KR20220122762A - 가용성 섬유아세포 성장 인자 수용체 3(sfgfr3) 폴리펩티드 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 가용성 섬유아세포 성장 인자 수용체3(sFGFR3) 폴리펩타이드를 특징으로 한다. 본 발명은 또한 골격 성장 지연 장애, 예컨대 연골무형성증을 치료하기 위한 sFGFR3 폴리펩타이드의 사용 방법을 특징으로 한다.
Description
본 발명은 가용성 섬유아세포 성장 인자 수용체 3(sFGFR3) 폴리펩타이드 및 이의 조성물을 특징으로 한다. 본 발명은 또한 골격 성장 지연 장애, 예컨대 연골무형성증의 치료 방법을 특징으로 한다.
섬유아세포 성장 인자 수용체 3(FGFR3)은 패밀리 구성원 간 아미노산 서열이 크게 보존된 섬유아세포 성장 인자(FGFR) 패밀리의 구성원이다. FGFR 패밀리의 구성원은 리간드 결합 친화도 및 조직 분포 둘 다에 의해 분화된다. 전장 FGFR 폴리펩타이드는 세포외 도메인(ECD), 소수성 막통과 도메인, 및 세포질 티로신 키나제 도메인을 함유한다. FGFR 폴리펩타이드의 ECD는 섬유아세포 성장 인자(FGF)와 상호작용하여 하류 신호전달을 매개하며, 이는 궁극적으로 세포 분화에 영향을 미친다. 특히, FGFR3 단백질의 활성화는 성장판에서 연골세포 증식을 억제하고 뼈 연장을 제한함으로써 뼈 발달에서 역할을 담당한다.
FGFR3에서 기능-획득 점 돌연변이는 몇몇 유형의 인간 골격 성장 지연 장애, 예컨대 연골무형성증, 치사성 형성이상 I형(TDI), 치사성 형성이상 II형(TDII), 발달 지연 및 흑색 가시세포증을 갖는 중증 연골무형성증(SADDAN), 연골발육부전, 및 두개골유합 증후군(예컨대, y케 증후군, 크루종 증후군, 및 크루종피부골격 증후군)을 유도하는 것으로 알려져 있다. FGFR3의 기능-손실 점 돌연변이는 또한 골격 성장 지연 장애, 예컨대 굴지증, 큰 신장, 및 청력 소실 증후군(CATSHL)을 유도하는 것으로 알려져 있다. 연골무형성증은 가장 일반적인 형태의 짧은-사지 왜소증이며, 사지의 불균형성 짧음 및 상대적 대두증을 특징으로 한다. 대략 97%의 연골무형성증은 FGFR3을 인코딩하는 유전자의 단일 점 돌연변이에 의해 유도되며, 여기서 글리신 잔기는 FGFR3 아미노산 서열의 위치 380에서 아르기닌 잔기로 치환된다. 리간드 결합 시, 돌연변이는 수용체/리간드 복합체의 제거를 감소시켜 연장된 세포내 신호전달을 일으킨다. 이러한 연장된 FGFR3 신호전달은 연골 성장판의 증식 및 분화를 억제하고, 결과적으로 연골내 뼈 성장을 손상시킨다.
골격 성장 지연 장애, 예컨대 연골무형성증을 치료하기 위해 기능장애 FGFR3을 표적화하는 개선된 치료제에 대한 필요성이 존재한다.
본 발명은 가용성 섬유아세포 성장 인자 수용체 3(sFGFR3) 폴리펩타이드 및 환자(예컨대, 인간, 특히 유아, 어린이, 또는 청소년)에서 골격 성장 지연 장애(예컨대, 연골무형성증)의 치료를 위한 sFGFR3 폴리펩타이드의 용도를 포함하는 이의 용도를 특징으로 한다. 특히, 본 발명의 sFGFR3 폴리펩타이드는, 예컨대, 야생형 FGFR3 폴리펩타이드(예컨대, SEQ ID NO: 5 또는 32의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드)의 아미노산 서열의 아미노산 289 내지 400의 결실을 특징으로 하여, 하기 sFGFR3 폴리펩타이드: 위치 253에서 시스테인 잔기의 세린 잔기로의 아미노산 치환을 포함하는 sFGFR3_Del4(sFGFR3_Del4-C253S; SEQ ID NO: 2) 및 연장된 Ig-유사 C2-유형 도메인 3을 포함하는 sFGFR3_Del4(sFGFR3_Del4-D3; SEQ ID NO: 33) 및 이의 변이체, 예컨대 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 갖는 sFGFR3 폴리펩타이드를 제공한다. 또한, 본 발명의 sFGFR3 폴리펩타이드에는 신호 펩타이드, 예컨대 SEQ ID NO: 18 또는 34의 아미노산 서열을 갖는 sFGFR3 폴리펩타이드가 포함될 수 있다.
본 발명의 제1 양태는 SEQ ID NO: 32의 아미노산 잔기 23 내지 357과 적어도 90% 아미노산 서열 동일성(예컨대, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상(예컨대, 100%)의 서열 동일성)을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함하는 가용성 섬유아세포 성장 인자 수용체 3(sFGFR3) 폴리펩타이드를 특징으로 한다. 특히, 폴리펩타이드에는 신호 펩타이드(예컨대, SEQ ID NO: 32의 아미노산 1 내지 22) 및 FGFR3의 막통과 도메인(예컨대, SEQ ID NO: 32의 아미노산 367 내지 399)이 없으며, (i) 500개 미만의 아미노산 길이(예컨대, 475개, 450개, 425개, 400개, 375개, 또는 350개 미만의 아미노산 길이)이고; (ii) 200개 이하의 연속 아미노산(예컨대, 175개, 150개, 125개, 100개, 75개, 50개, 40개, 30개, 20개, 15개 이하의 연속 아미노산)의 FGFR3의 세포내 도메인이 포함되고/되거나; (iii) FGFR3의 티로신 키나제 도메인이 없다. sFGFR3 폴리펩타이드에는 또한 FGFR3의 세포내 도메인, 예컨대 SEQ ID NO: 32의 아미노산 잔기 423 내지 435 또는 SEQ ID NO: 32의 아미노산 잔기 423 내지 435와 적어도 90%, 92%, 95%, 97%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열이 포함될 수 있다. 특히, 폴리펩타이드에는 SEQ ID NO: 33과 적어도 92%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열이 포함된다(예컨대, 폴리펩타이드에는 SEQ ID NO: 33이 포함되거나 이로 구성된다). sFGFR3 폴리펩타이드에는 또한 신호 펩타이드가 포함될 수 있다(예컨대, 신호 펩타이드는 SEQ ID NO: 6 또는 35의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 6 또는 35와 적어도 92%, 95%, 97%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다). 예를 들어, sFGFR3 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 34와 적어도 92%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다(예컨대, sFGFR3 폴리펩타이드에는 SEQ ID NO: 34가 포함되거나 이로 구성된다). sFGFR3 폴리펩타이드는 또한 이종성 신호 펩타이드를 가질 수 있다(예컨대, 폴리펩타이드에는 SEQ ID NO: 35의 아미노산 서열을 갖는 이종성 신호 펩타이드가 포함된다).
본 발명의 제2 양태는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열과 적어도 85% 서열 동일성(예컨대, 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드를 특징으로 하며, 여기서 sFGFR3 폴리펩타이드에는 SEQ ID NO: 1의 위치 253에서 시스테인 잔기를 제거하는 아미노산 치환이 추가로 포함된다. 예를 들어, 위치 253에서 시스테인 잔기는 세린 잔기, 또는 예컨대, 또 다른 보존적 아미노산 치환, 예컨대 알라닌, 글리신, 프롤린, 또는 트레오닌으로 치환된다. 특히, sFGFR3 폴리펩타이드에는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열이 포함되거나 이로 구성된다. 예를 들면, sFGFR3 폴리펩타이드는 단리된 sFGFR3 폴리펩타이드일 수 있다. sFGFR3 폴리펩타이드에는 또한 신호 펩타이드가 포함될 수 있다(예컨대, 신호 펩타이드는 SEQ ID NO: 6 또는 35의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 6 또는 35와 적어도 92%, 95%, 97%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다). 예를 들어, sFGFR3은 SEQ ID NO: 18과 적어도 92%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다(예컨대, sFGFR3 폴리펩타이드에는 SEQ ID NO: 18이 포함되거나 이로 구성된다). sFGFR3 폴리펩타이드는 또한 이종성 신호 펩타이드를 가질 수 있다(예컨대, 폴리펩타이드에는 SEQ ID NO: 35의 아미노산 서열을 갖는 이종성 신호 펩타이드가 포함된다).
본 발명의 제3 양태는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열과 적어도 85% 서열 동일성(예컨대, 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드를 특징으로 하며, 여기서 sFGFR3 폴리펩타이드에는 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열의 전부 또는 단편(예컨대, SEQ ID NO: 3의 적어도 10개, 20개, 30개, 40개, 45개 이상의 연속 아미노산)과 적어도 85% 서열 동일성(예컨대, 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 도메인이 추가로 포함되며, 여기서 도메인은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 잔기 288과 289 간에 삽입된다. 예를 들어, 도메인에는 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열과 적어도 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열이 포함될 수 있다(예컨대, 도메인에는 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열이 포함되거나 이로 구성될 수 있다). 선택적으로, sFGFR3 폴리펩타이드에는 SEQ ID NO: 1의 위치 253 및/또는 SEQ ID NO: 3의 위치 28에서, 시스테인 잔기의 세린 잔기, 또는 예컨대, 또 다른 보존적 아미노산 치환, 예컨대 알라닌, 글리신, 프롤린, 또는 트레오닌으로의 아미노산 치환이 포함된다. 특히, sFGFR3 폴리펩타이드에는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열이 포함되거나 이로 구성된다. 예를 들어, sFGFR3 폴리펩타이드는 단리된 sFGFR3 폴리펩타이드일 수 있다.
또한 SEQ ID NO: 20, 21, 36, 또는 37의 핵산 서열과 적어도 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 본 발명의 제1, 제2, 또는 제3 양태의 sFGFR3 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드(예컨대, 단리된 폴리뉴클레오타이드)를 특징으로 한다(예컨대, 폴리뉴클레오타이드에는 SEQ ID NO: 20, 21, 36, 또는 37의 핵산이 포함되거나 이로 구성된다). 본 발명은 또한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터(예컨대, 단리된 벡터), 예컨대 플라스미드, 인공 염색체, 바이러스 벡터, 또는 파지 벡터를 특징으로 한다. 또한, 본 발명은 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포(예컨대, 단리된 숙주 세포), 예컨대 HEK 293 세포 또는 CHO 세포를 특징으로 한다.
본 발명은 본 발명의 제1, 제2, 또는 제3 양태의 sFGFR3 폴리펩타이드 또는 본 발명의 제1, 제2, 또는 제3 양태의 sFGFR3 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물을 특징으로 한다. 또한, sFGFR3 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 또는 숙주 세포는 조성물에서 제형화될 수 있다. 조성물에는 또한 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 담체, 또는 희석제가 포함될 수 있다. sFGFR3 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 또는 벡터를 포함하는 조성물은 약 0.002 ㎎/㎏ 내지 약 30 ㎎/㎏, 예컨대 약 0.001 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏의 용량으로 투여를 위해 제형화될 수 있다. 숙주 세포를 포함하는 조성물은 약 1 × 103 세포/㎖ 내지 약 1 × 1012 세포/㎖의 용량으로 투여를 위해 제형화될 수 있다. 조성물은 매일, 매주, 또는 매월, 예컨대 1주 7회, 1주 6회, 1주 5회, 1주 4회, 1주 3회, 1주 2회, 1주 1회, 2주 1회, 또는 1개월 1회 투여를 위해 제형화될 수 있다. 예를 들어, sFGFR3 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 또는 벡터를 포함하는 조성물은 1주 1회 또는 2회 약 0.25 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏의 용량으로 투여를 위해 제형화된다. 조성물은 비경구 투여(예컨대, 피하 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 동맥내 투여, 경막내 투여, 또는 복강내 투여), 장내 투여, 또는 국소 투여를 위해 제형화될 수 있다. 바람직하게는, 조성물은 피하 투여를 위해 제형화된다. 본 발명은 또한 상술된 하나 이상의 조성물을 포함하는 약제를 특징으로 한다.
본 발명은 또한 환자에게 유효량의 본 발명의 제1, 제2, 또는 제3 양태의 sFGFR3 폴리펩타이드, sFGFR3 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 벡터, 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터를 함유하는 숙주 세포, 또는 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 또는 숙주 세포를 함유하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 골격 성장 지연 장애(예컨대, 연골무형성증)를 갖는 환자(예컨대 인간)에서 조직(예컨대, 골격 조직)으로 sFGFR3 폴리펩타이드를 전달하는 단계를 특징으로 한다.
본 발명의 제4 양태는 본 발명의 제1, 제2, 또는 제3 양태의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 벡터, 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터를 함유하는 숙주 세포, 또는 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 또는 숙주 세포를 함유하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 환자(예컨대, 인간)에서 골격 성장 지연 장애(예컨대, FGFR3-관련 골격 질환)를 치료하는 방법을 특징으로 한다. FGFR3-관련 골격 질환은 연골무형성증, 치사성 형성이상 I형(TDI), 치사성 형성이상 II형(TDII), 발달 지연을 갖는 중증 연골무형성증 및 흑색 가시세포증(SADDEN), 연골발육부전, 두개골유합 증후군(예컨대, y케 증후군, 크루종 증후군, 및 크루종피부골격 증후군), 및 굴지증, 큰 신장, 및 청력 소실 증후군(CATSHL)으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 특히, 골격 성장 지연 장애는 연골무형성증이다.
FGFR3-관련 골격 질환은 구성적으로 활성인 FGFR3의 환자 내 발현, 예컨대 SEQ ID NO: 5 또는 32의 위치 380에서 글리신 잔기의 아르기닌 잔기로의 아미노산 치환에 의해 유도될 수 있다. 특히, 환자는 골격 성장 지연 장애로 진단받을 수 있다(예컨대, 치료 전). 예를 들면, 환자는 짧은 사지, 짧은 몸통, 앙가발, 오리 걸음, 두개골 기형, 클로버잎 두개골, 두개골유합, 보름뼈, 손의 이상, 발의 이상, 히치하이커 엄지, 및 흉부 이상으로 구성되는 군으로부터 선택되는 골격 성장 지연 장애의 하나 이상의 증상을 나타내어, 환자는 sFGFR3 폴리펩타이드(또는 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 벡터, 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터를 함유하는 숙주 세포, 또는 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 또는 숙주 세포를 함유하는 조성물)의 투여 후 골격 성장 지연 장애의 하나 이상의 증상에서 개선을 나타낸다. 또한, 환자는 이전에 sFGFR3 폴리펩타이드를 투여받지 않았을 수 있다. 예를 들어, 환자는 유아, 어린이, 청소년, 또는 성인일 수 있다.
예를 들어, 폴리펩타이드는 약 0.002 ㎎/㎏ 내지 약 30 ㎎/㎏의 용량(예컨대, 약 0.001 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏의 용량)으로 환자에게 투여된다. 폴리펩타이드는 매일, 매주 1회 이상(예컨대, 1주 2회, 1주 3회, 1주 4회, 1주 5회, 1주 6회, 또는 1주 7회), 2주 1회, 매월, 또는 매년 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 적어도 약 1주 1회 또는 2회 이상 약 0.25 ㎎/㎏ 내지 약 30 ㎎/㎏의 용량으로 환자에게 투여된다(예컨대, 폴리펩타이드는 1주 1회 또는 2회 약 2.5 ㎎/㎏ 또는 약 10 ㎎/㎏의 용량으로 환자에게 투여된다). 폴리펩타이드는 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 담체, 또는 희석제를 포함하는 조성물로 환자에게 투여될 수 있다. 폴리펩타이드는 비경구로(예컨대, 피하로, 정맥내로, 근육내로, 동맥내로, 경막내로, 또는 복강내로), 장내로, 또는 국소로 환자에게 투여될 수 있다. 바람직하게는, 조성물은 피하 주사에 의해 환자에게 투여된다. 또한, 폴리펩타이드는 섬유아세포 성장 인자 1(FGF1), 섬유아세포 성장 인자 2(FGF2), 섬유아세포 성장 인자 9(FGF9), 섬유아세포 성장 인자 18(FGF18), 섬유아세포 성장 인자 19(FGF19), 또는 섬유아세포 성장 인자 21(FGF21)에 결합할 수 있다. 특히, 결합은 약 0.2 nM 내지 약 20 nM의 평형 해리 상수(Kd)를 특징으로 할 수 있고, 예컨대 결합은 약 1 nM 내지 약 10 nM(예컨대, 약 1 nm, 약 2 nm, 약 3 nm, 약 4 nm, 약 5 nm, 약 6 nm, 약 7 nm, 약 8 nm, 약 9 nm, 또는 약 10 nm)의 Kd를 특징으로 한다. 폴리펩타이드는 FGF19 및 FGF21에 대한 폴리펩타이드의 결합 친화도에 비해 FGF1, FGF2, FGF9, 및 FGF18에 대해 더 큰 결합 친화도를 나타낼 수 있다.
폴리펩타이드는 약 2시간 내지 약 25시간(예컨대, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간, 24시간, 또는 25시간)의 생체내 반감기를 가질 수 있다. 바람직하게는, 폴리펩타이드의 투여는 환자의 생존 증가, 환자의 보행 개선, 환자에서 복식 호흡의 개선, 환자의 신체 및/또는 뼈 길이의 증가, 환자의 두개 비의 개선, 및/또는 환자에서, 예컨대, 미치료 환자(예컨대, 미치료 연골무형성증 환자) 대비 대공 형태의 복원 중 하나 이상, 또는 전부를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 제1, 제2, 또는 제3 양태의 sFGFR3 폴리펩타이드를 제조하는 방법을 특징으로 하며, 여기에는 sFGFR3 폴리펩타이드의 발현을 실시하기 적합한 조건 하에 배양 배지 중 상술된 숙주 세포(예컨대, CHO 세포 또는 HEK 293 세포)를 배양하는 단계 및 배양 배지로부터 sFGFR3 폴리펩타이드를 회수하는 단계가 포함된다. 특히, 회수 단계에는 크로마토그래피, 예컨대 친화도 크로마토그래피(예컨대, 이온 교환 크로마토그래피 또는 항-FLAG 크로마토그래피, 예컨대 면역침전) 또는 크기 배제 크로마토그래피가 포함된다.
본 발명의 제5 양태는 환자에서 골격 성장 지연 장애를 치료하기 위한 본 발명의 제1, 제2, 또는 제3 양태의 폴리펩타이드(또는 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 벡터, 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터를 함유하는 숙주 세포, 또는 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 또는 숙주 세포를 함유하는 조성물)를 특징으로 한다. 특히, sFGFR3 폴리펩타이드는 섬유아세포 성장 인자 1(FGF1), 섬유아세포 성장 인자 2(FGF2), 섬유아세포 성장 인자 9(FGF9), 섬유아세포 성장 인자 18(FGF18), 섬유아세포 성장 인자 19(FGF19), 또는 섬유아세포 성장 인자 21(FGF21)에 결합할 수 있다.
본 발명의 제6 양태는 환자(예컨대, 인간)에서 골격 성장 지연 장애를 치료하기 위한 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열과 적어도 85% 서열 동일성(예컨대, 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드(또는 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 벡터, 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터를 함유하는 숙주 세포, 또는 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 또는 숙주 세포를 함유하는 조성물)를 특징으로 하며, 여기서 sFGFR3 폴리펩타이드에는 SEQ ID NO: 1의 위치 253에서 시스테인 잔기를 제거하는 아미노산 치환이 추가로 포함된다. 예를 들어, 위치 253의 시스테인 잔기는 세린 잔기, 또는 예컨대, 또 다른 보존적 아미노산 치환, 예컨대 알라닌, 글리신, 프롤린, 또는 트레오닌으로 치환된다. 특히, sFGFR3 폴리펩타이드에는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열이 포함되거나 이로 구성된다. 예를 들어, sFGFR3 폴리펩타이드는 단리된 sFGFR3 폴리펩타이드일 수 있다. 또한, sFGFR3 폴리펩타이드는 섬유아세포 성장 인자 1(FGF1), 섬유아세포 성장 인자 2(FGF2), 섬유아세포 성장 인자 9(FGF9), 섬유아세포 성장 인자 18(FGF18), 섬유아세포 성장 인자 19(FGF19), 또는 섬유아세포 성장 인자 21(FGF21)에 결합할 수 있다.
본 발명의 제7 양태는 환자(예컨대, 인간)에서 골격 성장 지연 장애를 치료하기 위한 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열과 적어도 85% 서열 동일성(예컨대, 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드(또는 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 벡터, 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터를 함유하는 숙주 세포, 또는 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 또는 숙주 세포를 함유하는 조성물)를 특징으로 하며, 여기서 sFGFR3 폴리펩타이드에는 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열의 전부 또는 단편(예컨대, SEQ ID NO: 3의 적어도 10개, 20개, 30개, 40개, 45개 이상의 연속 아미노산)과 적어도 85% 서열 동일성(예컨대, 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 도메인이 추가로 포함되며, 여기서 도메인은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 잔기 288 및 289 간에 삽입된다. 예를 들어, 도메인에는 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열과 적어도 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열이 포함될 수 있다(예컨대, 도메인에는 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열이 포함되거나 이로 구성될 수 있다). 선택적으로, sFGFR3 폴리펩타이드에는 SEQ ID NO: 1의 위치 253에서 및/또는 SEQ ID NO: 3의 위치 28에서 시스테인 잔기의 세린 잔기, 또는 예컨대, 또 다른 보존적 아미노산 치환, 예컨대 알라닌, 글리신, 프롤린, 또는 트레오닌으로의 아미노산 치환이 포함된다. 특히, sFGFR3 폴리펩타이드에는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열이 포함되거나 이로 구성된다. 예를 들어, sFGFR3 폴리펩타이드는 단리된 sFGFR3 폴리펩타이드일 수 있다. 또한, sFGFR3 폴리펩타이드는 섬유아세포 성장 인자 1(FGF1), 섬유아세포 성장 인자 2(FGF2), 섬유아세포 성장 인자 9(FGF9), 섬유아세포 성장 인자 18(FGF18), 섬유아세포 성장 인자 19(FGF19), 또는 섬유아세포 성장 인자 21(FGF21)에 결합할 수 있다.
제5, 제6, 또는 제7 양태의 용도는 또한 본 발명의 제1, 제2, 또는 제3 양태의 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 숙주 세포, 또는 조성물의 투여를 특징으로 한다. 본 발명의 제6 양태의 sFGFR3 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 20 또는 36의 핵산 서열과 적어도 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩될 수 있다(예컨대, 폴리뉴클레오타이드에는 SEQ ID NO: 20 또는 36의 핵산이 포함되거나 이로 구성된다). 본 발명의 제5 또는 제7 양태의 sFGFR3 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 21 또는 37의 핵산 서열과 적어도 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩될 수 있다(예컨대, 폴리뉴클레오타이드에는 SEQ ID NO: 21 또는 37의 핵산이 포함되거나 이로 구성된다).
본 발명의 제5, 제6, 또는 제7 양태의 골격 성장 지연 장애는 임의의 FGFR3-관련 골격 질환, 예컨대 연골무형성증, TDI, TDII, 발달 지연을 갖는 중증 연골무형성증 및 흑색 가시세포증(SADDEN), 연골발육부전, 두개골유합 증후군(예컨대, 케 증후군, 크루종 증후군, 및 크루종피부골격 증후군), 또는 CATSHL일 수 있다. 특히, 골격 성장 지연 장애는 연골무형성증이다. FGFR3-관련 골격 질환은 구성적으로 활성인 FGFR3의 환자 내 발현에 의해 유도될 수 있고, 예컨대, 여기서 구성적으로 활성인 FGFR3에는 SEQ ID NO: 5의 위치 380에서 글리신 잔기의 아르기닌 잔기로의 아미노산 치환이 포함된다.
본 발명의 제5, 제6, 또는 제7 양태의 환자(예컨대, 인간)는 골격 성장 지연 장애로 진단받은 환자일 수 있다(예컨대, 치료 전에). 환자는 짧은 사지, 짧은 몸통, 앙가발, 오리 걸음, 두개골 기형, 클로버잎 두개골, 두개골유합, 보름뼈, 손의 이상, 발의 이상, 히치하이커 엄지, 및 흉부 이상으로 구성되는 군으로부터 선택되는 골격 성장 지연 장애(예컨대, 연골무형성증)의 하나 이상의 증상을 나타낼 수 있다. 방법의 결과, 환자는 sFGFR3 폴리펩타이드의 투여 후 골격 성장 지연 장애의 하나 이상의 증상에서 개선을 나타낼 수 있다. 또한, sFGFR3 폴리펩타이드의 투여는 환자의 생존을 증가시키고/시키거나 환자의 대공 형태를 복원할 수 있다. 환자는 유아, 어린이, 청소년, 또는 성인일 수 있다. 또한, 환자는 이전에 sFGFR3 폴리펩타이드(또는 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 벡터, 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터를 함유하는 숙주 세포, 또는 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 또는 숙주 세포를 함유하는 조성물)를 투여받지 않은 환자일 수 있다.
본 발명의 제5, 제6, 또는 제7 양태의 sFGFR3 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 또는 벡터는 약 0.002 ㎎/㎏ 내지 약 30 ㎎/㎏, 예컨대 약 0.001 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏의 용량으로 환자(예컨대, 인간)에게 투여될 수 있다. 본 발명의 제4 또는 제5 양태의 숙주 세포를 포함하는 조성물은 약 1 × 103 세포/㎖ 내지 약 1 × 1012 세포/㎖의 용량으로 환자(예컨대, 인간)에게 투여될 수 있다. 예를 들어, sFGFR3 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 또는 숙주 세포는 매일, 매주, 매월, 또는 매년 1회 이상 환자에게 투여된다(예컨대, sFGFR3 폴리펩타이드는 환자에게 1주 7회, 1주 6회, 1주 5회, 1주 4회, 1주 3회, 1주 2회, 1주 1회, 2주 1회, 또는 1개월 1회 투여된다). 특히, sFGFR3 폴리펩타이드는 1주 1회 또는 2회 약 0.25 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏의 용량으로 환자에게 투여된다. sFGFR3 폴리펩타이드는 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 담체, 또는 희석제를 포함하는 조성물 중 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 비경구로(예컨대, 피하로, 정맥내로, 근육내로, 동맥내로, 경막내로, 또는 복강내로), 장내로, 또는 국소로 환자에게 투여된다. 특히, 조성물은 피하 주사에 의해 환자에게 투여된다.
본 발명은 FGFR3 폴리펩타이드로부터 신호 펩타이드, 막통과 도메인, 및 세포내 도메인의 일부를 결실시켜(예컨대, SEQ ID NO: 33의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 제조하기 위해) 본 발명의 제1 양태의 sFGFR3 폴리펩타이드를 제조하는 방법을 특징으로 한다. 특히, 세포내 도메인은 SEQ ID NO: 32의 아미노산 잔기 436 내지 806으로 구성된다. 본 발명은 또한 SEQ ID NO: 1의 위치 253에서 시스테인 잔기를 제거하는 아미노산 치환을 도입하여(예컨대, SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 제조하기 위해) 본 발명의 제2 양태의 sFGFR3 폴리펩타이드를 제조하는 방법을 특징으로 한다. 예를 들어, 위치 253의 시스테인 잔기는 세린 잔기, 또는 예컨대, 또 다른 보존적 아미노산 치환, 예컨대 알라닌, 글리신, 프롤린, 또는 트레오닌으로 치환된다.
본 발명은 또한 본 발명의 제1, 제2, 또는 제3 양태의 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대, SEQ ID NO: 2, 4, 또는 33의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드), 본 발명의 제1, 제2, 또는 제3 양태의 폴리뉴클레오타이드(예컨대, SEQ ID NO: 20, 21, 36, 또는 37의 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드), 본 발명의 제1, 제2, 또는 제3 양태의 벡터(예컨대, 플라스미드, 인공 염색체, 바이러스 벡터, 또는 파지 벡터), 또는 본 발명의 제1, 제2, 또는 제3 양태의 숙주 세포(예컨대, HEK 293 세포 또는 CHO 세포)를 포함하는 키트를 특징으로 하며, 여기서 키트에는 선택적으로 키트의 사용 지침이 포함된다.
정의
본원에서 사용되는 부정관사("a" 및 "an")는 달리 나타내지 않는 한, "적어도 하나" 또는 "하나 이상"을 의미한다. 또한, 단수 형태("a," "an," 및 "the")에는 문맥 상 명확히 달리 나타내지 않는 한, 복수의 언급이 포함된다.
본원에서 사용되는 "약"은 인용된 값의 ±10%이고 바람직하게는 인용된 값의 ±5%, 또는 더 바람직하게는 인용된 값의 ±2%인 양을 나타낸다. 예를 들면, 용어 "약"은 본원에서 인용되는 모든 투여량 또는 범위를 인용된 값의 ±10% 또는 범위 종결점에 의해 수식하기 위해 사용될 수 있다.
용어 "도메인"은 폴리펩타이드 내에 식별 가능한 구조 및/또는 기능을 갖는 폴리펩타이드(예컨대 FGFR3 폴리펩타이드)의 아미노산 서열의 보존된 영역을 나타낸다. 도메인은, 예컨대, 약 20개 아미노산 내지 약 600개 아미노산으로, 길이가 변할 수 있다. 예시적인 도메인에는 FGFR3의 면역글로불린 도메인(예컨대, Ig-유사 C2-유형 도메인 1, Ig-유사 C2-유형 도메인 2, 및 Ig-유사 C2-유형 도메인 3)이 포함된다.
용어 "투여량"은 활성 제제가 환자(예컨대, 골격 성장 지연 장애, 예컨대 연골무형성증을 갖는 환자)에게 투여되는 경우, 요망되는 치료 효과(예컨대, 골격 성장 지연 장애, 예컨대 연골무형성증의 치료)를 생성하기 위해 계산된 활성 제제(예컨대, sFGFR3 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예컨대 SEQ ID NO: 2, 4, 또는 33의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드)의 결정된 양을 나타낸다. 투여량은 활성 제제의 정의된 양 또는 특정한 투여 빈도와 커플링된 정의된 양의 관점에서 정의될 수 있다. 투여량 형태에는 임의의 적합한 약제학적 부형제, 담체, 또는 희석제와 연합된 sFGFR3 폴리펩타이드 또는 이의 단편이 포함될 수 있다.
용어 "유효량", "에 유효한 양" 및 "치료 유효량"은 요망되는 결과, 예를 들어, 골격 성장 지연 장애(예컨대, 연골무형성증)의 치료를 일으키기 충분한 sFGFR3 폴리펩타이드, sFGR3을 인코딩하는 벡터, 및/또는 sFGFR3 조성물의 양을 나타낸다.
용어 "세포외 도메인" 및 "ECD"는 막통과 도메인 너머 세포외 공간 내로 연장되는 FGFR3 폴리펩타이드 부분을 나타낸다. ECD는 하나 이상의 섬유아세포 성장 인자(FGF)로의 FGFR3의 결합을 매개한다. 예를 들면, ECD에는 FGFR3 폴리펩타이드의 Ig-유사 C2-유형 도메인 1 내지 3이 포함된다. 특히, ECD에는 야생형(wt) FGFR3 폴리펩타이드의 Ig-유사 C2-유형 도메인 1(예컨대, SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 갖는 wt FGFR3 폴리펩타이드의 아미노산 36 내지 88(신호 서열이 없는 성숙 FGFR3 단백질) 또는 SEQ ID NO: 32의 아미노산 서열을 갖는 wt FGFR3 폴리펩타이드의 아미노산 57 내지 110(신호 서열을 갖는 전구체 FGFR3 단백질)), 야생형(wt) FGFR3 폴리펩타이드의 Ig-유사 C2-유형 도메인 2(예컨대, SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 갖는 wt FGFR3 폴리펩타이드의 아미노산 139 내지 234 또는 SEQ ID NO: 32의 아미노산 서열을 갖는 wt FGFR3 폴리펩타이드의 아미노산 161 내지 245), 및 wt FGFR3 폴리펩타이드의 Ig-유사 C2-유형 도메인 3(예컨대, SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 갖는 wt FGFR3 폴리펩타이드의 아미노산 247 내지 335 또는 SEQ ID NO: 32의 아미노산 서열을 갖는 wt FGFR3 폴리펩타이드의 아미노산 268 내지 310)이 포함된다. FGFR3의 ECD에는 또한 야생형 FGFR3 Ig-유사 C2-유형 도메인 3의 단편, 예를 들면 SEQ ID NO: 1의 aa 247 내지 288이 포함될 수 있고, 여기에는 또한, 예컨대 SEQ ID NO: 1의 위치 253(예컨대, SEQ ID NO: 2의 aa 247 내지 288)에서 시스테인 잔기의 세린 잔기로의 아미노산 치환 또는 또 다른 보존적 아미노산 치환(예컨대, 알라닌, 글리신, 프롤린, 또는 트레오닌)이 포함될 수 있다. 또한, ECD에는, 예컨대, SEQ ID NO: 4의 aa 247 내지 335의 Ig-유사 C2-유형 도메인 3이 포함될 수 있다. 따라서, FGFR3 폴리펩타이드의 예시적인 ECD에는, 예컨대, SEQ ID NO: 1 및 2의 aa 1 내지 288 또는 SEQ ID NO: 4 및 33의 aa 1 내지 335의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드들이 포함된다. 특히, FGFR3 폴리펩타이드의 ECD에는 SEQ ID NO: 33의 aa 1 내지 335가 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "FGFR3-관련 골격 질환"은 FGFR3 활성화의 비정상적인 증가에 의해, 예컨대 FGFR3의 기능-획득 돌연변이체의 발현에 의해 유도되는 골격 질환을 나타낸다. 어구 "FGFR3의 기능-획득 돌연변이체"는 생물학적 활성을 나타내는, 예컨대 하류 신호전달을 유발하는 FGFR3의 돌연변이체를 나타내며, 이는 FGF 리간드의 존재 하에 대응하는 야생형 FGFR3(예컨대, SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드)의 생물학적 활성보다 높다. FGFR3-관련 골격 질환에는 선천성 또는 산발성 질환이 포함될 수 있다. 예시적인 FGFR3-관련 골격 질환에는 비제한적으로 연골무형성증, 치사성 형성이상 I형(TDI), 치사성 형성이상 II형(TDII), 발달 지연 및 흑색 가시세포증을 갖는 중증 연골무형성증(SADDAN), 연골발육부전, 두개골유합 증후군(예컨대, y케 증후군, 크루종 증후군, 및 크루종피부골격 증후군), 및 굴지증, 큰 신장, 및 청력 소실 증후군(CATSHL)이 포함된다.
용어 "섬유아세포 성장 인자" 및 "FGF"는 FGF 패밀리의 구성원을 나타내며, 여기에는 내분비 신호전달 경로, 발달, 상처 치유, 및 혈관신생을 포함하는 다양한 대사 공정에 관여되는 구조적으로 관련된 신호전달 분자가 포함된다. FGF는 광범위한 세포 및 조직 유형의 증식 및 분화에서 주요 역할을 담당한다. 이 용어는 바람직하게는 FGF1, FGF2, FGF9, FGF18, FGF19, 및 FGF21을 나타내며, 이는 FGFR3에 결합하는 것으로 나타났다. 예를 들면, FGF에는 인간 FGF1(예컨대, SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드), 인간 FGF2(예컨대, SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드), 인간 FGF9(예컨대, SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드), 인간 FGF18(예컨대, SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드), 인간 FGF19(예컨대, SEQ ID NO: 38의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드), 및 인간 FGF21(예컨대, SEQ ID NO: 39의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드)이 포함될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "섬유아세포 성장 인자 수용체 3", "FGFR3", 또는 "FGFR3 수용체"는 하나 이상의 FGF(예컨대, FGF1, FGF2, FGF9, FGF18, FGF19, 및/또는 FGF21)에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드를 나타낸다. 염색체 4의 원위 짧은 팔에 위치하는, 인간 FGFR3 유전자는 19개 엑손을 함유하고 신호 펩타이드를 포함하는 806개 아미노산 단백질 전구체(섬유아세포 성장 인자 수용체 3 이소형 1 전구체)를 인코딩한다(예컨대, SEQ ID NO: 6 또는 35의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드). 골격 성장 장애(예컨대, 연골무형성증)를 야기하는 FGFR3 아미노산 서열의 돌연변이에는, 예컨대, 위치 380에서 글리신 잔기의 아르기닌 잔기로의 치환(즉, G380R)이 포함된다. 천연 발생 인간 FGFR3 유전자는 Genbank Accession number NM_000142.4에 나타낸 바와 같이 뉴클레오타이드 서열을 가지며 천연 발생 인간 FGFR3 단백질은 본원에서 SEQ ID NO: 5로 나타내는, Genbank Accession number NP_000133에 나타낸 바와 같이 아미노산 서열을 갖는다. 야생형 FGFR3(예컨대, SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드)은 Ig-유사 C2-유형 도메인 1 내지 3(아미노산 잔기 1 내지 335)을 포함하는 세포외 면역글로불린-유사 막 도메인, 막통과 도메인(아미노산 잔기 345 내지 377), 및 세포내 도메인(아미노산 잔기 378 내지 784)으로 구성된다. FGFR3에는 전장, 야생형 FGFR3(예컨대, SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드)의 단편 및/또는 변이체(예컨대, 스플라이스 변이체, 예컨대 엑손 9 대신 대안적 엑손 8을 이용하는 스플라이스 변이체)가 포함될 수 있다.
용어 "단편" 및 "부분"은 전체의 일부, 예컨대 바람직하게는, 참조 핵산 분자 또는 폴리펩타이드의 전체 길이의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상을 함유하는 폴리펩타이드 또는 핵산 분자를 나타낸다. 단편 또는 부분은, 예컨대, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개, 200개, 210개, 220개, 230개, 240개, 250개, 260개, 270개, 280개, 290개, 300개, 310개, 320개, 330개, 340개, 350개, 360개, 370개, 380개, 390개, 400개, 500개, 600개, 700개 이상의 아미노산 잔기 내지 참조 폴리펩타이드의 전체 길이(예컨대, SEQ ID NO: 5 또는 32의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드)를 함유할 수 있다. 예를 들어, FGFR3 단편에는 SEQ ID NO: 1 또는 2의 적어도 200개, 205개, 210개, 215개, 220개, 225개, 235개, 230개, 240개, 245개, 250개, 255개, 260개, 265개, 275개, 280개, 285개, 290개, 또는 300개 연속 아미노산을 갖는 임의의 폴리펩타이드가 포함될 수 있다. 또한, FGFR3 단편에는 SEQ ID NO: 4 또는 33의 적어도 200개, 205개, 210개, 215개, 220개, 225개, 235개, 230개, 240개, 245개, 250개, 255개, 260개, 265개, 275개, 280개, 285개, 290개, 300개, 305개, 310개, 315개, 320개, 325개, 330개, 335개, 345개, 또는 345개 연속 아미노산을 갖는 임의의 폴리펩타이드가 포함될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "숙주 세포"는 대응하는 폴리뉴클레오타이드로부터 sFGFR3 폴리펩타이드를 발현하기 위해 요구되는, 필요한 세포 성분, 예컨대, 소기관을 포함하는 비히클을 나타낸다. 폴리뉴클레오타이드의 핵산 서열에는 전형적으로 당분야에 공지된 통상적 기법(예컨대, 형질전환, 전달감염, 전기천공, 칼슘 포스페이트 침전, 및 직접적 마이크로주사)에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있는 핵산 벡터(예컨대, 플라스미드, 인공 염색체, 바이러스 벡터, 또는 파지 벡터)가 포함된다. 숙주 세포는 원핵 세포, 예컨대, 박테리아 또는 고세균 세포, 또는 진핵 세포, 예컨대, 포유류 세포(예컨대, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 인간 배아 신장 293(HEK 293))일 수 있다. 바람직하게는, 숙주 세포는 포유류 세포, 예컨대 CHO 세포이다.
"단리된"은 그 자연 환경으로부터 분리되거나, 회수되거나, 정제됨을 의미한다. 예를 들어, 단리된 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대, sFGFR3 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예컨대 SEQ ID NO: 2 또는 4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드)는, 예컨대, 세포 배양 배지로부터 sFGFR3 폴리펩타이드의 단리 후 소정 정제 정도를 특징으로 할 수 있다. 단리된 sFGFR3 폴리펩타이드는 sFGFR3 폴리뉴클레오타이드가 조제물에 존재하는 전체 물질(예컨대, 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 세포 파편, 및 환경 오염물질)의 적어도 75 중량%(예컨대, 조제물에 존재하는 전체 물질의 적어도 80 중량%, 적어도 85 중량%, 적어도 90 중량%, 적어도 95 중량%, 적어도 96 중량%, 적어도 97 중량%, 적어도 99 중량%, 또는 적어도 99.5 중량%)를 차지하도록, 적어도 75% 순수할 수 있다. 마찬가지로, sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대, SEQ ID NO: 20, 21, 36, 또는 37의 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드)를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드, 또는 단리된 숙주 세포(예컨대, CHO 세포, HEK 293 세포, L 세포, C127 세포, 3T3 세포, BHK 세포, 또는 COS-7 세포)는 폴리뉴클레오타이드 또는 숙주 세포가 조제물에 존재하는 전체 물질(예컨대, 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 세포 파편, 및 환경 오염물질)의 적어도 75 중량%(예컨대, 조제물에 존재하는 전체 물질의 적어도 80 중량%, 적어도 85 중량%, 적어도 90 중량%, 적어도 95 중량%, 적어도 96 중량%, 적어도 97 중량%, 적어도 99 중량%, 또는 적어도 99.5 중량%)를 차지하도록, 적어도 75% 순수할 수 있다.
본원에서 상호 교환적으로 사용되는 "폴리뉴클레오타이드" 및 "핵산 분자"는 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체를 나타내며, DNA 및 RNA가 포함된다. 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기, 및/또는 이의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 도입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드에는 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오타이드 및 이의 유사체가 포함될 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 전에 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오타이드의 서열은 비-뉴클레오타이드 성분에 의해 단속될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 합성 후, 예컨대 표지로의 컨쥬게이션에 의해 추가 변형될 수 있다.
용어 "환자" 및 "대상체"는 비제한적으로 인간(예컨대, 골격 성장 지연 장애, 예컨대 연골무형성증을 갖는 인간) 또는 비-인간 포유동물(예컨대, 골격 성장 지연 장애, 예컨대 연골무형성증을 갖는 비-인간 포유동물), 예컨대 소, 말, 개, 양, 또는 고양이를 포함하는 포유동물을 나타낸다. 바람직하게는, 환자는 골격 성장 지연 장애(예컨대, 연골무형성증)를 갖는 인간, 특히 골격 성장 지연 장애(예컨대, 연골무형성증)를 갖는 유아, 어린이, 또는 청소년이다.
본원에서 사용되는 용어 "비경구 투여", "비경구로 투여되는" 및 다른 문법적으로 동등한 어구는 장내 및 국소 투여 이외에, 보통 주사에 의한, sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대, sFGFR3 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예컨대 SEQ ID NO: 2, 4, 또는 33의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드, 또는 신호 펩타이드, 예컨대 SEQ ID NO: 18 또는 34의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드)를 포함하는 조성물의 투여 방식을 나타내며, 비제한적으로 피하, 피내, 정맥내, 비강내, 안내, 폐, 근육내, 동맥내, 경막내, 낭내, 안와내, 심장내, 피내, 폐내, 복강내, 경기관, 피부밑, 관절내, 낭밑, 지주막하, 척추내, 경막외, 뇌내, 두개내, 경동맥내, 및 흉골내 주사 및 주입이 포함된다.
"약제학적으로 허용 가능한 희석제, 부형제, 담체, 또는 애쥬번트"란 함께 투여되는 약학 조성물(예컨대, sFGFR3 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예컨대 SEQ ID NO: 2, 4, 또는 33의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드, 또는 신호 펩타이드, 예컨대 SEQ ID NO: 18 또는 34의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드)의 치료 성질을 보유하면서 대상체(예컨대, 인간)에 대해 생리적으로 허용 가능한 희석제, 부형제, 담체, 또는 애쥬번트를 각각 의미한다. 하나의 예시적인 약제학적으로 허용 가능한 담체는 생리 식염수이다. 다른 생리적으로 허용 가능한 희석제, 부형제, 담체, 또는 애쥬번트 및 이의 제형물은 당업자에게 공지되어 있다.
"약학 조성물"이란 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 담체, 또는 희석제와 제형화된 활성 제제, 예컨대 sFGFR3(예컨대, sFGFR3 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예컨대 SEQ ID NO: 2, 4, 또는 33의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드, 또는 신호 펩타이드, 예컨대 SEQ ID NO: 18 또는 34의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드)을 함유하는 조성물을 의미한다. 약학 조성물은 환자(예컨대, 골격 성장 지연 장애를 갖는 환자, 예컨대 연골무형성증을 갖는 환자)에서 질환 또는 사건(예컨대, 골격 성장 지연 장애, 예컨대 연골무형성증)의 치료를 위한 치료 요법의 일환으로서 정부 규제 당국의 승인 하에 제조되거나 판매될 수 있다. 약학 조성물은, 예컨대, 비경구 투여를 위해, 예컨대 피하 투여를 위해(예컨대 피하 주사에 의해) 또는 정맥내 투여를 위해(예컨대, 입상 색전이 없는 멸균 용액으로서 그리고 정맥내 용도에 적합한 용매계 중), 또는 경구 투여를 위해(예컨대, 정제, 캡슐, 캐플릿, 젤캡, 또는 시럽으로서) 제형화될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "서열 동일성"은 필요한 경우, 최대 동일성 백분율을 달성하기 위해, 서열을 정렬하고 갭을 도입한 후(예컨대, 갭이 후보 및 참조 서열 중 하나 또는 둘 모두에서 최적 정렬을 위해 도입될 수 있고, 비-상동성 서열은 비교 목적을 위해 무시될 수 있다), 참조 서열, 예컨대, 야생형 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대, SEQ ID NO: 5 또는 32의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드) 또는 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대, sFGFR3 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예컨대 SEQ ID NO: 2, 4, 또는 33의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드, 또는 신호 펩타이드, 예컨대 SEQ ID NO: 18 또는 34의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드)의 아미노산(또는 핵산) 잔기와 동일한 후보 서열, 예컨대 FGFR3 폴리펩타이드의 아미노산(또는 핵산) 잔기의 백분율을 나타낸다. 동일성 백분율의 결정 목적을 위한 정렬은 당분야의 기술 범위 내에서, 예를 들면, 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, BLAST-P, BLAST-N, BLAST-X, WU-BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2, CLUSTAL, 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 예를 들면, 주어진 참조 서열에, 이와, 또는 이에 대해 주어진 후보 서열의 아미노산(또는 핵산) 서열 동일성 백분율(주어진 참조 서열에, 이와, 또는 이에 대해 소정의 아미노산(또는 핵산) 서열 동일성 백분율을 갖거나 포함하는 주어진 후보 서열로서 대안적으로 표현될 수 있다)은 하기와 같이 계산된다:
100 × (분율 A/B)
식 중, A는 후보 서열 및 참조 서열의 정렬에서 동일한 것으로 스코어링된 아미노산(또는 핵산) 잔기의 수이며, B는 참조 서열에서 아미노산(또는 핵산) 잔기의 전체 수이다. 특히, 후보 서열과의 비교를 위해 정렬된 참조 서열은 후보 서열이 후보 서열의 전장 또는 후보 서열의 연속 아미노산(또는 핵산) 잔기의 선택된 부분에 걸쳐, 예컨대, 50% 내지 100% 동일성을 보임을 나타낼 수 있다. 비교 목적을 위해 정렬된 후보 서열의 길이는 참조 서열의 길이의 적어도 30%, 예컨대, 적어도 40%, 예컨대, 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%이다. 후보 서열 내 위치가 참조 서열 내 대응 위치와 동일한 아미노산(또는 핵산) 잔기에 의해 점유되는 경우, 분자는 그 위치에서 동일하다.
"신호 펩타이드"란 폴리펩타이드를 분비 경로(예컨대, 세포외 공간)로 보내는 폴리펩타이드의 N-말단의 짧은 펩타이드(예컨대, 5개 내지 30개 아미노산 길이, 예컨대 22개 아미노산 길이)를 의미한다. 신호 펩타이드는 전형적으로 폴리펩타이드의 분비 동안 절단된다. 신호 서열은 폴리펩타이드를 세포내 구획 또는 소기관, 예컨대 골지 기구로 보낼 수 있다. 신호 서열은 폴리펩타이드를 세포의 특정 영역으로 표적화하는 공지된 기능을 갖는 펩타이드에 대한 상동성, 또는 생물학적 활성에 의해 확인될 수 있다. 당업자는 쉽게 이용 가능한 소프트웨어(예컨대, Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705의 서열 분석 소프트웨어 패키지, BLAST, 또는 PILEUP/PRETTYBOX 프로그램)를 사용하여 신호 펩타이드를 확인할 수 있다. 신호 펩타이드는, 예를 들어, SEQ ID NO: 6 또는 35의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 것일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "골격 성장 지연 장애"는 뼈의 변형 및/또는 기형을 특징으로 하는 골격 질환을 나타낸다. 이들 장애에는 비제한적으로 성장판(physeal) 골절에 의해 유도된 골격 성장 지연 장애, 특발성 골격 성장 지연 장애, 또는 FGFR3-관련 골격 질환이 포함된다. 특히, 골격 성장 지연 장애(예컨대, 연골무형성증)를 갖는 환자는 건강한 환자의 뼈보다 짧은 뼈를 가질 수 있다. 예를 들어, 골격 성장 지연 장애에는 골격 형성이상, 예컨대, 연골무형성증, 동종접합성 연골무형성증, 이종접합성 연골무형성증, 연골무발생증, 선단이골증, 전완하퇴말단 형성이상, 아텔로스테오제네시스(atelosteogenesis), 굴지성 형성이상, 점상 연골형성 장애증, 어깨엉덩관절 유형의 점상 연골형성 장애증, 쇄골두개골 이골증, 선천성 짧은 대퇴, 두개골유합(예컨대, y케 증후군, 크루종 증후군, 아페르 증후군, 잭슨-바이스 증후군, 파이퍼 증후군, 또는 크루종피부골격 증후군), 가락소실, 단지증, 굴지증, 다지증, 합지증, 이영양성 형성이상, 왜소증, 이상분절 형성이상, 내연골종증, 섬유연골형성, 섬유성 형성이상, 선천성 다발성 외골증, 연골발육부전, 저인산증, 저인산혈 구루병, 야페-리히텐슈타인 증후군, 니스트 형성이상, 니스트 증후군, 랭거-유형 전완부 형성이상, 마르팡 증후군, 맥쿤-올브라이트 증후군, 소지증, 골간단 형성이상, 잰슨-유형 골간단 형성이상, 영양변경 형성이상, 모르키오 증후군, 니페어겔트-유형 전완부 형성이상, 신경섬유종증, 골관절염, 골연골형성이상, 불완전골 생성증, 출생전후 치사 유형의 불완전골 생성증, 골화석증, 골반문증, 말초 이골증, 라인하르트 증후군, 로버트 증후군, 로비노 증후군, 짧은-갈비뼈 다지증 증후군, 짧은 신장, 선천성 척추골단 형성이상, 및 척추사지골단 형성이상이 포함될 수 있다.
용어 "가용성 섬유아세포 성장 인자 수용체 3", "가용성 FGFR3" 및 "sFGFR3"은 막통과 도메인의 전부 또는 상당부 및 FGFR3 폴리펩타이드를 세포 막으로 부착시킬 임의의 폴리펩타이드 부분(예컨대, 티로신 키나제 도메인)의 부재 또는 기능적 손상을 특징으로 하는 FGFR3을 나타낸다. sFGFR3 폴리펩타이드는 막 결합되지 않은 형태의 FGFR3 폴리펩타이드이다. 특히, FGFR3의 막통과 도메인은 야생형 FGFR3 서열의 아미노산 잔기 345 내지 377(예컨대, SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드) 또는 신호 펩타이드를 포함하는 야생형 FGFR3 서열의 아미노산 잔기 367 내지 399(예컨대, SEQ ID NO: 32의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드)로 연장된다. 따라서, sFGFR3 폴리펩타이드에는 야생형 FGFR3 폴리펩타이드 서열의 아미노산 잔기 345 내지 377(예컨대, SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드) 또는 신호 펩타이드를 포함하는 야생형 FGFR3 서열의 아미노산 잔기 367 내지 399(예컨대, SEQ ID NO: 32의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드)의 일부 또는 전부의 결실이 포함될 수 있다. sFGFR3 폴리펩타이드에는 야생형 FGFR3 폴리펩타이드 서열의 세포질 도메인(SEQ ID NO: 5의 아미노산 잔기 378 내지 784) 또는 신호 펩타이드 서열을 포함하는 야생형 FGFR3 폴리펩타이드 서열의 세포질 도메인(SEQ ID NO: 32의 아미노산 잔기 378 내지 806)의 결실이 추가로 포함될 수 있다.
예시적인 sFGFR3 폴리펩타이드에는 비제한적으로 SEQ ID NO: 1 또는 2의 적어도 아미노산 1 내지 100, 1 내지 125, 1 내지 150, 1 내지 175, 1 내지 200, 1 내지 205, 1 내지 210, 1 내지 215, 1 내지 220, 1 내지 225, 1 내지 230, 1 내지 235, 1 내지 240, 1 내지 245, 1 내지 250, 1 내지 252, 1 내지 255, 1 내지 260, 1 내지 265, 1 내지 270, 1 내지 275, 1 내지 280, 1 내지 285, 1 내지 290, 1 내지 295, 또는 1 내지 300, 또는 1 내지 301이 포함될 수 있다. sFGFR3 폴리펩타이드에는 SEQ ID NO: 1 또는 2의 임의의 이들 sFGFR3 폴리펩타이드와 적어도 50%(예컨대, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상) 서열 동일성을 갖는 임의의 폴리펩타이드가 포함될 수 있다. 또한, 예시적인 sFGFR3 폴리펩타이드에는 비제한적으로 SEQ ID NO: 4 또는 33의 적어도 아미노산 1 내지 100, 1 내지 125, 1 내지 150, 1 내지 175, 1 내지 200, 1 내지 205, 1 내지 210, 1 내지 215, 1 내지 220, 1 내지 225, 1 내지 230, 1 내지 235, 1 내지 240, 1 내지 245, 1 내지 250, 1 내지 255, 1 내지 260, 1 내지 265, 1 내지 270, 1 내지 275, 1 내지 280, 1 내지 285, 1 내지 290, 1 내지 295, 1 내지 300, 1 내지 305, 1 내지 310, 1 내지 315, 1 내지 320, 1 내지 325, 1 내지 330, 1 내지 335, 1 내지 340, 1 내지 345, 또는 1 내지 348이 포함될 수 있다. sFGFR3 폴리펩타이드에는 SEQ ID NO: 4 또는 33의 아미노산 서열을 갖는 임의의 이들 sFGFR3 폴리펩타이드와 적어도 50%(예컨대, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상) 서열 동일성을 갖는 임의의 폴리펩타이드가 포함될 수 있다. 임의의 상기 sFGFR3 폴리펩타이드 또는 이의 변이체에는 선택적으로 N-말단 위치에서의 신호 펩타이드, 예컨대 SEQ ID NO: 6의 아미노산 1 내지 22(MGAPACALALCVAVAIVAGASS) 또는 SEQ ID NO: 35의 아미노산 1 내지 19(예컨대, MMSFVSLLLVGILFHATQA)가 포함될 수 있다.
"치료하기" 및 "치료"란 환자(예컨대, 인간, 예컨대 유아, 어린이, 또는 청소년)에서 골격 성장 지연 장애(예컨대, 연골무형성증)의 진행 또는 중증도, 또는 골격 성장 지연 장애(예컨대, 연골무형성증)의 하나 이상의 증상의 진행, 중증도, 또는 빈도 감소(예컨대, 적어도 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 99%, 또는 심지어 100% 만큼)를 의미한다. 치료는 치료 기간 동안 일어날 수 있고, 여기서 sFGFR3 폴리펩타이드는 골격 성장 지연 장애, 예컨대 연골무형성증을 갖는 환자(예컨대, 인간, 예컨대 유아, 어린이, 또는 청소년)를 치료하기 위한 시기(예컨대, 수 일, 수 개월, 수 년 이상) 동안 투여된다. sFGFR3(예컨대, sFGFR3 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예컨대 SEQ ID NO: 2, 4, 또는 33의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드, 또는 신호 펩타이드, 예컨대 SEQ ID NO: 18 또는 34의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드)으로 치료될 수 있는 연골무형성증의 예시적인 증상에는 비제한적으로 짧은 신장, 긴 몸통, 단축된 사지, 약 42인치 내지 약 56인치의 성인 신장, 상대적으로 큰 머리, 돌출된 이마, 얼굴의 발달되지 못한 부분, 외반슬(예컨대, "충돌-무릎"), 오리 걸음, 짧고 뭉툭한 손가락, 짧고 뭉툭한 발가락, 팔꿈치에서 팔을 펴는 능력의 제한, 등 하부의 과도한 굴곡, 치아 문제(예컨대, 치아의 과밀), 체중 조절 문제, 신경학적 문제, 호흡 문제, 및/또는 등 하부 및/또는 척추의 통증 및 무감각이 포함된다.
폴리펩타이드에 대한 용어 "변이체"는 변이체가 유도되는 폴리펩타이드(예컨대, 모체 폴리펩타이드, 예컨대 SEQ ID NO: 1 또는 7의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드)로부터의 아미노산 서열이 하나 이상의 변화에 의해 상이한 폴리펩타이드(예컨대, sFGFR3 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예컨대 SEQ ID NO: 2, 4, 또는 33의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드, 또는 신호 펩타이드, 예컨대 SEQ ID NO: 18 또는 34의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드)를 나타낸다. 폴리뉴클레오타이드에 대한 용어 "변이체"는 변이체가 유도되는 폴리뉴클레오타이드(예컨대, 모체 폴리뉴클레오타이드)로부터의 핵산 서열이 하나 이상의 변화에 의해 상이한 폴리뉴클레오타이드(예컨대, sFGFR3 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 SEQ ID NO: 20, 21, 36, 또는 37의 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드)를 나타낸다. 변이체의 아미노산 또는 핵산 서열에서의 변화는, 예컨대, 아미노산 또는 핵산 치환, 삽입, 결실, N-말단 절단, 또는 C-말단 절단, 또는 이의 임의의 조합일 수 있다. 특히, 아미노산 치환은 보존적 및/또는 비-보존적 치환일 수 있다. 변이체는 각각 모체 폴리펩타이드(예컨대, sFGFR3 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예컨대 SEQ ID NO: 2, 4, 또는 33의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드, 또는 신호 펩타이드, 예컨대 SEQ ID NO: 18 또는 34의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드) 또는 모체 폴리뉴클레오타이드(예컨대, sFGFR3 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 SEQ ID NO: 20, 21, 36, 또는 37의 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드)와의 아미노산 서열 동일성 또는 핵산 서열 동일성을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 변이체에는 SEQ ID NO: 1, 2, 4, 또는 33의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드와 적어도 50%(예컨대, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상) 서열 동일성을 갖는 임의의 폴리펩타이드가 포함될 수 있다. 변이체에는 또한 SEQ ID NO: 20, 21, 36, 또는 37의 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드와 적어도 50%(예컨대, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상) 서열 동일성을 갖는 임의의 폴리뉴클레오타이드가 포함될 수 있다.
"벡터"란 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대, sFGFR3 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예컨대 SEQ ID NO: 2, 4, 또는 33의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드, 또는 신호 펩타이드, 예컨대 SEQ ID NO: 18 또는 34의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드)를 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 또는 이의 단편을 포함하는 DNA 작제물을 의미한다. 벡터는 세포(예컨대, 숙주 세포 또는 인간 골격 성장 지연 장애, 예컨대 연골무형성증을 갖는 환자의 세포)를 감염시키기 위해 사용될 수 있고, 이는 벡터의 폴리뉴클레오타이드의 sFGFR3 폴리펩타이드 내로의 번역을 일으킨다. 벡터의 하나의 유형은 "플라스미드"이며, 이는 추가적인 DNA 분절이 결찰될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 나타낸다. 소정 벡터는 이들이 도입되는 숙주 세포 내에서 자가 복제할 수 있다(예컨대, 박테리아의 복제 기원 및 에피솜 포유류 벡터를 갖는 박테리아 벡터). 다른 벡터(예컨대, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포 내로의 도입 시 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이에 따라 숙주 게놈을 따라 복제된다. 또한, 소정 벡터는 이들이 작동 가능하게 연결되는 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 일반적으로, 재조합 DNA 기법에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태이다.
용어 "단위 투여량 형태(들)"는 인간 대상체 및 다른 포유동물에 대한 단위 투여량으로 적합한 물리적 개별 단위(들)를 나타내며, 각각의 단위는 임의의 적합한 약제학적 부형제, 담체, 또는 희석제와 함께, 요망되는 치료 효과를 생성하기 위해 계산된 사전 결정된 양의 활성 물질을 함유한다.
본원에서 종결점에 의한 수치 범위의 인용은 그 범위 내에 포섭되는 모든 수치를 포함하려는 것이다(예컨대, 1 내지 5의 인용에는 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.80, 4, 및 5가 포함된다).
본 발명의 다른 특징 및 장점은 하기 상세한 설명 및 청구범위로부터 자명할 것이다.
도 1a 내지 도 1d는 sFGFR3 폴리펩타이드의 센서그램을 나타내는 그래프이다. sFGFR3_Del1(SEQ ID NO: 7), sFGFR3_Del4(SEQ ID NO: 1), 및 sFGFR3_Del4-LK1-LK2(SEQ ID NO: 10; 도 1a); sFGFR3_Del1(SEQ ID NO: 7) 및 sFGFR3_Del1-D3(SEQ ID NO: 9; 도 1b); sFGFR3_Del4-LK1-LK2(SEQ ID NO: 10), sFGFR3_Del4-LK1-LK2-C253S(SEQ ID NO: 11), 및 sFGFR3_Del4-LK1-LK2-D3(SEQ ID NO: 12; 도 1c); 및 sFGFR3_Del4(SEQ ID NO: 1), sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), 및 sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33; 도 1d)에 대한 센서그램을 나타낸다.
도 2a 내지 도 2c는 sFGFR3 폴리펩타이드의 웨스턴 블롯 이미지이다. sFGFR3_Del1, sFGFR3_Del1-C253S(SEQ ID NO: 8), 및 sFGFR3_Del1-D3(도 2a); sFGFR3_Del4-LK1-LK2, sFGFR3_Del4-LK1-LK2-C253S, 및 sFGFR3_Del4-LK1-LK2-D3(도 2b); 및 sFGFR3_Del4, sFGFR3_Del4-C253S, 및 sFGFR3_Del4-D3(도 2c)에 대한 환원성(R) 및 비-환원성(NR) 조건 하의 웨스턴 블롯을 나타낸다.
도 3a 및 도 3b는 FGF2의 존재 하에 Fgfr3 ach/+ 연골 세포를 사용하는 sFGFR3_Del4, sFGFR3_Del4-C253S, 및 sFGFR3_Del4-D3의 센서그램(도 3a) 및 증식 검정(도 3b)을 나타내는 그래프이다.
도 4는 1 ng/㎖의 hFGF2를 포함하거나 포함하지 않고 0 nM, 70 nM, 및 280 nM의 sFGFR3_Del4-D3과 인큐베이션된 FGFR3G380R을 발현하는 혈청 반응 요소-루시퍼라제(SRE-Luc) HEK 세포에서의 루시퍼라제 신호전달을 나타내는 그래프이다(0 nM의 sFGFR3_Del4-D3 대비 *은 p값 0.05 미만을 나타내며; ***은 p값 0.001 미만을 나타낸다).
도 5는 연령(일) 대비 저용량(0.25 ㎎/㎏)의 sFGFR3_Del4-D3으로의 처리 3일 후 생존 동물(야생형(wt) 및 Fgfr3 ach/+ 마우스)의 백분율을 나타내는 그래프이다. 비히클(PBS)을 수여받는 생존 wt 마우스의 백분율을 또한 나타낸다.
도 6은 야생형 FGFR3 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 5 또는 32), sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), 및 sFGFR3_Del4-D3의 변이체(SEQ ID NO: 33)의 대응하는 Ig-유사 C2-유형 도메인 1(IgI), 2(IgII), 및 3(IgIII)의 아미노산 잔기를 나타내는 이미지이다. sFGFR3_Del4-C253S에는 SEQ ID NO: 1의 위치 253에서 시스테인 잔기의 세린 잔기로의 아미노산 치환이 포함된다.
도 7a 및 도 7b는 sFGFR3 폴리펩타이드의 웨스턴 블롯 이미지이다. 2.3 ㎎/㎖ 및 23 ㎎/㎖ sFGFR3_Del1-D3(도 7a) 및 1.5 ㎎/㎖ 및 15 ㎎/㎖ sFGFR3_Del1-C253S(도 7b)에 대한 환원성(R) 및 비-환원성(NR) 조건 하의 웨스턴 블롯을 나타낸다.
도 8a 및 도 8b는 20 mM 포스페이트, 40 mM NaCl, pH 7.5 완충액 및 40 mM 시트레이트, 40 mM NaCl, pH 6.5 완충액 중 sFGFR3_Del4-C253S의 용융 온도(Tm)(도 8a) 및 20 mM 포스페이트, 40 mM NaCl, pH 7.5 완충액 및 20 mM 시트레이트, 40 mM NaCl, pH 6.5 완충액 중 sFGFR3_Del4-D3의 Tm(도 8b)을 나타내는 그래프이다.
도 9a 내지 도 9c는 sFGFR3_Del4-D3의 고속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC) 용출 프로필을 나타내는 그래프이다. 도 9a: 0분, 2시간, 및 24시간에 sFGFR3_Del4-D3의 cpm/분획(도 9a); 도 9b: 1분, 15분, 30분, 2시간, 및 24시간에 정맥내 볼루스로 투여되고 최고 피크에 대해 정상화된 sFGFR3_Del4-D3의 cpm/분획(도 9b 계속에 나타냄); 도 9c: 30분, 2시간, 4시간, 및 24시간에 피하 주사로 투여되고 최고 피크에 대해 정상화된 sFGFR3_Del4-D3의 cpm/분획(도 9c 계속에 나타냄)에 대한 FPLC 용출 프로필을 나타낸다.
도 10a 및 도 10b는 sFGFR3 폴리펩타이드의 존재 하에 Fgfr3 ach/+ 연골 세포의 증식 백분율(%)을 나타내는 그래프이다. 1 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 및 50 ㎍/㎖의 sFGFR3_Del4-D3(도 10a) 및 1 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 및 50 ㎍/㎖의 sFGFR3_Del4-C253S(도 10b)에 대한 Fgfr3 ach/+ 연골세포 증식을 나타낸다.
도 11은 피하 투여된 2.5 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3 및 정맥내 투여된 2.5 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3의 PK 프로필을 나타내는 그래프이다.
도 12는 정맥내 투여 후 30분, 120분, 및 1440분에 신장, 간, 비장, 폐, 및 심장 조직에서 125I-sFGFR3_Del4-D3의 농도를 나타내는 그래프이다. 농도는 그램 당 주사 용량의 백분율(% ID/g)로 표현된다.
도 13은 피하 투여 후 30분, 120분, 240분, 480분, 및 1440분에 신장, 간, 비장, 폐, 및 심장 조직에서 125I-sFGFR3_Del4-D3의 농도를 나타내는 그래프이다. 농도는 % ID/g로 표현된다.
도 14a 및 도 14b는 뇌 조직에서 125I-sFGFR3_Del4-D3의 농도(c) 및 분포 부피(Vd)를 나타내는 그래프이다. 혈관 함량에 대한 보정 전 및 후 125I-sFGFR3_Del4-D3의 c 및 정맥내 볼루스 후 30분, 2시간, 및 24시간에서의 분해(도 14a) 및 정맥내 볼루스 후 30분, 2시간, 및 24시간에 125I-sFGFR3_Del4-D3 및 RSA의 Vd(도 14b)를 나타낸다.
도 15는 sFGFR3_Del4-D3이 투여된 생존 Fgfr3 ach/+ 마우스의 백분율을 나타내는 그래프이다. 22일에 걸쳐 생존 야생형 마우스, 비히클로서 PBS가 투여된 Fgfr3 ach/+ 마우스, 1주 1회 2.5 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3이 투여된 Fgfr3 ach/+ 마우스, 1주 2회 2.5 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3이 투여된 Fgfr3 ach/+ 마우스, 및 1주 2회 10 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3이 투여된 Fgfr3 ach/+ 마우스를 나타낸다.
도 16은 비히클로서 PBS, 1주 1회 2.5 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3, 1주 2회 2.5 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3, 및 1주 2회 10 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3이 투여된 Fgfr3 ach/+ 마우스에서 보행 및 복식 호흡 합병증의 백분율(%)을 나타내는 그래프이다.
도 17a 내지 도 17d는 sFGFR3_Del4-D3이 투여된 Fgfr3 ach/+ 마우스의 길이를 나타내는 그래프 및 x-선 방사선촬영이다. 비히클로서 PBS가 투여된 야생형 마우스, 및 비히클로서 PBS, 1주 1회 2.5 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3, 1주 2회 2.5 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3, 및 1주 2회 10 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3이 투여된 Fgfr3 ach/+ 마우스의 축 길이(도 17a), 꼬리 길이(도 17b), 및 경골 길이(도 17c)를 나타낸다. 또한 비히클로서 PBS가 투여된 야생형 마우스 및 비히클로서 PBS, 1주 2회 2.5 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3, 및 1주 2회 10 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3이 투여된 Fgfr3 ach/+ 마우스의 x-선 방사선촬영(도 17d)을 나타낸다. 모든 측정은 밀리미터(㎜)이다.
도 18a 및 도 18b는 sFGFR3_Del4-D3이 투여된 Fgfr3 ach/+ 마우스의 두개골을 나타내는 두개 비 및 x-선 방사선촬영을 각각 나타내는 그래프이다. 비히클로서 PBS가 투여된 야생형 마우스 및 비히클로서 PBS, 1주 1회 2.5 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3, 1주 2회 2.5 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3, 및 1주 2회 10 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3이 투여된 Fgfr3 ach/+ 마우스의 두개 비(L/W)를 그래프에 나타낸다(도 18a). 비히클로서 PBS가 투여된 야생형 마우스, 비히클로서 PBS가 투여된 Fgfr3 ach/+ 마우스, 1주 2회 10 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3이 투여된 야생형 마우스, 및 1주 2회 10 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3이 투여된 Fgfr3 ach/+ 마우스의 두개골의 x-선 방사선촬영을 나타낸다(도 18b).
도 19a 내지 도 19e는 실시간으로 고정화된 SFGFR3_DEL4-D3에 대한 상이한 농도의 hFGF1, FGF2, hFGF9, hFGF18, hFGF19, 및 hFGF21의 결합에 대한 동역학 프로필을 나타내는 그래프이다. 0.5 nM 내지 12 nM 농도 hFGF1의 고정화된 SFGFR3_DEL4-D3으로(도 19a); 2 nM 내지 10 nM 농도 hFGF2의 고정화된 SFGFR3_DEL4-D3으로(도 19b); 1 nM 내지 5 nM 농도 hFGF9의 고정화된 SFGFR3_DEL4-D3으로(도 19c); 1 nM 내지 10 nM 농도 hFGF18의 고정화된 SFGFR3_DEL4-D3으로(도 19d); 2 nM 내지 20 nM 농도 hFGF19의 고정화된 SFGFR3_DEL4-D3으로(도 19e); 및 100 nM 내지 10000 nM 농도 hFGF21의 고정화된 SFGFR3_DEL4-D3으로(도 19f)의 결합에 대한 동역학 프로필을 나타낸다. 더 진한, 중첩 선은 Kd 값을 생성하기 위해 사용된 2:1 결합 모델을 나타낸다.
도 20은 유도되지 않은 야생형 ATDC5 및 FGFR3G380R을 발현하는 레트로바이러스로 감염된 ATDC5 세포의 웨스턴 블롯 이미지이다.
도 21은 3개 실험에 있어서 SFGFR3_DEL4-D3의 존재 하에 ATDC5 FGFR3G380R 세포의 증식 유도를 나타내는 그래프이다. 미처리 ATDC5 FGFR3G380R 세포를 대조군으로 사용하였다.
도 2a 내지 도 2c는 sFGFR3 폴리펩타이드의 웨스턴 블롯 이미지이다. sFGFR3_Del1, sFGFR3_Del1-C253S(SEQ ID NO: 8), 및 sFGFR3_Del1-D3(도 2a); sFGFR3_Del4-LK1-LK2, sFGFR3_Del4-LK1-LK2-C253S, 및 sFGFR3_Del4-LK1-LK2-D3(도 2b); 및 sFGFR3_Del4, sFGFR3_Del4-C253S, 및 sFGFR3_Del4-D3(도 2c)에 대한 환원성(R) 및 비-환원성(NR) 조건 하의 웨스턴 블롯을 나타낸다.
도 3a 및 도 3b는 FGF2의 존재 하에 Fgfr3 ach/+ 연골 세포를 사용하는 sFGFR3_Del4, sFGFR3_Del4-C253S, 및 sFGFR3_Del4-D3의 센서그램(도 3a) 및 증식 검정(도 3b)을 나타내는 그래프이다.
도 4는 1 ng/㎖의 hFGF2를 포함하거나 포함하지 않고 0 nM, 70 nM, 및 280 nM의 sFGFR3_Del4-D3과 인큐베이션된 FGFR3G380R을 발현하는 혈청 반응 요소-루시퍼라제(SRE-Luc) HEK 세포에서의 루시퍼라제 신호전달을 나타내는 그래프이다(0 nM의 sFGFR3_Del4-D3 대비 *은 p값 0.05 미만을 나타내며; ***은 p값 0.001 미만을 나타낸다).
도 5는 연령(일) 대비 저용량(0.25 ㎎/㎏)의 sFGFR3_Del4-D3으로의 처리 3일 후 생존 동물(야생형(wt) 및 Fgfr3 ach/+ 마우스)의 백분율을 나타내는 그래프이다. 비히클(PBS)을 수여받는 생존 wt 마우스의 백분율을 또한 나타낸다.
도 6은 야생형 FGFR3 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 5 또는 32), sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), 및 sFGFR3_Del4-D3의 변이체(SEQ ID NO: 33)의 대응하는 Ig-유사 C2-유형 도메인 1(IgI), 2(IgII), 및 3(IgIII)의 아미노산 잔기를 나타내는 이미지이다. sFGFR3_Del4-C253S에는 SEQ ID NO: 1의 위치 253에서 시스테인 잔기의 세린 잔기로의 아미노산 치환이 포함된다.
도 7a 및 도 7b는 sFGFR3 폴리펩타이드의 웨스턴 블롯 이미지이다. 2.3 ㎎/㎖ 및 23 ㎎/㎖ sFGFR3_Del1-D3(도 7a) 및 1.5 ㎎/㎖ 및 15 ㎎/㎖ sFGFR3_Del1-C253S(도 7b)에 대한 환원성(R) 및 비-환원성(NR) 조건 하의 웨스턴 블롯을 나타낸다.
도 8a 및 도 8b는 20 mM 포스페이트, 40 mM NaCl, pH 7.5 완충액 및 40 mM 시트레이트, 40 mM NaCl, pH 6.5 완충액 중 sFGFR3_Del4-C253S의 용융 온도(Tm)(도 8a) 및 20 mM 포스페이트, 40 mM NaCl, pH 7.5 완충액 및 20 mM 시트레이트, 40 mM NaCl, pH 6.5 완충액 중 sFGFR3_Del4-D3의 Tm(도 8b)을 나타내는 그래프이다.
도 9a 내지 도 9c는 sFGFR3_Del4-D3의 고속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC) 용출 프로필을 나타내는 그래프이다. 도 9a: 0분, 2시간, 및 24시간에 sFGFR3_Del4-D3의 cpm/분획(도 9a); 도 9b: 1분, 15분, 30분, 2시간, 및 24시간에 정맥내 볼루스로 투여되고 최고 피크에 대해 정상화된 sFGFR3_Del4-D3의 cpm/분획(도 9b 계속에 나타냄); 도 9c: 30분, 2시간, 4시간, 및 24시간에 피하 주사로 투여되고 최고 피크에 대해 정상화된 sFGFR3_Del4-D3의 cpm/분획(도 9c 계속에 나타냄)에 대한 FPLC 용출 프로필을 나타낸다.
도 10a 및 도 10b는 sFGFR3 폴리펩타이드의 존재 하에 Fgfr3 ach/+ 연골 세포의 증식 백분율(%)을 나타내는 그래프이다. 1 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 및 50 ㎍/㎖의 sFGFR3_Del4-D3(도 10a) 및 1 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 및 50 ㎍/㎖의 sFGFR3_Del4-C253S(도 10b)에 대한 Fgfr3 ach/+ 연골세포 증식을 나타낸다.
도 11은 피하 투여된 2.5 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3 및 정맥내 투여된 2.5 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3의 PK 프로필을 나타내는 그래프이다.
도 12는 정맥내 투여 후 30분, 120분, 및 1440분에 신장, 간, 비장, 폐, 및 심장 조직에서 125I-sFGFR3_Del4-D3의 농도를 나타내는 그래프이다. 농도는 그램 당 주사 용량의 백분율(% ID/g)로 표현된다.
도 13은 피하 투여 후 30분, 120분, 240분, 480분, 및 1440분에 신장, 간, 비장, 폐, 및 심장 조직에서 125I-sFGFR3_Del4-D3의 농도를 나타내는 그래프이다. 농도는 % ID/g로 표현된다.
도 14a 및 도 14b는 뇌 조직에서 125I-sFGFR3_Del4-D3의 농도(c) 및 분포 부피(Vd)를 나타내는 그래프이다. 혈관 함량에 대한 보정 전 및 후 125I-sFGFR3_Del4-D3의 c 및 정맥내 볼루스 후 30분, 2시간, 및 24시간에서의 분해(도 14a) 및 정맥내 볼루스 후 30분, 2시간, 및 24시간에 125I-sFGFR3_Del4-D3 및 RSA의 Vd(도 14b)를 나타낸다.
도 15는 sFGFR3_Del4-D3이 투여된 생존 Fgfr3 ach/+ 마우스의 백분율을 나타내는 그래프이다. 22일에 걸쳐 생존 야생형 마우스, 비히클로서 PBS가 투여된 Fgfr3 ach/+ 마우스, 1주 1회 2.5 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3이 투여된 Fgfr3 ach/+ 마우스, 1주 2회 2.5 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3이 투여된 Fgfr3 ach/+ 마우스, 및 1주 2회 10 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3이 투여된 Fgfr3 ach/+ 마우스를 나타낸다.
도 16은 비히클로서 PBS, 1주 1회 2.5 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3, 1주 2회 2.5 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3, 및 1주 2회 10 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3이 투여된 Fgfr3 ach/+ 마우스에서 보행 및 복식 호흡 합병증의 백분율(%)을 나타내는 그래프이다.
도 17a 내지 도 17d는 sFGFR3_Del4-D3이 투여된 Fgfr3 ach/+ 마우스의 길이를 나타내는 그래프 및 x-선 방사선촬영이다. 비히클로서 PBS가 투여된 야생형 마우스, 및 비히클로서 PBS, 1주 1회 2.5 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3, 1주 2회 2.5 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3, 및 1주 2회 10 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3이 투여된 Fgfr3 ach/+ 마우스의 축 길이(도 17a), 꼬리 길이(도 17b), 및 경골 길이(도 17c)를 나타낸다. 또한 비히클로서 PBS가 투여된 야생형 마우스 및 비히클로서 PBS, 1주 2회 2.5 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3, 및 1주 2회 10 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3이 투여된 Fgfr3 ach/+ 마우스의 x-선 방사선촬영(도 17d)을 나타낸다. 모든 측정은 밀리미터(㎜)이다.
도 18a 및 도 18b는 sFGFR3_Del4-D3이 투여된 Fgfr3 ach/+ 마우스의 두개골을 나타내는 두개 비 및 x-선 방사선촬영을 각각 나타내는 그래프이다. 비히클로서 PBS가 투여된 야생형 마우스 및 비히클로서 PBS, 1주 1회 2.5 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3, 1주 2회 2.5 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3, 및 1주 2회 10 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3이 투여된 Fgfr3 ach/+ 마우스의 두개 비(L/W)를 그래프에 나타낸다(도 18a). 비히클로서 PBS가 투여된 야생형 마우스, 비히클로서 PBS가 투여된 Fgfr3 ach/+ 마우스, 1주 2회 10 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3이 투여된 야생형 마우스, 및 1주 2회 10 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3이 투여된 Fgfr3 ach/+ 마우스의 두개골의 x-선 방사선촬영을 나타낸다(도 18b).
도 19a 내지 도 19e는 실시간으로 고정화된 SFGFR3_DEL4-D3에 대한 상이한 농도의 hFGF1, FGF2, hFGF9, hFGF18, hFGF19, 및 hFGF21의 결합에 대한 동역학 프로필을 나타내는 그래프이다. 0.5 nM 내지 12 nM 농도 hFGF1의 고정화된 SFGFR3_DEL4-D3으로(도 19a); 2 nM 내지 10 nM 농도 hFGF2의 고정화된 SFGFR3_DEL4-D3으로(도 19b); 1 nM 내지 5 nM 농도 hFGF9의 고정화된 SFGFR3_DEL4-D3으로(도 19c); 1 nM 내지 10 nM 농도 hFGF18의 고정화된 SFGFR3_DEL4-D3으로(도 19d); 2 nM 내지 20 nM 농도 hFGF19의 고정화된 SFGFR3_DEL4-D3으로(도 19e); 및 100 nM 내지 10000 nM 농도 hFGF21의 고정화된 SFGFR3_DEL4-D3으로(도 19f)의 결합에 대한 동역학 프로필을 나타낸다. 더 진한, 중첩 선은 Kd 값을 생성하기 위해 사용된 2:1 결합 모델을 나타낸다.
도 20은 유도되지 않은 야생형 ATDC5 및 FGFR3G380R을 발현하는 레트로바이러스로 감염된 ATDC5 세포의 웨스턴 블롯 이미지이다.
도 21은 3개 실험에 있어서 SFGFR3_DEL4-D3의 존재 하에 ATDC5 FGFR3G380R 세포의 증식 유도를 나타내는 그래프이다. 미처리 ATDC5 FGFR3G380R 세포를 대조군으로 사용하였다.
본 발명자들은 가용성 섬유아세포 성장 인자 수용체 3(sFGFR3) 폴리펩타이드 및 이의 변이체가 환자(예컨대, 인간, 특히 유아, 어린이, 또는 청소년)에서 골격 성장 지연 장애, 예컨대 연골무형성증을 치료하기 위해 사용될 수 있음을 발견하였다. 특히, 본 발명의 sFGFR3 폴리펩타이드는, 예컨대, SEQ ID NO: 5의 아미노산 289 내지 400 또는 SEQ ID NO: 32의 아미노산 311 내지 422의 결실을 특징으로 하여, 하기 예시적인 sFGFR3 폴리펩타이드: 위치 253에 시스테인 잔기의 세린 잔기로의 아미노산 치환을 포함하는 sFGFR3_Del4(sFGFR3_Del4-C253S; SEQ ID NO: 2) 및 연장된 Ig-유사 C2-유형 도메인 3을 포함하는 sFGFR3_Del4(sFGFR3_Del4-D3; SEQ ID NO: 33) 및 이의 변이체, 예컨대 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 갖는 sFGFR3 폴리펩타이드를 제공한다. 또한, sFGFR3 폴리펩타이드에는 신호 펩타이드가 포함될 수 있으며, 예컨대 SEQ ID NO: 18 또는 34의 아미노산 서열을 갖는 sFGFR3 폴리펩타이드가 포함될 수 있다. sFGFR3_Del4(SEQ ID NO: 1)의 설명에 대해서는 각각 이의 전문이 본원에 참조로 포함되는, U.S. 가출원 62/276,222호 및 국제 출원 PCT/US16/12553호를 참고한다.
예를 들어, sFGFR3 폴리펩타이드 및 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열과 적어도 85% 서열 동일성(예컨대, 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성)을 갖는 이의 변이체에는 SEQ ID NO: 1의 위치 253에서 시스테인 잔기를 제거하는 아미노산 치환(예컨대 sFGFR3_Del4-C253S; SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드)이 포함될 수 있다. 특히, 본 발명의 sFGFR3 폴리펩타이드에는 SEQ ID NO: 1의 위치 253에서 시스테인 잔기의, 예컨대, 세린 잔기로의 치환이 포함될 수 있다. 예를 들어, 위치 253의 시스테인 잔기는 세린 잔기, 또는 예컨대, 또 다른 보존적 아미노산 치환, 예컨대 알라닌, 글리신, 프롤린, 또는 트레오닌으로 치환된다.
sFGFR3 폴리펩타이드에는 또한 SEQ ID NO: 32의 아미노산 잔기 23 내지 357과 적어도 90%(예컨대, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성) 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열이 포함될 수 있으며, 여기서 폴리펩타이드에는 FGFR3의 신호 펩타이드 및 막통과 도메인이 없고, (i) 500개 미만의 아미노산 길이이고; (ii) 200개 이하의 연속 아미노산의 FGFR3의 세포내 도메인을 포함하고/하거나; (iii) FGFR3의 티로신 키나제 도메인이 없다(예컨대, sFGFR3_Del4-D3; SEQ ID NO: 33의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드). 환자(예컨대, 인간, 특히 유아, 어린이, 또는 청소년)에서 골격 성장 지연 장애(예컨대, 연골무형성증)를 치료하기 위해 본 발명의 sFGFR3 폴리펩타이드를 투여하는 방법이 또한 기재된다.
본 발명의 sFGFR3 폴리펩타이드, 제조 방법, 치료 방법, 조성물, 및 키트가 본원에서 기재된다.
가용성 섬유아세포 성장 인자 수용체 3(sFGFR3) 폴리펩타이드
본 발명은 골격 성장 지연 장애(예컨대, 연골무형성증)의 치료를 위해 제형화된 sFGFR3 폴리펩타이드 및 이의 변이체를 특징으로 한다. 특히, sFGFR3 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열과 적어도 85% 서열 동일성(예컨대, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성)을 가질 수 있으며, 여기서 sFGFR3 폴리펩타이드에는 SEQ ID NO: 1의 위치 253에서 시스테인 잔기를 제거하는 아미노산 치환이 포함된다(예컨대 sFGFR3_Del4-C253S; SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드). 예를 들어, SEQ ID NO: 1의 위치 253에서 시스테인 잔기는 세린 잔기 또는 보존적 아미노산 치환, 예컨대 알라닌, 글리신, 프롤린, 또는 트레오닌으로 치환된다.
sFGFR3 폴리펩타이드 및 이의 변이체에는 또한 SEQ ID NO: 2와 적어도 50% 서열 동일성(예컨대, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성)을 갖는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열의 단편(예컨대, SEQ ID NO: 2의 적어도 아미노산 1 내지 200, 1 내지 205, 1 내지 210, 1 내지 215, 1 내지 220, 1 내지 225, 1 내지 235, 1 내지 230, 1 내지 240, 1 내지 245, 1 내지 250, 1 내지 253, 1 내지 255, 1 내지 260, 1 내지 265, 1 내지 275, 1 내지 280, 1 내지 285, 1 내지 290, 또는 1 내지 300)이 포함될 수 있다. 또한, sFGFR3 폴리펩타이드에는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1 내지 301이 포함될 수 있으며, 여기서 sFGFR3 폴리펩타이드에는 SEQ ID NO: 1의 위치 253에서 시스테인 잔기의 세린 잔기로의 아미노산 치환(예컨대, SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드)이 포함된다.
sFGFR3 폴리펩타이드 및 이의 변이체에는 또한 SEQ ID NO: 33과 적어도 50% 서열 동일성(예컨대, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성)을 갖는 SEQ ID NO: 33의 아미노산 서열의 단편(예컨대, SEQ ID NO: 33의 적어도 아미노산 1 내지 200, 1 내지 210, 1 내지 220, 1 내지 230, 1 내지 240, 1 내지 250, 1 내지 260, 1 내지 270, 1 내지 280, 1 내지 290, 1 내지 300, 1 내지 310, 1 내지 320, 1 내지 330, 1 내지 340, 1 내지 340, 또는 1 내지 345)이 포함될 수 있다. 또한, SEQ ID NO: 4 또는 33의 위치 253 및/또는 SEQ ID NO: 4의 위치 316에서의 시스테인 잔기는, 존재하는 경우, 세린 잔기 또는 보존적 아미노산 치환, 예컨대 알라닌, 글리신, 프롤린, 또는 트레오닌으로 치환될 수 있다.
본원에서 기재된 결과에 기반하여, 본 발명은 특정한 sFGFR3 폴리펩타이드 또는 이의 변이체로 제한되지 않는다. 상기 논의된 예시적인 sFGFR3 폴리펩타이드 및 이의 변이체에 부가하여, 본 발명의 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33), 및 이의 변이체(SEQ ID NO: 4) 또는 신호 펩타이드(SEQ ID NO: 18 또는 34)를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드)와 유사한 결합 친화도로 하나 이상의 FGF(예컨대, FGF1(예컨대, SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드), FGF2(예컨대, SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드), FGF9(예컨대, SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드), FGF18(예컨대, SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드), FGF19(예컨대, SEQ ID NO: 38의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드), 및/또는 FGF21(예컨대, SEQ ID NO: 39의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드))에 결합하는 임의의 폴리펩타이드는, 예컨대 골격 성장 지연 장애, 예컨대, 연골무형성증을 치료하기 위한, 방법에서 사용될 수 있다. sFGFR3 폴리펩타이드는, 예를 들어, FGFR3 전사체 변이체 2의 단편(Accession No. NM_022965)에 대응하는, Ig-유사 C2-유형 도메인 3의 C-말단 절반을 인코딩하는 엑손 8 및 9, 및 막통과 도메인을 포함하는 엑손 10이 없는 FGFR3 이소형 2의 단편(예컨대, SEQ ID NO: 5 또는 32의 아미노산 서열의 단편)일 수 있다.
본 발명의 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33), 및 이의 변이체(SEQ ID NO: 4))에는 N-말단 위치에 신호 펩타이드가 포함될 수 있다. 예시적인 신호 펩타이드에는 비제한적으로 SEQ ID NO: 6의 아미노산 1 내지 22(예컨대, MGAPACALALCVAVAIVAGASS) 또는 SEQ ID NO: 35의 아미노산 1 내지 19(예컨대, MMSFVSLLLVGILFHATQA)가 포함될 수 있다. 따라서, sFGFR3 폴리펩타이드에는 N-말단 신호 펩타이드가 없는 분비된 형태, 및 N-말단 신호 펩타이드를 포함하는 분비되지 않은 형태가 둘 모두 포함된다. 예를 들면, 분비된 sFGFR3 폴리펩타이드에는 SEQ ID NO: 2, 4, 또는 33의 아미노산 서열이 포함될 수 있다. 대안적으로, sFGFR3 폴리펩타이드에는 SEQ ID NO: 18, 19, 또는 34의 아미노산 서열과 같은, 신호 펩타이드가 포함된다. 당업자는 N-말단 신호 펩타이드의 위치가 상이한 sFGFR3 폴리펩타이드에서 변할 것이며, 예를 들어 폴리펩타이드의 N-말단 상에서 처음 5개, 8개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 27개, 30개 이상의 아미노산 잔기가 포함될 수 있음을 이해할 것이다. 당업자는, 예컨대 문헌[Bendtsen et al. (J. Mol. Biol. 340(4)783-795, 2004)]에 기재되고 웹 상 cbs.dtu.dk/services/SignalP/에서 이용 가능한 것과 같은 적절한 컴퓨터 알고리즘에 의해, 신호 서열 절단 부위의 위치를 예측할 수 있다.
또한, 본 발명의 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33), 및 이의 변이체(SEQ ID NO: 4) 또는 신호 펩타이드(SEQ ID NO: 18 또는 34)를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드)는 글리코실화될 수 있다. 특히, sFGFR3 폴리펩타이드는 sFGFR3 폴리펩타이드가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키도록 변경될 수 있다. sFGFR3 폴리펩타이드에 대한 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 올리고당이 아스파라긴 잔기의 아미드 질소로 부착되는 N-연관 글리코실화는 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 4 또는 33), 및 이의 변이체의 아미노산 서열의 위치 Asn76, Asn148, Asn169, Asn203, Asn240, Asn272, 및/또는 Asn294에서 일어날 수 있다. 하나 이상의 이들 Asn 잔기는 또한 글리코실화 부위를 제거하기 위해 치환될 수 있다. 예를 들면, 올리고당이 아미노산 잔기의 산소 원자로 부착되는 O-연관 글리코실화는 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33), 이의 변이체(SEQ ID NO: 4), 및 신호 펩타이드(SEQ ID NO: 18 또는 34)를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 위치 Ser109, Thr126, Ser199, Ser274, Thr281, Ser298, Ser299, 및/또는 Thr301에서 일어날 수 있다. 또한, O-연관 글리코실화는 sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33) 및 이의 변이체(SEQ ID NO: 4)의 위치 Ser310 및/또는 Ser321에서 일어날 수 있다. 하나 이상의 이들 Ser 또는 Thr 잔기는 또한 글리코실화 부위를 제거하기 위해 치환될 수 있다.
sFGFR3 융합 폴리펩타이드
본 발명의 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33), 및 이의 변이체(SEQ ID NO: 4) 또는 신호 펩타이드(SEQ ID NO: 18 또는 34)를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드)는 이종성 폴리펩타이드로부터의 기능적 도메인(예컨대, 면역글로불린의 단편 결정화 가능 영역(Fc 영역; 예컨대 SEQ ID NO: 25 및 26의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드) 또는 인간 혈청 알부민(HSA; 예컨대 SEQ ID NO: 27의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드))에 융합되어 sFGFR3 융합 폴리펩타이드를 제공할 수 있다. 선택적으로, 가요성 링커가 sFGFR3 폴리펩타이드와 이종성 폴리펩타이드(예컨대, Fc 영역 또는 HSA), 예컨대 세린 또는 글리신-풍부 서열(예컨대, 폴리-글리신 또는 폴리-글리신/세린 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 28 및 29) 사이에 포함될 수 있다.
예를 들어, sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33), 및 이의 변이체(SEQ ID NO: 4) 또는 신호 펩타이드(SEQ ID NO: 18 또는 34)를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드)는, 예컨대, N-말단 또는 C-말단 도메인에 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 융합 폴리펩타이드일 수 있다. 특히, 유용한 Fc 영역에는 임의의 포유류(예컨대, 인간)로부터의 IgG, IgM, IgA, IgD, 또는 IgE 및 이의 다양한 서브클래스(예컨대, IgG-1, IgG-2, IgG-3, IgG-4, IgA-1, IgA-2)를 포함하는 임의의 면역글로불린 분자의 Fc 단편이 포함될 수 있다. 예를 들면, Fc 단편 인간 IgG-1(SEQ ID NO: 25) 또는 인간 IgG-1의 변이체, 예컨대 SEQ ID NO: 25의 위치 297에서 아스파라긴의 알라닌으로의 치환을 포함하는 변이체(예컨대, SEQ ID NO: 26의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드). 본 발명의 Fc 단편에는, 예를 들어, 중쇄의 CH2 및 CH3 도메인 및 힌지 영역의 임의의 부분이 포함될 수 있다. 본 발명의 sFGFR3 융합 폴리펩타이드에는 또한, 예컨대, 단량체성 Fc, 예컨대 CH2 또는 CH3 도메인이 포함될 수 있다. Fc 영역은 선택적으로 당업자에게 공지된 임의의 적절한 하나 이상의 아미노산 잔기에서 글리코실화될 수 있다. 본원에서 기재된 바와 같이 Fc 단편은 본원에 기재되는 임의의 Fc 단편에 대해 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 50개 이상의 부가, 결실, 또는 치환을 가질 수 있다.
또한, sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33), 및 이의 변이체(SEQ ID NO: 4) 또는 신호 펩타이드(SEQ ID NO: 18 또는 34)를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드)는 수용액 중 단백질의 용해도 및 안정성을 개선하는 목적을 위해 N-말단 또는 C-말단 도메인에서 다른 분자에 컨쥬게이션될 수 있다. 이러한 분자의 예에는 인간 혈청 알부민(HSA), PEG, PSA, 및 소 혈청 알부민(BSA)이 포함된다. 예를 들면, sFGFR3 폴리펩타이드는 인간 HSA(예컨대, SEQ ID NO: 27의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드) 또는 이의 단편에 컨쥬게이션될 수 있다.
sFGFR3 융합 폴리펩타이드에는 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33), 및 이의 변이체(SEQ ID NO: 4) 또는 신호 펩타이드(SEQ ID NO: 18 또는 34)를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드)와 이종성 폴리펩타이드(예컨대, Fc 영역 또는 HSA) 사이에 펩타이드 링커 영역이 포함될 수 있다. 링커 영역은 sFGFR3이 생물학적으로 활성인 채 유지되도록, 예컨대 입체적으로 장애받지 않도록 하는 임의의 서열 및 길이일 수 있다. 예시적인 링커 길이는 1개 내지 200개 아미노산 잔기, 예컨대, 1개 내지 5개, 6개 내지 10개, 11개 내지 15개, 16개 내지 20개, 21개 내지 25개, 26개 내지 30개, 31개 내지 35개, 36개 내지 40개, 41개 내지 45개, 46개 내지 50개, 51개 내지 55개, 56개 내지 60개, 61개 내지 65개, 66개 내지 70개, 71개 내지 75개, 76개 내지 80개, 81개 내지 85개, 86개 내지 90개, 91개 내지 95개, 96개 내지 100개, 101개 내지 110개, 111개 내지 120개, 121개 내지 130개, 131개 내지 140개, 141개 내지 150개, 151개 내지 160개, 161개 내지 170개, 171개 내지 180개, 181개 내지 190개, 또는 191개 내지 200개 아미노산 잔기이다. 예를 들면, 링커에는 가요성 부분, 예컨대 유의미한 고정 2차 또는 3차 구조를 갖지 않는 영역이 포함되거나 이로 구성된다. 바람직한 범위는 5개 내지 25개 및 10개 내지 20개 아미노산 길이이다. 이러한 가요성은 아미노산이 작고 아미노산쇄의 회전 또는 굴곡을 방해하는 부피가 큰 측쇄를 갖지 않는 경우, 일반적으로 증가된다. 따라서, 바람직하게는 본 발명의 펩타이드 링커는 증가된 함량의 소형 아미노산, 특히 글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌, 류신 및 이소류신을 갖는다.
예시적인 가요성 링커는, 예컨대, 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 심지어 100% 글리신 잔기를 함유하는, 글리신-풍부 링커이다. 링커는 또한, 예컨대, 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 심지어 100% 세린 잔기를 함유하는, 예컨대, 세린-풍부 링커를 함유할 수 있다. 일부 경우에서, 링커의 아미노산 서열은 글리신 및 세린 잔기만으로 구성된다. 예를 들어, 링커는 GGGGAGGGG(SEQ ID NO: 28) 또는 GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 29)의 아미노산 서열일 수 있다. 링커는 선택적으로 임의의 적절한 하나 이상의 아미노산 잔기에서 글리코실화될 수 있다. 링커는 또한 부재할 수 있으며, 여기서 FGFR3 폴리펩타이드 및 이종성 폴리펩타이드(예컨대, Fc 영역 또는 HSA)는 개입하는 잔기 없이, 직접 함께 융합된다.
sFGFR3 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드
본 발명에는 또한 환자(예컨대, 인간, 예컨대 유아, 어린이, 또는 청소년)에서 골격 성장 지연 장애(예컨대, 연골무형성증)를 치료하기 위해 사용될 수 있는 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33), 및 이의 변이체(SEQ ID NO: 4) 또는 신호 펩타이드(SEQ ID NO: 18 또는 34)를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드)를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 SEQ ID NO: 20, 21, 36, 또는 37이 포함된다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 20 또는 36의 핵산 서열일 수 있고, 이는 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), 또는 SEQ ID NO: 20 또는 36의 핵산 서열과 적어도 85% 서열 동일성(예컨대, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성)을 갖는 변이체를 인코딩한다. 또한, 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 21 또는 37의 핵산 서열일 수 있고, 이는 SEQ ID NO: 21 또는 37의 핵산 서열과 적어도 85% 서열 동일성(예컨대, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성)을 갖는, sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33)을 인코딩한다. 본 발명에는 또한 sFGFR3 융합 폴리펩타이드(예컨대, 이종성 폴리펩타이드, 예컨대 Fc 영역 또는 HSA에 융합된 sFGFR3 폴리펩타이드)를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 신호 펩타이드가 없는 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대, SEQ ID NO: 2, 4, 및 33의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드)를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 신호 펩타이드(예컨대, SEQ ID NO: 18, 19, 및 34의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드)를 갖는 sFGFR3 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 포함된다. 또한, 본 발명에는 본원에서 기재된 임의의 글리코실화 부위를 변경하기 위한 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 포함된다.
선택적으로, 본 발명의 sFGFR3 폴리뉴클레오타이드(예컨대 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33), 및 이의 변이체(SEQ ID NO: 4) 또는 신호 펩타이드(SEQ ID NO: 18 또는 34)를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드)는 핵산에서 코돈을 변경하기 위해, 특히 폴리뉴클레오타이드의 핵산 서열에 의해 인코딩되는 sFGFR3 폴리펩타이드를 변경하지 않고 숙주 유기체(예컨대, 인간)의 전형적인 코돈 사용을 반영하기 위해 코돈 최적화될 수 있다. 코돈-최적화된 폴리뉴클레오타이드(예컨대, SEQ ID NO: 20, 21, 36, 또는 37의 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드)는, 예컨대, GC 함량의 감소에 의해 및/또는 숙주 세포(예컨대, HEK 293 세포 또는 CHO 세포)에서의 발현을 위해 유전적 조작을 촉진할 수 있다. 코돈-최적화는 당업자에 의해, 예컨대 온라인 툴, 예컨대 자바 코돈 어댑션 툴(JAVA Codon Adaption Tool)(www.jcat.de) 또는 인테그레이티드 DNA 테크놀로지 툴(Integrated DNA Technologies Tool)(www.eu.idtdna.com/CodonOpt)을 사용하여 폴리뉴클레오타이드의 핵산 서열 및 코돈이 최적화될 숙주 유기체를 단순 입력하여 수행될 수 있다. 상이한 유기체의 코돈 사용은 온라인 데이터베이스, 예를 들어, www.kazusa.or.jp/codon에서 이용 가능하다.
sFGFR3 폴리펩타이드의 발현을 위한 숙주 세포
포유류 세포는 본 발명의 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33), 및 이의 변이체(SEQ ID NO: 4) 또는 신호 펩타이드(SEQ ID NO: 18 또는 34)를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드)의 발현을 위한 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 방법에서 유용한 예시적인 포유류 세포 유형에는 비제한적으로 인간 배아 신장(HEK; 예컨대, HEK 293) 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, L 세포, C127 세포, 3T3 세포, BHK 세포, COS-7 세포, HeLa 세포, PC3 세포, Vero 세포, MC3T3 세포, NS0 세포, Sp2/0 세포, VERY 세포, BHK, MDCK 세포, W138 세포, BT483 세포, Hs578T 세포, HTB2 세포, BT20 세포, T47D 세포, NS0 세포, CRL7O3O 세포, 및 HsS78Bst 세포, 또는 당분야에 공지된 임의의 다른 적합한 포유류 숙주 세포가 포함된다. 대안적으로, 대장균 세포는 sFGFR3 폴리펩타이드의 발현을 위한 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 대장균 균주의 예에는 비제한적으로 대장균 294(ATCC® 31,446), 대장균 λ 1776(ATCC® 31,537), 대장균 BL21(DE3)(ATCC® BAA-1025), 대장균 RV308(ATCC® 31,608), 또는 당분야에 공지된 임의의 다른 적합한 대장균 균주가 포함된다.
sFGFR3 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터
본 발명은 또한 상술된 임의의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 특징으로 한다. 본 발명의 벡터는 본 발명의 sFGFR3 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드(예컨대 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33), 및 이의 변이체(SEQ ID NO: 4) 또는 신호 펩타이드(SEQ ID NO: 18 또는 34)를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드)를 전달하기 위해 사용될 수 있고, 여기에는 포유류, 바이러스, 및 박테리아 발현 벡터가 포함될 수 있다. 예를 들어, 벡터는 플라스미드, 인공 염색체(예컨대 BAG, PAC, 및 YAC), 및 바이러스 또는 파지 벡터일 수 있고, 선택적으로 폴리뉴클레오타이드의 발현을 위한 프로모터, 인핸서, 또는 조절인자가 포함될 수 있다. 벡터는 또한 하나 이상의 선별 마커 유전자, 예컨대 박테리아 플라스미드의 경우, 암피실린, 네오마이신, 및/또는 카나마이신 내성 유전자 또는 진균 벡터에 대한 내성 유전자를 함유할 수 있다. 벡터는 시험관내 DNA 또는 RNA의 제조를 위해 사용될 수 있거나 벡터에 의해 인코딩되는 sFGFR3 폴리펩타이드의 제조를 위해 숙주 세포, 예컨대 포유류 숙주 세포를 전달감염시키거나 형질전환시키기 위해 사용될 수 있다. 벡터는 또한 유전자 치료법의 방법에서 생체내 사용되기 위해 채택될 수 있다.
본 발명의 sFGFR3 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드(예컨대 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33), 및 이의 변이체(SEQ ID NO: 4) 또는 신호 펩타이드(SEQ ID NO: 18 또는 34)를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드)를 전달하기 위해 사용될 수 있는 예시적인 바이러스 벡터에는 레트로바이러스, 아데노바이러스(예컨대, Ad2, Ad5, Ad11, Ad12, Ad24, Ad26, Ad34, Ad35, Ad40, Ad48, Ad49, Ad50, 및 Pan9(AdC68로도 알려짐)), 파보바이러스(예컨대, 아데노-연관 바이러스), 코로나바이러스, 음성 가닥 RNA 바이러스, 예컨대 오르토믹소바이러스(예컨대, 인플루엔자 바이러스), 랩도바이러스(예컨대, 광견병 및 소수포 구내염 바이러스), 파라믹소바이러스(예컨대 홍역 및 센다이), 양성 가닥 RNA 바이러스, 예컨대 피코나바이러스 및 알파바이러스, 및 이중 가닥 DNA 바이러스, 예컨대 아데노바이러스, 헤르페스바이러스(예컨대, 단순 헤르페스 바이러스 유형 1 및 2, 엡스타인-바 바이러스, 사이토메갈로바이러스), 및 폭스바이러스(예컨대, 백시니아, 변형된 백시니아 앙카라(MVA), 조류폭스 및 카나리폭스)가 포함된다. sFGFR3 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 전달하기 위해 유용한 다른 바이러스에는 노워크 바이러스, 토가바이러스, 플라비바이러스, 레오바이러스, 파포바바이러스, 헤파드나바이러스, 및 간염 바이러스가 포함된다. 레트로바이러스의 예에는 조류 백혈증-육종, 포유류 C-유형, B-유형 바이러스, D-유형 바이러스, HTLV-BLV 그룹, 렌티바이러스, 및 스푸마바이러스가 포함된다(Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, Third Edition, B. N. Fields, et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996).
제조 방법
본 발명의 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33), 및 이의 변이체(SEQ ID NO: 4) 또는 신호 펩타이드(SEQ ID NO: 18 또는 34)를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드)를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 당분야에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 폴리뉴클레오타이드는 분자 클로닝 방법을 사용하여 생성되며, 벡터, 예컨대 플라스미드, 인공 염색체, 바이러스 벡터, 또는 파지 벡터 내에 배치된다. 벡터는 sFGFR3 폴리펩타이드의 발현을 위해 적절한 숙주 세포 내로 폴리뉴클레오타이드를 형질전환하기 위해 사용된다.
핵산 벡터 작제 및 숙주 세포
본 발명의 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33), 및 이의 변이체(SEQ ID NO: 4) 또는 신호 펩타이드(SEQ ID NO: 18 또는 34)를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드)는 숙주 세포로부터 제조될 수 있다. sFGFR3 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드(예컨대, SEQ ID NO: 20, 21, 36, 또는 37의 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 및 이의 변이체)는 당분야에 공지된 통상적인 기법(예컨대, 형질전환, 전달감염, 전기천공, 칼슘 포스페이트 침전, 직접적 미세주사, 또는 감염)에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있는 벡터 내에 포함될 수 있다. 벡터의 선택은 부분적으로 사용될 숙주 세포에 의존한다. 일반적으로, 숙주 세포는 원핵(예컨대, 박테리아) 또는 진핵(예컨대, 포유류) 기원일 수 있다.
본 발명의 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33), 및 이의 변이체(SEQ ID NO: 4) 또는 신호 펩타이드(SEQ ID NO: 18 또는 34)를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드)를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 당분야에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 이들 방법에는 비제한적으로 올리고뉴클레오타이드-매개(또는 부위-매개) 돌연변이화 및 PCR 돌연변이화가 포함된다. sFGFR3 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 표준 기법, 예컨대 유전자 합성을 사용해서 수득될 수 있다. 대안적으로, 야생형 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대, SEQ ID NO: 5 또는 32의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드)를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 당분야의 표준 기법, 예컨대, QuikChange™ 돌연변이화를 사용하여 특정 아미노산 치환(예컨대, SEQ ID NO: 33의 위치 253 및/또는 SEQ ID NO: 4의 위치 316에서 시스테인 잔기의 세린 잔기로의 아미노산 치환 또는 보존적 아미노산 치환, 예컨대 알라닌, 글리신, 프롤린, 또는 트레오닌)을 함유하도록 돌연변이될 수 있다. sFGFR3 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는, 예컨대, 뉴클레오타이드 합성장치 또는 PCR 기법을 사용하여 합성될 수 있다.
본 발명의 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33), 및 이의 변이체(SEQ ID NO: 4) 또는 신호 펩타이드(SEQ ID NO: 18 또는 34)를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드)를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 복제하고 발현할 수 있는 벡터 내로 삽입될 수 있다. 방법에서 유용한 예시적인 벡터에는 비제한적으로 플라스미드, 인공 염색체, 바이러스 벡터, 및 파지 벡터가 포함될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터에는 sFGFR3 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 핵산 서열을 함유하는 상술된 바이러스 벡터, 예컨대 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 또는 폭스바이러스 벡터(예컨대, 백시니아 바이러스 벡터, 예컨대 변형된 백시니아 앙카라(MVA), 아데노-연관 바이러스 벡터, 및 알파바이러스 벡터)가 포함될 수 있다. 각각의 벡터는 특정 숙주 세포와의 상용성을 위해 조정되고 최적화될 수 있는 다양한 성분을 함유할 수 있다. 예를 들어, 벡터 성분에는 비제한적으로 복제 기원, 선별 마커 유전자, 프로모터, 리보솜 결합 부위, 신호 서열, sFGFR3 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 핵산 서열, 및/또는 전사 종결 서열이 포함될 수 있다.
상술된 벡터는 당분야의 통상적인 기법, 예컨대, 형질전환, 전달감염, 전기천공, 칼슘 포스페이트 침전, 및 직접적 미세주사를 사용하여 적절한 숙주 세포(예컨대, HEK 293 세포 또는 CHO 세포) 내로 도입될 수 있다. 일단 벡터가 본 발명의 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33), 및 이의 변이체(SEQ ID NO: 4) 또는 신호 펩타이드(SEQ ID NO: 18 또는 34)를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드)의 제조를 위해 숙주 세포 내로 도입되면, 숙주 세포는 프로모터의 유도, 형질전환체의 선택, 또는 sFGFR3 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드(예컨대 SEQ ID NO: 20 및 21 및 이의 변이체)의 증폭을 위해 적절하게 변형된 통상적인 영양 배지 중에 배양된다. 치료 단백질, 예컨대 sFGFR3 폴리펩타이드의 발현 방법은 당분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Paulina Balbas, Argelia Lorence (eds.) Recombinant Gene Expression: Reviews and Protocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press; 2nd ed. 2004 (July 20, 2004) 및 Vladimir Voynov and Justin A. Caravella (eds.) Therapeutic Proteins: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) Humana Press; 2nd ed. 2012 (June 28, 2012)]을 참고한다.
sFGFR3 폴리펩타이드 제조, 회수, 및 정제
본 발명의 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33), 및 이의 변이체(SEQ ID NO: 4) 또는 신호 펩타이드(SEQ ID NO: 18 또는 34)를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드)를 제조하기 위해 사용되는 숙주 세포(예컨대, HEK 293 세포 또는 CHO 세포)는 당분야에 공지되어 있고 선택된 숙주 세포의 배양에 적합한 배지 중에 성장시킬 수 있다. 포유류 숙주 세포를 위해 적합한 배지의 예에는 최소 필수 배지(MEM), 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium: DMEM), Expi293™ 발현 배지, 우 태아 혈청(FBS)이 보충된 DMEM, 및 RPMI-1640이 포함된다. 박테리아 숙주 세포를 위해 적합한 배지의 예에는 필요한 보충물질, 예컨대 선별 제제, 예컨대, 암피실린을 포함하는 LB(Luria broth)가 포함된다. 숙주 세포는 적합한 온도, 예컨대 약 20℃ 내지 약 39℃, 예컨대, 25℃ 내지 약 37℃, 바람직하게는 37℃, 및 CO2 수준, 예컨대 5% 내지 10%(바람직하게는 8%)에서 배양된다. 배지의 pH는 주로 숙주 유기체에 따라, 일반적으로 약 6.8 내지 7.4, 예컨대, 7.0이다. 유도성 프로모터가 발현 벡터에서 사용되는 경우, sFGFR3 폴리펩타이드 발현은 프로모터의 활성화를 위해 적합한 조건 하에 유도된다.
본 발명의 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33), 및 이의 변이체(SEQ ID NO: 4) 또는 신호 펩타이드(SEQ ID NO: 18 또는 34)를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드)는 숙주 세포의 상청액으로부터 회수될 수 있다. 대안적으로, sFGFR3 폴리펩타이드는 sFGFR3 폴리펩타이드를 제거하기 위해 숙주 세포의 손상(예컨대, 삼투압 쇼크, 초음파 분쇄, 또는 용해를 사용함)에 이어 원심분리 또는 여과에 의해 회수될 수 있다. 이어서 sFGFR3 폴리펩타이드의 회수 시, sFGFR3 폴리펩타이드는 추가 정제될 수 있다. sFGFR3 폴리펩타이드는 단백질 정제 분야에 공지된 임의의 방법, 예컨대 단백질 A 친화도, 다른 크로마토그래피(예컨대, 이온 교환, 친화도, 및 크기-배제 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차별적 용해도, 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기법에 의해 정제될 수 있다(그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Process Scale Purification of Antibodies, Uwe Gottschalk (ed.) John Wiley & Sons, Inc., 2009]을 참고한다).
선택적으로, 본 발명의 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33), 및 이의 변이체(SEQ ID NO: 4) 또는 신호 펩타이드(SEQ ID NO: 18 또는 34)를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드)는 정제를 위한 검출 가능한 표지에 컨쥬게이션될 수 있다. sFGFR3 폴리펩타이드의 정제에서 사용하기 적합한 표지의 예에는 비제한적으로 단백질 태그, 형광단, 발색단, 방사선표지, 금속 콜로이드, 효소, 또는 화학발광체, 또는 생물발광체 분자가 포함된다. 특히, sFGFR3 폴리펩타이드의 정제에 유용한 단백질 태그에는 비제한적으로 크로마토그래피 태그(예컨대, 다중음이온성 아미노산으로 구성되는 펩타이드 태그, 예컨대 FLAG-태그, 또는 헤마글루티닌 "HA" 태그), 친화도 태그(예컨대, 폴리(His) 태그, 키틴 결합 단백질(CBP), 말토스 결합 단백질(MBP), 또는 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST)), 가용화 태그(예컨대, 티오레독신(TRX) 및 폴리(NANP)), 에피토프 태그(예컨대, V5-태그, Myc-태그, 및 HA-태그), 또는 형광 태그(예컨대, GFP, GFP 변이체, RFP, 및 RFP 변이체)가 포함될 수 있다.
치료 방법
환자, 예컨대 연골무형성증을 갖는 환자(예컨대, 연골무형성증을 갖는 인간)에서 골격 성장 지연 장애를 치료하는 방법이 본원에서 제공된다. 특히, 환자는 골격 성장 지연 장애(예컨대, 연골무형성증)의 하나 이상의 증상을 나타내거나, 이것이 발생할 가능성이 있는 환자이다. 방법에는 골격 성장 지연 장애를 갖는 환자, 예컨대 연골무형성증을 갖는 환자(예컨대, 연골무형성증을 갖는 인간)에게 본 발명의 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33), 및 이의 변이체(SEQ ID NO: 4) 또는 신호 펩타이드(SEQ ID NO: 18 또는 34)를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드)를 투여하는 단계가 관여된다. 특히, 방법에는 골격 성장 지연 장애를 갖는 환자, 예컨대 연골무형성증을 갖는 환자(예컨대, 연골무형성증을 갖는 인간)에게 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2) 또는 sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33)을 투여하는 단계가 관여된다. 예를 들어, 환자는 골격 성장 지연 장애를 갖는 유아 또는 어린이, 예컨대 연골무형성증을 갖는 유아, 어린이, 또는 청소년(예컨대, 연골무형성증을 갖는 인간)이다.
환자(예컨대, 인간)는 골격 성장 지연 장애(예컨대, 연골무형성증)의 증상이 나타나기 전에 또는 골격 성장 지연 장애(예컨대, 연골무형성증)의 증상이 발생한 후에 치료받을 수 있다. 특히, 본 발명의 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33), 및 이의 변이체(SEQ ID NO: 4) 또는 신호 펩타이드(SEQ ID NO: 18 또는 34)를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드)로 치료받을 수 있는 환자는 비제한적으로 짧은 사지, 짧은 몸통, 앙가발, 오리 걸음, 두개골 기형, 클로버잎 두개골, 두개골유합, 보름뼈, 손의 이상, 발의 이상, 히치하이커 엄지, 및/또는 흉부 이상을 포함하는 증상을 나타내는 환자이다. 또한, sFGFR3 폴리펩타이드로의 치료는 골격 성장 지연 장애, 예컨대 연골무형성증의 하나 이상의 상기 언급된 증상의 개선(예컨대, 미치료 환자 대비)을 일으킬 수 있다.
환자(예컨대, 인간)는 본 발명의 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33), 및 이의 변이체(SEQ ID NO: 4) 또는 신호 펩타이드(SEQ ID NO: 18 또는 34)를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드)의 투여 전에 골격 성장 지연 장애, 예컨대 연골무형성증으로 진단받을 수 있다. 또한, 골격 성장 지연 장애, 예컨대 연골무형성증을 갖는 환자는 이전에 sFGFR3 폴리펩타이드로 치료받지 않은 환자일 수 있다.
골격 성장 지연 장애
골격 성장 지연 장애는 이를 필요로 하는 환자(예컨대, 인간)에게 본원에서 기재된 바와 같이 sFGFR3 폴리펩타이드를 투여하여 치료받을 수 있다. 방법에는 본 발명의 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33), 및 이의 변이체(SEQ ID NO: 4) 또는 신호 펩타이드(SEQ ID NO: 18 또는 34)를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드)를 골격 성장 지연 장애를 갖는 환자(예컨대, 인간)에게 투여하는 단계가 관여된다. sFGFR3 폴리펩타이드로 치료받을 수 있는 골격 성장 지연 장애는 뼈의 변형 및/또는 기형을 특징으로 하며, 비제한적으로 FGFR3-관련 골격 질환이 포함될 수 있다. 특히, 환자는 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2) 또는 sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33)으로 치료받는다.
본 발명의 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33), 및 이의 변이체(SEQ ID NO: 4) 또는 신호 펩타이드(SEQ ID NO: 18 또는 34)를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드)의 투여는 비제한적으로 연골무형성증, 연골무발생증, 선단이골증, 전완하퇴말단 형성이상, 아텔로스테오제네시스(atelosteogenesis), 굴지성 형성이상, 점상 연골형성 장애증, 어깨엉덩관절 유형의 점상 연골형성 장애증, 쇄골두개골 이골증, 선천성 짧은 대퇴, 크루종 증후군, 아페르 증후군, 잭슨-바이스 증후군, 파이퍼 증후군, 크루종피부골격 증후군, 가락소실, 단지증, 굴지증, 다지증, 합지증, 이영양성 형성이상, 왜소증, 이상분절 형성이상, 내연골종증, 섬유연골형성, 섬유성 형성이상, 유전성 다발성 외골증, 저인산증, 저인산혈 구루병, 야페-리히텐슈타인 증후군, 니스트 형성이상, 니스트 증후군, 랭거-유형 전완부 형성이상, 마르팡 증후군, 맥쿤-올브라이트 증후군, 소지증, 골간단 형성이상, 잰슨-유형 골간단 형성이상, 영양변경 형성이상, 모르키오 증후군, 니페어겔트-유형 전완부 형성이상, 신경섬유종증(예컨대 유형 1(예컨대, 뼈 발현을 갖거나 뼈 발현을 갖지 않음), 유형 2, 또는 신경초종증), 골관절염, 골연골형성이상, 불완전골 생성증, 출생전후 치사 유형의 불완전골 생성증, 골화석증, 골반문증, 말초 이골증, 라인하르트 증후군, 로버트 증후군, 로비노 증후군, 짧은-갈비뼈 다지증 증후군, 짧은 신장, 선천성 척추골단 형성이상, 및 척추사지골단 형성이상을 포함하는 골격 성장 지연 장애를 치료할 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33), 및 이의 변이체(SEQ ID NO: 4) 또는 신호 펩타이드(SEQ ID NO: 18 또는 34)를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드)는 상술된 장애, 예컨대 연골무형성증을 포함하는 골격 성장 지연 장애와 연관된 증상을 치료하기 위해 사용될 수 있다. sFGFR3 폴리펩타이드로 치료받을 수 있는 골격 성장 지연 장애 증상의 비제한적 예에는 짧은 사지 및 몸통, 앙가발, 오리 걸음, 두개골 기형(예컨대, 큰 두부), 클로버잎 두개골, 두개골유합(예컨대, 두개골 내 뼈의 조기 융합), 보름뼈(예컨대, 두개골 내 뼈 간의 비정상적인 스레드-유형 연결), 손 및 발의 이상(예컨대, 다지증 또는 추가 손가락), "히치하이커" 엄지 및 비정상적인 손톱 및 발톱, 그리고 흉부 이상(예컨대, 배-모양 흉부 또는 좁은 가슴)이 포함된다. sFGFR3 폴리펩타이드의 투여에 의해 치료받을 수 있는 추가적인 증상에는 또한 골격 성장 지연 장애를 갖는 환자에서의 비-골격 비정상성, 예컨대 눈, 입, 및 귀의 이상, 예컨대 선천성 백내장, 근시, 구개열, 또는 난청; 뇌 기형, 예컨대 수두증, 공뇌증, 무뇌수두증, 또는 뇌량의 무발생; 심장 결손, 예컨대 심방 중격 결손, 동맥관 개존증, 또는 대혈관의 전위; 발달 지연; 또는 정신 장애가 포함될 수 있다.
본 발명의 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대, sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33), 및 이의 변이체(SEQ ID NO: 4) 또는 신호 펩타이드(SEQ ID NO: 18 또는 34)를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드)로의 치료는 또한 골격 성장 지연 장애(예컨대, 연골무형성증)를 갖는 환자(예컨대, 인간)의 생존을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, sFGFR3 폴리펩타이드로 치료받은 환자의 생존율은, 예컨대 수 일, 수 개월, 수 년 이상의 치료 기간에 걸쳐 골격 성장 지연 장애(예컨대, 연골무형성증)를 갖는 미치료 환자 대비 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상 증가할 수 있다. 특히, sFGFR3_Del4-D3의 투여는 골격 성장 지연 장애, 예컨대 연골무형성증을 갖는 환자(예컨대, 인간)의 생존을 증가시킬 수 있다(예컨대, 미치료 환자 대비).
FGFR3-관련 골격 질환인(예컨대, 기능-획득 FGFR3 돌연변이의 결과로 FGFR3의 과활성화에 의해 유도되거나 이와 연관됨) 임의의 골격 성장 지연 장애는 환자(예컨대, 인간)에게 본 발명의 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33), 및 이의 변이체(SEQ ID NO: 4) 또는 신호 펩타이드(SEQ ID NO: 18 또는 34)를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드)를 투여하여 치료받을 수 있다. 예를 들어, FGFR3-관련 골격 질환에는 비제한적으로 연골무형성증, 치사성 형성이상 I형(TDI), 치사성 형성이상 II형(TDII), 발달 지연 및 흑색 가시세포증을 갖는 중증 연골무형성증(SADDAN), 연골발육부전, 및 두개골유합(예컨대, y케 증후군, 크루종 증후군, 및 크루종피부골격 증후군)이 포함될 수 있다.
상이한 FGFR3-관련 골격 장애, 예컨대 연골무형성증, 연골발육부전, SADDAN, TDI, 및 TDII와 연관된 FGFR3 유전자에 돌연변이를 갖는 환자(예컨대, 인간)는 본 발명의 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33), 및 이의 변이체(SEQ ID NO: 4) 또는 신호 펩타이드(SEQ ID NO: 18 또는 34)를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드)로 치료받을 수 있다. 예를 들어, sFGFR3 폴리펩타이드는 FGFR3 유전자의 G380R, G375C, G346E 또는 S279C 돌연변이로부터 생성되는 연골무형성증을 치료하기 위해 투여될 수 있다. sFGFR3 폴리펩타이드의 투여는 하기 예시적인 FGFR3-관련 골격 장애: FGFR3 유전자의 G375C, G346E 또는 S279C 돌연변이로부터 생성되는 연골발육부전; FGFR3 유전자의 R248C, S248C, G370C, S371C, Y373C, X807R, X807C, X807G, X807S, X807W 및 K650M 돌연변이로부터 생성되는 TDI; FGFR3 유전자의 K650E 돌연변이로부터 생성되는 TDII; 및 FGFR3 유전자의 K650M 돌연변이로부터 생성되는 SADDAN을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
FGFR3 유전자에서 임의의 상기 언급된 돌연변이(예컨대, FGFR3 유전자의 G380R 돌연변이)는 본 발명의 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33), 및 이의 변이체(SEQ ID NO: 4) 또는 신호 펩타이드(SEQ ID NO: 18 또는 34)를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드)로의 치료 전에 또는 후에 환자(예컨대, 연골무형성증, 연골발육부전, SADDAN, TDI, 및 TDII를 갖는 인간)로부터의 샘플에서 검출될 수 있다. 또한, 환자의 모체 및/또는 태아 샘플(예컨대, 모체 혈액, 태반, 또는 태아 샘플로부터 수득된 태아 핵산)은 치료에 대한 이의 필요성을 결정하기 위해 FGFR3 유전자에서의 돌연변이에 대해 당분야에 공지된 방법에 의해 평가될 수 있다.
연골무형성증
연골무형성증은 인간에서 왜소증의 가장 일반적인 원인이며 본원에서 기재된 바와 같이 sFGFR3 폴리펩타이드의 투여에 의해 치료받을 수 있다. 특히, 연골무형성증은 본 발명의 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33), 및 이의 변이체(SEQ ID NO: 4) 또는 신호 펩타이드(SEQ ID NO: 18 또는 34)를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드)의 투여에 의해 치료받을 수 있다. 따라서, sFGFR3 폴리펩타이드의 투여는 비제한적으로 성장 지연, 두개골 변형, 치과 결손, 자궁목 압박(예컨대, 중추 무호흡 또는 발작으로부터, 사망의 위험을 가짐), 척추관 협착(예컨대, 다리 및 등 하부 통증), 수두증(예컨대, 뇌 단락술을 필요로 함), 만성 중이염으로 인한 청력 소실, 심혈관 질환, 신경학적 질환, 호흡기 문제, 피로, 통증, 등 하부 및/또는 척추 무감각, 및/또는 비만을 포함하는 증상의 개선을 일으킬 수 있다.
본 발명의 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33), 및 이의 변이체(SEQ ID NO: 4) 또는 신호 펩타이드(SEQ ID NO: 18 또는 34)를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드)를 사용하여 치료받는 환자에는 연골무형성증을 갖는 유아, 어린이, 및 성인이 포함될 수 있다. 특히, 유아는 종종 출생 시 연골무형성증으로 진단되며, 이에 따라 sFGFR3 폴리펩타이드로의 치료는 환자의 수명에서 최대한 빨리, 예컨대 출생 직후, 또는 출생 전(자궁 내) 시작될 수 있다.
환자(예컨대, 인간)에서 연골무형성증의 증상은 또한 환자가 본 발명의 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33), 및 이의 변이체(SEQ ID NO: 4) 또는 신호 펩타이드(SEQ ID NO: 18 또는 34)를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드)로 치료받기 전에 또는 후에 모니터링될 수 있다. 예를 들면, 연골무형성증의 증상은 방법의 수행 전 연골무형성증의 중증도 및 환자의 상태를 평가하기 위해 치료 전에 모니터링될 수 있다.
방법에는 환자에서 연골무형성증의 진단 및 연골무형성증의 증상 변화, 예컨대 환자의 체중 및 두개골 크기(예컨대, 두개골 길이 및/또는 두개골 폭)의 변화에 대한 환자를 모니터링하는 것이 포함될 수 있다. 체중 및 두개골 크기의 변화는 일정 시기, 예컨대 매월 또는 매년 1회, 2회, 3회, 4회 이상 또는 본 발명의 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33), 및 이의 변이체(SEQ ID NO: 4) 또는 신호 펩타이드(SEQ ID NO: 18 또는 34)를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드)로의 치료 과정에 걸쳐 대략 매 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 12주 또는 16주 마다 모니터링될 수 있다. 연골무형성증을 갖는 환자의 체중 및/또는 두개골 크기는 또한 치료 특이적 사건 시, 예컨대 sFGFR3 폴리펩타이드의 투여 전에 및/또는 후에 결정될 수 있다.
예를 들어, 체중 및/또는 두개골 크기는 본 발명의 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33), 및 이의 변이체(SEQ ID NO: 4) 또는 신호 펩타이드(SEQ ID NO: 18 또는 34)를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드)의 투여에 반응하여 측정될 수 있다. 체중은 저울 상에서, 바람직하게는 표준화된 방식으로, 예컨대 동일한 옷을 입거나 옷을 입지 않고 또는 하루 중 소정 시간에, 바람직하게는 공복 상태로(예컨대 아침식사 전 오전에 또는 적어도 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간 이상 공복 후) 연골무형성증을 갖는 환자를 측량하여 측정될 수 있다. 두개골 크기는 두개골의 길이, 높이, 폭, 및/또는 둘레로 나타낼 수 있다. 측정은 임의의 공지된 또는 자가-고안된 표준화된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 인간 대상체에 있어서, 두개골 둘레의 측정이 바람직하며, 이는 머리의 가능한 최대 둘레에 걸쳐(예컨대, 이마의 가장 튀어나온 부분으로부터 머리 뒤의 가장 넓은 부분까지에 걸쳐) 랩핑된 유연하고 신장 불가능한 물질, 예컨대 테이프를 사용하여 측정될 수 있다. 대상체(예컨대, 인간)의 두개골의 높이는 또한 턱의 하부부터 머리의 최상부 지점까지로 결정될 수 있다. 바람직하게는, 임의의 측정은 1회 초과로, 예컨대 적어도 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회 이상 수행된다.
sFGFR3 폴리펩타이드의 투여
본 발명의 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33), 및 이의 변이체(SEQ ID NO: 4) 또는 신호 펩타이드(SEQ ID NO: 18 또는 34)를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드)는 당분야에 공지된 임의의 경로에 의해, 예컨대 비경구 투여, 장내 투여, 또는 국소 투여에 의해 투여될 수 있다. 특히, sFGFR3 폴리펩타이드는 골격 성장 지연 장애(예컨대, 연골무형성증)를 갖는 환자에게 피하로(예컨대, 피하 주사로), 정맥내로, 근육내로, 동맥내로, 경막내로, 또는 복강내로 투여될 수 있다.
본 발명의 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33), 및 이의 변이체(SEQ ID NO: 4) 또는 신호 펩타이드(SEQ ID NO: 18 또는 34)를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드)는 유의미한 독성을 유도하지 않는, 사전 결정된 투여량, 예컨대 골격 성장 지연 장애(예컨대, 연골무형성증)를 치료하기 위한 유효량으로 환자(예컨대, 인간)에게 투여될 수 있다. 예를 들어, sFGFR3 폴리펩타이드는 약 0.002 ㎎/㎏ 내지 약 50 ㎎/㎏(예컨대, 2.5 ㎎/㎏ 내지 30 ㎎/㎏, 0.002 ㎎/㎏ 내지 20 ㎎/㎏, 0.01 ㎎/㎏ 내지 2 ㎎/㎏, .2 ㎎/㎏ 내지 20 ㎎/㎏, 0.01 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏, 10 ㎎/㎏ 내지 100 ㎎/㎏, 0.1 ㎎/㎏ 내지 50 ㎎/㎏, 0.5 ㎎/㎏ 내지 20 ㎎/㎏, 1.0 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏, 1.5 ㎎/㎏ 내지 5 ㎎/㎏, 또는 0.2 ㎎/㎏ 내지 3 ㎎/㎏) 범위의 개별 용량으로 골격 성장 지연 장애(예컨대, 연골무형성증)를 갖는 환자에게 투여될 수 있다. 특히, sFGFR3 폴리펩타이드는, 예컨대, 0.001 ㎎/㎏ 내지 50 ㎎/㎏, 예컨대 2.5 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏의 개별 용량으로 투여될 수 있다.
골격 성장 지연 장애(예컨대, 연골무형성증)를 갖는 환자(예컨대, 인간)로의 투여를 위한 본 발명의 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33), 및 이의 변이체(SEQ ID NO: 4) 또는 신호 펩타이드(SEQ ID NO: 18 또는 34)를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드)의 예시적인 용량에는, 예컨대, 0.005 ㎎/㎏, 0.01 ㎎/㎏, 0.02 ㎎/㎏, 0.05 ㎎/㎏, 0.1 ㎎/㎏, 0.2 ㎎/㎏, 0.3 ㎎/㎏, 0.4 ㎎/㎏, 0.5 ㎎/㎏, 0.6 ㎎/㎏, 0.7 ㎎/㎏, 0.8 ㎎/㎏, 0.9 ㎎/㎏, 1 ㎎/㎏, 2 ㎎/㎏, 2.5 ㎎/㎏, 3 ㎎/㎏, 3.5 ㎎/㎏, 4 ㎎/㎏, 4.5 ㎎/㎏, 5 ㎎/㎏, 5.5 ㎎/㎏, 6 ㎎/㎏, 6.5 ㎎/㎏, 7 ㎎/㎏, 7.5 ㎎/㎏, 8 ㎎/㎏, 8.5 ㎎/㎏, 9 ㎎/㎏, 9.5 ㎎/㎏, 10 ㎎/㎏, 11 ㎎/㎏, 12 ㎎/㎏, 13 ㎎/㎏, 14 ㎎/㎏, 15 ㎎/㎏, 20 ㎎/㎏, 25 ㎎/㎏, 30 ㎎/㎏, 35 ㎎/㎏, 40 ㎎/㎏, 45 ㎎/㎏, 또는 50 ㎎/㎏이 포함된다. 이들 용량은 매일, 매주, 매월, 또는 매년 1회 이상(예컨대, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회, 11회, 또는 12회 이상) 투여될 수 있다. 예를 들어, sFGFR3 폴리펩타이드는, 예컨대, 약 0.0014 ㎎/㎏/주 내지 약 140 ㎎/㎏/주, 예컨대, 약 0.14 ㎎/㎏/주 내지 약 105 ㎎/㎏/주, 또는 예컨대, 약 1.4 ㎎/㎏/주 내지 약 70 ㎎/㎏/주 범위(예컨대, 2.5 ㎎/㎏/주, 5 ㎎/㎏/주, 10 ㎎/㎏/주, 20 ㎎/㎏/주, 30 ㎎/㎏/주, 40 ㎎/㎏/주, 또는 50 ㎎/㎏/주)의 주별 투여량으로 환자에게 투여될 수 있다.
유전자 치료법
본 발명의 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33), 및 이의 변이체(SEQ ID NO: 4) 또는 신호 펩타이드(SEQ ID NO: 18 또는 34)를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드)는 또한 유전자 치료법을 통해 전달될 수 있으며, 여기서 sFGFR3 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 관심 조직으로 전달되고 생체내 발현된다. 유전자 치료 방법은, 예컨대 그 각각이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Verme et al. (Nature 389: 239-242, 1997), Yamamoto et al. (Molcular Therapy 17: S67-S68, 2009), 및 Yamamoto et al., (J. Bone Miner. Res. 26: 135-142, 2011)]에서 논의된다.
본 발명의 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33), 및 이의 변이체(SEQ ID NO: 4) 또는 신호 펩타이드(SEQ ID NO: 18 또는 34)를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드)는 sFGFR3 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 핵산 서열을 함유하는 벡터(예컨대, 플라스미드, 인공 염색체(예컨대 BAG, PAC, 및 YAC), 또는 바이러스 벡터)를 투여하여 골격 성장 지연 장애(예컨대, 연골무형성증)를 갖는 환자(예컨대, 인간)의 세포에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 또는 폭스바이러스 벡터(예컨대, 백시니아 바이러스 벡터, 예컨대 변형된 백시니아 앙카라(MVA)), 아데노-연관 바이러스 벡터, 또는 알파바이러스 벡터일 수 있다. 벡터는, 예컨대, 형질전환, 전달감염, 전기천공, 칼슘 포스페이트 침전, 또는 직접적 미세주사에 의해, 골격 성장 지연 장애(예컨대, 연골무형성증)를 갖는 환자(예컨대, 인간)의 세포 내에 들어가면, sFGFR3 폴리펩타이드의 발현을 촉진할 것이며, 이어서 세포로부터 분비된다. 본 발명에는 또한 세포-기반 치료법이 포함되며, 여기서 환자(예컨대, 인간)에는 sFGFR3 폴리펩타이드를 발현하는 세포가 투여된다.
약학 조성물
본 발명의 약학 조성물에는 본 발명의 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33), 및 이의 변이체(SEQ ID NO: 4) 또는 신호 펩타이드(SEQ ID NO: 18 또는 34)를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드), 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 및/또는 숙주 세포가 포함될 수 있다. sFGFR3 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 및/또는 숙주 세포를 포함하는 조성물은 일정 범위의 투여량으로, 다양한 제형으로, 그리고 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 담체, 또는 희석제와 조합되어 제형화될 수 있다.
본 발명의 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33), 및 이의 변이체(SEQ ID NO: 4) 또는 신호 펩타이드(SEQ ID NO: 18 또는 34)를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드), 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 및/또는 숙주 세포를 포함하는 약학 조성물은 특정 투여량, 예컨대 유의미한 독성을 유도하지 않고, 골격 성장 지연 장애(예컨대, 연골무형성증) 환자(예컨대, 인간)를 치료하기 위한 유효한 투여량으로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 약 1 ㎎/㎖ 내지 약 500 ㎎/㎖의 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대, 10 ㎎/㎖ 내지 300 ㎎/㎖, 20 ㎎/㎖ 내지 120 ㎎/㎖, 40 ㎎/㎖ 내지 200 ㎎/㎖, 30 ㎎/㎖ 내지 150 ㎎/㎖, 40 ㎎/㎖ 내지 100 ㎎/㎖, 50 ㎎/㎖ 내지 80 ㎎/㎖, 또는 60 ㎎/㎖ 내지 70 ㎎/㎖의 sFGFR3 폴리펩타이드)를 포함하도록 제형화될 수 있다.
본 발명의 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33), 및 이의 변이체(SEQ ID NO: 4) 또는 신호 펩타이드(SEQ ID NO: 18 또는 34)를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드), 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 및/또는 숙주 세포를 포함하는 약학 조성물은 다양한 형태로, 예컨대 액체 용액, 분산액 또는 현탁액, 분말, 또는 안정한 보관을 위해 적합한 다른 조직화된 구조로 제조될 수 있다. 예를 들어, 전신 또는 국소 전달을 목적으로 한 sFGFR3 폴리펩타이드를 포함하는 조성물은, 예컨대 비경구 투여(예컨대, 피하, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 또는 복강내 투여)를 위한, 주사용 또는 주입용 용액의 형태일 수 있다. 주사(예컨대, 피하 또는 정맥내 주사)용 sFGFR3 조성물은 비히클로서 멸균 용액 또는 임의의 약제학적으로 허용 가능한 액체를 사용하여 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 비히클에는 비제한적으로 멸균수, 생리 식염수, 및 세포 배양 배지(예컨대, 둘베코 변형 이글 배지(DMEM), α-변형 이글 배지(α-MEM), F-12 배지)가 포함된다. 제형화 방법은 당분야에 공지되어 있으며, 예컨대 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Banga (ed.) Therapeutic Peptides and Proteins: Formulation, Processing and Delivery Systems (2nd ed.) Taylor & Francis Group, CRC Press (2006)]을 참고한다.
본 발명의 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33), 및 이의 변이체(SEQ ID NO: 4) 또는 신호 펩타이드(SEQ ID NO: 18 또는 34)를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드), 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 및/또는 숙주 세포를 포함하는 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 담체, 또는 희석제와의 조합으로 골격 성장 지연 장애(예컨대 연골무형성증)를 갖는 환자(예컨대, 인간)에게 제공될 수 있다. 허용 가능한 부형제, 담체, 또는 희석제에는 완충액, 항산화제, 보존제, 중합체, 아미노산, 및 탄수화물이 포함될 수 있다. 수성 부형제, 담체, 또는 희석제에는 물, 물-알코올 용액, 식염수를 포함하는 에멀젼 또는 현탁액, 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스 용액, 덱스트로스와 염화나트륨 용액, 락토스를 함유하는 링거 용액을 포함하는 완충된 의학적 비경구 비히클, 및 고정유가 포함될 수 있다. 비-수성 부형제, 담체, 또는 희석제의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 어류 오일, 및 주사용 유기 에스테르이다.
약제학적으로 허용 가능한 염은 또한 본 발명의 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33), 및 이의 변이체(SEQ ID NO: 4) 또는 신호 펩타이드(SEQ ID NO: 18 또는 34)를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드), 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 및/또는 숙주 세포를 포함하는 조성물에 포함될 수 있다. 예시적인 약제학적으로 허용 가능한 염에는 무기 산의 염(예컨대, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 포스페이트, 및 설페이트) 및 유기 산의 염(예컨대, 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 및 벤조에이트)이 포함될 수 있다. 또한, 보조 성분, 예컨대 습윤제 또는 유화제 및 pH 완충 성분이 존재할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 담체, 및 희석제의 철저한 논의는 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Ed., Allen (2012)]에서 이용 가능하다.
본 발명의 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33), 및 이의 변이체(SEQ ID NO: 4) 또는 신호 펩타이드(SEQ ID NO: 18 또는 34)를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드), 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 및/또는 숙주 세포를 포함하는 약학 조성물, 예컨대 임플란트 및 미세캡슐화 전달 시스템을 포함하는 제어 방출 제형물이 또한 신속 방출에 대해 sFGFR3 폴리펩타이드를 보호할 담체와 제형화될 수 있다. 예를 들어, sFGFR3 조성물은 코아세르베이트화 기법에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조되는 마이크로캡슐, 예컨대 하이드록시메틸셀룰로스, 젤라틴, 또는 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐; 콜로이드성 약물 전달 시스템(예컨대, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노-입자, 또는 나노캡슐); 또는 매크로에멀젼에 포획될 수 있다. 또한, sFGFR3 조성물은 지속-방출 조성물로서 제형화될 수 있다. 예를 들어, 지속-방출 조성물에는 본 발명의 sFGFR3 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 또는 숙주 세포를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함될 수 있고, 여기서 매트릭스는 형상화된 물품, 예컨대 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다.
키트
본 발명의 키트에는 본원에서 기재된 바와 같이 본 발명의 하나 이상의 sFGFR3 폴리펩타이드(예컨대 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2), sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33), 및 이의 변이체(SEQ ID NO: 4) 또는 신호 펩타이드(SEQ ID NO: 18 또는 34)를 포함하는 sFGFR3 폴리펩타이드), 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 및/또는 세포가 포함될 수 있다. 예를 들어, sFGFR3 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 및/또는 세포는 액체 형태(예컨대, 물 또는 완충 염 용액, 예컨대, 2 mM 내지 20 mM의 인산나트륨, pH 6.5 또는 7.0, 및 25 mM 내지 250 mM 염화나트륨 중)로 용기(예컨대, 유리 바이알)에 존재할 수 있다. 대안적으로, sFGFR3 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 및/또는 벡터는 동결건조된 형태로 용기(예컨대, 유리 바이알)에 존재하며, 여기에는 선택적으로 동결건조된 sFGFR3 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 및/또는 세포의 투여 전 액체 형태로의 재구성을 위해 희석제(예컨대, 물 또는 완충 염 용액)가 포함될 수 있다. sFGFR3 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 및/또는 세포는 또한 본원에서 기재된 바와 같이 또 다른 제형물로 키트에 존재할 수 있다. 키트 성분은 투여를 촉진하기 위한 투여량 형태로 제공될 수 있으며, 선택적으로 투여를 위해 필요한 물질 및/또는 방법과 일관되는 환자 치료용 지침이 포함될 수 있다. 예를 들어, 키트에는 사용 지침이 포함될 수 있고, 이는 사용자(예컨대, 의사)에게 sFGFR3 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 및/또는 세포의 투여에 대해 안내한다.
실시예
하기 실시예는 본 개시를 제한하려는 것이 아니라 예시하려는 것이다. 이들 연구는 연골무형성증 및 이와 연관된 증상을 치료하기 위해, 연골무형성증을 갖는 환자(예컨대, 인간)에 대한 sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2) 및 sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33)의 sFGFR3 폴리펩타이드의 투여를 특징으로 한다.
실시예 1: sFGFR3 폴리펩타이드의 제조
sFGFR3_Del4-C253S(SEQ ID NO: 2) 및 sFGFR3_Del4-D3(SEQ ID NO: 33)을 3개의 상이한 현탁 세포 유형: HEK 293 프리스타일, CHO-S 프리스타일 세포 및 Expi CHO-S 세포에서 일시적 전달감염에 의해 제조하였다. HEK 293 프리스타일 및 CHO-S 프리스타일 세포에서의 제조를 위해, 제조업체의 지시에 따라, 폴리에틸렌이민(PEIpro®-Polyplus-전달감염)을 사용하여 전달감염을 수행하였다. 단백질을 3일 후 수확하였다. Expi CHO-S 세포에서의 sFGFR3 폴리펩타이드 제조를 위해, 고 역가 제조 프로토콜을 사용하여 제조업체에서 설명된 바와 같이 Expifectamine을 사용하여 전달감염을 수행하였다. 시간 경과를 거치고, sFGFR3 폴리펩타이드를 12일 후 최적으로 수확하였다. 이어서 50 ng의 sFGFR3 폴리펩타이드를 사용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 차단 완충액 중 1:2000 희석된 일차 항체로서 B9(항 FGFR3, sc-13121, Santa Cruz) 및 차단 완충액 중 1:5000 희석된 항-마우스 IgG 이차 항체(항-마우스 IgG, #7076, Cell signaling)로 전통적인 웨스턴 블롯 프로토콜을 사용하였다.
실시예 2: sFGFR3 폴리펩타이드의 정제
sFGFR3_Del4-C253S 및 sFGFR3_Del4-D3을 이온 교환 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피를 포함하는 2-단계 정제 공정을 사용해서 각각 정제하였다.
이온 교환 크로마토그래피를 위해, 300 ㎖의 배양 상청액을 5 ㎛ 및 0.2 ㎛ 캡슐(각각 KGF-A0504 TT 및 KMP-HEC 9204 TT, GE Healthcare)을 사용해서 직교류 여과(™ 플럭스, GE Healthcare)에 의해 정제하였다. 이어서 샘플의 전도성을 14 mS/㎝(™ 퓨어 25(GE Healthcare))까지 조정한 후, sFGFR3_Del4-C253S 또는 sFGFR3_Del4-D3을 포함하는 정제된 샘플을 20 ㎖/분으로 평형화된 컬럼 상에 로딩하였다. 사용한 컬럼은 53 ㎖의 층 부피를 갖는 HiPrep Q FF 26/10(GE Healthcare)이었다. 결합 완충액은 1X PBS였고, 용출 완충액은 PBS 1X + 1 M NaCl이었다. 컬럼을 4 컬럼 부피의 1X PBS로 세척하였다. sFGFR3_Del4-C253S 및 sFGFR3_Del4-D3의 용출을 각각 4 컬럼 부피를 사용하여 5% NaCl 및 10% NaCl의 2 단계로 수행하였다. 5% NaCl 및 10% NaCl을 둘 모두 풀링하고 직교류 여과(™ 플럭스, GE Healthcare)에 의해 농축하였다. 이어서 잔류 부피를 10분 동안 4℃, 3,900 g에서 원심분리에 의해 30 kDa 필터 상에서 농축하였다(MILLLIPORE® UFC903024 AMICON® Ultra-15 원심분리 필터 농축장치). 크기 배제 크로마토그래피를 위해, 잔류 부피를 320 ㎖의 층 부피를 갖는 HiLoad 26/600 SUPERDEX™ 200 분취용 등급(28-9893-36, GE Healthcare) 상에 로딩하였다. 로딩 부피는 12.8 ㎖을 초과하지 않았다. 용출을 1X PBS 중 수행하였다.
실시예 3: sFGFR3 폴리펩타이드의 동역학 검정 및 해리 상수(K
d
) 측정
sFGFR3_Del4-C253S 및 sFGFR3_Del4-D3의 무검정 농도 분석 및 동역학 검정을 센서 칩 CM5(GE Healthcare)로 수행하였다. 인간 FGF2(hFGF2)를 아민 커플링에 의해 약 5000 RU 수준으로 센서 칩 CM5에 공유 고정화하였다. 5000 RU를 달성하기 위해, hFGF2를 10 ㎕/분의 유속 및 농도 25 ㎍/㎖로 420초 동안 고정화하였다. 수행 완충액은 HBS-EP+완충액(GE Healthcare)이었다. 재생 완충액은 2 M 염화나트륨 pH 4.5를 함유하는 100 mM 아세트산나트륨이었다. FGF 결합, 해리 상수(Kd) 측정, 및 동역학 파라미터를 BIACORE™ T200(GE Healthcare)을 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정하였다. 동역학 검정 및 Kd 결정을 위해 사용한 모델은 1:1 결합 알고리즘이었다.
실시예 4: sFGFR3 폴리펩타이드의 증식 검정
ATDC5 및 ATDC5 FGFR3G380R 세포주를 둘 모두 폴리머 베이스(ThermoFisher Scientific, Catalog No. 165305) 함유 NUNC™ MICROWELL™ 96-웰 광학성-바닥 플레이트에 25,000 세포/㎠의 밀도로 접종하였다. 24시간 인큐베이션 기간 후, 세포를 0.5% BSA 중에서 48시간 동안 고갈시킨 후 hFGF2(Peprotech)를 포함 및 포함하지 않고 sFGFR3_Del4-C253S 또는 sFGFR3_Del4-D3으로 72시간 동안 자극하였다. 이어서 CyQUANT® Direct Cell Proliferation 검정(Molecular Probes, Catalog No. C35012)을 사용하여 세포 증식을 측정하였다. 자극 후, 웰 당 10 ㎕의 CyQUANT® Direct Cell Proliferation(Invitrogen; 1 ㎖ 1X PBS, 250 ㎕ 배경 억제인자, 및 50 ㎕ 핵 염색)을 첨가하였다. 이어서 ATDC5 및 ATDC5 FGFR3G380R 세포를 2시간 동안 암소 내 실온에서 인큐베이션하였다. VARIOSKAN™ LUX 멀티모드 마이크로플레이트 판독장치(ThermoFisher Scientific)를 사용하여 형광을 판독하였다.
실시예 5: sFGFR3 폴리펩타이드의 루시퍼라제 검정
FGFR3G380R을 발현하는 혈청 반응 요소-루시퍼라제(SRE-Luc) HEK 세포를 표준 배양 96웰 플레이트에서 100,000 세포/㎠의 밀도로 접종하였다. 이어서 세포를 0.5% 열 비활성화 우 태아 혈청(hiFBS)으로 24시간 동안 고갈시킨 후, 24 h 동안 1 ng/㎖의 hFGF2를 포함하거나 포함하지 않고 0 nm, 70 nm, 및 280 nm의 농도로 sFGFR3_Del4-D3으로 처리하였다. 배양 플레이트를 15분 동안 실온까지 평형화한 후 100 ㎕/웰의 Firefly Luc One-Step Glow 검정 작업 용액(ThermoFisher Scientific, Catalog No. 16197)을 첨가한 후, 3분 동안 600 rpm에서 진탕하였다. 플레이트를 10분 동안 실온에서 인큐베이션하고 발광 신호를 증가시키고 교차 오염을 감소시키기 위해 각각의 세포 용해액을 흰색 불투명 96웰 플레이트로 옮겼다. VARIOSKAN™ LUX 멀티모드 마이크로플레이트 판독장치(ThermoFisher Scientific)를 사용하여 발광 신호를 판독하였다.
실시예 6: sFGFR3 폴리펩타이드의 생체내 유효성 연구
돌연변이체 FGFR3의 발현이 Col2a1 프로모터/인핸서에 의해 유도되는 트랜스제닉 Fgfr3 ach/+ 동물에서 실험을 수행하였다. 마우스를 12시간 명/암 주기로 노출시키고 표준 실험실 식이 및 물에 자유롭게 접근할 수 있게 하였다. FGFR3 트랜스진의 360 bp를 증폭하는, 프라이머 5'-AGGTGGCCTTTGACACCTACCAGG-3'(SEQ ID NO: 30) 및 5'-TCTGTTGTGTTTCCTCCCTGTTGG-3'(SEQ ID NO: 31)을 사용하는 게놈 DNA의 PCR에 의해 유전형을 확인하였다.
CHO 세포를 사용하여 제조된 sFGFR3_Del4-D3을 1주 2회 0.25 ㎎/㎏의 피하 용량으로 평가하였다. 3일차에, 하나의 한배새끼로부터의 모든 신생 마우스가 동일 용량을 수여받았다. 대조군 한배새끼는 10 ㎕의 PBS(비히클)를 수여받았다. 이후, 교대로 등의 왼쪽 및 오른쪽 측면 상에, sFGFR3_Del4-D3(0.25 ㎎/㎏)의 피하 주사를 3주 동안 1주 2회 투여하였다. 마우스를 보행 및 배뇨 변경에 대해 특히 주의하여 매일 관찰하였다. 교배를 수행하여 야생형 절반 및 이종접합성 Fgfr3 ach/+ 마우스 절반을 갖는 한배새끼를 생성하였다. 표현형 침투 변이로 인한 편향을 피하기 위해, 동일 종축으로부터 적어도 2개의 한배새끼(처리된 한배새끼 및 대조군 한배새끼)에서 실험을 수행하였다. 이전 데이터는 수컷 및 암컷 간 통계적 차이가 없음을 시사하였고, 이에 따라 수컷 및 암컷이 모든 분석에서 하나의 군으로 간주되었다.
22일차에, 모든 동물을 펜토바르비탈의 치사 주사로 희생시키고, 성별을 결정하였다. 연구자 편향을 피하기 위해, 마우스 유전형을 모르는 채 모든 후속 측정 및 분석을 수행하였다. 연구 말기에 유전형 분석을 수행하여 데이터와 특정 유전형의 관련성을 드러내었다. 연골무형성증은 표현형 변동성을 갖는 질환이므로, 모든 동물이 연구에 포함되었다. 22일 전에 사망한 동물을 사용하여 조기 사망에 대한 치료의 영향을 조사하였다. 22일차의 생존 동물을 모든 분석을 위해 사용하였다. 모든 실험 및 데이터 측정은 모든 시점에서 맹검 실험에 의해 수행하였다.
22일차에 희생시킨 후, 체중을 측정하였다. 시체의 가죽을 조심스럽게 벗기고, 창자를 빼내고, 골격 측정을 X-선에 기반하여 수행하였다. 장기를 수확하고, 측량하고, 표준 파라핀-포매 기법을 사용하여 추가 조직학 분석을 위해 10% 포르말린 중에 보관하였다. 이어서 장기를 거시적 비정상성, 예컨대 색상 또는 텍스처의 변형 및 결절의 존재에 대해 관찰하였다. 모든 동물 실험 동안 실험실 동물 관리 원칙(NIH 공보 번호 85-23, 1985년 개정; http://grants1.nih.gov/grants/olaw/references/phspol.htm) 및 과학적 목적을 위해 사용되는 동물의 보호를 위한 유럽 연합 가이드라인(http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/legislation_en.htm)을 따랐다. 모든 절차는 실험실 동물의 사용을 위한 기관 윤리 위원회의 승인을 받았다(CIEPAL Azur)(승인 # NCE-2012-52).
실시예 7: sFGFR3 폴리펩타이드를 제조하기 위해 사용된 세포주가 활성에 영향을 미치지 않았음
현탁 HEK 293 세포 또는 CHO 세포에서 제조된 sFGFR3_Del1(SEQ ID NO: 7), sFGFR3_Del4(SEQ ID NO: 1), 및 sFGFR3_Del4-LK1-LK2(SEQ ID NO: 10)의 FGF2 결합 활성, Kd, 및 세포 신호전달에 대한 효과를 비교하였다. HEK 293 세포 또는 CHO 세포는 단백질의 번역-후 변형이 상이하다. 상이한 세포주에서 sFGFR3 폴리펩타이드의 발현은 Kd, 결합 활성, 또는 세포내 신호전달 억제에 대한 sFGFR3 폴리펩타이드의 효과에 영향을 미치지 않았다(도 1a 내지 도 1d).
실시예 8: sFGFR3_Del4-C253S 및 sFGFR3_Del4-D3의 개선된 제조
sFGFR3_Del1(SEQ ID NO: 7), sFGFR3_Del4(SEQ ID NO: 1), 및 sFGFR3_Del4-LK1-LK2(SEQ ID NO: 10)의 sFGFR3 폴리펩타이드를 각각 위치 253에서 시스테인 잔기의 세린 잔기로의 아미노산 치환 또는 연장된 Ig-유사 C2-유형 도메인 3(SEQ ID NO: 33)을 포함하도록 변형하였다. 응집이 여전히 가시적이었으므로, sFGFR3_Del1 및 sFGFR3_Del4-LK1-LK2의 이러한 변형은 sFGFR3 폴리펩타이드의 제조에 영향을 미치지 않거나 최소 효과를 가졌다(각각 도 2a 및 도 2b). 놀랍게도, 위치 253에서 시스테인 잔기의 세린 잔기로의 아미노산 치환(sFGFR3_Del4-C253S) 또는 연장된 Ig-유사 C2-유형 도메인 3(SEQ ID NO: 33)을 포함시키는 sFGFR3_Del4의 변형은 sFGFR3 폴리펩타이드의 제조를 개선하였다. 특히, 환원성 및 비-환원성 조건 하에 둘 모두에서 sFGFR3_Del4-C253S 및 sFGFR3_Del4-D3의 최소 응집이 존재하였다(도 2c). C253S 또는 D3의 포함은 또한 sFGFR3_Del4 대비, sFGFR3_Del4-C253S 제조에서 2배 증가 및 sFGFR3_Del4-D3 제조에서 3배 증가의 상대적인 제조 증가를 초래하였다.
또한, sFGFR3_Del4, sFGFR3_Del4-C253S, 및 sFGFR3_Del4-D3은 유사한 Kd를 나타내었고, 번역 후 변형에서 세포 유형 특이적 변화에 의해 영향받지 않았다. Expi CHO 세포에서, sFGFR3_Del4의 Kd는 0.8 nM이었고, sFGFR3_Del4-C253S의 Kd는 0.6 nM이었고, sFGFR3_Del4-D3의 Kd는 0.7 nM이었다(도 3a 및 표 1).
[표 1]
실시예 9: sFGFR3_Del4-C253S 및 sFGFR3_Del4-D3이 시험간내 동등 활성임
sFGFR3_Del4, sFGFR3_Del4-C253S, 및 sFGFR3_Del4-D3은 FGFR3ach 돌연변이를 과발현하도록 유전적으로 변형된 ATDC5 세포(ATDC5 FGFR3G380R 세포주)의 증식을 복원하였다. 36 nM의 용량으로, sFGFR3_Del4는 HEK 293 세포를 사용하여 115.5%의 증가된 증식을 일으켰고, sFGFR3_Del4는 CHO-S 세포를 사용하여 116%의 증가된 증식을 일으켰고, sFGFR3_Del4-C253S는 CHO-S 세포를 사용하여 114.4%의 증가된 증식을 일으켰고, sFGFR3_Del4-D3은 CHO-S 세포를 사용하여 120.1%의 증가된 증식을 일으켰다(도 3b).
sFGFR3_Del4-D3을 또한 1 ng/㎖의 hFGF2를 포함하거나 포함하지 않고, 0 nM, 70 nM, 및 280 nM의 용량으로 FGFR3G380R 발현 SRE(-Luc) HEK 세포주에서 평가하였다(도 4; n = 8). 도 4에 나타낸 데이터는 평균 +/- 평균의 표준 편차(SEM)이다. 이들 데이터는 정규 법칙을 따랐으며, D'Agostino-Pearson 옴니버스 정규성 평가에 기반하여 동일 분산을 갖는다. sFGFR3_Del4-D3을 포함하는 및 포함하지 않는 통계 비교를 스튜던트 t-평가를 사용하여 수행하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, sFGFR3_Del4-D3은 SRE 세포주에서 루시퍼라제 신호전달을 감소시킨다.
실시예 10: sFGFR3_Del4-D3이 연골무형성증을 갖는 마우스에서 뼈 성장을 복원하고, 사망을 방지하고, 대공 형태를 복원함
저용량(0.25 ㎎/㎏)의 sFGFR3_Del4-D3을 사용하여 실시예 6에서와 같이 생체내 유효성 연구를 수행하였다. 총 60마리의 마우스가 비히클 군에 포함되었으며, 32마리는 야생형(wt) 마우스이고 28마리는 Fgfr3 ach/+ 마우스였다. 처리군에는 40마리 마우스가 포함되었으며, 19마리는 wt 마우스이고 21마리는 Fgfr3 ach/+ 마우스였다. 놀랍게도, 저용량의 sFGFR3_Del4-D3은 연골무형성증 마우스의 조기 사망을 거의 완전히 방지하였다(도 5). 대조군에서, 53.6%의 Fgfr3 ach/+ 마우스는 이유 전에 사망한 반면, 처리군에서는 4.8%의 마우스만 22일 전에 사망하였고, 20%의 마우스는 0.25 ㎎/㎏의 sFGFR3_Del1의 처리 후 사망하였다(표 2; 또한 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Garcia et al. Sci. Transl. Med. 5:203ra124, 2013]을 참고한다).
sFGFR3_Del4-D3은 또한 축 및 충수 골격 상에서 wt 및 Fgfr3 ach/+ 마우스 간 초기 불일치의 교정과 더불어 뼈 성장을 부분적으로 복원시켰다(표 2). 저용량의 sFGFR3_Del1 처리의 이전 결과와 대조적으로, 저용량의 sFGFR3_Del4-D3 처리는 정상 대공 형태를 복원시켰다.
[표 2]
실시예 11 : sFGFR3_Del4-C253S의 투여에 의한 연골무형성증의 치료
연골무형성증을 겪는 인간 환자(예컨대, 유아, 어린이, 청소년, 또는 성인)는 수 일, 수 주, 수 개월, 또는 수 년의 과정에 걸쳐 특정 투여량(예컨대, 0.0002 ㎎/㎏/일 내지 약 20 ㎎/㎏/일, 예컨대 0.001 ㎎/㎏/일 내지 7 ㎎/㎏/일)으로 적절한 경로에 의해(예컨대, 피하 주사에 의해) sFGFR3_Del4-C253S(도 6; SEQ ID NO: 2)를 투여하여 치료받을 수 있다. sFGFR3_Del4-C253S로 치료받는 연골무형성증의 진행은 하나 이상의 몇몇 확립된 방법에 의해 모니터링될 수 있다. 의사는 치료에 반응하여 환자가 나타내는 연골무형성증의 증상이 어떻게 변화했는지를 평가하기 위해 직접 관찰에 의해 환자를 모니터링할 수 있다. 예를 들면, 의사는 일정 시기, 예컨대 매월 또는 매년 1회, 2회, 3회, 4회 이상 또는 sFGFR3_Del4-C253S로의 치료 과정에 걸쳐 대략 매 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 12주, 또는 16주에 걸쳐 환자의 체중, 두개골 길이, 및/또는 두개골 폭의 변화를 모니터링할 수 있다. 환자의 체중 및/또는 두개골 크기 또는 이의 변화는 또한 치료 특이적 사건, 예컨대 sFGFR3_Del4-C253S의 투여 전에 및/또는 후에 결정될 수 있다. 예를 들어, 체중 및/또는 두개골 크기는 sFGFR3_Del4-C253S의 투여에 반응하여 측정된다.
실시예 12: sFGFR3_Del4-D3의 투여에 의한 연골무형성증의 치료
또한, 연골무형성증을 겪는 인간 환자(예컨대, 유아, 어린이, 청소년, 또는 성인)는 수 일, 수 주, 수 개월, 또는 수 년의 과정에 걸쳐 특정 투여량(예컨대, 0.0002 ㎎/㎏/일 내지 약 20 ㎎/㎏/일, 예컨대 0.001 ㎎/㎏/일 내지 7 ㎎/㎏/일)으로 적절한 경로에 의해(예컨대, 피하 주사에 의해) sFGFR3_Del4-D3의 sFGFR3 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 33)의 투여에 의해 치료받을 수 있다. sFGFR3_Del4-D3으로 치료받는 연골무형성증의 진행은 하나 이상의 몇몇 확립된 방법에 의해 모니터링될 수 있다. 의사는 치료에 반응하여 환자가 나타내는 연골무형성증의 증상이 어떻게 변화했는지를 평가하기 위해 직접 관찰에 의해 환자를 모니터링할 수 있다. 예를 들면, 의사는 일정 시기, 예컨대 매월 또는 매년 1회, 2회, 3회, 4회 이상 또는 sFGFR3_Del4-D3으로의 치료 과정에 걸쳐 대략 매 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 12주, 또는 16주에 걸쳐 환자의 체중, 두개골 길이, 및/또는 두개골 폭의 변화를 모니터링할 수 있다. 환자의 체중 및/또는 두개골 크기 또는 이의 변화는 또한 치료 특이적 사건, 예컨대 sFGFR3_Del4-D3의 투여 전에 및/또는 후에 결정될 수 있다. 예를 들어, 체중 및/또는 두개골 크기는 sFGFR3_Del4-D3의 투여에 반응하여 측정된다.
실시예 13: sFGFR3_Del4-D3 및 sFGFR3_Del4-C253S의 제조
sFGFR3_Del4-D3 및 sFGFR3_Del4-C253S 폴리펩타이드를 실시예 2에 기재된 바와 같이 정제하였다. 연장된 Ig-유사 C2-유형 도메인 3(FGFR3_Del4-D3) 또는 위치 253에서 시스테인 잔기의 세린 잔기로의 아미노산 치환(sFGFR3_Del4-C253S)을 포함하는 sFGFR3_Del4의 변형은 sFGFR3 폴리펩타이드의 제조를 개선하였다. 특히, 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 사용하는 환원성 및 비-환원성 조건 하에 둘 모두 sFGFR3_Del4-D3 및 sFGFR3_Del4-C253S의 약 2% 미만 응집이 존재하였다(FGFR3_Del4-D3에 있어서 2.3 ㎎/㎖ 또는 23 ㎎/㎖ 및 sFGFR3_Del4-C253S에 있어서 1.5 ㎎/㎖ 및 15 ㎎/㎖의 농도를 사용하는 로딩 하에 관찰됨)(SDS-PAGE; 각각 도 7a 및 도 7b). 공급-배치 배양에서 sFGFR3_Del4-D3 및 sFGFR3_Del4-C253S의 제조 후, 모세관 전기영동을 사용하여 최상위 5개 클론을 분리하여 각각 0.93 g/L 내지 1.0 g/L 및 0.98 g/L 내지 1.1 g/L의 sFGFR3_Del4-D3 및 sFGFR3_Del4-C253S를 산출하였다. 이온-교환 크로마토그래피를 사용하는 바이러스 여과는 sFGFR3_Del4-D3 및 sFGFR3_Del4-C253S 둘 모두에 대해 60% 초과의 수율을 생성하였다.
실시예 14: 생체내 sFGFR3_Del4-D3의 약물동력학 및 조직 분포
sFGFR3_Del4-D3의 약물동력학 파라미터, 혈액 뇌 장벽을 거친 sFGFR3_Del4-D3의 흡수, 및 신장, 간, 비장, 폐, 및 심장에서 sFGFR3_Del4-D3의 조직 분포를 조사하기 위해 생체내 연구를 수행하였다. 본원에서 기재된 연구에는 부문 당 5개 군의 C57BL/6J 마우스 및 군 당 총 4마리 마우스(n = 4)를 갖는, 4개 부문이 포함되었다(표 3). 마우스는 수컷이었고, 25그램 내지 30그램으로 측량되었다.
[표 3]
군 1은 1분, 15분, 및 30분에 샘플링하였고; 군 2는 4시간에 샘플링하였고; 군 3은 24시간에 샘플링하였고; 군 4는 36시간에 샘플링하였고; 군 5는 48시간에 샘플링하였다. 군 1에 있어서, 유치 동맥내 카테터(PE-10)를 이소플루란 마취 하에 하나의 총 경동맥 내로 삽입하고, 30분 최종 샘플링 시점에 반복 혈액 샘플링을 위해 사용하였다. 정맥내 주사를 위해, 125I-sFGFR3_Del4-D3을 경정맥 내로 정맥내 주사하고, 이를 이소플루란 마취 하에 피부 절개에 의해 노출시켰다. 군 1 마우스는 실험 동안 마취 하에 유지하였다. 반복 혈액 샘플(2x 약 50 ㎕)을 정맥내 주사 1분 및 15분 후 동맥 카테터로부터 인출하였다. 군 2 내지 5에 있어서, 125I-sFGFR3_Del4-D3의 주사 후, 피부를 수술 클립으로 폐쇄하고, 마우스가 깨어나도록 두고 우리로 복귀시켰다. 군 3에 있어서 종결 시간 5분 전에, 마우스를 재마취하고 경정맥 내로 3H-알부민의 정맥내 볼루스를 수여하였다. 3H 추적자 용량을 표적화하여 혈중 125I 대 3H의 비를 산출하였고, 이는 이후 샘플링 시간에 더 낮은 용량으로의 이중 동위원소 표지화에 적합하다. 최종 샘플링 시간(2시간, 3시간, 24시간, 36시간, 및 48시간)에, 혈액 샘플을 수집하고, 동물을 안락사시켰다. 균질화 및 추적자의 조직 농도 결정을 위해 뇌를 샘플링하였다. 연구의 종결점에는 sFGFR3_Del4-D3에 대한 약물동력학 파라미터(최종 반감기), 혈액 뇌 장벽을 거친 sFGFR3_Del4-D3의 흡수, 및 신장, 간, 비장, 폐, 및 심장에서 sFGFR3_Del4-D3의 조직 분포가 포함되었다.
실시예 15: sFGFR3_Del4-D3 및 sFGFR3_Del4-C253S의 열 및 혈장 안정성
마우스 혈장 중 sFGFR3_Del4-D3 및 sFGFR3_Del4-C253S의 열 안정성을 시차 주사 열량측정을 사용해서 조사하였다. sFGFR3_Del4-D3에 있어서, 2개 완충액(20 mM 포스페이트, 40 mM NaCl, pH 7.5, 및 20 mM 시트레이트, 40 mM NaCl, pH 6.5)을 폴리펩타이드 샘플에 첨가하였다. sFGFR3_Del4-C253S에 있어서, 2개 완충액(20 mM 포스페이트, 40 mM NaCl, pH 7.5, 및 40 mM 시트레이트, 40 mM NaCl, pH 6.5)을 폴리펩타이드 샘플에 첨가하였다. 20 mM 포스페이트, 40 mM NaCl, pH 7.5 완충액 중 sFGFR3_Del4-C253S에 대한 용융 온도(Tm)는 52℃ 및 56℃였고, 40 mM 시트레이트, 40 mM NaCl, pH 6.5 완충액 중 sFGFR3_Del4-C253S에 대한 Tm은 55℃ 및 60℃였다(도 8a). sFGFR3_Del4-D3에 있어서, 2개 완충액(20 mM 포스페이트, 40 mM NaCl, pH 7.5, 및 20 mM 시트레이트, 40 mM NaCl, pH 6.5)을 폴리펩타이드 샘플에 첨가하였다. 20 mM 포스페이트, 40 mM NaCl, pH 7.5 완충액 중 sFGFR3_Del4-D3에 대한 Tm은 50℃ 및 54℃였고, 20 mM 시트레이트, 40 mM NaCl, pH 6.5 완충액 중 sFGFR3_Del4-D3에 대한 Tm은 53℃ 및 58℃였다(도 8b). 이들 결과는 sFGFR3_Del4-D3 및 sFGFR3_Del4-C253S가 둘 모두 폴리펩타이드 안정성 및 언폴딩의 2개 도메인을 나타냄을 시사한다.
히스티딘 태그를 갖는 sFGFR3_Del4-D3의 생체외 혈장 안정성을 Bolton-Hunter 방법을 사용하는 125I-추적자로의 정제된 sFGFR3_Del4-D3의 표지화에 이어서 PD-10(Sephadex® G-25) 컬럼 상 정제에 의해 결정하였다. 125I-추적자의 안정성을 확인하기 위해 피크 분획의 트리클로로아세트산(TCA) 침전 가능성을 또한 결정하였다. 37℃까지 사전-가온된 마우스 혈장(n = 4)에 125I-sFGFR3_Del4-D3을 약 10 cpm/㎖의 농도까지 스파이크 처리한 후 볼텍싱하였다. 혈장 샘플을 온건한 회전(300 rpm) 하에 Eppendorf ThermoMixer®에서 125I-sFGFR3_Del4-D3과 인큐베이션하였다. 이어서 분취물을 0분, 30분, 60분, 120분, 180분, 및 360분의 간격으로 TCA 침전(10 ㎕ 샘플 및 100 ㎕ 2% BSA)을 위해 그리고 고속 성능 액체 크로마토그래피(FPLC) 컬럼(20 ㎕ 샘플 및 150 ㎕ 10 mM PBS, pH 7.4) 상의 주사를 위해 수집하였다. TCA 침전 또는 FPLC 주사가 수행될 때까지 분취물을 얼음 상에 보관하였다.
TCA 침전을 위해, 1 ㎖의 빙냉 10% TCA를 혈장 샘플에 첨가하고, 얼음 상에서 10분 동안 인큐베이션하고, 5분 동안 4,000 g에서 원심분리한 후, 상청액 및 펠렛을 분리하고, 둘 모두 감마 계수기에서 계수하였다. 생체외 혈장 안정성의 평가를 위해, 100 ㎕의 샘플을 FPLC 컬럼(Superdex® 200 10/300 GL) 상에 주사하고 1.5 컬럼 부피에 대해 0.75 ㎖/분의 속도로 용출시켰다. 1 ㎖의 분획을 컬럼으로부터 수집한 후 감마 계수기에서 측정하였다. 37℃에서 sFGFR3_Del4-D3의 혈장 안정성은 0분에 95%, 2시간에 95%, 및 24시간에 약 92%로 결정되었고, 약간의 응집만을 가졌다(도 9a).
정맥내 및 피하 주사에 의한 투여 후 혈장 중 sFGFR3_Del4-D3의 생체내 안정성을 또한 결정하였다. sFGFR3_Del4-D3을 Bolton-Hunter 방법을 사용하여 125I-추적자로 표지한 후, PD-10(Sephadex® G-25) 컬럼 상에서 정제하였다. 125I-표지된 sFGFR3_Del4-D3(약 50 ㎕ PBS 중 10 μCi)을 마취된 C57BI/6 마우스 내로 정맥내 또는 피하 주사에 의해 투여하였다. 125I-추적자 단백질 용량(대략 0.1 ㎎/㎏)을 총 용량 2.5 ㎎/㎏까지 미표지 단백질로 보충하였다. 혈관 마커로 사용된 래트 혈청 알부민을 [3H]-NSP(N-숙신이니딜[2,3-3H]프로피오네이트; Perkin Elmer)로 표지하고 PD-10(Sephadex® G25) 컬럼 상에서 정제하였다.
정맥내 볼루스 주사 후 혈장 중 sFGFR3_Del4-D3의 안정성에 있어서, FPLC 용출 프로필은 최대 15분 동안 혈장 중 분해 산물을 나타내지 않았다(도 9b). sFGFR3_Del4-D3의 투여 30분 후, 소량의 저분자량 분해 산물이 나타났고, 2시간 경 증가했으나 24시간 경 대부분 소실되었다. 피하 주사 후 혈장 중 sFGFR3_Del4-D3의 안정성에 있어서, FPLC 용출 프로필은 30분에 혈장 중 일부 분해 산물을 나타내었고, 2시간 및 4시간 경 분해가 증가되었다(도 9c). 24시간 후 혈장에 남아있는 소량의 추적자는 대부분 온전한 sFGFR3_Del4-D3 폴리펩타이드인 것으로 나타난다. 도 9b 및 9c에 있어서 하부 패널 크로마토그램은 용출 패턴의 더 용이한 비교를 위해 각각의 개별 수행에서 최고 피크에 대해 정상화하여 나타낸다.
실시예 16: sFGFR3_Del4-D3 및 sFGFR3_Del4-C253S의 리간드 결합 활성
인간 FGF2에 대한 sFGFR3_Del4-D3 및 sFGFR3_Del4-C253S의 결합 친화도를 특징화하기 위해 실험을 수행하였다. FGF2에 대한 sFGFR3_Del4-D3의 해리 상수(Kd) 및 sFGFR3_Del4-C253S의 Kd를 20 mM 포스페이트, 40 mM NaCl, pH 7.5의 재생 완충액으로 실시예 3에 기재된 바와 같이 결정하였다. sFGFR3_Del4-D3 및 sFGFR3_Del4-C253S 둘 모두에 대해 13 nM, 6.5 nM, 3.25 nM, 및 1.75 nM의 농도를 평가하였다. sFGFR3_Del4-D3의 Kd는 약 3.6 nm로 결정되었고, sFGFR3_Del4-C253S의 Kd는 약 6.9 nm로 결정되었다. 이들 결과는 sFGFR3_Del4-D3 및 sFGFR3_Del4-C253S가 낮은 nM 범위에서 FGF2에 대한 결합 활성을 가짐을 시사한다.
실시예 17: sFGFR3_Del4-D3 및 sFGFR3_Del4-C253S가 시험관내 기능적 활성을 나타냄
sFGFR3_Del4-D3 및 sFGFR3_Del4-C253S의 기능적 활성을 증식 검정을 사용하여 평가하였다. FGFR3ach 돌연변이를 과발현하도록 유전적으로 변형된 ATDC5 세포(ATDC5 FGFR3G380R 세포주)를 사용하는 증식 검정을 sFGFR3_Del4-D3 및 sFGFR3_Del4-C253S에 대해 1 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 및 50 ㎍/㎖의 농도로 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행하였다. 각각의 이들 농도에서, sFGFR3_Del4-C253S 및 sFGFR3_Del4-D3은 FGFR3G380R 세포의 증식을 복원하였다(도 10a 및 도 10b). EC50은 1 ㎍/㎖의 농도에 기반하여 sFGFR3_Del4-D3 및 sFGFR3_Del4-C253S 둘 모두에 대해 약 10 nM로 결정되었다. 이들 결과는 sFGFR3_Del4-D3 및 sFGFR3_Del4-C253S가 낮은 nM 범위에서 생물학적으로 활성임을 시사한다.
실시예 18: sFGFR3_Del4-D3 및 sFGFR3_Del4-C253S의 약물동력학 프로필
2.5 ㎎/㎏의 용량으로 피하 또는 정맥내 투여된 sFGFR3_Del4-D3의 약물동력학(PK) 프로필을 사용하여 sFGFR3_Del4-D3의 최종 제거 반감기를 결정하였다(도 11). sFGFR3_Del4-D3이 피하 투여된 마우스에 대해 샘플을 30분, 2시간, 4시간, 8시간, 24시간, 36시간, 및 48시간에 수집하였다. sFGFR3_Del4-D3이 정맥내 투여된 마우스에 대해 샘플을 1분, 15분, 30분, 2시간, 24시간, 및 36시간에 수집하였다. 2.5 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3의 피하 최종 제거 반감기는 약 20시간이었던 반면, 2.5 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3의 정맥내 최종 제거 반감기는 약 7시간이었다. PK 프로필로부터, 피하 투여된 2.5 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3에 대해 Tmax는 약 8시간이었고, Cmax는 약 4.5 nM이었고, 추정된 생체이용률은 약 30%였다. sFGFR3_Del4-C253S에 대해 유사한 정맥내 PK 프로필을 가지며, 정맥내 투여된 sFGFR3_Del4-D3의 α상 동안의 신속한 제거에 이어 더 느린 β상 제거가 존재하였다.
실시예 19: 신장 및 간이 sFGFR3_Del4-D3의 주요 제거 경로임
sFGFR3_Del4-D3의 제거를 2.5 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3의 정맥내 투여 후 30분, 120분, 및 1440분 후에, 그리고 2.5 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3의 피하 투여 후 30분, 120분, 240분, 480분, 및 1440분 후에 신장, 간, 비장, 폐, 및 심장 조직에서 평가하였다. 간 및 신장이 정맥내 투여에 대한 sFGFR3_Del4-D3 제거의 주요 경로였다(도 12). 신장은 피하 투여에 대한 sFGFR3_Del4-D3 제거의 주요 경로였다(도 13).
실시예 20: sFGFR3_Del4-D3이 혈액 뇌 장벽을 통과하지 않음
야생형 마우스에서 혈액 뇌 장벽을 통한 sFGFR3_Del4-D3의 흡수를 결정하기 위해 약물동력학 연구를 또한 수행하였다. 정맥내 볼루스 주사 후, 3개 시점(30분, 2시간, 및 24시간)에서 sFGFR3_Del4-D3의 뇌 조직 흡수를 측정하였다. 2.5 ㎎/㎏ 미표지 sFGFR3_Del4-D3과 함께 sFGFR3_Del4-D3을 방사선 표지된 추적자로서 주사하였다(125I-sFGFR3_Del4-D3). 125I-sFGFR3_Del4-D3의 주사 용량은 동물 당 약 10 μCi였으며, 이는 0.1 ㎎/㎏ 미만에 대응한다. 30분, 2시간, 및 24시간에 마우스를 안락사시킨 후, 기관 및 혈장 중 125I-sFGFR3_Del4-D3의 농도를 액체 신틸레이션 계수에 의해 측정하였다.
트리클로로아세트산(TCA) 침전 가능한 물질(예컨대, 온전한 추적자)의 분율을 측정함으로써 125I-sFGFR3_Del4-D3 농도를 혈장 중 및 뇌 샘플 중 대사에 대해 보정하였다. 크기 배제 고속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC) 컬럼 상에 샘플을 주사하여 TCA 보정의 타당성을 또한 확인하였다. 동물을 희생시키기 직전에 방사선 표지된 알부민(3H-RSA)을 주사하여 125I-sFGFR3_Del4-D3의 기관 농도를 혈관내 함량(V0)에 대해 보정하였다. RSA의 겉보기 기관 분포 부피가 V0을 나타낸다. 알부민의 용량은 미미하였다(생리적 농도의 1% 수준). 뇌 이외의 모든 기관에 대해, 혈관 함량을 감산하고 혈장 중 TCA 침전 가능한 분율을 고려하여 농도를 계산하였다. 그러나, TCA 침전을 수행하지 않았으므로, 뇌 이외의 이들 기관 내로의 분해된 물질의 흡수에 대한 보정은 수행하지 않았다.
뇌 농도는 하기 공식: C뇌(보정) = [Vd(sFGFR3_Del4-D3)-V0] × C혈장(최종)에 의해 계산하였고, 식 중 Vd(sFGFR3_Del4-D3)는 뇌에서 sFGFR3_Del4-D3의 분포 부피(C뇌/C혈장으로 계산됨)이며, V0은 뇌에 분포된 알부민의 부피이고, C혈장(최종)은 최종 샘플링 시간에서의 sFGFR3_Del4-D3의 혈장 농도이다. 모든 농도를 각각 그램 또는 ㎖ 당 주사 용량의 백분율(%ID/g 또는 %ID/㎖)로 표현하였고, 정맥내 볼루스 용량은 100%이다. 이들 값에 주사 용량을 곱해서 [㎎/g] 또는 [㎎/㎖]로 전환할 수 있다: (체중 g/1000 g) × 2.5 ㎎. 모든 체중은 25 g 내지 30 g 범위였다.
임의의 측정된 시점에서의 보정된 뇌 농도(혈관 함량 및 분해(TCA 침전 가능성)에 대한 보정 후)로 나타낸 바와 같이, 125I-sFGFR3_Del4-D3의 검출 가능한 뇌 흡수는 존재하지 않았다(도 14a). 또한, RSA의 Vd(=V0) 및 125I-sFGFR3_Del4-D3은 페어링된 t-평가에 의해 결정된 바와 같이 임의의 측정된 시점(30분, 2시간, 및 24시간)에 유의미하게 상이하지 않았다(도 14b). 결론적으로, 정맥내 볼루스로 주사된 2.5 ㎎/㎏ 용량에서는 30분, 2시간, 및 24시간에 마우스 뇌 조직 내로의 sFGFR3_Del4-D3의 측정 가능한 흡수가 존재하지 않는다.
실시예 21: 연골무형성증의 치료를 위한 sFGFR3_Del4-D3의 생체내 유효성
sFGFR3_Del4-D3 및 sFGFR3_Del4-C253S를 각각 1주 1회 또는 2회 2.5 ㎎/㎏ 또는 1주 2회 10 ㎎/㎏의 피하 용량으로 평가하였다. 교배를 수행하여 절반 야생형 및 절반 이종접합성 Fgfr3 ach/+ 마우스의 30마리 한배새끼를 생성하였다(표 4).
[표 4]
3일차에, 하나의 한배새끼로부터의 모든 신생 마우스가 동일한 용량을 수여받았다. 대조군 한배새끼는 10 ㎕의 PBS(비히클)를 수여받았다. 이후, sFGFR3_Del4-D3 및 sFGFR3_Del4-C253S의 피하 주사를 1주 1회 또는 2회 2.5 ㎎/㎏ 또는 1주 2회 10 ㎎/㎏의 용량으로 3주 동안, 교대로 등의 왼쪽 및 오른쪽 측면 상에 투여하였다. 마우스를 보행 및 배뇨 변경에 특히 주의하며 매일 관찰하고 주사 일에 측량하였다. 합병증을 갖는 마우스는 감독을 위해 1일 2회 관찰하였다. 이전 데이터가 수컷 및 암컷 간에 통계적 유의차가 없음을 시사하였으므로, 수컷 및 암컷을 모든 분석에 있어서 1개 군으로 간주하였다.
22일차에, 모든 동물을 펜토바르비탈의 치사 주사로 희생시키고, 성별을 결정하였다. 연구자 편향을 피하기 위해, 마우스 유전형을 모르는 채 모든 후속 측정 및 분석을 수행하였다. 연구 말기에 데이터와 특정 유전형의 관련성을 드러내기 위해 유전형 분석을 수행하였다. 연골무형성증은 표현형 변동성을 갖는 질환이므로, 모든 동물이 연구에 포함되었다. 22일 전에 사망한 동물을 사용하여 조기 사망에 대한 치료의 영향을 조사하였다. 22일차의 생존 동물을 모든 분석을 위해 사용하였다. 모든 실험 및 데이터 측정을 모든 시점에서 맹검 실험에 의해 수행하였다.
1주 1회 또는 2회 2.5 ㎎/㎏ 또는 1주 2회 10 ㎎/㎏으로의 sFGFR3_Del4-D3의 피하 투여는 PBS를 수여받는 Fgfr3 ach/+ 마우스 대비 Fgfr3 ach/+ 마우스의 생존을 증가시켰다(도 15 및 표 4). 특히, 1주 2회 10 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3의 투여는 Fgfr3 ach/+ 마우스의 93% 생존을 초래하였고, 1주 1회 2.5 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3의 투여는 Fgfr3 ach/+ 마우스의 84% 생존을 초래하였고, 1주 2회 2.5 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3의 투여는 Fgfr3 ach/+ 마우스의 72% 생존을 초래한 반면, PBS를 수여받는 Fgfr3 ach/+ 마우스의 생존은 62.8%였다. 1주 2회 10 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3이 투여된 Fgfr3 ach/+ 마우스의 사망률은 6.7%였고, 1주 1회 2.5 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3이 투여된 Fgfr3 ach/+ 마우스의 사망률은 15.4%였고, 1주 2회 2.5 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3이 투여된 Fgfr3 ach/+ 마우스의 사망률은 28.0%였고, PBS가 투여된 Fgfr3 ach/+ 마우스의 사망률은 37.2%였다. sFGFR3_Del4-D3으로의 치료 후 Fgfr3 ach/+ 마우스 생존의 통계 분석을 t-평가에 이어 Agostino 및 Pearson 옴니버스 정규성 평가를 사용하여 수행하였다. 모든 조사군이 정규성 평가를 통과하였다. 이들 분석으로부터의 P-값을 아래에 나타내며, 여기서 *은 P-값 0.05 미만을 나타내고 ***은 P-값 0.001 미만을 나타낸다(표 5).
[표 5]
1주 1회 또는 2회 2.5 ㎎/㎏ 또는 1주 2회 10 ㎎/㎏의 sFGFR3_Del4-D3의 피하 투여는 또한 PBS를 수여받는 Fgfr3 ach/+ 마우스 대비 Fgfr3 ach/+ 마우스에서 보행 문제의 중증도 및 빈도 그리고 복식 호흡에서의 합병증을 감소시켰다(도 16). 특히, 보행 문제는 1주 2회 10 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3을 피하 투여받은 Fgfr3 ach/+ 마우스에서 가장 크게, 그리고 그 다음으로 1주 2회 sFGFR3_Del4-D3 2.5 ㎎/㎏이 투여된 마우스 및 1주 1회 sFGFR3_Del4-D3 2.5 ㎎/㎏이 투여된 마우스 순으로 감소하였다. 복식 호흡에서의 합병증은 1주 2회 10 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3을 피하 투여받은 Fgfr3 ach/+ 마우스에서 가장 크게, 그리고 그 다음으로 1주 1회 sFGFR3_Del4-D3 2.5 ㎎/㎏이 투여된 마우스, 이어서 1주 2회 sFGFR3_Del4-D3 2.5 ㎎/㎏이 투여된 마우스 순으로 감소하였다. 이들 결과는 sFGFR3_Del4-D3이 Fgfr3 ach/+ 마우스에서 연골무형성증의 증상을 감소시킴을 나타낸다.
sFGFR3_Del4-D3의 피하 투여는 또한 PBS를 수여받는 Fgfr3 ach/+ 마우스에 비해 1주 1회 또는 2회 2.5 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3 또는 1주 2회 10 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3을 수여받는 Fgfr3 ach/+ 마우스에서 축 길이 및 꼬리 길이, 및 긴 뼈를 포함하여, 전체 신체 길이를 유의미하게 증가시켰다(p = 0.07)(도 17a 내지 도 17c). 꼬리 및 신체 길이(축 길이)는 전체 골격 상에서 동일한 디지털 캘리퍼를 사용하여 측정하였다. 경골 길이는 디지털 X-선 상에서 측정하였다. 1주 2회 10 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3의 투여는 Fgfr3 ach/+ 마우스의 51% 축 보정(신체 및 꼬리 길이)에 이어, 1주 2회 2.5 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3을 수여받는 Fgfr3 ach/+에서 43% 축 보정, 그리고 1주 1회 2.5 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3을 수여받는 Fgfr3 ach/+ 마우스에서 39% 축 보정을 일으켰다. 뼈 및 신체 길이의 증가는 또한 PBS를 수여받는 Fgfr3 ach/+ 마우스에 비해 1주 2회 2.5 ㎎/㎏ 또는 10 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3이 투여된 Fgfr3 ach/+ 마우스의 x-선 방사선촬영으로부터 자명하였다(도 17d). 1주 2회 10 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3의 투여는 Fgfr3 ach/+ 마우스의 86% 충수 보정(경골 및 대퇴 길이)에 이어, 1주 2회 2.5 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3을 수여받는 Fgfr3 ach/+에서 68% 충수 보정 및 1주 1회 2.5 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3을 수여받는 Fgfr3 ach/+ 마우스에서 54% 충수 보정을 일으켰다.
sFGFR3_Del4-D3의 피하 투여는 또한 PBS를 수여받는 Fgfr3 ach/+ 마우스 대비 Fgfr3 ach/+ 마우스에서 두개 비(길이/폭(L/W))의 용량-의존적 개선을 초래하였다(도 18a). 두개 비(L/W)에 있어서 1주 2회 10 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3이 피하 투여된 Fgfr3 ach/+ 마우스가 가장 크게, 이어서 1주 2회 2 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3이 투여된 Fgfr3 ach/+ 마우스 및 1주 1회 2 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3이 투여된 Fgfr3 ach/+ 마우스가 개선을 나타내었다. 특히, 1주 2회 10 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3의 투여는 Fgfr3 ach/+ 마우스의 37% 두개골 형태 보정(L/W비)에 이어 1주 2회 2.5 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3을 수여받는 Fgfr3 ach/+에서 29% 두개골 형태 보정 및 1주 1회 2.5 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3을 수여받는 Fgfr3 ach/+ 마우스에서 19% 두개골 형태 보정을 일으켰다. 두개 비의 개선은 또한 PBS를 수여받는 Fgfr3 ach/+ 마우스 대비 10 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3을 투여받은 Fgfr3 ach/+ 마우스의 x-선 방사선촬영으로부터 자명하였다(도 18b). 신체 길이, 꼬리, 대퇴, 경골, 및 두개 비에 대한 뼈 측정(㎜ 및 평균 ± SEM으로 나타냄)을 아래에 나타낸다(표 6). 이들 결과는 Fgfr3 ach/+ 마우스의 증가된 생존, 감소된 합병증 수, 증가된 뼈 성장, 및 골격 비율의 개선에 의해 실증된 바와 같이, sFGFR3_Del4-D3의 용량-의존적인 생체내 유효성을 시사한다.
[표 6]
또한, 1주 2회 2.5 ㎎/㎏의 투여량으로 sFGFR3_Del1이 투여된 Fgfr3 ach/+ 마우스에 대한 뼈 측정의 비교는 1주 2회 2.5 ㎎/㎏의 투여량으로의 sFGFR3_Del4-D3의 투여가 Fgfr3 ach/+ 마우스의 뼈, 꼬리, 대퇴, 및 경골 길이의 증가 및 두개 비의 개선에 있어서 필적하거나 더 효과적이었음을 나타낸다(표 7). 특히, sFGFR3_Del1이 투여된 Fgfr3 ach/+ 마우스에 있어서의 134.4 ± 1.17 ㎜ 대비 sFGFR3_Del4-D3이 투여된 Fgfr3 ach/+ 마우스의 신체 길이는 135.5 ± 1.75 ㎜로 개선되었고; sFGFR3_Del1이 투여된 Fgfr3 ach/+ 마우스에 있어서의 71.58 ± 0.86 ㎜ 대비 sFGFR3_Del4-D3이 투여된 Fgfr3 ach/+ 마우스의 꼬리 길이는 73.69 ± 1.5 ㎜로 개선되었고; sFGFR3_Del1이 투여된 Fgfr3 ach/+ 마우스에 있어서의 10.01 ± 0.06 ㎜ 대비 sFGFR3_Del4-D3이 투여된 Fgfr3 ach/+ 마우스의 대퇴 길이는 10.58 ± 0.09 ㎜로 개선되었고; sFGFR3_Del1이 투여된 Fgfr3 ach/+ 마우스에 있어서의 13.27 ± 0.31 ㎜ 대비 sFGFR3_Del4-D3이 투여된 Fgfr3 ach/+ 마우스의 경골 길이는 14.09 ± 0.12 ㎜로 개선되었고; sFGFR3_Del1이 투여된 Fgfr3 ach/+ 마우스에 있어서의 1.81 ± 0.02 ㎜ 대비 sFGFR3_Del4-D3이 투여된 Fgfr3 ach/+ 마우스의 두개 비는 1.85 ± 0.01 ㎜로 개선되었다.
[표 7]
실시예 22: sFGFR3_Del4-D3의 투여와 연관된 기관 독성 없음
sFGFR3_Del4-D3 투여와 연관된 기관 독성을 특징화하기 위해 조직병리 연구를 수행하였다. 야생형 마우스(용량 당 6마리 수컷 및 6마리 암컷)에 PBS, 1주 1회 2.5 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3, 1주 2회 2.5 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3, 또는 1주 2회 10 ㎎/㎏ sFGFR3_Del4-D3을 투여하였다. 연구한 기관에는 신장, 피부, 침샘, 하악골 림프절, 담낭, 비장, 췌장, 폐, 심장, 대동맥, 공장, 결장, 및 간이 포함되었다. 임의의 용량의 sFGFR3_Del4-D3이 투여된 야생형 마우스에서도 기관 독성을 시사하는 조직병리 결과는 존재하지 않았다. 이들 결과는 1주 2회 10 ㎎/㎏까지 sFGFR3_Del4-D3의 투여와 연관된 독성이 존재하지 않았음을 시사한다.
실시예 23: 섬유아세포 성장 인자에 대한 sFGFR3_Del4-D3의 결합 친화도 결정
본 발명자들은 sFGFR3_Del4-D3이 섬유아세포 성장 인자(FGF) 리간드에 결합하며 막 결합된 FGFR3에 대한 FGF의 결합을 방지하는 유인물로 작용함을 결정하였다. 고정화된 sFGFR3_Del4-D3으로의 상이한 인간 FGF(hFGF) 결합에 대한 Kd 값을 결정하기 위해 BIACORE™ T200(GE Healthcare)을 사용하여 표면 플라즈몬 공명을 수행하였다. 특히, 주변분비 hFGF인 hFGF1(도 19a), hFGF2(도 19b), hFGF9(도 19c), 및 hFGF18(도 19d), 그리고 내분비 hFGF인 hFGF19(도 19e) 및 hFGF21(도 19f)에 대한 Kd 값을 결정하였다. 모든 4개의 주변분비 FGF 리간드는 나노몰 농도(nM) 친화도로 sFGFR3_Del4-D3에 결합하였다(표 8).
[표 8]
FGF2 및 FGF18에 있어서, 1:1 결합 모델로 우수한 피팅이 달성되었고, 이는 결합 친화도의 가장 직접적인 모델이다. 상기 모델은 단일 온-속도 및 오프-속도를 가지며 상이한 FGF에 결합하는 고정화된 SFGFR3_DEL4-D3을 갖는 칩 표면 상의 1:1 결합 상호작용: A + B = AB를 설명한다. 2:1 모델도 SFGFR3_DEL4-D3에 대한 FGF 결합의 1:1 상호작용을 설명하지만, 또한 복합체를 안정화하는 입체형태 변화: A + B = AB = AB*를 가정하며, 2개의 온-속도 및 오프-속도를 나타낸다. 상기 모델은 입체형태적으로 변화된 복합체(FGF에 결합된 SFGFR3_DEL4-D3)가 입체형태 변화의 역전에 의해서만 해리할 수 있다고 가정한다. hFGF1, hFGF9, hFGF19, 및 hFGF21에 대한 실험 데이터는 2:1 모델에 매우 잘 피팅되는 것으로 결정되었으며, 이에 따라 hFGF1, hFGF9, hFGF19, 및 hFGF21에 대한 Kd는 2:1 모델로부터 유도되었다.
hFGF1, hFGF9, hFGF19, 및 hFGF21이 모두 낮은 nM 범위의 Kd를 가짐에도 불구하고, 이들 hFGF의 동역학 프로필은 유의미하게 상이하였다. 예를 들어, FGF1은 매우 빠른 온-속도 및 오프-속도로 sFGFR3_Del4-D3에 결합하는 반면, FGF2는 FGF1만큼 빠른 온-속도 또는 오프-속도로 sFGFR3_Del4-D3에 결합하지 않아, FGF1 대비 FGF2에 대해 전반적으로 더 작은 Kd를 생성하였다(표 8). 주변분비 hFGF 대비 sFGFR3_Del4-D3 및 내분비 FGF15/FGF19 하위패밀리의 구성원인 hFGF19 또는 hFGF21 간에 유의미하게 더 낮은 친화도가 측정되었다(표 8 및 도 19d 및 도 19e). FGF15/FGF19 하위패밀리는 보조-인자로서 프로테오글리칸 대신 클로토(Klotho)를 사용하며, 대사 파라미터, 예컨대 포스페이트, 담즙산, 탄수화물, 및 지질 대사의 전신 조절을 위해 중요한, 내분비-작용 성장 인자로 진화하였다.
이들 결과는 sFGFR3_Del4-D3과 hFGF1, hFGF2, hFGF9, 및 hFGF18 간에 고친화도 상호작용이 존재한 반면, sFGFR3_Del4-D3과 FGF19 및 FGF21 간에 저친화도 상호작용이 존재하였음을 실증한다. FGF19 및 FGF21에 대한 sFGFR3_Del4-D3의 낮은 친화도는 sFGFR3_Del4-D3이 생체내에서 이들 FGF의 기능을 방해할 확률은 낮을 것이므로 유리하다.
실시예 24: sFGFR3_Del4-D3의 시험관내 증식 검정
FGF의 결합 후, FGFR3은 이량체화하여 신호전달 캐스케이드를 개시한다. 몇몇 하류 신호전달 경로가 FGF 신호전달과 연관된다. 연골세포에서, 이량체화된 FGFR3은 연골세포 내로 항-증식 신호/조기 분화 신호를 생성하며, 이는 궁극적으로 뼈 성장의 억제로 이어진다. 예를 들어, RAS/MAPK 경로는 증식, 말단 분화, 및 유사분열-후 기질 합성에 부정적으로 영향을 미치는 신호를 전파하며, STAT1 경로는 세포 주기 조절인자 p107 및 130 및 세포 주기 억제제 p21Waf/Cip1과 함께 연골세포 증식의 억제를 매개한다. 유전자 발현 연구는 여러 다른 경로가 또한 성장-촉진 분자의 하향-조절 또는 항-증식 기능의 유도에 관여됨을 제시한다.
연골세포 세포 모델에서 FGFR3G380R의 FGFR3-유인물 유도 억제를 연구하기 위해, FGFR3ach 돌연변이를 과발현하도록 유전적으로 변형된 ATDC5 세포(ATDC5 FGFR3G380R 세포)의 증식에 대한 sFGFR3_Del4-D3의 효과를 결정하기 위한 연구를 수행하였다. 분화 중인 기형암종 줄기 세포주 AT805에서 최초 단리된 연골세포 세포주 ATDC5 세포는 시험관내 연골세포 연구를 위한 모델로서 일반적으로 사용된다. ATDC5 세포를 먼저 레트로바이러스 발현 벡터로 감염시키고 FGFR3G380R을 발현하는 안정한 세포주를 생성하였다. ATDC5 세포주에서 FGFR3G380R의 발현을 웨스턴 블롯을 통해 결정하였다(도 20). 저항성 세포 선택 후 계대 1(G380R #1) 및 2(G380R #2)에 FGFR3G380R을 발현하는 ATDC5 세포의 추출물 및 대조군 ATDC5 세포의 추출물을 블로팅하고, FGFR3의 전체 인산화(pFGFR3), FGFR3에서 특정 인산티로신 724(pFGFR3 Y724), 및 전체 FGFR3 발현(FGFR3)에 대한 항체로 검출하였다. 전체 세포외 신호-관련 키나제 발현을 로딩 대조군으로서 사용하였다(ERK). ATDC5 FGFR3G380R 세포에 대한 SFGFR3_DEL4-D3의 첨가는 1.25 +/- 0.27 nM의 EC50을 가지며 ATDC5 FGFR3G380R 세포의 증식 지수를 2배 만큼 용량 의존적으로 증가시켰다(도 21). 이들 결과는 ATDC5 FGFR3G380R 세포에 대한 SFGFR3_DEL4-D3의 첨가가 연골무형성증의 세포 모델에서 FGFR3G380R에 의해 매개되는 부정적 성장 신호를 극복하며 연골세포에서 FGFR3에 의해 매개되는 항-증식 신호와 일관됨을 실증하고, 이는 연골세포가 G380R 돌연변이를 포함하는 FGFR3을 발현하는 경우 더욱 현저하다.
다른 구현예
상기 명세서에서 언급된 모든 공보, 특허, 및 특허 출원은 각각의 개별 공보, 특허 또는 특허 출원의 그 전문이 본원에 참조로 포함됨을 구체적이고 개별적으로 나타낸 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다. 본 발명의 기재된 방법, 약학 조성물, 및 키트의 다양한 변형 및 변이는 본 발명의 범위 및 정신에서 벗어나지 않고 당업자에게 자명할 것이다. 본 발명이 구체적 구현예에 관해 기재되었으나, 추가 변형이 가능하며 청구되는 본 발명이 이러한 구체적 구현예에 부당하게 제한되지 않아야 함이 이해될 것이다. 실제로, 당업자에게 자명한 본 발명을 수행하기 위해 기재된 방식의 다양한 변형은 본 발명의 범위 내인 것으로 의도된다. 상기 출원은 일반적으로 본 발명의 원리를 따르며 본 발명이 속하는 기술 분야 내의 공지된 통상적 실시 내에 속하고 본원에서 앞서 언급한 본질적인 특징에 적용될 수 있는 본 개시로부터의 이러한 변동을 포함하는 본 발명의 임의의 변이, 사용, 또는 채택을 포괄하려는 것이다.
SEQUENCE LISTING
<110> THERACHON SAS
INSERM (Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale)
UNIVERSITE DE NICE SOPHIA ANTIPOLIS
<120> SOLUBLE FIBROBLAST GROWTH FACTOR RECEPTOR 3 (SFGFR3) POLYPEPTIDES
AND USES THEREOF
<130> IPA190021-US-D1
<150> US 62/467,478
<151> 2017-03-06
<150> US 62/359,607
<151> 2016-07-07
<160> 39
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 301
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
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<223> Synthetic construct
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195 200 205
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210 215 220
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245 250 255
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275 280 285
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<213> Homo sapiens
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20
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<213> Homo sapiens
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<220>
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Pro Glu Ala Leu Phe Asp Arg Val Tyr Thr His Gln Ser Asp Val Trp
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Tyr Pro Gly Ile Pro Val Glu Glu Leu Phe Lys Leu Leu Lys Glu Gly
565 570 575
His Arg Met Asp Lys Pro Ala Asn Cys Thr His Asp Leu Tyr Met Ile
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Met Arg Glu Cys Trp His Ala Ala Pro Ser Gln Arg Pro Thr Phe Lys
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Gln Leu Val Glu Asp Leu Asp Arg Val Leu Thr Val Thr Ser Thr Asp
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Glu Tyr Leu Asp Leu Ser Ala Pro Phe Glu Gln Tyr Ser Pro Gly Gly
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 9
Glu Ser Leu Gly Thr Glu Gln Arg Val Val Gly Arg Ala Ala Glu Val
1 5 10 15
Pro Gly Pro Glu Pro Gly Gln Gln Glu Gln Leu Val Phe Gly Ser Gly
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Asp Ala Val Glu Leu Ser Cys Pro Pro Pro Gly Gly Gly Pro Met Gly
35 40 45
Pro Thr Val Trp Val Lys Asp Gly Thr Gly Leu Val Pro Ser Glu Arg
50 55 60
Val Leu Val Gly Pro Gln Arg Leu Gln Val Leu Asn Ala Ser His Glu
65 70 75 80
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50 55 60
Gly Gly Gly Pro Met Gly Pro Thr Val Trp Val Lys Asp Gly Thr Gly
65 70 75 80
Leu Val Pro Ser Glu Arg Val Leu Val Gly Pro Gln Arg Leu Gln Val
85 90 95
Leu Asn Ala Ser His Glu Asp Ser Gly Ala Tyr Ser Cys Arg Gln Arg
100 105 110
Leu Thr Gln Arg Val Leu Cys His Phe Ser Val Arg Val Thr Asp Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Gly Asp Asp Glu Asp Gly Glu Asp Glu Ala Glu Asp Thr
130 135 140
Gly Val Asp Thr Gly Ala Pro Tyr Trp Thr Arg Pro Glu Arg Met Asp
145 150 155 160
Lys Lys Leu Leu Ala Val Pro Ala Ala Asn Thr Val Arg Phe Arg Cys
165 170 175
Pro Ala Ala Gly Asn Pro Thr Pro Ser Ile Ser Trp Leu Lys Asn Gly
180 185 190
Arg Glu Phe Arg Gly Glu His Arg Ile Gly Gly Ile Lys Leu Arg His
195 200 205
Gln Gln Trp Ser Leu Val Met Glu Ser Val Val Pro Ser Asp Arg Gly
210 215 220
Asn Tyr Thr Cys Val Val Glu Asn Lys Phe Gly Ser Ile Arg Gln Thr
225 230 235 240
Tyr Thr Leu Asp Val Leu Glu Arg Ser Pro His Arg Pro Ile Leu Gln
245 250 255
Ala Gly Leu Pro Ala Asn Gln Thr Ala Val Leu Gly Ser Asp Val Glu
260 265 270
Phe His Ser Lys Val Tyr Ser Asp Ala Gln Pro His Ile Gln Trp Leu
275 280 285
Lys His Val Glu Val Asn Gly Ser Lys Val Gly Pro Asp Gly Thr Pro
290 295 300
Tyr Val Thr Val Leu Lys Val Ser Leu Glu Ser Asn Ala Ser Met Ser
305 310 315 320
Ser Asn Thr
<210> 20
<211> 987
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 20
atgggagtga aggtgctgtt cgccctgatc tgtatcgccg tggccgaggc cgagtctctg 60
ggcacagaac agagagtcgt gggcagagcc gccgaagtgc ctggacctga acctggccag 120
caggaacagc tggtgtttgg cagcggcgac gccgtggaac tgagctgtcc tccacctggc 180
ggaggcccta tgggacctac cgtgtgggtc aaggatggca ccggactggt gcctagcgag 240
agggtgctcg tgggacctca gagactgcag gtgctgaacg ccagccacga ggatagcggc 300
gcctacagct gcagacagag actgacacag cgggtgctgt gccacttctc cgtcagagtg 360
accgacgccc ctagctccgg cgacgatgag gatggcgaag atgaggccga ggacaccggc 420
gtggacacag gcgctccata ctggaccaga cccgagcgga tggacaagaa actgctggcc 480
gtgcctgccg ccaacaccgt gcggtttaga tgtcctgccg ccggaaaccc cacccccagc 540
atcagctggc tgaagaacgg cagagagttc cggggcgagc acagaatcgg cggcatcaag 600
ctgagacacc agcagtggtc cctcgtgatg gaaagcgtgg tgcccagcga ccggggcaac 660
tacacctgtg tggtggaaaa caagttcggc agcatccggc agacctacac cctggacgtg 720
ctggaaagaa gcccccacag acccatcctg caggccggac tgcctgccaa tcagacagcc 780
gtgctgggca gcgacgtgga atttcacagc aaggtgtaca gcgacgccca gccccacatc 840
cagtggctga aacacgtgga agtgaacggc agcaaagtgg gccccgacgg caccccttat 900
gtgaccgtgc tgaaggtgtc cctggaaagc aacgccagca tgagcagcaa caccgactac 960
aaggacgacg acgacaagtg aaagctt 987
<210> 21
<211> 1131
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 21
atgggagtga aggtgctgtt cgccctgatc tgtatcgccg tggccgaggc cgagtctctg 60
ggcacagaac agagagtcgt gggcagagcc gccgaagtgc ctggacctga acctggccag 120
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gtggacacag gcgctccata ctggaccaga cccgagcgga tggacaagaa actgctggcc 480
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ggcttcagcc accattctgc ctggctggtg gtgctgcccg tgtccctgga aagcaacgcc 1080
agcatgagca gcaacaccga ctacaaggac gacgacgaca agtgaaagct t 1131
<210> 22
<211> 2019
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 22
atggagtctc tgggcacaga gcagagagtc gtgggcagag ccgctgaagt gcctggacct 60
gagcctggcc agcaggaaca gctggtcttt ggctctggcg acgccgtgga actgagctgt 120
cctccacctg gcggaggccc tatgggacct accgtgtggg tcaaggatgg caccggactg 180
gtgcctagcg agagggtgct cgtgggacct cagagactgc aggtcctgaa cgccagccac 240
gaggatagcg gcgcctacag ctgcagacag agactgaccc agcgggtgct gtgccacttc 300
agcgtcagag tgaccgatgc ccccagcagc ggagatgacg aggatggcga ggatgaggcc 360
gaggatacag gcgtggacac aggcgcccct tactggacca gacccgagcg gatggacaag 420
aaactgctgg ccgtgcctgc cgccaacacc gtgcggttta gatgccctgc cgccggaaac 480
cccaccccca gcatctcttg gctgaagaac ggcagagagt tccggggcga gcaccggatc 540
ggcggcatta agctgagaca ccagcagtgg tccctggtca tggaaagcgt ggtgcccagc 600
gaccggggca actacacctg tgtggtggaa aacaagttcg gcagcatccg gcagacctac 660
accctggacg tgctggaaag aagcccccac agacctatcc tgcaggccgg actgcctgcc 720
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cagccccaca tccagtggct gaagcacgtg gaagtgaacg gcagcaaagt gggccccgac 840
ggcacccctt acgtgaccgt gctgaaagtg tccctggaaa gcaacgccag catgagcagc 900
aacacccccc tcgtgcggat cgccagactg tctagcggag agggccctac cctggccaac 960
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ctgggcaagc ctctgggcga gggctgtttt ggacaggtgg tcatggccga ggccatcggc 1080
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gccaccgaca aggacctgag cgacctggtg tccgagatgg aaatgatgaa gatgatcggc 1200
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ctggtggaat acgccgccaa gggcaacctg agagagttcc tgagagccag aaggccccct 1320
ggcctggact acagcttcga tacctgcaag ccccccgaag aacagctgac cttcaaggat 1380
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ctgcctccag cccctcctag ctctggcggc tctagaacc 2019
<210> 23
<211> 1491
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 23
atggagagcc tgggcacaga acagagagtc gtgggcagag ccgccgaagt gcctggacct 60
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cctccacctg gcggaggccc tatgggacct accgtgtggg tcaaggatgg caccggactg 180
gtgcctagcg agagggtgct cgtgggacct cagagactgc aggtcctgaa cgccagccac 240
gaggatagcg gcgcctacag ctgcagacag agactgaccc agcgggtgct gtgccacttc 300
agcgtcagag tgaccgatgc ccccagcagc ggagatgacg aggatggcga ggatgaggcc 360
gaggatacag gcgtggacac aggcgcccct tactggacca gacccgagcg gatggacaag 420
aaactgctgg ccgtgcctgc cgccaacacc gtgcggttta gatgccctgc cgccggaaac 480
cccaccccca gcatctcttg gctgaagaac ggcagagagt tccggggcga gcaccggatc 540
ggcggcatta agctgagaca ccagcagtgg tccctggtca tggaaagcgt ggtgcccagc 600
gaccggggca actacacctg tgtggtggaa aacaagttcg gcagcatccg gcagacctac 660
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cagccccaca tccagtggct gaagcacgtg gaagtgaacg gcagcaaagt gggccccgac 840
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aacaccagcg gcagcggctc tggcagcgga tctggttctg gctccggcag cgtggtgttc 960
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<210> 24
<211> 1710
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 24
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cctgaacctg gccagcagga acagctggtc tttggctctg gcgacgccgt ggaactgagc 180
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ctggtgccta gcgagagggt gctcgtggga cctcagagac tgcaggtcct gaacgccagc 300
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ttcagcgtca gagtgaccga tgcccccagc agcggagatg acgaggatgg cgaggatgag 420
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agcgaccggg gcaactacac ctgtgtggtg gaaaacaagt tcggcagcat ccggcagacc 720
tacaccctgg acgtgctgga aagaagcccc cacagaccta tcctgcaggc cggactgcct 780
gccaatcaga cagccgtgct gggcagcgac gtggaatttc actgcaaggt gtacagcgac 840
gcccagcccc acatccagtg gctgaagcac gtggaagtga acggcagcaa agtgggcccc 900
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ctggaagtgc tgagcctgca caacgtgacc ttcgaggacg ccggcgagta cacctgtctg 1020
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gaggccgccg tcagattcgt gggcttcccc 1710
<210> 25
<211> 236
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 25
Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
1 5 10 15
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
20 25 30
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
35 40 45
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
50 55 60
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
65 70 75 80
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
85 90 95
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
100 105 110
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
115 120 125
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
130 135 140
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
145 150 155 160
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
165 170 175
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
180 185 190
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
195 200 205
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
210 215 220
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230 235
<210> 26
<211> 236
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 26
Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
1 5 10 15
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
20 25 30
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
35 40 45
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
50 55 60
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
65 70 75 80
Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
85 90 95
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
100 105 110
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
115 120 125
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
130 135 140
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
145 150 155 160
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
165 170 175
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
180 185 190
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
195 200 205
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
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Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<210> 27
<211> 585
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27
Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu
1 5 10 15
Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln
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Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu
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Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu
65 70 75 80
Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro
85 90 95
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu
100 105 110
Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His
115 120 125
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130 135 140
Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala
165 170 175
Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser
180 185 190
Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu
195 200 205
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210 215 220
Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys
225 230 235 240
Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp
245 250 255
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser
260 265 270
Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His
275 280 285
Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser
290 295 300
Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala
305 310 315 320
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Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr
485 490 495
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Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu
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Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val
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Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
580 585
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 28
Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 29
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 29
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 30
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 30
Ala Gly Gly Thr Gly Gly Cys Cys Thr Thr Thr Gly Ala Cys Ala Cys
1 5 10 15
Cys Thr Ala Cys Cys Ala Gly Gly
20
<210> 31
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 31
Thr Cys Thr Gly Thr Thr Gly Thr Gly Thr Thr Thr Cys Cys Thr Cys
1 5 10 15
Cys Cys Thr Gly Thr Thr Gly Gly
20
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<211> 806
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 32
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1 5 10 15
Val Ala Gly Ala Ser Ser Glu Ser Leu Gly Thr Glu Gln Arg Val Val
20 25 30
Gly Arg Ala Ala Glu Val Pro Gly Pro Glu Pro Gly Gln Gln Glu Gln
35 40 45
Leu Val Phe Gly Ser Gly Asp Ala Val Glu Leu Ser Cys Pro Pro Pro
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Arg Glu Phe Arg Gly Glu His Arg Ile Gly Gly Ile Lys Leu Arg His
195 200 205
Gln Gln Trp Ser Leu Val Met Glu Ser Val Val Pro Ser Asp Arg Gly
210 215 220
Asn Tyr Thr Cys Val Val Glu Asn Lys Phe Gly Ser Ile Arg Gln Thr
225 230 235 240
Tyr Thr Leu Asp Val Leu Glu Arg Ser Pro His Arg Pro Ile Leu Gln
245 250 255
Ala Gly Leu Pro Ala Asn Gln Thr Ala Val Leu Gly Ser Asp Val Glu
260 265 270
Phe His Cys Lys Val Tyr Ser Asp Ala Gln Pro His Ile Gln Trp Leu
275 280 285
Lys His Val Glu Val Asn Gly Ser Lys Val Gly Pro Asp Gly Thr Pro
290 295 300
Tyr Val Thr Val Leu Lys Thr Ala Gly Ala Asn Thr Thr Asp Lys Glu
305 310 315 320
Leu Glu Val Leu Ser Leu His Asn Val Thr Phe Glu Asp Ala Gly Glu
325 330 335
Tyr Thr Cys Leu Ala Gly Asn Ser Ile Gly Phe Ser His His Ser Ala
340 345 350
Trp Leu Val Val Leu Pro Ala Glu Glu Glu Leu Val Glu Ala Asp Glu
355 360 365
Ala Gly Ser Val Tyr Ala Gly Ile Leu Ser Tyr Gly Val Gly Phe Phe
370 375 380
Leu Phe Ile Leu Val Val Ala Ala Val Thr Leu Cys Arg Leu Arg Ser
385 390 395 400
Pro Pro Lys Lys Gly Leu Gly Ser Pro Thr Val His Lys Ile Ser Arg
405 410 415
Phe Pro Leu Lys Arg Gln Val Ser Leu Glu Ser Asn Ala Ser Met Ser
420 425 430
Ser Asn Thr Pro Leu Val Arg Ile Ala Arg Leu Ser Ser Gly Glu Gly
435 440 445
Pro Thr Leu Ala Asn Val Ser Glu Leu Glu Leu Pro Ala Asp Pro Lys
450 455 460
Trp Glu Leu Ser Arg Ala Arg Leu Thr Leu Gly Lys Pro Leu Gly Glu
465 470 475 480
Gly Cys Phe Gly Gln Val Val Met Ala Glu Ala Ile Gly Ile Asp Lys
485 490 495
Asp Arg Ala Ala Lys Pro Val Thr Val Ala Val Lys Met Leu Lys Asp
500 505 510
Asp Ala Thr Asp Lys Asp Leu Ser Asp Leu Val Ser Glu Met Glu Met
515 520 525
Met Lys Met Ile Gly Lys His Lys Asn Ile Ile Asn Leu Leu Gly Ala
530 535 540
Cys Thr Gln Gly Gly Pro Leu Tyr Val Leu Val Glu Tyr Ala Ala Lys
545 550 555 560
Gly Asn Leu Arg Glu Phe Leu Arg Ala Arg Arg Pro Pro Gly Leu Asp
565 570 575
Tyr Ser Phe Asp Thr Cys Lys Pro Pro Glu Glu Gln Leu Thr Phe Lys
580 585 590
Asp Leu Val Ser Cys Ala Tyr Gln Val Ala Arg Gly Met Glu Tyr Leu
595 600 605
Ala Ser Gln Lys Cys Ile His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu
610 615 620
Val Thr Glu Asp Asn Val Met Lys Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg
625 630 635 640
Asp Val His Asn Leu Asp Tyr Tyr Lys Lys Thr Thr Asn Gly Arg Leu
645 650 655
Pro Val Lys Trp Met Ala Pro Glu Ala Leu Phe Asp Arg Val Tyr Thr
660 665 670
His Gln Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile Phe
675 680 685
Thr Leu Gly Gly Ser Pro Tyr Pro Gly Ile Pro Val Glu Glu Leu Phe
690 695 700
Lys Leu Leu Lys Glu Gly His Arg Met Asp Lys Pro Ala Asn Cys Thr
705 710 715 720
His Asp Leu Tyr Met Ile Met Arg Glu Cys Trp His Ala Ala Pro Ser
725 730 735
Gln Arg Pro Thr Phe Lys Gln Leu Val Glu Asp Leu Asp Arg Val Leu
740 745 750
Thr Val Thr Ser Thr Asp Glu Tyr Leu Asp Leu Ser Ala Pro Phe Glu
755 760 765
Gln Tyr Ser Pro Gly Gly Gln Asp Thr Pro Ser Ser Ser Ser Ser Gly
770 775 780
Asp Asp Ser Val Phe Ala His Asp Leu Leu Pro Pro Ala Pro Pro Ser
785 790 795 800
Ser Gly Gly Ser Arg Thr
805
<210> 33
<211> 349
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 33
Glu Ser Leu Gly Thr Glu Gln Arg Val Val Gly Arg Ala Ala Glu Val
1 5 10 15
Pro Gly Pro Glu Pro Gly Gln Gln Glu Gln Leu Val Phe Gly Ser Gly
20 25 30
Asp Ala Val Glu Leu Ser Cys Pro Pro Pro Gly Gly Gly Pro Met Gly
35 40 45
Pro Thr Val Trp Val Lys Asp Gly Thr Gly Leu Val Pro Ser Glu Arg
50 55 60
Val Leu Val Gly Pro Gln Arg Leu Gln Val Leu Asn Ala Ser His Glu
65 70 75 80
Asp Ser Gly Ala Tyr Ser Cys Arg Gln Arg Leu Thr Gln Arg Val Leu
85 90 95
Cys His Phe Ser Val Arg Val Thr Asp Ala Pro Ser Ser Gly Asp Asp
100 105 110
Glu Asp Gly Glu Asp Glu Ala Glu Asp Thr Gly Val Asp Thr Gly Ala
115 120 125
Pro Tyr Trp Thr Arg Pro Glu Arg Met Asp Lys Lys Leu Leu Ala Val
130 135 140
Pro Ala Ala Asn Thr Val Arg Phe Arg Cys Pro Ala Ala Gly Asn Pro
145 150 155 160
Thr Pro Ser Ile Ser Trp Leu Lys Asn Gly Arg Glu Phe Arg Gly Glu
165 170 175
His Arg Ile Gly Gly Ile Lys Leu Arg His Gln Gln Trp Ser Leu Val
180 185 190
Met Glu Ser Val Val Pro Ser Asp Arg Gly Asn Tyr Thr Cys Val Val
195 200 205
Glu Asn Lys Phe Gly Ser Ile Arg Gln Thr Tyr Thr Leu Asp Val Leu
210 215 220
Glu Arg Ser Pro His Arg Pro Ile Leu Gln Ala Gly Leu Pro Ala Asn
225 230 235 240
Gln Thr Ala Val Leu Gly Ser Asp Val Glu Phe His Cys Lys Val Tyr
245 250 255
Ser Asp Ala Gln Pro His Ile Gln Trp Leu Lys His Val Glu Val Asn
260 265 270
Gly Ser Lys Val Gly Pro Asp Gly Thr Pro Tyr Val Thr Val Leu Lys
275 280 285
Thr Ala Gly Ala Asn Thr Thr Asp Lys Glu Leu Glu Val Leu Ser Leu
290 295 300
His Asn Val Thr Phe Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Thr Cys Leu Ala Gly
305 310 315 320
Asn Ser Ile Gly Phe Ser His His Ser Ala Trp Leu Val Val Leu Pro
325 330 335
Val Ser Leu Glu Ser Asn Ala Ser Met Ser Ser Asn Thr
340 345
<210> 34
<211> 368
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 34
Met Met Ser Phe Val Ser Leu Leu Leu Val Gly Ile Leu Phe His Ala
1 5 10 15
Thr Gln Ala Glu Ser Leu Gly Thr Glu Gln Arg Val Val Gly Arg Ala
20 25 30
Ala Glu Val Pro Gly Pro Glu Pro Gly Gln Gln Glu Gln Leu Val Phe
35 40 45
Gly Ser Gly Asp Ala Val Glu Leu Ser Cys Pro Pro Pro Gly Gly Gly
50 55 60
Pro Met Gly Pro Thr Val Trp Val Lys Asp Gly Thr Gly Leu Val Pro
65 70 75 80
Ser Glu Arg Val Leu Val Gly Pro Gln Arg Leu Gln Val Leu Asn Ala
85 90 95
Ser His Glu Asp Ser Gly Ala Tyr Ser Cys Arg Gln Arg Leu Thr Gln
100 105 110
Arg Val Leu Cys His Phe Ser Val Arg Val Thr Asp Ala Pro Ser Ser
115 120 125
Gly Asp Asp Glu Asp Gly Glu Asp Glu Ala Glu Asp Thr Gly Val Asp
130 135 140
Thr Gly Ala Pro Tyr Trp Thr Arg Pro Glu Arg Met Asp Lys Lys Leu
145 150 155 160
Leu Ala Val Pro Ala Ala Asn Thr Val Arg Phe Arg Cys Pro Ala Ala
165 170 175
Gly Asn Pro Thr Pro Ser Ile Ser Trp Leu Lys Asn Gly Arg Glu Phe
180 185 190
Arg Gly Glu His Arg Ile Gly Gly Ile Lys Leu Arg His Gln Gln Trp
195 200 205
Ser Leu Val Met Glu Ser Val Val Pro Ser Asp Arg Gly Asn Tyr Thr
210 215 220
Cys Val Val Glu Asn Lys Phe Gly Ser Ile Arg Gln Thr Tyr Thr Leu
225 230 235 240
Asp Val Leu Glu Arg Ser Pro His Arg Pro Ile Leu Gln Ala Gly Leu
245 250 255
Pro Ala Asn Gln Thr Ala Val Leu Gly Ser Asp Val Glu Phe His Cys
260 265 270
Lys Val Tyr Ser Asp Ala Gln Pro His Ile Gln Trp Leu Lys His Val
275 280 285
Glu Val Asn Gly Ser Lys Val Gly Pro Asp Gly Thr Pro Tyr Val Thr
290 295 300
Val Leu Lys Thr Ala Gly Ala Asn Thr Thr Asp Lys Glu Leu Glu Val
305 310 315 320
Leu Ser Leu His Asn Val Thr Phe Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Thr Cys
325 330 335
Leu Ala Gly Asn Ser Ile Gly Phe Ser His His Ser Ala Trp Leu Val
340 345 350
Val Leu Pro Val Ser Leu Glu Ser Asn Ala Ser Met Ser Ser Asn Thr
355 360 365
<210> 35
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 35
Met Met Ser Phe Val Ser Leu Leu Leu Val Gly Ile Leu Phe His Ala
1 5 10 15
Thr Gln Ala
<210> 36
<211> 963
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 36
atgatgtcct ttgtctctct gctcctggtt ggcatcctat tccatgccac ccaggccgag 60
tccttgggga cggagcagcg cgtcgtgggg cgagcggcag aagtcccggg cccagagccc 120
ggccagcagg agcagttggt cttcggcagc ggggatgctg tggagctgag ctgtcccccg 180
cccgggggtg gtcccatggg gcccactgtc tgggtcaagg atggcacagg gctggtgccc 240
tcggagcgtg tcctggtggg gccccagcgg ctgcaggtgc tgaatgcctc ccacgaggac 300
tccggggcct acagctgccg gcagcggctc acgcagcgcg tactgtgcca cttcagtgtg 360
cgggtgacag acgctccatc ctcgggagat gacgaagacg gggaggacga ggctgaggac 420
acaggtgtgg acacaggggc cccttactgg acacggcccg agcggatgga caagaagctg 480
ctggccgtgc cggccgccaa caccgtccgc ttccgctgcc cagccgctgg caaccccact 540
ccctccatct cctggctgaa gaacggcagg gagttccgcg gcgagcaccg cattggaggc 600
atcaagctgc ggcatcagca gtggagcctg gtcatggaaa gcgtggtgcc ctcggaccgc 660
ggcaactaca cctgcgtcgt ggagaacaag tttggcagca tccggcagac gtacacgctg 720
gacgtgctgg agcgctcccc gcaccggccc atcctgcagg cggggctgcc ggccaaccag 780
acggcggtgc tgggcagcga cgtggagttc cactccaagg tgtacagtga cgcacagccc 840
cacatccagt ggctcaagca cgtggaggtg aatggcagca aggtgggccc ggacggcaca 900
ccctacgtta ccgtgctcaa ggtgtccctg gagtccaacg cgtccatgag ctccaacaca 960
tga 963
<210> 37
<211> 1107
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 37
atgatgtcct ttgtctctct gctcctggtt ggcatcctat tccatgccac ccaggccgag 60
tccttgggga cggagcagcg cgtcgtgggg cgagcggcag aagtcccggg cccagagccc 120
ggccagcagg agcagttggt cttcggcagc ggggatgctg tggagctgag ctgtcccccg 180
cccgggggtg gtcccatggg gcccactgtc tgggtcaagg atggcacagg gctggtgccc 240
tcggagcgtg tcctggtggg gccccagcgg ctgcaggtgc tgaatgcctc ccacgaggac 300
tccggggcct acagctgccg gcagcggctc acgcagcgcg tactgtgcca cttcagtgtg 360
cgggtgacag acgctccatc ctcgggagat gacgaagacg gggaggacga ggctgaggac 420
acaggtgtgg acacaggggc cccttactgg acacggcccg agcggatgga caagaagctg 480
ctggccgtgc cggccgccaa caccgtccgc ttccgctgcc cagccgctgg caaccccact 540
ccctccatct cctggctgaa gaacggcagg gagttccgcg gcgagcaccg cattggaggc 600
atcaagctgc ggcatcagca gtggagcctg gtcatggaaa gcgtggtgcc ctcggaccgc 660
ggcaactaca cctgcgtcgt ggagaacaag tttggcagca tccggcagac gtacacgctg 720
gacgtgctgg agcgctcccc gcaccggccc atcctgcagg ctgggctgcc tgctaaccag 780
acagcggtgc tgggcagcga cgtggagttc cactgcaagg tgtacagtga cgcacagccc 840
cacatccagt ggctcaagca cgtggaggtg aatggcagca aggtgggccc ggacggcaca 900
ccctacgtta ccgtgctcaa gacggcgggc gctaacacca ccgacaagga gctagaggtt 960
ctctccttgc acaacgtcac ctttgaggac gccggggagt acacctgcct ggcgggcaat 1020
tctattgggt tttctcatca ctctgcgtgg ctggtggtgc tgccagtgtc cctggagtcc 1080
aacgcgtcca tgagctccaa cacatga 1107
<210> 38
<211> 216
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 38
Met Arg Ser Gly Cys Val Val Val His Val Trp Ile Leu Ala Gly Leu
1 5 10 15
Trp Leu Ala Val Ala Gly Arg Pro Leu Ala Phe Ser Asp Ala Gly Pro
20 25 30
His Val His Tyr Gly Trp Gly Asp Pro Ile Arg Leu Arg His Leu Tyr
35 40 45
Thr Ser Gly Pro His Gly Leu Ser Ser Cys Phe Leu Arg Ile Arg Ala
50 55 60
Asp Gly Val Val Asp Cys Ala Arg Gly Gln Ser Ala His Ser Leu Leu
65 70 75 80
Glu Ile Lys Ala Val Ala Leu Arg Thr Val Ala Ile Lys Gly Val His
85 90 95
Ser Val Arg Tyr Leu Cys Met Gly Ala Asp Gly Lys Met Gln Gly Leu
100 105 110
Leu Gln Tyr Ser Glu Glu Asp Cys Ala Phe Glu Glu Glu Ile Arg Pro
115 120 125
Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Arg Ser Glu Lys His Arg Leu Pro Val Ser
130 135 140
Leu Ser Ser Ala Lys Gln Arg Gln Leu Tyr Lys Asn Arg Gly Phe Leu
145 150 155 160
Pro Leu Ser His Phe Leu Pro Met Leu Pro Met Val Pro Glu Glu Pro
165 170 175
Glu Asp Leu Arg Gly His Leu Glu Ser Asp Met Phe Ser Ser Pro Leu
180 185 190
Glu Thr Asp Ser Met Asp Pro Phe Gly Leu Val Thr Gly Leu Glu Ala
195 200 205
Val Arg Ser Pro Ser Phe Glu Lys
210 215
<210> 39
<211> 209
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 39
Met Asp Ser Asp Glu Thr Gly Phe Glu His Ser Gly Leu Trp Val Ser
1 5 10 15
Val Leu Ala Gly Leu Leu Leu Gly Ala Cys Gln Ala His Pro Ile Pro
20 25 30
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr
35 40 45
Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg
50 55 60
Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu
65 70 75 80
Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val
85 90 95
Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly
100 105 110
Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu
115 120 125
Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu
130 135 140
His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly
145 150 155 160
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu
165 170 175
Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp
180 185 190
Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala
195 200 205
Ser
Claims (98)
- SEQ ID NO: 32의 아미노산 잔기 23 내지 357과 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함하는 가용성 섬유아세포 성장 인자 수용체 3(sFGFR3) 폴리펩타이드로서, 폴리펩타이드에 신호 펩타이드 및 FGFR3의 막통과 도메인이 없으며, (i) 500개 미만의 아미노산 길이이거나; (ii) 200개 이하 연속 아미노산의 FGFR3의 세포내 도메인을 포함하거나; (iii) FGFR3의 티로신 키나제 도메인이 없는 폴리펩타이드.
- 제1항에 있어서, 폴리펩타이드는 475개, 450개, 425개, 400개, 375개, 또는 350개 미만의 아미노산 길이인 폴리펩타이드.
- 제1항에 있어서, 폴리펩타이드는 175개, 150개, 125개, 100개, 75개, 50개, 40개, 30개, 20개, 15개 이하 연속 아미노산의 FGFR3의 세포내 도메인을 포함하는 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 32의 아미노산 잔기 423 내지 435와 적어도 90%, 92%, 95%, 97%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 추가로 포함하는 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 32의 아미노산 잔기 423 내지 435를 추가로 포함하는 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 32의 아미노산 잔기 23 내지 357과 적어도 92%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 33과 적어도 92%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 33을 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩타이드.
- SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가용성 섬유아세포 성장 인자 수용체 3(sFGFR3) 폴리펩타이드로서, 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 위치 253에서 시스테인 잔기를 제거하는 아미노산 치환을 추가로 포함하는 폴리펩타이드.
- 제9항에 있어서, 위치 253에서의 시스테인 잔기는 세린 잔기로 치환되는 폴리펩타이드.
- 제9항 또는 제10항에 있어서, 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열과 적어도 87%, 90%, 92%, 95%, 97%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
- 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드는 단리된 sFGFR3 폴리펩타이드인 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드는 섬유아세포 성장 인자 1(FGF1), 섬유아세포 성장 인자 2(FGF2), 섬유아세포 성장 인자 9(FGF9), 섬유아세포 성장 인자 18(FGF18), 섬유아세포 성장 인자 19(FGF19), 또는 섬유아세포 성장 인자 21(FGF21)에 결합하는 폴리펩타이드.
- 제14항에 있어서, 결합은 약 0.2 nM 내지 약 20 nM의 평형 해리 상수(Kd)를 특징으로 하는 폴리펩타이드.
- 제15항에 있어서, 결합이 약 1 nM 내지 약 10 nM의 Kd를 특징으로 하며, 선택적으로 Kd는 약 1 nm, 약 2 nm, 약 3 nm, 약 4 nm, 약 5 nm, 약 6 nm, 약 7 nm, 약 8 nm, 약 9 nm, 또는 약 10 nm인 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 20, 21, 36, 또는 37의 핵산 서열과 적어도 85%, 87%, 90%, 92%, 95%, 97%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드.
- 제17항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 20, 21, 36, 또는 37의 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩타이드.
- 제17항 또는 제18항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 단리된 폴리뉴클레오타이드인 폴리펩타이드.
- 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
- 제20항에 있어서, 벡터는 플라스미드, 인공 염색체, 바이러스 벡터, 및 파지 벡터로 구성되는 군으로부터 선택되는 벡터.
- 제21항에 있어서, 벡터는 단리된 폴리뉴클레오타이드인 벡터.
- 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드 또는 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- 제23항에 있어서, 숙주 세포는 단리된 숙주 세포인 숙주 세포.
- 제23항 또는 제24항에 있어서, 숙주 세포는 HEK 293 세포 또는 CHO 세포인 숙주 세포.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드, 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드, 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항의 벡터, 또는 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항의 숙주 세포를 포함하는 조성물.
- 제26항에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 담체, 또는 희석제를 추가로 포함하는 조성물.
- 제26항 또는 제27항에 있어서, 조성물은 약 0.002 ㎎/㎏ 내지 약 30 ㎎/㎏의 용량으로 투여를 위해 제형화되는 조성물.
- 제28항에 있어서, 조성물은 약 0.001 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏의 용량으로 투여를 위해 제형화되는 조성물.
- 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 매일, 매주, 또는 매월 투여를 위해 제형화되는 조성물.
- 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 1주 7회, 1주 6회, 1주 5회, 1주 4회, 1주 3회, 1주 2회, 1주 1회, 2주 1회, 또는 1개월 1회 투여를 위해 제형화되는 조성물.
- 제31항에 있어서, 조성물은 1주 1회 또는 2회 약 2.5 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏의 용량으로 투여를 위해 제형화되는 조성물.
- 제26항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 비경구 투여, 장내 투여, 또는 국소 투여를 위해 제형화되는 조성물.
- 제33항에 있어서, 조성물은 피하 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 동맥내 투여, 경막내 투여, 또는 복강내 투여를 위해 제형화되는 조성물.
- 제34항에 있어서, 조성물은 피하 투여를 위해 제형화되는 조성물.
- 제26항 내지 제35항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 약제.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드, 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드, 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항의 벡터, 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항의 숙주 세포, 제26항 내지 제35항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제36항의 약제를 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 골격 성장 지연 장애의 치료 방법.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드, 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드, 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항의 벡터, 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항의 숙주 세포, 제26항 내지 제35항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제36항의 약제의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 골격 성장 지연 장애를 갖는 환자에서 조직으로의 폴리펩타이드의 전달 방법.
- 제38항에 있어서, 조직은 골격 조직인 방법.
- 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 골격 성장 지연 장애는 FGFR3-관련 골격 질환인 방법.
- 제40항에 있어서, FGFR3-관련 골격 질환은 연골무형성증, 치사성 형성이상 I형(TDI), 치사성 형성이상 II형(TDII), 발달 지연을 갖는 중증 연골무형성증 및 흑색 가시세포증(SADDEN), 연골발육부전, 두개골유합 증후군, 및 굴지증, 큰 신장, 및 청력 소실 증후군(CATSHL)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
- 제41항에 있어서, 골격 성장 지연 장애는 연골무형성증인 방법.
- 제41항에 있어서, 두개골유합 증후군은 y케 증후군, 크루종 증후군, 및 크루종피부골격 증후군으로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
- 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, FGFR3-관련 골격 질환은 구성적으로 활성인 FGFR3의 환자 내 발현에 의해 유도되는 방법.
- 제44항에 있어서, 구성적으로 활성인 FGFR3은 SEQ ID NO: 5의 위치 380에서 글리신 잔기의 아르기닌 잔기로의 아미노산 치환을 포함하는 방법.
- 제37항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 골격 성장 지연 장애로 진단받은 방법.
- 제37항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 짧은 사지, 짧은 몸통, 앙가발, 오리 걸음, 두개골 기형, 클로버잎 두개골, 두개골유합, 보름뼈, 손의 이상, 발의 이상, 히치하이커 엄지, 및 흉부 이상으로 구성되는 군으로부터 선택되는 골격 성장 지연 장애의 하나 이상의 증상을 나타내는 방법.
- 제47항에 있어서, 환자는 폴리펩타이드의 투여 후 골격 성장 지연 장애의 하나 이상의 증상에서 개선을 나타내는 방법.
- 제37항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 이전에 폴리펩타이드를 투여받지 않은 방법.
- 제37항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 유아, 어린이, 청소년, 및 성인으로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
- 제37항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 인간인 방법.
- 제37항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드는 약 0.002 ㎎/㎏ 내지 약 30 ㎎/㎏의 용량으로 환자에게 투여되는 방법.
- 제52항에 있어서, 폴리펩타이드는 약 0.001 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏의 용량으로 환자에게 투여되는 방법.
- 제37항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드는 매일, 매주, 매월, 또는 매년 1회 이상 환자에게 투여되는 방법.
- 제37항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드는 환자에게 1주 7회, 1주 6회, 1주 5회, 1주 4회, 1주 3회, 1주 2회, 1주 1회, 2주 1회, 또는 1개월 1회 투여되는 방법.
- 제55항에 있어서, 폴리펩타이드는 환자에게 적어도 약 1주 1회 또는 2회 이상 약 0.25 ㎎/㎏ 내지 약 20 ㎎/㎏의 용량으로 투여되는 방법.
- 제56항에 있어서, 폴리펩타이드가 환자에게 1주 1회 또는 2회 약 2.5 ㎎/㎏ 또는 약 10 ㎎/㎏의 용량으로 투여되는 방법.
- 제37항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드는 환자에게 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 담체, 또는 희석제를 포함하는 조성물에서 투여되는 방법.
- 제58항에 있어서, 조성물은 환자에게 피하, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 또는 복강내 투여되는 방법.
- 제59항에 있어서, 조성물은 환자에게 피하 주사에 의해 투여되는 방법.
- 제59항 또는 제60항에 있어서, 폴리펩타이드는 약 2시간 내지 약 25시간의 생체내 반감기를 갖는 방법.
- 제37항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드의 투여는 환자의 생존을 증가시키는 방법.
- 제37항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드의 투여는 환자의 보행을 개선하는 방법.
- 제37항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드의 투여는 환자에서 복식 호흡을 개선하는 방법.
- 제37항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드의 투여는 환자의 신체 및/또는 뼈 길이를 증가시키는 방법.
- 제37항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드의 투여는 환자에서 두개 비를 개선하고/하거나 대공 형태를 복원하는 방법.
- 폴리펩타이드의 발현을 실시하기 적합한 조건 하에 배양 배지 중 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 배양 배지로부터 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드의 제조 방법.
- 제67항에 있어서, 회수 단계는 크로마토그래피를 포함하는 방법.
- 제68항에 있어서, 크로마토그래피는 친화도 크로마토그래피 또는 크기 배제 크로마토그래피를 포함하는 방법.
- 제69항에 있어서, 친화도 크로마토그래피는 이온 교환 크로마토그래피 또는 항-FLAG 크로마토그래피를 포함하는 방법.
- 제70항에 있어서, 항-FLAG 크로마토그래피는 면역침전을 포함하는 방법.
- 환자에서 골격 성장 지연 장애를 치료하기 위한 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드.
- 제72항에 있어서, 골격 성장 지연 장애는 FGFR3-관련 골격 질환인 폴리펩타이드.
- 제73항에 있어서, FGFR3-관련 골격 질환은 연골무형성증, TDI, TDII, SADDEN, 연골발육부전, 두개골유합 증후군, 및 CATSHL로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드.
- 제74항에 있어서, FGFR3-관련 골격 질환은 연골무형성증인 폴리펩타이드.
- 제75항에 있어서, 두개골유합 증후군은 y케 증후군, 크루종 증후군, 및 크루종피부골격 증후군으로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드.
- 제73항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, FGFR3-관련 골격 질환은 구성적으로 활성인 FGFR3의 환자 내 발현에 의해 유도되는 폴리펩타이드.
- 제77항에 있어서, 구성적으로 활성인 FGFR3은 SEQ ID NO: 5의 위치 380에서 글리신 잔기의 아르기닌 잔기로의 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩타이드.
- 제72항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 골격 성장 지연 장애로 진단받은 폴리펩타이드.
- 제72항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 짧은 사지, 짧은 몸통, 앙가발, 오리 걸음, 두개골 기형, 클로버잎 두개골, 두개골유합, 보름뼈, 손의 이상, 발의 이상, 히치하이커 엄지, 및 흉부 이상으로 구성되는 군으로부터 선택되는 골격 성장 지연 장애의 하나 이상의 증상을 나타내는 폴리펩타이드.
- 제80항에 있어서, 환자는 sFGFR3 폴리펩타이드의 투여 후 골격 성장 지연 장애의 하나 이상의 증상에서 개선을 나타내는 폴리펩타이드.
- 제72항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 폴리펩타이드를 이전에 투여받지 않은 폴리펩타이드.
- 제72항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 유아, 어린이, 청소년, 및 성인으로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드.
- 제72항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 인간인 폴리펩타이드.
- 제72항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드는 약 0.002 ㎎/㎏ 내지 약 30 ㎎/㎏의 용량으로 환자에게 투여되는 폴리펩타이드.
- 제85항에 있어서, 폴리펩타이드는 약 0.001 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏의 용량으로 환자에게 투여되는 폴리펩타이드.
- 제72항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드는 매일, 매주, 매월, 또는 매년 1회 이상 환자에게 투여되는 폴리펩타이드.
- 제72항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드는 환자에게 1주 7회, 1주 6회, 1주 5회, 1주 4회, 1주 3회, 1주 2회, 1주 1회, 2주 1회, 또는 1개월 1회 투여되는 폴리펩타이드.
- 제88항에 있어서, 폴리펩타이드는 환자에게 1주 2회 약 2.5 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏의 용량으로 투여되는 폴리펩타이드.
- 제72항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드는 환자에게 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 담체, 또는 희석제를 포함하는 조성물에서 투여되는 폴리펩타이드.
- 제90항에 있어서, 조성물은 환자에게 비경구, 장내, 또는 국소 투여되는 폴리펩타이드.
- 제91항에 있어서, 조성물은 환자에게 피하, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 또는 복강내 투여되는 폴리펩타이드.
- 제92항에 있어서, 조성물은 환자에게 피하 주사에 의해 투여되는 폴리펩타이드.
- 제72항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드는 섬유아세포 성장 인자 1(FGF1), 섬유아세포 성장 인자 2(FGF2), 섬유아세포 성장 인자 9(FGF9), 섬유아세포 성장 인자 18(FGF18), 섬유아세포 성장 인자 19(FGF19), 또는 섬유아세포 성장 인자 21(FGF21)에 결합하는 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드의 제조 방법으로서, 상기 방법은 FGFR3 폴리펩타이드로부터 신호 펩타이드, 막통과 도메인, 및 세포내 도메인의 일부를 결실시키는 단계를 포함하는 방법.
- 제95항에 있어서, 세포내 도메인의 일부는 SEQ ID NO: 32의 아미노산 잔기 436 내지 806으로 구성되는 방법.
- 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드의 제조 방법으로서, 상기 방법은 SEQ ID NO: 1의 위치 253에서 시스테인 잔기를 제거하는 아미노산 치환을 도입하는 단계를 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드, 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드, 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항의 벡터, 또는 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항의 숙주 세포를 포함하는 키트로서, 키트는 선택적으로 키트의 사용 지침을 포함하는 키트.
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