ES2912559T3

ES2912559T3 - Polipéptidos del receptor 3 del factor de crecimiento de fibroblastos solubles (sFGFR3) y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2912559T3
Application number: ES17742195T
Authority: ES
Inventors: Elvire Gouze; Stéphanie Garcia
Original assignee: Pfizer Corp Belgium; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Universite de Nice Sophia Antipolis UNSA; Pfizer Corp SRL
Current assignee: Pfizer Corp Belgium; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Universite de Nice Sophia Antipolis UNSA; Pfizer Corp SRL
Priority date: 2016-07-07
Filing date: 2017-07-07
Publication date: 2022-05-26
Anticipated expiration: 2037-07-07
Also published as: JP7348980B2; KR20220122762A; SG11201900074WA; KR102432192B1; AU2017294551B2; EP3481859B1; IL264030A; PL3481859T3; CN109715658B; EP3481859A1; JP2019527053A; US20210309718A1; AU2017294551A1; US20180230197A1; CA3029877A1; MX2018016257A; ZA201900507B; JP7046903B2; US11021528B2; US10294289B2

Abstract

Un polipéptido del receptor 3 del factor de crecimiento de fibroblastos solubles (sFGFR3), cuya secuencia de aminoácidos consiste en una secuencia de aminoácidos con al menos un 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 4.

Description

DESCRIPCIÓN

Polipéptidos del receptor 3 del factor de crecimiento de fibroblastos solubles (sFGFR3) y usos de los mismos Campo de la invención

La invención presenta polipéptidos del receptor 3 del factor de crecimiento de fibroblastos solubles (sFGFR3) y composiciones de los mismos. La invención también cuenta con procedimientos para tratar los trastornos de retraso del crecimiento esquelético, tales como la acondroplasia.

Antecedentes de la invención

El receptor 3 del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR3) es un miembro de la familia del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR), en la que existe una alta conservación de la secuencia de aminoácidos entre los miembros de la familia. Los miembros de la familia FGFR se diferencian tanto por su afinidad de unión al ligando como por su distribución en los tejidos. Un polipéptido FGFR de longitud completa contiene un dominio extracelular (DEC), un dominio transmembrana hidrofóbico y un dominio citoplasmático de tirosina quinasa. El DEC de los polipéptidos FGFR interactúa con los factores de crecimiento de los fibroblastos (FGF) para mediar en la señalización descendente, que en última instancia influye en la diferenciación celular. En particular, la activación de la proteína FGFR3 desempeña un papel en el desarrollo óseo al inhibir la proliferación de condrocitos en el cartílago de crecimiento y limitar el alargamiento del hueso.

Se sabe que las mutaciones puntuales de ganancia de función en el FGFR3 causan diversos tipos de trastornos de retraso en el crecimiento del esqueleto humano, tales como la acondroplasia, la displasia tanatofórica de tipo I (TDI), la displasia tanatofórica de tipo II (TDII), la acondroplasia severa con retraso en el desarrollo y acantosis nigricans (SADDAN), la hipocondroplasia y los síndromes de craneosinostosis (por ejemplo, Muenke, Crouzon y Crouzonodermoskeletal). También se sabe que las mutaciones puntuales de pérdida de función en el FGFR3 causan trastornos de retraso del crecimiento esquelético, tales como el síndrome de camptodactilia, estatura alta y pérdida de audición (CATSHL). La acondroplasia es la forma más común de enanismo de extremidades cortas y se caracteriza por una cortedad desproporcionada de las extremidades y una macrocefalia relativa. Aproximadamente el 97% de la acondroplasia está causada por una única mutación puntual en el gen que codifica el FGFR3, en la que un residuo de glicina se sustituye por un residuo de arginina en la posición 380 de la secuencia de aminoácidos del FGFR3. Tras la unión del ligando, la mutación disminuye la eliminación del complejo receptor/ligando, lo que da lugar a una señalización intracelular prolongada. Esta señalización prolongada del FGFR3 inhibe la proliferación y la diferenciación de la placa de crecimiento del cartílago, lo que perjudica el crecimiento del hueso endocondral.

Existe la necesidad de mejorar las terapias dirigidas al FGFR3 disfuncional para el tratamiento de los trastornos del retraso del crecimiento esquelético, como la acondroplasia.

Sumario de la invención

La invención presenta polipéptidos del receptor 3 del factor de crecimiento de fibroblastos solubles (sFGFR3) con una secuencia de aminoácidos que consiste en una secuencia de aminoácidos con al menos un 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 4, y usos de los mismos para el tratamiento de los trastornos de retraso del crecimiento esquelético (por ejemplo, la acondroplasia) en un paciente (por ejemplo, un humano, particularmente un bebé, un niño o un adolescente).

Un primer aspecto de la invención presenta un polipéptido del receptor 3 del factor de crecimiento de fibroblastos solubles (sFGFR3) con una secuencia de aminoácidos que consiste en una secuencia de aminoácidos con al menos un 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 4. En particular, el polipéptido incluye una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC. ID Núm.: 33 (por ejemplo, el polipéptido incluye o consiste en SEC. ID Núm.: 33).

El polipéptido sFGFR3 puede incluir una sustitución de aminoácidos que remueve un residuo de cisteína en la posición 253 de la SEC. ID Núm.: 1. Por ejemplo, el residuo de cisteína en la posición 253 se sustituye por un residuo de serina o, por ejemplo, por otra sustitución de aminoácidos conservadora, tales como alanina, glicina, prolina o treonina.

El polipéptido sFGFR3 puede estar formado por la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 4.

También se desvela un polinucleótido (por ejemplo, un polinucleótido aislado) que codifica el polipéptido sFGFR3 del primer aspecto de la invención (opcionalmente con un péptido señal, por ejemplo, el péptido señal puede tener la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 6 o 35 o una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 92%, 95%, 97% o 99% de identidad de secuencia con la SEC. ID Núm.: 6 o 35), que incluye una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 85%, 90%, 92%, 95%, 97% o 99% de identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de la SEC. ID Núm.: 21 o 37 (por ejemplo, el polinucleótido incluye o consiste en el ácido nucleico de la SEC. ID Núm.: 21 o 37), También se desvela un vector (por ejemplo, un vector aislado) que incluye el polinucleótido, tal como un plásmido, un cromosoma artificial, un vector viral o un vector fago. Además, se desvela una célula huésped (por ejemplo, una célula huésped aislada) que incluye el polinucleótido, tal como una célula HEK 293 o una célula CHO.

La invención presenta una composición que incluye el polipéptido sFGFR3 del primer aspecto de la invención. También se desvela una composición que incluye el polinucleótido que codifica el polipéptido sFGFR3 del primer aspecto de la invención. Además, el vector o célula huésped que incluye el polinucleótido que codifica el polipéptido sFGFR3 se puede formular en una composición. La composición además puede incluir un excipiente, portador o diluyente aceptable para uso farmacéutico. La composición que incluye el polipéptido, polinucleótido o vector de sFGFR3 se puede formular para su administración a una dosis de aproximadamente 0,002 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, tales como por ejemplo de aproximadamente 0,001 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. La composición que incluye la célula huésped se puede formular para su administración a una dosis de aproximadamente 1 * 103 células/mL a aproximadamente 1 * 1012 células/mL. La composición se puede formular para su administración diaria, semanal o mensual, tal como por ejemplo siete veces por semana, seis veces por semana, cinco veces por semana, cuatro veces por semana, tres veces por semana, dos veces por semana, semanalmente, cada dos semanas o una vez por mes. Por ejemplo, la composición que incluye el polipéptido, polinucleótido o vector de sFGFR3 se formula para su administración a una dosis de aproximadamente 0,25 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg una o dos veces por semana. La composición se puede formular para la administración parenteral (por ejemplo, administración subcutánea, administración intravenosa, administración intramuscular, administración intraarterial, administración intratecal o administración intraperitoneal), administración enteral o administración tópica. Preferentemente, la composición está formulada para la administración subcutánea. La invención también presenta un medicamento que incluye la composición que incluye el polipéptido sFGFR3 del primer aspecto de la invención. Además, se desvela un medicamento que incluye la composición con el polinucleótido, el vector o la célula huésped.

Se además describe un procedimiento de administración de un polipéptido sFGFR3 a un tejido (por ejemplo, un tejido esquelético) en un paciente (por ejemplo, un humano) que tiene un trastorno de retraso del crecimiento esquelético (por ejemplo, acondroplasia) que incluye administrar al paciente una cantidad eficaz del polipéptido sFGFR3 del primer aspecto de la invención, un polinucleótido que codifica el polipéptido sFGFR3, un vector que contiene el polinucleótido, una célula huésped que contiene el polinucleótido o el vector, o una composición que contiene el polipéptido, el polinucleótido, el vector o la célula huésped.

Un segundo aspecto de la invención presenta el polipéptido del primer aspecto de la invención o una composición que contiene el polipéptido para su uso en un procedimiento de tratamiento de un trastorno de retraso del crecimiento esquelético (por ejemplo, una enfermedad esquelética relacionada con FGFR3) en un paciente (por ejemplo, un humano) que incluye la administración del polipéptido del primer aspecto de la invención. También se describe un polinucleótido que codifica el polipéptido, un vector que contiene el polinucleótido, una célula huésped que contiene el polinucleótido o el vector, o una composición que contiene el polinucleótido, el vector, o la célula huésped para su uso en un procedimiento de tratamiento de un trastorno de retraso del crecimiento esquelético (por ejemplo, una enfermedad esquelética relacionada con FGFR3) en un paciente (por ejemplo, un humano) que incluye la administración del polinucleótido, el vector, una célula huésped o la composición. La enfermedad esquelética relacionada con FGFR3 se selecciona del grupo que consiste en acondroplasia, displasia tanatofórica tipo I (TDI), displasia tanatofórica tipo II (TDII), acondroplasia severa con retraso del desarrollo y acantosis nigricans (SADDEN), hipocondroplasia, un síndrome de craneosinostosis (por ejemplo, Muenke, Crouzon y Crouzonodermoskeletal) y el síndrome de camptodactilia, estatura alta y pérdida de audición (CATSHL). En concreto, el trastorno de retraso del crecimiento esquelético es la acondroplasia.

La enfermedad esquelética relacionada con el FGFR3 puede ser causada por la expresión en el paciente de un FGFR3 constitutivamente activo, tal como una sustitución de aminoácidos de un residuo de glicina por un residuo de arginina en la posición 380 de la SEC. ID Núm.: 5 o 32. En particular, el paciente puede ser diagnosticado con el trastorno de retraso en el crecimiento esquelético (por ejemplo, antes del tratamiento). Por ejemplo, el paciente presenta uno o más síntomas del trastorno de retraso del crecimiento esquelético seleccionados del grupo que consiste en extremidades cortas, tronco corto, piernas arqueadas, marcha de pato, malformaciones del cráneo, cráneo en forma de hoja de trébol, craneosinostosis, huesos wormianos, anomalías de las manos, anomalías de los pies, pulgar de autoestopista y anomalías del pecho, de forma que el paciente muestre una mejoría en uno o más síntomas del trastorno de retraso del crecimiento esquelético tras la administración del polipéptido sFGFR3 (o un polinucleótido que codifica el polipéptido, un vector que contiene el polinucleótido, una célula huésped que contiene el polinucleótido o el vector, o una composición que contiene el polipéptido, el polinucleótido, el vector o la célula huésped). Además, el paciente puede no haber recibido previamente el polipéptido sFGFR3 (o un polinucleótido que codifique el polipéptido, un vector que contenga el polinucleótido, una célula huésped que contenga el polinucleótido o el vector, o una composición que contenga el polipéptido, el polinucleótido, el vector o la célula huésped). Por ejemplo, el paciente puede ser un bebé, un niño, un adolescente o un adulto.

Por ejemplo, el polipéptido (o polinucleótido o vector) se administra al paciente a una dosis de aproximadamente 0,002 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg (por ejemplo, una dosis de aproximadamente 0,001 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg). El polipéptido se puede administrar al paciente una o más veces al día, semanalmente (por ejemplo, dos veces por semana, tres veces por semana, cuatro veces por semana, cinco veces por semana, seis veces por semana o siete veces por semana), cada dos semanas, mensualmente o anualmente. Por ejemplo, el polipéptido se administra al paciente a una dosis de aproximadamente 0,25 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg al menos una o dos veces por semana o más (por ejemplo, el polipéptido se administra al paciente a una dosis de aproximadamente 2,5 mg/kg o aproximadamente 10 mg/kg una o dos veces por semana). El polipéptido se puede administrar al paciente en una composición que incluya un excipiente, portador o diluyente aceptable para uso farmacéutico. El polipéptido se puede administrar al paciente por vía parenteral (por ejemplo, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal o intraperitoneal), enteral o tópica. Preferentemente, la composición se administra al paciente por inyección subcutánea. Además, el polipéptido se puede unir al factor de crecimiento de fibroblastos 1 (FGF1), al factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2), al factor de crecimiento de fibroblastos 9 (FGF9), al factor de crecimiento de fibroblastos 18 (FGF18), al factor de crecimiento de fibroblastos 19 (FGF19) o al factor de crecimiento de fibroblastos 21 (FGF21). En particular, la unión se puede caracterizar por una constante de disociación de equilibrio (Kd) de aproximadamente 0,2 nM a aproximadamente 20 nM, tal como la unión se caracteriza por una Kd de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 10 nM (por ejemplo, de aproximadamente 1 nm, de aproximadamente 2 nm, de aproximadamente 3 nm, de aproximadamente 4 nm, de aproximadamente 5 nm, de aproximadamente 6 nm, de aproximadamente 7 nm, de aproximadamente 8 nm, de aproximadamente 9 nm o de aproximadamente 10 nm). El polipéptido puede mostrar una mayor afinidad de unión a FGF1, FGF2, FGF9 y FGF18 en relación con la afinidad de unión del polipéptido a FGF19 y FGF21.

El polipéptido puede tener una vida media in vivo de entre aproximadamente 2 horas y aproximadamente 25 horas (por ejemplo, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 13 horas, 14 horas, 15 horas, 16 horas, 17 horas, 18 horas, 19 horas, 20 horas, 21 horas, 22 horas, 23 horas, 24 horas o 25 horas). La administración del polipéptido sFGFR3 puede aumentar la supervivencia del paciente y/o restaurar la forma del foramen magnum del paciente. Preferentemente, la administración del polipéptido proporciona uno o más, o todos, de los siguientes: un aumento de la supervivencia del paciente, una mejora de la locomoción del paciente, una mejora de la respiración abdominal en el paciente, un aumento de la longitud corporal y/o ósea del paciente, una mejora de la relación craneal del paciente, y/o la restauración de la forma del foramen magnum en el paciente, por ejemplo, en relación con un paciente no tratado (por ejemplo, un paciente con acondroplasia no tratado).

Se desvela además un procedimiento de producción del polipéptido sFGFR3 del primer aspecto de la invención, que incluye cultivar la célula huésped descrita anteriormente (por ejemplo, una célula CHO o una célula HEK 293) en un medio de cultivo en condiciones adecuadas para efectuar la expresión del polipéptido sFGFR3 y recuperar el polipéptido sFGFR3 del medio de cultivo. En particular, la recuperación incluye la cromatografía, tal como la cromatografía de afinidad (por ejemplo, la cromatografía de intercambio iónico o la cromatografía anti-FLAG, tal como la inmunoprecipitación) o la cromatografía de exclusión por tamaño.

El polipéptido sFGFR3 de la invención puede ser codificado por un polinucleótido que incluye una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 85%, 90%, 92%, 95%, 97% o 99% de identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de la SEC. ID Núm.: 21 o 37 (por ejemplo, el polinucleótido incluye o consiste en el ácido nucleico de la SEC. ID Núm.: 21 o 37),

La composición que incluye la célula huésped se puede administrar al paciente (por ejemplo, un humano) a una dosis de aproximadamente 1 * 103 células/mL a aproximadamente 1 * 1012 células/mL. Por ejemplo, el polipéptido, polinucleótido, vector o célula huésped de sFGFR3 se administra al paciente una o más veces al día, semanalmente, mensualmente o anualmente (por ejemplo, el polipéptido de sFGFR3 se administra al paciente siete veces por semana, seis veces por semana, cinco veces por semana, cuatro veces por semana, tres veces por semana, dos veces por semana, semanalmente, cada dos semanas o una vez por mes).

La divulgación presenta un procedimiento de fabricación del polipéptido sFGFR3 del primer aspecto de la invención por medio de la supresión del péptido señal, el dominio transmembrana y una porción del dominio intracelular de un polipéptido FGFR3 (por ejemplo, para fabricar un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 33). En particular, el dominio intracelular consiste en los residuos de aminoácidos 436 a 806 de la SEC. ID Núm.: 32. La divulgación también presenta un procedimiento de fabricación del polipéptido sFGFR3 por medio de la introducción de una sustitución de aminoácidos que remueve un residuo de cisteína en la posición 253 de la SEC. ID Núm.: 1. Por ejemplo, el residuo de cisteína en la posición 253 se sustituye por un residuo de serina o, por ejemplo, por otra sustitución de aminoácidos conservadora, tal como alanina, glicina, prolina o treonina.

La invención también presenta un kit que incluye el polipéptido sFGFR3 del primer aspecto de la invención (por ejemplo, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 4 o 33), La divulgación presenta además un kit que incluye el polinucleótido (por ejemplo, un polinucleótido que tiene la secuencia de ácido nucleico de la SEC. ID Núm.: 21 o 37), el vector (por ejemplo, un plásmido, un cromosoma artificial, un vector viral o un vector fago) o la célula huésped (por ejemplo, una célula HEK 293 o una célula CHO) descritos anteriormente.

El kit incluye opcionalmente instrucciones de uso.

Definiciones

Como se utiliza en la presente memoria, “un” y “una” significa “al menos uno/a” o “uno/a o más”, a menos que se indique lo contrario. Además, las formas singulares “un”, “una”, “el” y “la” incluyen referentes plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario.

Como se utiliza en la presente memoria, “aproximadamente” se refiere a una cantidad que es ± 10% del valor recitado y es preferentemente ±5% del valor recitado, o más preferentemente ±2% del valor recitado. Por ejemplo, el término “aproximadamente” se puede usar para modificar todas las dosis o intervalos recitados en la presente memoria en ± 10% de los valores recitados o puntos finales del intervalo.

El término “dominio” se refiere a una región conservada de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido (por ejemplo, un polipéptido FGFR3) que tiene una estructura y/o función identificable dentro del polipéptido. Un dominio puede variar en longitud desde, por ejemplo, aproximadamente 20 aminoácidos hasta aproximadamente 600 aminoácidos. Los dominios ejemplares incluyen los dominios de inmunoglobulina del FGFR3 (por ejemplo, el dominio 1 de tipo C2 similar a Ig, el dominio 2 de tipo C2 similar a Ig y el dominio 3 de tipo C2 similar a Ig).

El término “dosificación” se refiere a una cantidad determinada de un agente activo (por ejemplo, un polipéptido sFGFR3 o una variante del mismo, tal como un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 4 o 33) calculado para producir un efecto terapéutico deseado (por ejemplo, el tratamiento de un trastorno de retraso del crecimiento esquelético, tal como la acondroplasia) cuando el agente activo se administra a un paciente (por ejemplo, un paciente que tiene un trastorno de retraso del crecimiento esquelético, como la acondroplasia). Una dosis se puede definir en términos de una cantidad definida del agente activo o una cantidad definida unida a una frecuencia particular de administración. Una forma de dosificación puede incluir un polipéptido sFGFR3 o un fragmento del mismo en asociación con cualquier excipiente farmacéutico, portador o diluyente adecuado.

Los términos “cantidad efectiva”, “cantidad efectiva para” y “cantidad terapéuticamente efectiva” se refieren a una cantidad de un polipéptido sFGFR3, un vector que codifica un sFGR3, y/o una composición de sFGFR3 que es suficiente para producir un resultado deseado, por ejemplo, el tratamiento de un trastorno de retraso del crecimiento esquelético (por ejemplo, acondroplasia).

Los términos “dominio extracelular” y “DEC” se refieren a la porción de un polipéptido FGFR3 que se extiende más allá del dominio transmembrana en el espacio extracelular. El DEC media la unión de un FGFR3 a uno o más factores de crecimiento de fibroblastos (FGF). Por ejemplo, un DEC incluye los dominios tipo Ig2 1-3 de un polipéptido FGFR3. En particular, el DEC incluye el dominio tipo C2 de tipo Ig de un polipéptido FGFR3 de tipo salvaje (por ejemplo, los aminoácidos 36 a 88 de un polipéptido FGFR3 de tipo salvaje que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 5 (una proteína FGFR3 madura sin secuencia señal) o los aminoácidos 57 a 110 de un polipéptido FGFR3 wt que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 32 (una proteína FGFR3 precursora con la secuencia de señal)), el dominio 2 de tipo C2 similar a Ig de un polipéptido FGFR3 de tipo salvaje (wt) (por ejemplo, los aminoácidos 139 a 234 de un polipéptido FGFR3 wt que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 5 o los aminoácidos 161 a 245 de un polipéptido FGFR3 wt que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 32), y el dominio 3 de tipo C2 similar a Ig de un polipéptido FGFR3 wt (por ejemplo, los aminoácidos 247 a 335 de un polipéptido FGFR3 wt que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 5 o los aminoácidos 268 a 310 de un polipéptido FGFR3 wt que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 32). Un DEC de un FGFR3 también puede incluir un fragmento del dominio 3 tipo Ig del FGFR3, por ejemplo, aa 247 a 288 de la SEC. ID Núm.: 1, que puede incluir además, por ejemplo, una sustitución de aminoácidos de un residuo de cisteína por un residuo de serina u otra sustitución de aminoácidos conservadora (por ejemplo, alanina, glicina, prolina o treonina) en la posición 253 de la SEC. ID Núm.: 1 (por ejemplo, aa 247 a 288 de la SEC. ID Núm.: 2). Además, un DEC puede incluir un dominio tipo C2 de tipo Ig de, por ejemplo, aa 247 a 335 de la SEC. ID Núm.: 4. Así, los DEC ejemplares de polipéptidos FGFR3 incluyen, por ejemplo, aquellos polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de aa 1 a 288 de las SEC. ID Núms.: 1 y 2 o aa 1 a 335 de las SEC. ⁱD Núms.: 4 y 33. En particular, el DEC de un polipéptido FGFR3 incluye los aa 1 a 335 de la SEC. ID Núm.: 33.

El término “enfermedad esquelética relacionada con el FGFR3”, como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una enfermedad esquelética que es causada por un aumento anormal de la activación del FGFR3, tal como por ejemplo por la expresión de un mutante de ganancia de función del FGFR3. La frase “mutante de ganancia de función del FGFR3” se refiere a un mutante del FGFR3 que presenta una actividad biológica, tal como la activación de la señalización descendente, que es superior a la actividad biológica del correspondiente FGFR3 de tipo salvaje (por ejemplo, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 5) en presencia de un ligando del FGF. Las enfermedades esqueléticas relacionadas con el FGFR3 pueden incluir una enfermedad heredada o una esporádica. Las enfermedades esqueléticas relacionadas con el FGFR3 incluyen, entre otras, la acondroplasia, la displasia tanatofórica de tipo I (TDl), la displasia tanatofórica de tipo II (TDII), la acondroplasia severa con retraso en el desarrollo y acantosis nigricans (SADDAN), la hipocondroplasia, un síndrome de craneosinostosis (por ejemplo, Muenke, Crouzon y Crouzonodermoskeletal) y el síndrome de camptodactilia, estatura alta y pérdida de audición (CATSHL).

Los términos “factor de crecimiento de fibroblastos” y “FGF” se refieren a un miembro de la familia FGF, que incluye moléculas de señalización estructuralmente relacionadas que participan en varios procesos metabólicos, incluidas las vías de señalización endocrinas, el desarrollo, la curación de heridas y la angiogénesis. Los FGF desempeñan un papel fundamental en la proliferación y diferenciación de una amplia gama de tipos de células y tejidos. El término se refiere preferentemente a FGF1, FGF2, FGF9, FGF18, FGF19 y FGF21, que han demostrado unirse al FGFR3.

Por ejemplo, los FGFs pueden incluir el FGF1 humano (por ejemplo, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 13), FGF2 humano (por ejemplo, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 14), FGF9 humano (por ejemplo, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 15), FGF18 humano (por ejemplo, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 16), FGF19 humano (por ejemplo, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 38), y FGF21 humano (por ejemplo, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 39).

Los términos “receptor 3 del factor de crecimiento de fibroblastos”, “FGFR3” o “receptor FGFR3”, como se utilizan en la presente memoria, se refieren a un polipéptido que se une específicamente a uno o más FGF (por ejemplo, FGF1, fGf2, FGF9, FGF18, FGF19 y/o FGF21). El gen humano FGFR3, situado en el brazo corto distal del cromosoma 4, codifica un precursor proteico de 806 aminoácidos (precursor de la isoforma 1 del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos), que contiene 19 exones, e incluye un péptido señal (por ejemplo, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 6 o 35), Las mutaciones en la secuencia de aminoácidos del FGFR3 que dan lugar a trastornos del crecimiento del esqueleto, (por ejemplo, acondroplasia), incluyen, por ejemplo, la sustitución de un residuo de glicina en la posición 380 por un residuo de arginina (es decir, G380R). El gen FGFR3 humano natural tiene una secuencia de nucleótidos como la que se muestra en el número de acceso del Genbank NM_000142.4 y la proteína FGFR3 humana natural tiene una secuencia de aminoácidos como la que se muestra en el número de acceso del Genbank NP_000133, en la presente memoria representada por SEC. ID Núm.: 5. El FGFR3 de tipo salvaje (por ejemplo, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 5) consiste en un dominio extracelular de membrana tipo inmunoglobulina que incluye los dominios 1 a 3 tipo Ig2 (residuos de aminoácidos 1 a 335), un dominio transmembrana (residuos de aminoácidos 345 a 377) y un dominio intracelular (residuos de aminoácidos 378 a 784). Los FGFR3 pueden incluir fragmentos y/o variantes (por ejemplo, variantes de empalme, tales como las variantes de empalme que utilizan el exón 8 alternativo en lugar del exón 9) del FGFR3 de longitud completa, de tipo salvaje (por ejemplo, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 5).

Los términos “fragmento” y “porción” se refieren a una parte de un todo, tal como un polipéptido o una molécula de ácido nucleico que contiene, preferentemente, al menos el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de la longitud total de la molécula de ácido nucleico o el polipéptido de referencia. Un fragmento o porción puede contener, por ejemplo 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 500, 600, 700, o más residuos de aminoácidos, hasta la longitud total del polipéptido de referencia (por ejemplo un polipéptido que tenga la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 5 o 32), Por ejemplo, un fragmento de FGFR3 puede incluir cualquier polipéptido que tenga al menos 200, 205, 210, 215, 220, 225, 235, 230, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 275, 280, 285, 290 o 300 aminoácidos consecutivos de la SEC. ID Núm.: 1 o 2. Además, un fragmento de FGFR3 puede incluir cualquier polipéptido que tenga al menos 200, 205, 210, 215, 220, 225, 235, 230, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 275, 280, 285, 290, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 345 o 345 aminoácidos consecutivos de la SEC. ID Núm.: 4 o 33.

Como se utiliza en la presente memoria, el término “célula huésped” se refiere a un vehículo que incluye los componentes celulares necesarios, por ejemplo, orgánulos, necesarios para expresar un polipéptido sFGFR3 a partir de un polinucleótido correspondiente. La secuencia de ácido nucleico del polinucleótido se incluye típicamente en un vector de ácido nucleico (por ejemplo, un plásmido, un cromosoma artificial, un vector viral o un vector fago) que se puede introducir en la célula huésped por medio de técnicas convencionales conocidas en la técnica (por ejemplo, transformación, transfección, electroporación, precipitación de fosfato de calcio y microinyección directa). Una célula huésped puede ser una célula procariota, por ejemplo, una célula bacteriana o arquea, o una célula eucariota, por ejemplo, una célula de mamífero (por ejemplo, una célula de ovario de hámster chino (CHO) o un riñón embrionario humano 293 (HEK 293)). Preferentemente, la célula huésped es una célula de mamífero, tal como una célula CHO.

Por “aislado” se entiende separado, recuperado o purificado de su entorno natural. Por ejemplo, un polipéptido sFGFR3 aislado (por ejemplo, un polipéptido sFGFR3 o una variante del mismo, tal como un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 4) se puede caracterizar por un cierto grado de pureza después de aislar el polipéptido sFGFR3 de, por ejemplo, medios de cultivo celular. Un polipéptido sFGFR3 aislado puede tener una pureza de al menos el 75%, de forma que el polinucleótido sFGFR3 constituye al menos el 75% en peso del material total (por ejemplo, polipéptidos, polinucleótidos, restos celulares y contaminantes ambientales) presente en la preparación (por ejemplo, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 99% o al menos el 99,5% en peso del material total presente en la preparación). Asimismo, un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido sFGFR3 (por ejemplo, un polinucleótido que tiene la secuencia de ácido nucleico de la s Ec . ID Núm.: 21 o 37), o una célula huésped aislada (por ejemplo, una célula CHO, una célula HEK 293, una célula L, una célula C127, una célula 3T3, una célula BHK o una célula COS-7) puede tener una pureza de al menos el 75%, de forma que el polinucleótido o la célula huésped constituye al menos el 75% en peso del material total (por ejemplo polipéptidos, polinucleótidos, restos celulares y contaminantes ambientales) presente en la preparación (por ejemplo, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 99% o al menos el 99,5% en peso del material total presente en la preparación).

Los términos “polinudeótido” o “ácido nucleico”, como se utilizan indistintamente en la presente memoria, se refieren a cadenas de nucleótidos de cualquier longitud, e incluyen el ADN y el ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos o bases modificadas, y/o análogos de los mismos, o cualquier sustrato que se pueda incorporar a un polímero por la ADN o ARN polimerasa o por medio de una reacción sintética. Un polinucleótido puede incluir nucleótidos modificados, tales como los nucleótidos metilados y análogos de los mismos. Si está presente, la modificación de la estructura de los nucleótidos se puede impartir antes o después del montaje del polímero. La secuencia de nucleótidos puede ser interrumpida por componentes no nucleótidos. Un polinucleótido se puede modificar aún más después de la síntesis, tal como por medio de la conjugación con una etiqueta.

Los términos “paciente” y “sujeto” se refieren a un mamífero, que incluyen, pero no se limitan a, un humano (por ejemplo, un humano que tenga un trastorno de retraso del crecimiento esquelético, tales como la acondroplasia) o un mamífero no humano (por ejemplo, un mamífero no humano que tenga un trastorno de retraso del crecimiento esquelético, tales como la acondroplasia), tales como un bovino, equino, canino, ovino o felino. Preferentemente, el paciente es un ser humano que tiene un trastorno de retraso del crecimiento esquelético (por ejemplo, acondroplasia), particularmente un bebé, un niño o un adolescente que tiene un trastorno de retraso del crecimiento esquelético (por ejemplo, acondroplasia).

Los términos “administración parenteral”, “administrado por vía parenteral” y otras frases gramaticalmente equivalentes, como se utilizan en la presente memoria, se refieren a un modo de administración de composiciones que incluyen un polipéptido sFGFR3 (por ejemplo, un polipéptido sFGFR3 o una variante del mismo, tal como un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 4, o 33) diferentes de la administración enteral y tópica, generalmente por inyección, e incluyen, sin limitación, la administración subcutánea, intradérmica, intravenosa, intranasal, intraocular, pulmonar, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intrapulmonar, intraperitoneal, transtraqueal, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural, intracerebral, intracraneal, intracarotídea e inyección e infusión intraesternal.

Por “diluyente, excipiente, portador o adyuvante aceptable para uso farmacéutico” se entiende un diluyente, excipiente, portador o adyuvante, respectivamente, que es fisiológicamente aceptable para el sujeto (por ejemplo, un ser humano) y que conserva las propiedades terapéuticas de la composición farmacéutica (por ejemplo, un polipéptido sFGFR3 o una variante del mismo, tal como un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 4 o 33) con el que se administra. Un portador ejemplar aceptable para uso farmacéutico es la solución salina fisiológica. Otros diluyentes, excipientes, portadores o adyuvantes fisiológicamente aceptables y sus formulaciones son conocidos por los expertos en la técnica.

Por “composición farmacéutica” se entiende una composición que contiene un agente activo, tal como un sFGFR3 (por ejemplo, un polipéptido sFGFR3 o una variante del mismo, tal como un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 4 o 33), formulado con al menos un excipiente, portador o diluyente aceptable para uso farmacéutico. La composición farmacéutica se puede fabricar o comercializar con la aprobación de una agencia reguladora gubernamental como parte de un régimen terapéutico para el tratamiento de una enfermedad o evento (por ejemplo, un trastorno de retraso del crecimiento esquelético, tal como la acondroplasia) en un paciente (por ejemplo, un paciente con un trastorno de retraso del crecimiento esquelético, tal como un paciente con acondroplasia). Las composiciones farmacéuticas se pueden formular, por ejemplo, para la administración parenteral, tal como para la administración subcutánea (por ejemplo, por medio de una inyección subcutánea) o la administración intravenosa (por ejemplo, como una solución estéril libre de embolias de partículas y en un sistema de disolventes adecuado para el uso intravenoso), o para la administración oral (por ejemplo, como un comprimido, una cápsula, un caplet, un gelcap o un jarabe).

Como se utiliza en la presente memoria, el término “identidad de secuencia” se refiere al porcentaje de residuos de aminoácidos (o ácidos nucleicos) de una secuencia candidata, por ejemplo, un polipéptido FGFR3, que son idénticos a los residuos de aminoácidos (o ácidos nucleicos) de una secuencia de referencia, por ejemplo, un polipéptido sFGFR3 o una variante del mismo, tal como un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 4, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad (por ejemplo, se pueden introducir huecos en una o en ambas secuencias candidatas y de referencia para conseguir un alineamiento óptimo y se pueden descartar las secuencias no homólogas a efectos de comparación). La alineación para determinar el porcentaje de identidad se puede lograr de varias maneras que están dentro de la habilidad en la técnica, por ejemplo, mediante el uso de software informático disponible públicamente, tal como BLAST, BLAST-2, BLAST-P, BLAST-N, BLAST-X, WU-BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2, CLUSTAL, o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para medir la alineación, incluidos los algoritmos necesarios para lograr la máxima alineación en toda la longitud de las secuencias comparadas. Por ejemplo, el porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos (o ácidos nucleicos) de una determinada secuencia candidata con respecto a una determinada secuencia de referencia, o en comparación con ella (que también se puede expresar como una determinada secuencia candidata que tiene o incluye un determinado porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos (o ácidos nucleicos) con respecto a una determinada secuencia de referencia, o en comparación con ella) se calcula de la siguiente manera:

100 x (fracción de A/B)

en el que A es el número de residuos de aminoácidos (o ácidos nucleicos) calificados como idénticos en el alineamiento de la secuencia candidata y la secuencia de referencia, y en la que B es el número total de residuos de aminoácidos (o ácidos nucleicos) en la secuencia de referencia. En particular, una secuencia de referencia alineada para su comparación con una secuencia candidata puede mostrar que la secuencia candidata presenta, por ejemplo, una identidad del 50% al 100% en toda la longitud de la secuencia candidata o en una porción seleccionada de residuos de aminoácidos (o ácidos nucleicos) contiguos de la secuencia candidata. La longitud de la secuencia candidata alineada con fines de comparación es al menos el 30%, por ejemplo, al menos el 40%, por ejemplo, al menos el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 90% o el 100% de la longitud de la secuencia de referencia. Cuando una posición de la secuencia candidata está ocupada por el mismo residuo de aminoácido (o ácido nucleico) que la posición correspondiente de la secuencia de referencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición.

Por “péptido señal” se entiende un péptido corto (por ejemplo, de 5 a 30 aminoácidos de longitud, tal como 22 aminoácidos de longitud) en el N-terminal de un polipéptido que dirige un polipéptido hacia la vía secretora (por ejemplo, el espacio extracelular). El péptido señal se suele escindir durante la secreción del polipéptido. La secuencia señal puede dirigir el polipéptido a un compartimento u orgánulo intracelular, por ejemplo, el aparato de Golgi. Una secuencia señal puede ser identificada por homología, o actividad biológica, a un péptido con la función conocida de dirigir un polipéptido a una región particular de la célula. Los expertos en la técnica pueden identificar un péptido señal mediante el uso de programas informáticos de fácil acceso (por ejemplo, el Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705, BLAST, o los programas PILEUP/PRETTYBOX). Un péptido señal puede ser uno que sea, por ejemplo, sustancialmente idéntico a la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 6 o 35.

El término “trastorno de retraso del crecimiento esquelético”, como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una enfermedad esquelética caracterizada por deformidades y/o malformaciones de los huesos. Estos trastornos incluyen, pero no se limitan a, los trastornos de retraso del crecimiento esquelético causados por fracturas del cartílago de crecimiento (fisis), los trastornos de retraso del crecimiento esquelético idiopáticos o las enfermedades esqueléticas relacionadas con el FGFR3. En particular, un paciente que tiene un trastorno de retraso del crecimiento del esqueleto (por ejemplo, acondroplasia) puede tener huesos más cortos que los de un paciente sano. Por ejemplo, el trastorno del retraso del crecimiento del esqueleto puede incluir una displasia del esqueleto, por ejemplo acondroplasia, acondroplasia homocigótica, acondroplasia heterocigótica, acondrogénesis, acrodisostosis, displasia acromesomélica, atelosteogénesis, displasia camptomélica, condrodisplasia punctata, condrodisplasia punctata de tipo rizomélico, disostosis cleidocraneal, fémur corto congénito, craneosinostosis (por ejemplo, síndrome de Muenke, síndrome de Crouzon, síndrome de Apert, síndrome de Jackson-Weiss, síndrome de Pfeiffer o síndrome de Crouzonodermoesquelético), dactilia, braquidactilia, camptodactilia, polidactilia, sindactilia, displasia diastrófica, enanismo, displasia disegmental, encondromatosis, fibrocondrogénesis, displasia fibrosa, exostosis múltiple hereditaria, hipocondroplasia, hipofosfatasia, raquitismo hipofosfatémico, síndrome de Jaffe-Lichtenstein, displasia de Kniest, síndrome de Kniest, displasia mesomélica tipo Langer, síndrome de Marfan, síndrome de McCune-Albright, micromelia, displasia metafisaria, displasia metafisaria tipo Jansen, displasia metatrófica, síndrome de Morquio, displasia mesomélica tipo Nievergelt, neurofibromatosis, osteoartritis, osteocondrodisplasia, osteogénesis imperfecta, tipo letal perinatal de osteogénesis imperfecta, osteopetrosis, osteopoiquilosis, disostosis periférica, síndrome de Reinhardt, síndrome de Roberts, síndrome de Robinow, síndromes de polidactilia de costillas cortas, baja estatura, displasia espondiloepifisaria congénita y displasia espondiloepimetafisaria.

Los términos “receptor 3 del factor de crecimiento de fibroblastos soluble”, “FGFR3 soluble” y “sFGFR3” se refieren a un FGFR3 que se caracteriza por la ausencia o la interrupción funcional de todo o de una parte sustancial del dominio transmembrana y de cualquier porción polipeptídica que anclaría el polipéptido FGFR3 a una membrana celular (por ejemplo, un dominio de tirosina quinasa). Un polipéptido sFGFR3 es una forma no unida a la membrana de un polipéptido FGFR3. En particular, el dominio transmembrana del FGFR3 se extiende desde los residuos de aminoácidos 345 a 377 de la secuencia del FGFR3 de tipo salvaje (por ejemplo, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 5) o los residuos de aminoácidos 367 a 399 de la secuencia del FGFR3 de tipo salvaje que incluye un péptido señal (por ejemplo, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 32).

Cualquiera de los polipéptidos sFGFR3 anteriores o variantes de los mismos pueden incluir opcionalmente un péptido señal en la posición N-terminal, tal como los aminoácidos 1 a 22 de la SEC. ID Núm.: 6 (MGAPACALALCVAIVAGASS) o los aminoácidos 1 a 19 de la SEC. ID Núm.: 35 (por ejemplo, MMSFVSLLLVGILFHATQA).

Por “tratar” y “tratamiento” se entiende una reducción (por ejemplo, de al menos un 10%, un 15%, un 20%, un 25%, un 30%, un 35%, un 40%, un 45%, un 50%, un 60%, un 70%, un 80%, un 90%, un 95%, un 99% o incluso un 100%) en la progresión o la gravedad de un trastorno de retraso del crecimiento esquelético (por ejemplo, acondroplasia), o en la progresión, gravedad o frecuencia de uno o más síntomas de un trastorno de retraso del crecimiento esquelético (por ejemplo, acondroplasia) en un paciente (por ejemplo, un ser humano, tal como un bebé, un niño o un adolescente). El tratamiento puede tener lugar durante un período de tratamiento, en el que se administra un polipéptido sFGFR3 durante un período de tiempo (por ejemplo, días, meses, años o más) para tratar a un paciente (por ejemplo, un humano, tal como un bebé, un niño o un adolescente) que tiene un trastorno de retraso del crecimiento esquelético, tal como la acondroplasia. Los síntomas ejemplares de acondroplasia que pueden ser tratados con un sFGFR3 (por ejemplo, un polipéptido sFGFR3 o una variante del mismo, tal como un polipéptido que tenga la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 4 o 33) incluyen, pero no se limitan a, una estatura baja, un tronco largo, extremidades acortadas, una altura adulta de entre 42 y 56 pulgadas aproximadamente, una cabeza relativamente grande, una frente prominente, porciones de la cara poco desarrolladas, genu valgum (,por ejemplo, “golpes entre rodillas”), marcha de pato, dedos cortos y rechonchos, capacidad limitada para enderezar el brazo en el codo, una curva excesiva de la parte inferior de la espalda, problemas dentales (por ejemplo, por el apiñamiento de los dientes), problemas de control de peso, problemas neurológicos, problemas respiratorios, y/o dolor y entumecimiento en la parte inferior de la espalda y/o la columna vertebral.

El término “variante”, con respecto a un polipéptido, se refiere a un polipéptido (por ejemplo, un polipéptido sFGFR3 o una variante del mismo, tal como un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 4) que difiere por uno o más cambios en la secuencia de aminoácidos del polipéptido del que deriva la variante (por ejemplo, el polipéptido padre). El término “variante”, con respecto a un polinucleótido, se refiere a un polinucleótido (por ejemplo, un polinucleótido que codifica un polipéptido sFGFR3, tal como un polinucleótido que tiene la secuencia de ácido nucleico de la SEC. ID Núm.: 21 o 37) que difiere por uno o más cambios en la secuencia de ácido nucleico del polinucleótido del que deriva la variante (por ejemplo, el polinucleótido padre). Los cambios en la secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos de la variante pueden ser, por ejemplo, sustituciones de aminoácidos o de ácidos nucleicos, inserciones, supresiones, truncamientos N-terminal o C-terminal, o cualquier combinación de los mismos. En particular, las sustituciones de aminoácidos pueden ser sustituciones conservativas y/o no conservativas. Una variante puede incluir cualquier polinucleótido que tenga al menos un 50% (por ejemplo, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más) de identidad de secuencia con un polinucleótido que tenga la secuencia de ácido nucleico de la SEC. ID Núm.: 21 o 37.

Por “vector” se entiende una construcción de ADN que incluye uno o más polinucleótidos, o fragmentos de los mismos, que codifican un polipéptido sFGFR3 (por ejemplo, un polipéptido sFGFR3 o una variante del mismo, tal como un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 4 o 33, o un polipéptido sFGFR3 que incluya un péptido señal, tal como un polipéptido que tenga la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 18 o 34), El vector se puede utilizar para infectar una célula (por ejemplo, una célula huésped o una célula de un paciente que tenga un trastorno de retraso del crecimiento esquelético humano, tal como la acondroplasia), lo que da lugar a la traducción de los polinucleótidos del vector en un polipéptido sFGFR3. Un tipo de vector es el “plásmido”, que se refiere a un bucle circular de ADN de doble cadena en el que se pueden ligar segmentos adicionales de ADN. Algunos vectores son capaces de replicarse de forma autónoma en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episomales de mamíferos). Otros vectores (por ejemplo, los vectores de mamíferos no episomales) se pueden integrar en el genoma de una célula huésped al introducirse en ella, y por lo tanto se replican junto con el genoma del huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de los genes a los que están vinculados operativamente. En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante suelen tener la forma de plásmidos.

El término “forma(s) de dosificación unitaria” se refiere a la(s) unidad(es) físicamente discreta(s) adecuada(s) como dosis unitaria(s) para sujetos humanos y otros mamíferos, cada unidad contiene una cantidad predeterminada de material activo calculado para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con cualquier excipiente farmacéutico, portador o diluyente adecuado.

La recitación en la presente memoria de intervalos numéricos por puntos finales pretende incluir todos los números subsumidos dentro de ese intervalo (por ejemplo, una recitación de 1 a 5 incluye 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,80, 4 y 5). Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente Descripción Detallada y de las reivindicaciones.

Breve descripción de las diversas vistas de los dibujos

Las FIGS. 1A a 1D son gráficos que muestran los sensorgramas de los polipéptidos sFGFR3. Se muestran los sensorgramas para sFGFR3_Del1 (SEC. ID Núm.: 7), sFGFR3_Del4 (SEC. ID Núm.: 1), y sFGFR3_Del4-LK1-LK2 (SEC. ID Núm.: 10; Fig. 1A); sFGFR3_Del1 (SEC. ID Núm.: 7) y sFGFR3_Del1-D3 (SEC. ID Núm.: 9; Fig. 1B); sFGFR3_Del4-LK1-LK2 (SEC. ID Núm.: 10), sFGFR3_Del4-LK1 -LK2-C253S (SEC. ID Núm.: 11), y sFGFR3_Del4-LK1-LK2-D3 (SEC. ID Núm.: 12; Fig. 1C); y sFGFR3_Del4 (SEC. ID Núm.: 1), sFGFR3_Del4-C253S (SEC. ID Núm.: 2), y sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 33; Fig. 1D).

Las FIGS. 2A a 2C son imágenes de Western blots de los polipéptidos sFGFR3. Se muestran los Western blots en condiciones reductoras (R) y no reductoras (NR) para sFGFR3_Del1, sFGFR3_Del1-C253S (SEC. ID Núm.: 8) y sFGFR3_Del1-D3 (Fig. 2A); sFGFR3_Del4-LK1 -LK2, sFGFR3_Del4-LK1 -LK2-C253S y sFGFR3_Del4-LK1 -LK2-D3 (Fig. 2B); y sFGFR3_Del4, sFGFR3_Del4-C253S y sFGFR3_Del4-D3 (Fig. 2C).

Las FIGS. 3A a 3B son gráficos que muestran un sensorgrama (Fig. 3A) y ensayos de proliferación de sFGFR3_Del4, sFGFR3_Del4-C253S, y sFGFR3_Del4-D3 (Fig. 3B) mediante el uso de células de condrocitos Fgfr3ach/+ en presencia de FGF2.

La FIG. 4 es un gráfico que muestra la señalización de la luciferasa en células HEK que expresan FGFR3G380R y que son incubadas con sFGFR3_Del4-D3 a 0 nM, 70 nM y 280nM con o sin 1 ng/mL de hFGF2 (* indica un valor p < 0,05; *** indica un valor p < 0,001 en comparación con sFGFR3_Del4-D3 a 0 nM).

La FIG. 5 es un gráfico que muestra el porcentaje de animales vivos (ratones de tipo salvaje (wt) y Fgfr3ach/+) después de 3 días de tratamiento con una dosis baja (0,25 mg/kg) de sFGFR3_Del4-D3 en relación con la edad (días). También se muestra el porcentaje de ratones vivos en peso que recibieron el vehículo (PBS).

La FIG. 6 es una imagen que muestra los residuos de aminoácidos correspondientes a los dominios 1 (IgI), 2 (IgII) y 3 (IgIII) de tipo salvaje del polipéptido FGFR3 (SEC. ID Núm.: 5 o 32), sFGFR3_Del4-C253S (SEC. ID Núm.: 2), y una variante de sFGFR3_Del4-D3 (SEC. iD Núm.:33). sFGFR3_Del4-C253S incluye una sustitución de aminoácidos de un residuo de cisteína por un residuo de serina en la posición 253 de la SEC. ID Núm.: 1. Las FIGS. 7A a 7B son imágenes de Western blots de los polipéptidos sFGFR3. Se muestran los Western blots en condiciones reductoras (R) y no reductoras (NR) para 2,3 mg/ml y 23 mg/ml de sFGFR3_Del1-D3 (Fig. 7A) y 1,5 mg/ml y 15 mg/ml de sFGFR3_Del1-C253S (Fig. 7B).

Las FIGS. 8A a 8B son gráficos que muestran la temperatura de fusión (T^m) de sFGFR3_Del4-C253S en tampón 20 mM fosfato, 40mM de NaCl, pH 7,5 y 40 mM de citrato, 40mM de NaCl, pH 6.5 (Fig. 8A) y la T^mde sFGFR3_Del4-D3 en tampón de 20 mM de fosfato, 40mM de NaCl, pH 7,5 y 20 mM de citrato, 40mM de NaCl, pH 6,5 (Fig. 8B).

Las FIGS. 9A a 9C son gráficos que muestran los perfiles de elución de la cromatografía líquida de proteínas rápida (FPLC) de sFGFR3_Del4-D3. Los perfiles de elución por FPLC se muestran para la Fig. 9A: sFGFR3_Del4-D3 a los 0 minutos, 2 horas y 24 horas en cpm/fracción (Fig. 9A); Fig. 9B: sFGFR3_Del4-D3 administrado por bolo intravenoso a los 1 minuto, 15 minutos, 30 minutos, 2 horas y 24 horas en cpm/fracción y normalizado al pico más alto (mostrado en la Fig. 9B cont.); Fig. 9C: sFGFR3_Del4-D3 administrado por inyección subcutánea a los 30 minutos, 2 horas, 4 horas y 24 horas en cpm/fracción y normalizado al pico más alto (mostrado en la Fig. 9C cont.).

Las FIGS. 10A a 10B son gráficos que muestran el porcentaje (%) de proliferación de las células de condrocitos Fgfr3ach/+ en presencia de los polipéptidos sFGFR3. Se muestra la proliferación de condrocitos Fgfr3ach/+ para 1 ug/ml, 10 ug/ml y 50 ug/ml de sFGFR3_Del4-D3 (Fig. 10A) y para 1 ug/ml, 10 ug/ml y 50 ug/ml de sFGFR3_Del4-C253S (Fig. 10B).

La FIG. 11 es un gráfico que muestra los perfiles PK de 2,5 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 administrados por vía subcutánea y 2,5 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 administrados por vía intravenosa.

La FIG. 12 es un gráfico que muestra la concentración de ¹²⁵I-sFGFR3_Del4-D3 en los tejidos de riñón, hígado, bazo, pulmón y corazón a los 30 minutos, 120 minutos y 1440 minutos después de la administración intravenosa. La concentración se expresa como el porcentaje de dosis inyectada por gramo (%ID/g).

La FIG. 13 es un gráfico que muestra la concentración de ¹²⁵I-sFGFR3_Del4-D3 en los tejidos de riñón, hígado, bazo, pulmón y corazón a los 30 minutos, 120 minutos, 240 minutos, 480 minutos y 1440 minutos después de la administración subcutánea. La concentración se expresa en %ID/g.

La FIG. 14A a 14B son gráficos que muestran la concentración (c) y el volumen de distribución (Vd) de ¹²⁵I-sFGFR3_Del4-D3 en el tejido cerebral. Se muestra el c de ¹²⁵I-sFGFR3_Del4-D3 antes y después de la corrección del contenido vascular y la degradación a los 30 minutos, 2 horas y 24 horas después del bolo intravenoso (Fig. 14A) y el Vd de ¹²⁵I-sFGFR3_Del4-D3 y RSA a los 30 minutos, 2 horas y 24 horas después del bolo intravenoso (Fig. 14B).

La FIG. 15 es un gráfico que muestra el porcentaje de ratones Fgfr3?ch/+ supervivientes administrados con sFGFR3_Del4-D3. Se muestran los ratones supervivientes de tipo salvaje, los ratones Fgfr3ach/+ a los que se les administró PBS como vehículo, los ratones Fgfr3ach/+ a los que se les administró 2,5 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 una vez por semana, los ratones Fgfr3ach/+ a los que se les administró 2,5 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 dos veces por semana y los ratones Fgfr3ach/+ a los que se les administró 10 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 dos veces por semana durante 22 días.

La FIG. 16 es un gráfico que muestra el porcentaje (%) de complicaciones locomotoras y respiratorias abdominales en ratones Fgfr3ach/+ a los que se les administró PBS como vehículo, 2,5 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 una vez por semana, 2,5 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 dos veces por semana y 10 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 dos veces por semana.

Las FIGS. 17A a 17D son gráficos y una radiografía que muestran la longitud de los ratones Fgfr3ach/+ a los que se les administró sFGFR3_Del4-D3. Se muestra la longitud axial (Fig. 17A), la longitud de la cola (Fig. 17B) y la longitud de la tibia (Fig. 17C) de ratones de tipo salvaje a los que se les administró PBS como vehículo, y ratones Fgfr3ach/+a los que se les administró PBS como vehículo, 2,5 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 una vez por semana, 2,5 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 dos veces por semana y 10 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 dos veces por semana. También se muestra la radiografía (Fig. 17D) de los ratones de tipo salvaje a los que se les administró PBS como vehículo y de los ratones Fgfr3ach/+ a los que se les administró PBS como vehículo, 2,5 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 dos veces por semana y 10 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 dos veces por semana. Todas las medidas están en milímetros (mm).

Las FIGS. 18A a 18B son un gráfico que muestra la proporción del cráneo y una radiografía que muestra los cráneos de los ratones Fgfr3ach/+administrados con sFGFR3_Del4-D3, respectivamente. En el gráfico (Fig. 18A) se muestra la relación craneal (L/W) de los ratones de tipo salvaje a los que se les administró PBS como vehículo y de los ratones Fgfr3ach/+ a los que se les administró PBS como vehículo, 2,5 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 una vez por semana, 2,5 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 dos veces por semana y 10 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 dos veces por semana. En la radiografía (Fig. 18B) se muestran los cráneos de ratones de tipo salvaje administrados con PBS como vehículo, ratones Fgfr3ach/+ administrados con PBS como vehículo, ratones de tipo salvaje administrados con 10 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 dos veces por semana, y ratones Fgfr3ach/+ administrados con 10 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 dos veces por semana.

Las FIGS. 19A a 19E son gráficos que muestran el perfil cinético para la unión de diferentes concentraciones de hFGF1, FGF2, hFGF9, hFGF18, hFGF19 y hFGF21 a SFGFR3_DEL4-D3 inmovilizado en tiempo real. Se muestran los perfiles cinéticos de unión de hFGF1 a concentraciones de 0,5 nM a 12 nM a SFGFR3_DEL4-D3 inmovilizado (FIG. 19A); hFGF2 en concentraciones de 2 nM a 10 nM a SFGFR3_DEL4-D3 inmovilizado (FIG.

19B); hFGF9 en concentraciones de 1 nM a 5 nM a SFGFR3_DEL4-D3 inmovilizado (FIG. 19C); hFGF18 en concentraciones de 1 nM a 10 nM a SFGFR3_DEL4-D3 inmovilizado (FIG. 19D); hFGF19 en concentraciones de 2 nM a 20 nM a SFGFR3_DEL4-D3 inmovilizado (FIG. 19E); y hFGF21 en concentraciones de 100 nM a 10000 nM a SFGFR3_DEL4-D3 inmovilizado (FIG. 19F). Las líneas más oscuras y superpuestas representan el modelo de unión 2:1 utilizado para generar los valores de Kd.

La FIG. 20 es una imagen de un Western blot de células ATDC5 de tipo salvaje no inducidas y de células ATDC5 infectadas retroviralmente que expresan FGFR3G380R.

La FIG. 21 es un gráfico que muestra la inducción de la proliferación de las células ATDC5 FGFR3G380R en presencia de SFGFR3_DEL4-D3 durante tres experimentos. Las células ATDC5 FGFR3G380R no tratadas se utilizaron como control.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Se ha descubierto que los polipéptidos del receptor 3 del factor de crecimiento de fibroblastos solubles (sFGFR3) y variantes de los mismos se pueden utilizar para tratar los trastornos de retraso del crecimiento esquelético, tales como la acondroplasia, en un paciente (por ejemplo, un humano, particularmente un bebé, un niño o un adolescente). En particular, los polipéptidos sFGFR3 de la invención presentan una supresión de, por ejemplo, los aminoácidos 289 a 400 de la SEC. ID Núm.: 5 o los aminoácidos 311 a 422 de la SEC. ID Núm.: 32, para proporcionar los siguientes polipéptidos ejemplares de sFGFR3: sFGFR3_Del4 que incluye un dominio extendido tipo Ig23 (sFGFR3_Del4-D3; s Ec . ID Núm.: 33) y el polipéptido sFGFR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 4. Véase la solicitud provisional de los Estados Unidos Núm. 62/276.222 y la solicitud internacional Núm.PCT/US16/12553 para una descripción de sFGFR3_Del4 (SEC. ID Núm.: 1).

Polipéptidos del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos soluble 3 (sFGFR3)

La invención presenta polipéptidos sFGFR3 y variantes de los mismos formulados para el tratamiento de los trastornos de retraso del crecimiento esquelético (por ejemplo, acondroplasia). Los polipéptidos sFGFR3 tienen al menos un 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 4

Los polipéptidos sFGFR3 y variantes de los mismos también pueden incluir fragmentos de la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 33 que tiene al menos un 99% de identidad de secuencia con la SEC. ID Núm.: 33 siempre que tengan también la identidad de secuencia con la SEC. ID Núm.: 4 definido anteriormente. El residuo de cisteína en la posición 253 de la SEC. ID Núm.: 4 o 33, si están presentes, pueden ser sustituidos por un residuo de serina o una sustitución de aminoácidos conservadora, tal como alanina, glicina, prolina o treonina.

Un polipéptido sFGFR3 descrito en la presente memoria (por ejemplo, sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 33), y la SEC. ⁱD Núm.: 4) puede incluir un péptido señal en la posición N-terminal. Un péptido señal ejemplar puede incluir, pero no está limitado a, los aminoácidos 1 a 22 de la s Ec . ID Núm.: 6 (por ejemplo, MGAPACALa Lc vA iVAGASS) o los aminoácidos 1 a 19 de la SEC. ID Núm.: 35 (por ej., MMSFV^sL^lL^vGⁱLFHATQA). En consecuencia, existen formas secretadas, que carecen del péptido señal N-terminal, y formas no secretadas, que incluyen el péptido señal N-terminal. Por ejemplo, un polipéptido sFGFR3 secretado puede incluir la secuencia de aminoácidos de las SEC. ID Núms.: 4 o 33. Los expertos en la técnica apreciarán que la posición del péptido señal N-terminal variará en diferentes polipéptidos sFGFR3 y puede incluir, por ejemplo, los primeros 5, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 30, o más residuos de aminoácidos en el N-terminal del polipéptido. Los expertos en la técnica pueden predecir la posición de un sitio de escisión de la secuencia señal, por ejemplo, por medio de un algoritmo informático adecuado tal como el descrito en Bendtsen et al. (J. Mol. Biol. 340(4):783 a 795, 2004) y disponible en la web en cbs.dtu.dk/services/SignalP/.

Además, los polipéptidos sFGFR3 (por ejemplo, sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 33) o la SEC. ID Núm.: 4)) de la invención pueden ser glicosilados. En particular, un polipéptido sFGFR3 puede ser alterado para aumentar o disminuir el grado de glicosilación del polipéptido sFGFR3. La adición o supresión de sitios de glicosilación a un polipéptido sFGFR3 se puede llevar a cabo por medio de la alteración de la secuencia de aminoácidos de forma que se creen o eliminen uno o más sitios de glicosilación. Por ejemplo, la glicosilación ligada al N, en la que un oligosacárido se une al nitrógeno amídico de un residuo de asparagina, puede ocurrir en la posición Asn76, Asn148, Asn169, Asn 203, Asn240, Asn272, y/o Asn 294 de la secuencia de aminoácidos de sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 4 o 33), y variantes de los mismos. Uno o más de estos residuos de Asn también pueden ser sustituidos para remover el sitio de glicosilación. Por ejemplo, la glicosilación ligada a O, en la que un oligosacárido se une a un átomo de oxígeno de un residuo de aminoácido, puede ocurrir en la posición Ser109, Thr126, Ser199, Ser274, Thr281, Ser298, Ser299, y/o Thr301 de la secuencia de aminoácidos de sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 4 o 33), Además, la glicosilación ligada a O puede ocurrir en la posición Ser310 y/o Ser321 de sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 4 o 33), Uno o más de estos residuos Ser o Thr también pueden ser sustituidos para remover el sitio de glicosilación.

Polipéptidos de fusión sFGFR3

Los polipéptidos sFGFR3 de la invención (por ejemplo, sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 4 o 33)) se pueden fusionar con un dominio funcional de un polipéptido heterólogo (por ejemplo, un fragmento de región cristalizable de una inmunoglobulina (región Fc; tal como un polipéptido que tenga la secuencia de aminoácidos de las SEC. ID Núms.: 25 y 26) o albúmina sérica humana (HSA; tal como un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 27)) para obtener un polipéptido de fusión sFGFR3. Opcionalmente, se puede incluir un enlazador flexible entre el polipéptido sFGFR3 y el polipéptido heterólogo (por ejemplo, una región Fc o HSA), tal como una secuencia rica en serina o glicina (por ejemplo, un enlazador de poliglicina o un enlazador de poliglicina/serina, tal como las SEC. ID Núms.: 28 y 29).

Por ejemplo, los polipéptidos sFGFR3 (por ejemplo, sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 4 o 33)) puede ser un polipéptido de fusión que incluya, por ejemplo, una región Fc de una inmunoglobulina en el dominio N-terminal o C-terminal. En particular, las regiones Fc útiles pueden incluir el fragmento Fc de cualquier molécula de inmunoglobulina, que incluyen IgG, IgM, IgA, IgD o IgE y sus diversas subclases (por ejemplo, IgG-1, IgG-2, IgG-3, IgG-4, IgA-1, IgA-2) de cualquier mamífero (por ejemplo, un humano). Por ejemplo, el fragmento Fc de la IgG-1 humana (SEC. ID Núm.: 25) o una variante de la IgG-1 humana, tal como una variante que incluye una sustitución de asparagina en la posición 297 de la SEC. ID Núm.: 25 con alanina (por ejemplo, un polipéptido que tenga la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 26). Los fragmentos Fc de la invención pueden incluir, por ejemplo, los dominios CH2 y CH3 de la cadena pesada y cualquier porción de la región bisagra. Los polipéptidos de fusión sFGFR3 de la invención también pueden incluir, por ejemplo, un Fc monomérico, tal como un dominio CH2 o CH3. La región Fc puede estar opcionalmente glicosilada en uno o más residuos de aminoácidos apropiados conocidos por los expertos en la técnica. Un fragmento Fc como el descrito en la presente memoria puede tener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50 o más adiciones, supresiones o sustituciones en relación con cualquiera de los fragmentos Fc descritos en la presente memoria.

Además, los polipéptidos sFGFR3 (por ejemplo, sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 4 o 33)) se pueden conjugar con otras moléculas en el dominio N-terminal o C-terminal con el fin de mejorar la solubilidad y la estabilidad de la proteína en solución acuosa. Los ejemplos de estas moléculas son la albúmina de suero humano (HSA), el PEG, el PSA y la albúmina de suero bovino (BSA). Por ejemplo, los polipéptidos sFGFR3 se pueden conjugar con HSA humana (por ejemplo, un polipéptido que tenga la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 27) o un fragmento del mismo.

Los polipéptidos de fusión sFGFR3 pueden incluir una región de enlace peptídico entre el polipéptido sFGFR3 (por ejemplo, sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 4 o 33)) y el polipéptido heterólogo (por ejemplo, una región Fc o HSA). La región enlazadora puede ser de cualquier secuencia y longitud que permita que el sFGFR3 permanezca biológicamente activo, por ejemplo, que no esté estéricamente obstaculizado. Las longitudes ejemplares de los enlaces están entre 1 y 200 residuos de aminoácidos, por ejemplo 1 a 5, 6 a 10, 11 a 15, 16 a 20, 21 a 25, 26 a 30, 31 a 35, 36 a 40, 41 a 45, 46 a 50, 51 a 55, 56 a 60, 61 a 65, 66 a 70, 71 a 75, 76 a 80, 81 a 85, 86 a 90, 91 a 95, 96 a 100, 101 a 110, 111 a 120, 121 a 130, 131 a 140, 141 a 150, 151 a 160, 161 a 170, 171 a 180, 181 a 190, o 191 a 200 residuos de aminoácidos. Por ejemplo, los enlazadores incluyen o consisten en porciones flexibles, por ejemplo, regiones sin estructura secundaria o terciaria fija significativa. Los intervalos preferentes son de 5 a 25 y de 10 a 20 aminoácidos de longitud. Esta flexibilidad suele aumentar si los aminoácidos son pequeños y no tienen cadenas laterales voluminosas que impidan la rotación o la flexión de la cadena de aminoácidos. De este modo, preferentemente el enlazador peptídico de la presente invención tiene un contenido aumentado de aminoácidos pequeños, en particular de glicinas, alaninas, serinas, treoninas, leucinas e isoleucinas.

Los enlazadores flexibles ejemplares son enlazadores ricos en glicina, por ejemplo, que contienen al menos 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o incluso 100% de residuos de glicina. Los enlazadores también pueden contener, por ejemplo, enlazadores ricos en serina, por ejemplo, que contengan al menos un 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o incluso 100% de residuos de serina. En algunos casos, la secuencia de aminoácidos de un enlazador consiste únicamente en residuos de glicina y serina. Por ejemplo, el enlazador puede ser la secuencia de aminoácidos GGGGAGGG (SEC. ID Núm.: 28) o GGGGSGGGGSGGGGS (SEC. ID Núm.: 29). Un enlazador puede estar opcionalmente glicosilado en uno o más residuos de aminoácidos apropiados. El enlazador también puede estar ausente, en el que el polipéptido FGFR3 y el polipéptido heterólogo (por ejemplo, una región Fc o HSA) se fusionan directamente, sin residuos intermedios.

Polinucleótidos que codifican los polipéptidos sFGFR3

La divulgación además describe polinucleótidos que codifican los polipéptidos sFGFR3 (por ejemplo, sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 4 o 33) o un polipéptido ^{s F g F r 3}que incluye un péptido señal ^{( S e C .}ID Núm.: 18 o 34)) que se pueden utilizar para tratar los trastornos de retraso del crecimiento esquelético (por ejemplo, la acondroplasia) en un paciente (por ejemplo, un humano, tal como un bebé, un niño o un adolescente), tales como las SEC. ID Núm.: 21 o 37. Por ejemplo, el polinucleótido puede ser la secuencia de ácido nucleico de la SEC. ID Núm.: 21 o 37, que codifica sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 33), que tiene al menos un 85% de identidad de secuencia (por ejemplo, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más identidad de secuencia) con la secuencia de ácido nucleico de la SEC. ID Núm.: 21 o 37. La divulgación también describe polinudeótidos que codifican polipéptidos de fusión de sFGFR3 (por ejemplo, un polipéptido de sFGFR3 fusionado a un polipéptido heterólogo, tal como una región Fc o HSA) y polinucleótidos que codifican polipéptidos de sFGFR3 sin un péptido señal (por ejemplo, polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de las SEC. ID Núms.: 4 o 33) o con un péptido señal (por ejemplo, polipéptidos que tengan la secuencia de aminoácidos de las SEC. ID Núms.: 18, 19 y 34). Además, la invención incluye polinucleótidos que incluyen una o más mutaciones para alterar cualquiera de los sitios de glicosilación descritos en la presente memoria.

Opcionalmente, los polinucleótidos sFGFR3 (por ejemplo, sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 4 o 33) o un polipéptido sFGFR3 que incluye un péptido señal (SEC. ID Núm.: 18 o 34)) pueden ser optimizados para alterar los codones en el ácido nucleico, en particular para reflejar el uso típico de codones del organismo anfitrión (por ejemplo, un humano) sin alterar el polipéptido sFGFR3 codificado por la secuencia de ácido nucleico del polinucleótido. Los polinucleótidos optimizados para el codón (por ejemplo, un polinucleótido con la secuencia de ácido nucleico de la SEC. ID Núm.: 21 o 37) puede, por ejemplo, facilitar las manipulaciones genéticas por medio de la disminución del contenido de GC y/o para la expresión en una célula huésped (por ejemplo, una célula HEK 293 o una célula CHO). La optimización de codones puede ser llevada a cabo por los expertos, por ejemplo, mediante el uso de herramientas en línea tales como la Herramienta de Adaptación de Codones JAVA (www.jcat.de) o la Herramienta de Tecnologías Integradas de ADN (www.eu.idtdna.com/CodonOpt), simplemente por medio de la introducción de la secuencia de ácido nucleico del polinucleótido y el organismo huésped para el que se deben optimizar los codones. El uso de codones de diferentes organismos está disponible en bases de datos en línea, por ejemplo, www.kazusa.or.jp/codon.

Células huésped para la expresión de los polipéptidos sFGFR3

Las células de mamífero se pueden utilizar como células huésped para la expresión de los polipéptidos sFGFR3 (por ejemplo, sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: o 33) o un polipéptido sFGFR3 que incluya un péptido señal (SEC. ID Núm.: 18 o 34)). Algunos tipos de células de mamífero útiles en los procedimientos incluyen, pero no se limitan a, células de riñón embrionario humano (HEK; por ejemplo, HEK 293), células de ovario de hámster chino (CHO), células L, células C127, células 3T3, células BHK, células COS-7, células HeLa, células PC3, células Vero, células MC3T3, células NS0, células Sp2/0, células VERY, células BHK, células MDCK, células W138, células BT483, células Hs578T, células HTB2, células BT20, células T47D, células NS0, células CRL7O3O y células HsS78Bst, o cualquier otra célula huésped de mamífero adecuada conocida en la técnica. Alternativamente, se pueden utilizar células E. coli como células huésped para la expresión de los polipéptidos sFGFR3. Los ejemplos de cepas de E. coli incluyen, pero no se limitan a, E. coli 294 (ATCC®31.446), E. coli A 1776 (ATCC® 31.537, E. coli BL21 (DE3) (ATCC® BAA-1025), E. coli RV308 (ATCC® 31.608), o cualquier otra cepa de E. coli adecuada conocida en la técnica.

Vectores que incluyen polinucleótidos que codifican los polipéptidos sFGFR3

La divulgación también describe vectores recombinantes que incluyen uno o más de los polinucleótidos descritos anteriormente. Los vectores de la invención se pueden utilizar para entregar un polinucleótido que codifica un polipéptido sFGFR3 de la invención (por ejemplo, sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 4 o 33) o un polipéptido sFGf R3 que incluye un péptido señal (SEC. iD Núm.: 18 o 34)), que pueden incluir vectores de expresión de mamíferos, virales y bacterianos. Por ejemplo, los vectores pueden ser plásmidos, cromosomas artificiales (por ejemplo, BAG, PAC y YAC) y vectores de virus o fagos, y pueden incluir opcionalmente un promotor, potenciador o regulador para la expresión del polinucleótido. Los vectores también pueden contener uno o más genes marcadores seleccionables, tal como un gen de resistencia a la ampicilina, neomicina y/o kanamicina en el caso de un plásmido bacteriano o un gen de resistencia para un vector fúngico. Los vectores se pueden utilizar in vitro para la producción de ADN o ARN o utilizarse para transfectar o transformar una célula huésped, tal como una célula huésped de mamífero para la producción de un polipéptido sFGFR3 codificado por el vector. Los vectores también se pueden adaptar para ser utilizados in vivo en un procedimiento de terapia génica.

Vectores virales ejemplares que se pueden utilizar para entregar un polinucleótido que codifica un polipéptido sFGFR3 de la invención (por ejemplo, sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 4 o 33) o un polipéptido sFGFR3 que incluye un péptido señal (SEC. ID Núm.: 18 o 34)) incluyen un retrovirus, adenovirus (por ejemplo, Ad2, Ad5, Ad11, Ad12, Ad24, Ad26, Ad34, Ad35, Ad40, Ad48, Ad49, Ad50 y Pan9 (también conocido como AdC68)), parvovirus (por ejemplo, virus adeno-asociados), coronavirus, virus de ARN de cadena negativa tales como ortomixovirus (por ejemplo, el virus de la gripe), rabdovirus (por ejemplo, rabia y virus de la estomatitis vesicular), paramixovirus (por ejemplo, sarampión y Sendai), virus de ARN de cadena positiva, tales como picornavirus y alfavirus, y virus de ADN de doble cadena, que incluyen adenovirus, herpesvirus (por ejemplo, virus del herpes simple tipo 1 y 2, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus), y poxvirus (por ejemplo, vaccinia, vaccinia modificada Ankara (MVA), viruela aviar y viruela canaria). Otros virus útiles para entregar polinucleótidos que codifican polipéptidos sFGFR3 incluyen el virus Norwalk, togavirus, flavivirus, reovirus, papovavirus, hepadnavirus y el virus de la hepatitis. Algunos ejemplos de retrovirus son la leucosis-sarcoma aviar, los virus de tipo C y B de los mamíferos, los virus de tipo D, el grupo HTLV-BLV, el lentivirus y el spumavirus (Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, en Fundamental Virology, Third Edition, B. N. Fields, et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996).

Procedimientos de producción

Polinucleótidos que codifican polipéptidos sFGFR3 (por ejemplo, sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 4 o 33), o un polipéptido sFGFR3 que incluye un péptido señal (SEC. ID Núm.: Los anticuerpos humanos se pueden producir por medio de diversas técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, un polinucleótido se genera mediante el uso de procedimientos de clonación molecular y se coloca dentro de un vector, tal como un plásmido, un cromosoma artificial, un vector viral o un vector fago. El vector se utiliza para transformar el polinucleótido en una célula huésped apropiada para la expresión del polipéptido sFGFR3.

Construcción de vectores de ácido nucleico y células huésped

El polipéptido sFGFR3 (por ejemplo, sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 4 o 33) o un polipéptido sFGFR3 que incluye un péptido señal (SEC. ID Núm.: 18 o 34)) se pueden producir a partir de una célula huésped. Los polinucleótidos (por ejemplo, polinucleótidos que tienen la secuencia de ácido nucleico de la SEC. ID Núm.: 21 o 37 y variantes de los mismos) que codifican polipéptidos de sFGFR3 se pueden incluir en vectores que se pueden introducir en la célula huésped por medio de técnicas convencionales conocidas en la técnica (por ejemplo, transformación, transfección, electroporación, precipitación de fosfato de calcio, microinyección directa o infección). La elección del vector depende en parte de las células huésped que se vayan a utilizar. Por lo general, las células huésped son de origen procariota (por ejemplo, bacterias) o eucariota (por ejemplo, mamíferos).

Un polinucleótido que codifica un polipéptido sFGFR3 (por ejemplo, sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 4 o 33) o un polipéptido sFGFR3 que incluye un péptido señal (SEC. ID Núm.: 18 o 34) se pueden preparar por medio de una variedad de procedimientos conocidos en la técnica. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, la mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida al sitio) y la mutagénesis por PCR. Un polinucleótido que codifica un polipéptido sFGFR3 se puede obtener mediante el uso de técnicas estándar, por ejemplo, la síntesis de genes. Alternativamente, un polinucleótido que codifica un polipéptido sFGFR3 de tipo salvaje (por ejemplo, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 5 o 32) se pueden mutar para que contengan sustituciones de aminoácidos específicas (por ejemplo, una sustitución de aminoácidos de un residuo de cisteína por un residuo de serina o una sustitución de aminoácidos conservadora, tales como alanina, glicina, prolina o treonina, en la posición 253 de la SEC. ID Núm.: 33 y/o la posición 316 de la SEC. ID Núm.: 4) mediante el uso de técnicas estándar en la técnica, por ejemplo, la mutagénesis QuikChange™. Los polinucleótidos que codifican un polipéptido sFGFR3 se pueden sintetizar mediante el uso de, por ejemplo, un sintetizador de nucleótidos o técnicas de PCR.

Polinucleótidos que codifican el polipéptido sFGFR3 (por ejemplo, sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 4 o 33), o un polipéptido sFGFR3 que incluye un péptido señal (SEC. ID Núm.: 18 o 34)) se puede insertar en un vector capaz de replicar y expresar el polinucleótido en células huésped procariotas o eucariotas. Los vectores ejemplares útiles en los procedimientos pueden incluir, pero no se limitan a, un plásmido, un cromosoma artificial, un vector viral y un vector fago. Por ejemplo, un vector viral puede incluir los vectores virales descritos anteriormente, tal como un vector retroviral, un vector adenoviral, o un vector poxviral (por ejemplo, un vector viral de vaccinia, tal como el de Vaccinia Ankara Modificada (MVA)), un vector viral adeno-asociado, y un vector alfaviral)) que contenga la secuencia de ácido nucleico de un polinucleótido que codifique el polipéptido sFGFR3. Cada vector puede contener varios componentes que pueden ser ajustados y optimizados para la compatibilidad con la célula huésped particular. Por ejemplo, los componentes del vector pueden incluir, pero no se limitan a, un origen de replicación, un gen marcador de selección, un promotor, un sitio de unión a ribosomas, una secuencia señal, la secuencia de ácido nucleico del polinucleótido que codifica el polipéptido sFGFR3, y/o una secuencia de terminación de la transcripción.

Los vectores descritos anteriormente se pueden introducir en las células huésped apropiadas (por ejemplo, células HEK 293 o células CHO) mediante el uso de técnicas convencionales en la técnica, por ejemplo, transformación, transfección, electroporación, precipitación de fosfato de calcio y microinyección directa. Una vez que los vectores se introducen en células huésped para la producción de un polipéptido sFGFR3 de la invención (por ejemplo, sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 4 o 33) o un polipéptido sFGFR3 que incluye un péptido señal (SEC. ID Núm.: 18 o 34)), las células huésped se cultivan en medios nutritivos convencionales modificados de acuerdo con lo que convenga para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los polinucleótidos (por ejemplo, las SEC. ID Núms.: 21 y variantes de los mismos) que codifican el polipéptido sFGFR3. Los procedimientos para la expresión de proteínas terapéuticas, tales como los polipéptidos sFGFR3, son conocidos en la técnica, véase, por ejemplo Paulina Balbas, Argelia Lorence (eds.) Recombinant Gene Expression: Reviews and Protocols (Methods in MolecularBiology), Humana Press; 2da ed. 2004 (20 de julio de 2004) y Vladimir Voynov y Justin A. Caravella (eds.) Therapeutic Proteins: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) Humana Press; 2a ed. 2012 (28 de junio de 2012).

Producción, recuperación y purificación del polipéptido sFGFR3

Las células huésped (por ejemplo, células HEK 293 o células CHO) utilizadas para producir el polipéptido sFGFR3 (por ejemplo, sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 4 o 33) o un polipéptido sFGFR3 que incluye un péptido señal (SEC. ID Núm.: 18 o 34)) se pueden cultivar en medios conocidos en la técnica y adecuados para el cultivo de las células huésped seleccionadas. Algunos ejemplos de medios adecuados para las células huésped de mamíferos incluyen el Medio Esencial Mínimo (MEM), el Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), el Medio de Expresión Expi293™, el DMEM con suero fetal bovino (FBS) suplementado y el RPMI-1640. Los ejemplos de medios adecuados para las células huésped bacterianas incluyen el caldo Luria (LB) más los suplementos necesarios, tal como un agente de selección, por ejemplo, ampicilina. Las células huésped se cultivan a temperaturas adecuadas, tales como por ejemplo de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 39 °C, por ejemplo de 25 °C a aproximadamente 37 °C, preferentemente 37 °C, y a niveles de CO2, tal como por ejemplo del 5 al 10% (preferentemente 8%). El pH del medio es generalmente de aproximadamente 6,8 a 7,4, por ejemplo, 7,0, dependiendo principalmente del organismo huésped. Si se utiliza un promotor inducible en el vector de expresión, la expresión del polipéptido sFGFR3 se induce en condiciones adecuadas para la activación del promotor.

Un polipéptido sFGFR3 (por ejemplo, sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 4 o 33) o un polipéptido sFGFR3 que incluye un péptido señal (SEC. ID Núm.: 18 o 34)) se pueden recuperar del sobrenadante de la célula huésped. Alternativamente, el polipéptido sFGFR3 se puede recuperar por medio de la disrupción de la célula huésped (por ejemplo, mediante el uso de un choque osmótico, sonicación o lisis), seguido por centrifugación o filtración para remover el polipéptido sFGFR3. Una vez recuperado el polipéptido sFGFR3, éste se puede purificar aún más. Un polipéptido sFGFR3 se puede purificar por cualquier procedimiento conocido en la técnica de la purificación de proteínas, tal como la afinidad de la proteína A, otra cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad y cromatografía en columna de exclusión de tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial, o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas (véase Process Scale Purification of Antibodies, Uwe Gottschalk (ed.) John Wiley & Sons, Inc., 2009).

El polipéptido sFGFR3 (por ejemplo, sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 4 o 33) o un polipéptido sFGFR3 que incluye un péptido señal (SEC. ID Núm.: 18 o 34)) se puede conjugar con una etiqueta detectable para su purificación. Los ejemplos de etiquetas adecuadas para su uso en la purificación de los polipéptidos sFGFR3 incluyen, pero no se limitan a, una etiqueta proteica, un fluoróforo, un cromóforo, una etiqueta radiactiva, un coloide metálico, una enzima o una molécula quimioluminiscente o bioluminiscente. En particular, las etiquetas proteicas que son útiles para la purificación de los polipéptidos sFGFR3 pueden incluir, pero no se limitan a, etiquetas de cromatografía (por ejemplo, etiquetas de péptidos que consisten en aminoácidos polianiónicos, tal como una etiqueta FLAG, o una etiqueta de hemaglutinina “HA”), etiquetas de afinidad (por ejemplo, una etiqueta poli(His), una proteína de unión a la quitina (CBP), una proteína de unión a la maltosa (MBP) o una glutatión-S-transferasa (GST)), etiquetas de solubilización (por ejemplo, tiorredoxina (TRX) y poli(NANP)), etiquetas epitópicas (por ejemplo, etiqueta V5, etiqueta Myc y etiqueta HA) o etiquetas de fluorescencia (por ejemplo, GFP, variantes de ^gF^p, RFP y variantes de RFP). Procedimientos de tratamiento

En la presente memoria se dan a conocer procedimientos para tratar un trastorno de retraso del crecimiento esquelético en un paciente, tal como un paciente con acondroplasia (por ejemplo, un humano con acondroplasia). En particular, el paciente es uno que presenta o es probable que desarrolle uno o más síntomas de un trastorno de retraso del crecimiento esquelético (por ejemplo, acondroplasia). El procedimiento consiste en administrar un polipéptido sFGFR3 (por ejemplo, sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 4 o 33)) al paciente que tiene un trastorno de retraso del crecimiento esquelético, tal como un paciente con acondroplasia (por ejemplo, un humano con acondroplasia). En particular, el procedimiento implica administrar sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 33) al paciente que tiene un trastorno de retraso del crecimiento esquelético, tal como un paciente con acondroplasia (por ejemplo, un humano con acondroplasia). Por ejemplo, el paciente es un lactante o un niño que tiene un trastorno de retraso del crecimiento esquelético, tal como un lactante, un niño o un adolescente con acondroplasia (por ejemplo, un humano con acondroplasia).

El paciente (por ejemplo, un ser humano) puede ser tratado antes de que aparezcan los síntomas de un trastorno de retraso del crecimiento esquelético (por ejemplo, acondroplasia) o después de que se desarrollen los síntomas de un trastorno de retraso del crecimiento esquelético (por ejemplo, acondroplasia). En particular, los pacientes que pueden ser tratados son aquellos que presentan síntomas que incluyen, pero no se limitan a, extremidades cortas, tronco corto, piernas arqueadas, marcha de pato, malformaciones del cráneo, cráneo en forma de hoja de trébol, craneosinostosis, huesos wormianos, anomalías de las manos, anomalías de los pies, pulgar de autoestopista y/o anomalías del pecho. Además, el tratamiento con un polipéptido sFGFR3 puede dar lugar a una mejora de uno o más de los síntomas mencionados de un trastorno de retraso del crecimiento esquelético (por ejemplo, en relación con un paciente no tratado), tal como la acondroplasia.

El paciente (por ejemplo, un ser humano) puede ser diagnosticado con un trastorno de retraso del crecimiento esquelético, tal como la acondroplasia, antes de la administración de un polipéptido sFGFR3. Además, el paciente que tiene un trastorno de retraso del crecimiento esquelético, tal como la acondroplasia, puede ser uno que no haya sido tratado previamente con un polipéptido sFGFR3.

Trastornos de retraso en el crecimiento del esqueleto

Los trastornos del retraso del crecimiento esquelético se pueden tratar por medio de la administración de un polipéptido sFGFR3 como se describe en la presente memoria a un paciente (por ejemplo, un humano) que lo necesite. El procedimiento consiste en administrar al paciente (por ejemplo, un humano) que padece el trastorno de retraso del crecimiento esquelético un polipéptido sFGFR3 de la invención (por ejemplo, sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 4 o 33)). Los trastornos del retraso del crecimiento del esqueleto que se pueden tratar con los polipéptidos sFGFR3 se caracterizan por deformidades y/o malformaciones de los huesos y pueden incluir, entre otras, las enfermedades del esqueleto relacionadas con el FGFR3. En particular, el paciente es tratado con sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 33).

La administración de un polipéptido sFGFR3 de la invención (por ejemplo, sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 4 o 33)) puede tratar un trastorno del retraso del crecimiento del esqueleto, que incluyen, pero no se limitan a, acondroplasia, acondrogénesis, acrodisostosis, displasia acromesomélica, atelosteogénesis, displasia camptomélica, condrodisplasia punctata, condrodisplasia punctata de tipo rizomélico, disostosis cleidocraneal, fémur corto congénito, síndrome de Crouzon, síndrome de Apert, síndrome de Jackson-Weiss, síndrome de Pfeiffer, síndrome Crouzonodermoesquelético, dactilia, braquidactilia, camptodactilia, polidactilia, sindactilia, displasia diastrófica, enanismo, displasia disegmental, encondromatosis, fibrocondrogénesis, displasia fibrosa, exostosis múltiple hereditaria, hipofosfatasia, raquitismo hipofosfatémico, síndrome de Jaffe-Lichtenstein, displasia de Kniest, síndrome de Kniest, Displasia mesomélica de tipo Langer, síndrome de Marfan, síndrome de McCune-Albright, micromelia, displasia metafisaria, displasia metafisaria tipo Jansen, displasia metatrófica, síndrome de Morquio, displasia mesomélica tipo Nievergelt, neurofibromatosis (tal como el tipo 1 (por ejemplo, con manifestaciones óseas o sin manifestaciones óseas), tipo 2, o schwannomatosis), osteoartritis, osteocondrodisplasia, osteogénesis imperfecta, tipo letal perinatal de osteogénesis imperfecta, osteopetrosis osteopoiquilosis, disostosis periférica, síndrome de Reinhardt, síndrome de Roberts, síndrome de Robinow, síndromes de polidactilia de costillas cortas, baja estatura, displasia espondiloepifisaria congénita y displasia espondiloepimetafisaria.

Por ejemplo, los polipéptidos sFGFR3 de la invención (por ejemplo, sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 4 o 33)) se puede utilizar para tratar los síntomas asociados a un trastorno de retraso del crecimiento esquelético, incluidos los trastornos descritos anteriormente, tal como la acondroplasia. Entre los ejemplos no limitantes de los síntomas de los trastornos de retraso del crecimiento esquelético que se pueden tratar con los polipéptidos sFGFR3, se incluyen las extremidades y el tronco cortos, las piernas arqueadas, la marcha de pato, las malformaciones del cráneo (por ejemplo, una cabeza grande), el cráneo en forma de hoja de trébol, la craneosinostosis (por ejemplo, fusión prematura de los huesos del cráneo), huesos wormianos (por ejemplo, conexiones anómalas en forma de hilo entre los huesos del cráneo), anomalías de las manos y los pies (por ejemplo, polidactilia o dedos de más), pulgares “autoestopistas” y uñas anómalas de manos y pies, y anomalías torácicas (por ejemplo, tórax en forma de pera o estrecho). Los síntomas adicionales que se pueden tratar por medio de la administración de polipéptidos sFGFR3 también pueden incluir anomalías no esqueléticas en pacientes con trastornos de retraso del crecimiento esquelético, tales como anomalías de los ojos, la boca y los oídos, tales como cataratas congénitas, miopía, paladar hendido o sordera; malformaciones cerebrales, tales como hidrocefalia, porencefalia, hidranencefalia o agenesia del cuerpo calloso; defectos cardíacos, tales como comunicación interauricular, conducto arterioso persistente o transposición de los grandes vasos; retrasos en el desarrollo; o discapacidades mentales.

El tratamiento con los polipéptidos sFGFR3 de la invención (por ejemplo, sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 4 o 33)) también puede aumentar la supervivencia de los pacientes (por ejemplo, los humanos) con trastornos de retraso del crecimiento esquelético (por ejemplo, acondroplasia). Por ejemplo, la tasa de supervivencia de los pacientes tratados con los polipéptidos ^sfG^fR3 puede aumentar al menos en un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más en relación con, por ejemplo, un paciente no tratado con un trastorno de retraso del crecimiento esquelético (por ejemplo, acondroplasia), durante un período de tratamiento de días, meses, años o más. En particular, la administración de sFGFR3_Del4-D3 puede aumentar la supervivencia de los pacientes (por ejemplo, los seres humanos) con trastornos de retardo del crecimiento esquelético (por ejemplo, en relación con un paciente no tratado), tal como la acondroplasia.

Cualquier trastorno de retraso del crecimiento esquelético que sea una enfermedad esquelética relacionada con el FGFR3 (por ejemplo, causada por o asociada con la sobreactivación del FGFR3 como resultado de una mutación de ganancia de función del FGFR3) se puede tratar por medio de la administración de un polipéptido sFGFR3 de la invención (por ejemplo, sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 4 o 33)) a un paciente (por ejemplo, un humano). Por ejemplo, las enfermedades esqueléticas relacionadas con el FGFR3 pueden incluir, entre otras, la acondroplasia, la displasia tanatofórica de tipo I (TDI), la displasia tanatofórica de tipo II (TDII), la acondroplasia grave con retraso del desarrollo y acantosis nigricans (SADDAN), la hipocondroplasia y la craneosinostosis (por ejemplo, Muenke, Crouzon y Crouzonodermoskeletal).

Los pacientes (por ejemplo, humanos) con mutaciones en el gen FGFR3 asociadas a diferentes trastornos esqueléticos relacionados con el FGFR3, tales como la acondroplasia, la hipocondroplasia, el SADDAN, el TDI y el TDII, pueden ser tratados con polipéptidos sFGFR3 de la invención (por ejemplo, sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 4 o 33)). Por ejemplo, los polipéptidos sFGFR3 se pueden administrar para tratar la acondroplasia resultante de las mutaciones G380R, G375C, G346E o S279C del gen FGFR3. La administración de los polipéptidos sFGFR3 se puede utilizar para tratar los siguientes trastornos esqueléticos ejemplares relacionados con el FGFR3 hipocondroplasia resultante de las mutaciones G375C, G346E o S279C del gen FGFR3; TDI resultante de las mutaciones R248C, S248C, G370C, S371C, Y373C, X807R, X807C, X807G, X807S, X807W y K650M del gen FGFR3; TDII resultante de la mutación K650E del gen FGFR3; y SADDAN resultante de la mutación K650M del gen FGFR3.

Cualquiera de las mutaciones mencionadas en el gen FGFR3 (por ejemplo, la mutación G380R del gen FGFR3 ) se puede detectar en una muestra del paciente (por ejemplo, un humano con acondroplasia, hipocondroplasia, SADDAN, TDI y TDII) antes o después del tratamiento con un polipéptido sFGFR3 de la invención (por ejemplo, sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 4 o 33)). Además, los padres del paciente y/o las muestras fetales (por ejemplo, el ácido nucleico fetal obtenido de la sangre materna, la placenta o las muestras fetales) pueden ser analizados por procedimientos conocidos en la técnica para la mutación en el gen FGFR3 para determinar su necesidad de tratamiento.

Acondroplasia

La acondroplasia es la causa más común de enanismo en los seres humanos y puede ser tratada por medio de la administración de polipéptidos sFGFR3 como se describe en la presente memoria. En particular, la acondroplasia se puede tratar por medio de la administración de un polipéptido sFGFR3 de la invención (por ejemplo, sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 4 o 33)). En consecuencia, la administración de los polipéptidos sFGFR3 puede dar lugar a una mejora de los síntomas que incluyen, pero no se limitan a, el retraso del crecimiento, las deformidades del cráneo, los defectos de ortodoncia, la compresión de la médula cervical (con riesgo de muerte, por ejemplo, por apnea central o convulsiones), la estenosis espinal (por ejemplo, dolor en las piernas y en la parte baja de la espalda), hidrocefalia (por ejemplo, que requiera cirugía de derivación cerebral), pérdida de audición por otitis crónica, enfermedades cardiovasculares, enfermedades neurológicas, problemas respiratorios, fatiga, dolor, entumecimiento en la parte baja de la espalda y/o en la columna vertebral, y/u obesidad.

Los pacientes tratados con los polipéptidos sFGFR3 de la invención (por ejemplo, sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 4 o 33)) puede incluir a bebés, niños y adultos con acondroplasia. En particular, los bebés suelen ser diagnosticados con acondroplasia al nacer y, por lo tanto, el tratamiento con los polipéptidos sFGFR3 puede comenzar tan pronto como sea posible en la vida del paciente, por ejemplo, poco después del nacimiento, o antes del nacimiento (in utero).

Los síntomas de acondroplasia en los pacientes (por ejemplo, en los seres humanos) también se pueden controlar antes o después de que un paciente sea tratado con un polipéptido sFGFR3 de la invención (por ejemplo, sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 4 o 3)). Por ejemplo, los síntomas de la acondroplasia se pueden controlar antes del tratamiento para evaluar la gravedad de la acondroplasia y el estado del paciente antes de llevar a cabo los procedimientos.

Los procedimientos pueden incluir el diagnóstico de la acondroplasia en un paciente y la monitorización del paciente para detectar cambios en los síntomas de la acondroplasia, tales como cambios en el peso corporal y el tamaño del cráneo (por ejemplo, la longitud y/o la anchura del cráneo) del paciente. Los cambios en el peso corporal y en el tamaño del cráneo se pueden controlar durante un período de tiempo, por ejemplo, 1,2, 3, 4 o más veces por mes o por año o aproximadamente cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12 o 16 semanas durante el curso del tratamiento con el polipéptido sFGFR3 de la invención (por ejemplo, sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 4 o 33)). El peso corporal y/o el tamaño del cráneo del paciente con acondroplasia también se pueden determinar en eventos específicos del tratamiento, tales como antes y/o después de la administración del polipéptido sFGFR3.

Por ejemplo, se puede medir el peso corporal y/o el tamaño del cráneo en respuesta a la administración del polipéptido sFGFR3 de la invención (por ejemplo, sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 4 o 33)). El peso corporal se puede medir al pesar al paciente con acondroplasia en una báscula, preferentemente de forma estandarizada, tal como por ejemplo con la misma ropa o sin ella, o en un momento determinado del día, preferentemente en estado de ayuno (por ejemplo, por la mañana antes del desayuno o después de al menos 1, 2, 3, 4, 5 o más horas de ayuno). El tamaño del cráneo se puede representar por la longitud, la altura, la anchura y/o la circunferencia del cráneo. Las mediciones se pueden llevar a cabo por medio de cualquier procedimiento estandarizado conocido o ideado por el usuario. En el caso de un sujeto humano, se prefiere la medición de la circunferencia del cráneo, que se puede medir mediante el uso de un material flexible y no extensible, tales como una cinta, enrollada alrededor de la circunferencia más amplia posible de la cabeza (por ejemplo, desde la parte más prominente de la frente hasta la parte más ancha de la parte posterior de la cabeza). La altura del cráneo del sujeto (por ejemplo, humano) también se puede determinar desde la parte inferior de la barbilla hasta el punto más alto de la cabeza. Preferentemente, cualquier medición se lleva a cabo más de una vez, por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más veces. Administración de los polipéptidos sFGFR3

Un polipéptido sFGFR3 de la invención (por ejemplo, sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 4 o 33)) se puede administrar por cualquier vía conocida en la técnica, tal como por ejemplo por administración parenteral, enteral o tópica. En particular, el polipéptido sFGFR3 puede ser administrado al paciente que tiene un trastorno de retraso del crecimiento esquelético (por ejemplo, acondroplasia) por vía subcutánea (por ejemplo, por inyección subcutánea), intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal o intraperitoneal.

Un polipéptido sFGFR3 de la invención (por ejemplo, sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 4 o 33)) se puede administrar a un paciente (por ejemplo, un ser humano) a una dosis predeterminada, tal como en una cantidad eficaz para tratar un trastorno de retraso del crecimiento esquelético (por ejemplo, acondroplasia), sin inducir una toxicidad significativa. Por ejemplo, los polipéptidos sFGFR3 se pueden administrar a un paciente que tenga trastornos de retraso del crecimiento esquelético (por ejemplo, acondroplasia) en dosis individuales que van desde aproximadamente 0,002 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg (por ejemplo, de 2,5 mg/kg a 30 mg/kg, de 0,002 mg/kg a 20 mg/kg, de 0,01 mg/kg a 2 mg/kg, de 0,2 mg/kg a 20 mg/kg, de 0,01 mg/kg a 10 mg/kg, de 10 mg/kg a 100 mg/kg, de 0,1 mg/kg a 50 mg/kg, de 0,5 mg/kg a 20 mg/kg, de 1,0 mg/kg a 10 mg/kg, de 1,5 mg/kg a 5 mg/kg, o de 0,2 mg/kg a 3 mg/kg). En particular, el polipéptido sFGFR3 se puede administrar en dosis individuales de, por ejemplo, 0,001 mg/kg a 50 mg/kg, tal como 2,5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg.

Dosis ejemplares de un polipéptido sFGFR3 de la invención (por ejemplo, sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 4 o 33)) para su administración a un paciente (por ejemplo, un ser humano) que tiene un trastorno de retraso del crecimiento esquelético (por ejemplo, acondroplasia) incluyen, por ejemplo 0,005, 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 mg/kg. Estas dosis se pueden administrar una o más veces (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 o más veces) por día, semana, mes o año. Por ejemplo, un polipéptido sFGFR3 se puede administrar a los pacientes en una dosis semanal que oscila, por ejemplo, entre aproximadamente 0,0014 mg/kg/semana y aproximadamente 140 mg/kg/semana, por ejemplo, aproximadamente 0,14 mg/kg/semana a aproximadamente 105 mg/kg/semana, o, por ejemplo, aproximadamente 1,4 mg/kg/semana a aproximadamente 70 mg/kg/semana (por ejemplo, 2,5 mg/kg/semana, 5 mg/kg/semana, 10 mg/kg/semana, 20 mg/kg/semana, 30 mg/kg/semana, 40 mg/kg/semana o 50 mg/kg/semana).

Terapia génica

Un polipéptido sFGFR3 de la invención (por ejemplo, sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.:4 o 33)) también se puede administrar por medio de terapia génica, en la que un polinucleótido que codifica el polipéptido sFGFR3 se administra a los tejidos de interés y se expresa in vivo. Los procedimientos de terapia génica se discuten, por ejemplo, en Verme et al. (Nature 389: 239 a 242, 1997), Yamamoto et al. ((Molecular Therapy 17: S67 a S68, 2009), y Yamamoto et al., (J. Bone Miner. Res. 26: 135 a 142, 2011).

Un polipéptido sFGFR3 de la invención (por ejemplo, sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 4 o 33)) pueden ser producidas por las células de un paciente (por ejemplo, un humano) que tenga un trastorno de retraso del crecimiento esquelético (por ejemplo, acondroplasia) por medio de la administración de un vector (por ejemplo, un plásmido, un cromosoma artificial (por ejemplo, BAG, PAC y YAC) o un vector viral) que contenga la secuencia de ácido nucleico de un polinucleótido que codifique el polipéptido sFGFR3. Por ejemplo, un vector viral puede ser un vector retroviral, un vector adenoviral o un vector poxviral (por ejemplo, un vector viral de vaccinia, tal como el Vaccinia Ankara modificado (MVA)), un vector viral adenoasociado o un vector alfaviral. El vector, una vez dentro de una célula del paciente (por ejemplo, un humano) que tenga un trastorno de retraso del crecimiento esquelético (por ejemplo, acondroplasia), por, por ejemplo, transformación, transfección, electroporación, precipitación de fosfato de calcio o microinyección directa, promoverá la expresión del polipéptido sFGFR3, que posteriormente será secretado por la célula. La invención además incluye terapias basadas en células, en las que se administra al paciente (por ejemplo, un humano) una célula que expresa el polipéptido sFGFR3.

Composiciones farmacéuticas

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir un polipéptido sFGFR3 (por ejemplo, sFGFR3_Del4-C253S (SEC. ID Núm.: 2), sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 33), y variantes de los mismos (SEC. ID Núm.: 4) o un polipéptido sFGFR3 que incluye un péptido señal (SEC. ID Núm.: 18 o 34)), polinucleótido, vector y/o célula huésped. Las composiciones que incluyen un polipéptido, polinucleótido, vector y/o célula huésped de sFGFR3 se pueden formular en una gama de dosis, en una variedad de formulaciones y en combinación con excipientes, portadores o diluyentes aceptables para uso farmacéutico.

Una composición farmacéutica que incluye un polipéptido sFGFR3 (por ejemplo, sFGFR3_Del4-C253S (SEC. ID Núm.: 2), sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 33), y variantes de los mismos (SEC. ID Núm.: 4) o un polipéptido sFGFR3 que incluye un péptido señal (SEC. ID Núm.: 18 o 34)), el polinucleótido, el vector, y/o la célula huésped se pueden formular a una dosis específica, tal como una dosis que sea eficaz para tratar un trastorno de retraso del crecimiento esquelético de un paciente (por ejemplo, un humano), sin inducir una toxicidad significativa. Por ejemplo, las composiciones se pueden formular para incluir entre aproximadamente 1 mg/mL y aproximadamente 500 mg/mL del polipéptido sFGFR3 (por ejemplo, entre 10 mg/mL y 300 mg/mL, 20 mg/mL y 120 mg/mL, 40 mg/mL y 200 mg/mL, 30 mg/mL y 150 mg/mL, 40 mg/mL y 100 mg/mL, 50 mg/mL y 80 mg/mL, o 60 mg/mL y 70 mg/mL del polipéptido sFGFR3).

Las composiciones farmacéuticas que incluyen un polipéptido sFGFR3 (por ejemplo, sFGFR3_Del4-C253S (SEC. ID Núm.: 2), sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 33), y variantes de los mismos ^{( S e C .}ID Núm.: 4) o un polipéptido sFGFR3 que incluye un péptido señal (SEC. ID Núm.: 18 o 34)), el polinucleótido, el vector y/o la célula huésped se pueden preparar en una variedad de formas, tal como una solución líquida, una dispersión o suspensión, un polvo u otra estructura ordenada adecuada para un almacenamiento estable. Por ejemplo, las composiciones que incluyen un polipéptido sFGFR3 destinado a la administración sistémica o local pueden estar en forma de soluciones inyectables o infusibles, tal como para la administración parenteral (por ejemplo, administración subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal o intraperitoneal). Las composiciones de sFGFR3 para inyección (por ejemplo, inyección subcutánea o intravenosa) se pueden formular mediante el uso de una solución estéril o cualquier líquido aceptable para uso farmacéutico como vehículo. Los vehículos aceptables para uso farmacéutico incluyen, pero no se limitan a, agua estéril, solución salina fisiológica y medios de cultivo celular (por ejemplo, medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), medio de Eagles modificado (a-MEM), medio F-12). Los procedimientos de formulación son conocidos en la técnica, véase, por ejemplo Banga (ed.) Therapeutic Peptides and Proteins: Formulation, Processing and Delivery Systems (2a ed.) Taylor & Francis Group, CRC Press (2006).

Las composiciones que incluyen un polipéptido sFGFR3 (por ejemplo, sFGFR3_Del4-C253S (SEC. ID Núm.: 2), sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 33), y variantes de los mismos (SEC. ID Núm.: 4) o un polipéptido sFGFR3 que incluye un péptido señal (SEC. ID Núm.: 18 o 34)), el polinucleótido, el vector y/o la célula huésped se pueden proporcionar a pacientes (por ejemplo, humanos) que padecen trastornos de retraso del crecimiento esquelético (por ejemplo, acondroplasia) en combinación con excipientes, portadores o diluyentes aceptables para uso farmacéutico. Los excipientes, portadores o diluyentes aceptables pueden incluir tampones, antioxidantes, conservantes, polímeros, aminoácidos y carbohidratos. Los excipientes acuosos, portadores o diluyentes pueden incluir agua, soluciones hidroalcohólicas, emulsiones o suspensiones, incluida la solución salina, vehículos parenterales médicos tamponados, incluida la solución de cloruro de sodio, la solución de dextrosa de Ringer, la solución de dextrosa más cloruro de sodio, la solución de Ringer que contiene lactosa y los aceites fijos. Los ejemplos de excipientes no acuosos, portadores o diluyentes son el propilenglicol, el polietilenglicol, el aceite vegetal, el aceite de pescado y los ésteres orgánicos inyectables.

También se pueden incluir sales aceptables para uso farmacéutico en las composiciones que incluyen un polipéptido sFGFR3 (por ejemplo, sFGFR3_Del4-C253S (SEC. ID Núm.: 2), sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 33), y variantes de los mismos (SEC. ID Núm.: 4) o un polipéptido sFGFR3 que incluye un péptido señal (SEC. ID Núm.: 18 o 34)), polinucleótido, vector y/o célula huésped. Las sales ejemplares aceptables para uso farmacéutico pueden incluir sales de ácidos minerales (por ejemplo, clorhidratos, hidrobromuros, fosfatos y sulfatos) y sales de ácidos orgánicos (por ejemplo, acetatos, propionatos, malonatos y benzoatos). Además, puede haber sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes y sustancias amortiguadoras del pH. Se puede encontrar un análisis exhaustivo de los excipientes, portadores y diluyentes aceptables para uso farmacéutico en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22da ed., Allen (20l2).

Las composiciones farmacéuticas que incluyen un polipéptido sFGFR3 (por ejemplo, sFGFR3_Del4-C253S (SEC. ID Núm.: 2), sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 33), y variantes de los mismos ^{( S e C .}ID Núm.: 4) o un polipéptido sFGFR3 que incluye un péptido señal (SEC. ID Núm.: 18 o 34)), el polinucleótido, el vector y/o la célula huésped también se pueden formular con un portador que proteja el polipéptido sFGFR3 contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluidos los implantes y los sistemas de administración microencapsulados. Por ejemplo, la composición de sFGFR3 puede quedar atrapada en microcápsulas preparadas, por medio de técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, tales como microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas coloidales de administración de fármacos (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Además, una composición de sFGFR3 se puede formular como una composición de liberación sostenida. Por ejemplo, las composiciones de liberación sostenida pueden incluir matrices semipermeables de polímeros sólidos hidrofóbicos que contengan los polipéptidos sFGFR3, polinucleótidos, vectores o células huésped, en las que las matrices tienen la forma de artículos moldeados, tales como películas o microcápsulas.

Kits

Los kits de la invención pueden incluir uno o más polipéptidos sFGFR3 (por ejemplo, sFGFR3_Del4-C253S (SEC. ID Núm.: 2), sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 33), y variantes de los mismos ^{( S e C .}ID Núm.: 4) o un polipéptido sFGFR3 que incluye un péptido señal (SEC. ID Núm.: 18 o 34)), polinucleótidos, vectores y/o células como se describe en la presente memoria. Por ejemplo, el polipéptido, el polinucleótido, el vector y/o la célula de sFGFR3 pueden estar presentes en un recipiente (por ejemplo, un vial de vidrio) en forma líquida (por ejemplo, en agua o en una solución salina tamponada, tal como, de 2 mM a 20 mM de fosfato de sodio, pH 6,5 o 7,0, y de 25 mM a 250 mM de cloruro de sodio). Alternativamente, el polipéptido, polinucleótido y/o vector de sFGFR3 se presenta en un recipiente (por ejemplo, un vial de vidrio) en forma liofilizada, que puede incluir opcionalmente un diluyente (por ejemplo, agua o una solución salina tamponada) para la reconstitución del polipéptido, polinucleótido, vector y/o célula de sFGFR3 liofilizados en forma líquida antes de su administración. El polipéptido, polinucleótido, vector y/o célula de sFGFR3 también puede estar presente en un kit en otra formulación como la descrita en la presente memoria. Los componentes del kit se pueden proporcionar en forma de dosis para facilitar la administración y, opcionalmente, pueden incluir los materiales necesarios para la administración y/o las instrucciones para el tratamiento del paciente, de acuerdo con los procedimientos. Por ejemplo, el kit puede incluir instrucciones de uso, que guían al usuario (por ejemplo, el médico) con respecto a la administración del polipéptido, polinucleótido, vector y/o célula de sFGFR3.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar, más que limitar, la divulgación. Estos estudios incluyen la administración de los polipéptidos sFGFR3 de sFGFR3_Del4-C253S (SEC. ID Núm.: 2) y sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 33) a pacientes (por ejemplo, humanos) que tienen acondroplasia, para tratar la acondroplasia y los síntomas asociados a ella.

Ejemplo 1: Producción de polipéptidos sFGFR3

sFGFR3_Del4-C253S (SEC. ID Núm.: 2) y sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 33) se produjeron por transfección transitoria en tres tipos diferentes de células en suspensión: Células HEK 293 de estilo libre, células CHO-S de estilo libre y células Expi CHO-S. Para la producción en células HEK 293 freestyle y CHO-S freestyle, la transfección se llevó a cabo con polietilenimina (PEIpro^®- Polyplus-transfección), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las proteínas se cosecharon después de tres días. Para la producción del polipéptido sFGFR3 en células Expi CHO-S, la transfección se llevó a cabo con Expifectamine, como describe el fabricante, mediante el uso del protocolo de producción High Titer. Se llevó a cabo un curso de tiempo y los polipéptidos sFGFR3 se cosecharon de forma óptima después de 12 días. A continuación se llevaron a cabo Western blots con 50 ng de polipéptido sFGFR3. Se utilizaron los protocolos clásicos de western blot con B9 como anticuerpo primario (anti FGFR3, sc-13121, Santa Cruz) diluido 1:2000 en tampón de bloqueo y el anticuerpo secundario IgG anti-ratón (Anti-mouse IgG, Núm. 7076, Cell signaling) diluido 1:5000 en tampón de bloqueo.

Ejemplo 2: Purificación de los polipéptidos del sFGFR3

El sFGFR3_Del4-C253S y el sFGFR3_Del4-D3 se purificaron cada uno de ellos por medio de un proceso de purificación de dos etapas que incluía cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de exclusión por tamaño. Para la cromatografía de intercambio iónico, se purificaron 300 mL de sobrenadante de cultivo por medio de filtración de flujo cruzado (ÁKTA™ flux, GE Healthcare) mediante el uso de cápsulas de 5 pm y 0,2 pm (KGF-A0504 TT y KMP-HEC 9204 TT, GE Healthcare, respectivamente). A continuación, se cargó la muestra purificada que incluía sFGFR3_Del4-C253S o sFGFR3_Del4-D3 en una columna equilibrada a 20 mL/min, tras ajustar la conductividad de la muestra a 14 mS/cm (ÁKTA™ pure 25 (GE Healthcare)). Las columnas utilizadas fueron HiPrep Q FF 26/10 (GE Healthcare) con un volumen de lecho de 53 mL. El tampón de unión fue PBS 1X y el tampón de elución fue PBS 1X 1 M NaCl. La columna se lavó con cuatro volúmenes de columna de 1X PBS. La elución de sFGFR3_Del4-C253S y sFGFR3_Del4-D3 se llevó a cabo por medio de dos etapas de NaCl al 5% y NaCl al 10% mediante el uso de cuatro volúmenes de columna de cada uno. Tanto el NaCl al 5% como el NaCl al 10% se agruparon y concentraron por medio de filtración de flujo cruzado (ÁKTA™ flux, GE Healthcare). A continuación, el volumen restante se concentró en un filtro de 30 kDa por medio de centrifugación a 4 °C, 3.900 g durante 10 minutos (MILLLIPORE^®UFC903024 AMICON^®Ultra-15 Centrifugal Filter Concentrator). Para la cromatografía de exclusión por tamaño, el volumen restante se cargó en un HiLoad 26/600 SUPERDEX™ 200 prep grade (28-9893-36, GE Healthcare) con un volumen de lecho de 320 mL. El volumen de carga no superó los 12,8 mL. La elución se llevó a cabo en 1X PBS. Ejemplo 3: Ensayos cinéticos y mediciones de la constante de disociación (K ^d ) de los polipéptidos del sFGFR3

El análisis de concentración libre de calibración y los ensayos cinéticos de sFGFR3_Del4-C253S y sFGFR3_Del4-D3 se llevaron a cabo con un Sensor Chip CM5 (GE Healthcare). El FGF2 humano (hFGF2) se inmovilizó covalentemente en el Sensor Chip CM5 a un nivel de aproximadamente 5000 UI por acoplamiento de amina. Para conseguir 5000 RU, se inmovilizó el hFGF2 durante 420 segundos a un flujo de 10 pl/min y una concentración de 25 pg/ml. El tampón de ejecución fue el tampón HBS-EP+ (GE Healthcare). El tampón de regeneración era 100mM de acetato de sodio con 2M de cloruro de sodio, pH 4,5. La unión del FGF, las mediciones de la constante de disociación (K^d) y los parámetros cinéticos se determinaron por medio de Resonancia de Plasmón de Superficie mediante el uso de un BIACORE™ T200 (GE Healthcare). El modelo utilizado para los ensayos cinéticos y la determinación de la K^dfue un algoritmo de unión 1:1.

Ejemplo 4: Ensayos de proliferación de los polipéptidos sFGFR3

Ambas líneas celulares ATDC5 y ATDC5 FGFR3^G380Rse sembraron a una densidad de 25.000 células/cm²en placas NUNC™ MICROWELL™ de 96 pocillos de fondo óptico con base de polímero (ThermoFisher Scientific, Núm. de catálogo 165305). Tras un período de incubación de 24 horas, las células se agotaron durante 48 horas en BSA al 0,5% y posteriormente se estimularon durante 72 horas con sFGFR3_Del4-C253S o sFGFR3_Del4-D3 con y sin hFGF2 (Peprotech). A continuación, se midió la proliferación celular por medio del ensayo de proliferación celular CyQUANT^®Direct (Molecular Probes, Núm. de catálogo C35012). Tras la estimulación, se añadieron 10pl de CyQUANT^®Direct Cell Proliferation (Invitrogen; 1mL de PBS 1X, 250pl de supresor de fondo y 50pl de tinción nuclear) por pocillo. Las células ATDC5 y ATDC5 FGFR3^G380Rse incubaron a continuación a temperatura ambiente y en la oscuridad durante 2 horas. La fluorescencia se leyó mediante el uso del lector de microplacas multimodo VARIOSKAN™ LUX (ThermoFisher Scientific).

Ejemplo 5: Ensayos de luciferasa de los polipéptidos del sFGFR3

Las células HEK que expresan FGFR3^G380Rfueron sembradas a una densidad de 100.000 células/cm²en una placa de 96 pocilios de cultivo estándar. A continuación, las células se agotaron durante 24 horas con suero fetal bovino inactivado por calor al 0,5% (hiFBS), antes de ser tratadas con sFGFR3_Del4-D3 a concentraciones de 0 nm, 70 nm y 280 nm con o sin 1 ng/ml de hFGF2 durante 24h. La placa de cultivo se equilibró a temperatura ambiente durante 15 minutos antes de añadir 100pl por pocillo de la solución de trabajo para el ensayo de brillo en un paso de Firefly Luc (ThermoFisher Scientific, Núm. de catálogo 16197), y posteriormente se agitó a 600 rpm durante 3 minutos. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos y cada lisado celular se transfirió a una placa blanca opaca de 96 pocillos para aumentar la señal de luminiscencia y disminuir la contaminación cruzada. La señal de luminiscencia se leyó mediante el uso del lector de microplacas multimodo VARIOSKAN™ LUX (ThermoFisher Scientific).

Ejemplo 6: Estudio de eficacia in vivo de los polipéptidos sFGFR3

Los experimentos se llevaron a cabo en animales transgénicos Fgfr3lch/+ en los que la expresión del FGFR3 mutante está dirigida por el promotor/ potenciador Col2a1. Los ratones fueron expuestos a un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y tuvieron libre acceso a comida y agua estándar de laboratorio. Los genotipos se verificaron por medio de PCR del ADN genómico mediante el uso de los cebadores 5'-AGGTGGCCTTTGACACCTACCAGG-3' (SEC. ID Núm.: 30) y 5-TCTGTTGTGTTTCCTCCCTGTTGG-3 '(SEC. ID Núm.: 31), que amplifican 360 pb del transgén FGFR3.

El sFGFR3_Del4-D3 producido con células CHO se evaluó a una dosis subcutánea de 0,25 mg/kg dos veces por semana. En el día 3, todos los ratones recién nacidos de una misma camada recibieron la misma dosis. Las camadas de control recibieron 10 pl de PBS (vehículo). Posteriormente, se administraron inyecciones subcutáneas de sFGFR3_Del4-D3 (0,25 mg/kg) dos veces por semana durante tres semanas, alternativamente en los lados izquierdo y derecho de la espalda. Los ratones fueron observados diariamente con especial atención a las alteraciones de la locomoción y la micción. Se llevó a cabo la cría para generar camadas con la mitad de ratones de tipo salvaje y la mitad de ratones heterocigotos Fgfr3ach/+. Para evitar el sesgo debido a las variaciones de penetración del fenotipo, los experimentos se llevaron a cabo en al menos dos camadas (una tratada y otra de control) de los mismos criadores. Los datos anteriores indicaban que no había diferencias estadísticas entre hombres y mujeres, por lo que éstos se consideraron un solo grupo para todos los análisis.

En el día 22, todos los animales fueron sacrificados por medio de una inyección letal de pentobarbital, y se determinó el sexo. Todas las mediciones y análisis posteriores se llevaron a cabo sin conocer el genotipo de los ratones para evitar el sesgo del investigador. La genotipificación se llevó a cabo al final del estudio para revelar la correspondencia de los datos con un genotipo específico. Dado que la acondroplasia es una enfermedad con variabilidad fenotípica, se incluyeron todos los animales en el estudio. Los animales muertos antes del día 22 se utilizaron para investigar el impacto del tratamiento en la muerte prematura. Para todos los análisis se utilizaron los animales que sobrevivieron al día 22. Todos los experimentos y las mediciones de datos fueron llevados a cabo por experimentadores ciegos en todos los puntos temporales.

Tras el sacrificio en el día 22, se midió el peso corporal. Los cadáveres fueron cuidadosamente desollados, eviscerados y se llevaron a cabo mediciones del esqueleto a partir de radiografías. Los órganos se recolectaron, se pesaron y se almacenaron en formol al 10% para su posterior análisis histológico por medio de técnicas estándar de inclusión en parafina. A continuación se observaron los órganos para detectar anomalías macroscópicas, tales como la modificación del color o la textura y la presencia de nódulos. Durante todos los experimentos con animales se siguieron los Principios de Cuidado de Animales de Laboratorio (publicación del NIH Núm. 85-23, revisada en 1985; http://grants1.nih.gov/grants/olaw/references/phspol.htm) y las directrices de la Comisión Europea para la protección de los animales utilizados con fines científicos (http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/legislation_en.htm). Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Ético Institucional para el uso de Animales de Laboratorio (CIEPAL Azur) (aprobación Núm. NCE-2012-52).

Ejemplo 7: La Línea Celular utilizada para producir los Polipéptidos del sFGFR3 no afectó a la Actividad Se compararon la actividad de unión a FGF2, Kd, y el efecto sobre la señalización celular de sFGFR3_Del1 (SEC. ID Núm.: 7), sFGFR3_Del4 (SEC. ID Núm.: 1), y sFGFR3_Del4-LK1 -LK2 (SEC. ID Núm.: 10) producidos en células HEK 293 en suspensión o en células CHO. Las células HEK 293 o las células CHO difieren en la modificación post traducción de las proteínas. La expresión de los polipéptidos sFGFR3 en diferentes líneas celulares no afectó a la Kd, a la actividad de unión ni al efecto de los polipéptidos sFGFR3 en la inhibición de la señalización intracelular (FIGS. 1A a 1D

Ejemplo 8: Mejora de la producción de sFGFR3_Del4-C253S y sFGFR3_Del4-D3

Los polipéptidos sFGFR3 de sFGFR3_Del1 (SEC. ID Núm.: 7), sFGFR3_Del4 (SEC. ID Núm.: 1), y sFGFR3_Del4-LK1-LK2 (SEC. ID Núm.: 10) fueron modificados para incluir una sustitución de aminoácidos de un residuo de cisteína por un residuo de serina en la posición 253 o un dominio ampliado de tipo Ig23 (SEC. ID Núm.: 33). Estas modificaciones de sFGFR3_Del1 y sFGFR3_Del4-LK1-LK2 no tuvieron ningún efecto o un efecto mínimo en la producción de los polipéptidos sFGFR3, dado que la agregación seguía siendo visible (FIGS. 2A y 2B, respectivamente). Sorprendentemente, la modificación de sFGFR3_Del4 para incluir una sustitución de aminoácidos de un residuo de cisteína por un residuo de serina en la posición 253 (sFGFR3_Del4-C253S) o un dominio 3 de tipo similar a Ig C2 (SEC. ID Núm.: 33)) mejoró la producción de los polipéptidos sFGFR3. En particular, hubo una mínima agregación de sFGFR3_Del4-C253S y sFGFR3_Del4-D3 tanto en condiciones de reducción como de no reducción (FIG. 2C). La inclusión de C253S o D3 también dio lugar a un aumento relativo de la producción en comparación con sFGFR3_Del4, un aumento de dos veces en la producción de sFGFR3_Del4-C253S y un aumento de 3 veces en la producción de sFGFR3_Del4-D3.

Además, sFGFR3_Del4, sFGFR3_Del4-C253S y sFGFR3_Del4-D3 mostraron Kd similares y no se vieron afectados por los cambios específicos del tipo celular en las modificaciones postraduccionales. En células Expi CHO, la Kd de sFGFR3_Del4 fue de 0,8 nM, la Kd de sFGFR3_Del4-C253S fue de 0,6 nM, y la Kd de sFGFR3_Del4-D3 fue de 0,7 nM (FIG. 3A y Tabla 1).

Tabla 1. Constante de disociación (Kd) de los polipéptidos del sFGFR3.

Ejemplo 9: sFGFR3_Del4-C253S y sFGFR3_Del4-D3 son igualmente activos in vitro

sFGFR3_Del4, sFGFR3_Del4-C253S y sFGFR3_Del4-D3 restauraron la proliferación de las células ATDC5 modificadas genéticamente para sobreexpresar la mutación FGFR3ach (líneas celulares ATDC5 FGFR3G380R). A una dosis de 36 nM, el sFGFR3_Del4 producido con células HEK 293 aumentó la proliferación al 115,5%, el sFGFR3_Del4 producido con células ChO-S aumentó la proliferación al 116%, el sFGFR3_Del4-C253S producido con células ^cHO-S aumentó la proliferación al 114,4%, y el sFGFR3_Del4-D3 con células CHO-S aumentó la proliferación al 120,1% (FIG. 3B).

El sFGFR3_Del4-D3 también se ensayó en la línea celular HEK que expresaba SRE(-Luc) a dosis de 0 nM, 70 nM y 280nM con o sin 1 ng/ml de hFGF2 (FIG. 4; n=8). Los datos mostrados en la FIG. 4 son la media /- error estándar de la media (SEM). Estos datos siguieron una ley normal y tienen igual varianza de acuerdo con la prueba de normalidad ómnibus de D'Agostino- Pearson. Las comparaciones estadísticas con y sin sFGFR3_Del4-D3 se llevaron a cabo por medio de una prueba t de student. Como se muestra en la FIG. 4, sFGFR3_Del4-D3 disminuye la señalización de la luciferasa en la línea celular SRE.

Ejemplo 10: sFGFR3_Del4-D3 restablece el crecimiento óseo, evita la mortalidad y restablece la forma del foramen magnum en ratones con acondroplasia

Se llevó a cabo un estudio de eficacia in vivo como en el Ejemplo 6 mediante el uso de una dosis baja (0,25 mg/kg) de sFGFR3_Del4-D3. Se incluyeron un total de 60 ratones en el grupo del vehículo, con 32 ratones de tipo salvaje (wt) y 28 ratones Fgfr3ach/+. El grupo tratado incluía 40 ratones, con 19 ratones wt y 21 ratones Fgfr3ach/+. Sorprendentemente, la dosis baja de sFGFR3_Del4-D3 evitó casi por completo la muerte prematura de los ratones con acondroplasia (FIG. 5). En el grupo de control, el 53,6% de los ratones Fgfr3ach/+ murieron antes del destete, mientras que sólo el 4,8% de los ratones del grupo tratado murieron antes del día 22 y el 20% de los ratones murieron tras el tratamiento con sFGFR3_Del1 a 0,25 mg/kg (Tabla 2; véase también García et al. Sci. Transí. Med.

5:203ra124, 2013).

sFGFR3_Del4-D3 también restauró parcialmente el crecimiento óseo con la corrección de la discrepancia inicial entre los ratones wt y Fgfr3ach/+ en el esqueleto axial y apendicular (Tabla 2). En contraste con los resultados anteriores del tratamiento con una dosis baja de sFGFR3_Del1, el tratamiento con una dosis baja de sFGFR3_Del4-D3 restauró la forma normal del foramen magnum.

Tabla 2. Resultados in vivo de la administración de una dosis alta de sFGFR3_Del1, una dosis baja de sFGFR3_Del1 y una dosis baja de sFGFR3_Del4-D3 a ratones con acondroplasia

Ejemplo 11: Tratamiento de la Acondroplasia por medio de la Administración de sFGFR3_Del4-C253S Un paciente humano (por ejemplo, un bebé, un niño, un adolescente o un adulto) que sufre de acondroplasia puede ser tratado por medio de la administración de sFGFR3_Del4-C253S (FIG. 6; SEC. ID Núm.: 2) por una vía adecuada (por ejemplo, por inyección subcutánea) a una dosis determinada (por ejemplo, entre 0,0002 mg/kg/día y aproximadamente 20 mg/kg/día, tal como 0,001 mg/kg/día y 7 mg/kg/día) durante un curso de días, semanas, meses o años. La progresión de la acondroplasia que es tratada con sFGFR3_Del4-C253S puede ser monitorizada por uno o más de diversos procedimientos establecidos. El médico puede controlar al paciente por medio de la observación directa para evaluar cómo han cambiado los síntomas de acondroplasia que presenta el paciente en respuesta al tratamiento. Por ejemplo, un médico puede controlar los cambios en el peso corporal, la longitud del cráneo y/o la anchura del cráneo del paciente durante un período de tiempo, por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o más veces por mes o por año o aproximadamente cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12 o 16 semanas durante el curso del tratamiento con sFGFR3_Del4-C253S. El peso corporal y/o el tamaño del cráneo del paciente o sus cambios también se pueden determinar en eventos específicos del tratamiento, por ejemplo, antes y/o después de la administración de sFGFR3_Del4-C253S. Por ejemplo, se mide el peso corporal y/o el tamaño del cráneo en respuesta a la administración de sFGFR3_Del4-C253S.

Ejemplo 12: Tratamiento de la Acondroplasia por medio de la Administración de sFGFR3_Del4-D3 Además, un paciente humano (por ejemplo, un bebé, un niño, un adolescente o un adulto) que sufre de acondroplasia puede ser tratado por medio de la administración del polipéptido sFGFR3 de sFGFR3_Del4-D3 (SEC. ID Núm.: 33) por una vía adecuada (por ejemplo, por inyección subcutánea) a una dosis determinada (por ejemplo, entre 0,0002 mg/kg/día y aproximadamente 20 mg/kg/día, tal como 0,001 mg/kg/día y 7 mg/kg/día) durante un curso de días, semanas, meses o años. La progresión de la acondroplasia que es tratada con sFGFR3_Del4-D3 puede ser monitorizada por uno o más de diversos procedimientos establecidos. El médico puede controlar al paciente por medio de la observación directa para evaluar cómo han cambiado los síntomas de acondroplasia que presenta el paciente en respuesta al tratamiento. Por ejemplo, un médico puede controlar los cambios en el peso corporal, la longitud del cráneo y/o la anchura del cráneo del paciente durante un período de tiempo, por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o más veces por mes o por año o aproximadamente cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12 o 16 semanas durante el curso del tratamiento con sFGFR3_Del4-D3. El peso corporal y/o el tamaño del cráneo del paciente o sus cambios también se pueden determinar en eventos específicos del tratamiento, por ejemplo, antes y/o después de la administración de sFGFR3_Del4-D3. Por ejemplo, se mide el peso corporal y/o el tamaño del cráneo en respuesta a la administración de sFGFR3_Del4-D3.

Ejemplo 13: Producción de sFGFR3_Del4-D3 y sFGFR3_Del4-C253S

Los polipéptidos sFGFR3_Del4-D3 y sFGFR3_Del4-C253S se purificaron como se describe en el Ejemplo 2. La modificación de sFGFR3_Del4 para incluir un dominio 3 de tipo similar a Ig C2 ampliado (FGFR3_Del4-D3) o una sustitución de aminoácidos de un residuo de cisteína por un residuo de serina en la posición 253 (sFGFR3_Del4-C253S) mejoró la producción de los polipéptidos sFGFR3. En particular, hubo menos de un 2% de agregación de sFGFR3_Del4-D3 y sFGFR3_Del4-C253S (como se observó al cargar mediante el uso de una concentración de 2,3 mg/ml o 23 mg/ml para FGFR3_Del4-D3 y 1,5 mg/ml y 15 mg/ml de sFGFR3_Del4-C253S) tanto en condiciones reductoras como no reductoras mediante el uso de electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE; FIGS. 7A y 7B, respectivamente). Tras la producción de sFGFR3_Del4-D3 y sFGFR3_Del4-C253S en cultivos por lotes alimentados, los cinco clones principales se separaron por medio de electroforesis capilar para obtener de 0,93 a 1,0 g/L y de 0,98 a 1,1 g/L de sFGFR3_Del4-D3 y sFGFR3_Del4-C253S, respectivamente. La filtración viral por medio de cromatografía de intercambio iónico dio como resultado un rendimiento superior al 60% tanto para sFGFR3_Del4-D3 como para sFGFR3_Del4-C253S.

Ejemplo 14: Farmacocinética y distribución tisular de sFGFR3_Del4-D3 in vivo

Se llevaron a cabo estudios in vivo para investigar los parámetros farmacocinéticos de sFGFR3_Del4-D3, la captación de sFGFR3_Del4-D3 a través de la barrera hematoencefálica y la distribución tisular de sFGFR3_Del4-D3 en riñón, hígado, bazo, pulmón y corazón. Los estudios descritos en la presente memoria incluyeron cuatro brazos con cinco grupos de ratones C57BL/6J por brazo y un total de cuatro ratones (n=4) por grupo (Tabla 3). Los ratones eran machos y pesaban entre 25 y 30 gramos.

Tabla 3. Resumen de los ratones utilizados en los estudios de sFGFR3 Del4-D3.

El grupo 1 fue muestreado a 1 minuto, 15 minutos y 30 minutos; el grupo 2 fue muestreado a 4 horas; el grupo 3 fue muestreado a 24 horas; el grupo 4 fue muestreado a 36 horas; y el grupo 5 fue muestreado a 48 horas. Para el Grupo 1, se insertó un catéter intraarterial permanente (PE-10) en una arteria carótida común bajo anestesia de isoflurano y se utilizó para la toma de muestras de sangre repetidas en el punto de muestreo final de 30 minutos. Para la inyección intravenosa, se inyectó 125I-sFGFR3_Del4-D3 por vía intravenosa en la vena yugular, que se expuso por medio de una incisión cutánea bajo anestesia de isoflurano. Los ratones del Grupo 1 permanecieron anestesiados durante todo el experimento. Se extrajeron repetidas muestras de sangre (2 * ~50|^j L) del catéter arterial a 1 minuto y 15 minutos después de la inyección intravenosa. Para los grupos 2 a 5, después de la inyección de 125I-sFGFR3_Del4-D3, se cerró la piel con una pinza quirúrgica, y se permitió que los ratones se despertaran y volvieran a la jaula. 5 minutos antes de la hora de finalización para el grupo 3, los ratones fueron reanestesiados y recibieron un bolo intravenoso de 3H-albúmina en la vena yugular. La dosis de trazador de 3H se dirigió a producir una relación de 125I a 3H en la sangre, que es adecuada para el etiquetado de isótopos dobles con una dosis más baja en tiempos de muestreo posteriores. A la hora del muestreo final (2 horas, 3 horas, 24 horas, 36 horas y 48 horas), se recolectó una muestra de sangre y se procedió a la eutanasia del animal. Se tomaron muestras del cerebro para su homogeneización y la determinación de la concentración tisular de los trazadores. Los criterios de valoración de los estudios incluían los parámetros farmacocinéticos de sFGFR3_Del4-D3 (vida media terminal), la captación de sFGFR3_Del4-D3 a través de la barrera hematoencefálica y la distribución tisular de sFGFR3_Del4-D3 en riñón, hígado, bazo, pulmón y corazón.

Ejemplo 15: Estabilidad térmica y plasmática de sFGFR3_Del4-D3 y sFGFR3_Del4-C253S

Se investigó la estabilidad térmica de sFGFR3_Del4-D3 y sFGFR3_Del4-C253S en plasma de ratón por medio de colorimetría diferencial de barrido. Para el sFGFR3_Del4-D3, se añadieron dos tampones (20 mM de fosfato, 40mM de NaCl, pH 7,5, y 20 mM de citrato, 40mM de NaCl, pH 6,5) a las muestras de polipéptidos. Para sFGFR3_Del4-C253S, se añadieron dos tampones (20 mM de fosfato, 40mM de NaCl, pH 7,5, y 40 mM de citrato, 40mM de NaCl, pH 6,5) a las muestras de polipéptidos. La temperatura de fusión (Tm) del sFGFR3_Del4-C253S en el tampón 20 mM de fosfato, 40mM de NaCl, pH 7,5 fue de 52 °C y 56 °C, y la Tm del sFGFR3_Del4-C253S en el tampón 40 mM de citrato, 40mM de NaCl, pH 6,5 fue de 55 °C y 60 °C (FIG. 8A). Para sFGFR3_Del4-D3, se añadieron dos tampones (20 mM de fosfato, 40mM de NaCl, pH 7,5, y 20 mM de citrato, 40mM de NaCl, pH 6,5) a las muestras de polipéptidos. La Tm del sFGFR3_Del4-D3 en el tampón 20 mM de fosfato, 40mM de NaCl, pH 7,5 fue de 50 °C y 54 °C, y la Tm del sFGFR3_Del4-D3 en el tampón 20 mM de citrato, 40mM de NaCl, pH 6,5 fue de 53 °C y 58 °C (FlG.

8B). Estos resultados indican que tanto sFGFR3_Del4-D3 como sFGFR3_Del4-C253S muestran dos dominios de estabilidad y desdoblamiento del polipéptido.

La estabilidad plasmática ex vivo del sFGFR3_Del4-D3 con una etiqueta de histidina se determinó por medio del marcaje del sFGFR3_Del4-D3 purificado con un trazador de 125Imediante el uso del procedimiento Bolton-Hunter, seguido por la purificación en columnas PD-10 (Sephadex® G-25). También se determinó la precipitabilidad del ácido tricloroacético (TCA) de las fracciones de pico para confirmar la estabilidad del trazador de 125I. El plasma de los ratones (n = 4) precalentado a 37 °C se enriqueció con el 125I-sFGFR3_Del4-D3 a una concentración de -10 cpm/mL y posteriormente se mezcló en vórtex. Las muestras de plasma se incubaron con el 125I-sFGFR3_Del4-D3 en un Eppendorf ThermoMixer® con una rotación suave (300 rpm). A continuación, se recolectaron alícuotas para la precipitación con TCA (10 j l de muestra y 100 j l de BSA al 2%) y para la inyección en una columna de cromatografía líquida de alto rendimiento (FPLC) (20 j l de muestra y 150 j l de PBS 10 mM, pH 7,4) a intervalos de 0, 30, 60, 120, 180 y 360 minutos. Las alícuotas se almacenaron en hielo hasta que se llevó a cabo la precipitación con TCA o la inyección con FPLC.

Para la precipitación con TCA, se añadió 1 mL de TCA al 10% frío a las muestras de plasma, se incubó durante 10 minutos en hielo, se centrifugó a 4.000g durante 5 minutos, y posteriormente se separaron el sobrenadante y el gránulo y ambos se contaron en un contador gamma. Para evaluar la estabilidad del plasma ex vivo, se inyectaron 100 j l de la muestra en una columna de FPLC (Superdex® 200 10/300 GL) y se eluyeron a una velocidad de 0,75 ml/min para 1,5 volúmenes de columna. Se recolectaron fracciones de 1 ml de la columna y se midieron en un contador gamma. Se determinó que la estabilidad plasmática de sFGFR3_Del4-D3 a 37 °C era del 95% a los 0 minutos, del 95% a las 2 horas y del ~92% a las 24 horas, con sólo una pequeña agregación (FIG. 9A).

También se determinó la estabilidad in vivo del sFGFR3_Del4-D3 en el plasma tras su administración por inyección intravenosa y subcutánea. El sFGFR3_Del4-D3 se marcó con un trazador 125I mediante el uso del procedimiento Bolton-Hunter, seguido por una purificación en columnas PD-10 (Sephadex® G-25). El sFGFR3_Del4-D3 marcado con 125I (10 jC i en -50 jL de PBS) se administró por inyección intravenosa o subcutánea en ratones C57BI/6 anestesiados. La dosis de proteína trazadora de 125I (aproximadamente 0,1 mg/kg) se complementó con proteína no marcada hasta una dosis total de 2,5 mg/kg. La albúmina sérica de rata utilizada como marcador vascular se marcó con [3H]-NSP (N-succininidil[2,3-3H]Propionato; Perkin Elmer) y se purificó en columnas PD-10 (Sephadex® G25).

Para la estabilidad de sFGFR3_Del4-D3 en el plasma después de la inyección intravenosa en bolo, los perfiles de elución FPLC no mostraron productos de degradación en el plasma hasta 15 minutos (FIG. 9B). A los 30 minutos de la administración de sFGFR3_Del4-D3, apareció una pequeña cantidad de productos de degradación de bajo peso molecular, que aumentó a las 2 horas, pero que desapareció en gran medida a las 24 horas. Para la estabilidad del sFGFR3_Del4-D3 en el plasma después de la inyección subcutánea, los perfiles de elución de la FPLC mostraron algunos productos de degradación en el plasma a los 30 minutos, con una mayor degradación a las 2 horas y a las 4 horas (FIG. 9C). La baja cantidad de trazador que queda en el plasma después de 24 horas aparece en gran parte como el polipéptido sFGFR3_Del4-D3 intacto. Los cromatogramas del panel inferior de las FIGS. 9B y 9C se presentan normalizados al pico más alto de cada serie individual para facilitar la comparación de los patrones de elución.

Ejemplo 16: Actividad de unión a ligando de sFGFR3_Del4-D3 y sFGFR3_Del4-C253S

Se llevaron a cabo experimentos para caracterizar la afinidad de unión de sFGFR3_Del4-D3 y sFGFR3_Del4-C253S para el FGF2 humano. La constante de disociación (Kd) del sFGFR3_Del4-D3 y la Kd del sFGFR3_Del4-C253S para el FGF2 se determinaron como se describe en el Ejemplo 3 con un tampón de regeneración de 20mM de fosfato, 40mM de NaCl, pH 7,5. Se probaron concentraciones de 13 nM, 6,5 nM, 3,25 nM y 1,75 nM tanto para sFGFR3_Del4-D3 como para sFGFR3_Del4-C253S. La Kd de sFGFR3_Del4-D3 se determinó en ~3,6 nm, y la Kd de sFGFR3_Del4-C253S se determinó en ~6,9 nm. Estos resultados indican que el sFGFR3_Del4-D3 y el sFGFR3_Del4-C253S tienen una actividad de unión al FGF2 en el intervalo bajo de nM.

Ejemplo 17: sFGFR3_Del4-D3 y sFGFR3_Del4-C253S muestran actividad funcional in vitro

La actividad funcional de sFGFR3_Del4-D3 y sFGFR3_Del4-C253S se probó por medio de un ensayo de proliferación. Los ensayos de proliferación mediante el uso de células ATDC5 modificadas genéticamente para sobreexpresar la mutación FGFR3ach (líneas celulares ATDC5 FGFR3G380R) se llevaron a cabo como se describe en el Ejemplo 4 con concentraciones de 1 ug/ml, 10 ug/ml y 50 ug/ml para sFGFR3_Del4-D3 y sFGFR3_Del4-C253S. En cada una de estas concentraciones, sFGFR3_Del4-C253S y sFGFR3_Del4-D3 restauraron la proliferación de las células FGFR3G380R (FIG. 10A y 10B). Se determinó que la EC50 era de aproximadamente 10 nM tanto para el sFGFR3_Del4-D3 como para el sFGFR3_Del4-C253S sobre la base de una concentración de 1 ug/ml. Estos resultados indican que el sFGFR3_Del4-D3 y el sFGFR3_Del4-C253S son biológicamente activos en el intervalo bajo de nM.

Ejemplo 18: Perfil Farmacocinético de sFGFR3_Del4-D3 y sFGFR3_Del4-C253S

El perfil farmacocinético (PK) de sFGFR3_Del4-D3 administrado por vía subcutánea o intravenosa a una dosis de 2.5 mg/kg se utilizó para determinar la vida media de eliminación terminal de sFGFR3_Del4-D3 (FIG. 11). Las muestras se recolectaron a los 30 minutos, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 24 horas, 36 horas y 48 horas en los ratones a los que se administró sFGFR3_Del4-D3 por vía subcutánea. Las muestras se recolectaron a 1 minuto, 15 minutos, 30 minutos, 2 horas, 24 horas y 36 horas para los ratones a los que se les administró sFGFR3_Del4-D3 por vía intravenosa. La semivida de eliminación terminal subcutánea de 2,5 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 fue de -20 horas, mientras que la semivida de eliminación terminal intravenosa de 2,5 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 fue de ~7 horas. A partir del perfil PK, la Tmáx. fue de ~8 horas, la Cmáx. fue de ~4,5 nM, y la biodisponibilidad estimada fue de ~30% para 2.5 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 administrados por vía subcutánea. Se produjo un rápido aclaramiento de sFGFR3_Del4-D3 administrado por vía intravenosa durante la fase a, seguido por un aclaramiento más lento en la fase p, con un perfil PK intravenoso similar para sFGFR3_Del4-C253S.

Ejemplo 19: El riñón y el hígado son las principales vías de eliminación de sFGFR3_Del4-D3

El aclaramiento de sFGFR3_Del4-D3 se evaluó en el tejido de riñón, hígado, bazo, pulmón y corazón después de 30 minutos, 120 minutos y 1440 minutos tras la administración intravenosa de 2,5 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 y después de 30 minutos, 120 minutos, 240 minutos, 480 minutos y 1440 minutos tras la administración subcutánea de 2,5 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3. El hígado y el riñón fueron la principal vía de eliminación de sFGFR3_Del4-D3 en la administración intravenosa (FIG. 12). El riñón fue la principal vía de eliminación de sFGFR3_Del4-D3 para la administración subcutánea (FIG. 13).

Ejemplo 20: sFGFR3_Del4-D3 no cruza la barrera hematoencefálica

También se llevaron a cabo estudios farmacocinéticos para determinar la captación de sFGFR3_Del4-D3 a través de la barrera hematoencefálica en ratones de tipo salvaje. Tras la inyección intravenosa en bolo, se midió la captación de sFGFR3_Del4-D3 en el tejido cerebral en tres momentos (30 minutos, 2 horas y 24 horas). Se inyectó sFGFR3_Del4-D3 como trazador radiomarcado (125I-sFGFR3_Del4-D3) con 2,5 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 sin marcar. La dosis inyectada de 125I-sFGFR3_Del4-D3 fue de aproximadamente 10 pCi por animal, lo que corresponde a menos de 0,1 mg/kg. Tras la eutanasia de los ratones a los 30 minutos, a las 2 horas y a las 24 horas, se midió la concentración de 125I-sFGFR3_Del4-D3 en los órganos y en el plasma por medio del recuento por centelleo líquido. La concentración de 125I-sFGFR3_Del4-D3 se corrigió en función del metabolismo en las muestras de plasma y de cerebro por medio de la medición de la fracción de material precipitable de ácido tricloroacético (TCA) (por ejemplo, el trazador intacto). La validez de la corrección del TCA también se confirmó por medio de la inyección de las muestras en una columna de cromatografía líquida de proteínas de exclusión por tamaño (FPLC). La concentración en el órgano de 125I-sFGFR3_Del4-D3 se corrigió por el contenido intravascular (V0) por medio de la inyección de albúmina radiomarcada (3H-RSA) poco antes de sacrificar al animal. El volumen de distribución aparente del órgano de la RSA representa el V0. La dosis de albúmina fue insignificante (del orden del 1% de la concentración fisiológica). Para todos los órganos diferentes del cerebro, las concentraciones se calcularon por medio de la resta del contenido vascular y teniendo en cuenta la fracción precipitable del TCA en el plasma. Sin embargo, no se corrigió la captación de material degradado en estos órganos diferentes del cerebro porque no se llevó a cabo la precipitación del TCA.

Las concentraciones cerebrales se calcularon por medio de la siguiente fórmula: Ccerebro(corr) = [V(sFGFR3_Del4-D3) - Vo] x Cplasma(terminal), en el que Vd (sFGFR3_Del4-D3) es el volumen de distribución de sFGFR3_Del4-D3 en el cerebro (calculado como Ccerebro / Cplasma), Vo es el volumen de albúmina distribuido en el cerebro, y Cplasma(terminal) es la concentración plasmática de sFGFR3_Del4-D3 en el tiempo de muestreo terminal. Todas las concentraciones se expresaron como el porcentaje de la dosis inyectada por gramo o ml (%ID/g o %ID/mL), respectivamente, y la dosis del bolo intravenoso es igual al 100%. Estos valores se pueden convertir en [mg/g] o [mg/mL] por medio de la multiplicación por la dosis inyectada: (peso corporal en g /1000 g) * 2,5 mg. Todos los pesos corporales estaban en el intervalo de 25 g - 30 g.

No hubo captación cerebral detectable de 125I-sFGFR3_Del4-D3, como indican las concentraciones cerebrales corregidas (después de la corrección por el contenido vascular y la degradación (precipitabilidad del TCA)) en ninguno de los puntos temporales medidos (FIG. 14A). Además, la Vd de RSA (=V0) y 125I-sFGFR3_Del4-D3 no fue significativamente diferente en ninguno de los puntos de tiempo medidos (30 minutos, 2 horas y 24 horas), de acuerdo con lo determinado por medio de una prueba t emparejada (FIG. 14B). En conclusión, no hay captación medible de sFGFR3_Del4-D3 en el tejido cerebral de los ratones a los 30 minutos, 2 horas y 24 horas con una dosis de 2,5 mg/kg inyectada como bolo intravenoso.

Ejemplo 21: Eficacia in vivo del sFGFR3_Del4-D3 para el tratamiento de la acondroplasia

El sFGFR3_Del4-D3 y el sFGFR3_Del4-C253S fueron evaluados cada uno a una dosis subcutánea de 2,5 mg/kg una o dos veces por semana o 10 mg/kg dos veces por semana. Se llevó a cabo la cría para generar 30 camadas con la mitad de ratones de tipo salvaje y la mitad de ratones heterocigotos Fgfr3ach/+ (Tabla 4).

Tabla 4. Administración subcutánea de sFGFR3_Del4-D3 y sFGFR3_Del4-C253S a ratones de tipo salvaje (WT) y Fgfr3ach/+.

En el día 3, todos los ratones recién nacidos de una misma camada recibieron la misma dosis. Las camadas de control recibieron 10 pl de PBS (vehículo). Posteriormente, se administraron inyecciones subcutáneas de sFGFR3_Del4-D3 y sFGFR3_Del4-C253S a dosis de 2,5 mg/kg una o dos veces por semana o 10 mg/kg dos veces por semana durante tres semanas, alternativamente en los lados izquierdo y derecho de la espalda. Los ratones se observaron diariamente, prestando especial atención a las alteraciones de la locomoción y la micción, y se pesaron los días de la inyección. Los ratones con complicaciones fueron observados dos veces al día para su vigilancia. Los datos anteriores indicaban que no había diferencias estadísticas entre hombres y mujeres, por lo que éstos se consideraron un solo grupo para todos los análisis.

La administración subcutánea de sFGFR3_Del4-D3 a 2,5 mg/kg una o dos veces por semana o 10 mg/kg dos veces por semana aumentó la supervivencia de los ratones Fgfr3ach/+ en relación con los ratones Fgfr3ach/+ que recibieron PBS (FIG. 15 y Tabla 4). En particular, la administración de 10 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 dos veces por semana dio lugar a una supervivencia del 93% de los ratones Fgfr3ach/+, la administración de 2,5 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 una vez por semana dio lugar a una supervivencia del 84% de los ratones Fgfr3ach/+, y la administración de 2,5 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 dos veces por semana dio lugar a una supervivencia del 72% de los ratones Fgfr3ach/+, mientras que la supervivencia de los ratones Fgfr3ach/+ que recibieron PBS fue del 62,8%. La mortalidad de los ratones Fgfr3ach/+ a los que se les administró 10 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 dos veces por semana fue del 6,7%, la mortalidad de los ratones Fgfr3ach/+ a los que se les administró 2,5 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 una vez por semana fue del 15,4%, la mortalidad de los ratones Fgfr3ach/+ a los que se les administró 2,5 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 dos veces por semana fue del 28,0%, y la mortalidad de los ratones Fgfr3ach/+a los que se les administró PBS fue del 37,2%. El análisis estadístico de la supervivencia de los ratones Fgfr3ach/+ tras el tratamiento con sFGFR3_Del4-D3 se llevó a cabo por medio de la prueba de normalidad ómnibus de Agostino y Pearson, seguida por una prueba t. Todos los grupos investigados superaron las pruebas de normalidad. Los valores P de estos análisis se muestran a continuación, en los que * representa un valor P de <0,05 y *** representa un valor P de <0,001 (Tabla 5).

Tabla 5. Valores P para la administración subcutánea de sFGFR3_Del4-D3 a ratones de tipo salvaje (WT) y Fgfr3ach/+.

La administración subcutánea de sFGFR3_Del4-D3 a 2,5 mg/kg una o dos veces por semana o 10 mg/kg dos veces por semana también disminuyó la gravedad y la frecuencia de los problemas locomotores y las complicaciones en la respiración abdominal en los ratones Fgfr3ach/+ en relación con los ratones Fgfr3ach/+ que recibieron PBS (FIG. 16). En particular, los problemas locomotores disminuyeron más en los ratones Fgfr3ach/+ a los que se les administró por vía subcutánea 10 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 dos veces por semana, seguidos por los ratones a los que se les administró 2,5 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 dos veces por semana y los ratones a los que se les administró 2,5 mg/kg una vez por semana. Las complicaciones en la respiración abdominal disminuyeron en mayor medida en los ratones Fgfr3ach/+ a los que se les administró por vía subcutánea 10 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 dos veces por semana, seguidos por los ratones a los que se les administró 2,5 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 una vez por semana y, a continuación, los ratones a los que se les administró 2,5 mg/kg dos veces por semana. Estos resultados muestran que sFGFR3_Del4-D3 reduce los síntomas de la acondroplasia en los ratones Fgfr3ach/+.

La administración subcutánea de sFGFR3_Del4-D3 también aumentó significativamente la longitud corporal total, que incluye la longitud axial y la longitud de la cola, y los huesos largos (p = 0,07) en los ratones Fgfr3ach/+ que recibieron 2,5 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 una o dos veces por semana o 10 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 dos veces por semana en relación con los ratones Fgfr3ach/+ que recibieron PBS (FIGS. 17A a 17C). La longitud de la cola y del cuerpo (longitud axial) se midió con el mismo calibre digital en esqueletos enteros. La longitud de la tibia se midió en radiografías digitales. La administración de 10 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 dos veces por semana dio lugar a una corrección axial del 51% (longitud del cuerpo y de la cola) de los ratones Fgfr3ach/+, seguida por el 43% de corrección axial en los Fgfr3ach/+ que recibieron 2,5 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 dos veces por semana, y del 39% de corrección axial en los ratones Fgfr3ach/+ que recibieron 2,5 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 una vez por semana. El aumento de la longitud del hueso y del cuerpo también fue evidente en las radiografías de los ratones Fgfr3ach/+ a los que se les administró 2,5 mg/kg o 10 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 dos veces por semana en relación con los ratones Fgfr3ach/+ que recibieron PBS (FIG. 17D). La administración de 10 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 dos veces por semana dio lugar a una corrección apendicular del 86% (longitud de la tibia y el fémur) en los ratones Fgfr3ach/+, seguida por el 68% de corrección apendicular en los Fgfr3ach/+ que recibieron 2,5 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 dos veces por semana y del 54% de corrección apendicular en los ratones Fgfr3ach/+ que recibieron 2,5 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 una vez por semana.

La administración subcutánea de sFGFR3_Del4-D3 también dio lugar a una mejora dependiente de la dosis en la relación craneal (longitud/anchura (L/W)) en los ratones Fgfr3ach/+ en relación con los ratones Fgfr3ach/+ que recibieron PBS (FIG. 18A). Los ratones Fgfr3ach/+ a los que se les administró por vía subcutánea 10 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 dos veces por semana mostraron la mayor mejoría en la relación craneal (L/W), seguidos por los ratones Fgfr3ach/+ a los que se les administró 2 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 dos veces por semana y los ratones Fgfr3ach/+ a los que se les administró 2 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 una vez por semana. En particular, la administración de 10 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 dos veces por semana dio lugar a una corrección de la forma del cráneo del 37% (relación L/W) de los ratones Fgfr3ach/+, seguida por una corrección de la forma del cráneo del 29% en los Fgfr3ach/+que recibieron 2,5 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 dos veces por semana y del 19% en los ratones Fgfr3ach/+ que recibieron 2,5 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 una vez por semana. Las mejoras en la relación craneal también fueron evidentes en las radiografías de los ratones Fgfr3ach/+ a los que se les administró 10 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 en relación con los ratones Fgfr3ach/+que recibieron PBS (FIG. 18B). A continuación se muestran las medidas óseas (presentadas en mm y media ± SEM) para la longitud del cuerpo, la cola, el fémur, la tibia y la relación craneal (Tabla 6). Estos resultados indican la eficacia in vivo dependiente de la dosis de sFGFR3_Del4-D3, como se demuestra por el aumento de la supervivencia, la reducción del número de complicaciones, el aumento del crecimiento óseo y las mejoras en las proporciones del esqueleto de los ratones Fgfr3ach/+.

Tabla 6. Mediciones óseas (presentadas en mm y media ± SEM) para la longitud del cuerpo, la cola, el fémur, la tibia y la relación craneal de ratones WT y Fgfr3ach/+ a los que se les administró sFGFR3_Del4-D3 por vía subcutánea.

Además, la comparación de las mediciones óseas de los ratones Fgfr3ach/+ a los que se les administró sFGFR3_Del1 a una dosis de 2,5 mg/kg dos veces por semana muestra que la administración de sFGFR3_Del4-D3 a una dosis de 2,5 mg/kg dos veces por semana fue comparable o más eficaz para aumentar la longitud del hueso, la cola, el fémur y la tibia y mejorar la relación craneal de los ratones Fgfr3ach/+ (Tabla 7). En particular, la longitud del cuerpo de los ratones Fgfr3ach/+administrados con sFGFR3_Del4-D3 mejoró hasta 135,5 ± 1,75 mm en relación con 134,4 ± 1,17 mm para los ratones Fgfr3ach/+ administrados con sFGFR3_Del1; la longitud de la cola de los ratones Fgfr3^ch/+ administrados con sFGFR3_Del4-D3 mejoró hasta 73,69 ± 1,5 mm en relación con los 71,58 ± 0,86 mm de los ratones Fgfr3ach/+ administrados con sFGFR3_Del1; la longitud del fémur de los ratones Fgfr3ach/+ administrados con sFGFR3_Del4-D3 mejoró hasta los 10,58 ± 0,09 mm en comparación con los 10,01 ± 0,06 mm de los ratones Fgfr3ach/+ administrados con sFGFR3_Del4-D3; la longitud de la tibia de los ratones Fgfr3ach/+administrados con sFGFR3_Del4-D3 mejoró hasta los 14,09 ± 0,12 mm en comparación con los 13,27 ± 0.31 mm para los ratones Fgfr3ach/+ a los que se les administró sFGFR3_Del1; y la relación craneal de los ratones Fgfr3ach/+ a los que se les administró sFGFR3_Del4-D3 mejoró a 1,85 ± 0,01 mm en relación con los 1,81 ± 0,02 mm de los ratones Fgfr3ach/+ a los que se les administró sFGFR3_Del1.

Tabla 7. Mediciones óseas (presentadas en mm y media ± SEM) para la longitud del cuerpo, la cola, el fémur, la tibia y la relación craneal de ratones WT y Fgfr3ach/+ a los que se les administró sFGFR3_Del1 por vía subcutánea (datos descritos en García et al. Sci. Transí. Med. 5:203ra124, 2013).

Ejemplo 22: No hay toxicidad en los órganos asociada a la administración de sFGFR3_Del4-D3

Se llevaron a cabo estudios histopatológicos para caracterizar la toxicidad orgánica asociada a la administración de sFGFR3_Del4-D3. A los ratones de tipo salvaje (6 machos y 6 hembras por dosis) se les administró PBS, 2,5 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 una vez por semana, 2,5 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 dos veces por semana o 10 mg/kg de sFGFR3_Del4-D3 dos veces por semana. Los órganos investigados fueron el riñón, la piel, las glándulas salivales, los ganglios linfáticos mandibulares, la vesícula biliar, el bazo, el páncreas, los pulmones, el corazón, la aorta, el yeyuno, el colon y el hígado. No hubo resultados histopatológicos que indicaran toxicidad en los órganos de los ratones de tipo salvaje a los que se les administró ninguna de las dosis de sFGFR3_Del4-D3. Estos resultados indican que no hubo toxicidad asociada a la administración de sFGFR3_Del4-D3 hasta 10 mg/kg dos veces por semana.

Ejemplo 23: Determinación de la afinidad de unión de sFGFR3_Del4-D3 a los factores de crecimiento de fibroblastos

Se determinó que sFGFR3_Del4-D3 se une a los ligandos de los Factores de Crecimiento de Fibroblastos (FGF) y actúa como un señuelo para prevenir la unión de los FGFs a la membrana unida al FGFR3. La Resonancia de Plasmón de Superficie se llevó a cabo mediante el uso de un BIACORE™ T200 (GE Healthcare) para determinar los valores de Kd para diferentes FGFs humanos (hFGFs) que se unen a sFGFR3_Del4-D3 inmovilizado. En particular, se determinaron los valores de Kd para los hFGF paracrinos del hFGF1 (FIG. 19A), hFGF2 (FIG. 19B), hFGF9 (FIG.

19C), y hFGF18 (FIG. 19D) y los hFGF endocrinos de hFGF19 (FIG. 19E) y hFGF21 (FIG. 19F). Los cuatro ligandos paracrinos del FGF se unieron al sFGFR3_Del4-D3 con afinidad nanomolar (nM) (Tabla 8).

Tabla 8. Sumario de la determinación y los valores de K ^d para los FGF humanos paracrinos (hFGF1, hFGF2, hFGF9 y hFGF18) y los FGF humanos endocrinos (hFGF19 y hFGF21).

Para FGF2 y FGF18, se logró un buen ajuste con un modelo de unión 1:1, que es el modelo más directo de afinidad de unión. Este modelo describe una interacción de unión 1:1 en la superficie del chip con el SFGFR3_DEL4-D3 inmovilizado al unir diferentes FGFs: A B = AB con una sola tasa de encendido y apagado. El modelo 2:1 también describe una interacción 1:1 de la unión del FGF al SFGFR3_DEL4-D3, pero también asume un cambio conformacional que estabiliza el complejo: A B = AB = AB* y representa dos velocidades de entrada y salida. Este modelo asume que el complejo cambiado conformacionalmente (SFGFR3_DEL4-D3 unido al FGF) sólo se puede disociar por medio de la inversión del cambio conformacional. Se determinó que los datos experimentales para el hFGF1, el hFGF9, el hFGF19 y el hFGF21 se ajustaban muy bien al modelo 2:1 y, por tanto, la Kd para el hFGF1, el hFGF9, el hFGF19 y el hFGF21 se derivó del modelo 2:1.

A pesar de que el hFGF1, el hFGF9, el hFGF19 y el hFGF21 tienen todos una Kd en el intervalo bajo de nM, los perfiles cinéticos de estos hFGFs difieren significativamente. Por ejemplo, el FGF1 se une al sFGFR3_Del4-D3 con una tasa de activación y desactivación muy rápida, mientras que el FGF2 no se une al sFGFR3_Del4-D3 con una tasa de activación y desactivación tan rápida como la del FGF1, lo que resulta en una Kd general más pequeña para el FGF2 en comparación con el FGF1 (Tabla 8). Se midió una afinidad significativamente menor entre el sFGFR3_Del4-D3 y el hFGF19 o el hFGF21, que son miembros de la subfamilia endocrina FGF15/FGF19, en relación con los hFGF paracrinos (Tabla 8 y FIGS. 19D y 19E). La subfamilia FGF15/FGF19 utiliza Klotho en lugar de proteoglicanos como cofactor y ha evolucionado hasta convertirse en factores de crecimiento de acción endocrina, que son importantes para la regulación sistémica de parámetros metabólicos, tales como el fosfato, los

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido del receptor 3 del factor de crecimiento de fibroblastos solubles (sFGFR3), cuya secuencia de aminoácidos consiste en una secuencia de aminoácidos con al menos un 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 4.

2. El polipéptido sFGFR3 de la reivindicación 1, en el que:

(i) el polipéptido sFGFR3 es un polipéptido sFGFR3 aislado; y/o

(ii) el polipéptido sFGFR3 se une al factor de crecimiento de fibroblastos 1 (FGF1), al factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2), al factor de crecimiento de fibroblastos 9 (FGF9) o al factor de crecimiento de fibroblastos 18 (FGF18).

3. Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido sFGFR3 de la reivindicación 1 o 2 y un excipiente, portador o diluyente aceptable para uso farmacéutico, preferentemente en el que la composición farmacéutica comprende entre aproximadamente 1 mg/ml y aproximadamente 500 mg/ml del polipéptido sFGFR3.

4. El polipéptido sFGFR3 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2 para su uso en el tratamiento de un trastorno de retraso del crecimiento esquelético en un sujeto, en el que opcionalmente:

(i) el polipéptido sFGFR3 se administra a una dosis de aproximadamente 0,002 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, tal como una dosis de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg o una dosis de aproximadamente 0,2 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg; y/o

(ii) el polipéptido sFGFR3 está formulado para su administración diaria, semanal o mensual.

5. El polipéptido sFGFR3 para uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que:

(i) el polipéptido sFGFR3 está formulado para ser administrado siete veces por semana, seis veces por semana, cinco veces por semana, cuatro veces por semana, tres veces por semana o dos veces por semana; y/o

(ii) el polipéptido sFGFR3 está formulado para la administración parenteral, la administración enteral o la administración tópica, en el que opcionalmente el polipéptido sFGFR3 está formulado para la administración subcutánea, la administración intravenosa, la administración intramuscular, la administración intraarterial, la administración intratecal o la administración intraperitoneal.

6. El polipéptido sFGFR3 para uso de acuerdo con la reivindicación 4 o 5, en el que el trastorno de retraso del crecimiento esquelético es una enfermedad esquelética relacionada con el FGFR3, en el que opcionalmente la enfermedad esquelética relacionada con el FGFR3 se selecciona del grupo que consiste en acondroplasia, displasia tanatofórica tipo I (TDI), displasia tanatofórica tipo II (TDII), acondroplasia severa con retraso del desarrollo y acantosis nigricans (SADDEN), hipocondroplasia, un síndrome de craneosinostosis y el síndrome de camptodactilia, estatura alta y pérdida de audición (CATSHL).

7. El polipéptido sFGFR3 para uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que:

(i) el trastorno de retraso del crecimiento esquelético es la acondroplasia;

(ii) el síndrome de craneosinostosis se selecciona del grupo formado por el síndrome de Muenke, el síndrome de Crouzon y el síndrome Crouzonodermoesquelético; o

(iii) la enfermedad esquelética relacionada con el FGFR3 es causada por la expresión en el sujeto de un FGFR3 constitutivamente activo, en el que opcionalmente el FGFR3 constitutivamente activo comprende una sustitución de aminoácidos de un residuo de glicina por un residuo de arginina en la posición 380 de la SEC. ID Núm.: 5.

8. El polipéptido sFGFR3 para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en el que:

(i) el sujeto ha sido diagnosticado con el trastorno de retraso en el crecimiento esquelético;

(ii) el sujeto presenta uno o más síntomas del trastorno de retraso del crecimiento esquelético seleccionados del grupo que consiste en extremidades cortas, tronco corto, piernas arqueadas, marcha de pato, malformaciones del cráneo, cráneo en forma de hoja de trébol, craneosinostosis, huesos wormianos, anomalías de las manos, anomalías de los pies, pulgar de autoestopista y anomalías del pecho;

(iii) el sujeto exhibe una mejora en uno o más síntomas del trastorno de retraso del crecimiento esquelético tras la administración del polipéptido sFGFR3;

(iv) el sujeto no ha sido administrado previamente el polipéptido sFGFR3;

(v) el sujeto se selecciona del grupo formado por un bebé, un niño y un adulto; y/o

(vi) el sujeto es un ser humano.

9. El polipéptido sFGFR3 para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, en el que:

(i) el polipéptido sFGFR3 aumenta la supervivencia del sujeto; y/o

(ii) el polipéptido sFGFR3 restablece la forma del foramen magnum en el sujeto.

10. Un kit que comprende el polipéptido sFGFR3 de la reivindicación 1, en el que el kit comprende opcionalmente instrucciones para su uso.