JP2022096660A - 可溶性線維芽細胞成長因子受容体3(sFGFR3)ポリペプチドおよびその使用 - Google Patents
可溶性線維芽細胞成長因子受容体3(sFGFR3)ポリペプチドおよびその使用 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本明細書において使用される「a」および「an」は、特に示されない限り、「少なくとも1つ」または「1つ以上」を意味する。さらに、単数形「a」、「an」、および「the」は、特に文脈が明確に示さない限り、複数の参照対象を含む。
100×(A/Bの率)
(式中、Aは、候補配列および参照配列のアラインメントにおいて同一とスコアリングされるアミノ酸(または核酸)残基の数であり、Bは、参照配列中のアミノ酸(または核酸)残基の総数である)。特に、候補配列との比較のためにアラインされる参照配列は、候補配列が例えば、候補配列の全長または候補配列の連続アミノ酸(または核酸)残基の選択部分にわたり50%~100%の同一性を示すことを示し得る。比較目的のためにアラインされる候補配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも30%、例えば、少なくとも40%、例えば、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%または100%である。候補配列中の位置が、参照配列中の対応位置と同一のアミノ酸(または核酸)残基により占有される場合、その分子はその位置において同一である。
本発明は、骨格成長遅滞障害(例えば、軟骨無形成症)の治療のために配合されるsFGFR3ポリペプチドおよびそのバリアントを特徴とする。特に、sFGFR3ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも85%の配列同一性(例えば、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上の配列同一性)を有し得、sFGFR3ポリペプチドは、配列番号1の253位におけるシステイン残基を除去するアミノ酸置換を含む(例えば、sFGFR3_Del4-C253S;配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチド)。例えば、配列番号1の253位におけるシステイン残基は、セリン残基または保存的アミノ酸置換、例えば、アラニン、グリシン、プロリン、もしくはトレオニンにより置換されている。
本発明のsFGFR3ポリペプチド(例えば、sFGFR3_Del4-C253S(配列番号2)、sFGFR3_Del4-D3(配列番号33)、およびそれらのバリアント(配列番号4)またはシグナルペプチドを含むsFGFR3ポリペプチド(配列番号18または34))は、異種ポリペプチドからの機能ドメイン(例えば、免疫グロブリンの断片結晶化可能領域(Fc領域;例えば、配列番号25および26のアミノ酸配列を有するポリペプチド)またはヒト血清アルブミン(HSA;例えば、配列番号27のアミノ酸配列を有するポリペプチド))に融合させてsFGFR3融合ポリペプチドを提供することができる。場合により、フレキシブルリンカー、例えば、セリンまたはグリシンリッチ配列(例えば、ポリ-グリシンまたはポリ-グリシン/セリンリンカー、例えば、配列番号28および29)を、sFGFR3ポリペプチドおよび異種ポリペプチド(例えば、Fc領域またはHSA)間に含めることができる。
本発明はさらに、患者(例えば、ヒト、例えば、幼児、小児、または若年者)における骨格成長遅滞障害(例えば、軟骨無形成症)を治療するために使用することができるsFGFR3ポリペプチド(例えば、sFGFR3_Del4-C253S(配列番号2)、sFGFR3_Del4-D3(配列番号33)、およびそれらのバリアント(配列番号4)またはシグナルペプチドを含むsFGFR3ポリペプチド(配列番号18または34))をコードするポリヌクレオチド、例えば、配列番号20、21、36、または37を含む。例えば、ポリヌクレオチドは、sFGFR3_Del4-C253S(配列番号2)をコードする配列番号20もしくは36の核酸配列、または配列番号20もしくは36の核酸配列と少なくとも85%の配列同一性(例えば、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上の配列同一性)を有するバリアントであり得る。さらに、ポリヌクレオチドは、配列番号21または37の核酸配列と少なくとも85%の配列同一性(例えば、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上の配列同一性)を有するsFGFR3_Del4-D3(配列番号33)をコードする配列番号21または37の核酸配列であり得る。本発明はまた、sFGFR3融合ポリペプチド(例えば、異種ポリペプチド、例えば、Fc領域またはHSAに融合しているsFGFR3ポリペプチド)をコードするポリヌクレオチドおよびシグナルペプチドを有さないsFGFR3ポリペプチド(例えば、配列番号2、4、および33のアミノ酸配列を有するポリペプチド)またはシグナルペプチドを有するsFGFR3ポリペプチド(例えば、配列番号18、19、および34のアミノ酸配列を有するポリペプチド)をコードするポリヌクレオチドを含む。さらに、本発明は、本明細書に記載のグリコシル化部位のいずれかを変更するための1つ以上の突然変異を含むポリヌクレオチドを含む。
本発明のsFGFR3ポリペプチド(例えば、sFGFR3_Del4-C253S(配列番号2)、sFGFR3_Del4-D3(配列番号33)、およびそれらのバリアント(配列番号4)またはシグナルペプチドを含むsFGFR3ポリペプチド(配列番号18または34))の発現のための宿主細胞として哺乳動物細胞を使用することができる。本方法において有用な例示的な哺乳動物細胞タイプとしては、限定されるものではないが、ヒト胚性腎(HEK;例えば、HEK293)細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、L細胞、C127細胞、3T3細胞、BHK細胞、COS-7細胞、HeLa細胞、PC3細胞、ベロ細胞、MC3T3細胞、NS0細胞、Sp2/0細胞、VERY細胞、BHK、MDCK細胞、W138細胞、BT483細胞、Hs578T細胞、HTB2細胞、BT20細胞、T47D細胞、NS0細胞、CRL7O3O細胞、およびHsS78Bst細胞、または当分野における公知の任意の他の好適な哺乳動物宿主細胞が挙げられる。あるいは、sFGFR3ポリペプチドの発現のための宿主細胞として大腸菌(E.coli)細胞を使用することができる。大腸菌(E.coli)株の例としては、限定されるものではないが、大腸菌(E.coli)294(ATCC(登録商標)31,446)、大腸菌(E.coli)λ1776(ATCC(登録商標)31,537、大腸菌(E.coli)BL21(DE3)(ATCC(登録商標)BAA-1025)、大腸菌(E.coli)RV308(ATCC(登録商標)31,608)、または当分野における公知の任意の他の好適な大腸菌(E.coli)株が挙げられる。
本発明はまた、上記ポリヌクレオチドのいずれか1つ以上を含む組換えベクターを特徴とする。本発明のベクターを使用して本発明のsFGFR3ポリペプチド(例えば、sFGFR3_Del4-C253S(配列番号2)、sFGFR3_Del4-D3(配列番号33)、およびそれらのバリアント(配列番号4)またはシグナルペプチドを含むsFGFR3ポリペプチド(配列番号18または34))をコードするポリヌクレオチドを送達することができ、それとしては、哺乳動物、ウイルス、および細菌発現ベクターを挙げることができる。例えば、ベクターは、プラスミド、人工染色体(例えば、BAG、PAC、およびYAC)、およびウイルスまたはファージベクターであり得、場合により、プロモーター、エンハンサー、またはポリヌクレオチドの発現のための調節因子を含み得る。ベクターは、1つ以上の選択マーカー遺伝子、例えば、細菌プラスミドの場合のアンピシリン、ネオマイシン、および/もしくはカナマイシン耐性遺伝子、または真菌ベクターについての耐性遺伝子も含有し得る。ベクターは、DNAもしくはRNAの産生のためにインビトロで使用することができ、またはそれを使用してベクターによりコードされるsFGFR3ポリペプチドの産生のための宿主細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞を形質移入もしくは形質転換することができる。ベクターは、遺伝子療法の方法においてインビボで使用するために適合させることもできる。
本発明のsFGFR3ポリペプチド(例えば、sFGFR3_Del4-C253S(配列番号2)、sFGFR3_Del4-D3(配列番号33)、およびそれらのバリアント(配列番号4)またはシグナルペプチドを含むsFGFR3ポリペプチド(配列番号18または34))をコードするポリヌクレオチドは、当分野における公知の任意の方法により産生することができる。例えば、ポリヌクレオチドは、分子クローニング法を使用して生成され、ベクター、例えば、プラスミド、人工染色体、ウイルスベクター、またはファージベクター内に配置される。ベクターは、sFGFR3ポリペプチドの発現に適切な宿主細胞中にポリヌクレオチドを形質転換するために使用される。
本発明のsFGFR3ポリペプチド(例えば、sFGFR3_Del4-C253S(配列番号2)、sFGFR3_Del4-D3(配列番号33)、およびそれらのバリアント(配列番号4)またはシグナルペプチドを含むsFGFR3ポリペプチド(配列番号18または34))は、宿主細胞から産生することができる。sFGFR3ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(例えば、配列番号20、21、36、または37の核酸配列を有するポリヌクレオチドまたはそれらのバリアント)は、当分野における公知の慣用の技術(例えば、形質転換、形質移入、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、または感染)により宿主細胞中に導入することができるベクター中に含めることができる。ベクターの選択は、部分的には、使用すべき宿主細胞に依存する。一般に、宿主細胞は、原核生物(例えば、細菌)または真核生物(例えば、哺乳動物)のいずれかの起源のものであり得る。
本発明のsFGFR3ポリペプチド(例えば、sFGFR3_Del4-C253S(配列番号2)、sFGFR3_Del4-D3(配列番号33)、およびそれらのバリアント(配列番号4)またはシグナルペプチドを含むsFGFR3ポリペプチド(配列番号18または34))を産生するために使用される宿主細胞(例えば、HEK293細胞またはCHO細胞)は、当分野において公知であり、選択宿主細胞の培養に好適な培地中で成長させることができる。哺乳動物宿主細胞に好適な培地の例としては、最小必須培地(MEM)、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、Expi293(商標)発現培地、ウシ胎仔血清(FBS)が補給されたDMEM、およびRPMI-1640が挙げられる。細菌宿主細胞に好適な培地の例としては、ルリアブロス(LB)と必須サプリメント、例えば、選択薬剤、例えば、アンピシリンが挙げられる。宿主細胞は、好適な温度、例えば、約20℃~約39℃、例えば、約25℃~約37℃、好ましくは、37℃、およびCO2レベル、例えば、5~10%(好ましくは、8%)において培養される。培地のpHは、一般に、主に宿主生物に応じて約6.8~7.4、例えば、7.0である。誘導性プロモーターが発現ベクター中で使用される場合、sFGFR3ポリペプチド発現は、プロモーターの活性化に好適な条件下で誘導される。
本明細書において、患者、例えば、軟骨無形成症を有する患者(例えば、軟骨無形成症を有するヒト)における骨格成長遅滞障害を治療する方法が提供される。特に、患者は、骨格成長遅滞障害(例えば、軟骨無形成症)の1つ以上の症状を呈し、または発症する可能性が高い者である。本方法は、骨格成長遅滞障害を有する患者、例えば、軟骨無形成症を有する患者(例えば、軟骨無形成症を有するヒト)に本発明のsFGFR3ポリペプチド(例えば、sFGFR3_Del4-C253S(配列番号2)、sFGFR3_Del4-D3(配列番号33)、およびそれらのバリアント(配列番号4)またはシグナルペプチドを含むsFGFR3ポリペプチド(配列番号18または34))を投与することを含む。特に、本方法は、骨格成長遅滞障害を有する患者、例えば、軟骨無形成症を有する患者(例えば、軟骨無形成症を有するヒト)にsFGFR3_Del4-C253S(配列番号2)またはsFGFR3_Del4-D3(配列番号33)を投与することを含む。例えば、患者は、骨格成長遅滞障害を有する幼児または小児、例えば、軟骨無形成症を有する幼児、小児、または若年者(例えば、軟骨無形成症を有するヒト)である。
骨格成長遅滞障害は、骨格成長遅滞障害の治療が必要とされる患者(例えば、ヒト)に本明細書に記載のsFGFR3ポリペプチドを投与することにより治療することができる。本方法は、骨格成長遅滞障害を有する患者(例えば、ヒト)に本発明のsFGFR3ポリペプチド(例えば、sFGFR3_Del4-C253S(配列番号2)、sFGFR3_Del4-D3(配列番号33)、およびそれらのバリアント(配列番号4)またはシグナルペプチドを含むsFGFR3ポリペプチド(配列番号18または34))を投与することを含む。sFGFR3ポリペプチドにより治療することができる骨格成長遅滞障害は、骨の変形および/または奇形により特徴付けられ、それとしては、限定されるものではないが、FGFR3関連骨格疾患を挙げることができる。特に、患者は、sFGFR3_Del4-C253S(配列番号2)またはsFGFR3_Del4-D3(配列番号33)により治療される。
軟骨無形成症は、ヒトにおける小人症の最も一般的な原因であり、本明細書に記載のsFGFR3ポリペプチドを投与することにより治療することができる。特に、軟骨無形成症は、本発明のsFGFR3ポリペプチド(例えば、sFGFR3_Del4-C253S(配列番号2)、sFGFR3_Del4-D3(配列番号33)、およびそれらのバリアント(配列番号4)またはシグナルペプチドを含むsFGFR3ポリペプチド(配列番号18または34))を投与することにより治療することができる。したがって、sFGFR3ポリペプチドの投与は、症状、例として、限定されるものではないが、成長遅滞、頭蓋変形、歯列矯正欠陥、頸髄圧迫(例えば、中枢性無呼吸または発作からの死亡リスクを伴うもの)、脊髄の狭窄(例えば、脚部および腰部の疼痛)、水頭症(例えば、脳シャント手術を要求するもの)、慢性耳炎に起因する難聴、心血管疾患、神経疾患、呼吸疾病、疲労、疼痛、腰部および/もしくは脊柱における無感覚、ならびに/または肥満症の改善をもたらし得る。
本発明のsFGFR3ポリペプチド(例えば、sFGFR3_Del4-C253S(配列番号2)、sFGFR3_Del4-D3(配列番号33)、およびそれらのバリアント(配列番号4)またはシグナルペプチドを含むsFGFR3ポリペプチド(配列番号18または34))は、当分野における公知の任意の経路により、例えば、非経口投与、腸内投与、または局所投与により投与することができる。特に、sFGFR3ポリペプチドは、骨格成長遅滞障害(例えば、軟骨無形成症)を有する患者に皮下(例えば、皮下注射による)、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内または腹腔内投与することができる。
本発明のsFGFR3ポリペプチド(例えば、sFGFR3_Del4-C253S(配列番号2)、sFGFR3_Del4-D3(配列番号33)、およびそれらのバリアント(配列番号4)またはシグナルペプチドを含むsFGFR3ポリペプチド(配列番号18または34))は、sFGFR3ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを目的の組織に送達し、インビボで発現させる遺伝子療法を介して送達することもできる。遺伝子療法の方法は、例えば、Verme et al.(Nature 389:239-242,1997)、Yamamoto et al.(Molecular Therapy 17:S67-S68,2009)、およびYamamoto et al.,(J.Bone Miner.Res.26:135-142,2011)(それらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる)に考察されている。
本発明の医薬組成物は、本発明のsFGFR3ポリペプチド(例えば、sFGFR3_Del4-C253S(配列番号2)、sFGFR3_Del4-D3(配列番号33)、およびそれらのバリアント(配列番号4)またはシグナルペプチドを含むsFGFR3ポリペプチド(配列番号18または34))、ポリヌクレオチド、ベクター、および/または宿主細胞を含み得る。sFGFR3ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、および/または宿主細胞を含む組成物は、投与量の範囲において、種々の配合物中で、および薬学的に許容可能な賦形剤、担体、または希釈剤との組合せで配合することができる。
本発明のキットは、本明細書に記載の本発明の1つ以上のsFGFR3ポリペプチド(例えば、sFGFR3_Del4-C253S(配列番号2)、sFGFR3_Del4-D3(配列番号33)、およびそれらのバリアント(配列番号4)またはシグナルペプチドを含むsFGFR3ポリペプチド(配列番号18または34))、ポリヌクレオチド、ベクター、および/または細胞を含み得る。例えば、sFGFR3ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、および/または細胞は、容器(例えば、ガラスバイアル)中で液体形態(例えば、水または緩衝塩溶液、例えば、2mM~20mMのリン酸ナトリウム、pH6.5または7.0、および25mM~250mMの塩化ナトリウム中)で存在し得る。あるいは、sFGFR3ポリペプチド、ポリヌクレオチド、および/またはベクターは、容器(例えば、ガラスバイアル)中で、場合により、投与前の液体形態への凍結乾燥sFGFR3ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、および/または細胞の再構成のための希釈剤(例えば、水または緩衝塩溶液)を含み得る凍結乾燥形態で存在する。sFGFR3ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、および/または細胞は、キット中で本明細書に記載の別の配合物中でも存在し得る。キット構成成分は、投与を容易にするための剤形で提供することができ、場合により、投与に要求される材料および/または本方法に従う患者治療についての説明書を含み得る。例えば、キットは、sFGFR3ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、および/または細胞の投与に関して使用者(例えば、医師)にガイドする使用説明書を含み得る。
3つの異なる懸濁細胞タイプ:HEK293 freestyle、CHO-S freestyle細胞およびExpi CHO-S細胞中の一過的形質移入により、sFGFR3_Del4-C253S(配列番号2)およびsFGFR3_Del4-D3(配列番号33)を産生した。HEK293 freestyleおよびCHO-S freestyle細胞中での産生のため、ポリエチレンイミン(PEIpro(登録商標)-Polyplus-transfection)を製造業者の指示書に従って使用して形質移入を実施した。3日後にタンパク質を回収した。Expi CHO-S細胞中でのsFGFR3ポリペプチド産生のため、Expifectamineを製造業者による記載のとおりに使用して、High Titer産生プロトコルを使用して形質移入を実施した。タイムコースを実施し、12日後にsFGFR3ポリペプチドを最適に回収した。次いで、50ngのsFGFR3ポリペプチドを使用してウエスタンブロットを実施した。ブロッキング緩衝液中で1:2000希釈された一次抗体としてのB9(抗FGFR3、sc-13121、Santa Cruz)およびブロッキング緩衝液中で1:5000希釈された抗マウスIgG二次抗体(抗マウスIgG、#7076、Cell signaling)を用いて古典的ウエスタンブロットプロトコルを使用した。
イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを含む2ステップ精製プロセスを使用してsFGFR3_Del4-C253SおよびsFGFR3_Del4-D3をそれぞれ精製した。
Sensor Chip CM5(GE Healthcare)を用いてsFGFR3_Del4-C253SおよびsFGFR3_Del4-D3のキャリブレーションフリー濃度分析およびカイネティックアッセイを実施した。ヒトFGF2(hFGF2)を、Sensor Chip CM5に約5000RUのレベルにおいてアミンカップリングにより共有結合により固定化した。5000RUを達成するため、hFGF2を流速10μl/分および濃度25μg/mlにおいて420秒間固定化した。ランニング緩衝液は、HBS-EP+緩衝液(GE Healthcare)であった。再生緩衝液は、2Mの塩化ナトリウムを有する100mMの酢酸ナトリウム、pH4.5であった。BIACORE(商標)T200(GE Healthcare)を使用する表面プラズモン共鳴によりFGF結合、解離定数(Kd)計測、およびカイネティックパラメータを測定した。カイネティックアッセイおよびKd測定に使用されたモデルは、1:1結合アルゴリズムであった。
ATDC5およびATDC5 FGFR3G380R細胞系の両方を、NUNC(商標)MICROWELL(商標)96-Well Optical-Bottom Plates with Polymer Base(ThermoFisher Scientific、カタログ番号165305)中で25,000個の細胞/cm2の密度において播種した。24時間のインキュベーション期間後、細胞を0.5%のBSA中で48時間枯渇させ、次いでsFGFR3_Del4-C253SまたはsFGFR3_Del4-D3によりhFGF2(Peprotech)を用いてまたは用いずに72時間刺激した。次いで、CyQUANT(登録商標)Direct Cell Proliferation Assay(Molecular Probes、カタログ番号C35012)を使用して細胞増殖を計測した。刺激後、1ウェル当たり10μLのCyQUANT(登録商標)Direct Cell Proliferation(Invitrogen;1mlの1×PBS、250μLのバックグラウンド抑制剤、および50μLの核染色)を添加した。次いで、ATDC5およびATDC5 FGFR3G380R細胞を、暗所で室温において2時間インキュベートした。VARIOSKAN(商標)LUXマルチモードマイクロプレートリーダー(ThermoFisher Scientific)を使用して蛍光を読み取った。
FGFR3G380Rを発現する血清応答エレメント-ルシフェラーゼ(SRE-Luc)HEK細胞を、標準培養96ウェルプレート中で100,000個の細胞/cm2の密度において播種した。次いで、細胞を0.5%の熱不活化ウシ胎仔血清(hiFBS)により24時間枯渇させてから、0nm、70nm、および280nmの濃度におけるsFGFR3_Del4-D3により1ng/mlのhFGF2を用いてまたは用いずに24時間処理した。培養プレートを室温に15分間平衡化してから1ウェル当たり100μLのFirefly Luc One-Step Glow Assay Working Solution(ThermoFisher Scientific、カタログ番号16197)を添加し、次いで600rpmにおいて3分間振盪させた。プレートを室温において10分間インキュベートし、それぞれの細胞溶解物を白色不透明96ウェルプレートに移して発光シグナルを増加させ、交差汚染を減少させた。VARIOSKAN(商標)LUXマルチモードマイクロプレートリーダー(ThermoFisher Scientific)を使用して発光シグナルを読み取った。
突然変異FGFR3の発現がCol2a1プロモーター/エンハンサーによりドライブされるトランスジェニックFgfr3ach/+動物に対して実験を実施した。マウスを12時間の明/暗サイクルに曝露し、標準的な実験室飼料および水に自由にアクセスさせた。FGFR3導入遺伝子の360bpを増幅させるプライマー5’-AGGTGGCCTTTGACACCTACCAGG-3’(配列番号30)および5’-TCTGTTGTGTTTCCTCCCTGTTGG-3’(配列番号31)を使用するゲノムDNAのPCRによりゲノタイプを確認した。
懸濁HEK293細胞またはCHO細胞中で産生されたsFGFR3_Del1(配列番号7)、sFGFR3_Del4(配列番号1)、およびsFGFR3_Del4-LK1-LK2(配列番号10)のFGF2結合活性、Kd、および細胞シグナリングに対する効果を比較した。HEK293細胞またはCHO細胞は、タンパク質の翻訳後修飾が異なる。異なる細胞系中でのsFGFR3ポリペプチドの発現は、sFGFR3ポリペプチドのKdにも、結合活性にも、細胞内シグナリング阻害に対する効果にも影響を与えなかった(図1A~1D)。
sFGFR3_Del1(配列番号7)、sFGFR3_Del4(配列番号1)、およびsFGFR3_Del4-LK1-LK2(配列番号10)のsFGFR3ポリペプチドを、253位におけるセリン残基によるシステイン残基のアミノ酸置換または拡張Ig様C2型ドメイン3(配列番号33)のいずれかを含むようにそれぞれ改変した。sFGFR3_Del1およびsFGFR3_Del4-LK1-LK2のこれらの改変は、凝集が依然として可視的であったため、sFGFR3ポリペプチドの産生に対する効果を有さず、または最小の効果を有した(それぞれ、図2Aおよび2B)。驚くべきことに、253位におけるセリン残基によるシステイン残基のアミノ酸置換(sFGFR3_Del4-C253S)または拡張Ig様C2型ドメイン3(配列番号33))のいずれかを含めるためのsFGFR3_Del4の改変は、sFGFR3ポリペプチドの産生を改善した。特に、還元および非還元の両方の条件下でsFGFR3_Del4-C253SおよびsFGFR3_Del4-D3の最小の凝集が存在した(図2C)。C253SまたはD3の包含は、sFGFR3_Del4と比較して産生の相対的増加ももたらし、sFGFR3_Del4-C253S産生においては2倍の増加およびsFGFR3_Del4-D3産生においては3倍の増加をもたらした。
sFGFR3_Del4、sFGFR3_Del4-C253S、およびsFGFR3_Del4-D3は、FGFR3ach突然変異を過剰発現するように遺伝子改変させたATDC5細胞(ATDC5 FGFR3G380R細胞系)の増殖を回復させた。36nMの用量において、HEK293細胞を使用して産生されたsFGFR3_Del4は増殖を115.5%に増加させ、CHO-S細胞を使用して産生されたsFGFR3_Del4は増殖を116%に増加させ、CHO-S細胞を使用して産生されたsFGFR3_Del4-C253Sは増殖を114.4%に増加させ、CHO-S細胞を使用して産生されたsFGFR3_Del4-D3は増殖を120.1%に増加させた(図3B)。
低用量(0.25mg/kg)のsFGFR3_Del4-D3を使用してインビボ効力試験を実施例6のとおり実施した。合計60匹のマウスをビヒクル群に含め、32匹の野生型(wt)マウスおよび28匹のFgfr3ach/+マウスであった。処理群は40匹のマウスを含み、19匹のwtマウスおよび21匹のFgfr3ach/+マウスであった。驚くべきことに、低用量のsFGFR3_Del4-D3は、軟骨無形成症を有するマウスの早期死亡をほぼ完全に予防した(図5)。対照群において、Fgfr3ach/+マウスの53.6%が離乳前に死亡した一方、処理群のマウスの4.8%のみが22日目前に死亡し、0.25mg/kgにおけるsFGFR3_Del1による処理後にマウスの20%が死亡した(表2;Garcia et al.Sci.Transl.Med.5:203ra124,2013(参照により全体として本明細書に組み込まれる)も参照されたい)。
軟骨無形成症を罹患するヒト患者(例えば、幼児、小児、若年者、または成人)は、特定の投与量(例えば、0.0002mg/kg/日~約20mg/kg/日、例えば、0.001mg/kg/日~7mg/kg/日)において適切な経路(例えば、皮下注射による)によりsFGFR3_Del4-C253S(図6;配列番号2)を数日間、数週間、数ヵ月間、または数年間の過程にわたり投与することにより治療することができる。sFGFR3_Del4-C253Sにより治療される軟骨無形成症の進行は、いくつかの確立された方法の1つ以上によりモニタリングすることができる。医師は、患者を直接的な観察によりモニタリングして患者により呈される軟骨無形成症の症状が治療に応答していかに変化したかを評価することができる。例えば、医師は、患者の体重、頭蓋長および/または頭蓋幅の変化を一定期間にわたり、例えば、sFGFR3_Del4-C253Sによる治療過程にわたり1ヵ月当たりもしくは1年当たり1、2、3、4回以上または約1、2、3、4、5、6、7、8、12、もしくは16週間ごとにモニタリングすることができる。患者の体重および/もしくは頭蓋サイズまたはそれらの変化は、治療の規定イベントにおいて、例えば、sFGFR3_Del4-C253Sの投与前および/または後に測定することもできる。例えば、体重および/または頭蓋サイズは、sFGFR3_Del4-C253Sの投与に応答して計測する。
さらに、軟骨無形成症を罹患するヒト患者(例えば、幼児、小児、若年者、または成人)は、特定の投与量(例えば、0.0002mg/kg/日~約20mg/kg/日、例えば、0.001mg/kg/日~7mg/kg/日)において適切な経路により(例えば、皮下注射による)sFGFR3_Del4-D3(配列番号33)のsFGFR3ポリペプチドを数日間、数週間、数ヵ月間、または数年間の過程にわたり投与することにより治療することができる。sFGFR3_Del4-D3により治療される軟骨無形成症の進行は、いくつかの確立された方法の1つ以上によりモニタリングすることができる。医師は、患者を直接的な観察によりモニタリングして患者により呈される軟骨無形成症の症状が治療に応答していかに変化したかを評価することができる。例えば、医師は、患者の体重、頭蓋長および/または頭蓋幅の変化を一定期間にわたり、例えば、sFGFR3_Del4-D3による治療過程にわたり1ヵ月当たりもしくは1年当たり1、2、3、4回以上または約1、2、3、4、5、6、7、8、12、もしくは16週間ごとにモニタリングすることができる。患者の体重および/もしくは頭蓋サイズまたはそれらの変化は、治療の規定イベントにおいて、例えば、sFGFR3_Del4-D3の投与前および/または後に測定することもできる。例えば、体重および/または頭蓋サイズは、sFGFR3_Del4-D3の投与に応答して計測する。
sFGFR3_Del4-D3およびsFGFR3_Del4-C253Sポリペプチドを実施例2に記載のとおり精製した。拡張Ig様C2型ドメイン3(FGFR3_Del4-D3)または253位におけるセリン残基によるシステイン残基のアミノ酸置換(sFGFR3_Del4-C253S)のいずれかを含めるためのsFGFR3_Del4の改変は、sFGFR3ポリペプチドの産生を改善した。特に、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用する還元および非還元の両方の条件(SDS-PAGE;それぞれ図7Aおよび7B)下でsFGFR3_Del4-D3およびsFGFR3_Del4-C253Sの約2%未満の凝集が存在した(FGFR3_Del4-D3について2.3mg/mlまたは23mg/mlおよびsFGFR3_Del4-C253Sについて1.5mg/mlおよび15mg/mlの濃度を使用するロード時に観察)。流加培養におけるsFGFR3_Del4-D3およびsFGFR3_Del4-C253Sの産生後、キャピラリー電気泳動を使用して上位5つのクローンを分離して0.93~1.0g/Lおよび0.98~1.1g/LのsFGFR3_Del4-D3およびsFGFR3_Del4-C253Sをそれぞれ得た。イオン交換クロマトグラフィーを使用するウイルス濾過は、sFGFR3_Del4-D3およびsFGFR3_Del4-C253Sの両方について60%超の収率をもたらした。
インビボ試験を実施してsFGFR3_Del4-D3の薬物動態パラメータ、血液脳関門を越えるsFGFR3_Del4-D3の取り込み、ならびに腎臓、肝臓、脾臓、肺、および心臓中のsFGFR3_Del4-D3の組織分布を調査した。本明細書に記載の試験は4つの処理群を含み、1処理群当たり5つの群のC57BL/6Jマウスおよび1群当たり合計4匹のマウス(n=4)を有した(表3)。マウスは雄であり、25~30グラムの体重であった。
示差走査熱量測定を使用してマウス血漿中のsFGFR3_Del4-D3およびsFGFR3_Del4-C253Sの熱安定性を調査した。sFGFR3_Del4-D3については、2つの緩衝液(20mMのリン酸塩、40mMのNaCl、pH7.5、および20mMのクエン酸塩、40mMのNaCl、pH6.5)をポリペプチド試料に添加した。sFGFR3_Del4-C253Sについては、2つの緩衝液(20mMのリン酸塩、40mMのNaCl、pH7.5、および40mMのクエン酸塩、40mMのNaCl、pH6.5)をポリペプチド試料に添加した。20mMのリン酸塩、40mMのNaCl、pH7.5緩衝液中のsFGFR3_Del4-C253Sについての融解温度(Tm)は52℃および56℃であり、40mMのクエン酸塩、40mMのNaCl、pH6.5緩衝液中のsFGFR3_Del4-C253SについてのTmは55℃および60℃であった(図8A)。sFGFR3_Del4-D3については、2つの緩衝液(20mMのリン酸塩、40mMのNaCl、pH7.5、および20mMのクエン酸塩、40mMのNaCl、pH6.5)をポリペプチド試料に添加した。20mMのリン酸塩、40mMのNaCl、pH7.5緩衝液中のsFGFR3_Del4-D3についてのTmは50℃および54℃であり、20mMのクエン酸塩、40mMのNaCl、pH6.5緩衝液中のsFGFR3_Del4-D3についてのTmは53℃および58℃であった(図8B)。これらの結果は、sFGFR3_Del4-D3およびsFGFR3_Del4-C253Sの両方がポリペプチド安定性およびアンフォールディングの2つのドメインを示すことを示す。
ヒトFGF2についてのsFGFR3_Del4-D3およびsFGFR3_Del4-C253Sの結合親和性を特徴付けるための実験を実施した。FGF2についてのsFGFR3_Del4-D3の解離定数(Kd)およびsFGFR3_Del4-C253SのKdを実施例3に記載のとおり測定し、20mMのリン酸塩、40mMのNaCl、pH7.5の再生緩衝液を用いた。13nM、6.5nM、3.25nM、および1.75nMの濃度を、sFGFR3_Del4-D3およびsFGFR3_Del4-C253Sの両方について試験した。sFGFR3_Del4-D3のKdは約3.6nmであることが測定され、sFGFR3_Del4-C253SのKdは約6.9nmであることが測定された。これらの結果は、sFGFR3_Del4-D3およびsFGFR3_Del4-C253Sが低いnM範囲でFGF2についての結合活性を有することを示す。
増殖アッセイを使用してsFGFR3_Del4-D3およびsFGFR3_Del4-C253Sの機能的活性を試験した。FGFR3ach突然変異を過剰発現するように遺伝子改変されたATDC5細胞(ATDC5 FGFR3G380R細胞系)を使用する増殖アッセイを実施例4に記載のとおり実施し、濃度はsFGFR3_Del4-D3およびsFGFR3_Del4-C253Sについて1ug/ml、10ug/ml、および50ug/mlであった。これらの濃度のそれぞれにおいて、sFGFR3_Del4-C253SおよびsFGFR3_Del4-D3は、FGFR3G380R細胞の増殖を回復させた(図10Aおよび10B)。EC50は、1ug/mlの濃度に基づきsFGFR3_Del4-D3およびsFGFR3_Del4-C253Sの両方について約10nMであることが測定された。これらの結果は、sFGFR3_Del4-D3およびsFGFR3_Del4-C253Sが低いnM範囲で生物学的に活性であることを示す。
2.5mg/kgの用量において皮下または静脈内投与されるsFGFR3_Del4-D3の薬物動態(PK)プロファイルを使用してsFGFR3_Del4-D3の終末期消失半減期を測定した(図11)。sFGFR3_Del4-D3を皮下投与されたマウスについて30分、2時間、4時間、8時間、24時間、36時間および48時間において試料を回収した。sFGFR3_Del4-D3を静脈内投与されたマウスについて1分、15分、30分、2時間、24時間、および36時間において試料を回収した。2.5mg/kgのsFGFR3_Del4-D3の皮下終末期消失半減期は約20時間であった一方、2.5mg/kgのsFGFR3_Del4-D3の静脈内終末期消失半減期は約7時間であった。PKプロファイルから、皮下投与された2.5mg/kgのsFGFR3_Del4-D3についてTmaxは約8時間であり、Cmaxは約4.5nMであり、推定バイオアベイラビリティは約30%であった。α相の間の静脈内投与されたsFGFR3_Del4-D3の急速なクリアランスとそれに続くより緩慢なβ相クリアランスが存在し、sFGFR3_Del4-C253Sについて類似の静脈内PKプロファイルであった。
sFGFR3_Del4-D3のクリアランスを腎臓、肝臓、脾臓、肺、および心臓組織において2.5mg/kgのsFGFR3_Del4-D3の静脈内投与の30分、120分、および1440分後、ならびに2.5mg/kgのsFGFR3_Del4-D3の皮下投与の30分、120分、240分、480分、および1440分後に評価した。肝臓および腎臓は、静脈内投与についてのsFGFR3_Del4-D3クリアランスの主要な経路であった(図12)。腎臓は、皮下投与についてのsFGFR3_Del4-D3クリアランスの主要な経路であった(図13)。
野生型マウスにおける血液脳関門を越えるsFGFR3_Del4-D3の取り込みを測定するための薬物動態試験も実施した。静脈内ボーラス注射後、sFGFR3_Del4-D3の脳組織の取り込みを3つの時点(30分、2時間、および24時間)において計測した。sFGFR3_Del4-D3を放射性標識トレーサー(125I-sFGFR3_Del4-D3)として、2.5mg/kgの非標識sFGFR3_Del4-D3と注射した。125I-sFGFR3_Del4-D3の注射用量は1動物当たり約10μCiであり、それは0.1mg/kg未満に対応する。マウスを30分、2時間、および24時間において安楽死させた後、臓器および血漿中の125I-sFGFR3_Del4-D3の濃度を液体シンチレーション計数により計測した。
sFGFR3_Del4-D3およびsFGFR3_Del4-C253Sを、2.5mg/kgの週1回もしくは2回または10mg/kgの週2回の皮下用量においてそれぞれ評価した。繁殖を実施して半数の野生型および半数のヘテロ接合性Fgfr3ach/+マウスを有する30匹のリッターを生成した(表4)。
sFGFR3_Del4-D3投与に伴う臓器毒性を特徴付けるための病理組織学的試験を実施した。野生型マウス(1用量当たり6匹の雄および6匹の雌)にPBS、2.5mg/kgのsFGFR3_Del4-D3を週1回、2.5mg/kgのsFGFR3_Del4-D3を週2回、または10mg/kgのsFGFR3_Del4-D3を週2回投与した。調査臓器は、腎臓、皮膚、唾液腺、下顎リンパ節、胆嚢、脾臓、膵臓、肺、心臓、大動脈、空腸、結腸、および肝臓を含んだ。sFGFR3_Del4-D3の用量のいずれかを投与された野生型マウス中の臓器毒性を示す病理組織学的結果は存在しなかった。これらの結果は、sFGFR3_Del4-D3の10mg/kgまでの週2回の投与に伴う毒性が存在しないことを示す。
本発明者らは、sFGFR3_Del4-D3が線維芽細胞成長因子(FGF)リガンドに結合し、膜結合FGFR3へのFGFの結合を妨害するためのデコイとして作用することを決定した。BIACORE(商標)T200(GE Healthcare)を使用して表面プラズモン共鳴を実施して固定化sFGFR3_Del4-D3への異なるヒトFGF(hFGF)結合についてのKd値を測定した。特に、hFGF1(図19A)、hFGF2(図19B)、hFGF9(図19C)、およびhFGF18(図19D)の傍分泌hFGFならびにhFGF19(図19E)およびhFGF21(図19F)の内分泌hFGFについてのKd値を測定した。4つ全ての傍分泌FGFリガンドは、ナノモル濃度(nM)の親和性でsFGFR3_Del4-D3に結合した(表8)。
FGFの結合後、FGFR3は二量体化してシグナリングカスケードを開始する。いくつかの下流シグナリング経路がFGFシグナリングに関連する。軟骨細胞において、二量体化FGFR3は、軟骨細胞への抗増殖シグナル/早期分化シグナルをもたらし、それが最終的に骨成長の阻害をもたらす。例えば、RAS/MAPK経路は、増殖、最終分化、および有糸分裂後マトリックス合成に負の影響を与えるためのシグナルを伝播し、STAT1経路は、細胞周期調節因子p107および130ならびに細胞周期阻害因子p21Waf/Cip1と協調して軟骨細胞増殖の阻害を媒介する。遺伝子発現試験は、多数の他の経路も成長促進分子の下方調節または抗増殖機能の誘導に関与することを示唆する。
上記明細書に挙げられる全ての刊行物、特許、および特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許または特許出願が参照により全体として組み込まれることが具体的および個別的に示されるのと同一の程度に参照して本明細書に組み込まれる。本発明の記載の方法、医薬組成物、およびキットの種々の改変および変形は、本発明の範囲および主旨から逸脱せずに当業者に明らかである。本発明を具体的な実施形態と関連付けて記載してきたが、それがさらに改変され得ることおよび特許請求される本発明がそのような具体的な実施形態に過度に限定されるべきでないことが理解される。実際、当業者に明らかな記載の本発明の実施方式の種々の改変は、本発明の範囲であるものとする。本出願は、一般に、本発明の原理に従って本発明の任意の変形、使用、または適合を包含し、本開示からのそのような逸脱は、本発明が属する分野内の公知の慣習的な実務の範囲内に収まるものとし、本明細書に上記の必須の特徴部に適用することができる。
[項1]
配列番号32のアミノ酸残基23~357と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド配列を含む可溶性線維芽細胞成長因子受容体3(sFGFR3)ポリペプチドであって、FGFR3のシグナルペプチドおよび膜貫通ドメインを欠き、(i)500アミノ酸長未満であるか;(ii)200以下の連続アミノ酸のFGFR3の細胞内ドメインを含むか;または(iii)FGFR3のチロシンキナーゼドメインを欠く、ポリペプチド。
[項2]
475、450、425、400、375、または350アミノ酸長未満である、上記項1に記載のポリペプチド。
[項3]
175、150、125、100、75、50、40、30、20、15以下の連続アミノ酸のFGFR3の細胞内ドメインを含む、上記項1に記載のポリペプチド。
[項4]
配列番号32のアミノ酸残基423~435と少なくとも90%、92%、95%、97%または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列をさらに含む、上記項1から3のいずれか一項に記載のポリペプチド。
[項5]
配列番号32のアミノ酸残基423~435をさらに含む、上記項1から3のいずれか一項に記載のポリペプチド。
[項6]
配列番号32のアミノ酸残基23~357と少なくとも92%、95%、97%、99%または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、上記項1から5のいずれか一項に記載のポリペプチド。
[項7]
配列番号33と少なくとも92%、95%、97%、99%または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、上記項1から5のいずれか一項に記載のポリペプチド。
[項8]
配列番号33を含む、またはそれからなる、上記項1から5のいずれか一項に記載のポリペプチド。
[項9]
配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む可溶性線維芽細胞成長因子受容体3(sFGFR3)ポリペプチドであって、配列番号1の253位におけるシステイン残基を除去するアミノ酸置換をさらに含む、ポリペプチド。
[項10]
前記253位におけるシステイン残基が、セリン残基により置換されている、上記項9に記載のポリペプチド。
[項11]
アミノ酸配列と少なくとも87%、90%、92%、95%、97%または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、上記項9または10に記載のポリペプチド。
[項12]
配列番号2のアミノ酸配列を含む、またはそれからなる、上記項9から11のいずれか一項に記載のポリペプチド。
[項13]
単離sFGFR3ポリペプチドである、上記項1から12のいずれか一項に記載のポリペプチド。
[項14]
線維芽細胞成長因子1(FGF1)、線維芽細胞成長因子2(FGF2)、線維芽細胞成長因子9(FGF9)、線維芽細胞成長因子18(FGF18)、線維芽細胞成長因子19(FGF19)または線維芽細胞成長因子21(FGF21)に結合する、上記項1から13のいずれか一項に記載のポリペプチド。
[項15]
前記結合が、約0.2nM~約20nMの平衡解離定数(K d )により特徴付けられる、上記項14に記載のポリペプチド。
[項16]
前記結合が、約1nM~約10nMのK d により特徴付けられ、場合により、前記K d が、約1nm、約2nm、約3nm、約4nm、約5nm、約6nm、約7nm、約8nm、約9nm、または約10nmである、上記項15に記載のポリペプチド。
[項17]
配列番号20、21、36または37の核酸配列と少なくとも85%、87%、90%、92%、95%、97%または99%の配列同一性を有する核酸配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる、上記項1から16のいずれか一項に記載のポリペプチド。
[項18]
前記ポリヌクレオチドが、配列番号20、21、36または37の核酸配列を含む、またはそれからなる、上記項17に記載のポリペプチド。
[項19]
前記ポリヌクレオチドが単離ポリヌクレオチドである、上記項17または18に記載のポリペプチド。
[項20]
上記項17から19のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
[項21]
プラスミド、人工染色体、ウイルスベクター、およびファージベクターからなる群より選択される、上記項20に記載のベクター。
[項22]
単離ポリヌクレオチドである、上記項21に記載のベクター。
[項23]
上記項17から19のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは上記項20から22のいずれか一項に記載のベクターを含む、宿主細胞。
[項24]
単離宿主細胞である、上記項23に記載の宿主細胞。
[項25]
HEK293細胞またはCHO細胞である、上記項23または24に記載の宿主細胞。
[項26]
上記項1から16のいずれか一項に記載のポリペプチド、上記項17から19のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、上記項20から22のいずれか一項に記載のベクター、または上記項23から25のいずれか一項に記載の宿主細胞を含む、組成物。
[項27]
薬学的に許容可能な賦形剤、担体または希釈剤をさらに含む、上記項26に記載の組成物。
[項28]
約0.002mg/kg~約30mg/kgの用量における投与のために配合される、上記項26または27に記載の組成物。
[項29]
約0.001mg/kg~約10mg/kgの用量における投与のために配合される、上記項28に記載の組成物。
[項30]
1日1回、週1回、または月1回の投与のために配合される、上記項26から29のいずれか一項に記載の組成物。
[項31]
週7回、週6回、週5回、週4回、週3回、週2回、週1回、2週間に1回、または月1回の投与のために配合される、上記項26から30のいずれか一項に記載の組成物。
[項32]
約2.5mg/kg~約10mg/kgの用量における週1回または週2回の投与のために配合される、上記項31に記載の組成物。
[項33]
非経口投与、腸内投与または局所投与のために配合される、上記項26から32のいずれか一項に記載の組成物。
[項34]
皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、髄腔内投与または腹腔内投与のために配合される、上記項33に記載の組成物。
[項35]
皮下投与のために配合される、上記項34に記載の組成物。
[項36]
上記項26から35のいずれか一項に記載の組成物を含む、医薬品。
[項37]
患者における骨格成長遅滞障害を治療する方法であって、上記項1から16のいずれか一項に記載のポリペプチド、上記項17から19のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、上記項20から22のいずれか一項に記載のベクター、上記項23から25のいずれか一項に記載の宿主細胞、上記項26から35のいずれか一項に記載の組成物、または上記項36に記載の医薬品を投与することを含む、方法。
[項38]
骨格成長遅滞障害を有する患者において組織にポリペプチドを送達する方法であって、該患者に有効量の上記項1から16のいずれか一項に記載のポリペプチド、上記項17から19のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、上記項20から22のいずれか一項に記載のベクター、上記項23から25のいずれか一項に記載の宿主細胞、上記項26から35のいずれか一項に記載の組成物、または上記項36に記載の医薬品を投与することを含む、方法。
[項39]
前記組織が骨格組織である、上記項38に記載の方法。
[項40]
前記骨格成長遅滞障害が、FGFR3関連骨格疾患である、上記項37から39のいずれか一項に記載の方法。
[項41]
前記FGFR3関連骨格疾患が、軟骨無形成症、タナトフォリック骨異形成症I型(TDI)、タナトフォリック骨異形成症II型(TDII)、発育遅延および黒色表皮症を伴う重度の軟骨無形成症(SADDAN)、軟骨低形成症、頭蓋骨縫合早期癒合症候群、ならびに屈指・高身長・難聴症候群(CATSHL)からなる群より選択される、上記項40に記載の方法。
[項42]
前記骨格成長遅滞障害が、軟骨無形成症である、上記項41に記載の方法。
[項43]
前記頭蓋骨縫合早期癒合症候群が、Muenke症候群、クルーゾン症候群、およびクルーゾン皮膚骨格症候群からなる群より選択される、上記項41に記載の方法。
[項44]
前記FGFR3関連骨格疾患が、前記患者における構成的に活性なFGFR3の発現により引き起こされる、上記項40から43のいずれか一項に記載の方法。
[項45]
前記構成的に活性なFGFR3が、配列番号5の380位のアミノ酸におけるアルギニン残基によるグリシン残基の置換を含む、上記項44に記載の方法。
[項46]
前記患者が、骨格成長遅滞障害と診断されている、上記項37から45のいずれか一項に記載の方法。
[項47]
前記患者が、四肢短縮、短い胴体、O脚、動揺性歩行、頭蓋異形、クローバー葉頭蓋、頭蓋骨縫合早期癒合症、ウォルム骨、手の奇形、足の奇形、ヒッチハイカーの親指、および胸部奇形からなる群より選択される前記骨格成長遅滞障害の1つ以上の症状を呈する、上記項37から46のいずれか一項に記載の方法。
[項48]
前記患者が、前記ポリペプチドの投与後に前記骨格成長遅滞障害の1つ以上の症状の改善を呈する、上記項47に記載の方法。
[項49]
前記患者が、ポリペプチドを予め投与されていない、上記項37から48のいずれか一項に記載の方法。
[項50]
前記患者が、幼児、小児、若年者および成人からなる群より選択される、上記項37から49のいずれか一項に記載の方法。
[項51]
前記患者がヒトである、上記項37から50のいずれか一項に記載の方法。
[項52]
前記ポリペプチドを、患者に約0.002mg/kg~約30mg/kgの用量で投与する、上記項37から51のいずれか一項に記載の方法。
[項53]
前記ポリペプチドを、患者に約0.001mg/kg~約10mg/kgの用量で投与する、上記項52に記載の方法。
[項54]
前記ポリペプチドを、患者に1日1回以上、週1回以上、月1回以上、または年1回以上投与する、上記項37から53のいずれか一項に記載の方法。
[項55]
前記ポリペプチドを、患者に週7回、週6回、週5回、週4回、週3回、週2回、週1回、2週間に1回、または月1回投与する、上記項37から54のいずれか一項に記載の方法。
[項56]
前記ポリペプチドを、患者に約0.25mg/kg~約20mg/kgの用量で、少なくとも約週1回または2回以上投与する、上記項55に記載の方法。
[項57]
前記ポリペプチドを、患者に約2.5mg/kgまたは約10mg/kgの用量で、週1回または2回投与する、上記項56に記載の方法。
[項58]
前記ポリペプチドを、患者に薬学的に許容可能な賦形剤、担体または希釈剤を含む組成物中で投与する、上記項37から57のいずれか一項に記載の方法。
[項59]
前記組成物を、患者に皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内または腹腔内投与する、上記項58に記載の方法。
[項60]
前記組成物を、患者に皮下注射により投与する、上記項59に記載の方法。
[項61]
前記ポリペプチドが、約2時間~約25時間のインビボ半減期を有する、上記項59または60に記載の方法。
[項62]
前記ポリペプチドの投与が、患者の生存率を増加させる、上記項37から61のいずれか一項に記載の方法。
[項63]
前記ポリペプチドの投与が、患者のロコモーションを改善する、上記項37から62のいずれか一項に記載の方法。
[項64]
前記ポリペプチドの投与が、患者における腹式呼吸を改善する、上記項37から63のいずれか一項に記載の方法。
[項65]
前記ポリペプチドの投与が、患者の体長および/または骨長を増加させる、上記項37から64のいずれか一項に記載の方法。
[項66]
前記ポリペプチドの投与が、患者における頭蓋比を改善し、および/または大後頭孔形状を回復させる、上記項37から65のいずれか一項に記載の方法。
[項67]
前記ポリペプチドの発現を生じさせるために好適な条件下で培養培地中で上記項23から25のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養し、前記培養培地から前記ポリペプチドを回収することを含む、上記項1から16のいずれか一項に記載のポリペプチドの産生方法。
[項68]
前記回収がクロマトグラフィーを含む、上記項67に記載の方法。
[項69]
前記クロマトグラフィーが、親和性クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィーを含む、上記項68に記載の方法。
[項70]
前記親和性クロマトグラフィーが、イオン交換クロマトグラフィーまたは抗FLAGクロマトグラフィーを含む、上記項69に記載の方法。
[項71]
前記抗FLAGクロマトグラフィーが、免疫沈降を含む、上記項70に記載の方法。
[項72]
患者における骨格成長遅滞障害を治療するための、上記項1から16のいずれか一項に記載のポリペプチド。
[項73]
前記骨格成長遅滞障害が、FGFR3関連骨格疾患である、上記項72に記載のポリペプチド。
[項74]
前記FGFR3関連骨格疾患が、軟骨無形成症、TDI、TDII、SADDAN、軟骨低形成症、頭蓋骨縫合早期癒合症候群およびCATSHLからなる群より選択される、上記項73に記載のポリペプチド。
[項75]
前記FGFR3関連骨格疾患が、軟骨無形成症である、上記項74に記載のポリペプチド。
[項76]
前記頭蓋骨縫合早期癒合症候群が、Muenke症候群、クルーゾン症候群およびクルーゾン皮膚骨格症候群からなる群より選択される、上記項75に記載のポリペプチド。
[項77]
前記FGFR3関連骨格疾患が、構成的に活性なFGFR3の前記患者における発現により引き起こされる、上記項73~76のいずれか一項に記載のポリペプチド。
[項78]
前記構成的に活性なFGFR3が、配列番号5の380位のアミノ酸におけるアルギニン残基によるグリシン残基の置換を含む、上記項77に記載のポリペプチド。
[項79]
前記患者が、前記骨格成長遅滞障害と診断されている、上記項72から78のいずれか一項に記載のポリペプチド。
[項80]
前記患者が、四肢短縮、短い胴体、O脚、動揺性歩行、頭蓋異形、クローバー葉頭蓋、頭蓋骨縫合早期癒合症、ウォルム骨、手の奇形、足の奇形、ヒッチハイカーの親指、および胸部奇形からなる群より選択される前記骨格成長遅滞障害の1つ以上の症状を呈する、上記項72から79のいずれか一項に記載のポリペプチド。
[項81]
前記患者が、前記sFGFR3ポリペプチドの投与後に前記骨格成長遅滞障害の1つ以上の症状の改善を呈する、上記項80に記載のポリペプチド。
[項82]
前記患者が、前記ポリペプチドを予め投与されていない、上記項72から81のいずれか一項に記載のポリペプチド。
[項83]
前記患者が、幼児、小児、若年者および成人からなる群より選択される、上記項72から82のいずれか一項に記載のポリペプチド。
[項84]
前記患者がヒトである、上記項72から83のいずれか一項に記載のポリペプチド。
[項85]
前記患者に約0.002mg/kg~約30mg/kgの用量で投与される、上記項72から84のいずれか一項に記載のポリペプチド。
[項86]
前記患者に約0.001mg/kg~約10mg/kgの用量で投与される、上記項85に記載のポリペプチド。
[項87]
前記患者に1日1回以上、週1回以上、月1回以上、または年1回以上投与される、上記項72から86のいずれか一項に記載のポリペプチド。
[項88]
前記患者に週7回、週6回、週5回、週4回、週3回、週2回、週1回、2週間に1回、または月1回投与される、上記項72から87のいずれか一項に記載のポリペプチド。
[項89]
前記患者に約2.5mg/kg~約10mg/kgの用量で、週2回投与される、上記項88に記載のポリペプチド。
[項90]
前記患者に、薬学的に許容可能な賦形剤、担体、または希釈剤を含む組成物中で投与される、上記項72から89のいずれか一項に記載のポリペプチド。
[項91]
前記組成物が、前記患者に非経口、腸内、または局所投与される、上記項90に記載のポリペプチド。
[項92]
前記組成物が、前記患者に皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、または腹腔内投与される、上記項91に記載のポリペプチド。
[項93]
前記組成物が、前記患者に皮下注射により投与される、上記項92に記載のポリペプチド。
[項94]
線維芽細胞成長因子1(FGF1)、線維芽細胞成長因子2(FGF2)、線維芽細胞成長因子9(FGF9)、線維芽細胞成長因子18(FGF18)、線維芽細胞成長因子19(FGF19)、または線維芽細胞成長因子21(FGF21)に結合する、上記項72から93のいずれか一項に記載のポリペプチド。
[項95]
FGFR3ポリペプチドからシグナルペプチド、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインの一部を欠失させることを含む、上記項1から8のいずれか一項に記載のポリペプチドを製造する方法。
[項96]
前記細胞内ドメインの前記一部が、配列番号32のアミノ酸残基436~806からなる、上記項95に記載の方法。
[項97]
配列番号1の253位におけるシステイン残基を除去するアミノ酸置換を導入することを含む、上記項9から12のいずれか一項に記載のポリペプチドを製造する方法。
[項98]
上記項1から16のいずれか一項に記載のポリペプチド、上記項17から19のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、上記項20から22のいずれか一項に記載のベクター、または上記項23から25のいずれか一項に記載の宿主細胞を含むキットであって、場合により、前記キットの使用説明書を含む、キット。
上記明細書に挙げられる全ての刊行物、特許、および特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許または特許出願が参照により全体として組み込まれることが具体的および個別的に示されるのと同一の程度に参照して本明細書に組み込まれる。本発明の記載の方法、医薬組成物、およびキットの種々の改変および変形は、本発明の範囲および主旨から逸脱せずに当業者に明らかである。本発明を具体的な実施形態と関連付けて記載してきたが、それがさらに改変され得ることおよび特許請求される本発明がそのような具体的な実施形態に過度に限定されるべきでないことが理解される。実際、当業者に明らかな記載の本発明の実施方式の種々の改変は、本発明の範囲であるものとする。本出願は、一般に、本発明の原理に従って本発明の任意の変形、使用、または適合を包含し、本開示からのそのような逸脱は、本発明が属する分野内の公知の慣習的な実務の範囲内に収まるものとし、本明細書に上記の必須の特徴部に適用することができる。
Claims (98)
- 配列番号32のアミノ酸残基23~357と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド配列を含む可溶性線維芽細胞成長因子受容体3(sFGFR3)ポリペプチドであって、FGFR3のシグナルペプチドおよび膜貫通ドメインを欠き、(i)500アミノ酸長未満であるか;(ii)200以下の連続アミノ酸のFGFR3の細胞内ドメインを含むか;または(iii)FGFR3のチロシンキナーゼドメインを欠く、ポリペプチド。
- 475、450、425、400、375、または350アミノ酸長未満である、請求項1に記載のポリペプチド。
- 175、150、125、100、75、50、40、30、20、15以下の連続アミノ酸のFGFR3の細胞内ドメインを含む、請求項1に記載のポリペプチド。
- 配列番号32のアミノ酸残基423~435と少なくとも90%、92%、95%、97%または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列をさらに含む、請求項1から3のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 配列番号32のアミノ酸残基423~435をさらに含む、請求項1から3のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 配列番号32のアミノ酸残基23~357と少なくとも92%、95%、97%、99%または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1から5のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 配列番号33と少なくとも92%、95%、97%、99%または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1から5のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 配列番号33を含む、またはそれからなる、請求項1から5のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む可溶性線維芽細胞成長因子受容体3(sFGFR3)ポリペプチドであって、配列番号1の253位におけるシステイン残基を除去するアミノ酸置換をさらに含む、ポリペプチド。
- 前記253位におけるシステイン残基が、セリン残基により置換されている、請求項9に記載のポリペプチド。
- 配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも87%、90%、92%、95%、97%または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項9または10に記載のポリペプチド。
- 配列番号2のアミノ酸配列を含む、またはそれからなる、請求項9から11のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 単離sFGFR3ポリペプチドである、請求項1から12のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 線維芽細胞成長因子1(FGF1)、線維芽細胞成長因子2(FGF2)、線維芽細胞成長因子9(FGF9)、線維芽細胞成長因子18(FGF18)、線維芽細胞成長因子19(FGF19)または線維芽細胞成長因子21(FGF21)に結合する、請求項1から13のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記結合が、約0.2nM~約20nMの平衡解離定数(Kd)により特徴付けられる、請求項14に記載のポリペプチド。
- 前記結合が、約1nM~約10nMのKdにより特徴付けられ、場合により、前記Kdが、約1nm、約2nm、約3nm、約4nm、約5nm、約6nm、約7nm、約8nm、約9nm、または約10nmである、請求項15に記載のポリペプチド。
- 配列番号20、21、36または37の核酸配列と少なくとも85%、87%、90%、92%、95%、97%または99%の配列同一性を有する核酸配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる、請求項1から16のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記ポリヌクレオチドが、配列番号20、21、36または37の核酸配列を含む、またはそれからなる、請求項17に記載のポリペプチド。
- 前記ポリヌクレオチドが単離ポリヌクレオチドである、請求項17または18に記載のポリペプチド。
- 請求項17から19のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- プラスミド、人工染色体、ウイルスベクター、およびファージベクターからなる群より選択される、請求項20に記載のベクター。
- 単離ポリヌクレオチドである、請求項21に記載のベクター。
- 請求項17から19のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項20から22のいずれか一項に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 単離宿主細胞である、請求項23に記載の宿主細胞。
- HEK293細胞またはCHO細胞である、請求項23または24に記載の宿主細胞。
- 請求項1から16のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項17から19のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項20から22のいずれか一項に記載のベクター、または請求項23から25のいずれか一項に記載の宿主細胞を含む、組成物。
- 薬学的に許容可能な賦形剤、担体または希釈剤をさらに含む、請求項26に記載の組成物。
- 約0.002mg/kg~約30mg/kgの用量における投与のために配合される、請求項26または27に記載の組成物。
- 約0.001mg/kg~約10mg/kgの用量における投与のために配合される、請求項28に記載の組成物。
- 1日1回、週1回、または月1回の投与のために配合される、請求項26から29のいずれか一項に記載の組成物。
- 週7回、週6回、週5回、週4回、週3回、週2回、週1回、2週間に1回、または月1回の投与のために配合される、請求項26から30のいずれか一項に記載の組成物。
- 約2.5mg/kg~約10mg/kgの用量における週1回または週2回の投与のために配合される、請求項31に記載の組成物。
- 非経口投与、腸内投与または局所投与のために配合される、請求項26から32のいずれか一項に記載の組成物。
- 皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、髄腔内投与または腹腔内投与のために配合される、請求項33に記載の組成物。
- 皮下投与のために配合される、請求項34に記載の組成物。
- 請求項26から35のいずれか一項に記載の組成物を含む、医薬品。
- 患者における骨格成長遅滞障害を治療する方法であって、請求項1から16のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項17から19のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項20から22のいずれか一項に記載のベクター、請求項23から25のいずれか一項に記載の宿主細胞、請求項26から35のいずれか一項に記載の組成物、または請求項36に記載の医薬品を投与することを含む、方法。
- 骨格成長遅滞障害を有する患者において組織にポリペプチドを送達する方法であって、該患者に有効量の請求項1から16のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項17から19のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項20から22のいずれか一項に記載のベクター、請求項23から25のいずれか一項に記載の宿主細胞、請求項26から35のいずれか一項に記載の組成物、または請求項36に記載の医薬品を投与することを含む、方法。
- 前記組織が骨格組織である、請求項38に記載の方法。
- 前記骨格成長遅滞障害が、FGFR3関連骨格疾患である、請求項37から39のいずれか一項に記載の方法。
- 前記FGFR3関連骨格疾患が、軟骨無形成症、タナトフォリック骨異形成症I型(TDI)、タナトフォリック骨異形成症II型(TDII)、発育遅延および黒色表皮症を伴う重度の軟骨無形成症(SADDAN)、軟骨低形成症、頭蓋骨縫合早期癒合症候群、ならびに屈指・高身長・難聴症候群(CATSHL)からなる群より選択される、請求項40に記載の方法。
- 前記骨格成長遅滞障害が、軟骨無形成症である、請求項41に記載の方法。
- 前記頭蓋骨縫合早期癒合症候群が、Muenke症候群、クルーゾン症候群、およびクルーゾン皮膚骨格症候群からなる群より選択される、請求項41に記載の方法。
- 前記FGFR3関連骨格疾患が、前記患者における構成的に活性なFGFR3の発現により引き起こされる、請求項40から43のいずれか一項に記載の方法。
- 前記構成的に活性なFGFR3が、配列番号5の380位のアミノ酸におけるアルギニン残基によるグリシン残基の置換を含む、請求項44に記載の方法。
- 前記患者が、骨格成長遅滞障害と診断されている、請求項37から45のいずれか一項に記載の方法。
- 前記患者が、四肢短縮、短い胴体、O脚、動揺性歩行、頭蓋異形、クローバー葉頭蓋、頭蓋骨縫合早期癒合症、ウォルム骨、手の奇形、足の奇形、ヒッチハイカーの親指、および胸部奇形からなる群より選択される前記骨格成長遅滞障害の1つ以上の症状を呈する、請求項37から46のいずれか一項に記載の方法。
- 前記患者が、前記ポリペプチドの投与後に前記骨格成長遅滞障害の1つ以上の症状の改善を呈する、請求項47に記載の方法。
- 前記患者が、ポリペプチドを予め投与されていない、請求項37から48のいずれか一項に記載の方法。
- 前記患者が、幼児、小児、若年者および成人からなる群より選択される、請求項37から49のいずれか一項に記載の方法。
- 前記患者がヒトである、請求項37から50のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリペプチドを、患者に約0.002mg/kg~約30mg/kgの用量で投与する、請求項37から51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリペプチドを、患者に約0.001mg/kg~約10mg/kgの用量で投与する、請求項52に記載の方法。
- 前記ポリペプチドを、患者に1日1回以上、週1回以上、月1回以上、または年1回以上投与する、請求項37から53のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリペプチドを、患者に週7回、週6回、週5回、週4回、週3回、週2回、週1回、2週間に1回、または月1回投与する、請求項37から54のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリペプチドを、患者に約0.25mg/kg~約20mg/kgの用量で、少なくとも約週1回または2回以上投与する、請求項55に記載の方法。
- 前記ポリペプチドを、患者に約2.5mg/kgまたは約10mg/kgの用量で、週1回または2回投与する、請求項56に記載の方法。
- 前記ポリペプチドを、患者に薬学的に許容可能な賦形剤、担体または希釈剤を含む組成物中で投与する、請求項37から57のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物を、患者に皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内または腹腔内投与する、請求項58に記載の方法。
- 前記組成物を、患者に皮下注射により投与する、請求項59に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが、約2時間~約25時間のインビボ半減期を有する、請求項59または60に記載の方法。
- 前記ポリペプチドの投与が、患者の生存率を増加させる、請求項37から61のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリペプチドの投与が、患者のロコモーションを改善する、請求項37から62のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリペプチドの投与が、患者における腹式呼吸を改善する、請求項37から63のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリペプチドの投与が、患者の体長および/または骨長を増加させる、請求項37から64のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリペプチドの投与が、患者における頭蓋比を改善し、および/または大後頭孔形状を回復させる、請求項37から65のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリペプチドの発現を生じさせるために好適な条件下で培養培地中で請求項23から25のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養し、前記培養培地から前記ポリペプチドを回収することを含む、請求項1から16のいずれか一項に記載のポリペプチドの産生方法。
- 前記回収がクロマトグラフィーを含む、請求項67に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィーが、親和性クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィーを含む、請求項68に記載の方法。
- 前記親和性クロマトグラフィーが、イオン交換クロマトグラフィーまたは抗FLAGクロマトグラフィーを含む、請求項69に記載の方法。
- 前記抗FLAGクロマトグラフィーが、免疫沈降を含む、請求項70に記載の方法。
- 患者における骨格成長遅滞障害を治療するための、請求項1から16のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記骨格成長遅滞障害が、FGFR3関連骨格疾患である、請求項72に記載のポリペプチド。
- 前記FGFR3関連骨格疾患が、軟骨無形成症、TDI、TDII、SADDAN、軟骨低形成症、頭蓋骨縫合早期癒合症候群およびCATSHLからなる群より選択される、請求項73に記載のポリペプチド。
- 前記FGFR3関連骨格疾患が、軟骨無形成症である、請求項74に記載のポリペプチド。
- 前記頭蓋骨縫合早期癒合症候群が、Muenke症候群、クルーゾン症候群およびクルーゾン皮膚骨格症候群からなる群より選択される、請求項75に記載のポリペプチド。
- 前記FGFR3関連骨格疾患が、構成的に活性なFGFR3の前記患者における発現により引き起こされる、請求項73~76のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記構成的に活性なFGFR3が、配列番号5の380位のアミノ酸におけるアルギニン残基によるグリシン残基の置換を含む、請求項77に記載のポリペプチド。
- 前記患者が、前記骨格成長遅滞障害と診断されている、請求項72から78のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記患者が、四肢短縮、短い胴体、O脚、動揺性歩行、頭蓋異形、クローバー葉頭蓋、頭蓋骨縫合早期癒合症、ウォルム骨、手の奇形、足の奇形、ヒッチハイカーの親指、および胸部奇形からなる群より選択される前記骨格成長遅滞障害の1つ以上の症状を呈する、請求項72から79のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記患者が、前記sFGFR3ポリペプチドの投与後に前記骨格成長遅滞障害の1つ以上の症状の改善を呈する、請求項80に記載のポリペプチド。
- 前記患者が、前記ポリペプチドを予め投与されていない、請求項72から81のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記患者が、幼児、小児、若年者および成人からなる群より選択される、請求項72から82のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記患者がヒトである、請求項72から83のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記患者に約0.002mg/kg~約30mg/kgの用量で投与される、請求項72から84のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記患者に約0.001mg/kg~約10mg/kgの用量で投与される、請求項85に記載のポリペプチド。
- 前記患者に1日1回以上、週1回以上、月1回以上、または年1回以上投与される、請求項72から86のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記患者に週7回、週6回、週5回、週4回、週3回、週2回、週1回、2週間に1回、または月1回投与される、請求項72から87のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記患者に約2.5mg/kg~約10mg/kgの用量で、週2回投与される、請求項88に記載のポリペプチド。
- 前記患者に、薬学的に許容可能な賦形剤、担体、または希釈剤を含む組成物中で投与される、請求項72から89のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記組成物が、前記患者に非経口、腸内、または局所投与される、請求項90に記載のポリペプチド。
- 前記組成物が、前記患者に皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、または腹腔内投与される、請求項91に記載のポリペプチド。
- 前記組成物が、前記患者に皮下注射により投与される、請求項92に記載のポリペプチド。
- 線維芽細胞成長因子1(FGF1)、線維芽細胞成長因子2(FGF2)、線維芽細胞成長因子9(FGF9)、線維芽細胞成長因子18(FGF18)、線維芽細胞成長因子19(FGF19)、または線維芽細胞成長因子21(FGF21)に結合する、請求項72から93のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- FGFR3ポリペプチドからシグナルペプチド、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインの一部を欠失させることを含む、請求項1から8のいずれか一項に記載のポリペプチドを製造する方法。
- 前記細胞内ドメインの前記一部が、配列番号32のアミノ酸残基436~806からなる、請求項95に記載の方法。
- 配列番号1の253位におけるシステイン残基を除去するアミノ酸置換を導入することを含む、請求項9から12のいずれか一項に記載のポリペプチドを製造する方法。
- 請求項1から16のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項17から19のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項20から22のいずれか一項に記載のベクター、または請求項23から25のいずれか一項に記載の宿主細胞を含むキットであって、場合により、前記キットの使用説明書を含む、キット。
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