ES2375826T3

ES2375826T3 - Método para aislamiento de polipéptidos solubles.

Info

Publication number: ES2375826T3
Application number: ES06721715T
Authority: ES
Inventors: Jamshid Tanha
Original assignee: National Research Council of Canada
Current assignee: National Research Council of Canada
Priority date: 2005-03-25
Filing date: 2006-03-24
Publication date: 2012-03-06
Anticipated expiration: 2026-03-24
Also published as: JP6374851B2; EP2316948A1; EP2368991B1; EP2330196A3; EP2368997A2; EP2336325A1; EP2338999A2; ES2558338T3; EP2322622A2; EP2338999A3; EP2322624A2; EP2360256B1; EP2368991A3; EP2336326A3; JP2018110583A; US20090220485A1; EP2386638A3; EP2368994A2; EP2338997A1; EP1869182B1

Abstract

Un método de identificación de fragmentos de anticuerpo VH y/o VL humanos estables diana, que comprende: a. obtener una biblioteca de presentación de fago capaz de expresar una diversidad de fragmentos de anticuerpo VH y/o VL; b. permitir la infección de un césped bacteriano por el fago de la biblioteca; y c. identificar fagos que forman calvas mayores en el césped bacteriano; d. aislar el fago de la calva mayor en el paso (c) de la reivindicación 1; y e. determinar la secuencia de otras características de los fragmentos de anticuerpo VH y/o VL expresados por el fago de la calva mayor.

Description

Metodo para aislamiento de polipeptidos solubles

Campo de la invenci6n

Esta invenci6n se refiere al aislamiento, identificaci6n y manipulaci6n de polipeptidos, especialmente fragmentos 5 mon6meros de anticuerpos humanos.

Antecedentes de la invenci6n

Los anticuerpos en los vertebrados se componen tipicamente de cadenas pesada (H) y ligera (L) apareadas. El primer dominio de las cadenas H y L combinadas, el VH y VL, son de secuencia mas variable, y esta es la porci6n del anticuerpo que reconoce el antigeno y se fija al mismo. Los dominios VH y VL reconocen el antigeno como un par.

10 El repertorio inmunol6gico de los Camelidos (camellos, dromedarios y llamas) es unico en el sentido de que posee tipos raros de anticuerpos a los que se hace referencia como anticuerpos de cadena pesada (Hamers, Casterman C. et al., 1993). Estos anticuerpos carecen de cadenas ligeras y por tanto sus sitios de combinaci6n estan constituidos por un solo dominio, denominado VHH.

Los anticuerpos VHH recombinantes de un solo dominio (sdAbs) proporcionan varias ventajas sobre los fragmentos

15 FV monocatenarios (scFv) derivados de anticuerpos convencionales de cuatro cadenas. Si bien los sdAbs son comparables a sus contrapartidas scFv en terminos de afinidad, los mismos superan a los scFv en terminos de solubilidad, estabilidad, resistencia a la agregaci6n, susceptibilidad de replegado, rendimiento de expresi6n, y facilidad de manipulaci6n del DNA, construcci6n de bibliotecas y determinaciones estructurales 3-D. muchas de las propiedades mencionadas de los scAbs VHH son deseables en aplicaciones que implican anticuerpos.

20 Sin embargo, la naturaleza no humana de los VHHs limita su uso en inmunoterapia humana debido a inmunogenicidad. A este respecto, los sdAbs VH y VL humanos son candidatos ideales para aplicaciones de inmunoterapia debido a que se espera que sean menos inmun6genos.

Los VHs y VLs humanos, sin embargo, son por lo general tendentes a agregaci6n, una caracteristica comun a los VHs y VLs derivados de anticuerpos convencionales (Davies, J. et al., 1994; Tanha, J. et al., 2001; Ward E.S. et al.,

25 1989). Por ello, se han realizado intentos para obtener VHs y VLs humanos adecuados para aplicaciones de anticuerpos. Tales VHs y VLs han exhibido tambien otras propiedades utiles tipicas de los VHHs tales como alto rendimiento de expresi6n, alta susceptibilidad de replegado y resistencia a la agregaci6n. Bibliotecas sinteticas construidas a base de estos VHs y VLs como andamiajes de biblioteca podrian servir como una fuente prometedora de proteinas terapeuticas.

30 La camelizaci6n y la llamizaci6n, que implican incorporar residuos importantes de solubilidad de los VHHs de camello y llama, respectivamente, en VHs o VLs humanos se han empleado para generar VHs y VLs humanos mon6meros. Se ha demostrado que bibliotecas sinteticas de sdAb construidas sobre la base de estos VHs y VLs y generadas por aleatorizaci6n de la CDR son funcionales en terminos de producci6n de ligantes para diversos antigenos (Davies, J. et al., 1995; Tanha J. et al., 2001).

35 En otro enfoque, se aislaron VHs y VLs mon6meros totalmente humanos de bibliotecas sinteticas humanas de VH y VL sin recurrir a ingenieria de la clase arriba mencionada. En un experimento, se descubri6 un VH humano mon6mero cuando una biblioteca de VH humano se lav6 en batea contra lisozima de huevo de gallina (Jespers, L. et al., 2004b). Mas recientemente, un metodo de selecci6n basado en criterios de desplegado reversible y afinidad produjo un gran numero de VHs mon6meros a partir de bibliotecas humanas sinteticas de VH (Jespers, L. et al.,

40 2004a). Este descubrimiento puso de manifiesto el hecho de que un metodo de selecci6n apropiado es fundamental para la captura eficiente de VHs humanos mon6meros raros con propiedades biofisicas deseables.

Objetos de la invenci6n

Un primer objeto de la invenci6n es proporcionar un metodo de cribado de alta potencia para identificaci6n de fragmentos de anticuerpo VH y/o VL humanos estables diana.

45 Sumario de la invenci6n

Se proporciona un metodo para identificaci6n de fragmentos de anticuerpo VH y VL humanos estables. El metodo incluye los pasos de obtenci6n de una biblioteca de presentaci6n de fago capaz de expresar una diversidad de fragmentos de anticuerpo VH y VL, permisi6n de la infecci6n de un cesped bacteriano por el fago de la biblioteca, e identificaci6n de fagos que forman calvas mayores que el tamafo medio en el cesped bacteriano. Se aislan luego

50 los fagos de las calvas de mayor tamafo, pudiendo determinarse la secuencia u otras caracteristicas de los fragmentos de anticuerpo VH y/o VL expresados por los fagos de las calvas mayores.

En un primer aspecto, la presente invenci6n proporciona un metodo de identificaci6n de fragmentos de anticuerpo VH y/o VL humanos estables diana, que comprende a) obtener una biblioteca de presentaci6n de fago capaz de expresar una diversidad de fragmentos de anticuerpo VH y/o VL, b) permitir la infecci6n de un cesped bacteriano por el fago de la biblioteca y c) identificar fagos que forman calvas mayores que el tamafo medio en el cesped bacteriano.

Descripci6n Detallada de los Dibujos

Leyendas de las figuras

Figura 1. Una representaci6n grafica de los resultados de ejemplos seleccionados: el contraste en el tamafo de calva entre fagos que presentan un VH soluble (HVHP428) y aquellos que presentan uno insoluble (BT32/A6). La fotografia muestra una parte de la placa de agar de cesped bacteriano que se ampli6 para mejorar la visualizaci6n de la calva. Aunque la placa contenia un numero igual de cada uno de los dos tipos de calva, la fotografia contiene esencialmente las calvas HVHP428, de tamafo grande. La mayoria de las calvas BT32/A6 eran demasiado pequefas para producir imagenes claras bien definidas en la fotografia. Por tanto, las calvas marcadas por flechas representan una proporci6n menor de fagos BT32/A6 que eran lo suficientemente grandes para ser visibles en esta imagen. Los asteriscos marcan tamafos de calva representativos para los fagos HVHP428. Las identidades de las calvas se determinaron por secuenciaci6n del DNA.

Figura 2. Secuencia de aminoacidos de los VHs humanos seleccionados sobre la base de la afinidad para la proteina A y el tamafo de la calva. Los puntos en las entradas de la secuencia indican identidad de aminoacidos con HVHP2M10 o HVHP44. Se incluyen guiones para alineaci6n de las secuencias. Los residuos en las posiciones de solubilidad principales y el residuo 57T que se asocia con VHs/VHHs con la propiedad de fijaci6n de proteina A se muestran en negrilla. Se utiliza el sistema de numeraci6n Kabat. El valor de la "frecuencia" total es 114

CDR = regi6n determinante de la complementariedad; FR = regi6n de entramado; gln seq = secuencia de la linea germinal

Figura 3. Tendencias de agregaci6n de los VHs humanos. Cromatogramas de filtraci6n en gel que comparan el estado de oligomerizaci6n de un VH humano aislado en este estudio (HVHP428) con el de un VHH de llama (H11C7) y un VH humano tipico (BT32/A6). El pico que se eluye en ultimo lugar en cada cromatograma corresponde al VH mon6mero. El pico H11C7 dimero esta marcado por una flecha. B, espectros 1H NMR unidimensionales de HVHP414 a 800 MHz (i), HVHP423 a 500 MHz (ii) y HVHP428 a 800 MHz (iii). Los espectros en el panel izquierdo estan aumentados a escala con un factor de dos a fin de permitir una mejor observaci6n de las sefales de baja intensidad.

Figura 4. Estabilidad de los VHs humanos en terminos de su resistencia a tripsina a 37°C y su integridad despues de incubaci6n larga a 37°C. A, SDS-PAGE que compara las movilidades del VH HVHP414 sin tratar y tratado con tripsina a los 15, 30 y 60 min con relaci6n a un marcador de 21 kDa. HVHP414-cMyc denota VH de HVHP414 que carece del c-Myc. B, perfiles de masa molecular obtenidos por espectrometria de masas de VH de HVHP414 sin tratar y tratado con tripsina (60 min). El perfil de la espectrometria de masas del VH tratado se ha superpuesto al correspondiente al del VH sin tratar para proporcionar una mejor comparaci6n visual. La masa molecular experimental del VH sin tratar es 14.967,6 Da, que es esencialmente identica a la masa molecular esperada, 14.967,7 Da. La masa molecular observada del VH tratado con tripsina (13.368,5 Da) indica la perdida de 13 aminoacidos en el termino C por escisi6n en K (Lys) en la etiqueta de c-Myc para dar una masa molecular esperada de 13368,0 Da. El sitio de escisi6n de tripsina se muestra por una flecha vertical encima de la secuencia de aminoacidos de HVHP414. C, cromatogramas de filtraci6n en gel que comparan el estado de oligomerizaci6n del VH HVHP420 tratado a 37°C (perfil superior) con el del VH sin tratar (perfil inferior). Los cromatogramas se desplazaron verticalmente debido a que no podian distinguirse cuando estaban superpuestos. Los picos mayor y menor en cada cromatograma corresponden a VHs mon6meros y dimeros, respectivamente. El VH dimero constituye 3% de la proteina total. El recuadro muestra las superposiciones de sensogramas para la fijaci6n de HVHP420 tratado a 37°C a la proteina A a diversas concentraciones. Los VHs utilizados para estudios de estabilidad termica procedian de stocks que habian estado ya a 4°C durante varios meses.

Figura 5. Superposiciones de sensogramas que muestran la fijaci6n de HVHP423 nativo (lineas gruesas) y replegado (lineas delgadas) a la proteina A inmovilizada a concentraciones de 75, 100, 150 y 200 nM. Kon y Koref se calcularon a partir de los sensogramas respectivos y se utilizaron para determinar RE como se describe mas adelante.

Figura 6. Secuencias de aminoacidos de los VLs humanos seleccionados basadas en afinidad para la proteina L y tamafo de calva. Los puntos en las entradas de la secuencia indican identidad de aminoacidos con HVLP333. Se incluyen guiones para alineaci6n de la secuencia. Vease la BASE V (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/index.php?module=pagemaster&PAGE user op=view page&

PAGE id=7&MMN position=5:5) para numeraci6n de las secuencias y designaci6n de la CDR. L6, A27, L2, L16,

02/012, A30 y 1b son designaciones de la linea germinal V. Las designaciones de la linea germinal J aparecen entre parentesis. NF, no encontrado.

Figura 7. Cromatogramas de exclusi6n por tamafos de dominios VL humanos. En A, se aplicaron los VLs a una concentraci6n de 0,6 mg/ml. En B, se aplicaron los VLs a su maxima concentraci6n disponible: HVLP342, 1,0 mg/ml; HVLP3103, 5,9 mg/ml; HVLP335, 4,9 mg/ml, HVLP351, 0,89 mg/ml. "#" y "*" representan picos agregados y mon6meros, respectivamente. Los agregados se eluyen en el volumen de exclusi6n. El pico marcado por una flecha en el panel HVLP342 (B) es el arrastre de una operaci6n previa.

Figura 8. Superposiciones de sensogramas que muestran la fijaci6n de VLs a la proteina L inmovilizada a concentraciones de 0,2, 0,5, 0,75, 1, 2, 3, 5 y 10 IM (HVLP389, HVLP351 y HVLP364); 1, 2, 3, 5, 7,5 y 10 nM (HVLP342); 0,2, 0,5, 1, 2, 3, 5 y 10 IM (HVLP335); 0,2, 0,5, 1, 1,5, 2 y 5 IM (HVLP325), 0,2, 0,5, 0,75, 1, 1,5, 2, 3 y 5 IM (HVLP3103) y 1, 2, 3, 4, 5 y 6 nM (HVLP324). Los sensogramas para las fijaciones de HVLP324 y HVLP342 al sitio de baja afinidad de la proteina L no se incluyen, pero los KDs calculados se registran en la Tabla 3.

Figura 9. Fijaciones de HVHP328PTV2 a proteina A y HVLP335PTV2 a proteina L en experimentos de resonancia de plasmones de superficie. (A) Superposiciones de sensogramas que muestran la fijaci6n de HVH28PTV2 a proteina A inmovilizada a concentraciones de 1, 2, 3, 4, 6, 8 y 10 nM. (B) Superposiciones de sensogramas que muestran la fijaci6n de HVLP335PTV2 a proteina L inmovilizada a concentraciones de 1, 2, 2,5, 3, 3,5, 4 y 4,5 nM. Los datos de fijaci6n se registran en la Tabla 4.

Figura 10. Figura que muestra los resultados de los experimentos de microaglutinaci6n con celulas de S. aureus. La concentraci6n de los pentameros decrece dos veces desde el pocillo 1 al pocillo 11, teniendo el pocillo 12 los pentameros reemplazados con tamp6n de PBS. Los pocillos de la fila superior contienen pentamero de HVHP328PTV2 y los del fondo pentamero HVLP335PTV2. Las concentraciones de los pentameros en los pocillos 1 a 6 son 215, 108, 54, 27, 13 y 7 Ig/ml, respectivamente.

Descripci6n Detallada de la Invenci6n

Es deseable identificar fragmentos de anticuerpo VH y VL mon6meros humanos estables. Tales fragmentos de anticuerpo son utiles para una gran diversidad de aplicaciones inmunoterapeuticas, y como agentes de diagn6stico y detecci6n.

Los fragmentos de anticuerpo VH y/o VL humanos estables pueden identificarse por cribado de alta capacidad de bibliotecas capaces de expresar una diversidad de secuencias de polipeptidos. Por ejemplo, bibliotecas de presentaci6n de fago (preferiblemente de fago filamentoso tal como M13 o fd) pueden cribarse por infecci6n de un campo de bacterias sensibles al fago (un cesped bacteriano) con el fago, seguido por determinaci6n de que fagos han lisado satisfactoriamente las bacterias buscando las areas claras exentas de bacterias, conocidas como calvas. Los fagos que exhiben VHs y VLs mon6meros llamizados forman calvas de mayor tamafo en los cespedes bacterianos que los fagos que exhiben VHs totalmente humanos con tendencias a la agregaci6n. Asi, el tamafo de las calvas puede utilizarse como medio de identificaci6n de VHs y VLs mon6meros raros existentes naturalmente del repertorio de VH humanos.

El metodo descrito en esta memoria es util tambien en la identificaci6n de fragmentos de anticuerpos VH y/o VL humanos solubles y estables (la estabilidad abarca varias caracteristicas, que incluyen, pero sin caracter limitante, eficiencia de replegado termico alta, temperatura de fusi6n alta, mantenimiento de la funcionalidad despues de larga incubaci6n (de varios dias) a 37°C, resistencia a los desnaturalizantes quimicos, resistencia a las proteasas, teniendo una vida util larga a temperaturas inferiores a 0°C, y 4°C, y a la temperatura ambiente, mantenimiento de la funcionalidad en ambientes intracelulares, y mantenimiento de la funcionalidad en el interior del cuerpo humano, por ejemplo en el torrente sanguineo) y expresi6n alta de fragmentos de anticuerpo VH y/o VL humanos.

VHs y VLs humanos mon6meros

Se identificaron varios VHs humanos mon6meros con diferentes secuencias de la linea germinal y totales (vease Figura 2) de una biblioteca de presentaci6n de fago VH humano naif por este metodo de selecci6n basado en el tamafo de las calvas de fago. Los VHs se mantienen funcionales y en forma mon6mera despues de tratamiento con tripsina a 37°C, semanas de incubaciones a 37°C o meses de almacenamiento a 4°C, tienen altas eficiencias de replegado termico, se producen con buenos rendimientos en E. coli y poseen actividad de fijaci6n de la proteina A.

Se identificaron ademas varios VLs humanos mon6meros (vease la Figura 6). Los VLs se producen tambien con buenos rendimientos en E. coli y poseen actividad de fijaci6n de proteina L.

Dichas propiedades seran manifestadas tambien por VHs de bibliotecas sinteticas que utilicen los VHs anteriores como andamiaje. Asi, tales bibliotecas pueden producir VHs terapeuticos o de diagn6stico que podrian tener eficacia satisfactoria a temperatura fisiol6gica, vida util prolongada y una producci6n eficaz en costes. La caracteristica de alta eficiencia de replegado termico podria aumentar adicionalmente las aplicaciones biotecnol6gicas de etas bibliotecas a situaciones en las cuales se requieran fijadores de VH para mantener su actividad despues de

exposici6n a temperaturas altas transitorias. Los VHs podrian ser tambien muy adecuados para aplicaciones intracorp6reas debido a sus propiedades biofisicas deseables. La propiedad de fijaci6n de la proteina A simplificara la purificaci6n y detecci6n de VH en tests de diagn6stico, inmunotransferencia e inmunocitoquimica y puede aprovecharse para mejorar la eficiencia de las bibliotecas por retirada de los VHs no funcionales de las mismas. Analogamente, las bibliotecas que utilizan VHs como entramado produciran VLs terapeuticos o de diagn6stico que tengan propiedades analogamente deseables. Dado que los VLs se fijan con la proteina L, la purificaci6n y detecci6n de VL se simplifica aprovechando la ventaja de esta propiedad de fijaci6n de la proteina L.

Los VHs totalmente humanos consignados anteriormente con propiedades biofisicas favorables estaban basados en una secuencia de la linea germinal V simple: DP-47 ((Jespers, L. et al., 2004b; Jespers, L. et al., 2004a). La observaci6n de que los VHs humanos mon6meros de este estudio proceden de 6 secuencias de la linea germinal diferentes con inclusi6n de DP-47, demuestra que los VHs estables no estan restringidos en terminos de uso de genes de la linea germinal. De hecho, es muy probable que los autores de la invenci6n hubieran aislado VHs mon6meros de familia y origenes de linea germinal diferentes de los que se describen en esta memoria si no hubieran restringido la selecci6n a un subconjunto de VHs de la familia VH3 con actividad de fijaci6n de la proteina A. No es posible concretar aqui las mutaciones de aminoacidos (Tabla 1) responsables del comportamiento biofisico observado de los presentes VHs debido a la aparici6n de mutaciones multiples en VHs y al hecho de que se sabe tambien que CDR3 esta implicado en la conformaci6n de los perfiles biofisicos de sdAbs. Es posible, sin embargo, que mutaciones en las posiciones que se saben son importantes para la estabilidad y solubilidad de los sdAbs, v.g., V37F en HVHP423 y HVHP44B, o mutaciones que aparecen multiples veces en la misma posici6n, v.g., L5V/Q y V5Q en nueve VHs, tengan un papel en la determinaci6n de las propiedades biofisicas de VHs. En terminos de construcci6n de bibliotecas, seria deseable que el caracter mon6mero de los presentes VHs no sea dependiente de CDRs, en particular CDR3, a fin de que la aleatorizaci6n de CDR pueda realizarse sin la preocupaci6n de comprometer la estabilidad de la biblioteca. A este respecto, los VHs con CDR3 menor, v.g., HVHP82, pueden ser andamiajes preferidos, dado que ello implicaria menos dependencia de CDR3 para la estabilidad.

Se han descrito cierto numero de enfoques evolutivos para la selecci6n de proteinas con propiedades biofisicas mejoradas (Forrer, P. et al., 1999; Waldo, G.S., 2003); (Jespers, L. et al., 2004a; Jung, S. et al., 1999; Matsuura, T. et al., 2003). Tipicamente, se requiere una presi6n de estabilidad para asegurar la selecci6n preferencial de las variantes estables sobre las inestables o menos estables, de una poblaci6n de biblioteca. Por ejemplo, en un trabajo afin, se requiri6 tratamiento termico de bibliotecas de presentaci6n del fago VH para seleccionar VHs resistentes a la agregaci6n (Jespers, L. et al., 2004a). Ejemplos de enfoques de selecci6n evolutivos que implican presentaci6n de fago incluyen presentaci6n de fago convencional, fagos selectivamente infectivos y los enfoques de prote6lisis. En los dos primeros enfoques se utiliza selecci6n por afinidad para seleccionar especies estables de una biblioteca, basadas en la hip6tesis de que las proteinas estables poseen mejores propiedades de fijaci6n a su ligando que las inestables. Sin embargo, aun con la inclusi6n adicional de un paso de selecci6n por estabilidad, estos enfoques pueden enriquecer fundamentalmente por mayor afinidad mas que por mayor estabilidad (Jung, S. et al., 1999). Un requerimiento de pasos de fijaci6n limita tambien la aplicabilidad de estos enfoques a proteinas con ligandos conocidos. El tercero, enfoque de prote6lisis, esta basado en el hecho de que las proteinas estables son generalmente compactas y por consiguiente son resistentes a las proteasas, mientras que las inestables no lo son. El formato de presentaci6n de fago se modifica por ingenieria genetica de tal manera que la estabilidad a las proteasas de la proteina presentada se traduce en infectividad del fago. Asi, cuando una biblioteca variante de presentaci6n de fago se trata con una proteasa, unicamente los fagos que exhiben proteinas estables retienen su infectividad y pueden seleccionarse subsiguientemente por infecci6n de un E. coli hospedador. Dado que este enfoque es independiente de la fijaci6n de ligandos, el mismo es de utilidad general. Sin embargo, incluso las proteinas estables y bien plegadas tienen sitios sensibles a las proteasas, v.g. bucles y enlazadores, y esto podria impedir en algunos casos la selecci6n de especies estables en un enfoque de prote6lisis (Ban, Y. et al., 2004).

En contraste, en el presente enfoque evolutivo, los fragmentos de anticuerpo con propiedades biofisicas superiores (mayor estabilidad) se identifican directamente a simple vista. El enfoque no requiere pasos de fijaci6n de ligando, prote6lisis o desestabilizaci6n, y por consiguiente evita complicaciones que pueden encontrarse en los enfoques de selecci6n indicados. La ausencia de requerimiento de un paso de fijaci6n significa tambien que este enfoque tiene utilidad general. Como opci6n, puede incluirse un paso de fijaci6n para asegurar que las proteinas seleccionadas sean funcionales. Sin embargo, la dependencia del presente enfoque respecto a la extensi6n en placas (para visualizaci6n de las calvas) introduce una posible limitaci6n logistica en terminos de numeros de placas que pueden ser manipuladas y limita por tanto su aplicaci6n a bibliotecas mas pequefas. No obstante, la utilidad del presente enfoque puede extenderse a grandes bibliotecas, si la biblioteca se reduce primero a un tamafo manejable. Esto puede hacerse, por ejemplo, por incorporaci6n en el sistema de selecci6n de un paso que pudiera eliminar grandes poblaciones de especies inestables, v.g., la adsorci6n de la biblioteca en una superficie de proteina A, o en una columna de interacci6n hidr6foba para eliminar proteinas deficientemente plegadas con superficies hidr6fobas expuestas (Matsuura, T. et al., 2003). En este caso, el enfoque se utiliz6 para seleccionar fragmentos de anticuerpo VHs y VLs estables en un fondo de fragmentos VHs y VLs muy inestables. Sin embargo, puede ser mas dificil seleccionar las especies "6ptimas" de una biblioteca de mutantes que esta poblada con proteinas que poseen estabilidades razonablemente satisfactorias. En este caso, las variantes principales pueden identificarse basandose

en la tasa de formaci6n de calvas utilizando tiempos de incubaci6n mas cortos, o basandose en criterios de tamafo de calva y frecuencia.

EJEMPLOS

Identificaci6n y anmlisis de secuencia de VHs humanos mon6meros

Durante el curso de la construcci6n de bibliotecas de VH totalmente humanos y humanos llamizados, se descubri6 que los fagos que exhibian VHs llamizados mon6meros formaban calvas mayores en cespedes bacterianos que los fagos que exhibian VHs totalmente humanos con tendencias a agregaci6n. Por ello, se utiliz6 el tamafo de las calvas como medio para la identificaci6n de VHs mon6meros raros, existentes naturalmente a partir del repertorio de VHs humanos (Figura 1). A este fin, se construy6 una biblioteca de fagos que exhibia VHs humanos con un tamafo de 6 x 108 y se propag6 en forma de calvas en placas de agar. En las placas de titulaci6n, la biblioteca estaba constituida esencialmente por pequefas calvas intercaladas con algunas grandes. La PCR en 20 clones revel6 que las calvas pequefas correspondian a los fagos que presentaban VH, mientras que las grandes representaban los fagos de tipo salvaje, es decir, fagos que carecian de inserciones de la secuencia VH. No se encontr6 ninguno de los fagos que presentaban VH con morfologia de calvas grandes. Esto no era inesperado, dada la escasez de los VHs mon6meros en el repertorio humano y el gran tamafo de la biblioteca. Para facilitar la identificaci6n de VHs mon6meros, se decidi6 reducir la biblioteca a un tamafo manejable y eliminar los fagos de tipo salvaje causantes de interferencia con morfologia de gran tamafo de calva por lavado en batea de la biblioteca contra proteina A que se fija a un subconjunto de VHs humanos de la familia VH3.

Despues de unas cuantas tandas de lavado en batea, la biblioteca se enriqueci6 en fagos que producian calvas grandes, y la PCR y la secuenciaci6n de mas de 110 de dichas calvas demostraron que todas ellas tenian marcos de lectura abiertos VH completos. El tamafo de las calvas grandes que se seleccionaron para analisis se representa en la Figura 1. La secuenciaci6n revel6 15 VHs diferentes que pertenecian a la familia VH3 y utilizaban segmentos V de linea germinal DP-38, DP-47, V3-49, V3-53, YAC-5 u 8-1B (Tabla 1; Figura 2). Las secuencias de linea germinal DP-38 y DP-47 se han visto implicadas con anterioridad en fijaci6n de proteina A. Adicionalmente, todos los VHs tenian un residuo Thr en la posici6n 57 (Figura 2), consistente por su actividad de fijaci6n de proteina A. El segmento V de la linea germinal utilizado mas frecuentemente era DP-47, que existia en mas del 50% de los VHs, pero el clon mas frecuente (a saber, HVHP428; frecuencia relativa 46%) utilizaba el segmento V de la linea germinal V3-49. HVHP429, con una secuencia de linea germinal DP-47, era el segundo VH mas abundante con una frecuencia relativa de 21% (Figura 2). Las longitudes de CDR3 VH abarcaban desde 4 aminoacidos para HVHB82 hasta 16 aminoacidos para los aminoacidos de HVHP430, teniendo HVHP430 un par de residuos Cys en CDR3. Se observaron mutaciones de aminoacidos con respecto a las secuencias del segmento V de la linea germinal parental (residuos 1-94) y FR4 (residuos 103-113), en todos los VHs y estaban comprendidas entre dos mutaciones para HVHP44 (L5V y Q105R) y HVHB82 (E1Q y N5Q) hasta 16 mutaciones para HVHP426 (Tabla 1). Las mutaciones se concentraban en los segmentos V; se detectaron s6lo dos mutaciones en la totalidad de los 15 FR4s, en las posiciones 105 y 108. HVHP44 y HVHB82 diferian de otros VHs en que los mismos tenian un aminoacido cargado positivamente en la posici6n 105 en lugar de una Gln (Tabla 1; Figura 2). No obstante, si bien el aminoacido con carga positiva en HVHP44 se adquiria por mutaci6n, el de HVHB82 estaba codificado en la linea germinal. Excepto en lo que respecta a HVHP423 y HVHP44B, los VHs restantes tenian los residuos de la linea germinal en las posiciones de solubilidad principales: 37V/44G/45L/47W o 37F/44G/45L/47W (HVHP428; HVHP423 y HVHP44B tenian una mutaci6n V37F. Las mutaciones en otras posiciones que se demuestra o se supone son importantes en la solubilidad de VH incluian siete E6Q, tres S35T/H, una R83G y una K83R, una A84P y una T84A y una M108L. Se observaban tambien mutaciones frecuentes en las posiciones 1 y 5 que incluian once E1Q, ocho L5V/Q y una mutaci6n V5Q.

Caracterizaci6n biofisica de los VHs humanos

Todos los VHs excepto HVHP44B, que era esencialmente el mismo que HVHP423, se expresaban en volumenes de cultivo de 1 litro en la cepa TG1 de E. coli en fusi6n con el marcador c-Myc-His5 y se purificaron hasta homogeneidad de extractos periplasmicos por cromatografia de afinidad por iones metalicos inmovilizados (IMAC). Los rendimientos de expresi6n oscilaban desde 1,8 a 62,1 mg de proteina purificada por litro de cultivo bacteriano en matraces de sacudidas, teniendo la mayoria de los VHs rendimientos de varios miligramos (Tabla 2). En el caso de HVHP423 y HVHP430, otra prueba en condiciones de expresi6n "aparentemente" iguales dieron rendimientos de 2,4 y 6,4 mg frente 62,1 y 23,7 mg, respectivamente. Esto implica que para muchos de los VHs descritos en esta memoria deberian alcanzarse condiciones de expresi6n optimas, sin mucho esfuerzo, dando como resultado rendimientos de expresi6n significativamente mayores que los valores consignados en la Tabla 2. Como era de espesar, la totalidad de los VHs se fijaban a la proteina A en analisis de resonancia de plasmones de superficie (SPR), con KDs de 0,2-3 IM, un intervalo y magnitud comparables a los consignados previamente para variantes de VHH de llama con actividad de fijaci6n de proteina A. Ninguno de los VHs se fijaba a la superficie de referencia de Fab.

La tendencia a la agregaci6n de los VHs humanos se evalu6 en terminos de sus estados de oligomerizaci6n por cromatografia de filtraci6n en gel y NMR (Tabla 2). Todos los VHs se sometieron a cromatografia de filtraci6n en gel

Superdex 75. Analogamente a un VHs de llama, es decir, H11C7, todos los VHs daban un soplo pico simetrico para el volumen de eluci6n esperado para un mon6mero, y estaban sustancialmente exentos de cualesquiera agregados (vease el ejemplo para HVHP428 en la Figura 3A). En contraste, un VH humano tipico (a saber, BT32/A6) formaba una cantidad considerable de agregados. Para tres de los VHs, se observ6 tambien un pico menor con una movilidad esperada para un dimero de VH. Los analisis SPR de los picos menores daban valores de tasa de disociaci6n que eran significativamente mas lentos que los correspondientes a los VHs mon6meros, consistentes con el hecho de que se trataba de dimeros. El pico del dimero se observ6 tambien en el caso del VHH de llama, H11C7. Los estados de plegado y oligomerizaci6n de los VHs a concentraciones altas se estudiaron ulteriormente por espectroscopia NMR. Como se muestra en la Tabla II, todas las proteinas VH estudiadas parecian ser relativamente solubles y asumian una estructura tridimensional bien plegada. Los espectros NMR unidimensionales de los fragmentos VH (Fig. 3B) exhibian pliegues estructurales caracteristicos de dominios VH. El estado de agregaci6n de las proteinas se evalu6 tambien por el uso de un experimento de difusi6n PFG-NMR para el fragmento HVHP414 y dos isoformas, VH14 y VH14-cMyc-con y sin la secuencia c-Myc, del HVHP414. VH14 es una versi6n modificada de HVHP414 con una mutaci6n c-Myc N132E y con un residuo metionina adicional en el termino N. En resumen, los datos PFG-NMR (no presentados) indicaban que todas las muestras de proteina tenian los pesos moleculares mon6meros esperados incluso a las concentraciones de proteina relativamente altas utilizadas para los experimentos NMR.

Se investig6 ulteriormente la estabilidad de los VHs en terminos de su resistencia a tripsina respecto a la integridad a 37°C despues de incubaciones largas a 37°C. La tripsina escinde las cadenas principales amidicas de los polipeptidos en el termino C de un residuo Arg o Lys. Existen 9-13 residuos Arg y Lys en los VHs humanos (Figura 2). Existe tambien un residuo Lys adicional en el marcador c-Myc del terminal C que es sensible a la digesti6n por tripsina. La Figura 4a es un analisis SDS-PAGE de HVHP414 durante la digesti6n con tripsina. En el transcurso de una hora, la banda original se convertia completamente en un producto simple que tenia una movilidad esperada para el VH sin marcador c-Myc-His5 alguno. Se obtuvo el mismo resultado para otros 12 VHs despues de una incubaci6n de una hora con tripsina. La espectrometria de masas en una muestra seleccionada al azar de los VHs tratados con tripsina (a saber, HVHP414, HVHP419, HVHP420, HVHP423, HVHP429, HVHP430 y HVHM81) confirm6 que en todos los casos la masa molecular del producto digerido correspondia a un VH con el c-Myc Lys como el residuo C-terminal. HVHM41 daba un fragmento significativamente mas corto que el resto despues de digesti6n, y en este caso los experimentos de espectrometria de masas mapeaban el sitio de escisi6n al Arg 99 en CDR3 (datos no presentados).

0nce VHs comprendidos en concentraci6n desde 0,32 mg/ml (HVHP428) hasta 3,2 mg/ml (HVHP420) se incubaron a 37°C durante 17 dias. Su estabilidad se determin6 subsiguientemente en terminos de estado de oligomerizaci6n y fijaci6n de proteina A. Como se demostr6 por cromatografia de permeaci6n en gel, el tratamiento de VHs a 37°C no producia formaci6n alguna de agregados: todos los VHs daban perfiles de cromatograma que eran virtualmente identicos a los de VHs sin tratar y se mantenian esencialmente como mon6meros (vease el ejemplo para HVHP420; Figura 4c). Para asegurar que los VHs mantenian su plegamiento nativo despues del tratamiento a 37°C, se seleccionaron al azar dos VHs, a saber, HVHP414 (1,2 mg/ml) y HVHP420 (3,2 mg/ml), y se determinaron sus KDs de fijaci6n a la proteina A por SPR (datos presentados para HVHP420; recuadro en la Figura 4c) y se compararon con los KDs obtenidos para VHs sin tratar (Tabla 2). Los KDs calculados para los VHs tratados termicamente eran 1,4 IM y 1,0 IM para HVHP414 y HVHP420, respectivamente. Estos valores son esencialmente identicos a los valores correspondientes para los VHs sin tratar (Tabla 2), demostrando que el tratamiento de VHs a 37°C no afectaba a su plegamiento nativo. La posibilidad de que los VHs puedan haber estado en un plegamiento no nativo menos compacto durante los periodos de incubaci6n a 37°C y hayan adquirido nuevamente su plegamiento nativo despues de volver a la temperatura ambiente durante los experimentos de filtraci6n en gel y SPR es poco probable en vista del hecho de que los VHs eran resistentes a tripsina a 37°C (vease arriba), una propiedad asociada tipicamente para proteinas nativas bien plegadas.

La eficiencia de replegado (RE) de los VHs humanos se investig6 por comparaci6n de los valores Kos de la fijaci6n de los VHs nativos (Kon) y los replegados y tratados termicamente (Koref) a la proteina A (Tanha, J. et al., 2002). Cuando se desactiva una fracci6n del VH por tratamiento termico, el valor Ko medido seria mayor, dado que este parametro esta basado en la concentraci6n de fragmento de anticuerpo plegado, es decir, activo. Asi, la ratio de Kon a Koref da una medida de la RE de VH. La Figura 5 compara sensogramas para fijaci6n de HVHP483 a proteina A inmovilizada en estados nativo (lineas gruesas) y replegado (lineas delgadas) para varias concentraciones de VH seleccionadas. Como puede verse, la fijaci6n del VH replegado a la proteina A es menor en todos los casos, lo que indica que el desplegado no es totalmente reversible. Para cada uno de los 14 VHs, se midi6 la fijaci6n a la proteina A en ambos estados nativo y replegado a varias concentraciones, y se determinaron los valores Kos y subsiguientemente REs (Tabla 2, no se muestran los valores Koref). Se determinaron tambien los valores Kos y REs de dos VHHs anti-idiotipicos de llama, H11F9 y H11B2, que se utilizaron como referencias. Cuatro VHs tenian REs en el intervalo de 92%-95%, similares a las REs para H11F9 y H11B2, 95% y 100%, respectivamente. 0tros cinco tenian REs en el intervalo de 84%-88% y tres superiores a 70%. Unicamente dos tenian RE significativamente menor: HVHP413 (52%) y HVHP421 (14%). Varios VHHs publicados examinados con anterioridad tenian RE pr6xima a 50% (van der Linden, R.H. et al., 1999).

Construcci6n y lavado en batea de bibliotecas de presentaci6n de fago VH humanas. Se sintetiz6 cDNA a partir de mRNA de bazo humano (Ambion Inc., Austin, TX) utilizando iniciadores hexanucleotidicos aleatorios y el kit de 7 5

DNA de la Primera Cadena™ (GE Healthcare, Baie d'Urfe, QC, Canada). Utilizando los cDNAs como molde, genes de VH con secuencias CH flanqueantes se amplificaron por la reacci6n en cadena de polimerasa (PCR) en nueve reacciones separadas utilizando iniciadores especificos de la regi6n de entramado 1 (FR1) de VH y un iniciador especifico de inmunoglobina M (de Haard, H.J. et al., 1999). Los productos se purificaron en gel y se utilizaron como el molde en la segunda tanda de PCR para construir genes de VH utilizando los iniciadores especificos de FR1 y FR4 (de Haard, H.J. et al., 1999) que introdujeron tambien sitios de restricci6n flanqueantes ApalI y NotI para prop6sitos de clonaci6n. Los DNAs resultantes del repertorio VH se clonaron en el vector de fago fd-tetGIIID y se construy6 una biblioteca de presentaci6n de fago de VH (Tanha, J. et al., 2001). El lavado en batea contra proteina A (Amersham Biosciences Inc.) se realiz6 como ha sido descrito (Tanha, J. et al., 2001). La asignaci6n de secuencias de la linea germinal de los VHs seleccionados se realiz6 utilizando el softtare DNAPL0T, Version 2.0.1 y V BASE Version 1.0. (http://vbase.dnaplot.de/cqi-bin/vbase/vsearch.pl). Se aislaron los VHHs de llama H11C7, H11F9 y H11P2 de una biblioteca de presentaci6n de fagos VHH de llama por lavado en batea contra H11 scFv como se ha descrito (Tanha, J. et al., 2002).

Expresi6n y purificaci6n de VH. Se clonaron VHs en vectores de expresi6n pSJF2 por tecnicas estandar de clonaci6n (Sambrook, J. Fritsch E.F. y Maniatis P, 1989). La expresi6n periplasmica de sdAbs y la purificaci6n subsiguiente por cromatografia de afinidad metalica inmovilizada (IMAC) se realizaron como se ha descrito (Muruganandam, A. et al., 2002). Las concentraciones de proteinas se determinaron por medidas de A280 utilizando los coeficientes de absorci6n molar calculados para cada proteina (Pace, C.N. et al ., 1995). La cromatografia de filtraci6n en gel de los VHs purificados se realiz6 en una columna Superdex 75 (GE Healthcare) como ha sido descrito (Deng, S.J. et al., 1995).

Experimentos de eficiencia de fijaci6n y replegado. Las constantes de disociaci6n de equilibrio (Kos) y las eficiencias de replegado (REs) de VHs/ VHHs se derivaron de datos de resonancia de plasmones de superficie (SPR) recogidos con el sistema biosensor BIAC0RE 3000 (Biacore Inc., Piscatatay, NJ). Para medir la fijaci6n de VHs a la proteina A, se inmovilizaron 2000 unidades de resonancia (RUs) de proteina A o un fragmento de fijaci6n de antigeno (Fab) de referencia sobre chips sensores CM5 de grado investigaci6n (Biacore Inc.). Las inmovilizaciones se realizaron a concentraciones de25 Ig/ml (proteina A) o 50 Ig/ml (Fab) en tamp6n de acetato de sodio 10 mM de pH 4,5, utilizando el kit de acoplamiento de aminas proporcionado por el fabricante. Para medir la fijaci6n de los VHHs anti-idiotipicos de llama a H11 scFv, se inmovilizaron 4100 RUs de H11 scFv de 50 Ig/ml o 3000 Rus de Se1554 IgG de referencia de 10 Ig/ml, como se ha descrito arriba. En todos los casos, los analisis se realizaron a 25°C en HEPES 10 mM, de pH 7,4, que contenia NaCl 150 mM, EDTA 3 mM y 0,005% de P20 a un regimen de flujo de 40 Il/min, y las superficies se regeneraron por lavado con el tamp6n de desplazamiento. Para determinar las actividades de fijaci6n de las proteinas replegadas, se desnaturalizaron VHs o VHHs por incubaci6n a 85°C durante 20 min a concentraciones de 10 Ig/ml. Las muestras de proteina se enfriaron luego a la temperatura ambiente durante 30 min y se replegaron y centrifugaron subsiguientemente en una microcentrifuga a 14000 rpm durante 5 min a la temperatura ambiente para eliminar cualesquiera precipitados de proteina. Se recuperaron los sobrenadantes y se analizaron respecto a actividad de fijaci6n por SPR como se ha descrito arriba. Tanto para las proteinas plegadas como para las replegadas, se ajustaron los datos a un modelo de interacci6n 1:1 simultaneamente utilizando softtare BIAevaluation 4.1 (Biacore Inc.) y se determinaron subsiguientemente los valores Kos. Los valores REs se determinaron a partir de

donde Kon es el valor Ko de la proteina nativa y Koref es el valor Ko de la proteina replegada.

Experimentos de digesti6n con tripsina. Se afadieron 3 Il de una tripsina de grado secuenciaci6n de 0,1 Ig/ml recien preparada (Hoffmann-La Roche Ltd., Mississauga, 0N, Canada) en HCl 1 mM a 60 Ig de VH en tamp6n Tris-HCl 100 mM de pH 7,8. Las reacciones de digesti6n se realizaron en un volumen total de 60 Il durante 1 hora a 37°C y se pararon por adici6n de 5 Il de inhibidor de tripsina de 0,1 Ig/Il (Sigma, 0akville, 0N, Canada). Una vez completada la digesti6n, se retiraron 5 Il y se analizaron por SDS-PAGE; el resto se desal6 utilizando ZipTipC4 (Millipore, Nepean, 0N, Canada), se eluy6 con acido acetico al 1% en metanol:agua 50:50 y se someti6 a determinaci6n de la masa de VH por espectrometria de masas MALDI.

Estudios de estabilidad de las proteinas a 37°C. Anticuerpos mono-dominio (sdAbs) a concentraciones de 0,323,2 mg/ml se incubaron a 37°C en tamp6n PBS durante 17 dias. Despues de la incubaci6n, las muestras de proteina se centrifugaron en una microcentrifuga a la velocidad maxima durante 5 min incluso en ausencia de cualquier formaci6n visible de agregados. Las muestras se aplicaron luego a una columna de exclusi6n por tamafos Superdex 75 (GE Healthcare) y los picos de mon6mero se recogieron para analisis SPR contra proteina A. Los analisis SPR se efectuaron como se ha descrito arriba excepto que se inmovilizaron 500 RUs de proteina A o Fab de referencia y que las inmovilizaciones se realizaron a concentraci6n de 50 Ig/ml.

Experimentos NMR. Muestras de VH para analisis NMR se disolvieron en fosfato de sodio 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 0,5 mM, y NaN3 al 0,02% a pH 7,0. Las concentraciones de proteina eran 40 IM-1,0 mM. Todos los experimentos NMR se realizaron a 298 K en un espectr6metro Bruker Avance-800 o Bruker Avance-500 NMR. Los espectros 1H NMR unidimensionales (1D) se registraron con 16384 puntos de datos y las anchuras espectrales eran 8992,81 Hz a 500 MHz y 17605,63 Hz a 800 MHz, respectivamente. Se adquirieron espectros 1H-1H-N0ESY bidimensionales de 2048 x 400 puntos de datos en un espectr6metro Bruker Avance-800 NMR con una anchura espectral de 11990,04 Hz y un tiempo de mezcla de 120 ms. En todos los experimentos NMR, la supresi6n del agua se consigui6 utilizando el metodo WATERGATE implementado por el tren de impulsos 3-9-19 (Piotto, M. et al., 1992; Sklenar, V. et al., 1993). Los datos NMR se procesaron y analizaron utilizando el paquete de softtare Bruker XWINNMR. Todas las medidas de difusi6n PFG-NMR se realizaron con la secuencia LED previa supresi6n del agua (Altieri, A.S. et al., 1995), en un espectr6metro Bruker Avance-500 NMR, equipado con una sonda de resonancia triple con gradientes triaxiales. Los espectros unidimensionales de protones se procesaron y analizaron utilizando el paquete de softtare Bruker XWINNMR. Las intensidades de las sefales NMR se obtuvieron por integraci6n de los espectros NMR en la regi6n de los protones de metilo y metileno (2,3 ppm a -0,3 ppm), donde todas las sefales NMR se atenuaban uniformemente para todas las concentraciones de PFG dadas.

Construcci6n y lavado en batea de bibliotecas de presentaci6n de fago humanas VL. Se sintetizaron cDNAs a partir de mRNA de bazo humano como se ha descrito arriba para los VHs humanos. Se utiliz6 el cDNA como molde en la PCR para amplificar los genes VL en volumenes de reacci6n de 50 Il utilizando seis iniciadores VK inversos, once iniciadores VA inversos (de Haard, H.J. et al., 1999), cuatro iniciadores VK directos y dos iniciadores VA directos (Sblattero, D. et al., 1998). Los iniciadores inversos y directos se modificaron de modo que tuvieran sitios de restricci6n flanqueantes Apa LI y Not I, respectivamente, para prop6sitos de clonaci6n subsiguientes. Los iniciadores directos se agruparon en ratios que reflejaban su grado de degeneraci6n. Los genes VA se sometieron a PCR en once reacciones separadas utilizando los iniciadores directos VA agrupados y once iniciadores inversos VA individuales. Analogamente, los genes VA se amplificaron en seis reacciones separadas utilizando los iniciadores directos VK agrupados y seis iniciadores inversos VA individuales. Los productos PCR se agruparon, se purificaron en gel y se digirieron con las endonucleasas de restricci6n Apa LI y Not I. La biblioteca se construy6 como se describe para los VHs humanos. La PCR de las calvas se realiz6 sobre colonias de bibliotecas individuales y los genes VL amplificados se secuenciaron como se ha descrito (Tanha, J. et al., 2003). El lavado en batea contra la proteina L (Biolynx Inc., Brockville, 0N, Canada) y la asignaci6n de la secuencia de la linea germinal de los VHs seleccionados se realizaron como se ha descrito arriba para la biblioteca VH humana.

Expresi6n y purificaci6n de VL. La expresi6n, purificaci6n, determinaci6n de la concentraci6n y cromatografia de filtraci6n en gel de VL se realizaron como se ha descrito para VHs en "expresi6n y purificaci6n de VH".

Expresi6n y purificaci6n de pentmmeros de VL y VH. Se utilizaron iniciadores especificos en una PCR para amplificar los genes HVHP328 VH y HVLP335 VL. Se utilizaron tecnicas estandar de clonaci6n para clonar los genes HVHP328 y HVLP335 en fusi6n con el gen del dominio de pentamerizaci6n VT1B en un vector de expresi6n para producir pentameros HVHP328PVT2 y HVLP335PTV2, (Zhang, J. et al., 2004). Los pentameros se expresaron y purificaron como se ha descrito (Zhang, J. et al., 2004). Las concentraciones de proteina se determinaron como anteriormente.

Resonancia de plasmones de superficie de VLs. Las cineticas de fijaci6n para la interacci6n de los VLs a la proteina L se determinaron por SPR utilizando el sistema biosensor BIAC0RE 3000 (Biacore, Inc., Piscatatay, NJ). 680 RUs de proteina L u 870 RUs de una referencia Fab se inmovilizaron sobre chips sensores CM5 de grado investigaci6n (Biacore). Las inmovilizaciones se llevaron a cabo a una concentraci6n de proteina de 50 Ig/ml en tamp6n de acetato 10 mM de pH 4,5 utilizando el kit de acoplamiento de aminas suministrado por el fabricante. Todas las medidas se realizaron a 25°C en tamp6n HEPES 10 mM de pH 7,4, que contenia NaCl 150 mM, EDTA 3 mM y 0,005% de P20 a un regimen de flujo de 50 Il/min o 100 Il/min. Las superficies se regeneraron por lavado con el tamp6n de desplazamiento. Los datos se evaluaron utilizando el softtare BIAevaluation 4.1 (Biacore, Inc.).

Resonancia de plasmones de superficie de los pentmmeros de VL y VH. Se determinaron tambien por SPR las cineticas de fijaci6n para la interacci6n de HVHP328PVT2 con proteina A y HVLP335PTV2 con proteina L. Se inmovilizaron como anteriormente 520 RUs de proteina A o una Fab de referencia. Para el pentamero de VL, se utilizaron las mismas superficies preparadas anteriormente. Las medidas se efectuaron como anteriormente pero a un regimen de flujo de 20 Il/min. Las superficies se regeneraron por lavado con HCl 50 mM durante 3 s. Los datos se evaluaron como se ha descrito para los mon6meros.

Microaglutinaci6n de celulas

Se utiliz6 una sola colonia de S. aureus de una placa BHI para inocular 15 ml de medio BHI. Las bacterias se dejaron crecer durante una noche a 37°C a 200 rpm. A la mafana siguiente, se centrifug6 el cultivo en una centrifuga Sorvall RT6000B refrigerada de cubeta oscilante a 4000 rpm durante 10 min, se retir6 el sobrenadante y el sedimento de celulas se resuspendi6 en tamp6n PBS. Se centrifugaron de nuevo las celulas, se retir6 el sobrenadante y el sedimento de celulas se resuspendi6 de nuevo en tamp6n PBS. Se diluyeron las celulas a un valor A600 de 1,0, y se extendieron diluciones en serie de las celulas en placas BHI a 37°C para crecimiento durante

la noche. A la mafana siguiente se determin6 el titulo de celulas. Un valor A600 de 1,0 correspondia a 1,5 x 109 celulas ml-1. Se dieron pasos identicos para preparar celulas de la cepa TG1 de E. coli para ensayos subsiguientes de microaglutinaci6n, excepto que el medio de crecimiento era 2 x YT. Los recuentos viables fueron similares, A600 1,0 = 2,1 x 109 celulas ml-1.

Para realizar los ensayos de microaglutinaci6n, se realizaron diluciones al doble de HVHP328PVT2 en PBS de los pocillos 1 a 11 en una placa de microtitulaci6n. El pocillo 12 (blanco) tenia unicamente PBS. El volumen total en cada pocillo era 50 Il. Subsiguientemente, se afadieron 1 x 108 celulas de S. aureus en 50 Il de PBS a todos los pocillos, y la placa se incub6 durante una noche a 4°C. Para lograr un registro permanente de los resultados, se tom6 una fotografia de la placa durante la mafana. Para el experimento de control de pentameros, se reemplaz6 HVHP328PVT2 con el pentamero de VL, HVLP335PTV2. En los experimentos de control de celulas, se repitieron las dos mismas series de experimentos con celulas TG1 de E. coli.

Identificaci6n y anmlisis de la secuencia de los VLs humanos mon6meros

Se aplic6 esencialmente el mismo metodo de selecci6n empleado para aislar VHs solubles a partir de una biblioteca de presentaci6n de fago VH humana a una biblioteca humana de VL para aislar los VLs solubles mon6meros. Se construy6 una biblioteca de VL humana con un tamafo de 3 x 106. Se seleccionaron veinticuatro calvas de las placas de titulaci6n de la biblioteca y sus genes VL se sometieron a PCR y se secuenciaron. Las secuencias eran diversas en terminos de origen de la linea germinal, aunque el 75% de los VLs eran de origen VA (datos no presentados). Tres tandas de lavado en batea contra la proteina L dieron como resultado el enriquecimiento . .

Identificaci6n y anmlisis de la secuencia de VLs humanos mon6meros

Se aplic6 esencialmente el mismo metodo de selecci6n empleado para aislar VHs solubles de una biblioteca de presentaci6n de fago VH humana a una biblioteca VL humana para aislar los VLs solubles mon6meros. Se construy6 una biblioteca VL humana con un tamafo de 3 x 106. Se seleccionaron 24 calvas de las placas de titulaci6n de la biblioteca y sus genes VL se sometieron a PCR y se secuenciaron. Las secuencias eran diversas en terminos de origen de la linea germinal, aunque el 75% de los VLs eran de origen VA (datos no presentados). Tres tandas de lavado en batea contra la proteina L dieron como resultado el enriquecimiento de calvas grandes. Treintainueve de las calvas grandes se secuenciaron y se identificaron treinta y dos secuencias singulares (Figura 6). HVLP325, HVLP335 y HVLP351 aparecian con frecuencia de 3, 4 y 2, respectivamente. Excepto HVLP389 que es de la clase lambda (subgrupo VA1, linea germinal 1b), los 31 VL restantes pertenecian a la clase VK. De los 31 VLs Kappa, 24 caen dentro del subgrupo VKIII y 7 dentro del subgrupo VK1. Dieciseis de las 24 secuencias VKIII utilizan la secuencia de linea germinal L6, utilizando las restantes las secuencias de linea germinal A27, L2 y L6. Los VLs del subgrupo VK1 se originan a partir de la secuencia de linea germinal 02/012 o A30. En la posici6n 96 se producian mutaciones notables. Los aminoacidos de la linea germinal en esta posici6n son aminoacidos aromaticos e hidr6fobos Trp, Phe, Tyr, Leu o Ile para VLs kappa y Tyr, Val o Ala para los VLs lambda. Pero en la agrupaci6n seleccionada de VLs kappa unicamente 5 de 31 tienen sus aminoacidos de la linea germinal en la posici6n 96: HVLP325, HVLP349, HVLP388, HVLP3109 y HVLP393. Veintiun aminoacidos en la posici6n 96 estan cargados, de los cuales 20 tienen carga positiva: Arg, Lys o His. Dos aminoacidos son Pro, uno Gln, uno Ser y uno Thr. De siete VLs kappa analizados por cromatografia de filtraci6n en gel respecto a caracter mon6mero, seis que tenian Arg o Lys en la posici6n 96 eran tambien mon6meros, en tanto que HVLP325 con el aminoacido Leu de la linea germinal en la posici6n 96 formaba agregados (vease mas adelante). Analogamente, HVLP389 que era de la clase lambda y tenia una mutaci6n de la linea germinal a Ser era tambien mon6mero (vease mas adelante). Estos datos correlacionan la desviaci6n de los aminoacidos de la linea germinal en la posici6n 96 (27 de 32) con propiedades biofisicas mejoradas de VLs tales como el caracter mon6mero.

Dieciocho VLs de la clase kappa tenian sus tres ultimos residuos (105-107) reemplazados con aminoacidos Thr, Val y Leu que se encuentran unicamente en los VLs lambda. Estas sustituciones pueden haber tenido un papel en la mejora de las propiedades biofisicas de los VLs kappa, dando como resultado la selecci6n de los VLs mencionados anteriormente sobre los clones parentales con los residuos kappa originales en la posici6n 105-107.

Caracterizaci6n de los VLs humanos

0cho de los VLs seleccionados con origenes diferentes de la linea germinal V se expresaron en E. coli en cultivos de 1 litro y se purificaron: HVLP324, HVLP325, HVLP335, HVLP342, HVLP351, HVLP364, HVLP389 y HVLP3103

(Tabla 6). Todos ellos se expresaban con buenos rendimientos comprendidos entre 6,2 mg para HVLP324 y alrededor de 75 mg para HVLP335 y HVLP364.

La tendencia a la agregaci6n de los VLs humanos se evalu6 en terminos de su estado de oligomerizaci6n por cromatografia de filtraci6n en gel. Los VLs se sometieron a cromatografia de filtraci6n en gel Superdex 75 a una concentraci6n de 0,6 mg/ml. Todos excepto HVLP325 estaban esencialmente exentos de agregados y daban picos simples simetricos con el peso molecular medio aparente de 12,7 kDa (intervalo, 6,2-19,2 kDa) (Figura 7a y Tabla 3). Esto esta de acuerdo con la masa molecular esperada para VLs mon6meros, 13,4-13,8 kDa. La variaci6n de masa molecular aparente para anticuerpos mono-dominio ha sido consignada previamente (Jespers, L. et al., 2004a; Stevens, F.J. et al., 1980). Para HVLP325, los agregados formaban 11% de la proteina total (agregado mas mon6mero). HVLP351, HVLP342, HVLP335 y HVLP3103 eran todavia mon6meros cuando se testaron a su maxima concentraci6n disponible, a saber, 0,89 mg/ml, 1,0 mg/ml, 4,9 mg/ml y 5,9 mg/ml, respectivamente (Figura 7B).

Se sometieron los VLs a cromatografia con Superdex-75 antes del analisis BIAC0RE y los picos de mon6mero purificados se recogieron incluso en ausencia de cualquier evidencia de material agregado. En el analisis SPR, todos los VLs seleccionados se fijaban a proteina L (Figura 8). Esto no era inesperado, dado que los VLs se aislaron por lavado en batea contra proteina L. Para todos ellos, los valores KDs de fijaci6n a proteina L estaban comprendidos entre 0,6 y 3 IM (Tabla 3). HVLP324 y HVLP342 tenian valores KDs adicionales mas pequefos, 10 nM y 10 nM, respectivamente. Las fijaciones de afinidad baja y de afinidad alta de los VLs del subgrupo VKI a la proteina L han sido consignadas previamente (referencia). Ambos, HVHP324 y HVLP342, pertenecen al subgrupo VKI (Tabla 3). Como era de esperar, los datos cineticos y de equilibrio eran consistentes con el hecho de que pico mon6mero fuera realmente mon6mero.

Anmlisis de fijaci6n de pentmmeros

Las fijaciones del pentamero HVLP328PVT2 a proteina A y del pentamero HVLP335PTV2 a proteina L se determinaron por resonancia de plasmones de superficie (Figura 9). Las tasas de asociaci6n se calcularon independientemente a partir de graficas de kobs frente a la concentraci6n. Pudo calcularse mas de una tasa de disociaci6n (kd) debido a la heterogeneidad en fijaci6n multivalente entre la poblaci6n de pentameros. Por esta raz6n, pudo obtenerse mas de una constante de disociaci6n de equilibrio, Ko. HVHP328PTV2 y HVLP335PTV2 tenian valores Kos minimos de 2 mM y 200 pM, respectivamente (Tabla 4). Con Kos mas lentas, HVHP328PTV2 y HVHP335PTV2 tenian valores Kos tan bajos como 900 y 90 pM, respectivamente.

Detecci6n de pat6genos por VLs y VHs

La actividad de fijaci6n a proteina A y L de los VHs y VLs puede utilizarse para detectar bacterias que tienen proteina A y/o L en sus superficies. Esto es posible si los VHs y VLs son solubles y mon6meros (falta de tendencia a agregarse) tales como los VHs y VLs de esta invenci6n. Los dominios variables derivados de anticuerpos que carecen de cadenas ligeras tales como los anticuerpos de cadena pesada de Camelidos o los IgNARs de tibur6n nodriza o tibur6n alfombra son naturalmente solubles y mon6meros. De estos, los que poseen actividad de fijaci6n a proteina A y L pueden utilizarse tambien para detectar bacterias que tienen proteina A y/o L en sus superficies. La proteina A esta presente en la superficie de las bacterias pat6genas, Staphylococcus aureus. Asi, los VHs con actividad de fijaci6n a proteina A tales como los descritos en esta memoria pueden utilizarse para detectar S. aureus. Los inventores realizaron un ensayo de microaglutinaci6n para detectar la capacidad del pentamero de VH HVHP328PVT2 para fijarse a S. aureus. Se incubaron un numero constante de celulas bacterianas con diluciones al doble de HVHP328PVT2 en pocillos de microtitulaci6n (pocillos 1-11) (Figura 10). El pocillo 12 contenia tamp6n en lugar del pentamero. Si los VHs se fijan a las celulas bacterianas, entonces el pentamero, debido a su naturaleza multimera, deberia ser capaz de reticular las celulas y dar como resultado aglutinaci6n celular. Las celulas aglutinadas apareceran como celulas difusas en un pocillo de microtitulaci6n (Figura 10). En ausencia de cualquier fijaci6n, no ocurriria aglutinaci6n alguna, es decir ausencia de aglutinaci6n, y las celulas apareceran como una mancha en el fondo del pocillo. Como se muestra en la Figura 10, el pentamero se fija al S. aureus, dado que existe aglutinaci6n de celulas. La aglutinaci6n se observa hasta el pocillo 7. Mas alla del pocillo 7, la concentraci6n del pentamero es demasiado baja para la fijaci6n, por lo que no se produce ya aglutinaci6n alguna. El pentamero de control VL no exhibe aglutinaci6n alguna, demostrando la especificidad del pentamero VH para S. aureus (Figura 10). La fijaci6n es tambien especifica en cuanto a las celulas, dado que el pentamero VH, como era de esperar, no aglutina celulas de E. coli (cepa TG1) o de Salmonella (datos no presentados). Analogamente, los mon6meros de VL y pentameros de VL con actividad de fijaci6n para proteina L pueden utilizarse para la detecci6n de bacterias, en particular bacterias pat6genas tales como Peptostreptococcus magnus, que tienen proteina L en la superficie de sus celulas.

Debe entenderse que los ejemplos arriba descritos no tienen por objeto en modo alguno limitar el alcance verdadero de esta invenci6n, sino que en lugar de ello se presentan para prop6sitos ilustrativos.

Tabla 1. Desviaciones de secuencia de VH respecto a las secuencias de la linea germinal parental

Tabla 2. Caracteristicas biofisicas de los VHs humanos

# Rendimiento de expresi6n por litro de cultivo bacteriano

* Kos y REs se determinaron contra H11 scFv.

Tabla 3. Caracteristicas de los VLs humanos

VL: Subgrupo Expresi6na KD Estado de oligomerizaci6nb

mg: �M

HVLP324: VKI 6,9 0,2, 0,01c Mon6mero

HVLP325: VKIll 6,2 1 Mon6mero/Agregado

HVLP335: VKIll 73,5 2 Mon6mero

HVLP342: VKI 7,7 0,6, 0,04c Mon6mero

HVLP351: VKIll 8,9 2 Mon6mero

HVLP364: VKIll 77,1 3 Mon6mero

HVLP389: VAI 16,7 1 Mon6mero

HVLP3103: VKIll 19,0 1 Mon6mero

a Rendimiento de expresi6n por litro de cultivo bacteriano. b El estado de oligomerizaci6n se determin6 por cromatografia de filtraci6n en gel. c Los valores Ko mas pequefos corresponden a la fijaci6n de HVLP324 y HVLP342 a los sitios de afinidad alta en la

proteina L.

Tabla 4. Constantes cineticas y de equilibrio para las fijaciones de HVHLP328PTV2 y HVLP335PTV2 a proteina A y L, respectivamente

Pentacuerpo: HVHP328PTV2 HVLP335PTV2

ka (M-1s -1): 4,3 x 105 1,7 x 106

kd (s): <1 x10-3 < 4 x 10-4

Ko (M): <2 x 10-9 <2 x 10-10

Claims

REIVINDICACIONES

1.-Un metodo de identificaci6n de fragmentos de anticuerpo VH y/o VL humanos estables diana, que comprende:

a.

obtener una biblioteca de presentaci6n de fago capaz de expresar una diversidad de fragmentos de anticuerpo VH y/o VL;

b.

permitir la infecci6n de un cesped bacteriano por el fago de la biblioteca; y

c.

identificar fagos que forman calvas mayores en el cesped bacteriano;

d.

aislar el fago de la calva mayor en el paso (c) de la reivindicaci6n 1; y

e.

determinar la secuencia de otras caracteristicas de los fragmentos de anticuerpo VH y/o VL expresados por el fago de la calva mayor.
2.-Un metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en el cual los fragmentos de anticuerpo VH y/o VL diana son solubles.
3.-Un metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 1 o la reivindicaci6n 2, en el cual los fragmentos de anticuerpo diana VH y/o VLson mon6meros.
4.-Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual los fragmentos de anticuerpo diana VH y/o VL son no agregantes.
5.-Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual los fragmentos de anticuerpo diana VH y/o VL se expresan fuertemente.
6.-Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el fago es un fago filamentoso.
7.-Un metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 6, en el cual el fago es M13 o fd.
8.-Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual los fragmentos de anticuerpo estables VH y/o VL tienen alta eficiencia de replegado termico.
9.-Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual los fragmentos de anticuerpo estables VH y/o VL mantienen su funcionalidad despues de incubaci6n larga a 37°C.
10.-Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual los fragmentos de anticuerpo estables VH y/o VL son resistentes a las proteasas.
11.-Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual los fragmentos de anticuerpo estables VH y/o VL tienen una vida util larga a 4°C y/o a la temperatura ambiente y/o a 37°C.
12.-Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual los fragmentos de anticuerpo estables VH y/o VL son funcionales en ambientes intracelulares.
13.-Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual los fragmentos de anticuerpo estables VH y/o VL son capaces de ser funcionales cuando se administran internamente a humanos.

FIG�RA 10