ES2534305T3 - Método para aislamiento de polipéptidos solubles - Google Patents

Abstract

Un fragmento de anticuerpo que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 22.

Description

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31-03-2015

HVHP414 con una mutación c-Myc N132E y con un residuo metionina adicional en el término N. En resumen, los datos de PFG-NMR (no presentados) indicaban que todas las muestras de proteína tenían los pesos moleculares monómeros esperados incluso a las concentraciones de proteína relativamente altas utilizadas para los experimentos NMR.

Se investigó ulteriormente la estabilidad de los VHs en términos de su resistencia a tripsina en cuanto a integridad a 37ºC después de incubaciones largas a 37ºC. La tripsina escinde las cadenas principales amídicas de los polipéptidos en el término C de un residuo Arg o Lys. Existen 9-13 residuos Arg y Lys en los VHs humanos (Figura2). Existe también un residuo Lys adicional en la etiqueta c-Myc del terminal C que es sensible a la digestión por tripsina. La Figura 4a es un análisis SDS-PAGE de HVHP414 durante la digestión con tripsina. En el transcurso de una hora, la banda original se convertía completamente en un producto simple que tenía una movilidad esperada para el VH sin etiqueta c-Myc-His5 alguna. Se obtuvo el mismo resultado para otros 12 VHs después de incubación de una hora con tripsina. La espectrometría de masas sobre una muestra seleccionada al azar de los VHs tratados con tripsina (a saber, HVHP414, HVHP419, HVHP420, HVHP423, HVHP429, HVHP430 y HVHM81) confirmó que en todos los casos la masa molecular del producto digerido correspondía a un VH con el c-Myc Lys como el residuo Cterminal. HVHM41 daba un fragmento significativamente más corto que el resto después de digestión, y en este caso los experimentos de espectrometría de masas mapeaban el sitio de escisión en la Arg 99 en CDR3 (datos no presentados).

Once VHs comprendidos en concentración desde 0,32 mg/ml (HVHP428) hasta 3,2 mg/ml (HVHP420) se incubaron a 37ºC durante 17 días. Su estabilidad se determinó subsiguientemente en términos de estado de oligomerización y fijación de proteína A. Como se demostró por cromatografía de permeación en gel, el tratamiento de VHs a 37ºC no inducía formación alguna de agregados: todos los VHs daban perfiles de cromatograma que eran virtualmente idénticos a los de VHs sin tratar y se mantenían esencialmente como monómeros (véase el ejemplo para HVHP420; Figura 4c). Para asegurarse de que los VHs mantenían su plegamiento nativo después de tratamiento a 37ºC, se seleccionaron al azar dos VHs, a saber, HVHP414 (1,2 mg/ml) y HVHP420 (3,2 mg/ml), y se determinaron sus KDs de fijación a proteína A por SPR (datos presentados para HVHP420; recuadro en la Figura 4c) y se compararon con los KDs obtenidos para VHs sin tratar (Tabla 2). Los KDs calculados para los VHs tratados térmicamente eran 1,4 μM y 1,0 μM para HVHP414 y HVHP420, respectivamente. Estos valores son esencialmente idénticos a los valores correspondientes para los VHs sin tratar (Tabla 2), demostrando que el tratamiento de VHs a 37ºC no afectaba a su plegamiento nativo. La posibilidad de que los VHs puedan haber estado en un plegamiento no nativo menos compacto durante los periodos de incubación a 37ºC y hayan adquirido nuevamente su plegamiento original después de volver a la temperatura ambiente durante los experimentos de filtración en gel y SPR es poco probable, a la vista del hecho de que los VHs eran resistentes a tripsina a 37ºC (véase arriba), una propiedad asociada típicamente para proteínas nativas bien plegadas.

La eficiencia de replegado (RE) de los VHs humanos se investigó por comparación de los valores KDs de la fijación de los VHs nativos (KDn) y los replegados y tratados térmicamente (KDref) a la proteína A (Tanha, J. et al., 2002). Cuando se desactiva una fracción del VH por tratamiento térmico, el valor KD medido debe ser mayor, dado que este parámetro está basado en la concentración de fragmento de anticuerpo plegado, es decir, activo. Así, la ratio de KDn a KDref da una medida de la RE de VH. La Figura 5 compara sensogramas para fijación de HVHP423 a proteína A inmovilizada en estados nativo (líneas gruesas) y replegado (líneas delgadas) para varias concentraciones de VH seleccionadas. Como puede verse, la fijación del VH replegado a proteína A es menor en todos los casos, lo que indica que el desplegado no es totalmente reversible. Para cada uno de los 14 VHs, se midió la fijación a la proteína A en ambos estados nativo y replegado a varias concentraciones, y se determinaron los valores KDs y subsiguientemente REs (Tabla 2, no se muestran los valores KDref). Se determinaron también los valores KDs y REs de dos VHHs anti-idiotípicos de llama, H11F9 y H11B2, que se utilizaron como referencias. Cuatro VHs tenían REs en el intervalo de 92%-95%, similares a las REs para H11F9 y H11B2, 95% y 100%, respectivamente. Otros cinco tenían REs en el intervalo de 84%-88% y tres superiores a 70%. Únicamente dos tenían RE significativamente menor: HVHP413 (52%) y HVHP421 (14%). Varios VHHs publicados examinados con anterioridad tenían RE próxima a 50% (van der Linden, R.H. et al., 1999).

Construcción y lavado en batea de bibliotecas de presentación de fago VH humanas. Se sintetizó cDNA a partir de mRNA de bazo humano (Ambion Inc., Austin, TX) utilizando iniciadores hexanucleotídicos aleatorios y el kit de DNA de la Primera Cadena™ (GE Healthcare, Baie d'Urfé, QC, Canadá). Utilizando los cDNAs como molde, genes de VH con secuencias CH flanqueantes se amplificaron por la reacción en cadena de polimerasa (PCR) en nueve reacciones separadas utilizando iniciadores específicos de la región de entramado 1 (FR1) de VH y un iniciador específico de inmunoglobina M (de Haard, H.J. et al., 1999). Los productos se purificaron en gel y se utilizaron como el molde en la segunda tanda de PCR para construir genes de VH utilizando los iniciadores específicos FR1 y FR4 (de Haard, H.J. et al., 1999) que introducían también sitios de restricción flanqueantes Apa lI y Not I para propósitos de clonación. Los DNAs del repertorio VH resultantes se clonaron en el vector de fago fd-tetGIIID y se construyó una biblioteca de presentación de fago de VH (Tanha, J. et al., 2001). El lavado en batea contra proteína A (Amersham Biosciences Inc.) se realizó como se ha descrito (Tanha, J. et al., 2001). La asignación de secuencias de la línea germinal de los VHs seleccionados se realizó utilizando el software DNAPLOT, Version 2.0.1 y V BASE Version 1.0. (http://vbase.dnaplot.de/cqi-bin/vbase/vsearch.pl). Se aislaron los VHHs de llama H11C7, H11F9 y H11B2 de una biblioteca de presentación de fago VHH de llama por lavado en batea contra H11 scFv como se ha

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