CN105916523A - 针对成纤维细胞生长因子受体-3(fgfr3)的化合物和治疗方法 - Google Patents

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D.L.路德维格
C.M.莫克斯汉
G.D.普劳曼
A.C.赖比
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Abstract

本发明提供由药物部分药剂和细胞结合剂组成的缀合物，其靶向人成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)。由于这些缀合物被设计且定制用于靶向特异性细胞群体和在所述细胞内递送强大的细胞毒素，所以其具有治疗性用途。本发明的缀合物通过在仅适度表达的重要肿瘤学受体中提供靶向肿瘤治疗以及针对邻近细胞的旁观者活性而具有相比于本领域中已知的其它缀合物的显著优点。

Description

针对成纤维细胞生长因子受体-3(FGFR3)的化合物和治疗 方法
本申请主张2013年12月18日申请的美国临时申请号61/917457和2014年1月16日申请的美国临时申请号61/928025的权益。
本发明涉及免疫学、癌症治疗和靶向治疗剂的领域。更具体地，本发明涉及化合物，其为毒性药物部分(具体为细胞毒性剂)与细胞结合剂(更具体为抗体，且甚至更具体为靶向人成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)的抗体)经由接头部分的缀合物。
直接将靶向毒性剂递送至异常细胞而不是如用传统化学治疗进行全身地治疗整体是靶向治疗剂的关键优点。靶向递送通过减少对健康细胞的损伤而有助于使副作用降至最低。本发明的缀合物被设计且定制为靶向特异性细胞群体且在细胞内部递送强大的细胞毒素，同时使脱靶细胞毒性活性降至最低。本发明提供用于消除或降低异常细胞的活力同时使对于健康细胞的影响降至最低的新颖且有用的缀合物和用其治疗的方法。
本发明为对临床未得到满足的膀胱癌和多发性骨髓瘤(MM)治疗的需求的响应，所述膀胱癌包括移行细胞癌(TCC)，其是非肌肉侵袭性的（且主要为局部疾病）和肌肉侵袭性的（其具有非常高的转移性潜能，在下文中称为“M+”）。在2013年在美国估计有73,510个个体将新近诊断出膀胱癌且将造成14,880例癌症相关的死亡。这使其成为在男性中第四常见和在女性中第九常见的赘生性事件。所有新病例中的约70%为TCC(非肌肉侵袭性癌症)，其具有显著间歇性复发性，为此存在对改进当前医疗标准(其为卡介苗(bacillus Calmette-Guérin，BCG)/辐照/手术)的远未得到满足的医学需求。当前不存在用于肌肉侵袭性膀胱癌的靶向治疗，其中医疗标准为常常具有毒性的化学治疗的四个细胞毒性方案(甲氨喋呤、长春花碱、多柔比星和顺铂 (MVAC))的组合。因此，当前用次优的吉西他滨与顺铂的组合治疗大多数患者。多发性骨髓瘤仍然是不可治愈的疾病，当前其总存活期范围为三至五年。当前，用于多发性骨髓瘤的医疗标准为可变给药皮质类固醇(地塞米松)与化学治疗(包括长春新碱、环磷酰胺和多柔比星，已显示所有药物都对于大多数患者具有毒性)的细胞毒性方案的组合。
对于有效地靶向特定细胞群体且递送强大的细胞毒素、同时减轻对健康细胞和组织的损伤的癌症治疗存在关键需求。因此，本发明提供式I的化合物或其药学上可接受的盐：
(I)
其中n为1-10的整数且
R为结合至人FGFR3(SEQ ID NO 11)的细胞结合剂，且包含具有序列GYMFTSYGIS (SEQID NO 1)的CDRH1、具有序列WVSTYNGDTNYAQKFQG (SEQ ID NO 2)的CDRH2、具有序列VLGYYDSIDGYYYGMDV (SEQ ID NO 3)的CDRH3、具有序列GGNNIGDKSVH (SEQ ID NO 4)的CDRL1、具有序列LDTERPS (SEQ ID NO 5)的CDRL2和具有序列QVWDSGSDHVV (SEQ ID NO 6)的CDRL3。本发明在下文中被称为“缀合物1”。
在本文中科学证据表明本发明的化合物优于用于(肌肉侵袭性和非肌肉侵袭性)膀胱癌和多发性骨髓瘤的当前医疗标准，因为其直接靶向异常细胞且由此减少对身体的健康细胞的损伤，进而使副作用降至最低。此外，本发明的化合物优于其它缀合物，因为其靶向临床需求未得到满足的适应症和患者群体。不同于当前批准的缀合物Kadcyla®，本发明的化合物利用癌症形成中关键的但通常被认为不适当地过表达的目标，而适宜于缀合的目标治疗。不同于当前批准的缀合物Adcetris®，本发明的化合物使脱靶毒性降至最低，由此减少不良作用，所述不良作用为Adcetris®的已知限制。最后，不同于较早批准的缀合物，诸如吉妥珠单抗奥唑米星(gemutuzumab ozogamicin)(Mylotarg®-在2000年由FDA核准但在2010年自愿撤销)，其在循环中时遭受接头不稳定性，本发明的化合物具有稳定的接头，这由此避免循环中的不稳定性。
设计和工程改造缀合物是复杂的尝试。其远比仅选择抗原、药物部分、接头部分和细胞结合剂更复杂。(Ritter, A., Antibody-Drug Conjugates; Looking Ahead to anEmerging Class of Biotherapeutic, Pharmaceutical Technology 第42-47页(2012年1月))。肿瘤抗原、细胞结合剂的结合特异性、药物部分的作用机制和药物部分连接至细胞结合剂的方式是支配化合物的临床活性和耐受性的关键决定因素。
本发明的缀合物是新颖和创造性化合物，而非组分的组合。工程改造化合物需要鉴定和选择彼此互补的组成性官能团(药物部分、接头部分、细胞结合剂)。各组分是具有自身特征、益处和限制的官能团。方法类似于由包括、但不限于烷基、羰基等独特官能团构成的新颖小分子的设计。缀合物成为有效治疗剂需要小心设计以确保平衡的特征、益处和限制；然而结果不可预测。从大范围的药物部分、接头和细胞结合剂选择官能团是复杂且不可预测的。尽管官能团可以是先前所公开的(毒素：DM4(N2'-去乙酰基-N-2'(4-甲基-4-巯基-1-氧代戊基)-美登素)(美国专利号7,276,497)；接头：磺基-SPDB(4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基丁酸N-丁二酰亚胺基酯)(美国专利号8,236,319)；和细胞结合剂：抗体1(美国专利号8,043,618))，但就小分子化合物(例如甲氨喋呤、长春花碱、多柔比星和顺铂)的结构活性关系和化学活性而言，个别官能团的知识不赋予最终化合物的官能性的知识。
选择合适的目标抗原是本发明的关键方面。本发明的目标抗原是FGFR3。异常受体酪氨酸激酶(RTK)信号传导在癌症形成以及癌症进展中发挥关键作用。成纤维细胞生长因子(FGF)和其同源受体(FGFR)是RTK家族的一部分。FGF和FGFR在胚胎发育、组织内稳态和代谢期间发挥关键作用。经由突变、产生染色体融合或过表达的FGFR3的异常活化已与具有足以诱导致癌转化的活化的FGFR3过表达的癌症直接相关。
尽管FGFR3信号传导途径在癌症治疗中发挥突出作用，但FGFR3不可能是用于开发缀合物治疗的抗原选择。为了缀合物有效，通常将肿瘤细胞上的稳健的目标表达视为基本要求。尽管FGFR3是抗原阳性的，但其在肿瘤细胞上的过表达相比于正常细胞是适度的；其并不以本领域中理解的对于典型缀合物(包括当前由FDA核准的那些)所需且认为有利的抗原水平表达。鉴于FGFR3的适度表达水平，缀合物1是出乎意料地有效的。也已鉴定FGFR3的活化突变和融合，其进一步引发缀合物1的出乎意料的有效性。
因此，工程改造缀合物1以包括作为细胞结合剂的抗体1是本发明的关键方面。作为缀合物1的细胞结合剂，抗体1结合至受体且诱导该受体的内化和降解。经典想法是需要快速补充表面抗原以提高治疗剂的成功的可能性。尽管如此，已发现缀合物1尤其有效。
选择磺基-SPDB作为接头也是本发明的关键方面。选择磺基-SPDB以通过确保细胞内部的药物部分的细胞内代谢来平衡药物部分的毒性。然而，磺基-SPDB缀合物当细胞内代谢时，生成三种代谢产物(赖氨酸-N(ε)-磺基-SPDB-DM4、DM4和S-甲基-DM4)，其中两种能够经由递送游离药物(DM4和S-甲基-DM4)来促进邻近细胞的旁观者细胞杀死，其也可经由正常细胞的非特异性杀死来提高毒性。由于抗原的表达速率，该效应得到平衡，由此将察觉的缺点转变成本发明的缀合物的优点。此外，由于磺基-SPDB在一些肿瘤模型中的优异功效以及毒性考虑，选择磺基-SPDB而非其它可切割接头，诸如SPDB和SMCC。
尽管存在相当大的工程改造和缀合挑战，本发明的缀合物令人惊讶地使得癌症治疗能够有效地靶向特异性细胞群体，且递送强大的细胞毒素，同时减轻对适度表达抗原(其在癌症进展中发挥关键作用)的健康组织的损伤。
本发明的一个方面是前述缀合物1。本发明还涉及化合物，其中细胞结合剂进一步包含以下可变重链氨基酸序列：
和以下可变轻链氨基酸序列：
。
本发明涉及化合物，其中细胞结合剂进一步包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:10的轻链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:9的重链。本发明还涉及化合物，其中细胞结合剂进一步包含各自包含氨基酸序列SEQ ID NO:10的两条轻链和各自包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的两条重链。
在本发明的一个方面，化合物具有2.0至5.0的药物比抗体比率或如本文所使用的“DAR”。在本发明的另一个方面，化合物具有3.5±0.5的DAR。
本发明还涉及药物组合物，其包含前述化合物连同药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。药物组合物可进一步包含额外药剂。
本发明的一个方面是用于治疗的化合物。另一个方面是用于治疗癌症的化合物。
在另一个方面，本发明是用于治疗FGFR3表达水平大于对照群体中的FGFR3表达水平的患者中的癌症的化合物。在一个方面，对照群体包含至少一个未患有癌症的个体。
在另一个方面，本发明是用于治疗患者中的癌症的化合物，其中该患者具有升高的FGFR3表达水平，且治疗包括通过离体或体外测定患者的生物样品中的FGFR3表达水平且比较所述样品中的FGFR3表达水平与对照样品中的FGFR3表达水平来确定患者是否具有升高的FGFR3表达水平。
在一个方面，对照样品是来自未患有癌症的个体的生物样品。
在一个进一步方面，患者的生物样品选自血液、血清、血浆、尿液和组织。在又一个进一步方面，对照样品来自与患者的生物样品相同的来源。例如，如果来自患者的生物样品是血液样品，则对照样品也是血液样品。
在另一个方面，本发明是用于治疗患者中的癌症的化合物，该患者具有(a)FGFR3(SEQ ID NO 11)的突变，其中该突变选自S249C、R248C、Y373C、Y375C和其组合；(b)FGFR3-TACC3的融合；或(c)(a)和(b)的组合。
在另一个方面，本发明是用于治疗患者中的癌症的化合物，该患者具有(a)FGFR3(SEQ ID NO 11)的突变，其中该突变选自S249C、R248C、Y373C、Y375C和其组合；(b)FGFR3-TACC3的融合；或(c)(a)和(b)的组合，且该治疗包括通过离体或体外确定患者的生物样品中存在(i)S249C、R248C、Y373C、Y375C突变中的一种或多种；(ii)FGFR3-TACC3的融合；或(iii)(i)和(ii)的组合来确定患者是否具有(a)FGFR3(SEQ ID NO 11)的突变，其中该突变选自S249C、R248C、Y373C、Y375C和其组合；(b)FGFR3-TACC3的融合；或(c)(a)和(b)的组合。
在一个进一步方面，患者的生物样品选自血液、血清、血浆、尿液、组织、肿瘤细胞、肿瘤组织样品、循环肿瘤细胞和循环DNA。
在一些方面，癌症是膀胱癌或多发性骨髓瘤。
在另一个方面，化合物可与另一抗癌治疗同时、分别或依次施用。抗癌治疗选自抗血管生成剂、化学治疗剂和抗赘生剂。在本发明的一个方面，抗赘生剂是顺铂。
本发明还涉及治疗哺乳动物中的癌症的方法，其包括向有需要的所述哺乳动物施用有效量的化合物，其中该癌症选自膀胱或多发性骨髓瘤。该方法可进一步包括向所述哺乳动物施用另一抗癌治疗，其中所述抗癌治疗选自抗血管生成剂、化学治疗剂和抗赘生剂。在一个方面，抗赘生剂是顺铂。
本发明的一个方面是治疗患者中的癌症的方法，其包括步骤：(1)测量取自该患者的样品中的FGFR3(SEQ ID NO 11)的表达水平，其中该样品选自血液、血清、血浆、尿液和组织；和(2)如果该FGFR3表达水平高于存在于对照群体中的FGFR3表达水平，则向该患者施用化合物。
本发明的一个方面是治疗患者中的癌症的方法，其包括步骤：(1)确定取自该患者的样品中的异常的存在，其中该异常是：(a)FGFR3(SEQ ID NO 11)的突变，其中该突变选自S249C、R248C、Y373C、Y375C和其组合，(b)FGFR3-TACC3的融合，或(c)(a)和(b)的组合，且其中该样品选自血液、血清、血浆、尿液、组织、肿瘤细胞、肿瘤组织样品、循环肿瘤细胞和循环DNA；和(2)如果存在该异常，则向该患者施用化合物。
本发明的一个方面是治疗患者中的癌症的方法，其包括步骤：(1)确定取自该患者的样品中FGFR3(SEQ ID NO 11)的S249C突变的存在，其中该样品选自血液、血清、血浆、尿液、组织、肿瘤细胞、肿瘤组织样品、循环肿瘤细胞和循环DNA；和(2)如果存在该S249C突变，则向该患者施用化合物。
本发明的一个方面是治疗患者中的癌症的方法，其包括步骤：(1)确定取自该患者的样品中FGFR3(SEQ ID NO 11)的R248C突变的存在，其中该样品选自血液、血清、血浆、尿液、组织、肿瘤细胞、肿瘤组织样品、循环肿瘤细胞和循环DNA；和(2)如果存在该R248C突变，则向该患者施用化合物。
本发明的另一个方面是治疗患者中的癌症的方法，其包括步骤：(1)确定取自该患者的样品中FGFR3(SEQ ID NO 11)的Y373C突变的存在，其中该样品选自血液、血清、血浆、尿液、组织、肿瘤细胞、肿瘤组织样品、循环肿瘤细胞和循环DNA；和(2)如果存在该Y373C突变，则向该患者施用化合物。
本发明的另一个方面是治疗患者中的癌症的方法，其包括步骤：(1)确定取自该患者的样品中FGFR3(SEQ ID NO 11)的Y375C突变的存在，其中该样品选自血液、血清、血浆、尿液、组织、肿瘤细胞、肿瘤组织样品、循环肿瘤细胞和循环DNA；和(2)如果存在该Y375C突变，则向该患者施用化合物。
本发明的另一个方面是治疗患者中的癌症的方法，其包括步骤：(1)确定取自该患者的样品中FGFR3-TACC3的融合的存在，其中该样品选自血液、血清、血浆、尿液、组织、肿瘤细胞、肿瘤组织样品、循环肿瘤细胞和循环DNA；和(2)如果存在该FGFR3-TACC3的融合，则向该患者施用化合物。
本发明的一个方面是用于确定患有癌症的受试者是否是化合物的候选者的方法，其包括离体或体外测定该受试者的样品中的FGFR3(SEQ ID NO 11)表达水平，其中该样品选自血液、血清、血浆、尿液和组织，其中与未患有癌症的个体中的FGFR3表达水平相比，FGFR3表达水平的增加指示该受试者是化合物的候选者。
另一个方面是用于确定患有癌症的受试者是否是化合物的候选者的方法，其包括离体或体外确定取自患者的样品中异常的存在，其中该异常是：(1)FGFR3(SEQ ID NO 11)的突变，其中该突变选自S249C、R248C、Y373C、Y375C和其组合；(2)FGFR3-TACC3的融合；或(3)(a)或(b)的组合，且其中该样品选自血液、血清、血浆、尿液、组织、肿瘤细胞、肿瘤组织样品、循环肿瘤细胞和循环DNA，且其中检测到该突变指示该受试者是化合物的候选者。
本发明的一个方面是用于确定患有癌症的受试者是否是化合物的候选者的方法，其包括离体或体外确定该受试者的样品中FGFR3(SEQ ID NO 11)的S249C突变的存在，其中该样品选自血液、血清、血浆、尿液、组织、肿瘤细胞、肿瘤组织样品、循环肿瘤细胞和循环DNA，其中该S249C突变的检测指示该受试者是化合物的候选者。
本发明的一个方面是用于确定患有癌症的受试者是否是化合物的候选者的方法，其包括离体或体外确定该受试者的样品中FGFR3(SEQ ID NO 11)的R248C突变的存在，其中该样品选自血液、血清、血浆、尿液、组织、肿瘤细胞、肿瘤组织样品、循环肿瘤细胞和循环DNA，其中该R248C突变的检测指示该受试者是化合物的候选者。
另一个方面是用于确定患有癌症的受试者是否是化合物的候选者的方法，其包括离体或体外确定该受试者的样品中FGFR3(SEQ ID NO 11)的Y373C突变的存在，其中该样品选自血液、血清、血浆、尿液、组织、肿瘤细胞、肿瘤组织样品、循环肿瘤细胞和循环DNA，其中该Y373C突变的检测指示该受试者是化合物的候选者。
另一个方面是用于确定患有癌症的受试者是否是化合物的候选者的方法，其包括离体或体外确定该受试者的样品中FGFR3(SEQ ID NO 11)的Y375C突变的存在，其中该样品选自血液、血清、血浆、尿液、组织、肿瘤细胞、肿瘤组织样品、循环肿瘤细胞和循环DNA，其中该Y375C突变的检测指示该受试者是化合物的候选者。
另一个方面是用于确定患有癌症的受试者是否是化合物的候选者的方法，其包括离体或体外确定该受试者的样品中FGFR3-TACC3的融合的存在，其中该样品选自血液、血清、血浆、尿液、组织、肿瘤细胞、肿瘤组织样品、循环肿瘤细胞和循环DNA，其中该FGFR3-TACC3的融合的检测指示该受试者是化合物的候选者。
如本文所使用，术语“抗原”包括位于细胞的表面上的蛋白。抗原可包括多肽、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原或其它天然存在或合成的化合物。优选地，抗原是折叠的多肽或蛋白。特异性配体结合蛋白或受体，引发信号转导和细胞活性的变化。抗体也可结合抗原，其可阻断配体结合和所得信号转导。术语抗原、“受体”、“目标”或“目标抗原”在本文中可互换使用。
如本文所使用，术语“异常”包括抗原的序列的偏离野生型、标准、正常或预期的序列的任何变化。异常包括基因异常。异常包括所有类型的突变和融合。
如本文所使用，术语“突变”包括基因组的核苷酸序列的变化，包括抗原的氨基酸序列的变化。
如本文所使用，术语“融合体”包括经由接合两个或更多个的原先编码独立蛋白的基因而生成的蛋白。通常当染色体转位用来自第二基因的完整外显子置换一个基因的外显子时生成融合基因。这生成可转录、剪接和翻译以产生功能性融合蛋白的单一基因。
野生型FGFR3的过表达足以诱导致癌转化。经由突变产生FGFR3(SEQ ID NO:11)的组成型、非配体依赖性活性的异常活化已与癌症直接相关。鉴定的突变包括S249C、R248C、Y373C和Y375C。已在许多癌症中鉴定出目标FGFR3的外显子与转化酸性卷曲螺旋蛋白3(TACC3)的外显子剪接在一起的几种融合蛋白，如本文中用作“FGFR3-TACC3融合体”。如表5中所见的这些突变和一些融合体使得FGFR3是超敏的且因此更为本发明的缀合物所接受。
如本文所使用，术语“过表达”包括基因的过量表达，其中基因产生升高水平的其产物，包括一种或多种产物，其与增加的受体活化和信号传导有关。“过表达”抗原性受体的癌症是与相同组织的非癌细胞相比在细胞表面具有显著较高水平的受体的癌症。可通过经由免疫组织化学(IHC)测定评估存在于细胞表面上的受体蛋白的增加水平或经由荧光原位杂交(FISH)、southern印迹、northern印迹或聚合酶链式反应(PCR)测量细胞中的受体末端核酸的水平，在诊断或预后测定中测定受体过表达。
过表达不是无穷限，而是连续统(continuum)。受体细胞表面表达或相对受体细胞表面密度可通过中值荧光强度(MFI)测量。例如，FGFR3细胞表面表达呈现于膀胱癌细胞系BFTC-905(野生型)中的11,000个受体处，和RT112膀胱肿瘤细胞系(野生型和FGFR3-TACC3融合受体)中的16,000个FGFR3受体处。(参见表5。)Kadcyla®，也称为TDM1，在美国批准的两种缀合物之一，靶向转移性乳房肿瘤中平均2百万个受体的HER-2。(Lohrisch等人，Seminars in Oncology，第28卷，第6期，增刊18：3-11(2001))。尽管FGFR3可过表达，但当与被视为高度过表达的其它癌症相关蛋白(诸如HER-2)的量相比时，FGFR3蛋白表达量是适度的且肿瘤正常差异表达并不那么显著。
如本文所使用，术语“缀合物”是指连接至细胞结合剂(例如抗体或其片段)的药物部分或其衍生物，且通过以下通式定义：(D—L)n—R，其中D为药物部分，L为接头，R为包含抗体或抗体片段的细胞结合剂，且n为鉴定附接至各细胞结合剂的药物部分和接头的数目的整数。缀合物也称为“免疫缀合物”、“抗体药物缀合物”或“ADC”。
本发明的缀合物是单克隆抗体-类美登素缀合物，其由抗FGFR3抗体(抗体1)上的可用的赖氨酸残基共价附接至可切割接头(磺基-SPDB)、其中活性类美登素(DM4)经由二硫键键合附接至该接头而形成。
缀合物是被定制为靶向特定细胞群体且在细胞内递送强大的细胞毒素的化合物。缀合物可视为前药，因为当施用该缀合物时，其基本上无毒性，直至其被内化于异常细胞中。
缀合物的样品的平均负载率在本文中被称为DAR、类美登素比抗体比率“MAR”或“药物负载率”。如本文所使用，DAR是指连接或附接至细胞结合剂(例如抗FGFR3抗体)的药物分子(例如类美登素)的数目。当特异性缀合物分子的DAR具有精确值(例如式(I)中的n)时，应理解当该值用于描述含有许多分子的样品时，其由于具有不同药物比抗体比率的不同缀合物分子的存在而经常为平均值。在一个方面，可附接至细胞结合剂的药物分子数目平均值可以是约1至约10。在本发明的一个方面，DAR平均值为2至8。在本发明的其它方面，DAR平均值为2至5。在本发明的其它方面，DAR平均值为3至5。在本发明的还有其它方面，DAR平均值为3至4。在一些方面，‘约n’的DAR意指DAR的测量值在n±0.5内。在本发明的一个方面，DAR平均值为3.5±0.5。与较少数目的药物连接至相同细胞结合剂的药物负载率相比，缀合物的抗肿瘤活性可更有效，尽管增加所连接的药物数目可改进效价，但以改变细胞结合剂的药代动力学特性为代价。用于缀合的方法以及用于测量和计算DAR的方法和技术可影响化合物的DAR值。
DAR的一致性和再现性确保对于指定ADC的递送一致剂量和药代动力学。低DAR可导致具有较低细胞毒性活性的缀合物的开发。然而，高DAR可影响对受体的亲和力、受体结合和阻断活性以及缀合物的体内稳定性。
如本文所使用，术语“毒素”是能够对细胞的生长或增殖具有不良作用、导致细胞死亡、诱导细胞死亡或以一些方式降低细胞活力的任何物质。如本文所使用，术语“细胞毒素”或“细胞毒性剂”包括在细胞质中活化的毒素。
如本文所使用，术语“药物部分”、“药物”或“有效负载”包括毒素、细胞毒素或细胞毒性剂。一种类型的药物部分包括美登素类化合物。
如本文所使用，术语“类美登素”包括抑制细胞在有丝分裂时的增殖的细胞毒素微管靶向化合物。这包括N2'-去乙酰基-N-2'(4-甲基-4-巯基-1-氧代戊基)-美登素，其称为“DM4”(式II)。
显示类美登素的细胞毒性比常规癌症化学治疗剂高100至1000倍。尽管高度有效，但已证明类美登素当向1期试验中的患者全身性施用时毒性太大。然而，当作为靶向治疗剂的部分诸如缀合物施用时，直接将类美登素的高度细胞毒性性质递送至异常或损伤的细胞，因此减轻对体内的不表达目标或抗原的健康细胞的毒性、全身性影响。优点是双重的。第一，更大细胞毒性使得细胞死亡更高效和细胞活力降低。第二，更大细胞毒性可使得向细胞施用较少剂量而得到相同结果。这为患者提供更有效的治疗性选择，同时缩小不良事件范围。
如本文所使用，术语“接头部分”或“接头”是指充当将细胞结合剂连接至药物部分的结合剂的化学部分。更具体地，接头部分包含将细胞结合剂共价结合至药物部分的共价键或原子。接头可以是实现癌细胞内的有效负载的代谢释放的任何桥接化合物并且一些促进后续代谢物依赖性旁观者细胞杀死。在化合物或抗体保持活性的条件下，接头可易受或实质上耐受酸诱导的切割、光诱导的切割、肽酶诱导的切割、酯酶诱导的切割和二硫键切割。
例如，药物部分经由二硫键连接至细胞结合剂，在本发明中为抗体1，缀合物的抗FGFR3抗体。接头分子或交联剂包含可与细胞结合剂的赖氨酸残基或其它残基反应的反应性化学基团。与细胞结合剂反应的反应性化学基团可以是 N-丁二酰亚胺基酯和 N-磺基丁二酰亚胺基酯。此外，接头分子包含反应性化学基团，其可以是可与药物部分反应以形成二硫键的二硫代吡啶基。
例如，细胞结合剂可用交联试剂修饰且由此衍生的含有游离或受保护的硫醇基的细胞结合剂然后与含二硫键或硫醇的类美登素反应以产生缀合物。缀合物可通过包括、但不限于HPLC、大小排阻、吸附、离子交换和亲和力捕获、透析或切向流过滤的层析法来纯化。
磺基-SPDB或sSPDB(其在本文中可互换使用)，4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基丁酸N-丁二酰亚胺基酯(式III)，是由于细胞内还原环境而允许缀合物在目标细胞内在细胞溶质中切割的可切割接头。式III：
作为可切割接头，磺基-SPDB鉴于缀合物的代谢加工以生成DM4和S-甲基-DM4而允许通过游离药物增强旁观者细胞杀死。在本发明中，缀合物的抗体经由自由的表面暴露的赖氨酸残基连接至接头，进而经由硫基连接至缀合物的细胞毒素。当与类美登素缀合时，带电荷的代谢物具有降低的疏水性，其降低MDR流出泵的活性且因此经由降低的MDR-1特异性多药耐药性而为增加的细胞杀死提供机会。
如本文所使用，表述“连接至细胞结合剂”或“连接至抗FGFR3抗体或片段”是指包含经由合适的连接基团结合至细胞结合剂(例如缀合物1的抗FGFR3抗体)的至少一个药物衍生物的缀合物分子或其前体。
然而，在由目标细胞内化之后，缀合物的代谢途径改变。类美登素缀合物经历细胞结合组分在低pH值溶酶体中的快速降解，导致从经由接头附接至细胞结合剂的一个氨基酸(赖氨酸残基)的类美登素药物释放代谢产物。在二硫键连接的缀合物诸如磺基-SPDB-DM4的情况下，类美登素修饰的赖氨酸残基经历二硫键还原以释放含硫醇的药物，其可然后经历甲基化，据推测由细胞内甲基转移酶催化以产生高度有效的S-甲基-类美登素(S-甲基-DM4)或可简单地导致产生未修饰的美登素(DM4)。该释放的药物能够扩散出细胞外且经由已定义且描述为旁观者效应的方式降低邻近细胞的活力。鉴于观察到的大多数细胞表面受体的目标异质性，‘旁观者’现象可以是体内细胞杀死的重要机制，因为肿瘤群体中的所有细胞可能不在相同程度表达抗原。
如本文所使用，术语“抗体”包括免疫球蛋白分子，其包含四个多肽链，通过二硫键相互连接的两个重(H)链和两个轻(L)链。个别链可折叠成具有类似大小(110-125个氨基酸)和结构、但功能不同的结构域。在本文中抗体可缩写为“Ab”。
轻链可包含一个可变结构域(在本文中缩写为VL)和/或一个恒定结构域(在本文中缩写为CL)。人抗体(免疫球蛋白)的轻链为kappa (K)轻链或lambda (λ)轻链。如本文所使用，表述VL意欲包括来自κ型轻链(VK)和来自λ型轻链(Vλ)的两个可变区。重链也可包含一个可变结构域(在本文中缩写为VH)和/或，取决于抗体的种类或同种型，三或四个恒定结构域(CH1、CH2、CH3和CH4)(在本文中共同缩写为CH)。在人中，同种型是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中IgA和IgG进一步细分成亚类或亚型(IgA1-2和IgG1-4)。本发明包括任何前述种类或亚类的抗体。对于本发明的缀合物的抗体，人IgG1是优选的同种型。
称为高变或互补决定区(CDR)的三个区存在于VL和VH各自中，其通过称为构架(在本文中缩写为FR)的低可变区支持。根据Kabat规则(Kabat, et al., Sequences ofProteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Healthand Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991))、Chothia规则(Chothia,et al., J Mol Biol. 1987; 196: 901–917. Chothia, et al., Nature. 1989; 342:877–883) 和/或Oxford Molecular的AbM抗体建模软件(http://www.bioinf.org.uk/abs/)，将氨基酸分配至特定CDR区域或结构域。各VH和VL由按以下顺序从氨基末端至羧基末端排列的三个CDR和四个FR构成：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。由VL和VH结构域组成的抗体部分命名为Fv(可变片段)且构成抗原结合位点。单链Fv(scFv)是一个多肽链上含有VL结构域和VH结构域的抗体片段，其中一个结构域的N末端和其它结构域的C末端通过柔性接头接合。
抗体1，本发明的缀合物的细胞结合剂，是具有lambda (λ)轻链的单克隆抗体。缀合物1的抗体结构在允许以最小位阻缀合的位置处含有约100的典型数目的游离赖氨酸侧残基。其对FGFR3的两种剪接形式(FGFR3(IIIb)和FGFR3(IIIc))均高度特异且在结合至FGFR3后被内化。然而，与大多数抗体相比，抗体1具有略微较低的等电点(pI)，其可影响稳定性以及缀合过程。此外，在结合至FGFR3受体后，抗体1诱导受体降解，这通常被视为缺点。以其较低pI和λ轻链，抗体1为化合物赋予独特挑战。尽管存在不稳定性的挑战，但已证明缀合物令人惊讶地有效。
术语“分离的”是指不含或实质上不含存在于细胞环境中的其它大分子种类的抗体、蛋白、肽或核酸。如本文所使用，“实质上不含”意指目的蛋白肽或核酸包含超过80%(以摩尔计) 、优选超过90%且更优选超过95%的存在的大分子种类。“分离的”抗体的实例包括已经亲和纯化的抗体、通过杂交瘤或其它细胞系体外制备的抗体和来源于转基因小鼠的人抗体。
如本文所使用，术语“裸抗体”是指未缀合的抗体材料。
如本文所使用，术语“单克隆抗体”是指获自实质上均质的抗体群体的抗体，例如构成该群体的个别抗体除了可能天然存在的突变或可存在的少数翻译后变异以外是实质上相同的。单克隆抗体针对单一抗原位点(也称为决定簇或表位)是高度特异性的。此外，与通常包括针对不同决定簇的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物相反，各单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”表明抗体的特征为获自实质上均质的抗体群体，且不应理解为需要通过任何特定方法产生该抗体单克隆抗体。在本文中可缩写为“mAb”。
如本文所使用，术语“人抗体”包括具有对应于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体(如Kabat等人所述，同上)。本发明的缀合物的人抗体可包括例如CDR中的不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过随机或体外定点诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。人抗体可具有至少一个被氨基酸残基(例如不由人种系免疫球蛋白序列编码的增强活性的氨基酸残基)置换的位置。然而，如本文所使用，术语“人抗体”不意欲包括来源于另一种哺乳动物物种(诸如小鼠)的种系的CDR序列已移植于人构架序列上的抗体。如本文所使用，产生“人抗体”的方法不意欲包括人类中产生的抗体。
短语“重组人抗体”包括通过重组方式制备、表达、生成或分离的人抗体，诸如使用转染入宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体、从重组的组合人抗体文库分离的抗体、从人免疫球蛋白基因转基因的动物分离的抗体或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其它DNA序列的任何其它方式制备、表达、生成或分离的抗体。此类重组人抗体具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。
因此，本发明中的缀合物的抗体包括、但不限于分离的抗体、人抗体、人源化抗体、重组人抗体、单克隆抗体、其指定部分和变体；各自含有至少一个CDR。
抗体或其片段的特异性可基于亲和力来测定。表示为抗原与抗体的平衡解离常数(KD)的亲和力测量抗原决定簇和抗体结合位点之间的结合强度。亲和力可例如通过表面等离振子共振来测量。
本发明的抗体或其片段结合至位于细胞外结构域区段(在下文中简称为“结构域”或“ECD”)上的FGFR3的表位。如本文所使用，术语“表位”是指由本发明的抗体识别的抗原上的离散的三维位点。
除了本文中具体描述的抗体之外，其它“实质上同源的”修饰的抗体可容易地利用本领域技术人员众所周知的各种重组DNA技术来设计和制造。例如，构架区可在一级结构水平下通过几个氨基酸取代、末端和中间添加和缺失等而不同于天然序列。此外，可单独或以组合使用多种不同人构架区作为本发明中包括的人源化免疫球蛋白的基础。通常，基因的修饰可通过多种众所周知技术诸如定点诱变容易地实现。
本发明包括编码缀合物重链的抗FGFR3抗体组分的核酸序列，所述FGFR3抗体组分包含任一VH区或其部分；或任一VH CDR，包括其任何变体，如本文所公开。本发明的缀合物的抗体组分包括包含抗体1的相同CDR区和/或抗体1的相同轻链可变区和/或重链可变区的抗体。
缀合物1的抗体可通过本领域中已知的方法产生。这些方法包括由Kohler和Milstein, Nature 256: 495-497 (1975); Laboratory Techniques in Biochemistryand Molecular Biology, 第13卷(Burdon等人编, Elsevier Science Publishers,Amsterdam)的Monoclonal Antibody Technology, The Production andCharacterization of Rodent and Human Hybridomas (Campbell编, 1984)描述的免疫方法；以及由Huse等人, Science 246: 1275-1281 (1989)描述的重组DNA方法。缀合物1的抗体也可获自具有scFv或抗原结合片段(Fab)形式的VH和VL结构域的组合的文库。VH和VL结构域可由合成、部分合成或天然来源的核苷酸编码。本发明可通过具有人抗体片段的噬菌体展示文库制造。人抗体的其它来源是工程改造以表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠。
应理解作为单结构域抗体的结合的一级决定簇的氨基酸残基可在Kabat、Chothia、AbM或其组合定义的CDR内，但也可包括其它残基，诸如将以其它方式埋入VH-VL杂二聚体的VH-VL接口中的残基。
转化载体和表达缀合物1的抗体的优选寄主细胞是哺乳动物细胞，例如，NS0细胞(非分泌性(0)小鼠骨髓瘤细胞)、293、SP20和CHO细胞和淋巴来源的其它细胞系诸如淋巴瘤、骨髓瘤或杂交瘤细胞。或者可使用其它真核宿主诸如酵母。
抗体可通过本领域中已知的任何方法分离或纯化，包括通过硫酸铵或硫酸钠沉淀和随后针对盐水透析、离子交换层析、亲和或免疫-亲和层析以及凝胶过滤或区带电泳。用于缀合物1的抗体的纯化的优选方法是蛋白-A亲和层析。
类美登素可通过技术、包括但不限于详述于美国专利号7,432,088、7,301,019、7,598,375、RE39,151号和第7,411,063中的技术来合成。
本发明的缀合物可通过本领域中已知的多种方法来制备，所述方法诸如描述于美国专利号7,811,572、8,383,122、6,441,163、7,368,565、7,811,572、8,163,888和美国申请公开2011/0003969、2011/0166319、2012/0253021和2012/0259100中的方法。
制备本发明的缀合物的替代方式是将抗体浓缩至30mg/mL且以10倍渗滤体积渗滤入反应缓冲液(50mM EPPS、20mM氯化钠、2mM EDTA，pH 8.2)中，且进一步浓缩至45g/L。使相对于磺基-SPDB(10mM)的摩尔比为1.2的DM4(12mM)与相对于抗体的摩尔比为4.68的磺基-SPDB在167mM EPPS、66.7mM NaCl、2mM EDTA(pH 8.2)和70.0%(v/v)DMA中反应。在20±3℃下进行原位反应10±4小时，然后将DMA添加至抗体以实现在50mM EPPS、20mM NaCl、2mMEDTA(pH 8.2±0.2)和5.0% DMA(v/v)中20mg/mL的最终抗体浓度。在20.0±3.0℃下进行缀合反应16±8小时。在反应后，通过添加6.5%(v/v)的1M乙酸将缀合混合物pH快速调节至5.0。将pH调节的混合物浓缩至20mg/mL，且针对基本配制缓冲液(10mM乙酸盐，pH 5.0±0.1)以16倍渗滤体积进行渗滤。使用蔗糖(45%，w/v)和聚山梨醇酯-20(10%，w/v)的浓缩的储备溶液，将纯化的缀合物以5.0mg/mL配制于10mM乙酸盐、9%(w/v)蔗糖、0.01%(w/v)聚山梨醇酯-20(Tween-20)(pH 5.0)中。
每个抗体分子结合的类美登素分子的数目可通过以分光光度测量在252nm和280nm下的吸光度比率来测定。质谱使得能够监测缀合过程的再现性。类美登素分子相对于抗体的平均数目可以是例如1-10、2-8、2-5、3-5、3-4或3.5±0.5。
为了产生有商业价值的缀合物产物，缀合过程和缓冲液交换必须是有效的。在缀合物1的开发期间，发现当利用常用的缀合缓冲液时，化合物具有溶解性挑战且倾向于从溶液沉淀出。因素诸如净表面电荷和等电点(pI)(分子为中性或不具有净电荷的点)可改变分子的溶解性且可产生导致沉淀的稳定性问题。使用多种方法的许多尝试产生包括聚集物和沉淀物的缀合的材料。聚集和沉淀的耐受性水平取决于化合物的用途；对于意欲用于临床试验或商业生产的材料，耐受性水平通常较低。缀合物1的哪种或哪些特征可造成这些问题是未知的。对于缀合物1，碱性pH的缀合证明是挑战性的，这是因为维持抗体和缀合物在反应pH和配制pH的溶解性所需的离子强度不同。具体地，抗体1在用于反应的碱性pH下在低离子强度缓冲液中沉淀，而缀合物1在用于缀合物配制的酸性pH下在高离子强度缓冲液中沉淀。缀合缓冲液需要足以允许抗体1的缓冲液交换为碱性pH反应缓冲液的离子强度，但足够低以允许缀合物1的缓冲液交换为酸性pH配制缓冲液。或者，稀释反应混合物可用于使离子强度降低至所需水平。最终，在显著工程改造后，发现缀合物1需要pH和盐之间的平衡以便反应完全，以生成稳定且活性的化合物，所述化合物不从溶液沉淀出，也不需要其它不太期望的添加剂或技术来维持溶解性。
由美登素有效负载构成的缀合物可针对其经由目标介导的活性和/或体外非特异性抑制或杀死增殖性细胞的能力来评估。例如，细胞系诸如NCI-H226、NCI-H292和NCI-H322M可容易地用于评价缀合物的非靶向细胞毒性。待评估的细胞可暴露于化合物4至5天且细胞的存活分数可通过已知方法在直接测定中测量。然后可从测定的结果计算IC50值。缀合物1的目标介导的细胞毒性活性也可通过使用表达不同水平的FGFR3抗原的细胞系来评估。
在一些方面，如下文中更充分定义地通过% T/C测量，缀合物能够减小肿瘤体积。
本发明还提供通过向哺乳动物施用有效剂量的缀合物来治疗哺乳动物中的肿瘤生长的方法。适合于根据本发明的治疗的病况涉及优先表达FGFR3的肿瘤细胞。尽管不意欲束缚于任何特定机制，但本方法提供癌细胞(包括例如赘生性生长的癌细胞)的生长、骨转移、器官移植排斥或免疫病症(诸如由FGFR3的表达驱动或涉及FGFR3的表达的自体免疫疾病)的治疗。
在本发明的上下文中，“治疗(treatment)”或“治疗(treat)”是指治疗性治疗，包括减缓、减轻或逆转潜在病况的进展或与疾病或病症相关的不期望的生理变化或改善病况的临床症状。有益或期望的临床结果包括、但不限于症状减轻、疾病或病症的程度的减弱、疾病或病症的稳定(即，其中疾病或病症没有恶化)、疾病或病症的进展的延缓或减缓、疾病或病症的改善或缓和和疾病或病症(部分或全部)的缓解，无论是可检测的还是不可检测的。治疗也可意指与如果不接受治疗的预期存活期相比延长存活期。需要治疗的那些包括已经患有疾病的那些。在一个方面，本发明可用作药物。
在本发明的方法中，将治疗有效量的本发明的缀合物施用于有需要的哺乳动物或患者。此外，本发明的药物组合物可包括治疗有效量的本发明的缀合物。“治疗有效量”或“有效剂量”是指在剂量且持续必需时间段有效实现期望治疗结果的量。缀合物的治疗有效量可根据因素诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及缀合物引发个体中期望反应的能力而变化。其它因素包括施用、目标位点、患者的生理状态、患者是人还是动物和所施用的其它药物。尽管本发明的化合物尤其可用于向人施用，但其也可向其它哺乳动物施用。如本文所使用，术语哺乳动物意欲包括、但不限于人、实验室动物、家养宠物和农用动物。治疗有效量也是缀合物的治疗有益效应超过其任何毒性或有害效应的量。
可调整剂量方案以提供最佳期望反应(例如治疗反应)。治疗剂量可使用本领域技术人员已知的常规方法来滴定以使安全性和功效最佳化。静脉内(i.v.)或非静脉内施用、局部或全身性施用或其组合的给药时间表将通常范围为在单次推注剂量或连续输注至每天多次施用(例如每4-6小时)或如治疗医师和患者的病况所指示。缀合物1的治疗有效量的示例性、非限制性范围为0.1-50mg/kg、更优选为3-35mg/kg，且更优选为5-20mg/kg。给药量和频率将由治疗患者的医师确定，且可包括每天一次、每周三次、每周一次、每两周一次或以更低频率给予的小于1mg/kg至大于100mg/kg的剂量。然而，应注意，本发明不限于任何特定剂量。
缀合物可与一种或多种其它抗癌治疗(包括、但不限于抗血管生成剂、化学治疗剂和抗赘生剂)组合施用。可使用任何合适的抗癌剂，诸如化学治疗剂、辐射、抗体或其组合。
抗癌剂包括、但不限于抗赘生剂、抗体、佐剂和前药。目前本领域中已知或正在评估的抗赘生剂可分成多个种类，包括例如有丝分裂抑制剂、烷化剂、抗代谢物、嵌入抗生素、生长因子抑制剂、细胞周期抑制剂、酶、拓扑异构酶抑制剂、抗存活剂、生物反应改变剂、抗激素和抗血管生成剂。烷化剂的实例包括、但不限于顺铂、环磷酰胺、美法仑和达卡巴嗪。抗代谢物的实例包括、但不限于多柔比星、道诺霉素、紫杉醇、吉西他滨、ALIMTA®，且拓扑异构酶抑制剂包括伊立替康 (CPT-11)、氨基喜树碱、喜树碱、DX-8951f、拓朴替康 (拓扑异构酶I)、依托泊苷 (VP-16)和替尼泊苷 (VM-26)(拓扑异构酶II)。当抗赘生剂为辐射时，辐射的来源对于针对所治疗的患者可以是外部的(外部光束辐射治疗-EBRT)或内部的(近距离治疗-BT)。施用的抗赘生剂的剂量取决于许多因素，包括例如药剂类型、所治疗的肿瘤的类型和严重程度和药剂施用途径。然而，应强调本发明不限于任何特定剂量或给药方案。在一个方面，顺铂是本发明的优选抗赘生剂。
本发明的缀合物也可与抑制和/或调节参与肿瘤生长或血管生成的其它细胞表面受体的抗体和/或小分子抑制剂一起施用。缀合物也可与一种或多种合适的助剂(诸如例如细胞因子(IL-10、IL-4和IL-13))或其它免疫调节剂(诸如、但不限于趋化因子、肿瘤相关抗原和肽)组合施用。
在本发明中，可使用任何合适的方法或途径来施用本发明的缀合物且任选地共同施用抗赘生剂和/或其它受体的拮抗剂。在本发明的组合治疗中，缀合物可与另一药剂(包括、但不限于顺铂)同时、分别或依次施用。根据本发明利用的抗赘生剂方案包括据信最佳适用于治疗患者的赘生性病况的任何方案。不同的恶性肿瘤可需要使用特异性抗肿瘤缀合物和特异性抗赘生剂，其将基于不同的患者而确定。施用途径包括例如经口、静脉内、腹膜内、皮下或肌肉内施用。所施用的拮抗剂的剂量和剂量频率取决于许多因素，包括例如拮抗剂的类型、所治疗的肿瘤的类型和严重程度和拮抗剂的施用途径。然而，应强调本发明不限于任何特定方法或施用途径。
本发明的缀合物，当为了治疗的目的而用于哺乳动物中时，优选配制为药物组合物。此类药物组合物及其制备方法是本领域中众所周知的。参见例如Remington: TheScience and Practice of Pharmacy (Gennaro A., 等人编，第19版, Mack PublishingCo., 1995)。
可将FGFR3的患者表达水平与FGFR3的阈值表达水平相比较。这些阈值水平可取自多种来源，包括、但不限于癌症的动物模型、患者肿瘤微阵列数据或在对照群体(包括对照患者群体)中所见的水平。
FGFR3表达水平可在包括商业可得的试剂盒的多种方法中测量。测量FGFR3表达水平可包括、但不限于测量蛋白或mRNA。在一种此类技术中，将FGFR3标准品或样品添加至用针对人FGFR3 ECD的抗体预包被的板以允许FGFR3结合至抗体。在洗涤未结合的FGFR3和其它蛋白后，添加辣根过氧化物酶标记的识别FGFR3 ECD的抗FGFR3抗体。当将底物添加至孔时，偶联至辣根过氧化物酶的二抗发射浅蓝色。颜色的强度与特异性结合至板的FGFR3的量相关。
在第二种此类用于测量肿瘤组织或细胞中的FGFR3的技术中，制备由工程改造以稳定表达预定义水平的FGFR3的细胞、FGFR3阴性细胞和/或哺乳动物或患者样品生成的标准品，用于免疫组织化学染色。将组织或细胞福尔马林固定石蜡包埋。制备固定的组织用于载片上的免疫组织化学染色。载片与针对人FGFR3的一抗孵育。在洗涤掉未结合的抗体后，在载片上孵育结合至一抗且用辣根过氧化物酶标记的二抗。当将底物添加至载片时，偶联至辣根过氧化物酶的二抗发射浅蓝色。颜色的强度与组织载片中发现的FGFR3的量相关。
可类似地测量总FGFR3-TACC3融合水平。将FGFR3-TACC3标准品或样品添加至用针对人FGFR3 ECD的抗体预包被的板以允许FGFR3-TACC3结合至抗体。在洗涤未结合的FGFR3-TACC3和其它蛋白后，添加识别转位至FGFR3蛋白的TACC3蛋白结构域的二抗。当将底物添加至孔时，偶联至辣根过氧化物酶的二抗发射浅蓝色。颜色的强度与板中发现的FGFR3-TACC3的量相关。
患者的FGFR3突变状况的鉴定可在包括商业可得的试剂盒的多种方法中测量。在一种此类技术中，裂解细胞或组织样品且分离DNA。将分离的DNA用70%乙醇洗涤、干燥且再悬浮于水中。然后将DNA样品与具有特别设计以扩增已知含有目的突变的FGFR3基因的区域的引物一起置于PCR反应中。将所得PCR产物纯化且测序。FGFR3也可经由下一代测序、实时PCR或其它检测或基因组方法鉴定。
FGFR3-TACC3融合状况的鉴定可在包括商业可得的试剂盒的多种方法中测量。在一种此类技术中，裂解细胞或组织样品且分离总RNA。然后使用分离的总RNA来合成cDNA。然后将设计以扩增含有FGFR3-TACC3融合序列的区域的特异性PCR引物与cDNA一起用于PCR反应中。然后在用于分离PCR产物的凝胶上运行PCR反应。用从转染的具有融合体的细胞系生成的标准品跑胶。FGFR3-TACC3融合也可用标准实时PCR和荧光原位杂交(FISH)测定来检测。
可同时、分别或依次完成FGFR3的表达水平、FGFR3的突变、FGFR3的融合或其组合的测量或检测。测量或检测可用包括多峰式高通量PCR的多种技术进行。
本发明还包括用于抑制肿瘤生长和/或血管生成的试剂盒，其包含治疗有效量的缀合物。试剂盒可进一步包含缀合物和额外抗癌剂，包括抗赘生剂或治疗剂，包括、但不限于顺铂。可替代或另外地，试剂盒可含有任何合适的拮抗剂，例如参与下文讨论的肿瘤生成或血管生成的另一生长因子受体(包括EGFR)的拮抗剂。本发明的试剂盒可进一步包含佐剂。
因此，缀合物1可体内和体外用于本领域中众所周知的研究、诊断或治疗方法。本文公开的本发明的原理的改变可由本领域技术人员进行且意欲此类改变包括在本发明的范围内。
应理解且预期本文公开的本发明的原理的改变可由本领域技术人员进行，且意欲此类改变包括在本发明的范围内。
实施例
以下实施例进一步说明本发明，但不应理解为以任何方式限制本发明的范围。常规方法诸如用于构建载体和质粒、将编码多肽的基因插入此类载体和质粒中、将质粒引入寄主细胞中以及表达和测定基因和基因产物的详细描述可获自许多出版物，包括Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, ColdSpring Harbor Laboratory Press (1989) and Coligan, J. et al. CurrentProtocols in Immunology, Wiley & Sons, Incorporated (2007)。
用于缀合物1的人抗FGFR3抗体的表达和纯化
对于各抗体，通过合适方法诸如PCR克隆，将合适的重链核苷酸序列(例如抗体1的SEQID NO. 12)工程改造入合适的表达质粒，例如pGSHC，且将合适的轻链核苷酸序列(例如抗体1的SEQ ID NO. 13)工程改造入合适的表达质粒，诸如pGSLC。为了建立稳定的细胞系，通过电穿孔用线性化的重链和轻链质粒在合适的宿主细胞系(诸如NS0或CHO细胞)中共转染，且在合适的培养基中培养，所述培养基诸如不含谷氨酰胺的具有透析的胎牛血清和谷氨酰胺合成酶补充剂的Dulbecco氏改良的Eagle培养基。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)针对抗体表达筛选克隆，且选择最高生产者用于在旋转烧瓶中培养。通过合适方法诸如蛋白-A亲和层析纯化抗体。
表1提供本发明的缀合物1的抗体1的氨基酸序列和SEQ ID NO。所有CDR序列都使用AbM定义来确定。
表1：本发明的缀合物1的抗体1的氨基酸序列
缀合物1的缀合方法
本发明的缀合物可通过本领域中已知的多种方法来制备，所述方法诸如描述于美国专利号7,811,572、8,383,122、6,441,163、7,368,565、8,163,888和美国申请公开号2011/0003969、2011/0166319、2012/0253021和2012/0259100中的方法。以上公开的方法在导致的产率、纯度、单体、聚集物、游离类美登素的百分比、片段化等的量方面不同。适当的缀合方法的选择取决于终端使用者的需要。
在本发明的一个方面，使用2012/0253021中用于“一步”方法中记载的通用方法，使用磺基-SPDB接头使抗体1缀合至DM4。更具体地，将抗体1浓缩至10mg/mL且渗滤入反应缓冲液中。在具有50mM 4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪丙磺酸(EPPS)、20mM氯化钠、2mM EDTA(pH8.2)、补充有9% DMA(v/v)的缓冲液中，以10mg/mL将抗体1与相对于抗体的5.6摩尔DM4混合。在该混合物中通过添加5.1摩尔磺基-SPDB来缀合抗体1且在15℃反应20小时。用乙酸将缀合混合物的pH调节至5.0，浓缩至20mg/mL，12倍渗滤体积的针对含有10mM乙酸钠的缓冲液(pH 5.0)来渗滤。在含有10mM乙酸盐、9%蔗糖(w/v)、0.01%(w/v)聚山梨醇酯20(pH 5.0)的缓冲液中，以5.0mg/mL配制缀合物。
缀合物1的DAR的UV测定
使用如上文所制备的缀合物1材料，使用紫外线吸收评估缀合物1中DM4比抗体1的DAR。
通过测量缀合物在252nm和280nm的吸光度来计算DAR。使用DM4和抗体两者在这些波长的消光系数，测量溶液中总DM4和抗体的浓度。通过DM4的摩尔数/抗体的摩尔数的比率来定义DAR。
使用Beckman Coulter® DU800分光光度计，通过测量1cm路径长度石英杯中的缀合物溶液在280nm和252nm的吸光度来测定样品浓度。记录非吸收区(320nm)中的测量值，以确保光散射不影响在目标波长的吸光度读取值。用缓冲液稀释样品，使得280nm吸光度结果在仪器的线性范围内(吸光度目标0.7-1.5(或0.5至0.9g/L))，且在浓度计算中使用适当的稀释因子。通过以下方程测定浓度：
方程(1) DM4的摩尔浓度，CDM4(M)：
方程(2) 缀合物1的摩尔浓度，CA(M)：
方程(3) 缀合物1的浓度，CA(mg/mL):
方程(4) 类美登素比抗体比率，DAR：
缩写：
CDM4：DM4的浓度
CA：抗体1的浓度
DAR：类美登素比抗体比率
A280：在280nm的吸光度
A252：在252nm的吸光度
ε 280：在280nm的消光系数
ε 252：在252nm的消光系数
DM4的常数：
消光系数比率252nm/280nm，252nm/280nm, ε 252/ε 280: 4.89
分子量：780.4g/mol
D11抗体的常数：
ε A,280：1.7 mL/(mg*cm)或240,360 M-1cm-1
消光系数比率252nm/280nm，ε 252/ε 280: 0.35
分子量：145.6kDa
方程1通过减去在252nm下由抗体导致的吸光度来测定溶液中DM4的浓度。方程2通过减去由DM4导致的吸光度来测定抗体的浓度。通过计算DM4和抗体浓度的比率来测定DAR(方程4)。
通过大小排阻HPLC，用补充有15%(v/v)异丙醇的170mM磷酸钾、212mM氯化钾(pH7.0)以等度模式测定单体。注入150μg缀合物。在280nm下监测洗脱。将聚集物计算为在主峰前洗脱的所有峰的面积总和。将低分子量种类计算为在主峰后洗脱的所有解析峰的面积总和。
通过双柱SEC/反相HPLC测量游离类美登素水平。用20%乙腈制备缀合物溶液，在室温下孵育30分钟，且在分析之前储存在5℃下。将缀合物注入大小排阻柱(SEC)上，其中将缀合的抗体洗涤过柱。一旦洗脱缀合物，将柱流出物重导向至C-18柱，在该柱中剩余小分子结合且通过梯度程序(含有0.1% TFA的20%乙腈/含有0.1% TFA的80%水)洗脱35分钟。计算峰面积总和。使用来自标准曲线的斜率测定DM4含量。游离类美登素百分比是游离DM4的摩尔数(通过该双柱HPLC方法测定)比总DM4的摩尔数(通过UV DAR方法测定)的比率乘以100。
表2：DAR
产率 89.2%
浓度 4.9
DAR (UV) 3.5
游离类美登素(相比于总DM4的%) 0.7%
代表性批次的缀合物1的DAR是3.5±0.5。
通过表面等离振子共振测定(Biacore®)分析对人FGFR3的结合动力学和亲和力
在装填有运行缓冲液且分析温度设定为25℃的Biacore® T200仪器上，使用表面等离振子共振测定来测定对人FGFR3(IIIb)(FGFR3的剪接形式)的结合亲和力和结合化学计量。在2个流通池上使用含有固定的受体huFGFR3(IIIb)(使用标准NHS-EDC胺偶联生成)的CM5芯片。通过以60nM开始2倍连续稀释(总共6次稀释)于运行缓冲液中来制备缀合物1的样品。以2.5μg/mL(55 RU)固定受体。各分析循环由以下组成：(1)用180秒接触时间以30μL/min注入样品，(2)通过以30μL/min注入缓冲液900秒来解离，(3)在30秒接触时间以40μL/min流速在SDS的0.5%溶液中再生。使用标准双重参考处理数据且使用Biacore® 2000评估软件4.1版拟合至1:1结合模型，以测定结合速率(kon，M-1s-1单位)、解离速率(koff，s-1单位)和Rmax(RU单位)。从KD = koff/kon的关系计算平衡解离常数(KD)。KD以摩尔为单位。
抗体1具有1.3 x 10-10 M的KD。缀合物1以(2.27 ± 0.001) x 105的平均结合速率(kon)和(1.87 ± 0.13) x 10-4的解离速率(koff)结合至huFGFR3(IIIb)。表1显示来自n=3次独立实验的具有计算的标准偏差的实验结果的概述。缀合物1在生理pH和离子强度下以(8.23 ± 0.59) x 10-10 M的KD结合至huFGFR3(IIIb)。
表3：缀合物1对人FGFR3(IIIb)的结合动力学和亲和力
因此，结合不改变未结合的裸抗体的配体结合功能。
酶联免疫吸附(ELISA)测定
缀合物1阻断FGF1配体结合至人FGFR3(IIIb)
以每孔100ng的人FGFR3(IIIb)-Fc(5 µL/孔的PBS中的20μg/mL溶液)点包被标准96孔Multi-Array®板(Meso Scale Discovery® (MSD®) #L15XA-6)，在室温下覆盖且孵育过夜。为了封闭孔中的非特异性结合，将150μL的5% MSD®封闭剂A(R93BA-1)添加至各孔且在室温下孵育1小时。在独立的96孔ELISA板中，以1μg/mL开始制备测试品在PBS、0.05% Tween® 20 (PBS-T)、1% BSA中的1：3连续稀释液。丢弃封闭剂且将每孔30μL的这些稀释液转移入包被且封闭的MSD®板的适当孔中，且在室温下轻轻搅动1小时。倾析板且用200μL/孔PBS-T洗涤两次。将每孔30μL的PBS-T、1% BSA、10μg/mL肝素(Sigma目录号H3149-50KU)中的1μg/mL钌标记的FGF1添加至板且在室温下、在黑暗中轻轻搅动1小时。再次倾析板且用200μL/孔的PBS-T洗涤两次。在洗涤后，将150μL的1×MSD®读取缓冲液(MSD®，#R92TC-2)添加至各孔。电化学刺激后，结合的FGF-1上的钌标记在620nm发光。通过SECTOR® Imager 2400板读取器(MSD®，#1250)中的电荷耦合装置相机检测ECL信号。用GraphPad Prism®软件6.0版绘制作为相对光单位(RLU)测量的电化学发发光。利用软件的对数[抑制剂]相比于反应函数，通过非线性回归曲线拟合分析，来计算IC50值。
缀合物1以3.6nM的IC50阻断FGF1结合至FGFR3，其支持除了结合FGFR3以外，缀合物1也是功能阻断的，因为其阻断同源(FGF1)配体结合至FGFR3。
抗体1阻断FGF1和FGF9结合至FGFR3
评价抗体1(缀合物1的抗体组分)中和配体诱导的具有各种形式的FGFR3(包括突变体、融合体和野生型(WT))的细胞系的增殖的能力。
BaF3是小鼠前B细胞系，其存活取决于小鼠IL-3。当将受体引入BaF3细胞时，其可响应于受体配体而增殖，无需外源性IL-3。
通过逆转录病毒转导，制备表达野生型或突变型人FGFR3的BaF3细胞系。各系为耐嘌呤霉素稳定合并物。将细胞系在BaF3培养基(含有小鼠IL-3和嘌呤霉素)中以20,000至1,000,000个细胞/mL的细胞密度维持，且每1-4天用新鲜培养基稀释。在测定前1至3天，将用于3H胸苷掺入测定的BaF3+FGFR3细胞稀释至20至50,000个细胞/mL。对于测定，细胞培养物密度为100,000至1,000,000个细胞/mL。首先，对于BaF3+FGFR(III3b)WT、+FGFR3(IIIc)WT细胞中的3H胸苷掺入的剂量依赖性刺激测试FGF-1(酸性FGF)和/或FGF-9且与BaF3+MSCV空载体对照细胞进行比较。在室温下以1,000rpm将BaF3系离心3分钟，且用20mL BaF3测定培养基洗涤3次(在每次洗涤后以相同方式离心)。将100μL的BaF3+FGFR3(IIIb)WT、+FGFR3(IIIc)WT或+空载体细胞系以200,000个细胞/mL或800,000个细胞/mL(20,000个细胞/孔或80,000细胞/孔)添加至96孔组织培养板(BD Falcon™ No. 35-3072)的内部60个孔中。将50μL的4×肝素(最终浓度为5或10μg/mL)(或测定培养基)添加至孔中。在测定培养基中(在聚丙烯板中)连续稀释FGF-1或FGF-9(1:2-1:5)。将50μL的4×FGF-1、4×FGF-9或单独的测定培养基添加至孔(一式三份)。将250μL的测定培养基或Dulbecco氏PBS添加至边缘孔中以减少蒸发。在37℃、5% CO2和95% RH下孵育细胞72小时。每孔添加20μL D-PBS(MPBiomedicals No. 2406605)中的0.1mCi/mL胸苷-[甲基-3H]用于最后6小时孵育。在-80℃下冷冻测定板，在37℃下解冻，且使用Filtermate™收集器(Packard)收集于UniFilter-96GF/C板(Perkin Elmer No. 6005174)上。干燥UniFilter板且每孔添加20μl的Microscint-0闪烁液(Perkin Elmer No. 6013611)。在1450-021 Microbeta液体闪烁计数器(Wallac)上计数过滤板上每孔1分钟掺入的3H胸苷。为了针对野生型FGFR3或突变型FGFR3上的FGF-1或FGF-9活性的中和评估抗体1，使用恒定量的人FGF-1或人FGF-9(FGF-1：于FGFR3(IIIc)表达细胞上80ng/mL，于FGFR3(IIIb)表达细胞上800ng/mL；FGF-9：于FGFR3(IIIc)表达细胞上100ng/mL，于FGFR3(IIIb)表达细胞上800ng/mL)。与单独的测定培养基相比，这些浓度的FGF-1或FGF-9提供 3H -胸苷掺入的至少2倍增加。为了将浓度值从μg/mL转换为nM，使用下式：
以μg/mL计的浓度×转换系数=以nM计的浓度，其中转换系数与MW(分子量)成反比；假定MW为150kD，对于单克隆抗体的转换系数为6.667。FGF-1：分子量=15.5kD，因此转换系数为64.45。FGF-9：分子量=23kD，因此转换系数为43。
在室温下以1,000rpm将BaF3系(在获得嘌呤霉素抗性后2代至8代)离心3分钟，且用20mL BaF3测定培养基洗涤3次。将50μL的表达FGFR3(IIIb)WT、FGFR3(IIIc)WT、FGFR3(IIIb)突变体或FGFR3(IIIc)突变体的BaF3细胞以400,000个细胞/mL(20,000个细胞/孔)添加至96孔组织板(BD Falcon™)的内部60个孔中。在独立稀释板(聚丙烯)中，在测定培养基中稀释抗体1或人IgG1同种型对照抗体(至4×最高工作浓度)。进一步在测定培养基中连续稀释(1：3)抗体。将50μL的各测试浓度的抗体添加至含有BaF3细胞的孔中。每次处理使用三个重复的孔测试。对于“单独的培养基”和“单独的FGF”对照，添加50μL的测定培养基，而非抗体。在37℃、95% RH、5% CO2下孵育含有细胞和抗体混合物的板45分钟，然后添加肝素和FGF。将50μL的4×肝素(最终浓度为10μg/mL)添加至所有孔。将50μL的4×FGF-1或4×FGF-9(在测定培养基中稀释)或单独的测定培养基添加至孔(一式三份)。将250μL的测定培养基添加至边缘孔以减少蒸发。在37℃、5% CO2和95% RH下，孵育细胞72小时(表达FGFR3(IIIc)WT或突变体的细胞)至96小时(表达FGFR3(IIIb)WT或突变体的细胞)。每孔添加20μL的D-PBS中的0.1mCi/mL胸苷-[甲基-3H] (MP Biomedicals No. 2406605)，用于最后6小时孵育。收获掺入的3H -胸苷且如上文所述使用1450-021 Microbeta液体闪烁计数器来计数。
表4：抗体1对于中和野生型或突变型人FGFR3上的FGF1或FGF9的IC50值
AVG=平均值；IC50 =半最大抑制浓度；ND=未测定到；WT=野生型。
注：IC50值计算针对抗体1中和FGF1或FGF9诱导的表达人FGFR3(IIIb)WT、FGFR3(IIIc)WT或FGFR3突变的BaF3细胞中的3H -胸苷掺入。
在表4中，抗体1(缀合物1的抗体组分)有效地中和FGF1和FGF9配体诱导的具有WT和突变的FGFR3受体的细胞系的增殖。
细胞毒性研究
缀合物1对于过表达FGFR3的肿瘤细胞系的细胞毒性
为了测定缀合物1的细胞毒性，确立表达FGFR3的膀胱肿瘤和多发性骨髓瘤细胞系的相对FGFR3细胞表面密度。
将细胞系培养48小时，用Gibco®细胞解离缓冲液(不含酶) (Gibco®, #13151-014)收集，且计数细胞。以1000rpm将细胞离心5分钟，用冷PBS(pH 7.4)洗涤一次，且以2 x106个细胞/mL再悬浮于冷PBS(pH 7.4)中。在冰上的96孔圆底板中，用FACS(荧光活化的细胞分选)染色缓冲液(PBS，pH 7.4，3% BSA)中的30μg/mL人IgG封闭细胞1小时。封闭后，以1200rpm将细胞离心5分钟且移取上清液。将100μL的FACS染色缓冲液添加至未染色的对照孔中。将100μL的FACS染色缓冲液中的15μg/mL Alexa488标记的抗体1(用于监测FGFR3内化)、抗KLH(非靶向的对照缀合物)或chKTI抗体(非靶向的对照缀合物)添加至含有细胞的适当测试孔中。将缓冲液和抗体添加至空孔中，且然后将2滴来自Quantum™ SimplyCellular®珠粒试剂盒(Bangs Labs, #816B)的各标准珠粒溶液添加至适当孔中。在冰上在黑暗中孵育板1小时。用FACS洗涤缓冲液(PBS，pH 7.4，0.5% BSA)洗涤细胞和珠粒两次。将细胞再悬浮于50μL的FACS洗涤缓冲液中的5μg/mL 7-氨基放线菌素D(7-AAD)，且将珠粒再悬浮于50μL FACS洗涤缓冲液中。在IntelliCyt® HTFC上读取孔且使用FlowJo软件分析。将由FlowJo生成的中值荧光强度(MFI)值插入由Bangs Lab提供Excel电子表格中，用于抗体结合能力(ABC)测定。报道的值是从使用裸抗体1测定中的特异性ABC值减去使用抗KLH或chKTI抗体测定的非特异性ABC值的结果(参见表5中的标记为“FGFR3细胞表面表达(ABC)”的列)。应注意，以上方法用于测定本文中讨论的并未明确列于表5中的其它细胞系的ABC。
表5：缀合物1在肿瘤细胞系中的细胞毒性
NS=不显著。
观察到细胞毒性随着细胞表面上的FGFR3的表达增加而增加的倾向。这些数据也支持在FGFR3突变和/或融合存在的情况下对缀合物1的敏感性增加，其导致细胞的细胞毒性增强。
细胞毒性测试：抗体1(本发明的抗体组分)可选择性地递送细胞毒性有效负载
抗体1(本发明的抗体组分)可将细胞毒性有效负载选择性地递送至肿瘤细胞。
在90μL的完全培养基中以每孔2500个细胞将细胞铺板于96孔组织板中，且在37℃下在含有5% CO2的湿润氛围中孵育4小时。该孵育临结束前，在圆底96孔板中以3倍连续稀释用完全培养基稀释测试品。在孵育4小时后，将10μL的稀释的抗体与恒定量的缀合的Fab(10nM)混合，添加至细胞板中的对应的孔中，且在37℃下在含有5% CO2的湿润氛围中孵育96小时。在该孵育后，从培养箱移出板且使其达到室温用于所有后续步骤。将100μl的CellTiter-Glo®试剂(Promega #TB288)添加至各孔中，且将板避光孵育2小时。在Spectra Max® M5e多模式微板读取器中检测发光信号。将实验孔计算为未处理的对照孔的百分比。使用GraphPad Prism® 6绘制数据且使用log抑制剂相比于均一化应答、可变斜率、分析来测定IC50。
用表达120,000个抗原的多发性骨髓瘤细胞系KMS-11[t(4;14)，Y373C]( IC50=0.11nM)所见的显著细胞毒性验证了抗体1(缀合物1的抗体组分)可经由与FGFR3结合来递送有效负载。该数据表明细胞毒性效价随着FGFR3抗原密度和突变状态增加而增加，如当所评估的许多膀胱肿瘤细胞系(RT-112(TACC3)表达~16,000个抗原相比于BFTC-905(野生型)表达~11,000个抗原)和多发性骨髓瘤肿瘤细胞系(KMS-11[t(4;14)，Y373C]表达~120,000个抗原相比于OPM-2[t(4;14)，K650E]表达~51,000个抗原相比于LP-1[t(4;14)](野生型)表达约9,000个抗原)间进行比较时所见。尽管缀合物细胞毒性活性的重要组分是抗原密度，但在一些细胞系中与FGFR3突变状态搭配的抗原密度也可以是重要的。
表6：与FGFR3表面表达和FGFR3突变状态相关的效价
NA=在30nM的最大浓度下未获得IC50
细胞系：RT112(TACC3)、Cal-29膀胱、KMS-11[t5(4:14,Y373C]、OPM-2、LP-1多发性骨髓瘤、Kato-III胃、OE-33 SCHNN、转染的Baf3-FGFR3(IIIb)、Baf3-FGFR3(IIIc)。
膀胱(RT112-TACC3)、MM(KMS-11[t(4;14)Y373C]、OPM-2[t(4;14),K650E])、胃Kato-III和转染的Baf3-FGFR3(IIIb)、Baf3-FGFR3(IIIc)细胞系对缀合物1的选择性细胞毒性杀死作用敏感。该效价与FGFR3表面表达和FGFR3突变状态相关。
用缀合物1对膀胱肿瘤细胞系进行细胞毒性测试
缀合物1在许多体外的过表达各种形式的FGFR3的膀胱肿瘤细胞系中是细胞毒性的。
在90μL的完全培养基中以每孔2500个细胞将细胞铺板于96孔组织板中，且在37℃下在含有5% CO2的湿润氛围中孵育4小时。在该孵育临结束前，在圆底96孔板中以3倍连续稀释用完全培养基稀释测试品。在孵育4小时后，将10μL的稀释的抗体添加至细胞板中的对应的孔中，且在37℃下在含有5% CO2的湿润氛围中孵育96小时。在该孵育后，从培养箱移出板且使其达到室温，用于所有后续步骤。将100μL的Cell Titer-Glo®试剂(Promega #TB288)添加至各孔中，且将板避光孵育2小时。用Spectra Max® M5e多模式微板读取器检测发光信号。将实验孔计算为未处理的对照孔的百分比。使用GraphPad Prism® 6绘制数据且使用log抑制剂相比于均一化应答、可变斜率、分析来测定IC50。
结果显示当分子用于处理各过表达FGFR3的膀胱肿瘤细胞系时缀合物1的显著细胞毒性(参见表5)。化合物在过表达ECD中含有突变的FGFR3的UMUC-14肿瘤细胞系中略微更有效，其使得受体具有组成型活性。阴性对照同种型匹配的缀合物显示在任一系中用缀合物1所见的浓度范围内无细胞毒性。实验中包括不过表达FGFR3的膀胱肿瘤细胞系KU-19-19，以评价非特异性细胞毒性。缀合物1对KU-19-19系无细胞毒性。结果显示在FGFR3-TACC3融合受体不存在或存在的情况下，在过表达FGFR3 WT、FGFR3突变体S249C或Y373C的细胞系中可通过缀合物1诱导特异性体外细胞毒性。
FGFR3内化
采用活细胞成像、流式细胞术和各种生物化学分析来进行体外研究，以理解FGFR3突变状态、表面表达和受体介导的抗体内化之间的关系。测定这些因素如何组合以最终影响缀合物细胞毒性。
本文中的数据表明FGFR3内化的速率增加与包括S249C突变和FGFR3-TACC3融合的FGFR3的突变驱动者相关，且这些异常与对缀合物1的敏感性增强相关。抗体内化的定量分析在一组具有多种突变且表达不同水平的表面FGFR3的细胞系上进行。这些细胞系包括：RT-4(TACC3外显子-4，~ 29,000的表面密度抗体结合能力(ABC))、UMUC-14(S249C，ABC ~27,000)、RT-112(TACC3外显子-10，ABC ~16,000)、BFTC-905(WT，ABC ~11,000)、KU-19-19(WT，ABC ≤4,000)和UMUC-3(WT，ABC≤4,000)(部分参见表5和6)。
这些细胞系通过活细胞共焦显微镜和Alexa488荧光标记的抗体的初始表征表明抗FGFR3抗体(抗体1)与人IgG对照(chKTI)相比在一组膀胱细胞系中的特异性内化。
在添加抗体后24小时，RT-112细胞中的抗体1-Alexa488(67nM)的受体介导的内化是显而易见的。在活细胞实验中，见到抗体1内化入细胞中。
在平行活细胞实验中，使用pH活化的染料(pHrodo™)对将抗体-受体复合物递送至溶酶体进行定量，所述染料在中性pH下呈现最少荧光且荧光强度随着pH下降而增加。观察到在添加抗体1后与对照IgG抗体相比pH染料信号的积聚的显著增加，且该效应是受体介导的，因为不表达FGFR3(Baf3R2)的对照细胞没有得到高于背景的可感知的信号。
荧光标记抗体1和对照抗体chKTI(抗体1-Alexa488或chKIT-Alexa488)，将这些与同一组细胞系孵育且允许标记的抗体经48小时时间段内化。在0.5、1、2、4、6、24和48小时收获样品且通过流式细胞术定量细胞相关的荧光。
结果突出整组细胞系中的抗体1-Alexa488的内化程度的显著差异。具有S249C突变的UMUC-14细胞使大多数FGFR3抗体内化，在量和速率两者方面比对照大9倍，而含有TACC3融合体的细胞系RT-112和RT-4使抗体1-Alexa488以大于背景约7倍内化。代表低表达野生型细胞系的BFTC-905、KU-1919和UMUC-3表明抗体1极少至无明显内化。这些数据说明表面受体密度仅为抗体内化的一个决定因素；数据强调受体转运和缀合物诱导的细胞毒性中的活化FGFR3突变和/或FGFR3-TACC3融合蛋白可在内化中发挥重要作用。
功效模型
用多种肿瘤异种移植物模型评估缀合物1的抗肿瘤活性，所述模型包括来源于细胞系和患者两者的模型；且与未缀合的裸抗体(抗体1)进行比较。对照由媒介物或非特异性抗体处理的对照(chKTI或KLH和非目标对照，chKTI-磺基-SPDB-DM4或KLH-磺基-SPDB-DM4)组成。
用缀合物1治疗呈现抗肿瘤活性，导致许多具有差异FGFR3抗原表达模式的人膀胱和多发性骨髓瘤异种移植物中的肿瘤消退或停滞。在各研究中，与裸抗体1相比，缀合物1显示优异的抗肿瘤功效。治疗通过诱导肿瘤细胞凋亡(如通过切割的胱天蛋白酶3诱导所监测)来抑制肿瘤生长。
利用实验动物管理和使用委员会(Institutional Animal Care and UseCommittee)核准且根据美国农业部(United States Department of Agriculture)和美国国立卫生研究院(National Institute of Health)的当前法规和标准执行的动物研究方法。
在HBSS中或作为50%基质胶的混合物植入人膀胱癌或多发性骨髓瘤细胞系之后或将新鲜3-4mm肿瘤片段植入雌性免疫缺陷(无胸腺)或NOD/SCID γ(NSG)小鼠的侧腹中之后，生成异种移植物模型。使用无菌技术，根据批准的IACUC方案指南来进行肿瘤片段制备和植入。
当肿瘤达到指定大小(通常为200-300 mm3)时，通过肿瘤体积将具有肿瘤的小鼠随机化且分入处理组之一中，所述处理组通常包括媒介物、chKTI或KLH抗体对照、抗体1(裸mAb对照)、KLH-磺基-SPDB-DM4或chKTI-磺基-SPDB-DM4(非靶向的缀合物对照)和缀合物1。基于单次或重复(通常每周或每隔一周)给药时间表经由尾静脉推注注射静脉内(i.v.)施用测试品。在大部分研究中，在特定时间点收集EDTA血浆和肿瘤组织以分别测量化合物暴露和细胞凋亡标志物。使用三种不同ELISA测定缀合物1血浆浓度：一种对缀合物的抗体部分是特异性的(总体测定)；一种识别抗体部分和美登素有效负载两者(缀合物测定)；且一种检测游离美登素(游离测定)。简而言之，对于总体测定，捕获具有FGFR3(IIIb)的分子且使用抗人IgG分子检测。对于缀合物测定，捕获具有FGFR3(IIIb)的分子。使用抗美登素抗体检测缀合物，因此该测定对有效负载：抗体比率敏感。在游离测定中，首先使用丙酮沉淀来自样品的所有蛋白，同时将游离美登素保留于上清液中。移取上清液且在竞争ELISA中分析。
使用MSD®分析收集的肿瘤组织的切割的胱天蛋白酶-3。使用QiagenTissueLyser II裂解速冻的肿瘤片段(约100-200 mm3)。使用Hamilton STAR液体处置器将澄清的裂解物针对蛋白浓度均一化，且印入MSD®板中用于分析。根据制造商的方案使用独立384孔板对切割的胱天蛋白酶-3以及总胱天蛋白酶-3进行MSD® CC3(将结果表示为切割/总体的比率)。在封闭和孵育步骤之后，使用BioTek EL406™板洗涤器洗涤板且使用Mesoscale Sector® 2400成像仪分析。对于数据分析(包括单因子ANOVA统计分析)，使用Graphpad Prism®软件。
用卡尺测量肿瘤体积且记录体重，最初每周至少两次且随后每周测量一次。通过式体积 = [(Pi/6) l x w2]计算肿瘤体积，其中Pi等于3.14，w表示宽度且l表示长度。通过以下测定处理的持续时间：1)预定(例如，作用机制研究中的组织学分析的终止)，2)达到研究终点(即，实现统计学显著的肿瘤生长的抑制，或无抗肿瘤效应是明显的)，或3)达到临床终点(例如，肿瘤负荷影响动物福利或存活)。
将实验治疗的抗肿瘤功效表示为T/C比率(以百分比计且如下文概述计算)表示。
如果∆T >0，则%T/C = 100 x ∆T /∆C
其中∆T =研究的最后一天的药物治疗组的平均肿瘤体积减去最初给药日的药物治疗组的平均肿瘤体积；△C=研究的最后一日的对照(在各研究中指定)的平均肿瘤体积减去初始给药日的对照组的平均肿瘤体积。如果△T<0，则使用式=100×△T/T初始来计算消退率(%Reg)而非%T/C。如果肿瘤实现>50%消退，则其为局部反应(PR)。如果不可检测，则肿瘤具有完全反应(CR)。为了比较各组之间的肿瘤生长，使用重复测量方差分析(RM ANOVA)直至最后一日，以使用JMP Statistical Discovery Package(V.9.，SAS Institute Inc.Cary, NC)测定p值(P)。
表7概述本文测试的肿瘤异种移植物模型。以下再现的FGFR3受体密度(ABC)报道于表5中。
表7：测试的异种移植物模型的概述
缀合物1在RT-112人膀胱异种移植物模型中的功效
在RT-112(FGFR3-TACC3)人膀胱异种移植物模型中进行三次独立研究以评估缀合物1的重复静脉内给药后的反应的抗肿瘤功效和耐久性。RT-112(FGFR3-TACC3)是如通过FACS/BANGS分析所测定的表达16,000个受体的人膀胱癌细胞系，其具有近来报导的FGFR3-TACC3基因融合体。
当实现220-270 mm3的平均肿瘤体积范围时，通过肿瘤体积将小鼠随机化。随机化之后，向具有肿瘤异种移植物的动物(n=6至12/组)给予媒介物对照(10μL/g；10mM Tris、80mM NaCl、3.5%蔗糖、0.01% Tween-20，pH 7.5)、KLH、对照抗体1、KLH-磺基-SPDB-DM4或缀合物1。
在这些研究中，包括PK/PD组群动物(n=4)的独立组以研究作用机制。在这些研究中施用单次静脉内剂量的KLH-磺基-SPDB-DM4(以5mg/kg给药)或缀合物1(以2.5和5mg/kg给药)，且使动物在24小时和96小时时安乐死以便得到血浆和肿瘤组织。针对化合物血浆浓度评估血浆样品，且针对细胞凋亡标志物分析肿瘤组织。
在RT-112研究1中，具有肿瘤片段异种移植物的动物(n=6/组)在随机化之后接受媒介物对照(10μL/g；10mM Tris、80mM NaCl、3.5%蔗糖、0.01% Tween-20，pH 7.5)、KLH-磺基-SPDB-DM4(5mg/kg)或缀合物1(5mg/kg)的总共2个静脉内剂量(通过14天时间间隔分开)。
如表8中所示，两个静脉内剂量之后，5mg/kg的剂量的缀合物1抑制RT-112肿瘤的生长，在第99天在6/6(100%)的动物中导致完全反应(CR)且在第154天导致86%消退(5/6完全消退)。在这6只动物中，4/5的存活小鼠到第211天保持无肿瘤，而在单个动物中观察到肿瘤再生长。5mg/kg的剂量的KLH-磺基-SPDB-DM4在2/6的动物中导致CR。
在RT-112研究2(重复给药功效研究)中，在细胞植入后生成的具有肿瘤的小鼠(n=12/组)接受总共3个静脉内剂量(第13天、第35天和第49天)的USP盐水(10μl/g)、抗体1(10mg/kg)、KLH-磺基-SPDB-DM4(5mg/kg)或缀合物1(5mg/kg)。在该研究中，与媒介物对照(p<0.0001)相比，以5mg/kg给药的缀合物1在2个剂量后的第47天导致44%肿瘤消退。在最后一次剂量之后反应维持多于100天，其中9/12的动物实现完全反应(CR)。与盐水对照(p=0.02)相比，以5mg/kg给药的KLH-磺基-SPDB-DM4导致46%的T/C。与裸抗体1相比，缀合物1显著更有效，其中以10mg/kg给药的比较物裸抗体1导致55%的T/C。
在RT-112研究3(剂量反应研究(n=8/组))中，其中在总共5个静脉内剂量(第21天和第35天，随后3个每周一次剂量)后以1.25mg/kg、2.5mg/kg和5mg/kg评估缀合物1的抗肿瘤功效。研究中的对照为10mg/kg的KLH、10mg/kg的抗体1和5mg/kg的KLH-磺基-SPDB-DM4。PK/PD动物的组群(n=4)接受KLH-磺基-SPDB-DM4(5mg/kg)或缀合物1(2.5和5mg/kg)的单一静脉内剂量。
以2.5mg/kg或5mg/kg给药的缀合物1导致分别对应于93%和100%(在第82天)的肿瘤消退。结果显示，到第166天，在1.25mg/kg下2/5的动物中和各自分别以2.5mg/kg和5mg/kg给药后8/8的动物中的完全反应。以1.25mg/kg给药的缀合物1导致肿瘤停滞。以5mg/kg给药的KLH-磺基-SPDB-DM4导致肿瘤停滞，其中在2/7的动物中完全消退，且与媒介物对照(p=0.02)相比，效应是统计学显著的。在观察期(>160天)过程中，消退的肿瘤没有再生长。
表8：RT-112人膀胱异种移植物模型的概述
*：与媒介物、USP盐水或KLH对照比较
NA：不适用。
针对化合物血浆浓度评估血浆样品且针对细胞凋亡标志物分析肿瘤组织。缀合物1的血浆浓度-时间概况显示如由ELISA所测定的缀合物1和总IgG在以2.5和5.0mg/kg(在24小时分别为12.6和32.5μg/mL)静脉内推注施用下经取样时间(96小时)跨度的剂量依赖性浓度。此外，对缀合物1治疗的RT-112反应可在肿瘤组织中检测到，其显示切割的胱天蛋白酶-3水平的剂量依赖性增加，表明化合物的可能的作用模式。
在RT-112研究中，缀合物1导致剂量依赖性显著的功效，其在大部分动物中导致完全反应，且效应为持久的(大于100天)。与抗体1(裸抗体)相比，缀合物1明显更有效。
缀合物1在UMUC-14人膀胱异种移植物模型中的功效
在UMUC-14人膀胱癌异种移植物中，与裸抗体1相比，缀合物1的体内功效在基因上不同于RT-112(FGFR3-TACC3)模型。如由FACS分析和BANGS所测定，UMUC-14细胞系表达约27,000受体密度，且鉴于其具有S249C突变，其具有组成型活性。
用悬浮于HBSS中的5×106个UMUC-14细胞皮下接种NOD/SCID γ(NSG)小鼠(雌性，5-6周龄)。将动物随机分配入治疗剂组中，使得各组的平均肿瘤体积为240-250 mm3。以通过14天时间间隔分开的2个剂量或4个每周一次剂量，静脉内施用抗体1和缀合物1。对照使用缀合物制剂缓冲液(10mM Tris，80mM NaCl，3.5%蔗糖，0.01% Tween-20，pH 7.5)或5mg/kg的非靶向chKTI抗体、chKTI-磺基-SPDB-DM4或KLH-磺基-SPDB-DM4。
在第一研究中，在UMUC-14模型中，以5mg/kg的剂量在肿瘤植入后的第17天和第31天给药的缀合物1在10/10的动物中导致UMUC-14异种移植物的完全消退。结果显示无肿瘤状态维持~15天。在治疗停止后约30天，观察到肿瘤再生长。在第78天和第81天再治疗这些肿瘤之后，以5mg/kg给药的缀合物1不降低肿瘤大小，表明发展肿瘤抗性。
以10mg/kg给药的裸抗体1和以5mg/kg给药的KLH-磺基-SPDB-DM4两者都不显著影响肿瘤生长。在剂量后48小时血浆缀合物1水平达到~87μg/mL，且早在施用后48小时观察到切割的胱天蛋白酶-3水平的显著增加。
在第二研究中，在UMUC-14模型中，缀合物1的4个每周一次剂量之后无肿瘤状态显著延长。缀合物1以剂量依赖性方式抑制UMUC-14肿瘤生长，在5mg/kg的情况下在8/8的动物中实现完全肿瘤消退，在2.5mg/kg的情况下达到肿瘤停滞，且在1.25mg/kg时无效应。动物保持~30天无肿瘤，其后肿瘤开始再生长。
表9：UMUC-14人膀胱异种移植物模型的概述
*：与媒介物或chKTI对照比较
NA：不适用。
在UMUC-14人膀胱研究中，重复的静脉内给药之后的实现100%CR的显著影响随后为肿瘤再生长。
缀合物1在BFTC-905 FGFR3野生型(WT)人膀胱异种移植物模型中的功效
在野生型FGFR3表达存在的情况下，测定缀合物1的功效。用悬浮于HBSS中的2×106个BFTC-905皮下接种NOD/SCID γ(NSG)。在随机化后，按每周一次时间表静脉内施用抗体1和缀合物1。对照使用KLH或chKTI抗体和非靶向KLH-磺基-SPDB-DM4或chKTI-磺基-SPDB-DM4。在组合研究中，每周一次腹膜内施用顺铂。
缀合物1治疗在BFTC-905异种移植物中呈现剂量依赖性抗肿瘤功效，在5mg/kg时实现肿瘤停滞，而在1.25mg/kg和2.5mg/kg时显著抑制肿瘤生长。缀合物1和顺铂的组合以10/10PR导致肿瘤消退，且效应显著大于各单药治疗。缀合物1显示组织切割的胱天蛋白酶-3水平增加的趋势。
表10：BFTC-905人野生型膀胱异种移植物模型的概述
*：与chKTI或KLH对照比较
**：与顺铂和缀合物1比较
NA：不适用。
如由FACS分析和BANGS所测定，在BFTC-905中，人野生型FGFR3膀胱异种移植物细胞系表达约11,000受体密度。缀合物1仅在测试的较高剂量实现肿瘤停滞。与顺铂组合，缀合物1和顺铂的组合治疗显著提高单独的缀合物1的影响，其以10/10 PR导致肿瘤消退。组合效应大于累加效应，如由Bliss独立方法所定义。
缀合物1在KU-19-19 FGFR3阴性人膀胱异种移植物模型中的功效
评估FGFR3阴性膀胱癌异种移植物模型(KU-19-19)中的缀合物1以确立缀合物1的特异性。简而言之，用悬浮于HBSS中的KU-19-19细胞以2×106个细胞/小鼠皮下接种Nu/nu(雌性，5-6周龄)。在随机化后，按每周一次时间表静脉内施用抗体1和缀合物1。对照使用chKTI抗体和非靶向chKTI-磺基-SPDB-DM4。
表11：KU-19-19 FGFR3阴性人膀胱异种移植物模型的概述
*：与chKTI对照比较
NA：不适用。
如所预期，按每周一次时间表以5mg/kg给药的缀合物1针对KU-19-19肿瘤未呈现抗肿瘤效应，表明测试品针对FGFR3抗原的特异性。同样，均以5mg/kg每周一次给药的裸抗体(抗体1)和chKTI-磺基SDPD-DM4未展现抗肿瘤活性。
缀合物1在KMS-11人多发性骨髓瘤异种移植物模型中的功效
评估缀合物1在KMS-11和KMS-11LP(荧光素酶阳性)人多发性骨髓瘤(MM)异种移植物模型中的体内功效。KMS-11表达较高水平的FGFR3(~120,000)且携带染色体转位(t(4;14))和单点突变Y373C。KMS-11LP是亲本KMS-11系的衍生物，其为荧光素酶阳性的且表达较高水平的FGFR3抗原(~159,000)。
用悬浮于HBSS中的10×106个KMS-11或KMS-11LP细胞皮下接种NOD/SCID γ(NSG)小鼠(雌性，5-6周龄)。当肿瘤达到~300 mm3的平均肿瘤体积时，将动物随机分配入治疗剂组中。每周一次或每隔一周一次静脉内施用抗体1和缀合物1。对照使用缀合物制剂缓冲液(10mM Tris，80mM NaCl，3.5%蔗糖，0.01% Tween-20，pH 7.5)或非靶向的KLH抗体和KLH-磺基-SPDB-DM4。
在KMS-11研究1中，用单一剂量的缀合物1的治疗显著抑制KMS-11肿瘤的生长，最初肿瘤停滞，随后肿瘤再生长。收集的肿瘤组织的分析表明切割的胱天蛋白酶-3水平的显著增加，其在剂量后12小时开始，且在第24小时时达到峰值。
在更激进的给药时间表下，缀合物1功效显著提高。在KMS-11研究3中，缀合物1的总共5次每周一次剂量在2/7的动物中导致完全反应，而5/7的动物实现部分反应。然而以该给药时间表用非靶向缀合物对照具有显著效应。
表12：KMS-11人多发性骨髓瘤异种移植物模型的概述
*：与媒介物或KLH对照比较
NA：不适用。
研究显示在缀合物1治疗的KMS-11LP异种移植物中的显著稳健功效，所述KMS-11LP异种移植物与亲本KMS-11(119,000)相比表达略微更高的抗原密度(152,000)。在每14天施用的总共3个剂量后，缀合物1治疗在10/10的动物中导致完全反应，且在第70天观察期期间过程中维持无肿瘤状态。
序列表
<110> Eli Lilly and Company
<120> 针对成纤维细胞生长因子受体-3(FGFR3)的化合物和治疗方法
<130> X20104
<150> 61/917457
<151> 2013-12-18
<150> 61/928025
<151> 2014-01-16
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
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Gly Tyr Met Phe Thr Ser Tyr Gly Ile Ser
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<220>
<223> 合成的
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Trp Val Ser Thr Tyr Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
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Gly
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<220>
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Val Leu Gly Tyr Tyr Asp Ser Ile Asp Gly Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
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Val
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Gly Gly Asn Asn Ile Gly Asp Lys Ser Val His
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Leu Asp Thr Glu Arg Pro Ser
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Gln Val Trp Asp Ser Gly Ser Asp His Val Val
1 5 10
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Met Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Val Ser Thr Tyr Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Val Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Leu Gly Tyr Tyr Asp Ser Ile Asp Gly Tyr Tyr Tyr Gly
100 105 110
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Leu Ser Val Ala Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Ala Thr Phe Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Asp Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Met Tyr
35 40 45
Leu Asp Thr Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Met Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Phe Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Arg Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Gly Ser Asp His
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Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 9
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Met Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Val Ser Thr Tyr Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Val Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Leu Gly Tyr Tyr Asp Ser Ile Asp Gly Tyr Tyr Tyr Gly
100 105 110
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
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Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
130 135 140
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
145 150 155 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
165 170 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
180 185 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
195 200 205
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val
210 215 220
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
225 230 235 240
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
245 250 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
260 265 270
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
275 280 285
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
290 295 300
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
305 310 315 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
325 330 335
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
340 345 350
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
355 360 365
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
370 375 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
385 390 395 400
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
405 410 415
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
420 425 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
435 440 445
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455
<210> 10
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 10
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Leu Ser Val Ala Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Ala Thr Phe Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Asp Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Met Tyr
35 40 45
Leu Asp Thr Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Met Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Phe Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Arg Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Gly Ser Asp His
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Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln
115 120 125
Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly
130 135 140
Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly
145 150 155 160
Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala
165 170 175
Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser
180 185 190
Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val
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Ala Pro Ala Glu Cys Ser
210
<210> 11
<211> 795
<212> PRT
<213> 智人
<400> 11
Met Gly Ala Pro Ala Cys Ala Leu Ala Leu Cys Val Ala Val Ala Ile
1 5 10 15
Val Ala Gly Ala Ser Ser Glu Ser Leu Gly Thr Glu Gln Arg Val Val
20 25 30
Gly Arg Ala Ala Glu Val Pro Gly Pro Glu Pro Gly Gln Glu Leu Val
35 40 45
Phe Gly Ser Gly Asp Ala Val Glu Leu Ser Cys Pro Pro Pro Gly Gly
50 55 60
Gly Pro Met Gly Pro Thr Val Trp Val Lys Asp Gly Thr Gly Leu Val
65 70 75 80
Pro Ser Glu Arg Val Leu Val Gly Pro Gln Arg Leu Val Leu Asn Ala
85 90 95
Ser His Glu Asp Ser Gly Ala Tyr Ser Cys Arg Gln Arg Leu Thr Arg
100 105 110
Val Leu Cys His Phe Ser Val Arg Val Thr Asp Ala Pro Ser Ser Gly
115 120 125
Asp Asp Glu Asp Gly Glu Asp Glu Ala Glu Asp Thr Gly Val Asp Thr
130 135 140
Gly Ala Pro Tyr Trp Thr Arg Pro Glu Arg Met Asp Lys Lys Leu Leu
145 150 155 160
Ala Val Pro Ala Ala Asn Thr Val Arg Phe Arg Cys Pro Ala Ala Gly
165 170 175
Asn Pro Thr Pro Ser Ile Ser Trp Leu Lys Asn Gly Arg Glu Phe Arg
180 185 190
Gly Glu His Arg Ile Gly Gly Ile Lys Leu Arg His Gln Gln Trp Ser
195 200 205
Leu Val Met Glu Ser Val Val Pro Ser Asp Arg Gly Asn Tyr Thr Cys
210 215 220
Val Val Glu Asn Lys Phe Gly Ser Ile Arg Gln Thr Tyr Thr Leu Asp
225 230 235 240
Val Leu Glu Arg Ser Pro His Arg Pro Ile Leu Gln Ala Gly Leu Pro
245 250 255
Ala Asn Gln Thr Ala Val Leu Gly Ser Asp Val Glu Phe His Cys Lys
260 265 270
Val Tyr Ser Asp Ala Pro His Ile Gln Trp Leu Lys His Val Glu Val
275 280 285
Asn Gly Ser Lys Val Gly Pro Asp Gly Thr Pro Tyr Val Thr Val Leu
290 295 300
Lys Thr Ala Gly Ala Asn Thr Thr Asp Lys Glu Leu Glu Val Leu Ser
305 310 315 320
Leu His Asn Val Thr Phe Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Thr Cys Leu Ala
325 330 335
Gly Asn Ser Ile Gly Phe Ser His His Ser Ala Trp Leu Val Val Leu
340 345 350
Pro Ala Glu Glu Glu Leu Val Glu Ala Asp Glu Ala Gly Ser Val Tyr
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Ala Gly Ile Leu Ser Tyr Gly Val Gly Phe Phe Leu Phe Ile Leu Val
370 375 380
Val Ala Ala Val Thr Leu Cys Arg Leu Arg Ser Pro Pro Lys Lys Gly
385 390 395 400
Leu Gly Ser Pro Thr Val His Lys Ile Ser Arg Phe Pro Leu Lys Arg
405 410 415
Gln Val Ser Leu Glu Ser Asn Ala Ser Asn Ser Ser Asn Thr Pro Leu
420 425 430
Val Arg Ile Ala Arg Leu Ser Ser Gly Glu Gly Pro Thr Leu Ala Asn
435 440 445
Val Ser Glu Leu Glu Leu Pro Ala Asp Pro Lys Trp Glu Leu Ser Arg
450 455 460
Ala Arg Leu Thr Leu Gly Lys Pro Leu Gly Glu Gly Cys Phe Gly Gln
465 470 475 480
Val Val Met Ala Glu Ala Ile Gly Ile Asp Lys Asp Arg Ala Ala Lys
485 490 495
Pro Val Thr Val Ala Val Lys Met Leu Lys Asp Asp Ala Thr Asp Lys
500 505 510
Asp Leu Ser Asp Leu Val Ser Glu Met Glu Met Met Lys Met Ile Gly
515 520 525
Lys His Lys Asn Ile Ile Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Gln Gly Gly
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Pro Leu Tyr Val Leu Val Glu Tyr Ala Ala Lys Gly Asn Leu Arg Glu
545 550 555 560
Phe Leu Arg Ala Arg Arg Pro Pro Gly Leu Asp Tyr Ser Phe Asp Thr
565 570 575
Cys Lys Pro Pro Glu Glu Gln Leu Thr Phe Lys Asp Leu Val Ser Cys
580 585 590
Ala Tyr Gln Val Ala Arg Gly Met Glu Tyr Leu Ala Ser Lys Cys Ile
595 600 605
His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Thr Glu Asp Asn Val
610 615 620
Met Lys Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Val His Asn Leu Asp
625 630 635 640
Tyr Tyr Lys Lys Thr Thr Asn Gly Arg Leu Pro Val Lys Trp Met Ala
645 650 655
Pro Glu Ala Leu Phe Asp Arg Val Tyr Thr His Ser Asp Val Ser Phe
660 665 670
Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile Phe Thr Leu Gly Gly Ser Pro Tyr Pro
675 680 685
Gly Ile Pro Val Glu Glu Leu Phe Lys Leu Leu Lys Glu Gly His Arg
690 695 700
Met Asp Lys Pro Ala Asn Cys Thr His Asp Leu Tyr Met Ile Met Arg
705 710 715 720
Glu Cys Trp His Ala Ala Pro Ser Arg Pro Thr Phe Lys Leu Val Glu
725 730 735
Asp Leu Asp Arg Val Leu Thr Val Thr Ser Thr Asp Glu Tyr Leu Asp
740 745 750
Leu Ser Ala Pro Phe Glu Tyr Ser Pro Gly Gly Gln Asp Thr Pro Ser
755 760 765
Ser Ser Ser Ser Gly Asp Asp Ser Val Phe Ala His Asp Leu Leu Pro
770 775 780
Pro Ala Pro Pro Ser Ser Gly Gly Ser Arg Thr
785 790 795
<210> 12
<211> 1368
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 12
gaggtccagc tggtacagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaagtc 60
tcctgcaagg cttctggcta catgtttacc agctatggga tcagttgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg gtcagcactt acaatggtga cacaaactat 180
gcgcagaagt tccagggcag agtcaccgtg accacagaca catccacgag cacagcctac 240
atggagctga ggagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagtcttg 300
ggatactatg atagtataga tggctactac tacggtatgg acgtctgggg ccaagggacc 360
acggtcaccg tctcaagcgc tagcaccaag ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc 420
tccaagagca cctctggggg cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc 480
gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg 540
gctgtcctac agtcctcagg actctactcc ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc 600
agcttgggca cccagaccta catctgcaac gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg 660
gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca 720
cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 780
atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 840
gaggtcaagt tcaactggta tgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 900
cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccaa 960
gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 1020
atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 1080
cccccatccc gggaggagat gaccaagaac caagtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 1140
ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 1200
aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctattc caagctcacc 1260
gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 1320
ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggcaaa 1368
<210> 13
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 13
cagtctgtgc tgactcagcc accctcactg tcagtggccc caggaaagac ggccaccttt 60
acctgtgggg gaaacaacat tggagacaag agtgttcact ggtaccggca gaagccaggc 120
caggcccctg tcctggtcat gtatcttgat accgaacggc cctcagggat ccctgagcga 180
atgtctggct ccaactttgg gaacacggcc accctgacga tcaccagggt cgaagccggg 240
gatgaggccg actattactg tcaggtgtgg gatagtggta gtgatcatgt ggtcttcggc 300
ggagggacca agctgaccgt cctaggtcag cctaaggctg ccccctcggt cactctgttc 360
ccgccctcct ctgaggagct tcaagccaac aaggccacac tggtgtgtct cataagtgac 420
ttctacccgg gagccgtgac agtggcctgg aaggcagata gcagccccgt caaggcggga 480
gtggagacca ccacaccctc caaacaaagc aacaacaagt acgcggccag cagctacctg 540
agcctgacgc ctgagcagtg gaagtcccac agaagctaca gctgccaggt cacgcatgaa 600
gggagcaccg tggagaagac agtggcccct gcagaatgct ct 642

Claims (25)

1.式I的化合物：
其中n为1-10的整数且R为结合至人FGFR3(SEQ ID NO 11)的细胞结合剂，且包含具有序列GYMFTSYGIS (SEQ ID NO 1)的CDRH1、具有序列WVSTYNGDTNYAQKFQG (SEQ ID NO 2)的CDRH2、具有序列VLGYYDSIDGYYYGMDV (SEQ ID NO 3)的CDRH3、具有序列GGNNIGDKSVH (SEQID NO 4)的CDRL1、具有序列LDTERPS (SEQ ID NO 5)的CDRL2和具有序列QVWDSGSDHVV(SEQ ID NO 6)的CDRL3。
2.权利要求1的化合物，其中所述细胞结合剂进一步包含以下可变重链氨基酸序列：
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYMFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSTYNGDTNYAQKFQGRVTVTTDTSTSTAYMELRSLRSEDTAVYYCARVLGYYDSIDGYYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO 7)；和
以下可变轻链氨基酸序列：
QSVLTQPPSLSVAPGKTATFTCGGNNIGDKSVHWYRQKPGQAPVLVMYLDTERPSGIPERMSGSNFGNTATLTITRVEAGDEADYYCQVWDSGSDHVVFGGGTKLTVLG (SEQ ID NO 8)。
3.权利要求2的化合物，其中所述细胞结合剂进一步包含：包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链；和包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链。
4.权利要求3的化合物，其中所述细胞结合剂进一步包含：各自包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的两条轻链；和各自包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的两条重链。
5.权利要求1-4的化合物，其具有2.0至5.0的药物比抗体比率。
6.权利要求1-4的化合物，其具有3.5 ± 0.5的药物比抗体比率。
7.药物组合物，其包含权利要求1-6中任一项的化合物连同药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
8.权利要求7的药物组合物，其进一步包含额外药剂。
9.权利要求1-6中任一项的化合物，其用于治疗。
10.权利要求1-6中任一项的化合物，其用于治疗癌症。
11.权利要求1-6中任一项的化合物，其用于治疗FGFR3表达水平大于对照群体中的FGFR3表达水平的患者中的癌症。
12.根据权利要求11的用于治疗的权利要求1-6中任一项的化合物，其中所述对照群体包含至少一个未患有癌症的个体。
13.权利要求1-6中任一项的化合物，其用于治疗患者中的癌症，所述患者具有：
(a) FGFR3 (SEQ ID NO 11)的突变，其中所述突变选自S249C、R248C、Y373C、Y375C及其组合；
(b) FGFR3-TACC3的融合；或
(c) (a)和(b)的组合。
14.权利要求1-6中任一项的化合物，其用于治疗患者中的癌症，所述患者具有：
(a) FGFR3 (SEQ ID NO 11)的突变，其中所述突变选自S249C、R248C、Y373C、Y375C及其组合；
(b) FGFR3-TACC3的融合；或
(c) (a)和(b)的组合，
其中所述治疗包括通过离体或体外确定所述患者的生物样品中存在(i)S249C、R248C、Y373C、Y375C突变中的一种或多种；(ii)FGFR3-TACC3的融合；或(iii)(i)和(ii)的组合来确定所述患者是否具有(a)FGFR3 (SEQ ID NO 11)的突变，其中所述突变选自S249C、R248C、Y373C、Y375C及其组合；(b)FGFR3-TACC3的融合；或(c)(a)和(b)的组合。
15.权利要求1-6中任一项的化合物，其用于根据权利要求10-14中任一项使用，其中所述癌症是膀胱癌或多发性骨髓瘤。
16.权利要求1-6中任一项的化合物，其用于根据权利要求10-15中任一项使用，其中所述化合物与另一抗癌治疗同时、分别或依次施用。
17.权利要求1-6中任一项的化合物，其用于根据权利要求16使用，其中所述抗癌治疗选自抗血管生成剂、化学治疗剂和抗赘生剂。
18.权利要求1-6中任一项的化合物，其用于根据权利要求17使用，其中所述抗赘生剂是顺铂。
19.治疗哺乳动物中的癌症的方法，其包括向有需要的所述哺乳动物施用权利要求1-6的化合物，其中所述癌症选自膀胱癌或多发性骨髓瘤。
20.权利要求19的方法，其进一步包括向所述哺乳动物施用另一抗肿瘤治疗，其中所述抗癌治疗选自抗血管生成剂、化学治疗剂和抗赘生剂。
21.权利要求20的方法，其中所述抗赘生剂是顺铂。
22.治疗患者中的癌症的方法，其包括以下步骤：
(a) 测量取自所述患者的样品中的FGFR3(SEQ ID NO 11)的表达水平，其中所述样品选自血液、血清、血浆、尿液和组织；和
(b) 如果所述FGFR3表达水平高于存在于对照群体中的FGFR3表达水平，则向所述患者施用根据权利要求1-6中任一项的化合物。
23.治疗患者中的癌症的方法，其包括以下步骤：
(a) 确定取自所述患者的样品中的异常的存在，其中所述异常是：
(1) FGFR3 (SEQ ID NO 11)的突变，其中所述突变选自S249C、R248C、Y373C、Y375C及其组合；
(2) FGFR3-TACC3的融合；或
(3) (1)和(2)的组合，
且其中所述样品选自血液、血清、血浆、尿液、组织、肿瘤细胞、肿瘤组织样品、循环肿瘤细胞和循环DNA，和
(b) 如果存在所述异常，则向所述患者施用根据权利要求1-6中任一项的化合物。
24.用于确定患有癌症的受试者是否是权利要求1-6的化合物的候选者的方法，其包括： 离体或体外测定所述受试者的样品中的FGFR3(SEQ ID NO 11)表达水平，其中所述样品选自血液、血清、血浆、尿液和组织，其中与未患有癌症的个体中的FGFR3表达水平相比，FGFR3表达水平的增加指示所述受试者是化合物的候选者。
25.用于确定患有癌症的受试者是否是权利要求1-6的化合物的候选者的方法，其包括：
(a) 离体或体外确定取自患者的样品中的异常的存在，其中所述异常是：
(1) FGFR3 (SEQ ID NO 11)的突变，其中所述突变选自S249C、R248C、Y373C、Y375C及其组合；
(2) FGFR3-TACC3的融合；或
(3) (a)或(b)的组合；且
(b) 其中所述样品选自血液、血清、血浆、尿液、组织、肿瘤细胞、肿瘤组织样品、循环肿瘤细胞和循环DNA。
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