BR112014000627B1

BR112014000627B1 - Polipeptídeo mutante, proteínas de fusão, molécula de ácido nucleico, vetor, processo de produção do vetor, célula hospedeira, processo para produção recombinante, composição e kit

Info

Publication number: BR112014000627B1
Application number: BR112014000627-0A
Authority: BR
Inventors: Perrine Martin; Jean - Baptiste Marchand; Nathalie Silvestre
Original assignee: Transgene S.A.
Priority date: 2011-07-12
Filing date: 2012-07-12
Publication date: 2021-12-14
Also published as: TW201311901A; TWI623618B; KR20140066997A; BR112014000627A2; CN103998604B; US10662414B2; EP2732034B1; MX346835B; JP2014527404A; CN103998604A; IL230402B; RU2625021C2; TWI575070B; US9512412B2; US20140287480A1; MX2014000488A; EP2732034A1; PE20141210A1; TW201734208A; US20190144840A1

Abstract

polipeptídeos mutantes, proteínas de fusão, molécula de ácido nucleico, vetor, processo de produção do veto r, célula hospedeira, processo para produção recombina nte, composição e kit a presente invenção refere-se à polipeptídeos mutantes da polimerase de hbv que compreendem um domínio da polimerase mutada que é funcionalmente rompido para atividade da polimerase e proteínas de fusão que compreende esse polipeptídeo mutante da polimerase. a presente invenção também se refere a uma molécula de ácido nucleico e um vetor para expressão do dito polipeptídeo mutante da polimerase, bem com o uma composição que pode ser usada para obter uma resposta imune ao hbv, com o objetivo de fornecer um efeito protetor ou terapêutico contra a infecção por hbv.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a polipeptídeos mutantes da polimerase de HBV que compreendem um domínio da polimerase mutada que é funcionalmente rompido para atividade da polimerase e proteínas de fusão que compreende esse polipeptídeo da polimerase mutante. A presente invenção também se refere a uma molécula de ácido nucleico e um vetor para expressão do dito polipeptídeo mutante da polimerase, bem como uma composição que pode ser usada para obter uma resposta imune ao HBV, com o objetivo de fornecer um efeito protetor ou terapêutico contra a infecção por HBV. A invenção é de interesse muito especial no campo da imunoterapia e mais específica para o tratamento de pacientes infectados com HBV, especialmente os cronicamente infectados.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] A hepatite B é um principal problema de saúde pública com mais de 350 milhões de pessoas cronicamente infectadas no mundo, 20 a 40% delas em risco de desenvolver doença hepática crônica, cirrose e carcinoma hepatocelular. Apesar da existência de vacinas preventivas efetivas, a infecção pelo vírus da hepatite B (HBV) ainda é desenfreada em muitos países, mesmo nos desenvolvidos, com uma estimativa de 4,5 milhões de novos casos de infecção por ano no mundo inteiro. Ao contrário da recomendação da OMS que é para implementar vacinação universal, a cobertura de série completa de vacinação preventiva, varia de 25% na Ásia a 75 a 90% na Europa. Atualmente a hepatite B é a 10acausa de mortalidade (por volta de 1 milhão de mortes/ano) e o carcinoma hepático relacionado ao HBV, o 5° tipo de câncer mais frequente. A repartição geográfica da infecção pelo HBV é desigual, com prevalência inferior a 1% nos países ocidentais a mais de 10% nos países do Sudeste, a maior parte da África e América do Sul Equatorial.

[003] O vírus da hepatite B é um membro da hepadnaviridae e infecta principalmente o fígado, replicando-se nos hepatócitos. As partículas infecciosas são as chamadas “partículas de Dane” de 42 a 45 nm que consistem em um envelope de lipoproteína externa com três diferentes proteínas de superfície (HBs) e uma nucleocapsídeo interno, a principal proteína estrutural da qual é a proteína núcleo (HBcAg). Dentro da nucleocapsídeo está uma cópia única do genoma do HBV ligado à proteína da polimerase viral (P). Além de vírions de 42 a 45 nm, o sangue de pacientes infectados pelo HBV contém esferas de 20 nm feitas de HBsAg e lípidos derivados do hospedeiro, que são liberados a partir de células infectadas. Essas esferas superam os vírions por um fator de 104a 106.

[004] Depois dos viriões entrarem nos hepatócitos, por um receptor que é ainda desconhecido, os nucleocapsídeos transportam o DNA genômico do HBV para o núcleo, onde o DNA circular relaxado é convertido em DNA circular fechado covalentemente (cccDNA). O cccDNA funciona como o molde para a transcrição de quatro RNAs virais, que são exportados para o citoplasma e usados como mRNAs para tradução das proteínas do HBV. O RNA mais longo (pré-genômico) também funciona como molde para a replicação do HBV, que ocorre em nucleocapsídeos no citoplasma. Algum dos DNAs do VHB e capsídeos contendo polimerase são então transportados de volta para o núcleo, onde elas liberam o DNA circular relaxado recém-gerado para formar cccDNA adicional. Com uma meia vida mais longa do que a dos hepatócitos, o cccDNA é responsável pela persistência do HBV. Outros capsídeos estão envolvidos por brotamento no retículo endoplasmático e secretados após passar através do complexo de Golgi.

[005] A organização estrutural e funcional do genoma do HBV tem sido investigada por mais de 30 anos. O genoma do HBV é um DNA fita dupla parcialmente circular relaxado de aproximadamente 3.200 nucleotídeos, composto por uma fita negativa inteira e uma fita positiva mais curta. Ele contém quatro quadros abertos de leitura (ORF) que se sobrepõem, C, S, P e X. O ORF C codifica a proteína núcleo (ou HBcAg), uma proteína longa de 183 aminoácidos constitutiva do nucleocapsídeo e uma segunda proteína encontrada no soro dos pacientes durante a replicação do vírus conhecida como HBeAg que contém uma extensão N-terminal pré-core e uma parte de HBcAg. A terminação C da proteína núcleo é muito básica e contém quatro domínios ricos em Arg que são previstos para se ligarem aos ácidos nucleicos, bem como numerosos sítios de fosforilação. O ORF S codifica três proteínas de superfície, todas elas têm a mesma terminação C, mas que diferem na seu N-terminal devido à presença de três códons de iniciação ATG no quadro que dividem o ORF S em três regiões, S (226 aminoácidos), pré-S2 (55 aminoácidos) e pré-Sl (108 aminoácidos), respectivamente. A proteína grande de antígeno de superfície (L) é produzida após a iniciação da tradução no primeiro códon de iniciação ATG e compreende 389 resíduos de aminoácidos (pré-S1-pré-S2). A proteína mediana de antígeno de superfície (M) resulta da tradução da região S e da região pré-S2 iniciando no segundo ATG de iniciação, enquanto que a proteína pequena de antígeno de superfície de 226 aminoácidos (S, também designada HBsAg) resulta da tradução da região S iniciada no terceiro códon ATG de iniciação. As proteínas de superfície do HBV são glicoproteínas com cadeias laterais de carboidratos (glicanos) ligados através de ligações N- glicosídicas. O ORF P codifica a polimerase viral e o ORF X uma proteína conhecida como proteína X, que se acredita ser um ativador da transcrição.

[006] A polimerase viral tem cerca de 832 a 845 resíduos de aminoácidos de comprimento de acordo com o genótipo do HBV e é codificada em um quadro aberto de leitura longo (“P”) que se sobrepõe à extremidade 3’ do gene núcleo (core) e de todos os genes de proteínas de superfície. A polimerase viral é uma proteína multifuncional composta de quatro domínios, incluindo três domínios funcionais, respectivamente, a proteína terminal, polimerase e domínios de RNase H que catalisam as principais etapas de replicação doHBV (preparação (priming), síntese de DNA e remoção de moldes de RNA), bem como um domínio espaçador não essencial presente entre a proteína terminal e os domínios da polimerase (consulte, por exemplo, Radziwill et al., 1990, J. Virol. 64:613; Bartenschlager et al., 1990, J. Virol. 64, 5324). Os sítios catalíticos responsáveis pelas atividades enzimáticas foram caracterizados. A este respeito, quatro resíduos que formam o motivo YMDD conservado (resíduos 538 a 541 numerados em relação ao resíduo 832 da polimerase longa) mostraram ser essenciais à atividade da DNA polimerase dependente de DNA e RNA, enquanto que a atividade da RNase H é baseada em um motivo DEDD que envolve quatro resíduos de aminoácidos não consecutivos, respectivamente Asp (D) na posição 689, Glu (E) na posição 718, Asp (D) na posição 737 e Asp (D) na posição 777, bem como alguns outros resíduos de aminoácidos incluindo Val (V) na posição 769 e Thr (T) na posição 776. Diferentes mutações foram descritas na técnica que eliminam as atividades de polimerase RT e RNase H (Chang et al, 1990, J. Virol 64: 5553; Bartenschlager et al., 1990, J. Virol. 64, 5324, Radziwill et al., 1990, J. Virol. 64:613 e Chen et al., 1996, J. Virol. 70:6151). Vários grupos conseguiram expressar a proteína polimerase de VHB em vários sistemas hospedeiros, mas sua expressão tem sido relatada tóxica para as células que expressam, o que requer o uso de promotores induzíveis (Choi et al., 2002, Antiviral Res. 55:279; Karimi et al., 2002, J. Virol. 76:8609).

[007] Diversos estudos pré-clínicos e clínicos enfatizaram a importância das respostas imunes de células T CD4+ e CD8+ para a resposta antiviral efetiva. Foi de fato observado que pacientes que naturalmente se recuperam da hepatite B montaram respostas multiespecíficas e sustentadas mediadas por linfócitos T auxiliares (TH) e T citotóxicos (CTL) que são facilmente detectáveis no sangue periférico. O aparecimento de anticorpos anti-HBe e anti- HBs indica um resultado favorável de infecção. Anticorpos específicos de HBsAg são neutralizantes, medeiam a imunidade protetora e persistem ao longo da vida após a recuperação clínica.

[008] A infecção crônica por HBV é, no entanto, só raramente solucionada pelo sistema imune. A grande maioria dos pacientes cronicamente infectados mostram respostas imunes fraca de células T CD8 e CD4, que são antigenicamente restritas e ineficazes para eliminar a infecção viral. A razão para esta alteração das funções efetoras da resposta imune celular na hepatite B crônica não é bem compreendida atualmente, mesmo que o envolvimento de diferentes moléculas inibidoras que são suprarreguladas em pacientes cronicamente infetados pelo HBV, como PD-1, CTLA4, etc., tenha sido observado. Portanto, existe uma necessidade de estratégias imunomoduladoras capazes de induzir uma resposta efetiva de células T.

[009] O tratamento convencional da hepatite B crônica inclui interferon alfa peguilado (IFNα) e análogos de nucleosídeo/nucleotídeo (NUCs) como lamivudina, e mais recentemente entecavir, telbivudina, adefovir e tenofovir. IFNα é uma molécula antiviral potente, pelo qual inibe a replicação viral que, no entanto, provoca sérios efeitos colaterais somente em 25 a 30% dos pacientes. NUCs agem como inibidores competitivos da polimerase de HBV destinados a inibir a transcrição reversa do RNA pré-genômico na fita de DNA negativa e, então, do DNA viral fita dupla. Eles limitam a formação de novos vírions, mas não são efetivos para eliminar o cccDNA super enovelado escondido no núcleo dos hepatócitos infectados, os quais constituem uma fonte de novas progênies de vírus. Isso pode explicar por que a eficácia de NUC é temporária e o rebote viral ocorre imediatamente após a cessação do tratamento, exigindo que os pacientes fiquem em tratamento ao longo da vida. Além disso, a eficácia em longo prazo é também limitada devido à emergência de mutantes do HBV resistentes (mais de 24% depois de um ano e aproximadamente 66% depois de quatro anos de tratamento com lamivudina, conforme relatado em alguns estudos, embora NUCs mais recentes mostraram muito menos ocorrências de mutantes de HBV resistentes à droga. Várias linhagens de HBV que exibem uma redução na sensibilidade aos agentes antivirais já foram isoladas e o sequenciamento do genoma revelou ponto alto de mutações de substituição no domínio da polimerase, inclusive no motivo YMDD (patente US 2008-0233557; Zoulim e Locarnini, 2009, Gastroenterology, 137: 1593).

[010] Além de terapias antivirais, esforços são feitos atualmente para desenvolver terapias complementares visando o aprimoramento da resposta imune do hospedeiro, especificamente aquela mediada por linfócitos T citotóxicos e T auxiliares. Várias estratégias de vacina encorajadoras concentraram-se nas proteínas S, pré-S1 e pré-S2 de superfície do HBV (Zanetti et al., 2008, Vaccine 26: 6266; Mancini-Bourguine et al., 2006, Vaccine 24:4482), bem como nas abordagens de imunoterapia multivalente que visam atingir simultaneamente vários antígenos do HBV. Por exemplo, mostrou-se que a imunização com uma vacina de DNA de poliepítopo que codifica envelopes múltiplos, núcleo e epítopos de polimerase provocam respostas de CTL e TH em modelos pré-clínicos de camundongo Depla et al., 2008, J. Virol. 82: 435). Uma abordagem baseada em uma mistura de plasmídeos de DNA que codificam HBsAg, HBcAg e polimerase de HBV (documento WO 2005/056051; documento WO 2008/020656) demonstraram respostas celulares e humorais anti-HBV específicas no modelo de camundongo transgênico de hepatite B crônica (Chae Young Kim et al., 2008, Exp Mol Medicine 40: 669). Estudos clínicos de Fase I foram iniciados na Coréia do Sul, em portadores de HBV em combinação com tratamento com lamivudina (Yang et al., 2006, Gene Ther. 13: 1110). Outra abordagem recentemente investigada envolve o uso de uma vacina terapêutica com vetor que codifica uma combinação de polimerase de HBc e HBV juntamente com domínios imunogênicas de Hbs (documento WO 2011/01565). Camundongos imunizados com a vacina de Ad com vetor mostrou resposta de células T contra todos os antígenos do VHB expressos, especialmente contra polimerase.

[011] Pode-se esperar que o HBV continuará a ser uma ameaça séria à saúde global por muitos anos devido à natureza crônica e persistente da infecção, sua alta prevalência, a transmissão contínua do HBV e a morbidade significativa das doenças associadas. Assim, existe uma necessidade importante para o desenvolvimento de abordagens mais efetivas para melhorar a prevenção e tratamento de infecções por HBV ou doenças ou disfunções associadas ao HBV. Em particular, continua a existir a necessidade de abordagens que conciliem a imunidade mediada por células T contra o(s) antígeno(s) do HBV direcionados, especialmente contra o núcleo, e uma baixa toxicidade potencial. Essas abordagens são especialmente úteis para o tratamento de sujeitos cronicamente infectados com HBV.

[012] Este problema técnico é resolvido pelo fornecimento das realizações, conforme definidas nas reivindicações.

[013] Outros e aspectos, características e vantagens adicionais da presente invenção serão evidentes a partir da seguinte descrição das realizações atualmente preferenciais da invenção. Essas realizações são fornecidas para os propósitos de divulgação.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[014] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo mutante da polimerase, que compreende pelo menos 500 resíduos de aminoácidos de uma polimerase de HBV nativa, em que o dito polipeptídeo mutante da polimerase compreende um domínio da polimerase com uma deleção interna que rompe funcionalmente a atividade da polimerase e em que a dita deleção interna inclui pelo menos o motivo YMDD naturalmente presente no domínio da polimerase de uma polimerase nativa.

[015] A presente invenção também se refere a uma molécula de ácido nucleico que codifica o dito polipeptídeo mutante da polimerase, um vetor que compreende a dita molécula de ácido nucleico, ou uma composição que compreende ou que codifica o dito polipeptídeo mutante da polimerase.

[016] A presente invenção também se refere ao uso deste polipeptídeo mutante da polimerase, molécula de ácido nucleico, vetor ou composição, preferencialmente em combinação com polipeptídeos adicionais (por exemplo, com um ou mais polipeptídeo(s) do HBV) para o propósito de tratamento, prevenção ou inibição de uma infecção por HBV ou melhora de uma condição associada com uma infecção por HBV.

[017] Ainda outro aspecto da presente invenção inclui um método de tratamento, prevenção ou inibição da infecção por HBV, ou melhora de uma condição associada com infecção por HBV em um sujeito com necessidade do mesmo, que compreende fornecer ou administrar esse polipeptídeo mutante da polimerase, molécula de ácido nucleico, vetor ou composição, eventualmente em combinação com polipeptídeos adicionais (por exemplo, com um ou mais polipeptídeos do HBV) e/ou com o padrão de cuidado.

[018] Ainda outro aspecto da presente invenção refere-se a um método para provocar uma resposta imune em um sujeito com necessidade da mesma, que compreende fornecer ou administrar esse polipeptídeo mutante da polimerase, molécula de ácido nucleico, vetor ou composição, eventualmente em combinação com polipeptídeos adicionais (por exemplo, com um ou mais polipeptídeos do HBV) e/ou com o padrão de cuidado, para os propósitos de indução ou estímulo de uma resposta imune nesse sujeito ou para o tratamento de uma infecção por HBV ou melhora da condição ou sintoma associado com a infecção por HBV.

[019] Ainda mais um aspecto da presente invenção fornece um kit de partes compreendendo uma pluralidade de recipientes e instruções para fornecer ou administrar a um sujeito esse polipeptídeo mutante da polimerase, molécula de ácido nucleico, vector ou composição, eventualmente em combinação com polipeptídeos adicionais (por exemplo, com um ou mais polipeptídeos do HBV), de acordo com as composições e métodos descritos no presente pedido.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[020] A presente invenção fornece um polipeptídeo da polimerase mutante que compreende um domínio da polimerase mutada com uma deleção interna que interrompe funcionalmente a atividade da polimerase, em que a dita deleção interna compreende pelo menos o motivo YMDD naturalmente presente no domínio da polimerase de uma polimerase de HBV nativa. Esse polipeptídeo da polimerase mutante ou vetor que codifica o mesmo pode ser usado nas composições e métodos para o tratamento ou prevenção de uma infecção por HBV ou de uma condição associada com uma infecção por HBV, eventualmente em combinação com outros polipeptídeos e/ou padrão de cuidado. Essa invenção permite prever a expressão e produção do polipeptídeo da polimerase mutante em vários sistemas de vetor, devido à interrupção das atividades enzimáticas associadas. A invenção é também particularmente adaptada para uso humano e pode ser usada para reforçar as terapias convencionais (por exemplo, COS). A imunização de modelos animais com um vetor que codifica esse polipeptídeo da polimerase mutante em fusão com os domínios imunogênicos de HBc e HBs, provocaram respostas específicas de células T e, de maneira surpreendente, uma forte imunidade contra ambos, HBc e polimerase, foi observada.

[021] A seção a seguir fornece uma maior explicação sobre o significado de alguns dos termos usados no presente pedido.

DEFINIÇÕES

[022] Como usado ao longo de todo pedido, os termos “um” e “uma” são usados no sentido de “pelo menos um”, “pelo menos um primeiro”, “um ou mais” ou “uma pluralidade” dos referidos componentes ou etapas, a menos que o contexto indique de outra forma.

[023] O termo, “e/ou” sempre que usado no presente pedido, inclui o significado de “e”, “ou” e “toda ou qualquer outra combinação dos elementos conectados pelo dito termo”.

[024] O termo, “cerca de” ou “aproximadamente”, como usado no presente pedido, significa dentro do limite de 10%, preferencialmente dentro do limite de 8% e mais preferencialmente dentro do limite de 5% de um dado valor ou faixa.

[025] Os termos “aminoácidos”, “resíduos” e “resíduos de aminoácidos” são sinônimos e englobam aminoácidos naturais, bem como análogos de aminoácidos (por exemplo, aminoácidos não naturais, sintéticos e modificados, incluindo os isômeros ópticos D ou L).

[026] Os termos “polipeptídeo”, “peptídeo” e “proteína” referem-se a polímeros de resíduos de aminoácidos que compreendem pelo menos nove ou mais aminoácidos ligados através de ligações peptídicas. O polímero pode ser linear, ramificado ou cíclico e pode compreender aminoácidos que ocorrem naturalmente ou análogos de aminoácidos, e podem ser interrompidos por não aminoácidos. Como indicativo geral, se o polímero de aminoácidos possui mais de 50 resíduos de aminoácidos, ele é preferencialmente chamado de polipeptídeo ou proteína, enquanto que se ele apresenta 50 aminoácidos ou menos, é chamado de “peptídeo”.

[027] Como usado no presente pedido, quando usado para definir produtos, composições e métodos, o termo “que compreende” (e qualquer forma de compreender, como “compreendem” e “compreende”), “que tem” (e qualquer forma de ter, como “têm” e “tem”), “ que inclui” (e qualquer forma de incluir, como “inclui” e “incluem”) ou “que contém” (e qualquer forma de conter, como “contém” e “contêm”) são abrangentes e não excluem elementos ou etapas adicionais do método, não citados. Dessa forma, um polipeptídeo “compreende” uma sequência de aminoácidos quando a sequência de aminoácidos pode ser parte da sequência de aminoácidos final do polipeptídeo. Esse polipeptídeo pode ter até várias centenas de resíduos de aminoácidos adicionais. “Consistir essencialmente em” significa excluir outros componentes ou etapas de qualquer significância essencial. Dessa forma, uma composição que consiste essencialmente nos componentes citados não exclui traços de contaminantes e carreadores farmaceuticamente aceitáveis. Um polipeptídeo “consiste essencialmente em uma sequência de aminoácidos” quando essa sequência de aminoácidos está presente eventualmente com somente poucos resíduos de aminoácidos adicionais. “Que consiste em” significa excluindo mais do que traços de elementos de outros componentes ou etapas. Por exemplo, um polipeptídeo “consiste em uma sequência de aminoácidos” quando o polipeptídeo não contém quaisquer aminoácidos além da sequência de aminoácidos citada.

[028] Como usado no presente pedido, “HBV” e “vírus da hepatite B” são usados de maneira intercambiável e referem-se a qualquer membro dos hepadnaviridae (consulte, por exemplo, Ganem e Schneider em Hepadnaviridae (2001) “The viruses and their replication”, páginas 2923-2969, Knipe DM et al., Eds. Fields Virology, 4aed. Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkins ou edição subsequente). As sequências de aminoácidos dos vários polipeptídeos do HBV e as sequências de nucleotídeos codificadoras podem ser encontradas em bancos de dados especializados (por exemplo, aqueles mencionados acima) e na literatura (consulte, por exemplo, Valenzuela et al., 1980, The nucleotide sequence of the hepatitis B viral genome and the identification of the major viral genes (páginas 57-70) em “Animal Virus Genetics”; Ed B. Fields, et al.; Academic Press Inc., Nova York e Vaudin et al., 1988, J. Gen. Virol. 69: 1383).

[029] Como usado no presente pedido, o termo “polimerase de HBV” refere-se a um polipeptídeo que mantém pelo menos 500 resíduos de aminoácidos compreendidos em uma proteína polimerase de HBV nativa. De maneira desejável, esses pelo menos 500 resíduos de aminoácidos estão dispersos ao longo de três domínios funcionais e preferencialmente ao longo de quatro domínios normalmente presentes em uma polimerase de HBV nativa. Esse termo engloba polipeptídeos de polimerase nativa (isto é, que ocorrem naturalmente) de qualquer linhagem do HBV, isolado ou genótipo, que podem ser encontrados, isolados, obtidos a partir de uma fonte do HBV na natureza, como aquelas citadas acima relacionadas ao termo “HBV”, bem como polimerase modificada (isto é, polipeptídeo polimerase mutante) e fragmentos da mesma. Para fins de ilustração, os resíduos de aminoácidos para a polimerase de HBV descritos no presente pedido são numerados com referência a uma polimerase de 832 aminoácidos com o resíduo Tyr do motivo Tyr Met Asp Asp (YMDD) sendo o resíduo número 538. Está ao alcance de um técnico no assunto adaptar a numeração dos resíduos de aminoácidos para outras polimerases (por exemplo, polimerases com 843 ou 845 aminoácidos).

[030] Como usado no presente pedido, o termo “nativo” ou “que ocorre naturalmente” quando usado em relação a qualquer sequência de aminoácidos (por exemplo, peptídeo, polipeptídeo, proteína, etc.) ou sequência de nucleotídeos (por exemplo, gene, molécula de ácido nucleico, polinucleotídeo, etc.) refere-se a uma sequência de aminoácidos ou a uma sequência de nucleotídeos que pode ser encontrada, isolada, obtida a partir de uma fonte na natureza diferente daquela modificada ou mutada artificialmente pelo homem no laboratório (isto é, mutante). Essas fontes na natureza incluem amostras biológicas (por exemplo, sangue, plasma, soro, sêmen, saliva, secções de tecidos, espécime de biopsia, etc.) coletadas de um organismo infectado ou que foi exposto ao HBV, células em cultura (como HepG2.2.15, HuH6-C15 (Sureau et al., 1986, Cell 47:37; Sells et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84(4): 1005); HuH7.TA61 ou HuH7.TA62 (Sun et al., 2006, J Hepatol. 45(5):636), culturas de tecidos, bem como materiais recombinantes. Materiais recombinantes incluem, sem limitação, isolados do HBV (por exemplo, disponíveis em instituições depositárias), genomas do HBV, bibliotecas de RNA genômico ou cDNA, vetores contendo genoma do HBV ou fragmento(s) do mesmo ou qualquer vetor da técnica anterior conhecido por incluir esse(s) elemento(s).

[031] Para fins de ilustração, uma “polimerase de HBV nativa” significa uma polimerase de HBV codificada por ORF P de qualquer genótipo, linhagem ou isolado do HBV que ocorra naturalmente, descrito na técnica (por exemplo, um polipeptídeo de 832 a 845 aminoácidos dependendo do genótipo) ou fragmento do mesmo. O termo “nativo” também engloba polipeptídeos/peptídeos de polimerase de HBV que são representativos de um genótipo específico e, dessa forma, compreendem uma sequência de aminoácidos que corresponda a uma sequência consenso ou quase consenso que é, tipicamente, determinada após o alinhamento de sequências de várias polimerases do HBV de um genótipo específico.

[032] O termo “mutante”, como usado no presente pedido, refere- se a um polipeptídeo que exibe uma ou mais mutações com respeito ao correspondente nativo. Para fins de ilustração, um “polipeptídeo mutante da polimerase” refere-se a um polipeptídeo de polimerase que se origina de uma polimerase nativa após ser artificialmente mutada ou alterada pelo homem no laboratório, conforme descrito no presente pedido. Qualquer mutação pode ser prevista, incluindo substituição, inserção e/ou deleção de um ou mais nucleotídeos/resíduos de aminoácidos, arranjos não naturais (por exemplo, fusão com polipeptídeos/peptídeos estranhos), bem como qualquer combinação dessas possibilidades. Quando várias mutações são contempladas, elas podem envolver resíduos consecutivos e/ou resíduos não consecutivos. As mutações podem ser geradas por uma série de formas conhecidas por técnicos no assunto, como a mutagênese direcionada a um sítio (por exemplo, com o uso do sistema de mutagênese in vitro Sculptor™, Amersham, Les Ullis, França), mutagênese por PCR, embaralhamento de DNA e por técnicas sintéticas químicas (por exemplo, resultando em uma molécula de ácido nucleico sintética). De acordo com realizações preferenciais, as mutações contempladas pela presente invenção englobam deleção(ões) e/ou substituição(ões) de um ou mais resíduos de aminoácidos (consecutivos ou não) envolvidos direta ou indiretamente em, pelo menos, uma atividade enzimática exibida por uma polimerase de HBV nativa, com o objetivo de romper, pelo menos, essa uma atividade enzimática, como a atividade de polimerase e/ou atividade de RNaseH. No contexto da invenção, o polipeptídeo mutante da polimerase resultante retém globalmente um alto grau de identidade (por exemplo, pelo menos 80%) com a polimerase de HBV nativa correspondente em porções não mutadas.

[033] O termo “romper”, como usado no presente pedido, em relação a uma dada atividade enzimática, ou qualquer derivado, como “rompimento”, significa “eliminar” (sem nenhuma atividade residual) ou “reduzir significativamente” (atividade residual de menos de 20% da atividade exibida pela polimerase nativa).

[034] O termo “identidade” refere-se a uma exata correspondência aminoácido-aminoácido ou nucleotídeo-nucleotídeo entre duas sequências de polipeptídeos ou nucleotídeos. A porcentagem de identidade entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências, considerando o número de gaps que precisam ser introduzidos para um ótimo alinhamento e o comprimento de cada gap. Vários programas de computação e algoritmos matemáticos estão disponíveis na técnica para determinar a porcentagem de identidade entre sequências de aminoácidos como, por exemplo, o programa Blast, disponível no NCBI, ou ALIGN no Atlas of Protein Sequence and Structure (Dayhoffed., 1981, Sup, 3 482-489). Programas para determinar a homologia entre as sequências de nucleotídeos também estão disponíveis em bases de dados especializadas (por exemplo, Genbank, Wisconsin Sequence Analysis Package, programas BESTFIT, FASTA e GAP). Para fins ilustrativos, “pelo menos 80% de identidade de sequência”, como usado no presente pedido, significa 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%.

[035] Como usado no presente pedido, o termo “isolado” refere-se a uma proteína, polipeptídeo, peptídeo, polinucleotídeo, vetor plasmidial, vetor viral ou célula hospedeira que é removido do seu meio natural (isto é, separado de pelo menos outro componente(s) com o qual está naturalmente associado).

SEQUÊNCIA DO HBV

[036] Uma série de sequências do HBV é adequada para o uso nas realizações descritas no presente pedido, incluindo essas sequências que estão prontamente disponíveis para pesquisadores no campo, incluindo, mas não se limitando a sequências do HBV descritas no Genbank e PubMed. Para fins ilustrativos, extensivas análises filogenéticas foram realizadas para a classificação dos vírus da hepatite B em 8 principais genótipos (A a H) que mostram distribuição geográfica e resultados clínicos distintos, apesar de exibirem alto grau de conservação de sequências. Os vários HBV também foram classificados em nove subtipos diferentes (aywl, ayw2, ayw3, ayw4, ayr, adw2, adw4, adrq+ e adqr-) em relação a sorologia associada a HBsAq (consulte a revisão por Mamum-Al Mahtab et al., 2008, Hepatobiliary Pancrease Dis Int 5: 457; Schaeffer, 2007, World Gastroenterol. 7: 14). Cada genótipo ou sorotipo engloba diferentes linhagens e isolados do HBV. Um isolado corresponde a um vírus específico isolado de uma fonte específica do HBV (por exemplo, uma amostra de paciente ou outro reservatório biológico), enquanto uma linhagem engloba vários isolados que são muito próximos uns aos outros em termos de sequências genômicas.

[037] O HBV exemplar de genótipo A inclui, sem limitação, o isolado HB-JI444AF e a linhagem HB-JI444A (número de acesso AP007263). O HBV exemplar de genótipo B inclui, sem limitação, o clone pJDW233 (número de acesso D00329), isolado HBV/14611 (número de acesso AF121243), HBV- B1 (número de acesso no GenBank AF282917.1), linhagem do HBV Whutj-37 (número de acesso no GenBank AY2933309.1), linhagem do HBV chinesa GDH1 (número de acesso no GenBank AY766463.1) e o isolado do HBV 57-1 de subtipo adw (número de acesso no GenBank AY518556.1). O HBV exemplar de genótipo C inclui, sem limitação, o isolado AH- 1-ON980424 (número de acesso AB113879), linhagem HCC-3-TT (número de acesso AB113877), isolado do HBV SWT3.3 (número de acesso no GenBank EU916241.1), isolado do HBV H85 (número de acesso no GenBank AY306136.1), linhagem do HBV C1248 (número de acesso no GenBank DQ975272.1), isolado do HBV CHN-H155 (número de acesso no GenBank DQ478901.1) e isolado do HBV GZ28-1 (número de acesso no GenBank EF688062). O HBV exemplar de genótipo D inclui, sem limitação, os isolados KAMCHATKA27 (número de acesso AB188243), ALTAY136 (número de acesso AB188245) e Y07587 (número de acesso no Genbank Y07587 e Stoll-Becker et al., 1997, J. Virol. 71: 5399), bem como o isolado do HBV descrito com o número de acesso AB267090. O HBV exemplar de genótipo E inclui, sem limitação, o isolado HB-JI411F e a linhagem HB-JI411 (número de acesso AP007262). O HBV exemplar de genótipo F inclui, sem limitação, os isolados HBV-BL597 (número de acesso AB214516) e HBV- BL592 (número de acesso AB166850). O HBV exemplar de genótipo G inclui, sem limitação, HB-JI444GF e a linhagem HB-JI444G (número de acesso AP007264). O HBV exemplar de genótipo H inclui, sem limitação, o isolado do HBV ST0404 (número de acesso AB298362) e o isolado HB-JI260F e a linhagem HB-JI260 (número de acesso AP007261).

[038] O intuito é que a presente invenção não esteja limitada a essas sequências do HBV exemplares. De fato, as sequências de nucleotídeos e de aminoácidos de qualquer um ou de todos os polipeptídeos/peptídeos do HBV, usados de acordo com a presente invenção, podem variar entre diferentes isolados e genótipos do HBV, e essa variação genética natural está incluída dentro do escopo da invenção. Além disso, os polipeptídeos/peptídeos do HBV em uso na invenção podem ser representativos de um genótipo específico e, dessa forma, compreendem uma sequência de aminoácidos correspondente a uma sequência consenso ou quase consenso.

[039] Além disso, cada polipeptídeo/peptídeo do HBV pode se originar independentemente a partir de qualquer genótipo, linhagem ou isolado do HBV identificado na presente data, como aqueles descritos acima em relação ao termo “HBV”. Essa configuração pode permitir aprimorar a proteção contra uma ampla faixa de genótipos do HBV ou adaptação a uma região geográfica específica pelo uso do(s) genótipo(s) que é(são) endêmico(s) nessa região ou a uma população específica de pacientes. A este respeito, os genótipos A e C são os mais predominantes nos Estados Unidos, os genótipos A e D nos países da Oeste Europeu e o genótipo D na Bacia Mediterrânea, enquanto os genótipos B e C são os mais comuns na China. Dados limitados da Índia sugerem que os genótipos A e D são os mais predominantes na Índia. Está dentro do alcance de técnicos no assunto escolher os genótipos, sorotipos, linhagens e/ou isolados do HBV adequados de acordo com a população e/ou região geográfica a ser tratada.

[040] De acordo com a realização preferencial, os polipeptídeos/peptídeos do HBV em uso na invenção se originam a partir do vírus de genótipo D, com uma preferência específica pelo isolado do HBV Y07587.

POLIMERASE DE HBV MUTANTE

[041] O polipeptídeo mutante da polimerase da invenção compreende um domínio da polimerase mutada com uma deleção interna que interrompe funcionalmente a atividade da polimerase, caracterizado pelo fato da dita deleção interna compreender pelo menos o motivo YMDD naturalmente presente no domínio da polimerase de uma polimerase nativa. O rompimento da atividade da polimerase exibida pelo polipeptídeo mutante da polimerase resultante pode ser analisado pelo uso de ensaios bem conhecidos na técnica (por exemplo, ensaios de polimerase endógena descritos em Radziwill et al., 1990, J Virol. 64:613).

[042] Uma sequência de aminoácidos genérica que engloba o domínio da polimerase de polimerases do HBV nativas de genótipos B, C e D é fornecida na SEQ ID NO: 1, com o resíduo Xaa na posição 7 sendo Thr (T) ou Ala (A); o resíduo Xaa na posição 13 sendo Asn (N), Arg (R) ou His (H); o resíduo Xaa na posição 16 sendo He (I) ou Thr (T); o resíduo Xaa na posição 38 sendo Thr (T) ou Ala (A); o resíduo Xaa na posição 53 sendo Ser (S) ou Asn (N); o resíduo Xaa na posição 54 sendo Thr (T) ou Tyr (Y); o resíduo Xaa na posição 55 sendo His (H) ou Arg (R); o resíduo Xaa na posição 91 sendo He (I) ou Leu (L); o resíduo Xaa na posição 109 sendo Pro (P) ou Ser (S); o resíduo Xaa na posição 118 sendo Thr (T) ou Asn (N); o resíduo Xaa na posição 121 sendo Asn (N) ou He (I); o residuo Xaa na posição 122 sendo He (I) ou Phe (F); o resíduo Xaa na posição 124 sendo Tyr (Y) ou Asn (N); o resíduo Xaa na posição 127 sendo Gly (G) ou Arg (R); o resíduo Xaa na posição 131 sendo Asp (D) ou Asn (N); o resíduo Xaa na posição 134 sendo Asp (D) ou Asn (N); o resíduo Xaa na posição 145 sendo Leu (L) ou Met (M); o resíduo Xaa na posição 149 sendo Lys (K) ou Gin (Q); o resíduo Xaa na posição 151 sendo Phe (F) ou Tyr (Y); o resíduo Xaa na posição 221 sendo Phe (F) ou Tyr (Y); o resíduo Xaa na posição 222 sendo Thr (T) ou Ala (A); o resíduo Xaa na posição 223 sendo Ser (S) ou Ala (A); o resíduo Xaa na posição 224 sendo He (I) ou Val (V); o resíduo Xaa na posição 238 sendo Asn (N) ou His (H); o resíduo Xaa na posição 248 sendo Asn (N) ou His (H); o resíduo Xaa na posição 256 sendo Ser (S) ou Cys (C); o resíduo Xaa na posição 257 sendo Trp (W) ou Tyr (Y); o resíduo Xaa na posição 259 sendo Thr (T) ou Ser (S); o resíduo Xaa na posição 263 sendo Glu (E) ou Asp (D); o resíduo Xaa na posição 266 sendo Val (V) ou He (I); o resíduo Xaa na posição 267 sendo Leu (L) ou Gin (Q); o resíduo Xaa na posição 271 sendo Gin (Q), Met (M) ou Glu (E); o resíduo Xaa na posição 317 sendo Ser (S) ou Ala (A); e o resíduo Xaa na posição 332 sendo Cys (T) ou Ser (S).

[043] De acordo com a presente invenção, o domínio da polimerase mutado compreendido no polipeptídeo mutante da polimerase da invenção é desprovido, pelo menos, do motivo YMDD da posição 203 a 206 desse domínio da polimerase genérico de SEQ ID NO: 1.

[044] A presente invenção também engloba qualquer outra deleção interna de, pelo menos, 4 resíduos de aminoácidos e de, no máximo, 30 resíduos de aminoácidos que compreenda, pelo menos, esse motivo YMDD. Um polipeptídeo mutante da polimerase representativo, de acordo com a invenção, compreende um domínio da polimerase mutado que compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1, mas desprovido pelo menos do resíduo Tyr na posição 203, do resíduo Met na posição 204, do resíduo Asp na posição 205 e do resíduo Asp na posição 206.

[045] Além do motivo YMDD, é preferencial que a deleção interna também englobe todo ou partes do motivo VVL adjacente presente no C-terminal do motivo 10 YMDD no domínio polimerase nativo do HBV (correspondente aos resíduos nas posições 207 a 209 de SEQ ID NO: 1 e aos resíduos nas posições 542 a 544 de uma polimerase nativa de 832 aminoácidos). Esse motivo VVL pode de fato contribuir para a formação dos epítopos “de junção” (por exemplo, novos epítopos sintetizados colinearmente) que possuem risco de reduzir ou silenciar a resposta imune do hospedeiro direcionada contra um ou mais epítopos associados à polimerase de HBV.

[046] Preferencialmente, o polipeptídeo mutante da polimerase da invenção compreende um domínio polimerase mutado com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1, mas desprovido pelo menos do resíduo Tyr na posição 203, do resíduo Met na posição 204, do resíduo Asp na posição 205, do resíduo Asp na posição 206, do resíduo Val na posição 20.207, do resíduo Val na posição 208 e do resíduo Leu na posição 209.

[047] Mais preferencialmente, o polipeptídeo da polimerase mutante da invenção compreende um domínio polimerase compreende, de maneira alternativa, essencialmente consiste em, ou de maneira alternativa, consiste em uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 80% de identidade, de forma mais vantajosa, pelo menos 85% de identidade, preferencialmente, pelo menos 90% de identidade, com mais preferência, pelo menos 95% de identidade e, com ainda mais preferência, 100% de identidade com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2. Ainda com mais preferência, o domínio da polimerase mutado compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2.

[048] De maneira alternativa ou em conjunto, o polipeptídeo da polimerase mutante da invenção também compreende um domínio de RNaseH mutado que compreende mutação(ões) de um ou mais resíduos de aminoácidos que rompem funcionalmente a atividade de RNaseH normalmente exibida por uma polimerase de HBV nativa.

[049] Conforme discutido acima, o domínio funcional envolvido na atividade de RNaseH foi mapeado dentro da porção C-terminal, mais especificamente da posição 680 até o C-terminal de uma polimerase de HBV nativa com 832 aminoácidos (da posição 693 até o C-terminal de uma polimerase de HBV nativa com 845 aminoácidos), e a presente invenção engloba qualquer mutação nesse domínio que se correlacione com o rompimento da atividade de RNaseH (isto é, que eventualmente leva a uma fraca atividade residual menor que 20% da atividade de RNaseH nativa). O rompimento da atividade de RNaseH exibido pelo polipeptídeo da polimerase mutante pode ser analisado com o uso de ensaios conhecidos na técnica (por exemplo, ensaios da atividade de RNaseH in vitro ou análise da molécula in tandem DNA-RNA descrita em Radziwill et al., 1990, J Virol. 64:613 ou em Lee et al., 1997, Biochem. Bioph. Res. Commun. 233(2):401).

[050] Uma sequência de aminoácidos genérica que engloba o domínio de RNaseH das polimerases nativas do HBV de genótipos B, C e D é fornecida na SEQ ID NO: 3, com o resíduo Xaa na posição 2 sendo Ser (S) ou Pro (P); o resíduo Xaa na posição 19 sendo Ala (A) ou Val (V); o resíduo Xaa na posição 20 sendo He (I) ou Met (M); o resíduo Xaa na posição 30 sendo Val (V) ou Leu (L); o resíduo Xaa na posição 31 sendo Ala (A) ou Ser (S); o resíduo Xaa na posição 53 sendo Lys (K) ou Asn (N); o resíduo Xaa na posição 54 sendo Leu (L) ou He (I); o resíduo Xaa na posição 55 sendo Leu (L) ou He (I); o resíduo Xaa na posição 97 sendo Ala (A) ou Thr (T); o resíduo Xaa na posição 108 sendo Tyr (Y) ou Ser (S); o resíduo Xaa na posição 115 sendo Pro (P) ou Leu (L); o resíduo Xaa na posição 116 sendo Phe (F) ou Tyr (Y); o resíduo Xaa na posição 128 sendo Val (V) ou Asp (D).

[051] De maneira vantajosa, uma ou mais mutações compreendidas no domínio de RNaseH do polipeptídeo da polimerase mutante da invenção são selecionadas do grupo que consiste em: - uma deleção de pelo menos 8 aminoácidos e no máximo 60 aminoácidos, incluindo, pelo menos, a porção da SEQ ID NO: 3 que se estende aproximadamente a partir do resíduo Ala (A) na posição 46 (del ELLAACFA); - a substituição do resíduo Asp (D) na posição 10 da SEQ ID NO: 3 por um resíduo de aminoácido diferente de (D); - a substituição do resíduo Val (V) na posição 90 da SEQ ID NO: 3 por um resíduo de aminoácido diferente de V; - a substituição do resíduo Thr (T) ou Ala (A) na posição 97 da SEQ ID NO: 3 por um resíduo de aminoácido diferente de T ou A; - a substituição do resíduo Asp (D) na posição 98 da SEQ ID NO: 3 por um resíduo de aminoácido diferente de (D); e - qualquer combinação dos mesmos.

[052] Exemplos representativos das combinações adequadas incluem, sem limitação, (a) as substituições de resíduos de aminoácidos nas posições 10, 90, 97 e 98; (b) a deleção de 8 a 60 resíduos de aminoácidos incluindo o motivo GLLAACFA e as substituições de resíduos de aminoácidos em qualquer uma das posições citadas; ou (c) a combinação de todas as mutações listadas.

[053] De maneira adequada, o(s) resíduo(s) substituído(s) nas posições 10, 90, 97 ou 98 de SEQ ID NO: 3 é(são) individualmente substituído(s) pelo resíduo His (H) ou pelo resíduo Tyr (Y), com uma preferência específica para o resíduo na posição 10 de SEQ ID NO: 3 substituído por um resíduo His (H) (D689H), o resíduo na posição 90 de SEQ ID NO: 3 substituído por um resíduo Tyr (Y) (V769Y), o resíduo na posição 97 de SEQ ID NO: 3 substituído por um resíduo Tyr (Y) (T776Y ou A776Y) e/ou o resíduo na posição 98 de SEQ ID NO: 3 substituído por um resíduo His (H) (D777H).

[054] De maneira adequada, a deleção compreendida no domínio de RNaseH mutado inclui uma porção de pelo menos 19 resíduos de aminoácidos, que se estende aproximadamente do resíduo Glu (E) na posição 39 até aproximadamente o resíduo Thr (T) na posição 57 de SEQ ID NO: 3, e preferencialmente uma porção de pelo menos 25 aminoácidos que se estende aproximadamente do resíduo Glu (E) na posição 39 até aproximadamente o resíduo Leu (L) na posição 63 de SEQ ID NO: 3, e mais preferencialmente uma porção de pelo menos 25 aminoácidos, que se estende aproximadamente do resíduo Xaa (A ou S) na posição 31 até aproximadamente o resíduo Leu (L) na posição 63 de SEQ ID NO: 3.

[055] Preferencialmente, o polipeptídeo da polimerase mutante da invenção compreende um domínio de RNaseH mutado com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3, mas (a) desprovido da porção de 33 resíduos de aminoácidos que se estendem a partir do resíduo Xaa (X) na posição 31 até aproximadamente o resíduo Leu (L) na posição 63 e que compreende (b) a substituição do resíduo Asp (D) na posição 10 por um resíduo His (H) (D689H); (c ) a substituição do resíduo Val (V) na posição 90 por um resíduo Tyr (Y) (V769Y); (d) a substituição do resíduo na posição 97 por um resíduo Tyr (Y) (T/A776Y) e (e) a substituição do resíduo Asp (D) na posição 98 por um resíduo His (H) (D777H).

[056] Mais preferencialmente, o polipeptídeo da polimerase mutante da invenção compreende um domínio de RNaseH mutado que compreende, de maneira alternativa, essencialmente consiste de, ou de maneira alternativa, consiste de uma sequência de aminoácidos que exiba pelo menos 80% de identidade, de forma mais vantajosa, pelo menos 85% de identidade, preferencialmente, pelo menos 90% de identidade, com mais preferência, pelo menos 95% de identidade e, com ainda mais preferência, 100% de identidade com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4.

[057] Em uma realização ainda mais preferencial, o polipeptídeo da polimerase mutante da invenção compreende um domínio polimerase compreende, de maneira alternativa, essencialmente consiste em, ou de maneira alternativa, consiste em uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 80% de identidade, de forma mais vantajosa, pelo menos 85% de identidade, preferencialmente, pelo menos 90% de identidade, mais preferencialmente, pelo menos 95% de identidade e, ainda mais preferencialmente, 100% de identidade com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 5. Ainda mais preferencial é um polipeptídeo da polimerase mutante que compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 5.

[058] No contexto da invenção, o polipeptídeo da polimerase mutante da invenção pode compreender mutação(ões) adicional(is). No entanto, é preferencial evitar modificações que podem ser prejudiciais à atividade imunogênica, especialmente, nas porções ricas em epítopos B, CLT e/ou TH.

[059] Modificações adicionais exemplares incluem truncamento do N-terminal. Especificamente adequado é o truncamento de pelo menos 20 resíduos de aminoácidos e de, no máximo, 100 resíduos de aminoácidos normalmente presentes na terminação N de uma polimerase de HBV nativa ou de SEQ ID NO: 5, com uma preferência específica por um truncamento que se estende da posição 1 (iniciador de Met) ou 2 até aproximadamente a posição 47 de SEQ ID NO: 5. Essa modificação é particularmente relevante para o polipeptídeo da polimerase mutante usado em combinação com um polipeptídeo núcleo nativo do HBV devido ao fato de que esse truncamento do N-terminal contribui para reduzir ou deletar as porções sobrepostas entre esses dois polipeptídeos. No entanto, o mesmo pode ser atingido pelo uso de um polipeptídeo da polimerase mutante não trucando em combinação com um polipeptídeo Core do HBV truncado no C-terminal, conforme descrito abaixo.

[060] De maneira desejável, o polipeptídeo da polimerase mutante resultante retém as propriedades imunogênicas, em particular, a capacidade de estimular uma resposta imune mediada por célula dentro da mesma faixa ou, de maneira alternativa, maior do que a polimerase nativa.

COMBINAÇÃO/FUSÃO COM OUTRO(S) POLIPEPTÍDEO(S)

[061] Em outra realização, o polipeptídeo da polimerase mutante da invenção pode ser usado em combinação com um ou mais polipeptídeos ou peptídeos.

[062] O termo “combinação” e sua variação como “uso combinado” refere-se à ação de administrar no mesmo organismo hospedeiro duas ou mais entidades, uma das quais sendo um objeto da invenção. Tipicamente, as pelo menos duas entidades podem ser administradas por vias diferentes e de acordo com diferentes cronogramas. Uma combinação adequada inclui, sem limitação, a combinação do polipeptídeo da polimerase mutante descrito no presente pedido (ou um vetor que o codifica) com antivírus (SOC) e/ou com polipeptídeo(s) ou vetor(es) adicionais que codificam esse(s) polipeptídeo(s) adicional(is). Essa combinação pode estar sob a forma de (a) uma mistura (por exemplo, mistura de dois ou mais polipeptídeos ou vetores), (b) a fusão entre as duas ou mais entidades ou (c) através de design de expressão específico (por exemplo, expressão bicistrônica ou independente). Por exemplo, as duas ou mais entidades podem ser expressas independentemente no mesmo vetor com o uso de elementos reguladores distintos (por exemplo, sequências promotora e terminadora distintas). O projeto de expressão independente é especificamente adaptado para a expressão a partir de um plasmídeo ou vetores de sarampo. De forma alternativa, as duas ou mais entidades podem ser expressas de uma maneira bicistrônica sob o controle das mesmas sequências promotora e terminadora, mas que necessitam do uso de elementos reguladores adicionais, como IRES (para o sítio de ingresso no ribossomo interno), que permitem a tradução de dois ou mais cístrons a partir do mesmo mRNA. Uma ampla escolha de IRES está disponível na técnica, como aqueles que se originam do poliovírus, hepatite C e do vírus da encefalomiocardite (EMCV) (por exemplo, consulte documento WO 95/24485). O projeto bicistrônico é, especificamente, adaptado para a expressão a partir de vetores com capacidade de clonagem mais limitada, como o vetor adenoviral.

[063] O termo “fusão” ou “proteína de fusão”, como usado no presente pedido, refere-se à combinação com dois ou mais polipeptídeos/peptídeos em uma única cadeia de polipeptídeo. Preferencialmente, a fusão é realizada por meios genéticos, isto é, pela fusão no quadro das sequências de nucleotídeos que codificam cada um dos ditos polipeptídeos/peptídeos. Por “fundido no quadro” entende-se que a expressão da sequência codificadora fusionada resulta em uma única proteína sem qualquer terminador de tradução entre cada um dos polipeptídeos/peptídeos fundidos. A fusão pode ser direta (isto é, sem quaisquer resíduos de aminoácidos adicionais entre eles) ou através de um ligante (por exemplo, um peptídeo com 3 a 30 aminoácidos composto por resíduos de aminoácidos repetidos, como glicina, serina, treonina, asparagina, alanina e/ou prolina).

[064] O(s) polipeptídeo ou peptídeo(s) adicional(is) para o uso em combinação com o polipeptídeo da polimerase mutante da invenção é/são preferencialmente um polipeptídeo ou peptídeo codificado por um genoma do HBV, como quaisquer polipeptídeos nativos do HBV, derivados modificados e/ou fragmentos dos mesmos. Exemplos representativos desses polipeptídeos ou peptídeos do HBV incluem, sem limitação, HBc (core), HBs, proteína X ou qualquer fragmento imunogênico dos mesmos.

[065] De acordo com a invenção, conforme mencionado acima, quaisquer polipeptídeos ou peptídeos do HBV adicionais em uso na invenção podem se originar a partir de diferentes ou dos mesmos genótipos, linhagens ou isolados do HBV que originam o polipeptídeo da polimerase mutante da invenção. Preferencialmente, esse(s) polipeptídeo(s) do HBV adicional(is) se origina(m) de um genótipo D do HBV e, especialmente, do isolado Y07587.

[066] Uma combinação preferencial está sob a forma de uma proteína de fusão entre o polipeptídeo da polimerase mutante descrito no presente pedido e o(s) polipeptídeo(s) adicional(is). Essa fusão é preferencialmente direta sem qualquer ligante entre as entidades fundidas.

COMBINAÇÃO COM NÚCLEO ( CORE)

[067] Como usado no presente pedido, o termo “polipeptídeo núcleo” refere-se a um polipeptídeo que mantém pelo menos 100 resíduos de aminoácidos compreendidos em uma proteína núcleo nativa do HBV (HBc). Esse termo engloba polipeptídeos principais de polimerase nativa (isto é, que ocorrem naturalmente) de qualquer linhagem do HBV, isolado ou genótipo, que podem ser encontrados, isolados, obtidos a partir de uma fonte do HBV na natureza, como aquelas citadas acima relacionadas ao termo “HBV”, bem como centrais modificados e fragmentos do mesmo.

[068] O polipeptídeo núcleo do HBV em uso na invenção pode se originar a partir de um vírus do HBV com o mesmo ou diferente genótipo daquele que origina o polipeptídeo da polimerase mutante. Preferencialmente, ambos se originam a partir de um vírus de genótipo D e mais particularmente a partir do isolado Y07587. Os polipeptídeos centrais e suas sequências codificadoras podem ser gerados por uma série de modos conhecidos por técnicos no assunto, como pela síntese química da sequência codificadora (por exemplo, resultando em uma molécula de ácido nucleico sintética) ou por meios recombinantes (por exemplo, mutagênese sítio-dirigida da sequência de nucleotídeos correspondente, mutagênese por PCR, embaralhamento de DNA).

[069] Quaisquer modificações podem ser realizadas, contanto que o núcleo resultante mantenha uma atividade imunogênica significativa quando combinado ou fundido com o polipeptídeo da polimerase mutante descrito no presente pedido, preferencialmente na mesma faixa ou maior do que o núcleo nativo correspondente.

[070] Modificações adequadas incluem o truncamento de pelo menos 10 resíduos de aminoácidos e de, no máximo, 41 resíduos de aminoácidos normalmente presentes no C-terminal de um polipeptídeo core nativo ou dentro do C-terminal do mesmo, com uma preferência especial por um truncamento que se estenda do resíduo 143, 144, 145, 146, 147, 148 ou 149 até o C-terminal (resíduo 183) do polipeptídeo núcleo nativo. Outras modificações adequadas incluem a deleção interna de um ou mais resíduos de aminoácidos, especialmente nas regiões de superfície exposta, como a região localizada nas proximidades do resíduo 80 que se prevê formar uma alça externa (Argos et al., 1988, EMBO J. 7: 819; Borisova et al., 1993, J. Virol. 67: 3696; Schodel et al., 1992, J. Virol. 66: 106; Yon et al., 1992, J. Gen Virol. 73: 2569; e Pumpens et al., 1995, Intervirology 38: 63).

[071] Em uma realização preferencial, a combinação está sob a forma de uma fusão. Consequentemente, a invenção se refere a uma proteína de fusão que compreende o polipeptídeo da polimerase mutante descrito no presente pedido e um parceiro de fusão. Preferencialmente, o parceiro de fusão é um polipeptídeo core do HBV, com uma preferência específica por um polipeptídeo núcleo truncado no C-terminal e especialmente truncado no resíduo 148.

[072] Preferencialmente, o polipeptídeo núcleo do HBV é fundido no quadro à terminação N do polipeptídeo da polimerase mutante, descrito no presente pedido, resultando em uma proteína de fusão que se inicia com um iniciador Met, polipeptídeo núcleo (modificado ou nativo) sem qualquer códon de parada, polipeptídeo da polimerase mutante (sem qualquer iniciador Met) e um códon de parada.

[073] Uma proteína de fusão preferencial compreende, de maneira alternativa, essencialmente consiste em ou, de maneira alternativa, consiste em uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 80% de identidade, de maneira vantajosa, pelo menos 85% de identidade, preferencialmente, pelo menos 90% de identidade, com mais preferência, pelo menos 95% de identidade e, com ainda mais preferência, 100% de identidade com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 6. Mais preferencialmente, a proteína de fusão da invenção compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 6.

COMBINAÇÃO COM OS DOMÍNIOS DE HBSAG IMUNOGÊNICOS

[074] De maneira alternativa ou em combinação com a realização anterior (combinação com um polipeptídeo núcleo), o polipeptídeo da polimerase mutante da invenção pode ser usado em combinação com um HBsAg ou fragmento(s)/domínio(s) imunogênico(s) do mesmo.

[075] Como usado no presente pedido, o termo “domínio imunogênico” refere-se a um polipeptídeo com aproximadamente 15 até, aproximadamente, 100 resíduos de aminoácidos e, preferencialmente, pelo menos 20 e, no máximo, 60 aminoácidos consecutivos que compreendem pelo menos um epítopo B e/ou um epítopo de célula T específico para células T auxiliares (TH) e/ou para células citotóxicas T (CTL), normalmente presentes em uma proteína HBsAg nativa. Além disso, esses epítopos podem estar restritos a vários antígenos MHC de classe I e/ou de classe II (por exemplo, A2, A24, DR, DP, etc.). Preferencialmente, um ou mais domínios imunogênicos de HBsAg usados na invenção não incluem qualquer porção dos polipeptídeos preS1 e preS2 do HBV.

[076] Cada um ou mais dos domínios imunogênicos podem se originar independentemente a partir do mesmo ou de diferentes vírus do HBV, que podem ser o mesmo ou um diferente em relação ao vírus HBV do qual se origina o polipeptídeo da polimerase mutante descrito no presente pedido (e, eventualmente, o polipeptídeo núcleo). Preferencialmente, um ou mais domínios imunogênicos se originam de um HBV de genótipo D e, especialmente do isolado Y07587.

[077] Domínios imunogênicos exemplares que podem ser usados na invenção são descritos na técnica (por exemplo, documento WO 93/03764; documento WO 94/19011; Desombere et al., 2000, Clin. Exp. Immunol 122: 390; Loirat et al., 2000, J. Immunol. 165: 4748; Schirmbeck et al., 2002, J. Immunol 168: 6253; Depla et al., 2008, J. Virol. 82: 435 e documento WO 2011/015656). Domínios imunogênicos particularmente preferenciais incluem os domínios envl e env2 descritos no documento WO 2011/015656. ‘Envl” corresponde à porção de um HBsAg nativo, aproximadamente a partir da posição 14 até aproximadamente a posição 51 e env2 corresponde à porção de HBsAg, aproximadamente a partir da posição 165 até aproximadamente a posição 194.

[078] Em uma realização preferencial, a combinação está sob a forma de uma fusão e a invenção refere-se a uma proteína de fusão que compreende o polipeptídeo da polimerase mutante, descrito no presente pedido, e um ou mais domínios imunogênicos de HBsAg ou à proteína de fusão definida acima (que compreende pelo menos o polipeptídeo da polimerase mutante descrito no presente pedido e um polipeptídeo Hbc) que ainda compreende um ou mais domínios imunogênicos de HBsAg. Um ou mais domínios imunogênicos podem estar posicionados na proteína de fusão na terminação N, na terminação C e/ou internamente, por exemplo, dentro do polipeptídeo da polimerase mutante (por exemplo, no lugar da porção que falta na polimerase mutada e/ou nos domínios RNaseH) ou entre a parte principal e o polipeptídeo da polimerase mutante. Está ao alcance de um técnico no assunto definir, consequentemente, a necessidade e a localização dos elementos reguladores que medeiam a tradução (por exemplo, o iniciador Met e o códon de parada no N-terminal e no C-terminal da proteína de fusão).

[079] As proteínas de fusão de interesse particular compreendem o polipeptídeo da polimerase mutante, descrito no presente pedido, o polipeptídeo núcleo e os dois domínios imunogênicos de HBsAg, com uma preferência específica por uma fusão que compreenda um polipeptídeo núcleo em seu N-terminal (por exemplo, 183 resíduos nativos ou truncados com 148 resíduos com um iniciador Met) que compreende um ou mais domínios imunogênicos de HBsAg fundidos no lugar da deleção interna no domínio da polimerase mutado (por exemplo, envl) e/ou no lugar da deleção no domínio de RNaseH mutado (por exemplo, env2).

[080] Em um aspecto preferencial dessa realização, o polipeptídeo de fusão da invenção compreende um domínio polimerase compreende, de maneira alternativa, essencialmente consiste em, ou de maneira alternativa, consiste em uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 80% de identidade, de forma mais vantajosa, pelo menos 85% de identidade, preferencialmente pelo menos 90% de identidade, mais preferencialmente pelo menos 95% de identidade e, ainda mais preferencialmente 100% de identidade com qualquer uma das sequências de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 7-9. Uma realização particularmente preferencial é direcionada a uma proteína de fusão que compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 8.

[081] No contexto da invenção, o polipeptídeo da polimerase mutante da invenção ou a proteína de fusão da invenção podem compreender ainda características estruturais adicionais.

[082] Em uma realização, pode-se compreender compostos adicionais (por exemplo, peptídeo ou polipeptídeo) que visam aprimorar sua atividade imunogênica em um organismo hospedeiro. Esses compostos capazes de aprimorar a imunogenicidade foram descritos na literatura e incluem, sem limitação, calrreticulina (Cheng et al., 2001, J. Clin. Invest. 108: 669), proteína 70 de choque térmico de Mycobacterium tuberculosis (HSP70) (Chen et al., 2000, Cancer Res. 60: 1035), ubiquitina (Rodriguez et al., 1997, J. Virol. 71: 8497), toxina bacteriana, como o domínio de translocação da exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa (ETA(dlll)) (Hung et al., 2001, Cancer Res. 61 : bem como o(s) epítopo(s) de T auxiliares como o peptídeo Pan-Dr (Sidney et al., 1994, Immunity 1: 751), epítopo pstSl GCG (Vordermeier et al., 1992, Eur. J. Immunol. 22: peptídeos toxoides tetânicos P2TT (Panina-Bordignon et al., 1989, Eur. J. Immunol. 19: 2237) e P30TT (Demotz et al., 1993, Eur. J. Immunol. 23: 425), epítopo de influenza (Lamb et al., 1982, Nature 300: 66) e epítopo de hemaglutinina (Rothbard et al., 1989, Int. Immunol. 1: 479).

[083] Outras características estruturais adequadas são aquelas que são benéficas para a síntese, processamento, estabilidade e solubilidade do polipeptídeo da polimerase mutante ou da proteína de fusão da invenção (por exemplo, aquelas direcionadas para modificar os potenciais sítios de clivagem, potenciais sítios de glicosilação e/ou ancoragem na membrana de forma a aprimorar a apresentação à membrana celular).

[084] Poderia ser benéfico para a resposta imune direcionar a síntese do polipeptídeo da polimerase mutante ou da proteína de fusão, descritos no presente pedido, na superfície celular pelo uso de sequências adequadas bem conhecidas na técnica, como os peptídeos sinal e/ou transmembrana. Resumidamente, os peptídeos sinal estão geralmente presentes na terminação N dos polipeptídeos apresentados para a membrana ou secretados e iniciam sua passagem dentro do retículo endoplasmático (ER). Eles normalmente compreendem 15 a 35 aminoácidos essencialmente hidrofóbicos que são então removidos por uma endopeptidase localizada no ER para produzir o polipeptídeo maduro. Os peptídeos transmembrana também são altamente hidrofóbicos na natureza e servem para ancorar os polipeptídeos dentro da membrana celular. A escolha pelos peptídeos transmembrana e/ou sinal que podem ser usados no contexto da presente invenção é ampla. Eles podem ser obtidos a partir de qualquer polipeptídeo ancorado à membrana e/ou secretado (por exemplo, polipeptídeos celulares ou virais), como aqueles das imunoglobulinas, ativadores do plasminogênio tecidual, insulina, glicoproteína da raiva, glicoproteína do envelope viral do HIV ou a proteína F do vírus do sarampo ou podem ser sintetizados.

[085] Em uma realização, o polipeptídeo da polimerase mutante ou a proteína de fusão da invenção são fundidos no quadro a um peptídeo sinal que é inserido na terminação N a jusante do códon de iniciação da tradução. Em outra realização, o polipeptídeo da polimerase mutante ou a proteína de fusão da invenção são fundidos na estrutura a um peptídeo sinal (por exemplo, inserido na sua terminação) e a um peptídeo transmembrana (por exemplo, inserido na sua terminação C, por exemplo, imediatamente a montante do códon de parada). Preferencialmente, os peptídeos sinal e transmembrana usados no contexto da invenção se originam da glicoproteína da raiva (consulte, por exemplo, documento WO 99/03885 ou documento WO 2008/138649). Realizações preferenciais são direcionadas a um polipeptídeo da polimerase mutante do HBV e a uma proteína de fusão que compreende, de maneira alternativa essencialmente consiste em, ou de maneira alternativa consiste em uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 80% de identidade, de maneira vantajosa, pelo menos 85% de identidade, particularmente pelo menos 90% de identidade, preferencialmente pelo menos 95% de identidade e, mais preferencialmente 100% de identidade com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12.

MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO

[086] Em outro aspecto, a presente invenção fornece moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam polipeptídeos polimerase mutantes e proteínas de fusão descritos no presente pedido.

[087] Dentro do contexto da presente invenção, os termos “ácido nucleico”, “molécula de ácido nucleico”, “polipeptídeo” e “sequência de nucleotídeos” são usados de maneira intercambiável e definem um polímero de qualquer tamanho, tanto de polidesoxirribonucleotídeos (DNA) (por exemplo, cDNA, DNA genômico, plasmídeos, vetores, genomas virais, DNA isolado, sondas, primers e qualquer mistura dos mesmos) como polirribonucleotídeos (RNA) (por exemplo, mRNA, RNA antisense) ou polirribo- polidesoxirribonucleotídeos misturados. Eles englobam polinucleotídeos fita simples ou dupla-fita, linear ou circular, natural ou sintético. Além disso, um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos que não ocorrem naturalmente e podem ser interrompidos por componentes que não são nucleotídeos.

[088] As moléculas de ácido nucleico da presente invenção podem ser geradas a partir de qualquer fonte com o uso de dados de sequências acessíveis na técnica e a informação de sequência fornecida no presente pedido. Por exemplo, a sequência de DNA que codifica a polimerase de HBV e, se necessário, o polipeptídeo núcleo e os domínios imunogênicos HBsAg podem ser isolados independentemente a partir da célula que contenham HBV, bibliotecas de cDNA e genômica, genomas virais ou qualquer vetor da anterioridade conhecido por incluí-lo e, então, adequadamente ligado juntos por técnicas convencionais de biologia molecular e PCR. De maneira alternativa, as moléculas de ácido nucleico da invenção também podem ser geradas por síntese química em processo automatizado (por exemplo, reunidos a partir de oligonucleotídeos sintéticos ou gene sintético sobrepostos). Modificações podem ser geradas por uma série de formas conhecidas por técnicos no assunto, como síntese química, mutagênese sítio-dirigida, mutagênese por PCR, embaralhamento de DNA, etc.

[089] É de particular interesse qualquer molécula de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em: - uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da polimerase mutante que compreende um domínio da polimerase que tem a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1 ou 2; - uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da polimerase mutante que compreende um domínio de RNaseH que tem a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3 ou 4; - uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da polimerase mutante que compreende uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 80% de identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 100%) com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 5; ou - uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão que compreende uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos mais de 80% de identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 100%) com qualquer uma das sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 6-12.

[090] A presente invenção não está limitada a essas sequências de nucleotídeos exemplares e engloba quaisquer modificações que visam aprimorar a clonagem, expressão, estabilidade das moléculas de ácido nucleico em uso na invenção (por exemplo, a introdução de degeneração de sítios de restrição adequados e/ou otimização da sequência de nucleotídeos para otimizar a tradução em uma dada célula hospedeira e/ou supressão dos elementos potencialmente negativos que podem desestabilizar a molécula de ácido nucleico ou seu transcrito). Quando várias modificações são contempladas, elas podem envolver resíduos consecutivos e/ou resíduos não consecutivos. As modificações contempladas pela presente invenção englobam modificações silenciosas que não alteram a sequência de aminoácidos dos polipeptídeos e das proteínas de fusão codificados, bem como modificações que são traduzidas em polipeptídeos e proteínas de fusão codificados.

[091] Em uma realização, a molécula de ácido nucleico da invenção pode ser degenerada ao longo de sua sequência de nucleotídeos inteira ou em porções da mesma, de modo a reduzir a homologia de sequência entre as moléculas de ácido nucleico usadas no contexto da invenção ou na célula hospedeira. É, de fato, aconselhável degenerar as porções de sequências de ácido nucleico que mostram um alto grau de identidade de sequência de nucleotídeos, e um técnico no assunto é capaz de identificar essas porções por alinhamento de sequência. Por exemplo, se um vetor carrega uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da polimerase mutante, conforme descrito no presente pedido, e uma molécula de ácido nucleico que codifica outro polipeptídeo do HBV codificado por sequências sobrepostas no genoma do HBV, pode ser vantajoso degenerar uma ou mais moléculas de ácido nucleico nas porções sobrepostas de modo a evitar problemas de recombinação homóloga durante o processo de produção.

[092] De maneira alternativa ou em combinação, a molécula de ácido nucleico da invenção pode ser otimizada pelo fornecimento da expressão de alto nível em uma célula ou organismo hospedeiro específico. De fato, foi observado que quando mais de um códon está disponível para codificar para um dado aminoácido, os padrões de uso de códons dos organismos são altamente não aleatórios e a utilização de códons pode ser significativamente diferente entre hospedeiros diferentes. Como as sequências de nucleotídeos englobadas pela invenção são, em sua maioria, de origem viral (HBV), elas podem ter um padrão de uso de códons inadequado para a eficiente expressão em células hospedeiras, como a célula bacteriana e células eucariontes inferiores e superiores. Tipicamente, a otimização de códons pode ser realizada pela substituição de um ou mais códons “nativos” (por exemplo, HBV) correspondentes a códons não frequentemente usados na célula/organismo hospedeiro de interesse por um ou mais códons que codificam o mesmo aminoácido que é mais frequentemente usado na célula/organismo hospedeiro de interesse. Não é necessário substituir todos os códons nativos correspondentes em códons não frequentemente usados, uma vez que a expressão aumentada pode ser atingida mesmo com substituição parcial. Além disso, alguns desvios da adesão estrita para o uso otimizado de códons podem ser realizados para acomodar a introdução de sítio(s) de restrição dentro da molécula de ácido nucleico resultante.

[093] Além disso, a expressão na célula ou organismo hospedeiro pode ser melhorada através de modificações adicionais na sequência de nucleotídeos que visam prevenir o agrupamento de códons raros, não ótimos e/ou suprimir ou modificar, pelo menos parcialmente, os elementos negativos da sequência que são esperados influenciar negativamente sobre os níveis de expressão (por exemplo, trechos da sequência ricos em AT ou GC; sequências repetidas diretas ou invertidas instáveis; estruturas secundárias de RNA; e/ou elementos reguladores crípticos internos, como TATA-boxes internos, sítios-chi, sítios de entrada no ribossomo e/ou sítios doadores/aceitantes de splicing).

[094] Uma realização especificamente preferencial da presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico que compreende, de maneira alternativa, essencialmente consiste em ou, de maneira alternativa, consiste em uma sequência de nucleotídeos que exibe pelo menos 80% de identidade, de maneira vantajosa, pelo menos 85% de identidade, preferencialmente pelo menos 90% de identidade, com mais preferência pelo menos 95% de identidade e, ainda com mais preferência 100% de identidade com a sequência de nucleotídeos mostrada em quaisquer uma das SEQ ID NOs: 13 a 17.

[095] Outra realização da invenção pertence a fragmentos das moléculas de ácido nucleico da invenção, por exemplo, fragmentos gerados por endonuclease de restrição e fragmentos gerados por PCR. Esses fragmentos podem ser usados como sondas, primers ou fragmentos que codificam uma porção imunogênica do polipeptídeo imunogênico codificado.

VETORES

[096] Em outro aspecto, a presente invenção fornece vetores que compreendem uma molécula ácido nucleico da presente invenção.

[097] O termo “vetor”, como usado no presente pedido, refere-se a um veículo, preferencialmente a uma molécula de ácido nucleico ou a uma partícula viral que contém elementos necessários para permitir a distribuição, propagação e/ou expressão de uma ou mais moléculas de ácido nucleico dentro de uma célula ou organismo hospedeiro. Esse termo engloba vetores para a manutenção (vetores de clonagem) ou vetores para a expressão em várias células ou organismos hospedeiros (vetores de expressão), vetores extracromossomais (por exemplo, plasmídeos multicópias) ou vetores de integração (por exemplo, desenhados para se integrar ao genoma da célula hospedeira e produzir cópias adicionais das moléculas de ácido nucleico quando a célula hospedeira se replicar), bem como vetores ponte (por exemplo, para a transferência de moléculas de ácido nucleico em um genoma viral). Para os propósitos da invenção, os vetores podem ser de fontes genéticas que ocorrem naturalmente, sintéticos ou artificiais ou alguma combinação de elementos genéticos naturais e artificiais.

[098] No contexto da invenção, o termo “vetor” tem que ser entendido de forma ampla, incluindo vetores plasmidiais e virais. Um “vetor plasmidial”, como usado no presente pedido, refere-se a um constructo de DNA replicável. Usualmente, os vetores plasmidiais contêm genes marcadores selecionáveis que permitem às células hospedeiras que carregam o vetor plasmidial serem selecionadas em favor ou contra a presença de uma droga seletiva correspondente. Uma série de genes marcadores selecionáveis positivos e negativos é conhecida na técnica. A título de ilustração, um gene de resistência a antibióticos pode ser usado como um gene marcador selecionável positivo que permite a uma célula hospedeira ser selecionada na presença do antibiótico correspondente.

[099] O termo “vetor viral”, como usado no presente pedido, refere-se a um vetor de ácido nucleico que inclui pelo menos um elemento de um genoma viral e pode ser empacotado em uma partícula viral ou a uma partícula viral. Os termos “vírus”, “viriões”, “partícula viral” e “partícula de vetor viral” são usados de forma intercambiável para se referir a partículas virais que são formadas quando o vetor de ácido nucleico é traduzido em uma célula ou linhagem celular adequada de acordo com condições adequadas que permitam a geração de partículas virais infecciosas. No contexto da presente invenção, o termo “vetor viral” tem que ser entendido de forma ampla, incluindo vetor de ácido nucleico (por exemplo, vetor viral de DNA), bem como partículas virais geradas a partir do mesmo. O termo “infeccioso” refere-se à capacidade de um vetor viral de infectar e entrar em uma célula ou organismo hospedeiro. Os vetores virais podem ser replicantes-competentes ou replicantes-seletivos (por exemplo, elaborados geneticamente para replicar melhor ou seletivamente em células hospedeiras específicas) ou podem ser geneticamente incapazes, de modo a serem replicantes-defeituosos ou replicantes-prejudiciais.

[100] Vetores que são adequados no contexto da presente invenção incluem, sem limitação, bacteriófagos, vetores plasmidiais ou cosmidiais para a expressão em células hospedeiras procariontes, como as bactérias (por exemplo, E. coli, Bacillus subtilis ou Listeria); vetores para expressão em leveduras (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pombe, Pichia pastoris); vetores de baculovírus para a expressão em sistemas celulares de insetos (por exemplo, células Sf 9); vetores virais e plasmidiais para a expressão em sistemas celulares vegetais (por exemplo, plasmídeo Ti, vírus do mosaico da couve-flor CaMV; vírus do mosaico do tabaco TMV); bem como vetores virais e plasmidiais para a expressão em células e organismos eucariontes superiores.

[101] Tipicamente, esses vetores estão disponíveis comercialmente (por exemplo, junto a Invitrogen, Stratagene, Amersham Biosciences, Promega, etc) ou disponíveis junto a instituições depositárias como a Coleção Americana de Tipo de Cultura (ATCC, Rockville, Md.) ou vêm sendo objeto de numerosas publicações que descrevem sua sequência, organização e métodos de produção, permitindo ao técnico aplicá-los.

[102] Exemplos representativos de vetores plasmidiais adequados incluem, sem limitação, pREP4, pCEP4 (Invitrogen), pCI (Promega), pVAX (Invitrogen) e pgWiz (Gene Therapy System Inc).

[103] Exemplos representativos de vetores virais adequados são gerados a partir de uma série de diferentes vírus (por exemplo, retrovírus, adenovírus, vírus associado a adenovírus (AAV), poxvírus, vírus do sarampo, vírus espumoso, alfavírus, vírus da estomatite vesicular, etc.). Conforme descrito acima, o termo “vetor viral” engloba DNA vetorial, DNA genômico, bem como partículas virais geradas dos mesmos.

[104] A presente invenção também engloba vetores (por exemplo, DNA plasmidial) complexados com lipídeos ou polímeros para formar estruturas particuladas, como lipossomos, lipoplexos ou nanopartículas.

[105] Em uma realização, o vetor da invenção é um vetor adenoviral. Este pode ser derivado de uma série de adenovírus humanos ou animais (por exemplo, canino, ovino, símio, etc.). Qualquer sorotipo pode ser utilizado. De maneira desejável, o vetor adenoviral é replicante-defeituoso e se origina de um Ad humano e, mais especificamente, de um Ad humano de um sorotipo raro ou de um Ad de chimpanzé. Exemplos representativos de adenovírus humanos incluem Ad2, Ad5 e Ad 6 do subgênero C, Adl 1, Ad34 e Ad35 do subgênero B e Adl 9, Ad24, Ad48 e Ad49 do subgênero D. Exemplos representativos de Ad de chimpanzé incluem, sem limitação, AdCh3 (Peruzzi et al., 2009, Vaccine 27: 1293), AdCh63 (Dudareva et al., 2009, Vaccine 27: 3501) e qualquer um desses descritos na técnica (consulte, por exemplo, documentos WO 03/000283, WO 03/046124, WO 2005/071093, WO 2009/073103, WO 2009/073104, WO 2009/105084, WO 2009/136977 e WO 2010/086189).

[106] Vetores adenovirais replicantes-defeituosos podem ser obtidos conforme descrito na técnica, por exemplo, pela deleção de pelo menos uma região do genoma adenoviral ou porção do mesmo essencial para a replicação viral, com uma preferência específica pela deleção da região E1 que compreende as sequências codificadoras (por exemplo, que se estendem, aproximadamente, das posições 459 a 3510 por referência à sequência do adenovírus humano tipo 5 divulgado no GeneBank com o número de acesso M 73260 e em Chroboczek et al., 1992, Virol. 186:280). A presente invenção também engloba vetores com deleções/modificações adicionais dentro do genoma adenoviral (toda ou parte da região não essencial de E3 ou de outras regiões essenciais de E2 e E4, conforme descrito no documento WO 94/28152; Lusky et al., 1998, J. Virol 72: 2022).

[107] A molécula de ácido nucleico da presente invenção pode ser inserida em qualquer posição do genoma adenoviral e pode ser posicionada em orientação sense ou antisense em relação à direção transcricional natural da região em questão. Preferencialmente, a molécula de ácido nucleico da invenção é inserida em substituição à região E1 adenoviral e posicionada sob o controle do promotor de CMV.

[108] Outros vetores virais adequados no contexto da invenção são os vetores de poxvírus que podem ser obtidos a partir de qualquer membro da família poxviridae, com uma específica preferência por um vetor poxviral que se origina de um vírus da varíola de canário, aviária ou vaccinia, essa última sendo preferencial. Os vírus vaccinia preferenciais incluem, sem limitação, a linhagem de Copenhagen (Goebel et al., 1990, Virol. 179: 179: 247; Johnson et al., 1993, Virol. 196: 381), a linhagem Wyeth e particularmente a linhagem Ankara (MVA) modificada (Antoine et al., 1998, Virol. 244: 365). As condições gerais para a construção de poxvírus recombinantes são bem conhecidas na técnica. A molécula de ácido nucleico da presente invenção é, preferencialmente, inserida dentro do genoma poxviral em um locusnão essencial. O gene da timidina quinase é particularmente adequado para a inserção nos vetores de vaccinia de Copenhagen e deleção II ou III para a inserção em um vetor MVA. Preferencialmente, a molécula de ácido nucleico da invenção é inserida na deleção III do vetor MVA e posicionada sob o controle do promotor 7,5K de vaccinia ou pH5R.

[109] Outros vetores virais adequados no contexto da invenção são os morbilivírus que podem ser obtidos a partir da família paramyxoviridae, com uma preferência específica pelo vírus do sarampo. Várias linhagens atenuadas estão disponíveis na técnica (Brandler et al., 2008, CIMID, 31: 271; Singh et al., 1999, J. virol. 73(6): como, e sem limitação, as linhagens A e B de Edmonston (Griffin et al., 2001, Field’s in Virology, 1401-1441), a linhagem Schwartz (Schwarz A, 1962, Am J Dis Child, 103: 216), as linhagens S- 30 191 ou C-47 (Zhang et al., 2009, J Med Virol. 81 (8): 1477). A inserção entre os genes P e M é particularmente adequada.

[110] De acordo com a presente invenção, a(s) molécula(s) de ácido nucleico compreendida(s) no vetor da invenção está(ão) sob a forma adequada para a expressão em uma célula ou organismo hospedeiro, o que significa que a molécula de ácido nucleico está posicionada sob o controle de sequências reguladoras adequadas. Como usado no presente pedido, o termo “elementos reguladores” refere-se a qualquer elemento que permita, contribua ou module a expressão de uma molécula de ácido nucleico em uma dada célula ou organismo hospedeiro, incluindo replicação, duplicação, transcrição, splicing, tradução, estabilidade e/ou transporte do ácido nucleico ou de seu derivado (isto é, mRNA).

[111] Será apreciado pelos técnicos no assunto que a escolha de sequências reguladoras pode depender de fatores como o vetor em si, a célula hospedeira, o nível de expressão desejado, etc. O promotor é de especial importância. No contexto da invenção, ele pode ser constitutivo, direcionando a expressão da molécula de ácido nucleico em muitos tipos de células hospedeiras ou específica para algumas células hospedeiras (por exemplo, sequências reguladoras específicas do fígado) ou reguladas em resposta a eventos específicos ou fatores exógenos (por exemplo, pela temperatura, aditivo nutricional, hormônio, etc.) ou de acordo com a fase de um ciclo viral (por exemplo, final ou inicial). Um técnico também pode usar promotores que são reprimidos durante a etapa de produção em resposta a eventos específicos ou fatores exógenos para otimizar a produção vetorial e evitar a potencial toxicidade do(s) polipeptídeo(s) expresso(s).

[112] Promotores adequados para expressão constitutiva em células de mamíferos incluem, mas não se limitam ao promotor precoce imediato do citomegalovírus (CMV) (Boshart et al., 1985, Cell 41: 521), o promotor de RSV, promotor final principal do adenovírus, promotor da fosfogliceroquinase (PGK) (Adra et al., 1987, Gene 60: 65), promotor da timidina quinase (TK) do vírus da herpes simples (HSV)-l e promotor da polimerase T7. Os promotores virais da vaccinia são particularmente adaptados para a expressão em vetores poxvirais. Exemplos representativos incluem, sem limitação, os promotores da vaccinia 7.5K, H5R, 11K7.5 (Erbs et al., 2008, Cancer Gene Ther. 15: 18), TK, p28, pl l e K1L, bem como promotores sintéticos como aqueles descritos em Chakrabarti et al., (1997, Biotechniques 23: 1094), Hammond et al., (1997, J. Virological Methods 66: 135) e Kumar e Boyle (1990, Virology 179: bem como promotores quiméricos iniciais/finais. Os promotores adequados para a expressão mediada por sarampo incluem, sem limitação, qualquer promotor que direcione a expressão de unidades de transcrição do sarampo (Brandler e Tangy, 2008, CIMID 31: 271). Promotores específicos do fígado incluem, sem limitação, aqueles dos genes da HMG-CoA redutase (Luskey, 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 1881); elemento regulador de esterol 1 (SRE-1; Smith et al., 1990, J. Biol. Chem. 265: 2306); albumina (Pinkert et al., 1987, Genes Dev. 1: 268); fosfoenolpiruvato carboxiquinase (PEPCK) (Eisenberger et al., 1992, Mol. Cell Biol. 12: 1396); antitripsina alfa-1 (Ciliberto et al., 1985, Cell 41: 5 531); transferrina humana (Mendelzon et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 5717); e FIX (patente US 5.814.716).

[113] Técnicos no assunto apreciarão que os elementos reguladores que controlam a expressão da molécula de ácido nucleico da invenção podem compreender ainda elementos adicionais para a adequada iniciação, regulação e/ou terminação da transcrição (por exemplo, sequências terminadoras da transcrição poli-A), transporte de mRNA (por exemplo, sequências sinal de localização nuclear), processamento (por exemplo, sinais de splicing), estabilidade (por exemplo, íntrons e sequências 5’ e 3’ não codificadoras), tradução (por exemplo, um iniciador Met, sequências líder tripartida, sítios de ligação ao ribossomo IRES, sequências Shine-Dalgarno, etc.) na célula ou organismo hospedeiro e etapas de purificação (por exemplo, um marcador).

[114] As realizações particularmente preferenciais da invenção são direcionadas a vetores (ou partículas virais) selecionadas do grupo que consiste em: - um vetor de Ad defeituoso que compreende, inserido no lugar da região E1, uma molécula de ácido nucleico localizada sob o controle de um promotor como o promotor CMV, e que codifica um polipeptídeo da polimerase mutante que compreende uma sequência de aminoácidos, conforme mostrada na SEQ ID NO: 5 ou uma proteína de fusão que compreende uma sequência de aminoácidos conforme mostrada na SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 8; - um vetor de Ad defeituoso que compreende, inserido no lugar da região E1, uma molécula de ácido nucleico localizada sob o controle de um promotor como o promotor CMV, e que compreende a sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 15; - um vetor de Ad de replicação defeituoso que compreende, inserido no lugar da região E1, uma molécula de ácido nucleico localizada sob o controle de um promotor como o promotor CMV, e que compreende a sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 17; - um vetor de MVA que compreende uma molécula de ácido nucleico localizada sob o controle de um promotor de vaccinia, como o promotor 7.5K ou pH5R, e que codifica um polipeptídeo da polimerase mutante que compreende a sequência de aminoácidos conforme mostrada na SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 10 ou uma proteína de fusão que compreende a sequência de aminoácidos conforme mostrada na SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 12; e um vetor de MVA que compreende uma molécula de ácido nucleico localizada sob o controle de um promotor de vaccinia, como o promotor 7.5K ou pH5R, e que compreende a sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 15. Preferencialmente, a dita molécula de ácido nucleico é inserida na deleção III do genoma de MVA.

[115] Se necessário, o vetor da invenção pode ainda compreender um ou mais transgenes, por exemplo, um gene de interesse a ser expresso junto com a molécula de ácido nucleico da invenção em uma célula ou organismo hospedeiro que vise aprimorar a atividade terapêutica ou protetora contra uma infecção por HBV ou qualquer doença ou condição causada por ou associada a uma infecção por HBV. Os transgenes adequados incluem, sem limitação, imunomoduladores, como citocinas e qualquer outro antígeno que se origina de um organismo potencialmente coinfectado (por exemplo, HIV, Mycobacterium tuberculosis, etc.). Se um transgene for usado, ele pode ser expresso a partir do vetor da invenção ou a partir de um vetor independente para uso em combinação que pode ser igual ou diferente em relação ao vetor da invenção. Por exemplo, um técnico pode prever seu uso em combinação com um adenovírus que expressa o polipeptídeo da polimerase mutante ou a proteína de fusão da invenção e um adenovírus que expressa um imunomodulador.

[116] De acordo com uma realização preferencial, o vetor da invenção está sob a forma de partículas virais infecciosas. Tipicamente, essas partículas virais são produzidas por um processo que compreende as etapas de (a) introduzir o vetor viral em uma linhagem celular adequada, (b) cultivar a dita linhagem celular sob condições adequadas de modo a permitir a produção da dita partícula viral infecciosa, (c) recuperar a partícula viral infecciosa produzida a partir do cultivo da dita linhagem celular, e (d) opcionalmente purificar a dita partícula viral.

[117] Quando o vetor viral é defeituoso, as partículas são usualmente produzidas em uma linhagem celular complementar ou por meio do uso de um vírus auxiliar, que fornece em trans os genes virais não funcionais. Por exemplo, linhagens celulares adequadas para complementar os vetores adenovírus com deleção de E1 incluem as células 293 (Graham et al., 1997, J. Gen. Virol. 36: 59-72), bem como as células HER-96 e PER- C6 (por exemplo, Fallaux et al., 1998, Human Gene Ther. 9: 1909-1917; documento WO 97/00326) ou qualquer derivado dessas linhagens celulares. Mas qualquer outra linhagem celular descrita na técnica também pode ser usada no contexto da presente invenção, especialmente qualquer linhagem celular usada para produzir um produto para uso humano, como as células Vera, HeLa e células aviárias, particularmente adequadas para a propagação dos vetores poxvirais. As células aviárias adequadas incluem, sem limitação, fibroblastos primários de embrião de galinha (CEF), preparados a partir de embriões de galinha obtidos de ovos fertilizados, e linhagens celulares de pato (por exemplo, conforme descrito nos documentos WO 03/076601, WO2009/004016, WO2010/130756 e patente US 2011/008872).

[118] As partículas virais infecciosas podem ser recuperadas a partir do sobrenadante da cultura e/ou a partir de células após a lise. Elas podem ser ainda purificadas de acordo com técnicas padrão (cromatografia, ultracentrifugação em um gradiente de cloreto de césio conforme descrito, por exemplo, no documento WO 96/27677, documento WO 98/00524, documento WO 98/22588, documento WO 98/26048, documento WO 00/40702, patente EP1016700 e documento WO 00/50573).

[119] A presente invenção também engloba vetores ou partículas virais que foram modificadas para permitir o direcionamento preferencial a uma célula hospedeira específica. Uma característica típica de vetores direcionados é a presença em sua superfície de um ligante capaz de reconhecer e de se ligar a um componente celular exposto na superfície, como um marcador célula-específico (por exemplo, uma célula infectada por HBV), um marcador tecido-específico (por exemplo, um marcador específico do fígado), bem como um antígeno viral (por exemplo, HBV). Exemplos de ligantes adequados incluem anticorpos ou fragmentos dos mesmos direcionados a um domínio antigênico do HBV. O direcionamento pode ser realizado por inserção genética do ligante a um polipeptídeo presente na superfície viral (por exemplo, fibra adenoviral, penton, pIX ou produto gênico pI4 da vaccinia).

CÉLULAS HOSPEDEIRAS

[120] Em outro aspecto, a invenção também se refere a células hospedeiras que compreendem as moléculas de ácido nucleico ou os vetores (ou partículas virais) da invenção.

[121] Como usado no presente pedido, o termo “célula hospedeira” deve ser amplamente entendido, sem qualquer limitação, em relação à organização específica de tecido, órgão ou células isoladas. Essas células podem ser de um tipo celular único ou um grupo de diferentes tipos celulares, como linhagens celulares cultivadas, células primárias e células proliferativas. No contexto da invenção, o termo “células hospedeiras” inclui células procariontes, células eucariontes inferiores, como levedura, e outras células eucariontes superiores, como células de insetos, plantas e mamíferos (por exemplo, humana ou não humana), bem como células capazes de produzir o vetor da invenção (por exemplo, células 293, HER96, PER.C6, Vera, HeLa, CEF, linhagens celulares de pato, etc.). Esse termo inclui células que podem ser ou foram receptoras do vetor descrito no presente pedido, bem como uma progênie dessas células. As células hospedeiras podem ser cultivadas em biorreatores de fermentação convencionais, frascos e placas de petri. A cultura pode ser realizada a uma temperatura, pH e conteúdo de oxigênio adequados para uma dada célula hospedeira. Nenhuma tentativa será feita no presente pedido para descrever em detalhe as várias células hospedeiras procariontes e eucariontes e os métodos conhecidos para a produção de polipeptídeos e vetores em uso na invenção.

[122] De acordo com uma realização específica da invenção, a célula hospedeira pode ser ainda encapsulada. A tecnologia de encapsulação celular é conhecida na técnica.

[123] Ainda um aspecto adicional da presente invenção é um método para a produção recombinante do polipeptídeo da polimerase mutante ou da proteína de fusão da invenção que utiliza os vetores (ou partículas virais infecciosas) e/ou células hospedeiras da invenção. Tipicamente, o método compreende (a) introduzir um vetor na célula hospedeira adequada para produzir uma célula hospedeira transfectada ou infectada, (b) cultivar in vitro a dita célula hospedeira transfectada ou infectada sob condições adequadas para o crescimento da célula hospedeira, (c) recuperar a cultura celular e (d) opcionalmente, purificar o polipeptídeo da polimerase mutante ou da proteína de fusão a partir da célula recuperada e/ou do sobrenadante da cultura.

[124] Espera-se que técnicos no assunto conheçam os vários sistemas de expressão disponíveis na técnica para a expressão do polipeptídeo da polimerase mutante ou da proteína de fusão em células hospedeiras adequadas (como aquelas descritas acima) e os métodos para a introdução de um vetor em uma célula hospedeira. Esses métodos incluem, mas não se limitam a microinjeção, transfecção mediada por CaP04, transfecção mediada por DEAE, eletroporação, lipofecção/fusão de lipossomo, pistola de genes, transdução, infecção viral, bem como administração direta em um organismo hospedeiro através de vários métodos. O vetor da invenção pode ser usado em associação com reagentes de transfecção para facilitar a introdução na célula hospedeira, como os polímeros policatiônicos (por exemplo, quitosana, polimetacrilato, PEI, etc.) e lipídeos catiônicos (por exemplo, DC-Chol/DOPE, transfectamina, lipofectamina, agora disponíveis junto à Promega).

[125] As células hospedeiras podem ser cultivadas em biorreatores de fermentação convencionais, frascos e placas de petri. A cultura pode ser realizada a uma temperatura, pH e conteúdo de oxigênio adequados para uma dada célula hospedeira. O polipeptídeo da polimerase mutante ou a proteína de fusão podem, então, ser purificados por métodos de purificação bem conhecidos, que incluem precipitação por sulfato de amônio, extração ácida, eletroforese em gel; métodos de filtração e cromatográficos (por exemplo, fase reversa, exclusão por tamanho, troca iônica, afinidade, interação hidrofóbica, hidroxiapatita, cromatografia líquida de alto desempenho, etc.). As condições e tecnologia a serem usadas dependem de fatores, como carga líquida, peso molecular, hidrofobicidade, hidrofilicidade, e serão aparentes para os técnicos no assunto. Além disso, o nível de purificação dependerá do uso intencionado.

COMPOSIÇÕES

[126] Em outro aspecto, essa invenção fornece uma composição que compreende pelo menos o polipeptídeo da polimerase mutante ou a proteína de fusão, a molécula de ácido nucleico, o vetor (por exemplo, a partícula viral infecciosa), ou a célula hospedeira descrita no presente pedido (também chamada no presente pedido de “agente ativo”) ou qualquer combinação dos mesmos (por exemplo, a combinação de diferentes polipeptídeos ou vetores/partículas virais, conforme descrito no presente pedido, ou a combinação de diferentes genótipos). Preferencialmente, a composição é uma composição farmacêutica que compreende um veículo farmaceuticamente aceitável, além de uma quantidade terapeuticamente efetiva do(s) agente(s) ativo(s).

[127] Como usado no presente pedido, um “veículo farmaceuticamente aceitável” tem a intenção de incluir qualquer um ou todos os carreadores, solventes, diluentes, excipientes, adjuvantes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes de retardo da absorção e similares, compatíveis com a administração em um organismo hospedeiro e em particular em humanos.

[128] Como usado no presente pedido, uma “quantidade terapeuticamente efetiva” é uma dose suficiente para o alívio de um ou mais sintomas normalmente associados com uma infecção por HBV ou qualquer doença ou condição causada ou associada a uma infecção por HBV. Quanto ao uso profilático, esse termo significa uma dose suficiente para prevenir ou retardar o estabelecimento de uma infecção por HBV. Composições “terapêuticas” são projetadas e administradas a um organismo hospedeiro já infectado por HBV com o objetivo de reduzir ou melhorar pelo menos uma doença ou condição causada por ou associada à dita infecção por HBV, eventualmente em combinação com uma ou mais modalidades terapêuticas convencionais, conforme descrito no presente pedido (por exemplo, tratamento com nucleosídeos, análogos de nucleotídeos e/ou terapia baseada em IFN). Por exemplo, uma quantidade terapeuticamente efetivo para a indução de uma resposta imune poderia ser aquela quantidade necessária para causar ativação do sistema imune (por exemplo, resultando no desenvolvimento de uma resposta anti-HBV).

[129] O termo “organismo hospedeiro” geralmente refere-se a um vertebrado, particularmente, um membro das espécies de mamíferos e, especialmente, animais domésticos, animais de criação, animais de competição e primatas, incluindo humanos, para os quais qualquer produto e método da invenção é necessário ou pode ser benéfico, como organismos que foram diagnosticados como sendo ou estando em risco de estarem infectados por um HBV e, dessa forma, são suscetíveis de ter ou em risco de terem uma doença ou condição causada por ou associada a uma infecção por HBV. Em realizações preferenciais, o organismo hospedeiro é um paciente humano cronicamente infectado com um vírus HBV ou, de maneira alternativa, coinfectado com um vírus HBV e outro vírus (por exemplo, o vírus da imunodeficiência humana, HIV). O HBV infectante pode ser do mesmo genótipo, linhagem ou isolado do HBV do qual se origina o polipeptídeo da polimerase mutante ou qualquer outro polipeptídeo/peptídeo do HBV em uso na presente invenção (por exemplo, genótipo D) ou ele pode ser de um genótipo diferente (por exemplo, genótipo B ou C). A potencial reação cruzada de uma composição de vacina baseada no genótipo D foi recentemente investigada pelos inventores (consulte pedido de patente US 13/423.193). Um amplo estudo in silico ressaltou que as sequências de aminoácidos da polimerase, proteínas núcleo e Env do HBV são altamente conservadas entre os genótipos B, C e D no nível proteico global, mas também no nível do epítopo de células T. A imunização in vivo em um modelo animal adequado suporta a capacidade de induzir respostas de células T de reação cruzada que reconheçam os epítopos dos genótipos B e C. Ainda que esse estudo seja limitado aos epítopos de HLA-A2, ele fornece uma prova do conceito de que uma composição de vacina baseada nos antígenos do genótipo D possa ser capaz de induzir respostas de células T que apresentam reação cruzada com outros genótipos do HBV.

[130] A composição da invenção é adequadamente tamponada para ser adequada para o uso humano a um pH fisiológico ou levemente básico (por exemplo, pH de aproximadamente 7 a aproximadamente 9). Tampões adequados incluem, sem limitação, tampão fosfato (por exemplo, PBS), tampão bicarbonato e/ou tampão Tris.

[131] A composição da invenção pode ainda compreender um diluente adequado para uso humano ou animal. É preferencialmente isotônico, hipotônico ou fracamente hipertônico e tem uma força isotônica relativamente baixa. Exemplos representativos incluem água estéril, salina fisiológica (por exemplo, cloreto de sódio), solução de Ringer, glicose, soluções de trealose ou sacarose, solução de Hank e outras soluções salinas aquosas balanceadas fisiologicamente (consulte, por exemplo, a edição mais recente de Remington: The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro, Lippincott, Williams&Wilkins).

[132] Os veículos adequados farmaceuticamente incluídos na composição da invenção também devem permitir preservar sua estabilidade sob as condições de fabricação e armazenamento em longo prazo (por exemplo, pelo menos um mês com uma preferência por pelo menos um ano) congelados (por exemplo, -70°C, -20°C), refrigerados (por exemplo, 4°C) ou em temperatura ambiente. Sobre esse respeito, as formulações que são especificamente adaptadas à composição da invenção incluem (a) sacarose 1 M, NaCl 150 mM, MgCl2 1 mM, 54 mg/l de Tween 80, Tris 10 mM pH 8,5 (especialmente quando o agente ativo é um vetor adenoviral), (b) 10 mg/ml de manitol, 1 mg/ml de HSA, Tris 20 mM, pH 7,2, e NaCl 150 mM e (c) salina fisiológica.

[133] Excipientes adicionais farmaceuticamente aceitáveis podem ser usados para fornecer propriedades farmacêuticas ou farmacodinâmicas desejadas, incluindo, por exemplo, a alteração ou manutenção do pH, osmolaridade, viscosidade, clareza, cor, esterilidade, estabilidade, taxa de dissolução da formulação, alteração ou manutenção da liberação ou absorção em um organismo humano ou animal, promoção do transporte ao longo da barreira sanguínea ou penetração em um órgão específico (por exemplo, fígado).

[134] Além disso, a composição da invenção pode compreender um ou mais adjuvantes adequados para a aplicação sistêmica ou mucosa em humanos. Preferencialmente, o adjuvante é capaz de estimular a imunidade à composição da invenção, especialmente uma imunidade mediada por células T, por exemplo, através dos receptores semelhantes a pedágio (TLR), como TLR- 7, TLR-8 e TLR-9. Exemplos representativos de adjuvantes úteis incluem, sem limitação, alúmen, emulsão de óleo mineral, como Freunds completo e incompleto (IF A), lipopolissacarídeo ou um derivado do mesmo (Ribi et al., 1986, Immunology and Immunopharmacology of Bacterial Endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, p407-419), saponinas, como QS21 (Sumino et al., 1998, J. Virol. 72: 4931; documento WO 98/56415), compostos imidazoquinolina, como Imiquimod (Suader, 2000, J. Am Acad Dermatol. 43: S6), S-27609 (Smorlesi, 2005, Gene Ther. 12: 1324) e compostos relacionados, como aqueles descritos no documento WO 2007/147529, oligodesoxinucleotídeos de citosina fosfato guanina, como CpG (Chu et al., 1997, J. Exp. Med. 186: 1623; Tritel et al., 2003, J. Immunol. 171: 2358) e peptídeos catiônicos como IC-31 (Kritsch et al., 5 2005, J. Chromatogr Anal. Technol Biomed Life Sci 822: 263).

[135] A composição da presente invenção é adequada para uma série de modos de administração.

[136] O termo “administração” (e qualquer forma de administração, como “administrado”), como usado no presente pedido, refere-se à distribuição de um agente terapêutico, como o polipeptídeo da polimerase mutante, a proteína de fusão, a molécula de ácido nucleico, o vetor descrito no presente pedido em uma célula ou organismo hospedeiro. Uma série de métodos e meios está disponível na técnica, como a administração direta para um organismo hospedeiro.

[137] A administração direta pode ser realizada por vias sistêmica, tópica ou mucosa. A administração sistêmica inclui, por exemplo, subcutânea, intradérmica, intramuscular, intravenosa (por exemplo, injeção em uma veia que alimenta o fígado, como a veia porta), intraperitoneal, intratumoral, intravascular, injeção intrarterial (por exemplo, por infusão da artéria hepática), bem como escarificação. As injeções podem ser realizadas com seringas e agulhas convencionais, ou qualquer outro dispositivo adequado disponível na técnica (por exemplo, eletroporação). De maneira alternativa, a composição da presente invenção pode ser administrada através de via mucosa, como oral/alimentar, intranasal, intratraqueal, intrapulmonar, intravaginal ou intrarretal. A administração no trato respiratório pode ser realizada através de nebulização ou aerossolização de gotas, spray, ou composições secas em pó com o uso de distribuidor adequado. A administração tópica também pode ser realizada com o uso de meios transdérmicos (por exemplo, emplastro e similares).

[138] No contexto da invenção, a composição é preferencialmente formulada para a administração intramuscular, subcutânea, intradérmica ou escarificação.

[139] A composição da invenção pode estar sob várias formas, por exemplo, sólida, líquida ou congelada. Composições sólidas (por exemplo, seca em pó ou liofilizada) podem ser obtidas por um processo que envolve secagem a vácuo e liofilização. Para a administração mucosa, as composições podem ser formuladas como cápsulas e grânulos gastrorresistentes para a administração oral, supositórios para a administração retal ou vaginal, eventualmente em combinação com aprimoradores de absorção úteis para aumentar o tamanho do poro das membranas mucosas. Esses aprimoradores de absorção são tipicamente substâncias com similaridades estruturais aos domínios de fosfolipídeos das membranas mucosas, como deoxicolato sódico, glicocolato sódico, dimetil-beta-ciclodextrina, lauril-1-lisofosfatidilcolina).

[140] A dosagem adequada pode ser adaptada em função de vários parâmetros, em particular ao modo de administração, a composição utilizada; a idade, saúde e peso do organismo hospedeiro; a natureza e extensão dos sintomas; tipo de tratamento simultâneo; a frequência do tratamento e/ou a necessidade de prevenção ou terapia. Refinamentos adicionais dos cálculos necessários para determinar a dosagem adequada para o tratamento são rotineiramente realizados por um profissional à luz das circunstâncias relevantes.

[141] Para orientação geral, a dosagem adequada para uma composição que compreende um vetor varia de cerca de 105a cerca de 1013vp (partículas virais), iu (unidade infecciosa) ou pfu (unidades formadoras de placas), dependendo do vetor e da técnica quantitativa usada. As técnicas disponíveis para avaliar a quantidade de vp, iu e pfu presentes em uma amostra são convencionais na técnica. Por exemplo, o número de partículas adenovirais (vp) é usualmente determinado pela medição da absorbância A260 ou HPLC, titulação de iu por imunofluorescência DBP e pfu por contagem do número de placas após infecção de células permissivas. Preferencialmente, a razão vp/iu é inferior a 100 em concordância com as orientações da FDA. Doses preferenciais contêm cerca de 105a cerca de 1012vp, com uma preferência específica para doses de cerca de 5 x 108, cerca de 109, cerca de 5 x 109, cerca de 1010, cerca de 5 x 1010vp ou cerca de 1011vp de um vetor adenoviral da invenção. Doses de cerca de 5 x 105a cerca de 109pfu são preferenciais para a composição baseada em vaccinia (MVA), com uma preferência específica para doses de cerca de 5 x 106, cerca de 107, cerca de 1 x 107, cerca de 108ou cerca de 5 x 108pfu. Uma composição baseada em plasmídeos vetoriais pode ser administrada em doses entre 10 μg e 20 mg, de maneira vantajosa, entre 100 μg e 2 mg. Uma composição proteica pode ser administrada em uma ou mais doses entre 10 ng e 20 mg, com uma preferência especial por uma dosagem de cerca de 0,1 μg a cerca de 2 mg do polipeptídeo imunogênico por kg de peso corporal. A administração pode ocorrer em uma dose única ou em uma dose repetida uma vez ou várias vezes após um certo intervalo de tempo.

[142] Em outra realização específica, o polipeptídeo da polimerase mutante, proteína de fusão, molécula de ácido nucleico, célula hospedeira ou composição da invenção podem ser usados em combinação com polipeptídeos ou peptídeos, ou vetor que codifica esses polipeptídeos ou peptídeos adicionais. Preferencialmente, o dito polipeptídeo ou peptídeo adicional é um antígeno do HBV com uma preferência específica por um polipeptídeo Hbc e/ou um ou mais domínios imunogênicos HBs, conforme descrito no presente pedido. O polipeptídeo ou peptídeo do HBV pode ser expresso a partir de um vetor, em especial um vetor selecionado a partir do grupo que consiste em DNA plasmidial, vetor adenoviral (por exemplo, Ad5, AdCh3, AdCh63, etc.), vetor poxviral (por exemplo, de vaccinia, como MVA) e vetores de sarampo. Consequentemente, a invenção também se refere a uma composição que compreende uma mistura de um vetor que codifica um polipeptídeo da polimerase mutante ou uma proteína de fusão da invenção e um vetor que codifica pelo menos um polipeptídeo/peptídeo adicional, como core e/ou domínio(s) imunogênico(s) HBs do HBV, conforme descrito no presente pedido.

[143] O polipeptídeo da polimerase mutante, proteína de fusão, molécula de ácido nucleico, célula hospedeira ou composição da invenção podem ser utilizados nos métodos para o tratamento de uma série de doenças e condições patológicas, especificamente aquelas causadas por ou associadas a uma infecção por HBV. Consequentemente, a presente invenção também engloba o polipeptídeo da polimerase mutante, proteína de fusão, molécula de ácido nucleico, vetor, célula hospedeira ou composição da invenção para uso no tratamento ou prevenção de infecções por HBV, doenças e condições patológicas associadas ao HBV, de acordo com as modalidades descritas no presente pedido e, especificamente, a infecção crônica por HBV. A presente invenção também se refere a um método de tratamento de um organismo em necessidade do mesmo, que compreende pelo menos a administração ao dito organismo de pelo menos um desses agentes ativos em uma quantidade suficiente para tratar as infecções por HBV (por exemplo, especificamente a infecção crônica por HBV) ou melhorar um ou mais sintomas relacionados a doenças e condições patológicas associadas ao HBV, de acordo com as modalidades descritas no presente pedido. Em uma realização específica, o(s) agente(s) e método(s) ativo(s) da invenção podem ser utilizados de acordo com as modalidades descritas no presente pedido para quebrar a tolerância imune específica ao HBV, normalmente encontrada em sujeitos com infecção crônica por HBV.

[144] O termo “tratamento” (e qualquer forma de tratamento, como “tratar”), como usado no presente pedido, refere-se a profilaxias (por exemplo, prevenção de um sujeito em risco de ser infectado por HBV) e/ou terapia (por exemplo, um sujeito diagnosticado como estando infectado por um HBV). É especialmente útil para o tratamento de infecção crônica por HBV e/ou de lesões hepáticas em pacientes infectados por HBV, incluindo cirrose e câncer hepático. O tratamento requer a administração externa ou interna a uma célula ou organismo hospedeiro de um agente terapêutico, como o polipeptídeo da polimerase mutante descrito no presente pedido, eventualmente em combinação com outros polipeptídeo(s) do HBV ou com o padrão de cuidado (SOC) (por exemplo, tratamento com nucleosídeos ou análogos de nucleotídeos).

[145] Tipicamente, mediante a administração em um organismo hospedeiro, de acordo com as modalidades descritas no presente pedido, o polipeptídeo da polimerase mutante, proteína de fusão, molécula de ácido nucleico, vetor, célula hospedeira e/ou composição da invenção fornecem um benefício terapêutico para o organismo hospedeiro tratado superior ao status de referência ou ao status esperado se não tratado. O benefício terapêutico pode ser evidenciado por qualquer medida clínica relevante, tipicamente usada por médicos ou outro profissional da área da saúde, incluindo, por exemplo, redução da carga viral do HBV quantificada no sangue, plasma ou soro de um organismo tratado e/ou uma redução do nível da atividade enzimática hepática (por exemplo, alanina aminotransferase (ALT) e/ou aspartato aminotransferase (AST)), e/ou um estado estabilizado (sem agravamento) da doença (por exemplo, estabilização ou decréscimo das condições tipicamente associadas à infecção por HBV, como inflamação/esteatose/fibrose hepática), e/ou a redução do nível de marcadores séricos, como HBeAg ou HBsAg (por exemplo, soroconversão de HBe ou HBs) e/ou uma resposta aprimorada do organismo tratado a terapias convencionais e/ou uma extensão da sobrevida em comparação à sobrevida esperada sem o tratamento.

[146] No contexto da invenção, o benefício terapêutico pode ser transitório (por um ou dois meses após a cessação da administração) ou mantido (por vários meses ou anos). Como o curso natural do status clínico pode variar consideravelmente de um sujeito para outro, não é necessário que o benefício terapêutico seja observado em cada organismo tratado, mas sim em um número significativo de organismos (por exemplo, diferenças estatisticamente significativas entre dois grupos podem ser determinadas por qualquer teste estatístico conhecido na técnica, como teste paramétrico de Tukey, teste Kruskal-Wallis, teste U de acordo com Mann e Whitney, teste t de Student, teste Wilcoxon, etc.).

[147] Essas medidas podem ser realizadas antes da administração do descrito no presente pedido (nível basal) e a vários pontos durante o tratamento e pelo menos por 12 semanas após a interrupção do tratamento. Para orientação geral, a carga viral pode ser determinada com o uso de um ensaio de PCR quantitativo ou qualquer outra metodologia aceita na técnica (por exemplo, ensaio Roche Ampli Prep/Cobas taqman v2.0, ensaio em tempo real do desempenho do vírus da hepatite B Abbott). Em realizações preferenciais, a administração do polipeptídeo da polimerase mutante, proteína de fusão, molécula de ácido nucleico, célula hospedeira e/ou composição da invenção resulta em uma redução da carga viral, se transitória ou mantida, de pelo menos 1 log10, preferencialmente pelo menos 1,5 log10e, com mais preferência, pelo menos 2 log10em comparação com a carga viral medida na linha basal ou em comparação ao grupo controle (sujeitos não tratados). A administração do(s) agente(s) ativo(s) descrito(s) no presente pedido pode resultar em pelo menos um retorno transitório aos valores de ALT e/ou AST normais em comparação à linha basal ou ao grupo controle. Os níveis da atividade enzimática hepática podem ser avaliados rotineiramente em laboratórios médicos ou hospitais. De maneira alternativa, a administração de agente(s) ativo(s) descrito(s) no presente pedido resulta em pelo menos uma redução transitória do marcador sérico Hbe e/ou HBs de pelo menos 1 log10, preferencialmente, de 1,5 log10e, com mais preferência, de 2 log10em comparação ao nível de marcador sérico medido na linha basal ou em comparação ao grupo controle (sujeitos não tratados). Os níveis do marcador sérico do HBV podem ser avaliados rotineiramente em laboratórios médicos e hospitais e um grande número de kits está disponível comercialmente (por exemplo, imunoensaios desenvolvidos pela Abbott Laboratories, Organon Technika).

[148] Preferencialmente, o polipeptídeo da polimerase mutante, proteína de fusão, molécula de ácido nucleico, célula hospedeira e/ou composição da invenção são usados ou administrados para induzir ou estimular uma resposta imune no organismo tratado. Consequentemente, a presente invenção também engloba um método para induzir ou estimular uma resposta imune contra HBV mediante a administração no organismo hospedeiro do polipeptídeo da polimerase mutante, proteína de fusão, molécula de ácido nucleico, vetor, célula hospedeira e/ou composição da invenção.

[149] A resposta imune induzida ou estimulada pode ser específica (isto é, direcionada a epítopos/antígenos do HBV) e/ou não específica (inata), humoral e/ou celular. No contexto da invenção, a resposta imune é preferencialmente uma resposta de células T mediada por CD4+ ou por CD8+, ou ambas, dirigidas a um polipeptídeo/epítopo do HBV.

[150] A capacidade do(s) agente(s) ativo(s) descritos no presente pedido para induzir uma resposta imune pode ser avaliada in vitro ou in vivo com o uso de uma série de ensaios diretos e indiretos que são padrões na técnica. O teste e a validação também são ilustrados na seção de Exemplos anexa.

[151] Para uma descrição geral das técnicas disponíveis para avaliar o início e ativação de uma resposta imune, consulte, por exemplo, Coligan et al., (1992 e 1994, Current Protocols in Immunology; Ed. J Wiley & Sons Inc, National Institute of Health, ou edições subsequentes). A capacidade para estimular uma resposta humoral pode ser determinada pela ligação ao anticorpo e/ou competição na ligação (consulte, por exemplo, Harlow, 1989, Antibodies, Cold Spring Harbor Press).

[152] A avaliação da imunidade não específica pode ser realizada, por exemplo, pela medição das células NK/NKT (por exemplo, representatividade e nível de ativação), bem como das citocinas relacionadas a IFN e/ou das cascatas de produção de quimiocina, ativação de TLRs e outros marcadores da imunidade inata (Scott-Algara et al., 2010 PLOS One 5(1), e8761; Zhou et al., 2006, Blood 107, 2461-2469; Chan, 2008, Eur. J. Immunol. 38, 29642968).

[153] A avaliação da imunidade celular pode ser realizada, por exemplo, pela quantificação das citocinas produzidas pelas células T ativas, incluindo aquelas derivadas das células CD4+ e CD8+ com o uso de bioensaios de rotina (por exemplo, caracterização e/ou quantificação de células T por ELISpot, citometria de fluxo de multiparâmetros ou ICS, análise do perfil de citocina com uso de tecnologias multiplex ou ELISA), pela determinação da capacidade proliferativa de células T (por exemplo, ensaios de proliferação de células T por ensaio de incorporação de [3H] timidina, pelo ensaio da capacidade citotóxica de linfócitos T antígeno-específicos em um sujeito sensibilizado ou por imunização de modelos animais adequados.

[154] A capacidade imunogênica do polipeptídeo da polimerase mutante, proteína de fusão, molécula de ácido nucleico, vetor, célula hospedeira e/ou composição da invenção também pode ainda ser validada em modelos animais, que podem ser desafiados por um agente infeccioso ou indutor tumoral adequado (por exemplo, um vírus de vaccinia ou uma bactéria Listeria Monocytogenes que expressa produtos do gene HBV) ou injetado por um DNA que codifica o genoma inteiro do HBV (conforme descrito em Huan et al., 2010, Proc. Natl. Acad. Sci. 107: 9340 para determinar a neutralização do agente infeccioso ou indutor tumoral e eventualmente a resistência parcial aos sintomas associados que refletem uma indução ou um aprimoramento de uma resposta imune anti-HBV. Modelos animais exemplares incluem, sem limitação os camundongos transgênicos HLA-A2.1 descritos em Exemplos e camundongos HBV transgênicos, como aqueles descritos em Chisari et al., (1996, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 206: 149) e Halverscheid et al. (2008, J. Med. Virol. 80: 583).

[155] O dito uso ou método compreende uma ou mais administrações (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) de uma quantidade terapeuticamente efetiva dos ditos agentes ativos, as ditas administrações sendo separadas uma das outras por um período adequado de tempo e sendo realizadas pela mesma via de administração ou por vias diferentes de administração no mesmo local ou em locais diferentes. As vias intramuscular e subcutânea são especificamente preferenciais no contexto da invenção. Três administrações subcutâneas separadas uma das outras por, aproximadamente, uma semana são especificamente adequadas para as composições e vetores baseados em MVA, enquanto uma ou duas administrações intramusculares ou subcutâneas são, especificamente, adequadas para composições e vetores baseados em Ad que podem ser separadas uma da outra por, aproximadamente, um mês ou mais. A primeira série de administrações pode ser seguida por uma ou mais administrações consecutivas com o uso do(s) mesmo(s) agente(s) ativo(s) dois ou vários meses após de modo a recordar a resposta imune anti- HBV.

[156] Se desejável, o método ou uso da invenção pode ser realizado em combinação com uma ou mais modalidades terapêuticas convencionais (por exemplo, radiação, quimioterapia e/ou cirurgia). Preferencialmente, o método ou uso da invenção está associado a uma ou mais drogas que estão disponíveis para o tratamento e prevenção de infecções por HBV, doenças e condições patológicas associadas ao HBV. A administração das mesmas pode preceder, ser concomitante ou subsequente à administração do agente ativo da invenção. Exemplos representativos de drogas adequadas incluem, sem limitação inibidores de polimerase, inibidores de Rnase H, análogos de nucleosídeos, análogos de nucleotídeos, agonistas de TLR, IFN, inibidores de N-glicosilação, siRNA, oligonucleotídeos antisense, anticorpos anti- HBV, moduladores imunes, vacinas terapêuticas e agentes antitumorais normalmente usados no tratamento de cânceres hepáticos associados ao HBV (por exemplo, adriamicina, adriamicina com lipiodol ou sorafenibe). Além disso, os agentes ativos também podem ser usados em combinação com outras vacinas terapêuticas, como peptídeos sintéticos, antígenos recombinantes, VLPs, vetores que codificam proteínas do HBV (core, preSl, PreS2, S e/ou polimerase) que são especificamente adequadas para desencadear uma resposta humoral anti-HBV. Um método ou uso especificamente adequado, de acordo com a invenção, é a combinação com padrão de cuidado e, especialmente, tratamento com citocinas (por exemplo, INF-alfa, IFNa2a ou 2b peguiladas, como Pegasys (Roche), Pegintron (Schering Plough) ou IntronA (Schering Plough)) e/ou com nucleotídeos ou análogos de nucleosídeos (NUCs), como lamivudine, entecavir, telbivudine, adefovir, dipivoxil ou tenofovir. O tratamento com NUCs somente é parcialmente efetivo (a resolução da infecção é observada em somente 3 a 5% dos sujeitos após 1 ano de tratamento) e requer terapia em longo prazo (pode ser para a vida toda). Espera-se que os agentes ativos e métodos da invenção tragam uma dimensão imune que permita complementar a ação de NUCs na replicação viral, resultando assim em um aprimoramento desses tratamentos (por exemplo, por doses decrescentes de NUCs ou duração do tratamento de NUC necessário para atingir um benefício terapêutico) ou um aumento da porcentagem de resolução da infecção (maior do que 5%).

[157] Em uma realização específica, o método ou uso da invenção pode ser realizado de acordo com a modalidade de reforço de primer que compreende administrações sequenciais de uma ou mais composições de preparação (priming) e uma ou mais composições de reforço. Tipicamente, as composições de priming e de reforço usam diferentes vetores que compreendem ou codificam pelo menos um domínio antigênico em comum. Além disso, as composições de priming e de reforço podem ser administradas ao mesmo sítio ou em sítios alternativos pela mesma via ou por vias diferentes de administração. Por exemplo, as composições baseadas em polipeptídeo podem ser administradas por uma via mucosa, enquanto as composições baseadas em vetores são preferencialmente injetadas, por exemplo, injeção subcutânea por um vetor MVA, injeção intramuscular por um plasmídeo de DNA ou injeção intramuscular por um vetor adenoviral.

[158] Em uma realização, a preparação (priming) é realizada com um vetor MVA e o reforço com um vetor Ad, com uma preferência específica pelo vetor MVA e/ou Ad que codifica uma proteína polimerase mutante ou uma proteína de fusão descrita no presente pedido, por exemplo, a proteína de fusão de SEQ ID NO: 8. O vetor MVA é administrado ao organismo uma ou mais vezes, seguido pela administração do vetor adenoviral uma ou mais vezes, com uma preferência específica por pelo menos 3 administrações subcutâneas do vetor MVA separadas por um período de tempo que varia de 3 dias a 3 meses, seguido por um reforço intramuscular ou subcutâneo do vetor adenoviral (por exemplo, de aproximadamente um mês a um ano após o primeiro MVA).

[159] Em outra realização, a preparação (priming) é realizada com um DNA plasmidial e o reforço com um vetor MVA, com uma preferência específica para o plasmídeo e/ou vetor MA que codifica uma proteína polimerase mutante ou uma proteína de fusão descrita no presente pedido, por exemplo, a proteína de fusão de SEQ ID NO: 8). O vetor de DNA é administrado ao organismo uma ou mais vezes, seguido pela administração do vetor MVA uma ou mais vezes, com uma preferência específica por pelo menos 3 administrações intramusculares do vetor de DNA separadas por um período de tempo que varia de 2 semanas a 3 meses e pelo menos um reforço subcutâneo do vetor MVA (por exemplo, de aproximadamente um mês a um ano após o primeiro DNA). Preferencialmente, o vetor de DNA é administrado por meio de eletroporação.

[160] A presente invenção também se refere a um kit de partes para uso no tratamento de uma infecção ou uma doença ou condição patológica associada ao HBV, em que o dito kit compreende uma série de agentes ativos selecionados do grupo que consiste do polipeptídeo da polimerase mutante, proteína de fusão, molécula de ácido nucleico, vetor, célula hospedeira e/ou composição da invenção e instruções para a administração da dita série de agentes ativos a um organismo em necessidade dos mesmos. Mais preferencialmente, o organismo é um paciente cronicamente infectado por HBV.

[161] Todas as divulgações acima citadas de patentes, publicações e entradas de dados são integralmente incorporadas ao presente pedido como referência na mesma medida como se cada patente, publicação ou entrada individual estivesse específica e individualmente indicada a ser incorporada como referência.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[162] A Figura 1 ilustra os polipeptídeos polimerase mutantes, proteínas de fusão e combinações antigênicas descritas na invenção.

[163] A Figura 2 ilustra os ensaios ElLISpot IFNY realizados após imunização de camundongos transgênicos HLA-A2 com plasmídeos pTG18188 (Core-Pol-Envl-Pol-Env2-Pol), pTG18194 (Core-Pol) ou pTG13135 (vazio). Os resultados estão representados como o número de pontos para 106 células correspondente à frequência de células produtoras de IFNY específicas a cada peptídeo HLA-A2 do HBV avaliado no experimento para 106 células de baço de camundongos imunizados. Cada barra representa um camundongo individual vacinado por um ou pelo outro plasmídeo e indicado por seu número de referência (1.1 ou 2.3 ... etc) e a média de todos os camundongos imunizados com o mesmo plasmídeo também está representada para cada grupo (a barra indicada como “média” no gráfico). Para camundongos individuais e médias, as frequências de células produtoras de IFNy específicas aos diferentes peptídeos testados são acumuladas. As barras são preenchidas com diferentes símbolos, cada símbolo representa a resposta contra um peptídeo do HBV específico como indicado pela legenda no gráfico.

[164] As Figuras 3A a F ilustram os ensaios ICS realizados após imunização de camundongos transgênicos HLA-A2 com plasmídeos pTG18188 (Core-P-E1-P-E2-P ou Core-Pol-Envl-Pol-Env2-Pol), pTG18194 (Core-Pol) ou pTG13135 (vazio). Os resultados estão apresentados como a porcentagem de células T CD8 (Figuras 3A, 3B, 3D e 3F) ou CD4 (Figuras 3C e 3E) que produzem IFNY(sozinho ou combinado com TNFα) específicas a cada peptídeo HLA-A2 do HBV (Figura 3A) ou a combinação de peptídeos que cobrem os antígenos core (Figuras 3B e 3C), polimerase (Figuras 3D e 3E) e env (Figura 3F) do HBV. Cada barra representa um camundongo individual vacinado por um ou pelo outro plasmídeo e indicado por seu número de referência (1.1 ou 2.3 ... etc) e a média de todos os camundongos imunizados com o mesmo plasmídeo também está representada para cada grupo (a barra indicada como “média” no gráfico). Para camundongos individuais e médias, as frequências de células T CD8 ou CD4 específicas a cada diferente peptídeo testado são acumuladas. As barras são preenchidas com diferentes símbolos, cada símbolo representa a resposta contra um peptídeo do HBV específico conforme indicado pela legenda no gráfico.

[165] A Figura 4 ilustra os ensaios ELISpot IFNYrealizados após imunização de camundongos transgênicos HLA-A2 com adenovírus AdTG 18201 (Core-Pol-Env Ad), AdTG18202 (Core-Pol Ad), AdTG18203 (Pol Ad) e AdTG15149 (Ad vazio). Os resultados estão representados como o número de pontos para 106 células correspondente à frequência de células produtoras de IFNy específicas a cada combinação de peptídeo que cobre o antígeno de interesse avaliado no experimento para 106 células de baço de camundongos imunizados. Cada barra representa um camundongo individual vacinado por um ou pelo outro plasmídeo e indicado por seu número de referência (1.1 ou 2.3 ... etc) e a média de todos os camundongos imunizados com o mesmo plasmídeo também está representada para cada grupo (a barra indicada como “média” no gráfico). Para camundongos individuais e médias, as frequências de células produtoras de IFNy específicas aos diferentes peptídeos testados são acumuladas. As barras são preenchidas com diferentes símbolos, cada símbolo representa a resposta contra um peptídeo do HBV específico conforme indicado pela legenda no gráfico.

[166] A Figura 5 ilustra os ensaios ELISpot IFNY realizados após imunização de camundongos transgênicos HLA-A2 com AdTG 18201 (Core-Pol- Env Ad). Os resultados estão representados como o número de pontos para 106 células correspondente à frequência de células produtoras de IFNY específicas a cada epítopo HLA-A2 do HBV ou de um peptídeo irrelevante avaliado no experimento para 106 células de baço de camundongos imunizados. Cada barra representa um camundongo individual vacinado pelo AdTG 18201 (indicado por seu número de referência, 3.1 a 3.8) e a mediana de todos esses camundongos imunizados com AdTG18201 também está representada (a barra indicada como “mediana” no gráfico). Para camundongos individuais e medianas, as frequências de células produtoras de IFNy específicas aos diferentes epítopos HLA-A2 do HBV são acumuladas, enquanto a frequência de células produtoras de IFNy observada na presença de um peptídeo irrelevante é representada em uma barra separada (indicada como “Irrel” no gráfico para cada camundongo). As barras são preenchidas com diferentes símbolos, cada símbolo representa a resposta contra um peptídeo do HBV específico conforme indicado pela legenda no gráfico.

[167] A Figura 6 ilustra os ensaios ICS realizados após imunização de camundongos HLA-A2 com AdTG18201 (Core-Pol-Env Ad) ou AdTG15149 (Ad vazio). Os resultados estão representados como a porcentagem de células T CD8 que produzem IFNy sozinho ou em combinação com TNFα específicas das duas combinações de peptídeos selecionadas, chamadas PP8 e PCI, e que cobrem respectivamente uma parte da polimerase de HBV (aminoácidos 725 a 835) e uma parte da proteína core do HBV (aminoácidos 1 a 100). Cada barra representa um camundongo individual vacinado por um ou pelo outro adenovírus e indicado por seu número de referência (1.1 ou 3.2... etc) e a mediana de todos esses camundongos imunizados com o mesmo adenovírus também está representada (a barra indicada como “mediana” no gráfico). As barras são preenchidas com diferentes símbolos, cada símbolo representa a(s) citocina(s) produzida(s) pelas células T CD8 detectadas conforme indicado pela legenda no gráfico.

[168] A Figura 7 ilustra os ensaios CLT in vivo realizados após imunização de camundongos HLA-A2 com AdTG18201 (Core-Pol-Env Ad) ou AdTG15149 (Ad vazio). Os resultados estão representados como a porcentagem de lise específica in vivo, isto é, a lise específica dos epítopos HLA-A2 do HBV que foram testados. Cada quadrado ou triângulo representa um camundongo individual e a média de todos os camundongos imunizados com o mesmo adenovírus também está representado para cada grupo (representado por uma barra espessa no gráfico).

[169] A Figura 8 ilustra os ensaios ICS realizados após imunização de camundongos transgênicos HLA-A2 com AdTG18201 (Core-Pol- Env Ad) ou AdTG15149 (Ad vazio). Os resultados estão representados como a porcentagem de células T CD8 que produzem tanto IFNYcomo TNFα específicas dos epítopos da polimerase de HBV (mistura de 2 peptídeos, chamados VSA e N13F) ou do envelope do HBV (1 epítopo chamado F13L) e encontrados no baço e fígado dos camundongos vacinados. Cada barra representa um camundongo individual vacinado por um ou pelo outro adenovírus e indicado por seu número de referência (1.1 ou 3.2... etc.) e a mediana de todos os camundongos imunizados com o mesmo adenovírus também está representada para cada grupo (a barra indicada como “mediana” no gráfico). A linha pontilhada representada no gráfico corresponde ao corte do experimento, isto é, o limiar acima do qual a porcentagem de células T CD8 é considerada como uma resposta imune positiva.

[170] A Figura 9 ilustra os ensaios de ELISpot IFNy realizados após imunização de camundongos transgênicos HLA-A2 com AdTG18201 (Core-Pol- Env Ad) com diferentes doses, de 105 a 109 iu. Os resultados estão representados como o número de pontos para 106células que corresponde à frequência de células produtoras de IFNYespecíficas a cada epítopo HLA-A2 do HBV, ou de um peptídeo irrelevante, ou na presença de meio apenas, avaliada no experimento para 106 células de baço de camundongos imunizados. Cada barra sólida ou pontilhada representa um camundongo individual vacinado por AdTG18201, e a média de todos os camundongos imunizados com AdTG18201 a uma dose específica também está representada (barras hachuradas). As diferentes doses estão representadas por diferentes cores ou símbolos, conforme indicado pela legenda no gráfico. A linha pontilhada representa o valor de corte, definido conforme descrito em Materiais e Métodos, acima da qual as respostas de células T são consideradas positivas.

[171] A Figura 10 ilustra os ensaios de ELISpot IFNy realizados após imunização de camundongos transgênicos HLA-A2 com AdTG18201 (Core-Pol-Env Ad) de acordo com diferentes cronogramas de injeções. Os camundongos foram imunizados tanto uma vez (quadrados) como receberam 3 injeções a um intervalo de 1 semana (triângulos) ou 6 injeções a um intervalo de 1 semana (círculos). Os resultados estão representados como o número de pontos para 106 células que corresponde à frequência de células produtoras de IFNy específicas a cada epítopo HLA-A2 do HBV, ou ao vetor adenoviral ou a um peptídeo irrelevante, ou na presença de meio apenas, avaliada no experimento para 106 células de baço de camundongos imunizados. Cada símbolo (quadrado, triângulo ou círculo) representa um camundongo individual vacinado com AdTG18202, e a média de todos os camundongos imunizados com AdTG18202 com um dos cronogramas testados está representada por uma linha sólida espessa. A linha pontilhada representa o valor de corte, definido conforme descrito em Materiais e Métodos, acima da qual as respostas de células T são consideradas positivas.

[172] A Figura 11 ilustra os ensaios de ELISpot IFNY realizados após imunização de camundongos transgênicos HLA-A2 com AdTG18202 (Core-Pol-Env Ad) de acordo com diferentes cronogramas de injeções. Os camundongos foram imunizados tanto uma vez antes do monitoramento das respostas de células T (grupo 1 representado pelos quadrados) ou uma vez 20 semanas antes do monitoramento das respostas de células T (grupo 2 representado pelos triângulos) como duas vezes a um intervalo de 2 meses (grupo 3 representado por círculos) ou duas vezes a um intervalo de 4 meses (grupo 4 representado por cruzes) ou três vezes a um intervalo de 2 meses (grupo 5 representado por losangos). Para todos os grupos, diferente de pelo grupo 2, as respostas de células T foram monitoradas duas semanas após a última injeção. Os resultados estão representados como o número de pontos para 106 células correspondente à frequência de células produtoras de IFNy específicas a cada epítopo HLA-A2 do HBV ou a um peptídeo irrelevante ou na presença de meio apenas, avaliada no experimento para 106 células de baço de camundongos imunizados. Cada símbolo (quadrado, triângulo, círculo, cruz ou losango) representa um camundongo individual vacinado com AdTG18202, e a média de todos os camundongos imunizados com AdTG18202 com um dos cronogramas testados está representada por uma linha sólida espessa. A linha pontilhada representa o valor de corte, definido conforme descrito em Materiais e Métodos, acima da qual as respostas de células T são consideradas positivas.

EXEMPLOS 1. MATERIAIS E MÉTODOS

[173] As construções descritas abaixo (consulte Figura 1) são realizadas de acordo com as técnicas gerais de elaboração genética e clonagem molecular detalhadas em Maniatis et al., (1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY ou edições posteriores) ou de acordo com as recomendações do fabricante quando um kit comercial é usado. As técnicas de amplificação por PCR são conhecidas a um técnico no assunto (consulte, por exemplo, PCR protocols - A guide to methods and applications, 1990, publicado por Innis, Gelfand, Sninsky and White, Academic Press). Os plasmídeos recombinantes que carregam o gene de resistência a ampicilina são replicados em E. coli C600 (Stratagene) em ágar ou meio líquido suplementado com 100 μg/ml de antibiótico.

[174] A construção do vetor MVA é realizada por recombinação homóloga entre um plasmídeo ponte e o genoma MVA, conforma previamente descrito em Erbs et al., (2008, Cancer Gene Ther. 15: 18). O plasmídeo ponte “básico” contém um sítio de clonagem múltiplo, um promotor do vírus da vaccinia (VV) cercado por sequências adjacentes de deleção III, bem como o gene de seleção xantina-guanina fosforibosil-transferase (GPT) de E. coli sob o controle do promotor pi 1K7.5 de vaccinia (Falkner e Moss, 1988). Brevemente, as células CEF foram infectadas com um MVA genômico sem qualquer transgene inserido (MVA-null) e, então, transfectadas por precipitação de CaCl2 com o plasmídeo ponte que carrega o gene de interesse clonado a jusante do promotor VV. A recombinação homóloga ocorreu entre MVA-null e o plasmídeo ponte, e os vírus recombinantes foram isolados pelas múltiplas etapas de seleção por ácido micofenólico. Os vírus MVA recombinantes foram controlados por PCR, amplificados em CEF e os estoques virais foram titulados em CEF por ensaio de placa.

[175] Para a construção do vetor adenoviral, um plasmídeo ponte adenoviral é primeiro construído pela inserção da molécula de ácido nucleico de interesse no plasmídeo ponte “básico” pTG13135. Tipicamente, a molécula de ácido nucleico é inserida nos sítios de restrição Nhel e Notl de pTG13135 contendo um cassete de expressão dirigido por CMV cercado por sequências adenovirais (nucleotídeos adenovirais 1 a 454 e nucleotídeos 3513 a 5781, respectivamente) para permitir geração adicional do genoma vetorial por recombinação homóloga (Chartier et al., 1996, J. Virol. 70:4805). O vetor adenoviral é, então, obtido por recombinação homóloga entre o vetor ponte recombinante digerido por Bst 11071 e Pad e pTG15375 (que codifica o genoma adenoviral completo) linearizado pela digestão por Clal. O vetor adenoviral resultante apresenta deleção de E3 (nucleotídeos 27867 a 30743) e E1 (nucleotídeos 455 a 3512), com a região E1 sendo substituída pelo cassete de expressão que contém, de 5’ a 3’, o aprimorador/promotor precoce imediato de CMV, um íntron β-globina/IgG humano quimérico (conforme encontrado no vetor pCI disponível junto a Promega), a molécula de ácido nucleico de interesse e o sinal de poliadenilação tardio de SV40. As partículas adenovirais são então obtidas pela transfecção do genoma viral linearizado por Pad em uma linhagem celular com complementação de E1. A propagação, purificação e titulação viral são realizadas conforme descrito previamente (Erbs et al., 2000, Cancer Res. 60:3813).

175.1. CONSTRUÇÕES E PRODUÇÃO VETORIAIS

[176] Os vetores ilustrados daqui em diante foram elaborados geneticamente para expressar o polipeptídeo polimerase mutante, eventualmente, fusionado ao polipeptídeo core e/ou aos domínios imunogênicos da proteína do envelope. Todas as sequências do HBV se originam da linhagem do HBV Y07587, cuja sequência está descrita no banco de dados internacional (Genbank Y07587) e em diferentes publicações. É um vírus de genótipo D de sorotipo ayw.

[177] Os exemplos a seguir ilustram a fusão de um polipeptídeo core truncado (aa 1 a 148) com um polipeptídeo polimerase mutante (designado Pol*) que compreende duas deleções internas (das posições 538 a 544 e das posições 710 a 742) e 4 substituições de aminoácidos (D689H, V769Y, T776Y e D777H, respectivamente) conforme representado em SEQ ID NO: 6, bem como uma fusão maior que compreende adicionalmente dois domínios Env imunogênicos (Envl e Env2, respectivamente, que se estendem dos aminoácidos 14 a 51 e dos aminoácidos 165 a 194 da proteína HBs) inseridos no lugar das regiões de pol deletadas, conforme representado em SEQ ID NO: 8.

1.1.1. CONSTRUÇÃO E PRODUÇÃO DE VETORES PLASMIDIAIS E ADENOVIRAIS QUE EXPRESSAM A PROTEÍNA DE FUSÃO CORE-POL*-ENYL-ENV2 (OU CORE-POL-ENYL- POL-ENV2-POL) TRUNCADA

[178] Um gene sintético (3024 nucleotídeos descritos em SEQ ID NO: 15) que codifica a proteína de fusão Core-Pol*-Envl-Env2 truncada (a sequência de aminoácidos está mostrada em SEQ ID NO: 8) foi sintetizado pelo GENEART (Regensburg, Alemanha). O fragmento sintético foi inserido nos sítios de restrição Nhel e Notl do plasmídeo ponte pTG13135, fornecendo pTG18188. Um vetor adenoviral foi, então, obtido por recombinação homóloga entre pTG18188 digerido por Bst11071 e Pad e pTG15375 linearizado por Clal. O vetor adenoviral resultante pTG18201 apresenta deleção de E3 e E1, com a região E1 substituída pelo cassete de expressão contendo a sequência sintética que codifica Core-Pol*-Envl-Env2 truncada dirigida pelo promotor de CMV. As partículas adenovirais (AdTG18201) foram obtidas pela transfecção do genoma viral linearizado por Pad na linhagem celular com complementação de E1.

1.1.2. CONSTRUÇÃO E PRODUÇÃO DE VETORES PLASMIDIAIS E ADENOVIRAIS QUE EXPRESSAM CORE-POL* TRUNCADA

[179] Um gene sintético (2820 nucleotídeos descritos em SEQ ID NO: 14) que codifica uma proteína de fusão Core-Pol* truncada foi sintetizado pela GENEART (Regensburg, Alemanha). O fragmento sintético foi inserido nos sítios de restrição Nhel e Notl do plasmídeo ponte pTG13135, fornecendo pTG18194. Um vetor adenoviral foi, então, obtido por recombinação homóloga entre pTG18194 digerido por Bst11071 e Pad e pTG15375 linearizado por Clal. O vetor adenoviral resultante pTG18202 apresenta deleção de E3 e E1, com a região E1 substituída pelo cassete de expressão contendo a sequência sintética que codifica Core-Pol* truncada dirigida pelo promotor de CMV. As partículas adenovirais (AdTG18202) foram obtidas pela transfecção do genoma viral linearizado por Pad na linhagem celular com complementação de E1.

1.1.3. CONSTRUÇÃO E PRODUÇÃO DE VETORES PLASMIDIAIS E ADENOVIRAIS QUE EXPRESSAM POL*

[180] Um gene sintético (2379 nucleotídeos descritos em SEQ ID NO: 13) que codifica o polipeptídeo mutante Pol foi sintetizado pela GENEART (Regensburg, Alemanha). O fragmento sintético foi inserido nos sítios de restrição Nhel e Notl do plasmídeo ponte pTG13135, fornecendo pTG18195. Um vetor adenoviral foi, então, obtido por recombinação homóloga entre pTG18195 digerido por Bst 11071 e Pad e pTG15375 linearizado por digestão por Clal. O vetor adenoviral resultante pTG18203 apresenta deleção de E3 e E1, com a região E1 substituída pelo cassete de expressão contendo a sequência sintética que codifica Pol* dirigida pelo promotor de CMV. As partículas adenovirais (AdTG18203) foram obtidas pela transfecção do genoma viral linearizado por Pad na linhagem celular com complementação de E1.

1.2. AVALIAÇÃO DA IMUNOGENICIDADE EM UM MODELO DE CAMUNDONGO

[181] A imunogenicidade do antígeno foi avaliada in vivo por ensaios para ELISpot IKNY e coloração da citocina intracelular (ICS) seguido por imunização de camundongos transgênicos HLA.

1.2.1 MODELO DE CAMUNDONGO

[182] Os camundongos transgênicos HLA-A2 usados no estudo foram descritos por Pascolo et al., (1997, J. Exp. Med. 185:2043). Esses camundongos têm genes de microglobulina H-2Db e β2 de murinos silenciados e expressam uma molécula de histocompatibilidade de classe I de monocadeia transgênica (molécula HHD), na qual o C-terminal de β2in humano está covalentemente ligado ao N-terminal de uma cadeia pesada quimérica (domínios transmembrana e intracitoplasmático HLA-A*0201 al-a2, H-2Db a3). Camundongos com 7 a 10 semanas de vida (machos e fêmeas) foram imunizados. O peso médio dos camundongos é de cerca de 25 a 30 g.

[183] Os camundongos HBV transgênicos usados no estudo foram descritos por Halverscheid et al. (2008, J. Med. Virol. 80: 583-590) e, gentilmente, fornecidos por Reinhold Schirmbeck. Esses camundongos são de uma base genética C57B1/6J e transgênicos para o genoma HBV (1,4 cópia do genoma HBV com uma mutação na posição 1438 (T por C) que evita a expressão da forma menor da proteína HBsAg e inibe a formação das partículas infecciosas do HBV). Camundongos com 10 a 16 semanas de vida (machos e fêmeas) foram imunizados. O peso médio dos camundongos é de cerca de 25 a 30 g.

183.1.2. PROTOCOLOS DE IMUNIZAÇÃO 1.2.2.1 PROTOCOLOS DE IMUNIZAÇÃO DO DNA

[184] Os protocolos de imunização do DNA foram realizados para avaliar a imunogenicidade de diferentes proteínas de fusão codificadas pelos plasmídeos ilustrados no Exemplo 1.1. O DNA usado para a imunização foi produzido em condições livres de endotoxina. Os camundongos foram imunizados duas vezes a um intervalo de 15 dias de 100 μg/injeção de cada plasmídeo testado através da via intramuscular no músculo anterior tibial. Uma injeção de cardiotoxina foi realizada antes da primeira injeção de DNA para favorecer a imunogenicidade do DNA. A resposta imune celular foi avaliada 15 dias após a última injeção de DNA.

1.2.2.2 PROTOCOLOS DE IMUNIZAÇÃO COM ADENOVÍRUS

[185] Os protocolos de imunização com adenovírus foram realizados para comparar a imunogenicidade de diferentes proteínas de fusão codificadas pelos vetores Ad que foram produzidos como descrito no Exemplo 1.1. Os camundongos foram imunizados uma vez com o adenovírus que codifica as diferentes proteínas de fusão (108 iu/camundongo/injeção) através da via subcutânea na base da cauda. A resposta imune celular foi avaliada 15 dias após a injeção com adenovírus.

[186] Diferentes doses de adenovírus também foram avaliadas com AdTG18201. Os camundongos foram imunizados uma vez com 105, 106, 107, 108 ou 109 iu de AdTG 18201 por via subcutânea na base da cauda.

[187] Os diferentes cronogramas de imunização também foram testados com AdTG18202 e os camundongos foram injetados uma, duas, três ou 6 vezes a intervalos de tempo diferentes. Cada injeção foi realizada com 108 iu/camundongo através da via subcutânea na base da cauda. Uma, três ou seis injeções a um intervalo de 1 semana foram comparados lada a lado. Uma injeção 2 ou 20 semanas antes do tempo de monitoramento das respostas de célula T induzidas, 2 injeções a um intervalo de 2 ou 4 meses e 3 injeções a um intervalo de 2 meses também foram comparados lada a lado.

1.2.3 PEPTÍDEOS

[188] Os peptídeos usados para a estimulação das células in vitro são tanto peptídeos curtos de 9 a 10 aminoácidos, que estão descritos ou previstos como epítopos restritos a HLA-A2, como epítopos longos de 15 aminoácidos incluídos em bibliotecas de peptídeos que cobrem todos os antígenos de interesse.

[189] Os peptídeos curtos correspondentes aos epítopos restritos a HLA-A2 descritos ou previstos da proteína core, proteína Pol ou domínios Env foram sintetizados por Eurogentec (Bélgica) e foram dissolvidos em DMSO 100% (Sigma, D2650) a uma concentração de 10 mM.

[190] As bibliotecas de peptídeos que cobrem os domínios inteiros de core, Pol e envelope foram sintetizadas por Prolmmune (Oxford, Reino Unido). As bibliotecas de core, Pol e Env eram compostas de peptídeos de 15 mer sobrepostos por 11 aminoácidos. Cada peptídeo bruto foi dissolvido em DMSO 100% (Sigma, D2650) a uma concentração de 50 mg/ml. Para cada biblioteca, os peptídeos foram combinados a uma concentração de 2 mg/ml por peptídeo: - Proteína core do HBV foi coberta por 2 combinações de 21 e 22 peptídeos (Combinação 1 (PC1): 22 peptídeos que cobrem os resíduos de core 1 a 100; Combinação 2 (PC2): 21 peptídeos que cobrem os resíduos de core 89 a 183); - Proteína Pol do HBV foi coberta por 8 combinações de 24 peptídeos (Combinação 1 (PP1): 24 peptídeos que cobrem os aa 45 a 151; Combinação 2 (PP2): 24 peptídeos que cobrem os aa 141 a 251 (peptídeo de aa 205 a 219 foi excluído por causa de sua insolubilidade em DMSO 100% ou DMSO + Tris 100 mM, pH 9; peptídeo de aa 221 a 235 foi dissolvido em DMSO + Tris 100 mM, pH 9, por causa de sua insolubilidade em DMSO 100%); Combinação 3 (PP3): 24 peptídeos que cobrem os aa 241 a 347; Combinação 4 (PP4): 24 peptídeos que cobrem os aa 337 a 447 (peptídeo de aa 373 a 387 foi excluído por causa de sua insolubilidade em DMSO 100% ou DMSO + Tris 100 mM, pH 9); Combinação 5 (PP5): 24 peptídeos que cobrem os aa 437 a 543; Combinação 6 (PP6): 24 peptídeos que cobrem os aa 533 a 639; Combinação 7 (PP7): 24 peptídeos que cobrem os aa 629 a 735; Combinação 8 (PP8): 24 peptídeos que cobrem os aa 725 a 835); - Domínios Env foram cobertos por 2 combinações de 9 e 10 peptídeos (Combinação 1 (PE1): 10 peptídeos que cobrem os resíduos HBs 8 a 59; Combinação 2 (PE2): 9 peptídeos que cobrem os resíduos HBs 157 a 194).

[191] Para os experimentos realizados em camundongos HBV transgênicos, com uma base genética C57BL/6J, os peptídeos do HBV descritos na literatura ou identificados em experimentos prévios como sendo reativos em camundongos com uma base genética C57BL/6J foram usados para a estimulação celular in vitro. Eles são tanto um peptídeo curto (VSAAFYHLPL para polimerase; SEQ ID NO: 24) como peptídeos longos (NLNVSIPWTHKVGNF chamado N13F para polimerase (SEQ ID NO: 25) e FLWEWASARFSWLSL chamado F13L para a proteína de envelope (SEQ ID NO: 26)). Eles foram sintetizados pela Eurogentec (Bélgica) ou pela Pro Immune (Oxford, Reino Unido). Cada peptídeo foi dissolvido em DMSO 100% (Sigma, D2650) a uma concentração de 10 mM. Eles foram usados a uma concentração de 10 μM durante os ensaios de ICS (mesmo quando testados como uma mistura de 2 peptídeos).

1.2. 4. ENSAIOS ELISPOT PARA IFNY

[192] Os esplenócitos de camundongos imunizados foram coletados e as hemácias foram lisadas (Sigma, R7757). 2.105 células por poço foram cultivadas em triplicata por 40 h em placas Multiscreen (Millipore, MSHA S4510) revestidas com um anticorpo monoclonal anti-IFNY de camundongo (BD Biosciences; 10 μg/ml, 551216) em meio de cultura MEM (Gibco, 22571) suplementado com FCS 10% (JRH, 12003-100M), penicilina 80 U/mL/estreptomicina 80 μg/mL (PAN, P06-07-100), L-glutamina 2 mM (Gibco, 25030), aminoácidos não essenciais 1x (Gibco, 11140), Hepes 10 mM (Gibco, 15630), piruvato de sódio 1 mM (Gibco, 31350) e β-mercaptoetanol 50 μM (Gibco, 31350) e na presença de 10 U/ml de IL2 de murino recombinante (Peprotech, 212-12), sozinho como controle negativo, ou com: - 10 μM de um peptídeo restrito a HLA-A2 presente nos antígenos do HBV codificados pelos plasmídeos (FLP, ILC para core, VLQ, FLG e GLS para Env e SLY para Pol) descritos em SEQ ID NOs: 18 a 23) ou um peptídeo irrelevante; - uma combinação de peptídeos a uma concentração final de 5 μg/ml por peptídeo; - 5 μg/ml de concanavalina A (Sigma, C5275) para controle positivo.

[193] As células T produtoras de IFNYforam quantificadas por ensaio ELISpot (imunospot ligado a enzima específica de citocina) conforme previamente descrito (Himoudi et al., 2002, J. Virol. 76: 12735). O número de pontos (correspondents às células T produtoras de IFNy) em poços de controle negativo foi substraído do número de pontos detectados em poços experimentais contendo os peptídeos do HBV. Os resultados estão mostrados como o valor médio obtido por poços em triplicata. Um limiar experimental de positividade para as respostas observadas (ou corte) foi determinado pelo cálculo de um valor limiar que corresponde ao valor médio de pontos observados com meio apenas + 2 desvios padrões, relatado para 106 células. Um corte técnico ligado ao leitor ELISpot CLT também foi definido como sendo 50 pontos/106 células (que é o valor acima do qual o CV (coeficiente de variação) do leitor foi sistematicamente menor do que 20%). O valor mais alto entre o corte técnico e o limiar experimental calculado para cada experimento foi considerado para definir o valor de corte de cada experimento. As análises estatísticas das respostas ELISpot foram realizadas pelo uso de um teste Mann-Whitney. p valor igual ou inferior a 0,05 será considerado como significativo.

1.2. 5. ENSAIOS DE COLORAÇÃO DE CITOCINAS INTRACELULARES (ICS)

[194] Ensaios ICS foram realizados em esplenócitos de cada animal de cada grupo. Após lise das hemácias com tampão de lise (Sigma, R7757), 2x106 células por poço em uma placa de 96 poços de fundo chato foram incubadas em meio de cultura MEM alfa completo (Gibco BRL, 22571) na presença de 10 U/ml de IL-2 recombinante de murinos (Peprotech, 212-12) apenas como controle negativo ou com 10 μM de peptídeo do HBV específico ou com uma combinação de peptídeos a uma concentração final de 5 μg/ml por peptídeo ou com 10 μM de um peptídeo irrelevante. O GolgiPlug (BD Biosciences, 555029) foi imediatamente adicionado a uma concentração final de 1 μl/ml por 5 h. Então, as células foram coletadas em placas de 96 poços de fundo em V e lavadas com PBS-FCS 1%. A coloração foi realizada com o uso de anticorpos monoclonais contra CD3 (MAb de haster anti-CD3e-PE, diluição 1/200) , CD8 (MAb de rato anti-CD8a-APC, diluição 1/600) e CD4 (MAb de rato anti-CD4-PerCP, diluição 1/600) (todos adquiridos junto a BD Biosciences, 553063, 553035 e 553052, respectivamente) em 50 μl de PBS-FCS 1% por 15 min em temperatura ambiente. Após lavagem, as células foram fixadas e permeabilizadas com Cytofix/Cytoperm e lavadas com solução Perm/Wash (BD Biosciences, 554714). Então, os anticorpos anti-IFNY de camundongo-PE (BD Biosciences, 554412557724) e os anticorpos anti-TNFα de camundongo- Alexa488 (BD Biosciences, 557719) ou os anticorpos anti-IFNY de camundongo- PE (BD Biosciences, 554412557724) foram adicionados por 15 min em temperatura ambiente e após lavagem com Perm/Wash, as células foram resuspendidas em PBS-FCS 1% e analisadas por citometria de fluxo com o uso de FacsCalibur (Becton Dickinson). Células CD3e+, CD8a+ ou células CD3e+, CD4+ foram aprisionadas para determinar as porcentagens da população de células T IFNY+CD8+ ou IFNY+ CD4+ T ou TNFα+ CD8+ ou TNFα+ CD4+ T ou IFNY+ TNFα+ CD8+ ou IFNY+ TNFα+ CD4+. A porcentagem obtida em meio apenas foi considerada como fundo.

[195] Para os experimentos realizados em camundongos HBV transgênicos, ensaios ICS também foram realizados em células hepáticas de cada animal de cada grupo. Após eutanásia do camundongo, o fígado foi perfundido in situ pela veia porta hepática com PBS resfriado até que o órgão se tornasse pálido. O fígado foi coletado, imerso em solução de PBS + FCS 2%, cortado em pedaços pequenos, pressionado gentilmente através de um filtro celular de 70 μm e, então, resuspendido em solução resfriada de PBS + FCS 2%. Após centrifugação, as células foram lavadas de novo com solução resfriada de PBS + FCS 2%. Após uma nova centrifugação, o pélete contendo as células foi resuspendido em 10 ml de solução Percoll, centrifugado por 12 min a 700 g em temperatura ambiente e lavado de novo com solução de PBS + FCS 2%. As hemácias foram lisadas conforme descrito anteriormente para os esplenócitos e todas as etapas posteriores foram realizadas conforme descrito no parágrafo anterior para os esplenócitos. Cumpre salientar que, para o fígado, como a quantidade de linfócitos T coletada é limitada, o número de células por poço é variável: todas as células obtidas foram cultivadas de maneira que uma quantidade equivalente de células fosse destacada em todos os poços.

1.2.6 ENSAIOS CLT IN VIVO

[196] O ensaio CLT in vivo foi realizado conforme descrito por Fournillier et al., (2007, Vaccine, 25: 7339-53) em camundongos transgênicos HLA- A2. As suspensões de esplenócitos foram obtidas a partir de baços de camundongos singênicos e ajustadas para 20 x 106 células/ml após lise das hemácias. Metade das células foi incubada com o peptídeo HBV de interesse (SLY, FLP ou ILC) a uma concentração final de 10 μM por 1h a 37°C e a outra metade das células foi deixada não pulsada. 5(6)-carboxifluoresceína diacetato succinimidil éster (CFSE) (Molecular Probes, CI 157) foi então adicionado a 10 μM (CFSE-alto) às células não pulsadas e 1 μM (CFSE-baixo) às células pulsadas com o peptídeo do HBV por 10 min. Após lavagem com PBS, todas as populações foram misturadas e 20 x 106 células totais foram injetadas em camundongos anestesiados através do seio retro-orbital, os camundongos sendo previamente imunizados (2 semanas antes) por AdTG18201 ou por AdTG15149. Assim, a população CFSE-baixa representou alvos supostamente lisados por células T citotóxicas induzidas pela vacinação e a população CFSE-alta foi uma referência interna que permite a normalização do ensaio. Os esplenócitos de camundongos recipientes foram analisados 24 h depois por citometria de fluxo para detectar as células marcadas com CFSE. Para cada animal, a razão entre alvos pulsados por peptídeo e alvos não pulsados foi calculada (R= Número de células CFSE-baixo/Número de células CFSE-alto). A porcentagem de lise específica para cada animal foi determinada pela fórmula a seguir: % lise = (1-Rcamundongo Rreferência) x 100, em que Rreferência é a média R obtida para 2 camundongos HLA-A2 não expostos que foram injetados com a mesma suspensão de alvos marcados com CFSE. Uma resposta foi considerada positiva se a porcentagem de lise específica foi superior a 10%.

1.3 ANÁLISE IN VITRO DE ADTG18201 POR MICROSCOPIA ELETRÔNICA

[197] Células A549 (linhagem celular epitelial de adenocarcinoma de pulmão humano) foram infectadas em suspensão e sob condições de volume de meio reduzido com AdTG18201 a diferentes MOI (25 a 100) e, então, cultivadas para 16 h, 24 h ou 48 h antes de serem coletadas para análise. As células foram coletadas a diferentes pontos e, então, fixadas com o uso de glutaraldeído 2% diluído em tampão de cocadilato de sódio 0,2 M. As células foram então secas, incluídas em blocos de resina e, então, cortadas em secções ultrafinas. As grades obtidas foram então coradas com o uso de acetato de uranila e citrato de chumbo e observadas por microscopia eletrônica.

2. RESULTADOS 2.1. IMUNOGENICIDADE DE PROTEÍNAS DE FUSÃO DO HBV EXPRESSAS PELOS PLASMÍDEOS DE DNA PTG18188 E PTG18194

[198] A imunogenicidade das proteínas de fusão expressas pelos plasmídeos de DNA foi avaliada em camundongos transgênicos HLA- A2. Após duas injeções intramusculares tanto de pTG18188 (tCore-Pol*- Envl-Env2) como de pTG18194 (tCore-Pol*), ou pTG13135 como controle negativo (plasmídeo vazio), as respostas de células T foram avaliadas por ELISpot IFNY e ICS (IFNY/TNFα) com o uso de epítopos de HLA-A2 conhecidos presentes nos domínios polimerase, core ou do envelope e/ou combinações de peptídeos sobrepostos que cobrem os antígenos do HBV de interesse.

2.1.1. AVALIAÇÃO DE CÉLULAS PRODUTORAS DE IFNY ESPECÍFICAS DO HBV POR ENSAIOS ELISPOT

[199] Conforme ilustrado na Figura 2, a imunização com o plasmídeo pTG18194 que codifica a proteína de fusão do HBV “tCore-Pol” induziu as células produtoras de IFNY específicas do epítopo SLY restrito a HLA- A2 (SEQ ID NO: 23) localizado dentro da polimerase de HBV (posições 816 a 824). A imunização com o plasmídeo pTG18194 também resultou na indução de alta frequência de células produtoras de IFNy específicas para dois epítopos restritos a HLA-A2 de core, FLP (SEQ ID NO: 18, localizado dentro da proteína core do HBV na posição 18 a 27) e ILC (SEQ ID NO: 19, localizado dentro da proteína core do HBV na posição 99 a 108). As respostas positivas foram observadas em 4 dentre 8 camundongos vacinados.

[200] Conforme ilustrado na Figura 2, o plasmídeo pTG18188 que codifica a proteína de fusão do HBV “Core-Pol*-Envl-Env2” também induziu as células produtoras de IFNy específicas do epítopo de HLA-A2 SLY e dos dois epítopos restritos a HLA-A2 de core, FLP e ILC. As respostas positivas foram observadas em 4 dentre 8 camundongos vacinados. Além disso, as células produtoras de IFNy específicas do epítopo de HLA-A2 GLS (SEQ ID NO: 22 localizado dentro de Env2 na posição 185 a 194 de HBsAg) também foram detectadas, apesar de a uma fraca frequência e em um camundongo vacinado.

2.1.2. AVALIAÇÃO DE CÉLULAS T CD8+ E CD4+ INDUZIDAS PRODUTORAS DE IFNY ESPECÍFICAS DO HBV POR ENSAIOS DE COLORAÇÃO INTRACELULAR 2.1.2.1. RESPOSTA DE CÉLULAS T CD8 ESPECÍFICAS DE EPÍTOPOS RESTRITOS A HLA-A2

[201] A porcentagem de células T que produzem tanto IFNy sozinho como combinado com TNFα direcionado a epítopos restritos a HLA-A2 incluídos nos domínios da polimerase (SLY), core (FLP e ILC) e do envelope (VLQ, FLG e GLS) foi avaliada por ensaios ICS. Os resultados são mostrados na Figura 3A como porcentagens de células T CD8+ específicas desses epítopos e produtoras de IFNY (soma de células produtoras de IFNYapenas ou células produtoras de IFNY e TNFα). Quatro dentro 8 animais imunizados com pTG18194 (que expressam tCore-Pol*) adquiriram células T CD8+ produtoras de IFNy específicas dos epítopos restritos a HLA-A2 FLP, ILC e SLY localizados, respectivamente, nos antígenos core e Pol. De maneira similar, 4 dentre 8 animais imunizados com pTG18188 (que expressam tCore-Pol*-Envl-Env2) também adquiriram células T CD8+ produtoras de IFNy específicas dos epítopos FLP, ILC e SLY. Além disso, conforme observado no ensaio ELISpot, 1 dentre 8 camundongos imunizados com o plasmídeo pTG18188 apresentaram uma resposta específica do epítopo restrito a HLA-A2 GLS localizado dentro do domínio Env2 mediado pelas células T CD8+ produtoras de IFNy. A imunização com pTG13135 não induziu qualquer resposta específica conforme esperado.

2.1.2.2 RESPOSTA DE CÉLULAS T CD8 E CD4 ESPECÍFICAS DE COMBINAÇÕES DE PEPTÍDEOS QUE COBREM A PROTEÍNA CORE, POLIMERASE E OS DOMÍNIOS ENV RESPOSTAS ESPECÍFICAS DE COMBINAÇÕES DE PEPTÍDEOS QUE COBREM A PROTEÍNA CORE

[202] A porcentagem de células T CD8 e CD4 capazes de produzir tanto IFNy sozinho como combinado com TNFα em resposta às combinações de peptídeos que cobrem a proteína core (PC) foi avaliada por ensaio ICS. Os resultados estão expressos como porcentagens de células T CD8+ ou CD4+ específicas dessas combinações de peptídeos e produtoras de IFNy (soma de células produtoras de IFNy apenas ou células produtoras de IFNy e TNFα).

[203] Conforme mostrado na Figura 3B, uma porcentagem positiva de células T CD8+ produtoras de IFNy foi detectada contra as 2 combinações de peptídeos que cobrem a proteína core (PC1 e PC2), com uma resposta de células T CD8+, principalmente, direcionada aos peptídeos da Combinação core 1. A porcentagem de células T CD8+ reativas observadas em camundongos vacinados tanto por pTG18194 como por pTG18188 foi significativamente diferente da porcentagem observada para camundongos vacinados com o controle negativo (pTG13135) (p<0,05, teste Mann-Withney) para ambas as combinações de peptídeos (1 e 2).

[204] Conforme mostrado na Figura 3C, a porcentagem positiva de células T CD4+ produtoras de IFNYtambém foi detectada contra uma combinação de peptídeos que cobrem a proteína core, a combinação core 2 nos dois grupos de camundongos vacinados com pTG18194 ou pTG18188. A porcentagem de células T CD4+ reativas observadas em camundongos vacinados com pTG18188 foi significativamente diferente da porcentagem observada para camundongos vacinados com o controle negativo (pTG13135) (p<0,05, teste Mann-Withney) para a combinação core 2.

RESPOSTAS ESPECÍFICAS DE COMBINAÇÕES DE PEPTÍDEOS QUE COBREM A PROTEÍNA POLIMERASE

[205] A porcentagem de células células T CD8 e CD4 capazes de produzir tanto IFNy sozinho como combinado com TNFα em resposta às combinações de peptídeos que cobrem a proteína polimerase foi avaliada por ensaio ICS. Os resultados estão expressos como porcentagens de células T CD8+ ou CD4+ específicas dessas combinações de peptídeos e produtoras de IFNy (soma de células produtoras de IFNy apenas ou células produtoras de IFNy e TNFα).

[206] Conforme mostrado na Figura 3D, uma porcentagem positiva de células T CD8+ produtoras de IFNy foi, principalmente, detectada contra uma combinação de peptídeos, PP8. Especificamente para PP8, a porcentagem de células T CD8+ observadas em camundongos vacinados tanto com pTG18194 como com pTG18188 foi significativamente diferente da porcentagem observada para camundongos vacinados com o controle negativo (pTG13135) (p<0,05, teste Mann- Withney). Cumpre ressaltar que um camundongo no grupo de camundongos vacinados com pTG18188 também apresentou porcentagem positiva de células T CD8+ produtoras de IFNY contra a combinação 4, combinação 5 e combinação 6.

[207] Conforme mostrado na Figura 3E, uma fraca, porém positiva porcentagem de células T CD4+ produtoras de IFNy foi detectada contra 4 combinações de peptídeos que cobrem a proteína Pol, a combinação 1, combinação 4, combinação 5 e combinação 6 nos dois grupos de camundongos vacinados com pTG18194 ou pTG18188, com pelo menos 3 dentre 8 camundongos testados em cada grupo apresentando respostas.

RESPOSTAS ESPECÍFICAS DE COMBINAÇÕES DE PEPTÍDEOS QUE COBREM OS DOMÍNIOS DE ENVELOPE

[208] A porcentagem de células T CD8 e CD4 capazes de produzir tanto IFNy apenas como combinado com TNFα em resposta às combinações de peptídeos que cobrem os domínios de envelope, Env1 e Env2, foi avaliada por ensaio ICS. Nenhuma resposta específica de células T CD4+ foi detectada durante esse experimento. Os resultados para a resposta de células CD8+ estão mostrados na Figura 3F como porcentagens de células T CD8+ específicas dessas combinações de peptídeos e produtoras de IFNy (soma de células produtoras de IFNy apenas ou células produtoras de IFNy e TNFα). Especificamente, uma fraca, porém positiva porcentagem de células T CD8+ produtoras de IFNy foi detectada para 1 camundongo vacinado com pTG18188 contra uma combinação de peptídeos, combinação Env2.

208.2. IMUNOGENICDADE DE PROTEÍNAS DE FUSÃO DO HBV EXPRESSAS PELO ADENOVÍRUS ADTG18201, ADTG18202 E ADTG18203 208.2.1. AVALIAÇÃO DE CÉLULAS T PRODUTORAS DE IFNY ESPECÍFICAS DO HBV POR ELISPOT IFNY COM O USO DE COMBINAÇÕES DE PEPTÍDEOS SOBREPOSTOS

[209] A imunogenicidade da proteína Pol mutante do HBV e da proteína de fusão expressas pelo adenovírus humano 5 foi avaliada em camundongos transgênicos HLA-A2 imunizados com AdTG18201, AdTG18202, AdTG18203 ou AdTG15149 (adenovírus vazio usado como controle negativo). As respostas de células T específicas induzidas após injeção subcutânea de adenovirus foram avaliadas por ELISpot IFNYcom o uso de combinações de peptídeos sobrepostos que cobrem os antígenos de interesse do HBV, core (PC1/2), polimerase (PP1 a 8) e domínios Env (PE1/2).

[210] Conforme ilustrado na Figura 4, AdTG18203 que codifica apenas o polipeptídeo polimerase mutante do HBV é capaz de induzir células produtoras de IFNy específicas das combinações de peptídeos polimerase 4, 5, 6 e 8. Todos os camundongos imunizados apresentaram respostas de células T específicas com uma alta frequência de células produtoras de IFNy, principalmente, contra as combinações de peptídeos polimerase 4 e 8.

[211] Conforme ilustrado na Figura 4, AdTG18202 que codifica a proteína de fusão do HBV “tCore-Pol*” induziu células produtoras de IFNy específicas de combinações de peptídeos PP2, PP3, PP4, PP5, e PP8, a resposta específica de polimerase sendo principalmente direcionada contra PP2, PP3 e PP8. A imunização com AdTG18202 também resultou na indução de alta frequência de células produtoras de IFNy específicas para as duas combinações de peptídeos core e para PC2 com uma frequência maior de células T direcionadas a PCI. As respostas positivas direcionadas para os antígenos polimerase e core foram observadas em 5 dentre 5 camundongos vacinados.

[212] AdTG18201 que codifica a proteína de fusão “Core-Pol*- Envl-Env2” também se mostrou imunogênica, conforme ilustrado na Figura 4. Mais especificamente, as células produtoras de IFNy específicas das combinações de peptídeos polimerase PP2, PP3 e PP8 foram induzidas em todos os camundongos vacinados, bem como contra PP4 e PP5 apesar de com pontos mais fracos e frequências mais baixas de camundongos responsivos. A imunização com AdTG18201 também resultou na indução de alta frequência de células produtoras de IFNYespecíficas para as duas combinações de peptídeos core e para PC2, em todos os camundongos vacinados (5/5). A imunização com AdTG18201 também induziu respostas de células T contra os domínios Env, mesmo se aquelas respostas foram fracas e esporádicas, com 1 dentre 5 camundongos apresentando respostas direcionadas a PE1 e 2 dentre 5 camundongos apresentando respostas direcionadas a PE2.

2.2.2. AVALIAÇÃO DE CÉLULAS T PRODUTORAS DE IFNY ESPECÍFICAS DO HBV POR ELISPOT IFNY COM O USO DE PEPTÍDEOS DEHLA-A2 APÓS IMUNIZAÇÃO COM ADTG18201

[213] A imunogenicidade de uma das proteínas de fusão do HBV expressas por AdTG18201 foi avaliada em camundongos transgênicos HLA-A2. Os animais foram imunizados por uma injeção subcutânea tanto de AdTG18201 como de AdTG15149 (adenovírus vazio usado como controle negativo). As respostas específicas de células T foram avaliadas por ELISpot IFNy com o uso de epítopos restritos a HLA-A2 contidos na polimerase (SLY), core (FLP e ILC) e envelope (VLQ e GLS).

[214] Conforme ilustrado na Figura 5, AdTG18201 que codifica a proteína de fusão Core-Pol*-Envl-Env2 mostrou-se ser imunogênico. Mais especificamente, as células produtoras de IFNy específicas do epítopo da polimerase de HLA-A2, SLY, foram induzidas em todos os camundongos vacinados com AdTG18201. Ao mesmo tempo, AdTG18201 também induziu células produtoras de IFNy específicas dos dois epítopos de HLA-A2 da proteína core, FLP e ILC, com altas frequências. A imunização com AdTG18201 também induziu respostas específicas de células T contra os domínios Env, apesar de as frequências e número de camundongos responsivos serem mais baixos, com 2 dentre 8 camundongos testados apresentando resposta de células T positiva contra o peptídeo VLQ e 5 dentre 8 camundongos testados apresentando resposta de células T positiva contra o peptídeo GLSP.

2.2.3. AVALIAÇÃO DE CÉLULAS T CD8+ PRODUTORAS DE IFNY E/OU TNFA ESPECÍFICAS DO HBV POR ENSAIOS DE COLORAÇÃO INTRACELULAR APÓS IMUNIZAÇÃO DE CAMUNDONGOSHLA-A2 COM ADTG18201 E COM O USO DE COMBINAÇÕES SELECIONADAS DE PEPTÍDEOS

[215] A porcentagem de células T CD8+ capazes de produzir tanto IFNY apenas como combinado com TNFα em resposta a combinações selecionadas de peptídeos que cobrem uma parte da proteína polimerase (PP8, aminoácidos 725 a 835) e uma parte da proteína core do HBV (PC1, aminoácidos 1 a 100) foi avaliada por ensaio ICS. O resultado está expresso como a porcentagem de células T CD8+ específicas dessas combinações de peptídeos e produtoras de IFNy apenas e IFNy combinado com TNFα.

[216] Conforme mostrado na Figura 6, AdTG18201 é especificamente capaz de induzir altas porcentagens de células T CD8+ que produzem tanto IFNy apenas como IFNy combinado com TNFα que reconhecem os peptídeos das combinações PP8 e PC1. Todos os camundongos vacinados apresentaram uma alta porcentagem de ambas as células T CD8+ específicas produtoras únicas (IFNy apenas) e duplas (IFNy e TNFα).

[217] Cumpre ressaltar que experimentos similares realizados em outro modelo de camundongo, camundongos C57B16, apresentaram resultados similares de imunogenicidade de AdTG18201 (não mostrado).

2.2.4. AVALIAÇÃO DA INDUÇÃO DE CÉLULAS T CD8+ FUNCIONAIS IN VIVO COM O USO DE UM ENSAIO CLT IN VIVO APÓS IMUNIZAÇÃO DE CAMUNDONGOSHLA-A2 COM ADTG 18201

[218] A capacidade de AdTG18201 de induzir células T CD8+ funcionais in vivo que apresentam atividade citolítica foi avaliada por ensaio in vivo (ou CLT) em camundongos HLA-A2 após imunização com AdTG18201 ou AdTG15149 (como controle negativo) e com o uso de 3 dos epítopos de HLA-A2 previamente mostrados como sendo direcionados pelas células T CD8+ induzidas produtoras de IFNY (SLY, FLP e ILC).

[219] Conforme ilustrado pela Figura 7, AdTG18201 é capaz de induzir alta porcentagem de lise específica in vivo contra o epítopo de polimerase, SLY, com uma lise específica detectada para todos os camundongos imunizados e uma porcentagem que varia de 42 a 75% (Figura 7A). Mostrou-se também que AdTG18201 é capaz de induzir alta porcentagem de lise específica in vivo contra os dois epítopos de HLA-A2 testados da proteína core, FLP (Figura 7A) e ILC (Figura 7B) com as porcentagens variando de 32 a 69% e 3 a 64%, respectivamente. A resposta contra o epítopo Env foi detectável, mas a níveis baixos.

[220] Esses dados claramente demonstram a capacidade de AdTG18201 em induzir as células T CD8+ funcionais in vivo que apresentam atividade citolítica e são direcionadas tanto para a proteína polimerase como para a proteína core do HBV.

2.2.5. AVALIAÇÃO DA INDUÇÃO DE CÉLULAS T CD8+ FUNCIONAIS EM CAMUNDONGOS TRANSGÊNICOS DO HBV APÓS IMUNIZAÇÃO COM ADTG18201 E COM O USO DE ENSAIOICS

[221] A capacidade de AdTG18201 de induzir células T funcionais em um modelo de camundongo tolerante foi avaliada em camundongos transgênicos do HBV. De fato, esses camundongos são transgênicos para o genoma do HBV e, assim, tolerantes aos antígenos do HBV que mimetizam, a um certo ponto, a tolerância encontrada em pacientes crônicos infectados por HBV. Os camundongos transgênicos do HBV foram imunizados por uma injeção subcutânea de AdTG18201 (108 iu) ou AdTG15149 como controle negativo. As células T induzidas foram monitoradas por ICS tanto no baço como no fígado de camundongos vacinados (detecção de células T CD8+ produtoras tanto de IFNY como TNFα). Nesse modelo específico, os peptídeos identificados como sendo reativos em camundongos C57B1/6J foram usados para triar a resposta de células T induzida: uma combinação dos peptídeos VSA e N13F para a polimerase e o peptídeo F13L para o envelope.

[222] Conforme ilustrado na Figura 8, as células T CD8+ funcionais que produzem tanto IFNy como TNFα foram detectadas no baço e no fígado de camundongos vacinados com AdTG18201, com 4 dentre 5 camundongos testados apresentando células T CD8+ produtoras de IFNy/TNFα funcionais específicas de envelope em ambos os órgãos. Conforme esperado, nenhuma resposta foi detectada em camundongos imunizados com AdTG15149 vazio ou quando a estimulação faz uso de um peptídeo irrelevante.

[223] Em conjunto, esses dados demonstram a capacidade do vetor viral AdTG18201 que expressa uma proteína de fusão contendo uma Pol mutante com RNaseH defeituosa e YMDD deletado, domínios Env e core em induzir células T CD8+ funcionais produtoras tanto de IFNy como de TNFα em um modelo tolerante do HBV.

2.3 AVALIAÇÃO DE DIFERENTES DOSES E CRONOGRAMAS DE IMUNIZAÇÃO COM ADTG18201 OU ADTG18202 2.3.1. AVALIAÇÃO DE DOSE DO ADENOVÍRUS

[224] A imunogenicidade da proteína de fusão do HBV expressa por AdTG18201 foi avaliada em camundongos transgênicos HLA-A2 a diferentes doses. Os animais foram imunizados por uma injeção subcutânea tanto de AdTG18201 a uma dose de 105, 106, 107, 108 ou 109 iu como de AdTG15149 a 109 iu (adenovírus vazio usado como controle negativo). As respostas de células T específicas foram avaliadas por ELISpot IFNy com o uso de epítopos restritos a HLA-A2 contidos na polimerase (SLY), core (FLP e ILC) e envelope (VLQ e GLS).

[225] Conforme ilustrado na Figura 9, AdTG18201 que codifica a proteína de fusão “Core-Pol*-Envl-Env2” mostrou-se imunogênica quando injetada às doses de 107, 108 e 109 iu. Mais especificamente, nenhuma célula produtora de IFNY específica desses epítopos de HLA-A2 testados de core, polimerase e domínios Env foi detectada com as doses de 105 e 106 iu. As células produtoras de IFNy específicas direcionadas aos dois epítopos testados de core e ao epítopo testado de Pol foram detectados para as doses de 107, 108 e 109 iu. Uma dose efetiva é observada para os três epítopos (SLY, FLP e ILC). Para os dois epítopos dos domínios Env (VLQ e GLS), as frequências de células produtoras de IFNy são baixas com as doses de 107 e 108 iu, enquanto as mesmas estão claramente aumentadas com uma dose de 109 iu.

2.3.2. AVALIAÇÃO DO CRONOGRAMA DE IMUNIZAÇÃO MÚLTIPLA A UM INTERVALO DE CURTO PRAZO

[226] A imunogenicidade de uma das proteínas de fusão do HBV expressas por AdTG18202 foi avaliada em camundongos transgênicos HLA-A2 de acordo com diferentes cronogramas de imunização. AdTG18202 foi administrado tanto uma vez como três vezes (uma injeção/semana durante 3 semanas) ou 6 vezes (uma injeção/semana durante 6 semanas) e as respostas imunes de células T induzidas foram avaliadas duas semanas após a última injeção por um ensaio ELISpot IFNy e com o uso de epítopos restritos a HLA- A2, SLY (Pol) e FLP e ILC (core). Alguns camundongos foram imunizados 6 vezes com um adenovírus vazio como controle negativo (não mostrado).

[227] Conforme ilustrado na Figura 10, AdTG18202 que codifica a proteína de fusão “Core-Pol*” mostrou-se imunogênica a qualquer cronograma testado. Mais especificamente, nenhuma resposta de células T específica foi detectada com o meio apenas e peptídeo irrelevante, enquanto frequências altas e similares de células produtoras de IFNy foram detectadas na presença dos três epítopos do HBV testados, SLY, FLP e ILC. As frequências de células produtoras de IFNYdetectadas mostram-se comparáveis entre os grupos de camundongos injetados uma vez, 3 vezes ou 6 vezes a um intervalo de uma semana, sem a aparência, ao nível da produção de IFNy, de exaustão de células T devido ao número muito alto de imunizações em um intervalo de tempo curto. As respostas de células T específicas de adenovírus parecem maiores quando os camundongos foram injetados 6 vezes do que quando eles foram injetados uma vez ou 3 vezes. Conforme esperado, nenhuma resposta de células T HBV- específica foi observada após imunização com um adenovírus vazio.

2.3.3. AVALIAÇÃO DO CRONOGRAMA DE IMUNIZAÇÃO MÚLTIPLA A UM INTREVALO LONGO

[228] A imunogenicidade de uma das proteínas de fusão expressas por AdTG18202 foi avaliada em camundongos transgênicos HLA-A2 de acordo com diferentes cronogramas de imunização. AdTG18202 foi administrado uma vez, (2 (grupo 1) ou 20 (grupo 2) semanas antes do monitoramento da resposta de células T) ou duas vezes (2 injeções a um intervalo de 2 (grupo 3) ou 4 (grupo 4) meses, monitoramento da resposta de células T 2 semanas após a imunização) ou três vezes (a um intervalo de 2 meses (grupo 5), monitoramento da resposta de células T 2 semanas após a última injeção). As células T induzidas foram monitoradas por um ensaio ELISpot IFNy e com o uso de epítopos restritos a HLA-A2, SLY (Pol) e FLP e ILC (core). Alguns camundongos foram imunizados tanto uma vez como três vezes a um intervalo de 2 meses com um adenovírus vazio como controle negativo (não mostrado).

[229] Conforme ilustrado pela Figura 11, AdTG18202 que codifica a proteína de fusão “Core-Pol*” mostrou-se imunogênica a qualquer cronograma testado, enquanto nenhuma resposta específica de células T foi detectada após as imunizações com AdTG18202 na presença de meio apenas e de um peptídeo irrelevante. Mais especificamente, as respostas específicas de células T observadas no grupo 2 mostraram que mesmo que mais baixas do que aquelas observadas no grupo 1, 2 semanas após uma imunização, as respostas de células T induzidas após uma injeção de AdTG18202 ainda está presente 20 semanas após a injeção. As respostas de células T observadas nos grupos 3 e 4 mostraram que a segunda imunização, 2 ou 4 meses após a primeira, foi capaz de invocar as respostas de células T específicas dos epítopos do HBV, pelo menos ao nível da resposta imune primária observada no grupo 1, mesmo sutilmente maior para o epítopo SLY. Uma observação similar foi realizada com os camundongos imunizados três vezes a um intervalo de 2 meses (grupo 5) com uma invocação das respostas de células T induzidas através da segunda e terceira injeções a um nível similar àquele observado no grupo 1. Conforme esperado, nenhuma resposta de células T HBV-específicas foi observada após imunização com um adenovírus vazio.

2.4 OBSERVAÇÃO POR MICROSCOPIA ELETRÔNICA

[230] Células A549 foram infectadas in vitro com AdTG18201 a MOI 25, 50 ou 100 e as células foram coletadas a 16 h, 24 h ou 48 h após a infecção. As células coletadas foram então tratadas para serem observadas por microscopia eletrônica.

[231] Algumas partículas semelhantes a vírus (VLP) foram observadas no núcleo e citoplasma de células infectadas com AdTG18201, enquanto nenhuma dessas estruturas foram observadas em células infectadas por um adenovírus vazio. Essas VLP estavam, principalmente, localizadas dentro núcleo. Em algumas células tanto agregados proteicos como VLP foram observados.

Claims

1. POLIPEPTÍDEO MUTANTE, caracterizado por compreender um domínio da polimerase de HBV mutada com uma deleção interna que interrompe funcionalmente a atividade da polimerase, em que dita deleção interna é de no máximo 30 resíduos de aminoácidos e compreende pelo menos o motivo YMDD naturalmente presente no domínio da polimerase de uma polimerase de HBV nativa, em que dito domínio da polimerase mutada consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 1, mas desprovido pelo menos do resíduo Tyr na posição 203, do resíduo Met na posição 204, do resíduo Asp na posição 205, do resíduo Asp na posição 206, do resíduo Val na posição 207, do resíduo Val na posição 208 e do resíduo Leu na posição 209.

2. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo dito domínio da polimerase mutada compreender uma sequência de aminoácidos que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2.

3. POLIPEPTÍDEO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado por adicionalmente compreender um domínio de RNaseH mutado de SEQ ID NO: 3 compreendendo ainda mutação(ões) de um ou mais resíduo(s) de aminoácido(s) que funcionalmente interrompe(m) a atividade de RNaseH normalmente exibida por uma polimerase de HBV nativa, em que a dita uma ou mais mutação(ões) compreendida(s) no domínio de RNaseH mutado é(são) selecionada(s) a partir do grupo que consiste em: - uma deleção de pelo menos 8 aminoácidos e no máximo 60 aminoácidos, incluindo, pelo menos, a porção da SEQ ID NO: 3 que se estende a partir do resíduo Glu (E) na posição 39 até o resíduo Ala (A) na posição 46; - a substituição do resíduo Asp (D) na posição 10 da SEQ ID NO: 3 por um resíduo de aminoácido diferente de Asp (D); - a substituição do resíduo Val (V) na posição 90 da SEQ ID NO: 3 por um resíduo de aminoácido diferente de Val (V); - a substituição do resíduo Thr (T) ou Ala (A) na posição 97 da SEQ ID NO: 3 por um resíduo de aminoácido diferente de Thr (T) ou Ala (A); - a substituição do resíduo Asp (D) na posição 98 da SEQ ID NO: 3 por um resíduo de aminoácido diferente de Asp (D); e - qualquer combinação das mesmas.

4. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo domínio de RNaseH mutado consistir na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3, mas (a) desprovido da porção de 33 resíduos de aminoácidos que se estendem a partir do resíduo Xaa na posição 31 até o resíduo Leu (L) na posição 63 e compreende (b) a substituição do resíduo Asp (D) na posição 10 por um resíduo His (H) (D689H); (c) a substituição do resíduo Val (V) na posição 90 por um resíduo Tyr (Y) (V769Y); (d) a substituição do resíduo na posição 97 por um resíduo Tyr (Y) (T/A776Y) e (e) a substituição do resíduo Asp (D) na posição 98 por um resíduo His (H) (D777H).

5. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por consistir na SEQ ID NO: 5.

6. PROTEÍNA DE FUSÃO, caracterizada por compreender o polipeptídeo mutante, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e um polipeptídeo núcleo de HBV, dito polipeptídeo núcleo de HBV sendo truncado em C-terminal no resíduo 148, em que a dita proteína de fusão consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 6.

7. PROTEÍNA DE FUSÃO, caracterizada por compreender o polipeptídeo mutante, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e um ou mais domínio(s) imunogênico(s) de HBsAg ou a proteína de fusão, conforme definida na reivindicação 6, adicionalmente compreendendo um ou mais domínio(s) imunogênico(s) de HBsAg, em que a dita proteína de fusão consiste na sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 7 a 9.

8. PROTEÍNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 7, caracterizada por compreender em seu N-terminal um polipeptídeo núcleo fundido ao polipeptídeo mutante e um ou dois domínios imunogênicos de HBsAg fundidos no lugar da deleção interna no domínio da polimerase mutada e/ou no lugar da deleção no domínio de RNaseH mutado e consistindo na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 8.

9. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, caracterizada por codificar o polipeptídeo mutante da polimerase, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou a proteína de fusão, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 6 a 8, em que a molécula de ácido nucleico consiste na sequência de nucleotídeos mostrada em uma das SEQ ID NOs: 13 a 17.

10. VETOR, caracterizado por compreender uma molécula de ácido nucleico, conforme definida na reivindicação 9.

11. VETOR, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por dito vetor ser um vetor adenoviral defeituoso para replicação proveniente de um humano ou a partir de um adenovírus de chimpanzé.

12. VETOR, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pela molécula de ácido nucleico ser inserida na região E1 do adenovírus e colocada sob o controle de um promotor CMV.

13. VETOR, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por dito vetor ser um vetor poxvirus, proveniente de um vírus canarypox, um fowlpox ou um vaccinia, preferencialmente um vírus vaccinia da linhagem Copenhagen, da linhagem Wyeth e da linhagem Ankara modificada (MVA).

14. VETOR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, caracterizado por dito vetor estar sob a forma de partículas virais infecciosas.

15. PROCESSO DE PRODUÇÃO DO VETOR, conforme definido na reivindicação 14, caracterizado por compreender as etapas de introduzir o vetor viral dentro de uma linhagem celular adequada, cultivar a dita linhagem celular sob condições adequadas de modo a permitir a produção da dita partícula viral infecciosa, recuperar a partícula viral infecciosa produzida a partir da cultura da dita linhagem celular e opcionalmente purificar a dita partícula viral, em que a linhagem celular adequada é selecionada a partir do grupo que consiste em células 293, células HER-96, células PER.C6, células Vera, células HeLa, células aviárias e quaisquer derivados dessas linhagens celulares.

16. CÉLULA HOSPEDEIRA, caracterizada por compreender a molécula de ácido nucleico, conforme definida na reivindicação 9, ou o vetor, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 10 a 14, em que dita célula hospedeira é uma célula procariótica.

17. PROCESSO PARA PRODUÇÃO RECOMBINANTE DO POLIPEPTÍDEO MUTANTE, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou a proteína de fusão, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado por compreender as etapas de introduzir o vetor, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 10 a 14, em uma célula hospedeira adequada para produzir uma célula hospedeira transfectada ou infectada, cultivar in vitro dita célula hospedeira transfectada ou infectada sob condições adequadas para crescimento da célula hospedeira, recuperar a cultura celular e, opcionalmente, purificar o polipeptídeo mutante ou proteína de fusão produzidos.

18. COMPOSIÇÃO, caracterizada por compreender pelo menos o polipeptídeo mutante, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, a proteína de fusão, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 6 a 8, a molécula de ácido nucleico, conforme definida na reivindicação 9, o vetor, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 10 a 14, a célula hospedeira, conforme definida na reivindicação 16, ou qualquer combinação das mesmas.

19. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada por ser para uso no tratamento ou prevenção de uma infecção por HBV ou doenças associadas ao HBV e condições patológicas.

20. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizados por ser no uso para provocar ou estimular uma resposta imune no organismo tratado.

21. KIT, de partes, caracterizado por dito kit compreender uma pluralidade de agentes ativos selecionados a partir do grupo que consiste em polipeptídeo mutante, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, a proteína de fusão, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 6 a 8, a molécula de ácido nucleico, conforme definida na reivindicação 9, o vetor, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 10 a 14, a célula hospedeira, conforme definida na reivindicação 16, ou a composição, conforme definida na reivindicação 18.