CN112218879A - 用于口服递送的改进的病毒样纳米颗粒 - Google Patents

Abstract

提供了基于戊型肝炎病毒(HEV)的病毒样纳米颗粒(HEVNP)，其由含有与金纳米簇缀合的开放阅读框2(ORF2)蛋白的至少一部分的修饰的衣壳蛋白制成。还提供了使用HEVNP靶向递送核酸的方法。

Description

用于口服递送的改进的病毒样纳米颗粒

相关申请

本申请要求2018年6月6日提交的美国临时专利申请第62/681,637号的优先权，所述美国临时专利申请的内容在此出于所有目的通过引用以其整体并入。

美国政府对本申请权利的声明

本申请的基础发明是在美国国立卫生研究院以及国家食品和农业研究所给予的第EB021230、CA198889和Ca-D*MCB-7399-H号基金的美国政府支持下完成的。政府享有本发明的某些权利。

发明背景

病毒样颗粒(VLP)可以用作用于靶向递送诊断和治疗方案，如DNA/RNA和各种化学治疗剂的纳米载体。戊型肝炎病毒(HEV)是引起人类急性肝炎的肠传播病毒。HEV病毒样颗粒(HEV VLP)是衣壳蛋白二十面体笼，其可以通过在真核表达系统中表达主要衣壳蛋白HEV开放阅读框2(ORF2)而产生。HEV VLP在酸和蛋白水解环境中是稳定的，这是HEV的天然传播途径所需的特征。因此，HEV VLP代表可以用于例如递送治疗剂、显像剂或疫苗的有希望的纳米载体。

利用HEV的通过口腔途径的天然感染，基于HEV的递送技术被设计用于通过口服施用的治疗用途。尽管HEV VLP相当稳定，但暴露于消化道中的极端pH和酶促活性仍会带来某些挑战。因此，迫切需要开发HEV VLP的新型修饰以在这些条件下实现改进的稳定性，并因此产生更可靠的基于HEV的递送系统。本发明满足了这种和其它相关的需要。

发明概述

本发明提供了新的和改进的HEV纳米颗粒(HEVNP)，其具有改进的稳定性(尤其是在较高的pH值下)的表面缀合的金纳米簇，因此特别适于通过口服施用递送由HEV-VLP携带的治疗方式。

在第一方面，本发明提供了修饰的衣壳蛋白，其包含戊型肝炎病毒(HEV)开放阅读框2(ORF2)蛋白的一部分，在SEQ ID NO：1所示的HEV ORF2蛋白氨基酸序列的342-344、402-408、510-514、493-498、570-579、529-536或520-525区段或者SEQ ID NO:2、3、4、5或6相应区段中的至少一个氨基酸被半胱氨酸替代，并且所述半胱氨酸继而与选自具有大于20的原子序数的第3族至第18族的元素的纳米簇缀合。

在一些实施方案中，所述元素是金或银。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1中所示的HEV ORF2蛋白氨基酸序列的氨基酸残基342或573(或342和573两者)或者SEQ ID NO:2、3、4、5或6的相应残基被半胱氨酸替代。在一些实施方案中，所述半胱氨酸是化学衍生的，例如用6-碳间隔基pMBA44衍生的，并且通过接头，例如马来酰亚胺接头与金纳米簇缀合。在一些实施方案中，所述纳米簇与所述半胱氨酸水平距离离为约2-3nm，并且垂直距离为约2nm。在一些实施方案中，所述纳米簇的直径为约1.5-3nm。

在第二方面，本发明提供了组合物，其包含(1)以上和本文所述的修饰的HEV ORF2衣壳蛋白和(2)封装在由所述修饰的衣壳蛋白形成的HEV病毒样颗粒(VLP)中的生物活性剂(例如，异源多核苷酸，DNA或RNA，或者异源多肽，如胰岛素蛋白或者编码胰岛素的DNA或RNA)。

在一些实施方案中，所述组合物还包含药学上可接受的赋形剂，例如，特别适于旨在口服施用的制剂的一种或多种赋形剂。

在第三方面，本发明提供了将生物活性剂(例如，异源多核苷酸，DNA或RNA，或者异源多肽，如胰岛素蛋白或者编码胰岛素的DNA或RNA)靶向递送至肝细胞的方法。所述方法包括使肝细胞与以上和本文所述的任何组合物接触的步骤。

在一些实施方案中，肝细胞在患者体内，并且接触步骤包括将以上和本文所述的组合物施用至所述患者。在一些实施方案中，施用是口服施用。在一些实施方案中，修饰的衣壳蛋白用pMBA44衍生，并且通过马来酰亚胺接头与金纳米簇缀合。在一些实施方案中，生物活性剂是编码胰岛素、胰岛素原或前胰岛素原的多核苷酸序列。在其它实施方案中，生物活性剂是胰岛素多肽。在一些实施方案中，所述患者已被诊断患有可通过所述生物活性剂治疗的疾病或病况，例如糖尿病。

附图简述

图1：用AuNC表面功能化HEV-VLP。(A)HEVNP的衣壳蛋白组合物包括包含壳(s)、中间(m)和突出(p)结构域的二聚体亚基。用连接至M结构域的富含脯氨酸的铰链稳定P结构域，而S结构域稳定二十面体壳。P结构域用于表面功能化。此处，用半胱氨酸替代残基573(以黄色突出显示)以允许硫醇交换二硫键。二聚体形成通过5倍轴的局部分子间相互作用稳定的五聚体(因此是十聚体)，并通过3倍的Ca+桥组装成HEVNP的衣壳。(B)Au102-pMBA-C6-马来酰亚胺(AuNC)通过硫醇交换反应与573C缀合。(C)使用冷冻电子显微镜(Cryo-EM)表征AuNC并通过单颗粒分析处理3D重建的数据。无Au和Au缀合的比较以箭头所指的高强度区为特征。(D)用HEVNP作为对照和HEVNP+Au102C6产生的3D重建显示5倍轴周围的高强度区(E)，表明5倍轴周围的AuNC定位和稳定。

图2：由于5倍界面处分子间相互作用减弱，HEVNP的稳定性在高pH下降低。(A)HEVNP在pH6.2和pH8.0下的TEM图像；在pH8.0下显示较大的颗粒。(B)圆形平均和1-D强度分布。观察到在pH8.0的HEVNP比不含AuNC的HEVNP大约10-15％。(C)进行分子建模，观察到随着pH增加至8，分子间相互作用在5倍时降低。

图3：在AuNC-C6缀合后HEVNP的稳定性增强。(A)与AuNC-C6缀合的HEVNP的TEM图像揭示了HEVNP的总体尺寸不随pH增加而改变。(B)圆形平均和1-D强度分布。数据显示，由于pH增加，HEVNP大小没有变化。(D)2D强度切片横截面分析揭示了Cryo-EM重建的3D密度图的5倍处的高强度区。(E)模型，其显示了通过HEVNP的二十面体5倍轴周围AuNC-C6的共定位潜在地保留了关键分子间相互作用的机制。

图4：显示HEVNP的3个不同结构域的HEVNP单体。壳结构域(S)(AA:118-317)在亚基间相互作用中是关键的，稳定二十面体衣壳。中间结构域(M)(AA:318-451)与S结构域结合并相互作用。突出结构域(P)(452-606)在2倍轴处形成二聚体尖峰(spike)。M结构域通过富含脯氨酸的铰链与P结构域连接，这促进突出尖峰的拓扑变化。

图5：通过可延伸的间隔臂在位置#N573C处与HEVNP的AuNC缀合的建模。HEVNP的5倍二十面体轴周围AuNC的共定位。

图6：在S结构域5倍处的径向线索，显示了在AuNC缀合中观察到的高密度区和在WT构建体中不存在这些高密度区。

图7：显示5倍轴周围的电子致密区的实验数据和建模数据的比较。完全占用允许5倍周围的5个独特密度，部分占用将允许4个或更少的AuNC在5倍周围共定位。Cryo-EMSingle Patrice重建分析表明，AuNC在水平上(垂直于5倍轴)是柔性的(范围为2-3nm)，并且在垂直上约2nm。

图8：5倍周围的AuNC共定位以保留TYR288和ASN200之间的关键分子间相互作用的建模。在B中，P二聚体的柔韧性允许向5倍中心弯曲；在没有AuNC缀合的情况下，在HEVNP对照图谱中没有观察到这种结构几何结构。在C中，总结了P结构域的柔韧性以及TYR288和ANS200的保留。

图9：HEVNP上具有指定几何结构的增强的锚定和位点的残基402-408、342-344和突出结构域中的残基521-526内的另外锚位点，以允许HEVNP的稳定的有效约束-缀合。

图10：在残基402-408、342-344和突出结构域中的残基521-526上半胱氨酸替代的新的组成修饰。

图11：与我们以前建立的工程化N573C位点相比，到5倍轴的相对平均距离。

图12：所选环上氨基酸的组成。左边的前两个来自M结构域，最后一个(黄色)来自HEVNP的P结构域。

图13：所选氨基酸(324-344)相对于5倍轴(用洋红色标记)的位置。

图14：所选氨基酸(402-408)相对于5倍轴(用洋红色标记)的位置。

图15：所选氨基酸(521-526)相对于5倍轴(用洋红色标记)的位置。

图16：有效封装核酸的优化的阳离子浓度。

图17：首次在P结构域以及M结构域周边的缀合位点的基于结构的设计。可以通过基因工程和/或化学缀合方法实现与这些位点的缀合。

图18：地特胰岛素(insulin-detemir)封装的HEVNP的电子显微镜断层扫描重建(左边：TEM显微照片；右边：HEVNP和封装的地特胰岛素的3D重建)。

图19：M结构域缀合位点(蓝色的残基342-344和红色的残基402-408)。朝向HEVNP的五倍轴的平均距离和锚固角的几何测量。

图20：通过基因和/或化学插入使用M结构域(蓝色)和P结构域(橙色)位点形成构象表位的双重插入。

图21：M结构域(342C)和P结构域(573C)上缀合位点的详细测量，以揭示两个位点之间的距离及其相距5倍轴中心的距离。在图B中，说明了形成四元表位的P结构域(橙色)和M结构域(蓝色)上的2个不同的肽插入。

图22：HEVNP的5倍轴周围的AuNC超级簇形成的结构引导的建模，其基于使用具有直接电子检测技术的Cryo-EM的高分辨率3D重建。

图23：AuNC功能化后HEVNP的温度耐受性测试，显示了HEVN-AuNC可以在20分钟的持续时间内经受高达70℃的温度。在右边，使用水浴和精确的温度测量进行实验设置。

图24：使用β-配对的标签和捕集器对HEVNP进行另外的表面功能化，以增强HEVNP的表面模块化从而携带更大的蛋白质。

图25：所有6种形式的ORF2(SEQ ID NO:1-6)的序列比对。

定义

如本说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“所述/该(the)”包括复数指示物，除非上下文另外明确规定。

“戊型肝炎病毒”或“HEV”是指病毒、病毒类型或病毒类别，其i)引起传播的感染性肝炎；ii)在血清学特征方面不同于甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)或丁型肝炎病毒(HDV)；和iii)含有与插入在pTZKF1(ET1.1)中的1.33kb cDNA同源的基因组区域，所述pTZKF1(ET1.1)是以登录号67717保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的大肠杆菌菌株中包含的质粒。

关于HEV的术语“衣壳蛋白”和“修饰的衣壳蛋白”是指成熟的或修饰的(例如，截短的、重组突变的或化学衍生的)HEV开放阅读框2(ORF2)多肽。如本文所用，提及这样的ORF2多肽或蛋白质意在包括全长多肽及其片段，并且还包括对ORF2蛋白质进行的任何取代、缺失、或插入或其它修饰。衣壳蛋白必须能够形成病毒样颗粒(VLP)。通常，衣壳蛋白至少含有HEV ORF2的残基112-608，尽管衣壳蛋白可以耐受多种另外的取代、缺失或插入，只要它们在不消除VLP形成的情况下耐受即可。

在一个实施方案中，术语“修饰的衣壳蛋白”是指衣壳蛋白或其部分(即，小于衣壳蛋白的全长)，其中存在诸如添加、缺失、取代中的一种或多种的修饰，但所得修饰的衣壳蛋白仍然能够形成VLP。这些修饰包括在美国专利第8,906,862号和第8,906,863号、WO2015/179321中描述的那些。例如，可以在诸如区段483-490、530-535、554-561、573-577、582-593或601-603内的位置，或者紧接在残基Y485之后将异源多肽插入衣壳蛋白或其部分中，参见美国专利第8,906,862号和第8,906,863号。作为另一个实例，WO2015/179321描述了修饰的衣壳蛋白的其它实例，其中HEV ORF2的P结构域的表面可变环被修饰以掺入在野生型衣壳蛋白序列中不存在的一个或多个半胱氨酸或赖氨酸。可选地或另外地，术语“修饰的衣壳蛋白”是指衣壳蛋白或其部分，其中HEV ORF2的至少一个残基(例如，位置342或573或两者)被修饰以掺入在野生型衣壳蛋白序列中不存在的一个或多个半胱氨酸或赖氨酸。可选地或另外地，术语“修饰的衣壳蛋白”是指衣壳蛋白或其部分，其中半胱氨酸或赖氨酸(例如，HEVORF2的S、M或P结构域的半胱氨酸或赖氨酸，或者在位置342或573或两者重组引入的半胱氨酸/赖氨酸)被化学衍生以共价缀合至蛋白的至少一个异源原子或分子。可以插入半胱氨酸或赖氨酸，使得HEV ORF2蛋白长度增加，或者半胱氨酸或赖氨酸可以替代S、M或P结构域表面可变环和/或C末端的一个或多个残基。

通常，修饰的衣壳蛋白保留了形成HEV VLP的能力。在一些情况下，一个或多个半胱氨酸或赖氨酸与生物活性剂(例如，细胞靶向配体，如肽LXY30)缀合。P结构域表面可变环包含例如HEV ORF2的残基475-493；残基502-535；残基539-569；残基572-579；以及残基581-595(SEQ ID NO:1、2、3、4、5或6)中的一个或多个。P结构域表面可变环还包含多肽的残基，其包含这样的氨基酸序列，其与SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6中的一个或多个具有至少约80％、85％、90％、95％、99％或更多的同一性并且对应于SEQ ID NO:1、2、3、4、5或6的残基475-493；残基502-535；残基539-569；残基572-579；以及残基581-595中的一个或多个。

如本文所用，术语“病毒样颗粒”(VLP)是指由衣壳蛋白形成的二十面体壳(例如，T1或T3)。VLP由于缺乏病毒基因组而不是感染性的。“VLP”是指衍生自戊型肝炎病毒衣壳蛋白HEV ORF2、其部分的非复制型二十面体病毒壳。VLP可以在适当的表达系统中重组表达蛋白质时自发地形成。在一些实施方案中，VLP由修饰的衣壳蛋白，例如在HEV ORF2的表面可变环中含有一个或多个半胱氨酸/赖氨酸残基的衣壳蛋白，或其部分形成。HEV VLP可以含有修饰的和/或未修饰的HEV ORF2蛋白的混合物。

在HEV VLP的上下文中，术语“酸和蛋白水解稳定的”是指对哺乳动物消化系统的酸和蛋白水解环境具有抗性的HEV VLP。评估酸和蛋白水解稳定性的方法描述于Jariyapong等人,2013，并且包括但不限于使HEV VLP经受酸(例如，pH为或为约6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5或2)和/或蛋白水解环境(例如，胰蛋白酶和/或胃蛋白酶)，并且通过电子显微镜、凝胶过滤色谱法或其它合适的方法检查接触的HEV VLP以确定是否保留了HEV VLP的四级结构(例如，T＝1、T＝3、二十面体、十二面体等)。HEV VLP群体(例如，修饰的或未修饰的)可以在酸和/或蛋白水解条件下孵育合适的时间段(例如，至少或至少约1、2、3、4、5、10、15、20、30、45或60分钟)，然后测试以确定四级结构保留的程度。在这样的上下文中，酸和蛋白水解稳定的修饰的HEV VLP是指修饰的HEV VLP，当在酸和/或蛋白水解条件下作为VLP群体孵育并通过电子显微镜测定时，该群体的VLP的至少10％、25％、50％、75％、90％、95％、99％或100％保留它们的四级结构。

可选地，可以通过口服途径将HEV VLP递送至对象，并且通过检测和/或定量评估递送效率：(i)对HEV VLP内的抗原的免疫应答；(ii)与HEV VLP缀合、重组引入HEV VLP或被HEV VLP封装的可检测标记物；或者(iii)由于向细胞递送与HEV VLP相关的生物活性剂(例如，重组引入HEV VLP、与HEV VLP缀合或被HEV VLP封装)而引起的生物应答。在这样的上下文中，酸和蛋白水解稳定的修饰的HEV VLP是指保留未修饰的HEV VLP的至少10％、25％、50％、75％、90％、95％、99％或100％的口服递送功效和/或细胞进入活性的修饰的HEVVLP。

在描述两个元件的相对位置的上下文中使用的术语“异源的”是指不是天然存在于相同的相对位置的诸如核酸(例如，启动子或蛋白编码序列)或蛋白质(例如，HEV ORF2蛋白质或其部分、或修饰的衣壳蛋白质和另一种蛋白质)的两个元件。因此，基因的“异源启动子”是指与该基因不是天然可操作地连接的启动子。类似地，在HEV VLP或HEV衣壳蛋白的上下文中的“异源多肽”或“异源核酸”是衍生自非HEV来源的一种。

已知戊型肝炎病毒(HEV)引起严重的急性肝衰竭。HEV属于肝炎病毒科中的肝炎病毒属。HEV含有约7.2kb的单链正义RNA分子。RNA是3'聚腺苷酸化的并且包括三个开放阅读框(ORF)。ORF1编码位于基因组的5'一半的病毒非结构蛋白。ORF2编码位于基因组3'末端的蛋白质形成病毒衣壳。ORF3编码与ORF1的C-末端和ORF2的N-末端重叠的13.5-kDa蛋白质。ORF3与膜以及细胞骨架部分相关。

本文所用的术语“封装”或“封装的”是指在本文所定义的VLP内包封异源物质，如异源核酸或蛋白质、化学治疗剂、显像剂、铁氧体纳米颗粒等。

术语“生物活性剂”是指靶向特定生物学位置(靶向剂)和/或提供可在体内或体外证明的一些局部或全身性生理或药理作用的任何药剂、药物、化合物或其混合物。非限制性实例包括药物、激素、疫苗、抗体、抗体片段、维生素和辅因子、多糖、碳水化合物、类固醇、脂质、脂肪、蛋白质、肽、多肽、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸和核酸(例如，mRNA、tRNA、snRNA、RNAi、DNA、cDNA、反义构建体、核酶等)。

“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”材料是这样的材料，其不是生物学上有害的或在其它方面不期望的，即该材料可以与衣壳蛋白或HEV VLP或本发明的组合物一起施用至个体而不会引起任何不期望的生物效应。该材料也不会以有害的方式与含有该材料的组合物中的任何组分相互作用。

术语“赋形剂”是指可以存在于本发明组合物的最终剂型中的任何基本上辅助的物质。例如，术语“赋形剂”包括媒介物、粘合剂、崩解剂、填充剂(稀释剂)、润滑剂、助流剂(流动增强剂)、压缩助剂、着色剂、甜味剂、防腐剂、悬浮剂/分散剂、成膜剂/包衣、调味剂和印刷油墨。

术语“佐剂”是指当与抗原联合施用时增强对抗原的免疫应答，但当单独施用时不产生对抗原的免疫应答的化合物。佐剂可以通过几种机制增强免疫应答，所述机制包括淋巴细胞募集、刺激B细胞和/或T细胞和刺激巨噬细胞。

对抗原或组合物的“免疫原性应答”是对感兴趣的组合物中存在的抗原的体液和/或细胞免疫应答在对象中的发展。为了本公开内容的目的，“体液免疫应答”是指由抗体分子介导的免疫应答，而“细胞免疫应答”是由T-淋巴细胞和/或其它白细胞介导的免疫应答。细胞免疫的一个重要方面涉及细胞溶解T细胞(“CTL”)的抗原特异性应答。CTL对肽抗原具有特异性，所述肽抗原与由主要组织相容性复合物(MHC)编码并在细胞表面表达的蛋白质结合存在。CTL帮助诱导和促进细胞内微生物的破坏或者这些微生物感染的细胞的裂解。细胞免疫的另一方面涉及辅助T细胞的抗原特异性应答。辅助T细胞帮助刺激非特异性效应细胞的功能，并将其活性集中于对抗在表面上展示与MHC分子相关的肽抗原的细胞。“细胞免疫应答”也指由活化的T细胞和/或其它白细胞(包括衍生自CD4+和CD8+T细胞的那些)产生的细胞因子、趋化因子和其它这样的分子的产生。因此，免疫应答可以包括以下效果中的一种或多种：B细胞产生抗体；和/或抑制性T细胞和/或γΔT细胞的活化，其特异性针对感兴趣的组合物或疫苗中存在的一种或多种抗原。这些应答可以用于中和感染性，和/或介导抗体-补体、或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，以对免疫的宿主提供保护。可以使用本领域众所周知的标准免疫测定和中和测定来确定这种应答。

“标记物”、“可检测标记物”或“可检测部分”是通过光谱、光化学、生化、免疫化学、化学或其它物理手段可检测的组合物。例如，有用的标记物包括³²P、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如如ELISA中常用的)、生物素、地高辛、或半抗原以及可以例如通过将放射性组分掺入肽中而被检测到的或用于检测与肽特异性反应的抗体的蛋白质。通常，可检测标记物是与具有限定的结合特性的探针或分子(例如，具有已知结合特异性的多肽或多核苷酸)连接的异源部分，从而使得易于检测到探针/分子(以及因此其结合靶标)的存在。标记物的异源性质确保其具有与其标记的探针或分子不同的来源，使得与可检测标记物连接的探针/分子不构成天然存在的组合物。

本申请中使用的术语“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”描述了导致相关病况的任何症状的消除、减轻、缓解、逆转或预防或延迟发作或复发的行为。换句话说，“治疗”病况涵盖针对该病症的治疗性和预防性干预。

本文所用的术语“有效量”是指在量上足以产生期望效果的给定物质的量。例如，封装胰岛素的HEV纳米颗粒(HEVNP)的有效量是实现可检测效果，使得在出于治疗目已经给予HEVNP的患者中，减轻、逆转、消除、预防或延迟发作靶标疾病(例如糖尿病)的症状、严重程度和/或复发机会的所述HEVNP的量。足以实现这一点的量被定义为“治疗有效剂量”。给药范围随着所施用的治疗剂的性质和其它因素，如施用途径和患者病症的严重程度而变化。本文所用的词语“约”表示参考值的+/-10％的范围。

本文所用的术语“患者”是指例如鸟类或哺乳动物物种的脊椎动物，尤其是哺乳动物(例如公牛/奶牛、猪、绵羊/山羊、马、兔、啮齿动物、狗、猫、狐狸等)，包括灵长类动物如黑猩猩、猴或人。

发明详述

A.引言

本公开内容涉及基于病毒的纳米衣壳HEVNP，其具有插入到ORF2衣壳蛋白序列中的至少一个半胱氨酸。然后将半胱氨酸化学衍生并用作锚以将金纳米簇与HEVNP缀合。所得HEVNP是化学稳定的并且对胃肠道中的酶促活性或pH具有抗性，适于口服递送预先选择的核酸或蛋白质(例如胰岛素)。

戊型肝炎病毒纳米颗粒(HEVNP)衍生自自组装的非感染性纳米衣壳。HEVNP在酸性环境中是稳定的并且对蛋白水解消化具有抵抗性，因此作为口服递送媒介物，其具有很大的优势。HEVNP可以经口施用，然后按照HEV的天然传播途径运输到小肠并最终运输到靶组织/细胞(例如，肝)。凭借其体外分解/重组能力，HEVNP能够封装药物或核酸以将其递送通过消化系统进入胃肠道中。特异性靶向配体(例如靶向递送至肝的配体)可以通过基因工程或化学缀合连接至HEVNP的突出结构域。通过缀合单分散的金纳米簇(AuNC)来稳定HEVNP结构，以获得口服递送的药物(例如，胰岛素)的更好的生物利用度。

本申请的发明人在本公开内容和早期出版物中的具体方面(参见，例如，美国专利第8,906,862号和第8,906,863号、WO2015/179321)概述了HEVNP的产生以及在表面修饰、用于治疗活性的核酸或蛋白质的口服递送的封装中的方法和应用。

作为口服递送胶囊的结构稳定的HEVNP提供了以下益处：(1)消除了针、相关风险和处理要求；(2)治疗性蛋白或多核苷酸编码序列本身可以在体外容易地封装到HEVNP结构中并通过口服递送；(3)由衣壳蛋白组成的HEVNP可以通过蛋白降解途径进行生物降解，而几乎没有毒理学问题。

B.生产和纯化修饰的衣壳蛋白和VLP形成

本发明的一个方面涉及用于生产和纯化衣壳蛋白和由其衍生的VLP的方法(参见Expression and self-assembly of empty virus-like particles of hepatitis Evirus.Li TC,Yamakawa Y,Suzuki K,Tatsumi M,Razak MA,Uchida T,Takeda N,MiyamuraT.,J Virol.1997Oct；71(10):7207-13.Essential elements of the capsid proteinfor self-assembly into empty virus-like particles of hepatitis E virus.Li TC,Takeda N,Miyamura T,Matsuura Y,Wang JC,Engvall H,Hammar L,Xing L,Cheng RH.JVirol.2005Oct；79(20):12999-3006.Niikura M等人,Chimeric recombinant hepatitisE virus-like particles as an oral vaccine vehicle presenting foreignepitopes.Virology 2002；293:273-280)。在一个实施方案中，衣壳蛋白是修饰的衣壳蛋白，并且由其衍生的VLP是半胱氨酸/赖氨酸修饰的HEV VLP。例如，修饰的衣壳蛋白在HEVORF2或其部分的表面可变环中含有一个或多个半胱氨酸/赖氨酸残基。

各种表达系统可以用于表达本发明的衣壳蛋白。可用于产生本发明的病毒样颗粒的表达系统的实例包括但不限于细菌表达系统(例如大肠杆菌)、昆虫细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞。本发明的优选表达系统包括使用昆虫细胞的杆状病毒表达系统。在用于杆状病毒载体和昆虫细胞培养程序的方法手册(A Manual of Methods for BaculovirusVectors and Insect Cell Culture Procedures)中概述了例如用于处理和制备杆状病毒载体和杆状病毒DNA的一般方法以及昆虫细胞培养程序。

可以将本发明的衣壳蛋白克隆到杆状病毒载体中，并用于感染适当的宿主细胞(参见，例如，O'Reilly等人,"Baculovirus Expression Vectors:A Lab Manual,"Freeman&Co.1992)。可以用含有编码本发明衣壳蛋白的多核酸的转移载体转化昆虫细胞系(例如Sf9或Tn5)。转移载体包括，例如，线性化的杆状病毒DNA和含有期望多核苷酸的质粒。宿主细胞系可以用线性化的杆状病毒DNA和质粒共转染以产生重组杆状病毒。

本发明的病毒样颗粒的纯化可以根据本领域的标准技术进行(参见Li TC等人,JVirol.1997Oct；71(10):7207-13.Li TC等人,J Virol.2005Oct；79(20):12999-3006.Niikura M等人,Virology 2002；293:273-280)。然后将纯化的VLP重悬于合适的缓冲液中。

在一些实施方案中，修饰的衣壳蛋白或由其衍生的VLP可以与一种或多种生物活性剂化学缀合。例如，可以使用本领域已知的方法将衣壳蛋白的一个或多个半胱氨酸/赖氨酸残基酰化、烷基化、芳基化、琥珀酰化或氧化。在一些情况下，可以使用马来酰亚胺官能团将一个或多个半胱氨酸/赖氨酸残基缀合，以将生物活性剂共价缀合至半胱氨酸或赖氨酸的硫醇部分。在一些情况下，可以使用点击化学(CLICK chemistry)修饰生物活性剂以引入马来酰亚胺官能团。例如，生物活性剂的炔烃衍生物可以在CuSO4和抗坏血酸存在下与马来酰亚胺-叠氮化物接触以产生马来酰亚胺生物活性剂。然后，马来酰亚胺可以与修饰的衣壳蛋白中的一个或多个半胱氨酸/赖氨酸接触以共价连接两个分子。在一些情况下，对未组装成VLP的衣壳蛋白进行缀合(例如，在EDTA、EGTA和/或还原剂如DTT或β巯基乙醇的存在下)。在一些情况下，对组装成VLP的衣壳蛋白进行缀合。

C.生物活性剂的封装

本发明的另一方面涉及将一种或多种生物活性剂封装在HEV病毒样颗粒(例如半胱氨酸修饰的金纳米簇缀合的HEV VLP)中(参见，DNA vaccine-encapsulated virus-likeparticles derived from an orally transmissible virus stimulate mucosal andsystemic immune responses by oral administration,Gene Therapy 2004.11,628–635.S Takamura,M Niikura,T-C Li,N Takeda,S Kusagawa,Y Takebe,T Miyamura和YYasutomi)。可以使用本领域中的任何标准技术将异源核酸、蛋白质、多肽、化学治疗剂、显像剂、纳米颗粒等封装到本发明的VLP中。示例性的生物活性剂是蛋白质形式或核酸形式的胰岛素。一般程序涉及(1)分解由根据本发明的衣壳蛋白形成的VLP；以及(2)在生物活性剂存在下重建VLP。本领域技术人员将认识到，优选在封装程序之前具有纯化的VLP。特别优选的是，在封装程序之前，耗尽或基本上耗尽VLP中任何不期望的材料(例如，核酸)。

可以使用本领域中的任何标准技术来进行VLP的分解。重构的病毒样颗粒可以在生理条件下产生(参见美国专利公开号：20080131928)。通常，病毒样颗粒的分解需要破坏VLP组装的试剂，如还原剂或螯合剂(参见美国专利公开号：20040152181)。本领域技术人员将认识到，影响组装和分解的因素和条件包括：pH、离子强度、病毒衣壳蛋白的翻译后修饰、二硫键和二价阳离子键合等。例如，对于多瘤病毒(Brady等人,J.Virol,23:717-724,1977)和轮状病毒(Gajardo等人,J.Virol,71:2211-2216,1997)，已经显示出阳离子键合，特别是钙在维持病毒体完整性中的重要性。另外，二硫键对于稳定多瘤病毒(Walter等人,ColdSpring Har Symp.Quant.Biol,39:255-257,1975；Brady等人,J.Virol,23:717-724,1977)和SV40病毒(Christansen等人,J.Virol,21:1079-1084,1977)似乎是重要的。另外，已知诸如pH和离子强度的因素可能通过影响静电相互作用来影响多瘤病毒衣壳稳定性(Brady等人,J.Virol,23:717-724,1977；Salunke等人,Cell,46:895-904,1986；Salunke et al.,Biophys.J,56:887-900,1980)。另外，已知一些病毒衣壳蛋白的翻译后修饰可能影响衣壳稳定性和组装，例如糖基化、磷酸化和乙酰化(Garcea等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:3613-3617,1983；Xi等人,J.Gen.Virol,72:2981-2988,1991)。因此，存在许多可能影响衣壳稳定性、组装和分解的相关因素。

优选地，本发明的VLP通过去除钙离子而分解(参见，Touze A,Coursaget P.Invitro gene transfer using human papillomavirus-like particles.Nucleic AcidsRes 1998；26:1317-1323；Takamura等人,DNA vaccine-encapsulated virus-likeparticles derived from an orally transmissible virus stimulate mucosal andsystemic immune responses by oral administration.Gene Therapy 2004；11:628-635)。根据本发明，使用还原剂或螯合剂或两者来分解VLP。可以使用各种还原剂。还原剂的优选实施方案包括但不限于二硫苏糖醇(DTT)。可以使用各种螯合剂，例如乙二醇四乙酸(EGTA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。VLP分解条件的实例包括但不限于以下：通过孵育含有50mMTris-HCl(pH7.5),150mM NaCl,1mM EGTA和20mM二硫苏糖醇的缓冲液30分钟来破坏纯化的VLP。

本领域技术人员还将认识到，尽管是优选的，但不需要完全分解VLP以封装生物活性剂。技术人员还将认识到，在其它情况下，优选对VLP进行部分分解。根据本发明，可以控制VLP部分分解的条件以仍然允许生物活性剂的有效封装。VLP的部分分解可以通过用单独的还原剂(例如20mM DTT)处理VLP来实现(Sapp等人,J.Gen.Virol.,76:2407-2412,1995)。根据本发明，一旦完全或部分分解VLP，生物活性剂的封装可以通过在生物活性剂存在下重新组装VLP来进行。在一些情况下，利用具有净负电荷的生物活性剂来增强封装可能是有利的。例如，与具有正电荷或中性电荷的化合物相比，核酸具有净负电荷并且可以被优先封装。

在本发明的一些实施方案中，VLP的重新组装是通过将钙离子重新补充到被破坏的VLP来实现的。可选地，VLP的重新组装是通过去除还原剂或螯合剂来实现的。任选地，可以调节诸如pH和离子强度的因素，本发明所述的其它因素，以实现VLP的有效重新组装和生物活性剂的有效封装。

在一些实施方案中，封装如下进行：在室温孵育30分钟后，将在50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)和150mM NaCl中的生物活性剂加入到破坏的VLP制剂中。然后通过用渐增浓度的CaCl₂(直至最终浓度为5mM)孵育1小时，使破坏的VLP制剂重折叠。通过超速离心沉淀VLP并将其重悬于10mM钾-MES缓冲液(pH6.2)中。为了估计封装剂的量，从任何未封装的生物活性剂中纯化重折叠和纯化的VLP，并用EGTA(1mM)破坏。上清液的吸光度或其它合适的方法可以用于检测生物活性剂。

在一些实施方案中，待封装的生物活性剂(例如，异源蛋白或核酸，如胰岛素蛋白或编码胰岛素的核酸)或显像剂与封装信号缀合。例如，对应于HEV开放阅读框1的密码子35-59的RNA元件是强的衣壳化信号，允许与HEV衣壳蛋白(包括本文所述的HEV ORF2VLP的截短的和/或半胱氨酸/赖氨酸修饰的形式)在体外特异性相互作用。为了使用VLP作为治疗剂或显像剂的载体，可以在衣壳自组装之前使用化学接头(例如，LC-SPDP或适配子、线性-树枝状嵌段共聚物(telodendrimer))，其用HEV衣壳化信号(如，前述RNA元件)标记试剂(例如，化学治疗剂)。

在一些实施方案中，封装可检测标记物(显像剂)。可检测标记物可以是通过多种机制(包括化学手段、酶促手段、免疫学手段或放射学手段)使其所连接的分子可检测的部分。可检测标记物的一些实例包括荧光分子(如荧光素、若丹明、德克萨斯红和藻红蛋白)和酶分子(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和β半乳糖苷酶)，其允许基于荧光发射或酶催化的化学反应的产物进行检测。涉及各种同位素(如³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C或³²P)的放射性标记物也可以连接到适当的分子上，以能够通过显示放射性的任何合适方法(如放射自显影)进行检测。参见，例如，Tijssen,"Practice and Theory of Enzyme Immunoassays,"LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology,Burdon和van Knippenberg编辑,Elsevier(1985),pp.9 20。对标记物、标记程序和标记物检测的介绍也可以见于Polak和Van Noorden,Introduction to Immunocytochemistry,第2版,Springer Verlag,NY(1997)；和Haugland,Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals,acombined handbook and catalogue published by Molecular Probes,Inc.(1996)。其它可检测标记物包括但不限于超顺磁性标记物(例如铁氧体)、对比度增强试剂(例如MRI造影剂)、原子簇(例如金簇)等。可以根据本领域已知的和在各种出版物中描述的方法进行单分散的金簇至修饰的衣壳蛋白，例如至修饰的衣壳蛋白中的半胱氨酸/赖氨酸残基(包括人工引入的半胱氨酸/赖氨酸残基)的缀合。

在一些实施方案中，封装生物活性剂。在一些情况下，生物活性剂是化学治疗剂。合适的化学治疗剂包括但不限于细胞毒性药物。可以用于本发明的细胞毒性药物的实例包括：烷基化药物，如环磷酰胺、ifospfamide、ehlorambucil、美法仑、白消安、洛莫司汀、卡莫司汀、chlormethhine(氮芥)、雌莫司汀、曲奥舒凡、噻替派、二溴甘露醇；细胞毒性抗生素，如多柔比星、表柔比星、阿柔比星、伊达比星、道诺霉素、米托蒽醌(mitoxantrone)(米托蒽醌(mitozantrone))、博来霉素、更生霉素和丝裂霉素；抗代谢物，如甲氨蝶呤、卡培他滨；阿糖胞苷、氟达拉滨、克拉屈滨、吉西他滨、氟尿嘧啶、雷替曲塞(拓优得)、巯嘌呤、替加氟和tioguaninc；长春花生物碱，如长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨和依托泊苷；其它肿瘤性药物，如安吖啶、阿替拉明(altetarmine)、克立他酶(crisantaspase)、达卡巴嗪和替莫唑胺、羟基脲(hydroxycarbamide)(羟基脲(hydroxyurea))、喷司他丁、铂化合物(包括卡铂、顺铂和奥沙利铂)、卟吩姆钠、丙卡巴肼、雷佐生；紫杉烷类，包括：多西他赛和紫杉醇；拓扑异构酶I抑制剂，包括inotecan和拓扑替康、曲妥单抗和维甲酸。在一些情况下，一种或多种前述显像剂和/或生物活性剂或其组合可以另外地或可选地通过硫醇键与P结构域表面可变环或C-末端中的半胱氨酸或赖氨酸(例如重组引入的半胱氨酸或赖氨酸)缀合。在一些情况下，一种或多种前述显像剂和/或生物活性剂或其组合可以另外地或可选地通过硫醇键与P结构域表面可变环或C-末端中的第二半胱氨酸或赖氨酸(例如重组引入的半胱氨酸或赖氨酸)缀合。

在一些实施方案中，胰岛素是封装在本发明的HEV VLP构建体中的生物活性剂。在一些情况下使用生物活性多肽形式的胰岛素(其可以包括任选的翻译后修饰，如糖基化，PEG化或者一种或多种人工氨基酸类似物(包括D-氨基酸)的取代等)，而在其它情况下，胰岛素是编码胰岛素和/或胰岛素原蛋白的多核苷酸序列(例如cDNA)的形式，例如，编码胰岛素的核酸是TA1m载体中的人胰岛素基因表达构建体[12]。胰岛素蛋白可以是重组的或者可以从天然来源分离。它可以是人胰岛素或衍生自其它动物，如牛、猪、猫或犬的动物。它可以是胰岛素原。可以使用不同形式的胰岛素：速效的(天冬胰岛素(Aspart):门冬胰岛素(Novolog)；赖谷胰岛素(Glulisine)；艾倍得(Apidra)；优泌乐(Lispro):赖脯胰岛素(Humalog))；短效的(常规的：优泌林(Humulin)、优泌林R(Humulin R)、诺和灵(Novolin))；中效的(NPH：优泌林N(Humulin N)、诺和灵N(Novolin N))；中效至长效的(地特胰岛素)；长效的(例如，甘精胰岛素)。此外，生物活性剂可以是胰岛素的类似物，如市售的诺和平(Levemir)胰岛素类似物；或甘精胰岛素，其是长效的基础胰岛素类似物并且以名称来得时(Lantus)销售。另外，生物活性剂可以是胰岛素和胰高血糖素样肽(GLP-1)受体或其它药物的组合。GLP-1受体激动剂的实例包括利拉鲁肽(诺和力(Victoza)、Saxenda)、利西拉肽(Lyxumia)、阿必鲁肽(Tanzeum)、度拉糖肽(度易达(Trulicity))和索马鲁肽(Ozempic)。胰岛素的合适形式或组合包括但不限于甘精胰岛素；赖脯胰岛素；门冬胰岛素；地特胰岛素；胰岛素(人)；门冬胰岛素+门冬胰岛素鱼精蛋白；赖谷胰岛素；胰岛素(人)+低精蛋白胰岛素[INN]；门冬胰岛素+德谷胰岛素；门冬胰岛素+低精蛋白胰岛素[INN]；德谷胰岛素+利拉鲁肽；甘精胰岛素+利西拉肽；胰岛素(人)+低精蛋白胰岛素[INN]；低精蛋白胰岛素[INN]+中性胰岛素；低精蛋白胰岛素(人)[INN]+胰岛素(人)；胰岛素(牛)；德谷胰岛素；人胰岛素锌；低精蛋白胰岛素[INN]；低精蛋白胰岛素人[INN]；中性胰岛素；胰岛素(人)+低精蛋白胰岛素(人)[INN]；中性胰岛素+低精蛋白胰岛素[INN]；胰岛素(猪)；中性胰岛素；鱼精蛋白锌胰岛素；胰岛素；曲戈胰岛素[INN]；人胰岛素+人胰岛素原；甘精胰岛素+赖脯胰岛素；人胰岛素+醋酸普兰林肽；度拉糖肽；度拉糖肽+甘精胰岛素；艾塞那肽+赖脯胰岛素；甘精胰岛素+利拉鲁肽；赖脯胰岛素+普兰林肽；efpeglenatide[INN]；人胰岛素+普兰林肽；艾塞那肽+人胰岛素；赖脯胰岛素+赖脯胰岛素鱼精蛋白；氯碘羟喹[INN]+人胰岛素；甘精胰岛素+赖谷胰岛素；和胰岛素I 131。此外，各种肽基和非肽基胰岛素模拟物，如Nankar等人(DrugDiscovery Today,第18卷,第15–16期,2013年8月,第748-755页)可以用作HEV VLP中封装的生物活性剂。

当使用不同的衣壳蛋白构建体时，VLP的大小可以变化。例如，可以调节衣壳蛋白的N-末端部分以增加或降低VLP的大小和封装容量。在本发明的一些实施方案中，在构建HEV VLP时，利用与HEV ORF2蛋白的一部分的N-末端融合的HEV ORF3蛋白的一部分来调节VLP的大小。通常，HEV VLP由至少具有HEV ORF2的残基112-608的HEV ORF2的一部分形成。

D.药物组合物、制剂和施用

本发明还提供药物组合物或生理组合物，其包含由修饰的衣壳蛋白形成的HEVNP，所述修饰的衣壳蛋白与封装生物活性剂(例如，异源核酸或蛋白)的金纳米簇缀合。这种药物或生理组合物还包含一种或多种药学上或生理学上可接受的赋形剂或载体。本发明的药物组合物适用于多种药物递送系统。用于本发明的合适制剂可见于Remington'sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Philadelphia,PA,第17版,(1985)。对于药物递送方法的简要回顾，参见Langer,Science 249:1527-1533(1990)。

本发明的组合物可以与赋形剂一起施用至宿主。可用于本发明的赋形剂包括但不限于媒介物、粘合剂、崩解剂、填充剂(稀释剂)、润滑剂、助流剂(流动增强剂)、压缩助剂、着色剂、甜味剂、防腐剂、悬浮剂/分散剂、成膜剂/包衣、调味剂和印刷油墨。

本发明的一个优点是本发明的组合物适于口服递送。因为本发明的HEVNP在酸性环境中是高度稳定的并且对胃肠道中的消化具有抵抗性，所以它适于口服递送胰岛素。与半胱氨酸或赖氨酸残基缀合的金纳米簇，尤其是在本发明的一些实施方案中工程化至修饰的衣壳蛋白表面的那些，还增强了HEVNP的稳定性、生物利用度和递送效率。因此，本发明的组合物的口服递送可以有效地为需要通过封装的生物活性剂(例如，胰岛素蛋白或编码胰岛素的DNA)治疗的患者提供治疗益处。本发明的HEVNP可以配制成固体(例如粉剂)或液体的形式，使得其可以用作日常生活中消费的普通食品或饮料物品的补充。

另外，本发明的组合物也可以配制用于粘膜递送，如递送至口腔粘膜或唇粘膜或呼吸道粘膜，包括鼻粘膜。

本发明的药物组合物可以通过各种途径，例如口服、皮下、透皮、皮内、肌内、静脉内或腹腔内施用。施用药物组合物的优选途径是以约0.01-5000mg，优选5-500mg的HEVNP的日剂量口服递送。口服施用是优选的施用模式，并且适当的剂量可以以片剂、胶囊的形式施用，或者作为对食品或饮料物品的补充以每日单剂量施用，或者作为以适当间隔，例如以每天两次、三次、四次或更多次亚剂量呈现的分剂量施用。

为了制备本发明的药物组合物，使用了惰性和药学上可接受的载体。药物载体可以是固体或液体。固体形式的制剂包括，例如，粉剂、片剂、可分散颗粒、胶囊、扁囊剂和栓剂。固体载体可以是这样的一种或多种物质，其还可以充当稀释剂、调味剂、增溶剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂或片剂崩解剂；它也可以是封装材料。

在粉剂中，载体通常是细粒固体，其与细粒活性组分(例如本发明的具有封装的核酸的HEVNP)混合。在片剂中，将活性成分(具有封装的核酸的HEVNP)与具有必要结合特性的载体以合适的比例混合，并压制成期望的形状和大小。

为了制备栓剂形式的药物组合物，首先将低熔点的蜡如脂肪酸甘油酯和可可脂的混合物熔化，并通过例如搅拌将活性成分分散在其中。然后将熔化的均匀混合物倒入合适尺寸的模具中并使其冷却和凝固。

粉剂和片剂优选含有约5重量％至约70重量％的活性成分。合适的载体包括，例如，碳酸镁、硬脂酸镁、滑石粉、乳糖、糖、果胶、糊精、淀粉、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可脂等。

药物组合物可以包含活性化合物与作为载体的封装材料的制剂，提供了胶囊，其中活性组分(有或没有其它载体)被载体包围，使得载体因此与化合物结合。以类似的方式，也可以包括扁囊剂。片剂、粉剂、扁囊剂和胶囊可以用作适于口服施用的固体剂型。

液体药物组合物包含，例如，适于口服或肠胃外施用的溶液、悬浮液和适于口服施用的乳液。活性组分的无菌水溶液(例如，具有封装的核酸的嵌合病毒样颗粒)或活性组分在包含水、缓冲水、盐水、PBS、乙醇或丙二醇的溶剂中的无菌溶液是适于肠胃外施用的液体组合物的实例。所述组合物可以含有接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，如pH调节和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂、洗涤剂等。还预期HEVNP可以是预先包装的粉剂中的片剂/胶囊形式或者浓缩的液体形式，如所销售的那样。患者将其进一步加入到食品或饮料(包括水)中，然后由患者食用。HEVNP也可以是液体形式并且不经进一步稀释直接食用。

无菌溶液可以通过以下制备：将活性组分(例如，具有封装的核酸的HEVNP)悬浮在期望的溶剂系统中，然后使所得溶液通过膜滤器以将其灭菌，或者可选地，在无菌条件下通过将无菌化合物溶解在先前灭菌的溶剂中。可以将所得水溶液包装以原样使用，或冻干，在施用前将冻干制剂与无菌水性载体组合。制剂的pH通常为3-9，更优选为5-8，并且最优选为6-7。

可以施用本发明的药物组合物用于预防性和/或治疗性治疗。在治疗性应用中，将组合物以足以预防、治愈、逆转或至少部分减缓或阻止病况及其并发症的症状的量施用至已经患有该病症的患者。足以实现这一点的量被定义为“治疗有效剂量”。对于这种用途有效的量将取决于疾病或病况的严重程度以及患者的体重和一般状态，但对于70kg的患者，通常为每天约0.1mg至约2,000mg的组合物，对于70kg的患者，通常使用的剂量为每天约5mg至约500mg的组合物。

在预防性应用中，将本发明的药物组合物以足以延迟或预防症状发作的量施用至易受疾病或病况(如糖尿病)影响或者在其他方面处于发展疾病或病况(如糖尿病)的风险中的患者。这样的量被定义为“预防有效剂量”。在该用途中，组合物的精确量再次取决于患者的健康状态和体重，但对于70kg患者/天，通常为约0.1mg至约2,000mg的抑制剂，对于70kg患者/天，更通常为约5mg至约500mg。

组合物的单次或多次施用可以由治疗医师选择的剂量水平和模式来进行。不管怎样，药物制剂应提供足以在治疗上或预防上在患者中实现预期效果的一定量的本发明的组合物。

实施例

以下实施例仅通过示例方式而非通过限制性方式提供。本领域技术人员将容易认识到可以改变或修改以产生基本上相同或类似结果的多种非关键参数。

实施例1：金纳米簇缀合的HEVNP

引言

纳米颗粒的使用已经成为纳米技术和纳米医学的中心焦点[1,2]。纳米颗粒的使用为诊断、靶向和治疗提供了有前途的方法。当前对抗癌症的方法限于手术、化疗和放射[3]。尽管这些方法在癌性区域的诊断和治疗中有些效果，但缺乏靶向特异性妨碍了治疗的效率并对健康细胞造成损害。

在纳米颗粒或纳米颗粒系统(如基于聚合物的、基于脂质的或树状物)中，衍生自病毒(也称为病毒样颗粒(VLP))的少量基于蛋白质的衣壳具有最低的毒性水平和最高的生物利用度[4]。迄今为止，FDA已经批准了几种预防性VLP作为商业化疫苗。这些包括GlaxoSmithKline’s

(乙型肝炎病毒)和

(人乳头瘤病毒)以及Merckand Co.公司的Recombivax

(乙型肝炎病毒)和

(人乳头瘤病毒)[5]。其它基于VLP的疫苗目前正处于针对流感病毒、细小病毒和诺瓦克病毒的临床开发中[5,6]。VLP技术的进展不限于疫苗接种；由于高的生物利用度，VLP也是作为药物载体的理想候选物[7,8]。化学表面调节的最新进展已经将VLP提升为用于抗原、靶向配体和追踪分子的多模态媒介物[9-12]。

戊型肝炎纳米颗粒(HEVNP)在核酸和代谢药物封装以及表面调节中显示出巨大前景[11,13]。由于HEV天生通过口腔途径感染，蛋白质衣壳获得了在胃肠道的苛刻酸性和酶促条件中幸存的进化优势，因此，衍生自HEV的非感染性纳米颗粒可以容易地用于口服和粘膜施用[14-17]。HEVNP的技术成就总结在Baikoghli等人,2018和Stark等人,2016[13]的综述文章中。在本文中，我们突出和讨论了HEVNP在通过AuNC追踪分子表面调节的情况下的表面调节，以及在不同pH条件下纳米颗粒的总体稳定性。

戊型肝炎纳米颗粒(HEVNP)

戊型肝炎病毒(HEV)是一种正义单链RNA病毒，基因组大小为7.2kbp，直径为

对HEV的ORF2的遗传修饰(包括对N-末端的111个AA截短和对C-末端的52个AA截短)导致形成直径为约

的较小的无基因组的HEV纳米颗粒[18,19]。HEVNP的结构已经通过x射线晶体学进行了解析[20]。当使用pOFR2在杆状病毒表达系统中表达时，HEVNP保留病毒体的二十面体稳定性[19,21]。存在60个亚基，每个由三个结构域组成，形成HEVNP的二十面体衣壳(图1A)。壳结构域(S)(AA:118-317)在亚基间相互作用中是关键的，稳定二十面体衣壳。中间结构域(M)(AA:318-451)与S结构域结合并与其相互作用[11,22]。突出结构域(P)(452-606)在2倍轴线处形成二聚体尖峰。M结构域通过富含脯氨酸的铰链与P结构域连接，这促进突出的尖峰中的拓扑变化[19,21]。

HEVNP的表面由在60个相同亚基中重复的多个锚定位点组成，其可以用各种缀合物调节。这种模块化允许小肽、组织靶向分子和追踪分子如荧光染料和金纳米簇的容易缀合。此外，在壳(S)结构域的底部，面向HEVNP的内表面的N-末端处带正电荷的残基可以用于DNA、CRISPR RNA和蛋白质的封装。暴露的P结构域环(环I(483-491)、II(530-535)、III(554-561)、IV(582-593)和573C)有助于靶向配体缀合位点[11,23]。HEVNP表面的P结构域由六十个相同亚基中的每一个中的多个锚定位点组成，其可用于表面功能化，而不改变衣壳蛋白的二十面体组织结构[11,15]。

HEVNP表面调节

纳米颗粒的表面功能化是选择性缀合天然存在的分子和合成分子的关键步骤。在2013年，Jariyapong等人将衍生自HIV的第三高变环的高免疫原性的15残基肽(p18)基因插入到HEVNP的表面上[15]。展示p18的60个拷贝，嵌合HEVNP触发了稳健的HIV-1特异性CTL应答。在残基Tyr485之后的插入不干扰HEVNP的二十面体排列和总体稳定性。尽管已经被证明是一种高效的粘膜疫苗接种方法，但缀合方法具有其局限性；包括高度劳动密集型嵌合-HEVNP生产、可重复性和制备持续时间[11,13,15]。

在2016年，Chen和同事利用硫醇-配体交换方法将HEVNP的表面功能化。对于P结构域上的表面缀合，选择5个半胱氨酸替代位点；这些包括Y485、T489、Y533、N573和T586。在这5个工程化位点中，N573C最适于进一步修饰。为此，将乳腺癌靶向配体LXY30[24]缀合至N573C位点。作为概念验证，在小鼠中进行的体内研究显示没有LXY30缀合的HEVNP不在肿瘤部位积聚，但LXY30功能化的HEVNP在肿瘤部位积聚。与遗传修饰相比，化学缀合是表面功能化的一种更有效和高度可再现的方法[11]。

AuNC在HEVNP的二十面体5倍轴周围的共定位

随后，Stark和同事成功地将用pMBA44、六碳长间隔基和马来酰亚胺接头功能化的磁性纳米金簇(下文称为HEVNP+Au102C6MI)缀合至HEVNP上的573C位点(图1A&B)[25-27]。已经广泛地描述了Au102的结构、表面电荷以及电子和振动特性[26,28-30]。纯化了HEVNP+Au102C6MI并准备用于Cryo-EM分析。进行比较性2D分析，并在Au102C6MI缀合的HEVNP中观察到独特的电子致密区(图1C)。进行Cryo-EM单颗粒分析以获得功能化纳米颗粒以及作为对照的573C-HEVNP的3D密度图。从收集的数据集中，通过迭代从头方法生成三维初始模型以确定和交叉验证颗粒参数[31]。使用稳健的基于PFT的颗粒筛选方案来确定关于三个角度

、θ和ω的颗粒取向以及笛卡尔坐标[32,33]。此外，使用集成在PFT包中的比例因子分析，筛选颗粒以降低尺寸不均一性[32]。随后，进行3D重建和精修(图1D)[31,34]。

为了通过差异映射进行验证和结构分析，我们对对照和HEVNP+Au102C6MI进行了同时的3D重建。在重建中，清楚地解析了S、M和P结构域(图1D)。另外，HEVNP+Au102C6MI的2D和3D图像分析揭示了在甜甜圈状阵列中的5倍轴周围存在5个独特的高密度区，其在对照重建中不存在；这通过差异映射验证[25]。进行局部强度分析以表征HEVNP+Au102C6MI 5倍轴密度从而确认Au102C6MI的大小。显示了将C6接头臂添加到Au102 pMBA中为甜甜圈状共定位以在HEVNP的5倍轴周围稳定提供了支持(图1E)。我们假设这种HEVNP的5倍轴周围的共定位可以通过增加分子内相互作用的稳定性来增强纳米颗粒的稳定性，从而支持十公尺(decametric)界面。

pH对HEVNP稳定性的影响

二十面体5倍轴处高度致密的分子间界面对于纳米衣壳组装和稳定性是关键的。仅包含S结构域中的残基，5倍轴处十公尺相互作用比分别在2倍和3倍轴处二聚体和三聚体的相互作用更紧密。在S结构域中的β-折叠之间存在4个环；4个环中的2个参与与相邻亚基的分子间相互作用。这些相互作用是由Asn-200和Tyr-288的侧链介导的，它们被小于埃的距离隔开[23,35]。位点突变研究已经揭示这些残基对于纳米衣壳形成和稳定性是关键的。值得一提的是，在rNV(重组诺瓦克病毒)、SMSV(圣米吉尔海狮病毒(San Miguel Sea LionVirus))和CARMV(香石竹斑驳病毒(Carnation Mottle Virus))中也观察到由芳香族氨基酸如Phe和Tyr介导的类似的5倍相互作用；表明5倍分子间界面在纳米衣壳形成中的进化意义[23]。

为了测试通过Au102C6MI的HEVNP的增强的稳定性是否通过5倍184二十面体轴周围的共定位来促进，我们进行了pH稳定性实验。先前报道了HEVNP在pH6.2下是最稳定的；在该最佳pH下，3倍轴处的Ca+桥和5倍轴处的分子间相互作用为T＝1二十面体蛋白质衣壳提供了稳定性。在pH8.0下，HEVNP开始溶胀，表明迫使紧密的T＝1二十面体构象的弱化的分子间界面。我们通过在pH6.2和pH8.0缓冲液中孵育HEVNP过夜进行了pH稳定性实验。TEM成像揭示了HEVNP纳米颗粒的尺寸在pH 6.2(平均直径23nm)和pH 8.0(平均直径27nm)存在显著差异(图2A)。为了定量描述我们的TEM观察分析，对颗粒进行圆形平均以绘制出径向强度分析(图2B)。观察到pH 8.0的颗粒平均比pH 6.2的颗粒大10-15％。此外，进行分子建模以观察pH6.2和pH8.0下5倍轴处的分子间相互作用；结果表明在pH8.0时界面较弱(图2C)。这些结果表明，在pH8.0时，HEVNP颗粒可能已经塌陷或衣壳蛋白稳定性显著减弱。

我们假设5倍分子间界面的结构保留可能在提高HEVNP在较高pH水平下的稳定性中起关键作用。在将HEVNP+Au102C6MI在pH6.2和pH8.0缓冲液中孵育过夜后，TEM成像揭示了由于衣壳亚基之间松弛的相互作用导致的稳定性减弱，Au102C6MI缀合的HEVNP的衣壳大小不会增加(图3A)。类似地，我们进行了衣壳投影(capsid projection)的2D圆形平均以比较研究这些颗粒的径向强度分布。与没有金缀合物的对照衣壳不同，我们观察到衣壳投影在半径上没有显著变化(图3B)。这些结果表明，5倍轴周围Au102C6MI的共定位可以增强S结构域界面处的分子间相互作用，从而增强HEVNP在较高pH值下的稳定性。

结论

先前，Cryo-EM SPR揭示了Au102C6MI表面缀合导致HEVNP的5倍二十面体轴周围形成甜甜圈状环[25]。Au102核心测量为1.5nm，而流体动力学直径(包括pMBA)测量为约2.5nm。这些尺寸与在HEVNP+Au102C6MI的Cryo-EM3D重建密度图中观察到的密度很好地匹配。C6间隔基为约1.1nm，因此从金核心的中心到马来酰亚胺结合位点(573C)的距离总计为约2-3nm。C6臂的长度足以为Au102C6MI围绕5倍轴共定位提供足够的灵活性(图3C-E)。在本文中，我们证明了在pH8.0时，Au102C6MI的缀合增强了HEVNP的总体稳定性；而对照HEVNP颗粒在pH8.0时显示出总体尺寸的增加，并且致密性变弱。

纳米颗粒系统的使用趋势已经在纳米医学领域中引起了极大的关注。纳米颗粒系统的组成和再现性在纳米递送系统的情况下是关键的。此外，纳米颗粒系统在纳米药物中的有效性受生物利用度和与生理条件的相容性控制。因此，戊型肝炎纳米颗粒在纳米热学(nanotheranostics)和表面调节的封装中已经显示出相当大的潜力。这种基于蛋白质的平台的应用范围从药物、核酸和无机金属的组织特异性递送到粘膜疫苗接种、癌症治疗诊断和颗粒追踪的表面调节。

在本报告中证明的HEVNP的增强的稳定性可能有益于颗粒追踪研究。尽管高度灵敏的荧光显微镜技术允许在摄取进入活细胞中的过程中单个纳米颗粒追踪[37]，但可以通过TEM实现亚纳米范围的较高空间分辨率。利用均匀的电子致密Au102C6MI[27,38]，可以进行电子显微镜研究，以进一步了解颗粒在靶组织中的分布及其与细胞的特异性相互作用；低温固定和化学固定技术可用于处理树脂块中的组织，随后通过超薄切片术进行切片，以通过透射电子显微镜进行2D和3D研究[39,40]。

在肿瘤靶向的热疗情况下，经由Au102C6MI缀合增强的HEVNP的稳定性可以在电磁场增强Au102的辐射特性中发挥优势[41]。据报道，受硫醇盐单层保护的AuNC中形成强的局部表面等离子体共振[42]。此外，如果Au纳米颗粒足够小(直径范围为1.5-3.0nm)，则在范围为520-540nm的波长下金发生强的等离子体共振[42,43]。已经证明激光诱导的组织热疗在癌症光疗中是有效的[44]，并且通过多峰HEVNP的癌症和肿瘤的组织特异性靶向可以提高治疗期间靶向的准确性和功效。

实施例2：用于粘膜递送的重金属纳米簇增强的病毒纳米衣壳

问题：戊型肝炎纳米颗粒(HEVNP)能够封装治疗剂，包括核酸、蛋白质和无机材料。为了增强HEVNP的组织特异性靶向能力，我们实验室在过去几年中已经开发了遗传和化学修饰方法(参见最近的出版物：DOI:10.3791/57020)。我们的目标是以受控的方式将治疗剂递送至沿着胃肠道的特定区域。我们以前的知识表明，HEVNP失去了它们的二十面体完整性，因此失去了在较高pH值(+8)下的总体稳定性，因此可能无法有效递送至结肠的远端区域(pH范围为5-8.5)。我们针对这种限制的解决方案是利用重金属，如金纳米簇，并使用它们的共振和磁性特性以在HEVNP的5倍轴周围和上方形成几何屏蔽(参见下面的细节)。在我们的2017出版物(Stark等人,2017)中，我们使用了先进的冷冻电子显微镜和单颗粒分析技术来表征具有6个碳长间隔臂的金纳米簇(AuNC)的位置，所述间隔臂与突出结构域上的残基#N573C结合。

解决方案：在我们最近的研究中，我们发现在HEVNP的5倍二十面体轴周围和上方的AuNC集聚化增强了其抵抗高pH降解的稳定性。我们的目标是扩大HEVNP作为纳米递送平台到达具有动态酸性条件的各种胃肠区域的能力，以通过增强的靶向和颗粒追踪方式将封装的药物进行有效的粘膜递送。我们先前建立的IP(包括我们最近的出版物)已经完全集中于设计我们的P结构域的环状物。当前关于增强的HEVNP的公开内容是基于我们在锚定将利用M-S结构域的相互作用的金-纳米簇的功能化以及基于将使HEVNP衣壳维持在扩展的质子浓度范围内的每五个互连的S-结构域顶部上五聚体纳米簇的垂直排列的二聚化结构单元之间的横向界面。这种合理化已经在被邀请出版在纳米医学的特刊中的手稿中的增强的结构完整性的概念证明中得到证明。

概述：通过AuNC增强的HEVNP稳定性抵抗高的pH降解

(1)通过指定锚/位点在AuNC缀合中的几何约束：将AuNC缀合至HEVNP的表面以在5倍界面上实现AuNC簇。可延伸的间隔基允许AuNC必要的柔韧性以形成5倍轴周围的簇中的一个簇。AuNC簇在5倍周围的甜甜圈状几何分布保护关键分子间相互作用以增强质子化状态下的HEVNP稳定性。Cryo-EM分析表明，AuNC在水平上(垂直于5倍轴)是柔性的(范围为2-3nm)，并且在垂直上约2nm。

(2)通过AuNC集聚化保护5倍界面处关键分子间相互作用TYR288和ASN200的几何屏蔽：HEVNP组装和分解：M-S结构域的相互作用。壳(S)和中间(M)结构域是HEVNP，在全功能HEVNP的组装中是关键的。HEVNP的二聚体结构单元形成五聚体(二聚体的五聚体：十聚体)。十聚体通过5倍界面处两个关键的分子间相互作用稳定：TYR288和ASN200。十聚体通过在HEVNP的3倍二十面体轴处形成钙桥而进一步稳定成全功能HEVNP。可延伸的间隔臂为5倍轴周围AuNC集聚化提供了稳定性；范围为5-12个单位，除了先前建立的P结构域残基483-490、530-535、554-561、573-577、582-593和601-613外，还覆盖了三个另外的缀合区。使用径向距离作为参考点；先前要求保护的残基都在HEVNP的中心上方+116埃。在本文中，我们利用了3个另外的径向分离的残基：96埃；残基组1：残基342-344；106埃：残基组2：残基402-408；114埃：残基组3：残基521-526。

(3)HENVP的中间结构域上的残基402-408，用于半胱氨酸突变和化学活化(通过硫醇交换缀合)。相距5倍轴的平均距离为约32埃。

(4)HENVP的中间结构域上的残基342-344，用于半胱氨酸突变和化学活化(通过硫醇交换缀合)。相距5倍轴的平均距离为约26埃。

(5)HENVP的中间结构域上的残基521-526，用于半胱氨酸突变和化学活化(通过硫醇交换缀合)。相距5倍轴的平均距离为约41埃。*参考我们先前的工作：N573C至5倍的距离为约35埃。

(6)HEVNP另外锚定位点的增强的模块化。我们先前的建立完全集中在突出结构域上的工程化环。在本文中，我们首次将残基的范围扩展至中间结构域(残基：402-408，342-344)以及突出结构域上另外的残基：521-526。我们的初步结果和准备中的手稿表明，这些另外的位点可能适合可延伸的间隔基长度的AuNC缀合。AuNC与中间结构域的缀合可以以与我们已经在被邀请出版在纳米医学的特刊中的手稿中的增强的结构完整性的概念证明中显示类似的方式增强HEVNP抵抗高pH降解的稳定性。尽管AuNC和5倍残基的特异性相互作用尚未完全理解，但获得的病毒衣壳的增强的稳定性允许多模式表面调节；AuNC和范围为5-12个单位的间隔臂与残基组1、2和3缀合，并利用先前建立的位点进行另外的修饰，如靶向肽缀合。AuNC提供的共振可以用光声激发，这对于成像引导的热疗以及用于体外和体内研究的颗粒追踪都可能是有益的。

有效封装核酸的优化的阳离子浓度

为了封装核酸，例如，首先需要浓缩质粒DNA。这可以使用阳离子如镁或锰来实现。尽管使用这些带正电荷的元素促进DNA浓缩，但它们可能通过干扰3倍处钙桥而在颗粒重组过程中引起问题。我们有初步的数据表明，在分别添加和去除钙和镁的优化浓度和时间下，可以实现DNA封装的高效率。我们具有显示十聚体形成但不是完整HEVNP的电子显微镜证据；我们设计基质以允许在其与Ca²⁺离子的相互作用中阳离子(例如Mg²⁺/Mn²⁺)对HEVNP组装的贡献。因此，正在进行的参数优化还将详述用于以受控方式提高DNA封装效率的高级条件。

使用优化的阳离子浓度进行高效率质粒DNA封装的方法。我们将DNA封装到具有不同参数的HEVNP中，所述参数包括在pH4至pH8的质子浓度；使用2mM至100mM的Mg²⁺/Mn²⁺的DNA浓缩试剂；使用2mM至50mM的Ca²⁺的HEVNP组装试剂。通过改变HEVNP和DNA的混合物的总浓度来分析DNA封装的动力学因素。DNA封装过程后通过微分离心沉降(DCS)分析DNA封装效率。在HEVNP分解后通过DTT(1mM-20mM)和EGTA/EDTA(1mM-10mM)的存在来测量和分析已经封装的DNA。

实施例3：在HEVNP上另外位点处的金纳米簇缀合

引言

戊型肝炎病毒纳米颗粒(HEVNP)由60个单体亚基组成，每个亚基由3个结构域组成：从N-末端到C-末端依次为壳(S)残基118-317、中间(M)残基318-451、突出(P)残基452-606。表面暴露的P结构域包含多个环，其可以(并且已经)用于肽(如靶向分子或免疫原性肽)的化学和/或遗传插入。我们首次在M结构域上设计了另外的缀合位点。在P结构域(残基：493-498、510-514、520-525、529-536和570-579)和M结构域(残基：342-344和402-408)上增强的多模式模块化使得HEVNP平台能够用于更广泛的应用(参见图17)。这些应用可以包括化疗、基因疗法、免疫疗法、放射疗法(PET和SPET)、磁热疗法(MRI和MRI引导的治疗)、光线疗法、光热消融和最佳成像、超声成像、疫苗接种、颗粒追踪和组织分布研究。此外，金纳米簇的缀合已经显示出增强HEVNP抵抗pH或酶降解的总体稳定性。使用化学缀合方法，将金纳米簇和接头臂(Au102-C6(也写为AuNC))缀合至HEVNP的P结构域上的位置N573C说明了AuNC倾向于在HEVNP的5倍轴周围形成簇。(Stark等人,2017SciRep)。Baikoghli等人,2018说明了与Au102-C6缀合的HEVNP增加了HEVNP的耐受性以避免在高pH值(>pH8)下降解。HEVNP构建体的这种实现扩大了纳米平台的应用，将其治疗范围从肿瘤靶向扩展至代谢疾病如糖尿病的治疗。AuNC功能化的HEVNP的增强的稳定性延长了其通过胃并到达门静脉的保留时间，使得可以通过口服递送在胃内实现药物如胰岛素的释放，并且也在肝中积聚。Cryo-EM断层扫描重建方法的效用揭开了HEVNP内的地特胰岛素的独特封装和包装(参见图18)。

M结构域的功能化

M结构域的功能通过将位点特异性氨基酸化学工程化为半胱氨酸来实现，这允许基于硫醇的缀合。HEVNP的M结构域上的这种工程化半胱氨酸残基通过在表面上提供多个锚定位点而为纳米颗粒提供了增强的模块化能力。这是通过HEVNP的几何构型实现的。作为一个实例并且如所示，通过HEVNP的P结构域上位置N573C处的接头臂，金纳米簇的缀合导致金纳米簇(AKA超级簇)的共定位，这继而为HEVNP提供了增强的稳定性(Stark等人,2017,Baikoghli等人,2018)。这些金纳米簇与M结构域残基(342-344和402-408)的缀合是前所未有的，并且使用可延伸的接头臂提供了几何上更有利的集聚化。由碳链组成的接头臂可以长达6-14个原子。金纳米簇的模块化性质可以用于优化金纳米簇共定位的最高稳定性。通过冷冻电子显微镜单颗粒分析揭示的如先前所述的P结构域上的N573C缀合位点提供的几何约束显示了在角度为27.5°时，距离朝向HEVNP的5倍二十面体轴的N573C位点的平均距离为

结构域位点范围为342-344的残基在角度为7.5°时距离5倍二十面体轴的中心平均为

M结构域位点范围为402-408的残基在角度为9.5°时距离5倍二十面体轴的中心平均为

(参见图19)。

双重结构域肽缀合

M结构域(342-344和402-408)和P结构域(493-498、510-514、520-525、529-536和570-579)上的表位提供了用于插入两个不同配体的最佳接近的多个锚定点。例如，使用化学插入或遗传插入将两个不同的肽缀合至M结构域和P结构域可以用于形成由两个肽形成的四元表位。这种结构引导的设计由双重结构域肽插入的几何构型驱动。因此，M结构域功能化使得P结构域对于另外的功能化是“自由的”。双重结构域缀合方法使得HEVNP P结构域能够用于靶向，而M结构域可以携带特异性治疗肽或无机材料用于成像引导的纳米热学的目的。M结构域(342-344和402-408)和P结构域(493-498、510-514、520-525、529-536和570-579)上的表位为插入两个不同配体提供了最佳接近的两个锚定点。缀合方法可以是化学的和/或通过基因工程。例如，位点#1(342C|M结构域)和位点#2(573C|P结构域)之间的距离测量为

从342C和573C到5倍中心的距离分别是

和

仅基于M结构域、或者M结构域和P结构域组合的双重插入被用于形成构象表位。因此，基于两个不同插入的四元表位形成可以通过遗传和/或化学缀合来实现(参见图20和21)。

另外的P结构域功能化位点

P结构域残基包括用于增强的多结构域功能化的残基493-498、510-514、520-525、529-536和570-579。除573C之外，另外的P结构域残基可以帮助增强缀合的AuNC的共振(如上所述)。HEVNP表面结构的几何约束迫使AuNC形成集群式集群(cluster-of-clusters)。金原子之间的距离允许电信号穿过簇和在簇周围传递。事实上，使用高分辨率的Cryo-EM(世界上的顶级机器之一—来自JEOL的CryoARM 300Cold-FEG电子显微镜)—我们获得了指示HEVNP与AuNC结合的电子显微镜显微照片。P结构域位点可以类似地用于AuNC与HEVNP的缀合。由于大部分位点位于HEVNP P结构域二聚体的周边附近，因此P结构域的顶端环能够缀合其它功能性肽和/或靶向/追踪分子(参见图22)。

此外，在HEVNP上的缀合位点插入AuNC增强了HEVNP在苛刻条件(包括pH和温度)下抵抗降解的稳定性(Baikoghli等人,2018)。在用AuNC表面调节后，HEVNP耐受较高的温度以避免降解。这对于纳米平台的功能具有重要影响以及对于储存和递送具有影响。纳米平台的这种实现是HEVNP的增强稳定性的独特发现(参见图23)。

此外，由于P结构域残基主要在HEVNP的周边，因此用β-配对的锚标签/捕集器进行功能化可以增加纳米平台的模块化容量。特别地，残基570-579对于bp标签插入是最佳的。bp-捕集器可以缀合至较大的蛋白质，如胰岛素(用于递送和治疗代谢疾病，如糖尿病)，其然后可以共价结合至HEVNP表面上的bp-标签。bp-标签的线性结构对于HEVNP的表面功能化是最佳的，因为缀合的结构不干扰HEVNP衣壳形成(参见图24)。

应用

扩大应用实现

(M结构域和P结构域的)多结构域功能化对实现作为纳米载体平台的HEVNP功能的效用在多种学科中具有应用，包括但不限于化疗；基因疗法；免疫疗法；放射疗法(PET和SPECT)；磁热疗法；MRI(和MRI引导的治疗)；光线疗法；X射线CT/PAT；光热消融和最佳成像；超声成像；疫苗接种；颗粒追踪和组织分布研究；以及代谢疾病的治疗。

增强的稳定性

已经显示金纳米簇的缀合增强了HEVNP的总体稳定性。例如，使用化学缀合方法，将金纳米簇和接头臂(Au102-C6(也写为AuNC))缀合至HEVNP的P结构域上的位置N573C说明了AuNC倾向于在HEVNP的5倍轴周围形成簇(Stark等人,2017SciRep)。此外，Baikoghli等人,2018显示了与Au102-C6缀合的HEVNP增加了HEVNP的耐受性以避免在高pH值(>pH8)下降解。

HEVNP在苛刻的生理条件下递送药物的能力增强

HEVNP在苛刻的生理条件下递送药物的能力增强包括在例如治疗代谢疾病中的应用；将蛋白质(如用于治疗糖尿病的胰岛素)递送至结肠的远端部分，其中pH通常是高的(pH范围为6.5-pH9)：将胰岛素封装在HEVNP中，并增加由AuNC的共振提供的纳米衣壳的稳定性；冷冻电子断层扫描方法用于表征封装胰岛素的HEVNP的3D结构(参见图18)；功能化的HEVNP表面(P结构域(残基：(493-498、510-514、520-525、529-536、570-579)或M结构域(342-344和402-408)))可以用于将封装胰岛素的HEVNP引导至适当的组织；HEVNP的分布可以通过MRI或TEM由重金属(如AuNC)监测。

M结构域残基的功能化

通过实现M结构域缀合进行多结构域模块化

在戊型肝炎病毒纳米颗粒(HEVNP)的M结构域上的工程化半胱氨酸残基通过在HEVNP的表面上提供多个锚定位点来为纳米颗粒提供增强的模块化能力。肽和/或无机材料如金纳米簇的位点特异性的基于硫醇的缀合容易在M结构域的表面暴露的残基处实现，所述残基落入残基342-344(蓝色)和402-408(红色)内(参见图19)。

HEVNP AuNC的几何构型

如所示，通过HEVNP的P结构域上位置N573C处的接头臂，金纳米簇的缀合导致金纳米簇(AKA超级簇)的共定位，这继而为HEVNP提供了增强的稳定性(Stark等人,2017,Baikoghli等人,2018)(参见图22)。这些金纳米簇与M结构域残基(342-344和402-408)的缀合是前所未有的，并且使用可延伸的接头臂提供了几何上更有利的集聚化。由碳链组成的接头臂可以长达6-14个原子。金纳米簇的模块化性质可以用于优化金纳米簇共定位的最高稳定性。通过冷冻电子显微镜单颗粒分析揭示的如先前所述(Stark等人,2017,Baikoghli等人,2018)的P结构域上的N573C缀合位点提供的几何约束显示了在角度为27.5°时，距离朝向HEVNP的5倍二十面体轴的N573C位点的平均距离为

M结构域位点范围为342-344的残基在角度为7.5°时距离5倍二十面体轴的中心平均为

M结构域位点范围为402-408的残基在角度为9.5°时距离5倍二十面体轴的中心平均为

使用M结构域和P结构域的多结构域功能化

M结构域功能化使得P结构域对于另外的功能化是“自由的”。M结构域残基342-344和402-408上的半胱氨酸突变用于缀合纳米簇无机材料，如金纳米簇，并且可以缀合至用于癌症治疗、代谢疾病治疗和/或代谢疾病治疗的小肽。这种双重结构域缀合方法使得HEVNPP结构域能够用于靶向，而M结构域可以携带特异性治疗肽或无机材料用于成像引导的纳米热学的目的。

双结构域肽缀合

M结构域(342-344和402-408)和P结构域(493-498、510-514、520-525、529-536和570-579)上的表位为插入两个不同配体提供了最佳接近的两个锚定点。缀合方法可以是化学的和/或通过基因工程。例如，可以插入免疫原性肽以形成四元表位：插入衣原体免疫原性环的可变结构域(例如，来自M结构域上位置342C的可变结构域2的表位和/或来自P结构域上位置573C的可变结构域3的表位)。两个单独插入的表位非常接近以形成嵌合的四元表位。

双重结构域插入的几何构型

位点#1(342C|M结构域)和位点#2(573C|P结构域)之间的距离(参见图20和21)。342和573的最远原子之间的距离测量为

选择的位点到5倍轴的中心的距离：342C到5倍轴的中心：

573C到5倍的中心：

P结构域残基的功能化

P结构域上的新缀合位点

P结构域残基(493-498、510-514、520-525、529-536、570-579)可以用于增强的多结构域功能化。值得注意的特征包括：(1)AuNC的共振：HEVNP表面结构的几何约束迫使AuNC形成集群式集群。金原子之间的距离允许电信号穿过簇和在簇周围传递。使用高分辨率的Cryo-EM(世界上的顶级机器之一—来自JEOL的CryoARM 300Cold-FEG电子显微镜)—我们获得了指示HEVNP与AuNC结合的电子显微镜显微照片(参见图22)。P结构域位点可以类似地用于AuNC与HEVNP的缀合。由于大部分位点位于HEVNP P结构域二聚体的周边附近(参见图22)。(2)使用Cryo-EM的高分辨率结构确定：Cryo-EM解析与AuNC缀合的HEVNP的高分辨率结构的效用。对比度传递函数信号显示达到

的最大分辨率(参见图22)。使用直接电子检测器技术收集数据以捕获40帧(每帧在1.5秒曝光)，总电子剂量为

进行运动校正以增强图像分辨率和减少散光。各个AuNC被很好地解析并且在背景中清楚地观察到HEVNP。(3)增强的稳定性：在HEVNP上的缀合位点插入AuNC增强了HEVNP在苛刻条件(包括pH(在1.2.1下讨论的)和温度)下抵抗降解的稳定性。HEVNP上新鉴定的缀合位点可以促进AuNC和/或磁性金属以增加HEVNP抵抗温度驱动的降解的稳定性。TEM分析说明了作为增加的温度的函数的HEVNP的增强的稳定性(参见图23)。

功能化的β-配对的标签/捕集器缀合至表面暴露的P结构域

利用HEVNP周边上的残基插入(遗传地或通过化学方法)被bp-捕集器蛋白识别的bp-标签肽(参见图24)提供了这些应用：用感兴趣的蛋白功能化bp-捕集器；用于治疗代谢疾病和靶向肿瘤的有效和扩大的缀合范围。

尽管将小肽或金属(如AuNC)直接插入(有或没有延长的接头)到遗传修饰的HEV-VLP Cys位点提供了合适的纳米平台，但(β-配对的：BP)BP-标签和BP-捕集器的使用可以允许更大的蛋白质(如酶)与功能化的HEV-VLP的表面缀合。这样的实现扩大了HEV-VLP纳米颗粒在诸如疫苗接种、氢形成和信号传导的多价活化的领域中的功能化范围。通过使用马来酰亚胺接头臂的S-S(基于硫醇的)缀合，可以实现BP-标签或BP-捕集器(取决于应用)在HEV-VLP上的I期缀合，同时将为较大蛋白质的II期缀合提供平台。

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参考文献

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Claims (20)

1.修饰的衣壳蛋白，其包含戊型肝炎病毒(HEV)开放阅读框2(ORF2)蛋白的一部分，其中在SEQ ID NO:1所示的HEV ORF2蛋白氨基酸序列的342-344、402-408、510-514、493-498、570-579、529-536或520-525区段或者SEQ ID NO:2、3、4、5或6的相应区段中的至少一个氨基酸被半胱氨酸替代，所述半胱氨酸与选自具有大于20的原子序数的第3族至第18族的元素的纳米簇缀合。

2.如权利要求1所述的修饰的衣壳蛋白，其中所述元素是金。

3.如权利要求1所述的修饰的衣壳蛋白，其中SEQ ID NO:1所示的HEV ORF2蛋白氨基酸序列的氨基酸残基342和/或573或者SEQ ID NO:2、3、4、5或6的相应残基被半胱氨酸替代。

4.如权利要求2所述的修饰的衣壳蛋白，其中所述半胱氨酸是化学衍生的并且通过接头与金纳米簇缀合。

5.如权利要求1所述的修饰的衣壳蛋白，其中所述纳米簇与所述半胱氨酸水平距离为约2-3nm，并且垂直距离为约2nm。

6.如权利要求1所述的修饰的衣壳蛋白，其中所述纳米簇的直径为约1.5-3nm。

7.如权利要求2所述的修饰的衣壳蛋白，其中所述半胱氨酸用6-碳间隔基衍生。

8.如权利要求7所述的修饰的衣壳蛋白，其中所述6-碳间隔基是pMBA44。

9.如权利要求8所述的修饰的衣壳蛋白，其中所述半胱氨酸通过马来酰亚胺接头与所述金纳米簇缀合。

10.如权利要求3所述的修饰的衣壳蛋白，其中所述半胱氨酸用6-碳间隔基pMBA44衍生并且通过马来酰亚胺接头与所述金纳米簇缀合。

11.组合物，其包含权利要求1-10中任一项所述的修饰的衣壳蛋白和封装在由所述修饰的衣壳蛋白形成的HEV病毒样颗粒(VLP)中的生物活性剂。

12.如权利要求11所述的组合物，其还包含药学上可接受的赋形剂。

13.如权利要求11所述的组合物，其被配制用于口服施用。

14.靶向递送生物活性剂的方法，其包括使肝细胞与权利要求11-13中任一项所述的组合物接触。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述肝细胞在患者体内，并且其中接触步骤包括将权利要求9-11中任一项所述的组合物施用至所述患者。

16.如权利要求14所述的方法，其中施用是口服施用。

17.如权利要求15所述的方法，其中所述修饰的衣壳蛋白用pMBA44衍生并且通过马来酰亚胺接头与金纳米簇缀合。

18.如权利要求14所述的方法，其中所述生物活性剂是编码胰岛素、胰岛素原或前胰岛素原的多核苷酸序列。

19.如权利要求14所述的方法，其中所述生物活性剂是胰岛素多肽。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述患者已被诊断患有糖尿病。

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