujący interferon (IFN) typu I i podjednostkę receptora ludzkiego interferonu α/β (IFNAR) do oddzielnego, równoczesnego lub kolejnego podawania pacjentowi w terapii antywirusowej, antynowotworowej albo terapii modulującej układ odpornościowy, przy czym IFN typu I jest:

a) natywnym IFN typu I;

b) fragmentem a), który wykazuje aktywność biologiczną IFN typu I.

Korzystnie interferon (IFN) typu I oraz INFAR są podawane oddzielne, a kompleks według wynalazku jest formowany in vivo. Korzystniej IFN jest IFNa, IFNp lub IFNω, a najkorzystniej IFN jest IFNp. Również korzystnie INFAR jest podjednostką beta receptora ludzkiego interferonu α/β (IFNAR2).

Przedmiotem wynalazku jest też zastosowanie interferonu (IFN) typu I i podjednostki receptora ludzkiego interferonu α/β (IFNAR), która jest zdolna do wiązania IFN typu I, do wytwarzania skojarzonego preparatu do symultanicznego, kolejnego lub oddzielnego podawania, do przedłużania działania in vivo interferonu (IFN) typu I, przy czym IFN typu I jest:

a) natywnym ludzkim IFN typu I;

b) fragmentem a), który ma aktywność biologiczną IFN typu I;

e) solą lub funkcjonalną pochodną a), b), c) lub d), która ma aktywność biologiczną IFN typu I; i IFNAR jest

f) łańcuchem polipeptydowym natywnego ludzkiego IFNAR;

g) fragmentem f), który ma aktywność biologiczną IFNAR;

j) solą lub funkcjonalną pochodną f), g), h) lub i), która ma aktywność biologiczną IFNAR.

Co więcej, IFNAR może być podany bez równoczesnego podawania IFN tak, że kompleks może być tworzony in vivo z endogennym krążącym IFN, w ten sposób wzmagając działanie endogennego IFN. Tak więc przedmiotem wynalazku jest też zastosowanie ludzkiego receptora interferonu α/ β (IFNAR) do wytwarzania leku do wzmagania efektów biologicznych interferonu (IFN) typu I, przy czym IFNAR jest:

a) łańcuchem polipeptydowym natywnego ludzkiego IFNAR;

b) fragmentem a), który ma aktywność biologiczną IFNAR;

c) wariantem a) lub b), który ma przynajmniej 70% identyczność sekwencji z a) lub b) i który ma aktywność biologiczną IFNAR;

PL 197 568 B1

d) wariantem a) lub b), który jest kodowany przez sekwencję DNA, która hybrydyzuje z sekwencją komplementarną do natywnej sekwencji DNA kodującej a) lub b) w umiarkowanie ostrych warunkach i który ma aktywność biologiczną IFNAR; lub

e) solą lub funkcjonalną pochodną a), b), c) lub d), która ma aktywność biologiczną IFNAR. Ponadto przedmiotem wynalazku jest zastosowanie kompleksu według wynalazku do wytwarzania leku do zastosowania w przedłużaniu działania in vivo IFN typu I.

Wynalazek dalej dotyczy cząsteczki DNA kodującej białko fuzyjne według wynalazku, wektora zawierającego taką cząsteczkę DNA, oraz komórki gospodarza transformowanej takimi wektorami w sposób, który pozwala na ekspresję białka fuzyjnego. Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania białka fuzyjnego według wynalazku obejmujący hodowanie komórki gospodarza według wynalazku i odzyskiwanie wyrażanego przezeń białka fuzyjnego.

Rozwiązania według wynalazku umożliwiają też stosowanie IFNAR jako stabilizatora w preparatach IFN. Wolny IFNp ma skłonność do oligomeryzacji. Procesowi temu zapobiega kompleksowanie z IFNAR, a szczególnie IFNAR2. Obecnie preparaty rekombinowanego IFNp muszą mieć kwaśny pH, co może powodować pewne lokalne podrażnienie przy ich podawaniu. Niekwaśne preparaty mogą być przygotowane jeśli IFNAR jest stosowany jako stabilizator. Tak więc przedmiotem wynalazku jest sposób przedłużania okresu trwałości interferonu typu I obejmujący przechowywanie interferonu w postaci kompleksu według wynalazku.

Krótki opis figur

Niniejszy wynalazek będzie lepiej zrozumiany w połączeniu z następującymi figurami, na których:

Figura 1 jest wykresem przedstawiającym zależną od dawki przeciwwirusową aktywność sIFNAR2 lub IFNAR2Ig (składającego się z zewnątrzkomórkowej domeny hIFNAR w fuzji z zawiasem ludzkiej IgG1, domenami CH2 i CH3) w obecności IFN3.

Figura 2 jest wykresem przedstawiającym przeciwwirusową aktywność sIFNAR2 i IFNp przy suboptymalnej dawce IFN3. Synergistyczne działanie przeciwwirusowe IFN3 i sIFNAR2 po jednej godzinie inkubacji wstępnej jest wykazane przy dawce pośredniej IFN3.

Figura 3 jest wykresem przedstawiającym przeciwwirusową aktywność sIFNAR2 i subefektywnej dawki IFNp (0,95 lU/ml) jako funkcję czasu inkubacji wstępnej. Komórki WISH eksponowano na IFN3 (0,95 lU/ml, dawka subefektywna) i sIFNAR2, po inkubacji wstępnej przez wskazane okresy czasu. Obserwowano Synergistyczne działanie przeciwwirusowe dopiero po 4 godzinach inkubacji wstępnej. Aktywność przeciwwirusową mierzono przez konwersję MIT 48 godzin po prowokacji VSV. Przy poziomach subterapeutycznych IFNp tworzenie kompleksu IFNAR2/IFN daje zwiększoną aktywność przeciwwirusową.

Figura 4 jest wykresem przedstawiającym zwiększoną przeciwwirusową aktywność ludzkiego IFN3 po inkubacji wstępnej z sIFNAR2.

Figura 5 jest wykresem pokazującym, że zwiększona przeciwwirusowa aktywność ludzkiego IFN3 asocjowanego z sIFNAR jest specyficzna wobec IFNAR2, ale nie innych białek.

Figura 6 jest wykresem przedstawiającym farmakokinetyczne porównanie ludzkiego IFN3 i kompleksu IFN3/IFNAR2 u myszy określone za pomocą ELISA.

Figura 7 jest wykresem przedstawiającym farmakokinetyczne porównanie ludzkiego IFN3 i kompleksu IFN3/IFNAR2 u myszy określone za pomocą biooznaczenia.

Figura 8 jest wykresem przedstawiającym farmakokinetyczne porównanie ludzkiego IFNa i kompleksu IFNa/IFNAR2 u myszy określone za pomocą ELISA.

Figura 9 jest wykresem przedstawiającym farmakokinetyczne porównanie ludzkiego IFNa i kompleksu IFNa/IFNAR2 u myszy określone za pomocą biooznaczenia.

Figura 10 przedstawia sekwencję aminokwasową białka fuzyjnego n=2 IFNAR2/IFN3 (ID. SEKW. NR:14). Linker (GGGGS)2 (reszty 240-249 ID. SEKW. NR:14) podkreślono.

Figura 11 przedstawia żel z analizy restrykcyjnej pCMV-IFNAR2/IFN3; 10% PAG, ścieżki 3-7; trawienie BamHI/XhoI; ścieżka 2: trawienie SmaI/XhoI; ścieżka 1: marker trawienia pBR322 MspI; ścieżka 2: pCMV-IFNAR2/IFN3, 0GS; ścieżka 3: 1GS; ścieżka 4: 2GS; ścieżka 5: 3GS; ścieżka 6: 4GS; ścieżka 7: 5GS; Ścieżka 8: marker trawienia HaeIII RFDNA φX174.

Figura 12 jest mapą restrykcyjną endonukleazy wektora ekspresyjnego IFNAR2/IFN3.

Figura 13 przedstawia wyniki analizy typu Western białka fuzyjnego IFNAR2/IFN3. Ścieżka 1, konstrukt IFNAR2/IFN3 niezawierający linkera; ścieżka 2, konstrukt IFNAR2/IFN3 zawierający jeden linker Gly₄Ser (ID. SEKW. NR: 1); ścieżka 3, konstrukt IFNAR2/IFN3 zawierający dwa linkery Gly₄Ser (ID. SEKW. NR: 1); ścieżka 4, konstrukt IFNAR2/IFN3 zawierający trzy linkery Gly₄Ser (ID. SEKW.

PL 197 568 B1

NR: 1); ścieżka 5, konstrukt IFNAR2/IFN3 zawierający cztery linkery Gly₄Ser (ID. SEKW. NR: 1); ścieżka 6, konstrukt IFNAR2/IFN3 zawierający pięć linkerów Gly₄Ser (ID. SEKW. NR: 1).

Figura 14 jest wykresem przedstawiającym przeciwwirusową aktywność cząsteczek interfuzji wyrażanych w supernatantach komórek CHO i normalizowanych wobec standardowej aktywności IFN3.

Figury 15A-B są wykresami przedstawiającym farmakokinetykę IFNp podanego po dożylnym wstrzyknięciu IFNAR2. IFN3 podano sam, jako kompleks IFNAR lub natychmiast po oddzielnym I.V. wstrzyknięciu sIFNAR2. Oceniono okres półtrwania we wskazanych czasach po zastrzyku za pomocą ELISA specyficznej w stosunku do IFNp (Figura 15A) i za pomocą bioaktywności w przeciwwirusowym oznaczeniu WISH (Figura 15B).

Figura 16 jest wykresem przedstawiającym ochronny efekt w przeliczeniu na procent cytotoksyczności różnych dawek kompleksu IFN „Universal (ludzki IFNaA/D) z sIFNAR2; w porównaniu z podawanym w pojedynkę IFN Universal lub kontrolą.

Figura 17 jest wykresem przedstawiającym stężenie w surowicy IFNp w funkcji czasu po pojedynczym wstrzyknięciu dożylnym bolusa interfuzji GS5 albo samego IFN β.

Szczegółowy opis wynalazku

Kompleks IFNAR/IFN według wynalazku i umożliwiająca technologia wymagana do wytwarzania tego kompleksu jest szczegółowo opisana poniżej. Dla większości wyników wybrano IFNp jako nieograniczający przykład.

Białka fuzyjne. C-końcowy koniec IFNAR2 lub dowolna jego podsekwencja wiążąca interferon jest połączona z N-końcową częścią IFNp lub jego biologicznie czynnymi fragmentami, jako że to wymaga najkrótszej odległości do pokonania między dwiema cząsteczkami. Odwrotne konstrukty mogą być też stosowane, w których C-końcowy koniec IFN3 lub jego fragmenty są połączone do N-końcowych sekwencji IFNAR2 lub jego podsekwencji.

Z molekularnych modeli kompleksu IFNAR/IFN3 oszacowana odległość między ograniczoną C-końcową zewnątrzkomórkową domeną IFNAR2 i N-końcem IFNp w aktywnym modelu kompleksu wynosi ok. 80 Angstremów. Aby skonstruować kompleks IFNAR2/IFN3, który pozwala na utrzymanie kompleksu elastyczny linker peptydowy, na przykład powtórzenia Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (GGGGS) (ID. SEKW. NR: 1), może być stosowany. Alternatywnie, linker może być elastyczny i stanowić cel dla cięcia proteolitycznego przez proteazy surowicy, proteazy związane z błoną i/lub proteazy komórkowe. Jako przykład miejsca cięcia przez proteazę, skonstruowana fuzja kompleksu IRNAR2/IFN3 może mieć miejsce cięcia czynnika Xa. Czynnik Xa tnie protrombinę w dwóch miejscach Arg273 i Arg322, i ma tetrapeptydowy sygnał rozpoznania Ile-Glu-Glu-Arg (ID. SEKW. NR: 2) (Nagai i wsp., 1984). Czynnik Xa jako taki jest generowany z obu szlaków wewnętrznego i zewnętrznego poprzez różne aktywatory, w tym czynnik tkankowy, który jest uwalniany przez naczyniowe komórki śródbłonka, makrofagi i komórki obojętnochłonne.

Czynnik Xa może działać na białko fuzyjne sIFNAR2/IFN3 zawierające sekwencję rozpoznawaną przez czynnik Xa w domenie linkera i uwalniać kompleks IFNAR2/IFN tak, że kompleks może działać jako kompleks niekowalencyjny.

Alternatywnie fuzja kompleksu IFNAR2/IFN3 może mieć miejsce cięcia proteazy błony komórkowej (np. hepsyny). Hepsyna jest 51 kDa zymogenem proteazy serynowej związanym z błoną, który jest wyrażanym na wysokim poziomie w tkance wątroby, ale jest też znajdowany w nerce, trzustce, płucu, tarczycy, przysadce i jądrach. Jedna sekwencja, o której wiadomo, że jest cięta przez hepsynę to wiązanie peptydowe Arg152-Ile153 w czynniku VII. Hepsynę implikowano w tworzeniu trombiny na komórkach nowotworów (Kazam i wsp., 1995).

Hepsyna może działać na białko fuzyjne sIFNAR2/IFN3 zawierające sekwencję rozpoznawaną przez hepsynę w domenie linkera i uwalniać kompleks IFNAR2/IFN tak, że kompleks może działać w sposób niekowalencyjny.

Alternatywna fuzja kompleksu IFNAR2/IFN3 może mieć miejsce cięcia przez wewnątrzkomórkową proteazę. Różne proteazy są uwalniane przez komórki w trakcie nekrozy lub apoptozy. Wśród nich są kaspazy (proteazy podobne do enzymu konwertującego interleukinę 1 beta), metaloproteinazy, proteazy lizosomalne (np. katepsyna B) i elastaza. Elastaza jest uwalniana przez granulocyty w czasie stanów chorobowych (np. posocznicy) i ma szeroką specyficzność w stosunku do cięcia aminokwasów podobnie jak trypsyna (Ertel i wsp., 1994; Szilagyi i wsp. 1995).

Wewnątrzkomórkowe proteazy mogą działać na białko fuzyjne IFNAR2/IFN zawierające miejsce rozpoznawane przez wewnątrzkomórkową proteazę w domenie linkera i uwalniać kompleks IFNAR2/IFN tak, że kompleks może działać jako kompleks niekowalencyjny.

PL 197 568 B1

Kilka przykładów konstruktów białek fuzyjnych, w których C-koniec sIFNAR2 (P40-ESEFS) jest połączony do N-końca IFNp (MSY) przez elastyczne linkery zostało w istocie przygotowanych. Przykłady linkerów peptydowych są następujące: ESEFS (GGGGS)nMSY, w którym n = 5 (ID. SEKW. NR: 3), 4 (ID. SEKW. NR: 4), 3 (ID. SEKW. NR: 5), 2 (ID. SEKW. NR: 6) lub 1 (ID. SEKW. NR: 7); ESEFS (hCG-CTP)MSY, w którym hCG-CTP = SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (ID. SEKW. NR: 8); ESEFS (EFM)nMSY, w którym n = 5 (ID. SEKW. NR: 9), 4 (ID. SEKW. NR: 10) lub 3 (ID. SEKW. NR: 11); ESEFS (EFGAGLVLGGQFM)nMSY, w którym n = 1 (ID. SEKW. NR: 12), lub 2 (ID. SEKW. NR: 13) oraz dowolne inne odpowiednie linkery, który rozciągają się na odległość między miejscem wiązania IFNAR2 i IFN3 w modelu kompleksu, a które nie tworzą immunogennego epitopu między resztami interferonu i receptora. Korzystnie te linkery mają do około 30 aminokwasów długości.

Kompleks kowalencyjny. Jednym przykładem generacji chemicznych sieciowanych cząsteczek jest zmodyfikowanie IFNAR2 w specyficznym miejscu przez reakcję z biodegradowalnym linkerem, takim jak glikol polietylenowy (PEG) z cysteinami obecnymi lub wprowadzonymi do IFNAR2 stosując albo podstawienie aminokwasu takie jak Ser210 na Cys lub Asn89 na Cys (mutageneza ukierunkowana). Możliwe było skonstruowanie następujących konstruktów: IFNAR(S210C)-PEGn-IFN3 (Cys17), w którym n = 2000, 5000 lub 10000 Daltonów lub IFNAR(N89C)-PEGn-IFN3 (Cys17).

Tworzenie kowalencyjnych mostków disiarczkowych między Cys dwóch różnych (dowolnie skonstruowanych) reszt jest również możliwe w realizacji niniejszego wynalazku.

Kompleks niekowalencyjny. Ludzki IFNAR2 jest kompleksowany z IFNp w warunkach, które maksymalizują generację aktywnego kompleksu. Jak wykazano w przykładach, in vitro optymalny stosunek 2,5 ng IFNAR2 do 1 międzynarodowej jednostki (IU) IFNP jest wymagany, aby uzyskać maksymalnie czynny kompleks. Optymalny stosunek IRNAR2 do IFNp, który maksymalizuje generację aktywnego kompleksu dla aktywności in vivo, jest obecnie określany, choć wydaje się, że optymalny stosunek będzie zależał od stężenia IFN3. Tak więc, na przykład, optymalny stosunek IFNAR2:IFN3 we wzmaganiu aktywności przeciwnowotworowej w stężeniu 2 x 10⁴ lU/mysz/dzień IFNp wynosił 2,5 mg IFNAR2 na pg IFNp, podczas gdy przy stężeniu 5 x 10⁴ lU/mysz/dzień IFNp, 0,3 ng IFNAR2 na pg IFN3 było optymalne. Te same proporcje stosowane do maksymalizacji generacji aktywnego kompleksu in vitro dały przedłużoną farmakokinetykę IFN in vivo.

Korzystnie IFNAR2 i IFNp stosowane do generacji kompleksu są cząsteczkami rekombinowanymi. W oznaczeniach przeciwwirusowych in vitro kompleks interferon/receptor wykazywał wzmożoną aktywność w porównaniu z aktywnością samego IFN3. Stałe stężenie IFNp mieszano z różnymi stężeniami rekombinowanego sIFNAR2 i tę mieszaninę (kompleks IFNAR2/IFN) dodano do komórek WISH (ludzkich komórek owodni). Te komórki WISH następnie podawano testowi prowokacji wirusem pryszczycy (VSV, ang. vesicular stomatitis virus) i przeciwwirusową aktywność IFN monitorowano jako zwiększenie stopnia przeżywania komórek po 48-godzinnej inkubacji. W każdym z tych eksperymentów dodanie IFNAR2 do stałej ilości IFNp prowadziło do zależnego od dawki zwiększenia przeżywalności komórek po prowokacji VSV przy optymalnym stosunku IFNAR2 do IFN. Te wyniki dowodzą, że kompleks IFNAR2 i IFNp wykazuje zwiększoną aktywność w porównaniu z wolnym IFNp w oznaczeniu przeciwwirusowym. Praktyczne implikacje tego są takie, że kompleks IFNAR2/IFN3 ma większą siłę i zwiększoną aktywność w porównaniu z wolnym IFN dla szeregu wskazań terapeutycznych, w których sam IFN jest aktywny. Te wskazania obejmują te, w których wolne IFN wykazały pewną terapeutyczną aktywność, taką jak przeciwwirusowa, przeciwnowotworowa i immunomodulująca. Oczekuje się, że kompleks IFNAR2/IFN ze względu na swoją większą siłę, wzmożoną aktywność i/lub polepszoną farmakokinetykę (tzn. okres półtrwania) będzie bardziej skuteczny w leczeniu zaburzeń wirusowych, onkologicznych i immunologicznych.

Gdy jest podawany in vivo, kompleks receptora interferonu wzmaga biodostępność, farmakokinetykę i/lub farmakodynamikę IFN, w ten sposób wzmagając przeciwwirusowe, przeciwnowotworowe i immunomodulujące właściwości IFN.

Zwiększona biodostępność IFN, w której pośredniczy kompleks może być uzyskana albo przez wstępną formację niekowalencyjnego kompleksu IFN/IFNAR, wspólne podanie wolnego IFN z IFNAR, przez podanie kowalencyjnego kompleksu IFN/IFNAR lub przez podanie białka fuzyjnego IFNAR/IFN.

W dalszej postaci wykonania, taka wzmożona biodostępność może też być uzyskana przez podanie samego składnika IFNAR bez dodania IFN. IFNAR wytworzy „kompleks in vivo z endogennym IFN i w ten sposób zwiększy biodostępność, farmakokinetykę i/lub farmakodynamikę endogennego IFN. Jest to szczególnie pożyteczne w przypadku terapii pacjentów mających chorobę lub stan, które naturalnie powodują indukcję natywnego IFN. W takich przypadkach IFN jest już w obiegu dla

PL 197 568 B1 swoich zamierzonych naturalnych efektów zwalczania takich chorób lub stanów, a dodany IFNAR zwiększy działanie natywnego IFN.

Korzystne cząsteczki do stosowania w kompleksach niniejszego wynalazku mają sekwencję natywnego IFN i IFNAR. Natywna sekwencja to sekwencja naturalnie występującego ludzkiego IFN lub IFNAR. Takie sekwencje są znane i mogą być łatwo znalezione w literaturze. Naturalnie występujące alleliczne warianty są też uważane za sekwencje natywne.

Niniejszy wynalazek także dotyczy analogów powyższego kompleksu IFNAR2/IFN według wynalazku, które to analogi zachowują zasadniczo tę samą aktywność biologiczną kompleksu mającego zasadniczo sekwencje natywnego IFNAR2 i IFN. Takimi analogami mogą być analogi, w których do około 30 reszt aminokwasowych może być usuniętych, dodanych lub podstawionych przez inne w ugrupowaniach IFNAR2 i/lub IFN kompleksu, jednakże modyfikacje tego rodzaju nie zmieniają znacząco aktywności biologicznej hybrydowego analogu białka w porównaniu z samym kompleksem. Różne analogi mogą najbardziej różnić się od siebie i od podstawowej cząsteczki kompleksu (tej z zasadniczo tylko naturalnie występującymi sekwencjami IFNAR2 i IFN) w miejscu peptydu linkerowego, który łączy dwie reszty w kompleksie. Jak wskazano powyżej, taki linker ma korzystnie do 30 aminokwasów długości i służy do rozdzielenia reszt IFNAR2 i IFN od siebie w kompleksie. W odniesieniu do linkera, należy uważać przy doborze jego sekwencji (a zatem także testować biologicznie w odpowiednich standardowych oznaczeniach każdy taki analog), tak, aby nie spowodował on na przykład nieprawidłowego zwinięcia kompleksu, co mogłoby doprowadzić do jego nieaktywności lub braku wzmożonej aktywności, lub spowodowałoby, że analog kompleksu stałby się immunogenny, co doprowadziłoby do tworzenia przeciwciał przeciw niemu u pacjenta, który ma być leczony, a tym samym analog byłby nieskuteczny przynajmniej w leczeniu średnio lub długoterminowym. W odniesieniu do powyższych analogów kompleksu według wynalazku, te analogi są takimi, w których jedna lub więcej i aż do około 30 aminokwasów podstawowego kompleksu według wynalazku jest zastąpionych przez różne reszty aminokwasowe lub są usunięte, lub jeden lub więcej aminokwasów, do około 30, są dodawane do oryginalnej sekwencji kompleksu według wynalazku (tej z zasadniczo tylko natywnymi sekwencjami IFNAR2/IFN) bez znacznej zmiany aktywności powstałych produktów, w porównaniu z podstawowym kompleksem według wynalazku. Te analogi są przygotowywane za pomocą znanej syntezy i/lub za pomocą znanych technik mutagenezy ukierunkowanej lub dowolnej innej odpowiedniej do tego techniki.

Dowolny taki analog korzystnie ma sekwencję aminokwasową wystarczająco odtwarzającą sekwencję podstawowego kompleksu IFNAR2/IFN, tak by mieć zasadniczo podobną do niego aktywność. Tak więc można ustalić czy dowolny dany analog ma zasadniczo tę samą aktywność i/lub stabilność jak podstawowy kompleks za pomocą rutynowych eksperymentów, obejmujących poddanie każdego takiego analogu testom aktywności biologicznej i stabilności przedstawionych w przykładach 2-7 poniżej.

Analogi kompleksu, które mogą być stosowane zgodnie z niniejszym wynalazkiem lub kodujące je sekwencje kwasu nukleinowego, obejmują skończony zestaw zasadniczo odpowiadających sobie sekwencji, takich jak peptydy substytucyjne lub polinukleotydy, które mogą być rutynowo otrzymane przez osobę o przeciętnych umiejętnościach w dziedzinie bez nadmiernych eksperymentów, w oparciu o ujawnienia i wytyczne tu prezentowane. Szczegółowy opis chemii i budowy białek przedstawiono w Schulz i wsp., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, Nowy Jork (1978); i Creighton, T.E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co, San Francisco (1983), które są tu włączone na drodze odniesienia. Zagadnienia związane z podstawieniem sekwencji nukleotydowej, takie jak preferencje kodonów, przedstawiono Ausubel i wsp. (1987, 1992), par. A.1.I-A 1.24 i Sambrook i wsp. (1987, 1992) par. 6.3 i 6.4 w Dodatkach C i D.

Korzystnymi zmianami dla analogów są takie, które określa się jako „konserwatywne podstawienia. Konserwatywne podstawienia aminokwasów w kompleksie o zasadniczo naturalnie występujących sekwencjach IFNAR2 i IFN mogą obejmować synonimowe aminokwasy w obrębie grupy, które mają dostatecznie podobne właściwości fizykochemiczne, że podstawienie między członkami tej grupy zachowa biologiczną funkcję cząsteczki (Grantham, 1974). Jest jasne, że insercje i delecje aminokwasów mogą też być przeprowadzone w powyższych sekwencjach bez zmiany ich funkcji, szczególnie jeśli insercje lub delecje dotyczą kilku aminokwasów np. poniżej trzydziestu, korzystnie poniżej dziesięciu i nie usuwają, ani nie zastępują aminokwasów, które są istotne dla funkcjonalnej konformacji np. reszt cysteiny (Anfinsen, 1973). Analogi otrzymywane przez takie delecje i/lub insercje wchodzą w zakres niniejszego wynalazku.

PL 197 568 B1

Korzystnie synonimowe grupy aminokwasów to te zdefiniowane w tabeli I. Bardziej korzystnie synonimowe grupy aminokwasów są zdefiniowane w tabeli II, a najkorzystniejsze synonimowe grupy aminokwasów są określone w tabeli III.

T a b e l a I. Korzystne grupy synonimowych aminokwasów

Aminokwas	Grupa synonimowa
Ser	Ser, Thr, Gly, Asn
Arg	Arg, Gln, Lys, Glu, His
Leu	Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu
Pro	Gly, Ala, Thr, Pro
Thr	Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr
Ala	Gly, Thr, Pro, Ala
Val	Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val
Gly	Ala, Thr, Pro, Ser, Gly
Ile	Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile
Phe	Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe
Tyr	Trp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr
Cys	Ser, Thr, Cys
His	Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His
Gln	Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln
Asn	Gln, Asp, Ser, Asn
Lys	Glu, Gln, His, Arg, Lys
Asp	Glu, Asn, Asp
Glu	Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg , Glu
Met	Phe, Ile, Val, Leu, Met
Trp	Trp

T a b e l a II. Bardziej korzystne grupy synonimowych aminokwasów

Aminokwas	Grupa synonimowa
1	2
Ser	Ser
Arg	His, Lys, Arg
Leu	Leu, Ile, Phe, Met
Pro	Ala, Pro
Thr	Thr
Ala	Pro, Ala
Val	Val, Met, Ile
Gly	Gly
Ile	Ile, Met, Phe, Val, Leu
Phe	Met, Tyr, Ile, Leu, Phe
Tyr	Phe, Tyr

PL 197 568 B1 cd. tabeli II

1	2
Cys	Cys, Ser
His	His, Gln, Arg
Gln	Glu, Gln, His
Asn	Asp, Asn
Lys	Lys, Arg
Asp	Asp, Asn
Glu	Glu, Gln
Met	Met, Phe, Ile, Val, Leu
Trp	Trp

T a b e l a III. Najbardziej korzystne grupy synonimowych aminokwasów

Aminokwas	Grupa synonimowa
Ser	Ser
Arg	Arg
Leu	Leu, Ile, Met
Pro	Pro
Thr	Thr
Ala	Ala
Val	Val
Gly	Gly
Ile	Ile, Met, Leu
Phe	Phe
Tyr	Tyr
Cys	Cys, Ser
His	His
Gln	Gln
Asn	Asn
Lys	Lys
Asp	Glu
Glu	Glu
Met	Met, Ile, Leu
Trp	Met

Przykłady wytwarzania podstawień aminokwasowych w białkach, które można użyć do otrzymywania analogów kompleksu IFNAR2/IFN do zastosowania w rozwiązaniach według wynalazku obejmują dowolne znane kroki metodyczne, takie jak przedstawione w patencie USA RE 33653; 4959314; 4588585 i 4737462 dla Mark i wsp.; 5116943 dla Koths i wsp.; 4965195 dla Namen i wsp.; i 5017691 dla Lee i wsp. oraz białka z podstawieniami lizynowymi przedstawione w patencie USA 4904584 (Shaw i wsp.).

W innym korzystnym wykonaniu tego wynalazku, dowolny analog kompleksu do zastosowania w rozwiązaniach według wynalazku ma sekwencję aminokwasową zasadniczo odpowiadającą se12

PL 197 568 B1 kwencji powyżej wspomnianego podstawowego kompleksu według wynalazku. Termin „zasadniczo odpowiadający ma obejmować analogi z niewielkimi zmianami w sekwencji podstawowego kompleksu, które nie wpływają na jego podstawową charakterystykę, a w szczególności bierze się tu pod uwagę jego zdolność do hamowania namnażania komórek nowotworowych lub promowania transplantacji szpiku kostnego. Rodzajami zmian, które, jak się uważa, mieszczą się w określeniu „zasadniczo odpowiadające są te, które powstają w wyniku zastosowania technik konwencjonalnej mutagenezy DNA kodującego kompleks według wynalazku, prowadząc w rezultacie do powstania kilku niewielkich modyfikacji, i badań przesiewowych pod kątem pożądanej aktywności w sposób omówiony powyżej.

Korzystne część IFNAR2 kompleksu ma sekwencję rdzeniową, która jest taka sama, jak sekwencja natywna lub jej czynny biologicznie fragment albo jej wariant o sekwencji aminokwasowej mającej co najmniej 70% identyczność z natywną sekwencją aminokwasową, i zachowuje jej biologiczną aktywność. Korzystniej sekwencja taka wykazuje co najmniej 85% identyczność, co najmniej 90% identyczność lub najkorzystniej, co najmniej 95% identyczność z sekwencją natywną.

W odniesieniu do części IFN kompleksu, sekwencją rdzeniową, którą można zastosować jest sekwencja natywna lub jej czynny biologicznie fragment, albo jej wariant o sekwencji aminokwasowej mającej wobec niej co najmniej 70% identyczność, korzystniej, co najmniej 85% identyczność lub 90% identyczność, a najkorzystniej, co najmniej 95% identyczność. Takie analogi muszą zachowywać aktywność biologiczną natywnej sekwencji IFN lub jej fragmentu, albo mieć aktywność antagonistyczną, jak opisano poniżej.

Stosowany tu termin „identyczność sekwencji oznacza, że sekwencje porównuje się jak następuje. Sekwencje porównuje się wzajemnie przy zastosowaniu wersji 9 GAP Genetic Computing Group (program przyrównania globalnego), przy zastosowaniu macierzy domyślnej (BLOSUM62) (wartości -4 do +11) z karą za powstanie przerwy wynoszącą -12 (dla pierwszej luki przerwy) i karą za rozszerzenie przerwy wynoszącą -4 (za każdą dodatkową kolejną lukę przerwy). Po dokonaniu porównania procent identyczności oblicza się wyrażając liczbę pasujących pozycji jako udział procentowy liczby aminokwasów w badanej sekwencji.

Analogi znajdujące zastosowanie w rozwiązaniach według wynalazku można również określić zgodnie z następującą procedurą. Jeśli chodzi o część IFNAR kompleksu, bądź część IFN kompleksu, DNA natywnej sekwencji jest znane w stanie techniki i można je znaleźć w literaturze cytowanej w części niniejszego opisu przedstawiającej stan techniki lub może on być bez trudu znaleziony przez specjalistów dziedzinie. Polipeptydy kodowane przez dowolne kwasy nukleinowe, takie jak DNA lub RNA, które hybrydyzują z sekwencją komplementarną do natywnego DNA lub RNA w ostrych lub średnio ostrych warunkach hybrydyzacji, tak długo, jak kodowany polipeptyd zachowuje aktywność biologiczną natywnej sekwencji lub, w przypadku IFN, zachowuje aktywność biologiczną bądź posiada aktywność antagonistyczną, są również uważane za odpowiednie do wykorzystania w rozwiązaniach według wynalazku.

Ostrość warunków jest funkcją temperatury stosowanej w doświadczeniach hybrydyzacyjnych, molarności kationów jednowartościowych i procentowej zawartości formamidu w roztworze hybrydyzacyjnym. W celu określenia stopnia ostrości stosowanych w danym zestawie warunków, można najpierw zastosować równanie Meinkoth et al. (1984) do określenia stabilności hybryd o 100% identyczności, wyrażanej jako temperatura topnienia Tm hybrydy DNA-DNA:

Tm=81,5°C + 16,6 (lo_SM) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% form) - 500/L, przy czym M jest molarnością kationów jednowartościowych, %GC jest składem procentowym nukleotydów G i C w DNA, % form jest stężeniem procentowym formamidu w roztworze hybrydyzacyjnym, a L jest długością hybrydy w parach zasad. Przy obniżeniu Tm o każdy 1°C w stosunku do wartości obliczonej dla 100% identyczności, dopuszczalny jest około 1% wzrost udziału niekomplementarnych zasad. A zatem, jeżeli Tm stosowana w dowolnym doświadczeniu hybrydyzacyjnym przy określonych stężeniach soli i formamidu jest o 10°C niższa od Tm obliczonej dla 100% hybrydy zgodnie z równaniem Meinkoth, hybrydyzacja nastąpi nawet wówczas, jeżeli niedopasowanie zasad wyniesie do około 10%.

Stosowane tu ostre warunki hybrydyzacji są takimi, które tolerują do około 15% różnic w sekwencji, podczas gdy średnio ostre warunku są takimi, jak te, które tolerują do 20% zróżnicowania sekwencji. Nie stanowiąc ograniczenia, przykłady bardzo ostrych (12-15°C poniżej obliczonej wartości Tm hybrydy) i średnich (15-20°C poniżej obliczonej wartości Tm hybrydy) warunków stosują jako roztwór do płukania 2 x SSC (standardowy cytrynianu sodu) i 0,5% SDS w odpowiedniej temperaturze poniżej obliczonej Tm dla hybrydy. Ostateczna ostrość warunków wynika głównie z warunków płukania, szczególnie, jeżeli stosowane warunki hybrydyzacji są takimi, które umożliwiają tworzenie się

PL 197 568 B1 obok stabilnych hybryd mniej stabilnych hybryd. Warunki płukania przy dużej ostrości usuwają następnie mniej stabilne hybrydy. Typowe warunki hybrydyzacji, które można zastosować jako opisane powyżej warunki płukania przy dużej do średniej ostrości to hybrydyzacja w roztworze 6 x SSC (lub 6 x SSPE), 5 x odczynnik Denhardta, 0,5% SDS, 100 ng/ml zdenaturowanego, pofragmentowanego DNA ze spermy łososia w temperaturze od około 20°C do 25°C poniżej Tm. Jeżeli stosuje się sondy mieszane, korzystne jest stosowanie zamiast SSC chlorku tetrametyloamonowego (TMAC) (Asubel, 1987, 1998).

Stosowany tu termin „funkcjonalne pochodne obejmuje pochodne, które można wytworzyć z grup funkcyjnych, które znajdują się jako łańcuchy boczne w resztach lub jako grupy N- albo -C końcowe, sposobami znanymi w tej dziedzinie i są objęte wynalazkiem tak długo, jak pozostają farmaceutycznie dopuszczalne, tj. nie niszczą aktywności biologicznej odpowiednich białek opisanego tu kompleksu i nie nadają właściwości toksycznych zawierającym je kompozycjom lub utworzonym z nich kompleksom. Pochodne mogą mieć reszty chemiczne, takie jak reszty węglowodanowe lub fosforanowe, przy założeniu, że taka frakcja ma taką samą aktywność biologiczną i pozostaje farmaceutycznie dopuszczalna.

Przykładowo, pochodne mogą obejmować estry alifatyczne grup karboksylowych, amidy grup karboksylowych utworzone w reakcji z amoniakiem lub z pierwszorzędowymi lub drugorzędowymi aminami, pochodne N-acylowe wolnych grup aminowych reszt aminokwasowych, utworzone z resztą acylową (np. grupy alkanoilowe lub karbocykliczne grupy aroilowe) albo O-acylowane pochodne wolnych grup hydroksylowych (np. tych z reszty serylowej i treonylowej) utworzone z udziałem grup acylowych. Takie pochodne mogą również obejmować, przykładowo, łańcuchy boczne glikolu polietylenowego, które mogą maskować miejsca antygenowe i rozszerzają oporność kompleksu lub jego części na płyny ustrojowe.

Termin „pochodne ma obejmować jedynie takie pochodne, które nie zmieniają żadnego aminokwasu na inny z dwudziestu powszechnie występujących naturalnych aminokwasów.

Termin sole oznacza zarówno sole grup karboksylowych, jak i sole addycyjne grup aminowych kompleksu według wynalazku lub jego analogów. Sole grup karboksylowych mogą być utworzone sposobami znanymi w tej dziedzinie i obejmują sole nieorganiczne, na przykład sodowe, wapniowe, amonowe, sole żelazowe i cynkowe i tym podobne, oraz sole z zasadami organicznymi, takie jak utworzone na przykład z aminami, takimi jak trietanoloamina, arginina lub lizyna, piperydyna, prokaina i tym podobne. Sole addycyjne z kwasem obejmują na przykład sole kwasów mineralnych, takich jak na przykład kwas hydrochlorowy lub kwas siarkowy, oraz sole kwasów organicznych takich jak, przykładowo kwas octowy lub kwas szczawiowy. Oczywiście, każda z tych soli musi mieć zasadniczo podobną aktywność biologiczną jak kompleks według wynalazku lub jego analogi.

Stosowany tu termin „aktywność biologiczna interpretuje się następująco. Jeżeli bierze się pod uwagę cześć INFAR2 kompleksu, ważną aktywnością biologiczną jest jej zdolność wiązania się z interferonem typu I. A zatem analogi lub warianty, sole i funkcjonalne pochodne dobiera się tak, aby zachowywały, swoją zdolność do wiązania interferonu. Można to sprawdzać w rutynowych testach wiązania. Ponadto, można również zastosować fragmenty IFNAR2 lub ich analogi o ile zachowują swoją aktywność wiązania interferonu. Fragmenty można łatwo przygotować przez usuniecie aminokwasów z każdej strony polipeptydu wiążącego interferon i testowanie powstałych w rezultacie cząsteczek pod kątem właściwości wiązania interferonu. Proteazy usuwające kolejno po jednym aminokwasie zarówno z N-końca, jak i C-końca polipeptydu są znane, także określenie fragmentów, które zachowują zdolność do wiązania interferonu wymaga jedynie rutynowych doświadczeń.

Dodatkowo, polipeptyd, który ma taką aktywność wiązania interferonu, czy to jest IFNAR2, sIFNAR2, analog lub wariant, sól, funkcjonalna pochodna czy jej fragment, mogą również zawierać dodatkowe reszty aminokwasowe otaczające polipeptyd wiążący interferon. Tak długo, jak otrzymane w rezultacie cząsteczki zachowują zdolność wiązania interferonu polipeptydu rdzeniowego, można ustalić przez rutynowe doświadczenia, czy którakolwiek z takich otaczających reszt wpływa na podstawowe i nowe właściwości rdzeniowego polipeptydu, tj. jego właściwości wiązania interferonu. Termin „składające się zasadniczo z kiedy odnosi się do konkretnej sekwencji, oznacza że mogą być obecne dodatkowe otaczające reszty, niewpływające na podstawowe i nowe właściwości danej sekwencji. Termin ten nie obejmuje podstawień, delecji i wstawień w obrębie danej sekwencji.

Podczas gdy IFNAR2 i sIFNAR2 były używane w tym opisie i w przykładach, powinno być zrozumiałe, że jest to jedynie korzystny przykład i że podjednostka IFNAR1, a w szczególności jej zewnątrzkomórkowa domena może zastąpić IFNAR2 wszędzie tam, gdzie znajduje się odniesienie do

PL 197 568 B1

IFNAR2. IFNAR1 może być stosowany jedynie w połączeniu z interferonami, które wiąże. Wiadomo, że IFNAR1 wiążę INFa. Każdy kompleks z zastosowaniem IFNAR1 musi występować z typem interferonu, a korzystnie z typami interferonu INFa, z którymi wiąże się IFNAR1.

W odniesieniu do części kompleksu, którą stanowi interferon według tego wynalazku, aktywnością biologiczną, która musi być utrzymywana przez dowolny analog lub wariant, sól, funkcjonalną pochodną czy jej fragment, jest aktywność interferonu, na której opiera się zamierzone zastosowanie. W większości przypadków będzie to zdolność wiązania się z natywnym powierzchniowym receptorem komórkowym i pośrednictwo w wytwarzaniu sygnału przez receptor. A zatem taki analog, pochodna czy fragment powinny utrzymywać aktywność agonisty receptora, aby być przydatnym w rozwiązaniach według wynalazku do takich zastosowań. Z drugiej strony, czasami korzystne jest posiadanie cząsteczki o aktywności antagonistycznej wobec receptora, tak, aby zapobiegać aktywności biologicznej natywnego interferonu. Tego rodzaju antagoniści mogą być również zastosowani do uzyskania przedłużonego, korzystnego działania za pośrednictwem kompleksu według wynalazku. Do takich zastosowań, w których pożądana jest eliminacja niepożądanych efektów interferonu, analogi, które nadal są wiązane przez receptor i przez część IFNAR kompleksu, ale nie przekazują sygnału i blokują wytwarzanie sygnału przez natywny interferon w tym receptorze mogą być również uważane za biologicznie aktywne dla potrzeb niniejszego zgłoszenia i objęte terminem interferon, kiedy są stosowane w odniesieniu do kompleksów według tego wynalazku. Proste testy mogą określić, czy analog zachowuje aktywność agonisty receptora, czy też ma aktywność antagonisty receptora i są one przydatne w realizacji rozwiązań według wynalazku.

Niniejszy wynalazek dotyczy również sekwencji DNA kodujących powyższy kompleks według wynalazku i jego analogi, jak również wektorów DNA, przenoszących takie sekwencje DNA, do ekspresji w odpowiednich prokariotycznych lub eukariotycznych komórkach gospodarza. Zdolność do wytwarzania dużych ilości białek heterologicznych przy zastosowaniu systemu ekspresji białka heterologicznego doprowadziło do opracowania różnych czynników leczniczych, np. t-PA i EPO (Eddington, 1995). Zakres różnych gospodarzy do ekspresji, z których można uzyskać zrekombinowane białka rozciąga się od organizmów prokariotycznych (np. bakterii (Olins, 1993), poprzez niższe eukarionty (np. drożdże) (Ratner, 19898) do wyższych gatunków eukariotycznych (np. owady i komórki ssacze) (Reuveny, 1993; Reff, 1993). Wszystkie te systemy opierają się na tej samej zasadzie - wprowadzeniu sekwencji DNA dla białka będącego przedmiotem zainteresowania do wybranego typu komórek (w sposób przejściowy lub stabilny, jako element włączony albo episomalny) i wykorzystaniu maszynerii transkrypcyjnej, translacyjnej i transportowej gospodarza do nadekspresji wprowadzonej sekwencji DNA jako białka heterologicznego (Keown, 1990).

Poza ekspresją sekwencji natywnego genu, zdolność do manipulowania DNA na poziomie nukleotydów przyspieszyła opracowanie nowych, uzyskanych na drodze inżynierii genetycznej sekwencji, które, jakkolwiek opierają się na białkach naturalnych, posiadają nowe aktywności w wyniku zmiany pierwszorzędowej struktury białka (Grazia, 1997).

Ponadto, wybrane sekwencje DNA można połączyć fizycznie w celu wytworzenia transkryptów, które dają nowe białka fuzyjne, w których niezależne dotychczas białka są teraz wyrażane jako jedna jednostka polipeptydowa (Ibanez, 1991). Aktywność takich białek fuzyjnych może być odmienna, np. silniejsza niż każdego z indywidualnych białek (Curtis, 1991).

Ludzki IFN3 jest otrzymywany w procesie wytwarzania, który stosuje ssacze komórki jajnika chomika chińskiego (CHO). Interferony typu l mogą być wyrażane różnych komórkach gospodarzy między innymi bakterii (Utsumi, 1987), owadów (Smith, 1983) i człowieka (Christofinis, 1981). Ludzki sIFNAR2 był także wyrażany przy zastosowaniu jako gospodarza komórek CHO. Alternatywnie, receptory rozpuszczalne, takie jak sIFNAR2, były także wyrażane z powodzeniem w bakteryjnych systemach ekspresji (Terlizzese, 1966). DNA każdego genu wprowadzano do genomu CHO przy zastosowaniu procedury transfekcji, której rezultatem była rekombinacja i wbudowanie wektora ekspresyjnego. Komórki, które wyrażały białko będące przedmiotem zainteresowania następnie izolowano, hodowano, a białko odzyskiwano i oczyszczano przy zastosowaniu standardowych przemysłowych sposobów znanych w tej dziedzinie.

Wynalazek dotyczy również kompozycji farmaceutycznej zawierającej jako składnik aktywny kompleks IFNAR2/IFN albo jego analogi albo ich mieszaninę albo ich sole i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik, rozcieńczalnik lub zaróbkę. Wykonanie kompozycji farmaceutycznej według wynalazku obejmuje kompozycję farmaceutyczną do wzmacniania działania typu IFN w leczeniu chorób wirusoPL 197 568 B1 wych, w terapii przeciwnowotworowej, w terapii modulującej układ odpornościowy i innych spokrewnionych z nimi zastosowaniach interferonów i cytokin.

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku przygotowuje się do podawania przez mieszanie kompleksu lub jego analogów z fizjologicznie dopuszczalnymi nośnikami i/lub stabilizatorami i/lub zarobkami i przygotowuje w postaci dawek np. poprzez liofilizację dawek w fiolkach. Sposób podawania może być dowolnym akceptowalnym sposobem podawania dla podobnych czynników i może zależeć od stanów, które mają być leczone np. dożylnie, domięśniowo, podskórnie, przez miejscowe wstrzyknięcie albo podawanie miejscowe lub w sposób ciągły poprzez wlew, itp. Ilość aktywnego związku, który ma być podany będzie zależała od drogi podawania, choroby, która ma być leczona i stanu pacjenta. Miejscowe wstrzyknięcie, na przykład, będzie wymagało mniejszej ilości białka na masę ciała niż wlew dożylny.

Wolny IFN3 ma tendencję do oligomeryzacji. W celu powstrzymania tej tendencji, obecne kompozycje IFN3 mają kwaśne pH, które może powodować miejscowe podrażnienie przy podawaniu. Ponieważ IFNAR może służyć jako czynnik stabilizujący dla IFNp, a zatem zapobiegać oligomeryzacji, jego zastosowanie w kompozycjach zawierających IFNp może służyć do stabilizacji IFNp, omijając w ten sposób konieczność stosowania kwaśnych kompozycji. Zgodnie z powyższym, niekwaśne kompozycje farmaceutyczne zawierające IFNp i IFNAR, obok innych konwencjonalnych farmaceutycznie dopuszczalnych zarobek jest również częścią tego wynalazku.

Niniejszym ujawnione zostały również zastosowania kompleksu według wynalazku albo jego analogów albo jego mieszanin do terapii antywirusowej, terapii przeciwnowotworowej oraz terapii modulującej układ odpornościowy. Konkretnie, kompleksy receptor interferonu-interferon według wynalazku są przydatne do takiej terapii antywirusowej w takich wskazaniach terapeutycznych, jak przewlekła choroba ziarniniakowa, kłykcina kończysta, młodzieńczy brodawczak krtaniowy, zapalenie wątroby typu A i przewlekłe infekcje wirusami zapalenia wątroby typu B i C.

W szczególności, kompleksy receptor interferonu-interferon według wynalazku są przydatne w terapii przeciwnowotworowej przy takich wskazaniach terapeutycznych, jak białaczka kosmatokomórkowa, mięsak Kaposiego, szpiczak mnogi, przewlekła białaczka pochodzenia szpikowego, chłoniak nieziarniczy i czerniak.

Kompleksy receptor interferonu-interferon według wynalazku są przydatne w terapii modulującej układ odpornościowy, takiej jak stwardnienie rozsiane, reumatoidalne zapalenie stawów, miastenia gravis, cukrzyca, AIDS, toczeń i itd.

Analogicznie, niniejszy wynalazek dotyczy również kompleksów albo ich analogów albo ich mieszanin do zastosowania przy wytwarzaniu leków do leczenia wspomnianych powyżej dolegliwości lub do zastosowania przy wymienionych powyżej wskazaniach.

Niniejszy wynalazek będzie teraz opisany bardziej szczegółowo w poniższych nieograniczających przykładach i towarzyszących im rysunkach.

Przykłady Materiały i metody

Antywirusowy test biologiczny WISH i wytwarzanie kompleksu

Test WISH został opracowany w oparciu o protokół Novick i wsp. (1982).

Materiały • Komórki WISH (ATCC CCL 25) • Bulion wirusa pryszczycy (VSV) (ATCC V-520-001-522), przechowywana w -70°C • IFN3, zrekombinowany ludzki, InterPharm Laboratories LTD 90 x 10⁶ lU/ml aktywność specyficzna: 264,5 x 106 lU/mg.

• Rozpuszczalny ludzki IFNAR2, stężenie wyjściowe w PBS 373 ąg/ml • Pożywka wzrostowa WISH (wysoko glukozowy MEM z solami Earl + 10% FBS + 1,0% L-glutamina + penicylina/streptomycyna (100 U/ml, 100 ąg/ml) ) • Pożywka testowa WISH (wysoko glukozowy MEM z solami Earl + 5% FBS + 1,0% L-glutamina + penicylina/streptomycyna (100 U/ml, 100 ąg/ml)), MTT w 5mg/ml w PBS, przechowywana w -70°C. Metody • Rozcieńczyć rekombinowany ludzki INFN3 do 19 lU/ml (4 x ustalona wstępnie dawka EC₅₀) w pożywce testowej WISH.

• Rozpoczynając od 90 ąg/ml, wykonać jedenaście (11) trzykrotnych rozcieńczeń ludzkiego rekombinowanego sIFNAR2 w probówkach Eppendorfa i pożywce testowej WISH. Dwunasta probówka zawiera jedynie pożywkę WISH

PL 197 568 B1 • Dodać 25 μΙ IFNB3 do każdej studzienki 96 studzienkowej płytki z płaskim dnem (dodać 25 μΙ samej pożywki testowej WISH do jednej z sekcji 3 x 11 studzienek celem kontroli dla działania IFNAR2 przy nieobecności IFN3).

• Dodać 25 μl z każdego rozcieńczenia sIFNAR2 (lub pożywki testowej tylko w dwunastym rzędzie) w trzech powtórzeniach w dwunastu rzędach 96-studzienkowej płytki.

• Inkubować wstępnie IFN3 z sIFNAR2 przez 1-4 godziny w 37°C inkubatorze przed dodaniem komórek WISH.

• Zebrać komórki WISH w fazie logarytmicznej wzrostu przy zastosowaniu roztworu trypsyna/EDTA, przemyć pożywką testową WISH i doprowadzić do końcowego stężenia 0,8 x 10⁶ komórek/ml • Dodać 50 μl zawiesiny komórek WISH do każdej studzienki (4 x 10⁴ komórek na studzienkę). Końcowe stężenie zarówno IFNp, jak i IFNAR2 jest takie, jakie stosuje się wobec komórek, tak, że stężenie końcowe IFN3 wynosi 4,75 lU/ml (1x), a stężenie końcowe sIFNAR2 w rzędzie pierwszym wynosi 22,5 H-g/ml.

• Po inkubacji przez 24 godziny w inkubatorze z 5% CO2 i nawilżaniem, 50 μl z rozcieńczenia 1 : 10 (w pożywce testowej WISH) zawiesiny VSV (ustalona wstępnie dawka dla 100% lizy komórek WISH w ciągu 48 godzin) dodaje się do wszystkich studzienek z wyjątkiem studzienek kontrolnych bez wirusa (tam daje się tylko równą objętość pożywki testowej).

• Po dodatkowej inkubacji przez 48 godzin, do wszystkich studzienek dodaje się 25 μl roztworu MTT, po czym każdą płytkę inkubuje się przez dodatkowe 2 godziny w inkubatorze.

• Zawartość studzienek usuwa się poprzez odwrócenie płytki i do studzienek dodaje się 200 μl 100% etanolu.

• Po 1 godzinie płytki sczytuje się przy 595 nm przy zastosowaniu zestawu oprogramowania Soft max Pro i systemu spektrofotometrycznego Spectramax (Molecular Devices).

Wszystkie reakcje sekwencjonowania przeprowadzono przy zastosowaniu zestawu ThermoSequenase™ do sekwencjonowania cyklicznego z wyznakowanym radioaktywnie terminatorem (Amersham Life Science; Cleavland, OH). Zastosowano protokoły dostarczone przez producenta. Wszystkie reakcje sekwencjonowania analizowano na gotowych żelach sekwencyjnych CastAway™, które zawierały 6% poliakryloamid i 7 M mocznik. Reakcje sekwencjonowania nakładano w porządku A-C-G-T. Autoradiogramy żeli sekwencyjnych sczytywano ręcznie. Do analizy sekwencji DNA stosowano Genetic Computer Group Sequence Analysis Software Package i komputer UNIX.

P r z y k ł a d 1

W celu zbadania antywirusowej aktywności ludzkich kompleksów IFNAR2/IFN3 i ludzkich kompleksów IFNAR2Ig-IFN3, stałe stężenie IFNp (4,75 lU/ml) inkubowano wstępnie przez 3 godziny w 37°C z ludzkim sIFNAR2 (rekombinant p40) lub ludzkim IFNAR2Ig w różnych stężeniach (0,25-30000 ng/ml), a następnie testowano w teście cytopatyczności WISH-VSV. W nieobecności INF nie wykrywano żadnej ochrony antywirusowej (dane nieprzedstawione).

Aktywność antywirusowa interferonów typu I (stosowanego w ustalonych wstępnie stężeniach EC₅₀) w obecności około 30 ng/ml sIFNAR2 wykazuje optymalną aktywność agonistyczną z IFNp, ale nie samodzielnie. Antywirusową aktywność mierzono poprzez konwersję MMT 48 godzin po sprowokowaniu VSV.

W obecności IFN w stężeniu spodziewanym jako EC₅₀ obserwowano ochronę (patrz fig. 1: absorbancja równa 0,45, absorbancja bez ochrony równa ~0,0, absorbancja przy pełnej ochronie równa ~1,8). Kiedy IFNAR2 lub IFNAR2Ig miareczkowano w różnych stężeniach, wtedy następował ok. 4x wzrost aktywności IFNp do 32 ng/ml IFNAR2 i IFNAR2Ig (patrz także przykład 2 i fig. 2). Powyżej 32 ng/ml IFNAR lub IFNAR2Ig aktywność IFN3 obniżała się, jak się spodziewano, prawdopodobnie na skutek współzawodnictwa sIFNAR o IFN β z błonowym IFNAR. Eksperyment ten dostarcza zatem potwierdzenia zwiększonej siły i wzmocnionej aktywności IFNp w kompleksie IFNAR2/IFN.

P r z y k ł a d 2

Efekt zmiany stężenia IFNp na aktywność kompleksu sIFNAR2/IFN badano przy różnych stężeniach IFNe w dodatku do ED₅₀. Jak można zobaczyć na fig 2, przy 4,75 lU/ml IFNe inkubacja wstępna z IFNAR2 przez 1 godzinę wzmocniła aktywność IFNp 2X przy stężeniu maksymalnym ~32 ng/ml. Przy każdym z większych stężeń IFNp niemożliwe było wykrycie wzmocnienia antywirusowej aktywności IFNAR2/IFN3, ponieważ aktywność ta już była minimalna. Wyniki te stanowią potwierdzenie, że kompleks IFNAR2/IFN3 ma wzmocnioną aktywność IFN.

PL 197 568 B1

P r z y k ł a d 3

Kinetykę tworzenia kompleksu IFNAR2/IFN3 badano przez testowanie aktywności antywirusowej subefektywnych stężeń IFNp (0,95 lU/ml) w różnych czasach reinkubacji z różnymi stężeniami IFNAR2. Jak widać na fig. 3, niezbędne były 4 godziny inkubacji wstępnej, aby uzyskać wzmocnienie aktywności antywirusowej IFNp przy takiej subefektywnej dawce. A zatem przy poziomach IFNp, które same są nieaktywne, dodanie IFNAR2 w celu wytworzenia kompleksu doprowadziło do pojawienia się znaczącej aktywności antywirusowej.

Doświadczenie to dostarczyło dodatkowego potwierdzenia zwiększonej aktywności IFN kompleksu IFNAR2/IFN3.

P r z y k ł a d 4

Ustalono, że aktywność biologiczna IFNp spada gwałtownie po rekonstytucji in vitro w 37°C (w buforze soli fizjologicznej pH 7,4). Jest tak co najmniej częściowo na skutek tworzenia się struktur oligomerycznych IFNp, które mają zmniejszoną aktywność. W celu przetestowania, czy IFNAR2 zwiększa stabilność IFNp w fizjologicznych warunkach pH, przeprowadzono doświadczenie, w którym IFN3 w różnych stężeniach inkubowano osobno (w pożywce RPMI 1640, Gibco) lub w tej samej pożywce w obecności IFNAR2 przy stałym stosunku IFNAR2 do IFNp (2,5 ng/IU).

IFN3 (500IU/ml) inkubowano wstępnie z równą objętością bądź sIFNAR2 (1,25 pg/ml) bądź jedynie RPMI przez 3 godz. w 37°C. Miareczkowanie obydwu roztworów IFNp przeprowadzono w pożywce testowej WISH w 96-studzienkowej płytce przed dodaniem komórek WISH. VSV dodawano po 24 godzinach i mierzono po dodatkowych 48 godzinach inkubacji, jak określono poprzez przekształcenie MTT. Jak widać na fig. 4, sam IFNp ma ED₅₀ wynoszące około 104 lU/ml, podczas gdy preinkubacja IFN3 z rozpuszczalnym IFNAR2 prowadzi do znacznie zwiększonego ED₅₀ = ~7 lU/ml. Wysoka wartość ED₅₀ samego IFNp może być spowodowana oligomeryzacją IFNp w roztworze. Powyższe wyniki pokazują ponownie zwiększoną stabilność po utworzeniu kompleksu z IFNAR2.

P r z y k ł a d 5

W celu zbadania, czy zwiększona aktywność IFN3 w obecności IFNAR2 wynika ze specyficznej ochrony przez IFNAR2, aktywność IFN3 oceniano po połączeniu w kompleks z IFNAR2 lub innymi niespokrewnionymi białkami w tych samych stężeniach (ludzka IgG, albumina z surowicy bydlęcej (BSA)).

Jak pokazano na fig. 5, IFN3 (500 lU/ml) inkubowano wstępnie z równą objętością wskazanego białka (1,25 pg/ml) lub jedynie RMI przez 4 godz. w 37°C. Miareczkowanie tych roztworów IFNp w pożywce testowej WISH przeprowadzono w 96-studzienkiowych płytkach przed dodaniem komórek WISH. Uwzględniono również świeżo przygotowane IFNp w celu ustalenia efektu preinkubacji na aktywność IFN3. VSV dodawano po 24 godzinach, a CPE oznaczano po dodatkowych 48 godzinach inkubacji określając konwersję MTT.

Wstępna inkubacja IFNp z białkami niespecyficznymi (tj. BSA lub ludzką IgG) w stężeniu 2,5 ng/IU IFNAR2 nie chroniła aktywności IFNp po rekonstytucji. Aktywność kompleksu IFNAR2/IFN3 w tym teście była podobna do świeżo dodawanego IFNp, co potwierdza odkrycie, że IFNAR2 stabilizuje aktywność IFN3.

P r z y k ł a d 6

Kompleks IFNAR2/IFN3 wykazuje znacznie wydłużony profil farmakokinetyczny IFNp u myszy w oparciu o analizę ELISA i test biologiczny (fig. 6 i 7).

Szczep myszy B6D2F1 otrzymał pojedynczy duży zastrzyk ludzkiego IFNp (2,5 x 10⁶) lU/kg), bądź to samo stężenie IFNp inkubowanego wstępnie przez 1 godzinę w 4°C z ludzkim IFNAR2 (2,2 ng/IU IFN). Surowice pobierano z tylnego splotu oczodołowego 0,05 do 48 godzin po podaniu i mierzono stężenie IFN3 i aktywność antywirusową IFNp poprzez test ELISA (fig. 6) lub test biologiczny WISH (fig. 7), odpowiednio. Stężenie surowicy spadające poniżej poziomu czułości testu (7,55 lU/ml) w teście ELISA nie było nanoszone na wykres.

Kompleks nie tylko wykazywał rozszerzony profil farmakokinetyczny, ale w teście antywirusowym WISH poziom biologicznie aktywnego IFN β u myszy był znacznie zwiększony w czasie, pokazując zwiększoną stabilność i przedłużony czas półtrwania kompleksu IFNAR2/IFN3 według wynalazku w osoczu w stosunku do samego IFNe.

P r z y k ł a d 7

Kompleks IFNAR2/IFNa2a wykazał znacznie rozszerzony profil farmakokinetyczny IFNa2a u myszy w oparciu o test ELISA i testy biologiczne (fig. 8 i 9).

Szczep myszy B6D2F1 otrzymał pojedynczy duży zastrzyk ludzkiego IFNa (1,25 x 10⁵ lU/kg,) bądź to samo stężenie IFNa inkubowanego wstępnie przez 1 godzinę w 4°C z ludzkim IFNAR2

PL 197 568 B1 (14,9 ng/IU IFN). Surowice pobierano we wskazanych czasach z tylnego splotu oczodołowego i mierzono stężenie IFNa oraz aktywność antywirusową IFNa poprzez test ELISA (fig. 8) lub test biologiczny WISH (fig. 9), odpowiednio.

IFNa oznaczano w teście ELISA specyficznym dla ludzkiego IFNa. Stężenie surowicy spadające poniżej poziomu czułości testu (30 lU/ml) w teście ELISA nie było nanoszone na wykres.

Kompleks nie tylko wykazywał rozszerzony profil farmakokinetyczny, ale w teście antywirusowym WISH poziom biologicznie aktywnego IFNa u myszy był znacznie zwiększony w czasie, wskazując na zwiększoną stabilność i przedłużony okres półtrwania kompleksu IFNAR2/IFN według wynalazku w osoczu w stosunku do samego IFNa.

P r z y k ł a d 8

Wytwarzanie białek fuzyjnych IFNAR2/IFN

Konstrukty wytworzono w taki sposób, aby połączyć C-końcową zewnątrzkomórkową domenę IFNAR2 z N-końcem dojrzałego IFN przy zastosowaniu następujących peptydowych linkerów, przy czym G i S reprezentują odpowiednio, aminokwasy glicynę i serynę:

\FNAR2zewnątrzkomórkowy (linker) dojrzały IFN β . . .ESEFS (GGGGS)nMSY . . . , w którym n = 0 (Sekw. Id. Nr: 5), 1 (Sekw. Id. Nr: 7), 2 (Sekw. Id. Nr: 6), 3 (Sekw. Id. Nr: 5), 4 (Sekw. Id. Nr: 4), oraz 5 (Sekw. Id. Nr: 3).

Pełna sekwencja aminokwasowa n = 2 fuzji IFNAR2/IFN3 jest pokazana na fig. 10 (Sekw. Id. Nr: 14).

Wektor ekspresyjny pSVEIF, który zawiera gen, z którego następuje ekspresja zrekombinowanego ludzkiego IFN, zastosowano jako matrycę do PCR. Syntetyczne startery zaprojektowano tak, aby na matrycy mógł być powielony jedynie region kodujący dojrzałego ludzkiego IFN (MSY. . .). Starter 5' składa się z sekwencji dla miejsca trawienia SmaI, co najmniej siedmiu aminokwasów z IFNAR2 (GQESEFS) (reszty 344-349 z Sekw. Id. Nr: 14), i linkera (GGGGS)1 (Sekw. Id. Nr: 1). Miejsca BamHI i Xhol zostały również wprowadzone do starterów 5' do PCR w celu ułatwienia klonowania innych kaset. Starter 3' zawierał miejsce AvrII bezpośrednio za kodonem stop TGA hlFNe. Mieszanina do reakcji PCR zawierała w przybliżeniu 1 g matrycy DNA, 1 g każdego ze starterów PCR, 0,2 mM każdego z dATP, dCTP, dGTP, i dTTP, 1 x bufor reakcyjny ThermoPol (10 mM KCl, 20 mM Tris-HCl, (pH 8,8 w 25°C), 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0,1% Triton X-100: New England Biolobs; Beverly, MA) oraz 3 mM MgSO₄ (końcowe stężenie 5 mM MgSO₄) w objętości reakcyjnej 100 μl. Po początkowej inkubacji VENTR® w 99,9°C przez 30 sekund, do reakcji dodawano 2 jednostki polimerazy DNA VENTR. Na PCR składało się 20 następujących cykli: (a) 99,9°C przez 30 sekund, (b) 65°C-55°C przez 30 sekund, obniżenie 0,5°C w każdym cyklu, i (c) 75°C przez 40 sekund. Dodatkowe 15 cykli przeprowadzono stosując powyższy profil, ale z temperaturą przyłączania starterów utrzymywaną na poziomie 55°C. Mieszaninę po reakcji PCR oczyszczano przy zastosowaniu Wizard PCR Preps DNA Purification System (Promega; Medison, WI). Po trawieniu produktów reakcji PCR przy użyciu AvrII, oczyszczano je na żelach agarozowych o niskiej temperaturze topnienia. Oczyszczone z żelu fragmenty zawierające sekwencję dojrzałego białka hINFe z linkerem poddawano ligacji z wektorem ekspresyjnym pCMV-p40 strawionym (Smal + AvrII), który zawierał gen kodujący rozpuszczalną postać ludzkiego zrekombinowanego IFNAR2. Produkty ligacji zastosowano do transformowania kompetentnych komórek E. coli XL-1 Blue przy zastosowaniu standardowych metod (Sambrook i wsp., 1989).

Prawidłowe połączenie konstruktu, nazwanego pCMV-IFNAR2/IFN3, potwierdzono poprzez trawienie endonukleazą restrykcyjną i sekwencjonowanie regionu „interfuzji wytworzonego w reakcji PCR. Kolejne konstrukty wytworzono przy zastosowaniu kasety oligonukleotydowej, każdej zawierającej wystające końce BamHI, odpowiedni linker (GGGGS)n (Sekw. Id. Nr: 1, gdy n = 1) i wystającego końca Xhol. Kaseta 0 GS zawierała wystające końce Smal i Xhol. Po potwierdzeniu prawidłowości wektora pCMV-IFNAR2/IFN3 1 GS, strawiono go BamHI i Xhol i odpowiednie kasety poddano ligacji z tym wektorem. Dla konstruktu 0 GS, wektor strawiono Smal i Xhol do ligacji z kasetą.

Ogółem wytworzono 6 wektorów, pCMV-IFNAR2/IFNe n (GS), gdzie n reprezentuje 0, 1,2, 3, 4 lub 5 jednostek linkera GGGGS (Sekw. Id. Nr: 1). Wyniki tych trawień restrykcyjnych są pokazane na fig. 11. Startery do sekwencjonowania zaprojektowano tak, że kaseta dla każdego konstruktu została w całości zsekwencjonowana. Hodowle do izolacji plazmidu na dużą skalę przygotowano dla każdego z potwierdzonych konstruktów przy zastosowaniu dostępnego handlowo zestawu i protokołów opisanych przez producenta (Qiagen,; Chatsworth, CA).

Figura 12 przedstawia reprezentatywną mapę plazmidową wektorów ekspresyjnych „Interfusion pCMV-IFNAR2/IFN3. Transkrypcja białka fuzyjnego pCMV-FNAR2/IFN3 jest kierowana przez

PL 197 568 B1 wczesny promotor CMV. Sygnał poliadenylacji ludzkiego hormonu wzrostu (hGH) dostarczonego przez wektor zastosowano do obróbki 3' końca transkryptów IFNAR2/IFNe.

Lista wektorów

Nr	Nazwa	Wektor Eksp.	linker GGGGS (Sekw. Id. Nr: 1)
1	pCMV-IFNAR2-IFNe, 0GS	pCMV.PA4	N/A
2	pCMV-IFNAR2- IFNe, 1GS	pCMV.PA4	Jeden
3	pCMV-IFNAR2- IFN β, 2 GS	pCMV.PA4	Dwa
4	pCMV-IFNAR2- IFNe, 3GS	pCMV.PA4	Trzy
5	pCMV-IFNAR2- IFNe, 4GS	pCMV.PA5	Cztery
6	pCMV-IFNAR2- IFNe, 50GS	pCMV.PA4	Pięć

Otrzymano dane o sekwencji dla wytworzonego w reakcji PCR regionu fuzji IFNAR2-IFN3, 1GS; dane te pokazały, że sekwencja była taka, jak przewidywano. Dane o sekwencji otrzymano dla regionu linkera peptydowego innych konstruktów, sekwencja była również taka, jak przewidywano.

Dla każdego konstruktu na transfekowanych komórkach przeprowadzono analizę Northern. Prążek o wielkości około 1,4 kb był obecny we wszystkich ścieżkach zawierających próbki IFNAR2IFN3 n GS, zarówno dla sondy IFNAR2, jak i IFN β. W przypadku sondy IFN β obserwowany był dodatkowy prążek, o wielkości około 0,9 kb. Prążek o tej wielkości odpowiadałby transkryptowi powstałemu w wyniku alternatywnego wycinania intronów, który zawierałby co najmniej sześć aminokwasów IFNAR2, linker peptydowy (n) GS oraz sekwencję kodującą dojrzały hlFN. Potwierdzono to poprzez sekwencjonowanie cDNA przygotowanego z całkowitego RNA wyizolowanego z przejściowo transfekowanych komórek CHO z przykładu 9.

P r z y k ł a d 9

Przejściowa transfekcja

Komórki CHO-DUKK są klonalnymi mutantami komórek jajnika chomika chińskiego pozbawionymi aktywności reduktazy dihydrofolianowej (Urlaub et al. (1980); Graff et al. (1982)). Komórki utrzymywano w pożywce Alpha Minimum Essential Medium (a MEM) plus rybonukleozydy i deoksyrybonukleozydy, uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% L-glutaminą (pożywka kompletna). Przejściową transfekcję przeprowadzono stosując Lipofectamine PLUS™ Reagent (GibcoBRL Life Technologies; Gaithersburg, MD) oraz protokół dostarczony przez producenta. Około 24 godziny przed transfekcją, komórki wysiewano na płytki o średnicy 100 mm przy gęstości 2 x 10⁶ komórek/płytkę. Do transfekcji używano 4 ąg superskręconego plazmidowego DNA wektora pCMVIFNAR2/IFN n GS, gdzie n + 0, 1, 2, 3, 4 lub 5). Pożywka wolna od surowicy dostarczona przez producenta była zastosowana do rozcieńczenia DNA i odczynnika PLUS. Supernatanty znad komórek zbierano po inkubacji w 37°C przez 48 godz. w pożywce kompletnej do testów ELISA (IFNAR2, IFNji) i żeli Western.

Otrzymywanie RNA i analiza Northern. Całkowity RNA komórkowy (Chomczynski et al., 1987) otrzymywano z przejściowo transfekowanych komórek CHO-DUKX. Dziesięć g całkowitego RNA na ścieżkę frakcjonowano pod względem wielkości na żelach agarozowych zawierających formaldehyd jako czynnik denaturujący. Próbki nakładano w dwóch powtórzeniach. RNA przenoszono na filtry nylonowe GeneScreen Plus (DuPont/Nen Medical Products; Boston, MA) poprzez transfer kapilarny w 10 x SSC (1,5 M chlorek sodu, 0,15 M cytrynian sodu). Unieruchomiony RNA hybrydyzowano do wyznakowanych ³²P fragmentów PCR hINFNAR2 i hINFe w zmodyfikowanym roztworze według Church i Gilbert (1984). Bufor zawierał 0,25 M fosforan sodu, pH 7,2, 0,25 M chlorek sodu, 7% siarczan dodecylu sodu (SDS), 1 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy i 100 ng/ml tRNA E. coli. Próbki znakowane 3^zp wytwarzano przy użyciu dostępnych handlowo zestawów („High Prime Boehringer Mannheim; Indianopolis, IN) i opisanej tam procedury. Niewłączoną radioaktywność usuwano poprzez chromatografię na kolumnach Sephadex G-50. Po hybrydyzacji filtry przemywano; w warunkach ostrych stosowano 0,2 x SSC, 0,1% SDS w 65°C. Następnie filtry poddawano autoradiografii.

Ekspresja białek interfuzji

Supernatanty z każdego z konstruktów interfuzji transfekowanych przejściowo do komórek CHO analizowano pod kątem poziomów ekspresji IFNAR2 i IFNe stosując ELISA specyficzną dla IFNAR2 i ELISA (Toray) dla IFNe, odpowiednio. Wyniki tej analizy są podane poniżej w tabeli IV.

PL 197 568 B1

T a b e l a IV

Konstrukty interfuzji przejściowo transfekowane do komórek CHO

Identyfikacja próbki	[hlFNp]* (U/ml)	^[hIFNAR2^]t (ng^/m^l)	[hlFNp]* (ńg/ml)	[hlFNp]# (pmole)	^[hIFNAR2^]§ (pmole)	IFN/IFNAR
0GS	29175	1094	0,146	6,571	31,802	0,207
1GS	24906	994	0,125	5,609	28,895	0,194
2GS	13597	600	0,068	3,063	17,442	0,175
3GS	14998	718	0,075	3,378	20,857	0,162
4GS	9998	535	0,050	2,251	15,538	0,145
5GS	9597	540	0,048	2,161	15,698	0,138
IFNAR2	nieokreślony	1176			34,200
Pożywka hodowlana	nieokreślony	0

* określone stosując zestaw TORAY t określone stosując ELISA hIFNAR2 ί oparte na aktywności specyficznej 2,0 x 105 u/_mg (2 x 10⁸/mg) # oparte na masie 22000 Daltonów (średnia masa określona za pomocą analizy MALDI-TOF hlFNp) § oparte na masie 34400 daltonów (średnia masa określona za pomocą analizy MALDI-TOF)

Jak widać, ze wzrastającą długością linkera stwierdzono obniżenie wykrywalnego IFNAR2 i IFNp. W tym momencie nie jest możliwe określenie czy jest to powodowane przez spadek ilości wyrażanego białka interfuzji w miarę wzrostu długości linkera lub też czy w miarę wzrostu długości linkera, IFNp może wiązać się z miejscem wiązania IFNAR2 i w związku z tym nie jest w pełni wykrywany przez oznaczenia ELISA. Wiadomo, że oznaczenie IFNp wykrywa tylko nieskompleksowany IFN β.

Analiza typu Western białka fuzyjnego IFNAR2/IFNp

W celu ustalenia, czy białka interfuzji są wyrażane z odpowiednią masę cząsteczkową i czy nie ma ekspresji wolnego IFNp, supernatanty z transfekowanych komórek analizowano za pomocą techniki Western stosując przeciwciało anty-IFNp, aby wykryć interfuzję. Wyniki tej analizy przedstawiono na figurze 13.

ul supernatantu hodowli z komórek CHO przejściowo transfekowanych konstruktem IFNAR2/IFNp (ścieżki 1-6) lub konstruktem IFNAR2 (ścieżka 7), podłożem hodowlanym (ścieżka 8) lub IFNp (ścieżka 9) poddano SDS-PAGE w warunkach nieredukujących, a następnie elektroprzenoszeniu na błonę PVDF. Błonę sondowano przeciwciałem królika anty-IFNp i rozwijano fosfatazą alkaliczną skoniugowaną z kozim przeciwciałem przeciwkróliczym, stosując zestaw luminescencyjny do detekcji Western Star.

Nie wykryto wolnego IFNp w supernatantach dowolnego z konstruktów interfuzji. Podobnie każdy z konstruktów wyrażał białko, które na podstawie analizy typu Western miało odpowiednią masę cząsteczkową dla każdego konstruktu interfuzji.

P r z y k ł a d 10

Przeciwwirusowa aktywność cząsteczek interfuzji. Każdy supernatant zawierający interfuzję testowano pod kątem aktywności przeciwwirusowej w oznaczeniu cytopatycznym, w którym komórki WISH (ludzkie komórki amniocytów) eksponowano na VSV po dodaniu albo IFNp (kontrola) lub Interfuzji. Wyniki przedstawiono na figurze 14.

Supernatanty komórek CHO zawierające wyrażane zrekombinwane białka (wykryte za pomocą ELISA i techniki Western) lub samo podłoże CHO dodawano w dwóch powtórzeniach do górnego rzędu 96-studzienkowych płytek do hodowli tkankowej o płaskich denkach w objętości 75 ul/płytkę. Do pozostałych studzienek płytki dodawano 50 ul pożywki do oznaczenia komórek WISH. Trzykrotne seryjne rozcieńczenia każdej próbki zrobiono usuwając 25 ul ze studzienek zawierających supernatanty (górny rząd) dodając to do następnego rzędu zawierającego 50 ul podłoża do oznaczenia WISH. W studzienkach z pozytywną kontrolą supernatant w górnym rzędzie zastępowano podłożem do oznaczeń WISH zawierającym 1000 lU/ml ludzkiego IFNp, który także rozcieńczano seryjnie trzykrotnie w dół płytki. Każda studzienka następnie otrzymywała 50 ul zawiesiny komórek WISH (0,6 x 10⁶komórek/ml w podłożu do oznaczeń WISH) tak, że końcowe stężenie w górnym rzędzie zawierającym REBIF® wynosiło 500 lU/ml, i wyjściowe rozcieńczenie dla supernatantów komórek CHO jest 1:2.

PL 197 568 B1

Po 24 godzinach inkubacji w 5% CO2 w 37°C, każda studzienka (z wyjątkiem tych określonych jako kontrola niezainfekowanych komórek) otrzymała 50 μΙ podłoża do oznaczeń WISH zawierającego VSV (1:10 roztworu wyjściowego). Określono żywotność komórek WISH, po kolejnych 48 godzinach hodowli, przez konwersję MTT.

Przeciwwirusowa aktywność wywoływana przez cząsteczki interfuzji była określana poprzez normalizację czynnika rozcieńczenia supernatantów niezbędna do uzyskania EC50 do EC50 określonego dla oczyszczonego standardu ludzkiego IFNp. W miarę wzrostu długości linkera, rośnie aktywność przeciwwirusowa konstruktów interfuzji.

P r z y k ł a d 11

Ten przykład jest farmakokinetycznym badaniem ludzkiego kompleksu IFNe/sIFNAR2 u myszy po podaniu dożylnym. Porównania przeprowadza się między wstępnie formowanymi i oddzielnie wstrzykiwanymi składnikami kompleksu. Trzydzieści sześć myszy szczepu D2F1 (6-8 tygodni) (około 20 g każda) dzielono na cztery grupy w sposób następujący:

Grupa 1 zawiera dziewięć myszy mających otrzymać zastrzyk dożylny pojedynczej dawki 200 μl roztworu 50000 lU/ml ludzkiego IFN3 (ostateczna dawka 10000 U/mysz).

Grupa 2 (dziewięć myszy) otrzymała 200 μl roztworu 5000 lU/ml ludzkiego IFNp i 125 mg/ml sIFNAR2 (stosunek 2,5 ng/IU).

Grupa 3 (dziewięć myszy) otrzymała (1) 200 μl roztworu 125 mg/ml a następnie (2) 200 ml roztworu 50000 lU/ml ludzkiego IFNp (stosunek 2,5 ng/IU).

Grupa 4 (9 myszy) otrzymała (1) 200 μl roztworu 625 mg/ml a następnie (2) 200 ml roztworu 50000 lU/ml ludzkiego IFNP (stosunek 10 ng/IU).

Próbki krwi (około 200 μl/próbę) zbierano w określonych czasach przez rozbicie retroorbitalnego węzła żylnego kapilarką. Trzy myszy z każdej grupy miały pobierane próbki krwi w 0,05, 2 i 12 godzin po podaniu. Trzy myszy z każdej grupy miały próbki krwi pobierane w 0,54 i 24 godziny po podaniu i trzy z każdej grupy miały pobierane próbki krwi w 1,8 i 48 godzin po podaniu. Próbkom krwi pozwalano na zakrzepnięcie przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej i zwirowywano je. Surowice usunięte z nich przechowywano w -70°C do zebrania wszystkich próbek. W surowicach oznaczano obecność ludzkiego IFN3 za pomocą ELISA specyficznej dla IFN3 stosując zestaw do ELISA ludzkiego IFN3 Toray (TFB, Inc.) i oznaczano w nich bioaktywność stosując oznaczenie przeciwwirusowe WISH.

Wyniki oznaczenia ELISA specyficznego w stosunku do IFNp są przedstawione na figurze 15A i wyniki oznaczenia przeciwwirusowego WISH są przedstawione na figurze 15B.

Widać, że okres półtrwania w surowicy IFN3 wstrzykniętego jako kompleks IFNAR2 jest podobny do IFN β wstrzykniętego po oddzielnym wstrzyknięciu IFNAR. Te wyniki są zgodne z tworzeniem in vivo kompleksu IFN3/IFNAR2 ze zwiększonym okresem półtrwania.

P r z y k ł a d 12

Myszy C57BL/6 traktowano kompleksem IFN „Universal (ludzki IFNaA/D) i sIFNAR2. Ochronny efekt pod względem cytotoksyczności mierzono w porównywaniu z podaniem różnych dawek samego IFN Universal lub z kontrolą. Pierwsza grupa otrzymała 5 x 10³ IU IFN Universal w kompleksie z 5/ng IU sIFNAR2. Druga grupa otrzymała 5 x 103 iu inf Universal. Trzecia grupa otrzymała 5 x 10⁴ IU IFN Universal i czwarta grupa otrzymała PBS/2% NMS. Dla każdej z tych myszy mierzono aktywność NK jako cytotoksyczność komórek śledziony w stosunku do docelowych komórek NK YAC-1. Wyniki przedstawiono na figurze 16. Aktywność NK była znacząco większa u myszy traktowanych kompleksem Universal IFN/sIFNAR2 w porównaniu z myszami traktowanymi tylko IFN Universal.

P r z y k ł a d 13

Jak wskazano powyżej, farmakokinetyczne badania wykazały dramatyczny wzrost w okresie półtrwania w surowicy IFN Typu I gdy jest podawany w kompleksie z sIFNAR2, rozpuszczalnej postaci podjednostek receptora IFN. Wyniki in vitro sugerują, że fizyczna asocjacja z IFNAR2 prowadzi do stabilizacji normalnie labilnego IFN. Aby określić czy wzmocniony profil PK i stabilizujący efekt IFNAR2 powodują zwiększenie i przedłużenie skuteczności z udziałem IFN in vivo opracowano model w którym myszy o złożonym ciężkim niedoborze odporności (scid/scid) są poddawane prowokacji letalnymi dawkami wrażliwej na IFN linii komórkowej Daudi chłoniaka ludzkich komórek B (Ghetie, 1991; Ghetie, 1990). U myszy tych rozwija się paraliż między 14 - 20 dniem po wstrzyknięciu komórek guza w połączeniu z histologicznymi dowodami na obecność rozproszonego chłoniaka. W szczególności, przeżycie tych myszy może być przedłużone w sposób zależny od dawki przez codzienne podskórne podanie ludzkiego IFNp. Model ten jest stosowany do oceny IFNAR2 jako czynnika wzmagającego aktywność biologiczną związaną z IFN typu I in vivo.

PL 197 568 B1

Aby ustalić stosunek między średnim czasem do paraliżu i dawką IFNp w modelu Daudi scid, pięć grup myszy BALB/cByJsmn-scid/scid w wieku 4-5 tygodni, samic, otrzymało podskórne podanie 200 ąl na mysz na dzień ludzkiego IFNp codziennie od dnia 0 do dnia 30. Standardowa dawka komórek Daudi, namnożonych z zamrożonych wyjściowych komórek, była 5 x 10⁶ komórek w PBS na mysz przez zastrzyk podskórny w kark w dniu 0. Grupy myszy otrzymały następujące ilości IFN.

Gru^pa 1: 135 x 10⁴ W/mysz (67⁵ x ^{104 l}U^/m^l)

Gru^pa 2: 45 x 10^{4 lU}/m^ysz (²²⁵ x ^{104 lU/}mQ

Gru^pa 3: 15 x 10^{4 lU}/m^ysz (⁷⁵ x ^{104 lU/}m^l) ^Gru^pa ⁴: ⁵ x ^{104 lU}/m^ysz (²⁵ x ^{104 lU/}m^l)

Grupa 5: PBS z 2% NMS

Czas do paraliżu jako indywidualne i średnie wartości przedstawiono w tabeli V.

T a b e l a V

	Dni do paraliżu	Średnia (± SD)
Grupa 1	26,	31,	35,	37,	40	33,8	(5^,4)
Grupa 2	20,	23,	23,	23,	26	23,0	(2^,1)
Grupa 3	20,	20,	22,	22,	23	21,4	(1^,3)
Grupa 4	17,	18,	18,	18,	18	17,8	(0^,5)
Grupa 5	14,	14,	15,	15,	15	14,6	(0^,6)

Widać więc, że średni czas do paraliżu w modelu ksenoprzeszczepu Daudi/scid jest przedłużany przez codzienne podskórne podawanie ludzkiego IFNp w sposób zależny od dawki.

P r z y k ł a d 14

Aby określić czy działanie przeciwnowotworowe IFN3 może być zwiększone przez kompleksowanie z IFNAR2 przy 2,5 ng/IU, traktowano siedem grup po pięć myszy takim samym protokołem jak omówiono w przykładzie 13 poza tym, że badane materiały podawane każdej z grup były następujące:

tylko IFNe/mysz

Gr^upa 1 2 ^x 10² IU

Gr^upa 2 2 ^x 10³ IU

Gr^upa 3 2 ^x 10⁴ IU

Grupa 7 otrzymała komórki Daudi, traktowana tylko rozcieńczalnikiem

IFN3 plus sIFNAR3/mysz Grupa 4 2 x 102 IU plus 0,5 _Llg Grupa 5 2 x 103IU plus 5,0 ąg Grupa 6 2 x 104IU plus 50,0 ąg

Czas do paraliżu jako wartości indywidualne i średnie jest podany w następującej tabeli.

T a b e l a VI

	Dni do paraliżu	Średnia (± SD)
Grupa 1	16,	16,	17,	18,	19	17,2	(1^,3)
Grupa 2	17,	18,	18,	19,	19	18,2	(0^,8)
Grupa 3	17,	17,	17,	18,	18	17,6	(0^,9)
Grupa 4	17,	17,	18,	18,	19	17,8	(0^,8)
Grupa 5	17,	18,	19,	20,	20	18,8	(0^,3)
Grupa 6	21,	22,	22,	23,	26	22,8	(1,9)*
Grupa 7	16,	16,	17,	17,	17	16,6	(0^,6)

Znacząco różna (wartość p < 0,05) niż to samo stężenie w formie nieskompleksowanej w odpowiadającej grupie porównawczej jak określono za pomocą jednostronnej ANOVA.

Widać, że działanie przeciwnowotworowe niskiej dawki IFNP 2 x 104/mysz/dzień w modelu ksenoprzeszczepu Daudi/scid jest znacząco zwiększone przez kompleksowanie z IFNAR2.

W dodatkowym doświadczeniu (nie przedstawiono) badano wpływ częstości zastrzyków na średni czas paraliżu. Stwierdzono, że znacząco zwiększona aktywność przeciwnowotworowa w modelu ksenoprzeszczepu Daudi-scid może być uzyskana przez traktowanie kompleksem IFN3/IFNAR G2 gdy jest wstrzykiwany tak rzadko jak raz w tygodniu w porównaniu z wolnym IFNp wstrzykiwanym tak

PL 197 568 B1 często jak raz dziennie. Co więcej, w dodatkowym doświadczeniu (nieprzedstawione) przebadano optymalny stosunek IFNAR do IFN3. Stwierdzono, że optymalny stosunek IFNAR2:IFN3 we wzmaganiu działalności przeciwnowotworowej w pojedynczym stężeniu IFNp 2 (2 x 10⁴/IU/mysz/dzień) wynosił 2,5 ng IFNAR2 na pg IFNp.

W drugim doświadczeniu stwierdzono, że optymalny stosunek IFNAR2:IFN3 we wzmaganiu aktywności przeciwnowotworowej w stężeniu IFNp 5 x 10⁴ lU/mysz/dzień wynosił 0,3 ng IFNAR2 na pg IFN3. Te dwa eksperymenty wskazują, że optymalny stosunek zależy od stężenia IFN3 i wydaje się wskazywać, że im wyższe stężenie IFNp tym niższy musi być ten stosunek.

W innym doświadczeniu stosującym ten sam model, ustalono, że podawanie samego IFNAR2 nie wzmaga przeżywania myszy w badaniach.

P r z y k ł a d 15

Ten przykład jest badaniem farmakokinetycznym mającym na celu ustalenie okresu półtrwania w surowicy myszy dla cząsteczki interfuzji 5GS po pojedynczej dawce po wstrzyknięciu dożylnym. Dwadzieścia jeden samic myszy szczepu B6DF1 (6-8 tygodni) (około 20 g każda) podzielono na trzy grupy jak następuje:

Grupa 1: zawiera dziewięć myszy, którym wstrzyknięto dożylnie pojedynczą dawkę 200 μl roz^tworu ^{100000 ITJ/}m^{l i}nterfuzj^{i 5GS} (koricowa daw^ka ^{20000 lU/}m^ysz ^lu^{b 5} x ^{106 lU/kg}).

Grupa 2: (dziewięć myszy) otrzymało 200 μl roztworu 10000 lU/ml ludzkiego IFN3.

Grupa 3: zawiera trzy myszy, które nie dostały zastrzyków i stanowią kontrolę negatywną.

Zakładając objętości krwi około 2 ml/mysz, teoretyczne C_max i T_max wynosi 10000 lU/ml dla grup 1 i 2. Trzy myszy z każdej z grup 1 i 2 miały pobierane próbki krwi 0,5, 4 i 24 godziny po podaniu, i trzy myszy każdej z grup 1 i 2 miały pobierane próbki krwi l, 8 i 48 godzin po podaniu. W surowicach badano obecność ludzkiego IFNp stosując oznaczenie WISH.

Wyniki przedstawiono na figurze 17. Podczas gdy IFNp jest usuwany prawie że natychmiast, cząsteczka interfuzji pozostaje w surowicy długo po zastrzyku. To wskazuje, że białko fuzyjne ma pożądany wpływ stabilizujący.

Uprzedni opis specyficznych postaci w tak pełny sposób ujawnia ogólną naturę tego wynalazku, tak aby inni mogli, przez zastosowanie współczesnej wiedzy, łatwo modyfikować i/lub adaptować go do różnych zastosowań, takich jak specyficzne postacie wykonania bez nadmiernego eksperymentowania i bez oddalania się od wyjściowej idei. Zatem takie adaptacje i modyfikacje powinny i są uważane za włączone w zakres ekwiwalentów ujawnionych postaci wykonania. Powinno być zrozumiane, że stosowana tu frazeologia lub terminologia jest dla celu opisu i nie ma na celu ograniczenia. Sposoby, materiały i etapy do przeprowadzenia różnych ujawnionych funkcji mogą przyjąć różne postacie bez odbiegania od wynalazku. Tak więc wyrażenie „sposób do i „sposób na lub język etapów dowolnego sposobu jaki może być znaleziony w specyfikacji powyżej i/lub w poniższych zastrzeżeniach, po którym następuje funkcjonalne twierdzenie, mają na celu definiowanie i obejmowanie jakiegokolwiek fizycznego, chemicznego lub elektrycznego elementu lub struktury, lub jakiegokolwiek etapu sposobu, który może teraz lub w przyszłości istnieć do przeprowadzenia wymienionej funkcji, bez względu na fakt, czy jest czy też nie jest dokładnie ekwiwalentna do postaci wymienionej lub wymienionych w powyższej specyfikacji. Oznacza to, że mogą być stosowane inne sposoby lub etapy do przeprowadzenia tych samych funkcji, i intencją jest by takim wyrażeniom nadawać ich najszersze interpretacje.

LITERATURA

Alam et al, Comparative pharmacokinetics and Pharmacodynamics of two recorabinant human interferon beta-1 (IFN3-1a) products administered intramuscularly in healthy male and female volunteers, Pharmaceutical Research 14:546-549 (1997)

Anfinsen, Principles That Govern The Folding of Protein Chains, Science 181:223-230 (1973)

Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publications and Wiley Interscience (New York, 1987-1992)

Baron et al, The interferons: A biological system with therapeutic potential in viral infections, Antiyiral Res. 24:97-110 (1994)

Baron, et al, The interferons. Mechanisms of action and clinical applications, J. Am. Med. Assoc. 266:1375-1383 (1991)

Chomczynski et al, Anal. Biochem. 162:156-159 (1987)

Christofinis, G.J., Interferon Production by Human Lymphoblastoid Cell Lines of Different Origins, Journal of General Virology 52:169-171 (1981)

PL 197 568 B1

Church et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1991-1995 (1984)

Colamonici et al, Multichain structure of the interferon alpha receptor on hematopoietic cells, J. Immunol. 148:2126-2132 (1992)

Colamonici et al, Identification of a novel subunit of the Type I interferon receptor localized to human chromosome 21, J. Biol. Chem. 268:10895-10899 (1993)

Curtis, B.M., Enhanced Hematopoietic Activity of a Human Granulocyte/Macrophage Colony-stimulating Factor-Interleukin 3 Fusion Protein, Proc. Natl. Acad. Sci. 88:5809-5813 (1991)

Domanski et al, Cloning and Expression of a Long Form of the β Subunit of the Interferon a β Receptor That is required for Signaling, The Journal of Biological Chemistry 270:6 (1995)

Duncan et al, The transcription factor interferon regulatory factor-1 is essential for natural killer cell function in vivo, J. Exp. Med. 184:2043-2048 (1996)

Dron et al, Interferon α/β gene structure and regulation in Interferon: Principles and Medical Applications, Baron et al, Editors, (University of Texas Medical Branch: Galveston, TX, 1992) pp. 33-45

Edington, S.M., Biotech Products as Drug Leads, BioTechnology 13:649 (1995)

Ertel et al, Arch. Surg. 129:1 (1994)

Fierlbeck et al, Pharmacodynamics of recombinant IFNp during long-term treatment of malignant melanoma, Journal of Interferon and Cytokine Research 16:777 (1996)

Ghetie et al, Cancer Research 51:5876 (1991)

Ghetie et al, Blood 80:2315 (1990)

Graff et al, Mol Cell. Biol. 2:93-96 (1982)

Grantham, Science 185:X62-X64 (1974)

Grazia Cusi, M., Harlequin Granulocyte-colony Stimulating Factor Interleukin 6 Molecules with Bifunctional and Antagonistic Activities, Immunotechnology 3:61-69 (1997)

Ibanez, C.F., Chimeric Molecules with Multiple Neurotrophic Activities Reveal Structural Elements Determining the Specificities of NGF and BDNF, EMBO Journal 10:2105-2110 (1991)

Kazam et al, J. Biol. Chem. 270:1 (1995)

Keown, W.A., Methods for Introducing DNA into Mammalian Cells, Methods in Enzymology 185:527-537 (1990)

Lengyl, P., Biochemistry of interferons and their actions, Ann. Rev. Biochem. 51:251-282 (1982)

Lutfalla et al, Mutant USA cells are complemented by an interferon-a/ β receptor subunit generated by alternative processing of a new member of a cytokine receptor gene cluster, EMBO Journal 14:5100-5108 (1995)

Meinkoth et al, Anal. Biochem. 138:267-284 (1984)

Nagai et al, Nature 309:810 (1984)

Novick et al, J. Immunol. 129:2244-2247 (1982)

Novick et al, Soluble interferon-alpha receptor molecules are present in body fluids FEBS Lett. 314:445-448 (1992)

Novick et al, The human interferon a/b receptor: Characterization and molecular cloning, Cell 77:391-400 (1994)

Novick et al, Soluble and membrane-anchored forma of the human IFN-α/β receptor, J. Leuk. Bio. 57:712-718 (1995)

Olins, P.O., Recent Advances in Heterologous Gene Expression in Escherichia coli, Current Opinion in Biotechnology 4:520-525 (1993)

Pestka, et al, Interferons and their actions, Ann. Rev. Biochem. 56:727-777 (1987)

Platanias et al, Characterization of the α-subunit of the interferon a receptor: evidence of N- and O-linked glycosylation and association with other surface proteins, J. Immunol. 150:3382-3388 (1993)

Platanias et al, Tyrosine phosphorylation of the α and β subunits of the Type I interferon receptor J. Biol. Chem. 269:17761-17764 (1994)

Platanias et al, Differences in interferon α and β signaling, J. Biol. Chem. 271:23630-23633 (1996)

Qureshi et al, Function of Stat2 protein in transcriptional activation by alpha interferon, Mol. Cell. Bio. 16:238-293 (1996)

Ratner, M., Protein Expression in Yeast, Bio/Technology 7:1129-1133 (1989)

Reff, M., High-level Production of Recombinant Immunoglobulins in mammalian Cells, Current Opinion in Biotechnology 4:573-576 (1993)

PL 197 568 B1

Reuveny, S., Production of Recombinant Proteins in High Density Insect Cell Cultures, Biotechnology and Bioengineering 42:235-239 (1993)

Salmon et al, Pharmacokinetics and phamacodynamics of recombinant human IFNp in healthy male volunteers, Journal of Interferon and Cytokine Research 16:759 (1996)

Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, NY, 1989)

Sharf et al, Functional domain analysis of interferon consensus sequence binding protein (ICSBP) and its association with interferon regulatory factors, J. Biol. Chem. 270:13063-13069 (1995)

Smith, G.E., Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector, Molecular and Cellular Biology 3:2156-2165 (1983)

Szilagyi et al, Biochim. Biophys. Acta 1251:1 (1995)

Tan et al, The linkage of genes for the human interferon induced antiviral protein and indophenol oxidase-B traits to chromosome G-21, J. Exp. Med. 137:317-330 (1973)

Terlizzese, M., In vitro comparison of inhibiting ability of soluble TNF receptor p75 (TBPII) vs. Soluble TNF Receptor p55 (TBPI) against TNF-α and TNF-β, Journal of Interferon and Cytokine Research 16:1047-1053 (1996)

Urlaub et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA 77:4216-4220 (1980)

Utsumi, J., Characterization of E. coli-derived Recombinant Human Interferon-beta as Compared with Fibroblast Human Interferon-beta, Journal of Biochemistry 101:1199-1208 (1987)

Uze et al, Genetic transfer of a functional human interferon alpha receptor into mouse cells: cloning and expression of its cDNA, Cell 60:225-234 (1990)

Weissmann et al, The interferon genes, Prog. Nucleic Acid Res. 33:251-3-02 (1986)

Yan et al, Molecular characterization of an alpha interferon receptor 1 subunit (IFNaR1) domain required for TYK2 binding and signal transduction, Mol. Cell. Bio. 16:2074-2082 (1996)

Yang et al, Direct association of STAT3 with the IFNAR-1 chain of the human Type I interferon receptor, J. Biol. Chem. 271:8057-8061 (1996)

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Kompleks zawierający interferon (IFN) typu I oraz podjednostkę receptora ludzkiego interferonu α/ β (IFNAR), która jest zdolna do wiązania z IFN typu I kompleksu, przy czym IFN typu I jest:

a) natywnym IFN typu I

b) fragmentem a), który ma aktywność biologiczną IFN typu I;

c) wariantem a) lub b), który ma przynajmniej 70% identyczność sekwencji z a) lub b) i który ma aktywność biologiczną IFN typu I;

d) wariantem a) lub b), który jest kodowany przez sekwencję DNA, która hybrydyzuje z sekwencją komplementarną do natywnej sekwencji DNA kodującej a) lub b) w umiarkowanie ostrych warunkach i który ma aktywność biologiczną IFN typu I; lub

e) solą lub funkcjonalną pochodną a), b), c) lub d), która ma aktywność biologiczną IFN typu I; i IFNAR jest:

f) łańcuchem polipeptydowym natywnego ludzkiego IFNAR;

g) fragmentem f), który ma aktywność biologiczną IFNAR;

h) wariantem f) lub g), który ma przynajmniej 70% identyczność sekwencji z f) lub g) i który ma aktywność biologiczną IFNAR;

i) wariantem f) lub g), który jest kodowany przez sekwencję DNA, która hybrydyzuje z sekwencją komplementarną do natywnej sekwencji DNA kodującej f) lub g) w umiarkowanie ostrych warunkach i który ma aktywność biologiczną IFNAR; lub

j) solą lub funkcjonalną pochodną f ), g), h) lub i), która ma aktywność biologiczną IFNAR.
2. Kompleks według zastrz. 1, znamienny tym, że IFN typu I jest związany z IFNAR wiązaniem kowalencyjnym.
3. Kompleks według zastrz. 1, znamienny tym, że IFN typu I jest związany z IFNAR wiązaniem peptydowym.
4. Kompleks według zastrz. 3, znamienny tym, że IFN typu I jest związany z IFNAR linkerem peptydowym.

PL 197 568 B1
5. Komplekswedług zastrz. 4, z namiennytym, że li nkerem peptydowym jest(GGGGS)n,przy czym k=1-5.
6. OmmelsSs wsOłgg zss(rz. 1, znamienny tym, żs IFN (ypu I jss( IFNa, IFNp lub IFNoj.
7. OmmelsSs wsOłgg ass(ra. 5, znamienny tym, żs IFN (yeg I jss( IFN3.
8. OmmelsSs wsOłgg ass(ra. l, znamienny tym, żs IFNAR jss( emOjsOkms(Są bs(s rscse(mrs IgOaSisgm ik(srfsrokg α/β (IFNAR2).
9. Caąs(scaSs DNA SoOgjącs bisłSo fgayjks oSrsśloks w ass(ra. 3.
10. WsS(or obsjmgjący caąs(scaSę DNA oSrsśloką w ass(ra. 9.
11. OomórSs goseoOsras (rsksformowsks wsS(orsm oSrsślokym w ass(ra. 10, w seosób, S(óry eoawsls ks sSserssję bisłSs fgayjksgo.
12. Oomeoaycjs fsrmscsg(ycaks, znamienna tym, żs aswisrs fsrmscsg(ycakis Ooegsacaslky kośkiS i SomelsSs oSrsśloky w ass(ra. 1.
13. OomelsSs wsOłgg ass(ra. 1 Oo ass(osowskis jsSo lsS.
14. OomelsSs wsOłgg ass(ra. 13 Oo ass(osowskis w (srseii sk(ywirgsowsj, sk(ykowo(worowsj lgb (srseii moOglgjącsj gSłsO oOeorkościowy.
15. OomelsSs wsOłgg ass(ra. 13 slbo 14 Oo ass(osowskis w erasOłgżskig Oaisłskis in vivo INF (yeg I g escjsk(s.
16. LsS, znamienny tym, żs obsjmgjs ik(srfsrok (IFN) (yeg I i eoOjsOkos(Sę rscse(ors lgOaSisgo ik(srfsrokg α/β (IFNAR) Oo oOOaislksgo, rówkocassksgo lgb Solsjksgo eoOswskis escjsk(owi w (srseii sk(dwirgsowsj, sk(ykowo(worowsj slbo (srseii moOglgjącsj gSłsO oOeorkościowy, eray caym IFN (yeg I jss(:

s) ks(dwkym IFN (yeg I;

b) frsgmsk(sm s), Stóry wySsagjs sS(ywkość biologicaką IFN (yeg I.
17. LsS wsOłgg ass(ra. 16, znamienny tym, żs ik(srfsrok (IFN) (yeg I orsa INFAR są eoOswsks oOOaislks, s SomelsSs oSrsśloky w ass(ra. 1 jss( formowsky in vivo.
18. LsS wsOłgg ass(ra. 16 slbo 17, znamienny tym, żs IFN jss( IFNa, IFN β lgb IFNω.
19. LsS wsOłgg ass(ra. 18, znamienny tym, żs IFN jss( IFNe.
20. LsS wsOłgg ass(ra. 16, znamienny tym, żs INFAR jss( eoOjsOkos(Są bs(s rscse(ors lgOaSisgo ik(srfsrokg α/β (IFNAR2).
21. Zss(osowskis lgOaSisgo rscse(ors iktsrfsrokg α/β (IFNAR) Oo wy(wsraskis lsSg Oo wamsgskis sfsS(ów biologicakych ik(srfsrokg (IFN) (yeg I, eray caym IFNAR jss(:

s) łsńcgchsm eoliesetyOowym ks(ywksgo lgOaSisgo IFNAR;

b) frsgmsk(sm s), S(óry ms aStdWkość biologicaką IFNAR;

c) wsrisk(sm s) lgb b), Stóry ms erayksjmkisj 70% iOsk(ycakość ssSwskcji a s) lgb b) i Stóry ms sS(ywkość biologicaką IFNAR;

O) wsrisk(sm s) lgb b), Stóry jss( SoOowsky erasa ssSwskcję DNA, S(órs hybryOyagjs a ssSwskcją Somelsmsk(srką Oo ks(ywksj ssSwskcji DNA SoOgjącsj s) lgb b) w gmisrSowskis os(rych wsrgkSsch i Stóry ms sS(ywkość biologicaką IFNAR; lgb

s) solą lgb fgkScjokslką eochoOką s), b), c) lgb O), S(órs ms sS(ywkość biologicaką IFNAR.
22. Zss(osowskis iktsrfsrokg (IFN) (yeg I i eoOjsOkos(Si rscse(ors lgOaSisgo ik(srfsrokg α/β (IFNAR), S(órs jss( aOolks Oo wiąaskis IFN (yeg I, Oo wdtwsrzskis sSojsrzoksgo ersesrs(g Oo symgl(skicaksgo, Solsjksgo lgb oOOaislksgo eoOswskis, Oo erzsOłgżskis Oaisłskis in vivo ik(srfsrokg (IFN) (yeg I, eray caym IFN (yeg I jss(:

s) ks(ywkym lgOaSim IFN (yeg I;

b) frsgmsk(sm s), Stóry ms sS(ywkość biologicaką IFN (yeg I;

c) wsrisk(sm s) lgb b), Stóry ms erayksjmkisj 70% iOsk(ycakość ssSwskcji a s) lgb b) i Stóry ms sS(ywkość biologicaką IFN (yeg I;

O) wsrisk(sm s) lgb b), Stóry jss( SoOowsky erasa ssSwskcję DNA, S(órs hybryOyagjs a ssSwskcją Somelsmsk(srką Oo ks(ywksj ssSwskcji DNA SoOgjącsj s) lgb b) w gmisrSowskis os(rych wsrgkSsch i Stóry ms sS(ywkość biologicaką IFN (yeg I; lgb

s) solą lgb fgkScjokslką eochoOką s), b), c) lgb O), S(órs ms sS(ywkość biologicaką IFN (yeg I; i IFNAR jss(

f) łsńcgchsm eoliesetyOowym kstywksgo lgOaSisgo IFNAR;

g) frsgmsk(sm f), Stóry ms sS(ywkość biologicaką IFNAR; h) wsrisk(sm f) lgb g), Stóry ms erayksjmkisj 70% iOsktycakość ssSwskcji z f) lgb g) i S(óry ms sS(ywkość biologicaką IFNAR;

PL 197 568 B1

i) wariantem f) lub g), który jest kodowany przez sekwencję DNA, która hybrydyzuje z sekwencją komplementarną do natywnej sekwencji DNA kodującej f) lub g) w umiarkowanie ostrych warunkach i który ma aktywność biologiczną IFNAR; lub j) solą lub funkcjonalną pochodną f), g), h) lub i), która ma aktywność biologiczną IFNAR.
23. Zastosowaniekomplekkswedług zastrz.ldowytwarzanial ekudo zastosowania w przedłużaniu działania in vivo IFN typu I.
24. wytwarzania znamienny tym, że obejmmje hoSowanie kk^r^ć^r^i gospodarza określonej w zastrz. 11 i odzyskiwanie wyrażanego przezeń białka fuzyjnego.
25. Sposób p^^^c^łł^^^r^ii^ okresu t^^łc^^c^i interferonu typu I, znamienny tym, że obejmuje przechowywanie interferonu w postaci kompleksu określonego w zastrz. 1.