JP6374851B2 - 可溶性ポリペプチドの単離方法 - Google Patents
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Description
Hと呼ばれる1個のドメインから構成される。
てきた。このようなVH及びVLは、高い発現収率、高いリフォールディング性及び凝集耐性等のVHHに一般的な他の有用な特性も示す。これらのVH及びVLでライブラリ骨格として構築される合成ライブラリは、治療用の有望なタンパク質源として役立つ可能性がある。
体のヒトのVH及びVLを生成した。これらのVH及びVLに基づき構築され、CDRランダム化により生成される合成sdAbライブラリは、様々な抗原との結合因子を得るといった点で機能的であることが示された(Davies, J. et al., 1995; Tanha, J. et al., 2001)。
理学的特性を有する珍しい単量体のヒトVHを効率的に捕捉する鍵となるという事実を明確に示していた。
ポリペプチド、好ましくは抗体フラグメント及び最も好ましくは望ましい生物物理学的特性(可溶性、安定性、高い発現性、単量体性、非凝集性、結合特異性)を有するヒトVH及びヒトVLを単離する方法が提供される。この方法は、様々なポリペプチド配列を発現することができるファージディスプレイライブラリを得る工程、ライブラリファージによる細菌層の感染を可能にする工程、及び細菌層上の平均よりも大きいプラークを形成するファージを同定する工程を包含する。それからファージを単離し、シークエンシングか、又はそうでなければポリペプチド配列を特定するこれらの工程を用いる。
ヒト起源であり、可溶性、安定性、凝集に対する耐性、リフォールディング性、高発現性、及びDNAレベルでの易操作性があり、ライブラリ構築及び三次元構造決定に理想的であるポリペプチド、特に抗体フラグメントを同定することが望ましい。このような抗体フラグメントは、多種の免疫療法への適用、並びに診断用薬剤及び検出用薬剤としても有用である。ヒトの単量体のVH抗体及びVL抗体は上記の特性の多くを有しているとされるので、特に興味深い。
1.VH、VL、Fab、scFv及びより詳細にはヒト抗体であるIgG等の全抗体、
2.非抗体スカフォールドの一本鎖T細胞受容体、T細胞受容体ドメイン、トランスフェリン、リポカリン、kunitzドメイン、アンキリン反復、及び細胞傷害性Tリンパ球関連抗原(CTLA−4)に基づくタンパク質変異体(ヒトのものを含む)、
3.ウイルス性及び細菌性のタンパク質ワクチン等のワクチン、
4.治療用タンパク質(例えば、インスリン、成長ホルモン、エリスロポエチン)
5.タンパク質性の診断用試薬及び生化学試薬(例えば、プロテインA、プロテインG)
が挙げられる。
ニングする。ライブラリはファージディスプレイライブラリ、又はリボソームディスプレイ及び酵母ディスプレイ等の他のディスプレイライブラリであり得る。
ヒトの単量体のVH及びVL
異なる生殖細胞及び全配列を有する幾つかの単量体のヒトVHが、ファージプラークサイズに基づくこの選択方法によって、ナイーブヒトVHファージディスプレイライブラリから同定された(図1及び配列番号8〜配列番号22を参照のこと)。VHは、37℃でのトリプシン処理、37℃での数週間のインキュベート、又は4℃での数ヶ月の保存後でも機能性及び単量体を維持し、熱リフォールディング効率が高く、大腸菌において良好な収率で生成され、プロテインA結合活性を有する。
al., 2004a)。この研究における単量体のヒトVHが、DP−47を含む6個の異なる生殖細胞系配列から起因しているという見解によって、安定性のあるVHは生殖細胞系遺伝子の利用に関して限定されないことが実証される。事実、本発明者らがファミリーの単量体のVHを単離し、本明細書で記載するものとは異なる生殖細胞系起源は、プロテインA結合活性のあるVH3ファミリーのVHのサブセットに対する本発明者らの選択を制限させない可能性が非常に高い。VHにおいて複数の突然変異が発生すること、及びCDR3はsdAbの生物物理学的プロファイルの形成にも関与することが知られているという事実により、本発明のVHの観察された生物物理学な挙動に関与するアミノ酸突然変異(第1表)を特定することは不可能である。しかし、sdAb安定性及び可溶性に重要であることが知られている位置(例えば、HVHP423及びHVHP44BにおけるV37F)での突然変異又は同じ位置(例えば、9個のVHにおけるL5V/Q及びV5Q)で複数回起こる突然変異は、VHの生物物理学的特性を決定するのに役立つ。ライブラリ構築に関して、ライブラリ安定性を危うくすることなくCDRランダム化が行われるように、本発明のVHの単量体性は、CDR、特にCDR3には依存しないことが望ましい。これに関して、安定性に関してCDR3への依存性が小さいので、より小さいCDR3を有するVH(例えばHVHB82)が好ましいスカフォールドであり得る。
ができる。それにより、治療用VHの生成に対するヒトVHライブラリの手法の代替方法を提供する。後者の手法による親和性の高い治療用VHの生成は、最初の合成ヒトVHライブラリから選択される主要な結合因子(複数可)の面倒で、且つ時間のかかるさらなるin vitroの親和性突然変異を要求することが度々あり得る。
ファージディスプレイ、選択的感染ファージ及びタンパク質分解の手法が挙げられる。最初の2個の手法において、安定性のあるタンパク質が不安定なものよりもそのリガンドに対してより良好な結合特性を有するという仮定に基づき、親和性の選択を使用して、ライブラリから安定性のある種を選択する。しかし、安定性選択工程がさらに包含されていても、これらの手法は主に安定性よりも親和性をより高める(Jung, S. et al., 1999)。結
合工程が要求されることによって、既知のリガンドを有するタンパク質に対するこれらの手法の適用性も制限される。第3のタンパク質分解の手法は、不安定なタンパク質がプロテアーゼに対して耐性がないのに対して、安定性のあるタンパク質は一般的に小さく、したがってプロテアーゼに対して耐性があるという事実に基づいている。ファージディスプレイフォーマットは、表示されたタンパク質のプロテアーゼ安定性が、ファージ感染性に変換されるように操作される。このように、変異型のファージディスプレイライブラリをプロテアーゼで処理する場合、安定性のあるタンパク質を表示するファージのみがこれらの感染性を維持し、その後、大腸菌宿主を感染させることにより選択することができる。この手法はリガンド結合と独立しているので、一般的に有用である。しかし、安定であり、且つ十分にフォールディングしたタンパク質であってもプロテアーゼ感受性部位(例えば、ループ及びリンカー)を有し、これによりタンパク質分解の手法における安定性のある種の選択が妨げられることもあり得る(Bai, Y. et al., 2004)。
を使用して、非常に不安定なVH及びVLのバックグラウンドにおいて良好な生物物理学
的特性を有するVH及びVLを選択した。しかし、適度に良好な安定性を有するタンパク質で集合化された突然変異型のライブラリから「最良の」種を選択することはより困難であり得る。この場合、より短期間のインキュベート時間でのプラーク形成速度に基づくか、又はプラークサイズ及び頻度基準(frequency criteria)に基づいて、主要な変異型を同定することができる。
五量体の結合分析
VL及びVHの両方が五量体化の影響を受けやすく、五量体化を使用して、親和性の低いVL又はVHの単量体を親和性の高いVL又はVHの五量体に迅速に変換することができる。このような五量体は貴重な診断用薬剤及び検出用薬剤である。このような用途において、VL又はVHの五量体のその標的との結合は、酵素(例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ又はアルカリ性のホスファターゼ)等のレポーター分子又は五量体と結合する蛍光分子で検出することができる。代替的に、五量体の結合は、レポーター分子と結合する二次分子で検出することができる。二次分子は、五量体自体又は6Hisタグ若しくはc−Mycタグ等のタグに特異的であり得る。例えば、一般的な二次分子はイムノグロブリンである。
五量体による病原体検出
VHのプロテインA結合活性及びVLのプロテインL結合活性を使用して、表面上にプロテインA及び/又はプロテインLを有する細菌を検出することができる。プロテインAは、病原菌である黄色ブドウ球菌の表面上に存在する。このように、本明細書に記載のもの等のプロテインA結合活性を有するVHを使用して、黄色ブドウ球菌を検出することができる。同様に、細胞表面上にプロテインLを有する細菌、特にペプトストレプトコッカス属マグヌス(Peptostreptococcus magnus)等の病原菌の検出のために、プロテインL結
合活性を有するVL単量体及びVL五量体を使用することができる。
五量体がプロテインLのIgE架橋作用を阻害する可能性があるので、これらは治療剤として潜在性がある。
毒性因子に関連する。その毒性は、抗体と結合することを含む宿主成分と相互作用する能力に起因している。プロテインA結合活性を有するVH単量体及び/又はVH五量体が宿主成分を有するプロテインAの相互作用を阻害する可能性があるので、これらは治療剤として潜在性がある。
完全なヒトVHライブラリ及びラマ化したヒトVHライブラリの構築の間に、単量体のラマ化したVHを表示するファージが、凝集傾向のある完全なヒトVHを表示するファージよりも細菌層上でより大きいプラークを形成したことを確認した。このように、ヒトVHレパートリから珍しく自然発生的な単量体のVHを同定する手段として、プラークサイズを使用した(図1)。この目的で、サイズが6×108であるヒトVHを示すファージライブラリを構築し、寒天プレート上でプラークとして増殖させた。タイタープレート上で、ライブラリは本質的に、幾つかの大きいプラークが散在する小さいプラークから成る。20個のクローンにおけるPCRによって、小さいプラークがVH表示ファージに対応し、一方で大きいプラークは野性型のファージ(すなわち、VH配列挿入を欠くファージ)を表すことが示された。VH表示ファージは、大きいプラーク形態では見出されなかった。このことは、ヒトのレパートリ及び大きいサイズのライブラリにおける単量体のVHの不足により予想外のことではなかった。単量体のVHの同定を容易にするために、VH3ファミリー由来のヒトVHのサブセットと結合するプロテインAに対してライブラリをパンニングすることにより、ライブラリを取り扱いが可能な大きさまで縮小し、プラークサイズ形態が大きくなるのを阻害する野性型のファージを取り除くことを決めた。
ていた。HVHP423及びHVHP44Bを除いて、残りのVHは鍵となる可溶性位置で生殖細胞系残基を有していた:37V/44G/45L/47W又は37F/44G/45L/47W(HVHP428)、HVHP423及びHVHP44BはV37F突然変異を有していた。VH可溶性に重要であることが示されるか、又は仮定される他の位置での突然変異には、7個のE6Q、3個のS35T/H、1個のR83G及び1個のK83R、1個のA84P及び1個のT84A及び1個のM108Lが包含されていた。11個のE1Q、8個のL5V/Q及び1個のV5Q突然変異を包含した高頻度の突然変異も1位及び5位で観察された。
ヒトVHの生物物理学的特徴
HVHP44B(HVHP423と本質的に同じであった)を除いて、全てのVHはc−Myc−His5タグとの融合における培養液量1Lの大腸菌株TG1で発現し、固定化金属親和性クロマトグラフィ(IMAC)によって、ペリプラズム抽出物から均一に精製した。発現収率は、振盪フラスコ内で細菌培養液1L当たりで精製タンパク質1.8〜62.1mgの範囲であり、VHのほとんどは数mgの収率があった(第2表)。HVHP423及びHVHP430の例において、「明らかに」同じ発現条件下での別の試験によって、62.1及び23.7mgに対してそれぞれ、2.4及び6.4mgの収率が得られた。このことは、本明細書中に記載の多くのVHに対して、大した努力をせずに最適な発現条件を達成でき、それにより第2表で報告された値より有意に高い発現収率がもたらされることを意味している。予想通り、全てのVHは表面プラズモン共鳴(SPR)分析(KDは0.2〜3μMである)においてプロテインAと結合していて、範囲及び規模はプロテインA結合活性を有するラマVHH変異型についてこれまでに報告されていた範囲及び規模に匹敵していた。VHはFab基準面と結合しなかった。
のHVHP414のSDS−PAGE分析である。1時間以内に、元のバンドは、c−Myc−His5タグを有しないVHで期待される移動度があった単一の生成物に完全に変換された。トリプシンによる1時間のインキュベート後に12個の他のVHにおいて、同じ結果が得られた。トリプシン処理したVHのランダムに選択されたサンプル(すなわち、HVHP414、HVHP419、HVHP420、HVHP423、HVHP429、HVHP430及びHVHM81)における質量分析によって、それぞれの場合に、消化した生成物の分子質量がC末端残基としてのc−Myc Lysを有するVHに対応していたことが確認された。HVHM41において、消化時の残りよりも有意に短いフラグメントが与えられ、この場合質量分析実験によって、CDR3におけるArg99に対する切断部位がマッピングされた(データ図示せず)。
余り小さくなく、且つ非天然であり、ゲルろ過実験及びSPR実験の間室温まで戻した時にこれらの天然のフォールディングを再開する可能性は、十分にフォールディングした天然のタンパク質に一般的に関連する特性であるVHが37℃でトリプシンに対して耐性があった(上記を参照のこと)という事実を鑑みて疑わしい。
ヒトVHファージディスプレイライブラリ構築及びパンニング
ランダムヘキサヌクレオチドプライマー及びFirst Strand cDNA(商標)キット(GE Healthcare, Baie d'Urfe, QC, Canada)を使用して、ヒト脾臓mRNAからcDNAを合成した。鋳型としてcDNAを使用して、VHフレームワーク領域1(FR1)に特異的なプライマー及びイムノグロブリンM特異的なプライマー(de Haard, H. J. et al., 1999)を使用した9個の別々の反応におけるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって、CH配列をフランキングしたVH遺伝子を増幅した。生成物をゲル精製し、2回目のPCRにおける鋳型として使用することにより、クローニング目的のためにフランキングしたApal I及びNot I制限部位も導入したFR1特異的なプライマー及びFR4特異的なプライマー(de Haard, H. J. et al., 1999)を使用して、VH遺伝子を構築した。得られたVHレパートリDNAをfd−tetGIIIDファージベクターにクローニングし、VHファージディスプレイライブラリを構築した(Tanha, J. et al., 2001)。プロテインAに対するパンニング(Amersham Biosciences Inc.)を記載のように行
った(Tanha, J. et al., 2001)。DNAPLOTソフトウェアバージョン2.0.1及びV BASEバージョン1.0(http://vbase.dnaplot.de/cgi-bin/vbase/vsearch.pl)を使用して、選択されたVHの生殖細胞系配列帰属を行った。記載のようにH11 scFvに対してパンニングすることによって、ラマVHHファージディスプレイライブラリからラマVHH H11C7、H11F9及びH11B2を単離した(Tanha, J. et al., 2002)。
VHの発現及び精製
標準的なクローニング技法により、VHをpSJF2発現ベクターにクローニングした(Sambrook, J. Fritsch E. F. and Maniatis T, 1989)。sdAbのペリプラズム発現及
びその後の固定化金属親和性クロマトグラフィ(IMAC)による精製を記載のように行った(Muruganandam, A. et al., 2002)。それぞれのタンパク質において算出したモル吸
収係数を使用したA280測定によって、タンパク質濃度を測定した(Pace, C. N. et al., 1995)。記載のように、Superdex75カラム(GE Healthcare)において、精製
したVHのゲルろ過クロマトグラフィを行った(Deng, S. J. et al., 1995)。
結合及びリフォールディング効率の実験
VH/VHHの平衡解離定数(KD)及びリフォールディング効率(RE)は、BIACORE3000バイオセンサーシステム(Biacore Inc., Piscataway, NJ)で回収した表面プラズモン共鳴(SPR)データから得られた。プロテインAとのVHの結合を測定するために、プロテインAの2000個の共鳴単位(RU)又は基準となる抗原結合フラグメント(Fab)を研究等級のCM5センサーチップ(Biacore Inc.)上で固定化した。製造業者によって提供されるアミンカップリングキットを使用して、10mMの酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)中の25μg/ml(プロテインA)又は50μg/ml(Fab)の濃度で固定化を行った。抗イディオタイプのラマVHHのH11scFvとの結合を測定するために、上記のように、50μg/mlのH11 scFv 4100RU又は10μg/mlのSe155−4 IgG基準 3000RUを固定化した。全ての例において、流量40μl/分で、150mMのNaCl、3mMのEDTA及び0.005%のP20を含む10mMのHEPES(pH7.4)中、25℃で分析を行い、表面を洗浄緩衝液で洗浄することにより再生させた。リフォールディングタンパク質の結合活性を測定するために、10μg/mlの濃度、85℃で20分間インキュベートすることによって、VH又はVHHを変性させた。それから、リフォールディングするためにタンパク質サンプルを30分間室温まで冷却し、その後室温で5分間14000rpmでマイクロフュージで遠心分離して、任意のタンパク質沈殿物を除去した。上清を回収し、上記のようにSPRによって結合活性について分析した。BIAevaluation4.1ソフトウェア(Biacore Inc.)を同時に使用して、フォールディングしたタンパク質及びリフォールディングタンパク質両方に関するデータを1:1の相互作用モデルに適合させ、その後KDを求めた。REは、
トリプシン消化実験
1mMのHCl中の新たに調製した0.1μg/μlのシークエンシング等級のトリプシン(Hoffmann-La Roche Ltd., Mississauga, ON, Canada)3μlを100mMのTri
s−HCl緩衝液(pH7.8)中のVH60μgに加えた。37℃で1時間、全量60μlで消化反応を行い、0.1μg/μlのトリプシン阻害剤(Sigma, Oakville, ON, Canada)5μlを加えることにより停止させた。消化の完了後、5μlを取り除き、SDS
−PAGEで分析して、ZipTipC4(Millipore, Nepean, ON, Canada)を使用して
残りを脱塩し、50:50のメタノール:水の1%酢酸で溶離して、MALDI質量分析によってVHの質量を求めた。
37℃でのタンパク質安定性研究
37℃で17日間PBS緩衝液において0.32〜3.2mg/mlの濃度での単一ドメイン抗体(sdAb)をインキュベートした。インキュベートの後、視覚的に凝集体の形成が全く見られなくても、5分間最大速度でミクロフュージにおいてタンパク質サンプルを沈降させた。それから、サンプルをSuperdex75サイズ排除カラム(GE Healthcare)に適用させ、プロテインAに対するSPR分析における単量体のピークを回収し
た。プロテインA500RU又は基準Fabを固定化したこと、及び50μg/mlの濃度で固定化を行ったことを除いて、上記のようにSPR分析を行った。
NMR実験
NMR分析におけるVHサンプルを10mMのリン酸ナトリウム、150mMのNaCl、0.5mMのEDTA及び0.02%のNaN3(pH7.0)中に溶解した。タンパク質濃度は40μM〜1.0mMであった。全てのNMR実験は、Bruker Avance−800NMRスペクトロメータ又はBruker Avance−500NMRスペクトロメータにおいて298Kで行った。一次元(1D)1H NMRスペクトルを16384個のデータ点で記録し、スペクトル幅はそれぞれ、500MHzで8992.81Hz及び800MHzで17605.63Hzであった。2048×400のデータ点の二次元1H−1H NOESYスペクトルがスペクトル幅11990.04Hz及び混合時間120msのBruker Avance−800NMRスペクトロメータにおいて得られた。全てのNMR実験において、3−9−19パルス列によって行われたWATERGATE法(Piotto, M. et al., 1992; Sklenar, V. et al., 1993)を使用して
水抑制を達成した。NMRデータを処理し、Bruker XWINNMRソフトウェアパッケージを使用して分析した。3軸勾配がある三重共鳴プローブを備えるBruker
Avance−500 NMRスペクトルメータで水抑制LED配列(Altieri, A. S. et al., 1995)によって、全てのPFG−NMR拡散測定を行った。一次元プロトンスペ
クトルを処理し、Bruker Xwinnmrソフトウェアパッケージを使用して分析した。全ての所与のPFG強度で均一に全てのNMRシグナルが弱まった場合に、メチル及びメチレンプロトン領域(2.3ppm〜−0.3ppm)におけるNMRスペクトルを統合することにより、NMRシグナル強度を得た。
ヒトVLファージディスプレイライブラリ構築及びパンニング
ヒトVHに関して上記のように、cDNAをヒト脾臓mRNAから合成した。cDNAをPCRの鋳型として使用し、6個のVκバックプライマー、11個のVλバックプライマー(de Haard, H. J. et al., 1999)、4個のVκフォワードプライマー及び2個のVλフォワードプライマー(Sblattero, D. et al., 1998)を使用して、反応体積50μlでV
L遺伝子を増幅させた。バックプライマー及びフォワードプライマーを修飾して、その後のクローニング目的のためにそれぞれ、Apa LI制限部位及びNot I制限部位をフランキングさせた。これらの縮重の程度に反映された比で共にフォワードプライマーがプールされた。プールされたVλフォワードプライマー及び11個の個々のVλバックプライマーを使用して、11個の別々の反応でVλ遺伝子をPCRした。同様に、プールされたVκフォワードプライマー及び6個の個々のVλバックプライマーを使用して、6個の別々の反応でVλ遺伝子を増幅させた。PCR生成物をプールし、ゲル精製して、Apa LI制限エンドヌクレアーゼ及びNot I制限エンドヌクレアーゼで消化した。ヒトVHに関して上記のように、ライブラリを構築した。個々のライブラリコロニーにおいてプラークPCRを行い、増幅したVL遺伝子を記載のようにシークエンシングした(Tanha, J. et al., 2003)。ヒトVHライブラリに関して上記のように、プロテインL(Biolynx Inc., Brockville, ON, Canada)に対するパンニング及び選択されたVLの生殖細胞系の配列帰属を行った。
VLの発現及び精製
「VHの発現及び精製」においてVHに関して上記のように、VLの発現、精製、濃度決定及びゲルろ過クロマトグラフィを行った。
VL及びVH五量体の発現及び精製
標準的なPCRにおいて特異的なプライマーを使用して、HVHP328 VH及びHVLP335 VL遺伝子を増幅させた。標準的なクローニング技法を使用して、発現ベクターにおいてVT1B五量体化ドメイン遺伝子と融合して、HVHP328及びHVLP335遺伝子をクローニングして、HVHP328PVT2及びHVLP335PTV2五量体を得た(Zhang, J. et al. 2004)。五量体を記載のように発現及び精製した(Zhang, J. et al., 2004)。上記のようにタンパク質濃度を決定した。
VLの表面プラズモン共鳴
BIACORE3000バイオセンサーシステム(Biacore, Inc., Piscataway, NJ)を
使用したSPRによって、VLのプロテインLとの相互作用に対する結合反応速度を測定した。プロテインL680RU又は基準Fab 870RUを研究等級のCM5センサーチップ(Biacore)上で固定化させた。製造業者によって供給されたアミンカップリングキ
ットを使用して、10mMの酢酸緩衝液(pH4.5)において50μg/mlのタンパク質濃度で固定化を行った。50μl/分又は100μl/分の流量で150mMのNaCl、3mMのEDTA及び0.005%のP20を含む10mMのHEPES緩衝液(pH7.4)中、25℃で全ての測定を行った。洗浄緩衝液で洗浄することにより表面を再生した。BlAevaluation4.1ソフトウェア(Biacore, Inc.)を使用して
、データを評価した。
五量体VL及びVHの表面プラズモン共鳴
SPRによって、HVHP328PVT2のプロテインAとの相互作用及びHVLP335PTV2のプロテインLとの相互作用に対する結合反応速度を決定した。520RUのプロテインA又は基準Fabを上記のように固定化した。VL五量体に関して、上記のように調製した同様の表面を使用した。上記のように測定を行ったが、流量は20μl/分であった。3秒間、50mMのHClで洗浄することによって、表面を再生した。単量体に関して記載のようにデータを評価した。
細胞の微小凝集
BHIプレート由来の黄色ブドウ球菌の単一コロニーを使用して、BHI培地15mLを接種した。細菌を37℃、200rpmで一晩成長させた。翌朝、培養液を回転バケット、Sorvall RT6000B冷凍遠心器において4000rpmで10分間遠心分離し(spun down)、上清を除去して、細胞ペレットをPBS緩衝液で再懸濁させた。
細胞を再び遠心分離し、上清を除去して、細胞ペレットを再びPBS緩衝液で再懸濁させた。細胞をA600が1.0になるまで希釈し、段階希釈した細胞を37℃のBHIプレート上に広げて、一晩成長させた。翌朝、細胞力価を測定した。A600 1.0が1.5×109細胞/mlに対応する。同一の工程を行い、成長培地が2xYTであったこと
を除いて、その後の微小凝集アッセイのために大腸菌株TG1細胞を調製した。生菌数は同様であった、A600 1.0=2.1×109細胞/ml。
単量体のヒトVLの同定及び配列分析
ヒトVHファージディスプレイライブラリから可溶性のVHを単離するために用いられた本質的に同じ選択方法を、可溶性で単量体のVLを単離するためにヒトVLライブラリに適用した。大きさが3×106であるヒトVLライブラリを構築した。ライブラリタイタープレートから24個のプラークを選別し、これらのVL遺伝子をPCR及びシークエンシングした。配列は、生殖細胞系起源に関して異なるが、VLの75%はVλ起源であった(データ図示せず)。プロテインLに対する3回のパンニングによって、大きいプラークにおける富化がもたらされた。39個の大きいプラークをシークエンシングして、32個の特殊な配列を同定した(図6)。HVLP325、HVLP335及びHVLP351はそれぞれ、3、4及び2の頻度で起こった。λクラス(サブグループVλ1、生殖細胞系1b)であるHVLP389を除いて、残りの31個のVLはVκクラスに属していた。31個のκVLの中で、24個はVκIIIサブグループに含まれ、7個はVκ1サブグループに含まれていた。24個のVκIII配列の16個は、残りの利用されるA27、L2及びL6生殖細胞系配列を有するL6生殖細胞系配列を利用する。Vκ1サブグループのVLはO2/O12又はA30生殖細胞系配列に由来する。顕著な突然変異は96位で起こった。この位置での生殖細胞系アミノ酸は芳香族及び疎水性アミノ酸、κVLに対するTrp、Phe、Tyr、Leu又はIle、及びλVLに対するTyr、Val又はAlaである。しかし、κVLの選択プールにおける31個の中の5個だけが96位でこれらの生殖細胞系アミノ酸を有している:HVLP325、HVLP349、HVLP388、HVLP3109及びHVLP393。96位での21個のアミノ酸を帯電させ、この中の20個が正に帯電する:Arg、Lys又はHis。2個のアミノ酸はPro、1個はGln、1個はSer、及び1個はThrである。単量体化のためにゲルろ過クロマトグラフィで分析された7個のκVLの中で96位がArg又はLysである6個が単量体であった一方で、96位が生殖細胞系アミノ酸LeuであるHVLP325が凝集体を形成した(以下を参照のこと)。同様に、λクラスであり、且つSerに対する生殖細胞系突然変異を有していたHVLP389も単量体であった(以下を参照のこと)。これらのデータは単量体化等のVLの生物物理学的特性が改良された96位での生殖細胞系アミノ酸からの偏差に相関がある(32個の中の27個)。
ヒトVLの特徴付け
異なるV生殖細胞系起源を有する選択VLの中の8個は、培養液1L中の大腸菌で発現し、精製された:HVLP324、HVLP325、HVLP335、HVLP342、HVLP351、HVLP364、HVLP389及びHVLP3103(第6表)。全てがHVLP324に対する6.2mgからHVLP335及びHVLP364に対する
約75mgまでに及ぶ良好な収率で発現した。
1980)。HVLP325に関して、凝集体が全タンパク質(凝集体+単量体)の11%を構成していた。HVLP351、HVLP342、HVLP335及びHVLP3103は、これらの利用可能な最も高い濃度、すなわちそれぞれ、0.89mg/ml、1.0mg/ml、4.9mg/ml及び5.9mg/mlで試験した場合、依然として単量体であった(図7B)。
五量体の結合分析
表面プラズモン共鳴によって、HVHP328PVT2五量体のプロテインAとの結合及びHVLP335PTV2五量体のプロテインLとの結合を測定した(図9)。会合速度をkobs対濃度のプロットから独立して算出した。五量体の集合の間の多価結合における不均一性によって、1を超えた解離速度(kd)を算出することができる。したがって、1を超えた平衡解離定数(KD)を得ることができる。HVHP328PTV2及びHVLP335PTV2はそれぞれ、2nM及び200pMの最小KDを有していた(第4表)。kdがより遅い場合、HVHP328PTV2及びHVLP335PTV2はそれぞれ、900pM及び90pMまで低いKDを有していた。
VL及びVHによる病原菌検出
VHのプロテインA結合活性及びVLのプロテインL結合活性を使用して、これらの表面上にプロテインA及び/又はプロテインLを有する細菌を検出することができる。本明細書中のVH及びVL等のVH及びVLが可溶性であり、且つ単量体である(凝集傾向が失われている)場合、このことは可能である。ラクダ科の重鎖抗体又はナースシャーク及びテンジクザメのIgNAR等の軽鎖が欠失した抗体由来の可変ドメインは、自然発生的に可溶性且つ単量体である。このことから、プロテインA結合活性及びプロテインL結合活性を有するものを使用して、これらの表面上にプロテインA及び/又はプロテインLを有する細菌を検出することもできる。プロテインAは、病原菌である黄色ブドウ球菌の表面上に存在する。このように、本明細書中に記載のもの等のプロテインA結合活性のあるVHを使用して、黄色ブドウ球菌を検出することができる。本発明者らは微小凝集アッセイを行い、HVHP328PVT2 VH五量体の黄色ブドウ球菌と結合する能力を検出した。マイクロタイターウェル(ウェル1〜ウェル11)において2倍希釈したHVHP328PVT2で一定数の細菌細胞をインキュベートした(図10)。ウェル12は五量体の代わりに緩衝液を含んでいた。VHが細菌細胞と結合する場合、したがってその多量体の性質により、五量体は細胞を架橋し、その結果、細胞凝集をもたらすことが可能であ
るはずである。凝集細胞がマイクロタイターウェルにおける拡散細胞として現れる(図10)。何の結合もなければ、凝集は起こるはずがなく、したがって凝集体は存在せず、細胞はウェルの底部に点として現れる。図10で示されるように、細胞の凝集体が存在するので、五量体は黄色ブドウ球菌と結合する。凝集体は最大ウェル7まで観察される。ウェル7より先は、五量体の濃度が結合するには低すぎるので、凝集体は存在しない。対照のVL五量体は、全く凝集を示さず、これによりVH五量体の黄色ブドウ球菌に対する特異性が実証される(図10)。予想通りVH五量体が大腸菌(TG1株)又はサルモネラ細胞を凝集させないので、結合は細胞特異的でもある(データは示さず)。同様に、これらの細胞表面上にプロテインLを有する細菌、特にペプトストレプトコッカス属マグヌス等の病原菌の検出にプロテインL結合活性を有するVL単量体及びVL五量体を使用することができる。
参考文献リスト
Claims (15)
- QLQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSのフレームワークリージョン1(FR1)配列(配列番号16における1番目〜30番目のアミノ酸)、WFRQAPGKGLEWVGのFR2配列(配列番号16における36番目〜49番目のアミノ酸)、RFTISRDDSKSIAYLQMNSLRAEDTAMYYCARのFR3配列(配列番号16における69番目〜100番目のアミノ酸)、及びWGQGTLVTVSSのFR4配列(配列番号16における113番目〜123番目のアミノ酸)を含む、抗原結合V H フラグメント。
- 更に1個以上のランダム化された相補性決定領域(CDR)配列を含み、
前記CDR配列は、配列番号16における1個以上のCDR1、CDR2及びCDR3が、それぞれ、ランダム化されたCDR1、CDR2及びCDR3で置き換えられたものである、請求項1に記載の抗原結合V H フラグメント。 - 配列番号16の配列のFR1、FR2、FR3及びFR4部分、並びに
1個以上のランダム化されたCDR配列を含み、
前記CDR配列は、配列番号16における1個以上のCDR1、CDR2及びCDR3が、それぞれ、ランダム化されたCDR1、CDR2及びCDR3で置き換えられたものである、抗原結合V H フラグメント。 - 請求項1〜3のいずれか一項に記載の抗原結合V H フラグメントを含む多量体。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の抗原結合V H フラグメントを含む二量体。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の抗原結合V H フラグメントを含む三量体。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の抗原結合V H フラグメントを含む五量体。
- 1個以上のランダム化された相補性決定領域を有し、発現された請求項1〜3のいずれかに記載の抗原結合V H フラグメントが、リボソーム、酵母、細菌細胞又はファージにディスプレイされている、構築されたディスプレイライブラリ。
- ライブラリがファージディスプレイライブラリである、請求項8に記載のディスプレイライブラリ。
- ライブラリが、リボソームディスプレイ、ARMリボソームディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌細胞ディスプレイ、又はインビトロ区画化ライブラリである、請求項8に記載のディスプレイライブラリ。
- a)請求項1に記載の抗原結合V H 抗体フラグメントをコードする核酸を提供する工程、
b)ランダム化されたコドンを含むオリゴヌクレオチドを提供する工程、
c)配列番号16において、1個以上の相補性決定領域(CDR)をランダム化し、1個以上のCDR1、CDR2及びCDR3が、それぞれ、ランダム化されたCDR1、CDR2及びCDR3で置き換えられるように、前記a)に記載の抗原結合V H 抗体フラグメントをコードする核酸へランダム化オリゴヌクレオチドを組み込む工程、
d)工程c)で作製された核酸を発現させる工程、及び
e)発現された、標的ポリペプチドへ結合するペプチドをスクリーニングする工程、
を含む、抗原結合V H フラグメントライブラリを作製する方法。 - スクリーニングが、標的分子に対してパンニングを行うことをさらに含む、請求項11に記載の方法。
- 標的分子に対してパンニングを行うことを含む、請求項8〜10のいずれか一項に記載のディスプレイライブラリのスクリーニングする方法。
- 配列番号16におけるCDR3が、ランダム化されたCDR3で置き換えられたものであり、前記ランダム化されたCDR3が12個のアミノ酸残基を有する、請求項3に記載の抗原結合V H フラグメント。
- 凝集耐性のある請求項1〜3のいずれか一項に記載の抗原結合V H フラグメント。
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