EA003635B1 - Комплекс ifnar2/ifn - Google Patents

Abstract

Эффект интерферона (IFN) типа I in vivo может быть пролонгирован путем введения интерферона в виде комплекса с интерферонсвязывающей цепью рецептора человеческого интерферона α/β (IFNAR). Такой комплекс также улучшает стабильность IFN и повышает потенцию IFN. Этот комплекс может быть нековалентным комплексом или комплексом, в котором IFN и IFNAR связаны ковалентной или пептидной связью. В случае связывания пептидной связью в форме слитого белка IFN может быть отделен от IFNAR посредством пептидного линкера. Такой гибридный белок может быть получен с помощью технологии рекомбинантной ДНК. Хранение IFN в виде такого комплекса улучшает состояние при хранении IFN и позволяет хранить его при более мягких условиях, чем это возможно в других случаях.

Description

Настоящее изобретение относится к комплексу интерферона типа I, составленному из полипептидной последовательности внеклеточного домена рецептора интерферона α/β (ΙΕΝΑΚ2) интерферона типа I (ΙΕΝα, ΙΕΝβ и ΙΕΝω). Такой комплекс улучшает стабильность, увеличивает эффективность и пролонгирует фармакокинетику ίη νίνο свободного ΙΤΝ при антивирусной, противораковой и иммуномодулирующей активности. Конкретнее, этот комплекс представляет собой слитый белок, или ковалентный комплекс, или нековалентный комплекс, содержащий полипептидную последовательность целого внеклеточного домена ΙΕΝΑΚ2, или любой его интерферонсвязывающей субфракции, в комплексе с интерфероном типа Ι (ΙΕΝα, ΙΕΝβ, ΙΕΝω), или любой его биологически активной субфракцией.

Предпосылки создания изобретения

Интерфероны классифицируются как интерфероны типа Ι, производные лейкоцитов и фибробластов, или как митоген-индуцированные или иммунные интерфероны типа ΙΙ (Рс51ка е! а1, 1987). По анализам идентичности последовательностей и общей биологической активности, интерфероны типа Ι включают интерферон альфа (ΙΕΝα), интерферон бета (ΙΕΝβ) и интерферон омега (ΙΕΝω), тогда как интерферон типа ΙΙ включает интерферон гамма (ΙΕΝγ). Гены ΙΕΝα, ΙΕΝβ и ΙΕΝω собраны на коротком плече хромосомы 9 (Ьеп§у1, 1982). Существует, по меньшей мере, 25 неаллельных генов ΙΕΝα, 6 неаллельных генов ΙΕΝω и один ген ΙΕΝβ. Считается, что все они развиваются из одного общего гена-предшественника. У генов ΙΕΝα, внутри видов, по меньшей мере, 80% последовательности является общей, идентичной одна другой. У гена ΙΕΝβ приблизительно 50% последовательности идентично последовательности ΙΕΝα, и ген ΙΕΝω имеет приблизительно 70% последовательности, гомологичной ΙΕΝα (^е188шап е! а1, 1986; Ότοη е! а1, 1992). ΙΕΝα имеет молекулярный вес, находящийся в интервале 17-23 кДа (165-166 аминокислот), ΙΕΝβ имеет молекулярный вес, равный ~23 кДа (166 аминокислот) и ΙΕΝω имеет молекулярный вес, ~24 кДа (172 аминокислоты).

Интерфероны типа Ι являются плейотропными (множественного действия) цитокинами, обладающими активностью при защите организма-хозяина против вирусной и паразитической инфекций, в качестве противораковых цитокинов и как иммуномодуляторы (Вагоп е! а1, 1994; Вагоп е! а1, 1991). Физиологические ответы интерферона типа Ι включают антипролиферативную активность на нормальных и трансформированных клетках; стимуляцию цитотоксической активности лимфоцитов, натуральных киллерных клеток (натуральных киллеров или НК-клеток) и фагоцитарных клеток (фагоцитов);

модуляцию клеточной дифференциации; стимуляцию экспрессии антигенов класса Ι МНС; ингибирование класса ΙΙ МНС; и модуляцию ряда клеточных поверхностных рецепторов. В нормальных физиологических условиях ΙΕΝα и ΙΕΝβ (ΙΕΝα/β) в основном секретируются большинством клеток человека на низком уровне, с увеличением экспрессии под влиянием добавления ряда индукторов, включающих инфицирующие агенты (вирусы, бактерии, микоплазму и простейших), άδΚΝΑ и цитокины (Μ-Ο8Ε, 41α, Ш-2, ΤΝΕα). Действие интерферона типа Ι ίη νίνο может контролироваться с помощью заместительных маркеров, неоптерина, 2',5'олигоаденилатсинтетазы и β2 микроглобулина (А1ат. е! а1, 1997; ОегЬеск е! а1, 1996; 8а1шоп е! а1, 1996).

Интерфероны типа Ι (ΙΕΝα/β/ω) действуют через клеточный поверхностный рецепторный комплекс, вызывая специфические биологические эффекты, такие как антивирусная, противораковая и иммуномодуляторная активность. Рецептор ΙΕΝ типа Ι (ΙΕΝΑΚ) представляет собой гетеромультимерный рецепторный комплекс, составленный, по меньшей мере, из двух различных полипептидных цепей (Со1атошс1 е! а1, 1992; Со1атоша е! а1, 1993; Р1а!аша8 е! а1, 1993). Гены этих цепей обнаружены на хромосоме 21, и их белки экспрессируются на поверхности большинства клеток (Тап е! а1, 1973). Рецепторные цепи вначале обозначались альфа и бета по их способности распознаваться моноклональными антителами ΙΕΝαΚ3 ΙΕΝαΚβ1, соответственно. Совсем недавно они были переименованы: альфа-субъединица в ΙΕΝΑΚ1 и бета-субъединица в ΙΕΝΑΚ2. В большинстве клеток ΙΕΝΑΚΤ (альфа-цепь, субъединица ихе) Шхе е! а1, 1990) имеет молекулярный вес, равный 100-130 кДа, тогда как ΙΕΝΑΚ2 (бета-цепь, В_ъ, ΙΕΝα/βΚ) имеет молекулярный вес, равный 100 кДа. В клетках некоторых типов (клеточные линии моноцитов и нормальные клетки костного мозга) был идентифицирован альтернативный рецепторный комплекс, в котором субъединица ΙΕΝΑΚ2 (βδ) экспрессируется в виде укороченного рецептора с молекулярным весом, равным 51 кДа. Субъединицы ΙΕΝΑΚΤ и ΙΕΝΑΗ2, βδ и βΤ были клонированы (ШуКк е! а1, 1994; Оотшък! е! а1, 1995). Субъединицы ΙΕΝΑΚ2, βδ и βΤ, имеют идентичные внеклеточные и трансмембранные домены; однако, в цитоплазматическом домене они идентичны только по первым 15 аминокислотам. Одна субъединица ΙΕΝΑΚ2 способна связывать ΙΕΝα/β, тогда как субъединица ΙΕΝΑΚΤ не способна связывать ΙΕΝα/β. Если одну субъединицу человеческого рецептора ΙΕΝΑΚ1 трансфицировать в мышиные фибробласты Ь-929, то никакие ΙΕΝα, за исключением ΙΕΝα8/ΙΕΝαΒ, не способны связываться с клетками (Ихе е! а1, 1990). Человеческая субъединица ΙΕΝΑΚ2, трансфицированная в Ь-клетки в отсутствии человеческой субъединицы ΙΕΝΑΚ 1, связывает человеческий ΙΕΝα2 с Кд, приблизительно равной 0,45 нМ. Если человеческие субъединицы ΙΕΝΑΚ2 трансфицируют в присутствии человеческой субъединицы ΙΕΝΑΚ1, может быть продемонстрировано высокое сродство связывания с Кд, равной 0,026-0,114 нМ (ΝονΕΚ е! а1, 1994; ΟοιηαηδΚί е! а1, 1995). Было оценено, что на большинстве клеток присутствует от 500-20000 связывающих ΙΕΝ мест с высоким сродством и 2 000-100 000 с низким сродством. Хотя комплекс субъединиц ΙΕΝΑΚ1/2 (α/βδ или α/βΕ) связывает ΙΕΝα с высоким сродством, оказалось, что только пара α/βΕ является функциональным сигнальным рецептором.

Трансфекция субъединиц ΙΕΝΑΚ1 и ΙΕΝΑΚ2 βΕ в клетки мыши Б-929. с последующей инкубацией с ΙΕΝα2, индуцирует антивирусное состояние, инициирует фосфорилирование внутриклеточного белка и вызывает активацию внутриклеточных киназ (1ак1 и Тук2) и факторов транскрипции (8ТАТ 1, 2, и 3) (ΝονίοΚ е! а1, 1994; ΟοιηαηδΚί е! а1, 1995). В соответствующем эксперименте трансфекция субъединицы ΙΕΝΑΚ2 βδ не приводила к инициированию подобного ответа. Таким образом, субъединица ΙΕΝΑΚ2 βΕ необходима для функциональной активности (антивирусного ответа) с максимальной индукцией, которая имеет место при ассоциации с субъединицей ΙΕΝΑΚ1.

Кроме связанных с мембраной клеточных поверхностных форм ΙΕΝΑΚ, был обнаружен растворимый ΙΕΝΑΚ, как в человеческой моче, так и в сыворотке (ΝονίοΚ е! а1, 1994; ΝονίοΚ е! а1, 1995; Νον^ е! а1, 1992; Ьийа11а е! а1, 1995). Растворимый ΙΕΝΑΚ, выделенный из сыворотки, имеет кажущийся молекулярный вес, равный 55 кДа, по δΌδ-ΡΑΟΕ, тогда как растворимый ΙΕΝΑΚ из мочи имеет кажущийся молекулярный вес, равный 40-45 кДа (р40). Транскрипты для растворимого р40 ΙΕΝΑΚ2 присутствуют на уровне мРНК и охватывают почти весь внеклеточный домен субъединицы ΙΕΝΑΚ2 с двумя новыми аминокислотами и концевой карбоксильной группой. Существуют пять потенциальных сайтов гликозилирования на растворимом рецепторе ΙΕΝΑΚ2. Показано, что растворимый р40 ΙΕΝΑΚ2 связывает ΙΕΝα2 и ΙΕΝβ и ингибирует ίη νίίτο антивирусную активность смеси разновидностей ΙΕΝα (лейкоцитарный ΙΕΝ) и индивидуальных ΙΕΝδ типа Ι (ΝονίοΚ е! а1, 1995). Показано, что рекомбинантная субъединица ΙΕΝΑΚ2 слитого белка Ιβ ингибирует связывание разных видов ΙΕΝ типа Ι (ΙΕΝαΑ, ΙΕΝαΒ, ΙΕΝαΌ, ΙΕΝβ, ΙΕΝα Εοιι1 и ΙΕΝω) с клетками Οηιιάί и Сοδ-клетками, дважды трансфицированными субъединицами α/βδ.

Недавно были идентифицированы сигнальные пути с участием ΙΕΝ типа Ι (Р1а!агйа8 е! а1, 1996; Уап е! а1, 1996; ОнгехШ е! а1, 1996;

Эппсам е! а1, 1996; ЗйагГ е! а1, 1995; Уапд е! а1, 1996). Считается, что начальные события сигнального пути происходят посредством связывания ΙΕΝα/β/ω с субъединицей ΙΕΝΑΚ2, что сопровождается ассоциацией с субъединицей ΙΕΝΑΚ1 с образованием комплекса ΙΕΝΑΚ1/2 (Р1а!ап1аз е! а1, 1994). Связывание ΙΕΝα/β/ω с комплексом ΙΕΝΑΚ1/2 приводит к активации двух киназ 1апи8 (1ак1 и Тук2), которые, как полагают, фосфорилируют специфические тирозины на субъединицах ΙΕΝΑΒ1 и ΙΕΝΑΚ2. По мере фосфорилирования этих субъединиц фосфорилируются молекулы 8ТΑТ (8ТΑТ 1, 2 и 3), что приводит к димеризации транскрипционных комплексов 8ТΑТ с последующей локализацией этого транскрипционного комплекса в ядре и активацией специфических генов, индуцируемых ΙΕΝ.

Фармакокинетику и фармакодинамику ΙΕΝ-ов типа Ι оценивали у людей (Α1;ιιι е! а1, 1997; Пег1Ьеск е! а1, 1996; 8а1тοη е! а1, 1996). Выведение ΙΕΝβ является довольно быстрым при более низкой биодоступности ΙΕΝβ, чем ожидается для большинства цитокинов. Хотя фармакодинамику ΙΕΝβ оценивали у людей, не было установлено отчетливой корреляции между биодоступностью и клинической эффективностью ΙΕΝβ. У нормальных здоровых людейдобровольцев введение однократной внутривенной (вв) болюсной дозы (6 МШ) рекомбинантного СНО-производного ΙΕΝβ приводит к фазе быстрого распределения в 5 мин и конечному полупериоду жизни, равному ~5 ч (Α1ат е! а1, 1997). Сывороточные уровни ΙΕΝβ, сопровождающие подкожное (пк) или внутримышечное (вм) введение, выходящие на плато, составляют только ~15% от системно доступной дозы. Фармакодинамические параметры ΙΕΝβ после вв, вм или пк введения (что измеряли по изменению активности 2'5'-олигоаденилатсинтетазы (2'5'Α8) в РВМСз) увеличивались в течение первых 24 ч и медленно уменьшались до базовых уровней в течение следующих 4 дней. Величина и длительность биологического эффекта были одинаковыми независимо от способа введения.

Фармакокинетику (ФК) и фармакодинамику (ФД) ΙΕΝβ, произведенного двумя различными компаниями (ΚΕΒΙΕ©-Зегом и ΑνΟΝΕΧ©Вюдеп), определяли после вм инъекции единичной дозы в 6 МШ рекомбинантного ΙΕΝβ (8а1тοη, 1996). Сывороточные концентрации ΙΕΝβ и заместительного маркера ΙΕΝβ, неоптерина, регистрировали в течение определенного времени. Для обоих препаратов ΙΕΝβ были получены сходные ФК профили с пиком сывороточного уровня ΙΕΝβ, достигаемого через ~1215 ч, хотя ΚΕΒΙΕ© дает более низкие максимальные уровни. Уровни ΙΕΝβ остаются повышенными как для ΚΕΒΙΕ©, так и для ΑνΟΝΕΧ©, в течение, по меньшей мере, первых 36 ч после вм инъекции и затем уменьша ются до уровня, слегка превышающего базовый в течение 48 ч. Для ΚΕΒΙΡ® и ΑνΟΝΕΧ® были получены очень сходные профили уровней неоптерина, причем максимальные уровни неоптерина достигаюсь через ~44-50 ч после инъекции, оставаясь повышенными в течение 72 ч после инъекции, и затем постепенно снижались до базовой линии в течение 144 ч.

Фармакодинамические исследования многократных доз ΙΡΝβ проводили на пациентах с меланомой (Р1ег1Ьеск с1 а1, 1996), ΙΡΝβ вводили пк способом, три раза в неделю при 3 Μΐυ/дозу в течение шести месяцев. Фармакодинамические маркеры, 2'5'-Α8 синтетаза, β2микроглобулин, неоптерин и активация НКклеток достигали пика после второй инъекции (4 день) и уменьшались в течение 28 дней, оставаясь слегка увеличенными до шести месяцев.

Итак, выведение интерферонов типа I у людей происходит быстро. Долго действующий препарат интерферона мог бы привести к улучшениям с клинической точки зрения.

Краткое содержание изобретения

В настоящее время обнаружено, что комплекс интерферона типа I, составленный из растворимой ΙΡΝΑΚ в комплексе с интерферонами (ΙΡΝ) типа I, проявляет по сравнению со свободным ΙΡΝ повышенную стабильность, увеличенную эффективность и пролонгированную фармакокинетику ίη νίνο в отношении антивирусной, противораковой и иммуномодулирующей активности.

Таким образом, настоящее изобретение предоставляет комплекс интерферона (ΙΡΝ) типа Ι, составленный из полипептидной последовательности внеклеточного домена субъединицы человеческого рецептора интерферона α/β (ΙΡΝΑΚ) и интерферонов типа Ι, который проявляет по сравнению со свободным ΙΡΝ повышенную стабильность, увеличенную эффективность и/или пролонгированную фармакокинетику ίη νίνο в отношении антивирусной, противораковой и иммуномодулирующей активности. Предпочтительно, этот комплекс представляет собой внеклеточный домен субъединицы ΙΡΝΑΚ2 с любым интерфероном типа Ι, или субъединицу ΙΡΝΑΚ1 с ΙΡΝα.

Более конкретно этот комплекс представляет собой слитый белок или ковалентный комплекс, или нековалентный комплекс, содержащий полипептидную последовательность всего внеклеточного домена ΙΡΝΑΚ, предпочтительно ΙΡΝΑΚ2, или его субфракции, связывающей интерферон, находящуюся в комплексе с ΙΡΝα, или ΙΡΝβ, или ΙΡΝω, или с любой его биологически активной субфракцией.

Подразумевается, что ΙΡΝΑΚ охватывает любой из известных внеклеточных рецепторов ΙΡΝΑΚ, как определено выше, а также любой из его активных фрагментов. ΙΡΝΑΚ может быть необязательно слит с другим белком, например, иммуноглобулином, таким как Ι§0. ΙΡΝ, ΙΡΝα, ΙΡΝβ и ΙΡΝω подразумевают один из более чем 20 интерферонов типа Ι, идентифицированных к настоящему времени, или любой другой интерферон типа Ι, идентифицированный в будущем.

В одном воплощении настоящего изобретения комплекс составлен из ΙΡΝα или ΙΡΝβ, ковалентно связанного с ΙΡΝΑΚ2 посредством химической связи.

Дополнительное воплощение включает комплекс, составленный из ΙΡΝα или ΙΡΝβ, нековалентно комплексующимися с ΙΡΝΑΚ2. Это дополнительное воплощение также включает композицию, содержащую ΙΡΝ типа Ι и ΙΡΝΑΚ2 в любом соотношении. Смесь (состав) ΙΡΝ типа Ι и избытка ΙΡΝΑΚ2, как определено выше, также включена в определение комплекс настоящей заявки. Два компонента также могут быть введены раздельно с тем, чтобы образовать комплекс ίη νίνο. Таким образом, в дополнительном воплощении комплекс представляет собой смесь ΙΡΝΑΚ2 и ΙΡΝ, полученный путем одновременного или последовательного совместного введения ΙΡΝα или ΙΡΝβ и растворимой ΙΡΝΑΚ2. Кроме того, ΙΡΝΑΚ может быть введен без какого-либо сопутствующего введения ΙΡΝ, так, что комплекс может быть образован ίη νίνο с эндогенным циркуляционным ΙΡΝ, посредством этого способствуя проявлению эффектов эндогенного ΙΡΝ.

В виде отдельного воплощения комплекс составлен из ΙΡΝα, или ΙΡΝβ, или ΙΡΝω, слитого с ΙΡΝΑΚ2, как рекомбинантным слитым белком, где фрагменты ΙΡΝ и ΙΡΝΑΚ2 необязательно слиты через гибкую пептидную линкерную молекулу. Этот пептидный линкер может отщепляться или не отщепляться ίη νίνο.

Далее данное изобретение относится к ДНК, кодирующей такие слитые белки, векторам, содержащим такие ДНК, клеткамхозяинам, трансформированным этими векторами таким образом, чтобы они экспрессировали слитые белки, и к способам получения таких слитых белков путем культивирования таких клеток-хозяев и выделения слитых белков, экспрессированных ими.

Дополнительный аспект настоящего изобретения представляет собой способы применения комплексов настоящего изобретения для пролонгирования ίη νίνο эффекта ΙΡΝ, который является полезным при лечении любого заболевания или состояния, которое лечится ΙΡΝ.

Другой аспект настоящего изобретения относится к применению ΙΡΝΑΚ в качестве стабилизатора в композициях с ΙΡΝ. Свободный ΙΡΝβ имеет тенденцию к олигомеризации. Это предотвращается при образовании комплекса с ΙΡΝΑΚ, особенно ΙΡΝΑΚ2. Существующие в настоящее время составы с рекомбинантным ΙΡΝβ должны иметь кислый рН, который может вызвать некоторое местное раздражение при введении. Некислые композиции могут быть составлены, если в качестве стабилизатора используется ΙΕΝΑΚ..

Краткое описание рисунков

Настоящее изобретение станет понятнее из следующих рисунков.

Фиг. 1 представляет собой график, демонстрирующий дозозависимую антивирусную активность 8ΙΕΝΆΚ2 или ΙΕΝΆΚ2Ι§ (составленный из внеклеточного домена 11ΙΕΝΛΕ2. слитого с шарниром человеческого Ι§6Ι, доменами СН2 и СН3) в присутствии ΙΕΝβ.

Фиг. 2 представляет собой график, демонстрирующий антивирусную активность 8ΙΕΝΆΚ2 и ΙΕΝβ при субоптимальной дозе ΙΕΝβ. Синергическая антивирусная активность ΙΕΝβ и 8ΙΕΝΆΚ2 через один час преинкубации обнаруживается при промежуточной дозе ΙΕΝβ.

Фиг. 3 представляет собой график, демонстрирующий антивирусную активность 8ΙΕΝΆΚ2 и субэффективной дозы ΙΕΝβ (0,95 МЕ/мл) как функцию времени преинкубации. Клетки ^Ι8Η подвергают воздействию ΙΕΝβ (0,95 МЕ/мл, субэффективная доза) и 8ΙΕΝΑΚ2 с последующей преинкубацией в течение определенного времени. Синергическая антивирусная активность наблюдалась только после 4 ч преинкубации. Антивирусную активность измеряли путем МТТ конверсии через 48 ч после воздействия У8У. При субтерапевтических уровнях ΙΕΝβ образование комплекса ΙΕΝΆΚ2/ΙΕΝ приводит к усилению антивирусной активности.

Фиг. 4 представляет собой график, демонстрирующий повышение антивирусной активности человеческого ΙΕΝβ после преинкубации с 8ΙΕΝΆΚ2.

Фиг. 5 представляет собой график, демонстрирующий, что повышение антивирусной активности человеческого ΙΕΝβ, связанное с §ΙΕΝΆΚ, специфично для ΙΕΝΆΚ2, но не для других белков.

Фиг. 6 представляет собой график, демонстрирующий фармакокинетическое сравнение человеческого ΙΕΝβ и комплекса ΙΕΝβ/ΙΕΝΆΚ2 у мышей, проводимое с помощью теста ЕЫ8Л.

Фиг. 7 представляет собой график, демонстрирующий фармакокинетическое сравнение человеческого ΙΕΝβ и комплекса ΙΕΝβ/ΙΕΝΆΚ2 у мышей, проводимое с помощью биоанализа.

Фиг. 8 представляет собой график, демонстрирующий фармакокинетическое сравнение человеческого ΙΕΝα и комплекса ΙΕΝα/ ΙΕΝΆΚ2 у мышей, проводимое с помощью теста ΕΕΙ8Α.

Фиг. 9 представляет собой график, демонстрирующий фармакокинетическое сравнение человеческого ΙΕΝα и комплекса ΙΕΝα/ΙΕΝΆΚ2 у мышей, проводимое с помощью биоанализа.

Фиг. 10 демонстрирует аминокислотную последовательность слитого белка η=2 ΙΕΝΆΚ2/ ΙΕΝβ (8 ЕС) ΙΌ ΝΟ: 14). Линкер (66668)2 (остатки 240-249 8Е6 ΙΌ ΝΟ: 14) подчеркнут.

Фиг. 11 представляет собой гель, демонстрирующий анализ ρΟΜν-ΙΕΝΑΚ2/ΙΕΝβ с помощью рестрикционного фермента; 10% ΡΑ6, дорожки 3-7: ВатШ/ХМ расщепление; дорожка 2: 8таI/XйοI расщепление; дорожка 1: маркер расщепления рВК.322 ΌΝΑ-ΜκρΙ; дорожка 2: ρΟΜν-ΙΕΝΑΚ2/ΙΕΝβ, Ο68; дорожка 3: 168; дорожка 4: 268; дорожка 5: 368; дорожка 6: 468; дорожка 7: 568; дорожка 8: маркер расщепления 0Х174 ΡΕΌΝΑ НаеШ.

Фиг. 12 представляет собой рестрикционную эндонуклеазную карту экспрессионного вектора ΙΕΝΑΡ2/ΙΕΝβ.

Фиг. 13 представляет собой анализ слитого белка ΙΕΝΑΚ.2/ΙΕΝβ методом Вестерн-блотинга. Дорожка 1, конструкция ΙΕΝΑΚ.2/ΙΕΝβ, не содержащая линкера; дорожка 2, конструкция ΙΕΝΑΚ.2/ΙΕΝβ, содержащая один линкер 61у₄8ег (8Е6 ΙΌ ΝΟ:1); дорожка 3, конструкция ΙΕΝΑΚ.2/ΙΕΝβ, содержащая два линкера 61у₄8ег (8Е6 ΙΌ ΝΟ:1); дорожка 4, конструкция

ΙΕΝΑΚ.2/ΙΕΝβ, содержащая три линкера 61у₄8ег (8Е6 ΙΌ ΝΟ:1); дорожка 5, конструкция

ΙΕΝΑΚ.2/ΙΕΝβ, содержащая четыре линкера 61у₄8ег (8Е6 ΙΌ ΝΟ:1); дорожка 6, конструкция ΙΕΝΑΚ.2/ΙΕΝβ, содержащая пять линкеров 61у48ег (8ЕС) ΙΌ ΝΟ:1).

Фиг. 14 представляет собой график, демонстрирующий антивирусную активность внутренних слитых молекул, экспрессированных в супернатантах клеток СНО, и нормализованный к стандартной активности ΙΕΝβ.

Фиг. 15А-В представляют собой графики, демонстрирующие фармакокинетику ΙΕΝβ, введенного после внутривенной инъекции ΙΕΝΑΚ2. ΙΕΝβ вводят либо один, в виде комплекса с ΙΕΝΑΚ, или сразу после отдельного введения 5ΙΕΝΑΚ.2. Период полужизни в сыворотке оценивали через определенные промежутки времени после инъекции с помощью ΙΕΝβспецифичного ЕБ^Л-теста (фиг. 15А) и с помощью биоактивности в антивирусном анализе \\Ί811 (фиг. 15В).

Фиг. 16 представляет собой график, демонстрирующий защитный эффект, выраженный в процентах цитотоксичности различных доз комплекса универсального ΙΕΝ (человеческий ΙΕΝαΑ/Ό) с δΙΕΝΑΚ.2 по сравнению с введением только универсального ΙΕΝ или контролем.

Фиг.17 представляет собой график, демонстрирующий сывороточную концентрацию ΙΕΝβ как функцию от времени, после однократной болюсной внутривенной инъекции или внутривенного слитого 685, или одного 1ιΙ:ΕΝβ.

Подробное описание предпочтительных воплощений

Комплекс ΙΕΝΑΚ/ΙΕΝ настоящего изобретения и технология, необходимая для получения этого комплекса, описаны ниже в деталях. Для большинства результатов ΙΕΝβ был выбран в качестве неограничивающего примера.

Слитый белок. С-конец ΙΕΝΑΚ2, или любая его последовательность, связывающая интерферон, была слита с Ν-концом ΙΕΝβ или его биологически активными фрагментами, так, чтобы было кратчайшее расстояние для образования мостика между двумя молекулами. Могут быть также получены обратные конструкции, в которых С-конец ΙΕΝβ, или его фрагментов, сливают с Ν-концом ΙΕΝΆΚ.2, или его субпоследовательностями.

Рассчитанная из молекулярных моделей комплекса ΣΕΝΑΚ2/ΙΕΝβ, дистанция между напряженным С-концевым внеклеточным доменом ΙΕΝΆΚ2 и Ν-концом ΙΕΝβ в активных моделях комплекса составляет ~80 Ангстрем. Для конструирования комплекса ΙΕΝΆΚ2/ΙΕΝβ, который позволяет сохранять активность, может быть использован, например, гибкий пептидный линкер, например, повторы С1у-С1у-С1у-С1у-8ег (СССС8) (8ЕС ΙΌ ΝΟ:1). Альтернативно, линкер может быть гибким, и являться мишенью для протеолитического расщепления под действием сывороточных, мембрано-связанных и/или клеточных протеаз. Как пример сайта расщепления для сывороточной протеазы, конструированный слитый комплекс ΣΕΝΑΚ2/ΙΕΝβ может иметь сайт расщепления для фактора Ха. Фактор Ха расщепляет протромбин по двум положениям: Агд273 и Агд322, и он имеет тетрапептидный распознавательный сигнал Пе-С1и-С1иАгд (δΕΟ ΙΌ ΝΟ:2) (Ν;·ι§;·ιί е! а1, 1984). Фактор Ха образуется посредством внутренних и внешних путей под действием различных активаторов, включая тканевый фактор, который высвобождается клетками сосудистого эндотелия, макрофагами и нейтрофилами.

Фактор Ха может действовать на слитый белок κΙΕΝΑΚ2/ΙΕΝ, содержащий последовательность, узнаваемую фактором Ха, в линкерном домене, и высвобождать комплекс ΙΕΝΑΚ2/ΙΕΝ так, что этот комплекс может функционировать как нековалентный комплекс.

Альтернативно, слитый комплекс ΙΕΝΑΚ2/ ΙΕΝβ может иметь сайт расщепления клеточной мембранной протеазой (например, гепсином). Гепсин представляет собой мембраносвязанный сериновый протеолитический зимоген размером 51 кДа, экспрессирующийся на высоких уровнях в ткани печени, но также обнаруженный в почках, поджелудочной железе, легких, щитовидной железе, гипофизе и семенниках. Известно, что в одной последовательности гепсин расщепляет пептидную связь Α^152-ΙΚ153 в факторе ΥΙΙ. Гепсин участвует в образовании тромбина на опухолевых клетках (Кахаш е! а1, 1995).

Гепсин может действовать на слитый белок 5ΙΕΝΑΚ.2/ΙΕΝ. содержащий последовательность, узнаваемую гепсином, в линкерном до мене, и высвобождать комплекс ΙΕΝΑΚ2/ΙΕΝ так, что этот комплекс может функционировать как нековалентный.

Альтернативно, слитый комплекс ΙΕΝΑΚ2/ΙΕΝβ может иметь сайт расщепления внутриклеточной протеазой. Ряд протеаз высвобождается некрозными и апоптозными клетками. К ним относятся каспазы (протеазы, подобные ферменту, конвертирующему интерлейкин 1 бета), металлопротеиназы, лизомальные протеазы (например, катепсин В) и эластаза. Эластаза высвобождается гранулоцитами в процессе болезненных состояний (например, сепсиса), и имеет широкую специфичность в отношении расщепления аминокислотной последовательности, сродни трипсину (Ейе1 е! а1, 1994; δχί1;·ι§νί е! а1, 1995).

Внутриклеточная протеаза может действовать на слитый белок κΙΕΝΑΚ2/ΙΕΝ, содержащий последовательность, узнаваемую внутриклеточной протеазой, в линкерном домене, и высвобождать комплекс ΣΕΝΑΚ.2/ΙΕΝ так, что этот комплекс может функционировать как нековалентный комплекс.

В действительности, было получено несколько примеров конструкций слитого белка, в которых С-конец κΙΕΝΑΚ.2 (Ρ40-ΕδΕΕδ) связан с Ν-концом ΙΕΝβ (ΜδΥ) посредством гибких линкеров. Примерами пептидных линкеров являются следующие: ΕδΕΕδ (ΟΟΟΟδ)ηΜδΥ, где η = 5, (δΕΟ ΙΌ ΝΟ:3), 4 (δΕΟ ΙΌ ΝΟ:4), 3 (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 5), 2 (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 6), или 1 (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 7); ΕδΕΕδ (^Ο-ΟΤΡ)ΜδΥ, где ЙСС-СТР = δδδδΚΑΡΡΡδΕΡδΡδΚΌΡΟΡδΌΤΡΡΙΕΡρ (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 8); ΕδΕΕδ (ΕΕΜ)ηΜδΥ, где η = 5 (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 9), 4 (δΕΟ ΙΌ Ν0:10), или 3 (δΕΟ ΙΌ ΝΟ:11); ΕδΕΕδ (ΕΕΟΑΟΌνΕΟΟρΕΜ) ηΜδΥ, где η = 1 (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 12), или 2 (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 13), и любой другой подходящий линкер, который покрывает дистанцию между связывающим сайтом ΙΕΝΑΚ2 и ΙΕΝβ в комплексной модели, и который не образует иммуногенный эпитоп между фрагментами интерферона и рецептора. Предпочтительно, эти линкеры составляют в длину до 30 аминокислот.

Ковалентный комплекс. Одним примером образования химически связанных молекул является сайт-специфическое модифицирование ΙΕΝΑΚ2 путем взаимодействия биодеградируемого линкера, такого как полиэтилен гликоль (ΡΕΟ), с остатками цистеина, присутствующими или вставленными в ΙΕΝΑΚ2 путем того или другого аминокислотного замещения, такого как δе^₂₁₀ на Сук или Акп₈₉ на Сук (сайтнаправленный мутагенез). Могут быть составлены следующие конструкции:

ΙΕΝΑΚ(δ2^)-ΡΕΟη-ΙΕΝβ^κ17), где η = 2000, 5000 или 10000 Да, или IΕNΑΚ(N89С)ΡΕΟη-ΙΕΝβ^κ17).

Образование ковалентных дисульфидных связей между Сук двух различных (необязатель но модифицированных) фрагментов также находится в сфере настоящего изобретения.

Нековалентный комплекс

Проводят образование комплекса человеческого ΙΡΝΑΚ2 с ΙΝΡβ в условиях, которые максимально способствуют образованию активного комплекса. Как изложено в примерах, для получения максимально активного комплекса ίη νίΐτο требуется оптимальное соотношение, составляющее 2,5 нг ΙΡΝΑΚ2 к 1 международной единице (ΜΕ) ΙΝΡβ. Оптимальное соотношение ΙΡΝΑΚ2 к ΙΝΡβ, которое максимально способствует образованию активного комплекса для активности ίη νίνο, в настоящее время определяется, хотя, видимо, оптимальное соотношение зависит от концентрации ΙΝΡβ. Так, например, оптимальное соотношение ΙΡΝΑΚ2 и ΙΡΝβ для увеличения антиопухолевой активности при концентрации 2х10⁴ ΜΕ/мышь/день ΙΡΝβ составляет 2,5 нг ΙΡΝΑΚ2 на пг ΙΡΝβ, тогда как при концентрации 5х10⁴ МЕ/мышь/день ΙΡΝβ оптимальным является 0,3 нг ΙΡΝΑΚ2 на пг ΙΡΝβ. Такое же соотношение используется для максимизации образования активного комплекса ίη νίΐΓο, приводящего к пролонгированию фармакокинетики ΙΡΝ ίη νίνο.

Предпочтительно, ΙΡΝΑΚ2 и ΙΡΝβ, используемые для образования комплекса, являются рекомбинантными молекулами. В антивирусном анализе ίη νίΐτο комплекс интерферон/рецептор проявлял повышенную активность по сравнению с активностью одного ΙΡΝβ. ΙΡΝβ при постоянной концентрации смешивают с различными концентрациями рекомбинантного 8ΙΡΝΑΚ2, и эту смесь (комплекс ΙΡΝΑΚ2/ΙΡΝ) добавляют к клеткам ^Ι8Η (человеческие амниотические клетки). Затем эти ^Ι8Η клетки заражают вирусом везикулярного стоматита (νδν) и регистрируют антивирусную активность ΙΡΝ как степень выживания клеток после 48 ч инкубации. В каждом эксперименте добавление ΙΡΝΑΚ2 к постоянному количеству ΙΡΝβ приводит к дозозависимому увеличению выживания клеток при заражении νδν при оптимальном соотношении ΙΡΝΑΚ2 к ΙΡΝ. Эти результаты доказывают, что комплекс ΙΡΝΑΚ2 и ΙΡΝβ проявляет в антивирусном анализе повышенную активность по сравнению со свободным ΙΡΝβ. Практическими заключениями из этого является то, что комплекс ΙΡΝΑΚ2/ΙΡΝβ обладает большей мощностью и повышенной активностью по сравнению со свободным ΙΡΝ для ряда терапевтических назначений, при которых сам ΙΡΝ является активным. Эти назначения включают такие, при которых свободные ΙΡΝ показывают некоторую терапевтическую активность, такую как антивирусную, противоопухолевую и иммуномодуляторную. Ожидается, что комплекс ΙΡΝΑΚ2/ΙΡΝ в силу своей большей мощности, увеличенной активности и/или улучшенной фармакокинетики (например, период полужизни), будет более эффективным при лечении вирусных, онкологических и иммунных расстройств.

При введении ίη νίνο рецепторный комплекс интерферона увеличивает биодоступность, фармакокинетику и/или фармакодинамику ΙΡΝ путем усиления антивирусных, противораковых и иммуномодулирующих свойств ΙΡΝ.

Повышенная биодоступность ΙΡΝ, опосредованная комплексом, может быть достигнута либо путем предварительного образования нековалентного комплекса ΙΡΝ/ΙΡΝΑΚ, совместного введения свободного ΙΡΝ с ΙΡΝΑΚ, последовательного введения компонента ΙΡΝ или ΙΡΝΑΚ, введения ковалентного комплекса ΙΡΝ/ΙΡΝΑΚ, либо путем введения слитого белка ΙΡΝΑΚ/ΙΡΝ.

В дополнительном воплощении такое увеличение биодоступности может быть также достигнуто путем введения одного компонента ΙΡΝΑΚ, без добавления какого-либо ΙΡΝ. ΙΡΝΑΚ будет образовывать комплекс ίη νίνο с эндогенным ΙΡΝ и таким образом повышать биодоступность, фармакокинетику и/или фармакодинамику эндогенного ΙΡΝ. Это особенно полезно для лечения пациентов с заболеванием или состоянием, которое естественно вызывает индукцию нативного ΙΡΝ, так что ΙΡΝ будет уже циркулировать для выполнения своего природного предназначения, борьбы с таким заболеванием или состоянием. Добавленный ΙΡΝΑΚ будет потенцировать эффекты нативного ΙΡΝ.

Предпочтительные молекулы для применения в комплексах настоящего изобретения имеют последовательность нативного ΙΡΝ и ΙΡΝΑΚ. Нативная последовательность - это последовательность встречающихся в природе человеческих ΙΡΝ или ΙΡΝΑΚ. Такие последовательности являются известными и могут быть легко найдены в литературе. Встречающиеся в природе аллельные вариации также рассматриваются как нативные последовательности.

Настоящее изобретение также касается аналогов вышеупомянутого комплекса ΙΡΝΑΚ/ ΙΡΝ данного изобретения, которые в основном сохраняют такую же биологическую активность, как у комплекса, имеющего, по существу, последовательности нативных ΙΡΝΑΚ2 и ΙΡΝ. Такими аналогами могут быть аналоги, в которых до 30 аминокислотных остатков может быть удалено, добавлено или замещено другими в ΙΡΝΑΚ2 и/или ΙΡΝ фрагментах комплекса, так чтобы модификации такого рода существенно не изменяли бы биологической активности химерного белкового аналога в отношении самого комплекса. Различные аналоги могут сильно отличаться один от другого и от основной комплексной молекулы (которая имеет в основном только встречающиеся в природе последовательности ΙΡΝΑΚ2 и ΙΡΝ) по сайту линкерного пептида, который соединяет два фрагмента в комплекс. Как описано выше, такой линкер предпочтительно составляет в длину приблизительно до 30 аминокислот и служит для разделения фрагментов ΙΕΝΛΚ.2 и ΙΕΝ один от другого в комплексе. Что касается такого линкера, его последовательность необходимо тщательно выбирать (и, следовательно, также биологически тестировать каждый такой аналог в соответствующих стандартных анализах), так, чтобы она не привела, например, к неправильному складыванию комплекса, что может сделать его неактивным, или не увеличит его активности, или сделает аналог комплекса иммуногенным, который будет вызывать появление антител против него у пациента, который подвергнут лечению, что приведет к тому, что такой аналог будет неэффективным, по меньшей мере, как среднеили долгодействующий лекарственный препарат. Что касается вышеупомянутых аналогов комплекса данного изобретения, эти аналоги являются такими, в которых один или несколько, приблизительно до 30, аминокислотных остатков основного комплекса данного изобретения замещены различными аминокислотными остатками или удалены, или один или несколько аминокислотных остатков, приблизительно до 30, добавлены к исходной последовательности комплекса данного изобретения (которая в основном имеет только нативные последовательности ΙΕΝΆΚ.2/ΙΡΝ) без значительного изменения активности полученных продуктов по сравнению с основным комплексом данного изобретения. Эти аналоги получают с помощью известных методик синтеза и/или сайт-направленного мутагинеза, или любой другой подходящей для этого известной методики.

Любой другой аналог предпочтительно имеет последовательность аминокислот, в достаточной степени воспроизводящую последовательность основного комплекса ΙΕΝΆΚ.2/ΙΕΝ так, чтобы иметь активность, в основном подобную активности этого комплекса. Так, может быть определено, имеет ли какой-либо данный аналог, по существу, такую же активность и/или стабильность, как основной комплекс данного изобретения, с помощью рутинных экспериментов, включающих подвергание каждого такого аналога тестам биологической активности и стабильности, приведенным ниже в примерах 27.

Аналоги данного комплекса, которые могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением, или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая их, включают ограниченный набор, по существу, аналогичных последовательностей, как замещенных пептидов или полинуклеотидов, которые могут быть получены обычным способом рядовым специалистом в данной области, без лишних экспериментов, на основании методик и руководств, присутствующих в данном документе. Для детального описания химии и структуры белка см. 8е1ш1х. е! а1, Ргтс1р1ек о£ Рго!еш

8!гис!иге, 8рттдег-Уег1ад, Νον Уотк (1978); и Сте1дй!оп, Т. Е., Рто1е1п8: 81гис1иге апб Мо1еси1аг Рторейтек, Н. Егеешап & Со, 8ап Етаиаксо (1983), которые включены в данном документе в качестве ссылки. Для представления замещенных нуклеотидных последовательностей, таких как предпочтительные кодоны, (см. АикиЬе1 е! а1 (1987, 1992), §§ А.1.1-А. 1.24, и 8ашЬтоок е! а1 (1987, 1992), §§ 6.3 апй 6.4 а! Аррепйюек С апй О).

Предпочтительные изменения аналогов в соответствии с настоящим изобретением - это такие, которые известны как консервативные замещения. Консервативные аминокислотные замещения в комплексе, имеющем в основном встречающиеся в природе последовательности IΕNАΚ2 и ΙΕΝ, могут включать синонимные аминокислоты в пределах группы, в которой они имеют в достаточной степени подобные физико-химические свойства, так что замещение между членами группы будет сохранять биологическую функцию молекулы (СгапШаш, 1974). Ясно, что вставки и удаления аминокислот могут быть также проведены в определенных выше последовательностях без изменения их функции, особенно, если вставки или удаления включают только несколько аминокислот, например, до тридцати, и, предпочтительно, до десяти, и не удаляют или не смещают аминокислоты, которые являются существенными для функциональной конформации, например, остатки (АпЕшкеп, 1973). Аналоги, полученные в результате таких удалений или вставок, входят в объем настоящего изобретения.

Предпочтительно группы синонимных аминокислот являются такими, как определено в табл. Ι. Более предпочтительно группы синонимных аминокислот являются такими, как определено в табл. ΙΙ, и наиболее предпочтительно группы синонимных аминокислот являются такими, как определено в табл. ΙΙΙ.

Таблица Ι. Предпочтительные группы синонимных аминокислот

Аминокислота	Синонимная группа
8ег	8ег, ТЬг, О1у, Акп
Агд	Агд, От, Ьук, О1и, Н1к
Ьеи	11с, РЬс, Туг, Ме!, Уа1, Ьеи
Рго	О1у, А1а, ТЬг, Рго
ТЬг	Рго, 8ег, А1а, О1у, Н1к, От, ТЬг
А1а	О1у, ТЬг, Рго, А1а
Уа1	Ме!, Туг, РЬе, Пе, Ьеи, Уа1
О1у	А1а, ТЬг, Рго, 8ег, О1у
Пе	Ме!, Туг, РЬе, Уа1, Ьеи, Пе
РЬе	Тгр, Ме!, Туг, Пе, Уа1, Ьеи, РЬе
Туг	Тгр, Ме!, РЬе, Пе, Уа1, Ьеи, Туг
Сук	8ег, ТЬг, Сук
Н18	О1и, Ьук, О1п, ТЬг, Агд, Н1к
О1п	О1и, Ьук, Акп, Н1к, ТЬг, Агд, О1п
Акп	О1п, Акр, 8ег, Акп
Ьук	О1и, О1п, Н1к, Агд, Ьук
Акр	О1и, Акп, Акр
О1и	Акр, Ьук, Акп, О1п, Н1к, Агд, О1и
Ме1	РЬе, Пе, Уа1, Ьеи, Ме!
Тгр	Тгр

Таблица II. Более предпочтительные группы синонимных аминокислот

Аминокислота	Синонимная группа
8ег	8ег
Агд	Н18, Ьу8, Агд
Ьеи	Ьеи, Пе, РЬе, Ме!
Рго	А1а, Рго
Тпг	ТЬг
А1а	Рго, А1а
Уа1	Уа1, Ме!, Пе
С1у	С1у
Не	Не, Ме!, РЬе, Уа1, Ьеи
РЬе	Ме!, Туг, Пе, Ьеи, РЬе
Туг	РЬе, Туг
Су8	Су8, 8ег
Н18	Н18, С1п, Агд
С1п	С1и, С1п, Н18
А8П	А8р, А8П
Ьу8	Ьу8, Агд
А8р	А8р, А8П
С1и	С1и, С1п
Ме!	Ме!, РЬе, Пе, Уа1, Ьеи
Тгр	Тгр

Таблица III. Наиболее предпочтительные группы синонимных аминокислот

Аминокислота	Синонимная группа
8ег	8ег
Агд	Агд
Ьеи	Ьеи, Пе, Ме!
Рго	Рго
ТЬг	ТЬг
А1а	А1а
Уа1	Уа1
С1у	С1у
Пе	Пе, Ме!, Ьеи
РЬе	РЬе
Туг	Туг
Су8	Су8, 8ег
Н18	Н18
С1п	С1п
А8П	А8П
Ьу8	Ьу8
А8р	С1и
С1и	С1и
Ме!	Ме!, Пе, Ьеи
Тгр	Ме!

Примеры проведения аминокислотных замещений в белках, которые могут быть использованы для получения аналогов комплекса ΣΕΝΆΚ^/ΓΕΝ для применения в настоящем изобретении, включают любые известные методические стадии, такие как представленные в патентах США КБ 33653; 4959314; 4588585 и 4737462, Магк е! а1; 5116943, Ко!Ьз е! а1; 4965195, №ипеп е! а1; и 5017691 Бее, е! а1, и лизин-замещенные белки, представленные в патенте США 4904584 (81ιπ\ν е! а1).

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения любой аналог комплекса для использования в настоящем изобретении имеет аминокислотную последовательность, по существу, аналогичную последовательности вышеупомянутого основного комплекса данного изобретения. Термин по существу аналогичный подразумевает охваченные аналоги с небольшими изменениями в последовательности основного комплекса, которые не влияют на его основные характеристики, в частности такие, например, которые связаны с его способностью ингибировать пролиферацию раковых клеток или способствовать трансплантации костного мозга. Тип изменений, которые обычно считают относящимися к термину по существу аналогичный, это такие изменения, которые получались бы в результате традиционных методов мутагенеза ДНК, кодирующей комплекс данного изобретения, приводящих к нескольким небольшим модификациям, и которые анализировали на наличие желательной активности с помощью способа, обсужденного выше.

Предпочтительно, фрагмент ΓΕΝΑΚ2 данного комплекса будет иметь коровую последовательность, которая является такой же, как нативная последовательность, или ее биологически активный фрагмент, или ее вариантный аналог, который имеет аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70% идентичности нативной аминокислотной последовательности и сохраняет ее биологическую активность. Более предпочтительно, такая последовательность имеет, по меньшей мере, 85% идентичности, по меньшей мере, 90% идентичности, или наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 95% идентичности нативной последовательности.

Что касается фрагмента ΣΕΝ данного комплекса, коровая последовательность, которая может быть использована, является нативной последовательностью, или ее биологически активным фрагментом, или ее вариантным аналогом, который имеет аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70% идентичности, более предпочтительно, по меньшей мере, 85% или, по меньшей мере, 90% идентичности, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 95% идентичности. Такие аналоги должны сохранять биологическую активность нативной последовательности ΓΕΝ, или ее фрагмента, или обладать антагонистической активностью, как описано ниже.

Термин «идентичность последовательности», использующийся в данном документе, означает, что последовательности сравнивают следующий образом. Последовательности выстраивают в ряд с помощью версии 9 СепеОе С’отриПпд Сгоир'8 САР (д1оЬа1 айдптеп! ргодгат), используя дефолтную (ВЬО8ИМ62) матрицу (значения от -4 до +11) со «штрафом» по открытому гэпу, равному 12 (для первого нуля гэпа) и со «штрафом» по расширенному гэпу, равному -4 (для каждого дополнительного последующего нуля в гэпе). После выстраивания процентную идентичность рассчитывают путем выражения числа совпадений как процент от числа аминокислот в заявляемой последовательности.

Аналоги в соответствии с настоящим изобретением могут быть также определены в соответствии со следующей процедурой. В отно шений как фрагмента ΙΡΝΆΚ, так и фрагмента ΙΡΝ комплекса, ДНК нативной последовательности известна из предыдущего уровня техники, и либо может быть найдена из литературы, расположенной в сопровождающей секции настоящего описания, либо может быть легко обнаружена специалистом в данной области. Полипептиды, которые кодируются какой-либо нуклеиновой кислотой, такой как ДНК или РНК, которая гибридизуется с комплементом нативной ДНК или РНК в очень строгих или умерен строгих условиях, по мере того, как этот полипептид сохраняет биологическую активность нативной последовательности, или в случае ΙΡΝ, или сохраняет биологическую активность, или обладает антогонистической активностью, также попадают в объем настоящего изобретения.

Строгие условия являются функцией от температуры, использующейся в процессе гибридизации, молярности моновалентных катионов и процентного содержания формамида в гибридизационном растворе. Для определения степени строгости, включенной с любым данным набором условий, вначале используют уравнение МешкоШ с1 а1. (1984) для определения стабильности гибридов 100% идентичности, выраженной как температура плавления (Тпл) гибрида ДНК-РНК: Тпл = 81,5°С + 16,6 (1о§М) + 0,41 (%СС) -0,61 (%форм) - 500/Ь, где М представляет собой молярность моновалентных катионов, %СС - процентное содержание нуклеотидов С и С в ДНК, %форм - процентное содержание формамида в гибридизационном растворе, а Ь - длина гибрида в парах оснований. Для каждого 1°С, на который понижается Тпл по сравнению с рассчитанной для гибрида со 100% идентичностью, количество допущенных ошибок увеличивается примерно на 1%. Таким образом, если Тпл, используемая для любого данного процесса гибридизации при конкретных концентрациях соли и формамида на 10°С ниже, чем Тпл, рассчитанная для 100% гибрида в соответствии с уравнением Меткой!, гибридизация будет происходить, даже если количество ошибок достигает приблизительно 10%.

В данном документе очень строгие условия это такие, которые являются толерантными до 15% дивергенции последовательности, тогда как умеренно строгие условия это такие, которые являются толерантными до 20% дивергенции последовательности. Не ограничиваясь этим, в примерах очень строгих (на 12-15°С ниже рассчитанной Тпл гибрида) и умеренных (на 15-20°С ниже рассчитанной Тпл гибрида) условий используют раствор для промывания 2 х 88С (стандартный солевой цитрат) и 0,5% 8Ό8 при соответствующей температуре ниже рассчитанной Тпл гибрида. Окончательная строгость условий в первую очередь обусловлена условиями промывания, особенно, если используемые условия гибридизации являются такими, которые позволяют менее стабильным гибридам образовываться наряду со стабильными гибридами. При очень строгих условиях менее стабильные гибриды удаляются при промывке. Обычные условия гибридизации, которые могут быть использованы с описанными выше условиями промывания от очень строгих до умеренно строгих, это гибридизация в растворе 6 х 88С (6 х 88РЕ), 5 х реагента ПеийагФ, 0,5% 8Ό8, 100 мг/мл денатурированной, фрагментированной ДНК спермы лосося, при температуре, ниже Тпл приблизительно на 20-25°С. Если используются смешанные пробы, предпочтительно использовать хлорид тетраметиламмония (ТМАС) вместо 88С (Ли8иЬе1, 1987, 1998).

Функциональные производные, используемые в данном документе, охватывают производные, которые могут быть получены из функциональных групп, которые встречаются в виде боковых цепей на остатках Ν- или С-концевых групп, с помощью средств, известных в данной области, и включены в данное изобретение пока они остаются фармацевтически приемлемыми, т. е. они не нарушают биологическую активность соответствующего белка комплекса, как описано в данном документе, и не придают токсических свойств композициям, содержащим их, или комплексу, сделанному для них. Производные могут иметь химические фрагменты, такие как углеводные или фосфатные остатки, при условии, что такая фракция имеет такую же биологическую активность и остается фармацевтически приемлемой.

Например, производные могут включать алифатические эфиры карбоксилов карбоксильных групп, амиды карбоксильных групп, полученные путем взаимодействия с аммиаком или с первичными или вторичными аминами, Νацилированные производные свободных аминогрупп аминокислотных остатков, полученные с помощью ацильных фрагментов (например, алканоильных или карбоциклических ароильных групп), или 0-ацилированные производные свободных гидроксильных групп (например из серильных или треонильных остатков), полученные с помощью ацильных фрагментов. Такие производные могут также включать, например, полиэтиленгликолевые боковые цепи, которые могут маскировать антигенные сайты и продлевать присутствие комплекса или его фракций в жидкостях организма.

Термин производные подразумевает включение только тех производных, в которых не происходило изменение одной аминокислоты на другую из двадцати обычно встречающихся в природе аминокислот.

Термин соли относится как к солям карбоксильных групп, так и к кислотным добавочным солям аминогрупп комплекса данного изобретения или его аналогов. Соли карбоксильной группы могут быть образованы с помощью методов, известных в данной области, и включают неорганические соли, например, соли натрия, кальция, аммония, железа или цинка и т. п., и соли, образованные с органическими основаниями, например, с аминами, такими как триэтаноламин, аргинин или лизин, пиперидин, прокаин и т. п. Кислотные добавочные соли включают, например, соли с минеральными кислотами, такими как, например, хлористоводородная кислота или серная кислота, и соли с органическими кислотами, такими как, например, уксусная кислота или щавелевая кислота. Конечно, любые такие соли должны иметь, по существу, биологическую активность, подобную активности комплекса данного изобретения или его аналогов.

Термин «биологическая активность», используемый в данном документе, интерпретируется следующим образом. Поскольку рассматривается фрагмент комплекса ΙΕΝΑΚ2, то важной биологической активностью является его способность связывать интерферон типа Ι. Таким образом, аналоги или варианты, соли и функциональные производные должны быть выбраны так, чтобы сохранить их способность связывать интерферон. Это можно анализировать с помощью рутинных анализов связывания. Кроме того, могут быть также использованы фрагменты ΙΕΝΑΚ2 или их аналоги, если они сохраняют интерферон-связывающую активность. Фрагменты могут быть легко получены путем удаления аминокислот с любого конца интерферон-связывающего полипептида и тестирования полученных фрагментов на интерферон-связывающие свойства. Протеазы для удаления одной аминокислоты с Ν-конца или с Сконца полипептида известны, и, таким образом, определяющие фрагменты, которые сохраняют интерферон-связывающую способность, включают только рутинные эксперименты.

Кроме того, полипептид, который имеет такую интерферон-связывающую активность, будет ли это ΙΕΝΑΚ2, δΙΕΝΑΚ2, аналог или вариант, соль, функциональное производное или его фрагмент, может также содержать дополнительные аминокислотные остатки, фланкирующие интерферон-связывающий полипептид. По мере того как полученная молекула сохраняет интерферон-связывающую способность корового полипептида, с помощью рутинных экспериментов можно определить действительно ли такие фланкирующие остатки влияют на основные и новые характеристики корового пептида, т.е. его интерферон-связывающие характеристики. Термин состоящий по существу, если относится к конкретной последовательности, обозначает, что могут присутствовать дополнительные фланкирующие остатки, которые не влияют на основные и новые характеристики конкретной последовательности. Этот термин не охватывает замещения, удаления или добавления в пределах конкретной последовательности.

Хотя во всем описании и в примерах используются ΙΕΝΑΚ2 иди δΙΕΝΑΚ2, надо понять, что это только предпочтительный пример, и что субъединица ΙΕΝΑΚ1, и особенно ее внеклеточный домен, может заменять ΙΕΝΑΚ2 везде, где бы он ни упоминался в данном описании. ΙΕΝΑΚ1 может быть использован в сочетании с интерферонами, с которыми он связывается. Известно, что ΙΕΝΑΚ1 связывается с ΙΕΝα. Любой комплекс, использующий ΙΕΝΑΚ1 должен быть с разновидностями интерферона, предпочтительно с разновидностями ΙΕΝα, с которым связывается ΙΕΝΑΚ1.

Что касается интерфероновой части комплекса настоящего изобретения, биологическая активность, которая должна сохраняться в любом аналоге или варианте, соли, функциональном производном или фрагменте, является активностью интерферона, положенной для предполагаемого применения. В большинстве примеров это будет способностью связывать нативный клеточный поверхностный рецептор и посредством этого опосредовать продукцию сигнала рецептором. Таким образом, любой такой аналог, производное или фрагмент, должен поддерживать такую рецептор-агонистическую активность, чтобы быть полезным в настоящем изобретении для такого применения. С другой стороны, иногда полезно иметь молекулу с антагонистической активностью по отношению к рецептору, так, чтобы предотвратить биологическую активность нативного интерферона. Такой антагонист может быть также использован для пролонгированного улучшенного эффекта посредством комплекса настоящего изобретения. Для таких применений, в который желательно исключить нежелательный эффект интерферона, аналоги, которые еще связываются рецептором и фрагментом ΙΕΝΑΚ комплекса, но которые не опосредуют сигнал, или блокируют образование сигнала под действием нативного интерферона на этот рецептор, могут также считаться биологически активными для целей данного изобретения и охватываться термином интерферон при использовании в отношении комплексов настоящего изобретения. Прямые анализы могут определить, действительно ли такой аналог сохраняет такую агонистическую активность, или имеет антагонистическую активность по отношению к рецептору, и, таким образом будет полезным для одного из применений настоящего изобретения.

Настоящее изобретение также относится к последовательностям ДНК, кодирующим вышеупомянутый комплекс данного изобретения и его аналоги, а также ДНК векторам, несущим такие последовательности ДНК для экспрессии в подходящих прокариотических или эукариотических клетках-хозяинах. Способность генерировать большие количества гетерологичных белков с помощью системы экспрессии реком бинантного белка привело к развитию различных терапевтических агентов, например, 1-РЛ и ЕРО (ΈάίπβΙοπ. 1995). Могут быть использованы различные экспрессирующие хозяева, начиная с прокариотов (например, бактерии) (Οΐίηδ, 1993) и низших эукариотов (например, дрожжи) (Ка1пег, 1989) заканчивая высшими видами эукариотов (например, клетками насекомых или млекопитающих) (Кеиуепу, 1993; ЕеГГ, 1993), в которых могут быть образованы рекомбинантные белки. Все эти системы основаны на одном и том же принципе - введении последовательности ДНК интересующего белка в клетки выбранного типа (неустойчивым или устойчивым образом, как интегрированный или эписомальный элемент) и использовании механизмов транскрипции, трансляции и транспортации хозяина для сверхэкспрессии введенной последовательности ДНК в виде гетерологичного белка (Кеотеп, 1990).

Кроме экспрессии нативных последовательностей генов, умение обращаться с ДНК на нуклеотидном уровне способствует развитию новых конструированных последовательностей, которые, хотя и основаны на природных белках, обладают новыми активностями в результате изменения первичной структуры белка (Стах1а, 1997).

Более того, выбранные последовательности ДНК могут быть физически связаны с образованием транскриптов, которые проявляются в новых слитых белках, где некогда независимые белки теперь экспрессируются как одна полипептидная единица (1Ьапе/, 1991). Активность таких слитых белков может быть различной, например, более мощной, чем у любого из индивидуальных белков (Сийй, 1991).

Человеческий ΙΕΝβ получают по способу, который использует клетки яичника млекопитающего китайского хомячка (СНО). Интерфероны типа 1 могут быть экспрессированы в ряд клеток-хозяев, включая клетки бактерий (и18ит1, 1987), насекомых (Бтйй, 1983) и человека (Сйп81оГ1Ш8, 1981). Человеческий 8ΙΕΝΆΚ2 также экспрессируют, используя клетки-хозяева СНО. Альтернативно растворимые рецепторы, такие как 8ΙΕΝΆΚ2, могут успешно экспрессироваться в бактериальных экспрессионных системах (ТегН/хе^е, 1996). ДНК для каждого гена вводят в геном СНО, используя метод трансфекции, который приводит к рекомбинации и интеграции экспрессионного вектора. Затем клетки, которые экспрессируют интересующий белок, выделяют, культивируют и белок выделяют и очищают, используя стандартные промышленные процедуры, хорошо известные в данной области.

Данное изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента комплекс ΙΕΝΆΚ2/ΙΕΝ или его аналоги, или их смеси, или их соли, и фармацевтически приемлемый носи тель, разбавитель или эксципиент. Воплощение фармацевтической композиции данного изобретения включает фармацевтическую композицию для увеличения активности типа ΙΕΝ при лечении вирусных заболеваний, противораковой терапии, при иммуномодулирующей терапии и других применениях интерферонов и родственных им цитокинов.

Фармацевтические композиции данного изобретения получают для введения путем смешивания комплекса или его аналогов с физиологически приемлемыми носителями и/или стабилизаторами и/или эксципиентами, и получают в дозировочной форме, например, путем лиофилизации в дозировочных флаконах. Способ введения может осуществляться через любой из допускаемых путей введения для подобных агентов и будет зависеть от состояния, которое надо лечить, например, внутривенно, внутримышечно, подкожно, путем местной инъекции или наружного применения, или длительно путем инфузий и т. д. Количество активного соединения, которое должно быть введено, будет зависеть от способа введения, заболевания, подлежащего лечению и состояния пациента. Местные инъекции, например, будут требовать более низкого количества белка по отношению к весу тела, чем при внутривенной инфузий.

Свободный ΙΕΝβ имеет тенденцию к олигомеризации. Для подавления этой тенденции современные композиции на основе ΙΕΝβ имеют кислый рН, который может вызвать некоторое местное раздражение при введении. Так как ΙΕΝΆΚ может служить как стабилизирующий фактор для ΙΕΝβ и посредством этого предотвращать олигомеризацию, его применение в композициях на основе ΙΕΝβ может служить для стабилизации ΙΕΝβ и таким образом позволяет избежать необходимости в кислых составах. Соответственно, некислая фармацевтическая композиция, содержащая ΙΕΝβ и ΙΕΝΆΒ вместе с другими традиционными фармацевтически приемлемыми эксципиентами также является частью настоящего изобретения.

Настоящее изобретение также относится к применениям комплекса данного изобретения или его аналогов или их смесей для антивирусной, противораковой и иммуномодулирующей терапии. Особенно комплексы рецептор интерферона-интерферон данного изобретения являются полезными для антивирусной терапии при таких терапевтических показаниях, как хроническая гранулематозная болезнь, остроконечная кондилома, юношеский папилломатоз гортани, гепатит А и хронические инфекции вирусов гепатита В и С.

Особенно комплексы рецептор интерферона-интерферон данного изобретения являются полезными для противораковой терапии при таких терапевтических показаниях, как волосатоклеточный лейкоз, саркома Капоши, рассеян ная миелома, хронический миелоидный лейкоз, лимфома и меланома не-Ходжкина.

Комплексы рецептор интерферонаинтерферон данного изобретения являются полезными для иммуномодулирующей терапии при таких заболеваниях, как рассеянный склероз, ревматоидный артрит, тяжелая псевдопаралитическая миастения, диабет, СПИД, волчанка и т. д.

Настоящее изобретение также относится к комплексу или его аналогам, или их смесям для применения в получении лекарственных препаратов для лечения вышеупомянутых болезней, или для применения в вышеуказанных показаниях.

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно в следующих не ограничивающих примерах и сопровождающих рисунках.

Примеры

Материалы и методы

Антивирусный биоанализ \νΙ8Η и образование комплекса:

\νΙ8Η-метод был разработан на основании работы ΝονΚ1< е1 а1 (1982).

Материалы:

- νΙ8Η клетки (АТСС ССЬ 25),

- препараты вируса везикулярного стоматита (АТСС ν-520-001-522), хранение при -70°С,

- ΙΡΝβ, человеческий рекомбинантный, ППегРкагт ^аЬο^аΐο^^е8 ЬТО 90 х 10⁶ МЕ/мл специфическая активность: 264,5 х 10⁶ МЕ/мг,

- человеческий растворимый ΙΡΝΑΚ2, концентрация для хранения в РВ8 373 мкг/мл,

- среда для выращивания \νΙ8Η (ΜΕΜ с высокой глюкозой и с солями Эрла + 10% ΡΒ8 + 0,1 % Ь-глютамин + пенициллин/стрептомицин (100 Е/мл, 100 мкг/мл)

- среда для метода \νΙ8Η (ΜΕΜ с высокой глюкозой с солями Эрла + 5% ΡΒ8+ 0,1% Ьглютамин + пенициллин/стрептомицин (100 Е/мл, 100 мкг/мл), МТТ, 5 мг/мл в РВ8, хранение при -70°С.

Методы:

- Развести рекомбинантный человеческий ΙΡΝβ до 19 МЕ/мл (4Х предварительно определенная доза ЕС₅₀) в среде для метода \νΙ8Η.

- Начиная с 90 мкг/мл, сделать одиннадцать (11) трехкратных разведений человеческого рекомбинантного δΙΡΝΑΚ.2 в пробирках Эппиндорфа в среде для \νΙ8Η. 12-ая пробирка содержит только среду \νΙ8Η.

- Добавить 25 мкл ΙΡΝβ в каждую лунку плоскодонного 96-луночного планшета (добавить 25 мкл только среды \νΙ8Η в секцию 3х12 для контроля действия ΙΡΝΑΚ2 в отсутствие ΙΡΝβ).

- Добавить 25 мкл каждого разведения 8ΙΡΝΑΚ2 (или только среду в 12 ряд) в трех кратном разведении вниз на 12 рядов 96луночного планшета.

- Проинкубировать ΙΡΝβ с 4ΡΝΑΚ.2 в течение 1-4 ч при 37°С в инкубаторе перед добавлением \νΙ8Η клеток.

- Собрать \νΙ8Η клетки в логарифмической фазе роста в растворе трипсин/ΕΌΤΑ, промыть в \νΙ8Η среде, и довести до конечной концентрации 0, 8 х 10⁶ клеток/мл.

- Добавить по 50 мкл суспензии \νΙ8Η клеток (4 х 10⁴ клеток в лунку) в каждую лунку. Конечная концентрация ΙΡΝβ и 8ΙΡΝΑΚ2 такая, как представлена клеткам, то есть конечная концентрация ΙΡΝβ составляет 4,75 МЕ/мл (ΙΧ) и конечная концентрация 8ΙΡΝΑΚ2 в первом ряду составляет 22,5 мкг/мл.

- После инкубации в течение 24 ч в инкубаторе при 5% СО₂, 50 мкл 1:10 разведения (в \νΙ8Η среде) раствора νδν (в дозе, которая предварительно определена для лизиса 100% \νΙ8Η клеток за 48 ч) добавляют во все лунки, за исключением контрольных (туда добавляют равное количество среды) .

- После еще одной инкубации в течение 48 ч 25 мкл раствора МТТ добавляют во все лунки, после чего планшет инкубируют еще 2 ч в инкубаторе.

- Содержимое лунок удаляют, перевернув планшет и добавляют 200 мкл 100% этанола в лунки.

- Через 1 ч планшеты считывают при 595 нм, используя программное обеспечение 8οΠ тах Рго и 8рес!татах спектрофотометр (Μο1еси1аг Ое\зсе5).

Все реакции секвенирования проводят, используя набор Τйе^тο8е^иеηа8е™ радиоактивно меченого терминатора цикла секвенирования (ΑιικΓδΙιηιη Ы£е 8с1спсс; Оетек-шй, ОН). Придерживаются методики производителя. Все реакции секвенирования анализируют на Са8ΐΑтау™ РгесаЧ гелях для секвенирования (§1га(адеие; Е-аШИа, СА) которые содержат 6% полиакриламида и 7М мочевины. Реакции секвенирования загружают в порядке Α-С-О-Т. Авторадиографию гелей для секвенирования считывают согласно инструкции. Для анализа последовательности ДНК используют программное обеспечение Тке СеиеРсх СотрШег Отоир 8ес.|пейсе ΑιτιΕ-δίδ 8οΠ\ν;·ιΐΌ Раскаде и υΝΙΧ \\όγ1<4;·ιΙίοη.

Пример 1.

Для определения антивирусной активности человеческого §ΙΡΗΑΚ2/ΙΡΝβ комплекса и человеческого δΙΡΝΑΚ.2Ι§-ΙΡΝβ комплекса, фиксированную концентрацию ΙΡΝβ (4,75 МЕ/мл) преинкубируют в течение 3 ч при 37°С с человеческим 8ΙΡΝΑΚ2 (рекомбинант р40) или человеческим δΙΡΝΑΚ.2Ι§ при различных концентрациях (0,25 - 300000 нг/мл) и затем определяют в \νΙ8Η-Υ8ν цитопатическом тесте. В отсутствие

ΙΕΝ антивирусная защита не обнаруживается (результаты не представлены).

Антивирусная активность интерферонов типа I (использованных в предопределенных концентрациях ЛД50) в присутствии приблизительно 30 нг/мл 8ΙΕΝΆΚ2 обнаруживается при оптимальной агонистической активности с ΙΕΝβ, но не сама по себе. Антивирусную активность измеряют по концентрации МТТ через 48 ч после добавления У8У.

Если интерферон находится в ожидаемой концентрации для ЛД₅₀, наблюдают защиту (см. фиг. 1 - абсорбция, равная 0,45, отсутствие защиты - абсорбция ~0,0, полная защита - абсорбция ~1,8). Если ΙΕΝΑΚ2 и ΙΕΝΆΚ2Ι§ титруют при различных концентрациях, получают ~4Х усиление активности ΙΕΝβ вплоть до 32 нг/мл ΙΕΝΑΚ2 и ΙΕΝΆΚ2Ι§ (также см. пример 2 и фиг. 2). Выше 32 нг/мл ΙΕΝΑΒ2 и ΙΕΝΑΒ2Ι§, активность ΙΕΝβ уменьшалась, как и ожидали, предположительно за счет «борьбы» за ΙΕΝβ и между δΙΕΝΛΚ. и мембранным ΙΕΝΛΚ.. Этот эксперимент, таким образом, поддерживает предположение о повышенной потенции и усиленной активности ΙΕΝβ в комплексе ΙΕΝΛΚ.2/ΙΕΝ.

Пример 2.

Эффект влияния изменения концентрации ΙΕΝβ на активности в комплексе 4ΕΝΑΚ.2/ΙΕΝ проверяли при различных концентрациях ΙΕΝβ в дополнение к ΕΌ₅₀. Как видно на фиг. 2, при 4,75 МЕ/мл ΙΕΝβ, преинкубация ΙΕΝΑΚ2 в течение 1 ч усиливает активность ΙΕΝβ в ~2Х при максимальной концентрации -32 нг/мл. При каждой из более высоких концентраций ΙΕΝβ, уже невозможно определить усиление антивирусной активности ΙΕΝβ, т.к. активность и так максимальна. Эти результаты также подтверждают, что ΙΕΝΑΚ2/ΙΕΝβ комплекс имеет усиленную активность ΙΕΝ.

Пример 3.

Кинетику образования комплекса ΙΕΝΑΚ2/ ΙΕΝβ оценивали путем измерения антивирусной активности субэффективной концентрации ΙΕΝβ (0,95 МЕ/мл) за различное время преинкубации при различных концентрациях ΙΕΝΑΚ2. Как видно на фиг. 3, 4 ч преинкубация необходима для усиления антивирусной активности ΙΕΝβ при этой субэффективной дозе. Таким образом, при уровнях ΙΕΝβ, в которых он неактивен сам по себе, добавление ΙΕΝΛΚ.2 для образования комплекса приводит к значительной антивирусной активности ΙΕΝ. Этот эксперимент является дополнительным подтверждением того, что комплекс ΙΕΝΑΚ2/ ΙΕΝβ усиливает активность ΙΕΝ.

Пример 4.

Полагают, что биоактивность ΙΕΝβ быстро падает вслед за реконституцией ίη νίίτο при 37°С (РВ8 рН 7,4). Это происходит, по крайней мере, частично за счет формирования олиго мерных структур ΙΕΝβ, которые имеют пониженную активность. Чтобы проверить, усиливает ли ΙΕΝΛΚ.2 стабильность ΙΕΝβ при физиологических рН, провели эксперимент, в котором ΙΕΝβ при различных концентрациях инкубировали сам по себе (в ΚΡΜΙ 1640 среде, 61Ьсо) или в этой же среде в присутствии ΙΕΝΑΚ.2 при постоянном соотношении ΙΕΝΛΚ.2 к ΙΕΝβ (2,5 нг/МЕ).

ΙΕΝβ (500 МЕ/мл) проинкубировали с равным объемом или 4ΕΝΑΚ.2 (1,25 мкг/мл) или только с ΒΡΜΙ в течение 3 ч при 37°С. Титрование обоих растворов ΙΕΝβ проводили в \νΙ8Η среде в 96-луночном планшете до добавления \νΙ8Η клеток. У8У добавили через 24 ч, и измерение проводили еще через 48 ч инкубации, как и определяют превращение МТТ.

Как видно на фиг. 4, ΙΕΝβ сам по себе имеет ΕΌ₅₀ -104 МЕ/млм, а преинкубация ΙΕΝβ с растворимым ΙΕΝΆΚ2 приводит к значительному увеличению ΕΌ₅₀ = ~7 МЕ/мл. Высокая ЛД₅₀ ΙΕΝβ самого по себе возможна благодаря олигомеризации ΙΕΝβ в растворе. Выше приведенные результаты еще раз показывают повышение стабильности ΙΕΝβ в комплексе с ΙΕΝΛΚ.2.

Пример 5.

Чтобы оценить происходит ли повышение активности ΙΕΝβ в присутствии ΙΕΝΆΚ2 благодаря специфической защите 5ΙΕΝΛΚ.2. активность ΙΕΝβ измеряли вслед за образованием комплекса с ΙΕΝΆΚ2 или другими неродственными белками в той же концентрации (человеческий Ι§Ο, бычий сывороточный альбумин (В8А)).

Как показано на фиг. 5, ΙΕΝβ (500 МЕ/мл) проинкубировали с равным объемом из вышеуказанных белков (1,25 мкг/мл) или только с ΒΡΜΙ в течение 4 ч при 37°С. Титрование этих растворов ΙΕΝβ в \νΙ8Η среде проводили в 96луночных планшетах перед добавлением \νΙ8Η клеток. Свежеприготовленный ΙΕΝβ также включают для определения эффекта преинкубации на активность ΙΕΝβ. У8У добавляют через 24 ч и СРЕ оценивают еще через 48 ч инкубации по превращению МТТ.

Преинкубация ΙΕΝβ с не специфическими белками (например, В8А или ΙβΟ) человека при 2,5 нг/МЕ ΙΕΝβ не защищала активность ΙΕΝβ после восстановления. Активность ΙΕΝΑΚ2/ ΙΕΝβ комплекса в этом тесте сходна с активностью свежедобавленного ΙΕΝβ, что поддерживает идею о том, что ΠΕΝΑΚ.2 стабилизирует активность ΙΕΝβ.

Пример 6.

Комплекс ΙΕΝΑΚ.2/ΙΕΝβ имеет сильно пролонгированный фармакокинетический профиль ΙΕΝβ у мыши при определении с помощью ЕЫ8А и биотестов (фиг. 6 и 7).

Мыши линии Β6Ό2Ε1 получили одно внутривенное болюсное введение или человече ского ΙΡΝβ (2,5 х 10⁶ МЕ/кг) или ту же концентрацию ΙΡΝβ; проинкубированного в течение 1 ч при 4°С с человеческим ΙΡΝΛΚ.2 (2,5 нг/МЕ ΙΡΝ). Сыворотки собирают через 0,05 - 48 ч после введения из ретроорбитального синуса, и концентрацию ΙΡΝβ, а также антивирусную активность ΙΡΝβ оценивают по ЕЫБЛ (фиг. 6) или по νΙ8Η биотесту (фиг. 7) соответственно. При концентрациях сыворотки ниже уровня чувствительности теста (7,55 МЕ/мл) в ЕЫ8Л результаты не отображают.

Комплекс показал не только расширенный фармакокинетический профиль, но и по νΙ8Η антивирусному анализу уровень биологической активности ΙΡΝβ у мыши был сильно увеличен по времени, что показывает повышенную стабильность и пролонгированное время полужизни комплекса ΙΡΝΛΚ.2/ΙΡΝβ настоящего изобретения по отношению только к ΙΡΝβ.

Пример 7.

ΙΡΝΛΚ.2/ΙΡΝα2α комплекс показывает очень пролонгированный фармакокинетический профиль ΙΡΝα2α в мыши на основании ΕΕΙ8Ά и биотестов (фиг. 8 и 9).

Мыши линии Β6Ό2Ρ1 получили одно внутривенное болюсное ведение или человеческого ΙΡΝα (1,25 х 10⁵ МЕ/кг) или ту же концентрацию ΙΡΝα, проинкубированного в течение 1 ч при 4°С с человеческим ΙΡΝΑΚ2 (14,9 нг/МЕ ΙΡΝ). Сыворотку собирали в обозначенное время после введения из ретроорбитального синуса и оценивали концентрацию ΙΡΝα2α и антивирусную активность ΙΡΝα по ΕΕΙ8Ά (фиг. 8) или по \νΙ8Η биотесту (фиг. 9) соответственно.

ΙΡΝα оценивали по ΕΕΙ8Ά, специфичному к человеческому ΙΡΝα. Сыворотки, концентрация которых была ниже уровня чувствительности теста (30 МЕ/мл) в ЕЫ8Л, не отмечали.

Комплекс показал не только расширенный фармакокинетический профиль для ΙΡΝα, но и по νΙ8Η антивирусной активности уровень биологической активности ΙΡΝα у мыши был сильно увеличен по времени, что показывает повышенную стабильность и пролонгированное время полужизни в плазме комплекса ΙΡΝΑΚ2/ΙΡΝα. настоящего изобретения в отношении только ΙΡΝα.

Пример 8. Конструирование ΙΡΝΛΚ.2/ΙΡΝ сшитых белков.

Конструкции созданы таким образом, что С-конец внеклеточного домена ΙΡΝΑΚ2 сшит с Ν-концом зрелого ΙΡΝ, с помощью следующих пептидных линкеров, 6 и 8, представляющих собой аминокислоты глицин и серин соответственно: внеклеточный ΙΡΝΑК.2 (линкер) зрелый ΙΡΝβ.

. . .Ε8ΕΡ8(66668)ηΜ8Υ, где η = 0 (8 ЕС) ГО ΝΟ: 5), 1(8Ер ГО ΝΟ:7), 2 (8 ЕС) ГО ΝΟ:6), 3 (8 ЕС) ΙΌ ΝΟ:5), 4 (8 ЕС) ΙΌ ΝΟ:4) и 5 (8 ЕС) ΙΌ ΝΟ:3).

Полная аминокислотная последовательность, η = 2 ΙΡΝΑΚ2/ΙΡΝβ химеры показана на фиг. 10 (8ЕС) ΙΌ ΝΟ:14).

Вектор экспрессии ρ8νΕΙΡ, который содержит ген, экспрессирующий человеческий рекомбинантный ΙΡΝ, использовали как матрицу для ПЦР. Синтетические праймеры были созданы таким образом, что только кодирующий участок зрелого белка человеческого ΙΡΝ(Μ8Υ..) может быть амплифицирован с матрицы. 5' праймер состоит из последовательностей для сайта расщепления 8таф последних 7 аминокислот ΙΡΝΑΚ2 (66Ε8ΕΡ8) остатков 344349 последовательности (8ЕЦ ГО ΝΟ:14) и (СССС8)|(8ЕЦ ГО ΝΟ:1) линкера. ВатШ и ΧΙιοΙ сайты также введены в 5' ПЦР праймер для облегчения клонирования других кассет. 3' праймер содержит ΑντΙΙ сайт сразу после Τ6Α стоп-кодона ΙιΙΕΝβ. ПЦР содержала примерно 1 г матричной ДНК, 1 г каждого ПЦР праймера, 0,2 мМ каждого дАТФ, дСТФ, дГТФ и дТТФ, ΙΧ ТйегтоРо1 Кеаейоп Вийег (10 тМ КС1, 20 тМ ТГ18-НС1, (ρΗ 8,8, при 25°С), 10тМ (ΝΗ₄)₂8Ο₄, 2 тМ, Μ§8Ο.·|. 0,1% Ττίΐοη Χ-100: №\ν ЕпДанб Вю1аЬк; Βеνе^1у, ΜΑ) и 3тМ Μ§8Ο₄ (5тМ Μ§8Ο₄ конечная концентрация) в объеме реакции 100 мкл. После νΕΝΤΚ® начальной инкубации при 99,9°С в течение 30 с, 2 единицы νΕΝΤΚ® ДНК полимеразы добавляют к реакции. ПЦР состоит из 20 циклов, таких как: а) 99,9°С 30 с, б) 65-55°С 30 с, понижение на 0,5°С с каждым циклом, с) 75°С 40 с. Еще 15 циклов делают по вышеуказанному профилю, но температуру отжига поддерживают при 55°С. Реакции ПЦР очищают, используя \νίζ;·ΐΓ<ί^ΙΛΙ РСК Ргерк ΌΝΑ Рипйсайоп 8уЧет (Рготеда; Майкоп, νΙ). После расщепления продуктов ПЦР ΑντΙΙ, реакции очищают при низкой точке плавления в агарозном геле. Гель-очищенные фрагменты, содержащие последовательность 11 ΙΡΝβ зрелого белка с 1 68 линкером, лигируют в (8таI + ΑντΙΙ(-расщепляемый вектор экспрессии ρСΜV-ρ40, который содержит ген, кодирующий растворимую форму человеческого рекомбинантного ΙΝΡΑΚ2. Реакцию лигирования используют для трансформации компетентных клеток Е. сой ХЬ-1 голубых клеток, используя стандартные способы (8атЬгоок е! а1, 1989). Правильную сборку конструкции, называемую ρСΜV-IΡNΑК2/IΡNΑβ68 подтверждают расщеплением рестрикционной эндонуклеазой и секвенированием ПЦР-образуемого участка внутреннего слияния. Последующие конструкции создавали с помощью кассет олигонуклеотидов, каждая содержала ВатШ выступ, соответственно (66668)п линкер (8ЕЦ ГО ΝΟ:1, η = 1) и ХМ выступ. О 68 кассеты содержали 8та! и ΧΙμΙ выступы. После подтверждения ρСΜV-IΡNΑК2/IΡNΑβ 1 68 вектора, его расщепляют 8та! и ΧΙμΙ и соответствующие кассеты лигируют в этот вектор. Для О 68 кон струкции вектор расщепляют 3ιη;·ιΙ и ΧΙιοΙ для лигирования с кассетой.

Создают общий из 6 векторов, ρСΜVΙΕΝΑΚ2 /Ш^п (63), где п является 0, 1, 2, 3, 4 или 5 66663 (3Ε6 ΙΌ ΝΟ: 1) линкерными единицами. Результаты рестриктозного расщепления показаны на фиг. 11. Праймеры секвенирования конструируют так, что кассета для каждой конструкции секвенируется полностью. Для каждой из подтвержденных конструкций получают культуры плазмидной ДНК в большом количестве, используя коммерчески доступный набор и протоколы, описанные производителями (фадеп; ^ай^Лй, СΑ).

Фиг. 12 представляет собой иллюстративную плазмидную карту ρСΜV-IΕNΑΚ2/IΕNβ внутренних слитых векторов экспрессии. Транскрипция ΙΕΝΑΚ2/ΙΕΝβ слитого белка управляется человеческим непосредственным ранним промотером 6Μν. Сигнальную последовательность полуаденилирования гормона роста человека (й6Н), предоставляемую посредством вектора, используют для процессинга 3' ΙΕΝΑΚ2/ΙΕΝβ транскриптов.

Список векторов

Номер	Название	Вектор экспрессии	66663 (3ΕΡ ГО ΝΟ: 1), линкер
1	ρСΜV-IΡNΑК2-IΡNβ, О63	ΡСΜV.ΡΑ4	Ν/Α
2	ρСΜV-IΡNΑК2-IΡNβ, 163	ΡСΜV.ΡΑ4	один
3	ΡСΜV-IΡNΑК2-IΡNβ, 263	ΡСΜV.ΡΑ4	два
4	ρСΜV-IΡNΑК2-IΡNβ, 363	ΡСΜV.ΡΑ4	три
5	ρСΜV-IΡNΑК2-IΡNβ, 463	ΡСΜV.ΡΑ5	четыре
6	ρСΜV-IΡNΑК2-IΡNβ, 563	ΡСΜV.ΡΑ4	пять

Информация о последовательности получена для ПЦР-образованного участка ΙΕΝΑΚ2/ ΙΕΝβ 163 химеры; эта информация показывает, что последовательность такая, как и было предсказано. Информация о последовательности получена для участка пептидного линкера других конструкций; последовательности такие же, как были предсказаны.

На клетках, трансфицированных каждым из конструктов, проводили нозерн-блот анализ. Полоса размера приблизительно 1,4 тпн имеется во всех дорожках, содержащих ΙΕΝΑΚ2-ΙΕΝβ п 63 образцы для ΙΕΝΑΚ2 пробы и для ΙΕΝβ пробы. В ΙΕΝβ пробе обнаружена дополнительная полоса приблизительно в 0,9 тпн. Дорожка такого размера может соответствовать транскрипту альтернативного сплайсинга, который содержит 6 последних аминокислот ΙΕΝΑΚ2 (п) 63 пептидный линкер и кодирующую последовательность ΜΕΝ зрелого белка. Это подтверждается секвенированием кДНК, полученной из общей РНК, выделенной из временно трансфицированных клеток СНО примера 9.

Пример 9. Временная трансфекция.

Клетки СНО-ΌυΚΧ представляют собой клональный мутант клеток яичников китайского хомячка, без дигидрофолатредуктазной активности (иг1аиЬ е! а1 (1980), 6гаГГ е! а1 (1982)). Клетки поддерживают на Альфа Минимальной необходимой среде («МЕМ) плюс рибонуклеозиды и дезоксирибонуклеозиды, снабженные 10% плодной бычьей сывороткой (ΕΒ3) и 1% Ьглютамином (полная среда). Временную трансфекцию осуществляют с использованием Б-ίροГес!атте РЬи3^ТМ Кеадеп! (6&μΒΚΤ ЬгГе Тесйпск^ев; 6аййег8Ьигд, ΜΌ) и методики, предложенной производителем. Приблизительно за 24 ч до трансфекции клетки размещают на чашках 100 мм диаметра с плотностью 2 х 10⁶ клеток/чашка. Для трансфекции используют 4 мкг суперскрученной векторной плазмидной ДНК (ρ6Μν-ΙΕΝΑΚ2/ΙΕΝ п 63, где п = 0, 1, 2, 3, 4, 5). Для разведения ДНК и РЬи3 реагента используют бессывороточную среду, предоставляемую производителем. Клеточные супернатанты собирают после инкубации при 37°С в течение 48 ч в полной среде для ΕΟ3Α (ΙΕΝΑΚ2-ΙΕΝβ) и Вестерн гелей.

Экстрагирование РНК и нозерн анализ.

Общую клеточную РНК (Оютс/упхк! е! а1 1987) экстрагируют из временно трансфицированных СНО-ΌυΚΧ клеток. 10 г тотальной РНК на дорожку фракционируют по размеру в агарозных гелях, которые содержат формальдегид в качестве денатурирующего агента. Образцы размещают в дубликатах. РНК переносят на 6епе3сгееп Р1из найлоновые мембраны (^иΡοηί/NΕ^ Мей1са1 Ргойисй; ΒοδΙοιι, ΜΑ) путем капиллярного блота в 10 х 33С (1,5М хлорид натрия, 0,15М цитрат натрия). Иммобилизованную РНК гибридизуют с меченными ³²Р 11ΙΕΝΑΚ2 и ΙιΙΕΝβ ПЦР фрагментами в растворе, модифицированном из раствора Сйигсй и 611Ьей (1984). Буфер содержит 0,25М фосфата натрия, рН 7,2 0,25М хлорида натрия, 7% додецилсульфата натрия (3Ό3), 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты и 100 мкг/мл Ε.μ1ι тРНК. Меченные ³²Р зонды получают, используя коммерчески доступный набор (Н1дй Рпте Βοей^^ηде^ Маппйе1т; ^^ρο^δ, ΙΝ) и методики, описанные здесь. Невключенную радиоактивность отмывают с помощью хроматографии на 3ерйайех 6-50 колонках. После гибридизации блоты промывают, наиболее строгие условия представляют собой 0,2 х 33С, 0,1% 3Ό3 при 65°С. Блоты радиографируют.

Экспрессия внутренних слитых белков.

Супернатанты каждой внутренней слитой конструкции временно трансфицируют в СНО клетки, анализируют на уровень экспрессии ΙΕΝΑΚ2 и ΙΕΝβ, используя ΙΝΕΑΚ2 специфические ΕΟ3Α и ΙΕΝβ ΕΟ3Α (Γοπη·), соответственно. Результаты этого анализа показаны ниже в табл. Ιν.

Таблица ΙΥ. Внутренние слитые конструкции, временно трансфицированные в СНО клетки

Идентификация образца	[ΜΕΝβ]* (Е/мл)	[ΜΝΑΚ2]' (нг/мл)	[ΜΕΝβ] (мкг/мл)	[ΜΕΝβ]# пмоль)	[ΜΕΝΑΚ2]+ пмоль)	ΙΕΝ/ ΙΕΝΑΚ
008	29,175	1094	0,146	6,571	31,802	0,207
108	24,906	994	0,125	5,609	28,895	0,194
208	13,597	600	0,068	3,063	17,442	0,175
308	14,998	718	0,075	3,378	20,857	0,162
408	9,998	535	0,050	2,251	15,538	0,145
508	9,597	540	0,048	2,161	15,698	0,138
ΙΕΝΑΚ2	Не обнаружено	1176			34,200
Культуральная среда	Не обнаружено	0

* - определено при помощи набора Тогау ' - определено с помощью ΜΕΝΑΚ2 ΕΌΙ8Α '' - на основании специфической активности 2,0 х 10⁵ Ε/тд (2 х 10⁸/тд) # - основано на массе в 22 200 дальтон (средняя масса по ΜΑΌΌΙΤΟΕ анализу ΙιΙΕΝβ) + - основано на массе в 34 400 дальтон (средняя масса по ΜΑΕΌΙΤΘΕ анализу)

Как можно понять, с увеличением длины линкера наблюдается уменьшение определения ΙΕΝΑΚ2 и ΙΕΝβ. В это же время, невозможно установить происходит ли это благодаря понижению экспрессии количества внутреннего слитого белка вследствие увеличения длины линкера, или поскольку длина линкера увеличивается, ΙΕΝβ может связаться с ΙΕΝΑΚ2 связывающим сайтами и, таким образом, не полностью определяется с помощью ΕΌΙ8Α. Известно, что ΙΕΝβ анализ определяет только несвязанный ΙΕΝβ.

Вестерн блот анализ ΙΕΝΑΚ2/ΙΕΝβ составного белка

Для того чтобы установить, что внутренние слитые белки экспрессируются при определенном молекулярном весе и что нет свободного экспрессируемого ΙΕΝβ, супернатанты от трансфицированных клеток анализируют с помощью Вестерн блотинга с использованием анти-ΙΕΝβ антител для определения внутреннего слияния. Результаты анализа показаны на фиг. 13.

мкл культуральных супернатантов от клеток СНО временно трансфицированных ΙΕΝΑΚ2/ΙΕΝβ конструкциями (дорожки 1-6) или ΙΕΝΑΚ2 конструкциями (дорожка 7), культуральную среду (дорожка 8) или ΙΕΝβ (дорожка 9) подвергли 8Ό8-ΡΑ0Ε в невосстанавливающих условиях, а за этим электропереносу на ΡΥΌΕ мембрану. Мембрану зондировали антителами кролика к ΙΕΝβ и затем антителами козы против кролика, конъюгированными с щелочной фосфатазой с использованием ^еδ!ет-8!а^ набора определения люминисценции.

Не было обнаружено свободного ΙΕΝβ в супернатантах любой из внутренних слитых конструкций. Более того, каждая из конструкций экспрессировала белок, который при Вестерн блоте имел соответствующий ΜΒ для каждой составной внутренней слитой конструкции.

Пример 10. Антивирусная активность внутренних слитых молекул.

Каждый культуральный супернатант, содержащий внутреннюю химеру, тестируют на антивирусную активность в тесте цитопатичности, в котором ^Ι8Η клетки (амниотические клетки человека) подвергают действию У8У, а за тем добавляют или ΙΕΝβ (контроль) или внутренние химеры. Результаты приведены на фиг. 14.

Супернатанты СНО клеток, содержащие экспрессированные рекомбинантные белки (что определено в ΕΌΙ8Α и Вестерн блоте) или СНО культуральную среду саму по себе добавили в повторах в верхний ряд 96-луночного плоскодонного планшета в объеме 75 мкл/лунка. 50 мкл клеток ^Ι8Η добавляли в оставшиеся лунки планшета. Трехкратные последовательные разведения каждого образца проводили путем удаления 25 мкл из лунок, содержащих супернатанты (верхний ряд) и добавления их в следующий ряд содержащий 50 мкл ^Ι8Η тестируемой среды. В лунках положительного контроля супернатант в верхнем ряду замещают средой \νΙ8Η, содержащей 1000 МЕ/мл человеческого ΙΕΝβ, который затем разводят трехкратно далее по всей длине планшета. В каждой лунке, таким образом, получается 50 мкл суспензии \νΙ8Η клеток (0,6 х 10⁶ клеток/мл в ΧΫΙ8Η тестируемой среде), так, что конечная концентрация в верхнем ряду, содержащем ΚΕΒΙΕ®, составляет 500 МЕ/мл и начальное разведение для супернатантов СНО клеток составляет 1:2. После 24 ч инкубации в 5% СО₂ при 37°С в каждую лунку (за исключением тех, которые представляют собой неинфицированные контрольные лунки) добавляют 50 мкл ΧΫΙ8Η тестируемой среды, содержащей У8У (1:10 из раствора для хранения) . Жизнеспособность \νΙ8Η клеток определяют после 48 ч инкубации культуры по превращению МТТ.

Антивирусную активность, опосредованную внутренними слитыми молекулами, определяют путем нормализации фактора разведения супернатантов, необходимого для достижения ЕС₅₀ до ЕС₅₀, определяемой для очищенного человеческого стандарта ΙΕΝβ. С увеличением длины линкера увеличивается антивирусная активность внутренних слитых конструкций.

Пример 11.

Этот пример представляет собой фармакокинетическое исследование комплекса человеческого ΙΕΝΑΚ2/ΙΕΝβ у мыши после внутривенного введения. Сравнение проводят между приготовленными заранее и раздельно введенными компонентами комплекса. 36 мышей линии Ό2Ε1 (6-8 недельные приблизительно 20 г каждая) разделили на 4 группы следующим образом:

Группа 1 содержала 9 мышей для внутривенного введения единственной болюсной дозы 200 мкл 50 000 МЕ/мл человеческого ΙΕΝβ (конечная доза 10 000 МЕ/мышь).

Группа 2 (9 мышей) получила 200 мкл раствора 5000 МЕ/мл человеческого ΙΕΝβ и 125 мг/мл 8ΙΕΝΑΚ2 (2,5 нг/МЕ соотношение).

Группа 3 (9 мышей) получила (1) 200 мкл раствора 125 мг/мл, а за этим (2) 200 мкл раствора 50 000 МЕ/мл человеческого ΙΕΝβ (2,5 нг/МЕ соотношение).

Группа 4 (9 мышей) получила (1) 200 мкл раствора 625 мг/мл, а за этим (2) 200 мкл раствора 50 000 МЕ/мл человеческого ΙΕΝβ (10 нг/МЕ соотношение).

Образцы крови (приблизительно 200 мкл/образец) собрали в определенное время, разрывая ретроорбитальный синус с помощью капиллярной трубки. У трех мышей из каждой группы забирали образцы крови через 0,05, 2 и 12 ч после введения. У трех мышей из каждой группы образцы крови забирали через 0,54 и 24 ч после введения и у остальных трех мышей через 1, 8 и 48 ч после введения. Образцам крови дают возможность свернуться в течение 1 ч при комнатной температуре, отбирают и микроцентрифугируют. Сыворотку, отмытую таким образом, хранят при -70°С до тех пор пока не будут собраны все образцы. Сыворотку анализируют на присутствие человеческого ΙΕΝβ путем измерения ΙΕΝβ в специфическом тесте ΕΕΙ8Α, используя набор Тогау к человеческому ΙΕΝβ (ΤΕΒ, Ιηο.) и проверяют на биоактивность, используя антивирусный тест νΙ8Η.

Результаты ΙΕΝβ специфического теста ΕΠ8Α показаны на фиг. 15 А и результаты антивирусного теста ^νΙ8Η показаны на фиг. 15В.

Видно, что время полужизни ΙΕΝβ в сыворотке, введенного в комплексе с ΙΕΝΑΚ2, такое же, как и у отдельно введенного ΙΕΝβ, с последующим отдельным введением ΙΕΝΑΚ. Эти результаты подтверждают образование ίη νίίΓΟ комплекса ΙΕΝβ/ΙΕΝΑΚ2, который увеличивает время полужизни.

Пример 12.

Мышей С57ВЬ/6 обрабатывали комплексом универсального ΙΕΝ (человеческий ΙΕΝαΑ/ϋ) и 8ΙΕΝΑΚ2. Измеряли защитный эффект по цитотоксичности по сравнению с введением различных доз универсального ΙΕΝ самого по себе или с контролем. Первая группа получила 5 х 10³ ΜΕ универсального ΙΕΝ в комплексе с 5 нг/МЕ 8ΙΕΝΑΚ2. Вторая группа получила 5 х 10³ ΜΕ универсального ΙΕΝ. Третья группа получила 5 х 10⁴ ΜΕ универсального ΙΕΝ и четвертая группа получила ΡΒ8/2% ΝΜ8. Для каждой из этих мышей измеряли активность НК как цитотоксичность клеток селезенки против клеток-мишеней НК ΥΑ^1. Результаты показаны на фиг. 16. Активность НК значительно выше у мышей, обработанных комплексом универсального ΙΕΝ с 8ΙΕΝΑΚ2 по сравнению с мышами, обработанными только универсальным ΙΕΝ.

Пример 13.

Как определено выше, фармакокинетические исследования показали значительное увеличение времени полужизни в сыворотке ΙΕΝ типа Ι при введении в комплексе с 8ΙΕΝΑΚ2, растворимой формы субъединиц рецептора ΙΕΝ. Результаты ίη νίίΓΟ предполагают, что физическое соединение с ΙΕΝΑΡ2 приводит к стабилизации в норме лабильного ΙΕΝ. Для того чтобы определить, являются ли увеличение РК профиля и стабилизирующий эффект ΙΕΝΑΚ2 причиной усиления и пролонгирования ΙΕΝопосредованной активности ίη νίνο, была разработана модель, в которой мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (δοίά/δοίά) были введены летальные дозы ΙΕΝчувствительных В клеток Дауди клеточной линии человеческой лимфомы (6йебе 1991; СйеПе 1990). У этих мышей развивался паралич между 14 - 20 днями после введения опухолевых клеток в комплексе с гистологической очевидностью диффузной лимфомы. Следует отметить, что выживание таких мышей можно продлить дозозависимым способом с помощью ежедневного подкожного введения человеческого ΙΕΝβ. Эту модель использовали для определения ΙΕΝΑΡ2 в качестве потенциатора биологической активности, связанной с ΙΕΝ типа Ι ίη νίνο.

Для того чтобы установить взаимоотношения между значением времени до паралича и дозы ΙΕΝβ в 8С16 модели Дауди, пяти группам мышей ΒΑ^Β/сΒу^8тη-8С^ά/8С^ά линии, 4-5 недельного возраста, самкам, производили подкожное введение 200 мкл на мышь в день человеческого ΙΕΝβ ежедневно, начиная с 0 дня до 30 дня. Стандартная доза клеток Дауди, разведенная из замороженного раствора хранения составляет 5 х 10⁶ клеток на мышь путем подкожного введения в загривок в 0 день в ΡΒ8.

Группы мышей получили следующие количества ΙΡΝ:

Группа 1: 135 х 10⁴ МЕ/мышь (675 х 10⁴ МЕ/мл).

Группа 2: 45 х 10⁴ МЕ/мышь (225 х 10⁴ МЕ/мл).

Группа 3: 15 х 10⁴ МЕ/мышь (75 х 10⁴ МЕ/мл).

Группа 4: 5 х 10⁴ МЕ/мышь (25 х 10⁴

МЕ/мл).

Группа 5: РВ8 с 4% ΝΜ8.

Время до паралича индивидуально и средние значения показаны в табл. V.

Таблица V

	Дни до паралича	Среднее значение (±СД)
Группа 1	26, 31, 35, 37, 40	33,8 (5,4)
Группа 2	20, 23, 23, 23, 26	23,0 (2,1)
Группа 3	20, 20, 22, 22, 23	21,4 (1,3)
Группа 4	17, 18, 18, 18, 18	17,8 (0,5)
Группа 5	14, 14, 15, 15, 15	14,6 (0,6)

Возможно, что среднее значение времени до паралича в модели ксенотрансплантанта Дауди/8С1б увеличено путем ежедневных подкожных введений человеческого ΙΡΝβ дозозависимым образом.

Пример 14.

Чтобы определить, можно ли усилить антиопухолевое действие ΙΡΝβ путем его объединения в комплекс с ΙΡΝΑΚ2 при 2,5 нг/МЕ, семь групп по пять мышей обработали по тому же протоколу, который обсуждали в примере 13, за исключением того, что тестируемый материал вводили в каждую группу следующим образом:

ΙΡΝβ только/мышь	ΙΡΝβ + 8IΡNΑΚ2/мышь
Группа 1 2 х 102 МЕ	Группа 4 2 х 102 НЕ плюс 0,5 мкг
Группа 2 2 х 103 МЕ	Группа 5 2 х 102 МЕ плюс 5,0 мкг
Группа 3 2 х 104 МЕ	Группа 6 2 х 102 МЕ плюс 50,0 мкг
Группа 7 получила клетки Дауди, обработана только средой разведения

Время до паралича индивидуально и средние значения показаны в следующей таблице:

Таблица νΙ

	Дней до паралича	Средние значения (± 8Э)
Группа 1	16, 16, 17, 18, 19	17,2 (1,3)
Группа 2	17, 18, 18, 19, 19	18,2 (0,8)
Группа 3	17, 17, 17, 18, 18	17,6 (0,9)
Группа 4	17, 17, 18, 18, 19	17,8 (0,8)
Группа 5	17, 18, 19, 20, 20	18,8 (1,3)
Группа 6	21, 22, 22, 23, 26	22,8 (1,9)*
Группа 7	16, 16, 17, 17, 17	16,6 (0,6)

*3начительно отличается (значение р < 0,05) от такой же концентрации ΙΡΝβ в некомплексном виде в сравнениях пар групп, как определено с помощью однодорожечного ΑΝΟνΑ.

Видно, что антиопухолевая активность низкой дозы ΙΡΝβ, равной 2х10⁴ МЕ/мышь/день и модели ксенотрансплантанта Дауди/8С1б значительна увеличивается при образовании комплекса с ΙΡΝΑΚ2.

В дополнительном эксперименте (не показано) влияние частоты инъекции исследовали по среднему времени паралича. Было определено, что значительнее повышение антиопухолевой активности на модели ксенотрансплантанта Дауди/δίίά может быть получено путем обработки комплексом ΙΡΝβ/ΙΡΝΑΚ С2 при частоте инъекции один раз в неделю по сравнению со свободным ΙΡΝβ, вводимым один раз в день. Кроме того, в дополнительном эксперименте (не показано) определяли оптимальное соотношение ΙΡΝΑΚ2 к ΙΡΝβ. Было обнаружено, что оптимальное соотношение ΙΡΝΑΚ2: ΙΡΝβ для увеличения противоопухолевой активности при единственной концентрации ΙΡΝβ (2х10⁴ МЕ/мышь/день) составляет 2,5 нг ΙΡΝΑΚ2 на пг ΙΡΝβ.

Во втором эксперименте было обнаружено, что оптимальное соотношение ΙΡΝΑΚ2:ΙΡΝβ для увеличения противоопухолевой активности при концентрации ΙΡΝβ 5х10⁴ МЕ/мышь/день составляет 0,3 нг ΙΡΝΑΚ2 на пг ΙΡΝβ. Эти два эксперимента определяют, что оптимальное соотношение зависит от концентраций ΙΡΝβ, и оказывается, что, чем выше концентрация ΙΡΝβ, тем ниже должно быть соотношение .

В другом эксперименте, использующем такую же модель, было установлено, что введение только ΙΡΝΑΚ2 не повышает выживаемость мышей в данном исследовании.

Пример 15.

Этот пример представляет собой фармакокинетическое исследование для определения периода полужизни внутренней слитой молекулы 5С8 в сыворотке мыши после однократной болюсной внутривенной инъекции. Двадцать одну самку мыши штамма Β6Ό2Ρ1 (6-8 недель) (приблизительно по 20 г каждая) разделили на три группы следующим образом:

Группа 1: содержит девять мышей, которым вводили внутривенно один болюс с 200 мкл раствора, содержащего 100000 МЕ/мл внутреннего слитного 5С8 (конечная доза составляет 20000 МЕ/мышь или 5х10⁶ МЕ/кг).

Группа 2: (девять мышей) получали 200 мкл раствора 100000 МЕ/мл человеческого ΙΡΝβ.

Группа 3: содержит трех неинъецированных мышей, которые служат как отрицательный контроль.

Полагая объем крови приблизительно 2 мл/мышь, теоретические значения Стах и Ттах составляют 10000 МЕ/мл для групп 1 и 2. У трех мышей из каждой из групп 1 и 2 брали образцы крови через 0,05, 2 и 12 ч после введения. У трех мышей из каждой группы 1 и 2 брали образцы крови через 0,5, 4 или 24 ч и трех мышей из каждой группы 1 и 2 брали образцы крови через 1, 8 и 48 ч после введения. Сыворотку исследовали на присутствие биоактивного человеческого ΙΡΝβ, используя анализ \νΙ8Η.

Результаты показаны на фиг. 17. Тогда как ΙΕΝβ выводится почти немедленно, внутренняя слитая молекула остается в сыворотке в течение длительного времени после инъекции. Это демонстрирует, что слитый белок имеет желательный стабилизирующий эффект.

Предшествующее описание конкретных воплощений настолько полно открывает основную природу изобретения, что другие специалисты могут, применяя существующие в настоящее время знания, легко модифицировать и/или приспособить для различных применений такие конкретные воплощения без лишнего экспериментирования и без отклонения от основной концепции, и, следовательно, считается, что такие приспособления и модификации находятся в средствах и области эквивалентов раскрытых воплощений. Должно быть понятно, что фразеология и терминология, применяемые в данном документе, предназначены для описания, но не для ограничения. Средства, материалы и стадии для проведения различных раскрытых функций могут принимать ряд альтернативных форм без отступлений от изобретения. Таким образом, под выражениями означает, что... и означает для... или любая формулировка стадии способа, какая может быть найдена в вышеприведенном описании и/или в нижеприведенной формуле изобретения, сопровождаемыми функциональными утверждениями, подразумевают определение и охват какого либо структурного, физического, химического или электрического элемента или структуры, или в какой-либо стадии способа, которые могут существовать в настоящее время или в будущем, и которые выполняют указанную функцию вне зависимости от точной эквивалентности воплощению или воплощениям, раскрытым в вышеприведенном описании, то есть, могут использоваться другие средства или стадии для выполнения тех же функций, и под этим подразумевают, что таким выражениям придается их широчайшая интерпретация.

Ссылки

Α1ат е! а1, Сотрагайуе рЬагтасоктебск алб ΡЬа^тасοбу-ηат^сκ о£ 1\\ό гесотЬтап! Питан т!егГегоп β-1 (ΙΕΝβ-1α) ргобис!к абнишк!егеб т1гатикси1аг1у ίη Ьеа1!Ьу та1е апб Гета1е уоПпНеегк. ΡЬа^тасеиί^саί ВекеагсЬ 14:546-549 (1997).

Αηίϊη^η, Ρπι·!^^ ТЬа! Соует ТЬе Εο1бтд о£ ΡΐΌΟίη СЬатк, δ№ι^ 181:223-230 (1973).

ΑиκиЬе1 е! а1, Сиггеп! Ρι^^Η ίη Μο1еси1а^ В1о1оду, Сгеепе ΡυΜ^^^ апб ^11еу ЕНегкаепсе (Ναιν Уогк, 1987-1992).

Вагон е! а1, ТЬе 1п!ег£егопк: Α Ыо1од1са1 кук!ет νίΐΠ !Ьегареибс ро!еп!1а1 ίη упа1 тГес6опк. ΑηίΐνπΏ1 Век. 24:97-110 (1994).

Вагон е! а1, ТЬе т!ег£егопк. оГ асПоп анб с11П1с11 аррПсаПопк, б. Α111. Μοб. Α^ кос. 266:1375-1383 (1991).

СЬон^упкк! ес а1. ΑπΛ. ВтсЬет. 162:156159 (1987).

СЬпкЮПтк, С.6., Iη!е^Ге^οη Ρ^οбисί^οη Ьу Нитан Ьут-рЬоЬ1ак!о1б Се11 Ьтек оГ ОШегеп! Ο^^д^ηκ. боита1 оГ Се не га 1 ^го1оду 52:169-171 (1981).

СЬигсЬ е! а1, Ριό^ Νι!1. Αсаб. δα. υδΑ 81:1991-1995 (1984).

Со1атоша е! а1, ΜΗΠίΟπΠη к!гис!иге оГ Не т!егГегоп а1рЬа гесер!ог оп Ьета1оро1е11с се11к, б. ]ттипок 148:2126-2132 (1992).

Со1атоша е! а1, Iбеηί^Г^са!^οη оГ а ηονе1 киЬиш! оГ !Ье Туре Ι 1п!егГегоп гесер!ог 1оса11/еб !о Ьитап сЬготокоте 21, б. Вю1. СЬет. 258:10895-10899 (1993).

Сигбк, Ε.Μ., Επ1ιιικ66 Нета!оро1е!1с Αα ίίνίίν оГ а Нитап С^али1οсу!е/Μас^οрЬаде Со1опу-к11ти1а11пд Εас!ο^-Iη!е^1еик^η 3 Пиктн Ριό1ет, Ρι-ос. ЫаЙ. Αсаб. 8ά. 88:5809-5813 (1991).

Оотанкк1 е! а1, Сботпд анб курн^кти оГ а Бонд Погт оГ Ле β διιΠιιηίΙ оГ !Ье ЕНегГегоп а β Весер!ог ТЬа! 1к гес.|тгеб Гог δ^дηа1^ηд. ТЬе боигпа1 оГ Вю1одюа1 СЬет1к!гу 270:6 (1995).

Эинсан е! а1, ТЬе 1ганксг1р11он Гас!ог 1н(егГегон геди1а!огу Гас!ог-1 1к еккепПа1 Гог на!ига1 кШег се11 ГипсПоп ίη '«гсо, б. ехр. Μο6. 184:20432048 (1996).

Огст е! а1, ЕНегГегоп α/β деле к!гис!иге алб геди1а!юп ίη ЕиегГегоп; Ρ^^лс^р1еκ алб Μο6χι1 Αрр1^са!^οлκ. Вагоп е! а1, Εб^!ο^κ, ШпгсегкПу о£ Техак Μο6χι1 ВгапсЬ: СаКекЮп, ТХ, 1992) рр 33-45.

Εб^ηд!οη, δ.Μ., Вю!есЬ Ρ^οбис!κ ак Эгид Ьеабк, ВюТесЬло1оду 13:649 (1995).

Бг(е1 е! а1, ΑγΟι. διιι^. 129:1 (1994).

В1ег1Ьеск е! а1, ΡЬа^тасοбуηат^сκ о£ гесотЬтал! ΙΕΝβ бигшд 1опд-!егт 1геа!теп! о£ таЬдпап! те1алота. боита1 о£ ЕНегГегст алб Су!окте ВекеагсЬ 16:777 (1996).

СЬебе е! а1. Сапсег ВекеагсЬ 51:5876 (1991).

СПеИе е! а1. В1ооб 80:2315 (1990).

Сга££е! а1. Μο1 Се11. Вю1. 2:93-96 (1982). Сгал!Ьат, δс^еηсе 185:Х62-Х64 (1974).

Сга/1а СикП Μ., Наг1ес.|ит Сгали1осу!есо1опу δΙίΐΗΗ1Ηΐίι^ Рас Юг ЕНебеикт 6 Μο1еси1еκ νίίΠ Вбипс!юпа1 алб Αη!адοшκί^с Αс!^ν^ί^еκ, Iттиηο!есЬлο1οду 3:61-69 (1997).

Йапе/, С.Е., Сбтнепс Μο1еси1еκ \νί!1ι Μι.ι1!1р1е №иго!горЬ1с Αс!^ν^ί^еκ Ве\^геа1 δίΓ^ΛΐΉί Ε^ηοΗ^ Ое1егтттд Не δрес^Г^с^(^еκ о£ NСΕ алб 131)410 ΕΜВΟ боита1 10:2105-2110 (1991).

Кгсат е! а1, б. Вю1. СЬет. 270:1 (1995).

Кеогсн, XV. Α., '^е^бк £ог ЕНгобистд ΌΝΑ 1п!о Μаттаί^ал Се11к, Μе!Ьοбκ ίη Εηζνто1оду 185:527-537 (1990).

Ьепду1, Ρ., ВтсЬет1к!гу о£ т!егГегопк алб !Ье1г асбопк, Απη. Βν. ВюсЬет. 51:251-282 (1982).

БгПГаИа е! а1, Ми!ап! И5А се118 аге сотр1етеп!еб Ьу ап тЮгГегоп-α/β гесер!ог 8иЬиш! депега!еб Ьу аНегпаОуе ргосе88тд оГ а пе\г тетЬег оГ а су!окте гесер!ог депе с1и8!ег, ЕМВО 1овгпа1 14:5100-5108 (1995).

Меткой е! а1, Апа1. Вюсбет. 138:267-284 (1984).

№1да1 е! а1, №Ииге 309:810 (1984).

е! а1, к Iттипо1. 129:2244-2247 (1982).

№\аск е! а1, 8о1иЬ1е т!егГегоп-а1рЬа гесер!ог то1еси1е8 аге рге8еп! т Ьобу Г1шб8 РЕВ8 Ье!!. 314:445-448 (1992).

е! а1, ТЬе Ьитап т!егГегоп α/β гесер!ог: СЬагааепхабоп апб то1еси1аг с1ошпд, Се11 77:391-400 (1994).

№\аск е! а1, 8о1иЬ1е апб тетЬгапеапсЬогеб Гогт8 оГ 1Ье Ьитап ΣΡΝ-α/β гесер!ог, Σ. Ьеик. Вю. 57:712-718 (1995).

О11П8, Р.О., Кесеп! Абуапсе8 ίπ Не!его1одои8 Сепе Ехрге88юп ш Е8сЬепсФа соб. Сиггеп! Ортюп 1п Вю!есЬпо1оду 4:520-525 (1993).

Ре8!ка е! а1, 'ЧгИегГегснъ апб !Ьеб асбоп8, Апп. Кеу. ВюсЬет. 56:727-777 (1987).

Р1а!ата8 е! а1, СЬагас1ег1ха11оп оГ !Ье α8иЬиш! оГ !Ье т!егГегоп а гесер!ог: еу|бепсе оГ Νапб 0-бпкеб д1усо8у1абоп апб а88ос1абоп \\6Ь о!Ьег 8игГасе рго!ет8, к Iттиπо1. 150:3382-3388 (1993).

Р1а!ата8 е! а1, Туго8те рЬо8рЬогу1абоп оГ !Ье α апб β 8иЬиш!8 оГ !Ье Туре I т!егГегоп гесер!ог к Вю1. СЬет. 269:17761-17764 (1994).

Р1а!ата8 е! а1, ЛгГГегепсе8 ш т!егГегоп α апб β 81дпабпд, к Вю1. СЬет. 271:23630-23633 (1996).

0иге8Ы е! а1, Рипсбоп оГ 8!а!2 рго!ет ш !гап8спрбопа1 асбуабоп Ьу а1рЬа т!егГегоп, Мо1. Се11. Вю. 16:288-293 (1996).

Ка!пег, М., Рго!ет Ехрге88юп т Уеа8!, Вю/ТесЬпо1оду 7:1129-1133 (1989).

КеГГ, М., Н|дЬ-1ете1 Ргобисбоп оГ КесотЫпап! [ттвпод1оЬиНп8 ш таттабап Се118, Сиггеп! Ортюп т Вю!есЬпо1оду 4:573-576 (1993).

Кеиуепу, 8., Ргобисбоп оГ КесотЬтап! Рго!ет8 1п Н|дЬ Леп8Йу бъес! Се11 Си1!иге8, Вю!есЬпо1оду апб Вюепдтееппд 42:235-239 (1993).

8а1топ е! а1, РЬагтасоктебс8 апб рЬагтасобупатю8 оГ гесотЬтап! Ьитап ΣΕΝβ ш ЬеаЪЬу та1е уо1ип!еег8. 1овгпа1 оГ Iπ!е^Ге^оπ апб Су!окте Ке8еагсЬ 16:759 (1996).

8атЬгоок е! а1. Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, 2пб Еб., Со1б 8рппд НагЬог Рге88 (Со1б 8рппд НагЬог, ΝΥ, 1989).

8ЬагГ е! а1, Рипсбопа1 ботат апа1у818 оГ 1п!егГегоп соп8еп8и8 8ес.|вепсе Ьтбтд рго!ет ЦС8ВР) апб ί!8 а88оаабоп \\6Ь т!егГегоп геди1а!огу Гас!ог8, к Вю1. СЬет. 270:13063-13069 (1995).

8тЪЬ, С.Е., Ргобисбоп оГ Нитап β биегГегоп 1п й8ес! Се118 ТпГесГеб \νίΐΗ а Васв1оу|гв8 Ехрге88юп Уес!ог, Мо1еси1аг апб Се11и1аг Вю1оду 3:2156-2165 (1983).

8хбаду| е! а1, ВюсЫт. ВюрЬу8. Ас!а 1251:1 (1995).

Тап е! а1, ТЬе бпкаде оГ депе8 Гог !Ье Ьитап 1п!егГегоп тбисеб апбу1га1 рго!ет апб 1пборЬепо1 ох1ба8е-В баб8 !о сЬгото8оте С-21, к ехр . Меб. 137:317-330 (1973).

Тег1|ххе8е, М., 'Тп убго сотрап8оп оГ тЬ1Ь1бпд аЬббу оГ 8о1иЬ1е ТИР гесер!ог р75 (ТВРП) ν8. 8о1иЬ1е ΪΝΕ Кесер!ог р55 (ТВРЦ адат8! ТНЕα; апб ΈΝΕ-β, Гоита1 оГ Iπ!е^Ге^оπ апб Су!окте Ке8еагсЬ 16:1047-1053 (1996).

Иг1аиЬ е! а1, Ргос. Асаб. 8а И8А 77:4216-4220 (1980).

и!8ит1, к, СЬагас1епхабоп оГ Е.соН-бегб'еб КесотЬтап! Нитап Iπ!е^Ге^оπ-β а8 Сотрагеб \\6Ь Р1ЬгоЬ1а8! Нитап Iπ!е^Ге^оπ-β, 1овгпа1 оГ ВюсЬет18!гу 101:1199-1208 (1987).

и хе е! а1, Сепебс бапкГег оГ а Гипсбопа1 Ьитап т!егГегоп а1рЬа гесер!ог т!о тои8е се118: с1ошпд апб ехрге88юп оГ ί!8 сЛНА, Се11 60:225234 (1990).

\Уе188тапп е! а1, ТЬе т!егГегоп депе8, Ргод. ΝηοΦΐο Ааб Ке8. 33:251-302 (1986).

Υаπ е! а1., Мо1еси1аг сЬагааепхабоп оГ ап а1рЬа 1п!егГегоп гесер!ог 1 8иЬиш! (ШЫаКГ) ботат гес.]гпгеб Гог ΊΥΚ2 Ьтбтд апб 81дпа1 1гап8бисбоп, Мо1. Се11. Вю. 16:2074-2082 (1996).

Υιι'^ е! а1, Лбес! а88оаабоп оГ 8ТАТ3 \\ЬЬ !Ье ШЫАК-1 сЬат оГ !Ье Ьитап Туре I т!егГегоп гесер!ог, к Вю1. СЬет. 271:8057-8061 (1996).

Список последовательностей <110> ΤΞΡΡΕΕ, Магк

ΚϋΝΝΙΝΟΗΑΜ, Магк

3ΗΕΕΕΙ3,

ЕЬ ΤΑΥΑΕ, ЫаЫ1

ΜοΚΕΝΝΑ, Зсап <120> Комплекс ΙΓΝΑΒ.2/ΙΕΝ <130> ΤΕΡΡΕΕΙΑ.3Ε0 <140> Ешё не получено <141> 1998-12-18 <150> 60/068, 295 <151> 1997-12-19 <160> 14 <170> РаСепЫпУег · 2.0 .

<210> 1 .

<211> 5 <212> РЕТ <213> Неизвестно <220>

<223> Описание неизвестного организма: пептид <400> 1

61у О1у б1у С1у Зег

5 <210> 2 <211> 4 <212> РЕТ <213> Неизвестно <220> ' <223> Описание неизвестного организма: пептид <400> 2

Не С1и 61и Агд <210> 3 <211> 33 <212> РЕТ <213> Неизвестен <220>

<223> Описание неизвестного организма: пептид <400> 3

О1и Зег О1и РЬе Зег С1у 61у О1у <31у Зег С1у 61у С1у С1у

10

Зег	С1у	С1у	С1у	О1у Зег 61у О1у С1у	С1у Зег С1у С1у <31у
15				20	25
С1у	Зег	МеС	Зег	Туг
	30

<210> 4 <211> 28 <212> РЕТ <213> Неизвестен <220>

<223> Описание неизвестного организма: пептид <400> 4

С1ц	Зег С1и	РЬе Зег	61у	О1у	С1у	О1у	Зег	О1у 61у	С1у	61у
1		5					10
Зег	О1у С1у	С1у О1у	Зег	С1у	С1у	С1у	61у	Зег МеС	Зег	Туг
15			20					25

<210> 5 <211> 23 <212> РЕТ <213> Неизвестно <220>

<223> Описание неизвестного организма: пептид <400> 5

61и Зег О1и РЬе Зег 61у С1у О1у 61у Зег 61у 61у О1у <31у

1510

Зег С1у С1у С1у С1у Зег МеС Зег Туг

1520 <210> 6 <211> 18 <212> РЕТ.

<213> Неизвестно <220> ' <223> Описание неизвестного организма: пептид <400> б

61и Зег 61и РЬе Зег С1у О1у О1у 61у Зег <31у О1у 61у С1у

10

Зег МеС Зег Туг <210> 7 <211> 13 <212> РЕТ <213> Неизвестно <220> ’ <223> Описание неизвестного организма: пептид <400> 7

С1и Зег С1и РЬе Зег С1у О1у С1у С1у Зег МеС Зег Туг

10 <210> 8 <211> 36 <212> РЕТ <213> Неизвестно <220>

<223> Описание неизвестного организма: пептид <400> 8

С1и

Зег

О1и

РЬе

Зег

Зег

Зег

Зег

Зег

Ьуз

А1а

Рго

Рго

Рго

1

5

10

Зег

Ьеи

Рго

Зег

Рго

Зег

Агд.

Ьеи

Рго

С1у

Рго

Зег

Азр

ТЬг

15

20

25

Рго

Не

Ьеи

Рго

61п

МеС

Зег

Туг

· 35 <210> 9 <211> 23 <212> РЕТ <213> Неизвестно <220>

<223> Описание неизвестного организма: пептид <400> 9

С1и	Зег	С1и	РЬе	Зег	С1и	РЬе	Мей	С1и	РЬе Мей О1ц РЬе Мей
1				5					10
(31ц	РЬе	Мей	С1и	РЬе	Мей	Мей	Зег	Туг
15					20

<210> 10 <211> 20 <212> РЕТ <213> Неизвестно <220>

<223> Описание неизвестного организма: пептид <400> 10

С1и Зег С1и РЬе Зег С1и РЬе Мей С1и РЬе Мей С1и РЬе Мей

1510

С1и РЬе Мей Мей Зег Туг

1520 <210> 11 .

<211> 17 <212> РЕТ.

<213> Неизвестно <220> ’ <223> Описание неизвестного организма: пептид <400>11

О1и Зег О1и РЬе Зег С1и РЬе Мей С1и РЬе Мей С1и РЬе Мей

10

Мей Мей Зег Туг <210> 12 <211> 21 <212> РЕТ <213> Неизвестно <220>

<223> Описание неизвестного организма: пептид <400> 12

С1и Зег С1и РЬе Зег С1и РЬе С1у А1а С1у Ьеи Уа1 Ьеи С1у

10

С1у 61п РЬе Мей Мей Зег Туг

20 <210> 13 <211> 34 <212> РЕТ <213> Неизвестно <220>

<223> Описание неизвестного организма: пептид <400> 13

С1и

Зег

С1и

РЬе

Зег

С1и

РЬе.

С1у

А1а

С1у

Ьеи

Уа1

Ьеи

С1у

1

5

10

(31у

С1п

РЬе

Мей

С1и

РЬе

Мей

С1и

РЬе

С1у

А1а

С1у

Ьеи

Уа1

15

20

25

Ьеи

С1у

С1у

С1п

РЬе

Мей

Мей

Зег

Туг

35 <210> 14 <211> 400 <212> РЕТ <213> Неизвестно <220>

<223> Описание неизвестного организма: пептид <400> 14

Мей

Ьеи

Ьеи

Зег

С1п

Азп

А1а

РЬе

Не

Уа1

Агд

Зег

Ьеи

Азп

1

5

10

Ьеи

Уа1

Ьеи

Мей

Уа1

Туг

Не

Зег

Ьеи

Уа1

РЬе

С1у

Не

Зег

15

20

25

Туг

Азр

Зег

Рго

Азр

Туг

ТЬг

Азр

С1и

Зег

Суз

ТЬг РЬе Ьуз

30

35

40

Не

Зег

Ьеи

Агд

Азп

РЬе

Агд

Зег

Не

Ьеи

Зег

Тгр

С1и

Ьеи

45

50

55

Ьуз

Азп

ΗΪ3

Зег

Не

Уа1

Рго

ТЬг

ΗΪ3

Туг

ТЬг

Ьеи

Ьеи

Туг

60

65

70

ТЬг

Не

Мей

Зег

Ьуз

Рго

СГи

Азр

Ьеи

Ьуз

Уа1

Уа1

Ьуз

Азп

75

80

Суз

А1а

Азп

ТЬг

ТЬг

Агд

Зег

РЬе

Суз

Азр

Ьеи

ТЬг

Азр

С1и

85

90

95

Тгр

Агд

Зег

ТЬг

ΗΪ3

С1и

А1а

Туг

Уа1

ТЬг

Уа1

Ьеи

С1и

61у

100

105

110

РЬе

Зег

С1у

Азп

ТЬг

ТЬг

Ьеи

РЬе

Зег

Суз

Зег

Η13

Азп

РЬе

115

120

125

Тгр

Ьеи

А1а

Не

Азр

Мей

Зег

РЬе

С1и

Рго

Рго

С1и

РЬе

С1и

130

135

140

Не

Уа1

С1у

РЬе

ТЬг

Азп

Н1з.

Не

Азп

Уа1

Мей

Уа1

Ьуз

РЬе

145

150

Рго

Зег

Не

Уа1

С1и

С1и

С1и

Ьеи

С1п

РЬе

Азр

Ьеи

Зег

Ьеи

155

160

165

Уа1

Не

С1и

С1и

С1п

Зег

С1и

С1у

Не

Уа1

Ьуз

Ьуз

ΗΪ3

Ьуз

170

175

180

Рго

С1и

Не

Ьуз

С1у

Азп

Мей

Зег

С1у

АЗП

РЬе

ТЬг

ТЬг

Не

185

190

195

Не

Азр

Ьуз

Ьеи

Не

Рго

Азп

ТЬг

Азп

Туг

Суз

Уа1

Зег

Уа1

200

205

210

ТЬг

Ьеи

С1и

Н13

Зег

Азр

С1и

С1п

А1а

Уа1

Не

Ьуз

Зег

Рго

215

220

Ьеи

Ьуз

Суз

ТЬг

Ьеи

Ьеи

Рго

Рго

С1у

С1п

С1и

Зег

С1и

РЬе

225

230

235

Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у

С1у

Зег Мей 250

Зег

Туг

240

245

Азп

Ьеи

Ьеи

С1у

РЬе

Ьеи

С1п

Агд

Зег

Зег

Азп

РЬе

С1п

Суз

255

260

265

С1п

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Тгр

С1п

Ьеи

Азп

С1у

Агд

Ьеи

С1и

Туг

Суз

270

275

280

Ьеи

Ьуз

Азр

Агд

Мей

АЗП

РЬе

Азр

Не

Рго

С1и

С1и

Не

Ьуз

285

290

С1п

Ьеи

С1п

С1п

РЬе

С1п

Ьуз

С1и

Азр

А1а

А1а

Ьеи

ТЬг

Не

295

300

305

Туг

(31и

Мей

Ьеи

С1п

Азп

Не

РЬе

А1а

Не

РЬе

Агд

С1п

Азр

310

315

320

Зег

Зег

Зег

ТЬг

С1у

Тгр

АЗП

С1и

ТЬг

Не

Уа1

С1и

Азп

Ьеи

325

330

335

Ьеи

А1а

Азп

Уа1

Туг

Нйз

С1п

Не

Азп

ΗΪ5

Ьеи

Ьуз

ТЬг

Уа1

340

345

350

Ьеи

С1и

С1и

Ьуз

Ьеи

С1и

Ьуз

С1и

Азр

РЬе

ТЬг

Агд

С1у

Ьуз

355

360

Ьеи

Мей

Зег

Зег

Ьеи

Низ

Ьеи

Ьуз

Агд

Туг

Туг

С1у

Агд

Не

365

370

375

Ьеи

ΗΪ3

Туг

Ьеи

Ьуз

А1а

Ьуз

С1и

Туг

Зег

Н15

Суз

А1а

Тгр

380

385

390

ТЬг

Не

Уа1

Агд

Уа1

С1и

Не

Ьеи

395

400

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (25)

1. Комплекс, включающий интерферон (ΙΕΝ) типа I и субъединицу рецептора человеческого интерферона α/β (ΙΕΝΆΚ), которая способна связываться с ΙΕΝ типа I комплекса, в котором указанный ΙΕΝ типа I представляет собой:

a) нативный ΙΕΝ типа I;

b) фрагмент а), который обладает биологической активностью ΙΕΝ типа I;

с) вариант а) или Ь), который обладает, по меньшей мере, 70% идентичностью последовательности с а) или Ь) и который обладает биологической активностью ΙΡΝ типа I;

ά) вариант а) или Ь), который кодируется последовательностью ДНК, которая гибридизуется с комплементом последовательности нативной ДНК, кодирующей а) или Ь) при умеренно строгих условиях, и который обладает биологической активностью ΙΡΝ типа I; или

е) соль или функциональное производное

а), Ь), с) или ά), которое обладает биологической активностью ΙΡΝ типа I; и в котором указанный ΙΡΝΑΚ представляет собой:

Г) полипептидную цепь нативного человеческого ΙΡΝΑΚ;

д) фрагмент Г), который обладает биологической активностью ΙΡΝΆΚ;

11) вариант Г) или д), который обладает, по меньшей мере, 70% идентичностью последовательности с Г) или д) и который обладает биологической активностью ΙΡΝΑΚ;

ί) вариант Г) или д), который кодируется последовательностью ДНК, которая гибридизуется с комплементом последовательности нативной ДНК, кодирующей Г) или д) при умеренно строгих условиях, и который обладает биологической активностью ΙΡΝΑΚ; или

.)) соль или функциональное производное Г), д), 1) или ί), которое обладают биологической активностью ΙΡΝΑΚ.

2. Комплекс по п.1, отличающийся тем, что указанный ΙΡΝ типа Ι связан с указанным ΙΡΝΑΚ ковалентной связью.

3. Комплекс по п.1, отличающийся тем, что указанный ΙΡΝ типа Ι связан с указанным ΙΡΝΑΚ пептидной связью.

4. Комплекс по п.3, отличающийся тем, что указанный ΙΡΝ типа Ι связан с указанным ΙΡΝΑΚ посредством пептидного линкера.

5. Комплекс по п.4, отличающийся тем, что указанный пептидный линкер представляет собой (ССССБ)п. где п=1-5.

6. Комплекс по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что указанный ΙΡΝ типа Ι представляет собой ΙΡΝα, ΙΡΝβ или ΙΡΝω.

7. Комплекс по п.5, отличающийся тем, что указанный ΙΡΝ типа Ι представляет собой ΙΡΝβ.

8. Комплекс по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что указанный ΙΡΝΑΚ представляет собой бета-субъединицу рецептора человеческого интерферона α/β(ΙΡΝΑΚ2).

9. Молекула ДНК, кодирующая слитый белок по любому из пп.3-5.

10. Вектор, включающий молекулу ДНК по п.9.

11. Штамм клетки-хозяина, трансформированный вектором по п.10, таким образом, что позволяет экспрессировать указанный слитый белок.

12. Фармацевтическая композиция, включающая фармацевтически приемлемый носитель и комплекс по любому из пп.1-8.

13. Применение комплекса по любому из пп.1-8 в качестве лекарственного средства.

14. Применение комплекса по любому из пп.1-8 в противовирусной, противораковой или иммуномодулирующей терапии.

15. Применение комплекса по любому из пп.1-8 для пролонгирования действия ΙΡΝ типа Ι у пациента ίη νίνο.

16. Лекарственное средство, включающее комплекс по п.1, полученный путем раздельного, одновременного или последовательного введения интерферон (ΙΡΝ) типа Ι и субъединицы рецептора человеческого интерферона α/β (ΙΡΝΑΚ) пациенту, нуждающемуся в противовирусной, противораковой или иммуномодулирующей терапии, в котором указанный ΙΡΝ типа Ι представляет собой:

a) нативный ΙΡΝ типа Ι.

b) фрагмент а), который обладает биологической активностью ΙΡΝ типа Ι.

17. Лекарственное средство по п.16, отличающееся тем, что указанный интерферон (ΙΡΝ) типа Ι и указанный ΙΡΝΑΚ вводят отдельно и комплекс по любому из пп.1-8 образуется ίη νίνο.

18. Лекарственное средство по п.16 или 17, отличающееся тем, что ΙΡΝ представляет собой ΙΡΝα, ΙΡΝβ или ΙΡΝω.

19. Лекарственное средство по п.18, отличающееся тем, что ΙΡΝ представляет собой ΙΡΝβ.

20. Лекарственное средство по любому из пп.16-19, отличающееся тем, что указанный ΙΡΝΑΚ представляет собой бета-субъединицу рецептора человеческого интерферона α/β (ΙΡΝΑΚ2).

21. Применение рецептора человеческого интерферона α/β (ΙΡΝΑΚ) для производства лекарственного средства, содержащего комплекс по п.1, для усиления биологического действия интерферона (ΙΡΝ) типа Ι, где указанный ΙΡΝΑΚ представляет собой:

a) полипептидную цепь нативного человеческого ΙΡΝΑΚ;

b) фрагмент а), обладающий биологической активностью ΙΡΝΑΚ;

c) вариант а) или Ь), обладающий, по крайней мере, 70% идентичностью последовательности с а) или Ь) и который обладает биологической активностью ΙΡΝΑΚ;

ά) вариант а) или Ь), кодируемый последовательностью ДНК, которая гибридизуется в умеренно строгих условиях с последовательностью, комплементарной ДНК, кодирующей а) или Ь), причем указанный вариант обладает биологической активностью ΙΡΝΑΚ; или

е) соль или функциональное производное

а), Ь), с) или б), которое обладает биологической активностью ΙΕΝΑΚ.

22. Применение интерферона (ΙΕΝ) типа Ι и субъединицы рецептора человеческого интерферона α/β (ΙΕΝΑΚ), способной связываться с указанным ΙΕΝ типа Ι для производства лекарственного препарата, содержащего комплекс по п.1, обладающего пролонгированным действием ΙΕΝ, причем указанный препарат получают ίη νίνο путем раздельного, одновременного или последовательного введения составляющих указанного комплекса нуждающемуся в этом пациенту, где указанный ΙΕΝ типа Ι представляет собой:

a) нативный ΙΕΝ типа Ι;

b) фрагмент а), который обладает биологической активностью ΙΕΝ типа Ι;

c) вариант а) или Ь), обладающий, по крайней мере, 70% идентичностью последовательности с а) или Ь) и который обладает биологической активностью ΙΕΝ типа Ι;

б) вариант а) или Ь), кодируемый последовательностью ДНК, которая гибридизуется в умеренно строгих условиях с последовательностью, комплементарной ДНК, кодирующей а) или Ь), причем указанный вариант обладает биологической активностью ΙΕΝ типа Ι; или

е) соль или функциональное производное а), Ь), с) или б), которое обладает биологической активностью ΙΕΝ типа Ι;

и где указанный ΙΕΝΑΚ представляет собой:

a) полипептидную цепь нативного человеческого ΙΕΝΆΚ;

b) фрагмент а), обладающий биологической активностью ΙΕΝΑΚ;

c) вариант а) или Ь), обладающий, по крайней мере, 70% идентичностью последовательности с а) или Ь) и который обладает биологической активностью ΙΕΝΑΚ;

б) вариант а) или Ь), кодируемый последовательностью ДНК, которая гибридизуется в умеренно строгих условиях с последовательностью, комплементарной ДНК, кодирующей а) или Ь), причем указанный вариант обладает биологической активностью ΙΕΝΑΚ; или

е) соль или функциональное производное а), Ь), с) или б), которое обладает биологической активностью ΙΕΝΑΚ.

23. Применение комплекса по любому из пп.1-8 для производства лекарственного средства, используемого для пролонгирования действия ΙΕΝ типа Ι ίη νίνο.

24. Способ получения слитого белка, включающий культивирование штамма клетки хозяина по п.11 и выделение экспрессируемого слитого белка.

25. Способ улучшения сохраняемости интерферона типа Ι, включающий хранение указанного интерферона в форме комплекса по любому из пп.1-8.