JPWO2012157408A1 - 細胞傷害性ｔ細胞誘導剤 - Google Patents

細胞傷害性ｔ細胞誘導剤 Download PDF

Info

Publication number
JPWO2012157408A1
JPWO2012157408A1 JP2013515059A JP2013515059A JPWO2012157408A1 JP WO2012157408 A1 JPWO2012157408 A1 JP WO2012157408A1 JP 2013515059 A JP2013515059 A JP 2013515059A JP 2013515059 A JP2013515059 A JP 2013515059A JP WO2012157408 A1 JPWO2012157408 A1 JP WO2012157408A1
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
vlp
cells
virus
peptide
loop
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2013515059A
Other languages
English (en)
Inventor
宏 半田
宏 半田
雅章 川野
雅章 川野
政則 松井
政則 松井
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
LSIP LLC
Original Assignee
LSIP LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by LSIP LLC filed Critical LSIP LLC
Publication of JPWO2012157408A1 publication Critical patent/JPWO2012157408A1/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/162—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001103—Receptors for growth factors
    • A61K39/001106—Her-2/neu/ErbB2, Her-3/ErbB3 or Her 4/ErbB4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001152—Transcription factors, e.g. SOX or c-MYC
    • A61K39/001153—Wilms tumor 1 [WT1]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001154—Enzymes
    • A61K39/001157—Telomerase or TERT [telomerase reverse transcriptase]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/00118—Cancer antigens from embryonic or fetal origin
    • A61K39/001182—Carcinoembryonic antigen [CEA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001184—Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
    • A61K39/001186—MAGE
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001184—Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
    • A61K39/001188—NY-ESO
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/00119—Melanoma antigens
    • A61K39/001191—Melan-A/MART
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/00119—Melanoma antigens
    • A61K39/001192—Glycoprotein 100 [Gp100]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/01—DNA viruses
    • C07K14/025—Papovaviridae, e.g. papillomavirus, polyomavirus, SV40, BK virus, JC virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5258—Virus-like particles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/22011—Polyomaviridae, e.g. polyoma, SV40, JC
    • C12N2710/22023—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/22011—Polyomaviridae, e.g. polyoma, SV40, JC
    • C12N2710/22034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

アジュバントがなくても、ペプチドにワクチンとしての十分な効果を発揮させることを目的として、シミアンウイルス40のVP1から構成されるウイルス様粒子を含有する細胞傷害性T細胞誘導剤であって、前記VP1のDEループ及び／又はHIループ中にT細胞エピトープペプチドが挿入されていることを特徴とする細胞傷害性T細胞誘導剤を提供する。

Description

本発明は、細胞傷害性T細胞(CTL)誘導剤、及びこれを利用したウイルス性疾患又は癌の予防又は治療方法に関する。
シミアンウイルス(Simian virus)40(SV40)は、パポーバウイルス科に属する、サルのポリオーマウイルスの一種であり、小形で、エンベロープを有しない腫瘍ウイルスである。
SV40ウイルスの外殻は、VP1と呼ばれるメジャーカプシドタンパク質によって構成されている。VP1遺伝子を昆虫細胞内などで高発現させると、VP1が多量に合成され、細胞の核内で自己組織化して多くのウイルス様粒子（VLP）が形成される。このVLPの内部に薬剤などを封入し、ドラッグデリバリーとして利用することが本発明者らによって提案されている（国際公開2006/004173）。
VP1に外来性ペプチドを挿入すると正常なVLPが形成されなくなることが多いが、VP1中のDEループやHIループに挿入した場合には、正常な粒子が形成されることが本発明者らによって確認されている。この性質を利用し、DEループやHIループに外来性ペプチドを挿入し、VLPの細胞指向性を変更することが可能である（特許文献１）。
このVLPを利用してワクチンを作製することは従来から行われている。例えば、特許文献２には、CTLエピトープペプチドを結合させたVLPを含むCTLワクチンが記載されている。
国際公開2006/088229 特開2009-197001号公報
ウイルス感染細胞などを破壊するため、ウイルス由来のペプチドをワクチンとして利用することが行われている。しかし、ペプチドは滞留性が悪く、また、分解され易いため、通常、アジュバントと共に投与される。しかし、アジュバントには副作用があるものが多く、ヒトに投与するのには問題がある。
本発明は、以上のような技術的背景の下になされたものであり、アジュバントがなくても、ペプチドにワクチンとしての十分な効果を発揮させ得る手段を提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、T細胞エピトープペプチドをDEループやHIループに挿入した改変型VP1から構成されるVLPが強いCTL誘導性を示すことを見出した。
DEループやHIループに外来性ペプチドを挿入した改変型VP1から構成されるVLPは、特許文献１に開示されている。しかし、特許文献１では、外来性ペプチドは専らVLPの細胞指向性を変更するために挿入されており、外来性ペプチドを用いてCTLを誘導するという発想は、特許文献１には開示されていない。なお、特許文献１の請求項１０などには、外来性ペプチドとして抗原エピトープを使用することが記載されているが、この抗原エピトープは、VLPが抗体と結合できるようにするために使用されているものである。即ち、特許文献１に記載されている「エピトープ」は、抗体によって認識されるエピトープであり、T細胞によって認識されるエピトープ（T細胞エピトープ）ではない。
CTLエピトープペプチドを結合させたVLPを含むCTLワクチンは特許文献２に開示されている（請求項１８２など）。しかし、特許文献２には、シミアンウイルス40のVP1のDEループ及び／又はHIループ中にCTLエピトープペプチドを挿入することは開示されていない。また、本発明のCTL誘導剤は、免疫賦活物質がなくても、十分なCTL誘導効果を持つが、引用文献２に開示されているワクチンは、非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドなどの免疫賦活物質を含んでおり（請求項１）、この点も、本発明のCTL誘導剤と異なる。
本発明は、以上の知見に基づき完成されたものである。
即ち、本発明は、以下の（１）〜（１０）を提供する。
（１）シミアンウイルス40のVP1から構成されるウイルス様粒子を含有するCTL誘導剤であって、前記VP1のDEループ及び／又はHIループ中にT細胞エピトープペプチドが挿入されていることを特徴とするCTL誘導剤。
（２）T細胞エピトープペプチドが、ウイルスタンパク質由来のペプチドであることを特徴とする（１）に記載のCTL誘導剤。
（３）T細胞エピトープペプチドが、インフルエンザウイルスのHA、NA、M1、M2、NP、NS1、NS2、PA、PB1、PB2、又はPB1-F2由来のペプチドであることを特徴とする（１）に記載のCTL誘導剤。
（４）T細胞エピトープペプチドが、癌細胞に特異的なタンパク質由来のペプチドであることを特徴とする（１）に記載のCTL誘導剤。
（５）T細胞エピトープペプチドが、Melan-A/MART-1、gp100、MAGE-A3、MAGE-A10、CEA、HER2/new、NY-E50-1、WT-1、又はhTERT由来のペプチドあることを特徴とする（１）に記載のCTL誘導剤。
（６）T細胞エピトープペプチドが、配列番号１乃至３９のいずれかの配列番号に記載されたアミノ酸配列からなるペプチドであることを特徴とする（１）に記載のCTL誘導剤。
（７）シミアンウイルス40のVP1から構成されるウイルス様粒子であって、前記VP1のDEループ及び／又はHIループ中にウイルスタンパク質由来のT細胞エピトープペプチドが挿入されているウイルス様粒子を、ヒト以外の動物に投与することを特徴とするヒト以外の動物のウイルス性疾患の予防又は治療方法。
（８）シミアンウイルス40のVP1から構成されるウイルス様粒子であって、前記VP1のDEループ及び／又はHIループ中に癌細胞に特異的なタンパク質由来のT細胞エピトープペプチドが挿入されているウイルス様粒子を、ヒト以外の動物に投与することを特徴とするヒト以外の動物の癌の予防又は治療方法。
（９）シミアンウイルス40のVP1から構成されるウイルス様粒子であって、前記VP1のDEループ及び／又はHIループ中にウイルスタンパク質由来のT細胞エピトープペプチドが挿入されているウイルス様粒子を、ヒトに投与することを特徴とするヒトのウイルス性疾患の予防又は治療方法。
（１０）シミアンウイルス40のVP1から構成されるウイルス様粒子であって、前記VP1のDEループ及び／又はHIループ中に癌細胞に特異的なタンパク質由来のT細胞エピトープペプチドが挿入されているウイルス様粒子を、ヒトに投与することを特徴とするヒトの癌の予防又は治療方法。
本発明のCTL誘導剤に含まれるVLPは、アジュバントがなくても、強いCTL誘導効果を持つ。従って、本発明のCTL誘導剤は、副作用を生じさせることなく、ウイルス性疾患や癌の予防や治療を行うことができる。
M1-DE-VLPとM1-HI-VLPのライセート及びペレット溶液のSDS-PAGE後のCBB染色の結果を示す図。調製したライセート及びペレット溶液の一部を10%SDS-PAGEに展開し、CBBで染色した。M1-DE-VLPのライセートは左図のレーン1-4で、レーン1, 2はCpGアジュバントを含んでないもの、レーン3, 4はCpGアジュバントを含む試料を展開した。M1-DE-VLPのペレットは左図のレーン5-6で、レーン5, 6はCpGアジュバントを含んでいないもの、レーン7, 8はCpGアジュバントを含む試料を展開した。M1-HI-VLPのライセートは右図のレーン1-4で、レーン1, 2はCpGアジュバントを含んでないもの、レーン3, 4はCpGアジュバントを含む試料を展開した。M1-HI-VLPのペレットは右図のレーン5-6で、レーン5, 6はCpGアジュバントを含んでいないもの、レーン7, 8はCpGアジュバントを含む試料を展開した。 M1-DE-VLPとM1-HI-VLPのライセート及びペレット溶液の足蹠免疫後の細胞内サイトカイン染色（ICS, Intracellular cytokine staining）解析結果を示す図。M1-DE-VLP (Ａ、Ｂ) 及びM1-HI-VLP (Ｃ、Ｄ) のペレット溶液 (超音波処理によって再懸濁 (Ａ、Ｃ)、及び、ピペッティングによって再懸濁 (Ｂ、Ｄ)) をトランスジェニックマウスに免疫し、一週間後ICSで解析した。また、M1-DE-VLP (Ｅ、Ｆ) 及びM1-HI-VLP (Ｇ、Ｈ) のペレット溶液 (超音波処理によって再懸濁 (Ｅ、Ｇ)) 及びライセート溶液 (Ｆ、Ｈ)をトランスジェニックマウスに免疫し、二週間後ICSで解析した。CpG (-)はCpGアジュバントを加えていないことを示し、CpG +はCpGアジュバントを加えていることを示している。また、peptide pulse (M1 flu M58-66) (-)は、CTLエピトープ配列（GILGFVFTL）を加えていないもの、peptide pulse (M1 flu M58-66) +は、前記配列を加えることでCTLを再誘導していることを示している。各図の右上枠内のドットが、CD8陽性・細胞内IFN-γ陽性細胞を表し、枠内の数字がこの細胞の割合を示す。 M1-DE-VLPとM1-HI-VLPの異なる免疫経路でのICS解析結果を示す図。M1-DE-VLP (左図) 及びM1-HI-VLP (右図) のペレット溶液 (超音波処理によって再懸濁) を踵関節、静脈内、腹腔内、筋肉内、鼻腔内の経路で免疫し、一週間後ICS解析を行った。peptide pulse (M1 flu M58-66) (-)は、CTLエピトープ配列（GILGFVFTL）を加えていないもの、peptide pulse (M1 flu M58-66) +は、前記配列を加えることでCTLを再誘導していることを示している。また、spleenは脾臓から抽出したリンパ球、lungは肺から抽出したリンパ球を示している。各図の右上枠内のドットが、CD8陽性・細胞内IFN-γ陽性細胞を表し、枠内の数字がこの細胞の割合を示す。 M1-DE-VLPとM1-HI-VLPの免疫でのCD107-ICS解析結果を示す図。M1-DE-VLP (左図) 及びM1-HI-VLP (右図) のペレット溶液 (超音波処理によって再懸濁) を、筋肉内、腹腔内の経路で免疫し、一週間後CD107-ICS解析を行った。peptide pulse (M1 flu M58-66) (-)は、CTLエピトープ配列（GILGFVFTL）を加えていないもの、peptide pulse (M1 flu M58-66) +は、前記配列を加えることでCTLを再誘導していることを示している。また、spleenは脾臓から抽出したリンパ球を示している。各図の右上枠内のドットが、各々、CD8陽性・細胞内IFN-γ陽性細胞 (上図)、CD8陽性細胞中のCD107陽性・細胞内IFN-γ陽性細胞 (下図) を表し、枠内の数字がこの細胞の割合を示す。 M1-DE-VLPとM1-HI-VLPの免疫での51Chrome release解析結果を示す図。M1-DE-VLP (左図) 及びM1-HI-VLP (右図) のペレット溶液 (超音波処理によって再懸濁) を筋肉内、腹腔内の経路で免疫し、一週間後51Chrome release解析のためにリンパ球を取り出して培養し、一週間の培養後51Chrome release解析を行った。(-)は、CTLエピトープ配列（GILGFVFTL）を加えていないターゲット細胞からのクロムリリースの割合、M1:58-66は、前記配列を加えたターゲット細胞からのクロムリリースの割合を示している。 M1-DE-VLPとM1-HI-VLPの免疫でのIn vivo CTL解析結果を示す図。M1-DE-VLP (左図) 及びM1-HI-VLP (右図) のペレット溶液 (超音波処理によって再懸濁) を筋肉内、腹腔内の経路で免疫し、一週間後、CFSE染色した、CTLエピトープ配列（GILGFVFTL）を混合したリンパ球 (CFSE high)と混合していないリンパ球 (CFSE low)を、同数、静脈注射で導入し、さらに一日後、In vivo CTL解析を行った。各図は、マウスのリンパ球中のCFSE染色した細胞のCFSE強度 (横軸)と細胞数 (縦軸)を示している。図中の(-)は、免疫をしていないマウスのリンパ球を用いた場合を示し、M1-DE-VLP及びM1-HI-VLPは、それぞれM1-DE-VLP及びM1-HI-VLPで免疫したマウスのリンパ球を用いた場合を示している。枠内の数字は、以下の式によって算出されるリンパ球に対する特異的傷害率を示している。特異的傷害率(%)=(1-r(control)/r(immunized))x100但し、r(control)は、免疫していないマウスにおける(CFSE lowのリンパ球数/CFSE highのリンパ球数)を表し、r(immunized)は、免疫したマウスにおける(CFSE lowのリンパ球数/CFSE highのリンパ球数)を表す。 M1-DE-VLPとM1-HI-VLPの添加によるリンパ球の成熟化を示す図。何も加えない (ヒストグラムで灰色の領域)、 50% Opti-prepTM 溶液の添加 (上段、ヒストグラムで太線、中抜け)、M1-DE-VLPの添加 (中段、ヒストグラムで太線、中抜け)、M1-HI-VLPの添加 (下段、ヒストグラムで太線、中抜け)したリンパ球を、6時間後 (各々の左図)、および、24時間後 (各々の右図) に回収し、FITC-抗CD80抗体 (左)、FITC-抗CD86抗体 (中央)、FITC-抗CD40抗体 (右)で染色し、ヒストグラム解析した。縦軸は細胞数を表し、横軸はFITCの強度を表す。FITC-抗CD86抗体、および、FITC-CD40抗体で染色したM1-DE-VLPおよびM1-HI-VLPとインキュベートしたリンパ球 (ヒストグラムで太線、中抜け) では、何もくわえなかったもの (ヒストグラムで灰色の領域) と比べて、ヒストグラムが右に偏っている。これは、CD86およびCD40がリンパ球表面に発現したため、何も加えなかったリンパ球に対し、FITC-抗CD86抗体、および、FITC-抗CD40抗体がより多くリンパ球表面に結合したことを表している。 M1-DE-VLPとM1-HI-VLPの免疫でのインフルエンザウイルスに対するウイルスチャレンジ実験解析結果を示す図。〔図８-a〕M1-DE-VLP及びM1-HI-VLPのペレット溶液 (超音波処理によって再懸濁) を、筋肉内、腹腔内の経路で免疫し、一週間後、influenza A virus (A/H1N1/PR8及びA/H3N2/Aichi、濃度：100 TCID50/20 μl、接種量：20 μl) を、免疫したマウスに麻酔を施した後、経鼻感染させ、4日後に肺から抽出液を調製し、そこに含まれるインフルエンザウイルス量を赤血球の凝集の分布から、tissue culture influenza virus infectious dose (TCID50) で算出した。左の表は、A/H1N1/PR8を感染させたマウス肺のインフルエンザウイルス量の結果、右の表は、A/H3N2/Aichiを感染させたマウス肺のインフルエンザウイルス量の結果を示している。immunized with (-)は、免疫していないマウス、M1-DE-VLPはM1-DE-VLPで免疫したマウス、M1-HI-VLPはM1-HI-VLPで免疫したマウスの肺の抽出液1 ml当たりに含まれるインフルエンザウイルス量のtissue culture influenza virus infectious dose (TCID50)を示している。〔図８-b〕M1-DE-VLP及びM1-HI-VLPのペレット溶液 (超音波処理によって再懸濁) を、筋肉内、腹腔内の経路で免疫し、一週間後、influenza A virus (A/H1N1/PR8、濃度：100 TCID50/20 μl、接種量：20 μl) を、免疫したマウスに麻酔を施した後、経鼻感染させ、その時のマウスの体重を100%として、2週間、マウスの体重変化を毎日解析した。左図は免疫していないマウス、中央はM1-DE-VLPで免疫したマウス、右図はM1-HI-VLPで免疫したマウスの体重変化を示している。 〔図９-a〕WT1WT-DE-VLPとWT1WT-HI-VLPのライセート及びペレット溶液のSDS-PAGE後のCBB染色の結果を示す図。調製したライセート及びペレット溶液の一部を10%SDS-PAGEに展開し、CBBで染色した。WT1WT-DE-VLPのライセートはレーン3、WT1WT-DE-VLPのペレットはレーン4、WT1WT-HI-VLPのライセートはレーン5、WT1WT-HI-VLPのペレットはレーン6である。〔図９-b〕WT1WT-DE-VLPとWT1WT-HI-VLPの異なる免疫経路でのICS解析結果を示す図。WT1WT-DE-VLP (図９-b、上段) 及びWT1WT-HI-VLP (図９-b、下段) のペレット溶液 (超音波処理によって再懸濁) を筋肉内 (WT1WT-DE-VLP)、腹腔内 (WT1WT-HI-VLP) の経路で免疫し、一週間後ICS解析を行った。peptide pulse (RMFPNAPYL) (-)は、CTLエピトープ配列（RMFPNAPYL）を加えていないもの、peptide pulse (RMFPNAPYL) +は、前記配列を加えることでCTLを再誘導していることを示している。各図の右上枠内のドットが、CD8陽性・細胞内IFN-γ陽性細胞を表し、枠内の数字がこの細胞の割合を示す。〔図９-c〕WT1WT-DE-VLPとWT1WT-HI-VLPの免疫での51Chrome release解析結果を示す図。M1-DE-VLP (左図) 及びM1-HI-VLP (右図) のペレット溶液 (超音波処理によって再懸濁) を筋肉内、腹腔内の経路で免疫し、一週間後51Chrome release解析のためにリンパ球を取り出して培養し、一週間の培養後51Chrome release解析を行った。(-)は、CTLエピトープ配列（RMFPNAPYL）を加えていないターゲット細胞からのクロムリリースの割合、WT1WTは、前記配列を加えたターゲット細胞からのクロムリリースの割合を示している。 IFA (incomplete freund’s adjuvant) とM1-DE-VLP、M1-HI-VLPのCTL誘導をICS解析によって比較した結果を示す図。M1 : 58-66のCTLエピトープ配列 (GILGFVFTL) のペプチドをIFAで懸濁させた乳濁液を皮下内 (s.c.) の経路で一回免疫 (左上図)、及び、一回免疫一週間後に二回目の免疫 (左下図) を行って一週間経過したマウスと、M1-DE-VLP (右上図) 及びM1-HI-VLP (右下図) のペレット溶液 (超音波処理によって再懸濁) を皮下内 (s.c.) の経路で免疫して一週間経過したマウスでICS解析を行った。peptide pulse (M1: 58-66) (-)は、CTLエピトープ配列（GILGFVFTL）を加えていないもの、peptide pulse (M1: 58-66) +は、前記配列を加えることでCTLを再誘導していることを示している。また、spleenは脾臓から抽出したリンパ球を示している。各図の右上枠内のドットが、CD8陽性・細胞内IFN-γ陽性細胞を表し、枠内の数字がこの細胞の割合を示す。 M1-DE-VLP及びM1-HI-VLPでインキュベートしたときの脾臓抽出リンパ球からのIL-12の分泌量をELISAで解析した結果を示す図。表の左のoptiprepはVLPを溶解している溶媒のみ、wild-type-VLPはCTLエピトープを挿入していない野生型のVLP、LPSはlipopolysaccharideで脾臓から抽出したリンパ球とインキュベートしたことを示している。中央はインキュベーション時間、右はELISAによって算出したリンパ球を培養した培養上清のIL-12の濃度を示している。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のCTL誘導剤は、シミアンウイルス40のVP1から構成されるウイルス様粒子を含有するものであって、前記VP1のDEループ及び／又はHIループ中にT細胞エピトープペプチドが挿入されていることを特徴とするものである。
本発明において使用するT細胞エピトープペプチドはCTLを誘導し得るものであれば特に限定されない。T細胞エピトープペプチドとしては、ウイルスタンパク質由来のペプチドや癌細胞に特異的なタンパク質由来のペプチドなどが知られているが、本発明においては、これらいずれのペプチドも使用できる。なお、ここで「癌細胞に特異的なタンパク質」とは、正常細胞では発現せず、癌細胞のみで発現しているタンパク質、又は正常細胞と比較して癌細胞で発現が増加しているタンパク質をいう。
ウイルスタンパク質由来のペプチドとしては、インフルエンザウイルスのHA、NA、M1、M2、NP、NS1、NS2、PA、PB1、PB2、PB1-F2などのタンパク質由来のペプチドを例示できる。これらの中では、インフルエンザウイルスのM1、NP、NS1、PA、PB1、PB2などのタンパク質由来のペプチドが好ましい。具体的なペプチドとしては、インフルエンザウイルスのM1由来のペプチドであるGILGFVFTL（配列番号１）、ASCMGLIY（配列番号２）、SIIPSGPLK（配列番号３）、ILGFVFTLTV（配列番号４）、NP由来のペプチドであるCTELKLSDY（配列番号５）、LPFEKSTVM（配列番号６）、ILRGSVAHK（配列番号７）、ELRSRYWAI（配列番号８）、SRYWAIRTR（配列番号９）、PB1由来のペプチドであるNMLSTVLGV（配列番号１０）、RIFLAMITYI（配列番号１１）、VSDGGPNLY（配列番号１２）、PB2由来のペプチドであるVLTGNLQTL（配列番号１３）、NS1由来のペプチドであるIILKANFSV（配列番号１４）などを例示できる。
インフルエンザウイルス以外のウイルスのタンパク質由来のペプチドとしては、HIVのGag、Pol、Env、Tat、Nef、Rev由来のペプチド、C型肝炎ウイルス(HCV)のE1、E2、Core、NS2、NS3、NS4、NS5由来のペプチド、ヒトパピローマウイルス(HPV)のE6、E7由来のペプチドなどを例示できる。
癌細胞に特異的なタンパク質由来のペプチドとしては、Melan-A/MART-1、gp100、MAGE-A3、MAGE-A10、CEA、HER2/new、NY-E50-1、WT-1、hTERTなどのタンパク質由来のペプチドを例示できる。これらの中では、HER2/new、WT-１、MAGE-A3などのタンパク質由来のペプチドが好ましい。具体的なペプチドとしては、HER2/new由来のペプチドであるALCRWGLLL（配列番号１５）、QLFEDNYAL（配列番号１６）、KIFGSLAFL（配列番号１７）、ILHNGAYSL（配列番号１８）、IISAVVGIL（配列番号１９）、VVLGVVFGI（配列番号２０）、RLLQETELV（配列番号２１）、VMAGVGSPYV（配列番号２２）、CLTSTVQLV（配列番号２３）、QLMPYGCLL（配列番号２４）、YLEDVRLV（配列番号２５）、VLVKSPNHV（配列番号２６）、YMIMVKCWMI（配列番号２７）、ELVSEFSRM（配列番号２８）、VLRENTSPK（配列番号２９）、RWGLLLALL（配列番号３０）、TYLPTNASL（配列番号３１）、PYVSRLLGI（配列番号３２）、WT-1由来のペプチドであるRMFPNAPYL（配列番号３３）、SLGEQQYSV（配列番号３４）、CMTWNQMNL（配列番号３５）、YMFPNAPYL（配列番号３６）、CMTWNQMNL（配列番号３７）、CYTWNQMNL（配列番号３８）、RWPSCQKKF（配列番号３９）などを例示できる。
ループ中に挿入するT細胞エピトープペプチドの長さは、CTLを誘導し得る限り限定されないが、通常、３〜２７アミノ酸であり、好ましくは、８〜１１アミノ酸、より好ましくは９アミノ酸である。
DEループはVP1のN末端から数えて127-146位にあり、HIループは268-277位にある（国際公開2006/088229）。T細胞エピトープペプチドは、これらのループのいずれに挿入してもよいが、DEループについては137-138位のアミノ酸配列をT細胞エピトープペプチドで置き換えるように挿入するのが好ましく、HIループについては273-274位のアミノ酸配列をT細胞エピトープペプチドで置き換えるように挿入するのが好ましい。また、ループに挿入されるT細胞エピトープペプチドの両端には、通常、１〜数個のスペーサーアミノ酸、例えば、グリシン、アラニン、セリンなどが挿入されている（国際公開2006/088229）。スペーサーアミノ酸の個数は、通常、１〜９個であり、好ましくは１〜６個であり、更に好ましくは３〜６個である。
T細胞エピトープペプチドは、DEループ及びHIループの両方に挿入してもよいし、一方にのみ挿入してもよい。また、両方挿入する場合は、同一のT細胞エピトープペプチドを挿入してもよいし、異なるT細胞エピトープペプチドを挿入してもよい。更に、ループ中に二以上のT細胞エピトープペプチドを直列に挿入してもよい。
外来性ペプチドをループ中に挿入したVP1から構成されるウイルス様粒子の作製方法は、国際公開2006/088229に記載されているので、この方法に従って、T細胞エピトープペプチをループ中に挿入したVP1から構成されるウイルス様粒子を作製することができる。例えば、T細胞エピトープペプチドをコードする塩基配列が挿入された改変型VP1遺伝子を作製し、この改変型VP1遺伝子を、バキュロウイルスベクター等を用いて昆虫細胞内等で高発現させることにより、目的のウイルス様粒子を作製できる。
本発明のCTL誘導剤は、有効成分とされる物質の性状に応じた一般的な医薬組成物の形態とし、組成物の直接送達は、一般に非経口的注射（例えば、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、筋肉内注射、組織の間隙の空間への注射等）によって達成される。他の投与法としては、粘膜投与（例えば、経口、経鼻、また肺）、眼を通じた投与、経皮的投与及び坐剤が挙げられる。
すなわち、非経口的に投与する場合には、注射剤、経鼻剤、局所投与剤（経皮剤等）、直腸投与剤等の投与形態で投与することができる。経口的に投与する場合、通常当分野で用いられる投与形態で投与することができる。注射剤としては、例えば無菌の溶液又は懸濁液、乳剤等が挙げられ、具体的には水、水−プロピレングリコール溶液、緩衝化液、0.4％の生理食塩水等が挙げられる。さらに液状製剤とした場合は凍結保存、又は、凍結乾燥等により水分を除去して保存することができる。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水などを加え、再溶解して使用される。局所投与剤としては、例えばクリーム、軟膏、ローション、経皮剤等が挙げられる。経口剤又は直腸投与剤としては、例えばカプセル、錠剤、ピル、散剤、ドロップ、座剤、液剤等が挙げられる。
以上の剤形は通常当分野で行われている手法により、薬学的に許容される賦形剤、添加剤と共に製剤化される。薬学的に許容される賦形剤、添加剤としては、担体、結合剤、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤、pH調節剤、張度調節剤、浸潤剤等が挙げられる。また、薬学的に許容される担体としては、例えば炭酸マグネシウム、ラクトース、ペクチン、澱粉、メチルセルロース等が挙げられる。
本発明のCTL誘導剤は、アジュバントがなくても十分なCTL誘導効果を持つので、アジュバントを含まなくてもよいが、含んでいてもよい。使用するアジュバントとしては、水酸化アルミニウムゲル、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、百日咳菌アジュバント、ポリ(I,C)、CpG-DNA等が挙げられる。
製剤中のT細胞エピトープペプチドの投与量、製剤の投与回数は、T細胞エピトープペプチドの種類、投与対象の症状、年齢、体重、投与形態等によって異なるが、通常0.01μg〜1mg、好ましくは0.1μg〜500μg、より好ましくは1.0μg〜100μgであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。例えば、初期免疫（すなわち、治療的又は予防的投与）では成人患者に関して1.0μg〜500μgのペプチドを投与し、患者の血液における特異的なCTL活性の測定による患者の応答及び状態に応じて、数週間から数ヶ月にわたるブースティング療法に従う1.0μg〜100μgのペプチドのブースティング投与がそれに続く。
本発明のCTL誘導剤は、ウイルス性疾患の予防又は治療用ワクチンや各種癌の予防又は治療用ワクチンとして使用できる。
本発明のCTL誘導剤は、ヒトやヒト以外の動物を投与対象とすることができる。ヒト以外の動物としては、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ニワトリなど）、愛玩動物（例えば、イヌ、ネコなど）、実験動物（マウス、ラットなど）などを挙げることができる。
本発明のCTL誘導剤は、以下のような予防又は治療方法にも利用できる。
（Ａ）シミアンウイルス40のVP1から構成されるウイルス様粒子であって、前記VP1のDEループ及び／又はHIループ中にウイルスタンパク質由来のT細胞エピトープペプチドが挿入されているウイルス様粒子をヒトに投与し、ヒトのウイルス性疾患を予防又は治療する方法。
（Ｂ）シミアンウイルス40のVP1から構成されるウイルス様粒子であって、前記VP1のDEループ及び／又はHIループ中にウイルスタンパク質由来のT細胞エピトープペプチドが挿入されているウイルス様粒子をヒト以外の動物に投与し、ヒト以外の動物のウイルス性疾患を予防又は治療する方法。
（Ｃ）シミアンウイルス40のVP1から構成されるウイルス様粒子であって、前記VP1のDEループ及び／又はHIループ中に癌細胞に特異的なタンパク質由来のT細胞エピトープペプチドが挿入されているウイルス様粒子をヒトに投与し、ヒトの癌を予防又は治療する方法。
（Ｄ）シミアンウイルス40のVP1から構成されるウイルス様粒子であって、前記VP1のDEループ及び／又はHIループ中に癌細胞に特異的なタンパク質由来のT細胞エピトープペプチドが挿入されているウイルス様粒子をヒト以外の動物に投与し、ヒト以外の動物の癌を予防又は治療する方法。
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
〔実施例１〕 M1 CTLエピトープ挿入SV40 VP1遺伝子の作製
インフルエンザウイルス粒子内部タンパク質M1のCTLエピトープ配列 (GILGFVFTL)を（このエピトープ配列は、ヒトのMHC class IのHLA-A＊0201に対するエピトープ配列である。）、SV40 VP1に挿入した。具体的には、VP1のDEループ領域 (137-138アミノ酸領域、古典的にVP1遺伝子の4番目のAlaをアミノ酸番号1として) またはHIループ領域 (273-274アミノ酸領域) をGILGFVFTLで置き換え、M1 CTL エピトープ挿入SV40 VP1挿入変異体を作製した (M1-DE-VP1、M1-HI-VP1)。作製方法は、SV40 VP1をコードするpFastBac 1-SV40 wild type VP1をテンプレートして、Overhang PCR法にて作製した。プライマーは以下のものを用いた。
M1-DE-VP1作製用プライマー
1st round
5'-SalI-Kozac-SV40 VP1
AAAAGTCGACACCATGAAGATGGCCCCAACAAAAAG（配列番号４０）
3'-DE2 loop (M1)
CGTGAACACAAAGCCCAAAATGCCGCCACCGCCATGAGTTTTTTGTGTCCCTGAATG（配列番号４１）
5'-DE2 loop (M1)
CATTTTGGGCTTTGTGTTCACGTTGGGCGGCGGTGGTGCTGGAAAACCCATTCAAG（配列番号４２）
3'-KpnI-SV40 VP1
AAAAGGTACCTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTG（配列番号４３）
2nd round
5'-SalI-Kozac-SV40 VP1
AAAAGTCGACACCATGAAGATGGCCCCAACAAAAAG（配列番号４４）
3'-KpnI-SV40 VP1
AAAAGGTACCTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTG（配列番号４５）
M1-HI-VP1作製用プライマー
1st round
5'-SalI-Kozac-SV40 VP1
AAAAGTCGACACCATGAAGATGGCCCCAACAAAAAG（配列番号４６）
3'-HI1 loop (M1)
CGTGAACACAAAGCCCAAAATGCCGCCACCGCCGTTGGTAAACAGCCCACAAATG（配列番号４７）
5'-HI1 loop (M1)
CATTTTGGGCTTTGTGTTCACGTTGGGCGGCGGTGGAACACAGCAGTGGAAGGG（配列番号４８）
3'-KpnI-SV40 VP1
AAAAGGTACCTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTG（配列番号４９）
2nd round
5'-SalI-Kozac-SV40 VP1
AAAAGTCGACACCATGAAGATGGCCCCAACAAAAAG（配列番号５０）
3'-KpnI-SV40 VP1
AAAAGGTACCTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTG（配列番号５１）
テンプレートは10 ng使用し、プライマーは、50 pmolずつ加えて、KOP polymerase 2.5 units, 0.2 mM dNTPs, 1 mM MgCl2, 6 mM (NH4)2SO4, 10 mM KCl, 120 mM Tris-HCl(pH8.0), 0.1% TritonX-100, 0.001% BSAの濃度の混合溶液30 μlを調製した。
PCRは1st round、2 nd round共に、98℃で60秒インキュベートした後、次のサイクルを25回繰り返し (98℃15秒、59℃15秒、74℃30秒) 、最後に74℃で1分30秒インキュベートして、4℃に移行した。
Overhang PCRで作製した、PCR断片を制限酵素のKpnIとSalIで切断し、pFastBac 1プラスミドベクターのKpnI、SalIサイトの間に挿入し、M1-DE-VP1及びM1-HI-VP1プラスミドとした。
〔実施例２〕 M1-DE-VP1及びM1-HI-VP1を発現するバキュロウイルスの作製
バキュロウイルスゲノムを保持する大腸菌DH10bac (invitrogen) にM1-DE-VP1及びM1-HI-VP1プラスミドを導入して形質転換し、M1-DE-VP1及びM1-HI-VP1を組込んだ組換えバキュロウイルスゲノムを調製した。組換えバキュロウイルスゲノムをSf-9細胞にトランスフェクションし、三日後にその上清を回収して、組換えバキュロウイルスを含む溶液とした。この溶液の一部を再び、Sf-9細胞に感染させることで、組換えバキュロウイルスタイターを上昇させて、組換えバキュロウイルスのストック溶液とした。
〔実施例３〕 M1-DE-VLP及びM1-HI-VLPの調製
M1-DE-VP1及びM1-HI-VP1を組込んだ組換えバキュロウイルスを、M.O.I. (multiplicity of infection) = 0.05〜0.2で3x107個のSf-9細胞に感染させた。感染3日後にSf-9細胞を回収、PBS(-)で洗浄した後、細胞を200 μlの50% Opti-prepTM 溶液 (20 mM Tris-HCl(pH7.9), 50% Opti-prepTM) で再懸濁し、超音波破砕して、ライセート溶液とした (図1左図、レーン1-4、 M1-DE-VP1及び右図、レーン1-4、M1-HI-VP1)。一方、細胞を1 mlのVP1 超音波処理 溶液 (20 mM Tris-HCl(pH7.9), 1% sodium deoxycholate) で再懸濁し、超音波破砕した後、15,000 rpm、4℃で5分間遠心して上清とペレットに分画し、上清を除いた。残ったペレットに50% Opti-prepTM 溶液 (20 mM Tris-HCl(pH7.9), 50%Opti-prepTM) を加えて、ピペッティング、または、超音波処理することで再懸濁し、ペレット溶液とした (図1左図、レーン5-8、 M1-DE-VP1及び右図、レーン5-8、M1-HI-VP1)。
調製したライセート及びペレット溶液の一部をSDS-PAGEで泳動後、CBB染色によって染色した (図1)。
〔実施例４〕 M1-DE-VLP及びM1-HI-VLPの免疫
上記のM1-DE-VLP及びM1-HI-VLPを含むライセート溶液 (100 μl) 及びペレット溶液 (100 μl)にアジュバントとしてはCpG-olygodeoxyncleotide5002 (TCCATGACGTTCTTGATGTT：配列番号５２) アジュバントを5 μg加えて、8週齢のトランスジェニックマウスに足蹠、踵関節、静脈内、腹腔内、筋肉内、鼻腔内の経路で免疫した。トランスジェニックマウスは、C57BL/6をバックグラウンドとし、HLA-A＊0201とH-2Dbのキメラでさらにヒトのβ2mを融合したものを発現しているものを使用した。このマウスは、マウスのβ2mおよびH-2Dbをノックアウトしているため、マウス由来のMHC class Iは細胞表面に露出していないと考えられる。
〔実施例５〕 免疫したマウスの脾臓及び肺からのリンパ球の調製
免疫1週間または2週間後、マウスから脾臓及び肺を摘出し、それぞれ5 mlのRPMI-1640 培地の入ったφ6 cm ディッシュに置いた。ピンセットを用いて脾臓を培地内で、良く揉みほぐし、培地に溶出されたリンパ球を含む溶液を15 ml チューブに移し、もう一度、φ6 cm ディッシュを5 mlのRPMI-1640 培地で洗浄し、上清をその15 ml チューブに加え、総量 10 mlとした。すぐに15 ml チューブの底にたまる組織断片を残して、上清を再び新しい15 ml チューブに移し、室温、1,200 rpmで5分間遠心し、リンパ球をペレットに移行させた。上清を除いて、ペレットをほぐした後、赤血球を除くために、250 μlのNH4Cl-トリス溶液を加えかき混ぜた後、すばやく10 mlのRPMI-1640 培地を加え、室温、1,2000 rpmで5分間遠心し、リンパ球をペレットに移行させた。上清を除いて、ペレットをほぐした後、再び10 mlのRPMI-1640 培地を加え、変性した赤血球を吸わないように、ピペットで新しい15 ml チューブに移して、再び室温、1,200 rpmで5分間遠心した。上清を除いた後、ペレットをほぐしてもう一度10 mlのRPMI-1640 培地で懸濁し、室温、1,200 rpmで5分間遠心した。上清を除いて、最後に2 mlの10% FCS混入RPMI-1640 培地で懸濁した。リンパ球を数えるために、490 μlの2%酢酸溶液に10 μlの上記懸濁溶液を加え、ビュルケルチュルク血球計算版で、細胞数を算出し、2x107 cells/mlとなるように10%FCS混入RPMI-1640 培地で希釈、または、濃縮した。
摘出した肺は、培地の混入していないφ6 cm ディッシュに移し、ハサミで良く切り刻んだ後、10 mlの50 unit/ml Collagenase Type 1、10% FCS混入RPMI-1640 培地で懸濁し、1時間、37℃、5% CO2 incubatorでインキュベートした。インキュベート後、100 μm Nylon製のcell strainer (BD Falcon) を通して、50 ml チューブに上清を回収し、strainerに残った組織片をcell scraperですり潰した後、さらに10 ml 10% FCS混入RPMI-1640 培地を通過させ、総量 20 mlの溶液を50 ml チューブに回収した。回収した溶液を室温、1,200 rpmで5分間遠心し、上清を除いて、ペレットをほぐした後、10 ml RPMI-1640 培地を加えて、懸濁液を15 ml チューブに移した。移した15 ml チューブを室温、1,200 rpmで5分間遠心し、上清を除き、ペレットをほぐした後、さらに10 ml RPMI-1640 培地を加えて室温、1,200 rpmで5分間遠心することで、細胞を洗浄した。上清を除いた後、ペレットをほぐして、最後に10 mlの10% FCS混入RPMI-1640 培地を加えて室温、1,200 rpmで5分間遠心し、上清を除いて、ペレットをほぐした後、250 μlの10% FCS混入RPMI-1640 培地を加えた。
〔実施例６〕 ICS解析
上記の方法で脾臓及び肺から回収したリンパ球中に、M1のCTLエピトープ配列 (GILGFVFTL)に反応して誘導されるCTLが存在することを調べるために、ICS解析を行った。96 ウェル丸底プレートに10% FCS混入RPMI-1640 培地で25倍希釈したBD GolgiPlugTM (BD) を1 ウェル当り5 μl加え、そこにさらに10% FCS混入RPMI-1640 培地で希釈した20 μMのM1のCTLエピトープのペプチド（GILGFVFTL、Operon）を100 μl加えた。ネガティブコントロールとして、ペプチドを含まない10% RCS混入RPMI-1640 培地を100 μl加えた。
このウェルに上記で調製した、脾臓から調製したリンパ球及び肺から調製したリンパ球を100 μl加えた後、5時間、37℃、5% CO2 incubatorでインキュベートした。
インキュベート後4℃、1,400 rpmでスピンダウンして上清を除き、ボルテックスミキサーで細胞をほぐした後、1 ウェル当り、FACS バッファー (2% FCS, 0.1% sodium azide, 1xPBS(-))を200 μl加え、再び4℃、1,400 rpmでスピンダウンして上清を除き、細胞をほぐした後、FACS バッファーで5 μg/mlに希釈したMouse BD Fc BlockTM (BD Pharmingen) を100 μl加えて、４℃で10分間インキュベートした。
インキュベート後、4℃、1,400 rpmでスピンダウンして上清を除き、細胞をほぐした後、1 ウェル当り、FACS バッファーを200 μl加え、再び4℃、1,400 rpmでスピンダウンして上清を除き、もう一度FACS バッファーによる洗浄操作を行った。ほぐした細胞に、1 ウェル当り、FACS バッファーで10 μg/mlに希釈したFITC Rat Anti-Mouse CD8a Clone: 53-6.7 (BD Pharmingen) を50 μl加えて、4℃暗所で30分間インキュベートした。
インキュベート後、200 μlのFACS バッファーでの洗浄操作を2回行った後、ほぐした細胞に、1 ウェル当り、100 μlのBD Cytofix/CytopermTM (BD Biosciences)を加えて、4℃暗所で20分間インキュベートした。インキュベート後、200 μlの1xBD Perm/WashTM (BD biosciences)でFACS バッファーで行った洗浄操作と同様の操作を2回行った後、ほぐした細胞に、1xBD Perm/WashTM で10 μg/mlに希釈したPE anti-mouse IFN-γClone: XMG1.2 (BioLegend) を50 μl加えて、4℃暗所で30分間インキュベートした。
インキュベート後、200 μlの1xBD Perm/WashTMでの洗浄操作を2回行った後、ほぐした細胞に、1 ウェル当り、100 μlのFACS固定バッファー (1% ホルムアルデヒド, 1xFACS バッファー)を加えて、4℃ 暗所でovernightインキュベートした。
インキュベート後、400 μlのFACS バッファーを5 mlのポリスチレンチューブに加え、そこに100 μlのFACS固定バッファーで固定したサンプルを加えた後、FACScan (BD) でドットプロット解析を行った。解析にはCell Quest (BD) のソフトウェアを使用した。図２、図３に、ICSの2次元解析の結果を示した。
図２に示すように、いずれの測定結果においてもCTLエピトープペプチドのインキュベートによりCD8陽性・細胞内IFN-γ陽性細胞数の割合が増大していた。また、CpGを加えない方がCD8陽性・細胞内IFN-γ陽性細胞数の割合が増大するという結果も得られた。これらから、M1-DE-VLP及びM1-HI-VLPは、アジュバントがなくても、CTLを誘導できる可能性があることがわかった。
図３に示すように、M1-DE-VLPを筋肉内投与した場合、及びM1-HI-VLPを腹腔内投与した場合に、CTLエピトープペプチドのインキュベートによるCD8陽性・細胞内IFN-γ陽性細胞数の増大が著しかった。
〔実施例7〕 CD107-ICS解析
実施例5の方法で脾臓から回収したリンパ球中に、M1のCTLエピトープ配列 (GILGFVFTL)に反応して誘導される細胞傷害活性を有するCTLが存在することを調べるために、CD107-ICS解析を行った。96 ウェル丸底プレートに10% FCS混入RPMI-1640 培地で25倍希釈したBD GolgiPlugTM (BD) を1 ウェル当り5 μl、及び、10% FCS混入RPMI-1640 培地で25倍希釈したBD GolgiStopTM (BD) を1 ウェル当り5 μl、FITC Rat Anti-Mouse CD107a Clone: 1D4B (BD Pharmingen)を0.8 μg加え、 そこにさらに10% FCS混入RPMI-1640 培地で希釈した20 μMのM1のCTLエピトープのペプチド（GILGFVFTL、Operon）を100 μl加えた。ネガティブコントロールとして、ペプチドを含まない10% RCS混入RPMI-1640 培地を100 μl加えた。
このウェルに実施例5で調製した、脾臓から調製したリンパ球を100 μl加えた後、暗所、6時間、37℃、5% CO2 incubatorでインキュベートした。
インキュベート後4℃、1,400 rpmでスピンダウンして上清を除き、ボルテックスミキサーで細胞をほぐした後、1 ウェル当り、FACS バッファー (2% FCS, 0.1% sodium azide, 1xPBS(-))を200 μl加え、再び4℃、1,400 rpmでスピンダウンして上清を除き、細胞をほぐした後、FACS バッファーで5 μg/mlに希釈したMouse BD Fc BlockTM (BD Pharmingen) を100 μl加えて、４℃で10分間インキュベートした。
インキュベート後、4℃、1,400 rpmでスピンダウンして上清を除き、細胞をほぐした後、1 ウェル当り、FACS バッファーを200 μl加え、再び4℃、1,400 rpmでスピンダウンして上清を除き、もう一度FACS バッファーによる洗浄操作を行った。ほぐした細胞に、1 ウェル当り、FACS バッファーで10 μg/mlに希釈したPE/Cy5 Rat Anti-Mouse CD8a Clone: 53-6.7 (BD Pharmingen) を50 μl加えて、4℃暗所で30分間インキュベートした。
インキュベート後、200 μlのFACS バッファーでの洗浄操作を2回行った後、ほぐした細胞に、1 ウェル当り、100 μlのBD Cytofix/CytopermTM (BD Biosciences)を加えて、4℃暗所で20分間インキュベートした。インキュベート後、200 μlの1xBD Perm/WashTM (BD biosciences)でFACS バッファーで行った洗浄操作と同様の操作を2回行った後、ほぐした細胞に、1xBD Perm/WashTM で10 μg/mlに希釈したPE anti-mouse IFN-γClone: XMG1.2 (BioLegend) を50 μl加えて、4℃暗所で30分間インキュベートした。
インキュベート後、200 μlの1xBD Perm/WashTMでの洗浄操作を2回行った後、ほぐした細胞に、1 ウェル当り、100 μlのFACS固定バッファー (1% ホルムアルデヒド, 1xFACS バッファー)を加えて、4℃ 暗所でovernightインキュベートした。
インキュベート後、400 μlのFACS バッファーを5 mlのポリスチレンチューブに加え、そこに100 μlのFACS固定バッファーで固定したサンプルを加えた後、FACScan (BD) でドットプロット解析を行った。解析にはCell Quest (BD) のソフトウェアを使用した。図4に、CD107-ICSの2次元解析の結果を示した。
図4に示すように、いずれの測定結果においてもCTLエピトープペプチドのインキュベートによりCD8陽性・細胞内IFN-γ陽性細胞数の割合が増大する場合、CD8陽性・CD107陽性・細胞内IFN-γ陽性細胞数の割合も増大することがわかった。CD8陽性・CD107陽性・細胞内IFN-γ陽性細胞は、細胞傷害活性を有することから、M1-DE-VLP及びM1-HI-VLPによる免疫は、細胞傷害性を有するCTLを誘導できる可能性があることがわかった。
〔実施例8〕 51Chrome release解析
実施例7で示した、CD8陽性・CD107陽性・細胞内IFN-γ陽性細胞が、細胞傷害することを示すために、51Chrome release解析を行った。免疫をしていないマウスから脾臓のリンパ球を実施例5と同様の方法で調製した。2 mlの10% FCS混入RPMI-1640 培地中の免疫していないマウスの脾臓リンパ球2.4x108 cellsに、10 mMのM1のCTLエピトープのペプチド（GILGFVFTL、Operon）を4 μl加え、15 mlチューブ中で、2時間、37℃、5% CO2 incubatorでインキュベートした。インキュベート後、20 Gy (グレイ) のX線を照射した。照射後、室温、1,2000 rpmで5分間遠心し、リンパ球をペレットに移行させた。上清を除いて、ペレットをほぐした後、2 mlの10% FCS混入RPMI-1640 培地を加え、リンパ球を数えるために、490 μlの2%酢酸溶液に10 μlのリンパ球溶液を加え、ビュルケルチュルク血球計算版で、細胞数を算出し、5x106 cells/mlとなるように10%FCS混入RPMI-1640 培地で希釈した。
同時に、筋肉注射によって約50 μgのM1-DE-VLP、及び、腹腔注射によって約50 μgのM1-HI-VLPを免疫し、免疫1週間後、マウスから脾臓を摘出し、それぞれ5 mlのRPMI-1640 培地の入ったφ6 cm ディッシュに置いた。ピンセットを用いて脾臓を培地内で、良く揉みほぐし、培地に溶出されたリンパ球を含む溶液を15 ml チューブに移し、もう一度、φ6 cm ディッシュを5 mlのRPMI-1640 培地で洗浄し、上清をその15 ml チューブに加え、総量 10 mlとした。免疫をしたリンパ球は、血液を除かないので、すぐに15 ml チューブの底にたまる組織断片を残して、上清を再び新しい15 ml チューブに移し、室温、1,200 rpmで5分間遠心し、リンパ球をペレットに移行させた。上清を除いて、ペレットをほぐした後、2 mlの10% FCS混入RPMI-1640 培地を加え、リンパ球を数えるために、490 μlの2%酢酸溶液に10 μlのリンパ球溶液を加え、ビュルケルチュルク血球計算版で、細胞数を算出し、5x106 cells/mlとなるように10%FCS混入RPMI-1640 培地で希釈した。
48 ウェルのプレートに、1 ウェル当り、上記免疫を施していない、M1のCTLエピトープのペプチドでインキュベートし、X線照射したリンパ球5x106 cells/ml、500 μlと、免疫したリンパ球5x106 cells/ml、500μlを混合した。このウェルは1 サンプル当り、24 ウェル作製した。混合後、7日間、37℃、5% CO2 incubatorでインキュベートした。
7日間のインキュベート後、24 ウェル中のリンパ球を1本の50 mlチューブに集めて、室温、1,200 rpmで5分間遠心し、リンパ球をペレットに移行させた。上清を除いて、ペレットをほぐした後、2 mlの10% FCS混入RPMI-1640 培地を加え、リンパ球を数えるために、20 μlの0.4%トリパンブルー溶液 (Gibco) に20 μlのリンパ球溶液を加え、ビュルケルチュルク血球計算版で、細胞数を算出し、7.5x106 cells/mlとなるように10%FCS混入RPMI-1640 培地で希釈または濃縮した。この調製したリンパ球をエフェクター細胞とした。
同時に、1x106 cells/mlのRMA-HHD培養細胞を1 mlずつ、2本の15 mlチューブに分注し、片方のチューブには、10 mMのM1のCTLエピトープのペプチド（GILGFVFTL、Operon）を5 μl加え、2時間、37℃、5% CO2 incubatorでインキュベートした。もう片方のチューブにはペプチドは加えなかった。インキュベート後、室温、1,000 rpmで5分間遠心し、細胞をペレットに移行させた。上清を除いて、ペレットをほぐした後、100 μCi (マイクロシーベルト) のNa2 51CrO4溶液を加え、30分間、37℃、5% CO2 incubatorでインキュベートした。インキュベート後、室温、1,000 rpmで5分間遠心し、細胞をペレットに移行させた。上清を除いて、ペレットをほぐした後、洗浄操作のために、1 mlの10% FCS混入RPMI-1640 培地を加え、室温、1,200 rpmで5分間遠心し、リンパ球をペレットに移行させ、上清を除いた。この洗浄操作を5回繰り返した。最後に、上清を除いた後、1 mlの10% FCS混入RPMI-1640 培地を加えた。新しい15 mlチューブに、この細胞溶液500 μlと9.5 mlの10% FCS混入RPMI-1640 培地を混合して20倍希釈した。この細胞溶液をターゲット細胞とした。
96 ウェルプレートに、100 μlのターゲット細胞 (5x103 cells) を分注し、そこに、エフェクター細胞：ターゲット細胞の比率が150：1となるように、エフェクター細胞を100 μl (7.5x105 cells)、エフェクター細胞：ターゲット細胞の比率が30：1となるように、エフェクター細胞を20 μl (1.5x105 cells)と80 μlの10% FCS混入RPMI-1640 培地、エフェクター細胞：ターゲット細胞の比率が15：1となるように、エフェクター細胞を10 μl (7.5x104 cells)と90 μlの10% FCS混入RPMI-1640 培地を加えた。ポジティブコントロールとして、100 μlの5% Triton-X 100溶液、ネガティブコントロールとして、100 μlの10% FCS混入RPMI-1640 培地を加えた。混合後、4時間、37℃、5% CO2 incubatorでインキュベートした。
インキュベート後、Supernatant collection system (Molecular Devices) を用いて、上清を回収し、AUTO WELL GAMMA SYSTEM (ARC-380CL, Aloka)、及び、ALOKA RIA Program (ARCAS ver. 3.11, Aloka)で、リリースされた51Crのガンマ線をカウントし、解析した。図5に51Chrome release解析の結果を示した。
図5に示すように、M1-DE-VLP及びM1-HI-VLPで免疫し、調製したリンパ球は、M1のCTLエピトープのペプチド（GILGFVFTL）を提示している細胞 (図5のM1: 58-66) を選択的に傷害することで、51Crのリリースを誘導することから、M1-DE-VLP及びM1-HI-VLPによる免疫は、M1のCTLエピトープのペプチド（GILGFVFTL）を提示している細胞を選択的に傷害するCTLを誘導できることがわかった。
〔実施例9〕 In vivo CTL解析
実施例8で示した、M1のCTLエピトープのペプチド（GILGFVFTL）を提示している細胞を選択的に傷害するCTLが、実際に動物体内でM1のCTLエピトープのペプチド（GILGFVFTL）を提示している細胞を選択的に傷害することを解析するために、In vivo CTL解析を行った。筋肉注射によって約50 μgのM1-DE-VLP、及び、腹腔注射によって約50 μgのM1-HI-VLPを免疫した。
免疫1週間後、免疫していないマウス3匹から脾臓を摘出し、5 mlのRPMI-1640 培地の入ったφ6 cm ディッシュに置いた。ピンセットを用いて脾臓を培地内で、良く揉みほぐし、培地に溶出されたリンパ球を含む溶液を15 ml チューブに移し、もう一度、φ6 cm ディッシュを5 mlのRPMI-1640 培地で洗浄し、上清をその15 ml チューブに加え、総量 10 mlとした。免疫をしていないリンパ球は、血液を除かないので、すぐに15 ml チューブの底にたまる組織断片を残して、上清を再び新しい15 ml チューブに移し、室温、1,200 rpmで5分間遠心し、リンパ球をペレットに移行させた。上清を除いて、ペレットをほぐした後、2 mlの10% FCS混入RPMI-1640 培地を加えた。2本の15 mlチューブに調製した免疫をしていないリンパ球を1 mlずつ分注し、片方には、10 mMのM1のCTLエピトープのペプチド（GILGFVFTL、Operon）を1 μl加え、1時間、37℃、5% CO2 incubatorでインキュベートした。インキュベート後、室温、1,2000 rpmで5分間遠心し、リンパ球をペレットに移行させた。上清を除いて、ペレットをほぐした後、再び10 mlのRPMI-1640 培地を加え、室温、1,2000 rpmで5分間遠心し、リンパ球をペレットに移行させた。上清を除いて、ペレットをほぐした後、20 mlの0.1% BSA混入PBS(-)溶液を加え、CTLエピトープのペプチド（GILGFVFTL）でインキュベートしたリンパ球溶液には、10 μlの5 mM carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) (Molecular Probes)、ペプチドでインキュベートしていないリンパ球溶液には、1 μlの5 mM CFSEを加えて、よく混合した後、10分、37℃のウォーターバスで振とう培養した。振とう後、室温、1,200 rpmで5分間遠心し、リンパ球をペレットに移行させた。上清を除いて、ペレットをほぐした後、10 mlの10% FCS混入RPMI-1640 培地を加え、室温、1,200 rpmで5分間遠心し、リンパ球をペレットに移行させた。上清を除いて、ペレットをほぐした後、2 mlの10% FCS混入RPMI-1640 培地を加え、リンパ球を数えるために、490 μlの2%酢酸溶液に10 μlのリンパ球溶液を加え、ビュルケルチュルク血球計算版で、細胞数を算出し、5x107 cells/mlとなるように10%FCS混入RPMI-1640 培地で希釈または濃縮した。CFSEで標識したペプチドでインキュベートしていないリンパ球5x107 cells/mlとインキュベートしたリンパ球5x107 cells/mlを同量混合し、CFSE標識リンパ球溶液とした。
免疫をしていないマウス、筋肉注射によって約50 μgのM1-DE-VLP、及び、腹腔注射によって約50 μgのM1-HI-VLPを免疫し、一週間経過したマウス各々に、上記で調製したCFSE標識リンパ球溶液200 μlを静脈注射し、一日経過させた。
一日経過後、マウスから脾臓を摘出し、5 mlのRPMI-1640 培地の入ったφ6 cm ディッシュに置いた。ピンセットを用いて脾臓を培地内で、良く揉みほぐし、培地に溶出されたリンパ球を含む溶液を15 ml チューブに移し、もう一度、φ6 cm ディッシュを5 mlのRPMI-1640 培地で洗浄し、上清をその15 ml チューブに加え、総量 10 mlとした。リンパ球は、血液を除かないので、すぐに15 ml チューブの底にたまる組織断片を残して、上清を再び新しい15 ml チューブに移し、室温、1,200 rpmで5分間遠心し、リンパ球をペレットに移行させた。上清を除いて、ペレットをほぐした後、1 mlのFACS固定バッファー (1% ホルムアルデヒド, 1xFACS バッファー)を加えた。500 μlのFACS バッファーを5 mlのポリスチレンチューブに加え、そこに200 μlのFACS固定バッファーで固定したリンパ球溶液を加えた後、FACScan (BD) でヒストグラム解析を行った。解析にはCell Quest (BD) のソフトウェアを使用した。図6に、In vivo CTL解析の結果を示した。
図6に示すように、免疫していないマウスからリンパ球を調製した場合、CTLエピトープ配列を混合していないリンパ球（図中のlowの位置に示される。）とCTLエピトープ配列を混合したリンパ球（図中のhighの位置に示される。）の細胞数はほぼ同じであった。一方、M1-DE-VLP又はM1-HI-VLPで免疫したマウスからリンパ球を調製した場合、CTLエピトープ配列を混合していないリンパ球（図中のlowの位置に示される。）に比べCTLエピトープ配列を混合したリンパ球（図中のhighの位置に示される。）の細胞数は少なかった。このことから、M1-DE-VLP又はM1-HI-VLPでの免疫によって誘導されたCTLは、実際に動物他内でM1のCTLエピトープのペプチドを提示している細胞を選択的に傷害することがわかった。
〔実施例１０〕 リンパ球の成熟化解析
実施例5と同様の方法で、C57BL/6マウスの脾臓から赤血球を除いたリンパ球を精製し、1x107 cells/mlとなるように10% FCS混入RPMI-1640 培地で希釈した。96 ウェルプレートに、a)何も加えない50% Opti-prepTM 溶液 (20 mM Tris-HCl(pH7.9), 50% Opti-prepTM)を5 μl、b)実施例3で調製したM1-DE-VLP溶液を5 μl、もしくは、c)M1-HI-VLP溶液を5 μl加え、そこに、上記で調製したリンパ球を50 μl加え、1 ウェル当りの総量が200 μlとなるように、10% FCS混入RPMI-1640 培地を加えた。ピペッティングで混合した後、このプレートを6時間、または24時間、37℃、5% CO2 incubatorでインキュベートした。
インキュベート後4℃、1,400 rpmでスピンダウンして上清を除き、ボルテックスミキサーで細胞をほぐした後、1 ウェル当り、FACS バッファー (2% FCS, 0.1% sodium azide, 1xPBS(-))を200 μl加え、再び4℃、1,400 rpmでスピンダウンして上清を除き、細胞をほぐした後、FACS バッファーで10 μg/mlに希釈したFITC Armenian Hamster Anti-Mouse CD80 Clone: 16-10A1 (BD Pharmingen)、または、FITC Rat Anti-Mouse CD86 Clone: GL-1 (BD Pharmingen)、もしくは、FITC Armenian Hamster Anti-Mouse CD40 Clone: HM40-3 (BD Pharmingen)を100 μl加えて、４℃、暗所で30分間インキュベートした。
インキュベート後、200 μlのFACS バッファーでの洗浄操作を2回行った後、ほぐした細胞に、1 ウェル当り、100 μlのFACS固定バッファー (1% ホルムアルデヒド, 1xFACS バッファー) を加えて、4℃ 暗所でovernightインキュベートした。
インキュベート後、400 μlのFACS バッファーを5 mlのポリスチレンチューブに加え、そこに100 μlのFACS固定バッファーで固定したサンプルを加えた後、FACScan (BD) でヒストグラム解析を行った。解析にはCell Quest (BD) のソフトウェアを使用した。図7に、ヒストグラムの結果を示した。
図7に示すように、50% Opti-prepTM 溶液はCD80, CD86, CD40の成熟化マーカーの発現を誘導しないのに対し、M1-DE-VLPおよびM1-HI-VLP混入の溶液は、CD86, CD40の成熟化マーカーの発現を誘導した。CD86の発現は細胞傷害性T細胞の活性化に重要であることから、M1-DE-VLP及びM1-HI-VLPは細胞傷害性T細胞の活性化作用があることがわかった。
〔実施例１１〕 ウイルスチャレンジ実験
M1のCTLエピトープのペプチド（GILGFVFTL）を提示している細胞を選択的に傷害するCTLが、インフルエンザウイルス感染に与える影響を解析するために、ウイルスチャレンジ実験を行った。筋肉注射によって約50 μgのM1-DE-VLP、及び、腹腔注射によって約50 μgのM1-HI-VLPをHLA-A2トランスジェニックマウス (HHDマウス) に免疫した。
免疫1週間後、インフルエンザウイルス（A/H1N1/PR8、および、A/H3N2/Aichi）をtissue culture influenza virus infectious dose (TCID50) で100 TCID50/20 μlとなるようにPBS(-)で希釈し、この希釈溶液20 μlを、免疫したマウスに麻酔を施した後、経鼻感染させた。
感染4日後に、マウス肺を取り出し、1 mlのPBS(-)を加えた後、ティッシューホモジナイザー (ガラスホモジナイザー、イボ付き、10 ml、812-770-02、池本理化) で組織が見えなくなるまですりつぶした後、溶液を15 mlチューブに移した。遠心機で4℃、2000 rpm、5分間遠心し、上清をスクリューキャップ付きの2 mlチューブに移した。鶏の赤血球を加えることによる赤血球の凝集からインフルエンザウイルス量を算出するために、マウス肺をすりつぶした上清100 μlを丸底の96穴プレートのレーンAに加え、レーンBからGには5%FCS混入DMEM培地を90 μl加え、ネガティブコントロールとしてレーンHに5%FCS混入DMEM培地を100 μl加えた。レーンAから10 μlをレーンBに移動させ、ピペッティングで懸濁した後、レーンBから10 μlをレーンCに移動させ懸濁するという繰り返し操作を、レーンGまで行い、インフルエンザウイルス感染肺上清の１０倍希釈系列を作製した。平均を算出するために、1サンプル当たり、この系列を5つ作製した。この系列全てに2.5x105 cells/mlのMDCK細胞を100 μlずつ加えた後、24時間、35℃、5% CO2 incubatorでインキュベートした。インキュベート後、培養上清をピペットで全て取り除き、200 μlの0.0002% trypsin混入 (2μl/ml trypsin) DMEM培地を加えた後、さらに3日間、35℃、5% CO2 incubatorでインキュベートした。インキュベート後、50 μl の0.8%ニワトリ血液 (ニワトリ保存血液、0109-1、日本バイオテスト研究所) を加え、4℃で1時間静置した。赤血球の凝集の分布から、tissue culture influenza virus infectious dose (TCID50) を算出した。
図8aに示すように、M1-DE-VLPおよびM1-HI-VLPで免疫したマウス肺におけるインフルエンザウイルスタイターは、免疫を行わなかったマウスと比較して、およそ10倍低いことから、M1-DE-VLPおよびM1-HI-VLP免疫はインフルエンザウイルスの肺での増殖を抑制する効果があることが示唆された。
また、インフルエンザウイルス（A/H1N1/PR8）感染後から、マウスの体重を2週間毎日計測し、感染前の体重を100%としたときの体重変化を記録した。図8bに示すように、M1-DE-VLPおよびM1-HI-VLPで免疫したマウスの体重はおおよそ元の体重を維持するのに対し、免疫を行わなかったマウスでは、著しい体重減少が観察されたことから、M1-DE-VLPおよびM1-HI-VLPによる免疫は、インフルエンザウイルス感染による体重減少の抑制にも効果があることが示唆された。
〔実施例１２〕 がんCTLエピトープを挿入したVLP免疫
実施例１から３と同じ方法で、M1のCTLエピトープ配列（GILGFVFTL）の代わりに、がん抗原として知られているWT1のHLA-A2に対するCTLエピトープ配列（RMFPNAPYL）を挿入したVLPを調製した (WT1WT-DE-VLP、WT1WT-HI-VLP) (図９-a) 。実施例４から６と同じ方法で、HLA-A2トランスジェニックマウスに免疫し、リンパ球を調製、WT1のCTLエピトープ配列に対するICS解析を行った (図９-b) 。また、実施例８と同様の方法により、WT1のCTLエピトープ配列に対する51Chrome release解析を行った。
図９に示すように、M1のCTLエピトープ配列を挿入したVLPと同様に、WT1のCTLエピトープ配列を挿入したVLPを調製し (図９-a)、免疫する事で、WT1のCTLエピトープ配列（RMFPNAPYL）に対するCTLが誘導され (図９-b)、誘導されたWT1のCTLエピトープに対するCTLがWT1のCTLエピトープ配列を提示している細胞を選択的に障害することが明らかになった (図９-c)。このことから、VLPが様々なCTLエピトープ配列に対するCTLを誘導することができる有用なキャリアであることが示された。
〔実施例１３〕 M1 CTL peptide懸濁IFA乳濁液によるCTL誘導のICS解析
実施例３から６と同様の方法によって、M1-DE-VLP (図１０, 右上図) 及びM1-HI-VLP (図１０, 右下図) のICS解析を行った。免疫は、実施例４と同様に調製した100 μlのM1-DE-VLP及びM1-HI-VLPのペレット溶液を鼠蹊部皮下 (subcutaneous, s.c.) に注射することによって行った。
一方、M1のCTLエピトープのペプチド（GILGFVFTL）を懸濁したIFA乳濁液は、20 μg/μlの濃度のDMSO溶媒に溶解させたGILGFVFTLペプチド (Operon) 50 μlを、450 μlのPBS(-)で希釈し、500 μlのincomplete freund’s adjuvant (IFA) (Sigma) と共にTwo-syringe法 (GPシリンジコネクタ, NIPRO) (Inject 2 ml, B. BRAUN) で混和することで調製した。調製した乳濁液100 μlを鼠蹊部皮下 (subcutaneous, s.c.) に注射することによって免疫を行った。一回免疫 (図１０, 左上図)、及び、一回免疫一週間後に二回目の免疫 (図１０, 左下図) を行って一週間経過したマウスを用いて実施例５から６と同様の方法によってICS解析を行った。
図１０に示すように、M1 CTL peptide懸濁IFA乳濁液によって一回免疫、二回免疫したマウス脾臓リンパ球よりも、M1-DE-VLPおよびM1-HI-VLPで一回免疫したマウスの脾臓リンパ球の方が、M1 CTL peptideとのインキュベーションによって誘導されるCD8陽性・細胞内IFN-γ陽性CTLの割合が高かった。このことから、古典的なアジュバントとして知られているIFAよりもVLPを用いて構築した本発明の細胞傷害性T細胞誘導剤の方がCD8陽性・細胞内IFN-γ陽性CTLの誘導効率が良いことが示唆された。
〔実施例１４〕 脾臓リンパ球のIL-12の分泌量のELISA解析
実施例5と同様の方法で、HLA-A2トランスジェニックマウスの脾臓から赤血球を除いたリンパ球を精製し、1x107 cells/mlとなるように10% FCS混入RPMI-1640 培地で希釈した。96 ウェルプレートに、a)何も加えない50% Opti-prepTM 溶液 (20 mM Tris-HCl(pH7.9), 50% Opti-prepTM) を5 μl、b)高度に精製された野生型SV40 VP1-VLP (500 ng/μl) を５μl、c)実施例3で調製したM1-DE-VLP溶液を5 μl、もしくは、d)M1-HI-VLP溶液を5 μl加え、そこに、上記で調製したリンパ球を50 μl加え、1 ウェル当りの総量が200 μlとなるように、10%FCS混入RPMI-1640 培地を加えた。または、上記で精製したリンパ球50 μlに10% FCS混入RPMI-1640 培地で100 ng/μlとなるように希釈したLPS (Sigma) を150 μl加えた。ピペッティングで混合した後、このプレートを6時間、または24時間、37℃、5% CO2 incubatorでインキュベートした。インキュベート後4℃、1,400 rpmでスピンダウンして上清をエッペンドルフチューブに回収し、4℃、15,000 rpmでスピンダウンして上清を新しいエッペンドルフチューブに回収した。回収した培養上清の50 μlをIL-12のenzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (Mouse Total IL-12 ELISA Kit, Thermo SCIENTIFIC) でキットのプロトコールに従って解析し、培養上清中のIL-12の濃度を算出した (図１１)。
図１１に示すように、マウスのリンパ球と外来のM1のCTLエピトープをVLPのDEループまたはHIループに挿入したVLP（M1-DE-VLP、M1-HI-VLP)でインキュベートすると、野生型のSV40 VP1 VLPと比べて培養上清中のIL-12の濃度が約２０倍増大したことから、外来のエピトープを挿入することで、野生型のVLPよりも、アジュバントとしての活性が増強され、細胞傷害性T細胞誘導剤としての効果が増大することが示された。
本発明は、ウイルス性疾患や癌の予防薬や治療薬として有用なので、製薬などの産業分野において利用可能である。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願（特願2011-107874号及び特願2011-191208号）の明細書および／または図面に記載されている内容を包含する。また、本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (10)

  1. シミアンウイルス40のVP1から構成されるウイルス様粒子を含有する細胞傷害性T細胞誘導剤であって、前記VP1のDEループ及び／又はHIループ中にT細胞エピトープペプチドが挿入されていることを特徴とする細胞傷害性T細胞誘導剤。
  2. T細胞エピトープペプチドが、ウイルスタンパク質由来のペプチドであることを特徴とする請求項１に記載の細胞傷害性T細胞誘導剤。
  3. T細胞エピトープペプチドが、インフルエンザウイルスのHA、NA、M1、M2、NP、NS1、NS2、PA、PB1、PB2、又はPB1-F2由来のペプチドであることを特徴とする請求項１に記載の細胞傷害性T細胞誘導剤。
  4. T細胞エピトープペプチドが、癌細胞に特異的なタンパク質由来のペプチドであることを特徴とする請求項１に記載の細胞傷害性T細胞誘導剤。
  5. T細胞エピトープペプチドが、Melan-A/MART-1、gp100、MAGE-A3、MAGE-A10、CEA、HER2/new、NY-E50-1、WT-1、又はhTERT由来のペプチドあることを特徴とする請求項１に記載の細胞傷害性T細胞誘導剤。
  6. T細胞エピトープペプチドが、配列番号１乃至３９のいずれかの配列番号に記載されたアミノ酸配列からなるペプチドであることを特徴とする請求項１に記載の細胞傷害性T細胞誘導剤。
  7. シミアンウイルス40のVP1から構成されるウイルス様粒子であって、前記VP1のDEループ及び／又はHIループ中にウイルスタンパク質由来のT細胞エピトープペプチドが挿入されているウイルス様粒子を、ヒト以外の動物に投与することを特徴とするヒト以外の動物のウイルス性疾患の予防又は治療方法。
  8. シミアンウイルス40のVP1から構成されるウイルス様粒子であって、前記VP1のDEループ及び／又はHIループ中に癌細胞に特異的なタンパク質由来のT細胞エピトープペプチドが挿入されているウイルス様粒子を、ヒト以外の動物に投与することを特徴とするヒト以外の動物の癌の予防又は治療方法。
  9. シミアンウイルス40のVP1から構成されるウイルス様粒子であって、前記VP1のDEループ及び／又はHIループ中にウイルスタンパク質由来のT細胞エピトープペプチドが挿入されているウイルス様粒子を、ヒトに投与することを特徴とするヒトのウイルス性疾患の予防又は治療方法。
  10. シミアンウイルス40のVP1から構成されるウイルス様粒子であって、前記VP1のDEループ及び／又はHIループ中に癌細胞に特異的なタンパク質由来のT細胞エピトープペプチドが挿入されているウイルス様粒子を、ヒトに投与することを特徴とするヒトの癌の予防又は治療方法。
JP2013515059A 2011-05-13 2012-04-24 細胞傷害性ｔ細胞誘導剤 Pending JPWO2012157408A1 (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2011107874 2011-05-13
JP2011107874 2011-05-13
JP2011191208 2011-09-02
JP2011191208 2011-09-02
PCT/JP2012/060910 WO2012157408A1 (ja) 2011-05-13 2012-04-24 細胞傷害性t細胞誘導剤

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPWO2012157408A1 true JPWO2012157408A1 (ja) 2014-07-31

Family

ID=47176744

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2013515059A Pending JPWO2012157408A1 (ja) 2011-05-13 2012-04-24 細胞傷害性ｔ細胞誘導剤

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20140286978A1 (ja)
EP (1) EP2708238A4 (ja)
JP (1) JPWO2012157408A1 (ja)
KR (1) KR20140056184A (ja)
CN (1) CN103747799A (ja)
CA (1) CA2836028A1 (ja)
WO (1) WO2012157408A1 (ja)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104277094A (zh) * 2014-07-04 2015-01-14 文康医疗技术（深圳）有限公司 Dc靶向肽及其应用
JP6675185B2 (ja) 2015-11-30 2020-04-01 宏 半田 免疫誘導剤およびその製造方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006088229A1 (ja) * 2005-02-16 2006-08-24 The Circle For The Promotion Of Science And Engineering 改変されたウイルスカプシドタンパク質及びその使用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4516748B2 (ja) 2001-09-14 2010-08-04 サイトス バイオテクノロジー アーゲー ウィルス様粒子中への免疫賦活物質のパッケージ化：調製法および使用法
WO2006004173A1 (ja) 2004-07-01 2006-01-12 The Circle For The Promotion Of Science And Engineering 生理的条件下でのウイルス粒子様構造体及びその形成方法
WO2008040060A1 (en) * 2006-10-04 2008-04-10 The University Of Queensland Vlp based vaccine delivery system
JP2011107874A (ja) 2009-11-16 2011-06-02 Aisin Aw Co Ltd 施設情報提供装置
JP2011191208A (ja) 2010-03-15 2011-09-29 Toru Mino 土壌水分測定方法及び土壌水分測定装置

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006088229A1 (ja) * 2005-02-16 2006-08-24 The Circle For The Promotion Of Science And Engineering 改変されたウイルスカプシドタンパク質及びその使用

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN6012032149; Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．１, 2008, ｐ１２-２０ *
JPN6012032152; Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｖｏｌ．６５，Ｎｏ．１３, 2005, ｐ５９５３-５９５７ *
JPN6012032153; Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．６, 2010, ｐ１０２７-１０３３ *
JPN6012032156; Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．２４７，Ｎｏ．１, 2007, ｐ１８-２７ *
JPN6012032159; Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．８２，Ｎｏ．２, 2008, ｐ７８５-７９４ *
JPN6012032160; Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１３５，Ｎｏ．４, 2008, ｐ３８５-３９２ *
JPN6012032162; 日本ウイルス学会学術集会プログラム・抄録集 Ｖｏｌ．５３, 2005, ｐ２１６ *
JPN6012032163; Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ Ｖｏｌ．３９１，Ｎｏ．３, 2010, ｐ１４９４-１４９９ *
JPN6012032165; Ｂｌｏｏｄ Ｖｏｌ．１１１，Ｎｏ．１, 2008, ｐ２３６-２４２ *
JPN6015052318; Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．７９，Ｎｏ．６, 2005, ｐ３８８３-３８８７ *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2708238A1 (en) 2014-03-19
CN103747799A (zh) 2014-04-23
US20140286978A1 (en) 2014-09-25
KR20140056184A (ko) 2014-05-09
EP2708238A4 (en) 2014-12-24
CA2836028A1 (en) 2012-11-22
WO2012157408A1 (ja) 2012-11-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10329329B2 (en) Fusion proteins for promoting an immune response, nucleic acids encoding same, and methods of making and use thereof
Chroboczek et al. Virus-like particles as vaccine.
TWI477602B (zh) Novel viral vector
US11944677B2 (en) Chimeric virus-like particles and uses thereof as antigen-specific redirectors of immune responses
TW201106967A (en) Composition for treating HBV infection
TW201311718A (zh) 類鐸受體-２ 增效劑及其用於刺激免疫反應之用途
WO2019195626A1 (en) T-cell inducing vaccine composition combinations and uses thereof
Zheng et al. Construction and immunogenicity of a recombinant fowlpox virus containing the capsid and 3C protease coding regions of foot-and-mouth disease virus
CN113666990A (zh) 一种诱导广谱抗冠状病毒的t细胞疫苗免疫原及其应用
JP2021500891A (ja) 卵における複製のための安定化されたｈａを有する組換えインフルエンザウイルス
WO2023023940A1 (zh) 一种诱导广谱抗冠状病毒的t细胞疫苗免疫原及其应用
EP4205761A1 (en) Novel coronavirus recombinant spike protein, polynucleotide encoding same, vector comprising polynucleotide, and vaccine for preventing or treating coronavirus infection, comprising vector
JP5735121B2 (ja) インフルエンザウィルスの組換えヘマグルチニン蛋白質及びそれを含むワクチン
WO2012157408A1 (ja) 細胞傷害性t細胞誘導剤
Collett et al. Development of virus-like particles with inbuilt immunostimulatory properties as vaccine candidates
Li et al. Immunogenicity assessment of rift valley fever virus virus-like particles in BALB/c mice
JP6675185B2 (ja) 免疫誘導剤およびその製造方法
Li et al. Development and characterization of Rift Valley fever virus-like particles
ZHANG et al. Baculovirus-expressed FAdV-4 penton base protein protects chicken against hepatitis-hydropericardium syndrome
WO2013030608A1 (en) Nanoparticle-based veterinary vaccine
JP2017114835A (ja) 免疫賦活化剤およびその製造方法
KR101302245B1 (ko) 넓은 범위의 교차 방어능력을 갖는 신규한 보강 인플루엔자 백신
TW202400800A (zh) 用於預防和治療狂犬病毒感染的組合物和方法
WO2022026885A2 (en) Modified chikungunya viruses and sindbis viruses and uses thereof
CN115516099A (zh) 甲型肝炎病毒制备方法和根据该方法制备的甲型肝炎病毒

Legal Events

Date Code Title Description
A711 Notification of change in applicant

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711

Effective date: 20140520

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20140520

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20150218

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20150218

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20160105

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20160705