KR20110056554A - 섬유모세포 성장 인자 수용체-3 (ｆｇｆｒ-3) 억제제 및 치료 방법 - Google Patents

섬유모세포 성장 인자 수용체-3 (ｆｇｆｒ-3) 억제제 및 치료 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 FGFR-3(IIIb) 및 FGFR-3(IIIc) 또는 이들의 돌연변이체 형태에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 단편에 관한 것이다. 추가적인 실시양태는 이러한 항체를 포함하는 제약 조성물 및 이러한 항체를 사용하여 암을 치료하는 방법을 포함한다.

Description

섬유모세포 성장 인자 수용체-3 (ＦＧＦＲ-3) 억제제 및 치료 방법{FIBROBLAST GROWTH FACTOR RECEPTOR-3 (FGFR-3) INHIBITORS AND METHODS OF TREATMENT}
본 발명은 면역학 및 암 치료에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 인간 섬유모세포 성장 인자 수용체 3 (FGFR-3) (서열 11)에 결합하는 인간 항체에 관한 것이다. FGFR은 CD333, ACH, CEK2, HSFGFR-3EX 및 JTK4로 또한 공지되어 있다.
FGFR-3은 다발성 골수종, 방광 및 요로상피세포 암종이 포함되는 암의 발달에서 수반되는 것으로 나타났다. FGF 리간드-수용체 결합은 수용체 이량체화 및 자가인산화를 유도하여, 이펙터(effector) 분자의 하류 활성화에 이른다. FGFR-3 신호전달은 증식, 분화, 이동, 생존/세포자멸사, 세포골격 및 시토카인 조절, 및 세포내이입/세포외배출과 같은 광범위한 세포 활성을 조절할 수 있다. FGFR-3 신호전달의 과다활성화는 종양 세포에게 성장 또는 생존 장점을 제공하고 따라서 종양 악성에 기여하는 중요한 이벤트로서 인식되었다.
전장 FGFR-3에는 FGFR-3의 세번째 IgG-유사 도메인을 코딩하는 별법적인 엑손들로부터 초래되는, FGFR-3(IIIb) 및 FGFR-3(IIIc)로 칭해지는 2가지 스플라이스(splice) 형태가 있다. FGFR-3에는 DNA 복제 또는 번역에서의 오류로 인한, 잘 보도되어 있는 돌연변이체 형태가 또한 존재한다. 암이 포함되는 광범위한 질환에서의 FGFR-3 신호전달 경로의 활발한 역할을 고려하여, 이러한 경로를 조절하기 위한 메커니즘이 요구된다.
리간드 결합을 차단하는 항-FGFR-3 항체가 개시되었다 ([Rauchenberger, R. et al., J. Biol. Chem. 2003 Oct 3; 278(40):38194-205]). 야생형 및 돌연변이체 형태의 FGFR-3 양쪽 모두에 결합하는 항-FGFR-3 항체가 개시되었다 ([Martinez-Torrecuadrada, J., et al., Clin. Cancer Res. 2005 Sep 1;11(17):6280-90]; [Trudel S., et al., Blood 2006 May 15;107(10):4039-46]). FGFR-3 신호전달의 리간드 매개 활성화를 억제하고 FGFR-3-매개 종양 성장을 억제하는 항-FGFR-3 항체가 개시되었다 ([Trudel S., et al., Blood 2006 May 15;107(10):4039-46]). 조합 요법으로서 제공되는 경우 시스플라틴의 항-종양 효과를 강화하는 항-FGFR-3 항체가 개시되었다 ([Deevi, D. et al., AACR 2007 Oct. 21-24]; [Wang, W., et al., EORTC 2008 Oct. 22-26]).
그러나, 하기의 것들 중 하나 이상이 가능한 항체 길항제가 당업계에서 요구된다: FGFR-3의 2가지 스플라이스 형태 (FGFR-3(IIIb) 및 FGFR-3(IIIc)) 양쪽 모두에 대해 고도로 특이적임, FGFR-3을 내재화시키고, 바람직하게는 FGFR-3(IIIb) 및 FGFR-3(IIIc) 또는 이들의 돌연변이체 형태의 분해를 또한 유도함, 및 화학-세포독성제와 조합되어 사용되는 경우 치료 효능을 강화하고 화학물질 저항성(chemo-resistance)을 역전시킴. 추가적으로, 바람직하게는 항체가 돌연변이체 형태의 FGFR-3에 대해 또한 활성이거나, FGF 리간드가 FGFR-3에 결합하는 것을 차단하거나, 리간드-유도 FGFR-3 신호전달 경로를 억제하거나, FGFR-3-매개 세포 활성을 억제하거나, 또는 시험관 내에서 및 생체 내에서 종양 성장을 억제한다.
본 발명의 항체가 이러한 요구들을 해소하였다. 본 발명의 항체는 FGFR-3의 2가지 스플라이스 형태 (FGFR-3(IIIb) 및 FGFR-3(IIIc)) 양쪽 모두에 대해 고도로 특이적이고, FGFR-3 수용체 또는 수용체 돌연변이체에 결합 시 FGFR-3을 내재화시키며, 바람직하게는 세포 내에서 수용체 분해를 또한 유도하고, 화학-세포독성제와 조합되어 사용되는 경우 치료 효능을 강화하고 화학물질 저항성을 역전시키며, 뿐만 아니라 돌연변이체 형태의 FGFR-3에 대해 활성이고, FGF 리간드가 FGFR-3에 결합하는 것을 차단하고, 리간드-유도 FGFR-3 신호전달 경로를 억제하고, FGFR-3-매개 세포 활성을 억제하고, 시험관 내에서 및 생체 내에서 종양 성장을 억제한다.
본 발명은 인간 FGFR-3(IIIb) 및 FGFR-3(IIIc)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체에 관한 것이다.
바람직하게는, 항체는 실온 (20-25℃)에서 약 1×10-8 M 이하의 KD를 갖는 인간 항체이다.
바람직하게는, 항체는 인간 FGFR-3 도메인 2 (서열 12)에 특이적으로 결합한다.
바람직하게는, 인간 FGFR-3(IIIb) 및 FGFR-3(IIIc)에 특이적으로 결합하는 본 발명의 항체는 서열
Figure pct00001
을 갖는 CDRH1, 서열
Figure pct00002
을 갖는 CDRH2, 서열
Figure pct00003
을 갖는 CDRH3, 서열
Figure pct00004
을 갖는 CDRL1, 서열
Figure pct00005
을 갖는 CDRL2, 및 서열
Figure pct00006
을 갖는 CDRL3을 포함한다.
바람직하게는, 항체는
Figure pct00007
의 중쇄 가변 아미노산 서열 및
Figure pct00008
의 경쇄 가변 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 항체는
Figure pct00009
의 중쇄 가변 아미노산 서열 또는
Figure pct00010
의 경쇄 가변 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
항체 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1, 또는 항체의 FGFR-3-결합 단편으로부터의 것일 수 있다. 바람직하게는, 항체는 서열 9의 중쇄 및 서열 10의 경쇄를 포함한다. 바람직하게는, 항체는 서열 9의 중쇄 및 서열 10의 경쇄, 또는 항체의 FGFR-3-결합 단편을 포함한다.
항체는 서열 9의 중쇄 2개 및 서열 10의 경쇄 2개를 또한 포함할 수 있다. 항체는 서열 9의 중쇄 2개 및 서열 10의 경쇄 2개를 또한 포함할 수 있다. 바람직하게는, 항체는 서열 9의 중쇄 2개 및 서열 10의 경쇄 2개, 또는 항체의 FGFR-3-결합 단편을 포함한다.
항체는 중화 인간 FGFR-3 결합 단편을 포함할 수 있다.
바람직한 측면에서, 본 발명은 경쟁 ELISA 분석법에서 FGFR-3의 세포외 도메인에 결합하는 것에 대해 실온 (20-25℃)에서 약 1×10-8 M 이하의 KD로 FGFR-3에 결합하는 경쟁 항체와 경쟁하는 단리된 항체 또는 이의 단편에 관한 것이다.
추가로 본 발명은 돌연변이체 형태의 FGFR-3에 결합하는 항체에 관한 것이다.
본 발명은 이러한 항체 또는 단편, 및 제약상 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또한 본 발명은 치료법에서 동시에, 별도로 또는 순차적으로 사용하기 위한 조합 치료를 위한 항체 또는 단편 및 추가적인 항암제를 함유하는 제품에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 항체 또는 단편은 의약으로서 사용하기 위한 것이다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 항체 또는 단편은 암의 치료에서 사용하기 위한 것이다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 항체 또는 단편이 암이 방광암 또는 다발성 골수종인 경우에 의약으로서 사용된다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 항체 또는 단편은 또 다른 작용제와 함께 암의 치료에서 사용된다. 본 발명의 항체 또는 단편은 유효량의 또 다른 작용제와 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 환자에게 투여될 수 있다. 본 발명은 화합물을 제약상 허용가능한 담체 및 임의적인 또 다른 치료 성분과 함께 포함하는 제약 조성물을 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 환자에게 유효량의 본 발명의 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 암은 방광암 또는 다발성 골수종일 수 있다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 항체 및 또 다른 작용제를 동시에, 별도로 또는 순차적으로 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 암을 치료하는 방법을 포함한다. 또 다른 작용제는 시스플라틴일 수 있다.
따라서, 본 발명의 항체는 천연 발생 형태 및 돌연변이체 형태의 FGFR-3에 결합하고, FGFR-3의 분해를 유도하며, 종양 세포, 뿐만 아니라 기질 성분 상에 작용함으로써 종양을 억제할 수 있고, 암 치료에서 광범위한 치료적 가치를 지닌다.
용어 "항체"는 디술피드 결합에 의해 서로 연결된 2개의 동일한 중쇄 (H) 및 2개의 동일한 경쇄 (L)의 폴리펩티드 사슬 4개를 포함하는 면역글로불린 분자를 포함한다. 각각의 사슬들은 크기 (아미노산 110-125개) 및 구조가 유사하지만 기능은 상이한 도메인으로 폴딩(folding)될 수 있다.
"단리된 항체"는 (1) 성분들의 혼합물로부터 부분적으로, 실질적으로 또는 완전히 정제되었거나; (2) 자신의 천연 환경의 성분으로부터 확인되고 분리 및/또는 회수되었거나; (3) 모노클로날 항체이거나; (4) 동일한 종으로부터의 다른 단백질이 없거나; (5) 상이한 종으로부터의 세포에 의해 발현되거나; 또는 (6) 천연에서 발생하지 않는 항체이다. 이의 천연 환경의 오염 성분은 항체에 대한 진단 또는 치료 용도를 방해할 물질이고, 효소, 호르몬, 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질이 포함될 수 있다. 단리된 항체의 예로는 친화력 정제된 항체, 시험관 내에서 하이브리도마 또는 기타 세포주에 의해 제조된 항체, 또는 트랜스제닉(transgenic) 마우스로부터 유래된 인간 항체가 포함된다.
본원에서 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체들의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 예를 들어, 집단을 이루는 개별적인 항체들은 존재할 수 있는 가능한 천연 발생 돌연변이 또는 미량의 번역후 변이를 제외하고는 실질적으로 동일하다. 모노클로날 항체는 단일한 항원성 부위 (결정인자 또는 에피토프로 또한 알려짐)에 대해 지시되어 고도로 특이적이다. 또한, 여러 결정인자에 대해 지시된 여러 항체를 전형적으로 포함하는 통상적인 (폴리클로날) 항체 제제와는 달리, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다. 수식어구 "모노클로날"은 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된다는 항체의 특성을 가리키는 것이며, 임의의 특정한 방법에 의한 항체 생산을 요구하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
본원에서 사용된 용어 "인간 항체"는 [Kabat et al.,상기 문헌], [Chothia et al., 상기 문헌] 및 [Martin, 상기 문헌]에 기술된 바와 같이 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 상응하는 가변 영역 및 불변 영역을 지니는 항체를 포함한다. 본 발명의 인간 항체는, 예를 들어 상보성-결정 영역 (CDR) 내에, 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관 내에서의 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체 내에서의 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 인간 항체에서, 1개 이상의 위치가 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 아미노산 잔기, 예를 들어, 활성 강화 아미노산 잔기로 교체될 수 있다. 그러나, 본원에서 사용된 용어 "인간 항체"는 또 다른 포유류 종, 예컨대 마우스의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 그래프트된 항체를 포함하도록 의도되지 않는다.
"재조합 인간 항체"라는 구절은 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 인간 항체, 예컨대 숙주 세포 내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체, 조합형의 재조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 인간 면역글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉한 동물로부터 단리된 항체, 또는 인간 면역글로불린 유전자 서열의 다른 DNA 서열로의 스플라이싱(splicing)을 수반하는 임의의 기타 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 이같은 재조합 인간 항체의 가변 영역 및 불변 영역은 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된다.
경쇄는 1개의 가변 도메인 (본원에서 VL로 약칭됨) 및/또는 1개의 불변 도메인 (본원에서 CL로 약칭됨)을 포함할 수 있다. 항체의 경쇄는 카파 (κ) 경쇄 또는 람다 (λ) 경쇄이다. 본원에서 사용된 VL에 대한 표현은 카파 유형 경쇄 (Vκ) 및 람다 유형 경쇄 (Vλ)로부터의 가변 영역 양쪽 모두를 포함하도록 의도된다. 중쇄 또한 1개의 가변 도메인 (본원에서 VH로 약칭됨) 및/또는 항체의 클래스 또는 이소타입에 따라 3개 또는 4개의 불변 도메인 (CH1, CH2, CH3 및 CH4)을 포함할 수 있다. 인간에서, 이소타입은 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이고, IgA 및 IgG는 서브클래스 또는 서브타입 (IgA1 -2 및 IgG1 -4)으로 추가로 세분된다.
본 발명은 상기 언급된 클래스 또는 서브클래스 중 임의의 것의 항체를 포함한다. 인간 IgG가 본 발명의 항체에 대한 바람직한 이소타입이다. 초가변 영역 또는 CDR로 칭해지는 3개의 영역이 VL 및 VH 각각에서 발견되고, 이들은 프레임워크 영역 (본원에서 FR로 약칭됨)으로 칭해지는 덜 가변성인 영역에 의해 지지된다.
아미노산은 카밧(Kabat) 관례 ([Kabat, et al., Ann. NY Acad. Sci. 190:382-93 (1971)]; [Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991)]) 또는 코티아(Chothia) 관례 ([C. Chothia and A.M. Lesk, J. Mol. Biol. 196 (4): 901-917 (1987)])에 따라 또는 마틴(Martin)의 방법 ([Martin, A.C.R. Accessing the Kabat Antibody Sequence Database by Computer PROTEINS: Structure, Function and Genetics, 25 (1996), 130-133])에 의해 특정 CDR 영역 또는 도메인으로 할당된다.
각각의 VH 및 VL은 아미노 말단에서 카르복시 말단으로 하기의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. VL 및 VH 도메인으로 구성된 항체의 일부분은 Fv (가변 단편(Fragment variable))로 명시되고, 항원 결합 부위를 구성한다. 단일쇄 Fv (scFv)는 하나의 도메인의 N 말단과 또 다른 도메인의 C 말단이 가요성 링커에 의해 연결된, 하나의 폴리펩티드 사슬 상에 VL 도메인 및 VH 도메인을 함유하는 항체 단편이다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,946,778 (Ladner 등), WO 88/09344 (Huston 등) 참조).
단편들은 전체 항체의 결합 특성과 동일하거나 이에 필적하는 결합 특성을 지닌다. 적절한 항체 단편에는 세포 성장을 억제하도록 특이적으로, 그리고 충분한 친화력으로 결합하기 위해 초가변 (즉, 상보성 결정) 영역의 충분한 부분을 포함하는 임의의 단편이 포함된다. 이같은 단편은, 예를 들어, Fab 단편 중 하나 또는 양쪽 모두 또는 F(ab')2 단편을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 항체 단편은 전체 항체의 상보성 결정 영역 6개 모두를 함유하지만, 이같은 영역 모두보다 적은 개수, 예컨대 3개, 4개 또는 5개의 CDR을 함유하는 기능성 단편이 또한 포함된다. 바람직한 단편은 단일쇄 항체, 또는 Fv 단편이다. 더욱 바람직한 단편은 2가이다. 단일쇄 항체는 상호연결 링커와 함께 또는 링커 없이 항체의 중쇄의 가변 영역 및 경쇄의 가변 영역을 적어도 포함하는 폴리펩티드이다. 따라서, Fv 단편은 전체 항체 결합 부위를 포함한다. 이러한 사슬은 박테리아 또는 진핵생물 세포에서 생산될 수 있다.
Fab (항원 결합 단편(Fragment, antigen binding))는 VL CL VH CH1 도메인으로 구성된 항체 단편을 지칭한다. 간단히 파파인 소화 후에 생성된 것들이 Fab로 지칭되고, 중쇄 힌지(hinge) 영역을 보유하지 않는다. 펩신 소화 후, 중쇄 힌지를 보유하는 다양한 Fab가 생성된다. 사슬간 디술피드 결합이 손상되지 않은 이러한 단편들이 F(ab')2로 지칭되는 한편, 디술피드 결합이 유지되지 않은 경우에는 단일 Fab'가 초래된다. F(ab')2 단편은 1가 Fab 단편보다 항원에 대한 결합력(avidity)이 더 높다.
Fc (결정화 단편(Fragment crystallization))는 쌍을 이룬 중쇄 불변 도메인들을 포함하는 항체의 일부분 또는 단편에 대한 명칭이다. IgG 항체에서, 예를 들어, Fc는 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. IgA 또는 IgM 항체의 Fc는 CH4 도메인을 추가로 포함한다. Fc는 Fc 수용체 결합, 보체-매개 세포독성의 활성화 및 항체-의존적 세포형 세포독성 (ADCC)과 관련된다. 다중 IgG 유사 단백질들의 복합체인 IgA 및 IgM과 같은 항체에 대해, 복합체 형성은 Fc 불변 도메인을 필요로 한다.
힌지 영역은 항체의 Fab 부분과 Fc 부분을 분리하여, 서로에 비해 및 Fc에 비해 Fab의 운동성을 제공할 뿐만 아니라, 2개의 중쇄의 공유결합 연결을 위한 다중 디술피드 결합을 포함한다.
따라서, 본 발명의 항체는 항원과 특이적으로 결합하는 천연 발생 항체, 인간 항체, 재조합 인간 항체, 모노클로날 항체, 소화 단편, 2가 단편 예컨대 (Fab')2, 1가 단편 예컨대 Fab, 단일쇄 항체, 단일쇄 Fv (scFv), 단일 도메인 항체, 다가 단일쇄 항체, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody) 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 항체는 FGFR-3에 대해 특이적이다. 항체 특이성은 항원의 특정 에피토프에 대한 항체의 선택적인 인식을 지칭한다. 항체는 종 선택성 및 분자 선택성 양쪽 모두를 나타낼 수 있거나, 또는 분자에 관해서만 선택적이고 1가지를 초과하는 종의 FGFR-3에 결합할 수 있다. 본 발명의 항체는 인간, 뮤린(murine), 래트(rat), 개 및/또는 토끼 FGFR-3에 결합할 수 있다. 바람직하게는, 항체는 인간 FGFR-3에 결합한다. 결합 특이성을 유지할 뿐만 아니라 또 다른 특성을 또한 지니는 항체 양식이 개발되었다.
본 발명의 항체는, 예를 들어, 단일특이적, 이중특이적 또는 다중특이적일 수 있다. 이중특이적 항체 (BsAb)는 2개의 상이한 항원-결합 특이성 또는 부위가 있는 항체이다. 다중특이적 항체에는 2개를 초과하는 상이한 항원-결합 특이성 또는 부위가 있다. 항체에 하나를 초과하는 특이성이 있는 경우, 인식되는 에피토프들은 단일 항원 또는 1개를 초과하는 항원과 관련될 수 있다.
친화력 및/또는 결합력을 기초로 FGFR-3 항체의 특이성을 결정할 수 있다. 항원과 항체의 해리에 대한 평형 상수 ("KD")로 표시되는 친화력은 항원 결정인자와 항체-결합 부위 간의 결합 강도를 측정한다. 결합력은 항체와 이의 항원 간의 결합 강도의 척도이다. 결합력은 에피토프와 항체 상의 항원 결합 부위 간의 친화력, 및 특정 에피토프의 항원 결합 부위의 개수를 지칭하는 항체의 수가(valency) 양쪽 모두와 관련된다. 항체는 전형적으로 약 10-5 내지 약 10-11 몰/ℓ의 해리 상수 (KD) (예를 들어, KD < 100 M)로 결합한다. 약 10-4 몰/ℓ 미만의 모든 KD는 일반적으로 비-특이적 결합을 가리키는 것으로 간주된다 --- KD 값이 낮을수록, 항원 결정인자와 항체 결합 부위 간의 결합 강도가 더 강하다.
특정 측면에서, 본 발명의 항체는 바람직하게는 약 1×10-8 M 이하, 더욱 바람직하게는 약 1×10-9 M 이하, 더욱 바람직하게는 약 1×10-10 M 이하, 가장 바람직하게는 약 1×10-11 M 이하의 KD로 FGFR-3에 결합한다. 하기 표 1 참조.
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특정 측면에서, 바람직하게는 본 발명의 항체의 KD는 약 5.0×10-10 M 내지 약 1.5×10-11 M, 약 1.0×10-10 M 내지 약 1.0×10-11 M 또는 약 1.5×10-11 M 내지 약 7.5×10-10 M이다.
본원에서 사용 시, 상호교환가능하게 사용된 용어 "결합 차단" 및 "결합 억제"는 시토카인/수용체 신호 경로의 생물학적 기능의 완전한 또는 부분적인 억제 또는 감소를 초래하는, 시토카인이 이의 수용체에 결합하는 것의 차단/억제를 지칭한다. 수용체 결합, 세포 성장에 대한 억제 효과, 화학 주성, 세포자멸사, 세포내 단백질 인산화, 또는 신호 전달과 같은 FGF 활성의 하나 이상의 시험관내 또는 생체내 지표물의 완전한 또는 부분적인 억제 또는 감소를 측정함으로써 FGF가 FGFR-3에 결합하는 것의 차단/억제가 평가된다. FGF가 FGFR-3에 결합하는 것을 차단하는 능력을 본원에 기술된 바와 같은 ELISA에 의해 측정할 수 있다. 본 발명의 항체는 살아 있는 세포에서의 리간드-유도 활성화에서 FGFR-3 수용체를 차단하는 길항제이다. ELISA를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 당업계에 공지된 다양한 방법을 사용하여 결합 분석법을 수행할 수 있다. 본원에서 사용된 "결합에 대해 경쟁한다"는 당업계에서 이용가능한 기술, 예를 들어, 경쟁 ELISA 또는 비아코어(BIAcore)로의 KD 측정에 의해 측정 시 항체가 결합 또는 신호전달을 적어도 약 20％, 30％, 50％, 70％ 또는 90％만큼 감소시키는 상황을 지칭하지만, 결합을 완전히 제거하도록 의도되지는 않는다.
중쇄 아미노산 서열이 서열 9에서 기술된다. 경쇄 아미노산 서열이 서열 10에서 제시된다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 항체는 항체 1의 임의의 CDR 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 모두의 상보성 결정 영역을 지닌다.
본 발명의 항체는 직접적인 돌연변이, 친화력 성숙 방법, 파지 디스플레이, 또는 사슬 셔플링(shuffling)에 의해 결합 특성이 개선된 것들을 또한 포함한다. CDR 및/또는 프레임워크 잔기를 돌연변이시키고, 원하는 특성이 있는 항원 결합 부위에 대해 스크리닝함으로써 친화력 및 특이성이 변형 또는 개선될 수 있다 (예를 들어, [Yang et al., J. Mol. Biol. 254:392-403 (1995)] 참조). 한가지 방식은 다른 면에서는 동일한 항원 결합 부위들의 집단에서, 2개 내지 20개의 아미노산의 부분집합이 특정 위치에서 발견되도록, 개별적인 잔기들 또는 잔기들의 조합물을 무작위화시키는 것이다. 별법적으로, PCR 방법을 사용하여 에러에 의해 광범위한 잔기에 걸쳐 돌연변이가 유도될 수 있다 (예를 들어, [Hawkins et al., J. Mol. Biol., (1992) 226:889 96)] 참조). 또 다른 예에서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자를 함유하는 파지 디스플레이 벡터가 대장균의 변이유발유전자 균주에서 증식될 수 있다 (예를 들어, [Low et al., J. Mol. Biol. 250:359 68(1996)] 참조).
그후, 시험관내 선별 공정을 적절하게 사용하여, 청구된 교차 반응성 및 시험관내를 지니는 Fab 단편에 대해 이러한 추가적인 가변 영역 아미노산 서열을 스크링할 수 있다. 이러한 방식으로, 본 발명에 따른 인간화 항체를 제조하는데 적절한 추가적인 Fab 단편이 확인된다. 바람직하게는, 프레임워크 내에서의 아미노산 치환이 본원에 개시된 프레임워크 서열들 중 하나 또는 각각 내의 1개, 2개 또는 3개의 위치에 제한된다. 바람직하게는, CDR 내에서의 아미노산 치환이 CDR 1개 또는 각각 내의 1개 내지 3개의 위치에 한정되고, 더욱 바람직하게는 CDR 1개 또는 각각 내의 1개 또는 2개의 아미노산 위치에서의 치환이 수행된다. 추가로 바람직한 아미노산 치환이 중쇄 가변 영역의 CDR들 내의 1개 또는 2개의 아미노산 위치에서 수행된다. 어버이 항체로 본원에서 기술되는 항체를 사용하여, 본 발명에 따른 별법적인 항체를 제조하기 위해 CDR 및 프레임워크 치환을 조합하기 위한 적절한 방법이 [Wu et al., J. Mol. Biol., 294:151-162]에서 제공된다.
당업계에 공지된 방법에 의해 본 발명의 항체를 제조할 수 있다. 이러한 방법에는 [Kohleer and Milstein, Nature 256:495-497 (1975)] 및 [Campbell, "Monoclonal Antibody Technology, The Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas", Burdon et al., Eds., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985)]에 기술된 면역학적 방법; 뿐만 아니라 [Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989)]에 기술된 재조합 DNA 방법이 포함된다.
파지 디스플레이 라이브러리가 포함되는 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 인간 항체가 또한 생산될 수 있다 ([Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581 (1991)]). [Cole et al.] 및 [Boemer et al.]의 기술이 인간 모노클로날 항체의 제조에 또한 이용가능하다 ([Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985)] 및 [Boemer et al., J. Immunol. 147(1):86-95 (1991)]). 서브클론에 의해 분비된 본 발명의 항체가 통상적인 면역글로불린 정제 절차, 예를 들어, 단백질 A-세파로스, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 젤 전기영동, 투석, 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 배지 또는 복수액으로부터 단리 또는 정제될 수 있다.
본 발명의 항체를 코딩하는 폴리핵산(polynucleic acid)이 표준 분자 생물학 기술에 의해 수득된다.
본 발명은 벡터의 형질전환 및 항체의 발현을 위한 숙주 세포를 또한 포함한다. 바람직한 숙주 세포에는 포유류 세포, 예컨대 NSO (비-분비 (o)) 마우스 골수종 세포, 293 및 CHO 세포, 및 림프구 기원의 기타 세포주 예컨대 림프종, 골수종 또는 하이브리도마 세포가 포함된다. 또 다른 진핵생물 숙주, 예컨대 효모가 사용될 수 있다.
박테리아, 특히 대장균에서 단백질을 발현시키기 위한 벡터가 공지되어 있다. 이같은 벡터에는 [Dieckmann and Tzagoloff, J. Biol. Chem. 260:1513-1520 (1985)]에 기술된 PATH 벡터가 포함된다. 이러한 벡터는 카르복시 말단에 폴리링커(polylinker)가 이어지는 안트라닐레이트 신쎄테이스(synthetase) (TrpE)를 코딩하는 DNA 서열을 함유한다. 또 다른 발현 벡터 시스템은 베타-갈락토시데이스(galactosidase) (pEX); 람다 PL; 말토스 결합 단백질 (pMAL); 및 글루타티온 S-트랜스퍼레이스(transferase) (pGST)를 기초로 한다. [Gene 67:31 (1988)] 및 [Peptide Research 3:167 (1990)] 참조.
효모에서 유용한 벡터가 이용가능하다. 적절한 예는 ZAP 플라스미드이다. 포유류 세포에서의 발현을 위한 적절한 벡터가 또한 공지되어 있다. 이같은 벡터에는 SV-40의 주지된 유도체, 아데노바이러스, 레트로바이러스-유래 DNA 서열, 및 기능성 포유류 벡터들의 조합으로부터 유래된 셔틀(shuttle) 벡터, 예컨대 상기 기술된 것들, 및 기능성 플라스미드 및 파지 DNA가 포함된다.
본 발명에서 유용한 벡터는 발현될 DNA 서열 또는 단편에 연결된 하나 이상의 제어 요소를 함유한다. 클로닝된 DNA 서열의 발현을 제어 및 조절하기 위해 제어 요소가 벡터 내에 삽입된다.
적절한 배지 내에 유지된 숙주 세포에서의 발현 후, 발현될 폴리펩티드를 당업계에 공지된 방법에 의해 배지로부터 회수하여 정제할 수 있다. 폴리펩티드 또는 펩티드가 배양 배지 내로 분비되지 않는 경우, 단리 및 정제 전에 숙주 세포가 용해된다.
본 발명은 본 발명의 항체, 폴리핵산, 벡터 또는 숙주 세포를 제약상 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 함께 포함하는 제약 조성물을 추가로 제공한다. 제약 조성물은 추가적인 치료제를 포함할 수 있다. 추가적인 치료제는 화학요법제, 예를 들어, 시스플라틴일 수 있다.
본원에서 사용되는 담체에는 사용된 투여량 및 농도에서 이에 노출될 세포 또는 포유동물에게 무독성인 제약상 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제가 포함된다. 종종, 생리학적으로 허용가능한 담체는 수성 pH 완충 용액이다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 특히 항체가 내재화되는 경우, 항-FGFR-3 항체 또는 항체 단편이 항종양제 또는 검출가능한 신호를 생산하는 작용제에 화학적으로 또는 생합성에 의해 연결될 수 있다. FGFR-3에 대한 항체는 방광암 세포와 같은 여러 암 세포에서 수용체 (인산화된 FGFR-3)의 활성화, 뿐만 아니라 포스포르-MAPK 및 포스포르-AKT가 포함되는 하류 신호전달 분자의 활성화를 억제할 수 있고, 이는 이러한 세포의 증식 능력의 억제를 초래한다.
본 발명의 항체는 천연 발생 FGFR-3 또는 이의 스플라이스 형태 또는 이들의 돌연변이체에 결합할 수 있다. FGFR-3의 "스플라이스 형태"는 FGFR-3(IIIb) 및 FGFR-3(IIIc)로 칭해지는, FGFR-3의 세번째 IgG-유사 도메인을 코딩하는 엑손들의 형태를 의미한다. 돌연변이체 FGFR-3은 DNA 복제 또는 번역 오류에 의해 변경된 수용체 형태를 포함한다. 돌연변이는 구성적 활성화, 반감기 연장 및 리간드 감도 증가와 같은 메커니즘을 통해 돌연변이체 수용체의 활성을 강화하는 기능 획득(gain-of-function) 돌연변이일 수 있다.
본 발명의 항체는 야생형 FGFR-3 도메인 2 (서열 12)에 결합할 수 있다. 인간 및 마우스 FGFR-3 서열의 위치 173의 아르기닌 잔기는 다른 패밀리 구성원에 의해 공유되지 않고, 이는 이러한 잔기가 항체 1이 나타내는 FGFR-3 특이성을 담당할 것임을 시사한다.
본 발명의 항체는 FGFR-3의 분해를 유도한다. 분해는 수용체가 더 이상 이의 신호전달 기능을 수행할 수 없도록 수용체를 붕괴시키는 것을 의미한다.
본 발명의 항체는 FGFR-3의 활성을 중화할 수 있다. 수용체 중화는 신호를 전달하는 수용체의 고유한 카이네이스(kinase) 활성을 불활성화시키는 것을 의미한다. 예를 들어, 리간드에 대한 특정 에피토프의 접근을 차단하는 항체에 의해, 또는 리간드, 특히 FGF가 수용체에 결합할 수는 있어도 수용체를 활성화시킬 수는 없는 특정 방식으로 FGFR-3의 형상을 변화시킴으로써, 중화가 일어날 수 있다. 예를 들어, 수용체의 내재화 또는 분해를 유도함으로써 또는 FGFR-3의 발현을 억제함으로써, FGFR-3을 발현하는 세포가 자신의 표면 상의 FGFR-3 수용체의 개수를 감소시키는 경우에 하류 조절이 일어날 수 있다. 따라서, 중화는 성장 (증식 및 분화), 혈관형성 (혈관 보충, 침습 및 전이), 및 세포 운동성 및 전이 (세포 부착 및 침습성)의 억제, 감소, 불활성화 및/또는 파괴가 포함되는 다양한 효과가 있다.
FGFR-3 중화의 한 척도는 수용체의 타이로신 카이네이스 활성의 억제이다. 주지된 방법을 사용하여, 예를 들어, 재조합 카이네이스 수용체의 자가인산화 수준, 및/또는 천연 또는 합성 기질의 인산화를 측정함으로써, 타이로신 카이네이스 억제를 결정할 수 있다. 따라서, 인산화 분석법이 본 발명의 정황에서 중화 항체를 결정하는데 유용하다. 예를 들어, ELISA 분석법에서 또는 웨스턴 블롯(western blot) 상에서 포스포타이로신에 특이적인 항체를 사용하여, 인산화를 검출할 수 있다. 타이로신 카이네이스 활성에 대한 일부 분석법들이 [Panek et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 283:1433-44 (1997)] 및 [Batley et al., Life Sci. 62:143-50 (1998)]에 기술되어 있다.
또한, 다수의 종양 세포의 세포 표면 상에 FGFR-3이 있기 때문에 본 발명의 항체는 종양 세포 자체에 의한 신호전달을 억제할 수 있다. 본 발명의 항체는 이를 필요로 하는 포유동물을 치료하는데 사용될 수 있다. 질환을 "치료하는 것"은 질환을 억제하는 것, 질환의 발달을 정지시키거나 지연시키는 것, 질환을 완화시키는 것, 또는 질환 증상의 퇴행을 야기하는 것을 포함한다.
본 발명의 항체 및 조성물은 암을 치료하는데 사용될 수 있다. 암은 난치성 또는 1차성일 수 있다. 암에는 뇌암, 폐암, 편평세포암, 방광암, 위암, 췌장암, 유방암, 두경부암, 신암, 신장암, 난소암, 전립선암, 결장암, 결장직장암, 식도암, 부인과 암 (난소, 자궁내막), 전립선암, 위암 또는 갑상선암, 백혈병 및 림프종이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 추가적으로, 본 발명의 항체 및 조성물에 의해 치료될 수 있는 암에는 다발성 골수종, 결장직장 암종, 유잉(Ewing) 육종, 융모막암종이 포함된다.
주사, 주입, 경구, 비경구, 피하, 근육내 또는 정맥내가 포함되는 임의의 적절한 투여 경로에 의해 투여가 달성된다.
항체가 또 다른 치료, 예컨대 항신생물제와 함께 투여되면서 본원에 기술된 치료 방법이 수행될 수 있다. 항신생물 치료는 소형 유기 분자를 포함할 수 있다. 이같은 소형 유기 분자의 예로는 세포독성제 및/또는 화학요법제 예컨대 탁솔, 독소루비신, 악티노마이신-D, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 이리노테칸 (CPT-11), 젬시타빈, 옥시플라틴, 플루오로우라실 (5-FU), 류쿠린 (LU), 시스플라틴, 파클리탁셀, 도세탁셀, 빈블라스틴, 에포틸론, 시스플라틴/카르보플라틴 및 PEG화 아드리아마이신이 포함된다. 바람직한 본 발명의 치료는 항체와 시스플라틴의 투여이다.
항신생물제는 또한 방사선조사일 수 있고, 방사선조사의 공급원은 치료될 환자에 대해 외부 (외부 방사선 요법 - EBRT), 또는 내부 (근접치료 - BT)일 수 있다. 투여되는 항신생물제의 용량은 작용제의 유형, 치료될 종양의 유형 및 중증도, 및 작용제의 투여 경로가 예를 들어 포함되는 다수의 요인에 좌우된다. 본 발명은 어떠한 특정 용량에도 한정되지 않는다.
FGFR-3 항체를 또 다른 항체 및/또는 치료와 함께 투여하는 것은 동시에, 또는 별도로 동일한 경로 또는 상이한 경로를 통해 동일한 시점 또는 상이한 시점에 일어날 수 있다. 추가로, 항체는 투여를 위한 또 다른 작용제들 중 하나 이상과 접합될 수 있다.
본원에 기술된 치료 방법은 영장류, 예컨대 원숭이 및 인간, 말, 소, 고양이, 개, 토끼 및 설치류 예컨대 래트 및 마우스가 포함되는 임의의 적절한 포유동물을 치료하는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 치료될 포유동물은 인간이다.
실시예
하기의 실시예들은 설명의 목적을 위해서만 제공되고, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범주를 제한하지 않는다. 실시예들은 통상적인 방법, 예컨대 벡터 및 플라스미드의 구축, 이같은 벡터 및 플라스미드 내로의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 삽입, 또는 숙주 세포 내로의 플라스미드의 도입에서 사용되는 것들의 상세한 설명을 포함하지 않는다. 이같은 방법들은 당업자에게 주지되어 있고, [Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press]가 포함되는 다수의 간행물에 기술되어 있다.
실시예 1
FGFR -3 특이적 항체 길항제의 생성
재조합 인간 FGFR-Fc, 재조합 인간 FGF, 주문 합성 프라이머, 제한 효소 및 DNA 중합효소를 판매자로부터 수득할 수 있거나 또는 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다.
공지된 패닝(panning) 프로토콜에 따라 10 ㎍ FGFR-3(IIIc) 세포외 도메인 (ECD)-Fc 재조합 단백질로 코팅된 튜브로 인간 FGFR-3 세포외 도메인에 대해 나이브(naive) 인간 Fab 박테리오파지 라이브러리를 패닝하였다. 유지된 파지를 패닝 프로세스로부터 용출시키고, 박테리아 숙주 세포를 유지된 파지로 감염시켰다. 숙주 세포에 의해 생산된 파지를 수집하였다. 상기 절차를 한번 더 반복하였다. 감염된 숙주 세포의 단일 콜로니들을 100 ㎕/웰의 2×YTAG를 함유하는 96웰 플레이트 내로 옮기고, 10 ㎕ M13KO7 헬퍼 파지 (5×1010 pfu/㎖)의 존재 하에 파지를 성장시켰다. 플레이트를 37℃에서 30분 동안 진탕시키지 않으면서 인큐베이션한 후, 30분 동안 진탕 (100 rpm)시키면서 인큐베이션하였다. 2,500 rpm에서 10분 동안의 원심분리에 의해 세포 펠렛을 제조하고, 200 ㎕의 2xYTAK에 재현탁시키고, 30℃에서 진탕 (100 rpm)하면서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 2,500 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 상등액을 새로운 플레이트에 옮기고, 6× 차단 완충제 (18％ 밀크/PBS)와 1시간 동안 혼합하였다. 하기 기술된 바와 같은 ELISA 결합 및 차단 분석법을 사용하여 파지 클론을 스크리닝하였다. FGFR-3(IIIb) 또는 FGFR-3(IIIc)에 결합하는 파지 클론을 선별한 후, 이러한 풀(pool)로부터 수용체가 FGF-1 리간드에 결합하는 것을 차단하는 클론들을 선별하였다. 표준 서열 기술에 따라 수용체에 결합하고 이를 차단하는 클론의 DNA 서열을 결정하였다. 각각의 독특한 DNA 서열을 기록하고, 상응하는 파지 클론을 FGFR-3 차단제 파지 후보물로 지정하였다. 이러한 파지 후보물들로부터 가용성 Fab를 제조하였다. 정제된 Fab들을 사용하여 ELISA 결합 및 차단 분석법을 반복하여, 차단 활성을 확인하였다. 공개된 기술에 따라 CDR (서열 1-6)을 인간 IgG1 프레임워크 내로 클로닝함으로써, 확인된 Fab 차단제들을 전체 크기 항체로 조작하였다. ELISA 결합 분석법을 사용하여 FGFR-1 (IIIb), FGFR-1 (IIIc), FGFR-2 (IIIb), FGFR-2 (IIIc), 및 FGFR-4 세포외 도메인 재조합 가용성 단백질에 대한 항체 1의 결합을 결정하였다. FGFR-3의 b 및 c 스플라이스 형태 양쪽 모두에 대해 높은 친화력의 결합을 나타내지만 다른 FGFR 수용체에 대해서는 낮은 친화력의 결합을 나타내는 항체를 선별하였다.
실시예 2
항체 1
주지된 방법을 사용하여 적절한 포유류 발현 시스템에서 항체 1을 생합성할 수 있고, 주지된 방법에 의해 이를 정제할 수 있다.
항체 1에 대한 아미노산 서열이 하기에서 제공된다.
Figure pct00012
분석법
ELISA 결합 분석법
PBS 내의 1 ㎍/㎖ 농도의 재조합 FGFR을 실온에서 2시간 동안 96웰 플레이트 상에 코팅하였다. 플레이트를 0.2％ 트윈(Tween)20/PBS로 3회 세정하고, 2시간 동안 5％ 밀크/PBS로 차단한 후 사용하였다. 파지, Fab 또는 항체를 플레이트에 첨가하고, 0.2％ 트윈20/PBS에서 단계적으로 희석하였다. 플레이트를 실온에서 2시간 동안 더 인큐베이션하였다. 포착된 분자를 적합한 시판되는 2차 항체를 사용하여 검출하고, 공급원의 설명서에 따라 검출하였다.
ELISA 차단 분석법
실온에서 2시간 동안 재조합 FGF를 이뮬론(Immulon)® 2B 미량역가 플레이트 (ThermoLab Systems, Franklin, MA) 상에 0.5-2 ㎍/㎖의 농도로 코팅하였다. 플레이트를 0.2％ 트윈20/PBS로 세정하고, 5％ 밀크/PBS로 2시간 동안 차단한 후 사용하였다. 파지, Fab 또는 항체를 5 ㎍/㎖ 헤파린, 5％ 밀크, PBS로 단계적으로 희석하였다. FGFR-3(IIIb) 또는 (IIIc) ECD (세포외 도메인) Fc 태그(tag) 부착 가용성 재조합 단백질을 1 ㎍/㎖의 최종 농도로 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, FGF-1이 코팅된 플레이트로 옮기고, 실온에서 추가로 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 0.2％ 트윈20/PBS로 3회 세정하였다. 결합된 수용체를 공급원의 설명서에 따라 제조된 양고추냉이 과산화효소 (HRP) 용액에 커플링된 항-인간 Fc 모노클로날 항체를 사용하여 검출하였다. 차단 활성은 감소된 신호를 초래하였다.
인간 및 마우스 FGFR -3( IIIb ) 및 FGFR -3( IIIc )에 대한 항체 1의 결합 친화력
제조사가 제안하는 표준 프로토콜에 따라 비아코어® 3000 바이오센서 (BiaCore, Inc., Piscataway, NJ)를 사용하여 FGFR-3(IIIb) 및 (IIIc)에 대한 항체의 결합 동역학을 결정하였다. 표 1에 기재된 결과들의 요약은 항체가 인간 FGFR-3의 b 및 c-스플라이스 형태 양쪽 모두에 결합할 뿐만 아니라 10-9 M 미만의 친화력으로 마우스 FGFR-3(IIIc) 수용체와 충분히 교차 반응한다는 것을 가리킨다.
막에 결합된 FGFR -3에 대한 항체 1의 특이성
뮤린 FGFR-3(IIIc)의 cDNA를 퓨로마이신 선별 유전자를 함유하는 pBABE 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 생성된 플라스미드의 레트로바이러스 발현을 L6 세포에서 수행하였다. 세포를 선별하고, 10％ FBS 및 2 ㎍/㎖ 퓨로마이신을 함유하는 DMEM 배지에서 배양하였다. FGFR-3을 발현하는 L6 세포를 1％ BSA/PBS에 현탁시켰다. 항체 1을 1-30 ㎍/㎖의 최종 농도로 첨가하였다. 얼음 상에서 1시간 인큐베이션한 후, 세포를 1％ BSA/PBS에서 세정하고, 얼음 상에서 1시간 동안 동일한 완충제에서 적합한 2차 검출 항체 또는 Fab 단편과 함께 인큐베이션하였다. 대조군 샘플은 이러한 2차 항체로만 염색하였다. FACSvantage SE 유동 세포측정기 (BD Biosciences)를 사용하여 모든 샘플을 분석하였다. FGFR-3으로 형질감염된 세포 (R3-L6)가 사용된 경우에만 양성 염색 신호가 생성되고, FGFR-3 음성 L6 어버이 세포가 사용된 경우에는 그렇지 않은 것에 의해 나타나는 바와 같이 항체 1은 FGFR-3에 대해 특이적이었다.
인간 배아 신장 (HEK) 293 세포, 293펙틴, 프리스타일(FreeStyle) 293 배지 및 OptiMEM 배지는 <Invitrogen> (Carlsbad, CA)으로부터 구입할 수 있다. 단백질-A 친화력 정제 배지는 <GE Healthcare>로부터 구입할 수 있다. FGFR(IIIb)-Fc에 대한 DNA 구축물을 생성시켰다.
FGFR -3( IIIb )- Fc , FGFR -3( IIIb )- Fc Ig 도메인 말단절단물 , 및 FGFR -3( IIIb )-Fc의 단일 잔기 알라닌 돌연변이체의 생산.
FGFR-3(III)b 도메인 경계를 FGFR-3(IIIb) 세포외 도메인 3D 모델, 뿐만 아니라 FGFR의 결정 구조를 기초로 정의할 수 있고, 이들은 공지되어 있다. 5개의 말단절단 FGFR-3(IIIb) ECD 구축물, 즉 D1 (25-148), D2 (149-245), D3 (250-372), D1-2 (25-245) 및 D2-3 (149-372)을 야생형 FGFR-3(IIIb) D1-3 (25-372)과 함께 디자인하였다. 구축물을 다중 클로닝 부위의 3' 말단에서 조작된 Fc 태그와 함께 pGS 벡터 내로 서브클로닝하고, 서열을 확인하였다. 추정 리간드 결합 영역에 인접한 20개의 FGFR-3(IIIb) 잔기, 뿐만 아니라 헤파린 결합 및 수용체-수용체 이량체화에 관련되는 잔기를 공지된 바와 같은 FGFR-3(IIIc) 구조 및 FGFR-3(IIIb) ECD 모델을 기초로 선택하였다. FGFR-3(IIIb) ECD 단일 잔기 알라닌 돌연변이체를 전장 FGFR(IIIb) ECD 구축물을 주형으로 사용하여 중첩 PCR을 통해 생성시키고, 이어서 pGS-Fc 벡터 내로 서브클로닝하였다. 293펙틴™ (Invitrogen)을 사용한 형질감염 후 도메인 말단절단물 및 알라닌 돌연변이체가 293 세포에서 일시적으로 발현되었다. 형질감염 6일 후 배양 상등액을 수확하고, 단백질을 함유하는 Fc를 단백질-A 친화력 칼럼 상에 통과시킴으로써 정제하고, 완충제를 PBS로 교환하고, 정량하고, SDS-PAGE 분석에 의해 평가하여 구조적 완전성을 확인하였다.
FGFR -3( IIIb )- Fc 메조스케일 ( mesoscale ) 결합 분석법: 항체-1의 정제된 용액을 PBS 내에 2 mg/㎖의 농도로 희석하였다. 루테늄-트리스-바이피리딘 N-하이드록시숙신이미드 에스테르인 MSD 술포(Sulfo)-TAG NHS-에스테르(Ester) (MesoScale Discovery, #R91AN2)를 저온 증류수로 10 nmol/ul의 농도로 재구성시켰다. 12:1 몰비의 MSD 술포-TAG NHS-에스테르 대 항체 1이 반응에 사용되었다. 빛으로부터 보호하면서 2시간 동안 실온에서 인큐베이션을 수행하였다. 접합된 항체 1로부터 탈염 수지를 사용하여 미반응 MSD 술포-TAG NHS-에스테르를 제거하였다. 루테늄이 접합된 항체 1을 -80℃에서 보관하였다. 접합된 항체 1의 농도를 소 혈청 알부민을 표준 곡선용으로 사용하여 결정하였다.
말단절단된 FGFR-3(IIIb)-Fc, 돌연변이체 FGFR-3(IIIb)-Fc 또는 야생형 FGFR-3(IIIb)-Fc를 포스페이트 완충 염수 PBS에서 5 ㎍/㎖로 희석하였다. 표준 96웰 플레이트를 25 ng/웰의 수용체로 코팅하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 웰에서의 비-특이적 결합을 차단하기 위해, 150 ㎕의 5％ MSD 블록커(Blocker) A (MesoScale Discovery, #R93Ba-1)를 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 차단 용액을 제거하고, 플레이트를 200 ㎕의 PBS, pH 7.4, 0.02％ 트윈®-20으로 5회 세정하였다. 루테늄-표지 항체 1의 일련의 3배 희석물 (250 - 0.001 nM)을 테스트될 각각의 단백질에 대해 삼중으로 25 ㎕의 부피로 첨가하였다. 가볍게 진탕하고 빛으로부터 보호하면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 웰 당 200 ㎕의 PBS, pH 7.4, 0.02％ 트윈-20으로 또다시 5회 세정함으로써 유리 루테늄-표지 항체를 제거하였다. 이러한 세정 후, 150 ㎕의 1× 판독 완충제 (MesoScale Discovery, #R92TC-2)를 각각의 웰에 첨가하였다. 전기화학 자극 후, 결합된 항체 상의 루테늄 표지가 620 nm에서 발광성 빛을 방출하였다. 전기화학발광 ECL 신호를 <SECTOR Imager 2400> 플레이트 판독기 (MesoScale Discovery, #1250) 내의 전하 결합 소자 카메라에 의해 검출하였고, 이는 ECLU로 표현되었다. ECL 신호를 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어 버젼 5.0에 플롯팅하였다. 소프트웨어의 <One Site - Specific Binding> 기능의 비-선형 회귀 곡선 피트(fit) 분석에 의해 KD 값을 계산하였다. 야생형 FGFR-3(IIIb)-Fc에 대한 루테늄-표지 항체 1의 결합이 야생형의 백분율로서 플롯팅된, 말단절단 또는 돌연변이체 FGFR의 상대적인 결합 친화력 분석에 대한 기준으로서 사용되었다.
Mab B9 ELISA 결합 분석법: 96웰 ELISA 미량역가 플레이트의 웰을 4℃에서 가볍게 진탕하면서 하룻밤 동안 100 ㎕의 PBS, pH 7.2 내의 200 ng의 항-FGFR-3 모노클로날 항체, B9 (Santa Cruz sc-13121)로 코팅하였다. 코팅 후, 항체 용액을 따라 내고, 웰을 2시간 동안 실온에서 가볍게 진탕하면서 100 ㎕의 0.1％ 트윈이 있는 포스페이트 완충 염수 (PBST), 5％ 소 혈청 알부민 (BSA)으로 차단하였다. 차단 후, 웰을 200 ㎕ PBST로 5회 세정하였다. 그후 100 ㎕의 PBST, 1％ BSA 내의 돌연변이체 또는 야생형 FGFR-3(IIIb)-Fc의 일련의 3배 희석물 (100 - 0.006 nM)을 테스트되는 각각의 단백질에 대해 삼중으로 첨가하고, 가볍게 진탕하면서 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 웰을 200 ㎕ PBST로 다시 5회 세정하였다. 100 ㎕의 PBST, 5％ BSA 내의 양고추냉이 과산화효소 (HRP)-접합 항-마우스 IgG의 1:5000 희석물을 각각의 웰에서 실온에서 1시간 동안 가볍게 진탕하면서 인큐베이션하였다. 웰을 200 ㎕ PBST로 마지막으로 5번 세정한 후, 100 ㎕의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 과산화효소 발색 기질로 5분 동안 발색시켰다. 웰 당 100 ㎕의 1N H2SO4로 반응을 정지시켰다. 450 nm에서 분광광도계로 흡광도를 측정하였다. 흡광도 판독치를 그래프패드 프리즘® 소프트웨어 버젼 5.0에서 플롯팅하였다. 소프트웨어의 <One Site - Specific Binding> 기능의 비-선형 회귀 곡선 피트 분석에 의해 KD 값을 계산하였다. 야생형 FGFR-3(IIIb)-Fc에 대한 B9의 결합이 야생형의 백분율로서 플롯팅된, 말단절단 또는 돌연변이체 FGFR의 상대적인 결합 친화력 분석에 대한 기준으로서 사용되었다.
인간 FGFR -3( IIIb )의 분자 모델링: 돌연변이유발 연구를 안내하는 것을 돕기 위해, SWISS-MODEL®을 사용하여 FGFR-3(IIIb) ECD의 도메인 2 및 3의 3차원 모델을 생성시켰다. 인간 FGFR-3(IIIb) 및 인간 FGFR-3(IIIc)의 서열을 CLUSTALW® 방법을 사용하여 정렬하고, 주형으로서 FGFR-3(IIIc)의 X선 결정 구조 (단백질 데이터 뱅크 코드 1RY7)를 사용하여 모델을 구축하였다.
항체 1의 에피토프가 FGFR -3의 두번째 면역글로불린-유사 ( Ig ) 도메인 내에 함유된다: FGFR 수용체 패밀리의 리간드-결합 부위는 세포외 도메인을 정의하는 3개의 N-말단 Ig 도메인 내에 함유된다 ([Chellaiah, et al., J. Biol. Chem. 1999 Dec. 3; 274(49):34785-34794]). 3개의 Ig 도메인 중 어느 것이 항체 1의 에피토프를 함유하는지를 결정하기 위해, 도메인 말단절단물들의 패널을 사용하였다. 인간 Ig 도메인을 코딩하는 DNA 서열을 다양한 형태로 말단절단하고, 인간 Fc 태그가 있는 동종이량체성 융합 단백질로서 발현시켰다. 코딩된 단백질을 일시적으로 형질감염된 세포의 컨디셔닝(conditioning)된 상등액으로부터 정제하고, 각각의 정제된 도메인 말단절단물의 동종이량체성 구조를 SDS-PAGE에 의해 확인하였다. 그후, 말단절단물을 항체 1에의 결합에 대해 메조스케일 결합 분석법 (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD)에서 테스트하였다. 메조스케일 결합 분석법 (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD)에서, 그리고 비아코어™ (Pharmacia, Piscataway, NJ)에 의해 결정 시, 항체 1이 말단절단물 D1 및 D3에 대해서는 검출가능한 결합을 나타내지 않은 반면, 말단절단물 D1-2 및 D2에 대해서는 유의한 결합을 나타냈다. B9는 수용체의 도메인 1 내의 입체형상적으로 민감한 에피토프를 인식하고, 따라서 도메인 1을 함유하는 말단절단물들은 전체적인 구조가 교란되지 않았다면 항체에 결합할 것으로 예상되었다. D1 및 D1-2 말단절단물들이 대조군 Mab B9에 대해 유의한 결합을 나타내었고, 메조스케일 결합 분석법 (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD)에서, 그리고 비아코어™ (Pharmacia, Piscataway, NJ)에 의해 결정 시 이러한 2개의 단백질의 구조적 완전성이 확인되었다. 말단절단물 결합 데이터에서, FGFR-3의 두번째 Ig 도메인이 항체 1에 결합하는데 충분하고 따라서 에피토프에 결정적인 잔기들을 함유한다는 것이 밝혀졌다.
항체 1에 의해 인식되는 에피토프 내의 FGFR -3의 아미노산의 확인: FGFR-3(IIIc)의 결정 구조를 기초로 FGFR-3(IIIb) ECD의 도메인 2 및 3의 3차원 모델이 생성되었다. 리간드 결합, 수용체 이량체화 또는 헤파린 결합에 인접하거나 직접적으로 수반되는 FGFR-3의 두번째 도메인 내의 20개의 아미노산 (D160, K161, K162, L163, L164, V166, P167, P220, R223, D244, N170, T171, R158, R173, R175, K205, R207, L246, E247, S249)을 분자 모델을 기초로 확인하고, 단일 잔기 알라닌 돌연변이를 생성시켰다.
FGFR-3 도메인 2의 야생형 서열을 결정하였다 (서열 12). 각각의 확인된 아미노산을 부위-지정 돌연변이유발에 의해 개별적으로 알라닌으로 돌연변이시키고, 전체 ECD를 코딩하는 FGFR(IIIb)-Fc 단백질의 정황에서 발현시켰다. 코딩된 돌연변이체 단백질을 일시적으로 형질감염된 세포의 컨디셔닝된 상등액으로부터 정제하고, 각각의 정제된 돌연변이체의 동종이량체성 구조를 SDS-PAGE에 의해 확인하였다.
상기 기술된 알라닌 돌연변이가 항체 1에 대한 결합의 유의한 손실에 이르는 경우 잔기가 에피토프에 결정적인 것으로 간주되었다. 그후, 유의한 결합 감소를 나타낸 모든 돌연변이체 단백질을 Mab B9에 대한 결합에 대해 테스트하여, 전반적인 단백질 구조에서의 총체적인 변화를 점검하였다. 시험된 20개의 위치 중에서, 위치 173의 아르기닌에 대한 알라닌 치환 (R173A)이 항체 1에 대한 결합의 거의 완전한 손실 (WT과 비교하여 결합의 >90％ 감소)에 이른 반면, 다른 치환들은 결합을 유지하였다 (WT과 비교하여 결합의 <20％ 감소). 후속 테스트는 Mab B9에 대한 결합이 R173A 치환에 영향을 받지 않았음을 나타냈고, 이는 위치 173이 항체 1에 의한 수용체의 특이적 인식을 위한 결정적인 잔기를 구성한다는 것을 시사한다. R173A 돌연변이체에 대한 항체 1의 친화력을 비아코어® 분석에 의해 결정하였다. R173A 돌연변이체에 대한 항체 1의 친화력은 야생형 단백질에 대한 항체의 친화력보다 7배 더 불량하였다.
인간 및 마우스 FGFR-3 서열의 위치 173의 아르기닌 잔기가 다른 패밀리 구성원에서는 공유되지 않는다는 것이 서열 비교에서 밝혀졌고, 이는 이러한 잔기가 항체 1이 나타내는 FGFR-3 특이성을 담당할 것임을 시사한다.
FGFR -3 항체 길항제가 FGFR -3( IIIb ) 및 FGFR -3( IIIc )-매개 FGF 결합 및 세포 신호전달을 차단한다.
상기 언급된 ELISA 차단 분석법으로부터의 결과는 항체 1이 1-10 nM 범위 내의 IC50으로 FGF-1/FGFR-3 결합을 차단한다는 것을 나타낸다. 상기 기술된 FGFR-3 발현 L6 세포를 사용하여, 살아 있는 세포에서의 FGFR-3 신호전달에 대한 이러한 항체의 활성을 테스트하였다. FGFR-3 발현 L6 세포를 매우 낮은 혈청 농도 (0.1％)의 배지에서 하룻밤 동안 휴지시켰다. 다음 날, 세포들을 동일한 크기의 5개의 샘플로 분할하였다. 샘플 1 및 2를 1시간 동안 이소타입이 매칭되는 비-특이적 대조군 항체 (200 nM) 및 항체 1 (200 nM)로 각각 처리하였다. 샘플 3을 15분 동안 0.6 nM의 FGF-9에 노출시켰다. 샘플 4 및 5를 먼저 1시간 동안 이소타입이 매칭되는 비-특이적 대조군 항체 (200 nM) 및 항체 1 (200 nM)로 각각 처리한 후, 15분 동안 0.6 nM의 FGF-9에 노출시켰다. 이러한 처리 및 노출 후, 세포를 용해시키고, SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯에 적용하였다. FGFR-3의 활성화에 대해 항-포스포-타이로신 항체로 프로빙(probing)하였다. 항체 1 단독은 활성화된 FGFR-3 및 MAPK의 신호를 증가시키거나 감소시키지 않았고, FGF-9 리간드 노출은 활성화된 FGFR-3 및 MAPK의 신호를 동일한 정도로 증가시켰다. 따라서 이러한 결과들은 항체 1이 살아 있는 세포에서의 리간드-유도 활성화에서 FGFR-3 수용체를 차단하는 길항제라는 것을 실연한다.
세포 표면 FGFR -3이 항체 1에의 결합 시 내재화된다.
항체 1은 수용체 신호전달의 하류 조절 메커니즘을 구성하는 FGFR-3의 내재화를 유발한다. 이를 테스트하기 위해, 항체 1/FGFR-3 복합체의 위치를 추적하기 위해 항체를 시판되는 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)® 염료 (Invitrogen)로 표지하였다. 항체 1 및 이소타입이 매칭되는 비-특이적 대조군 항체를 형광 염료와 접합시켰다. FGFR-3 발현 L6 세포를 매우 낮은 혈청 농도 (0.1％)의 배지에서 하룻밤 동안 휴지시켰다.
세포들을 동일한 크기의 8개의 샘플로 분할하고, 6웰 조직 배양 플레이트의 웰 내로 시딩(seeding)하였다. 이러한 샘플들에게 3가지 별개의 절차를 적용하였다: 1) 결합: 세포들을 1 ㎖의 200 nM 접합 항체와 함께 1시간 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 온도는 세포내이입을 금지하도록 낮았지만, 항체-항원 상호작용을 조장하였다; 2) 내재화: 세포들을 1 ㎖의 200 nM 접합 항체와 함께 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 이러한 온도는 세포내이입을 허용할 것이다; 3) 스트리핑(stripping): 세포들을 1 ㎖의 0.2 M 글리신-0.15 M NaCl, pH 3으로 30분 동안 4℃에서 처리하였다. 이러한 조건에서, 내재화되지 않은 항체는 더이상 표면 수용체에 결합할 수 없었고, 배지 내로 방출되었다. FGFR-3으로 형질감염된 L6 세포 샘플 8개를 하기의 설명에 따라 처리하였다: 샘플 1은 접합된 대조군 항체 (200 nM, 1 ㎖)와 함께 1시간 동안 4℃에서 인큐베이션하였다; 샘플 2는 접합된 대조군 항체 (200 nM, 1 ㎖)와 함께 1시간 동안 4℃에서 인큐베이션한 후, 스트리핑시켰다; 샘플 3은 접합된 대조군 항체 (200 nM, 1 ㎖)로 1시간 동안 37℃에서 처리하였다; 샘플 4는 접합된 대조군 항체 (200 nM, 1 ㎖)로 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 후, 스트리핑시켰다; 샘플 5는 접합된 항체 1 (200 nM, 1 ㎖)로 1시간 동안 4℃에서 처리하였다; 샘플 6은 접합된 항체 1 (200 nM, 1 ㎖)로 1시간 동안 4℃에서 처리한 후, 스트리핑시켰다; 샘플 7은 접합된 항체 1 (200 nM, 1 ㎖)로 1시간 동안 37℃에서 처리하였다; 샘플 8은 접합된 항체 1 (200 nM, 1 ㎖)로 1시간 동안 37℃에서 처리한 후, 스트리핑시켰다. 이러한 처리 후, 모든 세포를 1 ㎖의 빙냉 PBS로 3회 세정하고, 상대적인 형광 강도의 검출을 위해 오디세이(Odyssey) 적외선 영상화 시스템에 적용하였다. 샘플 1-8의 판독치는 하기와 같았다: 1.5, 0.6, 1.1, 1, 3.3, 1.5, 5, 및 5.8. 샘플 1 및 5가 처리된 조건은 항체-세포 표면 결합을 허용하였지만 내재화는 허용하지 않았다. 샘플 2 및 6이 처리된 조건은 세포-표면 결합 및 내재화를 허용하지 않았다. 샘플 3 및 7이 처리된 조건은 세포-표면 결합 및 내재화를 허용하였다. 샘플 4 및 8이 처리된 조건은 내재화를 허용하였지만, 세포-표면 결합은 허용하지 않았다. 샘플 1-4, 뿐만 아니라 샘플 6에 의해 생성된 신호는 비-특이성으로 인해 배경값으로 간주되었다.
인큐베이션 후 일부 샘플에 "산 세정" 단계를 수행하여, 표면에 결합된 항체를 세포 내부로 수송된 것들에 영향을 미치지 않으면서 스트리핑시켰다. 이는 내재화된 항체의 정량을 가능하게 하였다. 유사하게 표지된 대조군 항체 (비-특이적 hIgG)는 인큐베이션 온도 또는 세정 단계와 관계 없이 유지되지 않았다. 항체 1이 세정 전에는 양쪽 온도 모두에서 유지되었지만, 세정 후에는 37℃에서 인큐베이션된 것만 유지되었고, 이는 세포에 의한 항체의 내재화를 실연하였다.
항체 1이 세포에서 FGFR -3 수용체 분해를 유도한다.
OPM-2는 다발성 골수종의 암 세포로부터 최초로 단리된 세포주이다. OPM-2 세포는 기능 획득 K650E 점 돌연변이가 있는 FGFR-3 수용체를 발현하는 것으로 공지되어 있다. OPM-2 세포를 저혈청 배양 배지 (0.1％ FBS)에서 하룻밤 동안 휴지시켰다. 다음날, 이러한 세포들을 5개의 군으로 분할하였다. 군 1을 즉각적으로 용해시키고, 웨스턴 블롯 분석 시점까지 용해물을 -20℃에서 유지시켰다. 따라서 이러한 군은 0시간 시점 샘플로 명시되었다. 군 2-5 각각에는 군 2, 3, 4 및 5의 샘플 A, B 및 C로 명명된, 동일한 크기의 3개의 샘플이 있었다. 군 2-5의 샘플 A는 어떠한 추가적인 처리에도 적용되지 않았지만, 37℃에서 인큐베이션되었다. 군 2-5의 샘플 B는 37℃에서 30 ng/㎖ FGF-1로 처리되었다. 군 2-5의 샘플 C는 37℃에서 30 ug/㎖ 항체 1로 처리되었다. 군 2의 모든 샘플을 1시간 처리 후 용해시키고, 웨스턴 블롯 분석 시점까지 용해물을 -20℃에서 유지시켰다. 이러한 군은 1시간 시점 샘플로 명시되었다. 군 3의 모든 샘플을 4시간 처리 후 용해시키고, 웨스턴 블롯 분석 시점까지 용해물을 -20℃에서 유지시켰다. 이러한 군은 4시간 시점 샘플로 명시되었다. 군 4의 모든 샘플을 8시간 처리 후 용해시키고, 웨스턴 블롯 분석 시점까지 용해물을 -20℃에서 유지시켰다. 이러한 군은 8시간 시점 샘플로 명시되었다. 군 5의 모든 샘플을 24시간 처리 후 용해시키고, 웨스턴 블롯 분석 시점까지 용해물을 -20℃에서 유지시켰다. 이러한 군은 24시간 시점 샘플로 명시되었다. 모든 용해물이 준비되었을 때, 이들을 SDS-PAGE에 이어서 웨스턴 블롯 실험에 적용하였다. 군 1 및 군 2의 모든 샘플의 FGFR-3 신호가 유사하였다. 군 3에서, 샘플 A 및 C의 FGFR-3 신호가 군 1의 신호와 유사하였지만, 샘플 B의 신호는 유의하게 더 낮았다. 군 4에서, 샘플 A의 FGFR-3 신호가 군 1의 신호와 유사하였지만, 샘플 B 및 C의 신호는 유의하게 더 낮았다. 군 5에서, 샘플 A의 FGFR-3 신호가 군 1의 신호보다 더 낮았지만, 샘플 B 및 C는 신호가 거의 없었다. 따라서, FGFR 분해를 유도하는 것으로 공지된 FGF-1과 유사하게, 항체 1이 시간-의존적인 방식으로 FGFR-3 분해를 유도할 수 있었다; 본 발명가들이 생각하는 특색은 현재까지 제시되지 않았다.
항체 1이 세포 표면으로부터의 돌연변이체 FGFR -3 수용체의 고갈을 유도한다.
방광암에서 확인된 대부분의 FGFR-3-활성화 돌연변이는 수용체의 세포외 도메인 내에 위치한다. 이러한 돌연변이 (예를 들어 R248C 또는 S249C)는 새로운, 쌍을 이루지 않은 시스테인 잔기를 발생시켜, 리간드-독립적 방식으로 디술피드-연결 FGFR-3 이량체의 형성에 이른다. 가장 빈번한 돌연변이는 S249C, Y375C 및 R248C이고, 이들은 공동으로 방광암에서의 모든 FGFR-3 돌연변이의 91％를 차지한다. 게다가, FGFR-3(IIIc) 상의 S249C는 FGFR3(IIIc)의 구성적인 활성화에 또한 이른다. 항체 1은 야생형 (WT) FGFR-3뿐만 아니라, 가장 우세한 종양-관련 FGFR-3 돌연변이체들을 또한 내재화시켜 고갈시킬 수 있다.
가장 통상적인 3가지 FGFR3 돌연변이체 변종 및 WT FGFR-3 각각을 안정적으로 발현하는 NIH-3T3 및 Ba/F3 세포주를 생성시키기 위해, 전장 인간 FGFR-3(IIIb) 또는 (IIIc)를 코딩하는 cDNA를 pMSCVpuro 레트로바이러스 벡터 (Clontech Laboratories, Mountain View, CA) 내로 클로닝하여 pMSCVpuro-FGFR-3(IIIb) 또는 (IIIc)를 생성시켰다. 특정 돌연변이, 즉 S249C, Y375C 및 R248C를 cDNA 내로 퀵체인지(QickChange) (Stratagene, La Jolla, CA)를 통해 도입하였다. WT 또는 돌연변이체 FGFR-3을 발현하는 안정적인 NIH3T3 및 Ba/F3 세포를 생성시키기 위해, 다양한 pMSCVneo 구축물을 리포펙타민(Lipofectamine) (Invitrogen)으로 패키징(packaging) 세포 휘닉스-에코(Phoenix-Eco) (ATCC, Manassas, VA) 내로 형질감염시켰다. 레트로바이러스를 수집하고, 이를 사용하여 NIH3T3 및 Ba/F3 세포를 감염시켰다. 2주 동안 2 ㎍/㎕ 퓨로마이신으로 선별한 후, WT 또는 돌연변이체 FGFR-3을 발현하는 세포를 알렉사 플루오르 488이 접합된 항-인간 FGFR-3으로 염색하고, 형광-활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하여 분석하였다.
세포 표면으로부터의 돌연변이체 및 WT FGFR-3의 항체 1-유도 내재화/고갈을 위해, 6웰 조직 배양 플레이트 (Costar, #3598)의 웰에 2 ㎖의 배양 배지 (DMEM (Invitrogen); 10％ (v/v) FCS (Invitrogen); 2 mM L-글루타민 (Invitrogen); 100 U/500 ㎖ 페니실린 G, 및 100 ㎍/500 ㎖ 스트렙토마이신 (Invitrogen)) 내의 1.5×105개의 NIH-3T3-FGFR-3 돌연변이체를 시딩하였다. 플레이트를 24시간 동안 37℃에서 95％ 상대 습도 및 5％ (v/v) CO2 하에 인큐베이션하였다. 그후 항체 1을 5 ㎍/㎖의 최종 농도로 웰에 첨가하였다. 2시간 동안 처리한 후, 배양 배지를 웰에서 제거하고, 1 ㎖의 효소가 없는 세포 해리 용액 (Chemicon, #S-014-B)으로 교체하였다. 실온에서 5분 동안 인큐베이션한 후 세포를 원심분리 튜브 내로 수집하고, 배양 배지에서 1회 세정하고, 이어서 결합 완충제 (DPBS + 1％ (w/v) BSA 및 0.01％ (w/v) 아지드화나트륨)에서 1회 더 세정하였다. 세포를 염색하기 전에, 항체 1과 상이한 에피토프를 인식하는 FGFR-3 항체를 공급원의 설명서에 따라 알렉사 플루오르 488 모노클로날 항체 표지 키트 (Molecular Probes, Eugene, OR)를 사용하여 표지하였다. 2 ㎍/㎖의 알렉사 플루오르 488-표지 항체를 함유하는 결합 완충제 100 ㎕를 세포에 첨가한 후, 세포를 60분 동안 얼음 상에서 인큐베이션하였다. 그후 세포를 결합 완충제로 1회 세정하고, 2 ㎍/㎖ 요오드화 프로피듐을 함유하는 DPBS에 재현탁시켰다 (죽은 세포를 염색하기 위해). 세포 표면 상에 남아 있는 FGFR-3 분자의 양을 FACS 분석에 의해 분석하고, 각각의 샘플에 대해 10,000개의 이벤트를 획득하였다.
세포 표면 상의 평균 형광 강도가 항체 1로의 처리 후 세포 표면 상에 남아 있는 FGFR-3 분자의 양을 반영하였다. 인간 IgG1로 처리된 세포의 평균 형광 강도로 나눈 항체 1로 처리된 세포의 평균 형광 강도를 사용함으로써 세포 표면 상의 FGFR-3의 고갈 백분율을 계산하였다. 항체 1이 세포 표면으로부터 WT 및 돌연변이체 FGFR-3 양쪽 모두를 유의하게 감소시켰다.
Ba/F3-FGFR3 세포 증식 분석법을 위해, 80,000개의 세포/웰을 10％ FBS가 보충된 RPMI 1640 배지에 시딩하였다. 헤파린 (StemCell Technologies, Vancouver, Canada)과 함께 0.005 내지 10 ug/㎖의 농도로 항체 1을 첨가하였다. 72시간 동안 인큐베이션한 후, 6시간 동안 37℃, 5％ CO2에서 20 ul (2 uCi)/200 ul의 메틸-3H 티미딘으로 세포를 펄싱(pulsing)하였다. 세포를 수확하고, 3H 티미딘 혼입에 대해 카운팅하였다. 항체 1이 Ba/F3-FGFR-3-R248C 증식을 유의하게 억제하였다.
FGFR -3 항체 길항제가 시험관 내에서 FGFR -3 발현 종양 세포에서의 FGF -신호전달을 억제한다.
항체 1이 1차 항체인 유동 세포측정법을 사용하여 야생형 또는 돌연변이체 FGFR-3 (IIIb 및/또는 IIIc)을 발현하는 종양 세포주를 확인하였다. RT112, RT4 및 BFTC905의 3개의 방광 종양 세포주가 유의한 FGFR-3 발현을 나타냈다. 기능 획득 K650E 점 돌연변이가 있는 FGFR-3 수용체를 발현하는 것으로 공지된 OPM-2 세포 또한 이러한 연구에서 높은 수준의 발현을 나타냈다. 2개의 추가적인 세포주 GEO 및 FADU가 보통이지만 여전히 유의한 수준의 수용체를 발현하는 것으로 발견되었다. 이러한 종양 세포들에서의 FGFR-3 신호전달 경로를 웨스턴 블롯을 사용하여 특성화하였다.
OPM-2는 인간 다발성 골수종으로부터 유래된 세포주이다. 이러한 세포를 저혈청 배양 배지 (0.1％ FBS)에서 하룻밤 동안 휴지시켰다. 다음날, 이러한 세포들을 동일한 크기의 4개의 샘플로 분할하였다. 대조군 샘플로서 샘플 1을 따로 놓고 37℃에서 1시간 동안 유지시켰다. 샘플 2를 200 nM의 항체 1과 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 샘플 3을 37℃에서 1시간 동안 따로 놓은 후, 동일한 샘플을 37℃에서 15분 동안 0.2 nM의 FGF-9 리간드에 노출시켰다. 샘플 4를 200 nM의 항체 1과 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 동일한 샘플을 37℃에서 15분 동안 0.2 nM의 FGF-9에 노출시켰다. 이어서, 4개의 샘플 모두를 용해시키고, SDS-PAGE에 이어서 웨스턴 블롯팅에 적용하였다. FGFR-3의 활성화를 항-포스포-타이로신 항체로 프로빙하였다. 하류 이펙터 분자 MAPK의 활성화를 항-포스포-MAPK 항체로 프로빙하였다. 하류 이펙터 분자 Akt의 활성화를 항-포스포-Akt 항체로 프로빙하였다. 샘플 2 및 4로부터의 포스포르-FGFR-3의 신호가 미자극 수용체 상태를 나타내는 샘플 1로부터의 신호에 필적하였다. 샘플 3의 신호는 샘플 1의 신호의 3배를 초과하였다. 항체 1이 FGFR-3 활성화에 대한 FGF-9의 효과를 길항하는 것으로 결론지을 수 있었다. 샘플 2 및 4로부터의 포스포르-MAPK의 신호가 미자극 수용체 상태를 나타내는 샘플 1로부터의 신호에 필적하였다. 샘플 3의 신호는 샘플 1의 신호의 2배를 초과하였다. 항체 1이 MAPK 활성화에 대한 FGF-9의 효과를 길항하는 것으로 결론지을 수 있었다. GEO는 인간 결장직장 종양으로부터 유래된 세포주이다. 이러한 세포를 저혈청 배지 (0.1％ FBS)에서 하룻밤 동안 휴지시켰다. 다음날, 이러한 세포들을 동일한 크기의 6개의 샘플로 분할하였다. 대조군 샘플로서 샘플 1을 따로 놓고 37℃에서 1시간 동안 유지시켰다. 샘플 2를 200 nM의 이소타입이 매칭되는 비-특이적 대조군 항체와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 샘플 3을 200 nM의 항체 1과 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 샘플 4를 37℃에서 1시간 동안 따로 놓은 후, 동일한 샘플을 37℃에서 15분 동안 0.67 nM의FGF-1 리간드에 노출시켰다. 샘플 5를 200 nM 대조군 항체와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 동일한 샘플을 37℃에서 15분 동안 0.67 nM FGF-1에 노출시켰다. 샘플 6을 200 nM 항체 1과 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 동일한 샘플을 37℃에서 15분 동안 0.67 nM FGF-1에 노출시켰다. 6개의 샘플 모두를 용해시키고, SDS-PAGE에 이어서 웨스턴 블롯팅에 적용하였다. FGFR-3의 활성화를 항-포스포-타이로신 항체로 프로빙하였다. 샘플 1, 2 및 4는 유사한 낮은 수준의 포스포르-FGFR-3 수준을 나타낸 반면, 샘플 3은 단독으로 3가지 종류의 분자 모두에 상응하는 유의하게 더 높은 신호를 나타냈다. 따라서, 1) FGF-9 노출은 FGFR-3의 인산화를 증가시키고; 2) 항체 1은 이러한 증가를 길항하며, 3) 항체 1 단독은 어떠한 작동제 활성도 지니지 않는다.
RT-112는 인간 방광 종양으로부터 유래된 세포주이다. 이러한 세포를 저혈청 배양 배지 (0.1％ FBS)에서 하룻밤 동안 휴지시켰다. 다음날, 이러한 세포들을 동일한 크기의 4개의 샘플로 분할하였다. 대조군 샘플로서 샘플 1을 따로 놓고 37℃에서 1시간 동안 유지시켰다. 샘플 2를 200 nM의 항체 1과 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 샘플 3을 37℃에서 1시간 동안 따로 놓은 후, 동일한 샘플을 37℃에서 15분 동안 1.3 nM의 FGF-1 리간드에 노출시켰다. 샘플 4를 200 nM의 항체 1과 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 동일한 샘플을 37℃에서 15분 동안 0.13 nM의 FGF-1에 노출시켰다. 이어서, 4개의 샘플 모두를 용해시키고, 각각의 용해된 샘플 10％를 SDS-PAGE에 이어서 웨스턴 블롯팅에 적용하였다. 하류 이펙터 분자 MAPK의 활성화를 항-포스포-MAPK 항체로 프로빙하였다. 하류 이펙터 분자 Akt의 활성화를 항-포스포-Akt 항체로 프로빙하였다. 각각의 용해물의 나머지 90％를 면역침전 실험에 적용하였다. 샘플을 4℃에서 4-16시간 동안 시판되는 항-FGFR-3 항체와 혼합하여, 항체가 용해물 내의 FGFR-3 수용체를 수집하도록 한 후, 항-FGFR-3 항체가 결합된 FGFR-3을 4℃에서 하룻밤 동안 샘플에 20 ㎍의 단백질 A-단백질 G 비드 혼합물 (50:50, V:V)을 혼합함으로써 회수하였다. 이러한 비드를 PBS로 3회 세정한 후, SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅에 적용하였다. FGFR-3의 활성화를 항-포스포-타이로신 항체로 프로빙하였다. 샘플 1, 2 및 4는 유사한 낮은 수준의 포스포르-FGFR-3 및 포스포르-MAPK를 나타낸 반면, 샘플 3은 단독으로 3가지 종류의 분자 모두에 상응하는 유의하게 더 높은 신호를 나타냈다. 따라서, 1) FGF-1 노출은 FGFR-3 및 MAPK의 인산화를 증가시키고; 2) 항체 1은 이러한 증가를 길항하며, 3) 항체 1 단독은 어떠한 작동제 활성도 지니지 않는다. 샘플 4 단독은 나머지 샘플들보다 포스포르-Akt 신호가 더 낮았고, 이는 항체 1이 Akt 신호전달을 또한 길항할 수 있음을 가리킨다.
GEO 세포를 사용하여 상기 기술된 6개의 샘플을 제조한 후, 상기와 같이 용해시키고 SDS-PAGE에 이어서 웨스턴 블롯팅에 적용하였다. 그러나, 하류 이펙터 분자 MAPK의 활성화를 항-포스포-MAPK 항체로 프로빙하였다. 하류 이펙터 분자 Akt의 활성화를 항-포스포-Akt 항체로 프로빙하였다. 샘플 1, 2, 3 및 6은 유사한 낮은 수준의 포스포르-MAPK를 나타낸 반면, 샘플 4 및 5는 3가지 종류의 분자 모두에 상응하는 유의하게 더 높은 신호를 나타냈다. 따라서, 1) FGF-1 노출은 MAPK의 인산화를 증가시키고; 2) 항체 1은 이러한 증가를 길항하며, 3) 항체 1 단독은 어떠한 작동제 활성도 지니지 않는다.
항체 1이 시험관 내에서 종양 세포 성장 및 생존을 억제한다.
세포 증식 분석법을 사용하여 종양 세포의 성장에 대한 항체 1의 억제 효과를 나타냈다. 단층 RT112 세포를 저혈청 배양 배지 (0.1％ 소 태아 혈청, 5 ㎍/㎖ 헤파린)에서 24-72시간 동안 휴지시켰다. 세포를 4개의 샘플로 분할하였다. FBS (소 태아 혈청)을 샘플 1에 10％ (V:V)의 최종 농도로 첨가하였다. 샘플 2는 고갈(starving) 배지 내에 놓았다. FGF-1을 샘플 3에 1 nM의 최종 농도로 첨가하였다. 항체 1을 샘플 4에 200 nM의 최종 농도로 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 다음으로, FGF-1을 1 nM의 최종 농도로 첨가하였다. 상기 기술된 바와 같이 샘플 1-4를 제조한 후, 샘플들을 37℃로 설정되고 5％ CO2 (v:v)가 있는 조직 배양 인큐베이터에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 표준 3H-티미딘 혼입 분석법을 사용하여 세포 성장을 검출하였다. 생체 내의 RT112 세포가 1 nM 외인성 FGF-1로 자극되었을 때 종양 세포 성장이 배가되었다. 실험은 항체 1이 이러한 외인성으로 자극된 성장을 효과적으로 감소시킨다는 것을 또한 나타냈다.
콜로니 형성 분석법 또는 콜로니생성 분석법으로 또한 공지된 반고형 한천 분석법을 사용하여 종양 세포의 생존에 대한 항체 1의 억제 효과를 나타냈다. 200 nM 항체 1 (10 ％ FBS 배양 배지 내)을 함유하는 반고형 한천에서 성장된 RT112 세포는 10％ FBS 배양 배지 단독을 함유하거나 200 nM의 이소타입이 매칭되는 비-특이적 대조군 항체 (10 ％ FBS 배양 배지 내)를 함유하는 반고형 한천에서 성장된 것들보다 약 50 ％ 적은 콜로니를 형성하였다. 이는 종양 세포에 대한 항체 1의 항-생존 효과를 나타낸다.
항체 1이 FGFR -3을 보유하는 고형 종양 상에서 항-종양 효과를 나타낸다.
0-100％ 매트리젤(Matrigel)과 혼합된 100만-2000만 개의 종양 세포를 각각의 암컷 무흉선 누드 마우스에 피하 주사하는 일상적인 방법에 의해 RT112 및 GEO 이종이식편 종양 모델을 발달시켰다. 피하 종양의 평균 부피가 약 400 ㎟이면 항체 치료를 시작하였다. 대조군 코호트(cohort) 내의 동일한 유형의 종양과 비교하여 매주 3회의 40 mg/kg 항체 1의 복강내 주사 치료에 의해 2개의 종양 세포주 RT112 및 GEO에 상응하는 이종이식편 종양 양쪽 모두 효과적으로 억제되었다. 이러한 효과가 FGFR-3 신호전달 경로의 허용(rendering)으로부터 유래된다는 것을 실연하기 위해, FGFR-3 수용체 인산화의 웨스턴 블롯 분석으로부터의 음성 결과가 시사하는 바와 같이 종양 세포에 FGFR-3 신호전달이 결여된 동소이식 PC-3 종양 모델을 사용하여 효능 연구를 수행하였다. 루시퍼레이스로 형질감염된 PC-3 세포 (PC-3LP)를 수술을 통해 Nu/nu 마우스 (수컷, 7-8주, 1×106 개의 세포/마우스)의 등쪽(dorsal lobe) 전립선 내로 직접 주사함으로써 동소이식 PC-3 모델이 생성되었다. 세포 이식 2주 후, 동물들의 생체발광 영상을 복측 위치에서 포착하고 (동물들을 등을 대고 눕힘), 제조사의 설명서 (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA)에 따라 IVIS 시스템을 사용하여 정량하였다. 성공적인 이식물이 있는 마우스들을 여러 군으로 무작위화하여, 다양한 테스트 작용제들을 미리 정해진 스케쥴에 따라 복강 내로 제공하였다. IVIS에 의해 포착된 신호를 종양 부하의 대용물로서 사용하였고, 매주 기록하였다. 통계학적 분석을 반복측정 ANOVA를 사용하여 수행하였다. 항체 1은 PC-3 종양의 성장에 대한 유의한 효과를 나타내지 않았다. 따라서, 항체 1은 기능성 FGFR-3 신호전달 경로를 보유하는 고형 종양의 성장을 억제하였다.
항체 1이 돌연변이체 FGFR -3 수용체가 있는 골수종 종양에 대한 항-종양 효과를 나타낸다
OPM-2 및 KMS-11은 FGFR-3을 발현하는 다발성 골수종 세포주이다. 또한, 양쪽 세포주 내의 수용체는 단일 점 돌연변이를 보유하는 돌연변이체이다: OPM-2의 K650E 및 KMS-11의 Y373C. 이러한 2개의 돌연변이는 기능 획득 돌연변이이고, 구성적 활성화, 반감기 연장 및 리간드 감도 증가와 같은 메커니즘을 통해 돌연변이체 수용체의 활성을 강화한다. 0-100％ 매트리젤과 혼합된 100만-2000만 개의 종양 세포를 각각의 암컷 무흉선 누드 마우스에 피하 주사하는 일상적인 방법에 의해 OPM-2 이종이식편 종양 모델을 발달시켰다. 피하 종양의 평균 부피가 약 400 ㎟이면 항체 치료를 시작하였다. 매주 3회 치료하였다. 매주 3회 종양 부피를 측정하였다. 4주 치료 후 최종적으로 측정하였다. 항체 1로 치료된 동물의 평균 종양 크기는 대조군의 크기와 비교하여 64％ 더 작았다. 스튜던트(Student) t-테스트를 수행하였다. P 값은 0.0001 미만이었다. 따라서, 연구 결과가 고도로 유의하였다. [Xin X, et al., Clin Cancer Res. 2006 Aug 15;12(16):4908-15]에 따라 KMS-11 골 이식 모델을 확립하였다. 종양 세포 주사 1주일 후 항체 치료를 시작하였다. 매주 3회 치료하였다. 연구 기간 동안 종양 세포가 방출하는 신호를 여러 번 측정하였다. 최초의 주사 33일 후 최종적으로 측정하였다. 항체 1로 치료된 동물로부터의 평균 신호는 대조군 동물로부터의 신호의 1/4이었다. 로그 순위 (맨틀-콕스(Mantel-Cox)) 테스트를 수행하였다. P 값은 0.0002였다. 따라서, 연구 결과가 고도로 유의하였다. 양쪽 모델에서, 매주 3회의 40 mg/kg 항체 1로의 복강내 주사 치료가 대조군 코호트에 비교하여 종양 성장을 유의하게 억제하였다. 항체 1은 K650E 돌연변이체 형태의 FGFR-3이 있는 종양 세포, 뿐만 아니라 Y373C 돌연변이체 형태의 FGFR-3이 있는 종양 세포에 대해 생체내 항-종양 활성을 나타내는 최초의 물질인 것으로 여겨진다.
항체 1이 세포독성제의 치료 효능을 강화한다.
시스플라틴은 암 치료법에서 광범위하게 사용되는 세포독성제이다. 이는 DNA 가교를 야기하고, 세포자멸사를 유도한다. 3가지 방광 이종이식편 모델에서 시스플라틴과 FGFR-3 항체를 조합하는 것의 치료적 이점을 조사하였다. 0-100％ 매트리젤과 혼합된 100만-2000만 개의 종양 세포를 각각의 암컷 무흉선 누드 마우스에 피하 주사하는 일상적인 방법에 의해 RT112, RT4 및 BFTC905 이종이식편 모델을 발달시켰다. 피하 종양의 평균 부피가 약 400 ㎟이면 항체 치료를 시작하였다. 항체 1의 40 mg/kg, 매주 3회 주사 및 시스플라틴의 최대 허용 용량 (MTD)을 사용하였다. 연구를 끝낼 때까지 종양 부피를 매주 3회 측정하였다. RT112 종양 모델의 데이터의 요약이 하기 표에 기록된다:
Figure pct00013
RM ANOVO 통계 테스트를 수행하였다. 시스플라틴 치료의 효능 대 시스플라틴-항체 1 조합의 효능을 비교하였다. P 값은 0.018이었다. 따라서, 시스플라틴의 증가된 효능에 대한 항체 1의 효과가 고도로 유의하였다.
RT4 종양 모델의 데이터의 요약이 하기 표에 기록된다:
Figure pct00014
RM ANOVO 통계 테스트를 수행하였다. 시스플라틴 치료의 효능 대 시스플라틴-항체 1 조합의 효능을 비교하였다. P 값은 0.0162였다. 따라서, 시스플라틴의 증가된 효능에 대한 항체 1의 효과가 고도로 유의하였다.
BFTC905 종양 모델의 데이터의 요약이 하기 표에 기록된다:
Figure pct00015
RM ANOVO 통계 테스트를 수행하였다. 시스플라틴 치료의 효능 대 시스플라틴-항체 1 조합의 효능을 비교하였다. P 값은 0.0209였다. 따라서, 시스플라틴의 증가된 효능에 대한 항체 1의 효과가 고도로 유의하였다.
이러한 연구의 전체 과정 동안 동물이 치료로 인해 사망하지 않았고, 이는 항체 1을 MTD의 시스플라틴에 첨가하는 것이 2가지 약물의 유해 효과를 유의하게 악화시키지 않으면서 시스플라틴의 효능을 강화한다는 것을 시사한다.
SEQUENCE LISTING <110> Eli Lilly <120> FIBROBLAST GROWTH FACTOR RECEPTOR-3 (FGFR-3) INHIBITORS AND METHODS OF TREATMENT <130> X18531 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 Gly Tyr Met Phe Thr Ser Tyr Gly Ile Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 Trp Val Ser Thr Tyr Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 Val Leu Gly Tyr Tyr Asp Ser Ile Asp Gly Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp 1 5 10 15 Val <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 4 Gly Gly Asn Asn Ile Gly Asp Lys Ser Val His 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 5 Leu Asp Thr Glu Arg Pro Ser 1 5 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 6 Gln Val Trp Asp Ser Gly Ser Asp His Val Val 1 5 10 <210> 7 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 7 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Met Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Val Ser Thr Tyr Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Val Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Leu Gly Tyr Tyr Asp Ser Ile Asp Gly Tyr Tyr Tyr Gly 100 105 110 Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 8 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 8 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Leu Ser Val Ala Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr Ala Thr Phe Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Asp Lys Ser Val 20 25 30 His Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Met Tyr 35 40 45 Leu Asp Thr Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Met Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Phe Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Gly Ser Asp His 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 <210> 9 <211> 456 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 9 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Met Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Val Ser Thr Tyr Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Val Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Leu Gly Tyr Tyr Asp Ser Ile Asp Gly Tyr Tyr Tyr Gly 100 105 110 Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 140 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 145 150 155 160 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 165 170 175 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180 185 190 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile 195 200 205 Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val 210 215 220 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 225 230 235 240 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 245 250 255 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 260 265 270 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 275 280 285 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 290 295 300 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 305 310 315 320 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 325 330 335 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 340 345 350 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 355 360 365 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 370 375 380 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 385 390 395 400 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 405 410 415 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 420 425 430 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 435 440 445 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 10 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 10 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Leu Ser Val Ala Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr Ala Thr Phe Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Asp Lys Ser Val 20 25 30 His Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Met Tyr 35 40 45 Leu Asp Thr Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Met Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Phe Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Gly Ser Asp His 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys 100 105 110 Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln 115 120 125 Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly 130 135 140 Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly 145 150 155 160 Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala 165 170 175 Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser 180 185 190 Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val 195 200 205 Ala Pro Ala Glu Cys Ser 210 <210> 11 <211> 795 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Met Gly Ala Pro Ala Cys Ala Leu Ala Leu Cys Val Ala Val Ala Ile 1 5 10 15 Val Ala Gly Ala Ser Ser Glu Ser Leu Gly Thr Glu Gln Arg Val Val 20 25 30 Gly Arg Ala Ala Glu Val Pro Gly Pro Glu Pro Gly Gln Glu Leu Val 35 40 45 Phe Gly Ser Gly Asp Ala Val Glu Leu Ser Cys Pro Pro Pro Gly Gly 50 55 60 Gly Pro Met Gly Pro Thr Val Trp Val Lys Asp Gly Thr Gly Leu Val 65 70 75 80 Pro Ser Glu Arg Val Leu Val Gly Pro Gln Arg Leu Val Leu Asn Ala 85 90 95 Ser His Glu Asp Ser Gly Ala Tyr Ser Cys Arg Gln Arg Leu Thr Arg 100 105 110 Val Leu Cys His Phe Ser Val Arg Val Thr Asp Ala Pro Ser Ser Gly 115 120 125 Asp Asp Glu Asp Gly Glu Asp Glu Ala Glu Asp Thr Gly Val Asp Thr 130 135 140 Gly Ala Pro Tyr Trp Thr Arg Pro Glu Arg Met Asp Lys Lys Leu Leu 145 150 155 160 Ala Val Pro Ala Ala Asn Thr Val Arg Phe Arg Cys Pro Ala Ala Gly 165 170 175 Asn Pro Thr Pro Ser Ile Ser Trp Leu Lys Asn Gly Arg Glu Phe Arg 180 185 190 Gly Glu His Arg Ile Gly Gly Ile Lys Leu Arg His Gln Gln Trp Ser 195 200 205 Leu Val Met Glu Ser Val Val Pro Ser Asp Arg Gly Asn Tyr Thr Cys 210 215 220 Val Val Glu Asn Lys Phe Gly Ser Ile Arg Gln Thr Tyr Thr Leu Asp 225 230 235 240 Val Leu Glu Arg Ser Pro His Arg Pro Ile Leu Gln Ala Gly Leu Pro 245 250 255 Ala Asn Gln Thr Ala Val Leu Gly Ser Asp Val Glu Phe His Cys Lys 260 265 270 Val Tyr Ser Asp Ala Pro His Ile Gln Trp Leu Lys His Val Glu Val 275 280 285 Asn Gly Ser Lys Val Gly Pro Asp Gly Thr Pro Tyr Val Thr Val Leu 290 295 300 Lys Thr Ala Gly Ala Asn Thr Thr Asp Lys Glu Leu Glu Val Leu Ser 305 310 315 320 Leu His Asn Val Thr Phe Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Thr Cys Leu Ala 325 330 335 Gly Asn Ser Ile Gly Phe Ser His His Ser Ala Trp Leu Val Val Leu 340 345 350 Pro Ala Glu Glu Glu Leu Val Glu Ala Asp Glu Ala Gly Ser Val Tyr 355 360 365 Ala Gly Ile Leu Ser Tyr Gly Val Gly Phe Phe Leu Phe Ile Leu Val 370 375 380 Val Ala Ala Val Thr Leu Cys Arg Leu Arg Ser Pro Pro Lys Lys Gly 385 390 395 400 Leu Gly Ser Pro Thr Val His Lys Ile Ser Arg Phe Pro Leu Lys Arg 405 410 415 Gln Val Ser Leu Glu Ser Asn Ala Ser Asn Ser Ser Asn Thr Pro Leu 420 425 430 Val Arg Ile Ala Arg Leu Ser Ser Gly Glu Gly Pro Thr Leu Ala Asn 435 440 445 Val Ser Glu Leu Glu Leu Pro Ala Asp Pro Lys Trp Glu Leu Ser Arg 450 455 460 Ala Arg Leu Thr Leu Gly Lys Pro Leu Gly Glu Gly Cys Phe Gly Gln 465 470 475 480 Val Val Met Ala Glu Ala Ile Gly Ile Asp Lys Asp Arg Ala Ala Lys 485 490 495 Pro Val Thr Val Ala Val Lys Met Leu Lys Asp Asp Ala Thr Asp Lys 500 505 510 Asp Leu Ser Asp Leu Val Ser Glu Met Glu Met Met Lys Met Ile Gly 515 520 525 Lys His Lys Asn Ile Ile Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Gln Gly Gly 530 535 540 Pro Leu Tyr Val Leu Val Glu Tyr Ala Ala Lys Gly Asn Leu Arg Glu 545 550 555 560 Phe Leu Arg Ala Arg Arg Pro Pro Gly Leu Asp Tyr Ser Phe Asp Thr 565 570 575 Cys Lys Pro Pro Glu Glu Gln Leu Thr Phe Lys Asp Leu Val Ser Cys 580 585 590 Ala Tyr Gln Val Ala Arg Gly Met Glu Tyr Leu Ala Ser Lys Cys Ile 595 600 605 His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Thr Glu Asp Asn Val 610 615 620 Met Lys Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Val His Asn Leu Asp 625 630 635 640 Tyr Tyr Lys Lys Thr Thr Asn Gly Arg Leu Pro Val Lys Trp Met Ala 645 650 655 Pro Glu Ala Leu Phe Asp Arg Val Tyr Thr His Ser Asp Val Ser Phe 660 665 670 Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile Phe Thr Leu Gly Gly Ser Pro Tyr Pro 675 680 685 Gly Ile Pro Val Glu Glu Leu Phe Lys Leu Leu Lys Glu Gly His Arg 690 695 700 Met Asp Lys Pro Ala Asn Cys Thr His Asp Leu Tyr Met Ile Met Arg 705 710 715 720 Glu Cys Trp His Ala Ala Pro Ser Arg Pro Thr Phe Lys Leu Val Glu 725 730 735 Asp Leu Asp Arg Val Leu Thr Val Thr Ser Thr Asp Glu Tyr Leu Asp 740 745 750 Leu Ser Ala Pro Phe Glu Tyr Ser Pro Gly Gly Gln Asp Thr Pro Ser 755 760 765 Ser Ser Ser Ser Gly Asp Asp Ser Val Phe Ala His Asp Leu Leu Pro 770 775 780 Pro Ala Pro Pro Ser Ser Gly Gly Ser Arg Thr 785 790 795 <210> 12 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ala Pro Tyr Trp Thr Arg Pro Glu Arg Met Asp Lys Lys Leu Leu Ala 1 5 10 15 Val Pro Ala Ala Asn Thr Val Arg Phe Arg Cys Pro Ala Ala Gly Asn 20 25 30 Pro Thr Pro Ser Ile Ser Trp Leu Lys Asn Gly Arg Glu Phe Arg Gly 35 40 45 Glu His Arg Ile Gly Gly Ile Lys Leu Arg His Gln Gln Trp Ser Leu 50 55 60 Val Met Glu Ser Val Val Pro Ser Asp Arg Gly Asn Tyr Thr Cys Val 65 70 75 80 Val Glu Asn Lys Phe Gly Ser Ile Arg Gln Thr Tyr Thr Leu Asp Val 85 90 95 Leu Glu Arg Ser 100

Claims (19)

  1. 인간 FGFR-3(IIIb) 및 FGFR-3(IIIc)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체.
  2. 제1항에 있어서, 실온 (20-25℃)에서 약 1×10-8 M 이하의 KD를 갖는 인간 항체인 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 인간 FGFR-3 도메인 2 (서열 12)에 특이적으로 결합하는 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열
    Figure pct00016
    을 갖는 CDRH1, 서열
    Figure pct00017
    을 갖는 CDRH2, 서열
    Figure pct00018
    을 갖는 CDRH3, 서열
    Figure pct00019
    을 갖는 CDRL1, 서열
    Figure pct00020
    을 갖는 CDRL2, 및 서열
    Figure pct00021
    을 갖는 CDRL3을 포함하는, 인간 FGFR-3에 특이적으로 결합하는 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    Figure pct00022
    의 중쇄 가변 아미노산 서열 및
    Figure pct00023
    의 경쇄 가변 아미노산 서열을 포함하는 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 9의 중쇄 및 서열 10의 경쇄를 포함하는 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 9의 중쇄 2개 및 서열 10의 경쇄 2개를 포함하는 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항체의 중화 인간 FGFR-3-결합 단편.
  9. 경쟁 ELISA 분석법에서 FGFR-3의 세포외 도메인에 결합하는 것에 대해 실온 (20-25℃)에서 약 1×10-8 M 이하의 KD로 FGFR-3에 결합하는 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 경쟁 항체와 경쟁하는 단리된 항체 또는 이의 단편.
  10. 제9항에 있어서, 돌연변이체 FGFR-3에 특이적으로 결합하는 항체.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 항체 또는 단편, 및 제약상 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
  12. 치료법에서 동시에, 별도로 또는 순차적으로 사용하기 위한 조합 치료를 위한 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 항체 또는 단편, 및 추가적인 항암제를 함유하는 제품.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한 항체 또는 단편.
  14. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 암의 치료에서 사용하기 위한 항체 또는 단편.
  15. 제13항에 있어서, 암이 방광암 또는 다발성 골수종인 항체 또는 단편.
  16. 제14항에 있어서, 또 다른 작용제와 함께 사용되는 항체 또는 단편.
  17. 제16항에 있어서, 유효량의 또 다른 작용제를 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 환자에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 항체.
  18. 제17항에 있어서, 또 다른 작용제가 시스플라틴인 항체.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 제약상 허용가능한 담체 및 임의적인 또 다른 치료 성분과 함께 포함하는 제약 조성물.
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