KR20200015742A

KR20200015742A - 암 치료를 위한 인터페론 전구약물

Info

Publication number: KR20200015742A
Application number: KR1020207000744A
Authority: KR
Inventors: 양-신 푸; 수에즈 카오
Original assignee: 더 보드 오브 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템
Priority date: 2017-06-20
Filing date: 2018-06-18
Publication date: 2020-02-12
Also published as: CN111050803A; RU2020101640A; JP2020528878A; RU2020101640A3; EP3641829A4; CA3067539A1; US20200123227A1; WO2018236701A1; EP3641829A1

Abstract

본 개시내용은 인터페론 전구약물 및 암을 치료하는데 있어서의 이들의 용도에 관한 것이다. 이러한 작제물의 특별한 이점은 인터페론 요법과 관련된 다수의 상당한 독성의 감소와 생체내 강력한 항종양 활성을 발휘하는 능력이다.

Description

암 치료를 위한 인터페론 전구약물

우선권 주장

본 출원은 2017년 6월 20일자로 출원된 미국 가출원 제62/522,564호에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.

1. 분야

본 개시내용은 일반적으로 의약, 종양학 및 면역요법 분야에 관한 것이다. 보다 특히, 이는 암 치료에 있어서의 면역시약의 개발 및 사용에 관한 것이다.

2. 배경

타입 I 인터페론 (IFN)은 종양 세포 증식을 직접적으로 억제하는 것으로 생각된다. 이들은 혈액학적 종양 (만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia), 모발상 세포 백혈병(hairy cell leukemia), 다발성 골수종(multiple myeloma), 및 비호지킨 림프종(Non-Hodgkin lymphomas)) 및 고형 종양 (흑색종(melanoma), 신장 암종(renal carcinoma) 및 카포시 육종(Kaposi's sarcoma))을 포함한 몇몇 유형의 암 치료에 성공적으로 사용되어 왔다 (Ferrantini et al., 2007, Moschos & Kirkwood, 2007, Zitvogel et al., 2015, and Antonelli et al., 2015). 실제로, 축적된 증거들이 내인성 타입 I IFN이 화학요법, 방사선요법, 표적 요법 및 면역요법의 항종양 활성을 향상시키기 위해 종양 항원에 대한 교차 프라이밍을 증가시키기 위해 DC를 교육하는데 중요한 역할을 한다는 것을 보여준다 (Schiavoni et al., 2011, Burnette et al., 2011; Stagg et al., 2011 and Woo et al., 2014).

타입 I IFN 치료의 특별한 이점은 선천성 및 적응성 세포독성 림프구 집단의 자극, 억제 세포 유형의 음성 조절, 증식을 억제함으로써 및 아폽토시스(apoptosis), 분화, 이동 및 세포 표면 항원 발현을 조절함으로써 종양 세포에 대한 이의 영향을 포함하여 항종양 면역 반응의 생성에 있어서 여러 포인트에 개입할 수 있는 능력에 기인한다 (Parker et al., 2016). 중요하게도, 이들 작용 중 일부는 면역요법에 대한 암의 내성을 극복하는데 있어서 타입 I IFN을 사용하기 위한 잠재적인 전략을 나타낼 수 있다. 암 환자에서 재발의 메커니즘 중 하나는 종양 항원 제시를 위한 MHC 클래스 I 분자 및 펩티드 수송체 유전자의 발현의 하향조절로 인한 T 세포 인식의 부족이다 (Sharma et al., 2017). 타입 I IFN은 종양 세포에서 MHC 클래스 I 발현 뿐만 아니라 LMP2/7 및 TAP-1/2 발현을 유도하는데 사용될 수 있으며, 이와 함께 면역요법에 대한 치료적 내성을 퇴치하기 위한 이상적인 조합 전략이다 (Khanna, 1998). 또한, 타입 I IFN은 Treg의 증식을 음성으로 조절하고 (Pace et al., 2010 and Srivastava et al., 2014) MDSC의 축적 및 억제 기능을 감소시킴으로써 Treg 및 MDSC를 억제하는데 사용될 수 있으며 (Zoglmeier et al., 2011), 이들 둘 다는 세포독성 T 림프구 활성을 직접적으로 억제한다 (Schmidt et al., 2012 and Gabrilovich et al., 2009). 이러한 다중 항종양 효과는 타입 I IFN을 단일요법으로 및 다른 요법과 함께 흥미로운 항암 약물로 만든다.

그러나, 진료소에서의 타입 I IFN 사용에 대한 가장 큰 장벽 중 하나는 이러한 치료와 관련된 심각한 부작용이다. 가장 빈번하게 직면하는 부작용은 독감과 유사한 증상, 혈액학적 독성, 증가된 트랜스아미나제, 메스꺼움, 피로, 및 정신과 후유증이다. 이러한 부작용은 최대 치료 효과에 필요한 용량에 도달하고 유지하는데 방해가 되며, 이의 발생은 전적으로 타입 I IFN 치료의 임상적 이익보다 손해가 더 클 수 있다 (Kreutzer et al., 2004, Sleijfer et al., 2005 and Lotrich, 2009). 따라서, 타입 I IFN을 종양 미세환경에 특이적으로 전달하는 능력이 타입 I IFN의 지속적인 임상적 사용을 위해 필수적이다. 종양내 및 종양에서만 활성을 발휘하는 신규한 형태의 약물을 수득하고, 또한 종양 외부에서 심각한 부작용을 피하기 위해 타입 I IFN을 변형시키기 위한 전략이 필요하다.

따라서, 본 발명의 개시내용에 따르면, (a) IFN 결합 활성을 보유하는 인터페론 알파 및 베타 수용체 (IFNAR) 도메인; (b) 상기 IFNAR 도메인에 의해 맞물리지 않는 경우 타입 1 인터페론 활성을 보유하는 타입 1 인터페론 (IFN) 도메인; (c) 면역글로불린 (Ig) Fc 도메인, (d) 한쪽 말단은 상기 IFN의 N-말단에 융합되고 다른 말단은 상기 IFNAR에 융합된 제1 링커(여기서, 상기 제1 링커는 프로테아제 절단 가능하다); 및 (e) 한쪽 말단은 상기 IFN의 C-말단에 융합되고 다른 말단은 상기 Ig Fc 도메인의 N-말단에 융합된 제2 링커를 포함하는 인터페론 전구약물(prodrug)이 제공된다. Ig는 IgG1 또는 IgG2와 같은 IgG일 수 있다. 인터페론 전구약물은 상기 타입 1 IFN 도메인의 두 개의 카피를 함유할 수 있다. 인터페론 전구약물은 상기 타입 1 IFN 도메인의 둘 이상의 카피를 함유할 수 있다. 제1 링커는 MMP1, MMP3, MMP9, MMP10, MMP11, MMP12, MMP13 또는 MMP14와 같은 하나 이상의 매트릭스 메탈로프로테이나제에 의해 절단 가능할 수 있다. 제1 링커는 UPA, FAPa 및/또는 카텝신 B에 의해 절단 가능할 수 있다. 링커는 G4S-SUB1-G4S-SUB2-G4S-SUB3-G4S일 수 있으며, 여기서 SUB1-3은 별개의 효소 절단 부위이다. IFNAR은 IFNAR1 또는 IFNAR2일 수 있다. IFN은 IFN-α, IFN-β, IFN-κ, IFN-δ, IFN-ε, IFN-τ, IFN-ω 또는 IFN-ζ일 수 있다.

또 다른 실시양태에서, (a) IFN 결합 활성을 보유하는 인터페론 알파 및 베타 수용체 (IFNAR) 도메인; (b) 상기 IFNAR 도메인에 의해 맞물리지 않는 경우 타입 1 인터페론 활성을 보유하는 타입 1 인터페론 (IFN) 도메인; (c) 면역글로불린 (Ig) Fc 도메인, (d) 한쪽 말단은 상기 IFN의 N-말단에 융합되고 다른 말단은 상기 IFNAR에 융합된 제1 링커(여기서, 상기 제1 링커는 프로테아제 절단 가능하다); (e) 한쪽 말단은 상기 IFN의 C-말단에 융합되고 다른 말단은 상기 Ig Fc 도메인의 N-말단에 융합된 제2 링커; 및 (f) 상기 IFNα 도메인의 5' 내지 5' 말단에 위치한 프로모터를 포함하는 인터페론 전구약물을 암호화하는 핵산 작제물이 제공된다. Ig는 IgG1 또는 IgG2와 같은 IgG일 수 있다. 인터페론 전구약물은 상기 타입 1 IFN 도메인의 두 개의 카피를 함유한다. 인터페론 전구약물은 상기 타입 1 IFN 도메인의 둘 이상의 카피를 함유할 수 있다. 제1 링커는 MMP1, MMP3, MMP9, MMP10, MMP11, MMP12, MMP13 및/또는 MMP14와 같은 매트릭스 메탈로프로테이나제에 의해 절단 가능할 수 있다. 제1 링커는 UPA, FAPa 및/또는 카텝신 B에 의해 절단 가능할 수 있다. 링커는 G4S-SUB1-G4S-SUB2-G4S-SUB3-G4S일 수 있으며, 여기서 SUB1-3은 별개의 효소 절단 부위이다. IFNAR은 IFNAR1 또는 IFNAR2일 수 있다. IFN은 IFN-α, IFN-β, IFN-κ, IFN-δ, IFN-ε, IFN-τ, IFN-ω 또는 IFN-ζ일 수 있다.

상기 정의된 바와 같은 인터페론 전구약물을 발현하는 재조합 세포; 상기 정의된 바와 같은 핵산 작제물을 포함하는 재조합 세포; 상기 정의된 세포를 배양함을 포함하여 인터페론 전구약물을 발현시키는 방법; 상기 정의된 세포를 배양함을 포함하여 인터페론 전구약물을 발현시키는 방법, 및 (a) 암 치료용 약제의 제조에 있어서; 또는 (b) 암의 치료를 위한, 상기 정의된 바와 같은 인터페론 전구약물의 용도가 또한 제공된다.

또 다른 실시양태에서, 상기 정의된 바와 같은 인터페론 전구약물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함하여 암을 치료하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 상기 대상체로부터 수득된 암 세포에서 프로테아제 발현을 평가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 암 세포는 생검으로부터 수득될 수 있거나, 순환 종양 세포일 수 있다. 암은 폐암, 유방암, 뇌암, 구강암, 식도암, 두경부암, 피부암, 위암, 간암, 췌장암, 신장암, 난소암, 전립선암, 방광암, 결장암, 고환암, 자궁암, 자궁경부암, 림프종, 또는 백혈병일 수 있다. 암은 원발성, 재발성, 전이성 또는 다중-약물 내성일 수 있다. 환자는 이전에 수술 요법, 화학요법, 방사선요법, 호르몬 요법 또는 면역요법을 받았을 수 있다.

상기 방법은 상기 대상체를 제2 암 요법, 예를 들어 수술 요법, 화학요법, 방사선요법, 호르몬 요법 또는 면역요법으로 치료하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 대상체는 인간 또는 비-인간 포유동물일 수 있다. 상기 방법은 상기 인터페론 전구약물을 1회 이상, 예를 들어, 매일, 격일로, 매주, 격주로 또는 매월 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 전구약물은 전신으로 또는 종양내로, 종양에 국부적으로 또는 종양에 국소적으로 투여될 수 있다. 치료 단계는 종양 성장 둔화, 종양 성장 정지, 종양 크기 또는 부담의 감소, 비처리 대상체와 비교하여 생존 증가, 암 완화 유도, 종양 세포 아폽토시스 유도, 또는 종양 괴사 유도 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

본원에 기술된 임의의 방법 또는 조성물은 본원에 기술된 임의의 다른 방법 또는 조성물과 관련하여 실행될 수 있는 것으로 고려된다.

"a" 또는 "an"이라는 단어의 사용은, 청구 범위 및/또는 명세서에서 "포함하는(comprising)"이라는 용어와 함께 사용되는 경우, "하나(one)"를 의미할 수 있지만, 또한 "하나 이상(one or more)", "적어도 하나(at least one)" 및 "하나 또는 하나 이상(one or more than one)"의 의미와 일치한다. "약"이라는 단어는 명시된 숫자의 플러스 또는 마이너스 5%를 의미한다.

본 개시내용의 다른 목적, 특징 및 장점은 다음의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 본 개시내용의 취지 및 범위 내의 다양한 변화 및 수정이 이러한 상세한 설명으로부터 당업계의 숙련가들에게 명백해질 것이기 때문에, 상세한 설명 및 특정 실시예는 개시내용의 특정 실시양태를 나타내면서 단지 예시에 의해 제공되는 것으로 이해되어야 한다.

하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고 본 개시내용의 특정 측면을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 개시내용은 본원에 제시된 특정 실시양태의 상세한 설명과 함께 이들 도면 중 하나 이상을 참조하여 더 잘 이해될 수 있다.
도 1. IFN - 전구약물의 개략도. IFNAR - ECD (청색), 기질 링커 (적색), IFN (황색), 종양-특이 효소 (녹색), IgG Fc ( 회색). 좌측 N-말단 아암은 IFNAR-ECD가 IFN에 융합되어 결합된 온전한 IFN-전구약물 형태를 나타내는 반면, 우측 N 말단 아암은 IFNAR-ECD가 분리된 활성화된 IFN-전구약물을 나타낸다.
도 2a-c. IFN - 전구약물의 활성화된 형태는 복원하기 보다는 증가된 IFN 활동을 보여준다. (도 2a) hIg, IFNa4-Fc, IFNAR1-기반 IFN-전구약물 및 IFNAR2-기반 IFN-전구약물을 20 nM로부터 5배로 연속-희석시켰다. (도 2b-c) IFN-전구약물을 검정 완충액 (50 mM Tris, 10 mM CaCl2, 150 mM NaCl, 0.05% Brij-35 (w/v), pH 7.5 (TCNB))에서 1 μM로 되도록 희석시켰다. rmMMP-9를 1 ng/μL의 최종 농도로 되도록 첨가하고 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. (도 2b) IFNa4-Fc, rmMMP-9 처리의 부재 또는 존재하의 R1-NSUB 및 rmMMP-9 처리의 부재 또는 존재하의 R1-SUB (MMP-2/9 기질)를 20 nM로부터 5배로 연속-희석시켰다. (도 2c) IFNa4-Fc, rmMMP-9 처리의 부재 또는 존재하의 R2-NSUB (MMP-2/9 기질) 및 rmMMP-9 처리의 부재 또는 존재하의 R2-SUB를 20 nM로부터 5배로 연속-희석시켰다. 희석된 융합 단백질 용액을 RAW-Lucia-ISG 리포터 세포에 첨가하여 루시퍼라제 분비를 자극하였다. 컨디셔닝된 상청액을 루시퍼라제 검정을 위해 자극한지 24시간 후 수확하였다. 오차 막대는 삼중치(triplicate)의 평균 ± s.e.m을 나타낸다.
도 3. IFNAR2 -기반 IFN - 전구약물은 IFNAR1 -기반 IFN - 전구약물보다 우수한 항종양 효과를 보인다. C57BL/6 마우스(그룹당 n = 5)에게 5 Х 10⁵개 B16 세포를 s.c. 주사하고 11, 15 및 21일째에 1 nmol의 hIg, IFNa4-Fc, R1-SUB (MMP2/9 기질) 또는 R2-SUB (MMP2/9 기질)로 복강내 처리하였다. 종양 성장을 1주에 2회 모니터링하고 시간 경과에 따라 평균 종양 크기 ± s.e.m.로서 보고한다.
도 4a-d. 마우스 정상 및 종양 조직에서의 효소 발현. C57BL/6 마우스(n = 4)에게 1 Х 10⁶개 MC38 세포 또는 5 Х 10⁵개 B16 세포를 s.c. 주사하였다. 지시된 정상 조직 및 종양을 11일째에 수확하였다. 세포내 RNA를 RT-qPCR 분석을 위해 추출하여 (도 4a) uPA, (도 4b) MMP-2, (도 4c) MMP-9, 및 (도 4d) MMP-14 mRNA 존재비를 결정하였다. 결과는 18sr에 대한 백분율로 표시된다. 오차 막대는 삼중치의 평균 ± s.e.m을 나타낸다.
도 5a-e. IFN - 전구약물은 효능을 손상 시키지 않으면서 안전성을 개선시킨다. C57BL/6 마우스(그룹당 n = 3)에게 5 Х 10⁵개 B16 세포를 s.c. 주사하고 10일, 13일 및 16일째에 1 mM의 hIg, IFNa4-Fc, 또는 R2-SUB (MMP-14 기질)로 복강내 처리하였다. 마우스를 채혈하고 17일째에 혈청을 수집하였다. (도 5a) 혈청 중의 염증성 사이토킨 IL-6, TNF, MCP-1 및 IFN-g의 농도를 마우스 염증 혈구계산 비드 어레이 (CBA)에 의해 측정하였다. (도 5b) 혈청 중의 ALT의 활성을 Reflotron Plus® 시스템에 의해 측정하였다. (도 5c) 종양 성장 및 (도 5d) 체중을 1주에 2회 모니터링하였다. (도 5e) 독성으로 인한 생존 곡선. 체중이 30% 이상 감소한 마우스는 죽은 것으로 간주하였다. 오차 막대는 평균 ± s.e.m을 나타낸다.
도 6a-h. 종양 및 인접 정상 조직 간의 인간 프로테아제 발현 수준. TCGA(The Cancer Genome Atlas)로부터의 모든 샘플에 대한 유전자 발현 수준의 비교의 TIMER (Tumor Immune Estimation Resource) 웹사이트 온라인 분석의 DiffExp 모듈. (도 6a) MMP-1, (도 6b) MMP-3, (도 6c) MMP-9, (도 6d) MMP-10, (도 6e) MMP-11, (도 6f) MMP-12, (도 6g) MMP-13, 및 (도 6h) MMP-14.
도 7a-c. 시험관내 인간 ProIFN의 활성화. (도 7a) hIFNa2-Fc, hIFNAR1-기반 ProIFN 및 hIFNAR2-기반 ProIFN을 50 μM로부터 10배로 연속-희석시켰다. IFN 활성을 293T-Dual™ hSTING-R232 리포터 세포에 의해 측정하였다. (도 7b) 기질을 갖는(hProIFN-Sub) 또는 기질을 갖지 않는(hProIFN-Nsub) 인간 hIFNAR2-기반 ProIFN을 검정 완충액 (50 mM Tris, 10 mM CaCl₂, 150 mM NaCl, 0.05% Brij-35 (w/v), pH 7.5 (TCNB))에서 1 μM로 되도록 희석시켰다. rmMMP-9를 1 ng/μL의 최종 농도로 되도록 첨가하고 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. IFN 활성을 293T-Dual™ hSTING-R232 리포터 세포에 의해 측정하였다. (도 7c) 인간 hIFNAR2-기반 hProIFN-Sub 또는 hProIFN-Nsub를 검정 완충액 (50 mM Tris, 10 mM CaCl₂, 150 mM NaCl, 0.05% Brij-35 (w/v), pH 7.5 (TCNB))에서 1 μM로 되도록 희석시켰다. rmMMP-9를 1 ng/μL의 최종 농도로 되도록 첨가하고 37℃에서 0, 0.5, 2, 또는 6시간 동안 배양하였다. 소화된 샘플을 Stain Free™ 겔 상에서 분리하였다. 겔은 무-염색(stain-free) 가능한 영상장치로 이미지화하였다. 오차 막대는 삼중치의 평균 ± s.e.m을 나타낸다.

예시적인 실시양태의 설명

전구약물은 활성으로 되기 위해 신체 내에서 변환을 필요하는 약물의 약리학적으로 비활성인 화학적 유도체이다. 이들은 약물의 임상적 유용성을 제한하는 모 약물과 관련된 약제학- 및/또는 약동학-기반 문제를 극복하도록 설계된다 (Stella et al., 1985). 최근에, 죽상경화성 플라크의 마커인 혈관 세포 부착 분자 1 (VCAM-1)을 표적으로 하는 프로테아제-활성화 항체 (프로-항체)가 매트릭스 메탈로프로테아제 (MMP) 민감성 링커를 통해 항체에 결합 부위-마스킹 펩티드를 테더링함으로써 작제되었다. 이러한 질병-관련 프로테아제의 활성은 생체내에서 항체 활성을 부위-특이적으로 표적화하기 위해 이용될 수 있다 (Erster et al., 2012). 암 요법 예에서, EGFR 표적에 대한 항-EGFR의 결합을 차단할 수 있는 스크린-식별 펩티드를 항-EGFR 항체에 연결시켰다. 생성된 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)-지시된 프로-항체는 비인간 영장류에서 안전성을 현저히 개선시키면서 반감기를 증가시켜 세툭시맙보다 훨씬 높은 수준으로 안전하게 투여될 수 있다 (Desnoyers et al., 2013). 그러나, 이러한 펩티드는 종종 약한 친화도를 가지므로, 약물 단백질의 불완전한 차단 뿐만 아니라 더 긴 치료를 막는 강력한 면역원성을 초래한다. 따라서, 본 발명자들은 비-종양 조직에서 이의 수용체의 약물 맞물림(drug engaging)을 차단하기 위해 적절한 친화도를 갖고 숙주에서 면역원성이 없는 천연 수용체에 기초한 새로운 전략을 설계하였다. 특히, 이들은 다수의 암에 대한 항종양 면역 반응에서의 중요한 역할로 인해 타입 I 인터페론에 초점을 맞추었다⁸.

본 발명자들은 IFN의 N-말단에 융합된 IFN 활성 차단제로서 면역글로불린 (IgG) 불변 영역 및 IFNAR (IFNAR1 또는 IFNAR2) 세포외 도메인을 사용하여 IFN-전구약물을 설계하였다. IFNAR은 종양 미세환경에서 과발현된 프로테아제에 의해 선택적으로 절단 가능한 특이 링커와 연결된다. 이것은 IFN 도메인이 종양에 도달할 때까지 IFN 도메인의 독성 활성을 차폐시키는 반면, IFN의 C-말단에 융합된 Fc 단편은 생체내에서 이의 반감기를 개선시킨다. 이러한 IFN-전구약물은 링커의 절단 전에는 유의적으로 감소된 IFN 활성을 보였지만, 효소 절단 후에는 이의 활성을 회복하였다. 본 발명자들은 또한 마우스 B16-OVA 흑색종 모델에서 생체내 IFN-전구약물의 효능 및 증진된 안전성을 입증하였다.

따라서, 암에 대한 치료제로서 이러한 IFN-전구약물을 사용하는 이점은 1) 낮은 독성; 2) 모 IFN-Fc보다 활성화된 형태에서 놀랍도록 더 높은 IFN 활성; 3) 높은 수율로 용이한 생산 및 정제; 4) 종양 조직의 특이적 표적화; 5) 비-면역원성 차단 시약의 사용; 및 6) 상이한 종양 효소 발현에 따른 개인맞춤형 IFN-전구약물 설계이다. 따라서, 이러한 IFN-전구약물은 효능을 손상시키지 않으면서 인터페론의 안전성 프로파일을 개선시킬 수 있고, 따라서 항체-사이토킨 이중특이 융합 단백질과 같은 진보된 인터페론 요법 포맷의 보다 광범위한 사용을 가능하게 할 수 있다. 본 개시내용의 이들 및 다른 측면은 아래에 보다 상세하게 설명된다.

I. 타입 1 인터페론

A. 인터페론 타입

인간 타입 I 인터페론 (IFN)은 면역계의 활성을 조절하는데 도움이 되는 인터페론 단백질의 큰 하위그룹이다. 인터페론은 인터페론 수용체에 결합된다. 모든 타입 I IFN은 IFNAR1 및 IFNAR2 쇄로 구성된 IFN-α 수용체 (IFNAR)로 알려진 특정 세포 표면 수용체 복합체에 결합된다. 타입 I IFN은 모든 포유동물에서 발견되며, 상동성 (유사한) 분자가 조류, 파충류, 양서류 및 어류 종에서 발견되었다. 포유동물 유형은 IFN-α (알파), IFN-β (베타), IFN-κ (카파), IFN-δ (델타), IFN-ε (엡실론), IFN-τ (타우), IFN-ω (오메가) 및 IFN-ζ (제타, 리미틴(limitin)으로도 알려짐)로 명명된다.

IFN-α 단백질은 백혈구에 의해 생성된다. 이들은 바이러스 감염에 대한 선천적 면역 반응에 주로 관여한다. 이들의 합성을 담당하는 유전자는 IFNA1, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNA8, IFNA10, IFNA13, IFNA14, IFNA16, IFNA17, IFNA21로 불리는 13가지 서브타입에서 온다. 이들 유전자는 염색체 9에서 클러스터로 함께 발견된다.

IFN-α는 또한 모발상 세포 백혈병(hairy cell leukemia)의 약물로서 합성에 의해 제조된다. 제품의 국제 일반명(International Nonproprietary Name; INN)은 인터페론 알파이다. 재조합 유형은 인터페론 알파콘-1이다. 페길화 유형은 페길화 인터페론 알파-2a 및 페길화 인터페론 알파-2b이다.

IFN-β 단백질은 섬유아세포에 의해 대량으로 생산된다. 이들은 선천적 면역 반응에 주로 관여하는 항바이러스 활성을 갖는다. 두 가지 유형의 IFN-β, IFN-β1 (IFNB1) 및 IFN-β3 (IFNB3)가 기술되었다 (IFN-β2로 명명된 유전자는 실제로 IL-6이다). IFN-β1은 재발률을 감소시키기 때문에 다발성 경화증을 위한 치료제로서 사용된다. IFN-β1은 진행성, 비-재발 형태의 다발성 경화증을 갖는 환자에게 적합한 치료법이 아니다.

IFN-ε, -κ, -τ, 및 -ζ는, 이때에, 인간에서 단일 이소형, IFNK으로 오는 것으로 보인다. 반추 동물만이 IFN-ω의 변이체인 IFN-τ를 암호화한다. 지금까지, IFN-ζ는 마우스에서만 발견된 반면 구조적 상동체인 IFN-δ는 다양한 비-영장류 및 비-설치류 태반 포유동물에서 발견된다. 모두는 아니지만 대부분의 태반 포유동물은 기능적 IFN-ε 및 IFN-κ 유전자를 암호화한다.

IFN-ω는, 지금까지 설명된 단지 하나의 기능적 형태 (IFNW1)를 갖지만, 인간에서 수 개의 유사유전자(pseudogene): IFNWP2, IFNWP4, IFNWP5, IFNWP9, IFNWP15, IFNWP18, 및 IFNWP19를 갖는다. 여러 비-영장류 태반 포유동물은 다수의 IFN-ω 서브타입을 발현한다.

IFN-ν는 최근 인간에서는 유사유전자로 기술되었지만, 집고양이 게놈에서는 잠재적으로 기능적이다. 비-고양이 태반 포유동물의 다른 모든 게놈에서, IFN-ν는 유사유전자이고; 일부 종에서는 유사유전자가 잘 보존되어 있지만, 다른 종에서는 심하게 훼손되거나 검출할 수 없다. 게다가, 고양이 게놈에서, IFN-ν 프로모터는 유해하게 돌연변이된다. IFN-ν 유전자 패밀리는 포유동물 다양화 이전에 쓸모없게 될 가능성이 있다. 포유동물에서 타입 I IFN 유전자좌의 가장자리에 이것이 존재하면 이것이 폐색으로부터 차폐되어 이의 검출이 가능해질 수 있다.

IFN-α 및 IFN-β는 림프구 (NK 세포, B-세포 및 T-세포), 대식세포, 섬유아세포, 내피 세포, 골아세포 등을 포함한 여러 세포 유형에 의해 분비된다. 이들은 대식세포와 NK 세포 둘 다를 자극하여 항-바이러스 반응을 이끌어내며, 또한 종양에 대해 활성이다. 형질세포양 수지상 세포(plasmacytoid dendritic cell)는 항원에 반응하여 타입 I IFN의 가장 강력한 생산자인 것으로 확인되었으며, 따라서 천연 IFN 생성 세포를 만들었다. 현재의 연구 결과는, 종양-침윤 대식세포에서 IFN-α 발현을 강제함으로써, 보다 효과적인 수지상 세포 활성화 및 면역 이펙터 세포 세포독성을 유도할 수 있음을 시사한다.

IFN-ω는 바이러스 감염 또는 종양의 부위에서 백혈구에 의해 방출된다. IFN-α는 시상하부에서 열감수성 뉴런의 활성을 변경함으로써 발열원성 인자로서 작용하여 열을 유발한다. 이것은 오피오이드 수용체에 결합하여 프로스타글란딘 -E₂ (PGE₂)의 방출을 유도함으로써 이를 수행한다. 유사한 메카니즘이 통증을 줄이기 위해 IFN-α에 의해 사용된다; IFN-α는 μ-오피오이드 수용체와 상호작용하여 진통제로서 작용한다.

마우스에서, IFN-β는 면역 세포가 성장 인자를 생성하는 것을 억제함으로써 종양 성장을 늦추고, 다른 세포가 혈관 생성 성장 인자를 생성하는 것을 억제함으로써 종양 혈관신생을 차단하고 종양이 혈관계에 연결되는 것을 방해한다.

B. 인터페론 수용체

인터페론-α/β 수용체 (IFNAR)는 인터페론-α 및 -β를 포함한 타입 I 인터페론에 결합하는 수용체이다. 이것은 IFNAR1 및 IFNAR2라고 하는 두 개의 하위단위를 가진 하나의 쇄로 구성된 이종체 세포 표면 수용체이다. 타입 I IFN의 결합시, IFNAR은 JAK-STAT 신호전달 경로를 활성화시킨다. 인터페론 자극은 고전적으로 항-바이러스 면역 반응을 야기한다.

구조는 NMR을 사용하여 수득되었다. 원래 35개의 이형태체(conformer)가 계산되었다. 이것은 낮은 에너지를 기준으로 하여 22개로 좁혀진다. 최초의 나선형 사이토킨 수용체 구조는 용액에서 결정되었다. 분자는 하나의 중합체를 갖는다. 구조는 결합의 특성을 보여준다. IFNAR2의 모델은 IFN-알파 상의 매칭 소수성 표면과 상호작용하는 수용체 상의 우세한 소수성 패치를 나타낸다. 하전된 측쇄의 모티프가 그후 단백질을 단단한 복합체로 안내한다. 결합 계면이 수용체의 교차반응성 및 리간드 특이성을 설명할 수 있다. 실험의 소스는 인간이었지만 대장균(Escherichia coli)에서 발현되었다.

IFNAR은 이의 이차 구조적 함량에 기초하여 그룹 베타 단백질로 클러스터링된다. IFNAR의 폴드(fold)는 면역글로불린 베타-샌드위치와의 명확한 진화 관계를 보여준다. 이것은 가능한 공통 진화를 보여주는 구조적 및 기능적 유사성에 기초하여 수퍼패밀리 및 패밀리 피브로넥틴 타입 III으로 분류된다. 도메인, 즉 자연에서 관찰되는 진화 단위는 인터페론-알파/베타 수용체 베타 쇄이다. 종은 인간이었다.

II. 인터페론 전구약물

A. 일반

전구약물은 일반적으로 치료제일 수 있는 능력을 함유하지만 실제로 치료제이기 위해 약간의 변형을 필요로 하는 형태의 분자로 정의된다. 이러한 시약은 활성 약물 형태의 전달이 독성 또는 안정성 부족과 같은 몇 가지 고유한 제한을 가질 때 특히 유용하다. 적절한 시간 및/또는 부위에서 생체내 효과적인 활성화를 허용하면서, 이러한 단점 둘 다를 피할 수 있는 전구약물 형태를 생성함으로써.

본 개시내용의 전구약물은 5개의 별개의 성분을 갖는다. 첫 번째 성분은 인터페론이다. 두 번째 성분은 맞물려 있는 동안 인터페론이 이의 정상적인 활성을 발휘하는 능력을 차단하는 마스킹 도메인이다. 세 번째 성분은 안정화 피쳐, 예를 들면, 항체 상의 불변 도메인이다. 이러한 세 가지 성분은 링커에 의해 연결되며, 인터페론과 마스킹 도메인 사이에 배치된 링커는, 예를 들면, 암 세포에 의해 또는 종양 환경에서 발현되는 프로테아제에 의해 선택적으로 절단된다.

상기 논의된 바와 같이, 타입 1 인터페론은 IFN-α (알파), IFN-β (베타), IFN-κ (카파), IFN-δ (델타), IFN-ε (엡실론), IFN-τ (타우), IFN-ω (오메가), 및 IFN-ζ (제타)이다. 이들 분자 중 임의의 것이 본원에 기술된 작제물에 포함될 수 있다. 2개 또는 심지어 4개의 상이한 타입 1 인터페론을 갖는 이종이량체성 작제물을 제조하는 것이 또한 가능하다. 본원에 개시된 데이터를 생성하기 위해 출원인에 의해 사용된 인터페론은 전장 단백질이지만 신호 펩티드가 없었다.

작제물의 중요한 부분은 물론 마스킹 도메인이다. 본 발명자들은 이러한 목적을 위해 비-천연 서열을 선택하기 보다는 타입 1 인터페론에 대한 천연 수용체를 사용하기로 한다. 천연 수용체의 구조에 기초하여 마스킹 도메인을 사용하는 이점은 (a) 타입 1 인터페론의 높은 친화도 및 (b) 서열에 대한 면역 반응의 보다 낮은 가능성 둘 다를 포함한다. 서열

다음으로, 작제물은, 예를 들면, 생체내 반감기를 증가시키는 안정화 도메인을 포함한다. 본 발명자들은 Ig 불변 도메인을 사용하기로 하였다. IgG1 Fc 도메인이 사용되지만, 다른 Fc 도메인도 사용될 수 있다. IgA Fc 도메인의 사용에 대한 특별한 이점은 이들의 이량체화 능력이며, 이것은 최대 4개의 상이한 인터페론이 이러한 작제물에 포함될 수 있음을 의미한다. 다수의 인터페론 작제물을 생성하기 위해, 하나의 예는 각각 FcA 및 FcB의 링커에 삽입된 상이한 효소에 대해 특이적인 별개의 절단 기질을 사용하면서 FcA 또는 FcB에 융합된 하나의 차단 수용체 및 하나의 인터페론을 갖는 IgG1의 FcA-FcB 이종이량체를 사용하는 것이다. 인간 혈청 알부민 및 트랜스페린을 포함한 다른 안정화 단백질이 또한 사용될 수 있다.

마지막으로, 상기 도메인은 짧은 펩티드 분지(stretch), 또는 "링커"에 의해 함께 연결된다. 인터페론 분자와 마스킹 도메인 사이에 배치된 이들 링커 중 하나는 전구약물이 이의 표적 - 종양 또는 암 세포 -에 또는 근처에 도달할 때 절단된다. 특정 실시양태에서, 링커는 전구약물이 프로테아제를 함유하는 환경에 노출될 때, 링커가 절단되고 마스킹제가 전구약물로부터 방출되어 인터페론 분자를 활성화시키도록 프로테아제 표적 부위를 함유한다. 이상적으로, 링커는 암 세포에서 또는 종양 부위에서 과발현된 프로테아제에 대해 선택될 수 있으며, 심지어 사전 시험에 의해 특정 개체의 암/종양 프로테아제 프로파일에 맞추어질 수 있다. 다음은 암 또는 종양 환경에서 선택적으로 발현되거나 과발현된 효소의 몇 가지 예이다.

[표 2] 프로테아제 기질

링커의 예시적인 형태는 GGGGS-기질-GGGGS이다. 다른 두 가지 예는 (GGGGS)_n-기질-(GGGGS)_n, 및 G_n-기질-G_n (n은 임의의 수일 수 있다)이다.

B. 핵산 작제물의 조작 및 발현

상기 기술된 인터페론 전구약물 성분을 함유하는 다양한 유전자 작제물이 이용 가능하며, 이들은 발현을 위해 벡터에 도입될 수 있다. 전구약물 분자를 암호화하는 본 개시내용에 따르는 핵산은 다른 단백질 서열에 임의로 연결될 수 있다. 본 출원 전반에 걸쳐, 용어 "발현 작제물"은 핵산 암호화 서열의 일부 또는 전부가 전사될 수 있는 유전자 산물을 코딩하는 핵산을 함유하는 임의 유형의 유전자 작제물을 포함함을 의미한다. 전사체는 단백질로 번역될 수 있지만, 반드시 그럴 필요는 없다. 특정 실시양태에서, 발현은 유전자의 전사 및 mRNA의 유전자 산물로의 번역 둘 다를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 발현은 관심 유전자를 암호화하는 핵산의 전사만을 포함한다.

용어 "벡터"는 핵산 서열이 이것이 복제될 수 있는 세포 내로의 도입을 위해 삽입될 수 있는 담체 핵산 분자를 지칭하는데 사용된다. 핵산 서열은 "외인성"일 수 있으며, 이것은 벡터가 도입되는 세포에 대해 외래이거나 또는 서열이 원래 발견되지 않는 숙주 세포 핵산 내의 위치에서를 제외하고 서열이 세포에서의 서열과 상동성임을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 코스미드, 바이러스 (박테리오파지, 동물 바이러스, 및 식물 바이러스), 및 인공 염색체 (예를 들어, YACs)를 포함한다. 당업계의 숙련가는 표준 재조합 기술을 통해 벡터를 작제하는 장비를 잘 갖추고 있을 것이며, 이것은 문헌{Sambrook et al. (1989) and Ausubel et al. (1994)]에 기술되어 있고, 이들 둘 다는 본원에 참고로 포함된다.

용어 "발현 벡터"는 전사될 수 있는 유전자 산물의 적어도 일부를 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 벡터를 지칭한다. 일부 경우에, RNA 분자는 그후 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드로 번역된다. 또 다른 경우에, 이들 서열은, 예를 들면, 안티센스 분자 또는 리보자임의 생산에서는 번역되지 않는다. 발현 벡터는 다양한 "제어 서열"을 함유할 수 있으며, 이것은 특정 숙주 유기체에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열의 전사 및 가능하게는 번역에 필요한 핵산 서열을 지칭한다. 전사 및 번역을 통제하는 제어 서열 이외에, 벡터 및 발현 벡터는 다른 기능을 또한 수행하고 하기에 기술된 핵산 서열을 함유할 수 있다.

1. 조절 요소

"프로모터"는 개시 및 전사 속도가 제어되는 핵산 서열의 영역인 제어 서열이다. 이것은 RNA 폴리머라제 및 다른 전사 인자와 같은 조절 단백질 및 분자가 결합할 수 있는 유전 요소를 함유할 수 있다. 어구 "작동 가능하게 위치된", "작동 가능하게 연결된", "제어하에서" 및 "전사적 제어하에서"는 프로모터가 그 서열의 전사적 개시 및/또는 발현을 제어하기 위해 핵산 서열과 관련하여 올바른 기능적 위치 및/또는 배향에 있음을 의미한다. 프로모터는 "인핸서"와 함께 사용되거나 사용되지 않을 수 있으며, 이것은 핵산 서열의 전사 활성화에 관여하는 시스-작용성 조절 서열을 지칭한다.

프로모터는 코딩 세그먼트 및/또는 엑손의 상류에 위치한 5' 비-코딩 서열을 단리함으로써 수득될 수 있는 바와 같이 유전자 또는 서열과 자연적으로 연관된 것일 수 있다. 이러한 프로모터로를 "내인성"이라고 할 수 있다. 유사하게, 인핸서는 그 서열의 하류 또는 상류에 위치한 핵산 서열과 자연적으로 연관된 것일 수 있다. 대안적으로, 자연 환경에서는 핵산 서열과 정상적으로 관련되지 않은 프로모터를 지칭하는 재조합 또는 이종 프로모터의 제어하에 코딩 핵산 세그먼트를 위치시킴으로써 특정 이점이 달성될 것이다.

재조합 또는 이종 인핸서는 또한 이의 자연 환경에서 핵산 서열과 정상적으로 관련되지 않은 인핸서를 지칭한다. 이러한 프로모터 또는 인핸서는 다른 유전자의 프로모터 또는 인핸서, 및 임의의 다른 원핵 세포, 바이러스 또는 진핵 세포로부터 단리된 프로모터 또는 인핸서, 및 "자연-발생"이 아닌, 즉 상이한 전사 조절 영역의 상이한 요소 및/또는 발현을 변경시키는 돌연변이를 함유하는 프로모터 또는 인핸서를 포함할 수 있다. 프로모터 및 인핸서의 핵산 서열을 합성적으로 생성하는 것 외에도, 서열은 본원에 개시된 조성물과 관련하여 PCR™을 포함한 재조합 클로닝 및/또는 핵산 증폭 기술을 사용하여 생성될 수 있다 (미국 특허 제4,683,202호, 미국 특허 제5,928,906호 참조, 각각은 본원에 참고로 포함됨). 또한, 미토콘드리아, 엽록체 등과 같은 비핵 소기관 내에서 서열의 전사 및/또는 발현을 지시하는 제어 서열이 또한 사용될 수 있는 것으로 고려된다.

당연히, 발현을 위해 선택된 세포 유형, 소기관 및 유기체에서 DNA 세그먼트의 발현을 효과적으로 지시하는 프로모터 및/또는 인핸서를 사용하는 것이 중요할 것이다. 분자 생물학 분야의 숙련가들은 일반적으로 단백질 발현을 위한 프로모터, 인핸서 및 세포 유형 조합의 사용을 알고 있으며, 예를 들면, 본원에 참고로 포함된 문헌[Sambrook et al. (1989)]을 참조한다. 사용된 프로모터는 구성적이고, 조직-특이적이며, 유도성이고/이거나 재조합 단백질 및/또는 펩티드의 대규모 생산에 유리한 바와 같이 도입된 DNA 세그먼트의 높은 수준의 발현을 지시하기 위해 적절한 조건하에서 유용할 수 있다. 프로모터는 이종성 또는 내인성일 수 있다.

조직-특이적 프로모터 또는 요소의 정체 뿐만 아니라 이들의 활성을 특징짓는 분석법은 당업계의 숙련가들에게 잘 알려져 있다. 이러한 영역의 예는 인간 LIMK2 유전자 (Nomoto et al. 1999), 소마토스타틴 수용체 2 유전자 (Kraus et al., 1998), 뮤린 정소상체 레티노산-결합 유전자 (Lareyre et al., 1999), 인간 CD4 (Zhao-Emonet et al., 1998), 마우스 알파2 (XI) 콜라겐 (Tsumaki, et al., 1998), D1A 도파민 수용체 유전자 (Lee, et al., 1997), 인슐린-유사 성장 인자 II (Wu et al., 1997), 인간 혈소판 내피 세포 부착 분자-1 (Almendro et al., 1996)을 포함한다. 종양 특이 프로모터가 또한 본 개시내용에서 사용될 것이다.

코딩 서열의 효율적인 번역을 위해 특정 개시 신호가 또한 필요할 수 있다. 이러한 신호는 ATG 개시 코돈 또는 인접 서열을 포함한다. ATG 개시 코돈을 포함한 외인성 번역 제어 신호가 제공될 필요가 있을 수 있다. 당업계의 통상의 숙련가는 이를 쉽게 결정하고 필요한 신호를 제공할 수 있을 것이다. 개시 코돈은 전체 삽입물의 번역을 보장하기 위해 원하는 코딩 서열의 판독 프레임과 "인-프레임(in-frame)"이어야 함은 잘 알려져 있다. 외인성 번역 제어 신호 및 개시 코돈은 자연적이거나 합성적일 수 있다. 적절한 전사 인핸서 요소의 포함에 의해 발현의 효율을 향상시킬 수 있다.

2. IRES

본 개시내용의 특정 실시양태에서, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 요소의 사용이 다유전자, 또는 폴리시스트론 정보 (polycistronic, messages)를 생성하는데 사용된다. IRES 요소는 5'-메틸화된 Cap 의존적 번역의 리보솜 스캐닝 모델을 우회하여 내부 부위에서 번역을 시작할 수 있다 (Pelletier and Sonenberg, 1988). 피코르나바이러스 패밀리의 두 개의 구성원으로부터의 IRES 요소 (소아마비 및 뇌심근염)가 기술되었으며 (Pelletier and Sonenberg, 1988), 또한 포유동물 정보로부터의 IRES가 기술되었다 (Macejak and Sarnow, 1991). IRES 요소는 이종 개방 판독 프레임에 연결될 수 있다. 다중 개방 판독 프레임은 함께 전사될 수 있으며, 각각은 IRES에 의해 분리되어 폴리시스트론 정보를 생성한다. IRES 요소에 의해, 각각의 개방 판독 프레임은 효율적인 번역을 위해 리보솜에 접근 가능하다. 다중 유전자는 단일 정보를 전사하는 단일 프로모터/인핸서를 사용하여 효율적으로 발현될 수 있다 (본원에 참고로 포함된 미국 특허 제5,925,565호 및 제5,935,819호 참조).

3. 다목적 클로닝 부위

벡터는 다수의 제한 효소 부위를 함유하는 핵산 영역인 다중 클로닝 부위 (MCS)를 포함할 수 있으며, 이들 중 어느 것이라도 벡터를 소화시키기 위해 표준 재조합 기술과 함께 사용될 수 있다. 본원에 참고로 포함된 문헌[Carbonelli et al., 1999, Levenson et al., 1998, and Cocea, 1997]을 참고한다. "제한 효소 소화"는 핵산 분자의 특정 위치에서만 기능하는 효소에 의한 핵산 분자의 촉매적 절단을 지칭한다. 이러한 제한 효소 중 다수는 상업적으로 이용 가능하다. 이러한 효소의 사용은 당업계의 숙련가들에 의해 널리 이해된다. 종종, 벡터는 외인성 서열이 벡터에 결찰될 수 있도록 MCS 내에서 절단하는 제한 효소를 사용하여 선형화되거나 단편화된다. "결찰"은 서로 인접하거나 인접하지 않을 수 있는 두 개의 핵산 단편 사이에 포스포디에스테르 결합을 형성하는 과정을 지칭한다. 제한 효소 및 결찰 반응을 수반하는 기술은 재조합 기술 분야의 숙련가들에게 잘 알려져 있다.

4. 스플라이싱 부위

대부분의 전사된 진핵생물 RNA 분자는 RNA 스플라이싱을 거쳐 일차 전사체로부터 인트론을 제거한다. 게놈 진핵생물 서열을 함유하는 벡터는 단백질 발현을 위한 전사체의 적절한 처리를 보장하기 위해 공여자 및/또는 수용자 스플라이싱 부위를 필요로 할 수 있다 (본원에 참고로 포함된 문헌[Chandler et al., 1997] 참조).

5. 종결 신호

본 개시내용의 벡터 또는 작제물은 일반적으로 적어도 하나의 종결 신호를 포함할 것이다. "종결 신호" 또는 "종결자(terminator)"는 RNA 폴리머라제에 의한 RNA 전사체의 특이적 종결에 관여하는 DNA 서열로 구성된다. 따라서, 특정 실시양태에서 RNA 전사체의 생산을 종료시키는 종결 신호가 고려된다. 종결자는 바람직한 메시지 수준을 달성하기 위해 생체내에서 필요할 수 있다.

진핵생물 시스템에서, 종결자 영역은 또한 폴리아데닐화 부위를 노출시키도록 새로운 전사체의 부위-특이적 절단을 허용하는 특정 DNA 서열을 포함할 수 있다. 이것은 약 200 A 잔기 (polyA)의 분지를 전사체의 3 '말단에 추가하도록 특수한 내인성 폴리머라제를 신호한다. 이러한 polyA 꼬리를 갖는 변형된 RNA 분자는 보다 안정한 것으로 보이며 보다 효율적으로 번역된다. 따라서, 진핵생물을 수반하는 또 다른 실시양태에서, 종결자가 RNA의 절단에 대한 신호를 포함하는 것이 바람직하고, 종결자 신호가 메시지의 폴리아데닐화를 촉진하는 것이 더욱 바람직하다. 종결자 및/또는 폴리아데닐화 부위 요소는 메시지 수준을 향상시키고/시키거나 카세트에서 다른 서열로의 판독을 최소화하는 역할을 할 수 있다.

본 개시내용에서 사용하기 위해 고려되는 종결자는, 예를 들면, 소 성장 호르몬 종결자와 같은 유전자의 종결 서열 또는, 예를 들면, SV40 종결자와 같은 바이러스 종결 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는 본원에 기술되거나 당업계의 통상의 숙련가에게 공지된 임의의 공지된 전사 종결자를 포함한다. 특정 실시양태에서, 종결 신호는 서열 절단(sequence truncation)으로 인한 것과 같이 전사 가능하거나 번역 가능한 서열이 없을 수 있다.

6. 폴리아데닐화 신호

발현, 특히 진핵생물 발현에서, 전사체의 적절한 폴리아데닐화를 수행하기 위해 전형적으로 폴리아데닐화 신호를 포함할 것이다. 폴리아데닐화 신호의 특성이 본 개시내용의 성공적인 실시에 결정적인 것으로 여겨지지 않고/않거나, 임의의 이러한 서열이 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태는 통상적이고/이거나 다양한 표적 세포에서 잘 기능하는 것으로 알려진 SV40 폴리아데닐화 신호 및/또는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 폴리아데닐화는 전사체의 안정성을 증가시키거나 세포질 수송을 촉진할 수 있다.

7. 복제 기점

숙주 세포에서 벡터를 전파하기 위해, 이것은 복제가 개시되는 특정 핵산 서열인 하나 이상의 복제 부위 기점 (종종 "ori"라고 함)을 함유할 수 있다. 대안적으로 숙주 세포가 효모인 경우 자동 복제 서열 (autonomously replicating sequence; ARS)이 사용될 수 있다.

8. 선택 가능하고 선별 가능한 마커

본 개시내용의 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 핵산 작제물을 함유하는 세포는 발현 벡터에 마커를 포함시킴으로써 시험관내 또는 생체내에서 동정할 수 있다. 이러한 마커는 세포에 식별 가능한 변화를 부여하여 발현 벡터를 함유하는 세포의 용이한 동정을 가능하게 할 것이다. 일반적으로, 선택 가능한 마커는 선택을 허용하는 속성을 부여하는 것이다. 양성 선택 가능한 마커는 마커의 존재가 선택을 허용하는 마커인 반면 음성 선택 가능한 마커는 이의 존재가 선택을 방해하는 마커이다. 양성 선택 가능한 마커의 예는 약물 내성 마커이다.

통상적으로 약물 선택 마커의 포함은 형질전환체의 클로닝 및 동정을 도우며, 예를 들면, 네오마이신, 퓨로마이신, 하이그로마이신, DHFR, GPT, 제오신 및 히스티디놀에 대한 내성을 부여하는 유전자가 유용한 선택 가능한 마커이다. 조건의 구현에 기초하여 형질전환체의 식별을 가능하게 하는 표현형을 부여하는 마커 이외에, 비색 분석에 기초하는 GFP와 같은 선별 가능한 마커를 포함한 다른 유형의 마커가 또한 고려된다. 대안적으로, 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제 (tk) 또는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT)와 같은 선별 가능한 효소가 이용될 수 있다. 당업계의 숙련가는 또한 가능하게는 FACS 분석과 함께 면역학적 마커를 사용하는 방법을 알고 있을 것이다. 사용되는 마커는 유전자 산물을 암호화하는 핵산과 동시에 발현될 수 있는 한 중요한 것으로 여겨지지 않는다. 선택 가능하고 선별 가능한 마커의 추가의 예는 당업계의 숙련가에게 잘 알려져 있다.

9. 바이러스 벡터

세포를 효율적으로 감염시키거나 세포에 도입하고, 숙주 세포 게놈에 통합시키고, 바이러스 유전자를 안정적으로 발현시키는 특정 바이러스 벡터의 능력은 다수의 상이한 바이러스 벡터 시스템의 개발 및 응용으로 이어졌다 (Robbins et al., 1998). 바이러스 시스템은 생체외 및 생체내 유전자 전달을 위한 벡터로서 사용하기 위해 현재 개발되고 있다. 예를 들면, 아데노바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 레트로바이러스 및 아데노-관련 바이러스 벡터는 현재 암, 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 고셰병(Gaucher's disease), 신장 질환 및 관절염과 같은 질병의 치료에 대해 평가되고 있다 (Robbins and Ghivizzani, 1998; Imai et al., 1998; 미국 특허 제5,670,488호). 아래 기술된 다양한 바이러스 벡터는, 특정 유전자-치료 적용에 따라, 특정 장점 및 단점을 나타낸다.

10. 비-바이러스 형질전환

본 개시내용에 사용하기 위한 소기관, 세포, 조직 또는 유기체의 형질전환을 위한 핵산 전달에 적합한 방법은 본원에 기술된 바와 같이 또는 당업계의 통상의 숙련가에게 공지된 바와 같이 핵산 (예를 들어, DNA)을 소기관, 세포, 조직 또는 유기체에 도입할 수 있는 거의 모든 방법을 포함하는 것으로 여겨진다. 이러한 방법은 미량주사 (Harland and Weintraub, 1985; 미국 특허 제5,789,215호, 본원에 참고로 포함됨)를 포함한 주사(미국 특허 제5,994,624호, 제5,981,274호, 제5,945,100호, 제5,780,448호, 제5,736,524호, 제5,702,932호, 제5,656,610호, 제5,589,466호 및 제5,580,859호, 각각 본원에 참고로 포함됨)에 의해; 전기천공(미국 특허 5,384,253, 본원에 참고로 포함됨)에 의해; 인산칼슘 침전(Graham and Van Der Eb, 1973; Chen and Okayama, 1987; Rippe　et al.,　1990)에 의해; DEAE-덱스트란에 이어 폴리에틸렌 글리콜을 사용함으로써(Gopal, 1985); 직접 음속 부하 (direct sonic loading)(Fechheimer　et al.,　1987)에 의해; 리포솜 매개된 형질감염(Nicolau and Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987; Wong et al., 1980; Kaneda et al., 1989; Kato et al.,　1991)에 의해; 미립자가속장치 충격(microprojectile bombardment)(PCT 출원 제WO 94/09699호 및 제95/06128호; 미국 특허 제5,610,042호; 제5,322,783호, 제5,563,055호, 제5,550,318호, 제5,538,877호 및 제5,538,880호, 각각 본원에 참고로 포함됨)에 의해; 탄화규소 섬유와의 교반(Kaeppler　et al.,　1990; 미국 특허 제5,302,523호 및 제5,464,765호, 각각 본원에 참고로 포함됨)에 의해; 또는 원형질체의 PEG-매개된 형질전환(Omirulleh　et al.,　1993; 미국 특허 제4,684,611호 및 제4,952,500호, 각각 본원에 참고로 포함됨)에 의해; 건조/억제-매개된 DNA 흡수(Potrykus　et al.,　1985)에 의해서와 같은 DNA의 직접 전달을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들과 같은 기술의 적용을 통해, 소기관(들), 세포(들), 조직(들) 또는 유기체(들)가 안정적으로 또는 일시적으로 형질전형될 수 있다.

주사. 특정 실시양태에서, 핵산은, 예를 들면, 피하, 피내, 근육내, 정맥내 또는 복강내와 같은 하나 이상의 주사 (즉, 바늘 주사)를 통해 소기관, 세포, 조직 또는 유기체로 전달될 수 있다. 백신의 주사 방법은 당업계의 통상의 숙련가들에게 잘 알려져 있다 (예를 들어, 염수 용액을 포함하는 조성물의 주사). 본 개시내용의 추가의 실시양태는 직접 미량주사에 의한 핵산의 도입을 포함한다. 직접 미량주사는 제노푸스 난모세포(Xenopus oocyte)에 핵산 작제물을 도입하는데 사용되었다 (Harland and Weintraub, 1985).

전기천공. 본 개시내용의 특정 실시양태에서, 핵산은 전기천공을 통해 소기관, 세포, 조직 또는 유기체로 도입된다. 전기천공은 세포 및 DNA의 현탁액을 고전압 방전에 노출시킴을 포함한다. 이 방법의 일부 변형에서, 펙틴-분해 효소와 같은 특정 세포벽-분해 효소가 표적 수용자 세포가 비처리 세포보다 전기천공에 의한 형질전환에 더 취약하게 하는데 사용된다 (미국 특허 제5,384,253호, 본원에 참고로 포함됨). 대안적으로, 수용자 세포는 기계적 부상(mechanical wounding)에 의해 형질전환에 더 취약하게 될 수 있다.

전기천공을 이용한 진핵 세포의 형질감염은 상당히 성공적이었다. 이러한 방식으로 마우스 프리-B 림프구는 인간 κ-면역글로불린 유전자로 형질감염되었고 (Potter et al., 1984), 랫트 간세포는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 유전자 (Tur-Kaspa et al., 1986)로 형질감염되었다.

예를 들면, 식물 세포와 같은 세포에서 전기천공에 의한 형질전환을 수행하기 위해, 세포의 현탁 배양 또는 배발생 캘러스(embryogenic callus)와 같은 부서지기 쉬운 조직을 사용할 수 있거나 대안적으로 미성숙 배아 또는 다른 조직화된 조직을 직접 형질전환시킬 수 있다. 이 기술에서, 펙틴-분해 효소 (펙토리아제)에 노출시키거나 제어된 방식으로 기계적으로 상처를 입힘으로써 선택된 세포의 세포벽을 부분적으로 분해할 것이다. 무손상 세포의 전기천공에 의해 형질전환된 몇몇 종의 예는 옥수수 (미국 특허 제5,384,253호; Rhodes　et al.,　1995; D'Halluin　et al.,　1992), 밀 (Zhou　et al.,　1993), 토마토 (Hou and Lin, 1996), 대두 (Christou　et al.,　1987) 및 담배 (Lee　et al.,　1989)를 포함한다.

식물 세포의 전기천공 형질전환을 위해 원형질체를 또한 사용할 수 있다 (Bates, 1994; Lazzeri, 1995). 예를 들면, 자엽-유래 원형질체의 전기천공에 의한 형질전환 대두 식물의 생성은 본원에 참고로 인용된 국제 특허 출원 제WO 92/17598호에 Dhir 및 Widholm에 의해 기술되어 있다. 원형질체 형질전환이 기술된 종의 또 다른 예는 보리 (Lazerri, 1995), 수수 (Battraw　et al.,　1991), 옥수수 (Bhattacharjee　et al.,　1997), 밀 (He　et al.,　1994) 및 토마토 (Tsukada, 1989)를 포함한다.

인산칼슘. 본 개시내용의 또 다른 실시양태에서, 핵산은 인산칼슘 침전을 사용하여 세포에 도입된다. 인간 KB 세포는 이 기술을 사용하여 아데노바이러스 5 DNA (Graham and Van Der Eb, 1973)로 형질감염되었다. 또한 이러한 방식으로, 마우스 L (A9), 마우스 C127, CHO, CV-1, BHK, NIH3T3 및 HeLa 세포가 네오마이신 마커 유전자로 형질감염되었고 (Chen and Okayama, 1987), 랫트 간세포는 다양한 마커 유전자로 형질감염되었다 (Rippe　et al.,　1990).

DEAE - 덱스트란. 또 다른 실시양태에서, 핵산은 DEAE-덱스트란에 이어 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 세포 내로 전달된다. 이러한 방식으로, 리포터 플라스미드가 마우스 골수종 및 적백혈병 세포에 도입되었다 (Gopal, 1985).

초음파처리 부하. 본 개시내용의 추가의 실시양태는 직접 음속 부하에 의한 핵산의 도입을 포함한다. LTK^- 섬유아세포는 초음파 부하에 의해 티미딘 키나제 유전자로 형질감염되었다 (Fechheimer　et al.,　1987).

리포솜- 매개된 형질감염. 본 개시내용의 추가의 실시양태에서, 핵산은, 예를 들면, 리포솜과 같은 지질 복합체에 포획될 수 있다. 리포솜은 인지질 이중층 막 및 내부 수성 매질을 특징으로 하는 소포 구조이다. 다중층 리포솜은 수성 매질에 의해 분리된 다중 지질 층을 갖는다. 이들은 인지질이 과량의 수용액에 현탁되는 경우 자발적으로 형성된다. 지질 성분은 폐쇄 구조를 형성하기 전에 자기-재배열을 겪고 지질 이중층 사이에 물 및 용해된 용질을 포획한다 (Ghosh and Bachhawat, 1991). 리포펙타민 (Gibco BRL) 또는 슈퍼펙트 (Qiagen)와 착화된 핵산이 또한 고려된다.

시험관내 외래 DNA의 리포솜-매개된 핵산 전달 및 발현은 매우 성공적이었다 (Nicolau and Sene, 1982; Fraley　et al.,　1979; Nicolau　et al.,　1987). 배양된 병아리 배아, HeLa 및 간세포암 세포에서 외래 DNA의 리포솜-매개된 전달 및 발현의 실행가능성이 또한 입증되었다 (Wong　et al., 1980).

본 개시내용의 특정 실시양태에서, 리포솜은 혈구응집 바이러스 (HVJ)와 착화될 수 있다. 이것은 세포막과의 융합을 용이하게 하고 리포솜-캡슐화된 DNA의 세포 진입을 촉진하는 것으로 나타났다 (Kaneda　et al.,　1989). 또 다른 실시양태에서, 리포솜은 핵 비-히스톤 염색체 단백질 (HMG-1)과 함께 착화되거나 사용될 수 있다 (Kato　et al.,　1991). 추가의 실시양태에서, 리포솜은 HVJ 및 HMG-1 둘 다와 함께 착화되거나 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 전달 비히클은 리간드 및 리포솜을 포함할 수 있다.

수용체- 매개된 형질감염. 또한, 핵산은 수용체-매개된 전달 비히클을 통해 표적 세포로 전달될 수 있다. 이들은 표적 세포에서 발생하는 수용체-매개된 세포내이입(endocytosis)에 의한 거대분자의 선택적 흡수를 이용한다. 다양한 수용체의 세포 유형-특이 분포를 고려하여, 이러한 전달 방법은 본 개시내용에 다른 정도의 특이성을 추가한다.

특정 수용체-매개된 유전자 표적화 비히클은 세포 수용체-특이 리간드 및 핵산-결합제를 포함한다. 다른 것들은 전달될 핵산이 작동 가능하게 부착된 세포 수용체-특이 리간드를 포함한다. 수용체-매개된 유전자 전달에 여러 리간드가 사용되어 왔으며 (Wu and Wu, 1987; Wagner et al., 1990; Perales et al., 1994; Myers, EPO 0273085), 이것이 기술의 작동성을 확립한다. 다른 포유동물 세포 유형의 맥락에서 특이 전달이 기술되었다 (Wu and Wu, 1993; 본원에 참고로 포함됨). 본 개시내용의 특정 측면에서, 리간드는 표적 세포 집단에서 특이적으로 발현된 수용체에 상응하도록 선택될 것이다.

또 다른 실시양태에서, 세포-특이 핵산 표적화 비히클의 핵산 전달 비히클 성분은 리포솜과 조합된 특이 결합 리간드를 포함할 수 있다. 전달될 핵산(들)은 리포솜 내에 수용되며 특이 결합 리간드가 리포솜 막에 기능적으로 통합된다. 따라서 리포솜은 표적 세포의 수용체(들)에 특이적으로 결합하여 내용물을 세포에 전달할 것이다. 이러한 시스템은, 예를 들면, 표피 성장 인자 (EGF)가 EGF 수용체의 상향조절을 나타내는 세포로의 핵산의 수용체-매개된 전달에 사용되는 시스템을 사용하여 기능하는 것으로 나타났다.

여전히 추가의 실시양태에서, 표적화된 전달 비히클의 핵산 전달 비히클 성분은 리포좀 자체일 수 있으며, 이것은 바람직하게는 세포-특이 결합을 지시하는 하나 이상의 지질 또는 당단백질을 포함할 것이다. 예를 들면, 락토실-세라마이드, 갈락토스-말단 아시알로강글리오시드가 리포솜에 혼입되어 간세포에 의한 인슐린 유전자의 흡수 증가가 관찰되었다 (Nicolau　et al., 1987). 본 개시내용의 조직-특이 형질전환 작제물은 유사한 방식으로 표적 세포 내로 특이적으로 전달될 수 있는 것으로 고려된다.

11. 발현 시스템

상기 논의된 조성물의 적어도 일부 또는 전부를 포함하는 수많은 발현 시스템이 존재한다. 원핵생물- 및/또는 진핵생물-기반 시스템이 핵산 서열 또는 이의 동족 폴리펩티드, 단백질 및 펩티드를 생성하기 위해 본 발명에 사용하기 위해 이용될 수 있다. 이러한 많은 시스템은 상업적으로 널리 이용 가능하다.

곤충 세포/바큘로바이러스 시스템은 본원에 둘 다 참고로 포함된 미국 특허 제5,871,986호 및 제4,879,236호에 기술된 바와 같은 이종 핵산 세그먼트의 높은 수준의 단백질 발현을 생성할 수 있으며, 이것은, 예를 들면, Invitrogen^®로부터의 MaxBac^® 2.0 및 Clontech^®로부터의 BacPack™ 바큘로바이러스 발현 시스템이라는 명칭하에 구입할 수 있다.

발현 시스템의 또 다른 예는 합성 엑디손-유도성 수용체 또는 이의 pET 발현 시스템, 대장균 (E. coli) 발현 시스템을 포함하는 Stratagene^®의 Complete Control™ 유도성 포유동물 발현 시스템을 포함한다. 유도성 발현 시스템의 또 다른 예는 Invitrogen^®로부터 이용 가능하며, 이것은 전장 CMV 프로모터를 사용하는 유도성 포유동물 발현 시스템인 T-Rex™ (테트라사이클린-조절된 발현) 시스템을 보유한다. Invitrogen^®은 또한 메탄올 자화 효모 피치아 메타놀리카 (Pichia methanolica)에서 재조합 단백질의 고수준 생산을 위해 설계된 피치아 메타놀리카 발현 시스템이라 불리는 효모 발현 시스템을 제공한다. pGEM-T Easy 벡터, pCon Vectors™, Lonza pConIgG1 또는 pConK2 플라스미드 벡터, 및 293 Freestyle 세포 또는 Lonza CHO 세포가 또한 개시된 전구약물 작제물의 발현에 유용하다.

일차 포유류 세포 배양물은 다양한 방식으로 제조될 수 있다. 시험관내 및 발현 작제물과 접촉하는 동안 세포가 생존 가능하게 유지되기 위해서는, 세포가 정확한 비율의 산소와 이산화탄소 및 영양소와 접촉을 유지하지만 미생물 오염으로부터 보호되도록 보장하는 것이 필요하다. 세포 배양 기술은 잘 문서화되어 있다.

전술한 바의 하나의 실시양태는 단백질 생산을 위해 세포를 불멸화시키기 위한 유전자 전달의 사용을 포함한다. 관심 단백질에 대한 유전자가 상기 기술된 바와 같이 적절한 숙주 세포 내로 전달된 다음 적절한 조건하에서 세포 배양될 수 있다. 거의 모든 폴리펩티드에 대한 유전자가 이러한 방식으로 사용될 수 있다. 재조합 발현 벡터의 생성 및 그 안에 포함된 요소는 상기 논의되어 있다. 대안적으로, 생성될 단백질은 해당 세포에 의해 정상적으로 합성되는 내인성 단백질일 수 있다.

유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 Vero 및 HeLa 세포 및 차이니즈 햄스터 난소의 세포주, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, NIH3T3, RIN 및 MDCK 세포이다. 또한, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나, 원하는 방식으로 유전자 산물을 변형 및 가공하는 숙주 세포 균주가 선택될 수 있다. 단백질 산물의 이러한 변형 (예를 들어, 글리코실화) 및 가공 (예를 들어, 절단)은 단백질의 기능에 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질의 번역후 가공 및 변형을 위한 특징적이고 특이한 메카니즘을 갖는다. 발현된 외래 단백질의 정확한 변형 및 가공을 보장하기 위해 적절한 세포주 또는 숙주 시스템이 선택될 수 있다.

tk-, hgprt- 또는 aprt- 세포에서 각각 HSV 티미딘 키나제, 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 유전자를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다수의 선택 시스템이 사용될 수 있다. 또한, 항-대사산물 내성은 내성을 부여하는 dhfr ; 미코페놀산에 내성을 부여하는 gpt; 아미노글리코시드 G418에 내성을 부여하는 neo; 및 히그로마이신에 내성을 부여하는 hygro에 대한 선택의 기준으로서 사용될 수 있다.

E. 정제

특정 실시양태에서, 본 개시내용의 인터페론 전구약물은 정제될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "정제된"은 다른 성분으로부터 단리할 수 있는 조성물을 의미하며, 여기서 단백질은 자연적으로 수득 가능한 상태에 비해 어느 정도 정제된다. 따라서, 정제된 단백질은 또한 이것이 자연적으로 발생할 수 있는 환경이 없는 단백질을 의미한다. 용어 "실질적으로 정제된"이 사용되는 경우, 이러한 명칭은 단백질 또는 펩티드가 조성물 중 단백질의 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 또는 그 이상을 구성하는 것과 같은 조성물의 주요 성분을 형성하는 조성물을 지칭할 것이다.

단백질 정제 기술은 당업계의 숙련가들에게 잘 알려져 있다. 이러한 기술은, 하나의 수준에서, 폴리펩티드 및 비-폴리펩티드 분획으로의 세포 환경의 조악한 분별을 포함한다. 다른 단백질로부터 폴리펩티드를 단리한 후, 관심 폴리펩티드는 크로마토그래피 및 전기영동 기술을 사용하여 추가로 정제하여 부분적 또는 완전한 정제 (또는 균질화되도록 정제)를 달성할 수 있다. 순수한 펩티드의 제조에 특히 적합한 분석 방법은 이온-교환 크로마토그래피, 배제 크로마토그래피; 폴리아크릴아미드 겔 전기영동; 등전점 전기영동(isoelectric focusing)이다. 단백질 정제를 위한 또 다른 방법은 황산암모늄, PEG, 항체 등으로의 침전 또는 열 변성에 이은 원심분리; 겔 여과, 역상, 하이드록실아파타이트 및 친화성 크로마토그래피; 및 이러한 기술 및 다른 기술의 조합을 포함한다.

본 개시내용의 인터페론 전구약물을 정제하는데 있어서, 원핵 또는 진핵 발현 시스템에서 폴리펩티드를 발현시키고 변성 조건을 사용하여 단백질을 추출하는 것이 바람직할 수 있다. 폴리펩티드는 폴리펩티드의 태그된 부분에 결합하는 친화성 칼럼을 사용하여 다른 세포 성분으로부터 정제될 수 있다. 당업계에 일반적으로 알려진 바와 같이, 다양한 정제 단계를 수행하는 순서가 변경될 수 있거나, 특정 단계가 생략될 수 있으며, 실질적으로 정제된 단백질 또는 펩티드의 제조를 위한 적합한 방법이 여전히 생성되는 것으로 여겨진다. 일반적으로, 항체는 항체의 Fc 부분에 결합하는 제제 (즉, 단백질 A)를 이용하여 분별된다. 인터페론 전구약물이 이러한 도메인을 함유하는 경우, 이 접근법이 사용될 수 있다.

단백질 또는 펩티드의 정제 정도를 정량화하는 다양한 방법은 본 개시내용에 비추어 당업계의 숙련가들에게 공지될 것이다. 이들은, 예를 들면, 활성 분획의 특이 활성을 결정하거나, SDS/PAGE 분석에 의해 분획 내의 폴리펩티드의 양을 평가함을 포함한다. 분획의 순도를 평가하는 또 다른 방법은 분획의 특이 활성을 계산하고, 이를 초기 추출물의 특이 활성과 비교하고, 이에 따라 순도의 정도를 계산하는 것이다. 활성의 양을 나타내는데 사용되는 실제 단위는 물론, 정제를 수행하기 위해 선택된 특정 분석 기술 및 발현된 단백질 또는 펩티드가 검출 가능한 활성을 나타내는지 여부에 따라 좌우될 것이다.

폴리펩티드의 이동은 SDS/PAGE의 상이한 조건에 따라, 때때로 크게, 변할 수 있는 것으로 알려져 있다 (Capaldi et al., 1977). 따라서, 상이한 전기영동 조건하에서, 정제되거나 부분적으로 정제된 발현 산물의 겉보기 분자량이 변할 수 있음을 인지할 것이다.

III. 약제학적 제형 및 암의 치료

A. 암

암은 조직으로부터의 세포의 클론 집단의 결과물로부터 야기된다. 발암(carcinogenesis)이라고 하는 암의 발달은 여러 가지 방법으로 모델링되고 특성화될 수 있다. 암의 발달과 염증 사이의 연관성은 오랫동안 인식되어 왔다. 염증 반응은 미생물 감염에 대한 숙주 방어에 관여하고, 또한 조직 복구 및 재생을 유발한다. 상당한 증거들이 염증과 암 발병 위험 사이의 관련성을 가리키며, 즉, 만성 염증은 이형성증을 유발할 수 있다.

본 개시내용의 방법이 적용될 수 있는 암 세포는 일반적으로 프로테아제를 선택적으로 발현하는, 보다 특히, 정상 세포에 비해 이러한 프로테아제를 과발현하는 임의의 세포를 포함한다. 적절한 암 세포는 유방암, 폐암, 결장암, 췌장암, 신장암, 위암, 간암, 골암, 혈액암 (예를 들어, 백혈병 또는 림프종), 신경 조직 암, 흑색종, 난소암, 고환암, 전립선암, 자궁경부암, 질암, 또는 방광암 세포일 수 있다. 또한, 본 개시내용의 방법은 광범위한 종, 예를 들어 인간, 비인간 영장류 (예를 들어, 원숭이, 비비 또는 침팬지), 말, 소, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이, 토끼, 기니피그, 저지, 햄스터, 랫트, 및 마우스에 적용될 수 있다. 암은 또한 재발성, 전이성 및/또는 다약제 내성일 수 있고, 본 개시내용의 방법은 암을 절제 가능하게 하고, 완화(remission)를 연장하거나 재유도하며, 혈관신생을 억제하고, 전이를 예방 또는 제한하고/하거나 다약제 내성 암을 치료하는데 특히 적용될 수 있다. 세포 수준에서, 이것은 암 세포를 사멸시키거나, 암 세포 성장을 억제하거나, 달리 종양 세포의 악성 표현형을 역전 또는 감소시키는 것으로 번역될 수 있다.

B. 제형 및 투여

본 개시내용은 인터페론 전구약물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 용어 "약제학적으로 허용되는"은 동물, 보다 특히 인간에서 사용하기 위해 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 기타 일반적으로 인정되는 약전에 열거됨을 의미한다. 용어 "담체"는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 부형제 또는 비히클을 지칭한다. 이러한 약제학적 담체는 땅콩유, 대두유, 광유, 호마유 등과 같은 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것들을 포함하는 물 및 오일과 같은 멸균 액체일 수 있다. 다른 적합한 약제학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 염수, 덱스트로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다.

조성물은 중성 또는 염 형태로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유도된 것들과 같은 음이온으로 형성된 것들 및 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화 제2철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유도된 것들과 같은 양이온으로 형성된 것들을 포함한다.

본 개시내용의 항체는 고전적인 약제학적 제제를 포함할 수 있다. 본 개시내용에 따르는 이러한 조성물의 투여는 표적 조직이 그 경로를 통해 이용 가능한 한 임의의 통상의 경로를 통해 이루어질 것이다. 이것은 구강, 비강, 협측, 직장, 질 또는 국소를 포함한다. 대안적으로, 투여는 피내, 피하, 근육내, 복강내 또는 정맥내 주사에 의해 이루어질 수 있다. 이러한 조성물은 통상적으로 상기 기술된 약제학적으로 허용되는 조성물로서 투여될 것이다. 특히 관심이 있는 것은 직접 종양내 투여, 종양의 관류, 또는 종양에 국소 또는 국부 투여, 예를 들면, 국소 또는 국부 혈관구조 또는 림프계 또는 절제된 종양 층에서의 투여이다.

활성 화합물은 또한 비경구 또는 복강내 투여될 수 있다. 유리 염기 또는 약리학적으로 허용되는 염으로서의 활성 화합물의 용액은 하이드록시프로필셀룰로스와 같은 계면활성제와 적절히 혼합된 물에서 제조될 수 있다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물에서 및 오일에서 제조될 수 있다. 일반적인 보관 및 사용 조건하에서, 이러한 제제는 미생물의 성장을 막기 위해 보존제를 함유한다.

C. 병용 요법

본 개시내용의 맥락에서, 본원에 기술된 인터페론 전구약물이 면역치료, 화학치료 또는 방사선치료 개입, 또는 다른 치료와 함께 유사하게 사용될 수 있는 것으로 또한 고려된다. 특히 인터페론 전구약물을 암 세포 기능의 상이한 측면들을 표적으로 하는 다른 치료법과 조합하는 것이 또한 효과적인 것으로 판명될 수 있다.

본 개시내용의 방법 및 조성물을 사용하여 세포를 사멸시키거나, 세포 성장을 억제하거나, 전이를 억제하거나, 혈관형성을 억제하거나 달리 종양 세포의 악성 표현형을 역전 또는 감소시키기 위해, 일반적으로 "표적" 세포를 본 개시내용에 따르는 인터페론 전구약물 및 적어도 하나의 다른 제제와 접촉시킨다. 이들 조성물은 세포의 증식을 사멸시키거나 억제하는데 효과적인 조합된 양으로 제공될 것이다. 이 공정은 세포를 본 개시내용에 따르는 인터페론 전구약물 및 다른 제제(들) 또는 인자(들)와 동시에 접촉시킴을 포함할 수 있다. 이것은 세포를 단일 조성물 또는 제제 둘 다를 포함하는 약리학적 제형과 접촉시키거나, 세포를 두 개의 별개의 조성물 또는 제형과 동시에 접촉시킴으로써 달성될 수 있으며, 여기서 하나의 조성물은 본 개시내용에 따르는 인터페론 전구약물을 포함하고 다른 조성물은 다른 제제를 포함한다.

대안적으로, 인터페론 전구약물 요법은 수 분 내지 수 주 범위의 간격으로 다른 제제 치료법에 앞서거나 뒤따를 수 있다. 다른 제제 및 인터페론 전구약물이 세포에 별도로 적용되는 실시양태에서, 일반적으로 제제 둘 다가 여전히 세포에 대해 유리하게 조합된 효과를 발휘할 수 있도록 각 전달 사이에 상당한 시간이 만료되지 않도록 보장해야 한다. 이러한 경우에, 세포를 서로 약 12-24시간 내에, 보다 바람직하게는 서로 약 6-12시간 내에 두 가지 양식(modality) 모두와 접촉시키는 것이 고려되며, 단지 약 12시간의 지연 시간이 가장 바람직하다. 그러나, 몇몇 상황에서, 각각의 투여 사이에 수 일 (2, 3, 4, 5, 6 또는 7일) 내지 수 주 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주)가 경과하는 경우 치료 기간을 상당히 연장시키는 것이 바람직할 수 있다.

인터페론 전구약물 또는 다른 제제의 한 번 이상의 투여가 바람직할 것으로 또한 생각된다. 아래에 예시된 바와 같이 본 개시내용에 따르는 인터페론 전구약물이 "A"이고 다른 요법이 "B"인 다양한 조합이 사용될 수 있다:

A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B B/A/A A/B/B B/B/B/A B/B/A/B

A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B B/B/B/A

A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/A/B

다른 조합이 고려된다. 다시, 세포 사멸을 달성하기 위해, 두 제제는 세포를 사멸시키기에 효과적인 조합된 양으로 세포에 전달된다.

암 요법에 적합한 제제 또는 인자는 세포에 적용될 때 DNA 손상을 유도하는 임의의 화합물 또는 치료 방법을 포함한다. 이러한 제제 및 인자는 조사, 마이크로파, 전자 방출 등과 같은 DNA 손상을 유도하는 방사선 및 파를 포함한다. "화학요법제" 또는 "유전독성제"로도 기술된 다양한 화합물이 사용될 수 있다. 이것은 국소화된 종양 부위를 조사함으로써 달성될 수 있으며; 대안적으로, 종양 세포는 치료학적 유효량의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여함으로써 제제와 접촉될 수 있다.

다양한 부류의 화학요법제가 본 개시내용에 사용하기 위해 고려된다. 예를 들면, 선택적 에스트로겐 수용체 길항제 ("SERM"), 예를 들어 타목시펜, 4-하이드록시 타목시펜 (Afimoxfene), 팔소덱스, 랄록시펜, 바제독시펜, 클로미펜, 페마렐, 라소폭시펜, 오르멜록시펜 및 토레미펜.

유용한 것으로 고려되는 화학요법제는 예를 들어 캄프토테신, 악티노마이신-D, 미토마이신 C를 포함한다. 본 개시내용은 또한 방사선-기반이든 실제 화합물이든 간에 하나 이상의 DNA 손상제의 조합의 사용, 예를 들어 시스플라틴과 X-선 사용 또는 에토포시드와 시스플라틴 사용을 포함한다. 제제는 병용 치료 조성물로서 제조되고 사용될 수 있다.

열 충격 단백질 90은 많은 진핵 세포에서 발견되는 조절 단백질이다. HSP90 억제제는 암 치료에 유용한 것으로 나타났다. 이러한 억제제는 겔다나마이신, 17-(알릴아미노)-17-데메톡시겔다나마이신, PU-H71 및 리파부틴을 포함한다.

DNA를 직접 가교결합시키거나 부가물을 형성하는 제제가 또한 예상된다. 시스플라틴과 같은 제제 및 다른 DNA 알킬화제가 사용될 수 있다. 시스플라틴은 암을 치료하는데 광범위하게 사용되어 왔으며, 임상 용도에서 사용되는 효과적인 용량은 총 3개의 코스에 대해 3주마다 5일 동안 20 mg/m²이다. 시스플라틴은 경구로 흡수되지 않으며 따라서 정맥내, 피하, 종양내 또는 복강내 주사를 통해 전달되어야 한다.

DNA를 손상시키는 제제는 또한 DNA 복제, 유사분열 및 염색체 분리를 방해하는 화합물을 포함한다. 이러한 화학요법 화합물은 독소루비신으로도 알려진 아드리아마이신, 에토포시드, 베라파밀, 포도필로톡신 등을 포함한다. 신생물의 치료를 위한 임상 환경에서 널리 사용되는 경우, 이들 화합물은 독소루비신의 경우 21일 간격으로 25-75 mg/m² 내지 에토포시드의 경우 35-50 mg/m² 범위의 용량으로 정맥내 농축괴 주사를 통해 투여되거나 경구로 정맥내 용량을 배가시켜 투여된다. 탁산과 같은 미세소관 억제제가 또한 고려된다. 이들 분자는 Taxus 속의 식물에 의해 생성된 디테르펜이며, 파클리탁셀 및 도세탁셀을 포함한다.

FK506-결합 단백질 12-라파마이신 관련 단백질 1 (FRAP1)로도 알려진 라파마이신의 포유동물 표적인 Iressa, mTOR와 같은 표피 성장 인자 수용체 억제제는 세포 성장, 세포 증식, 세포 운동성, 세포 생존, 단백질 합성, 및 전사를 조절하는 세린/트레오닌 단백질 키나제이다. 따라서, 라파마이신 및 이의 유사체 ("라파로그")는 본 개시내용에 따라 암 요법에서 사용하기 위해 고려된다.

다른 가능한 치료법은 TNF-α (종양 괴사 인자-알파), 전신 염증에 관여하는 사이토킨 및 급성기 반응을 자극하는 사이토킨의 그룹의 구성원이다. TNF의 주요 역할은 면역 세포의 조절에 있다. TNF는 또한 아폽토시스 세포 사멸을 유도하고, 염증을 유도하며, 종양형성 및 바이러스 복제를 억제할 수 있다.

핵산 전구체 및 서브유닛의 합성 및 충실도를 방해하는 제제가 또한 DNA 손상을 초래한다. 이와 같이 다수의 핵산 전구체가 개발되었다. 광범위한 시험을 거쳐 쉽게 이용할 수 있는 제제가 특히 유용하다. 이와 같이, 5-플루오로우라실 (5-FU)과 같은 제제는 신생물 조직에 의해 우선적으로 사용되어, 이 제제가 신생물 세포를 표적화하는데 특히 유용하게 만든다. 비록 매우 독성이기는 하지만, 5-FU가 국소를 포함하여 광범위한 담체에서 적용 가능하지만, 3 내지 15 mg/kg/일 범위의 용량으로 정맥내 투여가 일반적으로 사용된다.

DNA 손상을 유발하는 광범위하게 사용되는 또 다른 인자는 일반적으로 γ선, x선, 및/또는 종양 세포로의 방사성 동위원소의 직접 전달로 알려진 것들을 포함한다. 마이크로파 및 UV-조사와 같은 다른 형태의 DNA 손상 인자가 또한 고려된다. 이러한 모든 인자들이 DNA의 전구체, DNA의 복제 및 복구, 및 염색체의 조립 및 유지에 대해 광범위한 DNA 손상을 수행할 가능성이 크다. x선에 대한 선량 범위는 연장된 기간 (3 내지 4주) 동안 매일 50 내지 200 뢴트겐 내지 2000-6000 뢴트렌의 단일 선량에 이른다. 방사성 동위원소에 대한 투여량 범위는 광범위하게 달라지며, 동위원소의 반감기, 방출되는 방사선의 강도 및 유형, 및 신생물 세포에 의한 흡수에 따라 좌우된다.

또한, 면역 요법, 호르몬 요법, 독소 요법 및 수술이 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 특히, 아바스틴, 에르비툭스, 글리벡, 헤르셉틴 및 리툭산과 같은 표적 요법을 사용할 수 있다.

숙련가는 "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, Chapter 33, 특히 624-652페이지를 주지한다. 치료되는 대상체의 상태에 따라 투여량의 약간의 변화가 반드시 발생할 것이다. 어떠한 경우든, 투여를 담당하는 사람은 개별 대상체에 적절한 용량을 결정할 것이다. 게다가, 인간 투여의 경우, 제제는 FDA의 생물제제 표준에 의해 요구되는 바와 같은 무균성, 발열원성, 일반적인 안전성 및 순도 표준을 충족해야 한다.

IV. 프로테아제 검출 방법

여전히 추가의 실시양태에서, 표적 암 세포 또는 종양에서 프로테아제 발현의 특성 및 양을 확인함으로써 환자의 종양에 의해 활성화될 가능성이 높은 특정 인터페론 전구약물을 맞춤화하는 것이 바람직할 것이다. 일반적으로, 이러한 검출에는 세 가지 접근법이 있다 - 프로테아제-특이 항체를 사용하는 것과 같은 면역학적 검출, mRNA 검출, 및 프로테아제 활성 분석.

A. 면역검출

프로테아제를 식별하고 정량화하기 위한 면역검출 방법은 몇 가지를 들자면 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA), 방사면역검정(RIA), 면역방사계측 검정, 형광면역검정, 화학발광 검정, 생물발광 검정, 및 웨스턴 블롯을 포함할 수 있다. 다양한 유용한 면역검출 방법의 단계들이 과학 문헌, 예를 들어, 문헌[Doolittle and Ben-Zeev (1999), Gulbis and Galand (1993), De Jager et al. (1993), and Nakamura et al. (1987)]에 기술되어 있다. 일반적으로, 면역결합 방법은, 경우에 따라, 면역복합체의 형성을 가능하게 하기에 효과적인 조건하에서 본원에 논의된 실시양태에 따라 샘플을 수득하고 샘플을 제1 항체와 접촉시킴을 포함한다.

선택된 생물학적 샘플을 효과적인 조건하에서 면역 복합체(일차 면역 복합체)의 형성을 허용하기에 충분한 시간 동안 항체와 접촉시키는 것은 일반적으로 단순히 항체 조성물을 샘플에 첨가하고 혼합물을 항체가 면역 복합체를 형성하기에, 즉 존재하는 프로테아제에 결합하기에 충분할 정도로 긴 시간 동안 배양하는 것의 문제이다. 이후, 조직 섹션, ELISA 플레이트, 도트 블롯 또는 웨스턴 블롯과 같은 샘플-항체 조성물은 일반적으로 임의의 비특이적으로 결합된 항체 종을 제거하도록 세척됨으로써 일차 면역 복합체 내에 특이적으로 결합된 항체만이 검출될 수 있게 된다.

일반적으로, 면역복합체 형성의 검출은 당업계에 잘 알려져 있으며 수많은 접근법의 적용을 통해 달성될 수 있다. 이러한 방법은 일반적으로 방사성, 형광성, 생물학적 및 효소적 태그와 같은 표지 또는 마커의 검출에 기초한다. 이러한 표지의 사용에 관한 특허들은 미국 특허 제3,817,837호, 제3,850,752호, 제3,939,350호, 제3,996,345호, 제4,277,437호, 제4,275,149호 및 제4,366,241호를 포함한다. 물론, 당업계에 공지된 바와 같이 이차 결합 리간드, 예를 들어 제2 항체 및/또는 비오틴/아비딘 리간드 결합 정렬의 사용을 통해 추가의 이점을 발견할 수 있다.

검출에 사용된 항체는 자체가 검출 가능한 표지에 연결될 수 있으며,그후 이 표지를 단순히 검출함으로써 조성물 내의 일차 면역 복합체의 양을 결정할 수 있게 된다. 대안적으로, 일차 면역 복합체 내에 결합되는 제1 항체는 항체에 대해 결합 친화성을 갖는 제2 결합 리간드에 의해 검출될 수 있다. 이러한 경우에, 제2 결합 리간드는 검출 가능한 표지에 연결될 수 있다. 제2 결합 리간드는 그 자체가 종종 항체이므로, 이를 "이차" 항체라고 할 수 있다. 일차 면역 복합체는 효과적인 조건하에서 이차 면역 복합체의 형성을 허용하기에 충분한 시간 동안 표지된 제2 결합 리간드 또는 항체와 접촉된다. 그후, 이차 면역 복합체는 일반적으로 세척되어 임의의 비특이적으로 결합된 표지된 이차 항체 또는 리간드를 제거한 다음 이차 면역 복합체의 나머지 표지가 검출된다.

추가의 방법은 2단계 접근법에 의한 일차 면역 복합체의 검출을 포함한다. 항체에 대해 결합 친화성을 갖는 항체와 같은 제2 결합 리간드가 상기 기술된 바와 같이 이차 면역 복합체를 형성하는데 사용된다. 세척 후, 이차 면역 복합체는 제2 항체에 대해 결합 친화성을 갖는 제3 결합 리간드 또는 항체와 다시 효과적인 조건하에서 면역 복합체 (삼차 면역 복합체)의 형성을 허용하기에 충분한 시간 동안 접촉된다. 제3 리간드 또는 항체는 검출 가능한 표지에 연결되어, 이렇게 형성된 삼차 면역 복합체의 검출을 가능하게 한다. 이러한 시스템은 요구되는 경우 신호 증폭을 제공할 수 있다.

면역검출의 한 가지 방법은 두 개의 상이한 항체를 사용한다. 제1 비오티닐화된 항체가 표적 항원을 검출하는데 사용된 다음 제2 항체가 복합체화된 비오틴에 부착된 비오틴을 검출하는데 사용된다. 이 방법에서, 시험하고자 하는 샘플을 먼저 제1 단계 항체를 함유하는 용액에서 배양한다. 표적 항원이 존재하는 경우, 항체 중의 일부는 항원에 결합하여 비오티닐화된 항체/항원 복합체를 형성한다. 그후, 항체/항원 복합체는 스트렙타비딘 (또는 아비딘), 비오티닐화 DNA, 및/또는 상보적 비오티닐화 DNA의 연속 용액에서 배양에 의해 증폭되며, 각 단계에서는 추가의 비오틴 부위를 항체/항원 복합체에 첨가한다. 증폭 단계는 적합한 수준의 증폭이 달성될 때까지 반복되며, 이 시점에서 샘플은 비오틴에 대한 제2 단계 항체를 함유하는 용액에서 배양된다. 이러한 제2 단계 항체는, 예를 들면, 발색체 기질을 사용하여 조직효소학(histoenzymology)에 의해 항체/항원 복합체의 존재를 검출하는데 사용될 수 있는 효소로 표지된다. 적합한 증폭으로, 육안으로 보이는 접합체가 생성될 수 있다.

면역검출의 또 다른 공지된 방법은 면역-PCR (폴리머라제 연쇄 반응) 방법의 이점을 취한다. PCR 방법은 비오티닐화 DNA와 배양하는 것까지는 Cantor 방법과 유사하지만, 여러 차례의 스트렙타비딘 및 비오티닐화 DNA 배양을 사용하는 대신, DNA/비오틴/스트렙타비딘/항체 복합체를 항체를 방출하는 낮은 pH 또는 높은 염 완충액으로 세척한다. 그후, 생성된 세척 용액을 사용하여 적절한 대조군을 갖는 적합한 프라이머와 PCR 반응을 수행한다. 적어도 이론적으로, PCR의 거대한 증폭 능력 및 특이성이 단일 항원 분자를 검출하는데 이용될 수 있다.

하나의 예시적인 ELISA에서, 본 개시내용의 항체를 폴리스티렌 미세역가 플레이트에서의 웰과 같은 단백질 친화성을 나타내는 선택된 표면 상에 고정시킨다. 그후, 프로테아제를 함유하는 것으로 의심되는 시험 조성물을 웰에 첨가한다. 결합 및 비특이적으로 결합된 면역 복합체를 제거하기 위한 세척 후, 결합된 항원을 검출할 수 있다. 검출은 검출 가능한 표지에 연결된 다른 항-프로테아제 항체의 첨가에 의해 달성될 수 있다. 이러한 유형의 ELISA는 단순 "샌드위치 ELISA"이다. 검출은 또한 제2 항-프로테아제 항체의 첨가에 이은 제2 항체에 대해 결합 친화성을 갖는 제3 항체의 첨가에 의해 달성될 수 있으며, 제3 항체는 검출 가능한 표지에 연결된다.

또 다른 예시적인 ELISA에서, 프로테아제를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 웰 표면에 고정시킨 다음 항-프로테아제 항체와 접촉시킨다. 결합 및 비특이적으로 결합된 면역 복합체를 제거하기 위한 세척 후, 결합된 항-프로테아제 항체를 검출한다. 초기 프로테아제 항체가 검출 가능한 표지에 연결된 경우, 면역 복합체를 직접 검출할 수 있다. 다시, 면역 복합체는 제1 항-프로테아제 항체에 대해 결합 친화성을 갖는 제2 항체를 사용하여 검출할 수 있으며, 제2 항체는 검출 가능한 표지에 연결된다.

사용된 형식에 관계없이, ELISA는 코팅, 배양 및 결합, 비특이적으로 결합된 종을 제거하기 위한 세척, 및 결합된 면역 복합체의 검출과 같은 특정한 특징을 통상적으로 갖는다. 이들은 아래에 기술되어 있다.

항원 또는 항체로 플레이트를 코팅하는데 있어서, 일반적으로 플레이트의 웰을 항원 또는 항체의 용액과 함께 밤새 또는 특정 시간 동안 배양할 것이다. 그후, 플레이트의 웰을 세척하여 불완전하게 흡착된 물질을 제거할 것이다. 이어서, 웰의 남아있는 이용 가능한 표면을 시험 항혈청과 관련하여 항원적으로 중성인 비특이 단백질로 "코팅"한다. 이들은 소 혈청 알부민 (BSA), 카제인 또는 분유 용액을 포함한다. 코팅은 고정화 표면 상의 비특이 흡착 부위의 차단을 가능하게 하고, 따라서 표면에의 항혈청의 비특이 결합에 의해 야기되는 백그라운드를 감소시킨다.

ELISA에서, 직접적인 절차보다는 이차 또는 삼차 검출 수단을 사용하는 것이 아마도 더욱 통상적일 것이다. 따라서, 단백질 또는 항체를 웰에 결합시키고, 비반응성 물질로 코팅하여 백그라운드를 감소시키고, 세척하여 결합되지 않은 물질을 제거한 후, 고정화 표면을 면역 복합체 (항원/항체) 형성을 허용하기에 효과적인 조건하에서 시험하고자 하는 생물학적 샘플과 접촉시킨다. 그후 면역 복합체의 검출은 표지된 이차 결합 리간드 또는 항체, 및 표지된 삼차 항체 또는 삼차 결합 리간드와 함께 이차 결합 리간드 또는 항체를 필요로 한다.

"면역 복합체 (항원/항체) 형성을 허용하기에 효과적인 조건하에서"는 조건이 바람직하게는 항원 및/또는 항체를 BSA, 소 감마 글로불린 (BGG) 또는 인산염 완충 염수 (PBS)/Tween과 같은 용액으로 희석시킴을 포함함을 의미한다. 이러한 첨가된 제제는 또한 비특이 백그라운드의 감소를 돕는 경향이 있다.

"적합한" 조건은 또한 배양이 효과적인 결합을 허용하기에 충분한 온도 또는 시간 동안 이루어짐을 의미한다. 배양 단계는 전형적으로 약 1 내지 2 내지 4시간 정도, 바람직하게는 25℃ 내지 27℃ 정도의 온도에서 이루어지거나, 약 4℃ 정도에서 밤새 이루어질 수 있다.

ELISA에서 모든 배양 단계 후에, 접촉된 표면은 비-복합체화된 물질을 제거하도록 세척된다. 바람직한 세척 과정은 PBS/Tween, 또는 붕산염 완충액과 같은 용액으로 세척함을 포함한다. 시험 샘플과 원래 결합된 물질 사이에 특이 면역 복합체의 형성 및 후속 세척 후, 아주 미량의 면역 복합체의 발생도 결정할 수 있다.

검출 수단을 제공하기 위해, 제2 또는 제3 항체는 검출을 가능하게 하는 관련 표지를 가질 것이다. 바람직하게는, 이것은 적절한 발색 기질과 함께 배양시 발색을 생성하는 효소일 것이다. 따라서, 예를 들면, 제1 및 제2 면역 복합체를 추가의 면역 복합체 형성의 발달에 유리한 시간 및 조건하에서 우레아제, 글루코스 옥시다제, 알칼리성 포스파타제 또는 하이드로겐 퍼옥시다제-접합 항체와 접촉 또는 배양하고자 할 것이다 (예를 들어, PBS-Tween과 같은 PBS-함유 용액 중에 실온에서 2시간 동안 배양).

표지된 항체와 함께 배양한 후, 및 결합되지 않은 물질을 제거하기 위한 세척에 이어, 표지의 양을, 예를 들어, 요소, 또는 브로모크레졸 퍼플과 같은 발색 기질, 또는 효소 표지로서의 퍼옥시다제의 경우 2,2'-아지노-디-(3-에틸-벤즈티아졸린-6-설폰산 (ABTS) 또는 H₂O₂와의 배양에 의해 정량한다. 그후, 정량은, 예를 들어, 가시 스펙트럼 분광광도계를 사용하여 생성된 색의 정도를 측정함으로써 달성된다.

B. mRNA 검출

mRNA 검출은 암 세포 또는 종양에서 프로테아제 활성을 평가하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, mRNA 검출은 하나의 핵산 - 프로브 또는 프라이머 - 을 다른 핵산 (표적)에 혼성화하는 것에 의존한다.

13 내지 100개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 17 내지 100개의 뉴클레오티드 길이, 또는 일부 측면에서 최대 1-2 킬로베이스 또는 그 이상의 길이의 프로브 또는 프라이머의 사용이 안정하면서도 선택적인 이중쇄 분자(duplex molecule)의 형성을 가능하게 한다. 수득된 혼성화 분자의 안정성 및/또는 선택성을 증가시키기 위해, 20개 이상 염기의 길이인 연속 분지를 능가하는 상보적인 서열을 갖는 분자가 일반적으로 바람직하다. 20 내지 30개 뉴클레오티드, 또는 경우에 따라 더 긴 하나 이상의 상보적 서열을 갖는 혼성화를 위한 핵산 분자를 설계하는 것을 일반적으로 선호할 것이다. 이러한 단편은, 예를 들면, 화학적 수단에 의해 단편을 직접 합성함으로써 또는 선택된 서열을 재조합체 생산을 위해 재조합 벡터에 도입함으로써 용이하게 제조될 수 있다.

따라서, 뉴클레오티드 서열은 상보적 분지 mRNA와 이중쇄 분자를 선택적으로 형성하거나 샘플로부터 mRNA의 증폭을 위한 프라이머를 제공하는 이들의 능력을 위해 사용될 수 있다. 구상된 적용에 따라, 표적 서열에 대한 프로브 또는 프라이머의 다양한 선택도를 달성하기 위해 다양한 혼성화 조건을 사용하고자 할 것이다.

높은 선택도를 요구하는 적용의 경우, 전형적으로 혼성물을 형성하기 위해 비교적 높은 엄격도 조건을 사용하고자 할 것이다. 예를 들면, 약 50℃ 내지 약 70℃의 온도에서 약 0.02 M 내지 약 0.10 M NaCl에 의해 제공되는 것과 같은 비교적 낮은 염 및/또는 높은 온도 조건. 이러한 높은 엄격도 조건은 프로브 또는 프라이머와 주형 또는 표적 가닥 사이의 미스매치를, 있다 하더라도, 거의 허용하지 않으며, 특정 유전자를 단리하거나 특정 mRNA 전사체를 검출하는데 특히 적합할 것이다. 증가하는 양의 포름아미드의 첨가에 의해 조건이 보다 엄격해질 수 있는 것으로 일반적으로 인지된다.

특정 적용을 위해, 보다 낮은 엄격도 조건이 바람직한 것으로 인지된다. 이러한 조건하에서는, 혼성화 가닥의 서열이 완벽하게 상보적이지 않더라도 혼성화가 일어날 수 있지만, 하나 이상의 위치에서 불일치한다. 염 농도를 증가시키고/시키거나 온도를 낮춤으로써 조건이 덜 엄격해질 수 있다. 예를 들면, 중간 엄격도 조건은 약 37℃ 내지 약 55℃의 온도에서 약 0.1 내지 0.25 M NaCl에 의해 제공될 수 있는 반면, 낮은 엄격도 조건은 약 20℃ 내지 약 55℃ 범위의 온도에서 약 0.15 M 내지 약 0.9 M 염에 의해 제공될 수 있다. 혼성화 조건은 원하는 결과에 따라 쉽게 조작할 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 혼성화는, 예를 들면, 대략 20℃ 내지 약 37℃의 온도에서 50　mM Tris-HCl (pH 8.3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 1.0 mM 디티오트레이톨의 조건하에서 달성될 수 있다. 사용되는 또 다른 혼성화 조건은 대략 40℃ 내지 약 72℃ 범위의 온도에서 대략 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂를 포함할 수 있다.

특정 실시양태에서, 혼성화를 결정하기 위해 표지와 같은 적절한 수단과 함께 본 발명의 정의된 서열의 핵산을 사용하는 것이 유리할 것이다. 검출될 수 있는 형광성, 방사성, 효소적 또는 다른 리간드, 예를 들어 아비딘/비오틴을 포함하는 광범위하게 다양한 적절한 지시기(indicator) 수단이 당업계에 공지되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 방사성 또는 다른 환경적으로 바람직하지 않은 시약 대신에 형광 표지 또는 효소 태그, 예를 들어 우레아제, 알칼리성 포스파타제 또는 퍼옥시다제를 사용하고자 할 것이다. 효소 태그의 경우에, 상보적 핵산 함유 샘플과의 특이적 혼성화를 확인하기 위해 가시적으로 또는 분광광도적으로 검출 가능한 검출 수단을 제공하기 위해 사용될 수 있는 비색 지시기 기질이 공지되어 있다.

일반적으로, 본원에 기술된 프로브 또는 프라이머는 상응하는 유전자의 발현을 검출하기 위해 PCR™에서 뿐만 아니라 고체상을 사용하는 실시양태에서와 같이 용액 혼성화(solution hybridization)에서 시약으로서 유용할 것으로 예상된다. 고체상을 포함하는 실시양태에서, 시험 mRNA는 선택된 매트릭스 또는 표면에 흡착되거나 달리 부착된다. 그후, 이러한 고정된 단일-가닥 핵산은 원하는 조건하에서 선택된 프로브와 혼성화에 적용된다. 선택된 조건은 특정 상황 (예를 들면, G+C 함량, 표적 핵산의 유형, 핵산의 공급원, 혼성화 프로브의 크기 등에 따라)에 따라 좌우될 것이다. 관심있는 특정 적용을 위한 혼성화 조건의 최적화는 당업계의 숙련가들에게 잘 알려져 있다. 비특이적으로 결합된 프로브 분자를 제거하기 위해 혼성화된 분자를 세척한 후, 결합된 표지의 양을 결정함으로써 혼성화를 검출 및/또는 정량화한다. 대표적인 고체상 혼성화 방법이 미국 특허 제5,843,663호, 제5,900,481호 및 제5,919,626호에 개시되어 있다. 본 발명의 실시에 사용될 수 있는 또 다른 혼성화 방법은 미국 특허 제5,849,481호, 제5,849,486호 및 제5,851,772호와 미국 특허 공개 제2008/0009439호에 개시되어 있다. 본 명세서의 이 섹션에서 확인된 이들 및 기타 참조문헌의 관련 부분은 본원에 참고로 포함된다.

표적 핵산은 표준 방법론에 따라 세포, 조직 또는 다른 샘플로부터 단리될 수 있다 (Sambrook et al., 2001). 특정 실시양태에서, 주형 핵산의 실질적인 정제없이 전체 세포 또는 조직 균질물 또는 생물학적 유체 샘플에 대해 분석을 수행한다. 또 다른 경우에, 정제 및/또는 증폭이 필요할 수 있다.

증폭은 전형적으로 선택적 혼성화를 허용하는 조건하에서 표적에 상응하는 핵산에 선택적으로 혼성화하도록 설계된 프라이머 쌍을 포함한다. 원하는 적용에 따라, 프라이머에 완전히 상보적인 서열에만 혼성화할 수 있는 높은 엄격도 혼성화 조건이 선택될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 혼성화는 프라이머 서열과의 하나 이상의 미스매치를 함유하는 핵산의 증폭을 허용하기 위해 감소된 엄격도하에서 일어날 수 있다. 일단 혼성화되면, 주형-프라이머 복합체는 주형-의존적 핵산 합성을 용이하게 하는 하나 이상의 효소와 접촉된다. "사이클(cycle)"이라고도 하는 여러 차례의 증폭이 충분한 양의 증폭 산물이 생성될 때까지 수행된다.

증폭 산물은 검출되거나 정량될 수 있다. 특정 적용에서, 검출은 시각적 수단에 의해 수행될 수 있다. 대안적으로, 검출은 화학발광, 통합된 방사선표지 또는 형광 표지의 방사성 섬광조영술(radioactive scintigraphy)을 통한 또는 심지어 전기적 및/또는 열적 임펄스 신호를 사용하는 시스템을 통한 생성물의 간접 동정을 포함할 수 있다 (Bellus, 1994).

주어진 주형 샘플에 존재하는 올리고뉴클레오티드 서열을 증폭시키기 위해 다수의 주형 의존적 공정이 이용 가능하다. 가장 잘 알려진 증폭 방법 중 하나는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR™이라고 함)이며, 이것은 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에, 및 문헌[Innis et al., 1988]에 상세하게 기술되어 있으며, 이들 각각은 전문이 본원에 참고로 포함된다.

역전사 효소 PCR™ 증폭 절차를 사용하여 증폭된 mRNA의 양을 정량할 수 있다. RNA를 cDNA로 역전사시키는 방법은 잘 알려져 있다 (참조; Sambrook et al., 2001). 역전사를 위한 대안적인 방법은 열안정성 DNA 폴리머라제를 사용한다. 이러한 방법은 제WO 90/07641호에 기술되어 있다. 폴리머라제 연쇄 반응 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. RT-PCR의 대표적인 방법은 미국 특허 제5,882,864호에 기술되어 있다.

cDNA로의 RNA의 역전사 (RT)에 이은 정량적 PCR (RT-PCR)을 사용하여 세포로부터 단리된 특정 mRNA 종의 상대 농도를 결정할 수 있다. 특정 mRNA 종의 농도가 변하는 것을 밝혀냄으로써, 특정 mRNA 종을 암호화하는 유전자가 차별적으로 발현되는 것으로 나타났다. 사이클 번호가 X 축에 있고 증폭된 표적 DNA의 농도 로그가 Y 축에 있는 그래프를 플롯팅하면, 플롯팅된 점들을 연결함으로써 특징적인 형상의 곡선이 형성된다. 첫 번째 사이클로 시작하여, 선의 기울기는 양성이며 일정하다. 이것을 곡선의 선형 부분이라고 한다. 시약이 제한된 후, 선의 기울기가 감소하기 시작하여 결국 0이 된다. 이 시점에서 증폭된 표적 DNA의 농도는 일부 고정된 값에 점근적으로 된다. 이것을 곡선의 안정부(plateau portion)라고 한다.

PCR 증폭의 선형 부분에서의 표적 DNA의 농도는 반응이 시작되기 전 표적의 출발 농도에 정비례한다. 동일한 수의 사이클을 완료하고 선형 범위에 있는 PCR 반응에서의 표적 DNA의 증폭 산물의 농도를 결정함으로써, 원래의 DNA 혼합물에서의 특정 표적 서열의 상대 농도를 결정할 수 있다. DNA 혼합물이 상이한 조직 또는 세포로부터 단리된 RNA로부터 합성된 cDNA인 경우, 표적 서열이 유래되는 특정 mRNA의 상대 존재비가 각각의 조직 또는 세포에 대해 결정될 수 있다. PCR 산물의 농도와 mRNA 상대 존재비 사이의 이러한 정비례는 PCR 반응의 선형 범위에서만 그러하다.

곡선의 안정부에서의 표적 DNA의 최종 농도는 반응 혼합물 중의 시약의 이용 가능성에 의해 결정되며 표적 DNA의 원래 농도와 무관하다. 따라서, RNA 집단의 수집을 위해 RT-PCR에 의해 mRNA 종의 상대 존재비가 결정될 수 있기 전에 충족되어야 하는 첫 번째 조건은 PCR 반응이 이들의 곡선의 선형 부분에 있을 때 증폭된 PCR 산물의 농도를 샘플링해야 한다는 것이다.

RT-PCR 실험을 위한 두 번째 조건은 특정 mRNA 종의 상대 존재비를 결정하는 것이다. 전형적으로, 증폭 가능한 cDNA의 상대 농도는 일부 독립적인 표준으로 정규화된다. RT-PCR 실험의 목표는 샘플에서의 모든 mRNA 종의 평균 존재비에 대한 특정 mRNA 종의 존재비를 결정하는 것이다.

경쟁적 PCR을 위한 대부분의 프로토콜은 대략 표적만큼 풍부한 내부 PCR 표준을 사용한다. 이러한 전략은 PCR 증폭의 산물이 이들의 선형기(linear phase) 동안 샘플링되는 경우 효과적이다. 반응이 안정기에 다다를 때 생성물이 샘플링되면, 덜 풍부한 생성물이 상대적으로 과잉 표현된다. 차등 발현을 위해 RNA 샘플을 검사하는 경우와 같이, 다수의 상이한 RNA 샘플에 대해 이루어진 상대 존재비의 비교는 RNA의 상대 존재비의 차이가 이들이 실제 그러한 것보다 덜 보이게 하는 방식으로 왜곡된다. 이것은 내부 표준이 표적보다 훨씬 풍부한 경우에는 큰 문제가 되지 않는다. 내부 표준이 표적보다 더 풍부한 경우, RNA 샘플간에 직접적인 선형 비교가 이루어질 수 있다.

RT-PCR은 내부 표준이 표적 cDNA 단편보다 큰 증폭 가능한 cDNA 단편이고 내부 표준을 암호화하는 mRNA의 존재비가 표적을 암호화하는 mRNA보다 대략 5-100배 더 높은 내부 표준을 사용한 상대 정량적 RT-PCR로서 수행될 수 있다. 이러한 검정은 각각의 mRNA 종의 절대 존재비가 아닌 상대 존재비를 측정한다.

증폭을 위한 또 다른 방법은 전문이 본원에 참고로 인용된 유럽 출원 제320 308호에 개시된 리가제 연쇄 반응 ("LCR")이다. 미국 특허 제4,883,750호는 프로브 쌍을 표적 서열에 결합시키기 위한 LCR과 유사한 방법을 기술한다. 미국 특허 제5,912,148호에 개시된 PCR™ 및 올리고뉴클레오티드 리가제 검정 (OLA)에 기초한 방법이 또한 사용될 수 있다.

본 발명의 실시에 사용될 수 있는 표적 핵산 서열의 증폭을 위한 대안적인 방법이 미국 특허 제5,843,650호, 제5,846,709호, 제5,846,783호, 제5,849,546호, 제5,849,497호, 제5,849,547호, 제5,858,652호, 제5,866,366호, 제5,916,776호, 제5,922,574호, 제5,928,905호, 제5,928,906호, 제5,932,451호, 제5,935,825호, 제5,939,291호 및 제5,942,391호, 영국 출원 제2 202 328호, 및 PCT 출원 제PCT/US89/01025호에 개시되어 있으며, 이들 각각은 전문이 본원에 참고로 포함된다.

PCT 출원 제PCT/US87/00880호에 기술된 Qbeta 레플리카제가 또한 본 발명에서 증폭 방법으로서 사용될 수 있다. 이 방법에서, 표적과 상보적인 영역을 갖는 RNA의 복제 서열이 RNA 폴리머라제의 존재하에서 샘플에 첨가된다. 폴리머라제는 복제 서열을 카피할 것이며, 이것이 그후 검출될 수 있다.

제한 엔도뉴클레아제 및 리가제가 제한 부위의 한 가닥에 뉴클레오티드 5'-[알파-티오]-트리포스페이트를 함유하는 표적 분자의 증폭을 달성하기 위해 사용하는 등온 증폭 방법이 또한 본 발명에서 핵산의 증폭에 유용할 수 있다 (Walker et al., 1992). 미국 특허 제5,916,779호에 개시된 가닥 변위 증폭 (SDA)은 여러 차례의 가닥 변위 및 합성, 즉 닉 (nick) 번역을 포함하는 핵산의 등온 증폭을 수행하는 또 다른 방법이다.

다른 핵산 증폭 절차는 핵산 서열 기반 증폭 (NASBA) 및 3SR을 포함하는 전사-기반 증폭 시스템 (TAS)을 포함한다 (Kwoh et al., 1989; PCT 출원 제WO 88/10315호, 전문이 본원에 참고로 포함됨). 유럽 출원 제329 822호는 본 발명에 따라 사용될 수 있는 단일-가닥 RNA ("ssRNA"), ssDNA 및 이중-가닥 DNA (dsDNA)를 주기적으로 합성함을 포함하는 핵산 증폭 과정을 개시한다.

PCT 출원 제WO 89/06700호 (전문이 본원에 참고로 포함됨)는 표적 단일-가닥 DNA ("ssDNA")에의 프로모터 영역/프라이머 서열의 혼성화에 이은 서열의 많은 RNA 카피의 전사에 기초한 핵산 서열 증폭 계획을 개시한다. 이러한 계획은 주기적이 아니며, 즉, 생성된 RNA 전사체로부터 새로운 주형이 생산되지 않는다. 또 다른 증폭 방법은 "RACE" 및 "편측 PCR"을 포함한다 (Frohman, 1990; Ohara et al., 1989).

임의의 증폭 후, 증폭 산물을 주형 및/또는 과량의 프라이머로부터 분리하는 것이 바람직할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 증폭 산물은 표준 방법을 사용하여 아가로스, 아가로스-아크릴아미드 또는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분리된다 (Sambrook et al., 2001). 분리된 증폭 산물은 추가 조작을 위해 겔로부터 절단되어 용출될 수 있다. 저 융점 아가로스 겔을 사용하여, 겔을 가열한 다음 핵산을 추출함으로써 분리된 밴드를 제거할 수 있다.

핵산의 분리는 또한 당업계에 공지된 크로마토그래피 기술에 의해 수행될 수 있다. 흡착, 분배, 이온-교환, 하이드록실아파타이트, 분자체, 역상, 칼럼, 종이, 박층, 및 기체 크로마토그래피 뿐만 아니라 HPLC를 포함하여 본 발명의 실시에 사용될 수 있는 많은 종류의 크로마토그래피가 있다.

특정 실시양태에서, 증폭 산물은 시각화된다. 전형적인 시각화 방법은 에티듐 브로마이드로 겔을 염색하고 UV 광 하에서 밴드를 시각화함을 포함한다. 대안적으로, 증폭 산물이 방사성- 또는 형광-표지된 뉴클레오티드로 통합적으로 표지된 경우, 분리된 증폭 산물은 x-선 필름에 노출되거나 적절한 여기성 스펙트럼 하에서 시각화될 수 있다.

하나의 실시양태에서, 증폭 산물의 분리 후, 표지된 핵산 프로브는 증폭된 마커 서열과 접촉하게 된다. 프로브는 바람직하게는 발색단에 접합되지만 방사성표지화될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 프로브는 항체 또는 비오틴과 같은 결합 파트너, 또는 검출 가능한 모이어티를 보유하는 또 다른 결합 파트너에 접합된다.

특정 실시양태에서, 검출은 표지된 프로브를 이용한 서던 블롯팅(Southern blotting) 및 혼성화에 의해 이루어진다. 서던 블롯팅에 관련된 기술은 당업계의 숙련가들에게 잘 알려져 있다 (참조; Sambrook et al., 2001). 전술한 것의 한 예는 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제5,279,721호에 기술되어 있으며, 이것은 핵산의 자동 전기영동 및 전달을 위한 장치 및 방법을 개시하고 있다. 상기 장치는 겔의 외부 조작 없이도 전기영동 및 블로팅을 가능하게 하며 본 발명에 따르는 방법을 수행하는데 이상적으로 적합하다.

당업계에 공지된 다양한 핵산 검출 방법이 미국 특허 제5,840,873호, 제5,843,640호, 제5,843,651호, 제5,846,708호, 제5,846,717호, 제5,846,726호, 제5,846,729호, 제5,849,487호, 제5,853,990호, 제5,853,992호, 제5,853,993호, 제5,856,092호, 제5,861,244호, 제5,863,732호, 제5,863,753호, 제5,866,331호, 제5,905,024호, 제5,910,407호, 제5,912,124호, 제5,912,145호, 제5,919,630호, 제5,925,517호, 제5,928,862호, 제5,928,869호, 제5,929,227호, 제5,932,413호 및 제5,935,791호에 개시되어 있으며, 이들 각각은 본원에 참고로 포함된다.

프로테아제 mRNA 검출은 어레이 또는 어레이로부터 생성된 데이터의 사용을 포함할 수 있다. 어레이는 일반적으로 다수의 mRNA 분자 또는 cDNA 분자와 완전히 또는 거의 상보적이거나 동일하고 공간적으로 분리된 조직에서 지지 물질 상에 위치하는 핵산 분자 (프로브)의 정렬된 마크로어레이 또는 마이크로어레이를 지칭한다. 마크로어레이는 전형적으로 프로브가 스폿팅된 니트로셀룰로스 또는 나일론의 시트이다. 마이크로어레이는 최대 10,000개의 핵산 분자가 전형적으로 1 내지 4 제곱 센티미터의 영역에 끼워질 수 있도록 핵산 프로브를 보다 조밀하게 위치시킨다. 마이크로어레이는 핵산 분자, 예를 들어 유전자, 올리고뉴클레오타이드 등을 기질 상에 스폿팅하거나 기질 상에 원위치에서 (in situ) 올리고뉴클레오타이드 서열을 제조함으로써 제조될 수 있다. 스폿팅되거나 제조된 핵산 분자는 제곱 센티미터 당 최대 약 30개 또는 그 이상, 예를 들어 제곱 센티미터 당 최대 약 100개 또는 심지어 1000개의 동일하지 않은 핵산 분자의 고밀도 매트릭스 패턴으로 적용될 수 있다. 마이크로어레이는 전형적으로 필터 어레이의 니트로셀룰로스-기반 물질과는 달리 코팅된 유리를 고체 지지체로서 사용한다. 상보적인 핵산 샘플의 정렬된 어레이를 가짐으로써, 각 샘플의 위치를 추적하고 원래 샘플에 연결할 수 있다. 다수의 별개의 핵산 프로브가 고체 지지체의 표면과 안정적으로 결합되는 각종 상이한 어레이 장치가 당업계의 숙련가들에게 공지되어 있다. 어레이에 유용한 기판은 나일론, 유리 및 실리콘을 포함한다. 이러한 어레이는 평균 프로브 길이, 프로브의 서열 또는 유형, 프로브와 어레이 표면 사이의 결합 특성, 예를 들어 공유 또는 비공유 등을 포함하여 여러 상이한 방식으로 변할 수 있다. 본 발명의 표지화 및 스크리닝 방법 및 어레이는 프로브가 발현 수준을 검출하는 것을 제외하고는 임의의 파라미터와 관련하여 그 유용성이 제한되지 않으며; 결과적으로, 방법 및 조성물은 각종 상이한 유형의 유전자에 사용될 수 있다.

마이크로어레이를 제조하기 위한 대표적인 방법 및 장치는, 예를 들면, 미국 특허 제5,143,854호; 제5,202,231호; 제5,242,974호; 제5,288,644호; 제5,324,633호; 제5,384,261호; 제5,405,783호; 제5,412,087호; 제5,424,186호; 제5,429,807호; 제5,432,049호; 제5,436,327호; 제5,445,934호; 제5,468,613호; 제5,470,710호; 제5,472,672호; 제5,492,806호; 제5,503,980호; 제5,510,270호; 제5,525,464호; 제5,527,681호; 제5,529,756호; 제5,532,128호; 제5,545,531호; 제5,547,839호; 제5,554,501호; 제5,556,752호; 제5,561,071호; 제5,571,639호; 제5,580,726호; 제5,580,732호; 제5,593,839호; 제5,599,695호; 제5,599,672호; 제5,610;287호; 제5,624,711호; 제5,631,134호; 제5,639,603호; 제5,654,413호; 제5,658,734호; 제5,661,028호; 제5,665,547호; 제5,667,972호; 제5,695,940호; 제5,700,637호; 제5,744,305호; 제5,800,992호; 제5,807,522호; 제5,830,645호; 제5,837,196호; 제5,871,928호; 제5,847,219호; 제5,876,932호; 제5,919,626호; 제6,004,755호; 제6,087,102호; 제6,368,799호; 제6,383,749호; 제6,617,112호; 제6,638,717호; 제6,720,138호, 뿐만 아니라 제WO 93/17126호; 제WO 95/11995호; 제WO 95/21265호; 제WO 95/21944호; 제WO 95/35505호; 제WO 96/31622호; 제WO 97/10365호; 제WO 97/27317호; 제WO 99/35505호; 제WO 09923256호; 제WO 09936760호; 제WO0138580호; 제WO 0168255호; 제WO 03020898호; 제WO 03040410호; 제WO 03053586호; 제WO 03087297호; 제WO 03091426호; 제WO03100012호; 제WO 04020085호; 제WO 04027093호; 제EP 373 203호; 제EP 785 280호; 제EP 799 897호 및 제UK 8 803 000호에 기술되어 있으며; 이의 개시내용은 모두 본원에 참고로 포함된다.

어레이는 100개 이상의 상이한 프로브를 함유하도록 고밀도 어레이일 수 있는 것으로 고려된다. 이들은 1000, 16,000, 65,000, 250,000 또는 1,000,000개 이상의 상이한 프로브를 함유할 수 있는 것으로 고려된다. 프로브는 하나 이상의 상이한 유기체의 표적에 지시될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프로브는 일부 실시양태에서 5 내지 50개, 5 내지 45개, 10 내지 40개, 또는 15 내지 40개 뉴클레오티드 범위의 길이이다. 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 프로브는 20 내지 25개 뉴클레오티드 길이이다.

어레이에서 각각의 상이한 프로브 서열의 위치 및 서열은 일반적으로 공지되어 있다. 게다가, 다수의 상이한 프로브는 cm²당 일반적으로 약 60, 100, 600, 1000, 5,000, 10,000, 40,000, 100,000 또는 400,000개 이상의 상이한 올리고뉴클레오티드 프로브의 프로브 밀도를 갖는 고밀도 어레이를 제공하는 비교적 작은 면적을 차지할 수 있다. 어레이의 표면적은 약 1, 1.6, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 cm² 이하일 수 있다.

또한, 당업계의 통상의 숙련가는 어레이를 사용하여 생성된 데이터를 용이하게 분석할 수 있다. 이러한 프로토콜은 상기 개시되어 있으며, 제WO 9743450호; 제WO 03023058호; 제WO 03022421호; 제WO 03029485호; 제WO 03067217호; 제WO 03066906호; 제WO 03076928호; 제WO 03093810호; 제WO 03100448A1호에서 찾아볼 수 있는 정보를 포함하며, 이들 모두는 구체적으로 참고로 포함된다.

V. 실시예

하기 실시예는 바람직한 실시양태를 입증하기 위해 포함된다. 하기 실시예에 개시된 기술은 실시양태의 실시에서 잘 기능하기 위해 본 발명자들에 의해 발견된 기술을 나타내고, 따라서 이의 바람직한 실시 방식을 구성하는 것으로 간주될 수 있는 것으로 당업계의 숙련가들에 의해 인지되어야 한다. 그러나, 당업계의 숙련가들은, 본 개시내용에 비추어, 개시된 특정 실시양태에서 많은 변화가 이루어질 수 있으며 본 개시내용의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 여전히 같거나 유사한 결과를 수득할 수 있음을 인지해야 한다.

실시예 1

인터페론 알파 및 베타 수용체 ( IFNAR )에 기반하는 IFN - 전구약물. 본 발명자들은 인간 면역글로불린 G1 (IgG1)의 구조에 기초하여 IFN-전구약물을 조작하였다 (도 1). 차단 시약은 천연 IFNAR1 또는 IFNAR2의 세포외 도메인 (ECD)이고, 절단 가능한 기질 링커에 의해 인터페론 알파의 N-말단에 연결된다. 이러한 형태에서, IFNAR은 세포 표면 IFNAR1/IFNAR2 이종이량체에 대한 결합을 차단한다. 안정성 및 반감기를 증가시키기 위해, 본 발명자들은 IgG1 Fc 도메인을 인터페론 알파의 C-말단에 융합시켰다 (도 1).

IFNAR1 또는 IFNAR2의 ECD가 인터페론 알파 활성을 차단할 수 있는지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 IFNa4-Fc, R1-IFNa4-Fc 및 R2-IFNa4-Fc를 정제하였다. R1-IFNa4-Fc 또는 R2-IFNa4-Fc의 링커는 삼중 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser 펩티드의 15-아미노산이며, 이것은 도메인 간의 상호작용을 가능하게 하는 가요성 링커이다²³. 이들은 5개의 IFN-자극된 반응 요소와 함께 ISG54 최소 프로모터의 제어하에 Lucia 루시페라제 유전자를 발현하는 RAW-Lucia ISG 세포를 사용하였다. RAW-Lucia ISG 세포는 뮤린 IFN-α 및 IFN-β에 반응성이다. hIg, IFNa4-Fc, R1-IFNa4-Fc, 및 R2-IFNa4-Fc를 루시퍼라제 리포터 분석을 위해 20nM로부터 5배로 연속-희석하였다. R1-IFNa4-Fc 및 R2-IFNa4-Fc는 둘 다 IFNa4-Fc에 비해 적어도 125배까지 IFN 활성의 현저한 감소를 보인다 (도 2a).

활성화된 IFN-전구약물의 활성이 IFNa4-Fc의 활성에 필적하는지 결정하기 위해, 본 발명자들은 R1-NSUB, R1-SUB, R2-NSUB 및 R2-SUB를 정제하였다. R1-SUB 또는 R2-SUB의 링커는 6-잔기 프로테아제-절단 가능한 기질 (PVGLIG)을 갖는 16-아미노산 펩티드이며²⁴, 이것은 양쪽에 가요성 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser 펩티드가 측면에 있는 MMP-2 또는 MMP-9에 의해 절단될 수 있다. 프로테아제-절단 가능한 기질이 없는 R1-NSUB 및 R2-NSUB를 대조 작제물로서 사용하였다. R1-NSUB, R1-SUB, R2-NSUB 또는 R2-SUB를 활성화를 위해 37℃에서 6시간 동안 rmMMP-9와 배양하였다. 활성화된 R1-SUB는 IFNa4-Fc에 비해 25배까지 증가된 IFN 활성을 보이는 반면, R1-NSUB의 활성은 효소 접종 후 변하지 않았다 (도 2b). R2-NSUB 및 R2-SUB에서도 유사한 결과가 관찰된 반면, 활성화된 R2-SUB는 IFNa4-Fc에 비해 25배 이상 훨씬 더 증가된 IFN 활성을 보였다 (도 2c).

따라서, 프로테아제-활성화된 IFN-전구약물의 생물학적 활성은 모체 IFNa4-Fc와 동등하게 복원될 것으로 예상되기 보다는 IFNA1-기반 또는 IFNAR2-기반 형태 둘 다에서 증가되었다. 게다가, IFN-전구약물은 프로테아제 절단 전에 이의 생물학적 활성이 현저히 감소한 것으로 보였으며, 이것은 IFN-전구약물은 절단될 때까지 생체내에서 안전하게 유지되며, 그후 국소 종양 미세환경에서 치료 활성이 증가할 것임을 시사한다.

IFNAR1 -기반 및 IFNAR2 -기반 IFN - 전구약물은 생체내에서 다양한 항종양 효과를 보인다. 다음으로, 본 발명자들은 마우스에서 B16 흑색종 모델을 사용하여 IFN-전구약물의 국소 활성화가 생체내 항종양 효능으로 전환되는지 여부를 조사하였다. 마우스 종양 모델에서 효소 발현을 스크리닝하지 않고서, 이들은 초기에 MMP-2 및 MMP-9의 절단 가능한 기질을 갖는 IFN-전구약물로 시작하였다. 확립된 B16 흑색종 종양을 갖는 마우스를 R1-SUB, R2-SUB, IFNa4-Fc, 또는 hIg 대조물로 처리하였다. 1 nmol의 투여 (3일마다 3회 주사)에서, R1-SUB, R2-SUB, 및 IFNa4-Fc는 이 모델에서 종양 성장을 억제하는데 다양한 효능을 입증하였다. 처리한지 10일 후의 시점에서, R1-SUB는 hIg-처리된 대조군에 비해 종양 성장을 24%까지, R2-SUB는 57%까지, 및 IFNa4-Fc는 72%까지 억제하였다 (도 3).

따라서, IFNAR2-기반 IFN-전구약물은 생체내 IFNAR1-기반 IFN-전구약물보다 더 우수한 항종양 효과를 나타내어, 본 발명자들은 다음 연구에서 R2-SUB에 초점을 맞췄다. 그러나, MMP-2 및 MMP-9의 절단 가능한 기질을 지니는 R2-SUB는 IFNa4-Fc에 비해 종양 성장을 억제하는 효능이 손상되었다. 본 발명자들은 IFN-전구약물의 개선된 효능이 마우스 종양 모델에서 적절한 절단 가능한 기질 링커를 선택함으로써 달성될 것이라고 가설을 세웠다.

IFNAR2 -기반 IFN - 전구약물은 개선된 효능 및 감소된 부작용을 갖는다. 보다 유리한 절단 가능한 기질 링커를 선택하기 위해, 본 발명자들은 마우스 종양 모델에서 다양한 인간 암에서 상향조절되는 것으로 알려진 가장 많이 연구된 프로테아제를 스크리닝하였다. 이러한 기질 선택 과정은 IFN-전구약물의 전신적 (비특이적) 활성화에 대한 가능성을 감소시키기 위해 정상적인 건강한 조직에서 발현된 프로테아제에 대한 대항-선택(counter-selection)을 포함하였다. 확립된 B16 흑색종 종양 또는 MC38 결장 종양을 갖는 마우스를 희생시키고, 비장, 심장, 간, 폐 및 신장을 포함한 종양 조직 및 정상 조직을 사용하여 다음의 프로테아제 유전자의 mRNA 발현 수준을 결정하였다: uPA, MMP-2, MMP-9, 및 MMP-14. UPA는 단지 신장에서 높게 발현되었지만 두 개의 종양 조직에서는 그렇지 않았다 (도 4a). MMP-2는 MC38 종양에서는 높게 발현되었지만 B16 종양에서는 그렇지 않았다; 그러나, 이것은 심장과 폐에서 높은 백그라운드를 가졌다 (도 4b). MMP-9의 발현 수준은 모든 정상 및 종양 조직에서 매우 낮았다 (도 4c). 마지막으로, MC38 및 B16 종양 둘 다는 높은 MMP-14 발현을 갖지만, 반대로, 정상 조직에서 MMP-14 발현은 최소였다 (도 4d). 마우스 종양 모델에서의 스크리닝 데이터는 MMP-14에 민감한 절단 가능한 기질 링커가 생체내에서 강력한 IFN-전구약물을 만들 것임을 시사하였다.

본 발명자들은 또한 종양과 인접 정상 조직 간의 인간 프로테아제 발현 수준을 분석하였다. TIMER (Tumor IMmune Estimation Resource)의 DiffExp 모듈은 TCGA (The Cancer Genome Atlas)의 모든 샘플에 대한 유전자 발현 수준의 비교를 제공한다. 종양 관련 효소의 대부분을 평가한 결과, MMP-1, MMP-3, MMP-9, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13 및 MMP-14가 정상 조직에서 비교적 낮은 백그라운드를 갖는 종양의 대부분에서 유의적으로 상향조절되는 이러한 프로테아제인 것으로 밝혀졌다 (도 6a-h). 이러한 프로테아제는 최대 항종양 효과 및 정상 조직에 대한 최소 부작용을 달성하려는 인간 IFN-전구약물 설계를 위한 탁월한 후보물질이다. 흥미롭게도, 마우스 및 인간 샘플 둘 다에서 MMP-14 발현 수준의 일관된 데이터는 IFN-전구약물에서 MMP-14 기질을 사용하는 것에 대한 본 발명자들의 신뢰를 향상시킨다.

따라서, 본 발명자들은 IFNAR2 및 MMP-14 기질에 기초하여 IFN-전구약물을 조작하고 정제하였다 (SGRSENIRTA)²⁵. 이들은 생체내 잠재적인 안전성 이점 및 항종양 효능을 조사하였다. 확립된 B16-OVA 흑색종 종양을 갖는 마우스를 3일마다 3회 주사로 1 mM의 투여량으로 R2-SUB, IFNa4-Fc 또는 hIg 대조물로 처리하였다. 본 발명자들은 IFN-전구약물과 IFNa4-Fc의 상대 안전성을 비교하였다. 3차 처리한 당일에 IFNa4-Fc 그룹에서 IL-6, TNF, MCP-1 및 IFN-g를 포함한 혈청내 염증 사이토킨의 높은 수준이 관찰되었다. 대조적으로, R2-SUB로 처리된 마우스는 이러한 염증 사이토킨의 매우 낮은 수준을 나타내었다 (도 5a). 간 독성을 나타내는 ALT 수준도 유사한 결과를 나타내었다 (도 5b).

본 발명자들은 종양 성장 및 체중을 계속 모니터링하였다. 처리한지 12일 후 시점에서, R2-SUB는 hIg-처리된 대조군에 비해 종양 성장을 76%까지, IFNa4-Fc는 67%까지 억제시켰다 (도 5c). 그러나, 이 시점에서, IFNa4-Fc 처리된 그룹으로부터의 마우스는 아마도 IFN의 심각한 부작용으로 인해 병들었다 (부화, 비활동 및 마름). 이들을 다음으로 체중 역학을 비교하였다. 데이터는 IFNa4-Fc 그룹으로부터의 마우스가 3차 처리 후 체중이 빨리 감소하기 시작하였지만, R2-SUB 그룹으로부터의 마우스의 체중은 세 번의 처리 후에 유의적으로 변하지 않았음을 보여 주었다 (도 5d). 마지막으로, 본 발명자들은, 독성에 기초한 생존 곡선에서, R2-SUB 처리군은 100% 생존한 반면, IFNa4-Fc 처리군은 33% 생존하였음을 보여주었다 (도 5e).

인터페론 알파 및 베타 수용체 ( IFNAR )에 기반하는 인간 IFN - 전구약물.

인간 IFNAR1 또는 IFNAR2의 ECD가 인간 인터페론 알파 2 활성을 차단할 수 있는지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 인간 IFNa2-Fc, R1-IFNa2-Fc 및 R2-IFNa2-Fc를 정제하였다. R1-IFNa2-Fc 또는 R2-IFNa2-Fc의 링커는 삼중 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser 펩티드의 15-아미노산이며, 이것은 도메인 간의 상호작용을 가능하게 하는 가요성 링커이다²³. 이들은 5개의 NF-κB 및 AP-1 결합 부위에 융합된 IFN-β 최소 프로모터의 제어하에 SEAP (분비된 배아 알칼리성 포스파타제) 리포터 유전자를 발현하는 293T-Dual™ hSTING-R232 리포터 세포를 사용하였다. 293T-Dual™ hSTING-R232 세포는 인간 IFN-α 및 IFN-β에 반응성이었다. 인간 IFNa2-Fc, R1-IFNa2-Fc, 및 R2-IFNa2-Fc를 SEAP 리포터 분석을 위해 50 nM로부터 10배로 연속-희석시켰다. 인간 IFNa2-Fc에 비해, R1-IFNa2-Fc는 IFN 활성이 10배 감소한 반면 R2-IFNa2-Fc는 IFN 활성이 100배 감소한 것으로 나타났다 (도 7a). 따라서, IFNAR2는 인간 IFN에 대한 보다 우수한 차단 시약이다.

활성화된 인간 IFN-전구약물의 활성이 IFNa2-Fc의 활성에 필적하는지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 인간 R2-NSUB 및 R2-SUB를 정제하였다. R2-SUB의 링커는 6-잔기 프로테아제-절단 가능한 기질 (PVGLIG)을 갖는 16-아미노산 펩티드이며²⁴, 이것은 양쪽에 가요성 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser 펩티드가 측면에 있는 MMP-2 또는 MMP-9에 의해 절단될 수 있다. 프로테아제-절단 가능한 기질이 없는 R2-NSUB를 대조 작제물로서 사용하였다. R2-NSUB 또는 R2-SUB를 37℃에서 0, 0.5, 2, 또는 6시간 동안 rmMMP-9와 배양하였다. 인간 R2-SUB는 시간-의존적 방식으로 rmMMP-9에 의해 절단되었다. 6시간 후, 절단 효능은 100%이었다 (도 7c). 활성화된 인간 R2-SUB는 인간 IFNa2-Fc에 비해 필적하는 IFN 활성을 보인 반면 R2-NSUB의 활성은 효소 접종 후 변하지 않았다 (도 7b).

따라서, 프로테아제-활성화된 인간 IFN-전구약물의 생물학적 활성은 IFNAR2-기반 형태에서 모체 IFNA4-Fc의 수준으로 완전히 회복되었다. 또한, 인간 IFNAR2-기반 IFN-전구약물은 프로테아제 절단 전에 생물학적 활성이 현저하게 감소된 것으로 보였으며, 이것은 인간 IFN-전구약물이 절단될 때까지 생체내에서 안전하게 유지되며, 그후 인간에서 국소 종양 미세환경에서 치료 활성이 증가할 것임을 시사한다.

따라서, 여기서 연구된 IFN-전구약물은 정상 조직에서 독성을 감소시킴으로써 종양 조직에 대한 타입 I 인터페론의 강화된 표적화를 가능하게 한다. IFN-전구약물의 항종양 효능은 각 종양에서 프로테아제 활성에 기초하여 맞춤화될 수 있으며, IFN-전구약물을 특정 상황에서 선택된 절단 가능한 기질 링커를 갖는 맞춤형 약물로 만들어 최상의 결과를 제공한다. 게다가, IFN-전구약물은 상이한 프로테아제에 민감한 상이한 링커를 사용하여 다수의 IFN 도메인을 보유함으로써 이의 치료 효과를 상당히 개선시키도록 설계될 수 있다.

* * * * * * * * * * * * * * * * *

본원에 개시되고 청구된 모든 조성물 및 방법은 본 개시내용에 비추어 과도한 실험없이 제조되고 실행될 수 있다. 본 개시내용의 조성물 및 방법이 바람직한 실시양태의 관점에서 기술되었지만, 변형이 본 개시내용의 개념, 취지 및 범위를 벗어나지 않고 본원에 기술된 조성물 및 방법에 그리고 단계에 또는 방법의 단계의 순서에 적용될 수 있음은 당업계의 숙련가들에게 명백할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적 및 생리학적으로 관련된 특정 제제는 본원에 기술된 제제로 대체될 수 있지만 동일하거나 유사한 결과가 달성될 수 있음이 명백할 것이다. 당업계의 숙련가들에게 명백한 이러한 모든 유사한 대체 및 변형은 첨부된 청구범위에 의해 정의된 바와 같이 본 개시내용의 취지, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.

VII. 참고문헌

하기 참고문헌은, 이들이 본원에 제시된 것에 보충적인 예시적 절차 또는 다른 세부사항을 제공하는 정도로, 본원에 구체적으로 참고로 포함된다.

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미국 특허 5,824,311

미국 특허 5,830,645

미국 특허 5,830,880

미국 특허 5,837,196

미국 특허 5,840,873

미국 특허 5,843,640

미국 특허 5,843,650

미국 특허 5,843,651

미국 특허 5,843,663

미국 특허 5,846,708

미국 특허 5,846,709

미국 특허 5,846,717

미국 특허 5,846,726

미국 특허 5,846,729

미국 특허 5,846,783

미국 특허 5,846,945

미국 특허 5,847,219

미국 특허 5,849,481

미국 특허 5,849,486

미국 특허 5,849,487

미국 특허 5,849,497

미국 특허 5,849,546

미국 특허 5,849,547

미국 특허 5,851,772

미국 특허 5,853,990

미국 특허 5,853,992

미국 특허 5,853,993

미국 특허 5,856,092

미국 특허 5,858,652

미국 특허 5,861,244

미국 특허 5,863,732

미국 특허 5,863,753

미국 특허 5,866,331

미국 특허 5,866,366

미국 특허 5,871,928

미국 특허 5,871,986

미국 특허 5,876,932

미국 특허 5,882,864

미국 특허 5,889,136

미국 특허 5,900,481

미국 특허 5,905,024

미국 특허 5,910,407

미국 특허 5,912,124

미국 특허 5,912,145

미국 특허 5,912,148

미국 특허 5,916,776

미국 특허 5,916,779

미국 특허 5,919,626

미국 특허 5,919,630

미국 특허 5,922,574

미국 특허 5,925,517

미국 특허 5,925,565

미국 특허 5,928,862

미국 특허 5,928,869

미국 특허 5,928,905

미국 특허 5,928,906

미국 특허 5,929,227

미국 특허 5,932,413

미국 특허 5,932,451

미국 특허 5,935,791

미국 특허 5,935,819

미국 특허 5,935,825

미국 특허 5,939,291

미국 특허 5,942,391

미국 특허 5,945,100

미국 특허 5,981,274

미국 특허 5,994,624

미국 특허 6,004,755

미국 특허 6,087,102

미국 특허 6,368,799

미국 특허 6,383,749

미국 특허 6,506,559

미국 특허 6,573,099

미국 특허 6,617,112

미국 특허 6,638,717

미국 특허 6,720,138

미국 특허 공개 2002/0168707

미국 특허 공개 2003/0051263

미국 특허 공개 2003/0055020

미국 특허 공개 2003/0159161

미국 특허 공개 2004/0064842

미국 특허 공개 2004/0265839

미국 특허 공개 2008/0009439

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Zoglmeier et al., Clin Cancer Res 17, 1765-1775, 2011.

Claims

(a) IFN 결합 활성을 보유하는 인터페론 알파 및 베타 수용체 (IFNAR) 도메인;
(b) 상기 IFNAR 도메인에 의해 맞물리지 않는 경우 타입 1 인터페론 활성을 보유하는 타입 1 인터페론 (IFN) 도메인;
(c) 면역글로불린 (Ig) Fc 도메인;
(d) 한쪽 말단은 상기 IFN의 N-말단에 융합되고 다른 말단은 상기 IFNAR에 융합된 제1 링커(여기서, 상기 제1 링커는 프로테아제 절단 가능하다); 및
(e) 한쪽 말단은 상기 IFN의 C-말단에 융합되고 다른 말단은 상기 Ig Fc 도메인의 N-말단에 융합된 제2 링커를 포함하는 인터페론 전구약물(prodrug).
제1항에 있어서, 상기 Ig가 IgG1 또는 IgG2와 같은 IgG인 융합 단백질.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 인터페론 전구약물이 상기 타입 1 IFN 도메인의 두 개의 카피를 함유하는 융합 단백질.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 인터페론 전구약물이 상기 타입 1 IFN 도메인의 둘 이상의 카피를 함유하는 융합 단백질.
제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 링커가 MMP1, MMP3, MMP9, MMP10, MMP11, MMP12, MMP13 또는 MMP14와 같은 하나 이상의 매트릭스 메탈로프로테이나제에 의해 절단 가능한 융합 단백질.
제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 링커가 UPA, FAPa 및/또는 카텝신 B에 의해 절단 가능한 융합 단백질.
제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 링커가 G4S-SUB1-G4S-SUB2-G4S-SUB3-G4S이고, 여기서 SUB1-3이 별개의 효소 절단 부위인 융합 단백질.
제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 IFNAR이 IFNAR1인 융합 단백질.
제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 IFNAR이 IFNAR2인 융합 단백질.
제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 IFN이 IFN-α, IFN-β, IFN-κ, IFN-δ, IFN-ε, IFN-τ, IFN-ω 또는 IFN-ζ인 융합 단백질.
(a) IFN 결합 활성을 보유하는 인터페론 알파 및 베타 수용체 (IFNAR) 도메인;
(b) 상기 IFNAR 도메인에 의해 맞물리지 않는 경우 타입 1 인터페론 활성을 보유하는 타입 1 인터페론 (IFN) 도메인;
(c) 면역글로불린 (Ig) Fc 도메인,
(d) 한쪽 말단은 상기 IFN의 N-말단에 융합되고 다른 말단은 상기 IFNAR에 융합된 제1 링커(여기서, 상기 제1 링커는 프로테아제 절단 가능하다);
(e) 한쪽 말단은 상기 IFN의 C-말단에 융합되고 다른 말단은 상기 Ig Fc 도메인의 N-말단에 융합된 제2 링커; 및
(f) 상기 IFNα 도메인의 5' 내지 5' 말단에 위치한 프로모터를 포함하는 인터페론 전구약물을 암호화하는 핵산 작제물.
제11항에 있어서, 상기 Ig가 IgG1 또는 IgG2와 같은 IgG인 핵산 작제물.
제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 인터페론 전구약물이 상기 타입 1 IFN 도메인의 두 개의 카피를 함유하는 핵산 작제물.
제11항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 인터페론 전구약물이 상기 타입 1 IFN 도메인의 둘 이상의 카피를 함유하는 핵산 작제물.
제11항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 링커가 MMP1, MMP3, MMP9, MMP10, MMP11, MMP12, MMP13 및/또는 MMP14와 같은 매트릭스 메탈로프로테이나제에 의해 절단 가능한 핵산 작제물.
제11항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 링커가 UPA, FAPa 및/또는 카텝신 B에 의해 절단 가능한 핵산 작제물.
제11항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 링커가 G4S-SUB1-G4S-SUB2-G4S-SUB3-G4S이고, 여기서 SUB1-3이 별개의 효소 절단 부위인 핵산 작제물.
제11항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 IFNAR이 IFNAR1인 핵산 작제물.
제11항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 IFNAR이 IFNAR2인 핵산 작제물.
제11항 내지 제19항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 IFN이 IFN-α, IFN-β, IFN-κ, IFN-δ, IFN-ε, IFN-τ, IFN-ω 또는 IFN-ζ인 핵산 작제물.
제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 따르는 인터페론 전구약물을 발현하는 재조합 세포.
제11항 내지 제20항 중의 어느 한 항에 따르는 핵산 작제물을 포함하는 재조합 세포.
제21항의 세포를 배양함을 포함하여, 인터페론 전구약물을 발현시키는 방법.
제22항의 세포를 배양함을 포함하여, 인터페론 전구약물을 발현시키는 방법.
(a) 암 치료용 약제의 제조에 있어서; 또는
(b) 암의 치료를 위한, 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 따르는 인터페론 전구약물의 용도.
제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 따르는 인터페론 전구약물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함하여, 암을 치료하는 방법.
제26항에 있어서, 상기 대상체로부터 수득된 암 세포에서 프로테아제 발현을 평가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제27항에 있어서, 상기 암 세포가 생검으로부터 수득되는 방법.
제27항에 있어서, 상기 암 세포가 순환 종양 세포인 방법.
제26항 내지 제29항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 폐암, 유방암, 뇌암, 구강암, 식도암, 두경부암, 피부암, 위암, 간암, 췌장암, 신장암, 난소암, 전립선암, 방광암, 결장암, 고환암, 자궁암, 자궁경부암, 림프종, 또는 백혈병인 방법.
제26항 내지 제30항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 원발성, 재발성, 전이성 또는 다중-약물 내성인 방법.
제26항 내지 제30항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 환자가 이전에 수술 요법, 화학요법, 방사선요법, 호르몬 요법 또는 면역요법을 받은 방법.
제26항 내지 제32항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체를 제2 암 요법으로 치료하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제33항에 있어서, 상기 제2 암 요법이 수술 요법, 화학요법, 방사선요법, 호르몬 요법 또는 면역요법인 방법.
제26항 내지 제34항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 인간 또는 비-인간 포유동물인 방법.
제26항 내지 제35항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 인터페론 전구약물을 1회 이상 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제36항에 있어서, 상기 인터페론 전구약물이 매일, 격일로, 매주, 격주로 또는 매월 투여되는 방법.
제26항 내지 제37항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 인터페론 전구약물이 전신으로 투여되는 방법.
제26항 내지 제37항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 인터페론 전구약물이 종양내로, 종양에 국부적으로 또는 종양에 국소적으로 투여되는 방법.
제26항 내지 제39항 중의 어느 한 항에 있어서, 치료 단계가 종양 성장 둔화, 종양 성장 정지, 종양 크기 또는 부담의 감소, 치료되지 않은 대상체와 비교하여 생존 증가, 암 완화 유도, 종양 세포 아폽토시스(apoptosis) 유도, 또는 종양 괴사 유도 중 하나 이상을 포함하는 방법.