KR20160074679A - 섬유모세포 성장 인자 수용체-3 (ｆｇｆｒ3)에 대한 화합물 및 치료 용도 - Google Patents

섬유모세포 성장 인자 수용체-3 (ｆｇｆｒ3)에 대한 화합물 및 치료 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 약물 모이어티 작용제, 및 인간 섬유모세포 성장 인자 수용체 3 (FGFR3)을 표적화하는 세포 결합 작용제로 이루어진 접합체를 제공한다. 상기 접합체는 특이적 세포 집단을 표적화하고, 세포 내부에서 강력한 세포독소를 전달하도록 디자인되고 적합화된 바, 치료 용도를 가진다. 본 발명의 접합체는 오직 중간 정도로만 발현되는 중요한 종양학상의 수용체에서 표적화된 종양 요법을 제공할 뿐만 아니라, 이웃하는 세포에는 방관자 활성을 제공함으로써 관련 기술분야에 공지된 다른 접합체에 비하여 상당한 이점을 가진다.

Description

섬유모세포 성장 인자 수용체-3 (ＦＧＦＲ3)에 대한 화합물 및 치료 용도 {COMPOUNDS TO FIBROBLAST GROWTH FACTOR RECEPTOR-3 (FGFR3) AND THERAPEUTIC USES}
본 출원은 2013년 12월 18일 출원된 미국 가출원 번호 61/917457 및 2014년 1월 16일 출원된 미국 가출원 번호 61/928025의 이점을 주장한다.
본 발명은 면역학, 암 치료 및 표적화된 치료제 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 링커 모이어티를 통해 독성 약물 모이어티, 구체적으로, 세포독성제, 및 세포 결합 작용제, 더욱 구체적으로, 항체, 및 더욱더 구체적으로, 인간 섬유모세포 성장 인자 수용체 3 (FGFR3)을 표적화하는 항체로 이루어진 접합체인 화합물에 관한 것이다.
종래 화학요법을 이용하여 수행하는 것과 같이 몸 전체를 전신 치료하기 보다는 표적화된 독성 작용제를 직접 비정상적인 세포로 전달하는 것이 표적화된 치료제에 있어서의 중요한 이점이다. 표적화된 전달은 건강한 세포에 대한 손상을 감소시킴으로써 부작용을 최소화시키는 데 도움이 된다. 본 발명의 접합체는 표적에서 벗어난 세포독성 활성은 최소화시키면서, 특이적 세포 집단을 표적화하고, 세포 내부에서 강력한 세포독소를 전달하도록 디자인되고, 적합화된 것이다. 본 발명은 건강한 세포에 미치는 영향은 최소화시키면서, 비정상적인 세포의 제거 또는 그의 생존능력 감소를 위한, 신규하고 유용한 접합체, 및 그를 이용한 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 이행 세포 암종 (TCC)을 비롯한, 비-근육 침윤성이고, 대개 국소 질환, 및 근육 침윤성이며, 전이성일 수 있는 잠재능이 매우 높은 (이하, "M+") 방광암, 및 다발성 골수종 (MM) 치료에 대하여 임상적으로 충족되지 못한 요구에 대한 대응책이다. 2013년 미국에서는 73,510명의 개체가 새로 방광암 진단을 받은 것으로 추정되었고, 방광암으로 인해 14,880건의 암 관련 사망이 일어났다. 이로써 남성에서는 4번째 가장 흔한, 그리고 여성에서는 9번째로 가장 흔한 신생물성 사례가 된다. 새로 발생한 모든 사례 중 약 70%는 TCC, 비-근육 침윤성 암이며, 상당한 우발적 재발에 대해서는 바실러스 칼메테-구에린(bacillus Calmette-Guerin) (BCG)/방사선 조사/수술인 현 표준 치료법을 개선시키기 위해 충족되지 못했던 의학적 필요가 고도로 요구되고 있다. 현재, 근육 침윤성 방광암에 대한 표적화된 요법은 없으며, 여기서 표준 치료법은 빈번하게 독성을 나타내는 화학요법 중 4가지 세포독성 요법 (메토트렉세이트, 빈블라스틴, 독소루비신, 및 시스플라틴 (MVAC))의 조합이다. 따라서, 현재 대부분의 환자들은 최적성이 더 낮은 겜시타빈 및 시스플라틴의 조합으로 치료받고 있다. 다발성 골수종은 여전히 난치병으로서, 현재 전체 생존 기간은 3년 내지 5년 범위이다. 현재, 다발성 골수종에 대한 표준 치료법은, 모든 약물이 대부분의 환자에 대하여 독성을 보인 것인 빈크리스틴, 시클로포스파미드 및 독소루비신을 비롯한, 화학요법 중 세포독성 요법과 조합된 코르티코스테로이드제 (덱사메타손)를 가변적으로 투약하는 것이다.
건강한 세포 및 조직에 대한 손상은 완화시키면서, 효과적으로 특이적 세포 집단을 표적화하고, 강력한 세포독소를 전달하는 암 치료법이 중대하게 요구되고 있다. 따라서, 본 발명은 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다:
<화학식 I>
Figure pct00001
상기 식에서,
n은 정수 1-10이고,
R은 인간 FGFR3 (서열 11)에 결합하며, 서열 GYMFTSYGIS (서열 1)를 가지는 CDRH1, 서열 WVSTYNGDTNYAQKFQG (서열 2)를 가지는 CDRH2, 서열 VLGYYDSIDGYYYGMDV (서열 3)를 가지는 CDRH3, 서열 GGNNIGDKSVH (서열 4)를 가지는 CDRL1, 서열 LDTERPS (서열 5)를 가지는 CDRL2, 및 서열 QVWDSGSDHVV (서열 6)를 가지는 CDRL3을 포함하는 세포 결합 작용제이다. 본 발명은 이하 "접합체 1"로서 지칭된다.
본원의 과학적 증거는 본 발명의 화합물이 비정상적인 세포를 직접적으로 표적화하고, 이로써, 신체의 건강한 세포에 대한 손상을 감소시킴으로써, 결국에는 부작용을 최소화시킨다는 점에서 방광암 (근육 침윤성 및 비-근육 침윤성) 및 다발성 골수종에 대한 현 표준 치료법보다 우수하다는 것을 제안한다. 추가로, 본 발명의 화합물은 임상적으로 충족되지 못했던 필요가 요구되고 있는 적응증 및 환자 집단을 표적화하기 때문에 다른 접합체보다 우수하다. 현재 승인받은 접합체인 캐드실라(Kadcyla)®와 달리, 본 발명의 화합물은 암 형성에서 중요하지만, 일반적으로 부적절하게 과다발현되어 접합된 표적 요법에 대해 적격인 것으로 간주될 수 있는 표적을 이용하다. 현재 승인받은 접합체인 애드세트리스(Adcetris)®와 달리, 본 발명의 화합물은 표적에서 벗어난 독성을 독성을 최소화시킴으로써 부작용을 감소시키는 데, 이는 애드세트리스®의 공지된 한계이다. 마지막으로, 예컨대, 순환시 링커 불안정성이 문제가 된 겜투주맙 오조가미신 (마일로탁(Mylotarg)® - 2000년 FDA 승인을 받았지만, 2010년 자발적으로 철회됨)과 같이 이전에 승인받은 접합체와 달리, 본 발명의 화합물은 안정한 링커를 가지며, 이로써, 순환시 불안정성을 막을 수 있다.
접합체를 디자인하고, 조작하는 것은 복잡한 노력이다. 이는 단지 항원, 약물 모이어티, 링커 모이어티 및 세포 결합 작용제를 선택하는 것보다도 훨씬 더 복합하다 (Ritter, A., Antibody-Drug Conjugates; Looking Ahead to an Emerging Class of Biotherapeutic, Pharmaceutical Technology pp 42-47 (January 2012)). 종양 항원, 세포 결합 작용제의 결합 특이성, 약물 모이어티의 작용 기전, 및 약물 모이어티가 세포 결합 작용제에 결합되는 방식 모두 화합물의 임상 활성 및 내약성을 지배하는 중요한 결정 요인이다.
본 발명의 접합체는 성분의 조합이 아닌, 신규하고 독창적인 화합물이다. 화합물 조작을 위해서는 서로를 보완하는 구성적 작용기 (약물 모이어티, 링커 모이어티, 세포 결합 작용제)의 확인 및 선택이 요구된다. 각 성분은 그 자신의 특징, 이점 및 제약 조건을 가지는 작용기이다. 본 공정은 알킬 기, 카르보닐 기 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 독특한 작용기로 구성된, 신규한 소분자를 디자인하는 것과 유사하다. 접합체가 효과적인 치료제가 되도록 하기 위해서는 특징, 이점 및 제약 조건이 확실하게 균형을 이루도록 주의 깊게 디자인하여야 한다; 그러나, 결과는 예측이 불가능하다. 광대한 약물 모이어티, 링커 및 세포 결합 작용제로부터의 작용기 선택은 복잡하고, 예측이 불가능하다. 예를 들어, 메토트렉세이트, 빈블라스틴, 독소루비신, 및 시스플라틴과 같은 소분자 화합물의 구조적 활성 관계 및 화학적 활성과 같이 작용기가 앞서 개시된 바 있기는 하지만 (독소: DM4 (N2'-데아세틸-N-2'(4-메틸-4-메르캅토-1-옥소펜틸)-메이탄신) (미국 특허 번호 7,276,497), 링커: 술포-SPDB (N-숙신이미딜 4-(2-피리딜디티오)-2-술포부타노에이트))(미국 특허 번호 8,236,319), 및 세포 결합 작용제: 항체 1 (미국 특허 번호 8,043,618)), 개별 작용기에 관한 지식이 최종 화합물의 관능성에 관한 지식을 전하지는 않는다.
적합한 표적 항원을 선택하는 것이 본 발명의 중요한 측면이다. 본 발명의 표적 항원은 FGFR3이다. 비정상적인 수용체 티로신 키나제 (RTK) 신호전달은 암 형성 뿐만 아니라, 암 진행에서 중요한 역할을 한다. 섬유모세포 성장 인자 (FGF) 및 그의 동족 수용체 (FGFR)는 RTK 패밀리의 일부분이다. FGF 및 FGFR은 배아 발생, 조직 항상성 및 대사 동안 중요한 역할을 한다. 돌연변이를 통한 FGFR3의 비정상적인 활성화, 염색체 융합물 생성, 또는 과다발현이 종양원성 형질전환을 유도하기에 충분할 정도의 활성화된 FGFR3 과다발현을 포함하는 암과 직접적으로 연관되어져 왔다.
FGFR3 신호전달 경로가 암 치료에서 일정 역할을 한다는 중요성에도 불구하고, FGFR3은 접합체 요법의 개발을 위해서는 가능성이 없는 항원 선택이 된다. 접합체가 효과적인 것이 되도록 하기 위해서는 종양 세포 상의 강력한 표적 발현이 일반적으로는 필수 요건인 것으로 간주된다. 비록 FGFR3이 항원 양성인 경우라도, 정상 세포 대비 종양 세포 상에서의 그의 과다발현은 중간 정도이고; 이는 관련 기술분야에서, 현재 FDA 승인을 받은 것을 비롯한, 전형적인 접합체에 대해 필요한 것으로 이해되고, 그에 대해 이로운 것으로 간주되는 항원 수준으로 발현되지 않는다. FGFR3의 발현 수준이 중간 정도라고 가정할 때, 접합체 1은 예상외로 효과가 있다. FGFR3의 돌연변이 및 융합물을 활성화시키는 것 또한 접합체 1의 예상밖의 효능을 추가로 유도하는 것으로 확인되었다.
따라서, 세포 결합 작용제로서 항체 1을 포함하도록 접합체 1을 조작하는 것이 본 발명의 중요한 측면이다. 접합체 1의 세포 결합 작용제로서, 항체 1은 수용에 결합하고, 수용체의 내재화 및 분해를 유도한다. 고전적으로는 치료제의 성공 가능성을 증진시키기 위해서는 표면 항원을 빠르게 보충시켜 주여야 한다고 생각되었었다. 이러한 생각에도 불구하고, 접합체 1은 특히 효능이 있는 것으로 밝혀졌다.
링커로서 술포-SPDB를 선택하는 것 또한 본 발명의 중요한 측면이다. 세포 내부에서 약물 모이어티의 세포내 대사가 확실하게 일어날 수 있도록 함으로써 약물 모이어티의 독성의 균형이 이루어지도록 술포-SPDB를 선택하였다. 그러나, 술포-SPDB 접합체는 세포내에서 대사되었을 때 3개의 대사 생성물 (리신-N(엡실론)-술포-SPDB-DM4, DM4, 및 S-메틸-DM4)을 생성하게 되는데, 그 중 둘은 유리 약물의 전달을 통하여 이웃 세포의 방관자 세포 사멸을 촉진시킬 수 있으며 (DM4 및 S-메틸-DM4), 이는 또한 정상 세포의 비-특이적인 사멸을 통해 독성을 증가시킬 수 있다. 항원의 발현 속도에 기인하여, 상기 효과는 균형을 이루었고, 이로써 감지된 단점은 본 발명의 접합체의 장점으로 전환되었다. 추가로, 술포-SPDB는 일부 종양 모델에서의 그의 우수한 효능 뿐만 아니라, 독성에 관한 고려 사항에 기인하여, 다른 절단가능한 링커, 예컨대, SPDB 및 SMCC보다도 더 선택되었다.
상당한 조작과 접합 도전 과제에도 불구하고, 본 발명의 접합체는 놀랍게도 암 진행에서 중요한 역할을 하는 항원으로서 중간 정도로 발현된 항원에서, 건강한 조직에 대한 손상은 완화시키면서, 효과적으로 특이적 세포 집단을 표적화하고, 강력한 세포독소를 전달하는 암 치료가 이루어질 수 있도록 할 수 있다.
본 발명의 한 측면은 상기 언급된 접합체 1이다. 본 발명은 또한, 세포 결합 작용제가
Figure pct00002
의 가변 중쇄 아미노산 서열, 및
Figure pct00003
의 가변 경쇄 아미노산 서열을 추가로 포함하는 것인 화합물에 관한 것이다.
본 발명은 세포 결합 작용제가 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 추가로 포함하는 것인 화합물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 세포 결합 작용제가, 각각이 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄 및 각각이 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 중쇄를 추가로 포함하는 것인 화합물에 관한 것이다.
본 발명의 한 측면에서, 화합물의 약물 대 항체의 비, 또는 본원에 사용된, "DAR"은 2.0 내지 5.0이다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 화합물의 DAR은 3.5 ± 0.5이다.
본 발명은 또한 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 상기 언급된 화합물을 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 제약 조성물은 추가의 제약 작용제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 한 측면은 요법에 사용하기 위한 화합물이다. 또 다른 측면은 암 치료에 사용하기 위한 화합물이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 FGFR3 발현 수준이 대조군 집단에서의 FGFR3 발현 수준보다 더 높은 것인 환자에서 암 치료에 사용하기 위한 화합물이다. 한 측면에서, 대조군 집단은 암을 앓지 않는 개체를 1명 이상 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 환자는 상승된 FGFR3 발현 수준을 가지고, 치료는 환자의 생물학적 샘플 중 FGFR3 발현 수준을 생체외에서 또는 시험관내에서 결정함으로써 환자가 상승된 FGFR3 발현 수준을 가지는지 여부를 결정하는 단계, 및 상기 샘플 중의 FGFR3 발현 수준을 대조군 샘플 중의 FGFR3 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 것인, 환자에서 암 치료에 사용하기 위한 화합물이다.
한 측면에서, 대조군 샘플은 암을 앓지 않는 개체로부터의 생물학적 샘플이다.
추가의 측면에서, 환자의 생물학적 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 소변 및 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가의 다른 측면에서, 대조군 샘플은 환자의 생물학적 샘플과 동일한 공급원으로부터의 것이다. 예를 들어, 환자로부터의 생물학적 샘플이 혈액 샘플일 경우, 대조군 샘플 또한 혈액 샘플이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) S249C, R248C, Y373C, Y375C, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, FGFR3 (서열 11)의 돌연변이; (b) FGFR3-TACC3의 융합물; 또는 (c) (a) 및 (b)의 조합을 가지는 환자에서 암 치료에 사용하기 위한 화합물이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) S249C, R248C, Y373C, Y375C, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, FGFR3 (서열 11)의 돌연변이; (b) FGFR3-TACC3의 융합물; 또는 (c) (a) 및 (b)의 조합을 가지는 환자에서 암 치료에 사용하기 위한 화합물이며, 치료는 환자의 생물학적 샘플 중 (i) S249C, R248C, Y373C, Y375C 돌연변이 중 하나 이상; (ii) FGFR3-TACC3의 융합물; 또는 (iii) (i) 및 (ii)의 조합의 존재를 생체외에서 또는 시험관내에서 결정함으로써 환자가 (a) S249C, R248C, Y373C, Y375C, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, FGFR3 (서열 11)의 돌연변이; (b) FGFR3-TACC3의 융합물; 또는 (c) (a) 및 (b)의 조합을 가지는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
추가의 측면에서, 환자의 생물학적 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 조직, 종양 세포, 종양 조직 샘플, 순환 종양 세포, 및 순환 DNA로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 측면에서, 암은 방광암 또는 다발성 골수종이다.
또 다른 측면에서, 화합물은 또 다른 항암 치료제와 함께 동시에, 별개로 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 항암 치료제는 항혈관신생제, 화학요법제, 및 항신생물제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 한 측면에서, 항신생물제는 시스플라틴이다.
본 발명은 또한 암 치료를 필요로 하는 포유동물에게 유효량의 화합물을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 암은 방광암 또는 다발성 골수종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 포유동물에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 상기 포유동물에게 또 다른 항암 치료제를 투여하는 단계로서, 여기서 상기 항암 치료제는 항혈관신생제, 화학요법제, 및 항신생물제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단계를 추가로 포함할 수 있다. 한 측면에서, 항신생물제는 시스플라틴이다.
본 발명의 한 측면은 (1) 환자로부터 채취된 샘플 중 FGFR3 (서열 11)의 발현 수준을 측정하는 단계로서, 여기서 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 및 조직으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단계, 및 (2) FGFR3 발현 수준이 대조군 집단에서 발견된 FGFR3 발현 수준보다 높다면, 상기 환자에게 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 암을 치료하는 방법이다.
본 발명의 한 측면은 (1) 환자로부터 채취된 샘플 중 이상의 존재를 결정하는 단계로서, 여기서 이상은 (a) S249C, R248C, Y373C, Y375C, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, FGFR3 (서열 11)의 돌연변이; (b) FGFR3-TACC3의 융합물; 또는 (c) (a) 및 (b)의 조합이고, 여기서 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 조직, 종양 세포, 종양 조직 샘플, 순환 종양 세포, 및 순환 DNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단계, 및 (2) 이상이 존재한다면, 상기 환자에게 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 암을 치료하는 방법이다.
본 발명의 한 측면은 (1) 환자로부터 채취된 샘플 중 FGFR3 (서열 11)의 S249C 돌연변이의 존재를 결정하는 단계로서, 여기서 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 조직, 종양 세포, 종양 조직 샘플, 순환 종양 세포, 및 순환 DNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단계, 및 (2) S249C 돌연변이가 존재한다면, 상기 환자에게 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 암을 치료하는 방법이다.
본 발명의 한 측면은 (1) 환자로부터 채취된 샘플 중 FGFR3 (서열 11)의 R248C 돌연변이의 존재를 결정하는 단계로서, 여기서 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 조직, 종양 세포, 종양 조직 샘플, 순환 종양 세포, 및 순환 DNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단계, 및 (2) R248C 돌연변이가 존재한다면, 상기 환자에게 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 암을 치료하는 방법이다.
본 발명의 또 다른 측면은 (1) 환자로부터 채취된 샘플 중 FGFR3 (서열 11)의 Y373C 돌연변이의 존재를 결정하는 단계로서, 여기서 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 조직, 종양 세포, 종양 조직 샘플, 순환 종양 세포, 및 순환 DNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단계, 및 (2) Y373C 돌연변이가 존재한다면, 상기 환자에게 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 암을 치료하는 방법이다.
본 발명의 또 다른 측면은 (1) 환자로부터 채취된 샘플 중 FGFR3 (서열 11)의 Y375C 돌연변이의 존재를 결정하는 단계로서, 여기서 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 조직, 종양 세포, 종양 조직 샘플, 순환 종양 세포, 및 순환 DNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단계, 및 (2) Y375C 돌연변이가 존재한다면, 상기 환자에게 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 암을 치료하는 방법이다.
본 발명의 또 다른 측면은 (1) 환자로부터 채취된 샘플 중 FGFR3-TACC3의 융합물의 존재를 결정하는 단계로서, 여기서 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 조직, 종양 세포, 종양 조직 샘플, 순환 종양 세포, 및 순환 DNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단계, 및 (2) FGFR3-TACC3의 융합물이 존재한다면, 상기 환자에게 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 암을 치료하는 방법이다.
본 발명의 한 측면은 암을 앓는 대상체의 샘플 중 FGFR3 (서열 11)의 발현 수준을 생체외에서 또는 시험관내에서 결정하는 단계로서, 여기서 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 및 조직으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 암을 앓지 않는 개체에서의 FGFR3 발현 수준과 비교하였을 때, FGFR3 발현 수준이 증가하였다면, 이는 상기 대상체가 화합물에 대한 후보라는 것을 시사하는 것인, 암을 앓는 대상체가 화합물에 대한 후보인지 여부를 결정하는 방법이다.
또 다른 측면은 환자로부터 채취된 샘플 중 이상의 존재를 생체외에서 또는 시험관내에서 결정하는 단계로서, 여기서 이상은 (1) S249C, R248C, Y373C, Y375C, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, FGFR3 (서열 11)의 돌연변이; (2) FGFR3-TACC3의 융합물, 또는 (3) (a) 및 (b)의 조합이고, 여기서 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 조직, 종양 세포, 종양 조직 샘플, 순환 종양 세포, 및 순환 DNA로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 돌연변이가 검출되었다면, 이는 상기 대상체가 화합물에 대한 후보라는 것을 시사하는 것인, 암을 앓는 대상체가 화합물에 대한 후보인지 여부를 결정하는 방법이다.
본 발명의 한 측면은 암을 앓는 대상체의 샘플 중 FGFR3 (서열 11)의 S249C 돌연변이의 존재를 생체외에서 또는 시험관내에서 결정하는 단계로서, 여기서 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 조직, 종양 세포, 종양 조직 샘플, 순환 종양 세포, 및 순환 DNA로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 S249C 돌연변이가 검출되었다면, 이는 상기 대상체가 화합물에 대한 후보라는 것을 시사하는 것인, 암을 앓는 대상체가 화합물에 대한 후보인지 여부를 결정하는 방법이다.
본 발명의 한 측면은 암을 앓는 대상체의 샘플 중 FGFR3 (서열 11)의 R248C 돌연변이의 존재를 생체외에서 또는 시험관내에서 결정하는 단계로서, 여기서 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 조직, 종양 세포, 종양 조직 샘플, 순환 종양 세포, 및 순환 DNA로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 R248C 돌연변이가 검출되었다면, 이는 상기 대상체가 화합물에 대한 후보라는 것을 시사하는 것인, 암을 앓는 대상체가 화합물에 대한 후보인지 여부를 결정하는 방법이다.
또 다른 측면은 암을 앓는 대상체의 샘플 중 FGFR3 (서열 11)의 Y373C 돌연변이의 존재를 생체외에서 또는 시험관내에서 결정하는 단계로서, 여기서 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 조직, 종양 세포, 종양 조직 샘플, 순환 종양 세포, 및 순환 DNA로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 Y373C 돌연변이가 검출되었다면, 이는 상기 대상체가 화합물에 대한 후보라는 것을 시사하는 것인, 암을 앓는 대상체가 화합물에 대한 후보인지 여부를 결정하는 방법이다.
또 다른 측면은 암을 앓는 대상체의 샘플 중 FGFR3 (서열 11)의 Y375C 돌연변이의 존재를 생체외에서 또는 시험관내에서 결정하는 단계로서, 여기서 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 조직, 종양 세포, 종양 조직 샘플, 순환 종양 세포, 및 순환 DNA로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 Y375C 돌연변이가 검출되었다면, 이는 상기 대상체가 화합물에 대한 후보라는 것을 시사하는 것인, 암을 앓는 대상체가 화합물에 대한 후보인지 여부를 결정하는 방법이다.
또 다른 측면은 암을 앓는 대상체의 샘플 중 FGFR3-TACC3의 융합물의 존재를 생체외에서 또는 시험관내에서 결정하는 단계로서, 여기서 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 조직, 종양 세포, 종양 조직 샘플, 순환 종양 세포, 및 순환 DNA로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 FGFR3-TACC3의 융합물이 검출되었다면, 이는 상기 대상체가 화합물에 대한 후보라는 것을 시사하는 것인, 암을 앓는 대상체가 화합물에 대한 후보인지 여부를 결정하는 방법이다.
본원에 사용된, "항원"이라는 용어는 세포 표면 상에 위치하는 단백질을 포함한다. 항원은 폴리펩티드, 탄수화물, 핵산, 지질, 합텐 또는 다른 자연 발생된 또는 합성 화합물을 포함할 수 있다. 바람직하게, 항원은 폴딩된 폴리펩티드 또는 단백질이다. 특이적인 리간드는 단백질 또는 수용체에 결합하여 신호 전달 및 세포 활성의 변화를 개시한다. 항체는 또한 항원에 결합하여 리간드 결합 및 생성된 신호 전달을 차단할 수 있다. 항원, "수용체," "표적" 또는 "표적 항원"이라는 용어는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
본원에 사용된, "이상"이라는 용어는 야생형, 표준, 정상 또는 예상되는 것으로부터 벗어나는 항원 서열에서의 임의의 변화를 포함한다. 이상은 유전적 이상을 포함한다. 이상은 모든 유형의 돌연변이 및 융합물을 포함한다.
본원에 사용된, "돌연변이"라는 용어는 항원의 아미노산 서열에서의 변화를 비롯한, 게놈의 뉴클레오티드 서열에서의 변화를 포함한다.
본원에 사용된, "융합물"이라는 용어는 원래는 별개의 단백질을 코딩하는 2개 이상의 유전자의 결합을 통해 생성된 단백질을 포함한다. 융합 유전자는 보편적으로 염색체 전좌가 한 유전자의 엑손을 제2 유전자로부터의 무손상 엑손으로 대체하였을 때 생성된다. 이는 전사, 스플라이싱, 및 번역되어 기능성 융합 단백질을 제조할 수 있는 단일 유전자를 생성한다.
야생형 FGFR3의 과다발현은 종양원성 형질전환을 유도하기에 충분하다. 돌연변이를 통한, FGFR3 (서열 11)의 구성적, 리간드 비의존적 활성을 유도하는 비정상적인 활성화는 암과 직접적으로 연관되어져 왔다. 확인된 돌연변이로는 S249C, R248C, Y373C, 및 Y375C를 포함한다. 본원에서 "FGFR3-TACC3 융합물"로서 사용되는, 표적 FGFR3의 엑손을 형질전환 산성 꼬인 코일형 단백질 3 (TACC3)의 엑손과 스플라이싱하는 수개의 융합 단백질이 다수의 암에서 확인되었다. 하기 표 5에서 알 수 있는 것과 같은 상기 돌연변이 및 일부 융합물은 FGFR3을 과민성으로 만들고, 이에 따라 FGFR3은 본 발명의 접합체에 대하여 더욱 큰 수용성을 나타내게 된다.
본원에 사용된, "과다발현"이라는 용어는 유전자가 하나 이상의 수용체를 비롯한 그의 생성물을 상승된 수준으로 생산하는 유전자의 과도한 발현을 포함하는 것으로, 이는 증가된 수용체 활성화 및 신호전달과 관련이 있다. 항원성 수용체를 "과다발현하는" 암은 같은 조직의 비암성 세포와 비교하였을 때, 세포 표면에서 수용체를 유의하게 더 높은 수준을 가지는 것이다. 수용체 과다발현은 면역조직화학 (IHC) 검정법을 통해 세포의 표면 상에 존재하는 수용체 단백질의 증가된 수준을 평가함으로써, 또는 형광 동소 하이브리드화 (FISH), 써던 블롯팅, 노던 블롯팅 또는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 통해 세포 중의 수용체-엔딩 핵산의 수준을 측정함으로써 진단적 또는 예후적 검정법으로 결정될 수 있다.
과다발현은 유한 한계가 아닌, 연속체이다. 수용체 세포 표면 발현 또는 상대적인 수용체 세포 표면 밀도는 중간 형광 강도 (MFI)에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, FGFR3 세포 표면 발현은 방광암 세포주 BFTC-905 (야생형)에서는 11,000개의 수용체로, 및 RT112 방광 종양 세포주 (야생형 및 FGFR3-TACC3 융합 수용체)에서는 16,000개의 FGFR3 수용체로 존재한다 (표 5 참조). 미국에서 승인받은 두 접합체 중 하나로서, TDM1로도 알려져 있는 것인 캐드실라®는 전이성 유방 종양 중 평균 200만 개의 수용체에 달하는 HER-2를 표적화한다 (Lohrisch, et al., Seminars in Oncology, Vol 28, No 6, Suppl 18: 3-11 (2001)). 비록 FGFR3이 과다발현될 수는 있지만, FGFR3 단백질 발현량은 중간 정도이고, 고도로 과다발현되는 것으로 간주되는 예컨대, HER-2와 같은 다른 암 관련 단백질의 발현량과 비교하였을 때, 종양과 정상의 발현차는 그렇게 유의하지는 않다.
본원에 사용된, "접합체"라는 용어는 세포 결합 작용제 (예컨대, 항체 또는 그의 단편)에 연결된 약물 모이어티 또는 그의 유도체를 의미하고, 일반식: (D―L)n―R (여기서, D는 약물 모이어티이고, L은 링커이고, R은 항체 또는 항체 단편을 포함하는 세포 결합 작용제이고, n은 각 세포 결합 작용제에 부착된 약물 모이어티 및 링커의 개수를 식별하는 정수이다)에 의해 정의된다. 접합체는 또한 "면역접합체," "항체 약물 접합체" 또는 "ADC"로도 공지되어 있다.
본 발명의 접합체는 디술피드 결합을 통해 링커에 부착된 활성 메이탄시노이드 (DM4)와 절단가능한 링커 (술포-SPDB)에의 항FGFR3 항체 (항체 1) 상의 이용가능한 리신 잔기의 공유 부착에 의해 형성된 모노클로날 항체-메이탄시노이드 접합체이다.
접합체는 특이적 세포 집단을 표적화하고, 세포 내부에서 강력한 세포독성을 전달하도록 적합화된 화합물이다. 접합체는 투여되었을 때, 비정상 세포 내로 내재화될 때까지는 본질적으로 비독성이라는 점에서 전구약물로 간주될 수 있다.
접합체의 샘플에 대한 평균 적재량은 본원에서 DAR, 메이탄시노이드-대-항체 비 "MAR" 또는 "약물 로드"로서 지칭된다. 본원에 사용된, DAR이란 세포 결합 작용제 (예컨대, 항FGFR3 항체)에 연결 또는 부착된 약물 분자 (예컨대, 메이탄시노이드)의 개수를 의미한다. DAR은 특이적 접합체 분자에 대해 정확한 값을 가지지만 (예컨대, 화학식 I에서 n), 약물 대 항체의 비가 다른 상이한 접합체 분자의 존재에 기인하여, 많은 분자를 함유하는 샘플을 기술하는 데 사용될 때에는 대개 평균값이 될 것으로 이해된다. 한 측면에서, 세포 결합 작용제에 부착될 수 있는 약물 분자의 개수는 평균 약 1개 내지 약 10개일 수 있다. 본 발명의 한 측면에서, DAR은 평균 2 내지 8이다. 본 발명의 다른 측면에서, DAR은 평균 2 내지 5이다. 본 발명의 추가의 다른 측면에서, DAR은 평균 3 내지 5이다. 본 발명의 추가의 다른 측면에서, DAR은 평균 3 내지 4이다. 일부 측면에서, DAR이 '약 n'이라는 것은 DAR의 측정값이 n ± 0.5 범위 내에 포함되어 있음을 의미한다. 본 발명의 한 측면에서, DAR은 평균 3.5 ± 0.5이다. 접합체의 항종양 활성은 같은 세포 결합 작용제에 연결된 약물 개수가 더 적은 약물 로드와 비교하였을 때 더욱 효과적일 수 있으며, 연결된 약물의 개수를 증가시키면, 효능은 개선될 수 있지만, 대신 세포 결합 작용제에 대한 약동학적 특성은 변경될 수 있다. 접합에 사용되는 방법 및 DAR을 측정 및 계산하는 방법론 및 기술이 화합물의 DAR 값에 영향을 미칠 수 있다.
DAR의 일관성 및 재현성이 언급된 ADC에 대해 일관된 용량 및 약동학적 성질의 전달을 보장한다. 낮은 DAR는 세포독성 활성이 더 낮은 접합체를 발생시킬 수 있다. 그러나, 높은 DAR은 수용체에 대한 친화도, 수용체 결합 및 차단 활성 뿐만 아니라, 생체내에서의 접합체의 안정성에 영향을 줄 수 있다.
본원에 사용된, "독소"라는 용어는 세포의 성장 또는 증식에 역효과를 미침으로써 세포의 사멸을 유발하거나, 세포 사멸을 유도하거나, 또는 일부 방식으로 세포의 생존능력을 감소시킬 수 있는 임의의 물질이다. 본원에 사용된, "세포독소" 또는 "세포독성제"라는 용어는 세포질에서 활성화된 독소를 포함한다.
본원에 사용된, "약물 모이어티," "약물" 또는 "페이로드"라는 용어는 독소, 세포독소 또는 세포독성제를 포함한다. 약물 모이어티의 한 유형은 메이탄신 부류의 화합물을 포함한다.
본원에 사용된, "메이탄시노이드"라는 용어는 유사분열에서 세포의 증식을 억제시키는 세포독소인 미세관 표적화된 화합물을 포함한다. 이는 "DM4" (하기 화학식 II)로 알려져 있는, N2'-데아세틸-N-2'(4-메틸-4-메르캅토-1-옥소펜틸)-메이탄신을 포함한다:
<화학식 II>
Figure pct00004
메이탄시노이드는 종래의 암 화학요법제보다 100 내지 1,000배 더 큰 세포독성을 가지는 것으로 밝혀져 있다. 비록 고도로 유효하기는 하지만, 메이탄시노이드는 1상 임상에서 환자에게 전신 투여되었을 때 독성이 매우 큰 것으로 입증되었다. 그러나, 예컨대, 접합체와 같이 표적 치료의 일부로서 투여되었을 때, 메이탄시노이드의 고도한 세포독성 성질은 비정상적인 또는 손상된 세포로 직접적으로 전달되고, 이로써, 표적 또는 항원을 발현하지 않는 체내의 건강한 세포에 미치는 독성의 전신 효과를 완화된다. 이중의 이점을 가진다. 첫째, 더 큰 세포독성을 가짐으로써 세포 사멸의 효능은 증가되고, 세포 생존능력은 감소될 수 있다. 둘째, 더 큰 세포독성을 가짐으로써 더 낮은 투여량을 투여함으로써 세포에 대해 같은 결과를 초래할 수 있다. 이는 유해 사례 범위는 감소시키면서, 환자에게 더욱 강력한 효능의 치료 옵션을 제공한다.
본원에 사용된, "링커 모이어티" 또는 "링커"라는 용어는 세포 결합 작용제를 약물 모이어티에 연결하는 결합제로서의 역할을 하는 화학적 모이어티를 의미한다. 더욱 구체적으로, 링커 모이어티는 세포 결합 작용제를 약물 모이어티에 공유적으로 결합시키는 공유 결합 또는 원자를 포함한다. 링커는 페이로드가 암 세포 내에서 대사적으로 유리될 수 있도록 하고, 일부는 후속되는 대사상 의존적 방식의 방관자 세포 사멸을 촉진시키는 임의의 가교 화합물일 수 있다. 링커는 화합물 또는 항체는 활성인 상태 그대로 유지되는 조건에서 산 유도성 절단, 광 유도성 절단, 펩티다제 유도성 절단, 에스테라제 유도성 절단, 및 디술피드 결합 절단에 대해 감수성이거나, 또는 실질적으로 그에 대해 저항성일 수 있다.
예를 들어, 약물 모이어티는 디술피드 결합을 통해 세포 결합 작용제, 본 발명에서 접합체의 항FGFR3 항체인 항체 1에 연결된다. 링커 분자 또는 가교제는 리신 잔기 또는 세포 결합 작용제의 다른 잔기와 반응할 수 있는 반응성 화학기를 포함한다. 세포 결합 작용제와의 반응을 위한 반응성 화학기는 N-숙신이미딜 에스테르 및 N-술포숙신이미딜 에스테르일 수 있다. 추가로, 링커 분자는 약물 모이어티와 반응하여 디술피드 결합을 형성할 수 있는 디티오피리딜 기일 수 있는 반응성 화학기를 포함한다.
예를 들어, 세포 결합 작용제는 가교 시약으로 변형될 수 있고, 그렇게 유도된 유리 또는 보호된 티올 기를 함유하는 세포 결합 작용제는 이어서 디술피드 또는 티올 함유한 메이탄시노이드와 반응하여 접합체를 생성한다. 접합체는 HPLC, 크기 배제, 흡착, 이온 교환 및 친화도 포착 크로마토그래피를 포함하나, 이에 한정되지 않는 크로마토그래피, 투석 또는 접선 유동 여과에 의해 정제될 수 있다.
하기 화학식 III의 술포-SPDB 또는 sSPDB (이는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜디티오)-2-술포부타노에이트는 세포내 환원성 환경에 기인하여 접합체가 표적 세포 내부에서 절단될 수 있도록 허용하는 절단가능한 링커이다:
<화학식 III>
Figure pct00005
접합체의 대사적 프로세싱으로 DM4, 및 S-메틸-DM4가 생성된다고 가정해 볼 때, 절단가능한 링커로서 술포-SPDB는 유리 약물에 의한 증진된 방관자 세포 사멸을 허용한다. 본 발명에서, 접합체의 항체는 표면에 노출된 유리 리신 잔기를 통해 링커에 연결되고, 이는 결국 티오 기를 통해 접합체에 세포독소에 연결된다. 메이탄시노이드와 접합되었을 때, 하전된 대사산물은 감소된 소수성을 가지며, 이는 MDR 유출 펌프의 활성을 감소시킴으로써 MDR-1 특이적 다중약물 저항성 감소를 통하여 세포 사멸이 증가될 수 있는 기회를 제공한다.
본원에 사용된, "세포 결합 작용제에 연결된" 또는 "항FGFR3 항체 또는 단편에 연결된"이라는 표현은 접합체 분자가 적합한 연결 기, 또는 그의 전구체를 통하여 예컨대, 접합체 1의 항FGFR3 항체와 같은, 세포 결합 작용제에 결합된 1종 이상의 약물을 포함한다는 것을 의미한다.
그러나, 접합체에 대한 대사 경로는 표적 세포에 의한 내재화시 달라진다. 낮은 pH의 리소솜에서는 메이탄시노이드 접합체에 대해 세포 결합 성분의 빠른 분해가 일어나고, 이로써, 링커를 통하여 세포 결합 작용제의 한 아미노산 (리신 잔기)에 부착되어 있는 메이탄시노이드 약물로부터 대사 생성물이 유리된다. 디술피드 연결된 접합체, 예컨대, 술포-SPDB-DM4인 경우, 메이탄시노이드-변형된 리신 잔기에 대해 디술피드 환원이 일어나고, 이로써, 티올 함유 약물이 유리되고, 이어서, 가정컨대, 세포내 메틸트랜스퍼라제 효소에 의해 촉매화되는 메틸화가 일어남으로써 고도로 강력한 고도로 강력한 효능의 S-메틸-메이탄시노이드 (S-메틸-DM4)가 생성될 수 있거나, 또는 간단하게 변형되지 않은 메이탄신 (DM4)이 생성될 수 있다. 이러한 유리된 약물은 세포 밖으로 확산될 수 있고, 방관자 효과로 정의되고 기술된 효과를 통하여 이웃 세포의 생존능력을 감소시킬 수 있다. 대부분의 세포 표면 수용체에 대하여 표적 이질성이 관찰된다고 가정할 때, 종양 집단 중 모든 세포는 같은 정도로 항원을 발현할 수 없기 때문에, '방관자' 현상은 생체내 세포 사멸의 중요한 기전이 될 수 있다.
본원에 사용된, "항체"라는 용어는 디술피드 결합에 의해 상호 연결된 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)인, 4개의 폴리펩티드 쇄를 포함하는 면역글로불린 분자를 포함한다. 개별 쇄는 크기 (110-125개의 아미노산) 및 구조는 유사하지만, 기능은 상이한 도메인으로 폴딩될 수 있다. 항체는 본원에서 "Ab"로 약칭될 수 있다.
경쇄는 1개의 가변 도메인 (본원에서 VL로 약칭됨) 및/또는 1개의 불변 도메인 (본원에서 CL로 약칭됨)을 포함할 수 있다. 인간 항체 (면역글로불린)의 경쇄는 카파 (κ) 경쇄 또는 람다 (λ) 경쇄이다. 본원에 사용된, VL이라는 표현은 카파 유형 경쇄 (Vκ) 및 람다 유형 경쇄 (Vλ)로부터의 가변 영역 둘 모두를 포함하는 것으로 의도된다. 중쇄는 또한 1개의 가변 도메인 (본원에서 VH로 약칭됨), 및/또는 항체의 부류 또는 이소형에 따라 3개 또는 4개의 불변 도메인 (CH1, CH2, CH3 및 CH4) (본원에서 총칭하여 CH로 약칭됨)을 포함할 수 있다. 인간에서, 이소형은 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이고, 여기서 IgA 및 IgG는 서브부류 또는 서브타입 (IgA1-2 및 IgG1-4)으로 추가로 세분된다. 본 발명은 상기 언급된 부류 또는 서브부류 중 임의의 것의 항체를 포함한다. 본 발명의 접합체의 항체에 대해서는 인간 IgG1이 바람직한 이소형이다.
초가변 영역 또는 상보성 결정 영역 (CDR)으로 명명되는 3개의 영역이 VL 및 VH 각각에서 발견되며, 이들은 프레임워크 영역 (본원에서 FR로 약칭됨)으로 명명되는 가변성이 덜한 영역에 의해 지지된다. 아미노산은 카바트(Kabat) 관례 (Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991)), 코티아(Chothia) 관례 (Chothia, et al., J Mol Biol. 1987; 196: 901-917. Chothia, et al., Nature. 1989; 342: 877-883), 및/또는 옥스포드 몰레큘라스 AbM(Oxford Molecular's AbM) 항체 모델링 소프트웨어(http://www.bioinf.org.uk/abs/)에 따라 특정 CDR 영역 또는 도메인으로 할당된다. 각각의 VH 및 VL은 아미노 말단에서부터 카르복시 말단으로 방향으로 하기 순서: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. VL 및 VH 도메인으로 이루어진 항체의 일부분은 Fv (가변 단편)로 명시되고, 항원 결합 부위를 구성한다. 단일 쇄 Fv (scFv)는 한 도메인의 N 말단과 나머지 다른 도메인의 C 말단이 가요성 링커에 의해 연결된, 하나의 폴리펩티드 쇄 상에 VL 도메인 및 VH 도메인을 함유하는 항체 단편이다.
항체 1인, 본 발명의 접합체의 세포 결합 작용제는 람다 (λ) 경쇄를 가지는 모노클로날 항체이다. 접합체 1의 항체 구조는 최소의 입체 장애로 접합이 이루어질 수 있도록 허용하는 위치에 전형적인 개수인 대략 100개의 유리 리신 측쇄 잔기를 함유한다. 두 FGFR3의 스플라이스 형태 모두 (FGFR3(IIIb) 및 FGFR3(IIIc))에 대해 고도로 특이적이며, FGFR3에의 결합시 내재화된다. 그러나, 항체 1은 대부분의 항체보다 약간 낮은 등전점 (pI)을 가지는데, 이는 안정성 뿐만 아니라, 접합 공정에도 영향을 미칠 수 있다. 추가로, 항체 1은 FGFR3 수용체에의 결합시 수용체 분해를 유도하게 되는데, 이는 일반적으로 단점인 것으로 간주된다. 그의 pI가 더 낮고, 람다 경쇄를 가졌다는 점에서, 항체 1은 본 화합물에 독특한 도전 과제를 부여한다. 불안정성과 관련된 도전 과제에도 불구하고, 접합체는 놀라울 정도로 유효한 것으로 입증되었다.
"단리된"이라는 용어는 항체, 단백질, 펩티드 또는 핵산이 세포 환경에서 발견되는 다른 거대분자 종을 함유하지 않거나, 또는 실질적으로 함유하지 않는다는 것을 의미한다. 본원에 사용된, "실질적으로 함유하지 않는다"는 것은 관심 단백질 펩티드 또는 핵산이 존재하는 거대분자 종 중 (몰 기준으로) 80% 초과, 바람직하게, 90% 초과, 및 더욱 바람직하게는 95% 초과를 차지한다는 것을 의미한다. "단리된" 항체의 예로는 단리된 항체의 예로는 친화도 정제된 항체, 시험관 내에서 하이브리도마 또는 다른 세포주에 의해 제조된 항체, 또는 트랜스제닉 마우스로부터 유래된 인간 항체를 포함한다.
본원에 사용된, "네이키드 항체"라는 용어는 접합되지 않은 항체 물질을 의미한다.
본원에 사용된, "모노클로날 항체"라는 용어는 실질적으로 균질한 항체들의 집단으로부터 수득된 항체를 의미하고, 예컨대, 집단을 이루는 개별 항체들은 존재할 수 있는 가능한 천연 발생 돌연변이 또는 미량의 번역 후 변이를 제외하면, 실질적으로 동일하다. 모노클로날 항체는 단일의 항원성 부위 (결정기 또는 에피토프로 또한 알려짐)에 대해 지시되어 고도로 특이적이다. 추가로는, 전형적으로 상이한 결정기에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 통상의 (폴리클로날) 항체 제제와는 달리, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 지시된다. "모노클로날"이라는 수식어는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된다는 항체의 특성을 가리키는 것이며, 임의의 특정한 방법에 의한 항체 생산을 요구하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 모노클로날 항체는 본원에서 "mAb"로 약칭될 수 있다.
본원에 사용된, "인간 항체"라는 용어는 (문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에 기술된 바와 같이) 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열에 상응하는 가변 영역 및 불변 영역을 가지는 항체를 포함한다. 본 발명의 접합체의 인간 항체는, 예를 들어, CDR 내에, 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예컨대, 시험관내에서의 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내에서의 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 인간 항체에서, 1개 이상의 위치가 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 아미노산 잔기, 예컨대, 활성 증진 아미노산 잔기로 교체될 수 있다. 그러나, 본원에 사용된, "인간 항체"라는 용어는 또 다른 포유동물 종, 예컨대, 마우스의 생식세포계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 그래프트된 항체를 포함하도록 의도되지 않는다. 본원에 사용된, "인간 항체"를 제조하는 방법은 인간에서 생산되는 항체를 포함하도록 의도되지 않는다.
"재조합 인간 항체"라는 어구는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 인간 항체, 예컨대, 숙주 세포 내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체, 조합형의 재조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 인간 면역글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉한 동물로부터 단리된 항체, 또는 인간 면역글로불린 유전자 서열의 다른 DNA 서열로의 스플라이싱을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 상기와 같은 재조합 인간 항체는 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역 및 불변 영역을 가진다.
따라서, 본 발명에서 접합체의 항체는, 각각은 1개 이상의 CDR을 함유하는 것인, 단리된 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 재조합 인간 항체, 모노클로날 항체, 그의 특정 부분 및 변이체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
항체 또는 그의 단편의 특이성은 친화도에 기초하여 결정될 수 있다. 항원의 항체와의 해리에 대한 평형 상수 (KD)로 표시되는 친화도는 항원성 결정기와 항체 결합 부위 사이의 결합 강도를 나타내는 척도가 된다. 친화도는 예를 들어, 표면 플라스몬 공명에 의해 측정될 수 있다.
본 발명의 항체, 또는 그의 단편은 세포외 도메인 세그먼트 (이하, "도메인" 또는 "ECD"로 간단하게 지칭됨) 상에 위치하는 FGFR3의 에피토프에 결합한다. 본원에 사용된, "에피토프"라는 용어는 본 발명의 항체에 의해 인식되는, 항원 상의 별개의 3차원 부위를 의미한다.
본원에서 구체적으로 기술된 항체 이외에도, "실질적으로 동종성인" 변형된 다른 항체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있는 다양한 재조합 DNA 기술을 이용하여 쉽게 디자인되고, 제조될 수 있다. 예를 들어, 프레임워크 영역은 수개의 아미노산 치환, 말단 및 중간 부분의 부가 및 결실 등에 의해 1차 구조 수준에서 천연 서열과 다르게 변형될 수 있다. 또한, 본 발명에 포함된 인간화된 면역글로불린에 대한 기초로서 각종의 상이한 인간 프레임워크 영역이 단일로 또는 조합되어 사용될 수 있다. 일반적으로, 유전자 변형은 널리 공지된 각종의 기술, 예컨대, 부위 지정 돌연변이유발에 의해 쉽게 달성될 수 있다.
본 발명은 본원에 개시된 바와 같이, VH 영역 또는 그의 일부 중 어느 하나, 또는 VH CDR 중 어느 하나 (그의 임의의 변이체 포함)를 포함하는, 접합체 중쇄의 항FGFR3 항체 성분을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 본 발명의 접합체의 항체 성분은 항체 1의 동일한 CDR 영역, 및/또는 항체 1의 동일한 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 포함한다.
접합체 1의 항체는 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방법으로는 문헌 [Kohler and Milstein, Nature 256: 495-497 (1975)]; [Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 13 (Burdon et al. eds., Elsevier Science Publishers, Amsterdam) in Monoclonal Antibody Technology, The Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas (Campbell ed., 1984)]에 기술된 면역학적 방법; 뿐만 아니라, 문헌 [Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1989)]에 기술된 재조합 DNA 방법을 포함한다. 접합체 1의 항체는 또한 scFv 또는 항원 결합 단편 (Fab)의 형태로 VH 및 VL 도메인의 조합을 포함하는 라이브러리로부터 수득될 수 있다. VH 및 VL 도메인은 합성이거나, 부분적으로 합성이거나, 또는 천연적으로 유래된 뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다. 본 발명은 인간 항체 단편을 포함하는 파지 디스플레이 라이브러리에 의해 제조될 수 있다. 인간 항체의 다른 공급원은 인간 면역글로불린 유전자를 발현하도록 조작된 트랜스제닉 마우스이다.
단일 도메인 항체의 결합의 주된 결정인자인 아미노산 잔기는 카바트, 코티아, AbM, 또는 그의 조합에 의해 정의된 CDR 범위 내에 존재할 수 있지만, 이는 또한 다른 잔기, 예컨대, 다르게는 VH-VL 이종이량체의 VH-VL 경계에 매립되어 있는 잔기를 포함할 수 있다.
벡터의 형질전환 및 접합체 1의 항체의 발현을 위해 바람직한 숙주 세포는 포유동물 세포, 예컨대, NS0 세포 (비-분비 (0) 마우스 골수종 세포), 293, SP20 및 CHO 세포, 및 림프구 기원의 다른 세포주, 예컨대, 림프종, 골수종, 또는 하이브리도마 세포이다. 대안적으로, 다른 진핵생물 숙주, 예컨대, 효모가 사용될 수 있다.
항체는 황산암모늄 또는 황산나트륨에 의한 침전, 이어서, 염수에 대한 투석, 이온 교환 크로마토그래피, 친화도 또는 면역친화도 크로마토그래피 뿐만 아니라, 겔 여과 또는 구역 전기영동법을 비롯한, 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 단리 또는 정제될 수 있다. 접합체 1의 항체에 대해 바람직한 정제 방법은 단백질 A 친화도 크로마토그래피이다.
메이탄시노이드는 미국 특허 번호 7,432,088, 7,301,019, 7,598,375, RE39,151 및 7,411,063에 상세하게 기술되어 있는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는 기술에 의해 합성될 수 있다.
본 발명이 접합체는 관련 기술분야에 공지되어 있는 다양한 방법, 예컨대, 미국 특허 번호 7,811,572, 8,383,122, 6,441,163, 7,368,565, 7,811,572, 8,163,888, 및 미국 출원 공개 2011/0003969, 2011/0166319, 2012/0253021 및 2012/0259100에 기술되어 있는 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 접합체를 제조하는 대안적 방법은 항체를 30 mg/mL로 농축시키고, 10 투석 부피를 위해 반응 완충제 (50 mM EPPS, 20 mM 염화나트륨, 2 mM EDTA, pH 8.2)로 투여 여과하고, 45 g/L로 추가로 농축시킨다. 술포-SPDB (10 mM)에 상대적인 1.2 몰비의 DM4 (12 mM)는 167 mM EPPS, 66.7 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 8.2 및 70.0% (v/v) DMA 중 항체에 대해 상대적인 4.68 몰비의 술포-SPDB와 반응한다. 동소 반응을 20 ± 3℃에서 10 ± 4시간 동안 수행한 후, DMA와 함께 항체에 첨가하고, 50 mM EPPS, 20 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 8.2 ± 0.2, 및 5.0% DMA (v/v) 중 20 mg/mL의 항체 최종 농도를 달성한다. 접합 반응을 20.0 ± 3.0℃에서 16 ± 8시간 동안 수행한다. 반응 후, 6.5% (v/v)의 1 M 아세트산을 첨가하여 접합 혼합물의 pH를 5.0으로 빠르게 조정한다. pH 조정된 혼합물을 20 mg/mL로 농축시키고, 16 투석 부피를 위해 기초 제제 완충제 (10 mM 아세테이트, pH 5.0 ± 0.1)에 대해 투석 여과한다. 수크로스 (45%, w/v) 및 폴리소르베이트-20 (10%, w/v)으로 이루어진 진한 스톡 용액을 이용하여 정제된 접합체를 10 mM 아세테이트, 9% (w/v) 수크로스, 0.01% (w/v) 폴리소르베이트-20 (트윈-20), pH 5.0 중에서 5.0 mg/mL로 제제화한다.
항체 분자 1개당 결합된 메이탄시노이드 분자의 개수는 252 nm 및 280 nm에서의 흡광도의 비를 분광광도법에 의해 측정함으로써 결정될 수 있다. 질량 분석법을 통하여 모니터링되는 접합 공정을 재현가능하게 할 수 있다. 항체에 대한 메이탄시노이드 분자의 평균 개수는 예를 들어, 1 - 10, 2 - 8, 2 - 5, 3 - 5, 3 - 4, 또는 3.5 ± 0.5일 수 있다.
상업적으로 실현가능한 접합체 생성물을 제조하기 위해, 접합 공정 및 완충제 교환은 효율적이어야 한다. 접합체 1을 개발하는 동안, 화합물은 가용성에 관한 도전 과제를 가졌고, 보편적으로 사용되는 접합 완충제를 사용하였을 때에는 용액으로부터 침전되는 경향이 있는 것으로 밝혀졌다. 인자, 예컨대, 표면 순전하 및 등전점 (pI) (분자가 중성이거나, 순전하를 가지지 않는 지점)이 분자의 가용성을 변경시킬 수 있고, 안정성에 관한 문제를 일으켜 침전이 일어나게 할 수 있다. 다양한 방법을 사용하는 다수의 시도 결과, 응집체 및 침전을 포함한 접합된 물질이 생성되었다. 응집 및 침전의 용인 수준은 화합물 사용에 의존하며; 용인 수준은 대개 임상 시험 또는 상업적 제조용으로 의도되는 물질의 경우 더 낮다. 접합체 1의 어떤 특징, 또는 특징들이 상기와 같은 문제를 유발할 수 있는지에 대해서는 알려져 있지 않다. 접합체 1의 경우, 반응 pH 및 제제화 pH에서 항체 및 접합체의 가용성을 유지시키는 데 필요한 이온 강도의 차이에 기인하여 염기성 pH에서의 접합기 도전 과제가 된다는 것이 입증되었다. 구체적으로, 항체 1은 반응을 위해 사용된 염기성 pH에서의 낮은 이온 강도의 완충제 중에서 침전한 반면, 접합체 1은 접합체 제제화를 위해 사용된 산성 pH에서의 높은 이온 강도의 완충제 중에서 침전하였다. 접합 완충제는 항체 1의 염기성 pH 반응 완충제로의 완충제 교환이 이루어질 수 있도록 허용하기 위해 충분한 이온 강도를 필요로 하였지만, 접합체 1의 산성 pH 제제화 완충제로의 완충제 교환이 이루어질 수 있도록 허용할 수 있을 정더로 충분히 낮다. 대안적으로, 이온 강도를 필요한 수준으로 감소시키기 위해 반응 혼합물의 희석이 사용될 수 있다. 결국, 상당 수준의 조작 이후에, 접합체 1은 반응이 완료되어 용액으로부터 침전되지 않으면서, 안정성 유지를 위해 덜 바람직한 다른 첨가제 또는 기술은 필요로 하지 않는 안정적이고, 활성을 나타내는 화합물이 생성되도록 하기 위해서는 pH와 염 사이의 균형을 필요로 하였다는 것을 알 수 있었다.
메이탄신 페이로드로 구성된 접합체는 표적 매개 활성을 통해 및/또는 비특이적으로 시험관내에서 증식 세포를 억제 또는 사멸시킬 수 있는 그의 능력에 대하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 접합체의 비표적화된 세포독성 평가를 위해 세포주, 예컨대, NCI-H226, NCI-H292, 및 NCI-H322M이 쉽게 사용될 수 있다. 평가하고자 하는 세포를 4 내지 5일 동안 화합물에 노출시키고, 공지된 방법에 의해 직접 검정법으로 생존한 세포의 분율을 측정할 수 있다. 이어서, 상기 검정법의 결과로부터 IC50 값을 계산할 수 있다. 상이한 수준의 FGFR3 항원을 발현하는 세포주를 사용함으로써 접합체 1의 표적 매개 세포독성 활성 또한 평가할 수 있다.
일부 측면에서, 접합체는 하기에서 더욱 상세하게 정의되는 바와 같이 % T/C에 의해 측정된 바와 같이, 종양 부피를 감소시킬 수 있다.
본 발명은 또한 포유동물에게 유효 용량의 접합체를 투여함으로써 포유동물에서 종양 성장을 치료하는 방법 또한 제공한다. 본 발명에 따른 치료에 적합한 조건으로는 FGFR3을 차별적으로 발현하는 종양 세포를 포함한다. 어느 특정 기전으로 한정하고자 하지 않으면서, 본 방법은 예를 들어, 신생물성 성장, 골 전이, 기관 이식 거부 또는 면역 장애, 예컨대, 자가면역 장애가 FGFR3의 발현에 의해 구동되거나, 또는 그를 포함하는 것을 비롯한, 암 세포의 성장을 치료하는 것을 제공한다.
본 발명과 관련하여 "치료" 또는 "치료하다"라는 것은 질환 또는 장애와 관련된 근본적인 병태 또는 원치않는 생리학적 변화의 진행을 저속화, 완화 또는 역전시키거나, 또는 병태의 임상적 증상을 호전시키는 것을 비롯한, 치유적 치료를 의미한다. 유익한 또는 원하는 임상적 결과로는 증상의 경감, 질환 또는 장애 정도의 감소, 질환 또는 장애의 안정화 (즉, 질환 또는 장애가 악화되지 않는 경우), 질환 또는 장애의 진행 지연 또는 저속화, 질환 또는 장애의 호전 또는 일시적 완화, 및 검출가능 여부와 상관없이, 질환 또는 장애의 관해 (부분 관해 또는 완전 관해인지와는 상관없이)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 치료란, 치료를 받지 않은 경우에 예상되는 생존 기간과 비교하였을 때, 생존 기간의 연장도 또한 포함할 수 있다. 치료를 필요로 하는 대상은 질환을 이미 앓고 있는 대상을 포함한다. 한 측면에서, 본 발명은 의약으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에서, 치료학상 유효량의 본 발명의 접합체가 그를 필요로 하는 포유동물 또는 환자에게 투여된다. 추가로, 본 발명의 제약 조성물은 치료학상 유효량의 본 발명의 접합체를 포함할 수 있다. "치료학상 유효량" 또는 "유효 용량"이란, 필요한 기간 동안 및 투여량에서 원하는 치료 결과를 달성하는 데 효과적인 양을 의미한다. 접합체의 치료학상 유효량은 인자, 예컨대, 질환 상태, 개체의 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 원하는 반응을 유도할 수 있는 접합체의 능력에 따라 달라질 수 있다. 다른 인자로는 투여, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태, 환자가 인간인지 또는 동물인지 여부, 및 투여되는 다른 약물을 포함한다. 비록 본 발명의 화합물이 인간에게 투여하는 데 특히 유용하기는 하지만, 이 화합물은 다른 포유동물에게도 또한 투여될 수 있다. 본원에 사용된, 포유동물이라는 용어는 인간, 실험실용 동물, 가정용 애완 동물 및 농격용 가축을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것으로 의도된다. 치료학상 유효량은 또한 치료학상 유익한 효과가 접합체의 임의의 독성 또는 유해한 효과를 능가하는 것이다.
투여량 요법은 최적의 원하는 반응 (예컨대, 치료 반응)을 제공할 수 있도록 조정될 수 있다. 치료 투여량은 통상의 기술자에게 공지된 통상의 방법을 사용하여 안전성 및 효능을 최적화시키도록 적정될 수 있다. 정맥내 (i.v.) 또는 비-정맥내 투여, 국소화된 또는 전신, 또는 그의 조합인 경우, 투약 스케줄은 전형적으로 단일 볼루스 투여, 또는 연속 주입부터 1일 다회 투여 (예컨대, 매 4-6시간마다) 범위일 수 있거나, 치료하는 의사 및 환자의 병태의 지시에 따를 수 있다. 접합체 1의 치료학상 유효량에 대한 예시적인, 비제한적 범위는 0.1-50 mg/kg, 더욱 바람직하게, 3-35 mg/kg, 및 더욱 바람직하게 5-20 mg/kg이다. 투여량 및 투약 빈도는 환자를 치료하는 의사에 의해 결정될 것이며, 이는 매일, 매주 3회, 매주, 매 2주마다 1회, 또는 그보다 덜 자주 1 mg/kg 미만 내지 100 mg/kg 초과까지의 용량을 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명은 임의의 특정 용량으로 한정되지 않는다는 것에 주의하여야 한다.
접합체는 항혈관신생제, 화학요법제, 및 항신생물제를 포함하나, 이에 한정되지 않는 하나 이상의 다른 항암 치료제와 함께 조합되어 투여될 수 있다. 임의의 적합한 항암제, 예컨대, 화학요법제, 방사선, 항체 또는 그의 조합이 사용될 수 있다.
항암제로는 항신생물제, 항체, 아주반트, 및 전구약물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 현재 관련 기술분야에 공지되어 있거나, 또는 평가 중에 있는 항신생물제는 예를 들어, 유사분열 억제제, 알킬화제, 항대사물질, 삽입성 항생제, 성장 인자 억제제, 세포 주기 억제제, 효소, 토포이소머라제 억제제, 생존 억제제, 생물학적 반응 조절물질, 항호르몬제, 및 항혈관신생제를 비롯한, 다양한 부류로 분류될 수 있다. 알킬화제의 예로는 시스플라틴, 시클로포스파미드, 멜팔란, 및 다카르바진을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 항대사물질의 예로는 독소루비신, 다우노루비신, 파클리탁셀, 겜시타빈, 알림타(ALIMTA)®를 포함하나, 이에 한정되지 않고, 토포이소머라제 억제제로는 이리노테칸 (CPT-11), 아미노캄프토테신, 캄프토테신, DX-8951f, 토포테칸 (토포이소머라제 I), 에토포시드 (VP-16), 및 테니포시드 (VM-26) (토포이소머라제 II)를 포함한다. 항신생물제가 방사선일 때, 방사선 공급원은 치료받는 환자에게 외부 (외부 빔 방사선 요법 - EBRT) 또는 내부 (근접 치료 - BT)의 것일 수 있다. 투여되는 항신생물제의 용량은 투여되는 길항제의 용량 및 투약 빈도는 예를 들어, 작용제 유형, 치료되는 종양의 유형 및 중증도, 및 작용제의 투여 경로를 비롯한 다수의 인자에 의존한다. 그러나, 본 발명은 임의의 특정 용량 또는 투약 요법으로 한정되지 않는다는 것이 강조되어야 한다. 한 측면에서, 시스플라틴이 본 발명의 바람직한 항신생물제이다.
본 발명의 접합체는 또한 종양 성장 또는 혈관신생에 관여하는 다른 세포 표면 수용체를 억제시키고/거나, 조절하는 항체 및/또는 소분자 억제제와 함께 투여될 수 있다. 접합체는 또한 하나 이상의 적합한 아주반트, 예컨대, 시토카인 (IL-10, IL-4 및 IL-13) 또는 다른 면역 조절 인자, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 케모카인, 종양 관련 항원, 및 펩티드와 함께 조합되어 투여될 수 있다.
본 발명에서, 임의의 적합한 방법 또는 경로를 사용하여 본 발명의 접합체를 투여할 수 있고, 임의적으로, 다른 수용체의 항신생물제 및/또는 길항제를 투여할 수 있다. 본 발명의 조합 요법에서, 접합체는 시스플라틴을 포함하나, 이에 한정되지 않는 또 다른 작용제와 함께 동시에, 별개로 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 항신생물제 요법은 환자의 신생물성 병태의 치료에 최적으로 적합한 것으로 간주되는 임의의 요법을 포함한다. 다른 악성 종양은 특이적인 항종양 접합체 및 특이적인 항신생물제의 사용을 요구할 수 있고, 이는 환자마다 다른 것에 기초하여 결정될 것이다. 투여 경로는 예를 들어, 경구, 정맥내, 복강내, 피하, 또는 근육내 투여를 포함한다. 투여되는 길항제의 용량 및 투약 빈도는 예를 들어, 길항제 유형, 치료되는 종양의 유형 및 중증도, 및 길항제의 투여 경로를 비롯한 다수의 인자에 의존한다. 그러나, 본 발명은 임의의 특정 투여 방법 또는 경로로 한정되지 않는다는 것이 강조되어야 한다.
본 발명의 접합체는 치료 목적으로 포유동물에서 사용될 때에는 바람직하게는 제약 조성물로서 제제화된다. 상기 제약 조성물 및 상기 조성물을 제조하는 공정은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예컨대, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Gennaro A., et al., eds., 19th ed., Mack Publishing Co., 1995)]를 참조할 수 있다.
환자에서의 FGFR3의 발현 수준을 FGFR3의 역치 발현 수준과 비교할 수 있다. 상기 역치 수준은 암을 앓는 동물 모델, 환자 종양에 관한 마이크로어레이 데이터 또는 대조군 환자 집단을 비롯한 대조군 집단에서 관찰된 수준을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 다양한 공급원으로부터 얻을 수 있다.
FGFR3 발현 수준은 상업적으로 이용가능한 키트를 비롯한, 다양한 방법으로 측정될 수 있다. FGFR3 발현 수준을 측정하는 것은 단백질 또는 mRNA를 측정하는 것을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기와 같은 한 기술에서, FGFR3이 항체에 결합할 수 있도록 허용하기 위해 인간 FGFR3 ECD에 대한 항체로 미리 코팅된 플레이트에 FGFR3 표준 또는 샘플을 첨가한다. 비결합 FGFR3 및 다른 단백질을 세척한 후, FGFR3 ECD를 인식하는, 양고추냉이 퍼옥시다제로 표지된 항FGFR3 항체를 첨가한다. 기질이 상기 웰에 첨가되었을 때, 양고추냉이 퍼옥시다제에 커플링된 2차 항체는 청색빛 색을 발산한다. 색상 강도는 특이적으로 플레이트에 결합된 FGFR3의 정량과 상관 관계가 있다.
종양 조직 또는 세포 중의 FGFR3을 측정하는 데 사용되는 상기와 같은 제2의 기술에서는 면역조직화학적 염색을 위해, 미리 정의된 수준으로 FGFR3을 안정하게 발현하도록 조작된 세포로부터 생성된 표준, FGFR3에 대해 음성인 세포, 및/또는 포유동물 또는 환자 샘플을 준비한다. 조직 또는 세포를 포르말린 고정된 파라핀에 포매시킨다. 고정된 조직을 면역조직화학적 염색을 위해 슬라이드 위에 준비한다. 슬라이드를 인간 FGFR3에 대한 1차 항체와 함께 인큐베이션시킨다. 비결합 항체를 세척하여 제거한 후, 1차 항체에 결합하고, 양고추냉이 퍼옥시다제로 표지된 2차 항체를 슬라이드 위에서 인큐베이션시킨다. 기질이 상기 슬라이드에 첨가되었을 때, 양고추냉이 퍼옥시다제에 커플링된 2차 항체는 청색빛 색을 발산한다. 색상 강도는 조직 슬라이드에서 발견되는 FGFR3의 정량과 상관 관계가 있다.
전체 FGFR3-TACC3 융합물 수준을 유사한 방식으로 측정할 수 있다. FGFR3-TACC3이 항체에 결합할 수 있도록 허용하기 위해 인간 FGFR3 ECD에 대한 항체로 미리 코팅된 플레이트에 FGFR3-TACC3 표준 또는 샘플을 첨가한다. 비결합 FGFR3-TACC3 및 다른 단백질을 세척한 후, FGFR3 단백질로 전위된 TACC3 단백질 도메인을 인식하는 2차 항체를 첨가한다. 기질이 상기 웰에 첨가되었을 때, 양고추냉이 퍼옥시다제에 커플링된 2차 항체는 청색빛 색을 발산한다. 색상 강도는 플레이트에서 발견되는 FGFR3-TACC3의 정량과 상관 관계가 있다.
환자의 FGFR3 돌연변이의 상태를 확인하는 것은 상업적으로 이용가능한 키트를 비롯한, 다양한 방법으로 측정될 수 있다. 상기와 같은 한 기술에서, 세포 또는 조직 샘플을 용해시키고, DNA를 단리시킨다. 단리된 DNA를 70% 에탄올로 세척하고, 건조시키고, 물 중에 재현탁시킨다. 이어서, 특이적으로 관심 돌연변이를 포함하는 것으로 공지된 FGFR3 유전자의 영역을 증폭시키도록 디자인된 프라이머와 함께 DNA 샘플을 PCR 반응에 놓는다. 생성된 PCR 생성물을 정제하고, 서열분석한다. FGFR3은 또한 차세대 서열분석, 실시간 PCR 또는 다른 검출 또는 게놈 방법을 통해 확인될 수 있다.
FGFR3-TACC3 융합물 상태를 확인하는 것은 상업적으로 이용가능한 키트를 비롯한, 다양한 방법으로 측정될 수 있다. 상기와 같은 한 기술에서, 세포 또는 조직 샘플을 용해시키고, 전체 RNA를 단리시킨다. 이어서, 단리된 전체 RNA를 이용하여 cDNA를 합성한다. 이어서, FGFR3-TACC3 융합물 서열을 함유하는 영역을 증폭시키도록 디자인된 특이적인 PCR 프라이머를 PCR 반응에서 cDNA와 함께 사용한다. 이어서, PCR 생성물을 분리시키는 데 사용되는 겔 상에서 PCR 반응을 수행한다. 상기 융합물을 포함하는 형질감염된 세포주로부터 생성된 표준을 이용하여 겔을 전개시킨다. FGFR3-TACC3 융합물은 또한 표준 실시간 PCR 및 형광 동소 하이브리드화 (FISH) 검정법을 이용하여 검출될 수 있다.
FGFR3의 발현 수준, FGFR3의 돌연변이, FGFR3의 융합물, 또는 그의 조합에 관한 측정 또는 검출은 동시에, 별개로 또는 순차적으로 완료될 수 있다. 측정 또는 검출은 다중모드의 고처리량 PCR을 비롯한, 다양한 기법을 이용하여 이루어질 수 있다.
본 발명은 또한 치료학상 유효량의 접합체를 포함하는, 종양 성장 및/또는 혈관신생을 억제시키기 위한 키트를 포함한다. 키트는 접합체, 및 시스플라틴을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 항신생물제 또는 치료를 비롯한 추가의 항암제를 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 키트는 예를 들어, EGFR을 비롯한, 하기에서 논의되는 종양형성 또는 혈관신생에 관여하는 또 다른 성장 인자 수용체의 임의의 적합한 길항제를 함유할 수 있다. 본 발명의 키트는 아주반트를 추가로 포함할 수 있다.
따라서, 접합체 1은 관련 기술분야에 널리 공지된 연구, 진단 또는 치료 방법을 위해 생체내 및 시험관내에서 사용될 수 있다. 통상의 기술자에 의해 본원에 개시된 본 발명의 원리에 대한 변형이 이루어질 수 있으며, 상기와 같은 변형은 본 발명의 범주 내에 포함되어야 하는 것으로 의도된다.
통상의 기술자에 의해 본원에 개시된 본 발명의 원리에 대한 변형이 이루어질 수 있다는 것을 이해하고, 예상하여야 하고, 상기와 같은 변형은 본 발명의 범주 내에 포함되어야 하는 것으로 의도된다.
실시예
하기의 실시예들은 본 발명을 추가로 설명하지만, 어느 방식으로든 본 발명의 범주를 한정하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 종래 방법, 예컨대, 벡터 및 플라스미드의 구축, 상기 벡터 및 플라스미드 내로의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 삽입, 숙주 세포 내로의 플라스미드의 도입, 및 유전자 및 유전자 생성물의 발현 및 그의 결정에서 사용되는 방법에 관한 상세한 설명은 문헌 [Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] 및 [Coligan, J. et al. Current Protocols in Immunology, Wiley & Sons, Incorporated (2007)]을 비롯한, 다수의 공개 문헌으로부터 얻을 수 있다.
접합체 1을 위한 인간 항FGFR3 항체의 발현 및 정제
각 항체를 위해, 적합한 방법, 예컨대, PCR 클로닝에 의해 적합한 중쇄 뉴글레오티드 서열, 예를 들어, 항체 1을 위한 서열 12를 적합한 발현 플라스미드, 예를 들어, pGSHC로 조작하고, 적합한 경쇄 뉴글레오티드 서열, 예를 들어, 항체 1을 위한 서열 13을 적합한 발현 플라스미드, 예컨대, pGSLC로 조작하였다. 안정한 세포주를 확립하기 위해, 적합한 숙주 세포주, 예컨대, NS0 또는 CHO 세포에서 전기천공에 의해 선형화된 중쇄 및 경쇄 플라스미드로 공형질감염시키고, 예컨대, 투석된 우태아 혈청 및 글루타민 신테타제 보충제를 포함하는 글루타민 무함유 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium)에서 배양하였다. 효소 결합 면역흡착 검정법 (ELISA)에 의해 클론을 항체 발현에 대하여 스크리닝하고, 스피너 플라스크에서 배양하기 위해 최고 생산자를 선택하였다. 적합한 방법, 예컨대, 단백질-A 친화도 크로마토그래피에 의해 항체를 정제하였다.
하기 표 1은 본 발명의 접합체 1의 항체 1의 아미노산 서열 및 서열 번호를 제공한다. 모든 CDR 서열은 AbM 정의를 사용하여 결정된 것이다.
<표 1>
본 발명의 접합체 1의 항체 1의 아미노산 서열
Figure pct00006
접합체 1의 접합 방법
관련 기술분야에 공지된 다양한 방법, 예컨대, 미국 특허 번호 7,811,572, 8,383,122, 6,441,163, 7,368,565, 8,163,888, 및 미국 출원 공개 번호 2011/0003969, 2011/0166319, 2012/0253021 및 2012/0259100에 기술된 방법에 의해 본 발명의 접합체를 제조할 수 있다. 상기 개시된 방법은 생성되는 수율의 양, 순도, 단량체, 응집체, 유리 메이탄시노이드 비율(%), 단편화 등에서 달라질 수 있다. 적절한 접합 방법을 선택하는 것은 최종 사용자의 요구 사항에 의존한다.
본 발명의 한 측면에서, "1단계" 공정을 위해, 2012/0253021에 기재된 일반 방법을 사용하여 항체 1을 술포-SPDB 링커를 이용하여 DM4에 접합시켰다. 더욱 구체적으로, 항체 1을 10 mg/mL로 농축시키고, 반응 완충제 내로 투석 여과하였다. 9% DMA (v/v)로 보충된, 50 mM 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진프로판술폰산 (EPPS), 20 mM 염화나트륨, 2 mM EDTA (pH 8.2)를 포함하는 완충제 중에서 10 mg/mL의 항체 1을 항체에 비례하여 5.6몰의 DM4와 혼합하였다. 5.1몰의 술포-SPDB를 첨가하여 상기 혼합물 중에서 항체 1을 접합시키고, 15℃에서 20시간 동안 반응시켰다. 아세트산을 이용하여 접합 혼합물의 pH를 5.0으로 조정하고, 20 mg/mL로 농축시키고, pH 5.0의 10 mM 아세트산나트륨을 함유하는 12 투석 부피의 완충제에 대하여 투석시켰다. 10 mM 아세테이트, 9% 수크로스 (w/v), 0.01% (w/v) 폴리소르베이트 20 (pH 5.0)을 함유하는 완충제 중 5.0 mg/mL로 접합체를 제제화하였다.
접합체 1의 DAR에 관한 UV 결정
상기와 같이 제조된 접합체 1 물질을 이용하여 자외선 흡수를 사용함으로써 접합체 1 중의 DM4 대 항체 1의 DAR을 평가하였다.
252 nm 및 280 nm에서의 접합체의 흡광도를 측정함으로써 DAR을 계산하였다. 상기 파장에서의 DM4 및 항체, 둘 모두에 대한 흡광 계수를 이용하여, 용액 중 전체 DM4 및 항체의 농도를 측정하였다. DAR은 DM4의 몰/항체의 몰의 비로 정의된다.
베크만 쿨터(Beckman Coulter)® DU800 분광광도계를 이용하여 1 cm 경로 길이 석영 큐벳 중에서 280 nm 및 252 nm에서의 접합체 용액의 흡광도를 측정함으로써 샘플 농도를 결정하였다. 비-흡수 영역 (320 nm)에서의 측정치를 기록함으로써 광 산란이 표적 파장에서의 흡광도 판독에 영향을 미치지 않는다는 것을 확인하였다. 280 nm 흡광도 결과가 장치의 선형 범위에 있을 수 있도록 (흡광도 표적 0.7-1.5 (또는 0.5 내지 0.9 g/L)) 샘플을 완충제로 희석시키고, 농도 계산에서 적절한 희석률을 사용하였다. 하기 방정식에 의해 농도를 결정하였다:
방정식 (1) DM4의 몰 농도, CDM4(M):
Figure pct00007
방정식 (2) 접합체 1의 몰 농도, CA(M):
Figure pct00008
방정식 (3) 접합체 1의 농도, CA(mg/mL):
Figure pct00009
방정식 (4) 메이탄시노이드 대 항체의 비, DAR:
Figure pct00010
약어:
CDM4: DM4의 농도
CA: 항체 1의 농도
DAR: 메이탄시노이드 대 항체의 비
A280: 280 nm에서의 흡광도
A252: 252 nm에서의 흡광도
ε280: 280 nm에서의 흡광 계수
ε252: 252 nm에서의 흡광 계수
DM4에 대한 상수:
εDM4 , 252: 26010 M-1cm-1
εDM4 , 280: 5323 M-1cm-1
흡광 계수 비 252 nm/280 nm, ε252/ε280: 4.89
분자량: 780.4 g/mol
D11 항체에 대한 상수:
εA,280: 1.7 mL/(mg*cm) 또는 240,360 M-1cm-1
흡광 계수 비 252 nm/280 nm, ε252/ε280: 0.35
분자량: 145.6 kDa
방정식 1은 252 nm에서의 항체에 기인한 흡광도를 감산함으로써 용액 중 DM4의 농도를 결정하였다. 방정식 2는 DM4에 기인한 흡광도를 감산함으로써 항체의 농도를 결정하였다. DAR은 DM4 농도 및 항체 농도의 비를 계산함으로써 결정되었다 (방정식 4).　
15% (v/v) 이소프로판올로 보충된, 170 mM 인산칼륨, 212 mM 염화칼륨 (pH 7.0)을 이용하여 등용매 모드로 크기 배제 HPLC에 의해 단량체를 결정하였다. 접합체 150 ㎍을 주입하였다. 280 nm에서 용리를 모니터링하였다. 주요 피크 앞에서 용리된 피크 모두의 면적의 총합으로서 응집체를 계산하였다. 주요 피크 뒤에서 용리된 모든 분해된 피크의 면적의 총합으로서 저분자량 종을 계산하였다.
이중 칼럼 SEC/역상 HPLC에 의해 유리 메이탄시노이드 수준을 측정하였다. 20% 아세토니트릴을 이용하여 접합체 용액을 제조하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션시키고, 분석하기 전 5℃에서 보관하였다. 접합체를 크기 배제 칼럼 (SEC) 상에 주입하고, 여기서 칼럼을 통해 접합된 항체를 세척하였다. 일단 접합체가 용리되고 나면, 칼럼 용출액을 C-18 칼럼으로 다시 보내고, 여기서 남은 소분자는 결합하게 되며, 이를 35분 동안에 걸쳐 구배 프로그램 (0.1% TFA를 포함하는 20% 아세토니트릴/0.1% TFA를 포함하는 80% 물)에 의해 용리시켰다. 피크 면적을 합산하였다. 표준 곡선으로부터 기울기를 사용하여 DM4 함량을 결정하였다. 유리 메이탄시노이드의 비율(%)은 (UV DAR에 의해 결정된) 전체 DM4의 몰에 대한 (상기 이중 칼럼 HPLC 방법에 의해 결정된) 유리 DM4의 몰의 비에 100을 곱한 값이다.
<표 2>
Figure pct00011
접합체 1의 대표적인 로트의 DAR은 3.5 ± 0.5였다.
표면 플라스몬 공명 검정법 ( 비아코어 ( Biacore )®)에 의한 인간 FGFR3에의 결합 동역학적 성질 및 친화도 분석
전개 완충제, 및 25℃로 설정된 분석 온도로 준비된 비아코어® T200 장치에서의 표면 플라스몬 공명 검정법을 이용하여 FGFR3의 스플라이스 형태인 인간 FGFR3(IIIb)에 대한 결합 친화도 및 결합 화학량론적 양을 결정하였다. 2개의 유동 셀 상에 (표준 NHS-EDC 아민 커플링을 사용하여 생성된) 고정된 수용체 huFGFR3(IIIb)을 함유하는 CM5 칩을 이용하였다. 60 nM을 시작으로 전개 완충제에 2배씩 연속으로 희석하여 총 6개의 희석액을 만듦으로써 접합체 1의 샘플을 제조하였다. 2.5 ㎍/mL (55 RU)로 수용체를 고정시켰다. 각 분석 사이클은 (1) 접촉 시간을 180 sec로 하여 30 ㎕/min으로 샘플 주입, (2) 30 ㎕/min으로 900 sec 동안 완충제를 주입하여 해리, (3) 유속 40 ㎕/min으로 접촉 시간을 30 sec로 하여 0.5% SDS 용액 중에서 재생으로 이루어졌다. 표준 이중 참조를 사용하여 데이터를 프로세싱하고, 비아코어® 2000 이벨류에이션(Biacore® 2000 Evaluation) 소프트웨어, 버전 4.1을 이용하여 1:1 결합 모델로 피팅하여 회합 속도 (k온, M-1s-1 단위), 해리 속도 (k오프, s-1 단위), 및 R최대 (RU 단위)를 결정하였다. 평형 해리 상수 (KD)는 KD = k오프/k온의 관계식으로부터 계산된다. KD는 몰 단위이다.
항체 1의 KD는 1.3 x 10-10 M이었다. 접합체 1은 평균 회합 속도 (k온) = (2.27 ± 0.001) x 105 및 회합 속도 (k오프) = (1.87 ± 0.13) x 10-4로 huFGFR3(IIIb)에 결합하였다. 표 1에는 n=3의 독립 실험으로부터 얻은 실험 결과 (계산된 표준 편차 포함)를 요약한 것이 제시되어 있다. 접합체 1은 생리학적 pH 및 이온 강도하에 KD = (8.23 ± 0.59) x 10-10 M으로 huFGFR3(IIIb)에 결합하였다.
<표 3>
Figure pct00012
따라서, 접합은 접합되지 않은, 네이키드 항체의 리간드 결합 관능성을 변경시키지 않았다.
효소 결합 면역흡착 (ELISA) 검정법
인간 FGFR3(IIIb)에의 FGF1 리간드 결합을 차단하는 접합체 1
표준 96 웰 멀티-어레이(Multi-Array)® 플레이트 (메조 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery)® (MSD®) #L15XA-6)를 100 ng/웰의 인간 FGFR3(IIIb)-Fc (5 ㎕/웰의 20 ㎍/mL PBS 중의 용액)으로 스폿 코팅하고, 덮고, 실온에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 웰에서 비특이적 결합을 차단하기 위해, 150 ㎕의 5% MSD® 블록커 A(Blocker A) (R93BA-1)를 각 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 별개의 96 웰 ELISA 플레이트에서, PBS, 0.05% 트윈(Tween)® 20 (PBS-T), 1% BSA 중에서 1 ㎍/mL를 시작으로 시험 물품을 1:3의 일련의 희석액을 제조하였다. 상기 차단제를 버리고, 30 ㎕/웰의 상기 희석액을 코팅되고, 차단된 MSD® 플레이트의 적절한 웰로 옮기고, 실온에서 1시간 동안 완만하게 교반시켰다. 플레이트를 경사 분리하고, 200 ㎕/웰 PBS-T로 2회에 걸쳐 세척하였다. 30 ㎕/웰의 PBS-T, 1% BSA, 10 ㎍/mL 헤파린 (시그마(Sigma) 카탈로그 번호 H3149-50KU) 중 루테늄 표지된 FGF1의 1 ㎍/mL를 플레이트에 첨가하고, 암실에서 실온에서 1시간 동안 완만하게 교반시켰다. 플레이트를 경사 분리하고, 200 ㎕/웰 PBS-T로 2회에 걸쳐 세척하였다. 세척한 후, 150 ㎕의 1X MSD® 리드 버퍼(Read Buffer) (MSD®, #R92TC-2)를 각 웰에 첨가하였다. 전기화학적 자극시, FGF-1에 결합된 루테늄 표지는 620 nm에서 발광 빛을 방출하였다. 섹터® 이미저(SECTOR® Imager) 2400 플레이트 판독기 (MSD®, #1250)에서 전하 결합 소자 카메라에 의해 ECL 신호를 검출하였다. 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)® 소프트웨어 버전 6.0에서, 상대 발광 단위 (RLU)로 측정된 전기화학발광을 플롯팅하였다. 소프트웨어의 로그 [억제제] 대 반응 함수를 이용하여 비선형 회귀 곡선 피트에 의해 IC50 값을 계산하였다.
접합체 1은 IC50 = 3.6 nM으로 FGF1의 FGFR3에의 결합을 차단하며, 이는 접합체 1이 FGFR3 결합 이외에도 FGFR3에의 동족 (FGF1) 리간드 결합을 차단한다는 점에서 차단하는 작용도 한다는 점을 지지한다.
FGFR3에의 FGF1 및 FGF9 결합을 차단하는 항체 1
돌연변이, 융합물 및 야생형 (WT)을 비롯한, 다양한 형태의 FGFR3을 포함하는 세포주의 리간드 유도성 증식을 중화시킬 수 있는, 접합체 1의 항체 성분인 항체 1의 능력을 평가하였다.
BaF3은 생존을 위하여 마우스 IL-3에 의존하는 마우스 프로-B 세포주이다. 수용체가 BaF3 세포 내로 도입되면, 이는 외인성 IL-3을 필요로 하지 않으면서, 수용체 리간드에 대한 반응으로 증식될 수 있다.
야생형 또는 돌연변이체 인간 FGFR3을 발현하는 BaF3 세포주를 레트로바이러스 형질도입에 의해 제조하였다. 각 세포주는 퓨로마이신 저항성의 안정적인 풀이다. 세포주를 (마우스 IL-3 및 퓨로마이신을 함유하는) BaF3 배양 배지 중에 20,000 내지 1,000,000개의 세포/mL의 세포 밀도로 유지시키고, 매 1-4일마다 새 배양 배지로 희석시켰다. 검정 1 내지 3일 전 3H 티미딘 혼입 검정법에서 사용되는 BaF3+FGFR3 세포를 20 내지 50,000개의 세포/mL로 희석하였다. 본 검정의 경우, 세포 배양 밀도는 100,000 내지 1,000,000개의 세포/mL였다. 먼저, BaF3+FGFR(III3b) WT, +FGFR3(IIIc) WT 세포에서 3H 티미딘 혼입의 용량 의존적 자극에 관하여 FGF-1 (산성 FGF) 및/또는 FGF-9를 시험하고, BaF3+MSCV 공 벡터 대조군 세포와 비교하였다. BaF3 세포주를 1,000 rpm으로 RT에서 3분 동안 원심분리하고, 20 mL BaF3 검정 배지로 3회에 걸쳐 세척하였다 (매회 세척 후에는 동일한 방식으로 원심분리하였다). 100 ㎕의 BaF3+FGFR3(IIIb) WT, +FGFR3(IIIc) WT, 또는 + 공 벡터 세포주를 200,000개의 세포/mL 또는 800,000개의 세포/mL (20,000 또는 80,000개의 세포/웰)로 96 웰 조직 배양 플레이트 (BD 팔콘(BD Falcon)™ 번호 35-3072)의 내부 60개의 웰에 첨가하였다. 50 ㎕의 4X 헤파린 (최종 농도 5 또는 10 ㎍/mL) (또는 검정 배지)을 웰에 첨가하였다. (폴리프로필렌 플레이트 중의) 검정 배지 중에서 FGF-1 또는 FGF-9 (1:2-1:5)를 연속으로 희석하였다. 50 ㎕의 4X FGF-1, 4X FGF-9, 또는 검정 배지만을 단독으로 웰에 (3중으로) 첨가하였다. 250 ㎕의 검정 배지 또는 둘베코 PBS를 가장자리 웰에 첨가하여 증발을 감소시켰다. 37℃, 5% CO2 및 95% RH에서 72시간 동안 세포를 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 마지막 6시간 동안 웰당 20 ㎕의, D-PBS 중의 0.1 mCi/mL 티미딘-[메틸-3H] (MP 바이오메디칼즈(MP Biomedicals) 번호 2406605)를 첨가하였다. 검정 플레이트를 -80℃에서 냉동시키고, 37℃에서 해동시키고, 필터메이트™ 하비스터(Filtermate™ Harvester) (패커드(Packard))를 이용하여 유니필터-96(UniFilter-96), GF/C 플레이트 (퍼킨 엘머(Perkin Elmer) 번호 6005174) 상에서 수거하였다. 유니필터 플레이트를 건조시키고, 웰당 20 ㎕의, 마이크로신트-0(Microscint-0) 신털런트(scintillant) (퍼킨 엘머 번호 6013611)를 첨가하였다. 1450-021 마이크로베타(Microbeta) 액체 섬광 계수기 (왈락(Wallac)) 상에서 웰당 1분 동안 필터 플레이트 상의 혼입된 3H 티미딘을 계수하였다. 야생형 FGFR3 또는 돌연변이체 FGFR3에 대한 FGF-1 또는 FGF-9 활성 중화에 대하여 항체 1을 평가하기 위해 일정량의 인간 FGF-1 또는 인간 FGF-9를 사용하였다 (FGF-1: FGFR3(IIIc)을 발현하는 세포 상에서 80 ng/mL, FGFR3(IIIb)을 발현하는 세포 상에서 800 ng/mL; FGF-9: FGFR3(IIIc)을 발현하는 세포 상에서 100 ng/mL, FGFR3(IIIb)을 발현하는 세포 상에서 800 ng/mL). 검정 배지 단독인 것과 비교하였을 때, 이러한 FGF-1 또는 FGF-9 농도가 3H-티미딘 혼입을 2배 이상 증가시켰다. 농도 값을 ㎍/mL에서 nM으로 전환하기 위해, 하기 공식을 사용하였다:
농도 (㎍/mL) x 전환 계수 = 농도 (nM) (여기서, 전환 계수는 MW (분자량)와 반비례하고; 모노클로날 항체의 경우, MW가 150 kD라고 가정할 때, 전환 계수는 6.667이다. FGF-1의 경우: 분자량 = 15.5 kD일 때에는 따라서, 전환 계수는 64.45이다. FGF-9의 경우: 분자량 = 23 kD일 때에는 따라서, 전환 계수는 43이다).
BaF3 세포주 (퓨로마이신 저항성을 획득한 후의 2 내지 8 계대)를 1,000 rpm으로 RT에서 3분 동안 원심분리하고, 20 mL BaF3 검정 배지로 3회에 걸쳐 세척하였다. 50 ㎕의, FGFR3(IIIb) WT, FGFR3(IIIc) WT, FGFR3(IIIb) 돌연변이체 또는 FGFR3(IIIc) 돌연변이체를 발현하는 BaF3 세포를 400,000개의 세포/mL (20,000개의 세포/웰)로 96 웰 조직 배양 플레이트 (BD 팔콘™)의 내부 60개의 웰에 첨가하였다. 별개의 희석 플레이트 (폴리프로필렌)에서, 항체 1 또는 인간 IgG1 이소형 대조군 항체 (최고 작업 농도의 4X로)를 검정 배지 중에서 희석하였다. 검정 배지 중에서 항체를 추가로 연속으로 희석하였다 (1:3). BaF3 세포를 함유하는 웰에 50 ㎕의, 각 시험 농도의 항체를 첨가하였다. 처리당 3중 웰을 사용하여 시험하였다. "배지 단독" 및 "FGF 단독"인 대조군인 경우, 항체 대신으로, 50 ㎕의 검정 배지를 첨가하였다. 헤파린 및 FGF를 첨가하기 전에 37℃, 95% RH, 5% CO2에서 45분 동안 세포 및 항체 혼합물을 함유하는 플레이트를 인큐베이션시켰다. 50 ㎕의 4X 헤파린 (최종 농도 10 ㎍/mL)을 모든 웰에 첨가하였다. 50 ㎕의 4X FGF-1 또는 4X FGF-9 (검정 배지 중에서 희석된 것), 또는 검정 배지만 단독으로 웰에 첨가하였다 (3중으로). 250 ㎕의 검정 배지를 가장자리 웰에 첨가하여 증발을 감소시켰다. 37℃, 5% CO2 및 95% RH에서 72시간 (FGFR3(IIIc) WT 또는 돌연변이체를 발현하는 세포의 경우) 내지 96시간 동안 (FGFR3(IIIb) WT 또는 돌연변이체를 발현하는 세포의 경우) 세포를 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 마지막 6시간 동안 웰당 20 ㎕의, D-PBS 중의 0.1 mCi/mL 티미딘-[메틸-3H] (MP 바이오메디칼즈 번호 2406605)를 첨가하였다. 혼입된 3H-티미딘을 수거하고, 1450-021 마이크로베타 액체 섬광 계수기를 이용하여 상기 기술된 바와 같이 계수하였다.
<표 4>
Figure pct00013
표 4에서, 접합체 1의 항체 성분인 항체 1은 WT 및 돌연변이화된 FGFR3 수용체를 포함하는 세포주의, FGF1 및 FGF9 리간드 유도성 증식을 효과적으로 중화시켰다.
세포독성 연구
FGFR3을 과다발현하는 종양 세포주에 대한 접합체 1의 세포독성
접합체 1의 세포독성을 결정하기 위해, FGFR3을 발현하는 방광 종양 및 다발성 골수종 세포주에 대한 상대적인 FGFR3 세포 표면 밀도를 확립하였다.
세포주를 48시간 동안 배양하고, 깁코(Gibco)® 세포 해리 완충제 (효소 무함유) (깁코®, #13151-014)를 이용하여 수거하고, 세포를 계수하였다. 세포를 1,000 rpm으로 5분 동안 원심분리하고, 냉 PBS (pH 7.4)로 1회 세척하고, 냉 PBS (pH 7.4) 중에 2 x 106개의 세포/mL로 재현탁시켰다. 세포를 얼음 상에서 1시간 동안 96 웰 둥근 바닥 플레이트 중의 FACS (형광 활성화 세포 분류) 염색 완충제 (PBS, pH 7.4, 3% BSA) 중 30 ㎍/mL 인간 IgG로 차단하였다. 차단한 후, 세포를 1,200 rpm으로 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. 100 ㎕의 FACS 염색 완충제를 비염색 대조군 웰에 첨가하였다. FACS 염색 완충제 중 100 ㎕의 15 ㎍/mL 알렉사488(Alexa488) 표지된 항체 1 (FGFR3 내재화를 모니터링하는 데 사용), 항KLH (비표적화된 대조군 접합체) 또는 chKTI 항체 (비표적화된 대조군 접합체)를, 세포를 함유하는 적절한 시험 웰에 첨가하였다. 완충제 및 항체를 빈 웰에 첨가한 후, 퀀텀™ 심플리 셀룰라® 비즈 키트(Quantum™ Simply Cellular® Beads Kit) (방스 랩스(Bangs Labs), #816B)로부터의 표준 비드 용액 각 2방울씩을 적절한 웰에 첨가하였다. 암실에서 얼음 상에서 1시간 동안 플레이트를 인큐베이션시켰다. 세포 및 비드를 FACS 세척 완충제 (PBS, pH 7.4, 0.5% BSA)로 2회 세척하였다. 50 ㎕ 7-아미노악티노마이신 D (7-AAD) 중의 세포를 FACS 세척 완충제 중에 5 ㎍/mL로 재현탁시키고 비드를 50 ㎕ FACS 세척 완충제 중에 재현탁시켰다. 인텔리시트(IntelliCyt)® HTFC 상에서 웰을 판독하고, 플로우조(FlowJo) 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 항체 결합능 (ABC) 측정을 위해 플로우조에 의해 생성된 중간 형광 강도 (MFI) 값을 방스 랩스로부터 제공받은 엑셀(Excel) 스프레드시트에 게재하였다. 기록된 값은 네이키드 항체 1을 사용하여 결정된 특이적인 ABC 값에서 항KLH 또는 chKTI 항체를 사용하여 결정된 비특이적 ABC 값을 감산한 결과이다 (하기 표 5에서 "FGFR3 세포 표면 발현 (ABC)"으로 표지된 세로 열 참조 ). 상기 방법은 표 5에서 명확하게 열거되지 않은, 본원에서 논의된 다른 세포주에 대한 ABC 측정에도 사용되었다는 것에 주의한다.
<표 5>
Figure pct00014
세포 표면 상에서의 FGFR3의 발현이 증가함에 따라 세포독성이 증가하는 경향이 있는 것으로 관찰되었다. 이러한 데이터는 또한 FGFR3 돌연변이 및/또는 융합물의 존재하에서 접합체 1에 대한 감수성이 증가하고, 이는 세포 세포독성을 증진시키는 것을 지지한다.
세포독성 시험: 본 발명의 항체 성분인 항체 1은 세포독성 페이로드를 선택적으로 전달할 수 있다.
본 발명의 항체 성분인 항체 1은 세포독성 페이로드를 종양 세포로 선택적으로 전달할 수 있다.
90 ㎕의 완전 배지 중 웰당 2,500개의 세포로 세포를 96 웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅하고, 5% CO2를 함유하는 습윤화된 대기하에 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션시켰다. 상기 인큐베이션 종료 직전에, 시험 물품을 둥근 바닥 96 웰 플레이트 중에서 완전 배지를 이용하여 3배 일련의 희석액으로 희석하였다. 4시간 동안 인큐베이션시킨 후, 10 ㎕의 희석된 항체를 일정량의 접합된 Fab (10 nM)와 혼합하고, 세포 플레이트 중 상응하는 웰에 첨가하고, 5% CO2를 함유하는 습윤화된 대기하에 37℃에서 96시간 동안 인큐베이션시켰다. 상기와 같이 인큐베이션시킨 후, 인큐베이터로부터 플레이트를 제거하고, 모든 후속 단계를 위해 실온이 되게 하였다. 100 ㎕의 셀 타이터-글로(Cell Titer-Glo)® 시약 (프로메가(Promega) #TB288)을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 2시간 동안 인큐베이션시키고, 빛이 닿지 않도록 보호하였다. 스펙트라 맥스® M5e 멀티-모드(Spectra Max® M5e Multi-Mode) 마이크로플레이트 판독기에서 발광 신호를 검출하였다. 비처리 대조군 웰에 대한 상대적인 비율로서 실험 웰을 계산하였다. 그래프패드 프리즘® 6을 이용하여 데이터를 플롯팅하고, 로그 억제제 대 정규화된 반응, 변수 기울기, 분석을 사용하여 IC50 값을 결정하였다.
120,000개의 항원을 발현하는 다발성 골수종 세포주 KMS-11 [t(4;14), Y373C] (IC50 = 0.11 nM)의 경우에 관찰된 유의한 세포독성을 통해, 접합체 1의 항체 성분인 항체 1이 FGFR3과의 결합을 통해 페이로드를 전달할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 상기 데이터는 평가된 다수의 방광 종양 세포주 (~16,000개의 항원을 발현하는 RT-112 (TACC3) 대 ~11,000개의 항원을 발현하는 BFTC-905 (야생형)) 및 다발성 골수종 종양 세포주 (~120,000개의 항원을 발현하는 KMS-11 [t(4;14), Y373C] 대 ~51,000개의 항원을 발현하는 OPM-2 [t(4;14), K650E] 대 ~9,000개의 항원을 발현하는 LP-1[t(4;14)] (야생형))에 걸쳐 비교하였을 때 관찰된 바와 같이, FGFR3 항원 밀도 및 돌연변이 상태가 증가함에 따라 세포독성 효능이 증가한다는 것을 제안한다. 접합체 세포독성 활성의 중요한 성분이 항원 밀도이지만, 일부 세포주에서는 FGFR3 돌연변이 상태와 파트너를 이루어 협력하는 항원 밀도 또한 중요할 수 있다.
<표 6>
Figure pct00015
방광 (RT112-TACC3), MM (KMS-11 [t(4;14) Y373C], OPM-2 [t(4;14), K650E]), 위 카토-III 및 형질감염된 Baf3-FGFR3(IIIb), Baf3-FGFR3(IIIc) 세포주는 접합체 1의 선택적인 세포독성 사멸 작용에 대해 감수성이었다. 이러한 효능은 FGFR3 표면 발현 및 FGFR3 돌연변이 상태와 상관 관계를 가진다.
접합체 1을 이용한 방광 종양 세포주에 대한 세포독성 시험
접합체 1은 다양한 형태의 FGFR3을 과다발현하는 다수의 시험관내 방광 종양 세포주에서 세포독성을 띤다.
90 ㎕의 완전 배지 중 웰당 2,500개의 세포로 세포를 96 웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅하고, 5% CO2를 함유하는 습윤화된 대기하에 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션시켰다. 상기 인큐베이션 종료 직전에, 시험 물품을 둥근 바닥 96 웰 플레이트 중에서 완전 배지를 이용하여 3배 일련의 희석액으로 희석하였다. 4시간 동안 인큐베이션시킨 후, 10 ㎕의 희석된 항체를 세포 플레이트 중 상응하는 웰에 첨가하고, 5% CO2를 함유하는 습윤화된 대기하에 37℃에서 96시간 동안 인큐베이션시켰다. 상기와 같이 인큐베이션시킨 후, 인큐베이터로부터 플레이트를 제거하고, 모든 후속 단계를 위해 실온이 되게 하였다. 100 ㎕의 셀 타이터-글로® 시약 (프로메가 #TB288)을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 2시간 동안 인큐베이션시키고, 빛이 닿지 않도록 보호하였다. 스펙트라 맥스® M5e 멀티-모드 마이크로플레이트 판독기에서 발광 신호를 검출하였다. 비처리 대조군 웰에 대한 상대적인 비율로서 실험 웰을 계산하였다. 그래프패드 프리즘® 6을 이용하여 데이터를 플롯팅하고, 로그 억제제 대 정규화된 반응, 변수 기울기, 분석을 사용하여 IC50 값을 결정하였다.
본 결과는 분자가 각각의, FGFR3을 과다발현하는 방광 종양 세포주를 치료하는 데 사용되었을 때의 접합체 1의 유의한 세포독성을 보여준다 (표 5 참조). 본 화합물은, (수용체가 구성적으로 활성을 나타내도록 만드는) ECD에 돌연변이를 함유하는 FGFR3을 과다발현하는 UMUC-14 종양 세포주에서 약건 더 큰 효능을 가졌다. 음성 대조군 이소형과 매칭된 접합체는 어느 세포주에서도 접합체 1을 사용하여 관찰된 농도 범위에서 어떤 세포독성도 보이지 않았다. 비특이적 세포독성을 평가하기 위하여 FGFR3을 과다발현하지 않는 방광 종양 세포주 KU-19-19를 본 실험에 포함시켰다. 접합체 1은 KU-19-19 세포주에 대해서는 세포독성을 나타내지 않았다. 이러한 결과는 특이적인 시험관내 세포독성은 FGFR3-TACC3 융합 수용체의 부재 또는 존재하에서, FGFR3 WT, FGFR3 돌연변이체 S249C 또는 Y373C를 과다발현하는 세포주에서 접합체 1에 의해 유도될 수 있다는 것을 나타낸다.
FGFR3 내재화
FGFR3 돌연변이 상태, 표면 발현, 및 수용체 매개 항체 내재화 사이의 관계를 이해하기 위해 살아있는 세포 영상화, 유세포 분석법, 및 다양한 생화학적 분석법을 이용하여 시험관내 연구를 수행하였다. 상기 인자들이 어떻게 조합하여 궁극적으로 접합체 세포독성에 영향을 미치게 되는지 결정하였다.
본원의 데이터는 FGFR3 내재화 속도 증가가 S249C 돌연변이 및 FGFR3-TACC3 융합물을 비롯한, FGFR3의 돌연변이 유발자와 관련이 있고, 이러한 이상은 접합체 1에 대한 감수성 증진과 상관 관계를 가진다는 것을 입증한다. 다양한 돌연변이를 포함하고, 표면 FGFR3을 다양한 수준으로 발현하는 세포주 패널에서 항체 내재화에 관한 정량적 분석을 수행하였다. 이러한 세포주로는 RT-4 (TACC3 엑손-4, 표면 밀도 항체 결합능 (ABC) ~ 29,000), UMUC-14 (S249C, ABC ~27,000), RT-112 (TACC3 엑손-10, ABC ~16,000), BFTC-905 (WT, ABC ~11,000), KU-19-19 (WT, ABC ≤4,000), 및 UMUC-3 (WT, ABC≤4,000) (부분적으로 표 5 및 6 참조)을 포함하였다.
살아있는 세포에 관한 공초점 현미경법 및 알렉사488 형광 표지화된 항체에 의한 상기 세포주에 대해 수행된 초기 특징 규명 결과, 방광 세포주 패널에서 인간 IgG 대조군 (chKTI)과 비교하였을 때, 항체 1인 항FGFR3 항체의 특이적인 내재화가 입증되었다.
RT-112 세포에서 항체 1-알렉사488 (67 nM)의 수용체 매개 내재화가 항체 첨가 후 24시간째 분명하게 나타났다. 살아있는 세포 실험에서, 항체 1이 세포 내로 내재화되는 것이 관찰되었다.
병행된 살아있는 세포 실험에서, 중성 pH에서 최소의 형광을 보이고, pH가 하락함에 따라 형광 강도는 증가되는 pH-활성화된 염료 (pH로도(pHrodo)™)를 사용하여 항체-수용체 복합체의 리소솜으로의 전달을 정량화하였다. 대조군 IgG 항체와 비교하였을 때, 항체 1 첨가시, pH-염료 신호 축적의 유의한 증가가 관찰되었으며, FGFR3을 발현하지 않는 대조군 세포 (Baf3R2)는 배경보다 높은 감지할 정도의 신호를 나타내지 않은 바와 같이, 상기와 같은 효과는 수용체 매개로 이루어지는 것이었다.
형광 표지 항체 1 및 대조군 항체 chKTI (항체 1-알렉사488 또는 chKIT-알렉사488)를 같은 세포주 패널과 함께 인큐베이션시키고, 48시간 동안에 걸쳐 표지화된 항체가 내재화될 수 있도록 하였다. 0.5, 1, 2, 4, 6, 24, 및 48시간에 샘플을 수거하고, 유세포 분석법에 의해 세포 결합 형광을 정량화하였다.
본 결과는 세포주 패널 간의 항체 1-알렉사488의 내재화 정도의 유의한 차이를 강조한다. S249C 돌연변이를 포함하는 UMUC-14 세포가 정량 및 속도, 두가지 면에서 모두 대조군에 비해 9배 더 큰 정도로 가장 많은 FGFR3 항체를 내재화시킨 반면, TACC3 융합물, RT-112 및 RT-4를 함유하는 세포주는 배경보다 대략 7배 높은 정도로 항체 1-알렉사488을 내재화하였다. 저발현 야생형 세포주를 대표하는 것인 BFTC-905, KU-1919 및 UMUC-3은 항체 1의 내재화를 감지할 정도로는 거의 보이지 않거나, 전혀 보이지 않았다. 이들 데이터는 표면 수용체 밀도가 항체 내재화의 오직 하나의 결정자임을 설명하며; 상기 데이터는 수용체 수송 및 접합체 유도성 세포독성에서 FGFR3 돌연변이 및/또는 FGFR3-TACC3 융합물 단백질을 활성화시키는 것이 내재화에 있어 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 강조한다.
효능 모델
세포주 및 환자 유래 모델, 둘 모두를 비롯한, 다중의 종양 이종이식편 모델에서 접합체 1의 항종양 활성을 평가하고, 접합되지 않은 네이키드 항체, 항체 1과 비교하였다. 대조군은 비히클 또는 비특이적 항체로 처리된 대조군; chKTI 또는 KLH 및 비표적 대조군, chKTI-술포-SPDB-DM4 또는 KLH-술포-SPDB-DM4로 이루어졌다.
접합체 1로 처리하였을 때, 항종양 활성을 보였고, 그 결과, 다양한 FGFR3 항원 발현 패턴을 가지는 다수의 인간 방광 및 다발성 골수종 이종이식편에서 종양 퇴행 또는 정체가 일어났다. 각 연구에서, 접합체 1은 네이키드 항체 1에 비하여 더 우수한 항종양 효능을 보였다. 처리하면, 이는 절단된 카스파제 3 유도에 의해 모니터링되는 바와 같이, 종양 세포 아폽토시스를 유도함으로써 종양 성장을 억제시켰다.
실험 동물 운영 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)로 승인을 받고, 미국 농무성(United States Department of Agriculture) 및 미국 국립보건원(National Institute of Health)의 현 규제 및 표준에 따라 실행되는 동물 연구 방법을 사용하였다.
HBSS 중에서 또는 50% 마트리겔(Matrigel)과의 혼합물로서 인간 방광 암종 또는 다발성 골수종 세포주를 이식한 후, 또는 암컷 면역결핍 (무흉선) 또는 NOD/SCID 감마 (NSG) 마우스 옆구리에 신선한 3-4 mm 종양 단편을 이식한 후, 이종이식편 모델을 생성하였다. 승인받은 IACUC 프로토콜 가이드라인에 따라 무균 기술을 사용하여 종양 단편 제조 및 이식을 수행하였다.
종양 크기가 명시된 크기 (전형적으로, 200-300 ㎣)에 도달하였을 때, 종양을 포함하는 마우스를 종양 부피에 의해 무작위하고, 전형적으로, 비히클, chKTI 또는 KLH 항체 대조군, 항체 1 (네이키드 mAb 대조군), KLH-술포-SPDB-DM4 또는 chKTI-술포-SPDB-DM4 (비표적화된-접합체 대조군) 및 접합체 1을 비롯한, 처리군 중 하나로 분류하였다. 시험 물품을 단일 또는 반복 (전형적으로, 매주 또는 격주로) 투약 스케줄로 볼루스 꼬리 정맥 주사를 통해 정맥내로 (i.v.) 투여하였다. 대부분의 연구에서, 특정 시점에 EDTA 혈장 및 종양 조직을 수집하여 화합물 노출 및 아폽토시스 마커를 각각 측정하였다. 접합체의 항체 부분에 대해 특이적인 것 (전체 검정법), 항체 부분 및 메이탄신 페이로드, 둘 모두를 인식하는 것 (접합체 검정법), 및 유리 메이탄신을 검출하는 것 (유리 검정법)인, 3가지 상이한 ELISA를 이용하여 접합체 1 혈장 농도를 결정하였다. 간략하면, 전체 검정법의 경우, FGFR3(IIIb)를 이용하여 분자를 포획하고, 항인간 IgG 분자를 이용하여 검출하였다. 접합체 검정법의 경우, FGFR3(IIIb)를 이용하여 분자를 포획하였다. 항메이탄신 항체를 이용하여 접합체를 검출하고, 이로써, 상기 검정법은 페이로드:항체의 비에 대해 감수성을 나타내었다. 유리 검정법에서는 먼저 아세톤을 이용하여 샘플로부터 모든 단백질을 침전시키고, 그때 유리 메이탄신은 상청액 중에 그대로 남아있었다. 상청액을 제거하고, 경쟁적 ELISA로 분석하였다.
수집된 종양 조직을 MSD®를 이용하여 절단된 카스파제-3에 대해 분석하였다. 퀴아젠 티슈라이저 II(Qiagen TissueLyser II)를 이용하여 급속 냉동된 종양 단편 (대략 100-200 ㎣)을 용해시켰다. 정화된 용해물을 해밀턴 스타(Hamilton STAR) 액체 핸들러를 사용하여 단백질 농도에 대해 정규화하고, 분석을 위해 MSD® 플레이트에 스탬핑하였다. 절단된 카스파제-3 뿐만 아니라, 전체 카스파제-3에 대하여 별개의 384 웰 플레이트를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 MSD® CC3을 수행하였다 (절단된 카스파제/전체 카스파제의 비로서 결과를 나타낸). 차단 및 인큐베이션 단계 후, 바이오테크(BioTek) EL406™ 플레이트 세척기를 사용하여 플레이트를 세척하고, 메조스케일 섹터® 2400 이미저를 사용하여 분석하였다. 1원 ANOVA 통계학적 분석을 비롯한 데이터 분석을 위해, 그래프패드 프리즘® 소프트웨어를 이용하였다.
캘리퍼스를 이용하여 종양 부피를 측정하고, 초기에는 주당 2회 이상 체중을 기록하고, 이어서, 매주 측정하였다. 종양 부피는 공식, 부피　= [(Pi/6) l x w2] (여기서, Pi = 3.14이고, w는 너비를 나타내고, l은 길이를 나타낸다)에 의해 계산하였다. 처리 지속 기간은 1) 사전 결정에 의해 (예컨대, 작용 기전 연구에서 조직학적 분석을 위해 종료), 2) 연구 종점에의 도달에 의해 (즉, 통계학상 유의한 종양 성장 억제에 도달하였을 때, 또는 어떤 뚜렷한 항종양 효과도 없을 때), 또는 3) 임상적 종점에의 도달에 의해 (예컨대, 종양 부하가 동물 보호 또는 생존에 영향을 미치는 경우) 결정하였다.
실험적 처리의 항종양 효능을 하기 요약된 바와 같이 계산되며, 비율(%)로 표시되는 T/C 비로 나타낸다.
%T/C = 100 x ΔT/ΔC (ΔT > 0일 경우)
여기서, ΔT = 연구 최종일의 약물 처리군의 평균 종양 부피 - 투약 개시일의 약물 처리군의 평균 종양 부피; ΔC = 연구 최종일의 (각 연구에서 명시된) 대조군의 평균 종양 부피 - 투약 개시일의 대조군의 평균 종양 부피. ΔT < 0일 경우, %T/C 대신, 공식 = 100 x ΔT/T (초기)를 사용하여 퇴행율 (% Reg)을 계산한다. 종양이 ≥50%의 퇴행을 달성하였다면, 이는 부분 관해 (PR)이다. 검출불가능한 경우, 이때 종양은 완전 관해 (CR)를 보이는 것이다. 군들 간의 종양 성장을 비교하기 위해 최종일까지 반복 측정 분산 분석 (RM ANOVA)을 이용하고, 이로써, JMP 스타티스티컬 디스커버리 패키지(JMP Statistical Discovery Package) (V.9., SAS 인스티튜트 인크.(SAS Institute Inc.: 미국 노스캐롤라이나주 캐리))를 사용하여 p 값 (P)을 결정한다.
하기 표 7에는 본원에서 시험된 종양 이종이식편 모델이 요약되어 있다. 하기 재생된 FGFR3 수용체 밀도 (ABC)는 표 5에 보고된 것이다.
<표 7>
Figure pct00016
RT-112 인간 방광 이종이식편 모델에서의 접합체 1의 효능
RT-112 (FGFR3-TACC3) 인간 방광 이종이식편 모델에서 3개의 독립 연구를 수행하여 접합체 1의 i.v. 반복 투약 이후의 항종양 효능 및 반응 지속성을 평가한다. RT-112 (FGFR3-TACC3)는 FACS/BANGS 분석에 의해 결정된 바와 같이, 16,000개의 수용체를 발현하는 인간 방광 암종 세포주로서, 이는 최근 보고된 FGFR3-TACC3 유전자 융합물을 포함하는 것이다.
평균 종양 부피 범위가 220-270 ㎣에 도달하였을 때 마우스를 종양 부피에 의해 무작위화하였다. 무작위화한 후, 비히클 대조군 (10 ㎕/g; 10 mM 트리스, 80 mM NaCl, 3.5% 수크로스, 0.01% 트윈-20, pH 7.5), KLH, 대조군 항체 1, KLH-술포-SPDB-DM4, 또는 접합체 1과 함께 종양 이종이식편 (n=6 내지 12개/군)을 동물에게 투여하였다.
작용 기전 연구를 위해 본 연구에 PK/PD 코호트 동물 (n=4)로 이루어진 별개의 군을 포함시켰다. 본 연구에서, 단일 i.v. 용량의 KLH-술포-SPDB-DM4를 5 mg/kg으로 투여하거나, 또는 접합체 1을 2.5 및 5 mg/kg으로 투여하고, 혈장 및 종양 조직을 위해 동물을 24시간 및 96시간째에 안락사시켰다. 혈장 샘플을 화합물 혈장 농도에 대해 평가하고, 종양 조직을 아폽토시스 마커에 대하여 분석하였다.
RT-112 연구 1에서, 종양 단편 이종이식편을 포함하는 동물 (n=6/군)은 무작위화 후, 비히클 대조군 (10 ㎕/g; 10 mM 트리스, 80 mM NaCl, 3.5% 수크로스, 0.01% 트윈-20, pH 7.5), KLH-술포-SPDB-DM4 (5 mg/kg), 또는 접합체 1 (5 mg/kg)을 14일 간격으로 총 2회에 걸쳐 i.v.로 투약받았다.
하기 표 8에 제시되어 있는 바와 같이, 5 mg/kg 용량의 접합체 1은 RT-112 종양의 성장을 억제시켰고, 그 결과, 2회의 i.v. 투약 후, 99일째에는 동물 6마리 중 6마리 (100%)가 완전 관해 (CR)를 보였고, 154일째에는 86%의 퇴행 (6마리 중 5마리에서 완전 퇴행)을 보였다. 상기 동물 6마리 중에서 생존 마우스 5마리 중 4마리는 211일째까지 무종양 상태 그대로 유지된 반면, 1마리의 동물에서는 종양 재성장이 관찰되었다. 5 mg/kg의 KLH-술포-SPDB-DM4를 투약한 결과, 동물 6마리 중 2마리가 CR을 보였다.
반복 투약 효능 연구인 RT-112 연구 2에서, 세포 이식 후 생성된 종양을 포함하는 마우스 (n=12/군)는 USP 염수 (10 ㎕/g), 항체 1 (10 mg/kg), KLH-술포-SPDB-DM4 (5 mg/kg) 또는 접합체 1 (5 mg/kg)을 총 3회에 걸쳐 i.v.로 투약받았다 (13, 35, 및 49일째). 본 연구에서, 2회 투약 후 47일째, 비히클 대조군과 비교하여 (p < 0.0001) 5 mg/kg으로 투약된 접합체 1은 44%의 종양 퇴행을 일으켰다. 이러한 반응은 최종 투약 후 100일을 초과하는 기간 동안 유지되었으며, 여기서 동물 12마리 중 9마리는 완전 관해 (CR)를 달성하였다. 염수 대조군과 비교하여 (p = 0.02) 5 mg/kg으로 투약된 KLH-술포-SPDB-DM4는 46%의 T/C를 보였다. 접합체 1은 네이키드 항체 1보다 유의하게 더 큰 효능을 보였으며, 여기서 비교물인 네이키드 항체 1은 10 mg/kg으로 투약되었을 때, 55%의 T/C를 보였다.
용량 반응 연구인 RT-112 연구 3에서 (n=8/군), 접합체 1을 1.25, 2.5 및 5 mg/kg으로 총 5회에 걸쳐 i.v.로 투약한 후 (21일째 및 35일째, 이어서, 주 1회로 3회 투약) 항종양 효능을 평가하였다. 본 연구에서 대조군은 10 mg/kg의 KLH, 10 mg/kg의 항체 1, 및 5 mg/kg의 KLH-술포-SPDB-DM4였다. PK/PD 코호트 동물 (n=4)은 5 mg/kg의 KLH-술포-SPDB-DM4, 또는 2.5 및 5 mg/kg의 접합체 1을 단일 i.v.로 투여받았다.
2.5 또는 5 mg/kg으로 투약된 접합체 1은 (82일째) 각각 93% 및 100%에 상응하는 종양 퇴행을 보였다. 상기 결과에서 166일째까지 1.25 mg/kg인 경우에는 5마리 중 2마리가 완전 관해를 보였고, 각각 2.5 및 5 mg/kg으로 투약 후, 동물 8마리 중 8마리가 완전 관해를 보였다. 1.25 mg/kg으로 투약된 접합체 1은 종양 정체를 보였다. 5 mg/kg으로 투약된 KLH-술포-SPDB-DM4는 종양 정체를 보였으며, 동물 7마리 중 2마리가 완전 퇴행을 보였고, 상기 효과는 비히클 대조군과 비교하여 통계학상 유의하였다 (p = 0.02). 퇴행된 종양은 관찰 기간 동안 (>160일)에는 재성장하지 않았다
<표 8>
Figure pct00017
혈장 샘플을 화합물 혈장 농도에 대해 평가하고, 종양 조직을 아폽토시스 마커에 대하여 분석하였다. 접합체 1 및 전체 IgG에 대한 ELISA에 의해 결정된 바와 같이, 접합체 1에 대한 혈장 농도-시간 프로파일은 샘플링 기간에 걸쳐 (96시간) 2.5 및 5.0 mg/kg (각각 24시간째 12.6 및 32.5 ㎍/mL)으로 i.v.로 볼루스 투여한 것과 용량 의존적 농도를 보였다. 추가로, 접합체 1 처리에 대한 RT-112 반응은 종양 조직에서 검출가능하였는데, 이는 용량에 의존하는 방식의 절단된 카스파제-3 수준 증가를 보였으며, 이는 상기 화합물의 가능한 작용 모드를 나타내는 것이다.
RT-112 연구에서, 접합체 1은 용량에 의존하는 방식으로 유의한 효능을 일으켰으며, 그 결과, 대부분의 동물은 완전 관해를 보였고, 그 효과는 지속성이 있었다 (100일 초과). 접합체 1은 네이키드 항체인 항체 1보다 유의하게 더 큰 효능을 보였다.
UMUC -14 인간 방광 이종이식편 모델에서의 접합체 1의 효능
UMUC-14 인간 방광 암종 이종이식편에서 네이키드 항체 1과 비교하였을 때 접합체 1의 생체내 효능은 RT-112 (FGFR3-TACC3) 모델과는 유전적으로 상이하였다. UMUC-14 세포주는 FACS 분석 및 BANGS에 의해 결정된 바와 같이, 대략 27,000개의 수용체 밀도로 발현하고, S249C 돌연변이를 포함한다고 가정하면, 이는 구성적으로 활성을 나타내었다.
HBSS에 현탁된 5x106개의 UMUC-14 세포를 NOD/SCID 감마 (NSG) 마우스 (암컷, 5-6주령)에 피하로 접종하였다. 동물을 무작위로 처리군으로 배정하고, 이로써 각 군의 평균 종양 부피는 240-250 ㎣이 되었다. 14일 간격으로 2회 투약 또는 주 1회로 4회 투약으로 항체 1 및 접합체 1을 i.v.로 투여하였다. 대조군은 접합체 제제화 완충제 (10 mM 트리스, 80 mM NaCl, 3.5% 수크로스, 0.01% 트윈-20, pH 7.5) 또는 5 mg/kg의 비표적화된 chKTI 항체, chKTI-술포-SPDB-DM4 또는 KLH-술포-SPDB-DM4를 이용하였다.
UMUC-14 모델에서의 제1 연구에서, 종양 이식 후 17일 및 31일째 접합체 1을 5 mg/kg의 용량으로 투약하였을 때, UMUC-14 이종이식편에서는 동물 10마리 중 10마리에서 완전 퇴행이 나타났다. 이 결과는 무종양 상태가 ~15일 동안 유지되었다는 것을 나타낸다. 치료 중단 후 대략 30일이 경과하였을 때, 종양 재성장이 관찰되었다. 78일 및 81일째 상기 종양 재치료시, 5 mg/kg의 용량으로 투약된 접합체 1은 종양 크기를 축소시키지 못하였는 데, 이는 종양 저항성이 발생하였다는 것을 제안하는 것이다.
10 mg/kg으로 투약된 네이키드 항체 1, 및 5 mg/kg 용량으로 투약된 KLH-술포-SPDB-DM4, 둘 모두 종양 성장에 대해 유의한 영향을 미치지 못했다. 투약 후 48시간째 혈장 접합체 1 수준은 ~87 ㎍/mL에 도달하였고, 투여 후 48시간째인 조기 시점에 절단된 카스파제-3 수준이 유의하게 증가된 것이 관찰되었다.
UMUC-14 모델에서의 제2 연구에서, 무종양 상태는 접합체 1을 주 1회로 4회 투약한 후 유의하게 연장되었다. 접합체 1은 용량에 의존하는 방식으로 UMUC-14 종양 성장을 억제시켰는데, 5 mg/kg의 경우, 동물 8마리 중 8마리에서 완전 종양 퇴행이 이루어졌고, 2.5 mg/kg의 경우, 종양 정체에 도달하였고, 1.25 mg/kg에서는 어떤 영향도 없었다. 동물에서는 ~30일 동안 무종양가 유지되었고, 그 이후에 종양은 재성장하기 시작하였다.
<표 9>
Figure pct00018
UMUC-14 인간 방광 연구에서, 반복적인 i.v. 투약 후에 100% CR에 도달하였던 유의한 효과는 이후 종양 재성장으로 이어졌다.
BFTC -905 FGFR3 야생형 (WT) 인간 방광 이종이식편 모델에서의 접합체 1의 효능
야생형 FGFR3 발현의 존재하에 접합체 1의 효능을 결정하였다. HBSS에 현탁된 2x106개의 BFTC-905를 NOD/SCID 감마 (NSG)에 피하로 접종하였다. 무작위화한 후, 항체 1 및 접합체 1을 주 1회 스케줄로 i.v.로 투여하였다. 대조군은 KLH 또는 chKTI 항체 및 비표적화된 KLH-술포-SPDB-DM4 또는 chKTI-술포-SPDB-DM4를 이용하였다. 조합 연구에서, 시스플라틴을 i.p.로 매주 투여하였다.
접합체 1 처리는 BFTC-905 이종이식편에서 용량에 의존하는 방식으로 항종양 효능을 보였으며, 5 mg/kg에서는 종양 정체를 달성한 반면, 1.25 및 2.5 mg/kg에서는 종양 성장을 유의하게 억제시켰다. 접합체 1 및 시스플라틴을 조합한 결과, 10마리 중 10마리에서의 PR로 종양 퇴행이 일어났고, 이 효과는 각 단일요법보다는 유의하게 더 컸다. 접합체 1은 조직 절단된 카스파제-3 수준의 증가를 보이는 경향을 나타내었다.
<표 10>
Figure pct00019
BFTC-905에서, 인간 야생형 FGFR3 방광 이종이식편 세포주는 FACS 분석 및 BANGS에 의해 결정된 바와 같이, 대략 11,000개의 수용체 밀도로 발현하였다. 접합체 1은 오직 시험된 보다 높은 고용량에서만 종양 정체를 달성하였다. 시스플라틴와 조합하였을 때, 접합체 1 및 시스플라틴의 조합 요법은 접합체 1만을 단독으로 사용하였을 때의 효과를 유의하게 개선시켰고, 그 결과 10마리 중 10마리에서의 PR로 종양 퇴행이 일어났다. 블리스 독립 방법(Bliss Independence Method)에 의해 정의된 바와 같이, 상기의 조합 효과는 상가 효과보다 더 컸다.
KU-19-19 FGFR3 음성 인간 방광 이종이식편 모델에서의 접합체 1의 효능
FGFR3 음성 방광 암종 이종이식편 모델인 KU-19-19에서 접합체 1을 평가하여 접합체 1의 특이성을 확립하였다. 간략하면, HBSS에 현탁된 2x106개의 세포/마우스로 KU-19-19 세포를 Nu/nu (암컷, 5-6주령)에 피하로 접종하였다. 무작위화한 후, 항체 1 및 접합체 1을 주 1회 스케줄로 i.v.로 투여하였다. 대조군은 chKTI 항체 및 비표적화된 chKTI-술포-SPDB-DM4를 이용하였다.
<표 11>
Figure pct00020
예상대로, 주 1회 스케줄로 5 mg/kg으로 투약된 접합체 1은 KU-19-19 종양에 대하여 어떤 항종양 효과도 보이지 않았으며, 이는 시험 물품의 FGFR3 항원에 대한 특이성을 시사하는 것이다. 유사하게, 매주 5 mg/kg으로 투약된 네이키드 항체 (항체 1) 및 chKTI-술포SDPD-DM4, 이 둘 모두 어떤 항종양 활성도 보이지 않았다.
KMS-11 인간 다발성 골수종 이종이식편 모델에서의 접합체 1의 효능
KMS-11 및 KMS-11LP (루시페라제 양성) 인간 다발성 골수종 (MM) 이종이식편 모델에서 접합체 1의 생체내 효능을 평가하였다. KMS-11은 고수준의 FGFR3 (~120,000개)을 발현하고, 이는 염색체 전좌 (t(4;14)) 및 단일 점 돌연변이, Y373C, 이 둘 모두를 포함하였다. KMS-11LP는 루시페라제 양성이고, 보다 더 높은 고수준의 FGFR3 항원 (~159,000개)을 발현하는, 모체 KMS-11 세포주의 유도체이다.
HBSS에 현탁된 10 x 106개의 KMS-11 또는 KMS-11LP 세포를 NOD/SCID 감마 (NSG) 마우스(암컷, 5-6주령)에 피하로 접종하였다. 종양이 ~300 ㎣의 평균 종양 부피에 도달하였을 때, 동물을 무작위로 처리군으로 배정하였다. 1회, 매주, 또는 격주로 항체 1 및 접합체 1을 i.v.로 투여하였다. 대조군은 접합체 제제화 완충제 (10 mM 트리스, 80 mM NaCl, 3.5% 수크로스, 0.01% 트윈-20, pH 7.5) 또는 비표적화된 KLH 항체 및 KLH-술포-SPDB-DM4를 이용하였다.
KMS-11 연구 1에서, 접합체 1을 단일 투약하여 처리하였을 때, KMS-11 종양의 성장을 유의하게 억제되었는데, 초기에는 종양이 정체된 후, 이어서, 종양은 재성장하였다. 수집된 종양 조직 분석 결과, 절단된 카스파제-3 수준은 투약 후 12시간이 경과하였을 때를 시작으로 하여, 24시간째에는 최고점에 도달하는, 유의한 증가를 보인 것으로 나타났다.
접합체 1의 효능은 투약 스케줄의 적극성이 증가함에 따라 유의하게 개선되었다. KMS-11 연구 3에서, 접합체 1을 주 1회로 총 5회 투약하였을 때, 동물 7마리 중 2마리에서 완전 관해가 일어났고, 동물 7마리 중 5마리에서는 부분 관해가 달성되었다. 그러나, 비표적화된 접합체 대조군을 상기 투약 스케줄로 사용한 경우에도 유의한 효과는 있었다.
<표 12>
Figure pct00021
본 연구는 모체 KMS-11 (119,000개)과 비교하여 약간 더 높은 항원 밀도 (152,000개)로 발현하는, 접합체 1로 처리된 KMS-11LP 이종이식편에서의 유의하게 강력한 효능을 나타내었다. 접합체 1로 처리한 결과, 매 14일마다 총 3회 투약으로 투여한 후, 동물 10마리 중 10마리에서 완전 관해가 일어났고, 70일째까지의 관찰 기간 동안 무종양 상태가 유지되었다.
추가 서열
서열 11
Figure pct00022
서열 12
Figure pct00023
서열 13
Figure pct00024
SEQUENCE LISTING <110> Eli Lilly and Company <120> COMPOUNDS TO FIBROBLAST GROWTH FACTOR RECEPTOR-3 (FGFR3) AND METHODS OF TREATMENT <130> X20104 <150> 61/917457 <151> 2013-12-18 <150> 61/928025 <151> 2014-01-16 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 Gly Tyr Met Phe Thr Ser Tyr Gly Ile Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 Trp Val Ser Thr Tyr Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 Val Leu Gly Tyr Tyr Asp Ser Ile Asp Gly Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp 1 5 10 15 Val <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 4 Gly Gly Asn Asn Ile Gly Asp Lys Ser Val His 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 5 Leu Asp Thr Glu Arg Pro Ser 1 5 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence 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Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Met Tyr 35 40 45 Leu Asp Thr Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Met Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Phe Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Gly Ser Asp His 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 <210> 9 <211> 456 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 9 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Met Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Val Ser Thr Tyr Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Val Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Leu Gly Tyr Tyr Asp Ser Ile Asp Gly Tyr Tyr Tyr Gly 100 105 110 Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 140 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 145 150 155 160 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 165 170 175 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180 185 190 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile 195 200 205 Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val 210 215 220 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 225 230 235 240 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 245 250 255 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 260 265 270 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 275 280 285 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 290 295 300 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 305 310 315 320 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 325 330 335 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 340 345 350 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 355 360 365 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 370 375 380 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 385 390 395 400 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 405 410 415 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 420 425 430 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 435 440 445 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 10 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 10 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Leu Ser Val Ala Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr Ala Thr Phe Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Asp Lys Ser Val 20 25 30 His Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Met Tyr 35 40 45 Leu Asp Thr Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Met Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Phe Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Gly Ser Asp His 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys 100 105 110 Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln 115 120 125 Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly 130 135 140 Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly 145 150 155 160 Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala 165 170 175 Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser 180 185 190 Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val 195 200 205 Ala Pro Ala Glu Cys Ser 210 <210> 11 <211> 795 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Met Gly Ala Pro Ala Cys Ala Leu Ala Leu Cys Val Ala Val Ala Ile 1 5 10 15 Val Ala Gly Ala Ser Ser Glu Ser Leu Gly Thr Glu Gln Arg Val Val 20 25 30 Gly Arg Ala Ala Glu Val Pro Gly Pro Glu Pro Gly Gln Glu Leu Val 35 40 45 Phe Gly Ser Gly Asp Ala Val Glu Leu Ser Cys Pro Pro Pro Gly Gly 50 55 60 Gly Pro Met Gly Pro Thr Val Trp Val Lys Asp Gly Thr Gly Leu Val 65 70 75 80 Pro Ser Glu Arg Val Leu Val Gly Pro Gln Arg Leu Val Leu Asn Ala 85 90 95 Ser His Glu Asp Ser Gly Ala Tyr Ser Cys Arg Gln Arg Leu Thr Arg 100 105 110 Val Leu Cys His Phe Ser Val Arg Val Thr Asp Ala Pro Ser Ser Gly 115 120 125 Asp Asp Glu Asp Gly Glu Asp Glu Ala Glu Asp Thr Gly Val Asp Thr 130 135 140 Gly Ala Pro Tyr Trp Thr Arg Pro Glu Arg Met Asp Lys Lys Leu Leu 145 150 155 160 Ala Val Pro Ala Ala Asn Thr Val Arg Phe Arg Cys Pro Ala Ala Gly 165 170 175 Asn Pro Thr Pro Ser Ile Ser Trp Leu Lys Asn Gly Arg Glu Phe Arg 180 185 190 Gly Glu His Arg Ile Gly Gly Ile Lys Leu Arg His Gln Gln Trp Ser 195 200 205 Leu Val Met Glu Ser Val Val Pro Ser Asp Arg Gly Asn Tyr Thr Cys 210 215 220 Val Val Glu Asn Lys Phe Gly Ser Ile Arg Gln Thr Tyr Thr Leu Asp 225 230 235 240 Val Leu Glu Arg Ser Pro His Arg Pro Ile Leu Gln Ala Gly Leu Pro 245 250 255 Ala Asn Gln Thr Ala Val Leu Gly Ser Asp Val Glu Phe His Cys Lys 260 265 270 Val Tyr Ser Asp Ala Pro His Ile Gln Trp Leu Lys His Val Glu Val 275 280 285 Asn Gly Ser Lys Val Gly Pro Asp Gly Thr Pro Tyr Val Thr Val Leu 290 295 300 Lys Thr Ala Gly Ala Asn Thr Thr Asp Lys Glu Leu Glu Val Leu Ser 305 310 315 320 Leu His Asn Val Thr Phe Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Thr Cys Leu Ala 325 330 335 Gly Asn Ser Ile Gly Phe Ser His His Ser Ala Trp Leu Val Val Leu 340 345 350 Pro Ala Glu Glu Glu Leu Val Glu Ala Asp Glu Ala Gly Ser Val Tyr 355 360 365 Ala Gly Ile Leu Ser Tyr Gly Val Gly Phe Phe Leu Phe Ile Leu Val 370 375 380 Val Ala Ala Val Thr Leu Cys Arg Leu Arg Ser Pro Pro Lys Lys Gly 385 390 395 400 Leu Gly Ser Pro Thr Val His Lys Ile Ser Arg Phe Pro Leu Lys Arg 405 410 415 Gln Val Ser Leu Glu Ser Asn Ala Ser Asn Ser Ser Asn Thr Pro Leu 420 425 430 Val Arg Ile Ala Arg Leu Ser Ser Gly Glu Gly Pro Thr Leu Ala Asn 435 440 445 Val Ser Glu Leu Glu Leu Pro Ala Asp Pro Lys Trp Glu Leu Ser Arg 450 455 460 Ala Arg Leu Thr Leu Gly Lys Pro Leu Gly Glu Gly Cys Phe Gly Gln 465 470 475 480 Val Val Met Ala Glu Ala Ile Gly Ile Asp Lys Asp Arg Ala Ala Lys 485 490 495 Pro Val Thr Val Ala Val Lys Met Leu Lys Asp Asp Ala Thr Asp Lys 500 505 510 Asp Leu Ser Asp Leu Val Ser Glu Met Glu Met Met Lys Met Ile Gly 515 520 525 Lys His Lys Asn Ile Ile Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Gln Gly Gly 530 535 540 Pro Leu Tyr Val Leu Val Glu Tyr Ala Ala Lys Gly Asn Leu Arg Glu 545 550 555 560 Phe Leu Arg Ala Arg Arg Pro Pro Gly Leu Asp Tyr Ser Phe Asp Thr 565 570 575 Cys Lys Pro Pro Glu Glu Gln Leu Thr Phe Lys Asp Leu Val Ser Cys 580 585 590 Ala Tyr Gln Val Ala Arg Gly Met Glu Tyr Leu Ala Ser Lys Cys Ile 595 600 605 His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Thr Glu Asp Asn Val 610 615 620 Met Lys Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Val His Asn Leu Asp 625 630 635 640 Tyr Tyr Lys Lys Thr Thr Asn Gly Arg Leu Pro Val Lys Trp Met Ala 645 650 655 Pro Glu Ala Leu Phe Asp Arg Val Tyr Thr His Ser Asp Val Ser Phe 660 665 670 Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile Phe Thr Leu Gly Gly Ser Pro Tyr Pro 675 680 685 Gly Ile Pro Val Glu Glu Leu Phe Lys Leu Leu Lys Glu Gly His Arg 690 695 700 Met Asp Lys Pro Ala Asn Cys Thr His Asp Leu Tyr Met Ile Met Arg 705 710 715 720 Glu Cys Trp His Ala Ala Pro Ser Arg Pro Thr Phe Lys Leu Val Glu 725 730 735 Asp Leu Asp Arg Val Leu Thr Val Thr Ser Thr Asp Glu Tyr Leu Asp 740 745 750 Leu Ser Ala Pro Phe Glu Tyr Ser Pro Gly Gly Gln Asp Thr Pro Ser 755 760 765 Ser Ser Ser Ser Gly Asp Asp Ser Val Phe Ala His Asp Leu Leu Pro 770 775 780 Pro Ala Pro Pro Ser Ser Gly Gly Ser Arg Thr 785 790 795 <210> 12 <211> 1368 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 12 gaggtccagc tggtacagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaagtc 60 tcctgcaagg cttctggcta catgtttacc agctatggga tcagttgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg gtcagcactt acaatggtga cacaaactat 180 gcgcagaagt tccagggcag agtcaccgtg accacagaca catccacgag cacagcctac 240 atggagctga ggagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagtcttg 300 ggatactatg atagtataga tggctactac tacggtatgg acgtctgggg ccaagggacc 360 acggtcaccg tctcaagcgc tagcaccaag ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc 420 tccaagagca cctctggggg cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc 480 gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg 540 gctgtcctac agtcctcagg actctactcc ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc 600 agcttgggca cccagaccta catctgcaac gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg 660 gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca 720 cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 780 atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 840 gaggtcaagt tcaactggta tgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 900 cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccaa 960 gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 1020 atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 1080 cccccatccc gggaggagat gaccaagaac caagtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 1140 ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 1200 aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctattc caagctcacc 1260 gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 1320 ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggcaaa 1368 <210> 13 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 13 cagtctgtgc tgactcagcc accctcactg tcagtggccc caggaaagac ggccaccttt 60 acctgtgggg gaaacaacat tggagacaag agtgttcact ggtaccggca gaagccaggc 120 caggcccctg tcctggtcat gtatcttgat accgaacggc cctcagggat ccctgagcga 180 atgtctggct ccaactttgg gaacacggcc accctgacga tcaccagggt cgaagccggg 240 gatgaggccg actattactg tcaggtgtgg gatagtggta gtgatcatgt ggtcttcggc 300 ggagggacca agctgaccgt cctaggtcag cctaaggctg ccccctcggt cactctgttc 360 ccgccctcct ctgaggagct tcaagccaac aaggccacac tggtgtgtct cataagtgac 420 ttctacccgg gagccgtgac agtggcctgg aaggcagata gcagccccgt caaggcggga 480 gtggagacca ccacaccctc caaacaaagc aacaacaagt acgcggccag cagctacctg 540 agcctgacgc ctgagcagtg gaagtcccac agaagctaca gctgccaggt cacgcatgaa 600 gggagcaccg tggagaagac agtggcccct gcagaatgct ct 642

Claims (25)

  1. 하기 화학식 I의 화합물.
    <화학식 I>
    Figure pct00025

    상기 식에서, n은 정수 1-10이고, R은 인간 FGFR3 (서열 11)에 결합하며, 서열 GYMFTSYGIS (서열 1)를 가지는 CDRH1, 서열 WVSTYNGDTNYAQKFQG (서열 2)를 가지는 CDRH2, 서열 VLGYYDSIDGYYYGMDV (서열 3)를 가지는 CDRH3, 서열 GGNNIGDKSVH (서열 4)를 가지는 CDRL1, 서열 LDTERPS (서열 5)를 가지는 CDRL2, 및 서열 QVWDSGSDHVV (서열 6)를 가지는 CDRL3을 포함하는 세포 결합 작용제이다.
  2. 제1항에 있어서, 세포 결합 작용제가
    Figure pct00026

    의 가변 중쇄 아미노산 서열; 및
    Figure pct00027

    의 가변 경쇄 아미노산 서열을 추가로 포함하는 것인 화합물.
  3. 제2항에 있어서, 세포 결합 작용제가 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 추가로 포함하는 것인 화합물.
  4. 제3항에 있어서, 세포 결합 작용제가 각각이 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄; 및 각각이 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 중쇄를 추가로 포함하는 것인 화합물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 대 항체의 비가 2.0 내지 5.0인 화합물.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 대 항체의 비가 3.5 ± 0.5인 화합물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 화합물을 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 포함하는 제약 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 추가의 제약 작용제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 요법에 사용하기 위한 화합물.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 암 치료에 사용하기 위한 화합물.
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, FGFR3 발현 수준이 대조군 집단에서의 FGFR3 발현 수준보다 더 큰 환자에서 암 치료에 사용하기 위한 화합물.
  12. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 대조군 집단이 암을 앓지 않는 개체를 1명 이상 포함하는 것인 제11항에 따라 사용하기 위한 화합물.
  13. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) S249C, R248C, Y373C, Y375C, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, FGFR3 (서열 11)의 돌연변이;
    (b) FGFR3-TACC3의 융합물; 또는
    (c) (a) 및 (b)의 조합
    을 가지는 환자에서 암 치료에 사용하기 위한 화합물.
  14. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) S249C, R248C, Y373C, Y375C, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, FGFR3 (서열 11)의 돌연변이;
    (b) FGFR3-TACC3의 융합물; 또는
    (c) (a) 및 (b)의 조합
    을 가지는 환자에서 암 치료에 사용하기 위한 화합물이며,
    여기서, 치료는 환자의 생물학적 샘플 중 (i) S249C, R248C, Y373C, Y375C 돌연변이 중 하나 이상; (ii) FGFR3-TACC3의 융합물; 또는 (iii) (1) 및 (2)의 조합의 존재를 생체외에서 또는 시험관내에서 결정함으로써 환자가 (a) S249C, R248C, Y373C, Y375C, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, FGFR3 (서열 11)의 돌연변이; (b) FGFR3-TACC3의 융합물; 또는 (c) (a) 및 (b)의 조합을 가지는지 여부를 결정하는 것을 포함하는 것인 화합물.
  15. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 방광암 또는 다발성 골수종인 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 화합물.
  16. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 또 다른 항암 치료제와 동시에, 별개로 또는 순차적으로 투여되는 것인 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 화합물.
  17. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항암 치료제가 항혈관신생제, 화학요법제, 및 항신생물제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제16항에 따라 사용하기 위한 화합물.
  18. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항신생물제가 시스플라틴인 제17항에 따라 사용하기 위한 화합물.
  19. 암 치료를 필요로 하는 포유동물에게 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 화합물을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 암은 방광암 또는 다발성 골수종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 포유동물에서 암을 치료하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 포유동물에게 또 다른 항암 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 상기 항암 치료제는 항혈관신생제, 화학요법제, 및 항신생물제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 항신생물제가 시스플라틴인 방법.
  22. (a) 환자로부터 채취된 샘플 중 FGFR3 (서열 11)의 발현 수준을 측정하는 단계로서, 여기서 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 및 조직으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단계; 및
    (b) FGFR3 발현 수준이 대조군 집단에서 발견된 FGFR3 발현 수준보다 높다면, 상기 환자에게 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 투여하는 단계
    를 포함하는, 환자에서 암을 치료하는 방법.
  23. (a) 환자로부터 채취된 샘플 중 이상의 존재를 결정하는 단계로서,
    여기서, 이상은
    (1) S249C, R248C, Y373C, Y375C, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, FGFR3 (서열 11)의 돌연변이;
    (2) FGFR3-TACC3의 융합물; 또는
    (3) (1) 및 (2)의 조합이고,
    샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 조직, 종양 세포, 종양 조직 샘플, 순환 종양 세포, 및 순환 DNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단계, 및
    (b) 이상이 존재한다면, 상기 환자에게 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 투여하는 단계
    를 포함하는, 환자에서 암을 치료하는 방법.
  24. 암을 앓는 대상체의 샘플 중 FGFR3 (서열 11)의 발현 수준을 생체외에서 또는 시험관내에서 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 및 조직으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 암을 앓지 않는 개체에서의 FGFR3 발현 수준과 비교하였을 때, FGFR3 발현 수준이 증가하였다면, 이는 상기 대상체가 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 화합물에 대한 후보라는 것을 시사하는 것인, 암을 앓는 대상체가 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 화합물에 대한 후보인지 여부를 결정하는 방법.
  25. (a) 환자로부터 채취된 샘플 중 이상의 존재를 생체외에서 또는 시험관내에서 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 이상은
    (1) S249C, R248C, Y373C, Y375C, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, FGFR3 (서열 11)의 돌연변이;
    (2) FGFR3-TACC3의 융합물; 또는
    (3) (a) 및 (b)의 조합이고;
    (b) 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 조직, 종양 세포, 종양 조직 샘플, 순환 종양 세포, 및 순환 DNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 암을 앓는 대상체가 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 화합물에 대한 후보인지 여부를 결정하는 방법.
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