JPWO2003031620A1 - 新規クラスｉｉサイトカイン受容体 - Google Patents

Abstract

新規なクラスＩＩサイトカイン受容体の遺伝子及び蛋白質と、該蛋白質に対する活性調節剤の効率的な評価方法を提供する。配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ及び該ＤＮＡにコードされるクラスＩＩサイトカイン受容体、該ＤＮＡ配列に対するアンチセンス核酸、該蛋白質の活性調節物質の評価方法。

Description

技術分野
本発明は、新規なクラスＩＩサイトカイン受容体、該蛋白質をコードするＤＮＡ及びその断片、該ＤＮＡを含む発現ベクター、該発現ベクターで形質転換された形質転換細胞、該蛋白質若しくはその部分ペプチドに反応性を有する抗体、当該抗体を用いたＳＪ２３６８の測定方法、該蛋白質の活性または発現を調節する物質のスクリーニング方法に関する。
背景技術
細胞は他の細胞とコミュニケーションすることによって、細胞の機能や増殖、分化を制御している。サイトカインは細胞間情報伝達を担う一群の糖蛋白質の総称である。サイトカインは細胞膜上に存在するサイトカイン受容体に特異的に結合することにより細胞内のシグナル伝達経路を活性化する。シグナルは核に伝わり遺伝子発現の調節を行い、細胞の増殖、分化、死、機能発現を制御する。
サイトカイン受容体はその構造的特徴から幾つかのファミリーに分類される。クラスＩサイトカイン受容体ファミリーにはＩＬ−２、３、４、５、６、７、９、１１や顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、成長ホルモン（ＧＨ）など多くのサイトカインの受容体が属する。このファミリーに属する受容体の細胞外ドメインには約２００アミノ酸残基からなる特有の配列が認められ、サイトカイン受容体相同性ユニットと呼ばれている。クラスＩＩサイトカイン受容体ファミリーにはインターフェロン（ＩＦＮ）α／β受容体、ＩＦＮγ受容体、ＩＬ−１０受容体、ＩＬ−２０受容体などが属する。このファミリーに属する受容体は細胞外ドメインに３つのトリプトファン、２組のＳ−Ｓ結合よりなるクラスＩＩサイトカイン受容体モチーフを有する。
クラスＩＩサイトカイン受容体ファミリーにより認識されるサイトカインとしては、ＩＬ−１０、１９、２０、ＩＬ−ＴＩＦ（Ｔ細胞由来誘導因子；ＩＬ−２２）、ＡＫ１５５（ＩＬ−２６）、ＭＤＡ−７（メラノーマ分化関連因子−７；ＩＬ−２４）などのＩＬ−１０ファミリーが挙げられる。これらのＩＬ−１０ファミリーのうち、ＩＬ−ＴＩＦはＨｅｐＧ２肝細胞に急性相炎症蛋白質を誘導する活性を有し（Ｌａｕｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、Ｖｏｌ．９７、１０１４４−１０１４９（２０００））、ＩＬ−２０はトランスジェニックマウスの解析から乾癬への関与が示されている（Ｂｌｕｍｂｅｒｇら、Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１０４，９−１９（２００１））。また、ＭＤＡ−７は腫瘍細胞に遺伝子導入することにより腫瘍増殖を抑制する（Ｓｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、Ｖｏｌ．９５、１４４００−１４４０５（１９９８））。このように、新規ＩＬ−１０ファミリーの病態への関連は急速に明らかになりつつある。
以上のＩＬ−１０ファミリーの中でＩＬ−１０、ＩＬ−２０、ＩＬ−ＴＩＦについては受容体が同定されている一方、ＩＬ−１９、ＭＤＡ−７、ＡＫ１５５については受容体蛋白が同定されておらず、ＩＬ−１０ファミリーを認識する新たなクラスＩＩサイトカイン受容体の単離同定が望まれている。
発明の開示
本発明は、新規なクラスＩＩサイトカイン受容体とその遺伝子を同定することにより、炎症性疾患や悪性腫瘍の予防並びに治療に有用な医薬及び方法を提供するものである。
本発明は、新規な遺伝子（ｓｊ２３６８とする）、当該遺伝子にコードされる新規なクラスＩＩサイトカイン受容体（ＳＪ２３６８）に関する。また、当該遺伝子を用いて形質転換した宿主細胞、ＳＪ２３６８の発現を調節するアンチセンス核酸、ＳＪ２３６８またはその部分ペプチドに対する抗体、当該抗体を用いたＳＪ２３６８の測定方法、ＳＪ２３６８の発現または活性を調節する物質のスクリーニング方法を提供する。
（核酸）
本発明は、ＳＪ２３６８（後に詳しく述べる）をコードする遺伝子ｓｊ２３６８を提供する。遺伝子ｓｊ２３６８とは具体的には、以下の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかに記載の蛋白質をコードするＤＮＡのことである；（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるヒトクラスＩＩサイトカイン受容体；（Ｂ）配列番号２０に示すアミノ酸配列からなるヒト可溶型ＳＪ２３６８蛋白質；（Ｃ）配列番号１４に示すアミノ酸配列からなるマウスクラスＩＩサイトカイン受容体；（Ｄ）配列番号１８に示すアミノ酸配列からなるマウス可溶型ＳＪ２３６８蛋白質。配列番号２に示すアミノ酸配列からなるヒトクラスＩＩサイトカイン受容体をコードするＤＮＡの具体例は、配列番号１または配列番号３に示すｃＤＮＡである。しかしこれらに限定されるものではなく、配列番号１や配列番号３に示すｃＤＮＡのほか該ｃＤＮＡの由来するゲノムＤＮＡも含まれる。配列番号２０に示すアミノ酸配列からなるヒト可溶型ＳＪ２３６８蛋白質は配列番号２に示すアミノ酸配列からなるヒトクラスＩＩサイトカイン受容体のスプライシングバリアントである。よって配列番号２０に示すアミノ酸配列からなるヒト可溶型ＳＪ２３６８蛋白質をコードするＤＮＡの配列は、配列番号１または配列番号３に示すｃＤＮＡの塩基配列より派生可能である。配列番号２０に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号２４に示す。配列番号１４に示すアミノ酸配列からなるマウスクラスＩＩサイトカイン受容体をコードするＤＮＡの具体例は、配列番号１５または配列番号１６に示すｃＤＮＡである。しかしこれらに限定されるものではなく、配列番号１５や配列番号１６に示すｃＤＮＡのほか該ｃＤＮＡの由来するゲノムＤＮＡも含まれる。配列番号１８に示すアミノ酸配列からなるマウス可溶型ＳＪ２３６８蛋白質は配列番号１４に示すアミノ酸配列からなるマウスクラスＩＩサイトカイン受容体のスプライシングバリアントである。よって、配列番号１８に示すアミノ酸配列からなるマウス可溶型ＳＪ２３６８蛋白質をコードするＤＮＡの配列は、配列番号１５または配列番号１６に示すｃＤＮＡの塩基配列より派生可能である。配列番号１８に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号２５に示す。派生可能とは、基となるＤＮＡ配列の少なくとも一部分の欠失により得られることをいう。該遺伝子はヒト脾臓やマウス肝臓から単離同定することができるが、本明細書に開示された配列を基に、一般的なハイブリダイゼーション等の遺伝子工学的手法を用いたクローニングやホスホアミダイト法などの化学合成的手法により調製されるＤＮＡであってもよい。その形態としてはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡの他、化学合成ＤＮＡなどが含まれるが、特に制限はない。本発明のＤＮＡは１本鎖であっても、それに相補的な配列を有するＤＮＡやＲＮＡと結合して２重鎖、３重鎖を形成していても良い。また、当該ＤＮＡは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）等の酵素や放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質等で標識されていてもよい。
また、ｓｊ２３６８の塩基配列が提供されれば、これより導かれるＲＮＡの配列や、相補的なＤＮＡおよびＲＮＡの配列などは一義的に決定されるので、本発明は、本発明のＤＮＡに対応するＲＮＡあるいは本発明のＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡおよびＲＮＡもまた提供するものと理解すべきである。本明細書中において、「ＤＮＡ」は「ポリヌクレオチド」と同義である。
さらに、本発明のＤＮＡには、配列番号１または配列番号１５に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡをも含むものである。
配列番号１または配列番号１５に記載の塩基配列からなるＤＮＡに対しては、これとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ該ＤＮＡにコードされる蛋白質がクラスＩＩサイトカイン受容体であれば、塩基配列のバリエーションが許容される。例えば、いわゆるコドン縮重による同一アミノ酸残基をコードする複数のコドンの存在や、種々の人為的処理例えば部位特異的変異導入、変異剤処理によるランダム変異、制限酵素切断によるＤＮＡ断片の変異・欠失・連結等により、部分的にＤＮＡ配列が変化したものであっても、これらＤＮＡ変異体が配列番号１または配列番号１５に記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつクラスＩＩサイトカイン受容体をコードするＤＮＡであれば、配列番号１または配列番号１５に示したＤＮＡ配列との相違に関わらず、本発明の範囲内のものである。
配列番号２４または配列番号２５に記載の塩基配列からなるＤＮＡに対しては、これとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ該ＤＮＡにコードされる蛋白質が可溶型ＳＪ２３６８蛋白質であれば、塩基配列のバリエーションが許容される。
上記のＤＮＡ変異の程度は、配列番号１または配列番号１５に記載のＤＮＡ配列、もしくは当該配列から派生可能なスプライシングバリアントのＤＮＡ配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の同一性を有するものであれば許容範囲内である。ＤＮＡ配列の同一性の判断には、ＢＬＡＳＴ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．，３６；２９０−３００（１９９３）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５；４０３−１０（１９９０））を用いることができる。また、ハイブリダイズする程度としては、ストリンジェントな条件下、例えばＤＩＧ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製 Ｃａｔ Ｎｏ．１１７５０３３）でプローブをラベルした場合に、例えば３２℃、好ましくは３７℃、より好ましくは４２℃のＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ溶液（ロシュ・ダイアグノスティックス社製Ｃａｔ Ｎｏ．１６０３５５８）中でハイブリダイズさせ、例えば５０℃、好ましくは６５℃の０．５×ＳＳＣ溶液（０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む）中でメンブレンを洗浄する条件（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウムである）でのサザンハイブリダイゼーションで、配列番号１または配列番号１５に記載の核酸、もしくは当該配列から派生可能なスプライシングバリアントの核酸にハイブリダイズする程度であればよい。
配列番号１または配列番号１５に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、もしくは当該配列から派生可能なスプライシングバリアントのＤＮＡあるいはその部分断片は、敗血症性臓器障害、自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー性疾患、腫瘍等本発明の蛋白質が関与する疾患の特異的プローブとして有用であると考えられる。
本発明のＤＮＡは、ＳＪ２３６８を大量に生産するために使用することができる。該ＤＮＡはまた、酵素等で標識して、組織における本発明の蛋白質の発現状況を検査するために使用することができる。すなわち、該ＤＮＡをプローブとして使用し、細胞における本発明の蛋白質の発現量を、ｍＲＮＡ発現量を指標として確認することにより、本発明の蛋白質の製造に適した細胞やその培養条件を決定することができるほか、本発明の蛋白質が関連する疾患、特に敗血症性臓器障害、自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー性疾患、腫瘍等の診断を行うことも可能である。
また、本発明のＤＮＡの一部をプライマーとして使用したＰＣＲ−ＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（Ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、シークエンシング等の方法により、核酸配列上の異常あるいは多型を検査・診断することができる。
また、本発明のＤＮＡを生体内の細胞に導入し、本発明の蛋白質の発現または活性が損なわれていることによる疾患の遺伝子治療にも使用する事ができる。
本発明のＤＮＡは、形質転換細胞の調製、さらには該形質転換細胞を用いた組換え蛋白質ＳＪ２３６８の生産方法、あるいはＳＪ２３６８の発現を特異的に抑制する化合物の探索に大いに有用である。
本発明における形質転換細胞は当業者に公知の技術を適用して調製することが可能であり、例えば、市販されあるいは当業者が一般に入手容易な様々なベクターを利用して、適当な宿主細胞へ本発明のＤＮＡを組み入れることが可能である。その際、遺伝子ｓｊ２３６８をプロモーターやエンハンサーに代表される発現制御遺伝子の影響下におくことで、遺伝子ｓｊ２３６８の宿主細胞内での発現を任意にコントロールすることが可能である。この手法は、形質転換された宿主細胞を用いたＳＪ２３６８の生産において好適に用いられる他、遺伝子ｓｊ２３６８の発現制御機構の研究あるいは該遺伝子の発現を調節し得る物質の探索などにも応用することが可能となる。
例えば、任意の被験物質と遺伝子ｓｊ２３６８を含むベクターで形質転換された細胞とを適当な条件下で接触させることで、被験物質の遺伝子ｓｊ２３６８の発現を促進あるいは抑制する作用を有する物質を探索し、あるいは評価を行うことができる。
また、本発明であるＤＮＡと公知の方法とを組み合わせて、マウスまたはその他の適当な動物を基にトランスジェニック動物を作製することが出来る。さらに、本発明の遺伝子ｓｊ２３６８を利用すれば、ヒト以外の動物からｓｊ２３６８に相当する遺伝子を破壊したいわゆるノックアウト動物を作製することも可能である。このモデル動物の物理学的、生物学的、病理学的及び遺伝子的特徴を分析することにより、本発明に係る遺伝子及び蛋白質の機能を解明することが可能となる。さらに、そのようにして内在性遺伝子が破壊された該動物に本発明のヒトｓｊ２３６８を導入することにより、ヒトｓｊ２３６８のみを有するモデル動物を作製することも可能となる。
かかるトランスジェニック動物、特に本発明である遺伝子ｓｊ２３６８あるいは蛋白質ＳＪ２３６８を大量に発現しているあるいは逆にこれらを欠いた動物を観察すれば、遺伝子ｓｊ２３６８あるいは蛋白質ＳＪ２３６８の機能を特定することが可能となる。さらに、このモデル動物は、該導入されたヒトＳＪ２３６８をターゲットとした薬剤の開発、評価に有用である。遺伝子ｓｊ２３６８あるいは蛋白質ＳＪ２３６８に特異的に作用しあるいは機能を補完する物質等を、生体レベルで調べることが可能となり、この様にして得た物質は、ＳＪ２３６８が特異的に機能する生体制御に働く薬物となることが期待される。
（蛋白質ＳＪ２３６８）
本発明はｓｊ２３６８にコードされる蛋白質ＳＪ２３６８を提供する。ＳＪ２３６８とは、具体的には配列番号２に示すアミノ酸配列からなるヒトクラスＩＩサイトカイン受容体である。また、ＳＪ２３６８の別な具体例としては、配列番号１４に示すアミノ酸配列からなるマウスクラスＩＩサイトカイン受容体である。
ＳＪ２３６８は細胞外ドメインに３つのトリプトファン、２組のＳ−Ｓ結合よりなるクラスＩＩサイトカイン受容体モチーフを有し、ＩＬ−２０受容体α鎖、マウスＩＦＮα／β受容体、ＩＬ−１０受容体と類似性を示すことから、ＩＬ−１０ファミリーを認識する新規な受容体と推定される。また、細胞内には３つのチロシン残基を有し、リガンド結合によってこれらの部位のいずれかがリン酸化されてＪＡＫ−ＳＴＡＴ系を活性化し、リン酸化ＳＴＡＴが核内移行してシグナルが伝わるものと想定される。また、本発明のクラスＩＩサイトカイン受容体は、肝臓などの重要な臓器に発現していること、細胞レベルでは末梢白血球、冠状動脈血管内皮細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞に発現していることから、敗血症などにおける臓器障害や免疫担当細胞のエフェクター機能調節に関与する蛋白質であると理解される。ＳＪ２３６８のクラスＩＩサイトカイン受容体としての活性は、例えば実施例６に示す方法で確認することが出来る。
この様に、ＳＪ２３６８はクラスＩＩサイトカイン受容体ファミリーに認められる特徴を高度に保持している一方、そのアミノ酸配列全長での相同性は、最も相同性の高いＩＬ−２０受容体との間でも２１．６％（ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ（Ｖｅｒ４．０．５）Ｍａｘｉｍｕｍ Ｍａｔｃｈｉｎｇ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）による数値）にとどまる。このことから、ＳＪ２３６８は、炎症反応の発現あるいは進行において、他のクラスＩＩサイトカイン受容体分子にはない特徴的な役割を果たしていることが強く推認される。従って、ＳＪ２３６８を標的とした医薬化合物は、従来にはない特徴を備えた医薬となり得るものと期待される。
なお、クラスＩＩサイトカイン受容体としての活性を有する蛋白質である限り、配列番号２または配列番号１４に示す蛋白質のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、欠失、および／もしくは付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドあるいは蛋白質も本発明の範囲内である。
また本発明は、可溶型ＳＪ２３６８蛋白質を提供する。可溶型ＳＪ２３６８蛋白質とは、少なくともＳＪ２３６８蛋白質の細胞外ドメインの一部を含んでなり、膜貫通型ではない蛋白質のことである。可溶型ＳＪ２３６８蛋白質の代表例は配列番号２０に示すアミノ酸配列からなる蛋白質および配列番号１８に示すアミノ酸配列からなる蛋白質である。配列番号２０に示すアミノ酸配列からなる蛋白質はヒトＳＪ２３６８のスプライシングバリアントであるヒト可溶型ＳＪ２３６８蛋白質である。配列番号１８に示すアミノ酸配列からなる蛋白質はマウスＳＪ２３６８のスプライシングバリアントであるマウス可溶型ＳＪ２３６８蛋白質である。他の可溶型ＳＪ２３６８蛋白質の例としては、細胞表面上に発現したＳＪ２３６８蛋白質の細胞外ドメインが切断されることにより生成されるタイプが挙げられる。別の可溶型ＳＪ２３６８蛋白質の例としては、ＳＪ２３６８蛋白質の細胞外ドメインの少なくとも一部からなるポリペプチドと、他のポリペプチドからなる融合蛋白質が挙げられる。ＳＪ２３６８蛋白質の細胞外ドメインの少なくとも一部とは、配列番号２における４３番、６８番、１１１番のトリプトファン（Ｗ）、７４番と８２番、１９５番と２１７番のシステイン残基のペアといったクラスＩＩサイトカイン受容体モチーフを含んでいればよく、配列番号２の４３〜２１７アミノ酸残基からなる領域または配列番号１４の４３〜２１６アミノ酸残基からなる領域が細胞外ドメインの少なくとも一部の好ましい例である。
また、可溶型ＳＪ２３６８蛋白質の活性を保持している限り、配列番号２０または配列番号１８に示す蛋白質のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、欠失、および／もしくは付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドあるいは蛋白質も本発明の範囲内である。
蛋白質の構成要素となるアミノ酸残基側鎖は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なるが、実質的に蛋白質全体の３次元構造（立体構造とも言う）に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つかの関係が知られている。例えば、アミノ酸残基の置換については、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、Ｇｌｙとアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン（Ｓｅｒ）またはＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）、等が挙げられる。また、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、Ｇｌｙ、Ｃｙｓは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有すると考えられる。非荷電極性アミノ酸としては、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、チロシン（Ｔｙｒ）、Ａｓｎ、Ｇｌｎが挙げられる。酸性アミノ酸としては、ＡｓｐおよびＧｌｕが挙げられる。塩基性アミノ酸としてはＬｙｓ、Ａｒｇ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）が挙げられる。また、上述の意味の保存性を損なう場合でも、なおその蛋白質の本質的な機能、本発明においてはクラスＩＩサイトカイン受容体または可溶型ＳＪ２３６８蛋白質としての機能を失わない変異も当業者に多く知られている。さらに、異なる生物種間に保存される同種の蛋白質が、幾つかのアミノ酸が集中あるいは分散して欠失あるいは挿入されていてもなお本質的な機能を保持している例も多く認められている。
従って、配列番号２または配列番号１４に示したアミノ酸配列上の幾つかのアミノ酸残基の置換、挿入、欠失等による変異蛋白質であっても、その変異蛋白質がクラスＩＩサイトカイン受容体としての活性を有する限り、これらは本発明の範囲内にあるものと言うことができる。ここにいうクラスＩＩサイトカイン受容体の活性とは、（ａ）リガンドと結合する活性、（ｂ）細胞内シグナル伝達を惹起する活性、の少くとも一つを有することであり、例えば実施例６に示す方法により確認することができる。ここでいう細胞内シグナル伝達とは、具体的にはＪＡＫ−ＳＴＡＴ系の活性化である。ＪＡＫ−ＳＴＡＴ系の活性化は、ＳＴＡＴによる遺伝子発現の活性化あるいはＳＴＡＴの標的配列への結合により確認できる。ＳＴＡＴの標的配列とは、ＳＴＡＴが活性化した際に結合するＤＮＡ配列のことであり、Ｆｃ受容体Ｉのγ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｒｅｇｉｏｎ（ＧＲＲ）が例として挙げられる。幾つかのアミノ酸残基が異なっていても、配列番号２または配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるＳＪ２３６８と実質的に同質の機能を有するものは、本発明の範囲内であるといえる。従って、リガンドへの結合能または細胞内シグナル伝達を惹起する活性が性質的に同質であればよく、該活性の強弱の変動、または糖鎖結合の相違などによる該蛋白質の分子量の量的変化などは許容されると解されるべきである。また、ＳＪ２３６８蛋白質は、以下の（ａ）および（ｂ）の性質を有し、免疫細胞（特にＴ細胞）において免疫機能を調節する活性を有するものと考えられる；（ａ）ＣＤ３陽性末梢血単核球、ＣＤ４陽性末梢血単核球およびＣＤ８陽性末梢血単核球においてはＰＭＡとイオノマイシンの共刺激により発現が誘導される；（ｂ）ＣＤ１６陽性末梢血単核球、ＣＤ１９陽性末梢血単核球およびＣＤ３３陽性末梢血単核球の細胞表面上に発現しておらず、これら細胞においてはＰＭＡとイオノマイシンの共刺激によっても発現は誘導されない。
また、配列番号２０または配列番号１８に示したアミノ酸配列上の幾つかのアミノ酸残基の置換、挿入、欠失等による変異蛋白質であっても、その変異蛋白質が可溶型ＳＪ２３６８蛋白質としての活性を有する限り、これらは本発明の範囲内にあるものと言うことができる。ここにいう可溶型ＳＪ２３６８蛋白質の活性とは、以下の（ａ）〜（ｃ）に記載の少なくとも一つの活性を有することである；（ａ）Ｔ細胞のインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）産生を増強する活性；（ｂ）Ｔ細胞のＩＬ−４産生を抑制する活性；（ｃ）混合リンパ球反応においてリンパ球の増殖を抑制する活性。
「増強する活性」あるいは「抑制する活性」とは各測定系において可溶型ＳＪ２３６８蛋白質存在下と非存在下において測定値に差があることを言う。測定値については用いる系の種類によって適宜定められる。たとえば、下記の式で計算される抑制率あるいは増強率が１５％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上、更に好ましくは５０％以上であることをいう。
抑制率あるいは増強率＝（可溶型ＳＪ２３６８蛋白質無添加群の測定値−可溶型ＳＪ２３６８蛋白質添加群の測定値）の絶対値／無添加群の測定値×１００
Ｔ細胞に可溶型ＳＪ２３６８蛋白質を作用させた場合Ｔ細胞のインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）産生が増強されＩＬ−４産生が抑制されるという現象は、ＳＪ２３６８がＴｈ１分化を誘導した結果であると考えることができる。Ｔ細胞のＩＦＮ−γ産生を増強する活性、Ｔ細胞のＩＬ−４産生を抑制する活性、混合リンパ球反応においてリンパ球の増殖を抑制する活性は、例えば実施例１０に示す方法で確認することができる。
可溶型ＳＪ２３６８は、正常人血清中に８〜１８ｎｇ／ｍＬ（平均値は１１．４ｎｇ／ｍＬ）の濃度で存在すること、肝不全、痴呆、骨粗しょう症、心不全、肺腫瘍および狭心症患者において高値を示す傾向があり、可溶型ＳＪ２３６８がこれらの疾患と関係していることが明らかになった。
このようなアミノ酸の改変は、遺伝子多型等によって生ずる変異の様に自然界において認められる他、当業者に公知の方法、例えばＮＴＧなどの変異誘発剤を用いた突然変異誘発法や種々の組換え遺伝子手法を用いた部位特異的変異法を利用して、人為的に行うことができる。アミノ酸の変異部位および個数は、変異蛋白質がクラスＩＩサイトカイン受容体である限り特に制限はないが、変異個数は通常数十アミノ酸以内、好ましくは１０アミノ酸以内、さらに好ましくは１または数個以下である。
また本発明では、ＳＪ２３６８を上述のような全てのドメイン構造を有する分子全体として理解できるほか、ＳＪ２３６８が有する機能の少なくとも一つを保持した機能的なドメイン、特にリガンドとの結合能を担うドメインを保持した部分ペプチドとして理解することもできる。膜貫通型蛋白質の中には、リガンド結合部位を含む部分ペプチドが、特徴的な立体構造を保持したまま他のドメインから切り離されるなどして、遊離の（あるいは可溶化とも言われる）部分ペプチドとして存在し得るものがあることが、以前より報告されている。この様な部分ペプチドは、依然として特異的なリガンドとの結合能を保持していることから、これを用いて該蛋白質への結合能を有する化合物の探索が可能となる。このような可溶型ＳＪ２３６８蛋白質は上述のように実際に存在することが知られており、ＳＪ２３６８の細胞外ドメインの少なくとも一部を含んでなる部分ペプチドは、上述の可溶型ＳＪ２３６８と同等の活性を有する限り、実質的には本発明と同等の物質であると理解すべきである。また、ＳＪ２３６８の部分ペプチドの他の好ましい態様としては、ＳＪ２３６８の細胞内ドメインを含むペプチドが挙げられる。ＳＪ２３６８の細胞内ドメインはＳＪ２３６８の機能のひとつであるシグナル伝達機能を担っている。よって、シグナル伝達機能を保持している限り、ＳＪ２３６８の細胞内ドメインを含むペプチドも本発明の範囲内のものである。このような部分ペプチドは、ＳＪ２３６８のほかのドメイン（例えば膜貫通領域）の全部または一部が連結していても良いし、他の蛋白質やペプチドとの融合蛋白質となっていても良い。ヒトＳＪ２３６８の細胞外ドメインは配列番号２に示すアミノ酸配列のＮ端から２２５番目までのアミノ酸配列からなる。マウスＳＪ２３６８の細胞外ドメインは配列番号１４に示すアミノ酸配列のＮ端から２２４番目までのアミノ酸配列からなる。この部分にリガンドが結合すると考えられる。またヒトＳＪ２３６８の細胞内ドメインは配列番号２に示すアミノ酸配列の２５３番目からＣ端までのアミノ酸配列からなる。マウスＳＪ２３６８の細胞内ドメインは配列番号１４に示すアミノ酸配列の２５３番目からＣ端までのアミノ酸配列からなる。この部分で細胞内にシグナルを伝達すると考えられる。ドメインをどこまでのアミノ酸残基で区切るかは、使用するドメインの予想方法（例えばシグナル配列予測プログラムや膜貫通領域の予測プログラムの差異）によって多少前後することがあるが、そのような差異は許容されるべきものである。なお、ドメインとしての活性を保持する限りにおいてアミノ酸配列の改変が許容される。
すなわち、本発明は以下の部分ペプチドを提供する。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の２１〜２２５番目のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド；
（ｂ）（ａ）に記載のポリペプチドのアミノ酸配列においてアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるヒトＳＪ２３６８細胞外ドメイン；
（ｃ）配列番号１４に記載のアミノ酸配列の２１〜２２４番目のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド；
（ｄ）（ｃ）に記載のポリペプチドのアミノ酸配列においてアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるマウスＳＪ２３６８細胞外ドメイン；
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の２５３〜５２０番目のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド；
（ｆ）（ｅ）に記載のポリペプチドのアミノ酸配列においてアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるヒトＳＪ２３６８細胞内ドメイン；
（ｇ）配列番号１４に記載のアミノ酸配列の２５３〜５３５番目のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド；
（ｈ）（ｇ）に記載のポリペプチドのアミノ酸配列においてアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるマウスＳＪ２３６８細胞内ドメイン。
これらの部分ペプチドをコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡに含まれる。部分ペプチドをコードするＤＮＡは、配列番号１または１５に示されるＤＮＡから派生可能である。
ＳＪ２３６８の細胞外ドメインや該ドメインを含んでなる融合蛋白質、ＳＪ２３６８の細胞内ドメインを含んでなる融合蛋白質および可溶型ＳＪ２３６８を含んでなる融合蛋白質も本発明の範囲内のものである。融合蛋白質がＳＪ２３６８または可溶型ＳＪ２３６８の活性の少なくとも一つの活性を有する限りにおいて、連結される他のポリペプチドには特に制限はない。連結されるポリペプチドの例としては、クラスＩＩサイトカイン受容体ファミリーの細胞外ドメインまたは細胞内ドメイン、イムノグロブリンのＦｃ断片（Ｆｃと記載する場合もある）などが挙げられる。Ｆｃ断片はＩｇＧの場合、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域からなる。Ｆｃ断片の部分（例えばヒンジ領域、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域もしくはＣＨ４領域の各領域の単独または任意の組合せ）も使用可能である。この場合のイムノグロブリンは、由来する種は何れでもよいが、ヒト由来のものが好ましい。また、クラス及びサブクラスに関しても必ずしも限定されず、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ、ＩｇＥおよびＩｇＤ等の何れもが使用可能であるが、例えば、ＩｇＧが好ましい例である。このような融合蛋白質の好ましい一例は、配列番号１７に示されるマウスＳＪ２３６８細胞外ドメイン−Ｆｃや配列番号１９に示されるヒトＳＪ２３６８細胞外ドメイン−Ｆｃである。連結されるポリペプチドの他の例としては、ＩＬ１０受容体のα鎖が挙げられ、ＩＬ１０受容体のα鎖の細胞外ドメインとＳＪ２３６８の細胞内ドメインからなる融合蛋白質の例は配列番号２２および配列番号２３に示されている。
これらの融合蛋白質をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡに含まれる。
またシグナル配列を有する蛋白質ではシグナル配列が切断されたものが成熟蛋白として機能している場合もある。よって本発明の蛋白質からシグナル配列が除かれた成熟ペプチドも、実質的には本発明と同等の物質であると理解すべきである。ヒトＳＪ２３６８の場合、配列番号２に示されるアミノ酸配列の８番目から２０番目のアミノ酸残基付近にシグナル配列の存在が予測されている。上記に述べた蛋白質は、いわゆる当業者における通常の認識の範囲にある塩の形態であっても差し支えないことは言うまでもない。
本発明の蛋白質またはその部分ペプチドは、該蛋白質の活性を調節する物質の探索に使用することが出来る。探索を通じて得られる化合物等は、本発明の蛋白質が関連する疾患、例えば敗血症性臓器障害、自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー性疾患、腫瘍等に対する有効な治療薬または予防薬となることが期待される。
（抗体）
本発明はさらにＳＪ２３６８に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、ＳＪ２３６８全体あるいはその部分ペプチドを抗原として特異的に認識する抗体であり、モノクローナル抗体及び／またはポリクローナル抗体が含まれる。また、免疫グロブリンの構造、物理化学的性質や免疫学的性質として分類される５つのクラス（ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＭ，ＩｇＤ，ＩｇＥ）、あるいはＨ鎖のタイプによるサブクラスのいずれに属するものであってもよい。さらに、免疫グロブリンを例えばペプシンで分解したときのＦ（ａｂ’）_２、パパインで分解したときのＦａｂなどのフラグメントであっても、またキメラ抗体やヒト化抗体であってもよい。またＳＪ２３６８全体あるいはその部分ペプチドを抗原として特異的に認識するのみでなく、ＳＪ２３６８の活性を調節する機能を有する抗体も本発明に含まれる。ＳＪ２３６８の活性を調節する機能を有する抗体とは、ＳＪ２３６８とリガンドの結合を阻害する中和抗体、ＳＪ２３６８に結合してホモあるいはヘテロオリゴマー化を阻害する中和抗体やＳＪ２３６８に結合し細胞内シグナル伝達を惹起する活性を有するアゴニスト抗体のことである。これらの抗体は、ＳＪ２３６８の研究的あるいは臨床的な検出等に有用である。
（アンチセンス核酸）
本発明は、生体内において核酸レベルでのＳＪ２３６８生合成を抑制することのできる、いわゆるアンチセンス核酸を提供する。かかるアンチセンス核酸は、ＳＪ２３６８をコードするｍＲＮＡを作り出すのに必要なゲノム領域からｐｒｅ−ｍＲＮＡへの転写段階、ｐｒｅ−ｍＲＮＡから成熟ｍＲＮＡへのプロセッシング段階、核膜通過段階、蛋白への翻訳段階のいずれかで、遺伝子情報を担うＤＮＡもしくはＲＮＡに結合し、遺伝情報の伝達の正常な流れに影響を与えて蛋白質の発現を調節するものを意味し、遺伝子ｓｊ２３６８の核酸配列の全体あるいはいずれかの部分に相補する配列からなるものであってもよい。好ましくは、配列番号１または配列番号３に記載の核酸配列の全部または一部に相当あるいは相補する配列から成る核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡを含む）である。別の好ましい例は、配列番号１５または配列番号１６に記載の核酸配列の全部または一部に相補する配列から成る核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡを含む）である。また、ゲノム領域から転写されるｍＲＮＡがイントロン構造あるいは５’末端や３’末端に非翻訳領域を含む形であるときは、かかる非翻訳部分の配列に相当あるいは相補するアンチセンス核酸も本発明のアンチセンス核酸と同等の機能を有するものとなろう。
本発明のアンチセンス核酸は、ＤＮＡやＲＮＡの他、その立体構造や機能がＤＮＡあるいはＲＮＡと類似する各種誘導体のすべてを含むものである。例えば、３’末端もしくは５’末端に他の物質が結合した核酸、オリゴヌクレオチドの塩基、糖、リン酸の少なくともいずれか１つにおいて置換や修飾が生じた核酸、天然には存在しないような塩基、糖あるいはリン酸を有する核酸、糖−リン酸骨格以外の骨格（バックボーン）を有する核酸等が挙げられる。これらの核酸は、ヌクレアーゼ耐性、組織選択性、細胞透過性、結合力の少なくとも１つが高められた誘導体として好適である。すなわち、ＳＪ２３６８の活性発現を抑制し得る機能を有する限り、核酸の形態に制限はない。
また本発明では、一般的には、ステム・ループを形成しているｍＲＮＡのループ部分にハイブリダイズするような塩基配列、すなわちステム・ループを形成している領域の塩基配列に相補的な塩基配列をもつアンチセンス核酸が好適である。あるいは、翻訳開始コドン付近、リボソーム結合部位、キャッピング部位、スプライス部位に結合するようなアンチセンス核酸、すなわちこれらの部位の配列に相補的な配列を有するアンチセンス核酸も、一般に高い発現抑制効果が期待できる点で好ましい。
この様なアンチセンス核酸を細胞内に取り込ませ、効率的に作用させるためには、本発明のアンチセンス核酸の鎖長は１５塩基以上３０塩基以下、好ましくは１５塩基以上２５塩基以下、より好ましくは１８塩基以上２２塩基以下の塩基数からなる塩基配列からなるものが好適である。
本発明のアンチセンス核酸の発現抑制効果は、公知の手法、例えば本発明の遺伝子の発現制御領域、５’非翻訳領域、翻訳開始部位近傍領域または翻訳領域の一部等を含むＤＮＡとルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子を連結した発現プラスミドを作製し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ反応（プロメガ社：Ｒｉｂｏ ｍａｘ ｓｙｓｔｅｍ等）とｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ反応（プロメガ社：Ｒａｂｂｉｔ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ等）を併用する系のような本発明の遺伝子が転写または翻訳される環境下で候補物質を系に添加し、該レポーター遺伝子の発現量を測定することにより評価することができる。
本発明のアンチセンス核酸は、生体内におけるｓｊ２３６８の発現を抑制することができるので、ＳＪ２３６８が関連する疾患の予防・治療剤として有用である。
発明を実施するための最良の形態
（核酸）
本発明のＤＮＡをＤＮＡライブラリーから得る例としては、適当なゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーを、ハイブリダイゼーションによるスクリーニング法や、抗体を用いたイムノスクリーニング法等でスクリーニングし、目的のＤＮＡを有するクローンを増殖させ、そこから制限酵素等を用いて切り出す方法がある。ハイブリダイゼーション法によるスクリーニングは、配列番号１または配列番号１５に記載の塩基配列もしくはその一部を有するＤＮＡを^３２Ｐ等でラベルしてプローブとし、任意のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーに対して、公知の方法で（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８２年）行うことができる。イムノスクリーニング法で用いる抗体は、後述する本発明の抗体を使用することができる。本発明の新規ＤＮＡはまた、ゲノムＤＮＡライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリーを鋳型とするＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）によっても得る事ができる。ＰＣＲは、配列番号１または配列番号１５に記載の塩基配列をもとに、センスプライマー、アンチセンスプライマーを作製し、任意のＤＮＡライブラリーに対し、公知の方法（例えばＭｉｃｈａｅｌ Ａ．Ｉ．等，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９０年参照）等を行って、本発明のＤＮＡを得る事もできる。上記各種方法で使用するＤＮＡライブラリーは、本発明のＤＮＡを有するＤＮＡライブラリーを選択して使用する。当該ＤＮＡライブラリーは、本発明のＤＮＡを有するライブラリーであれば、いかなるものも使用可能であり、市販のＤＮＡライブラリーを使用したり、本発明のＤＮＡを有する細胞からＤＮＡライブラリーを作製するのに適した細胞を選び公知の方法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ 等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９年参照）に従って、ＤＮＡライブラリーを作製し、利用することができる。
また、本明細書に開示された配列を基にホスホアミダイト法などの化学合成的手法により調製することも可能である。
本発明のＤＮＡを含む組換えベクターは、環状、直鎖状等いかなる形態のものであってもよい。かかる組換えベクターは、本発明のＤＮＡの全部または一部に加え、必要ならば他の塩基配列を有していてもよい。他の塩基配列とは、エンハンサーの配列、プロモーターの配列、リボゾーム結合配列、コピー数の増幅を目的として使用される塩基配列、シグナルペプチドをコードする塩基配列、他のポリペプチドをコードする塩基配列、ポリＡ付加配列、スプライシング配列、複製開始点、選択マーカーとなる遺伝子の塩基配列等のことである。本発明の組換えベクターの好ましい一例は、発現ベクターである。
遺伝子組換えに際しては、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて翻訳開始コドンや翻訳終止コドンを本発明のＤＮＡに付加したり、あるいは塩基配列内に適当な制限酵素切断配列を新たに発生させあるいは消失させることも可能である。これらは当業者が通常行う作業の範囲内であり、本発明のＤＮＡを基に任意かつ容易に加工することができる。
また本発明のＤＮＡを保持するベクターは、使用する宿主に応じた適当なベクターを選択して使用すればよく、プラスミドの他にバクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス等の種々のウイルスを用いることも可能であり、特に制限はない。
本発明の遺伝子の発現は、該遺伝子固有のプロモーター配列の制御下に発現させることができる。かかる発現系を用いれば、本発明の遺伝子の転写を促進あるいは抑制する物質の探索がより有利に行える。あるいは、本発明の遺伝子の上流に別の適当な発現プロモーターを該遺伝子固有のプロモーター配列に接続あるいは置き換えて使用することもできる。この場合に使用するプロモーターは、宿主及び発現の目的に応じて適宜選択すればよく、例えば宿主が大腸菌である場合にはＴ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、λＰＬプロモーターなどが、宿主が酵母である場合にはＰＨＯ５プロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が、宿主が動物細胞である場合にはＳＶ４０由来プロモーター、レトロウイルスプロモーター、延長因子１α（Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ １α）プロモーター等を例示できるが、当然ながらこれらには限定されない。
ＤＮＡをベクターに導入する方法は公知である（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），１９８９年、参照）。すなわち、ＤＮＡとベクターをそれぞれ適当な制限酵素で消化し、得られたそれぞれの断片を、ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションさせればよい。
（蛋白質）
本発明の蛋白質は、該蛋白質を発現している細胞や組織から調製することができ、またペプチド合成機（例えば、ペプチドシンセサイザー４３３Ａ型、アプライドバイオシステムズ ジャパン株式会社製）を使用した化学合成法でも、また原核生物あるいは真核生物から選択される適当な宿主細胞を用いた組換え方法によっても調製することができる。しかしながら、その純度の面から遺伝子工学的な手法による生産ならびに組換え型蛋白質が好ましい。
前項の組換えベクターを用いて形質転換させる宿主細胞には特に制限はなく、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓあるいはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに代表される遺伝子工学手法において利用可能な下等細胞、昆虫細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞に代表される動物細胞など多くの細胞が、本発明に対しても利用可能である。
本発明の形質転換細胞は、適当な宿主細胞を本発明の組換えベクターにより形質転換させることで得ることができる。前項の組換えベクターを宿主細胞に導入する方法としては、エレクトロボレーション法、プロトプラスト法、アルカリ金属法、リン酸カルシウム沈澱法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、ウイルス粒子を用いる方法等の公知方法（実験医学臨時増刊、遺伝子工学ハンドブック１９９１年３月２０日発行、羊土社、参照）があるが、いずれの方法を用いても構わない。
当該蛋白質を遺伝子工学的に生産するには、上述の形質転換細胞を培養して培養混合物を回収し、当該蛋白質を精製する。形質転換細胞の培養は、一般的な方法で行うことができる。形質転換細胞の培養については各種の成書（例、「微生物実験法」社団法人日本生化学会編、株式会社東京化学同人、１９９２年）があるので、それらを参考にして行うことができる。
培養混合物から本発明の蛋白質を精製する方法としては、蛋白質の精製に通常使用されている方法の中から適切な方法を適宜選択して行うことができる。すなわち、塩析法、限外濾過法、等電点沈澱法、ゲル濾過法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーや抗体クロマトグラフィー等の各種アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング法、吸着クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィー等、通常使用され得る方法の中から適切な方法を適宜選択し、必要によりＨＰＬＣシステム等を使用して適当な順序で精製を行えば良い。
また、本発明の蛋白質を他の蛋白質（例、免疫グロブリンのＦｃ断片）やタグ（例、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、プロテインＡ、ヘキサヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグその他）との融合蛋白質として発現させることも可能である。発現させた融合型は、適当なプロテアーゼ（例、トロンビン、エンテロカイネースその他）を用いて切り出すことが可能であり、ときとして蛋白質の調製をより有利に行うことが可能となる。また、免疫グロブリンのＦｃ断片を用いた場合などは、二量体形成能を賦与するなど、本発明の蛋白質の活性または機能を向上または修飾することが可能である。本発明の蛋白質の精製は当業者に一般的な手法を適宜組み合わせて行えばよく、特に融合蛋白質の形態で発現させたときは、その形態に特徴的な精製法を採用することが好ましい。
また、組換えＤＮＡ分子を利用して無細胞系の合成方法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．（１９８９年））で得る方法も、遺伝子工学的に生産する方法の１つである。
この様に本発明の蛋白質は、それ単独の形態でも別種の蛋白質との融合蛋白質の形態でも調製することができるが、これらのみに制限されるものではなく、本願発明の蛋白質を更に種々の形態へと変換させることも可能である。例えば、蛋白質に対する種々の化学修飾、ポリエチレングリコール等の高分子との結合、不溶性担体への結合など、当業者に知られている多種の手法による加工が考えられる。また、用いる宿主によっては糖鎮の付加の有無あるいはその程度にも違いが認められる。かかる場合にあっても、ＳＪ２３６８としてのリガンドへの結合能または細胞内シグナル伝達を惹起する活性を有する限りにおいて、なお、本発明であると理解されたい。
本発明の蛋白質は、抗体を作製するための抗原として使用し、あるいは該蛋白質に結合する物質や該蛋白の活性を調節する物質のスクリーニングに使用することができ、有用である。
本発明のＳＪ２３６８は、上述のような形質転換細胞、特に動物細胞を培養することにより、その細胞表面に目的分子を高発現させることが可能である。一方、ＳＪ２３６８の細胞外領域タンパクフラグメントなどの適当な断片を可溶性タンパクとして製造する場合には、当該細胞外領域あるいは各ドメインをコードするＤＮＡを用いて上述のように形質転換細胞を調製し、該形質転換細胞を培養し、培養上清中に分泌させることにより製造することができる。
一方、ＳＪ２３６８が形質転換細胞のペリプラズムまたは細胞質内に存在する場合は、適当な緩衝液に懸濁した細胞に対して、例えば超音波処理、凍結融解処理、あるいはリゾチーム処理などを行って細胞壁および／または細胞膜を破壊した後、遠心分離やろ過などの方法で本発明の蛋白質を含有する膜画分を得、さらに該膜画分を適当な界面活性剤を用いて可溶化して粗溶液を調製する。そして、当該粗溶液から定法により目的蛋白質を単離、精製することができる。
（ｓｊ２３６８遺伝子組換え非ヒト動物）
本発明は、ｓｊ２３６８遺伝子組換え非ヒト動物を提供する。ｓｊ２３６８遺伝子組換え非ヒト動物には、トランスジェニック非ヒト動物およびノックアウト非ヒト動物が含まれる。本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、本発明の蛋白質をコードする遺伝子を該動物の染色体上に人為的に組み込むことにより、本発明の蛋白質の発現の程度、発現時期、発現部位等が制御されることを特徴とする。非ヒト動物としては、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、マウス、ウマ、ニワトリなどが挙げられるがこれらに限定されるものではない。非ヒト動物の中でも非ヒト哺乳動物が好ましい。
本発明のｓｊ２３６８を用いれば、トランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製することができる。このトランスジェニック非ヒト哺乳動物も本願の発明に属する。該トランスジェニック非ヒト哺乳動物は、トランスジェニック動物の製造において通常使用されるような定法（例、発生工学実験マニュアル、講談社サイエンティフィク発行、勝木元也編、野村達次監修、１９８７年）に従って作製することができる。すなわち、本発明の遺伝子または組換えベクターを非ヒト動物の全能性細胞に導入し、この細胞を個体へと発生させ、体細胞のゲノム中に導入遺伝子が組み込まれた個体を選別する。
具体的には、例えば、トランスジェニックマウスの場合には、正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスから取得した前核期受精卵にｓｊ２３６８遺伝子が発現可能なように構築されたＤＮＡを直接注入する。より具体的には、適切なプロモーターの下流にｓｊ２３６８遺伝子を接続して導入したコンストラクトを作製し、その後必要であれば原核生物由来の配列を可能な限り除去した直鎖状ＤＮＡを得て、これを前核期受精卵前核に微細なガラス針を用いて直接注入する。
該受精卵を仮親となる別の偽妊娠マウスの子宮に移植する。偽妊娠マウスは一般的にＩＣＲ雌マウスを、精管を切断または結紮した雄マウスと交配して作製する。移植胚由来の仔の組織よりゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法またはサザンブロッティング法にてｓｊ２３６８遺伝子の導入の有無を確認しトランスジェニックマウスを得る。
また、ｓｊ２３６８（またはｓｊ２３６８のマウス相同遺伝子）の塩基配列に基づいて、いわゆる「ノックアウトマウス」を作製することができる。本発明における「ノックアウトマウス」とは、本発明のマウス由来のタンパクをコードする内在性遺伝子がノックアウト（不活性化）されたマウスであり、例えば相同組換えを応用したポジティブネガティブセレクション法（米国特許第５，４６４，７６４号公報、同５，４８７，９９２号公報、同５，６２７，０５９号公報、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８６，８９３２−８９３５，１９８９、Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３４２，４３５−４３８，１９８９など）を用いて作製することができ、このようなノックアウトマウスも本発明の一態様である。
または、最近中大動物においても核移植によるクローン動物の作出が可能となった。これに伴い本技術を用いたＴＧおよびＫＯ動物の作出も実際に行われるようになった。すなわち体細胞、あるいは生殖系列の細胞に対しｓｊ２３６８（または各動物におけるｓｊ２３６８の相同遺伝子）の塩基配列に基づいて、ＥＳ細胞に対して行うのと同様に相同組換えを行い、得られた細胞から核を得て、その核を用いてクローン動物を得ることができる。該動物はｓｊ２３６８（または各動物におけるｓｊ２３６８の相同遺伝子）が失われたノックアウト動物である。または、上述の方法と同様、任意の動物の任意の細胞にｓｊ２３６８（または各動物におけるｓｊ２３６８の相同遺伝子）遺伝子を導入し、その核を用いてクローン動物を得る事によりＴＧ動物を作製する事も可能である。このようなノックアウト非ヒト動物およびトランスジェニック非ヒト動物はその種に関わらず本発明の一態様である。
（抗体）
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体いずれも公知方法を参考にして得ることができる（例えば、免疫実験操作法、日本免疫学会編、日本免疫学会発行、参照）。
以下に簡単に説明する。
当該新規抗体を得るには、まず動物に、免疫抗原として本発明の蛋白質を必要に応じてフロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）や不完全アジュバント（ＦＩＡ）等の適切なアジュバントとともに接種し、必要があれば２〜４週間の間隔で追加免疫する。追加免疫後、採血を行い、抗血清を得る。抗原として用いる本発明の蛋白質は、それが抗体の作製に使用しうる精製度のものであればいかなる方法で得られたものであってもよい。本発明の蛋白質の部分ポリペプチドも免疫抗原として好適に使用しうる。免疫抗原として使用するポリペプチドが、低分子のポリペプチド、すなわち約１０〜２０アミノ酸からなるポリペプチドである場合には、それをキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等のキャリアと結合させて抗原として使用すればよい。免疫する動物はいかなるものであっても良いが、好ましくは通常当業者で免疫学的な実験に使用されるラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ニワトリ、ヤギ、ブタ、ウシ等から、目的の抗体を産生しうる動物種を選択して使用することが好ましい。
ポリクローナル抗体は、得られた抗血清を精製することによって得る事が出来る。精製は、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知方法を適宜組み合わせて行えば良い。
モノクローナル抗体を得るには以下のように行う。すなわち、免疫した動物から脾細胞もしくはリンパ球等の抗体産生細胞を採取し、ポリエチレングリコール、センダイウイルス、電気パルス等を用いる公知方法によって、ミエローマ細胞株等と融合し、ハイブリドーマを作製する。その後、本発明の蛋白質に結合する抗体を産生しているクローンを選択して培養し、その選択されたクローンの培養上清を精製することによって得れば良い。精製は、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知方法を適宜組み合わせて用いれば良い。
また、遺伝子工学的な方法を用いても当該新規抗体が得られる。例えば、本発明蛋白質またはその部分ポリペプチドで免疫した動物の脾細胞、リンパ球あるいは、本発明蛋白質またはその部分ポリペプチドに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマからｍＲＮＡを採取し、これをもとにｃＤＮＡライブラリーを作製する。抗原と反応する抗体を産生しているクローンをスクリーニングし、得られたクローンを培養し、培養混合物から目的とする抗体を公知方法を組み合わせて精製することができる。抗体を治療に使用する場合には、免疫原性の点からヒト化抗体が好ましい。ヒト化抗体は、免疫系をヒトのものと入れ替えたマウス（例 Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５；１４６−１５６（１９９７））を免疫することにより調製することが出来る。また、モノクローナル抗体の超可変領域を用いて遺伝子工学的に調製することもできる（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３；９９−１２１（１９９１））。
（アンチセンス核酸）
アンチセンス核酸は、公知方法で製造することができる（例えば、Ｓｔａｎｌｅｙ Ｔ．ＣｒｏｏｋｅおよびＢｅｒｎａｌｄ Ｌｅｂｌｅｕ編、ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ出版、フロリダ、１９９３年）。天然のＤＮＡやＲＮＡであれば、化学合成機を使用して合成し、あるいはｓｊ２３６８を鋳型としてＰＣＲ法により本発明のアンチセンス核酸を得ることができる。また、メチルフォスフォネート型やフォスフォロチオエート型等、誘導体の中には化学合成機（たとえばアプライドバイオシステムズ ジャパン株式会社製、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ Ｍｏｄｅｌ ８９０９）を使用して合成できるものもある。この場合には、化学合成機に添付されたマニュアルに従って操作を行い、得られた合成産物を、逆相クロマトグラフィー等を用いたＨＰＬＣ法により精製することによっても、アンチセンス核酸を得ることができる。
本発明のＤＮＡやアンチセンス核酸を診断用のプローブとして使用する場合には、それらを公知の方法に従い、ラジオアイソトープ、酵素、蛍光物質、あるいは発光物質等で標識する。次に、検体からＤＮＡもしくはｍＲＮＡを公知方法で調製し、これを被検物質として、前記標識プローブを加えて反応させた後、洗浄して未反応の前記標識プローブを除去する。被検物質中に、遺伝子ｓｊ２３６８もしくはＲＮＡが含まれていれば、当該アンチセンス核酸はそれらと結合する。結合形成の有無は、標識した酵素、蛍光物質、発光物質、あるいは放射性同位元素等による発光、蛍光、放射能等を指標として知ることができる。
本発明のＤＮＡ、アンチセンス核酸または組換えベクターを医薬用途に使用する場合には、医薬品として使用するのに適した純度のものを、薬理学的に許容されうる使用方法で使用することが好ましい。
本発明のＤＮＡ、アンチセンス核酸または組換えベクターは、それらを直接適当な溶媒に溶解もしくは懸濁して使用してもよいし、リポソーム中に封入したり、適当なベクターに組み込んだ形にして使用してもよい。また、必要に応じて、薬理学的に許容され得る補助成分を添加し、注射剤、錠剤、カプセル剤、点眼剤、クリーム剤、座剤、噴霧剤、パップ剤等適当な剤型にして使用してもよい。薬理学的に許容され得る補助成分とは、溶媒、基剤、安定化剤、防腐剤、溶解剤、賦形剤、緩衝剤等のことである。
本発明のＤＮＡ、アンチセンス核酸または組換えベクターは、上述のような剤型とした場合、患者の年齢や、性別、疾患の種類、程度に応じて、その投与方法、その投与量を設定して使用することができる。すなわち、病態を改善するのに適した量を、経口投与、あるいは、吸入、経皮投与、点眼、膣内投与、関節内投与、直腸投与、静脈内投与、局所投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与等から適当な方法を選んで投与すればよい。
（スクリーニング方法）
本発明は、本発明の蛋白質、該蛋白質を発現している形質転換細胞、本発明のＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクター、該組換えベクターで形質転換された形質転換細胞またはｓｊ２３６８遺伝子組換え非ヒト動物を用いることを特徴とし、本発明の蛋白質の機能または発現を調節する物質をスクリーニング方法に関する。より具体的には、（１）候補物質を用意し、本発明の蛋白質または該蛋白質を発現している形質転換細胞に該候補物質を接触させ、該候補物質が本発明の蛋白質の活性を調節する作用を有するかどうかを判定することからなる方法、（２）候補物質を用意し、本発明のＤＮＡを含む組換えベクターまたは該組換えベクターで形質転換された形質転換細胞に該候補物質を接触させ、該候補物質がｓｊ２３６８遺伝子の発現を調節する作用を有するかどうかを判定することからなる方法などが挙げられる。（１）の例としては、実施例６に示す系において、候補物質存在下／非存在下における本発明の蛋白質の活性を測定し、非存在下に比べて存在下において本発明の蛋白質の活性を増加または減少させる候補物質を選択する方法が挙げられる。（２）の例としては、ｓｊ２３６８遺伝子の発現制御領域、５’非翻訳領域、翻訳開始部位近傍領域または翻訳領域の一部等を含むＤＮＡとルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子を連結した発現プラスミドを作製し、本発明の遺伝子が転写または翻訳される環境下で該レポーター遺伝子の発現量を候補物質の存在下／非存在下で測定し、候補物質の転写促進活性または転写抑制活性を確認する方法が挙げられる。本発明のスクリーニング方法は、本発明の蛋白質、該蛋白質を発現している形質転換細胞、本発明のＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクター、該組換えベクターで形質転換された形質転換細胞またはｓｊ２３６８遺伝子組換え非ヒト動物と候補物質を接触させる工程；候補物質添加群と候補物質無添加群とにおける本発明の蛋白質の活性または本発明のＤＮＡの発現レベルに差があるかどうかを検出する工程；差が認められた候補物質を本発明の蛋白質の活性調節物質または本発明のＤＮＡの発現調節物質として選択する工程を含み得る。本発明の蛋白質の活性を調節する作用を示す物質とは、ＳＪ２３６８蛋白質および／または可溶型ＳＪ２３６８蛋白質の活性を増強あるいは阻害する作用を有する物質（アゴニストまたはアンタゴニスト）のいずれでも良いが、好ましくはアンタゴニストである。本発明のＤＮＡの発現調節作用を示す物質とは、遺伝子ｓｊ２３６８の発現を促進あるいは抑制する作用を有する物質のいずれでもよいが、好ましくは抑制する作用を有する物質である。候補物質が本発明の蛋白質の活性調節作用または本発明のＤＮＡの発現調節作用を示すかどうかは、蛋白質の活性を確認できる系またはＤＮＡの発現を確認できる系に候補物質を添加した場合と無添加の場合の蛋白質の活性またはＤＮＡの発現レベルに差があるかどうかを調べればよい。ＤＮＡの発現レベルとは、ｓｊ２３６８遺伝子のｍＲＮＡの発現強度、蛋白質の発現強度のいずれにより検出しても良い。また、ｓｊ２３６８遺伝子またはＳＪ２３６８蛋白質自体の発現レベルではなく、代替としてレポーター遺伝子の発現レベルを検出しても良い。レポーターアッセイ系は、転写調節領域の下流に配置したレポーター遺伝子の発現量を指標として、該転写調節領域に作用する物質をスクリーニングするアッセイ系をいう。転写調節領域としては、プロモーター、エンハンサー、通常プロモーター領域に見られるＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス等を例示することができる。またレポーター遺伝子としては、ＣＡＴ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ａｃｅｔｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓ）遺伝子、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）遺伝子、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）遺伝子等を利用することができる。本発明の遺伝子の発現制御領域や５’非翻訳領域は公知の方法で取得することが可能である（新細胞工学実験プロトコール（秀潤社）、１９９３年）。阻害（または抑制）する作用を有する、あるいは増強（または促進）する作用を有するとは、蛋白質の活性またはＤＮＡの発現レベルの測定値が、候補物質添加群と、候補物質無添加群との間に差があることをいう。たとえば、下記の式で計算される阻害（または抑制）率あるいは増強（または促進）率が１０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、更に好ましくは７０％以上、特に好ましくは９０％以上であることをいう。
阻害（または抑制）率あるいは増強（または促進）率＝（候補物質無添加群の測定値−候補物質添加群の測定値）の絶対値／無添加群の測定値×１００
ここで、阻害または増強のどちらの活性であるかについて、および測定値については蛋白質の活性を確認できる系またはＤＮＡの発現を確認できる系の種類によって適宜定められる。たとえば、蛋白質の活性を確認できる系が実施例６に示すルシフェラーゼアッセイ系の場合には、測定値としてはルシフェラーゼ活性を用いることができ、候補物質添加群の測定値＜候補物質無添加群の測定値となる場合、候補物質にはＳＪ２３６８蛋白質活性阻害作用があるといえる。また蛋白質の活性を確認できる系が実施例１０に示すＴ細胞のＩＦＮ−γ産生の測定系の場合には、測定値としてはＩＦＮ−γ産生量を用いることができ、候補物質添加群の測定値＜候補物質無添加群の測定値となる場合、候補物質には可溶型ＳＪ２３６８蛋白質活性阻害作用があるといえる。測定系にバックグラウンドやノイズの値が含まれる場合には、そのようなものを差し引いた値を測定値とすることは言うまでもない。
上述のスクリーニング方法あるいはトランスジェニック動物を用いた探索を通じて得られる化合物等は、敗血症性臓器障害、自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー性疾患、腫瘍等に対する有効な治療薬または予防薬となることが期待される。候補物質としては蛋白質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、合成化合物、天然由来化合物、醗酵生成物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられるがこれに限定されず、新規物質でも公知物質でもよい。
＜本発明の抗体を用いる測定法、試薬、キット＞
本発明は、（１）本発明の抗体を用いることを特徴とする、被験試料中の可溶型ＳＪ２３６８蛋白質の測定方法、（２）本発明の抗体を含有すること特徴とする、被験試料中の可溶型ＳＪ２３６８蛋白質を測定するための試薬またはキット、（３）ヒト体液中の可溶型ＳＪ２３６８蛋白質量の増加または減少を測定し、ＳＪ２３６８の機能異常、それらを伴う疾患または該疾患に付随する病態の予知、検出または診断に用いる（１）に記載の可溶型ＳＪ２３６８蛋白質の測定方法、（４）前記疾患が肝不全、痴呆、骨粗しょう症、心不全、肺腫瘍および狭心症より選ばれる少なくとも１つの疾患である（３）に記載の測定方法を提供する。
本発明の測定方法は、本発明の抗体を用いるステップを含むが、該ステップは、対象試料中の被験物質である可溶型ＳＪ２３６８蛋白質と本発明の抗体との抗原抗体反応により、対象試料中の被験物質をトラップする工程であることが好ましい。本発明の測定方法における被験物質の検出原理は特に限定されないが、凝集法、サンドイッチ法、固相直接法または固相結合法、競合法等が例示される。この内、サンドイッチ法及び競合法が好ましく、特にサンドイッチ法が好ましい。凝集法では、抗体を粒子、例えばラテックス粒子や赤血球（例えば羊赤血球）の表面に結合させて、可溶型ＳＪ２３６８蛋白質が存在すると粒子の凝集が生じるようにし、この粒子の凝集の程度を指標として可溶型ＳＪ２３６８蛋白質を測定する。
なお、この凝集法では、ラテックスや赤血球以外にも、ゼラチンやマイクロビーズ、カーボン粒子等、一般に用いられている粒子を使用することができる。また、サンドイッチ法、固相直接法または固相結合法、競合法では、標識された抗体や抗原を使用し、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ケミルミネッセンスイムノアッセイ（化学発光免疫測定法）、フルオロイムノアッセイ（蛍光免疫測定法）、時間分解蛍光免疫測定法（ＴＲ−ＦＩＡ）、イムノクロマトグラフィーアッセイ（ＩＣＡ）等の原理で測定を行なうことができる。
以下に、本発明の測定方法の好適例の１つである、ＥＩＡの原理に基づく、サンドイッチ法、固相直接法、競合法を説明する。ＥＩＡによるサンドイッチ法では、まず、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ等の酵素で標識した、可溶型ＳＪ２３６８蛋白質を認識する抗体または二次抗体を準備する。特にポリペルオキシダーゼ標識した抗体は好ましい例である。また、使用する固相には、可溶型ＳＪ２３６８蛋白質を認識する抗体を吸着させておく。サンプル（試料）もしくはスタンダードを添加後、上述の酵素標識抗体を添加し、抗原抗体反応を行なわしめる。過剰の酵素標識抗体を洗浄操作で除去した後、使用する酵素に応じた発色基質、例えばオルトフェニレンジアミンとＨ_２Ｏ_２、ｐ−ニトロフェニルリン酸、２−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド等を加えて酵素と反応させる。基質の発色は、酵素量、ひいてはサンプル中の可溶型ＳＪ２３６８蛋白質に依存するので、発色最終産物の量を測定することにより可溶型ＳＪ２３６８蛋白質を定量することができる。
固相直接法では、サンプル（試料）を直接固相に吸着させ、固相の可溶型ＳＪ２３６８蛋白質非吸着面を、その測定系には影響しないタンパク質、例えば ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）などでブロッキング処理し、次いで可溶型ＳＪ２３６８蛋白質を認識する酵素標識抗体を添加し、反応させる。以降は、サンドイッチ法と同様の操作を行ない、サンプル中の可溶型ＳＪ２３６８蛋白質の有無を判定するか定量を行う。
競合法では、使用する抗体が認識する一定量の可溶型ＳＪ２３６８蛋白質を直接固相に吸着させ、次いでブロッキング処理した後、ここに、可溶型ＳＪ２３６８蛋白質を認識する酵素標識抗体とサンプル（試料）とを添加する。一定時間反応させた後、洗浄して固相に非結合の物質を除去し、発色基質を加えて酵素と反応させる。反応後、サンプル添加による、酵素標識抗体の固相可溶型ＳＪ２３６８蛋白質への結合阻害度を測定することにより、サンプル中の可溶型ＳＪ２３６８蛋白質を定量する。
なお、はじめに抗体を固相に吸着させ、酵素標識した可溶型ＳＪ２３６８蛋白質をサンプルと同時に添加し、サンプル添加による標識物の固相化抗体への結合阻害度を測定することにより、サンプル中の可溶型ＳＪ２３６８蛋白質を定量してもよい。
上記以外の方法として、抗原抗体反応を液相中で行ない、後に、抗体を用いた凝集沈降法もしくは物理化学的な手法によって、標識抗体と結合した可溶型ＳＪ２３６８蛋白質と結合しなかった可溶型ＳＪ２３６８蛋白質を分離し定量する方法もある。また、可溶型ＳＪ２３６８蛋白質を認識する抗体を標識するのではなく、その抗体を認識する二次抗体を得、それを標識し、抗原抗体反応を行なわせて、可溶型ＳＪ２３６８蛋白質を測定することも可能である。
サンドイッチ法、固相直接法、競合法のいずれにおいても、標識酵素−発色基質の組合せを、標識酵素−生物発光基質または化学発光基質、標識酵素−蛍光基質等の組合せに変えることが可能である。この場合の、酵素−発光基質の代表的な組合せは、アルカリフォスファターゼ−ＡＭＰＰＤ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ−ルミノール、ルシフェラーゼ−ルシフェリン等があり、酵素−蛍光基質の代表的な組合せは、アルカリフォスファターゼ−ウンベリフェリルフォスフェート、ホースラディッシュペルオキシダーゼ−ｐ−ハイドロキシフェニルプロピオン酸等がある。
さらに、上記３種の測定方法において、酵素に代わって、放射性物質や化学発光物質あるいは蛍光物質で直接あるいは間接的に標識された抗体や抗原を用い、放射能や発光、蛍光の強度を測定することにより、サンプル中の可溶型ＳＪ２３６８蛋白質を測定することも可能である。
放射性物質としては、^１２５Ｉや^１３１Ｉ等が一般に使用されており、化学発光物質の代表的な物には、アクリジニウムエステル等がある。また、蛍光強度を測定する場合には、より高感度な方法として、抗体あるいは抗原にキレート剤を直接あるいは間接的に結合させ、励起光照射後にそのキレート剤に結合する希土類金属から発せられる蛍光の強度を時間分解的に測定することにより、試料中の可溶型ＳＪ２３６８蛋白質を測定する方法（時間分解蛍光免疫測定法）も有用である。なお、代表的な希土類金属の例として、ユーロピウムがあげられる。
本発明の測定方法は、以上説明したように、試料中の可溶型ＳＪ２３６８蛋白質を検出または測定することを目的としている。この場合、被験試料は動物、特にヒトの体液あるいは、組織、細胞および菌体ならびにそれらの抽出液、培養上清、塗末標本および切片があげられるが、体液であることが好ましい。より好ましくは、血液、血漿、血清、尿、髄液、リンパ液、唾液、腹水、胸水より選ばれる試料である。
本発明の測定方法を用いて健常人及び種々の疾患を有する患者の体液中の可溶型ＳＪ２３６８蛋白質を測定することができる。また、初めて体液中の可溶型ＳＪ２３６８蛋白質濃度が明らかとなり、特定の疾患において可溶型ＳＪ２３６８蛋白質濃度が変動することも明らかとなった。健常人及び種々の疾患を有する患者の体液中の可溶型ＳＪ２３６８蛋白質の濃度を比較する際には、当業者が通常用い得る統計学的手法を用いて両者の測定値に差があるか否かを判断すればよい。
なお、本発明の測定試薬及びキットは、上記した測定方法の構成等に準拠することができる。
実施例
以下の実施例により本発明を更に詳述するが、本発明はこれら実施例に限定して理解されるべきものではない。
実施例１ ヒト遺伝子ｓｊ２３６８のクローニング
（１）ヒト脾臓由来ｃＤＮＡのクローニング
ヒト脾臓由来ｃＤＮＡライブラリーの構築は、Ｏｈａｒａらの方法（ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４、ｐｐ．５３−５９（１９９７））に従った。即ち、具体的にはＮｏｔＩ部位を有するオリゴヌクレオチド（ＧＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＴＣＧＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣ（Ｔ）_１５：配列番号４）（ギブコＢＲＬ社）をプライマーとして、ヒト脾臓ｍＲＮＡ（クローンテック社）を鋳型にＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素キット（ギブコＢＲＬ社）で２本鎖ｃＤＮＡを合成した。ＳａｌＩ部位を有するアダプター（ギブコＢＲＬ社）をｃＤＮＡとライゲーションした。その後、ＮｏｔＩ消化し、１％濃度の低融点アガロース電気泳動により、３ｋｂ以上のＤＮＡ断片を精製した。
精製ｃＤＮＡ断片を、ＳａｌＩ−ＮｏｔＩ制限酵素処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋プラスミドとライゲーションした。大腸菌 ＥｌｅｃｔｒｏＭａｘ ＤＨ１０Ｂ株（ギブコＢＲＬ社）にエレクトロポーレーション法によりこの組換えプラスミドを導入した。次いで、こうして構築したｃＤＮＡライブラリーから、約１０，０００個の組換え体を選択し、これらのクローンの両末端ＤＮＡ配列を決定した。この中から、新規遺伝子を含む約１５０個のクローンのｃＤＮＡに関して全塩基配列の決定を行った。
配列決定には、株式会社島津製作所製のＤＮＡシーケンサー（ＲＩＳＡ）とＰＥアプライドバイオシステム社製反応キットを使用した。大部分の配列は、ショットガンクローンをダイターミネーター法を用いて決定した。
（２）ｃＤＮＡクローン塩基配列及びその推定蛋白質情報の解析
（１）に記載の方法で取得したプラスミドｓｊ０２３６８には、配列番号２で表される５２０個のアミノ酸からなる新規な蛋白質をコードする、配列番号１で表される１５６０塩基の塩基配列からなるオープンリーディングフレームを含む、全長４５１９塩基対の塩基配列（配列番号３）からなるｃＤＮＡが含まれていた。配列番号１で表される１５６０塩基の塩基配列からなるオープンリーディングフレームを含むプラスミドｓｊ０２３６８は、国際微生物寄託機関である独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（宛名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、２００１年９月１８日に寄託され、２００２年９月１７日にブダペスト条約に基づく寄託へ移管された（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８１８２）。
（３）ｃＤＮＡクローン及びその推定蛋白質の相同性解析とモチーフ解析
相同性の検索にはＢＬＡＳＴ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．、Ｖｏｌ．３６；２９０−３００（１９９３）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、Ｖｏｌ．２１５；４０３−１０（１９９０））を用いて、局部的な配列の一致を検索した。
配列番号２で表される蛋白質配列を、相同性検索を行うｂｌａｓｔｐプログラムを用いてＧｅｎｂａｎｋ蛋白質データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）に対しＢＬＡＳＴ相同性検索を行った。その結果、３１２残基にわたりマウスｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ（ａｌｐｈａａｎｄ ｂｅｔａ）ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ： ＮＰ＿０３４６３８）との相同性が３７％および同一性が２３％、１９０残基にわたりヒトｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２０ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ａｌｐｈａ（Ｇｅｎ Ｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ： ＮＰ＿０５５２４７）との相同性が３９％および同一性が２８％みられた。
また、重み行列を用いた膜貫通予測プログラムｔｍａｐ（Ｐｅｒｓｓｏｎ Ｂ，Ａｒｇｏｓ Ｐ．、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．、Ｖｏｌ．２３７；１８２−１９２（１９９４））により膜貫通ヘリックスの予測をおこなったところ、２２６番目から２５２番目のアミノ酸残基の２７残基において膜貫通領域が予測され、重み行列を用いたシグナルペプチド切断部位予測プログラムｓｉｇｃｌｅａｖｅ（ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ Ｇ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．、Ｖｏｌ．１４；４６８３ − ４６９０（１９８６））によりシグナルペプチの予測をおこなったところ、８番目から２０番目のアミノ酸残基の１３残基においてシグナルペプチドが予測された。
モチーフ解析により、ＳＪ２３６８の細胞外領域に、４３番、６８番、１１１番のトリプトファン（Ｗ）、７４番と８２番、１９５番と２１７番のシステイン残基のペアといったクラスＩＩサイトカイン受容体モチーフが認められた。これらの特徴は、ＩＬ−２０受容体、ＩＬ−１０受容体、インターフェロンａｌｐｈａ／ｂｅｔａ受容体にも認められる。また、細胞内領域にはＪＡＫ−ＳＴＡＴ系活性化への関与が予測される３つのチロシン残基が認められた。以上に述べたＳＪ２３６８の構造の特徴を第１図に示す。
実施例２ ＡＴＡＣ−ＰＣＲを用いた発現プロファイルの解析
Ａｄａｐｔｏｒ−ｔａｇｇｅｄ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＰＣＲ（ＡＴＡＣ−ＰＣＲ）は外部機関へ委託し、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５；４６９４−４６９６の方法に従って行った。また解析に用いたヒトＲＮＡは以下の通りである。ヒト冠状動脈血管内皮細胞（ＨＣＡＥＣ；ＴＡＫＡＲＡ社）及びヒト冠状動脈血管平滑筋細胞（ＣＡＳＭＣ；ＴＡＫＡＲＡ社）から定法によりｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、さらにｍＲＮＡを調製した。また、ヒト末梢血由来白血球を５０μｇ／ｍｌのＰＨＡ存在下あるいは非存在下で５時間培養した後にｔｏｔａｌ ＲＮＡを定法により抽出し、ｍＲＮＡを調製した。さらにヒトの肺、膵臓、心臓、副腎、精巣、胎児肝臓、胎児腎臓、脳のｍＲＮＡおよび腎臓、肝臓、小腸、胸腺、脾臓のｔｏｔａｌ ＲＮＡをＣＬＯＮＴＥＣＨ社より購入し、ｔｏｔａｌ ＲＮＡで購入したものはｍＲＮＡを調製した。大腸のｍＲＮＡはＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社より購入した。次に、これら各ｍＲＮＡ０．１２μｇよりオリゴｄＴプライマーを用いて１本鎖ｃＤＮＡの合成を定法に従って行った。逆転写酵素としてはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＲＮａｓｅ Ｈ⁻ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いた。また、ＰＣＲに用いたｓｊ２３６８特異的なプライマーの配列は５’−ＡＡＧ ＣＴＡ ＴＧＴ ＣＡＧ ＡＡＡ ＴＴＡ ＡＡＣ ＴＣ−３’（配列番号５）である。解析した結果、ｓｊ２３６８は末梢白血球、胎児肝臓、脳で強く発現し、ＨＣＡＥＣ、胎児腎臓、肝臓、ＣＡＳＭＣで弱く発現していた。
実施例３ ヒトＳＪ２３６８の発現
実施例１で得られたプラスミド、ｓｊ０２３６８より翻訳領域を含むｃＤＮＡ配列を調製し、哺乳動物細胞発現プラスミドに定法に従って挿入し、ヒトＳＪ２３６８発現プラスミドを構築する。その後、ＦｕＧＥＮＥ６（ロシュ・ダイアグノスティックス社）５０μｌを上記プラスミドＤＮＡ１２．５μｇと添付プロトコールに従い混合し、１５０ｃｍ^２フラスコにセミコンフルエントに増殖したＣＯＳ細胞に添加することによりヒトＳＪ２３６８を発現することができる。すなわち、実施例１で得られたｓｊ０２３６８を制限酵素で消化し、翻訳領域を含むｃＤＮＡ断片を調製した。このＤＮＡ断片を別途調製した哺乳動物細胞発現ベクターとライゲーションし、コンピテントセルＪＭ１０９（タカラバイオ株式会社）を形質転換した。得られたコロニーよりプラスミドを調製した後に、ｃＤＮＡ配列の確認を行い、ＳＪ２３６８発現プラスミドを得た。
実施例４ 可溶型ヒトＳＪ２３６８の発現
抗体作製用の投与抗原として用いるため、ヒトＳＪ２３６８の細胞外ドメインとヒスチジンタグあるいはヒトＩｇＧ Ｆｃフラグメントとのキメラ（融合）蛋白質を生産した。ヒトＳＪ２３６８の細胞外ドメインとヒスチジンタグのキメラ蛋白質であるヒトＳＪ２３６８−Ｈｉｓの発現プラスミドは以下の方法にて構築した。即ち、センスプライマー１（５’−ＣＣＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＡＧ ＧＡＡ ＧＧＣ ＣＡＴ ＧＧＣ ＧＧＧ ＧＣＣ ＣＧＡ Ｇ−３’：配列番号６）とアンチセンスプライマー１（５’−ＣＧＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＧＣ ＴＴＣ ＴＧＧ ＧＡＣ ＣＴＣ ＣＡＧ ＣＡＡ ＧＡＡ−３’：配列番号７）を合成し、実施例１で取得したプラスミドｓｊ０２３６８を鋳型にＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ）により９８℃で１０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分のサイクルを３０回繰り返し、ＰＣＲ反応を行った。得られた約０．７ｋｂのＰＣＲ産物をＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩにて消化し、アガロースゲル電気泳動にてＤＮＡ断片を回収した。またｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（−）ＡをＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩにて消化し、前述のＤＮＡ断片をライゲーションした。コンピテントセルＪＭ１０９を形質転換して定法に従いヒトＳＪ２３６８−Ｈｉｓ発現プラスミドを調製した。ヒトＳＪ２３６８の細胞外ドメインとヒトＩｇＧ Ｆｃフラグメントのキメラ蛋白質であるヒトＳＪ２３６８−Ｆｃの発現プラスミドは以下の方法で構築した。センスプライマー２（５’−ＣＣＧ ＧＡＡ ＴＴＣ ＡＧＧ ＡＡＧ ＧＣＣ ＡＴＧ ＧＣＧ ＧＧＧ ＣＣＣ ＧＡＧ Ｃ−３’：配列番号８）を合成し、アンチセンスプライマー１を用い、ｓｊ０２３６８を鋳型にＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ）により９８℃で１０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分のサイクルを３０回繰り返し、ＰＣＲ反応を行った。得られた約０．７ｋｂのＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩにて消化し、アガロースゲル電気泳動にてＤＮＡ断片を回収した。
また再公表ＷＯ９７／４２３１９に記載のＰＭ１３０４をＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩにて消化した後に、約７．１ｋｂの断片を回収した。次にｐＭ１３０４をＢａｍＨＩとＫｐｎＩにてダブルダイジェスチョンして、０．７ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。これら２種のＤＮＡ断片と、前述のＤＮＡ断片をライゲーションした。コンピテントセルＪＭ１０９を形質転換して定法に従いヒトＳＪ２３６８−Ｆｃ発現プラスミドを調製した。この構築で得られるヒトＳＪ２３６８−Ｆｃ蛋白質のアミノ酸配列は配列番号１９に示すとおりである。得られた発現プラスミドは、以下の方法でＣＯＳ細胞に導入した。即ち、ＦｕＧＥＮＥ６（ロシュ・ダイアグノスティックス社）５０μｌと上記各プラスミドＤＮＡ１２．５μｇとを添付プロトコールに従い混合し、１５０ｃｍ^２フラスコにセミコンフルエントに増殖したＣＯＳ細胞に添加した。５％ＣＯ_２存在下、３７℃で３日間培養した後に培養上清を回収した。培養上清中に含まれるヒトＳＪ２３６８−Ｈｉｓ及びヒトＳＪ２３６８−ＦｃをＳＤＳ−ＰＡＧＥ実施後、抗ヒスチジンタグ抗体（Ｐｅｎｔａ・Ｈｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｙ；ＱＩＡＧＥＮおよびペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体；ＤＡＫＯ）あるいは抗Ｆｃ抗体（パーオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＡ，ＩｇＧ，ＩｇＭ，Ｋａｐｐａ，Ｌａｍｂｄａ抗体；ＤＡＫＯ）を用いてウエスタンブロッティングにて検出を行った（第３図）。ヒトＳＪ２３６８−Ｈｉｓ及びヒトＳＪ２３６８−Ｆｃが培養上清中に発現されていることが確認された。
さらにヒトＳＪ２３６８−Ｈｉｓはニッケルカラムを用いて培養上清より精製し、ヒトＳＪ２３６８−ＦｃはＰｒｏｔｅｉｎＡカラムを用いて精製した。
実施例５ 抗ＳＪ２３６８抗体の作製
（１）ＳＪ２３６８の部分ペプチドの調製
ＳＪ２３６８に対する抗体を作製するため、ＳＪ２３６８の細胞外ドメインのＮ末端及びＣ末端の配列あるいはＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ及びＲｏｂｓｏｎの２次構造予測プログラムを用いて解析を行い、親水性が高く構造的にはαヘリックスを含むなどタンパク表面に露出しているであろう配列を選び出し、合成を行う。ペプチドの合成はＭｏｄｅｌ ４３３Ａペプチドシンセサイザー（アプライドバイオシステムズ ジャパン株式会社）を用いて、キャリア蛋白と結合できるようにするため、Ｃ端にシステインを付加し合成する。定法により樹脂よりペプチドの切り出し脱保護を行い、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣ（ＣＡＰＤＥＬＬ−ＰＡＫ、資生堂）を用いて精製を行う。
（２）ＳＪ２３６８のペプチド免疫抗原の調製
合成したペプチドを蒸留水で１０ｍｇ／ｍｌに溶解し、１０ｍｇ／ｍｌのマレイミド化キーホールリンペットヘモシアニン（ＰＩＥＲＣＥ）と等量混合を行う。室温で２時間反応後、ＮＡＰ−１０カラム（アマシャム ファルマシアバイオテク）で脱塩する。蛋白濃度は使用したＫＬＨ量を液量で割ったものを用い、算出する。
（３）ＳＪ２３６８抗体の作製
（３−１）ポリクローナル抗体の作製
ＳＪ２３６８に対するウサギポリクローナル抗体を作製するため、調製した各ペプチド抗原をそれぞれ各４０μｇずつ混合し、０．５ｍｌとする。その後、等量のフロインド完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）と混合し、ウサギの背部皮下に投与を行う。２週間後、同量をフロインド不完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）と混合したものを投与し、２週間後耳静脈より採血し抗血清を調製する。同様に実施例４で産生および精製したＳＪ２３６８−Ｆｃを３０μｇ／ｂｏｄｙで投与し、抗血清を作製する。
（３−２）ペプチド抗体の作製
調製した各ペプチドキャリア抗原２０μｇを１００μｌの生理食塩水に溶解し、フロインド完全アジュバントと等量混合を行う。ＢＡＬＢ／ｃマウス５週齢メスの腹腔に投与し、２週間後ペプチドキャリア抗原２０μｇを１００μｌの生理食塩水に溶解し、フロインド不完全アジュバントと等量混合し同様に腹腔に投与する。１週間後眼底より採血を行い、抗体価の上昇をウエスタンブロッティングにより確認する。すなわち組換えＳＪ２３６８蛋白質を４−２０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ＴＥＦＣＯ）にて電気泳動し、ミリポア社の方法にしたがってＰＶＤＦ膜に転写する。転写後５％スキンミルク、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．０７６Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．４）（以下Ｔ−ＰＢＳと記載）にてブロッキングを行う。採血した抗血清を０．５％ＢＳＡを含むＴ−ＰＢＳで５００倍に希釈し、転写したＰＶＤＦ膜と４℃で一夜反応させる。メンブレンをＴ−ＰＢＳで３回洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（ＤＡＫＯ）を０．５％ＢＳＡを含むＴ−ＰＢＳで５００倍に希釈し、メンブレンと室温で１時間反応させる。その後、メンブレンをＴ−ＰＢＳで３回洗浄後、ＥＣＬ（アマシャム ファルマシアバイオテク）で検出する。以上の操作で抗体価の上昇を確認し、抗原の最終投与３日後、脾細胞よりリンパ球を分離し、Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ１５８１）と混合後、ポリエチレングリコールを用いて安東民衛・千葉丈／著「単クローン抗体実験操作入門」（講談社）にしたがって細胞融合を行う。ＨＡＴ培地によりハイブリドーマを選択し、１週間後に目的の抗体を産生しているハイブリドーマのスクリーニングを行う。
０．０１Ｍ炭緩衝液（ｐＨ９．５）を用い、実施例４で生産及び精製するＳＪ２３６８−Ｈｉｓを１μｇ／ｍｌに希釈し、イムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ、ＮＵＮＣ）に５０μｌ／ウエル添加する。３７℃で１時間反応後、イオン交換水で５回洗浄し、０．５％ＢＳＡを含む０．０７６Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．４）（以下ＰＢＳと記載）を各ウエルに１００μｌ添加し、ブロッキングを行う。次に培養上清を各ウエルに添加し、３７℃で１時間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で３回洗浄する。ペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体を１０％ウサギ血清を含むＰＢＳで１０００倍に希釈し各ウエルに５０μｌ添加した。３７℃で１時間反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で５回洗浄し０．０１％過酸化水素を含むテトラメチルベンジジン溶液を各ウエルに添加する。室温で１０分間反応後、０．５Ｍ硫酸溶液で反応を停止する。プレート分光光度計（ＮＪ−２１００、日本インターメッド）で４５０ｎｍの吸光度を測定する。この結果をもとに、ＳＪ２３６８と反応する細胞を選択し、限界希釈法によりクローニングを行う。１０日後、同様にスクリーニングを行い、ＳＪ２３６８と反応する抗体を産生するクローンを取得することができる。選択したハイブリドーマは１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養後、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養し抗体を産生させ、Ｐｒｏｓｅｐ−Ａカラム（ミリポア）を用いて抗体を精製する。
（３−３）抗ＳＪ２３６８モノクローナル抗体の作製
ＢＡＬＢ／ｃマウス（メス、６週令）の腹腔に精製したＳＪ２３６８−Ｆｃ蛋白質２０μｇをフロインド完全アジュバントと等量混合して投与する。初回投与２週間後に抗原２０μｇを生理食塩水に溶解し、フロインド不完全アジュバントと等量混合後腹腔に投与する。さらに１週間後、抗体価の上昇を上記（３−２）記載の方法により確認し、最終投与を行う。マウスの腹腔に抗原１００μｇを投与し、３日後、脾臓を摘出する。脾臓よりリンパ球を分離し、Ｐ３×６３−Ａｇ．８．Ｕ・１と１０：１で混合し、ポリエチレングリコールを用いて細胞融合を行う。ＨＡＴ培地によりハイブリドーマを選択し、１週間後目的の抗体を産生しているハイブリドーマのスクリーニングを行う。（３−２）に記載の方法により抗ＳＪ２３６８抗体産生ウエルのスクリーニングを行い、ＳＪ２３６８−Ｈｉｓと反応したウエルを限界希釈法によりクローニングし、再度スクリーニングを行って抗ＳＪ２３６８モノクローナル抗体を取得することができる。
ハイブリドーマを１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養後、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養し、抗体を産生させ、Ｐｒｏｓｅｐ−Ａカラム（ミリポア）を用いて抗体を精製する。
実施例６ ＳＪ２３６８の活性測定
ＳＪ２３６８の生物活性は以下に示す活性測定系によって観察できる。これらの方法は、ＳＪ２３６８を介して細胞内にシグナル伝達を惹起するＩＬ−１０ファミリーその他の物質の探索・同定に有用であるのみならず、ＳＪ２３６８の生物活性を阻害する物質、例えば中和抗体などの、医薬品候補物質の発見にも有用である。
（１）ルシフェラーゼアッセイ
ＩＬ−１０ファミリーに属するサイトカインとＳＪ２３６８の結合に基づく活性測定は、例えばＬａｕｒｅらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、Ｖｏｌ．９７、１０１４４−１０１４９（２０００））のように、適当な細胞を用いた活性化ＳＴＡＴ類に反応するリポータージーンアッセイで検討できる。用いる細胞は、ＳＪ２３６８を発現している培養細胞、ＨｅｐＧ２やＨＥＫ２９３が良い。あるいはｓｊ２３６８遺伝子を適当な方法で遺伝子導入した細胞であっても良い。サイミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターでコントロールされたホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流に、５コピーのＧＲＲ配列を含む遺伝子コンストラクトを作製し（ｐＧＲＲ５リポーター）、内部標準として、ＴＫプロモーターでコントロールされたウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を含むｐＲＬ−ＴＫベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いる。この１５μｇのｐＧＲＲ５リポーターと１μｇのｐＲＬ−ＴＫを、１０^６個のＨｅｐＧ２細胞に、７４Ω、１２００μＦにて遺伝子導入する。この細胞を２４ウェルプレートの各ウェルに４２０００細胞ずつ播種し、１時間後に目的のＩＬ−１０ファミリーないしＩＬ−１０ファミリーを含む培養上清を添加する。２時間後、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔを用いて、ルシフェラーゼ活性の上昇を観察する。対照の試験として、ヒトＩＬ−６３００Ｕ／ｍｌ添加時の活性上昇と抗ＩＬ−６中和抗体や抗ｇｐ１３０中和抗体によるＩＬ−６活性の上昇阻害を同時に実施することが望ましい。なお、ＳＪ２３６８を介して細胞内にシグナル伝達を惹起するための精製サイトカインの代わりとして、サイトカイン遺伝子を導入した細胞の培養上清、腫瘍細胞の培養上清、エンドトキシンで活性化した末梢血白血球の培養上清などを用いる場合は、陰性対照としてサイトカイン遺伝子導入に用いたベクターのみを導入した細胞の培養上清（ｍｏｃｋ）や非刺激時の培養上清には活性が無いことを確認することが望ましい。ＳＪ２３６８を介した特異的な作用であることの確認は、ＳＪ２３６８−Ｆｃによる中和実験や、ＨｅｐＧ２細胞にＳＪ２３６８の細胞内チロシン残基をアラニンに変換したドミナントネガティブ体を導入する中和実験によって実施することが出来る。
（２）ゲルシフトアッセイ
ＳＪ２３６８がいずれのＳＴＡＴ類を活性化するかは、ゲルシフトアッセイにて検討できる（Ｄｅｍｏｕｌｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．１６，Ｐ４７１０−４７１６、１９９６）。即ち、ＳＪ２３６８を介して細胞内にシグナル伝達を惹起した細胞の核抽出物を調製し、Ｆｃ受容体Ｉのγ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｒｅｇｉｏｎ（ＧＲＲ）に対応する^３２Ｐ標識オリゴＤＮＡ（５’−ＡＴＧＴＡＴＴＴＣＣＣＡＧＡＡＡ−３’：配列番号１０と５’−ＣＣＴＴＴＴＣＴＧＧＧＡＡＡＴＡＣ−３’：配列番号９とからなる二本鎖ＤＮＡ）との結合を観察する。電気泳動上のスーパーシフトを抗ＳＴＡＴ１抗体、抗ＳＴＡＴ３抗体などを０．７５〜１μｇ／レーン添加により観察し、オリゴＤＮＡと結合するＳＴＡＴ類を同定することが出来る。
（３）（１）および（２）の試験に用い得るＩＬ−１０ファミリーの調製法
既に遺伝子が同定されているＩＬ−１０ファミリーは、上記１に述べたようにサイトカインそのもの、またはＦＬＡＧタグ、Ｆｃフラグメント、ヘキサヒスチジンタグなどの融合蛋白質として、適当な細胞に遺伝子導入して発現、精製する事が出来る。この他に、ＩＬ−１９は末梢血単球をエンドトキシンないし顆粒球・単球コロニー刺激因子で４〜２４時間刺激した培養上清中に得られる（Ｇａｌｌａｇｈｅｒら、Ｇｅｎｅｓ Ｉｍｍｕｎ．Ｖｏｌ．７、Ｐ４４２−４５０、（２０００））。また、ＩＬ−ＴＩＦは末梢血Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体とコンカナバリンＡで６〜２４時間刺激した培養上清、或いはＩＬ−９で６〜２４時間刺激で刺激した培養上清中に得られる（Ｘｉｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２７５、Ｎｏ．４０、Ｐ３１３３５−３１３３９、（２０００））。
実施例７ マウスｓｊ２３６８遺伝子のクローニング
（１）５’側配列のｉｎ ｓｉｌｉｃｏクローニング
相同性検索プログラムｓｉｍ４を用いて、ヒトｓｊ２３６８遺伝子のｃＤＮＡ配列（配列番号３）のヒトゲノム（データソースは以下を利用：ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ／ｇｅｎｏｍｅｓ／Ｈ−ｓａｐｉｅｎｓ／ｈｓ＿ｐｈａｓｅ ^＊ ．ｆｎａ．ｇｚ、但し＊は０、１、２または３）に対するマッピングを行った。その結果、第４図に示すように、ヒトｓｊ２３６８遺伝子は７つのエクソンによって構成されていた。このゲノム構造はＩＬ１０Ｒファミリーの遺伝子と同様の構造であった（一例としてＩＬ１０Ｒα鎖のゲノム構造を第５図に示す）。次に、マウスホモログ遺伝子を得るために、ヒトｓｊ２３６８遺伝子のｃＤＮＡ配列（配列番号３）をマウスゲノム配列（データソースは以下を利用：ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂ／ＴｒａｃｅＤＢ／ｍｕｓ＿ｍｕｓｃｕｌｕｓ／）に対してＢＬＡＳＴ検索を行った。その結果、局所に高い相同性を持つ配列が多数確認されたが、得られた配列について詳細に解析した結果、リピート配列が確認され、擬陽性の可能性が考えられた。このリピート配列はｓｊ２３６８の３’非翻訳領域である３８００−４１００ｂｐ付近に当たるため、この領域をマスクして、再度マウスゲノム配列を検索した。その結果、Ｇ１０Ｐ６４２１１５ＲＥ８．Ｔ０とＧ１０Ｐ６２５４１１ＲＢ５．Ｔ０の２つのホールショットガンシーケンス（ＷＧＳ）が検出された。これらの配列はそれぞれエクソン４、エクソン５の領域に相当していたが、他のエクソン領域の配列を得るために、これらのマウスエクソン配列を問い合わせ配列としてマウスＥＳＴデータベース（データソースは以下を利用：ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｄｂ／ｅｓｔ＿ｍｏｕｓｅ．Ｚ）を検索した。その結果、１番目のエクソンから５番目のエクソンまでをカバーするＢＩ１０４５９３が検出された（ヒトｓｊ２３６８ゲノム配列とマウスゲノムおよびＥＳＴ配列の位置関係を第６図にまとめる）。
（２）５’側配列のＲＴ−ＰＣＲクローニング
実施例７（１）の結果をもとに、ＰＣＲプライマーを設計してマウスｓｊ２３６８の５’側ｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲクローニングした。即ち、センスプライマーｍＳ１（５’−ＧＧＣ ＣＣＣ ＡＧＧ ＡＴＣ ＧＡＡ ＡＴＧ ＴＧ−３’）及びアンチセンスプライマーｍＡ１（５’−ＣＴＧ ＧＡＧ ＣＣＴ ＣＴＡ ＧＧＡ ＡＧＡ ＴＧ−３’）を設計し、ＢＡＬＢ／ｃマウスの肝臓由来のｔｏｔａｌ ＲＮＡを鋳型にＲＴ−ＰＣＲを行った。さらにアンチセンスプライマーｍＡ２（５’−ＣＡＧ ＣＴＧ ＧＧＣ ＴＣＡ ＧＡＧ ＡＡＣ ＴＧ−３’）を設計し、上記ＲＴ−ＰＣＲ産物を鋳型に、ｍＳ１とｍＡ２をプライマーとして再度ＰＣＲを行った。得られた約０．７ｋｂの断片をアガロース電気泳動によって回収した後、ＤＮＡ断片の５’末端をリン酸化し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）のＥｃｏＲＶに挿入し、マウスｓｊ２３６８の５’側ｃＤＮＡ配列を持つプラスミド（Ｎｏ．３−１／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋）を得た。得られたプラスミドには配列番号１１に示す６６１ｂｐのマウスｃＤＮＡが含まれていた。
（３）３’側配列ｉｎ ｓｉｌｉｃｏクローニング
マウスｓｊ２３６８遺伝子の３’側をクローニングするために、ヒトｓｊ２３６８のエクソン６から翻訳停止コドン付近までの約３．８ｋｂの配列を用い、再度マウスゲノム配列及びマウスＥＳＴ配列をＢＬＡＳＴ検索した。その結果、マウスゲノム（Ｍｓｅ４００９５−３４７ｆ０４．ｑ１ｃ、ｊｔｘ０６ｈ０８．ｂ１、Ｇ１０Ｐ６６５１９３ＦＦ５．Ｔ０）、マウスＥＳＴ（ＢＩ６５７６６８及びＢＢ７１６５３７）で高い相同性が確認され、マウスｓｊ２３６８遺伝子の３’端側がクローニングされた（ヒトｓｊ２３６８ゲノム配列と検出されたマウスゲノムおよびＥＳＴ配列の位置関係を第７図にまとめる）。
（４）３’側配列のＲＴ−ＰＣＲクローニング
実施例７（３）の結果をもとに、ＰＣＲプライマーを設計してマウスｓｊ２３６８の３’側ｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲクローニングした。即ち、終止コドン配列を含むアンチセンスプライマーｍＡ４（５’−ＣＣＧ ＧＣＣ ＡＧＣ ＴＣＡ ＣＣＴ ＧＡＣ ＣＡ−３’）を設計し、実施例７（１）記載のセンスプライマーｍＳ１を用いて、ＢＡＬＢ／ｃマウスの肝臓由来のｔｏｔａｌ ＲＮＡを鋳型にＲＴ−ＰＣＲを行った。さらにセンスプライマーｍＳ３（５’−ＣＡＧ ＴＴＣ ＴＣＴ ＧＡＧ ＣＣＣ ＡＧＣ ＴＧ−３’）、センスプライマーｍＳ５（５’−ＡＴＧ ＣＣＧ ＴＣＧ ＣＴＧ ＧＡＡ ＣＴＧ ＡＡ−３’）及びアンチセンスプライマーｍＡ５（５’−ＴＣＡ ＣＣＴ ＧＡＣ ＣＡＡ ＧＴＡ ＡＴＣ ＴＣ−３’）を設計し、上記ＲＴ−ＰＣＲ産物を鋳型に、ｍＳ３／ｍＡ５あるいはｍＳ５／ｍＡ５のプライマーセットでＰＣＲを行った。得られた約約１．０ｋｂあるいは約１．２ｋｂの断片をアガロース電気泳動によって回収し、ＤＮＡ断片の５’末端をリン酸化した後に、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）のＥｃｏＲＶに挿入し、クローン化した（それぞれＳ３＃２／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋あるいはＳ５＃１／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋）。得られたクローンは配列番号１２あるいは１３に示す９８１ｂｐあるいは１１６１ｂｐのマウスｃＤＮＡを含んでいた。また、Ｓ３＃２／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋とＳ５＃１／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋の塩基配列を比較した結果、Ｓ５＃１／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋ではＳ３＃２／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋の配列番号１２における４１番目から９１番目までの５１塩基が欠失していた。以上の結果及び実施例７（２）の結果よりマウスｓｊ２３６８のｃＤＮＡ配列は、配列番号１４で示される５３５アミノ酸をコードする配列番号１５で示される１６０５ｂｐのオープンリーディングフレームを含む、配列番号１６で示される全長１６２２ｂｐよりなることがわかった。ヒトＳＪ２３６８とマウスＳＪ２３６８の間の相同性はＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ：Ｍａｘｉｍｕｍ Ｍａｔｃｈｉｎｇによって調べた結果、約５９％の同一性であった（配列比較は第８図参照）。
（５）マウスｓｊ２３６８のゲノム構造
実施例７（４）でクローニングしたマウスｓｊ２３６８のゲノム構造を調べた。即ち、マウスｓｊ２３６８のｃＤＮＡ配列（配列番号１６）を用い、ｓｉｍ４によってマウスゲノム配列（データソースは以下を利用：ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／ｐｕｂ／ａｓｓｅｍｂｌｙ／ｍｏｕｓｅ／）に対してマッピングを行った。その結果、マウスｓｊ２３６８遺伝子は７つのエクソンより構成されていていることが明らかになった。また、ヒトｓｊ２３６８のゲノム構造に比べると、イントロンの長さがやや異なるが、エクソンの大きさや数及びその構造においてヒトとマウス間で非常に良く似ていた（第９図）。また、エクソンの繋ぎ目を第８図に示すが、実施例７（４）で得られた５１ｂｐ欠失体は、イントロン５の３’末端が５１ｂｐ下流にずれて認識されているために生じるａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇであることが確認できた。また、この欠失領域は膜貫通ドメインをコードしている領域であるため、ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｖａｒｉａｎｔ蛋白質は細胞外に分泌される可能性が考えられた。このｓｐｌｉｃｉｎｇ ｖａｒｉａｎｔ蛋白質（マウスＳＪ２３６８ｄｅｌ）のアミノ酸配列を配列番号１８に示す。
（６）マウスＳＪ２３６８発現プラスミドの構築
マウスＳＪ２３６８ｄｅｌ発現プラスミドは以下の方法で構築した。即ち、Ｎｏ．３−１／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋をＥｃｏＲＩ消化し、約０．５ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。また、Ｓ５＃１／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋をＥｃｏＲＩ消化し、約４．１ｋｂのＤＮＡ断片を回収した後に、５’末端を脱リン酸化処理し、先の約０．５ｋｂ断片を挿入した。得られたプラスミドをＥｃｏＲＩとＳｐｈＩあるいはＳｐｈＩとＫｐｎＩでそれぞれｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎして、約０．５ｋｂあるいは約１．２ｋｂのＤＮＡ断片を回収し、哺乳細胞発現ベクターのＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩサイトに３−ｗａｙ ｌｉｇａｔｉｏｎによって挿入した。
また、マウスＳＪ２３６８全長発現プラスミドは以下の方法で構築した。まず、センスプライマーｍＳ６（５’−ＧＴＴ ＣＡＡ ＡＧＧ ＡＣＧ ＡＧＴ ＡＣＡ ＧＧ−３’）、センスプライマーｍＳ７（５’−ＣＴＣ ＴＧＡ ＧＣＣ ＣＡＧ ＣＴＧ ＣＡＴ ＣＴＴ ＣＣＴ ＡＧＡ ＧＧＣ−３’）、アンチセンスプライマーｍＡ８（５’−ＧＣＣ ＴＣＴ ＡＧＧ ＡＡＧ ＡＴＧ ＣＡＧ ＣＴＧ ＧＧＣ ＴＣＡ ＧＡＧ−３’）及びアンチセンスプライマーｍＡ１０（５’−ＴＧＴ ＣＡＣ ＣＧＴ ＣＧＴ ＣＡＴ ＣＧＴ ＡＧ−３’）を設計した。次にＮｏ．３−１／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋を鋳型に、ｍＳ１／ｍＡ８のプライマーセットでＰＣＲを行い、約０．７ｋｂの増幅断片を回収した。一方、Ｓ３＃２／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋を鋳型にｍＳ７／ｍＡ５のプライマーセットで同様にＰＣＲを行い、約１．０ｋｂの増幅断片を回収した。さらに、これら２種の増幅断片のｍｉｘｔｕｒｅを鋳型として、ｍＳ６／ｍＡ１０プライマーセットでＰＣＲを行い、約０．７ｋｂの増幅断片を得た。この断片をＳｐｈＩとＳｃａＩでダブルダイジェスチョンし、約０．５ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。また、ｐＣＧｍｓｊ２３６８（ｄｅｌ）をＳｐｈＩとＰｓｔＩあるいはＳｃａＩとＰｓｔでそれぞれダブルダイジェスチョンし、約４．７ｋｂあるいは約１．２ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。次にこれら２種のＤＮＡ断片と、ＰＣＲ増幅断片を酵素消化して得られた約０．５ｋｂの断片を３−ｗａｙ ｌｉｇａｔｉｏｎして、ｍｓｊ２３６８全長発現プラスミドｐＣＧｍｓｊ２３６８を得た。このプラスミドは国際微生物寄託機関である独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（宛名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、２００２年７月９日に寄託され、２００２年９月２５日にブダペスト条約に基づく寄託へ移管された（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８１９５）。
実施例８ 可溶型マウスＳＪ２３６８の発現
マウスＳＪ２３６８の細胞外ドメインとヒトＩｇＧ Ｆｃフラグメントとのキメラ（融合）蛋白質を生産した。マウスＳＪ２３６８の細胞外ドメインとヒトＩｇＧ Ｆｃフラグメントのキメラ蛋白質であるマウスＳＪ２３６８−Ｆｃ（アミノ酸配列を配列番号１７に示す）の発現プラスミドは以下の方法で構築した。アンチセンスプライマーｍＡ９Ｂ（５’−ＣＧＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＴＣ ＣＣＣ ＴＧＧ ＡＧＣ ＣＴＣ ＴＡＧ ＧＡＡ−３’）を合成し、センスプライマーｍＳ１を用い、Ｓ５＃１／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋を鋳型にＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより９８℃で１０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分のサイクルを２５回繰り返し、ＰＣＲ反応を行った。得られた約０．７ｋｂのＰＣＲ産物をＢａｍＨＩにて消化し、５’末端をリン酸化した後に、アガロースゲル電気泳動にてＤＮＡ断片を回収した（ＤＮＡ断片Ａ）。また、再公表ＷＯ９７／４２３１９に記載のｐＭ１３０４をＥｃｏＲＩで消化した後に、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔを用いて末端平滑化した。さらに、ＫｐｎＩにて消化した後に、約７．０ｋｂの断片を回収した（ＤＮＡ断片Ｂ）。次にｐＭ１３０４をＢａｍＨＩとＫｐｎＩにてダブルダイジェスチョンして、約０．７ｋｂのＤＮＡ断片を回収した（ＤＮＡ断片Ｃ）。これら３種（ＤＮＡ断片Ａ、Ｂ及びＣ）を３−ｗａｙ ｌｉｇａｔｉｏｎし、コンピテントセルＪＭ１０９を形質転換して定法に従いマウスＳＪ２３６８−Ｆｃ発現プラスミドを調製した。得られた発現プラスミドは、以下の方法でＣＯＳ細胞に導入した。即ち、ＦｕＧＥＮＥ６ ５０μｌと上記マウスＳＪ２３６８−Ｆｃ発現プラスミド１２．５μｇとを添付プロトコールに従い混合し、１５０ｃｍ^２フラスコにセミコンフルエントに増殖したＣＯＳ細胞に添加した。５％ＣＯ_２存在下、３７℃で３日間培養した後に培養上清を回収した。培養上清中に含まれるＭＳＪ２３６８−ＦｃをＳＤＳ−ＰＡＧＥ実施後、抗ヒトＦｃ抗体（パーオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＡ，ＩｇＧ，ＩｇＭ，Ｋａｐｐａ，Ｌａｍｂｄａ抗体；ＤＡＫＯ）を用いてウエスタンブロッティングにて検出を行った（第１０図）。培養上清中にマウスＳＪ２３６８−Ｆｃが発現されていることが確認された。
つづいてマウスＳＪ２３６８−Ｆｃの大量調製を行った。セルファクトリー１０（Ｎｕｎｃ）にセミコンフルエントにＣＯＳ細胞を増殖させ、ＦｕＧＥＮＥ６を用いて上述のマウスＳＪ２３６８−Ｆｃ発現プラスミドを導入した。３日間培養を続けた後に培養上清を回収し、上清中に発現されるマウスＳＪ２３６８−ＦｃをＨｉＴｒａｐ ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＦＦ ｃｏｌｕｍｎｓ（アマシャム バイオサイエンス株式会社）を用いて精製した。
実施例９ ヒトｓｊ２３６８スプライシングバリアントの検索
実施例７−（４）に記載した通り、マウスｓｊ２３６８においては、膜貫通ドメインをコードする５１ｂｐを欠失したスプライシングバリアントがクローニングされた。ヒトｓｊ２３６８についてスプライシングバリアントが存在するか確認した。即ち、実施例２でｓｊ２３６８の発現が確認された、肝臓、脳、ＰＢＬ、胎児肝及び胎児腎由来のｃＤＮＡ（Ｈｕｍａｎ ＭＴＣ Ｐａｎｅｌ Ｉ及びＩＩ、Ｈｕｍａｎ Ｆｅｔａｌ ＭＴＣ Ｐａｎｅｌ；クローンテックカンパニー）を鋳型にＰＣＲを行った。まず、アンチセンスプライマー２（５’−ＣＧＧ ＧＧＴ ＡＣＣ ＴＴＧ ＣＡＡ ＡＧＧ ＣＡＧ ＣＡＧ ＣＡＧ−３’）を設計し、実施例４に記載のセンスプライマー１を用いてｐｌａｔｉｎｕｍ ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によりＰＣＲ反応を行った。反応条件は９４℃で２分加温して反応を開始した後に、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分のサイクルを３５回繰り返した。さらにセンスプライマー３（５’−ＣＣＴ ＧＣＴ ＧＣＡ ＧＧＣ ＣＧＣ ＴＣＣ ＡＧ−３’）及びアンチセンスプライマー３（５’−ＧＣＡ ＴＣＧ ＣＴＧ ＴＣＣ ＴＣＡ ＡＴＴ ＴＣ−３’）を設計し、上記ＰＣＲ反応液を鋳型に同条件でＰＣＲを行った。得られた約１．４ｋｂのフラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）に組み込み、その配列を確認した。その結果、ｓｊ２３６８と同一の配列を示すクローンの他に、▲１▼ｅｘｏｎ２が欠失したクローン、▲２▼ｅｘｏｎ６が欠失したクローン、▲３▼ｅｘｏｎ２と６の両方が欠失したクローンの３種のスプライシングバリアントが確認された。これらのスプライシングバリアントではアミノ酸翻訳においてフレームシフトが生じており、▲１▼及び▲３▼のバリアントでは配列番号２１で表されるポリペプチドがコードされていた。しかしながら、このポリペプチドはＳＪ２３６８のＮ端側の配列を約２０残基しか持たず、しかもこの領域はシグナル配列に相当するため、機能ある蛋白質としては発現していないと考えられた。一方、▲２▼のバリアントでは配列番号２０で表されるポリペプチドがコードされており、ＳＪ２３６８の細胞外ドメインは維持されている。また、膜貫通ドメインが欠失しているため、可溶型の蛋白質として発現し、ＳＪ２３６８とリガンド分子の結合に対し、競合している可能性が考えられた。スプライシングバリアント▲２▼を制限酵素ＳｐｈＩとＸｈｏＩでｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎし、ｅｘｏｎ６欠失部を含む約３４０ｂｐのＤＮＡ断片を調製した。また、実施例３で構築したＳＪ２３６８発現プラスミドを制限酵素ＳｐｈＩとＸｈｏＩで同様にｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎし、先のＤＮＡ断片をライゲーションした。即ち、ｅｘｏｎ６配列を含む約４７０ｂｐの断片とバリアント由来の約３４０ｂｐのＤＮＡ断片とを入れ換えることで、ヒトＳＪ２３６８バリアント発現プラスミドの構築を行った。ライゲーション反応液はコンピテントセルＪＭ１０９にトランスフォーメーションした後、定法に従ってプラスミドを調製した。
実施例１０ 可溶型ＳＪ２３６８の生理活性
（１）混合リンパ球反応（ＭＬＲ）に対する影響
可溶型ＳＪ２３６８の生理活性を調べる目的で、マウスＳＪ２３６８−Ｆｃを用いてＭＬＲに対する影響を調べた。ＢＡＬＢ／Ｃマウス及びＣ５７ＢＬ／６マウス（７−９週齢オス）より脾臓を摘出し、脾細胞をそれぞれ調製した。各脾細胞を等量混合し、９６ｗｅｌｌ−ｐｌａｔｅへ０．６×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、マウスＳＪ２３６８−Ｆｃの存在下あるいは非存在下で３７℃、５％ＣＯ_２、４日間培養した。コントロールとして、他のＩ型膜貫通蛋白分子の細胞外ドメインとヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインとのキメラ蛋白（ＣＯＮＴ−Ｆｃ）あるいはヒトＩｇＧ１蛋白存在下で同様に培養した。ＢｒｄＵ（Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡ，ＢｒｄＵ（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ）；ロシュ・ダイアグノスティックス社）を添加し、さらに４時間培養した後に、添付書に従いＢｒｄＵの取り込み量（すなわち細胞増殖の割合）を測定した。その結果、第１１図に示す通り、ＳＪ２３６８−Ｆｃ存在下では濃度依存的に抑制効果が確認された。一方、ＣＯＮＴ−ＦｃやヒトＩｇＧ１では抑制効果が全く見られず、マウスＳＪ２３６８−ＦｃはマウスＭＬＲに対し特異的に増殖抑制を示した。
（２）Ｔｈ１／Ｔｈ２分化に対する影響
マウスＳＪ２３６８−Ｆｃのｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔｈ１／Ｔｈ２分化系における効果を調べた。
（２−１）細胞刺激用抗体プレートの作製
抗マウスＣＤ３抗体（１４５−２Ｃ１１；ファーミンジェン）をＰＢＳで５μｇ／ｍｌに希釈した抗体溶液０．２ｍｌを４８ｗｅｌｌプレートの各ｗｅｌｌに添加し、４℃で一晩インキュベーションし、抗体をプレート上に固相化した。プレートは使用直前にＰＢＳで２回、培地（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５０μＭ ２−ＭＥ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０）で１回洗浄後、０．３５ｍｌ／ｗｅｌｌの培地を加え平衡化した。
（２−２）ナイーブＴ細胞の調製および刺激
ナイーブＴ細胞はＣ５７ＢＬ／６マウスから磁気標識細胞分離法により取得した。すなわち、Ｃ５７ＢＬ／６マウス１２匹より脾臓を摘出し、脾細胞をＰＲＭＩ１６４０ ３０ｍｌへ懸濁した。遠心後、０．０８５％塩化アンモニウムを含む０．１５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６５）溶血バッファーに再浮遊し３７℃で５分間処理した。細胞を２０ｍｌのＰＲＭＩ１６４０で一回、さらに３０ｍｌ ＭＡＣＳバッファー（０．５％ＦＢＳ、２．５ｍＭ ＥＤＴＡを含むハンクス平衡塩（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ））で洗浄した後、５％マウス血清を含むＭＡＣＳバッファーに１×１０^８細胞／ｍｌとなるように懸濁した。さらに０．５μｇの抗マウスＣＤ４−ＦＩＴＣ（ファーミンジエン）を加え６℃、６０分間インキュベーションした。次に、細胞をＭＡＣＳバッファー３０ｍｌで２回洗浄後、ＭＡＣＳバッファーで１×１０^８細胞／ｍｌに再懸濁した。１×１０^８細胞あたり４０μｌの抗ＦＩＴＣマイクロビーズ（第一化学薬品）を加え６℃、６０分間インキュベーションした。細胞を再度ＭＡＣＳバッファー３０ｍｌで洗浄し、１．５ｍｌのＭＡＣＳバッファーに浮遊した。このように調製した細胞をａｕｔｏＭＡＣＳ（第一化学薬品）へアプライし、プログラムＰＯＳＳＥＬＳによりＣＤ４陽性細胞を得た。３００μｌ／１５ｍｌのリリース試薬を添加し６℃、２０分間処理した。この細胞懸濁をａｕｔｏＭＡＣＳへアプライし、抗ＦＩＴＣマイクロビーズと細胞を分離した。さらにＣＤ６２Ｌ陽性ＣＤ４Ｔ細胞を得るために、調製したＣＤ４陽性Ｔ細胞を１×１０^７細胞あたり５０μｌのＭＡＣＳバッファーに浮遊し、１×１０^７細胞あたり３０μｌのｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（第一化学薬品）および１×１０^７細胞あたり２０μｌのＣＤ６２Ｌマイクロビーズ（抗マウスＣＤ６２Ｌマイクロビーズ（ＭＥＬ−１４）第一化学薬品）を加え６℃、３０分間インキュベートした。反応終了後、３０ｍｌのＭＡＣＳバッファーで細胞を２回洗浄し、１．５ｍｌの細胞懸濁液をａｕｔｏＭＡＣＳへアプライし、プログラムＰＥＳＳＥＬＳにＣＤ４ＣＤ６２Ｌ陽性Ｔ細胞を得た。細胞は１０％ＦＢＳを含むＴ細胞培養液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５０μＭ ２−メルカプトエタノール、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ ペニシリンストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０）で洗浄後、５×１０^５細胞／ｍｌとなるように１０％ＦＢＳ、Ｔ細胞培養液に懸濁した。取得したナイーブＴ細胞を上記（２−１）で作製した抗体プレートに、１ｗｅｌｌあたり０．５ｍｌずつ植え込んだ。さらに終濃度３μｇ／ｍＬあるいは３０μｇ／ｍＬとなるようにＳＪ２３６８−Ｆｃ溶液を１ｗｅｌｌあたり１００μＬ添加し５％ＣＯ_２環境下、３７℃で培養した。コントロールとして、ＳＪ２３６８−Ｆｃを添加する代わりに生理食塩液１００μＬまたは終濃度３０μｇ／ｍＬとなるようにヒトＩｇＧ蛋白質溶液１００μＬを添加した。培養開始７２時間後、上清１ｍｌを回収しＥＬＩＳＡによりサイトカイン濃度を測定した。
（２−３）ＥＬＩＳＡによるサイトカイン濃度の測定
培養開始３日後の培養上清中のサイトカイン濃度を測定した。測定は、ＯｐｔＥＩＡ Ｍｏｕｓｅ ＩＬ−４ Ｓｅｔ（ファ

（ＤＩＡＣＬＯＮＥ）を用いて測定した。
Ｔｈ１／Ｔｈ２分化系におけるマウスＦＪ２３６８−ＦｃのＩＦＮ−γおよびＩＬ−４産生誘導活性を、生理食塩液添加群を１としたときの誘導倍率で示した（表１）。

表１に示したように、マウスＳＪ２３６８−ＦｃによるＩＦＮ−γ産生の有意な亢進が認められた。なお、ＩＬ−４産生でもマウスＳＪ２３６８−Ｆｃによる抑制傾向が認められた。これはマウスＳＪ２３６８−ＦｃがマウスナイーブＴ細胞に作用し、Ｔｈ１分化を誘導した結果と考えられる。このことはＴ細胞に可溶型ＳＪ２３６８蛋白質の受容体が存在する可能性を示唆している。Ｔｈ１分化を誘導する細胞内シグナル伝達因子として、Ｔ−ｂｅｔやＴｘｋが知られているが、可溶型ＳＪ２３６８蛋白質はＴ細胞に存在する受容体と結合し上記のシグナル伝達因子を活性化しているのかもしれない。一方、ナイーブＴ細胞にＳＪ２３６８蛋白質（膜貫通型）が存在している場合、可溶型ＳＪ２３６８蛋白質がＴ細胞上に存在するＳＪ２３６８蛋白質（膜貫通型）の機能を競合的に阻害した結果としてＴｈ１分化誘導が起こったとも考えられる。この場合、ＳＪ２３６８蛋白質は本来的にはＴｈ２分化を誘導する活性を有しているものと推察される。
実施例１１ 抗ヒト及びマウスＳＪ２３６８抗体の作製
（１）ヒト及びマウスＳＪ２３６８の部分ペプチドの調製
マウス及びヒトＳＪ２３６８両者とクロスする抗体を作製するため、マウス及びヒトのアミノ酸配列を比較検討した。マウスＳＪ２３６８（配列番号１４）のＮ末のアミノ酸のうち２１番目から３２番目の配列（ＲＰＲＬＡＰＰＲＮＶＴＬ）はヒトＳＪ２３６８との間で１アミノ酸しか異ならず、またＮ末端に位置することからヒト／マウスＳＪ２３６８抗体作製に使用する免疫用ペプチドとして選択した。また、マウスＳＪ２３６８の１２２番目から１３６番目の配列（ＶＥＬＡＰＰＴＬＶＬＴＱＭＥＫ）はヒトＳＪ２３６８との間に２アミノ酸の違いが認められるが、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ及びＲｏｂｓｏｎの２次構造予測プログラムを用いて解析したところ、一部ターン構造を有するコンビネション構造を取ることが予想されたため、蛋白質表面に露出されているものと推定し、マウスＳＪ２３６８抗体作製に使用する免疫用ペプチドとして選択した。このペプチドにはキャリア蛋白と結合する反応基がないため、Ｃ端にシステインを追加した配列とした。ペプチドの合成はＡＢＩ４３３Ａペプチド合成機（アプライド）を用いて行い、定法により樹脂よりペプチドの切り出し脱保護を行い、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣ（ＣＡＰＣＥＬＬ−ＰＡＫ、資生堂）を用いて精製した。
（２）ＳＪ２３６８のペプチド免疫抗原の調製
合成したペプチドを蒸留水で１０ｍｇ／ｍＬに溶解し、１０ｍｇ／ｍＬのマレイミド化キーホールリンペットヘモシアニン（ＰＩＥＲＣＥ）と等量混合した。室温で２時間反応後、ＮＡＰ−１０カラム（ファルマシア）で脱塩した。
（３）ポリクローナル抗体の作製
ヒト及びマウスＳＪ２３６８に対するポリクローナル抗体を作製するため、調製したペプチド抗原１００μｇを等量のフロインド完全アジュバント（ＦＣＡ、ＤＩＦＣＯ）と混合し、ウサギ（ＮＺＷ、メス、２〜２．４ｋｇ、北山ラベス）又はラット（Ｗｉｓｔａｒ、メス、８週令、ＳＬＣ）の背部皮下に投与した。２週間後、同量をフロインド不完全アジュバント（ＦＩＡ、ＤＩＦＣＯ）と混合したものを同様に投与し、１週間後ウサギは耳静脈よりラットは心臓より採血し抗血清を調製した。次に得られた抗血清に５０％飽和となるように飽和硫酸アンモウニウム溶液を添加し、塩析を行った。得られた沈殿物を遠心後、ＰＢＳで溶解し、透析した。次にウサギ抗体はプロテインＡカラム（Ｐｒｏｓｅｐ−Ａ、ミリポア）でラット抗体はプロテインＧカラム（Ｐｒｏｓｅｐ−Ｇ、ミリポア）で精製し、ＩｇＧ分画を得た。蛋白質濃度は２８０ｎｍの吸光度より算出した。
実施例１２ ヒト可溶型ＳＪ２３６８蛋白質（スプライシングバリアント）特異抗体の作製
（１）ヒト可溶型ＳＪ２３６８蛋白質（スプライシングバリアント）のペプチドの調製
ヒト可溶型ＳＪ２３６８蛋白質（スプライシングバリアント）のアミノ酸配列のうち全長ＳＪ２３６８の配列とは一致しない２２４番目より２４４番目までのペプチド配列をＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ及びＲｏｂｓｏｎの２次構造予測プログラムを用いて解析を行ったところ、２３２番目から２４４番目の配列（ＣＧＮＬＳＡＱＱＴＲＶＲＥ）は親水性が高く、ターン構造を含む構造であり、蛋白質表面に露出されているものと推定し、免疫用ペプチドとして選択した。ペプチドの合成はＡＢＩ４３３Ａペプチド合成機（アプライド）を用いて行い、定法により樹脂よりペプチドの切り出し脱保護を行い、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣ（ＣＡＰＣＥＬＬ−ＰＡＫ、資生堂）を用いて精製した。
（２）可溶型ＳＪ２３６８の免疫抗原の調製
合成したペプチドを蒸留水で１０ｍｇ／ｍＬに溶解し、１０ｍｇ／ｍＬのマレイミド化キーホールリンペットヘモシアニン（ＰＩＥＲＣＥ）と等量混合した。室温で２時間反応後、ＮＡＰ−１０カラム（ファルマシア）で脱塩した。
（３）ポリクローナル抗体の作製
ヒト可溶型ＳＪ２３６８蛋白質（スプライシングバリアント）に対するポリクローナル抗体を作製するため、調製したペプチド抗原１００μｇを等量のＦＣＡ（ＤＩＦＣＯ）と混合し、Ｗｉｓｔａｒラット（８週令、メス、北山ラベス）の背部皮下に投与した。２週間後、同量をＦＩＡ（ＤＩＦＣＯ）と混合したものを投与し、１週間後心臓より採血し抗血清を得た。次に得られた抗血清に５０％飽和となるように飽和硫酸アンモウニウム溶液を添加し、塩析を行った。得られた沈殿物を遠心後ＰＢＳで溶解し、透析後プロテインＧカラム（Ｐｒｏｓｅｐ−Ｇ、ミリポア）で精製し、ＩｇＧ画分を得た。蛋白質濃度は２８０ｎｍの吸光度より算出した。得られた抗体がヒト可溶型ＳＪ２３６８蛋白質（スプライシングバリアント）と特異的に結合することをウエスタンブロッティングにより確認した。すなわち、ヒト可溶型ＳＪ２３６８蛋白質（スプライシングバリアント）を５−２０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ＡＴＴＯ）にて泳動し、ミリポア社の方法にしたがってＰＶＤＦ膜に転写した。転写後５％スキンミルク、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳにてブロッキングした。精製抗体を０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで５μｇ／ｍＬに希釈し転写したＰＶＤＦ膜と室温で１時間反応させた。次にメンブレンを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗ラットイムノグロブリン抗体（ＤＡＫＯ）を０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで１０００倍に希釈しメンブレンと室温で１時間反応させた。メンブレンを同様に３回洗浄後、ＥＣＬ（アマシャム）で検出した。その結果、約２７ｋＤａ付近にヒト可溶型ＳＪ２３６８蛋白質（スプライシングバリアント）のバンドが検出された。コントロールで用いた全長ＳＪ２３６８は検出されなかった。
実施例１３ 抗ＳＪ２３６８モノクローナル抗体の作製
（１）ラットモノクローナル抗体の作製
Ｗｉｓｔａｒラット（メス、８週令、北山ラベス）のフットパッドに実施例４で調製した精製ヒトＳＪ２３６８−Ｆｃ融合蛋白質２０μｇをＦＣＡと等量混合して投与した。初回投与２週間後に抗原２０μｇをＦＩＡと等量混合後同様に投与した。最終投与３日後、ラットより腸骨リンパ節を摘出し細胞融合を行った。すなわち、リンパ節よりセルストレイナー（ファルコン）を用いてリンパ球を分離し、ミエローマ細胞（Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４）と混合後、ポリエチレングリコールを用いて安東民衛・千葉丈／著「単クローン抗体実験操作入門」８３ページ、１９９１年（講談社）にしたがって細胞融合を行った。ＨＡＴ培地によりハイブリドーマを選択し、１週間後目的の抗体を産生しているハイブリドーマのスクリーニングを行った。すなわち、０．０７６Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．４）（以下ＰＢＳと記載）で精製ヒトＳＪ２３６８−Ｈｉｓ蛋白質を２．５μｇ／ｍＬに希釈し、イムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ、ＮＵＮＣ）に５０μＬ／ウエル添加した。３７℃で１時間反応後、イオン交換水で５回洗浄し、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳを各ウエルに１００μＬ添加しブロッキングを行った。次に培養上清を各ウエルに添加し３７℃で１時間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で３回洗浄した。ペルオキシダーゼ標識抗ラットイムノグロブリン抗体（ＤＡＫＯ）を１０％ウサギ血清を含むＰＢＳで１０００倍に希釈し各ウエルに５０μＬ添加した。３７℃で１時間反応後、同様に５回洗浄しＴＭＢ溶液（ＢｉｏＦｉｘ）を各ウエルに添加した。室温で１０分間反応後、０．５Ｍ硫酸溶液で反応を停止した。プレート分光光度計（ＮＪ−２１００、日本インターメッド）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。その結果、精製ＳＪ２３６８−Ｈｉｓ蛋白質と反応した細胞を選択し、限界希釈法によりクローニングを行った。１０日後、同様にスクリーニングを行い、精製ＳＪ２３６８−Ｈｉｓ蛋白質と反応する抗体を産生するクローン５クローンを得た。得られた抗体のうち、特に反応性の高いＦ１１２０−２１−３抗体のサブタイプをラットタイピングキット（ＺＹＭＥＤ）を用いて決定したところサブタイプはＩｇＧ２ｂ・κであった。
（２）マウスモノクローナル抗体の作製
ＣｐＧアジュバント（ＩｍｍｕｎＥａｓｙ Ｍｏｕｓｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ、ＱＩＡＧＥＮ）５０μＬと精製ヒトＳＪ２３６８−Ｆｃ融合蛋白質２０μｇを混合し１００μＬとした投与抗原をｄｄＹマウス（メス、８週令、ＳＬＣ）の両足のフットパッド内にマイクロシリンジによりそれぞれ５０μＬ投与した。９日後、投与抗原２０μｇを１００μＬの生理食塩水で希釈したものをフットパッド内に各５０μＬずつ投与した。３日後、腸骨リンパ節よりリンパ球を分離し、ミエローマＰ３Ｕ１と混合後、ポリエチレングリコールを用いて安東民衛・千葉丈／著「単クローン抗体実験操作入門」（講談社）にしたがって細胞融合を行った。ＨＡＴ培地によりハイブリドーマを選択し、１週間後目的の抗体を産生しているハイブリドーマのスクリーニングを（１）記載の方法と同様に行った。精製ＳＪ２３６８−Ｈｉｓ蛋白質と反応した細胞を限界希釈法によりクローニングし、１０日後、同様にスクリーニングした。その結果、精製ＳＪ２３６８−Ｈｉｓ蛋白質と反応する抗体を産生するクローン１０クローンを得た。選択したハイブリドーマを１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ−１６４０培地（ＧＩＢＣＯ）で培養後、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ）で培養し抗体を産生させ、Ｐｒｏｓｅｐ−Ａカラム（ミリポア）を用いて抗体を精製した。得られた抗体のうち、反応性の高いＦ１１５７−６−２、Ｆ１１５７−１０−２抗体のサブタイプをＩｓｏＳｔｒｉｐ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて決定したところサブタイプはそれぞれＩｇＧ１／κ、ＩｇＧ２ａ／κであった。
実施例１４ ラット及びマウスモノクローナル抗体の特異性
実施例４に示す方法で、ＳＪ２３６８発現プラスミド、ヒト可溶型ＳＪ２３６８蛋白質（スプライシングバリアント）プラスミドあるいはベクタープラスミドをＣＯＳ細胞に導入し、２日間培養した後に、細胞をＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーで溶解した。これらの細胞溶解液を５−２０％濃度勾配ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ＡＴＴＯ）で電気泳動した後に、ＰＶＤＦ膜（ミリポア）に蛋白を電気的にｔｒａｎｓｆｅｒした。実施例１３で作製した抗体を、１０％ブロックエースを含む０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以下、Ｔ−ＰＢＳと記載）を用いて５μｇ／ｍｌに希釈し蛋白を転写したＰＶＤＦ膜と室温で１時間反応させた。次に、Ｔ−ＰＢＳで３回洗浄した後に、ＨＲＰ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（ＤＡＫＯ）あるいはＨＲＰ標識抗ラットイムノグロブリン抗体（ＤＡＫＯ）と室温で１時間反応させた。Ｔ−ＰＢＳで３回洗浄した後に、ＥＣＬキット（アマシャム・バイオサイエンス）を用いて検出した。その結果、第１２図に示すようにＳＪ２３６８発現プラスミド及びヒト可溶型ＳＪ２３６８蛋白質（スプライシングバリアント）プラスミドを導入したＣＯＳ細胞の溶解液（ｌｙｓａｔｅ）で特異的な約５７ｋＤａ及び２７ｋＤａのバンドが検出された。
実施例１５ ＳＪ２３６８測定系の作製
（１）標識抗体の調製
サンドイッチＥＬＩＳＡ系を作製するため、実施例１３で得られたＦ１１２０−２１−３抗体をペルオキシダーゼで標識した。すなわち、中根らの方法（Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，２２，１０８４，１９７４）に従い、１ｍｇのペルオキシダーゼ（東洋紡）を蒸留水に溶解し、蒸留水で溶解した１００ｍＭの過ヨウ素酸を添加し２５℃で２０分間反応した。反応終了後１．５％エチレングリコールを添加し２５℃で１０分間反応後１ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．４）に対して透析した。次に、精製したＦ１１２０−２１−３抗体を１０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）で透析し、抗体１ｍｇに対して１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）を添加して活性化した１ｍｇのペルオキシダーゼを混合し２５℃で２時間反応した。４ｍｇ／ｍＬの水素化ホウ素ナトリウムを添加しさらに２時間４℃で反応した。反応液をＰＢＳに透析しペルオキシダーゼ標識抗体を得た。液量を測定し使用した抗体量より抗体濃度を算出した。
（２）サンドイッチＥＬＩＳＡ系の構築
Ｆ１１５７−１０−２抗体固相／ペルオキシダーゼ標識Ｆ１１２０−２１−３を用いてＥＬＩＳＡ系を作製した。まず、Ｆ１１５７−１０−２抗体固相化プレートを調製した。すなわち、抗体を５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で１０μｇ／ｍＬに希釈し、イムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、ＮＵＮＣ）の各ウエルに５０μＬ添加し、４５℃にて３０分間反応させた。次にイオン交換水で５回洗浄し、２０％ブロックエース（雪印乳業）を含むＰＢＳ（ｐＨ６．４）を各ウエルに１００μＬ添加しブロッキングした。標準品は精製ヒトＳＪ２３６８−Ｈｉｓ蛋白質を０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ６．４）で３．１、６．３、１２．５、２５、５０、１００、２００ｎｇ／ｍｌに希釈し調製した。ブランクは０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ６．４）を使用した。測定は、まずプレートのブロッキング剤を廃棄し、調製した標準品及びブランクを２５μｌ分注し、続けて１％ＢＳＡ、１％ラット血清、１％マウス血清を含むＤ−ＰＢＳ（ｐＨ７．４、ＳＩＧＭＡ）により２μｇ／ｍｌに希釈したペルオキシダーゼ標識Ｆ１１２０−２１−３抗体を２５μｌ添加し、２５℃で一晩反応した。プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で３回洗浄し、ＴＭＢ溶液（ＢｉｏＦＸ）を各ウエルに添加した。室温で２０分間反応後、０．５Ｍ硫酸溶液で反応を停止し、プレート分光光度計（ＮＪ−２１００、日本インターメッド）で４５０ｎｍの吸光度を測定し、標準曲線を作成した。第１３図に作成した標準曲線を示した。
実施例１６ 各種細胞株培養上清中可溶型ＳＪ２３６８蛋白質の測定
各種細胞株（１７３種類）の培養上清中ＳＪ２３６８蛋白質濃度を実施例１５に記載の測定系を用いて測定した。その結果、第１４図に示すように培養上清中の可溶型ＳＪ２３６８蛋白質濃度は多くの細胞では５〜１５ｎｇ／ｍｌ前後であったが、巨核球系細胞（Ｍｅｇａｋａｒｙｏｂｌａｓｔ）ではほとんど産生されない結果であった。また、一部の黒色腫、ヒトリンパ腫、ヒト膀胱癌、ｓａｒｃｏｍａ、Ｂリンパ球において濃度が上昇している例が認められた。以上の結果は可溶型ＳＪ２３６８蛋白質が各種細胞で恒常的に産生され、何らかの制御に関与している可能性を示唆している。
実施例１７ 各種患者血清中可溶型ＳＪ２３６８蛋白質の測定
健常人４０例（男性２０例、女性２０例）及び各種疾患患者（３５疾患、各３例、自己免疫性肝炎のみ１例、計１０３例）を実施例１５に記載の測定系を用いて測定した。その結果、健常人の血清中可溶型ＳＪ２３６８蛋白質濃度は８〜１８ｎｇ／ｍＬに分布し、平均値は１１．４ｎｇ／ｍＬであった。健常男性で若干高い結果であった。各種疾患患者血清中の可溶型ＳＪ２３６８蛋白質濃度は第１５図に示すように肺腫瘍、狭心症、心不全、肝不全、骨粗しょう症、痴呆の患者で上昇する例が認められた。特に、痴呆および肝不全患者においては３例中２例が高値を示した。以上の結果は、可溶型ＳＪ２３６８蛋白質が血中に恒常的に産生され、何らかの要因により上昇し、生体の恒常性の維持や上記疾患に関与している可能性を示している。なお、使用したＥＬＩＳＡ系の２種類の抗体は実施例１４に示すようにヒト可溶型ＳＪ２３６８蛋白質（スプライシングバリアント）とも結合するため、本系ではＳＪ２３６８蛋白質の細胞外領域が切断されて生成する可溶型ＳＪ２３６８蛋白質と、スプライシングバリアントである可溶型ＳＪ２３６８蛋白質の両者を測定しているものと考えられる。
実施例１８ ＳＪ２３６８のヒト末梢血単核球における発現
（１）ＳＪ２３６８抗体の蛍光染色
実施例１３で作製したＦ１１２０−２１−３抗体をＦｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙで用いるために蛍光色素染色を行った。即ち、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）を用い、添付のプロトコールに従って、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８ ｄｙｅ標識を行った（以下Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８標識Ｆ１１２０−２１−３をＯＧ標識Ｆ１１２０−２１−３と称する。）。さらにこのＯＧ標識Ｆ１１２０−２１−３抗体の反応性を確認するために、以下の方法でＦｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ解析を行った。実施例４に示す方法で、ＳＪ２３６８発現プラスミドあるいはベクタープラスミドをＣＯＳ細胞に導入した後、０．１％ＥＤＴＡを含むＰＢＳ⁻にて細胞を剥離した。剥離したＣＯＳ形質転換体を１０μｇ／ｍｌのＯＧ標識Ｆ１１２０−２１−３と氷上で３０分間インキュベーションした後に、０．２５％非動化ＦＢＳおよび０．１％ＥＤＴＡを含むＰＢＳ⁻で３回洗浄した後に、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（日本ベクトンディッキンソン）で解析を行った。その結果、ＳＪ２３６８発現プラスミドを導入した形質転換体で特異的な染色が確認でき、ＳＪ２３６８の細胞膜上への発現が確認された（第１６図）。
（２）ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）におけるＳＪ２３６８の発現
ヒトＰＢＭＣを用い、ＳＪ２３６８を発現する単核球画分を調べた。ＡｌｌＣｅｌｌｓ，ＬＬＣ社（代理店；株式会社ベリタス）より購入したヒトＰＢＭＣを５％非動化ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ）に懸濁し、０．８〜１．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで２４ｗｅｌｌ−ｐｌａｔｅに植え込んだ。その際に、培地のみもしくは５ｎｇ／ｍｌのＰｂｏｒｂｏｌ １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３−ａｃｅｔａｔｅ（以下、ＰＭＡと表記、Ｓｉｇｍａ）と０．５μｇ／ｍｌのＩｏｎｏｍｙｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ）を添加した。５％ＣＯ_２、３７℃で１８時間培養後、ＰＢＭＣを回収し、１０μｇ／ｍｌのラットＩｇＧ２ａコントロール抗体と氷上で４０分間インキュベーションした。次に、ＰＢＭＣを０．２５％非動化ＦＢＳおよび０．１％ＥＤＴＡを含むＰＢＳ⁻で三度洗浄した後に、（１）で作製したＯＧ標識Ｆ１１２０−２１−３抗体（１０μｇ／ｍｌ）及び市販のＰｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）標識細胞表面マーカー（日本ベクトンディッキンソン）と氷上で４０分間インキュベーションし、二重染色を行った。その後、０．２５％非動化ＦＢＳおよび０．１％ＥＤＴＡを含むＰＢＳ⁻で三度洗浄し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒで発現の様子を確認した。その結果、ＳＪ２３６８はＣＤ３ポジティブ細胞の一部で発現が確認され、ＰＭＡ＋Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ添加によりその割合が上昇していた。ＣＤ４ポジティブ細胞でも同様に発現が確認され、ＰＭＡ＋Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎで誘導された。ＣＤ８ポジティブ細胞では未刺激な条件では発現がほとんど確認されなかったが、ＰＭＡ＋Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎで刺激することで誘導発現が確認された。ＣＤ１９、ＣＤ１６及びＣＤ３３ポジティブ細胞では未刺激及びＰＭＡ＋Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎによる刺激でも発現が確認されなかった。以上の結果を表２にまとめる。ＳＪ２３６８及び各ＣＤ抗原ポジティブな細胞の割合を全ＰＢＭＣに対する百分率（％）で表示した。

実施例１９ ゲルシフトアッセイ
（１）ヒトＩＬ１０Ｒα鎖及びβ鎖のクローニング
ＳＪ２３６８の細胞内シグナル伝達機構を解明する目的で、Ｋｏｔｅｎｋｏらの方法（Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ｖｏｌ．１６ ｐｐ．５８９４−５９０３）を参考にゲルシフトアッセイを検討した。まず、ヒトＩＬ１０Ｒα鎖及びヒトＩＬ１０Ｒβ鎖のクローニングを行うために、センスプライマーＲＳ１（５’−ＣＣＧ ＧＡＡ ＴＴＣ ＡＧＧ ＣＣＧ ＧＣＴ ＣＣＧ ＣＴＣ ＣＧＧ−３’）、センスプライマーＲＳ２（５’−ＣＣＧ ＧＡＡ ＴＣＴ ＧＣＧ ＧＣＧ ＣＧＣ ＣＣＡ ＧＧＡ ＴＧＣ−３’）、センスプライマーＲＳ３（５’−ＣＣＧ ＧＴＣ ＧＡＧ ＴＧＣ ＴＴＧ ＧＡＧ ＧＡＡ ＧＣＣ ＧＣＧ−３’）、センスプライマーＲＳ４（５’−ＣＣＧ ＧＴＣ ＧＡＧ ＣＧＴ ＣＣＧ ＴＣＣ ＡＴＧ ＧＣＧ ＴＧＧ−３’）、アンチセンスプライマーＲＡ１（５’−ＣＧＧ ＧＧＴ ＡＣＣ ＴＣＣ ＴＧＧ ＴＣＣ ＡＧＧ ＣＡＧ ＡＧＧ−３’）、アンチセンスプライマーＲＡ２（５’−ＣＧＧ ＧＧＴ ＡＣＣ ＴＣＴ ＣＡＧ ＣＣＣ ＧＡＧ ＴＣＡ ＣＴＣ−３’）、アンチセンスプライマーＲＡ３（５’−ＣＣＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＴＡ ＧＡＴ ＧＴＧ ＧＧＧ ＣＴＧ ＧＣＴ−３’）、アンチセンスプライマーＲＡ４（５’−ＣＣＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＧＣＴ ＧＣＣ ＣＴＧ ＡＴＣ ＣＣＴ ＣＡＣ−３’）を設計した。鋳型としてヒトＰＢＬ由来ｃＤＮＡ（Ｈｕｍａｎ ＭＴＣ Ｐａｎｅｌ ＩＩ；クロンテック社）を用い、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラ バイオサイエンス社）によるＰＣＲを９８℃で１０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分３０秒のサイクルを３０回繰り返した。ＩＬ１０Ｒα鎖についてはセンスプライマーＲＳ１とアンチセンスプライマーＲＡ１のセットで、ＩＬ１０Ｒβ鎖についてはセンスプライマーＲＳ３とアンチセンスプライマーＲＡ３のセットで行った。その後、各ＰＣＲ反応液を鋳型にし、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてＩＬ１０Ｒα鎖についてはセンスプライマーＲＳ２とアンチセンスプライマーＲＡ２のセットで、ＩＬ１０Ｒβ鎖についてはセンスプライマーＲＳ４とアンチセンスプライマーＲＡ４のセットで、９８℃で１０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分３０秒のサイクルを３０回繰り返すＰＣＲ反応を再度行った。得られた約１．８ｋｂ及び１．１ｋｂ断片をホニュウ動物細胞発現プラスミドに挿入し、ＩＬ１０Ｒα鎖及びＩＬ１０Ｒβ鎖発現プラスミドを構築した。
（２）キメラレセプター発現プラスミドの構築
ＩＬ１０Ｒα鎖とＳＪ２３６８のキメラレセプター（以下ＣＲ１０と表記）の構築を行った。リコンビナントＰＣＲ法により、ヒトＩＬ１０Ｒα鎖の細胞外ドメインとヒトＳＪ２３６８の膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを融合したｃＤＮＡ断片を作製した。この際に、Ｋｏｔｅｎｋｏらの論文に記載されているＩＬ１０Ｒα鎖とＩＦＮ−γＲとのキメラレセプター構築と同様のコンストラクトである、ヒトＩＬ１０Ｒα鎖の細胞外ドメイン＋膜貫通ドメインの数アミノ酸からなるペプチドとヒトＳＪ２３６８の膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインの融合蛋白質であるＣＲ１０（以下ＣＲ１０Ａと表記；アミノ酸配列を配列番号２２に記載）とヒトＩＬ１０Ｒα鎖の細胞外ドメインからなるペプチドとヒトＳＪ２３６８の膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインの融合蛋白質であるＣＲ１０（以下ＣＲ１０Ｂと表記；アミノ酸配列を配列番号２３に記載）の２種のキメラレセプターを構築した。まず、センスプライマーＣＲＳ１（５’−ＡＧＧ ＣＡＧ ＴＡＴ ＴＴＣ ＡＣＣ ＧＴＧ ＡＣＣ ＡＡＣ ＴＧＧ ＧＣＴ ＴＴＣ ＣＴＧ ＧＴＧ ＣＴＧ ＣＣＡ−３’）、センスプライマーＣＲＳ２（５’−ＧＡＧ ＴＧＣ ＡＴＣ ＴＣＣ ＣＴＣ ＡＣＣ ＡＧＧ ＡＡＣ ＴＧＧ ＧＣＴ ＴＴＣ ＣＴＧ ＧＴＧ ＣＴＧ−３’）、アンチセンスプライマーＣＲＡ１（５’−ＴＧＧ ＣＡＧ ＣＡＣ ＣＡＧ ＧＡＡ ＡＧＣ ＣＣＡ ＧＴＴ ＧＧＴ ＣＡＣ ＧＧＴ ＧＡＡ ＡＴＡ ＣＴＧ ＣＣＴ−３’）及びアンチセンスプライマーＣＲＡ２（５’−ＣＡＧ ＣＡＣ ＣＡＧ ＧＡＡ ＡＧＣ ＣＣＡ ＧＴＴ ＣＣＴ ＧＧＴ ＧＡＧ ＧＧＡ ＧＡＴ ＧＣＡ ＣＴＣ−３’）を設計した。実施例３で作製したＳＪ２３６８発現プラスミドと（１）で作製したＩＬ１０Ｒα鎖発現プラスミドを鋳型に、ＣＲ１０ＡについてはセンスプライマーＣＲＳ１とアンチセンスプライマーＣＲＡ１を用い、ＣＲ１０ＢについてはセンスプライマーＣＲＳ２とアンチセンスプライマーＣＲＡ２を用いて、リコンビナントＰＣＲによりキメラレセプターｃＤＮＡ断片を増幅した。次にここで得られたＤＮＡ増幅断片とＩＬ１０Ｒα鎖発現プラスミドとを制限酵素サイトで繋ぎ変えＣＲ１０発現プラスミドをそれぞれ作製した。さらに、ＩＬ１０Ｒβ鎖発現プラスミドより、発現プロモーター／ＩＬ１０Ｒβ鎖ｃＤＮＡ／ｐｏｌｙＡ付加シグナルのユニットを切り出し、先に作製したＣＲ１０発現プラスミドのＩＬ１０Ｒα鎖用ｐｏｌｙＡ付加シグナルの下流にタンデムに挿入した。以上の手順にて、ＣＲ１０Ａ及びＩＬ１０Ｒβ鎖発現プラスミド（ｐＣＲ１０Ａ＋Ｒｂ）とＣＲ１０Ｂ及びＩＬ１０Ｒβ鎖発現プラスミド（ｐＣＲ１０Ｂ＋Ｒｂ）を構築した。
（３）ＣＲ１０Ａ及びＣＲ１０Ｂの発現
次に、ＣＲ１０Ａ及びＣＲ１０Ｂの発現を確認するため、ＳＪ２３６８発現プラスミド、ＩＬ１０Ｒα鎖発現プラスミド、ｐＣＲ１０Ａ＋Ｒｂ、ｐＣＲ１０Ｂ＋ＲｂあるいはベクタープラスミドをＨＥＫ２９３細胞あるいはＣＯＳ細胞に、ＦｕＧＥＮＥ６を用いて導入した。さらに２日間培養を続けた後に、０．１％ＥＤＴＡを含むＰＢＳ⁻で細胞を剥離し、ＰＥ標識抗ＣＤ２１０抗体（抗ＩＬ１０Ｒα鎖抗体；藤沢薬品工業）と氷上で３０分間インキュベーションした。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを用いて染色の様子を調べた結果、ｐＣＲ１０Ａ＋ＲｂあるいはｐＣＲ１０Ｂ＋Ｒｂを導入した細胞で、ＩＬ１０Ｒ発現プラスミド発現プラスミドを導入した細胞と同等の特異的な染色が確認され、ＳＪ２３６８発現プラスミドあるいはベクタープラスミドを導入した細胞では染色が確認されなかった（第１７図にＨＥＫ２９３細胞を用いたＦｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙの結果を示す。）以上のことから、ｐＣＲ１０Ａ＋ＲｂあるいはｐＣＲ１０Ｂ＋Ｒｂをｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎすることで、ＣＲ１０ＡあるいはＣＲ１０Ｂが細胞膜上に発現されることが確認された。
（４）ゲルシフトアッセイ
上記（３）に記載した方法で、ＩＬ１０Ｒα鎖とＳＪ２３６８とのキメラレセプター及びＩＬ１０Ｒβ鎖を発現する細胞を作製することが可能となり、以下、Ｋｏｔｅｎｋｏらの論文に記載されている方法で、ＩＬ１０で発現細胞を刺激し、Ｎｕｃｌｅａｒ Ｅｘｔｒａｃｔを調製することができる。また、同じ論文に記載されている方法で、ｈｕｍａｎ ＩＲＦ−１遺伝子のＧＡＳ ｅｌｅｍｅｎｔ（５’−ＧＡＴ ＣＧＡ ＴＴＴ ＣＣＣ ＣＧＡ ＡＡＴＣＡＴ Ｇ−３’）をプローブとして調製し、ゲルシフトアッセイを行うことにより、ＩＬ１０の刺激によるＳＴＡＴの活性化について確認することが可能となる。すなわち、ＳＪ２３６８の本来のリガンドは明らかとなっていないが、ＩＬ１０Ｒα鎖とのキメラレセプターを用いることで、細胞内へのシグナル伝達を引き起こすことが可能となり、ＳＪ２３６８のレセプター機能を明らかにすることができる。
実施例２０ ＤＮＡアレイを用いた解析
上記実施例１９に記載した方法で、ＣＲ１０発現細胞を準備する。次にＩＬ１０を添加あるいは未添加することで、ＳＪ２３６８細胞内シグナル伝達をＯＮ／ＯＦＦする。これらの細胞よりＲＮＡを調製し、市販のＤＮＡアレイ（あるいはＤＮＡチップ）を用いることで、ＳＪ２３６８シグナル伝達によって誘導あるいは抑制する遺伝子が確認でき、ＳＪ２３６８のシグナル伝達に関与する分子群を同定することができる。
産業上の利用可能性
本発明のＳＪ２３６８は、炎症性疾患の発症あるいは進行に対してその原因となり得る蛋白質であり、敗血症性臓器障害、自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー性疾患、腫瘍等の予防あるいは治療のための医薬品の開発において、極めて有用である。
また、遺伝子ｓｊ２３６８は、アンチセンス医薬品として、また遺伝子治療において利用することができ、蛋白質ＳＪ２３６８は、それ自体あるいはその可溶性断片（細胞外領域や各ドメイン）を作製することにより可溶性蛋白医薬品として有用である。さらに、ＳＪ２３６８またはその部分ペプチドに反応性を有する抗体及びその抗体の一部、また、ＳＪ２３６８の細胞内シグナル伝達系を修飾する低分子化合物は、生体内でのＳＪ２３６８機能を制御する医薬品として有用である。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
第１図は、ＳＪ２３６８の一次構造上の特徴を示す模式図である。
第２図は、ｓｊ２３６８遺伝子のヒト各種臓器および細胞での発現プロファイルを表す図である。
第３図は、ヒトＳＪ２３６８−ＨｉｓおよびヒトＳＪ２３６８−Ｆｃのウェスタンブロッティングの図である。
第４図は、ヒトｓｊ２３６８のゲノム構造を示す模式図である。太線がエクソンを示し、その上のアラビア数字はエクソンが配列番号３の何番目から何番目までの塩基を含むかを示す。また、ローマ数字はエクソンの番号を示す。エクソン間の数値はイントロンの長さを示す。
第５図は、ヒトＩＬ１０Ｒα鎖遺伝子のゲノム構造を示す模式図である。線、数値等は第４図と同様の表現である。
第６図は、マウスｓｊ２３６８のｉｎ ｓｉｌｉｃｏクローニング（５’側）の結果をまとめた図である。
第７図は、マウスｓｊ２３６８のｉｎ ｓｉｌｉｃｏクローニング（３’側）の結果をまとめた図である。
第８図は、ヒトＳＪ２３６８とマウスＳＪ２３６８のアミノ酸アライメントを表す図である。上段がヒトＳＪ２３６８、下段がマウスＳＪ２３６８のアミノ酸配列を示す。箱で囲んだドメインは膜貫通ドメインを、「−」はギャップ配列を、縦線はエクソンの区切りをそれぞれ示す。マウス配列で下線を施した部分はａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇによるｄｅｌｅｔｉｏｎ部分である。
第９図は、ヒトｓｊ２３６８およびマウスｓｊ２３６８のゲノム構造を模式的に示した図である。線、数値等は第４図と同様の表現である。
第１０図は、マウスＳＪ２３６８−Ｆｃのウエスタンブロッティングの結果を示す図である。Ｍはサイズマーカーを、１はマウスＳＪ２３６８−Ｆｃを発現させたトランスフェクタントの上清を、２はベクタープラスミドのトランスフェクタント上清をそれぞれ泳動したレーンである。
第１１図は、マウスＭＬＲに対するマウスＳＪ２３６８−Ｆｃの効果を示した図である。
相対比＝（蛋白存在下での培養におけるＢｒｄＵ取り込み）／（蛋白非存在下での培養におけるＢｒｄＵ取り込み）×１００
白いバーが１μｇ／ｍｌ、灰色のバーが３μｇ／ｍｌ、黒いバーが１０μｇ／ｍｌの蛋白をそれぞれ添加した時の値を示す。ＣＯＮＴ−Ｆｃは他のＩ型膜貫通蛋白分子の細胞外ドメインとヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインとのキメラ蛋白である。
第１２図は、マウス及びラットモノクローナル抗体Ｆ１１５７−１０−２、Ｆ１１２０−２１−３抗体の特異性をウエスタンブロティング法により検出した結果を示す。全長はＳＪ２３６８発現細胞、可溶型は可溶型ＳＪ２３６８（スプライスバリアント）発現細胞、ベクターはベクタープラスミド導入細胞由来のサンプルである。
第１３図は、サンドイッチＥＬＩＳＡ系で測定したＳＪ２３６８−Ｈｉｓの標準曲線を示す。
第１４図は、ＥＬＩＳＡ系で測定した各種細胞株培養上清中の可溶型ＳＪ２３６８蛋白質濃度を示す。
第１５図は、ＥＬＩＳＡ系で測定した各種疾患患者及び健常人血清中の可溶型ＳＪ２３６８蛋白質濃度を示す。
第１６図は、ＣＯＳ形質転換細胞をＯＧ標識Ｆ１１２０−２１−３によって染色し、Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ解析を行った結果を示す図である。実線がＳＪ２３６８発現プラスミドを導入した形質転換細胞を染色した結果で、点線がベクタープラスミドを導入した形質転換細胞を染色した結果である。
第１７図は、ＩＬ１０Ｒα鎖とＳＪ２３６８とのキメラレセプターの発現をＦｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙで解析した結果である。
Ａ：実線がＩＬ１０Ｒα鎖発現プラスミドを導入したＨＥＫ２９３形質転換細胞をＰＥ標識抗ＩＬ１０Ｒ抗体で染色した結果で、点線がベクタープラスミドを導入したＨＥＫ２９３形質転換細胞をＰＥ標識抗ＩＬ１０Ｒ抗体で染色した結果を示す。
Ｂ：実線がＣＲ１０Ａ発現プラスミドを導入したＨＥＫ２９３形質転換細胞をＰＥ標識抗ＩＬ１０Ｒ抗体で染色した結果で、点線がベクタープラスミドを導入したＨＥＫ２９３形質転換細胞をＰＥ標識抗ＩＬ１０Ｒ抗体で染色した結果を示す。
Ｃ：実線がＣＲ１０Ｂ発現プラスミドを導入したＨＥＫ２９３形質転換細胞をＰＥ標識抗ＩＬ１０Ｒ抗体で染色した結果で、点線がベクタープラスミドを導入したＨＥＫ２９３形質転換細胞をＰＥ標識抗ＩＬ１０Ｒ抗体で染色した結果を示す。
Ｄ：実線がＳＪ２３６８発現プラスミドを導入したＨＥＫ２９３形質転換細胞をＰＥ標識抗ＩＬ１０Ｒ抗体で染色した結果で、点線がベクタープラスミドを導入したＨＥＫ２９３形質転換細胞をＰＥ標識抗ＩＬ１０Ｒ抗体で染色した結果を示す。

Claims (26)

1. 以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質；
   （ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質；
   （ｂ）配列番号２のアミノ酸配列においてアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるクラスＩＩサイトカイン受容体。
2. 以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質；
   （ａ）配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質；
   （ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列においてアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるクラスＩＩサイトカイン受容体。
3. 以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質；
   （ａ）配列番号２０に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質；
   （ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列においてアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる可溶型ＳＪ２３６８蛋白質。
4. 以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質；
   （ａ）配列番号１８に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質；
   （ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列においてアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる可溶型ＳＪ２３６８蛋白質。
5. 請求項３または請求項４に記載の蛋白質を含んでなる融合蛋白質。
6. 以下の（ａ）〜（ｈ）のいずれかに記載のＳＪ２３６８部分ペプチド；
   （ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の２１〜２２５番目のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド；
   （ｂ）（ａ）に記載のポリペプチドのアミノ酸配列においてアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるヒトＳＪ２３６８細胞外ドメイン；
   （ｃ）配列番号１４に記載のアミノ酸配列の２１〜２２４番目のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド；
   （ｄ）（ｃ）に記載のポリペプチドのアミノ酸配列においてアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるマウスＳＪ２３６８細胞外ドメイン；
   （ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の２５３〜５２０番目のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド；
   （ｆ）（ｅ）に記載のポリペプチドのアミノ酸配列においてアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるヒトＳＪ２３６８細胞内ドメイン；
   （ｇ）配列番号１４に記載のアミノ酸配列の２５３〜５３５番目のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド；
   （ｈ）（ｇ）に記載のポリペプチドのアミノ酸配列においてアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるマウスＳＪ２３６８細胞内ドメイン。
7. 請求項６に記載の部分ペプチドを含んでなる融合蛋白質。
8. 以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡ；
   （ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
   （ｂ）配列番号１のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつクラスＩＩサイトカイン受容体をコードするＤＮＡ；
   （ｃ）請求項１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
9. 以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡ；
   （ａ）配列番号１５に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
   （ｂ）配列番号１５のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつクラスＩＩサイトカイン受容体をコードするＤＮＡ；
   （ｃ）請求項２に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
10. 以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡ；
    （ａ）配列番号２４に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
    （ｂ）配列番号２４のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ可溶型ＳＪ２３６８蛋白質をコードするＤＮＡ；
    （ｃ）請求項３に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
11. 以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡ；
    （ａ）配列番号２５に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
    （ｂ）配列番号２５のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ可溶型ＳＪ２３６８蛋白質をコードするＤＮＡ；
    （ｃ）請求項４に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
12. 請求項６に記載の部分ペプチドをコードするＤＮＡ。
13. 請求項５または請求項７に記載の融合蛋白質をコードするＤＮＡ。
14. 請求項８ないし請求項１３のいずれかに記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
15. 請求項１４に記載の組換えベクターにより形質転換された形質転換細胞。
16. ＳＪ２３６８蛋白質の発現を抑制するアンチセンス核酸。
17. 核酸配列が、請求項８に記載のＤＮＡまたは配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡの全部または一部に相補する配列である、請求項１６に記載のアンチセンス核酸。
18. 核酸配列が、請求項９に記載のＤＮＡまたは配列番号：１６に記載の塩基配列からなるＤＮＡの全部または一部に相補する配列である、請求項１６に記載のアンチセンス核酸。
19. ＳＪ２３６８蛋白質に対する抗体。
20. 可溶型ＳＪ２３６８蛋白質に対する抗体。
21. ＳＪ２３６８蛋白質あるいは該蛋白質を発現している形質転換細胞と候補物質とを接触させることを特徴とする、該蛋白質の活性調節作用を示す物質の検索方法。
22. 可溶型ＳＪ２３６８蛋白質と候補物質とを接触させることを特徴とする、該蛋白質の活性調節作用を示す物質の検索方法。
23. 請求項１４に記載の組換えベクターまたは請求項１５に記載の形質転換細胞と候補物質とを接触させることを特徴とする、遺伝子ｓｊ２３６８の発現調節作用を示す物質の検索方法。
24. ｓｊ２３６８遺伝子組換え非ヒト動物。
25. 請求項１９または請求項２０に記載の抗体を用いることを特徴とする、被験試料中の可溶型ＳＪ２３６８蛋白質の測定方法。
26. 請求項１９または請求項２０に記載の抗体を含有すること特徴とする、被験試料中の可溶型ＳＪ２３６８蛋白質を測定するための試薬またはキット。

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