WO2016031412A1 - 反応方法、検出方法および検出装置 - Google Patents

反応方法、検出方法および検出装置 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a reaction method using a container including a reaction field in which a capturing body is fixed, and a detection method and a detection device for detecting a substance to be detected using the container.
  • micro total analysis system ⁇ -TAS
  • the micro total analysis system has an advantage that analysis can be performed in a short time using a small amount of reagent or sample.
  • a micro flow channel system using a micro flow channel chip having a fine flow channel.
  • a reaction field in which a capturing body for capturing a substance to be detected is fixed is disposed in the channel of the microchannel chip.
  • an antigen-antibody reaction hereinafter also referred to as “primary reaction” is performed in which a substance to be detected contained in a sample provided in the flow path is bound to a capturing body.
  • the detection target substance captured by the capturing body is detected.
  • the substance to be detected can also adhere nonspecifically to the inner surface of the flow path.
  • the substance to be detected attached to the inner surface of the flow path outside the reaction field is not detected. Therefore, there is a problem that a reliable detection result cannot be obtained.
  • it has been proposed to perform blocking treatment on the inner surface of the flow channel as a means for preventing non-specific substances from adhering to the inner surface of the flow channel see, for example, Patent Document 1).
  • the blocking process is performed as a separate process from the primary reaction. Specifically, after the blocking process to the inner surface of the flow path, the blocking liquid is removed from the flow path, and the flow path is further cleaned. Thereafter, a sample containing the substance to be detected is introduced into the flow path, and a primary reaction is performed in the reaction field. As a result, the micro integrated analysis system described in Patent Document 1 prevents the substance to be detected from adhering to the inner surface of the flow path non-specifically.
  • the micro integrated analysis system described in Patent Document 1 has room for improvement from the viewpoint of shortening detection time and improving detection accuracy.
  • the first object of the present invention is to provide a reaction method capable of binding a capturing body and a substance to be reacted (substance to be detected) without reducing the effect of blocking treatment on the inner surface of the flow path (container). Is to provide.
  • the second object of the present invention is to detect a substance to be detected in a short time and with high accuracy without reducing the effect of blocking treatment on the inner surface of the flow path (container) by using this reaction method. It is providing the detection method and detection apparatus which can be performed.
  • a reaction method includes a storage unit for storing a liquid and a reaction field that is exposed to the storage unit and in which a capturing body is fixed.
  • a reaction method for binding the capturing body and the substance to be reacted a step of moving a blocking liquid containing a blocking agent in the container and blocking the inside of the container, and in the container
  • Providing the liquid containing the substance to be reacted, and capturing the substance to be captured by the capturing body, and the step of capturing the substance to be reacted by the capturing body is a step of performing the blocking process. Or performed simultaneously with the blocking process.
  • a detection method includes a container that contains a liquid, and a metal that is exposed to the container and includes a reaction field to which a capturing body is fixed.
  • a detection method for detecting the presence or amount of a substance to be detected in a specimen by utilizing surface plasmon resonance using a detection chip having a membrane, wherein the blocking liquid contains a blocking agent in the container A step of blocking the inside of the container, providing the sample in the container and capturing the substance to be detected by the capturing body, and the substance to be detected and the capturing body
  • the metal film is irradiated with light so that surface plasmon resonance occurs in the metal film, and fluorescence emitted from the vicinity of the surface of the metal film on the container side is emitted. Detecting the amount or the amount of light reflected by the metal film, and the step of capturing the substance to be detected by the capturing body is performed after the step of performing the blocking process, Alternatively, it
  • a detection device includes a storage unit for storing a liquid, and a metal that is exposed to the storage unit and includes a reaction field in which a capturing body is fixed.
  • a detection device for detecting the presence or amount of a substance to be detected in a specimen by utilizing surface plasmon resonance using a detection chip having a film, and a holder for holding the detection chip; The detection chip held by the holder so that surface plasmon resonance occurs in the metal film and a liquid feeding part that provides a liquid in the housing part with the detection chip held by the holder
  • a light detection unit that detects the amount of light reflected by the metal film, and the liquid feeding unit provides a blocking liquid containing a blocking
  • a step of blocking the inside of the storage unit and a step of providing the sample in the storage unit and capturing the substance to be detected by the capturing body is performed after the step of performing the blocking treatment or simultaneously with the step of performing the blocking treatment.
  • the capturing body and the substance to be reacted are efficiently combined in a short time without reducing the effect of the blocking process on the inner surface of the flow path (the housing part). Can be made. Therefore, according to the detection method and the detection apparatus of the present invention, the presence or amount of the substance to be detected can be detected in a short time and with high accuracy.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a configuration of a surface plasmon excitation enhanced fluorescence analyzer (SPFS apparatus) according to an embodiment.
  • FIG. 2 is a flowchart showing a first operation procedure of the SPFS apparatus shown in FIG.
  • FIG. 3 is a flowchart showing a second operation procedure of the SPFS apparatus shown in FIG.
  • FIG. 4A is a graph showing the relationship between the flow rate of the blocking liquid and the blocking rate when the primary reaction is performed next to the blocking process
  • FIG. 4B is the case where the blocking process and the primary reaction are performed simultaneously. It is a graph which shows the relationship between the flow volume of a liquid mixture, and a blocking rate.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a configuration of a surface plasmon excitation enhanced fluorescence analyzer (SPFS apparatus) according to an embodiment.
  • FIG. 2 is a flowchart showing a first operation procedure of the SPFS apparatus shown in FIG.
  • FIG. 3 is a flowchart showing a second operation procedure of
  • 5A is a graph showing the relationship between the presence / absence of movement of the blocking solution and the concentration of the blocking agent and the signal value indicating the amount of the substance to be detected when the primary reaction is performed after the blocking treatment. These are graphs which show the relationship between the concentration of a blocking agent and the signal value which shows the quantity of to-be-detected substance at the time of performing a blocking process and primary reaction simultaneously.
  • SPFS apparatus surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy
  • SPFS enhanced Fluorescence Spectroscopy
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a configuration of a surface plasmon excitation enhanced fluorescence analyzer (SPFS apparatus) 100 according to an embodiment of the present invention.
  • the SPFS device 100 includes an excitation light irradiation unit (light irradiation unit) 110, a reflected light detection unit 120, a fluorescence detection unit 130, a liquid feeding unit 140, a transport unit 150, and a control unit 160.
  • the SPFS device 100 is used in a state where the detection chip 10 (container) is mounted on the chip holder 152 of the transport unit 150. Therefore, the detection chip 10 will be described first, and then each component of the SPFS device 100 will be described.
  • the detection chip 10 includes a prism 20 having an incident surface 21, a film formation surface 22, and an output surface 23, a metal film 30 formed on the film formation surface 22, and a flow path lid 40 disposed on the metal film 30.
  • the detection chip 10 (accommodator) includes a flow path 41 (accommodation part) and a reaction field exposed to the flow path 41. In the reaction field, capture of the substance to be detected (reacted substance) by a capturing body, labeling of the substance to be detected by a fluorescent substance, and the like are performed.
  • the detection chip 10 is replaced for each analysis.
  • the detection chip 10 is preferably a structure having a length of several mm to several cm for each piece, but is a smaller structure or a larger structure that is not included in the category of “chip”. May be.
  • the prism 20 is made of a dielectric that is transparent to the excitation light ⁇ .
  • the prism 20 has an incident surface 21, a film forming surface 22, and an exit surface 23.
  • the incident surface 21 causes the excitation light ⁇ from the excitation light irradiation unit 110 to enter the prism 20.
  • a metal film 30 is disposed on the film formation surface 22.
  • the excitation light ⁇ incident on the inside of the prism 20 is reflected on the back surface of the metal film 30 and becomes reflected light ⁇ . More specifically, the excitation light ⁇ is reflected at the interface (deposition surface 22) between the prism 20 and the metal film 30 to become reflected light ⁇ .
  • the emission surface 23 emits the reflected light ⁇ to the outside of the prism 20.
  • the shape of the prism 20 is not particularly limited.
  • the shape of the prism 20 is a column having a trapezoidal bottom surface.
  • the surface corresponding to one base of the trapezoid is the film formation surface 22, the surface corresponding to one leg is the incident surface 21, and the surface corresponding to the other leg is the emission surface 23.
  • the trapezoid serving as the bottom surface is preferably an isosceles trapezoid. Thereby, the entrance surface 21 and the exit surface 23 are symmetric, and the S wave component of the excitation light ⁇ is less likely to stay in the prism 20.
  • the incident surface 21 is formed so that the excitation light ⁇ does not return to the excitation light irradiation unit 110.
  • the light source of the excitation light ⁇ is a laser diode (hereinafter also referred to as “LD”)
  • LD laser diode
  • the angle of the incident surface 21 is set so that the excitation light ⁇ does not enter the incident surface 21 perpendicularly in a scanning range centered on an ideal resonance angle or enhancement angle.
  • the “resonance angle” means the incident angle when the amount of the reflected light ⁇ emitted from the emission surface 23 is minimum when the incident angle of the excitation light ⁇ with respect to the metal film 30 is scanned.
  • the “enhancement angle” refers to scattered light having the same wavelength as the excitation light ⁇ emitted above the detection chip 10 when the incident angle of the excitation light ⁇ with respect to the metal film 30 is scanned (hereinafter referred to as “plasmon scattered light”). It means the incident angle when the light quantity of ⁇ is maximized.
  • the angle between the incident surface 21 and the film formation surface 22 and the angle between the film formation surface 22 and the emission surface 23 are both about 80 °.
  • the resonance angle (and the enhancement angle near the pole) is generally determined by the design of the detection chip 10.
  • the design factors are the refractive index of the prism 20, the refractive index of the metal film 30, the film thickness of the metal film 30, the extinction coefficient of the metal film 30, the wavelength of the excitation light ⁇ , and the like.
  • the resonance angle and the enhancement angle are shifted by the substance to be detected trapped on the metal film 30, but the amount is less than a few degrees.
  • the prism 20 has a considerable amount of birefringence.
  • Examples of the material of the prism 20 include resin and glass.
  • the material of the prism 20 is preferably a resin having a refractive index of 1.4 to 1.6 and a small birefringence.
  • the metal film 30 is disposed on the film formation surface 22 of the prism 20.
  • SPR surface plasmon resonance
  • Localized field light (generally also called “evanescent light” or “near field light”) can be generated on the surface of the metal film 30.
  • the metal film 30 is formed on the entire film formation surface 22.
  • the material of the metal film 30 is not particularly limited as long as it is a metal that can cause surface plasmon resonance.
  • Examples of the material of the metal film 30 include gold, silver, copper, aluminum, and alloys thereof.
  • the metal film 30 is a gold thin film.
  • the method for forming the metal film 30 is not particularly limited. Examples of the method for forming the metal film 30 include sputtering, vapor deposition, and plating.
  • the thickness of the metal film 30 is not particularly limited, but is preferably in the range of 30 to 70 nm.
  • a capturing body for capturing a substance to be detected is immobilized on the surface of the metal film 30 that does not face the prism 20 (the surface of the metal film 30). By immobilizing the capturing body, it becomes possible to selectively detect the substance to be detected.
  • the capturing body is uniformly fixed in a predetermined region (reaction field) on the metal film 30.
  • the type of capturing body is not particularly limited as long as it can capture the substance to be detected.
  • the capturing body is an antibody or a fragment thereof that specifically binds to the substance to be detected.
  • the capturing body is usually stored in a protective layer when not in use.
  • the channel lid 40 is disposed on the metal film 30.
  • the flow path lid 40 may be disposed on the film formation surface 22.
  • the flow path lid 40 is disposed on the metal film 30.
  • a flow channel groove is formed on the back surface of the flow channel cover 40, and the flow channel cover 40, together with the metal film 30 (and the prism 20), forms a storage portion for storing the liquid.
  • the accommodating portion is the flow path 41 through which the liquid flows. The moving speed of the liquid in the channel 41 can be adjusted according to the size of the cross-sectional area of the channel 41.
  • the cross-sectional area of the flow path 41 in the cross section perpendicular to the liquid flow direction on the reaction field described later is not particularly limited, but is preferably 0.01 mm 2 or more and 100 mm 2 or less, for example. From the viewpoint of moving faster the liquid in the flow channel 41, more preferably 0.01 mm 2 or more and 10 mm 2 or less, further preferably 0.01 mm 2 or more and 1 mm 2 or less.
  • the reaction field is arrange
  • liquids examples include specimens (eg, blood, serum, plasma, urine, nasal fluid, saliva, semen, etc.) containing a substance to be detected, blocking liquids containing blocking agents, and capturing bodies labeled with fluorescent substances. Includes labeling solution, reference solution, washing solution and the like.
  • the capturing body fixed to the metal film 30 is exposed in the flow path 41. Both ends of the channel 41 are respectively connected to an inlet and an outlet (not shown) formed on the upper surface of the channel lid 40. When liquid is provided into the flow path 41, the liquid comes into contact with the capturing body.
  • the channel lid 40 is preferably made of a material transparent to the fluorescent ⁇ and plasmon scattered light ⁇ emitted from the metal film 30.
  • An example of the material of the flow path lid 40 includes a resin.
  • the other portion of the channel lid 40 may be formed of an opaque material.
  • the flow path lid 40 is bonded to the metal film 30 or the prism 20 by, for example, adhesion using a double-sided tape or an adhesive, laser welding, ultrasonic welding, or pressure bonding using a clamp member.
  • the detection chip 10 may have a frame body having a through hole and a top plate laminated on the frame body instead of the flow path lid 40.
  • the channel 41 (accommodating portion) is formed by laminating the frame body and the top plate in this order on the prism 20 on which the metal film 30 is formed.
  • the surface of the metal film 30 becomes the bottom surface of the flow path 41.
  • the inner surface of the through hole of the frame body becomes the side surface of the flow path 41.
  • One surface (inner surface) of the top plate is the top surface of the flow path 41.
  • the excitation light ⁇ enters the prism 20 from the incident surface 21.
  • the excitation light ⁇ that has entered the prism 20 enters the metal film 30 at a total reflection angle (an angle at which SPR occurs).
  • a total reflection angle an angle at which SPR occurs.
  • This localized field light excites a fluorescent substance that labels the substance to be detected present on the metal film 30, and the fluorescent ⁇ is emitted from the vicinity of the surface of the metal film 30 on the channel 41 (accommodating portion) side.
  • the SPFS device 100 detects the presence or amount of the substance to be detected by measuring the amount of the fluorescent ⁇ emitted from the fluorescent substance.
  • the SPFS device 100 includes the excitation light irradiation unit 110, the reflected light detection unit 120, the fluorescence detection unit 130, the liquid feeding unit 140, the transport unit 150, and the control unit 160.
  • the excitation light irradiation unit 110 irradiates the detection chip 10 held by the chip holder 152 with excitation light ⁇ .
  • the excitation light irradiation unit 110 emits only the P wave toward the incident surface 21 so that the incident angle with respect to the metal film 30 is an angle causing SPR.
  • the “excitation light” is light that directly or indirectly excites the fluorescent material.
  • the excitation light ⁇ is light that generates localized field light on the surface of the metal film 30 that excites the fluorescent material when the metal film 30 is irradiated through the prism 20 at an angle at which SPR occurs.
  • the excitation light irradiation unit 110 includes a light source unit 111, an angle adjustment mechanism 112, and a light source control unit 113.
  • the light source unit 111 emits collimated excitation light ⁇ having a constant wavelength and light amount so that the shape of the irradiation spot on the back surface of the metal film 30 is substantially circular.
  • the light source unit 111 includes, for example, a light source of excitation light ⁇ , a beam shaping optical system, an APC mechanism, and a temperature adjustment mechanism (all not shown).
  • the type of the light source is not particularly limited, and is, for example, a laser diode (LD).
  • Other examples of light sources include light emitting diodes, mercury lamps, and other laser light sources.
  • the light emitted from the light source is not a beam, the light emitted from the light source is converted into a beam by a lens, a mirror, a slit, or the like.
  • the light emitted from the light source is not monochromatic light, the light emitted from the light source is converted into monochromatic light by a diffraction grating or the like.
  • the light emitted from the light source is not linearly polarized light, the light emitted from the light source is converted into linearly polarized light by a polarizer or the like.
  • the beam shaping optical system includes, for example, a collimator, a band pass filter, a linear polarization filter, a half-wave plate, a slit, and a zoom means.
  • the beam shaping optical system may include all of these or a part thereof.
  • the collimator collimates the excitation light ⁇ emitted from the light source.
  • the band-pass filter turns the excitation light ⁇ emitted from the light source into narrowband light having only the center wavelength. This is because the excitation light ⁇ from the light source has a slight wavelength distribution width.
  • the linear polarization filter turns the excitation light ⁇ emitted from the light source into completely linearly polarized light.
  • the half-wave plate adjusts the polarization direction of the excitation light ⁇ so that the P-wave component is incident on the metal film 30.
  • the slit and zoom means adjust the beam diameter, contour shape, and the like of the excitation light ⁇ so that the shape of the irradiation spot on the back surface of the metal film 30 is a circle of a predetermined size.
  • the APC mechanism controls the light source so that the output of the light source is constant. More specifically, the APC mechanism detects the amount of light branched from the excitation light ⁇ with a photodiode (not shown) or the like. The APC mechanism controls the input energy by a regression circuit, thereby controlling the output of the light source to be constant.
  • the temperature adjustment mechanism is, for example, a heater or a Peltier element.
  • the wavelength and energy of the light emitted from the light source may vary depending on the temperature. For this reason, the wavelength and energy of the light emitted from the light source are controlled to be constant by keeping the temperature of the light source constant by the temperature adjusting mechanism.
  • the angle adjustment mechanism 112 adjusts the incident angle of the excitation light ⁇ with respect to the metal film 30 (the interface (deposition surface 22) between the prism 20 and the metal film 30). In order to irradiate the excitation light ⁇ at a predetermined incident angle toward a predetermined position of the metal film 30 through the prism 20, the angle adjustment mechanism 112 relatively places the optical axis of the excitation light ⁇ and the chip holder 152. Rotate.
  • the angle adjustment mechanism 112 rotates the light source unit 111 around an axis (axis perpendicular to the paper surface of FIG. 1) orthogonal to the optical axis of the excitation light ⁇ .
  • the position of the rotation axis is set so that the position of the irradiation spot on the metal film 30 hardly changes even when the incident angle is scanned.
  • the position of the rotation center in the vicinity of the intersection of the optical axes of the two excitation lights ⁇ at both ends of the scanning range of the incident angle (between the irradiation position on the film forming surface 22 and the incident surface 21), The deviation of the irradiation position can be minimized.
  • the angle at which the amount of plasmon scattered light ⁇ is maximum is the enhancement angle.
  • the basic incident condition of the excitation light ⁇ is determined by the material and shape of the prism 20 of the detection chip 10, the film thickness of the metal film 30, the refractive index of the liquid in the flow channel 41, etc.
  • the optimum incident condition varies slightly depending on the type and amount of the light and the shape error of the prism 20. For this reason, it is preferable to obtain an optimal enhancement angle for each measurement.
  • the light source control unit 113 controls various devices included in the light source unit 111 to control the emission of the excitation light ⁇ from the light source unit 111.
  • the light source control unit 113 includes, for example, a known computer or microcomputer including an arithmetic device, a control device, a storage device, an input device, and an output device.
  • the reflected light detection unit 120 measures the amount of reflected light ⁇ generated by irradiating the detection chip 10 with the excitation light ⁇ in order to measure the resonance angle and the like.
  • the reflected light detection unit 120 includes a light receiving sensor 121, an angle adjustment mechanism 122, and a sensor control unit 123.
  • the light receiving sensor 121 is disposed at a position where the reflected light ⁇ is incident, and measures the amount of the reflected light ⁇ .
  • the type of the light receiving sensor 121 is not particularly limited.
  • the light receiving sensor 121 is a photodiode (PD).
  • the angle adjusting mechanism 122 adjusts the position (angle) of the light receiving sensor 121 according to the incident angle of the excitation light ⁇ with respect to the metal film 30.
  • the angle adjusting mechanism 122 relatively rotates the light receiving sensor 121 and the chip holder 152 so that the reflected light ⁇ enters the light receiving sensor 121.
  • the sensor control unit 123 controls detection of an output value of the light receiving sensor 121, management of sensitivity of the light receiving sensor 121 based on the detected output value, change of sensitivity of the light receiving sensor 121 for obtaining an appropriate output value, and the like.
  • the sensor control unit 123 includes, for example, a known computer or microcomputer including an arithmetic device, a control device, a storage device, an input device, and an output device.
  • the fluorescence detection unit 130 detects the fluorescence ⁇ generated by irradiating the metal film 30 with the excitation light ⁇ . Further, as necessary, the fluorescence detection unit 130 also detects plasmon scattered light ⁇ generated by the irradiation of the excitation light ⁇ to the metal film 30.
  • the fluorescence detection unit 130 includes a light receiving unit 131, a position switching mechanism 132, and a sensor control unit 133.
  • the light receiving unit 131 is arranged in the normal direction of the metal film 30 of the detection chip 10.
  • the light receiving unit 131 includes a first lens 134, an optical filter 135, a second lens 136, and a light receiving sensor 137.
  • the first lens 134 is, for example, a condensing lens, and condenses light emitted from the metal film 30.
  • the second lens 136 is an imaging lens, for example, and forms an image of the light collected by the first lens 134 on the light receiving surface of the light receiving sensor 137.
  • the optical path between both lenses is a substantially parallel optical path.
  • the optical filter 135 is disposed between both lenses.
  • the optical filter 135 guides only the fluorescence component to the light receiving sensor 137 and removes the excitation light component (plasmon scattered light ⁇ ) in order to detect the fluorescence ⁇ with a high S / N ratio.
  • the optical filter 135 include an excitation light reflection filter, a short wavelength cut filter, and a band pass filter.
  • the optical filter 135 is, for example, a filter including a multilayer film that reflects a predetermined light component (light having a predetermined wavelength component) or a color glass filter that absorbs a predetermined light component.
  • the light receiving sensor 137 detects fluorescence ⁇ and plasmon scattered light ⁇ .
  • the light receiving sensor 137 has high sensitivity capable of detecting weak fluorescence ⁇ from a very small amount of a substance to be detected.
  • the light receiving sensor 137 is, for example, a photomultiplier tube (PMT) or an avalanche photodiode (APD).
  • the position switching mechanism 132 switches the position of the optical filter 135 on or off the optical path in the light receiving unit 131. Specifically, when the light receiving sensor 137 detects the fluorescence ⁇ , the optical filter 135 is disposed on the optical path of the light receiving unit 131, and when the light receiving sensor 137 detects the plasmon scattered light ⁇ , the optical filter 135 is placed on the light receiving unit 131. Placed outside the optical path.
  • the sensor control unit 133 controls detection of an output value of the light receiving sensor 137, management of sensitivity of the light receiving sensor 137 based on the detected output value, change of sensitivity of the light receiving sensor 137 for obtaining an appropriate output value, and the like.
  • the sensor control unit 133 is configured by, for example, a known computer or microcomputer including an arithmetic device, a control device, a storage device, an input device, and an output device.
  • the liquid feeding unit 140 supplies a blocking liquid containing a specimen and a blocking agent, a labeling liquid, a reference liquid, a washing liquid, and the like into the flow path 41 of the detection chip 10 held by the chip holder 152.
  • the liquid feeding unit 140 includes a liquid chip 141, a syringe pump 142, and a liquid feeding pump drive mechanism 143.
  • the liquid chip 141 is a container for storing a liquid such as a specimen, a blocking liquid, a labeling liquid, a reference liquid, or a cleaning liquid.
  • a liquid chip 141 a plurality of containers are usually arranged according to the type of liquid, or a chip in which a plurality of containers are integrated is arranged.
  • the syringe pump 142 includes a syringe 144 and a plunger 145 that can reciprocate inside the syringe 144.
  • the plunger 145 By the reciprocating motion of the plunger 145, the liquid is sucked and discharged quantitatively. If the syringe 144 can be replaced, the syringe 144 need not be cleaned. For this reason, it is preferable from the viewpoint of preventing contamination of impurities.
  • the syringe 144 is not configured to be replaceable, it is possible to use the syringe 144 without replacing it by adding a configuration for cleaning the inside of the syringe 144.
  • the liquid feed pump driving mechanism 143 includes a driving device for the plunger 145 and a moving device for the syringe pump 142.
  • the drive device of the syringe pump 142 is a device for reciprocating the plunger 145, and includes, for example, a stepping motor.
  • the drive device including the stepping motor is preferable from the viewpoint of managing the remaining liquid amount of the detection chip 10 because it can manage the liquid feeding amount and the liquid feeding speed of the syringe pump 142.
  • the moving device of the syringe pump 142 freely moves the syringe pump 142 in two directions, ie, an axial direction (for example, a vertical direction) of the syringe 144 and a direction crossing the axial direction (for example, a horizontal direction).
  • the moving device of the syringe pump 142 is configured by, for example, a robot arm, a two-axis stage, or a turntable that can move up and down.
  • the liquid feeding unit 140 sucks various liquids from the liquid chip 141 and supplies them to the flow path 41 of the detection chip 10. At this time, by moving the plunger 145, the liquid reciprocates in the flow path 41 in the detection chip 10, and the liquid in the flow path 41 is stirred. As a result, it is possible to achieve a uniform concentration distribution of the liquid and promotion of a reaction (for example, an antigen-antibody reaction) in the flow channel 41. From the viewpoint of performing such an operation, the detection chip 10 and the syringe 144 are protected so that the injection port can be sealed when the injection port penetrates the multilayer film. It is preferable to be configured.
  • the liquid in the channel 41 is again sucked by the syringe pump 142 and discharged to the liquid chip 141 and the like.
  • reaction with various liquids, washing, and the like can be performed, and a target substance labeled with a fluorescent substance can be placed in the reaction field in the flow path 41.
  • the conveyance unit 150 conveys and fixes the detection chip 10 to the measurement position or the liquid feeding position.
  • the “measurement position” means that the excitation light irradiation unit 110 irradiates the detection chip 10 with the excitation light ⁇ , and the reflected light ⁇ , fluorescence ⁇ , or plasmon scattered light ⁇ generated accordingly is reflected light detection unit 120 or fluorescence detection.
  • the “liquid feeding position” is a position where the liquid feeding unit 140 supplies a liquid into the flow channel 41 of the detection chip 10 or removes the liquid in the flow channel 41 of the detection chip 10.
  • the transport unit 150 includes a transport stage 151 and a chip holder 152.
  • the chip holder 152 is fixed to the transfer stage 151, and holds the detection chip 10 in a detachable manner.
  • the shape of the chip holder 152 is a shape that can hold the detection chip 10 and does not obstruct the optical paths of the excitation light ⁇ , the reflected light ⁇ , the fluorescence ⁇ , and the plasmon scattered light ⁇ .
  • the chip holder 152 is provided with an opening through which excitation light ⁇ , reflected light ⁇ , fluorescence ⁇ , and plasmon scattered light ⁇ pass.
  • the transfer stage 151 moves the chip holder 152 in one direction and the opposite direction.
  • the transport stage 151 also has a shape that does not obstruct the optical paths of the excitation light ⁇ , reflected light ⁇ , fluorescence ⁇ , and plasmon scattered light ⁇ .
  • the transport stage 151 is driven by, for example, a stepping motor.
  • the control unit 160 controls the angle adjustment mechanism 112, the light source control unit 113, the angle adjustment mechanism 122, the sensor control unit 123, the position switching mechanism 132, the sensor control unit 133, the liquid feed pump drive mechanism 143, and the transport stage 151.
  • the control unit 160 includes, for example, a known computer or microcomputer including an arithmetic device, a control device, a storage device, an input device, and an output device.
  • FIG. 2 is a flowchart showing a first operation procedure of the SPFS device 100.
  • step S10 preparation for detection is performed. Specifically, the detection chip 10 is installed in the chip holder 152 of the SPFS device 100.
  • the control unit 160 operates the transport stage 151 to move the detection chip 10 to the liquid feeding position. Thereafter, the control unit 160 operates the liquid feeding pump drive mechanism 143 to provide the blocking liquid of the liquid chip 141 in the flow path 41 of the detection chip 10.
  • the protective layer of the capturing body is removed by the blocking liquid, and the blocking liquid moves in the flow path 41 to block the inner surface of the flow path 41.
  • the blocking liquid is moved in the flow channel 41 in order to make the concentration distribution of the blocking agent in the flow channel 41 more uniform and promote the blocking process.
  • the method for moving the blocking liquid is not particularly limited.
  • the method of moving the blocking liquid examples include alternately repeating suction and discharge with a syringe, irradiation with ultrasonic waves, microwaves, and the like.
  • the flow rate (movement amount) of the blocking liquid is not particularly limited.
  • the flow rate of the liquid (blocking solution) in the flow channel 41 is preferably 1600 ⁇ L / min or more and 3300 ⁇ L / min or less. Thereby, the density
  • the concentration of the blocking agent in the blocking liquid is preferably about 5 to 8% by mass. From the viewpoint of promoting the blocking treatment, it is preferable that the concentration of the blocking agent is high. However, when the concentration of the blocking agent is too high, the viscosity of the blocking solution increases, and the movement of the blocking solution is inhibited. On the other hand, when the concentration of the blocking agent is too low, the blocking treatment is not appropriately performed. Thereafter, the controller 160 operates the liquid feed pump drive mechanism 143 to remove the blocking liquid in the flow path 41.
  • the type of the blocking agent contained in the blocking liquid is not particularly limited as long as nonspecific binding of the substance to be detected to the inner surface of the channel 41 can be suppressed.
  • Examples of the type of the blocking agent include high molecular compounds such as albumin, casein, skim milk, gelatin, and polyethylene glycol; and low molecular compounds such as phospholipid, ethylenediamine, and acetonitrile. These blocking agents may be used alone or in combination of two or more.
  • the target substance is captured by the capturing body (primary reaction; step S30).
  • “next to the blocking process” means that other processes (for example, a cleaning process and a storage process for a long period of time) are not included after the blocking process.
  • the control unit 160 operates the liquid feed pump drive mechanism 143 to provide the sample in the liquid chip 141 in the flow channel 41.
  • the substance to be detected is captured by the capturing body on the metal film 30 by the antigen-antibody reaction.
  • the control unit 160 operates the liquid feeding pump drive mechanism 143 to remove the specimen in the flow path 41 and uses the cleaning liquid (for example, phosphate buffer) at least once in the flow path 41. Wash.
  • the optical blank value is measured (step S40).
  • the “optical blank value” means the amount of background light emitted above the detection chip 10 in the fluorescence ⁇ measurement (step S60) described later.
  • the control unit 160 operates the transfer stage 151 to move the detection chip 10 to the detection position. Thereafter, the control unit 160 operates the excitation light irradiation unit 110 and the fluorescence detection unit 130 so that the surface plasmon resonance is generated on the back surface of the metal film 30 corresponding to the region where the capturing body is fixed. While irradiating the excitation light ⁇ through the surface 21, the output value (optical blank value) of the light receiving sensor 137 is recorded.
  • control unit 160 operates the angle adjustment mechanism 112 to set the incident angle of the excitation light ⁇ to the enhancement angle. Further, the control unit 160 controls the position switching mechanism 132 to arrange the optical filter 135 in the optical path of the light receiving unit 131. The measured optical blank value is recorded in the control unit 160.
  • the target substance captured on the metal film 30 is labeled with a fluorescent substance (secondary reaction; step S50).
  • the control unit 160 operates the transport stage 151 to move the detection chip 10 to the liquid feeding position. Thereafter, the control unit 160 operates the liquid feed pump drive mechanism 143 to provide the liquid (labeled liquid) containing the capturing body labeled with the fluorescent substance in the flow channel 41 of the detection chip 10.
  • the detection target substance captured on the metal film 30 is labeled with a fluorescent substance by the antigen-antibody reaction.
  • the controller 160 operates the liquid feed pump drive mechanism 143 to remove the labeling liquid in the flow path 41 and clean the flow path 41 with the cleaning liquid.
  • the control unit 160 operates the transfer stage 151 to move the detection chip 10 to the detection position. Thereafter, the control unit 160 operates the excitation light irradiating unit 110 and the fluorescence detecting unit 130 so that the substance to be detected and the capturing body are combined and the sample does not exist on the metal film 30 from the prism 20 side.
  • the back surface of the metal film 30 corresponding to the region where the capturing body is fixed is irradiated with the excitation light ⁇ via the incident surface 21 and the output value of the light receiving sensor 137 is recorded.
  • the control unit 160 operates the angle adjustment mechanism 112 to set the incident angle of the excitation light ⁇ to the enhancement angle. Further, the control unit 160 controls the position switching mechanism 132 to arrange the optical filter 135 in the optical path of the light receiving unit 131.
  • the control unit 160 subtracts the optical blank value from the detection value, and calculates a signal value indicating the presence or amount of the substance to be detected in the sample. The signal value is converted into the amount or concentration of the substance to be detected as necessary.
  • FIG. 3 is a flowchart showing a second operation procedure of the SPFS apparatus 100.
  • the detection chip 10 is installed in the chip holder 152 of the SPFS apparatus 100 to prepare for detection (step S10 ').
  • step S20 ' the protective layer of the capturing body is removed, and the blocking process in the flow path 41 and the primary reaction are simultaneously performed (step S20 ').
  • the control unit 160 operates the transport stage 151 to move the detection chip 10 to the liquid feeding position. Thereafter, the control unit 160 operates the liquid feed pump drive mechanism 143 to provide the liquid mixture of the blocking liquid of the liquid chip 141 and the sample containing the detection target substance in the flow channel 41 of the detection chip 10.
  • the blocking liquid and the mixed solution of the specimen move in the flow channel 41, the protective layer of the capturing body is removed, and a blocking process is performed on the inner surface of the flow channel 41. Further, the substance to be detected is captured by the capturing body on the metal film 30 by the antigen-antibody reaction.
  • the liquid (blocking liquid and sample mixture) in the flow path 41 is moved in the same manner as in the first operation procedure.
  • the flow rate of the liquid (blocking solution and sample mixed solution) in the channel 41 is not particularly limited, and is the same as the flow rate in the first operation procedure.
  • the concentration of the blocking agent in the liquid (blocking liquid and sample mixture) in the channel 41 is preferably about 2 to 3% by mass, for example.
  • the liquid moving in the flow path 41 includes various proteins such as a substance to be detected in addition to the blocking agent.
  • the control unit 160 operates the liquid feed pump drive mechanism 143 to remove the liquid in the flow path 41 and uses the cleaning liquid (for example, phosphate buffer) at least once in the flow path 41. Wash.
  • the cleaning liquid for example, phosphate buffer
  • an optical blank value is measured (step S30 ′), and after a secondary reaction is performed (step S40 ′), a signal value indicating the presence or amount of the substance to be detected in the sample is obtained. (Step S50 ′).
  • the control unit 160 subtracts the optical blank value from the detection value, calculates a signal value indicating the presence or amount of the detected substance in the sample, and converts it to the amount or concentration of the detected substance as necessary.
  • the concentration distribution of the blocking agent can be made uniform by moving the blocking liquid in the flow path 41. As a result, the blocking process is promoted, and the blocking process can be performed in a short time. Moreover, in the SPFS apparatus 100 according to the present embodiment, since the blocking liquid is moved, the blocking process can be appropriately performed in a short time regardless of the viscosity of the blocking liquid.
  • the pH of the blocking liquid has been adjusted from the viewpoint of promoting the blocking treatment.
  • the pH of the blocking solution is different from the pH of the sample, there is a possibility that the substance to be detected and the blocking agent in the sample are denatured. For this reason, in order to remove the blocking liquid from the flow path 41 after the blocking process, it was necessary to clean the flow path 41.
  • the blocking agent may be peeled off by the cleaning liquid, so that the effect of the blocking process may be reduced. Therefore, the conventional detection method may not be able to detect the substance to be detected with high accuracy. . Further, by performing other steps such as a washing step, the number of steps until detection of the substance to be detected is increased, and the time required for detection is increased.
  • the blocking process is promoted by moving the blocking liquid. For this reason, it is not necessary to adjust the pH of the blocking solution. Moreover, in this Embodiment, since it is not necessary to include other processes, such as washing
  • the detection method and the detection apparatus that combine excitation light and surface plasmon by totally reflecting excitation light at the interface between the prism 20 and the metal film 30 have been described.
  • the detection method and the detection apparatus according to the present invention may combine excitation light and surface plasmon using a diffraction grating.
  • the metal film 30 may not be disposed on the prism 20, and may include a diffraction grating instead.
  • the detection method and the detection device using SPFS have been described.
  • the detection method and the detection device according to the present invention are not limited to the detection method and the detection device using SPFS.
  • the detection method and the detection device according to the present invention may be a detection method and a detection device using the SPR method.
  • the SPFS device 100 detects the presence or amount of the substance to be detected by measuring the amount of reflected light ⁇ as a signal value without measuring the amount of fluorescence ⁇ . Therefore, measurement of the optical blank value (step S40, step S30 ') and secondary reaction (step S50, step S40') are unnecessary.
  • Example 1 In Example 1, the effect of moving the blocking solution in the blocking treatment was examined.
  • detection chip In which the reaction field on the metal film (the region where the anti-troponin antibody is immobilized as a capturing body) is protected by a protective layer was prepared. . The cross-sectional area of the flow path on the reaction field is 0.46 mm 2 . The prepared detection chip was placed in the chip holder of the SPFS apparatus.
  • blocking solution A blocking agent (BSA; bovine serum albumin) was added to the acetate buffer so that the final concentration was 5% by mass to prepare a blocking solution.
  • BSA bovine serum albumin
  • Blocking treatment Using the syringe pump of the liquid feeding section, the blocking liquid (100 ⁇ L) is fed back and forth in the flow channel of the detection chip at a predetermined flow rate (1 to 3300 ⁇ L / min) for 35 seconds. Blocking was performed. Next, the blocking liquid in the flow path was removed using a syringe pump in the liquid feeding section.
  • the volume ratio of phosphate buffer and plasma (specimen) containing troponin (substance to be detected) is 2: 1.
  • the mixed plasma dilution (100 ⁇ L) was sent back and forth in the flow path at a flow rate of 3300 ⁇ L / min for 4 minutes to perform the primary reaction.
  • the metal film was irradiated with light having a wavelength of 635 nm from the prism side. Next, the reflected light from the metal film was detected and the reflectance was measured. The blocking rate was calculated based on the calibration curves of reflectance and blocking rate prepared in advance and the measured reflectance. When preparing the calibration curve, the blocking rate was set to 100% when the blocking treatment time was increased or the concentration of the blocking agent was increased and no change in reflectance was observed.
  • BSA blocking agent
  • a blocking liquid and plasma mixed solution (100 ⁇ L) is flown in the flow path at a predetermined flow rate (1 to 3300 ⁇ L / min) for 1 minute and 28 seconds.
  • the solution was reciprocated to perform blocking treatment and primary reaction.
  • the liquid mixture in the flow path was removed using a syringe pump in the liquid feeding section.
  • FIG. 4A is a graph showing the relationship between the flow rate of the blocking liquid and the blocking rate when the primary reaction is performed after the blocking process.
  • FIG. 4B is a graph showing the relationship between the flow rate of the mixed solution and the blocking rate when the blocking treatment and the primary reaction are simultaneously performed. 4A and 4B, the horizontal axis indicates the flow rate ( ⁇ L / min) of the liquid (blocking liquid or mixed liquid) in the flow path, and the vertical axis indicates the blocking rate (%).
  • the liquid (blocking solution) in the flow path is used in both cases where the primary reaction is performed after the blocking process and when the blocking process and the primary reaction are performed simultaneously.
  • the blocking rate increased as the flow rate of the mixed solution increased.
  • the blocking rate can be increased to 90% or more by setting the flow rate of the liquid in the flow channel to 1600 ⁇ L / min or more and 3300 ⁇ L / min or less.
  • Example 2 In Example 2, the relationship between the presence / absence of movement of the blocking liquid and the concentration of the blocking agent and the time required for the blocking treatment in the case of performing the primary reaction after the blocking treatment was examined.
  • blocking solution A blocking agent (BSA) is added to an acetate buffer so that the final concentration is 0% by mass, 1% by mass, 2% by mass, 5% by mass or 8% by mass, and 5 types of blocking are performed. A liquid was prepared.
  • BSA blocking agent
  • Blocking treatment Immediately after production, a detection chip that was not subjected to blocking treatment was placed in a chip holder of an SPFS device. Using a syringe pump in the liquid feeding section, a blocking liquid (100 ⁇ L) containing 0% by mass, 2% by mass, 5% by mass or 8% by mass of a blocking agent is reciprocated in the flow path at a predetermined flow rate for a predetermined time. The liquid (stirring) was performed and the blocking process was performed. Next, the blocking liquid in the flow path was removed using a syringe pump in the liquid feeding section.
  • blocking time a lower limit of the treatment time when the blocking rate was 90% or more was determined.
  • Table 1 shows the relationship between blocking conditions and blocking time. Under conditions A and C to E, blocking treatment is performed immediately before the primary reaction. Condition B performs a blocking process immediately after the detection chip is manufactured.
  • the blocking time when the blocking solution was not moved was 5 hours.
  • the blocking time when the blocking solution was moved was significantly shorter than that when the blocking solution was not moved (condition B). From this result, it can be seen that the blocking time can be greatly shortened by moving the blocking liquid. Moreover, it turns out that blocking time can be shortened, so that the density
  • Example 3 In Example 3, the relationship between the presence / absence of movement of the blocking solution, the concentration of the blocking agent, and the signal value when the primary reaction was performed after the blocking treatment was examined. As a comparative example, the case where other steps were included between the blocking treatment and the primary reaction was also examined.
  • Blocking treatment Immediately after production, a detection chip that was not subjected to blocking treatment was placed in the chip holder of the SPFS device. Using the same procedure as in Example 2, a blocking solution (100 ⁇ L) containing 0% by mass, 2% by mass, 5% by mass or 8% by mass of a blocking agent (100 ⁇ L) was used for 15 seconds at a rate of 3300 ⁇ L / min. The reciprocating liquid was sent in the flow path at a flow rate of. Next, the blocking liquid in the flow path was removed using a syringe pump in the liquid feeding section.
  • Table 2 shows the conditions for blocking treatment. Under conditions F and H to J, blocking treatment is performed immediately before the primary reaction. Condition G performs a blocking process immediately after the detection chip is manufactured.
  • FIG. 5A is a graph showing a signal value indicating the amount of a substance to be detected under conditions F to J.
  • the black bars indicate the results when a negative reaction is performed
  • the white bars indicate the results when a positive reaction is performed.
  • the vertical axis represents the signal value (relative value) when the signal value in condition G is defined as a reference (100).
  • the signal value in the case of performing a positive reaction is mainly derived from the fluorescence emitted from the fluorescent dye that labels the substance to be detected.
  • the signal value is derived from a fluorescent dye that is non-specifically bound in the flow path or other autofluorescence. That is, the signal value when the positive reaction is performed indicates the amount of the substance to be detected, and the signal value when the negative reaction is performed indicates the amount of noise.
  • the signal value (noise) of the detection chip (condition G) that was subjected to the blocking treatment immediately after production was found to be the blocking treatment immediately before the primary reaction. It was higher than the signal value (noise) of the detection chip (conditions H to J). From this result, it can be seen that the effect of the blocking process is reduced by storing the detection chip for a long time after the blocking process. From this, it can be seen that, from the viewpoint of improving the SN ratio, it is preferable to perform the blocking treatment immediately before the primary reaction without including other steps between the blocking treatment and the primary reaction.
  • the signal value (noise) decreased as the concentration of the blocking agent increased.
  • the signal value (noise) was reduced by about 30%.
  • the signal value (noise) was reduced by about 20% by moving the blocking solution. From these results, it can be seen that as the blocking liquid is moved and the concentration of the blocking agent is higher, the effect of the blocking treatment becomes higher and nonspecific binding of the detection target substance to the inner surface of the flow path can be suppressed.
  • the signal value did not decrease even when the concentration of the blocking agent was increased. From this, it is understood that when the primary reaction is performed after the blocking treatment, the concentration of the blocking agent does not affect the amount of the substance to be detected captured by the capturing body.
  • the SN ratio is improved while shortening the time required for detecting the detection target substance (including the time required for the blocking process). It can be seen that the amount of the substance to be detected can be detected with high accuracy.
  • Example 4 In Example 4, the relationship between the concentration of the blocking agent and the signal value when the blocking treatment and the primary reaction were simultaneously performed was examined.
  • Example 1 Preparation of detection chip As in Example 1, the detection chip in which the reaction field on the metal film (the region where the anti-troponin antibody is immobilized as a capturing body) is protected by a protective layer is used as the chip holder of the SPFS device. Installed. In addition, the cross-sectional area of the flow path on the reaction field is 0.46 mm 2 .
  • BSA blocking agent
  • the prepared blocking solution and plasma (specimen) were mixed so that the volume ratio was 2 to 1, thereby preparing 6 types of blocking solutions and plasma mixed solutions.
  • the final concentration of the blocking agent in the mixed solution is 0% by mass, 1% by mass, 2% by mass, 3% by mass, 4% by mass or 5% by mass, respectively.
  • 12 kinds of liquid mixtures were prepared using plasma containing a substance to be detected (troponin) or plasma not containing troponin as a specimen.
  • the black bars indicate the results when a negative reaction is performed, and the white bars indicate the results when a positive reaction is performed.
  • the horizontal axis indicates the concentration (% by mass) of the blocking agent.
  • the vertical axis represents the signal value (relative value) when the signal when the concentration of the blocking agent is 0% by mass (when the blocking agent is not included) is the reference (100).
  • the signal value (noise) is highest when the concentration of the blocking agent is 0% by mass, and the signal value (noise) tends to decrease as the concentration of the blocking agent increases. It was. From this result, it can be seen that the higher the concentration of the blocking agent, the higher the effect of the blocking treatment, and the non-specific binding in the channel can be suppressed.
  • the concentration of the blocking agent in the mixed solution it is preferable to set the concentration of the blocking agent in the mixed solution to 3% by mass or less in order to prevent the primary reaction from being inhibited. Recognize.
  • the detection method and detection apparatus for a substance to be detected using the reaction method according to the present invention can detect the substance to be detected with high reliability, and thus are useful for, for example, examination of diseases.

Abstract

　第１の工程では、液体を収容するための収容部内においてブロッキング剤を含むブロッキング液を移動させて、前記収容部内をブロッキング処理する。第２の工程では、前記収容部内に被反応物質（被検出物質）を含む液体を提供して、前記収容部に露出し、かつ捕捉体が固定されている反応場に前記被反応物質を捕捉させる。前記第２の工程は、前記第１の工程の次に行われるか、または前記第１の工程と同時に行われる。

Description

反応方法、検出方法および検出装置
　本発明は、捕捉体が固定されている反応場を含む収容器を用いた反応方法、ならびに前記収容器を用いて被検出物質を検出するための検出方法および検出装置に関する。
　臨床検査などにおいて、検体中のタンパク質やＤＮＡなどの微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出することができれば、患者の状態を迅速に把握して治療することが可能となる。このため、検体中の被検出物質を高感度かつ定量的に検出できる方法が求められている。
　近年、微量の被検出物質を分析するために、マイクロ総合分析システム（μ－ＴＡＳ）が使用されている。マイクロ総合分析システムは、少量の試薬や試料を用いて、短時間で分析できるという利点を有している。マイクロ総合分析システムの一例として、微細な流路を有するマイクロ流路チップを利用したマイクロ流路システムがある。マイクロ流路チップの流路内には、被検出物質を捕捉するための捕捉体が固定された反応場が配置されている。この反応場では、流路内に提供された検体に含まれる被検出物質を捕捉体に結合させる抗原抗体反応（以下、「一次反応」ともいう）などが行われる。このマイクロ流路システムでは、捕捉体に捕捉された被検出物質を検出している。
　しかし、被検出物質は、非特異的に流路の内面にも付着しうる。反応場外において流路の内面に付着した被検出物質は、検出されない。このため、信頼性のある検出結果を得られないという問題があった。そこで、被検出物質が、非特異的に流路の内面に付着することを防ぐための手段として、流路の内面にブロッキング処理を施すことが提案されている（例えば、特許文献１参照）。
　特許文献１に記載のマイクロ総合分析システムでは、ブロッキング処理は、一次反応と別工程として行われる。具体的には、流路の内面へのブロッキング処理の後に、流路内からブロッキング液を除去し、さらに流路内の洗浄が行われる。この後、流路内に被検出物質を含む検体が導入されて、反応場で一次反応が行われる。これにより、特許文献１に記載のマイクロ総合分析システムでは、非特異的に流路の内面に被検出物質が付着することを防いでいる。
特開２００６－２９２４７２号公報
　ブロッキング処理後に流路内の洗浄を行う場合、工程数が増えるため検出時間が長くなってしまう。また、洗浄によってブロッキング剤が流路の内面から剥がれてしまい、ブロッキング処理の効果が低下してしまうおそれもある。すなわち、特許文献１に記載のマイクロ総合分析システムは、検出時間の短縮化および検出精度の向上の観点から、改善の余地がある。
　本発明の第１の目的は、流路（収容部）の内面へのブロッキング処理の効果を低下させることなく、捕捉体と被反応物質（被検出物質）とを結合させることができる反応方法を提供することである。また、本発明の第２の目的は、この反応方法を利用することにより流路（収容部）の内面へのブロッキング処理の効果を低下させることなく、被検出物質を短時間かつ高精度で検出することができる検出方法および検出装置を提供することである。
　上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る反応方法は、液体を収容するための収容部と、前記収容部に露出し、かつ捕捉体が固定されている反応場とを含む収容器において、前記捕捉体と被反応物質とを結合させる反応方法であって、前記収容部内においてブロッキング剤を含むブロッキング液を移動させて、前記収容部内をブロッキング処理する工程と、前記収容部内に前記被反応物質を含む液体を提供して、前記被反応物質を前記捕捉体に捕捉させる工程と、を有し、前記被反応物質を前記捕捉体に捕捉させる工程は、前記ブロッキング処理をする工程の次に行われるか、または前記ブロッキング処理をする工程と同時に行われる。
　上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る検出方法は、液体を収容するための収容部と、前記収容部に露出し、かつ捕捉体が固定されている反応場を含む金属膜とを有する検出チップを用いて、表面プラズモン共鳴を利用することにより、検体中の被検出物質の存在または量を検出するための検出方法であって、前記収容部内においてブロッキング剤を含むブロッキング液を移動させて、前記収容部内をブロッキング処理する工程と、前記収容部内に前記検体を提供して、前記被検出物質を前記捕捉体に捕捉させる工程と、前記被検出物質と前記捕捉体とが結合している状態で、前記金属膜において表面プラズモン共鳴が発生するように前記金属膜に光を照射して、前記金属膜の前記収容部側の面の近傍から放出される蛍光の光量、または前記金属膜で反射された光の光量を検出する工程と、を有し、前記被検出物質を前記捕捉体に捕捉させる工程は、前記ブロッキング処理をする工程の次に行われるか、または前記ブロッキング処理をする工程と同時に行われる。
　上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る検出装置は、液体を収容するための収容部と、前記収容部に露出し、かつ捕捉体が固定されている反応場を含む金属膜とを有する検出チップを用いて、表面プラズモン共鳴を利用することにより、検体中の被検出物質の存在または量を検出するための検出装置であって、前記検出チップを保持するためのホルダーと、前記ホルダーに前記検出チップが保持された状態で、前記収容部内に液体を提供する送液部と、前記金属膜において表面プラズモン共鳴が発生するように、前記ホルダーに保持された前記検出チップの前記金属膜に光を照射する光照射部と、前記光照射部が前記金属膜に光を照射したときに、前記金属膜の前記収容部側の面の近傍から放出される蛍光の光量、または前記金属膜で反射された光の光量を検出する光検出部と、を有し、前記送液部は、前記収容部内にブロッキング剤を含むブロッキング液を提供するとともに、前記収容部内において前記ブロッキング液を移動させて、前記収容部内をブロッキング処理する工程と、前記検体を前記収容部内に提供して前記被検出物質を前記捕捉体に捕捉させる工程と、を行い、前記送液部は、前記被検出物質を前記捕捉体に捕捉させる工程を、前記ブロッキング処理をする工程の次、または前記ブロッキング処理をする工程と同時に行う。
　本発明に係る反応方法によれば、流路（収容部）の内面へのブロッキング処理の効果を低下させることなく、捕捉体と被反応物質（被検出物質）とを短時間で効率的に結合させることができる。したがって、本発明に係る検出方法および検出装置によれば、被検出物質の存在または量を短時間かつ高精度で検出することができる。
図１は、実施の形態に係る表面プラズモン励起増強蛍光分析装置（ＳＰＦＳ装置）の構成を示す模式図である。 図２は、図１に示されるＳＰＦＳ装置の第１の動作手順を示すフローチャートである。 図３は、図１に示されるＳＰＦＳ装置の第２の動作手順を示すフローチャートである。 図４Ａは、ブロッキング処理の次に一次反応を行った場合の、ブロッキング液の流量とブロッキング率との関係を示すグラフであり、図４Ｂは、ブロッキング処理と一次反応とを同時に行った場合の、混合液の流量とブロッキング率との関係を示すグラフである。 図５Ａは、ブロッキング処理の次に一次反応を行った場合の、ブロッキング液の移動の有無およびブロッキング剤の濃度と、被検出物質の量を示すシグナル値との関係を示すグラフであり、図５Ｂは、ブロッキング処理と一次反応とを同時に行った場合の、ブロッキング剤の濃度と被検出物質の量を示すシグナル値との関係を示すグラフである。
　以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。ここでは、本発明に係る検出装置の代表例として、検体（被反応物質を含む液体）中の被検出物質（被反応物質）の量を検出する表面プラズモン励起増強蛍光分光法（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy：以下「ＳＰＦＳ」と略記する）を利用する分析装置（ＳＰＦＳ装置）について説明する。
　（ＳＰＦＳ装置および検出チップの構成）
　図１は、本発明の実施の形態に係る表面プラズモン励起増強蛍光分析装置（ＳＰＦＳ装置）１００の構成を示す模式図である。図１に示されるように、ＳＰＦＳ装置１００は、励起光照射部（光照射部）１１０、反射光検出部１２０、蛍光検出部１３０、送液部１４０、搬送部１５０および制御部１６０を有する。ＳＰＦＳ装置１００は、搬送部１５０のチップホルダー１５２に検出チップ１０（収容器）を装着した状態で使用される。そこで、検出チップ１０について先に説明し、その後にＳＰＦＳ装置１００の各構成要素について説明する。
　検出チップ１０は、入射面２１、成膜面２２および出射面２３を有するプリズム２０と、成膜面２２上に形成された金属膜３０と、金属膜３０上に配置された流路蓋４０とを有する。また、後述のとおり、検出チップ１０（収容器）は、流路４１（収容部）と、流路４１に露出した反応場とを含む。反応場では、被検出物質（被反応物質）の捕捉体による捕捉や、被検出物質の蛍光物質による標識などが行われる。通常、検出チップ１０は、分析のたびに交換される。検出チップ１０は、好ましくは各片の長さが数ｍｍ～数ｃｍの構造物であるが、「チップ」の範疇に含まれないようなより小型の構造物、またはより大型の構造物であってもよい。
　プリズム２０は、励起光αに対して透明な誘電体からなる。プリズム２０は、入射面２１、成膜面２２および出射面２３を有する。入射面２１は、励起光照射部１１０からの励起光αをプリズム２０の内部に入射させる。成膜面２２上には、金属膜３０が配置されている。プリズム２０の内部に入射した励起光αは、金属膜３０の裏面で反射されて反射光βとなる。より具体的には、励起光αは、プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）で反射されて反射光βとなる。出射面２３は、反射光βをプリズム２０の外部に出射させる。
　プリズム２０の形状は、特に限定されない。本実施の形態では、プリズム２０の形状は、台形を底面とする柱体である。台形の一方の底辺に対応する面が成膜面２２であり、一方の脚に対応する面が入射面２１であり、他方の脚に対応する面が出射面２３である。底面となる台形は、等脚台形であることが好ましい。これにより、入射面２１と出射面２３とが対称になり、励起光αのＳ波成分がプリズム２０内に滞留しにくくなる。
　入射面２１は、励起光αが励起光照射部１１０に戻らないように形成される。励起光αの光源がレーザーダイオード（以下「ＬＤ」ともいう）である場合、励起光αがＬＤに戻ると、ＬＤの励起状態が乱れてしまい、励起光αの波長や出力が変動してしまう。そこで、理想的な共鳴角または増強角を中心とする走査範囲において、励起光αが入射面２１に垂直に入射しないように、入射面２１の角度が設定される。ここで「共鳴角」とは、金属膜３０に対する励起光αの入射角を走査した場合に、出射面２３から出射される反射光βの光量が最小となるときの、入射角を意味する。また、「増強角」とは、金属膜３０に対する励起光αの入射角を走査した場合に、検出チップ１０の上方に放出される励起光αと同一波長の散乱光（以下「プラズモン散乱光」という）δの光量が最大となるときの、入射角を意味する。本実施の形態では、入射面２１と成膜面２２との角度および成膜面２２と出射面２３との角度は、いずれも約８０°である。
　なお、検出チップ１０の設計により、共鳴角（およびその極近傍にある増強角）が概ね決まる。設計要素は、プリズム２０の屈折率や、金属膜３０の屈折率、金属膜３０の膜厚、金属膜３０の消衰係数、励起光αの波長などである。金属膜３０上に捕捉された被検出物質によって共鳴角および増強角がシフトするが、その量は数度未満である。
　プリズム２０は、複屈折特性を少なからず有する。プリズム２０の材料の例には、樹脂およびガラスが含まれる。プリズム２０の材料は、好ましくは、屈折率が１.４～１.６であり、かつ複屈折が小さい樹脂である。
　金属膜３０は、プリズム２０の成膜面２２上に配置されている。これにより、成膜面２２に全反射条件で入射した励起光αの光子と、金属膜３０中の自由電子との間で表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：以下「ＳＰＲ」と略記する）が生じ、金属膜３０の表面上に局在場光（一般に「エバネッセント光」または「近接場光」とも呼ばれる）を生じさせることができる。本実施の形態では、金属膜３０は、成膜面２２の全面に形成されている。
　金属膜３０の材料は、表面プラズモン共鳴を生じさせうる金属であれば特に限定されない。金属膜３０の材料の例には、金、銀、銅、アルミ、これらの合金が含まれる。本実施の形態では、金属膜３０は、金薄膜である。金属膜３０の形成方法は、特に限定されない。金属膜３０の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、メッキが含まれる。金属膜３０の厚みは、特に限定されないが、３０～７０ｎｍの範囲内が好ましい。
　また、特に図示しないが、金属膜３０のプリズム２０と対向しない面（金属膜３０の表面）には、被検出物質を捕捉するための捕捉体が固定化されている。捕捉体を固定化することで、被検出物質を選択的に検出することが可能となる。本実施の形態では、金属膜３０上の所定の領域（反応場）に、捕捉体が均一に固定化されている。捕捉体の種類は、被検出物質を捕捉することができれば特に限定されない。本実施の形態では、捕捉体は、被検出物質に特異的に結合する抗体またはその断片である。また、乾燥による変性を防止する観点から、通常、捕捉体は、未使用時において保護層により保存される。
　流路蓋４０は、金属膜３０上に配置されている。金属膜３０がプリズム２０の成膜面２２の一部にのみ形成されている場合、流路蓋４０は、成膜面２２上に配置されていてもよい。本実施の形態では、流路蓋４０は、金属膜３０の上に配置されている。流路蓋４０の裏面には、流路溝が形成されており、流路蓋４０は、金属膜３０（およびプリズム２０）と共に、液体を収容するための収容部を形成する。本実施の形態では、収容部は、液体が流れる流路４１である。流路４１の断面積の大きさにより流路４１内の液体の移動速度が調節されうる。後述する反応場上の液体の流れ方向に対して垂直な断面における流路４１の断面積は、特に限定されないが、例えば、０．０１ｍｍ２以上かつ１００ｍｍ２以下であることが好ましい。流路４１内で液体をより高速で移動させる観点からは、０．０１ｍｍ２以上かつ１０ｍｍ２以下であることがより好ましく、０．０１ｍｍ２以上かつ１ｍｍ２以下であることがさらに好ましい。また、反応場は、流路４１（収容部）に露出するように配置されている。液体の例には、被検出物質を含む検体（例えば、血液や血清、血漿、尿、鼻孔液、唾液、精液など）や、ブロッキング剤を含むブロッキング液、蛍光物質で標識された捕捉体を含む標識液、基準液、洗浄液などが含まれる。金属膜３０に固定化されている捕捉体は、流路４１内に露出している。流路４１の両端は、流路蓋４０の上面に形成された不図示の注入口および排出口とそれぞれ接続されている。流路４１内へ液体が提供されると、液体は捕捉体に接触する。
　流路蓋４０は、金属膜３０上から放出される蛍光γおよびプラズモン散乱光δに対して透明な材料からなることが好ましい。流路蓋４０の材料の例には、樹脂が含まれる。蛍光γおよびプラズモン散乱光δを外部に取り出す部分が蛍光γおよびプラズモン散乱光δに対して透明であれば、流路蓋４０の他の部分は、不透明な材料で形成されていてもよい。流路蓋４０は、例えば、両面テープや接着剤などによる接着や、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ部材を用いた圧着などにより金属膜３０またはプリズム２０に接合されている。
　なお、検出チップ１０は、流路蓋４０の代わりに、貫通孔を有する枠体と、枠体に積層される天板とを有していてもよい。この場合、流路４１（収容部）は、金属膜３０が形成されたプリズム２０に対して、枠体および天板をこの順で積層することで形成される。金属膜３０の表面は、流路４１の底面となる。枠体の貫通孔の内面は、流路４１の側面となる。天板の一方の面（内側の面）は、流路４１の天面となる。
　図１に示されるように、励起光αは、入射面２１からプリズム２０内に入射する。プリズム２０内に入射した励起光αは、金属膜３０に全反射角度（ＳＰＲが生じる角度）で入射する。このように金属膜３０に対して励起光αをＳＰＲが生じる角度で照射することで、金属膜３０上に局在場光を発生させることができる。この局在場光により、金属膜３０上に存在する被検出物質を標識する蛍光物質が励起され、蛍光γが金属膜３０の流路４１（収容部）側の面の近傍から放出される。ＳＰＦＳ装置１００は、蛍光物質から放出された蛍光γの光量を測定することで、被検出物質の存在または量を検出する。
　次に、ＳＰＦＳ装置１００の各構成要素について説明する。前述のとおり、ＳＰＦＳ装置１００は、励起光照射部１１０、反射光検出部１２０、蛍光検出部１３０、送液部１４０、搬送部１５０および制御部１６０を有する。
　励起光照射部１１０は、チップホルダー１５２に保持された検出チップ１０に励起光αを照射する。蛍光γまたはプラズモン散乱光δの測定時には、励起光照射部１１０は、金属膜３０に対する入射角がＳＰＲを生じさせる角度となるように、金属膜３０に対するＰ波のみを入射面２１に向けて出射する。ここで「励起光」とは、蛍光物質を直接または間接的に励起させる光である。たとえば、励起光αは、プリズム２０を介して金属膜３０にＳＰＲが生じる角度で照射されたときに、蛍光物質を励起させる局在場光を金属膜３０の表面上に生じさせる光である。励起光照射部１１０は、光源ユニット１１１、角度調整機構１１２および光源制御部１１３を含む。
　光源ユニット１１１は、コリメートされ、かつ波長および光量が一定の励起光αを、金属膜３０の裏面における照射スポットの形状が略円形となるように出射する。光源ユニット１１１は、例えば、励起光αの光源、ビーム整形光学系、ＡＰＣ機構および温度調整機構（いずれも不図示）を含む。
　光源の種類は、特に限定されず、例えばレーザーダイオード（ＬＤ）である。光源の他の例には、発光ダイオード、水銀灯、その他のレーザー光源が含まれる。光源から出射される光がビームでない場合、光源から出射される光は、レンズや鏡、スリットなどによりビームに変換される。また、光源から出射される光が単色光でない場合は、光源から出射される光は、回折格子などにより単色光に変換される。さらに、光源から出射される光が直線偏光でない場合、光源から出射される光は、偏光子などにより直線偏光の光に変換される。
　ビーム整形光学系は、例えば、コリメーターやバンドパスフィルター、直線偏光フィルター、半波長板、スリット、ズーム手段などを含む。ビーム整形光学系は、これらのすべてを含んでいてもよいし、一部を含んでいてもよい。コリメーターは、光源から出射された励起光αをコリメートする。バンドパスフィルターは、光源から出射された励起光αを中心波長のみの狭帯域光にする。光源からの励起光αは、若干の波長分布幅を有しているためである。直線偏光フィルターは、光源から出射された励起光αを完全な直線偏光の光にする。半波長板は、金属膜３０にＰ波成分が入射するように励起光αの偏光方向を調整する。スリットおよびズーム手段は、金属膜３０の裏面における照射スポットの形状が所定サイズの円形となるように、励起光αのビーム径や輪郭形状などを調整する。
　ＡＰＣ機構は、光源の出力が一定となるように光源を制御する。より具体的には、ＡＰＣ機構は、励起光αから分岐させた光の光量を不図示のフォトダイオードなどで検出する。そして、ＡＰＣ機構は、回帰回路で投入エネルギーを制御することで、光源の出力を一定に制御する。
　温度調整機構は、例えば、ヒーターやペルチェ素子などである。光源の出射光の波長およびエネルギーは、温度によって変動することがある。このため、温度調整機構で光源の温度を一定に保つことにより、光源の出射光の波長およびエネルギーを一定に制御する。
　角度調整機構１１２は、金属膜３０（プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２））に対する励起光αの入射角を調整する。角度調整機構１１２は、プリズム２０を介して金属膜３０の所定の位置に向けて所定の入射角で励起光αを照射するために、励起光αの光軸とチップホルダー１５２とを相対的に回転させる。
　たとえば、角度調整機構１１２は、光源ユニット１１１を励起光αの光軸と直交する軸（図１の紙面に対して垂直な軸）を中心として回動させる。このとき、入射角を走査しても金属膜３０上での照射スポットの位置がほとんど変化しないように、回転軸の位置を設定する。特に、回転中心の位置を、入射角の走査範囲の両端における２つの励起光αの光軸の交点近傍（成膜面２２上の照射位置と入射面２１との間）に設定することで、照射位置のズレを極小化することができる。
　前述のとおり、金属膜３０に対する励起光αの入射角のうち、プラズモン散乱光δの光量が最大となる角度が増強角である。励起光αの入射角を増強角またはその近傍の角度に設定することで、高強度の蛍光γを測定することが可能となる。検出チップ１０のプリズム２０の材料および形状、金属膜３０の膜厚、流路４１内の液体の屈折率などにより、励起光αの基本的な入射条件が決まるが、流路４１内の蛍光物質の種類および量、プリズム２０の形状誤差などにより、最適な入射条件はわずかに変動する。このため、測定ごとに最適な増強角を求めることが好ましい。
　光源制御部１１３は、光源ユニット１１１に含まれる各種機器を制御して、光源ユニット１１１からの励起光αの出射を制御する。光源制御部１１３は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
　反射光検出部１２０は、共鳴角の測定などを行うために、検出チップ１０への励起光αの照射によって生じた反射光βの光量を測定する。反射光検出部１２０は、受光センサー１２１、角度調整機構１２２およびセンサー制御部１２３を含む。
　受光センサー１２１は、反射光βが入射する位置に配置され、反射光βの光量を測定する。受光センサー１２１の種類は、特に限定されない。たとえば、受光センサー１２１は、フォトダイオード（ＰＤ）である。
　角度調整機構１２２は、金属膜３０に対する励起光αの入射角に応じて、受光センサー１２１の位置（角度）を調整する。角度調整機構１２２は、反射光βが受光センサー１２１に入射するように、受光センサー１２１とチップホルダー１５２とを相対的に回転させる。
　センサー制御部１２３は、受光センサー１２１の出力値の検出や、検出した出力値による受光センサー１２１の感度の管理、適切な出力値を得るための受光センサー１２１の感度の変更、などを制御する。センサー制御部１２３は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
　蛍光検出部１３０は、金属膜３０への励起光αの照射によって生じた蛍光γを検出する。また、必要に応じて、蛍光検出部１３０は、金属膜３０への励起光αの照射によって生じたプラズモン散乱光δも検出する。蛍光検出部１３０は、受光ユニット１３１、位置切替機構１３２およびセンサー制御部１３３を含む。
　受光ユニット１３１は、検出チップ１０の金属膜３０の法線方向に配置される。受光ユニット１３１は、第１レンズ１３４、光学フィルター１３５、第２レンズ１３６および受光センサー１３７を含む。
　第１レンズ１３４は、例えば、集光レンズであり、金属膜３０上から出射される光を集光する。第２レンズ１３６は、例えば、結像レンズであり、第１レンズ１３４で集光された光を受光センサー１３７の受光面に結像させる。両レンズの間の光路は、略平行な光路になっている。光学フィルター１３５は、両レンズの間に配置されている。
　光学フィルター１３５は、蛍光成分のみを受光センサー１３７に導き、高いＳ／Ｎ比で蛍光γを検出するために、励起光成分（プラズモン散乱光δ）を除去する。光学フィルター１３５の例には、励起光反射フィルター、短波長カットフィルターおよびバンドパスフィルターが含まれる。光学フィルター１３５は、例えば、所定の光成分（所定の波長成分の光）を反射する多層膜を含むフィルター、または所定の光成分を吸収する色ガラスフィルターである。
　受光センサー１３７は、蛍光γおよびプラズモン散乱光δを検出する。受光センサー１３７は、微量の被検出物質からの微弱な蛍光γを検出することが可能な、高い感度を有する。受光センサー１３７は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）やアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）などである。
　位置切替機構１３２は、光学フィルター１３５の位置を、受光ユニット１３１における光路上または光路外に切り替える。具体的には、受光センサー１３７が蛍光γを検出する時には、光学フィルター１３５を受光ユニット１３１の光路上に配置し、受光センサー１３７がプラズモン散乱光δを検出する時には、光学フィルター１３５を受光ユニット１３１の光路外に配置する。
　センサー制御部１３３は、受光センサー１３７の出力値の検出や、検出した出力値による受光センサー１３７の感度の管理、適切な出力値を得るための受光センサー１３７の感度の変更、などを制御する。センサー制御部１３３は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
　送液部１４０は、チップホルダー１５２に保持された検出チップ１０の流路４１内に、検体やブロッキング剤を含むブロッキング液、標識液、基準液、洗浄液などを供給する。送液部１４０は、液体チップ１４１、シリンジポンプ１４２および送液ポンプ駆動機構１４３を含む。
　液体チップ１４１は、検体やブロッキング液、標識液、基準液、洗浄液などの液体を収容する容器である。液体チップ１４１としては、通常、複数の容器が液体の種類に応じて配置されるか、または複数の容器が一体化したチップが配置される。
　シリンジポンプ１４２は、シリンジ１４４と、シリンジ１４４内を往復動作可能なプランジャー１４５とによって構成される。プランジャー１４５の往復運動によって、液体の吸引および吐出が定量的に行われる。シリンジ１４４が交換可能であると、シリンジ１４４の洗浄が不要となる。このため、不純物の混入などを防止する観点から好ましい。シリンジ１４４が交換可能に構成されていない場合は、シリンジ１４４内を洗浄する構成をさらに付加することにより、シリンジ１４４を交換せずに使用することが可能となる。
　送液ポンプ駆動機構１４３は、プランジャー１４５の駆動装置、およびシリンジポンプ１４２の移動装置を含む。シリンジポンプ１４２の駆動装置は、プランジャー１４５を往復運動させるための装置であり、例えば、ステッピングモーターを含む。ステッピングモーターを含む駆動装置は、シリンジポンプ１４２の送液量や送液速度を管理できるため、検出チップ１０の残液量を管理する観点から好ましい。シリンジポンプ１４２の移動装置は、例えば、シリンジポンプ１４２を、シリンジ１４４の軸方向（例えば垂直方向）と、軸方向を横断する方向（例えば水平方向）との二方向に自在に動かす。シリンジポンプ１４２の移動装置は、例えば、ロボットアーム、２軸ステージまたは上下動自在なターンテーブルによって構成される。
　送液部１４０は、液体チップ１４１より各種液体を吸引し、検出チップ１０の流路４１内に供給する。このとき、プランジャー１４５を動かすことで、検出チップ１０中の流路４１内を液体が往復し、流路４１内の液体が撹拌される。これにより、液体の濃度分布の均一化や、流路４１内における反応（例えば抗原抗体反応）の促進などを実現することができる。このような操作を行う観点から、検出チップ１０の注入口は多層フィルムで保護されており、かつシリンジ１４４がこの多層フィルムを貫通した時に注入口を密閉できるように、検出チップ１０およびシリンジ１４４が構成されていることが好ましい。
　流路４１内の液体は、再びシリンジポンプ１４２で吸引され、液体チップ１４１などに排出される。これらの動作の繰り返しにより、各種液体による反応、洗浄などを実施し、流路４１内の反応場に、蛍光物質で標識された被検出物質を配置することができる。
　搬送部１５０は、検出チップ１０を測定位置または送液位置に搬送し、固定する。ここで「測定位置」とは、励起光照射部１１０が検出チップ１０に励起光αを照射し、それに伴い発生する反射光β、蛍光γまたはプラズモン散乱光δを反射光検出部１２０または蛍光検出部１３０が検出する位置である。また、「送液位置」とは、送液部１４０が検出チップ１０の流路４１内に液体を供給するか、または検出チップ１０の流路４１内の液体を除去する位置である。搬送部１５０は、搬送ステージ１５１およびチップホルダー１５２を含む。チップホルダー１５２は、搬送ステージ１５１に固定されており、検出チップ１０を着脱可能に保持する。チップホルダー１５２の形状は、検出チップ１０を保持することが可能であり、かつ励起光α、反射光β、蛍光γおよびプラズモン散乱光δの光路を妨げない形状である。たとえば、チップホルダー１５２には、励起光α、反射光β、蛍光γおよびプラズモン散乱光δが通過するための開口が設けられている。搬送ステージ１５１は、チップホルダー１５２を一方向およびその逆方向に移動させる。搬送ステージ１５１も、励起光α、反射光β、蛍光γおよびプラズモン散乱光δの光路を妨げない形状である。搬送ステージ１５１は、例えば、ステッピングモーターなどで駆動される。
　制御部１６０は、角度調整機構１１２、光源制御部１１３、角度調整機構１２２、センサー制御部１２３、位置切替機構１３２、センサー制御部１３３、送液ポンプ駆動機構１４３および搬送ステージ１５１を制御する。制御部１６０は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
　（ＳＰＦＳ装置の検出動作）
　次に、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００の検出動作（本発明の実施の形態に係る検出方法）について説明する。ＳＰＦＳ装置１００は、例えば次に説明する２つの検出動作のいずれかに従って動作することができる。以下、それぞれの検出動作について図を用いて説明する。図２は、ＳＰＦＳ装置１００の第１の動作手順を示すフローチャートである。
　まず、検出の準備をする（工程Ｓ１０）。具体的には、ＳＰＦＳ装置１００のチップホルダー１５２に検出チップ１０を設置する。
　次いで、捕捉体の保護層を除去するとともに、流路４１の内面をブロッキング処理する（工程Ｓ２０）。具体的には、制御部１６０は、搬送ステージ１５１を操作して、検出チップ１０を送液位置に移動させる。この後、制御部１６０は、送液ポンプ駆動機構１４３を操作して、液体チップ１４１のブロッキング液を、検出チップ１０の流路４１内に提供する。流路４１内では、ブロッキング液によって捕捉体の保護層が除去されるとともに、ブロッキング液が流路４１内を移動し、流路４１の内面をブロッキング処理する。このとき、流路４１内におけるブロッキング剤の濃度分布をより均一化してブロッキング処理を促進させるために、ブロッキング液を流路４１内において移動させる。ブロッキング液を移動させる方法は、特に限定されない。ブロッキング液を移動させる方法の例には、シリンジで吸引と吐出とを交互に繰り返すことや、超音波やマイクロウェーブなどの照射などが含まれる。また、ブロッキング液の流量（移動量）は、特に限定されない。ブロッキング処理（工程Ｓ２０）と１次反応（工程Ｓ３０）とを別々に行う場合、流路４１内の液体（ブロッキング液）の流量は、１６００μＬ／分以上かつ３３００μＬ／分以下であることが好ましい。これにより、流路４１内におけるブロッキング剤の濃度分布を均一化してブロッキング処理を促進し、ブロッキング処理に要する時間を短縮化することができる。さらに、ブロッキング液におけるブロッキング剤の濃度は、５～８質量％程度であることが好ましい。ブロッキング処理を促進する観点からは、ブロッキング剤の濃度は、高いほうが好ましいが、ブロッキング剤の濃度が高すぎるとブロッキング液の粘度が高くなり、ブロッキング液の移動が阻害される。一方、ブロッキング剤の濃度が低すぎると、ブロッキング処理が適切に行われない。この後、制御部１６０は、送液ポンプ駆動機構１４３を操作して、流路４１内のブロッキング液を除去する。
　ブロッキング液に含まれるブロッキング剤の種類は、流路４１の内面への被検出物質の非特異的結合を抑制することができれば特に限定されない。ブロッキング剤の種類の例には、アルブミンやカゼイン、スキムミルク、ゼラチン、ポリエチレングリコールなどの高分子化合物；リン脂質やエチレンジアミン、アセトニトリルなどの低分子化合物などが含まれる。これらのブロッキング剤は、単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
　ブロッキング処理（工程Ｓ２０）の次に、被検出物質を捕捉体に捕捉させる（１次反応；工程Ｓ３０）。ここで、「ブロッキング処理の次に」とは、ブロッキング処理の後に他の工程（例えば洗浄工程や長期間に亘る保管工程など）を含まないことを意味する。具体的には、制御部１６０は、送液ポンプ駆動機構１４３を操作して、液体チップ１４１内の検体を流路４１内に提供する。流路４１内では、抗原抗体反応によって、金属膜３０上の捕捉体に被検出物質が捕捉される。この後、制御部１６０は、送液ポンプ駆動機構１４３を操作して、流路４１内の検体を除去し、少なくとも１回は洗浄液（例えば、リン酸緩衝液）を用いて、流路４１内を洗浄する。
　次いで、光学ブランク値を測定する（工程Ｓ４０）。ここで「光学ブランク値」とは、後述する蛍光γの測定（工程Ｓ６０）において検出チップ１０の上方に放出される背景光の光量を意味する。具体的には、制御部１６０は、搬送ステージ１５１を操作して、検出チップ１０を検出位置に移動させる。この後、制御部１６０は、励起光照射部１１０および蛍光検出部１３０を操作して、捕捉体が固定されている領域に対応した金属膜３０の裏面に、表面プラズモン共鳴が発生するように入射面２１を介して励起光αを照射するとともに、受光センサー１３７の出力値（光学ブランク値）を記録する。このとき、制御部１６０は、角度調整機構１１２を操作して、励起光αの入射角を増強角に設定する。また、制御部１６０は、位置切替機構１３２を制御して、光学フィルター１３５を受光ユニット１３１の光路内に配置する。測定された光学ブランク値は、制御部１６０に記録される。
　次いで、金属膜３０上に捕捉されている被検出物質を蛍光物質で標識する（２次反応；工程Ｓ５０）。具体的には、制御部１６０は、搬送ステージ１５１を操作して、検出チップ１０を送液位置に移動させる。この後、制御部１６０は、送液ポンプ駆動機構１４３を操作して、蛍光物質で標識された捕捉体を含む液体（標識液）を検出チップ１０の流路４１内に提供する。流路４１内では、抗原抗体反応によって、金属膜３０上に捕捉されている被検出物質が蛍光物質で標識される。この後、制御部１６０は、送液ポンプ駆動機構１４３を操作して、流路４１内の標識液を除去し、流路４１内を洗浄液で洗浄する。
　次いで、金属膜３０の流路４１（収容部）側の面の近傍から放出される蛍光γの光量を測定して、検体中の被検出物質の存在または量を示すシグナル値を得る（工程Ｓ６０）。具体的には、制御部１６０は、搬送ステージ１５１を操作して、検出チップ１０を検出位置に移動させる。この後、制御部１６０は、励起光照射部１１０および蛍光検出部１３０を操作して、被検出物質および捕捉体が結合し、かつ金属膜３０上に検体が存在しない状態で、プリズム２０側から捕捉体が固定されている領域に対応した金属膜３０の裏面に入射面２１を介して励起光αを照射するとともに、受光センサー１３７の出力値を記録する。このとき、制御部１６０は、角度調整機構１１２を操作して、励起光αの入射角を増強角に設定する。また、制御部１６０は、位置切替機構１３２を制御して、光学フィルター１３５を受光ユニット１３１の光路内に配置する。制御部１６０は、検出値から光学ブランク値を引き、検体中の被検出物質の存在または量を示すシグナル値を算出する。シグナル値は、必要に応じて、被検出物質の量や濃度などに換算される。以上の手順により、検体中の被検出物質の存在または量を検出することができる。
　次に、ＳＰＦＳ装置１００の第２の検出動作について説明する。図３は、ＳＰＦＳ装置１００の第２の動作手順を示すフローチャートである。
　まず、前述した動作手順と同様に、ＳＰＦＳ装置１００のチップホルダー１５２に検出チップ１０を設置して検出の準備をする（工程Ｓ１０’）。
　次いで、捕捉体の保護層を除去するとともに、流路４１内のブロッキング処理と一次反応とを同時に行う（工程Ｓ２０’）。具体的には、制御部１６０は、搬送ステージ１５１を操作して、検出チップ１０を送液位置に移動させる。この後、制御部１６０は、送液ポンプ駆動機構１４３を操作して、液体チップ１４１のブロッキング液と、被検出物質を含む検体との混合液を検出チップ１０の流路４１内に提供する。流路４１内では、ブロッキング液および検体の混合液が流路４１内を移動し、捕捉体の保護層が除去されるとともに、流路４１内の内面にブロッキング処理を施す。また、抗原抗体反応によって、金属膜３０上の捕捉体に被検出物質が捕捉される。本動作手順でも、ブロッキング処理を促進させるために、第１の動作手順と同様の方法で流路４１内の液体（ブロッキング液および検体の混合液）を移動させる。また、流路４１内の液体（ブロッキング液および検体の混合液）の流量は、特に限定されず、第１の動作手順での流量と同様である。一方、流路４１内の液体（ブロッキング液および検体の混合液）におけるブロッキング剤の濃度は、例えば、２～３質量％程度であることが好ましい。ブロッキング処理と一次反応とを同時に行う場合、流路４１内を移動する液体は、ブロッキング剤の他にも被検出物質などの各種タンパク質を含む。そのため、ブロッキング処理と一次反応とを別々に行う場合（ブロッキング剤の濃度は、５～８質量％）と比較して、液体の粘度が高くなり、液体を適切に移動させることが難しくなるおそれがあるため、流路４１内の液体に含まれるブロッキング剤の濃度を下げることが好ましい。この後、制御部１６０は、送液ポンプ駆動機構１４３を操作して、流路４１内の液体を除去し、少なくとも１回は洗浄液（例えば、リン酸緩衝液）を用いて、流路４１内を洗浄する。
　次いで、前述した動作手順と同様に、光学ブランク値を測定し（工程Ｓ３０’）、２次反応を行った後に（工程Ｓ４０’）、検体中の被検出物質の存在または量を示すシグナル値を得る（工程Ｓ５０’）。制御部１６０は、検出値から光学ブランク値を引き、検体中の被検出物質の存在または量を示すシグナル値を算出し、必要に応じて、被検出物質の量や濃度などに換算する。以上の手順により、検体中の被検出物質の存在または量を検出することができる。
　（効果）
　本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００では、ブロッキング液を流路４１内において移動させることで、ブロッキング剤の濃度分布を均一化することができる。この結果、ブロッキング処理が促進され、短時間でブロッキング処理を施すことができる。また、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００では、ブロッキング液を移動させるため、ブロッキング液の粘度にかかわらず、適切に、かつ短時間でブロッキング処理を施すことができる。
　従来、ブロッキング処理を促進させる観点から、ブロッキング液のｐＨの調整などが行われてきた。しかしながら、ブロッキング液のｐＨと、検体のｐＨとが異なる場合、検体中の被検出物質およびブロッキング剤が変性するおそれがあった。このため、ブロッキング処理の後に、流路４１内からブロッキング液を除去するために、流路４１内を洗浄する必要があった。しかしながら、前述したとおり、ブロッキング剤が洗浄液により剥がれ落ちることによって、ブロッキング処理の効果が低下するおそれがあるため、従来の検出方法では、被検出物質を高精度で検出することができないおそれがあった。また、洗浄工程などの他の工程を行うことにより被検出物質の検出までの工程が増え、検出に要する時間が長くなっていた。
　これに対して、本実施の形態では、ブロッキング液を移動させることにより、ブロッキング処理の促進を図っている。このため、ブロッキング液のｐＨを調整する必要がない。また、本実施の形態では、ブロッキング処理と一次反応との間に流路４１内の洗浄などの他の工程を含む必要がないため、他の工程によりブロッキング剤が剥がれ落ちるおそれがない。したがって、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００は、ブロッキング処理の効果を低下させることなく、被検出物質の存在または量を短時間で、かつ高精度で検出することができる。
　なお、上記実施の形態では、プリズム２０と金属膜３０の界面において励起光を全反射させることで、励起光と表面プラズモンとを結合させる検出方法および検出装置について説明した。しかし、本発明に係る検出方法および検出装置は、回折格子を利用して励起光と表面プラズモンとを結合させてもよい。この場合、ＳＰＦＳ装置１００では、金属膜３０は、プリズム２０上に配置されていなくてもよく、代わりに回折格子を含んでいてもよい。
　また、上記実施の形態では、ＳＰＦＳを利用する検出方法および検出装置について説明したが、本発明に係る検出方法および検出装置は、ＳＰＦＳを利用する検出方法および検出装置に限定されない。たとえば、本発明に係る検出方法および検出装置は、ＳＰＲ法を利用する検出方法および検出装置であってもよい。この場合、ＳＰＦＳ装置１００は、蛍光γの光量を測定せずに、シグナル値として反射光βの光量を測定することで被検出物質の存在または量を検出する。したがって、光学ブランク値の測定（工程Ｓ４０、工程Ｓ３０’）および２次反応（工程Ｓ５０、工程Ｓ４０’）は不要である。
　以下、本発明について実施例を参照して詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例により限定されない。
　［実施例１］
　実施例１では、ブロッキング処理においてブロッキング液を移動させることの効果を調べた。
　１．ブロッキング処理の次に一次反応を行う場合
　（１）検出チップの準備
　金属膜上の反応場（捕捉体として抗トロポニン抗体が固定されている領域）が保護層で保護されている検出チップを準備した。反応場上における流路の断面積は、０．４６ｍｍ２である。準備した検出チップをＳＰＦＳ装置のチップホルダーに設置した。
　（２）ブロッキング液の調製
　ブロッキング剤（ＢＳＡ；牛血清アルブミン）を終濃度が５質量％となるように酢酸緩衝液に加えて、ブロッキング液を調製した。
　（３）ブロッキング処理
　送液部のシリンジポンプを用いて、ブロッキング液（１００μＬ）を３５秒間、所定の流量（１～３３００μＬ／分）で、検出チップの流路内において往復送液を行って、ブロッキング処理をした。次いで、送液部のシリンジポンプを用いて、流路内のブロッキング液を除去した。
　（４）一次反応
　ブロッキング処理の次に、送液部のシリンジポンプを用いて、リン酸緩衝液とトロポニン（被検出物質）を含む血漿（検体）とを体積比が２対１になるように混合した血漿の希釈液（１００μＬ）を４分、３３００μＬ／分の流量で、流路内において往復送液を行って、一次反応を行った。
　（５）ブロッキング処理の効果の確認
　一次反応の後、波長６３５ｎｍの光をプリズム側から金属膜に照射した。次いで、金属膜からの反射光を検出し、反射率を測定した。あらかじめ作成しておいた反射率およびブロッキング率の検量線と、測定した反射率とに基づいてブロッキング率を算出した。検量線を作成する際、ブロッキング処理の時間を長くするか、またはブロッキング剤の濃度を高くしていき、反射率の変化が見られなくなったときのブロッキング率を１００％とした。
　２．ブロッキング処理および一次反応を同時に行う場合
　（１）検出チップの準備
　上記１.（１）と同様に、準備した検出チップをＳＰＦＳ装置のチップホルダーに設置した。
　（２）ブロッキング液および検体の混合液の調製
　ブロッキング剤（ＢＳＡ）を酢酸緩衝液に加えて、ブロッキング液を調製した。調製したブロッキング液および血漿を体積比が２対１となるように混合して、ブロッキング液および血漿の混合液を調製した。混合液中のブロッキング剤の終濃度は２質量％である。
　（３）ブロッキング処理および一次反応
　送液部のシリンジポンプを用いて、ブロッキング液および血漿の混合液（１００μＬ）を１分２８秒間、所定の流量（１～３３００μＬ／分）で、流路内において往復送液を行って、ブロッキング処理および一次反応を行った。次いで、送液部のシリンジポンプを用いて、流路内の混合液を除去した。
　（４）ブロッキング処理の効果の確認
　流路の内面をブロッキング処理した後、上記１.（５）と同様の手順でブロッキング率を算出した。
　３．結果
　図４Ａは、ブロッキング処理の次に一次反応を行った場合の、ブロッキング液の流量とブロッキング率との関係を示すグラフである。図４Ｂは、ブロッキング処理と一次反応とを同時に行った場合の、混合液の流量とブロッキング率との関係を示すグラフである。図４Ａおよび図４Ｂにおいて、横軸は、流路内の液体（ブロッキング液または混合液）の流量（μＬ／分）を示し、縦軸は、ブロッキング率（％）を示す。
　図４Ａおよび図４Ｂに示されるように、ブロッキング処理の次に一次反応を行った場合、およびブロッキング処理と一次反応とを同時に行った場合のいずれの場合においても、流路内の液体（ブロッキング液または混合液）の流量が大きいほど、ブロッキング率が高くなった。特に、いずれの場合も、流路内の液体の流量が１６００μＬ／分以上のとき、ブロッキング率が９０％以上となった。この結果から、流路内の液体を移動させることによって、流路内のブロッキング処理を短時間で行えることがわかる。また、流路内の液体の流量を１６００μＬ／分以上かつ３３００μＬ／分以下とすることで、ブロッキング率を９０％以上にできることもわかる。
　［実施例２］
　実施例２では、ブロッキング処理の次に一次反応を行う場合における、ブロッキング液の移動の有無およびブロッキング剤の濃度と、ブロッキング処理に要する時間との関係を調べた。
　（１）ブロッキング液の調製
　ブロッキング剤（ＢＳＡ）を終濃度が０質量％、１質量％、２質量％、５質量％または８質量％となるように酢酸緩衝液に加えて、５種類のブロッキング液を調製した。
　（２）検出チップの準備
　実施例１と同様に、金属膜上の反応場（捕捉体として抗トロポニン抗体が固定されている領域）が保護層で保護されている検出チップを複数作製した。反応場上における流路の断面積は、０．４６ｍｍ２である。一部の検出チップについては、作製直後にブロッキング剤を１質量％含むブロッキング液（１００μＬ）を流路内に提供し、検出チップを所定の時間静置して、ブロッキング処理をした。その後、流路内からブロッキング液を除去し、常温常圧下で１日以上保存した。
　（３）ブロッキング処理
　作製直後にブロッキング処理をしていない検出チップをＳＰＦＳ装置のチップホルダーに設置した。送液部のシリンジポンプを用いて、ブロッキング剤を０質量％、２質量％、５質量％または８質量％含むブロッキング液（１００μＬ）を所定の時間、所定の流量で、流路内において往復送液（撹拌）を行って、ブロッキング処理をした。次いで、送液部のシリンジポンプを用いて、流路内のブロッキング液を除去した。
　（４）一次反応
　ブロッキング処理の次に、リン酸緩衝液とトロポニン（被検出物質）を含む血漿（検体）を体積比が２対１になるように混合した血漿の希釈液（１００μＬ）を４分間、３３００μＬ／分の流量で、流路内において往復送液を行って一次反応を行った。また、作製直後にブロッキング処理をした検出チップについても、検出チップをＳＰＦＳ装置のチップホルダーにそれぞれ設置した後、同様の手順で一次反応を行った。
　（５）ブロッキング時間の決定
　一次反応の後、実施例１と同様の手順で流路の内面のブロッキング率を算出した。各ブロッキング処理の条件ごとに、ブロッキング率が９０％以上となるときの処理時間の下限値（以下、「ブロッキング時間」ともいう）を決定した。
　ブロッキング処理の条件と、ブロッキング時間との関係を表１に示す。条件Ａ、Ｃ～Ｅでは、一次反応の直前にブロッキング処理を行っている。条件Ｂは、検出チップの作製直後にブロッキング処理を行っている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示されるように、ブロッキング液を移動させなかった場合（条件Ｂ）のブロッキング時間は、５時間であった。一方、ブロッキング液を移動させた場合（条件Ｃ～Ｅ）のブロッキング時間は、ブロッキング液を移動させなかった場合（条件Ｂ）と比較して顕著に短くなっていた。この結果から、ブロッキング液を移動させることによって、ブロッキング時間を大幅に短縮できることがわかる。また、ブロッキング剤の濃度が高いほど、ブロッキング時間を短縮できることもわかる。
　［実施例３］
　実施例３では、ブロッキング処理の次に一次反応を行う場合における、ブロッキング液の移動の有無およびブロッキング剤の濃度と、シグナル値との関係を調べた。比較例として、ブロッキング処理と一次反応との間に他の工程を含む場合についても調べた。
　（１）検出チップの準備
　作製直後のブロッキング処理において、３０分間静置したこと以外は、実施例２と同様の手順により、作製直後にブロッキング処理をした検出チップと、作製直後にブロッキング処理をしていない検出チップを準備した。これらの検出チップを、常温常圧下で１日以上保存した。
　（２）ブロッキング処理
　作製直後にブロッキング処理をしていない検出チップをＳＰＦＳ装置のチップホルダーに設置した。実施例２と同様の手順で、送液部のシリンジポンプを用いて、ブロッキング剤を０質量％、２質量％、５質量％または８質量％含むブロッキング液（１００μＬ）を１５秒間、３３００μＬ／分の流量で流路内において往復送液を行った。次いで、送液部のシリンジポンプを用いて、流路内のブロッキング液を除去した。
　ブロッキング処理の条件を表２に示す。条件Ｆ、Ｈ～Ｊでは、一次反応の直前にブロッキング処理を行っている。条件Ｇは、検出チップの作製直後にブロッキング処理を行っている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　（３）一次反応
　ブロッキング処理の次に、送液部のシリンジポンプを用いて、リン酸緩衝液および血漿（検体）を体積比が２対１になるように混合した血漿の希釈液（１００μＬ）を、４分間、３３００μＬ／分の流量で、流路内において往復送液を行って、一次反応を行った。次いで、送液部のシリンジポンプを用いて、流路内の希釈液を除去した。また、作製直後にブロッキング処理をした検出チップについても、検出チップをＳＰＦＳ装置のチップホルダーにそれぞれ設置した後、同様の手順で一次反応を行った。
　本実験では、検体として、被検出物質（トロポニン）を含む血漿、またはトロポニンを含まない血漿のそれぞれについて送液を行った。以下、被検出物質を含む検体を用いた場合の一次反応を「ポジティブ反応」、被検出物質を含まない検体を用いた場合の一次反応を「ネガティブ反応」ともいう。
　（４）光学ブランク値の測定
　一次反応の後、流路内にリン酸緩衝液を導入して、流路内を洗浄した。その後、波長６３５ｎｍの光をプリズム側から金属膜に照射した。金属膜の流路側の面の近傍から放出される光を検出し、光学ブランク値を得た。
　（５）二次反応
　その後、送液部のシリンジポンプを用いて、蛍光色素で標識された抗トロポニン抗体を含む溶液（１００μＬ）を、１分間、３３００μＬ／分の流量で、流路内において往復送液を行って、二次反応を行った。なお、ポジティブ反応およびネガティブ反応いずれを行った場合も、二次反応を行った。次いで、送液部のシリンジポンプを用いて、流路内の溶液を除去した。
　（６）被検出物質の量を示すシグナル値の測定
　光学ブランク値の測定と同様に、流路内を洗浄した後に、金属膜の流路側の面の近傍から放出される蛍光を検出した。検出値から光学ブランク値を引いて、被検出物質の量を示すシグナル値を得た。測定結果を図５Ａに示す。
　図５Ａは、条件Ｆ～Ｊにおける被検出物質の量を示すシグナル値を示すグラフである。図５Ａにおいて、黒色の棒は、ネガティブ反応を行った場合の結果を示し、白色の棒は、ポジティブ反応を行った場合の結果を示している。縦軸は、条件Ｇにおけるシグナル値を基準（１００）としたときのシグナル値（相対値）を示している。ポジティブ反応を行った場合のシグナル値は、主に、被検出物質を標識している蛍光色素から放出される蛍光に由来する。一方、ネガティブ反応では、蛍光色素が特異的に結合しうる被検出物質が存在しないため、シグナル値は、流路内に非特異的に結合した蛍光色素やその他の自家蛍光に由来する。すなわち、ポジティブ反応を行った場合のシグナル値は、被検出物質の量を示し、ネガティブ反応を行った場合のシグナル値は、ノイズの量を示す。
　図５Ａにおいて、条件Ｇ～Ｊのネガティブ反応の結果を比較してみると、作製直後にブロッキング処理を行った検出チップ（条件Ｇ）のシグナル値（ノイズ）は、一次反応の直前にブロッキング処理を行った検出チップ（条件Ｈ～Ｊ）のシグナル値（ノイズ）よりも高かった。この結果から、ブロッキング処理を行った後に検出チップを長期間保管することによって、ブロッキング処理の効果が低下してしまうことがわかる。このことから、ＳＮ比を向上させる観点からは、ブロッキング処理と一次反応との間に他の工程を含まず、一次反応の直前にブロッキング処理を行うことが好ましいことがわかる。
　また、図５Ａにおいて、条件Ｆおよび条件Ｈ～Ｊのネガティブ反応の結果を比較してみると、ブロッキング剤の濃度が高いほど、シグナル値（ノイズ）が低下していた。特に、条件Ｆおよび条件Ｊのネガティブ反応の結果を比較してみると、シグナル値（ノイズ）は、３０％程度低減していた。また、条件Ｇおよび条件Ｊのネガティブ反応の結果を比較してみると、ブロッキング液を移動させることで、シグナル値（ノイズ）が２０％程度低減していた。これらの結果から、ブロッキング液を移動させ、かつブロッキング剤の濃度が高いほど、ブロッキング処理の効果は高くなり、被検出物質の流路の内面への非特異的結合を抑制できることがわかる。
　一方、条件Ｆ～Ｊのポジティブ反応の結果を比較してみると、シグナル値は、ブロッキング剤の濃度が高くなっても低下していなかった。このことから、ブロッキング処理の次に一次反応を行う場合、ブロッキング剤の濃度は、捕捉体に捕捉される被検出物質の量に影響を与えないことがわかる。
　以上の結果から、ブロッキング液を移動させるとともに、ブロッキング剤の濃度を高くすることによって、被検出物質の検出に要する時間（ブロッキング処理に要する時間を含む）を短縮化しつつ、ＳＮ比を向上させて被検出物質の量を高精度で検出できることがわかる。
　［実施例４］
　実施例４では、ブロッキング処理と一次反応とを同時に行う場合におけるブロッキング剤の濃度と、シグナル値との関係を調べた。
　（１）検出チップの準備
　実施例１と同様に、金属膜上の反応場（捕捉体として抗トロポニン抗体が固定されている領域）が保護層で保護されている検出チップをＳＰＦＳ装置のチップホルダーに設置した。なお、反応場上における流路の断面積は、０．４６ｍｍ２である。
　（２）ブロッキング液および検体の混合液の調製
　ブロッキング剤（ＢＳＡ）を酢酸緩衝液に加えて、ブロッキング液を調製した。調製したブロッキング液および血漿（検体）を体積比が２対１となるように混合して、６種類の濃度のブロッキング液および血漿の混合液を調製した。混合液中のブロッキング剤の終濃度は、それぞれ０質量％、１質量％、２質量％、３質量％、４質量％または５質量％である。このとき、検体として被検出物質（トロポニン）を含む血漿、またはトロポニンを含まない血漿を用いて、１２種類の混合液をそれぞれ調製した。
　（３）ブロッキング処理および一次反応
　送液部のシリンジポンプを用いて、混合液（１００μＬ）を、４分間、３３００μＬ／分の流量で、流路内において往復送液を行った。次いで、送液部のシリンジポンプを用いて、流路内の混合液を除去した。
　（４）被検出物質の量を示すシグナル値の測定
　実施例２と同様の手順で光学ブランク値の測定および二次反応を行い、被検出物質の量を示すシグナル値を得た。測定結果を図５Ｂに示す。
　図５Ｂにおいても、黒色の棒は、ネガティブ反応を行った場合の結果を示し、白色の棒は、ポジティブ反応を行った場合の結果を示している。横軸は、ブロッキング剤の濃度（質量％）を示している。縦軸は、ブロッキング剤の濃度が０質量％のとき（ブロッキング剤を含まないとき）のシグナルを基準（１００）としたときのシグナル値（相対値）を示している。
　ネガティブ反応の結果を比較してみると、ブロッキング剤の濃度が０質量％のときのシグナル値（ノイズ）が最も高く、ブロッキング剤の濃度が高いほど、シグナル値（ノイズ）が低下する傾向にあった。この結果から、ブロッキング剤の濃度が高いほど、ブロッキング処理の効果が高くなり、流路内の非特異的結合を抑制できることがわかる。
　一方、ポジティブ反応の結果を比較してみると、ブロッキング剤の濃度が３質量％より高くなると、ブロッキング剤の濃度が高いほど、シグナル値が低下していた。この結果は、ブロッキング剤の濃度が３質量％より高くなると、捕捉体と結合した被検出物質の量が減少することを示唆している。これは、ブロッキング剤の濃度が３質量％より高くなると、混合液の粘度が増大し、被検出物質の移動が抑制されるため、一次反応が阻害される傾向にあると考えられる。
　以上の結果から、ブロッキング処理と一次反応とを同時に行う場合は、一次反応が阻害されることを防止するために、混合液中のブロッキング剤の濃度を３質量％以下にすることが好ましいことがわかる。
　本出願は、２０１４年８月２５日出願の特願２０１４－１７０４３８に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。
　本発明に係る反応方法を用いた被検出物質の検出方法および検出装置は、被検出物質を高い信頼性で検出することができるため、例えば疾患の検査などに有用である。
　１０　検出チップ
　２０　プリズム
　２１　入射面
　２２　成膜面
　２３　出射面
　３０　金属膜
　４０　流路蓋
　４１　流路
　１００　ＳＰＦＳ装置
　１１０　励起光照射部
　１１１　光源ユニット
　１１２　角度調整機構
　１１３　光源制御部
　１２０　反射光検出部
　１２１　受光センサー
　１２２　角度調整機構
　１２３　センサー制御部
　１３０　蛍光検出部
　１３１　受光ユニット
　１３２　位置切替機構
　１３３　センサー制御部
　１３４　第１レンズ
　１３５　光学フィルター
　１３６　第２レンズ
　１３７　受光センサー
　１４０　送液部
　１４１　液体チップ
　１４２　シリンジポンプ
　１４３　送液ポンプ駆動機構
　１４４　シリンジ
　１４５　プランジャー
　１５０　搬送部
　１５１　搬送ステージ
　１５２　チップホルダー
　１６０　制御部
　α　励起光
　β　反射光
　γ　蛍光
　δ　プラズモン散乱光

Claims (12)

  1. 　液体を収容するための収容部と、前記収容部に露出し、かつ捕捉体が固定されている反応場とを含む収容器において、前記捕捉体と被反応物質とを結合させる反応方法であって、
    　前記収容部内においてブロッキング剤を含むブロッキング液を移動させて、前記収容部内をブロッキング処理する工程と、
    　前記収容部内に前記被反応物質を含む液体を提供して、前記被反応物質を前記捕捉体に捕捉させる工程と、
    　を有し、
    　前記被反応物質を前記捕捉体に捕捉させる工程は、前記ブロッキング処理をする工程の次に行われるか、または前記ブロッキング処理をする工程と同時に行われる、
    　反応方法。
  2. 　前記ブロッキング処理をする工程における、前記収容部内の液体の流量は、１６００μＬ／分以上かつ３３００μＬ／分以下であり、
    　前記反応場上の液体の流れ方向に対して垂直な断面における、前記収容部の断面積は、０．０１ｍｍ２以上かつ１００ｍｍ２以下である、
    　請求項１に記載の反応方法。
  3. 　前記被反応物質を前記捕捉体に捕捉させる工程は、前記ブロッキング処理をする工程の次に行われ、
    　前記ブロッキング液における前記ブロッキング剤の濃度は、５質量％以上かつ８質量％以下である、
    　請求項１または請求項２に記載の反応方法。
  4. 　前記被反応物質を前記捕捉体に捕捉させる工程は、前記ブロッキング処理をする工程と同時に行われ、
    　前記収容部内の前記ブロッキング液および前記被反応物質を含む液体の混合液における前記ブロッキング剤の濃度は、２質量％以上かつ３質量％以下である、
    　請求項１または請求項２に記載の反応方法。
  5. 　液体を収容するための収容部と、前記収容部に露出し、かつ捕捉体が固定されている反応場を含む金属膜とを有する検出チップを用いて、表面プラズモン共鳴を利用することにより、検体中の被検出物質の存在または量を検出するための検出方法であって、
    　前記収容部内においてブロッキング剤を含むブロッキング液を移動させて、前記収容部内をブロッキング処理する工程と、
    　前記収容部内に前記検体を提供して、前記被検出物質を前記捕捉体に捕捉させる工程と、
    　前記被検出物質と前記捕捉体とが結合している状態で、前記金属膜において表面プラズモン共鳴が発生するように前記金属膜に光を照射して、前記金属膜の前記収容部側の面の近傍から放出される蛍光の光量、または前記金属膜で反射された光の光量を検出する工程と、
    　を有し、
    　前記被検出物質を前記捕捉体に捕捉させる工程は、前記ブロッキング処理をする工程の次に行われるか、または前記ブロッキング処理をする工程と同時に行われる、
    　検出方法。
  6. 　前記ブロッキング処理をする工程における、前記収容部内の液体の流量は、１６００μＬ／分以上かつ３３００μＬ／分以下であり、
    　前記反応場上の液体の流れ方向に対して垂直な断面における、前記収容部の断面積は、０．０１ｍｍ２以上かつ１００ｍｍ２以下である、
    　請求項５に記載の検出方法。
  7. 　前記被検出物質を前記捕捉体に捕捉させる工程は、前記ブロッキング処理をする工程の次に行われ、
    　前記ブロッキング液における前記ブロッキング剤の濃度は、５質量％以上かつ８質量％以下である、
    　請求項５または請求項６に記載の検出方法。
  8. 　前記被検出物質を前記捕捉体に捕捉させる工程は、前記ブロッキング処理をする工程と同時に行われ、
    　前記収容部内の前記ブロッキング液および前記検体の混合液における前記ブロッキング剤の濃度は、２質量％以上かつ３質量％以下である、
    　請求項５または請求項６に記載の検出方法。
  9. 　液体を収容するための収容部と、前記収容部に露出し、かつ捕捉体が固定されている反応場を含む金属膜とを有する検出チップを用いて、表面プラズモン共鳴を利用することにより、検体中の被検出物質の存在または量を検出するための検出装置であって、
    　前記検出チップを保持するためのホルダーと、
    　前記ホルダーに前記検出チップが保持された状態で、前記収容部内に液体を提供する送液部と、
    　前記金属膜において表面プラズモン共鳴が発生するように、前記ホルダーに保持された前記検出チップの前記金属膜に光を照射する光照射部と、
    　前記光照射部が前記金属膜に光を照射したときに、前記金属膜の前記収容部側の面の近傍から放出される蛍光の光量、または前記金属膜で反射された光の光量を検出する光検出部と、
    　を有し、
    　前記送液部は、
    　前記収容部内にブロッキング剤を含むブロッキング液を提供するとともに、前記収容部内において前記ブロッキング液を移動させて、前記収容部内をブロッキング処理する工程と、
    　前記検体を前記収容部内に提供して前記被検出物質を前記捕捉体に捕捉させる工程と、
    　を行い、
    　前記送液部は、前記被検出物質を前記捕捉体に捕捉させる工程を、前記ブロッキング処理をする工程の次、または前記ブロッキング処理をする工程と同時に行う、
    　検出装置。
  10. 　前記送液部が移動させる前記収容部内の液体の流量は、１６００μＬ／分以上かつ３３００μＬ／分以下であり、
    　前記反応場上の液体の流れ方向に対して垂直な断面における前記収容部の断面積は、０．０１ｍｍ２以上かつ１００ｍｍ２以下である、
    　請求項９に記載の検出装置。
  11. 　前記送液部は、前記ブロッキング処理をする工程の次に、前記被検出物質を前記捕捉体に捕捉させる工程を行い、
    　前記ブロッキング液における前記ブロッキング剤の濃度は、５質量％以上かつ８質量％以下である、
    　請求項９または請求項１０に記載の検出装置。
  12. 　前記送液部は、前記ブロッキング処理をする工程と同時に、前記被検出物質を前記捕捉体に捕捉させる工程を行い、
    　前記収容部内の前記ブロッキング液および前記検体の混合液における前記ブロッキング剤の濃度は、２質量％以上かつ３質量％以下である、
    　請求項９または請求項１０に記載の検出装置。
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