JP2014527404A - Ｈｂｖポリメラーゼ変異体 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ポリメラーゼ活性が機能的に破壊されている突然変異ポリメラーゼドメインを含んでなるポリメラーゼＨＢＶ変異型ポリペプチド、およびそのようなポリメラーゼ変異型ポリペプチドを含んでなる融合タンパク質に関する。本発明はまた、前記ポリメラーゼ変異型ポリペプチドを発現させるための核酸分子および発現ベクター、ならびにＨＢＶ感染に対する予防または治療効果を提供することを目的としてＨＢＶに対する免疫応答を惹起するために使用することができる組成物に関する。

Description

本発明は、ポリメラーゼ活性が機能的に破壊されている突然変異ポリメラーゼドメインを含んでなるポリメラーゼＨＢＶ変異型ポリペプチド、およびそのようなポリメラーゼ変異型ポリペプチドを含んでなる融合タンパク質に関する。本発明はまた、前記ポリメラーゼ変異型ポリペプチドを発現させるための核酸分子および発現ベクター、ならびにＨＢＶ感染に対する予防または治療効果を提供することを目的としてＨＢＶに対する免疫応答を惹起するために使用することができる組成物に関する。本発明は、免疫療法の分野で、より詳しくはＨＢＶに感染した患者、特に慢性感染者の治療のために特に着目される。
Ｂ型肝炎は重大な公衆衛生問題であり、世界で３億５千万人を超える慢性感染者があり、そのうち２０〜４０％が慢性肝臓疾患、肝硬変および肝細胞癌を発症するリスクがある。有効な予防ワクチンが存在するにもかかわらず、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染は多くの国々に、先進国であっても、依然として蔓延しており、世界の新たな感染例は年間４５０万人と推計されている。皆接種を実施しようというＷＨＯの推奨とは異なり、フルコース予防接種の普及率は、アジアの２５％からヨーロッパの７５〜９０％まで様々である。現在のところ、Ｂ型肝炎は死因の第１０位であり（死者数は１００万人前後／年）、ＨＢＶは５番目に多い癌である肝臓癌に関連している。ＨＢＶ感染の地理的分布は一様ではなく、罹患率は西洋諸国では１％未満であり、東南諸国、アフリカの大部分、および南アメリカの赤道付近では１０％を超えている。
Ｂ型肝炎ウイルスはヘパドナウイルス科(Hepadnaviridae)のメンバーであり、主として肝臓に感染し、肝細胞で複製する。これらの感染性粒子がいわゆる４２〜４５ｎｍの「デーン(Dane)粒子」であり、３つの異なる表面タンパク質（ＨＢｓ）を有する外部リポタンパク質エンベロープと内部ヌクレオキャプシド（その主要な構造タンパク質はコアタンパク質（ＨＢｃＡｇ）である）からなる。このヌクレオキャプシド内には、ウイルスポリメラーゼタンパク質（Ｐ）と連結された１コピーのＨＢＶゲノムが存在する。ＨＢＶ感染患者の血液には、４２〜４５ｎｍビリオンの他、感染細胞から放出された、ＨＢｓＡｇと宿主由来脂質から構成される２０ｎｍの球状物が含まれる。これらの球状物の数はビリオンの１０４〜１０６倍である。
ビリオンは未知の受容体により肝細胞に侵入した後、ヌクレオキャプシドによりゲノムＨＢＶ ＤＮＡが核に移行し、そこで弛緩型環状ＤＮＡが共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）に変換される。このｃｃｃＤＮＡは４つのウイルスＲＮＡの転写の鋳型として働き、これらのＲＮＡは細胞質に輸送され、ＨＢＶタンパク質の翻訳のためのｍＲＮＡとして用いられる。最も長い（プレゲノム）ＲＮＡはＨＢＶ複製の鋳型としても働き、細胞質のヌクレオキャプシド内で生じる。このＨＢＶ ＤＮＡおよびポリメラーゼ含有キャプシドの一部は核に戻され、そこでそれらは新たに生成された弛緩型環状ＤＮＡを放出し、さらなるｃｃｃＤＮＡを形成する。半減期が肝細胞の半減期よりも長いので、ｃｃｃＤＮＡはＨＢＶの存続に関与する。他のキャプシドは小胞体への出芽によってエンベロープを獲得し、ゴルジ複合体を通過した後に分泌される。
ＨＢＶゲノムの構造的および機能的組織化は３０年以上調べられてきた。ＨＢＶゲノムは全長マイナス鎖とそれより短いプラス鎖からなる、およそ３，２００ヌクレオチドの弛緩型で環状の、部分的に二本鎖であるＤＮＡである。ＨＢＶゲノムは４つのオーバーラップオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、Ｃ、Ｓ、ＰおよびＸを含む。Ｃ ＯＲＦは、ヌクレオキャプシドを構成する１８３アミノ酸長のタンパク質であるコアタンパク質（またはＨＢｃＡｇ）と、ウイルス複製中に患者の血清に見られる、プレコアＮ末端伸長部とＨＢｃＡｇの一部を含んだＨＢｅＡｇとして知られる第２のタンパク質とをコードする。コアタンパク質のＣ末端は塩基性が極めて高く、核酸と結合すると予想されるＡｒｇに富んだ４つのドメインならびに多くのリン酸化部位を含む。Ｓ ＯＲＦは、３つの表面タンパク質をコードし、これらの表面タンパク質は総て同じＣ末端を有するが、３つのインフレームＡＴＧ開始コドンが存在することでそのＮ末端が異なり、Ｓ ＯＲＦはこれらの開始コドンによって３つの領域、それぞれＳ（２２６アミノ酸）、ｐｒｅ−Ｓ２（５５アミノ酸）およびｐｒｅ−Ｓ１（１０８アミノ酸）に分かれる。ラージ表面抗原タンパク質（Ｌ）は、第１のＡＴＧ開始コドンでの翻訳開始後に産生され、３８９個のアミノ酸残基を含んでなる（ｐｒｅＳ１−ｐｒｅＳ２−Ｓ）。ミドル表面抗原タンパク質（Ｍ）は、第２の開始ＡＴＧで始まるＳ領域とｐｒｅ−Ｓ２領域の翻訳から生じ、２２６アミノ酸のスモール表面抗原タンパク質（Ｓ、ＨＢｓＡｇとも呼ばれる）は、第３のＡＴＧコドンで始まるＳ領域の翻訳から生じる。ＨＢＶ表面タンパク質は、Ｎ−グリコシド結合により結合された糖側鎖（グリカン）を有する糖タンパク質である。Ｐ ＯＲＦはウイルスポリメラーゼをコードし、Ｘ ＯＲＦは、転写アクチベーターであると考えられる、Ｘタンパク質として知られるタンパク質をコードする。
ウイルスポリメラーゼは、ＨＢＶ遺伝子型によれば約８３２〜８４５個のアミノ酸残基長であり、コア遺伝子の３’末端と表面タンパク質遺伝子全域に重複を持つ長いオープンリーディングフレーム（「Ｐ」）にコードされている。ウイルスポリメラーゼは、３つの機能的ドメイン、それぞれ、末端タンパク質、ポリメラーゼ、およびＨＢＶ複製の主要な工程（プライミング、ＤＮＡ合成およびＲＮＡ鋳型の除去）を触媒するＲＮアーゼＨドメイン、ならびに末端タンパク質とポリメラーゼドメインの間に存在する非必須スペーサードメインの、４つのドメインから構成される多機能性タンパク質である（例えば、Radziwill et al., 1990, J. Virol. 64:613; Bartenschlager et al., 1990, J. Virol. 64, 5324参照）。酵素活性を担う触媒部位は、すでに同定されている。これに関して、保存されたＹＭＤＤモチーフを形成する４個の残基（８３２残基長のポリメラーゼに関して符番して残基５３８〜５４１）がＤＮＡ依存的およびＲＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼ活性に不可欠であることが示されているが、ＲＮアーゼＨ活性は、４個の非保存的アミノ酸残基、それぞれ、６８９番のＡｓｐ（Ｄ）、７１８番のＧｌｕ（Ｅ）、７３７番のＡｓｐ（Ｄ）および７７７番のＡｓｐ（Ｄ）を含むＤＥＤＤモチーフ、ならびに７６９番のＶａｌ（Ｖ）および７７６番のＴｈｒ（Ｔ）を含む他の少数のアミノ酸残基に基づく。ＲＴポリメラーゼ活性およびＲＮアーゼＨ活性を無効にする種々の突然変異が当技術分野ですでに記載されている(Chang et al., 1990, J. Virol. 64: 5553; Bartenschlager et al., 1990, J. Virol. 64, 5324, Radziwill et al., 1990, J. Virol. 64:613およびChen et al., 1996, J. Virol. 70:6151)。いくつかのグループが、種々の宿主系におけるＨＢＶポリメラーゼタンパク質の発現に成功しているが、その発現は発現細胞にとって有毒であり、誘導プロモーターの使用を必要とすることが報告されている(Choi et al., 2002, Antiviral Res. 55:279; Kar
imi et al., 2002, J. Virol. 76:8609)。
有効な抗ウイルス応答に対するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答の重要性を強調している前臨床および臨床研究がいくつかある。実際に、Ｂ型肝炎から自然に回復した患者は、末梢血において容易に検出できるＴヘルパー（ＴＨ）リンパ球および細胞傷害性Ｔ（ＣＴＬ）リンパ球により媒介される多重特異的かつ持続的応答を獲得していたことが認められた。抗ＨＢｅおよび抗ＨＢｓ抗体の出現は、有利な感染転帰を示す。ＨＢｓＡｇ特異的抗体は中和型であり、感染防御免疫を媒介し、臨床的回復後も生涯持続する。
しかしながら、慢性ＨＢＶ感染は、免疫系によってはまれにしか解決されない。慢性感染患者の大多数は、弱い一時的なＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞免疫応答を示し、これらは抗原性が限られており、ウイルス感染を排除するには有効でない。慢性Ｂ型肝炎における細胞性免疫応答のエフェクター機能のこの変化の理由は、ＨＢＶ慢性感染患者でアップレギュレートされているＰＤ−１、ＣＴＬＡ４などの種々の阻害分子の関与が見られているとしても、現在のところよく理解されていない。従って、有効なＴ細胞応答を誘導し得る免疫調節戦略の必要がある。
慢性Ｂ型肝炎の従来の治療には、ペグ化インターフェロン−α（ＩＦＮａ）およびヌクレオシド／ヌクレオチド類似体（ＮＵＣ）、例えば、ラミブジン、より最近ではエンテカビル、テルビブジン、アデホビルおよびテノホビルが含まれる。ＩＦＮａは、ウイルス複製を阻害する強力な抗ウイルス分子であるが、患者の２５〜３０％に過ぎないものの重篤な副作用を引き起こす。ＮＵＣは、プレゲノムＲＮＡのネガティブＤＮＡ鎖、次いで二本鎖ウイルスＤＮＡへの逆転写の阻害を目的としたＨＢＶポリメラーゼの競合的阻害剤として働く。ＮＵＣは、新たなビリオンの形成を制限するが、新たな後代ウイルスの供給源となる感染肝細胞の核に潜伏するスーパーコイルｃｃｃＤＮＡを排除するには有効でない。このことで、ＮＵＣの有効性が一時的で、治療中止直後にウイルスリバウンドが起こり、患者を生涯、治療下に置く必要がある理由を説明することができる。さらに、長期の有効性は耐性ＨＢＶ変異株の出現によっても制限される（新しいＮＵＣほどはるかに少ない薬剤耐性ＨＢＶ変異株の発生率を示したが、いくつかの研究で報告されたところでは、ラミブジン治療の１年後に２４％超、４年後にはおよそ６６％）。抗ウイルス薬に対して感受性の低下を示すいくつかのＨＢＶ系統が現在単離されており、ゲノムシーケンシグにより、ＹＭＤＤモチーフを含むポリメラーゼドメイン内に置換突然変異の高スポットが明らかにされている（ＵＳ２００８−０２３３５５７；Zoulim and Locarnini, 2009, Gastroenterology, 137: 1593)。
抗ウイルス療法の他、現在、宿主の免疫応答、具体的には、細胞傷害性Ｔリンパ球およびヘルパーＴリンパ球により媒介される免疫応答の改良を目的とする補助療法を開発するための努力がなされている。いくつかの有望なワクチン戦略は、ＨＢＶ表面タンパク質Ｓ、ｐｒｅＳ１および／またはｐｒｅＳ２(Zanetti et al., 2008, Vaccine 26: 6266; Mancini-Bourguine et al., 2006, Vaccine 24:4482)ならびに複数のＨＢＶ抗原を同時に標的とすることを目的とする多価免疫療法アプローチに焦点を当てている。例えば、複数のエンベロープ、コアおよびポリメラーゼエピトープをコードするポリエピトープＤＮＡワクチンを用いた免疫誘導は、前臨床マウスモデルにおいてＣＴＬ応答およびＴＨ応答を惹起することが示されている(Depla et al., 2008, J. Virol. 82: 435)。ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇおよびＨＢＶポリメラーゼをコードするＤＮＡプラスミドの混合物に基づくアプローチ（ＷＯ２００５／０５６０５１；ＷＯ２００８／０２０６５６）は、慢性Ｂ型肝炎のトランスジェニックマウスモデルにおいて特異的抗ＨＢＶ細胞性応答および体液性応答を示した(Chae Young Kim et al., 2008, Exp. Mol. Medicine 40: 669)。第Ｉ相臨床試験が韓国でＨＢＶ保菌者において、ラミブジン治療と併用して開始されている(Yang et al., 2006, Gene Ther. 13: 1110)。最近検討されている別のアプローチは、ＨＢｃとＨＢＶポリメラーゼの組合せをＨｂｓ免疫原性ドメインとともにコードするベクターを用いる治療ワクチンの使用を含む（ＷＯ２０１１／０１５６５）。Ａｄベクターを用いたワクチンで免疫誘導されたマウスは、発現されたＨＢＶ抗原の総てに対して、特にポリメラーゼに対してＴ細胞応答を示した。
ＨＢＶは、感染の慢性かつ持続性、その高い罹患率、ＨＢＶの継続的伝達および関連疾患の顕著な罹患率のために長年、重大な世界的健康脅威となり続けると思われる。従って、ＨＢＶ感染またはＨＢＶ関連疾患もしくは障害の予防および治療を改善するためのより有効なアプローチを開発する重要な必要性がある。特に、標的ＨＢＶ抗原に対する、特にコアに対するＴ細胞性免疫を制御するアプローチ、および低い潜在毒性の必要がなおある。このようなアプローチは、ＨＢＶに慢性感染した被験体を治療するために特に有用である。
この技術的問題は、特許請求の範囲に定義される実施態様の提供によって解決される。
本発明のその他およびさらなる側面、特徴および利点は、下記の本発明の現在好ましい実施態様の説明から明らかとなる。これらの実施態様は開示の目的で示されるものである。
発明の概要
一つの側面において、本発明は、天然型ＨＢＶポリメラーゼの少なくとも５００個のアミノ酸残基を含んでなる変異型ポリメラーゼポリペプチドに関し、前記変異型ポリメラーゼポリペプチドは、ポリメラーゼ活性を機能的に破壊する内部欠失を有するポリメラーゼドメインを含んでなり、前記内部欠失は、天然型ポリメラーゼのポリメラーゼドメインに天然に存在するＹＭＤＤモチーフを少なくとも含む。
本発明はまた、前記変異型ポリメラーゼポリペプチドをコードする核酸分子、前記核酸分子を含んでなるベクター、または前記変異型ポリメラーゼポリペプチドを含んでなるか、もしくはコードする組成物に関する。
本発明はまた、ＨＢＶ感染を治療、予防もしくは阻害すること、またはＨＢＶ感染に関連する病態を改善することを目的とした、この変異型ポリメラーゼポリペプチド、核酸分子、ベクターまたは組成物の、好ましくは、付加的ポリペプチド（例えば、１種類以上のＨＢＶポリペプチド）と組み合わせた使用に関する。
また、本発明のさらなる側面は、必要とする被験体において、ＨＢＶ感染を治療、予防もしくは阻害する、またはＨＢＶ感染に関連する病態を改善する方法を含み、その方法は、この変異型ポリメラーゼポリペプチド、核酸分子、ベクターまたは組成物を、最終的に付加的ポリペプチド（例えば、１種類以上のＨＢＶポリペプチド）および／または標準治療と組み合わせて提供または投与することを含んでなる。
本発明のなおさらなる側面は、必要とする被験体において免疫応答を惹起する方法に関し、その方法は、この被験体において免疫応答を誘導もしくは刺激する目的で、あるいはＨＢＶ感染を治療するため、またはＨＢＶ感染に関連する病態もしくは症状を改善するために、この変異型ポリメラーゼポリペプチド、核酸分子、ベクターまたは組成物を、最終的に付加的ポリペプチド（例えば、１種類以上のＨＢＶポリペプチド）および／または標準治療と組み合わせて提供または投与することを含んでなる。
本発明のなおさらなる側面は、本明細書に記載の組成物および方法に従って、この変異型ポリメラーゼポリペプチド、核酸分子、ベクターまたは組成物を、最終的に付加的ポリペプチド（例えば、１種類以上のＨＢＶポリペプチド）と組み合わせて被験体に提供または投与するための複数の容器および説明書を含んでなるパーツキットを提供する。
発明の具体的説明
本発明は、ポリメラーゼ活性を機能的に破壊する内部欠失を有する突然変異ポリメラーゼドメインを含んでなる変異型ポリメラーゼポリペプチドであって、前記内部欠失が、天然型ＨＢＶポリメラーゼのポリメラーゼドメインに天然に存在するＹＭＤＤモチーフを少なくとも含んでなる、変異型ポリメラーゼポリペプチドを提供する。このような変異型ポリメラーゼポリペプチドまたはそれをコードするベクターは、最終的に他のＨＢＶポリペプチドおよび／または標準治療と組み合わせた、ＨＢＶ感染またはＨＢＶ感染に関連する病態の治療または予防のための組成物および方法において使用することができる。本発明により、関連する酵素活性の破壊による種々のベクター系での変異型ポリメラーゼポリペプチドの発現および生産を想定することができる。本発明はまた、特にヒト用途に適合され、標準治療（例えば、ＳＯＣ）を強化するために使用することができる。ＨＢｃおよびＨｂｓ免疫原性ドメインと融合したこの変異型ポリメラーゼポリペプチドをコードするベクターで動物モデルの免疫誘導を行ったところＨＢＶ特異的Ｔ細胞応答が惹起され、驚くことにＨＢｃとポリメラーゼの療法に対する強い免疫が見られた。
下節に、本明細書で使用するいくつかの用語の意味の、より詳しい説明を示す。
定義
本明細書全体を通して使用する用語「１つの(a and an)」は、特に断りのない限り、それらが「少なくとも１つ」、「少なくとも第１」、「１以上」または「複数」の引用化合物または工程を意味するという意味で用いられる。
用語「および／または」は、本明細書で用いる場合には常に、「および」、「または」および「この用語によってつながれた要素の総てまたは他の任意の組合せ」の意味を含む。
本明細書において使用する用語「約」または「およそ」は、示された値または範囲の１０％以内、好ましくは８％以内、より好ましくは５％以内を意味する。
用語「アミノ酸」、「残基」および「アミノ酸残基」は同義であり、天然アミノ酸ならびにアミノ酸類似体（例えば、非天然アミノ酸、合成アミノ酸、およびＤまたはＬ光学異性体を含む修飾アミノ酸）を包含する。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、ペプチド結合によって結合された少なくとも９個以上のアミノ酸を含んでなるアミノ酸残基ポリマーを意味する。このポリマーは直鎖、分岐または環状であってよく、天然に存在するアミノ酸および／またはアミノ酸類似体を含んでなってよく、非アミノ酸が挿入されていてもよい。一般的な指標として、アミノ酸ポリマーが５０個を超えるアミノ酸残基であれば、好ましくはポリペプチドまたはタンパク質と呼ばれ、５０アミノ酸長以下であれば、「ペプチド」と呼ばれる。
本明細書において使用する、生成物、組成物および方法を定義するために用いる場合の用語「含んでなる(comprising)」（ならびに「comprise」および「comprises」などの含んでなる(comprising)の任意の形態）、「有する(having)」（ならびに「have」および「hasなどの有する(having)の任意の形態）、「含む(including)」（ならびに「includes」および「include」などの含む(including)の任意の形態）または「含有する(containing)（ならびに「contains」および「contain」などの含有する(containing)の任意の形態）はオープンエンドであり、列挙されていない付加的な要素または方法工程を排除しない。よって、ポリペプチドは、あるアミノ酸配列がそのポリペプチドの最終的なアミノ酸配列の一部となり得る場合には、そのアミノ酸配列を含んでなる。このようなポリペプチドは、最大数百の付加的アミノ酸残基を有することができる。「から本質的になる」とは、いずれの本質的に重要な他の成分または工程も排除することを意味する。よって、列挙された成分から本質的になる組成物は微量の混入物および薬学上許容可能な担体を排除するものではない。あるアミノ酸配列が最終的に付加的アミノ酸残基を数個だけ伴って存在する場合には、ポリペプチドはそのようなアミノ酸配列から「本質的になる」。「からなる」とは、微量要素とは言えない他の成分または工程を排除することを意味する。例えば、あるポリペプチドが列挙されたアミノ酸配列以外のいずれのアミノ酸も含まない場合には、そのポリペプチドはそのアミノ酸配列「からなる」。
本明細書において使用する「ＨＢＶ」および「Ｂ型肝炎ウイルス」は互換的に使用され、ヘパドナウイルス科のいずれのメンバーも意味する（例えば、Ganem and Schneider in Hepadnaviridae (2001) "The viruses and their replication", pp2923-2969, Knipe DM et al., eds. Fields Virology, 4th ed. Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkinsまたは後続版を参照）。種々のＨＢＶポリペプチドのアミノ酸配列およびコードヌクレオチド配列は専用のデータバンク（例えば、上述のもの）および文献に見出すことができる（例えば、Valenzuela et al., 1980, The nucleotide sequence of the hepatitis B viral genome and the identification of the major viral genes (pp57-70) in "Animal Virus Genetics"; eds B. Fields, et al; Academic Press Inc., New York and Vaudin et al., 1988, J. Gen. Virol. 69: 1383参照）。
本明細書において使用する用語「ＨＢＶポリメラーゼ」は、天然型ＨＢＶポリメラーゼタンパク質に含まれる少なくとも５００個のアミノ酸残基を保持するポリペプチドを意味する。望ましくは、このような少なくとも５００個のアミノ酸残基は、天然型ＨＢＶポリメラーゼに天然に存在する３つの機能的ドメインにわたって、好ましくは４つのドメインにわたって散在する。この用語は、用語「ＨＢＶ」に関して上記に引用されたものなど、自然界のＨＢＶ供給源から発見、単離、入手が可能な任意のＨＢＶ系統、分離株、または遺伝子型の天然型（すなわち、天然に存在する）ポリメラーゼポリペプチド、ならびに改変型ポリメラーゼ（すなわち、変異型ポリメラーゼポリペプチド）およびその断片を包含する。説明のため、本明細書に記載のＨＢＶポリメラーゼのアミノ酸残基が、８３２アミノ酸長のポリメラーゼに関して符番されており、モチーフＴｙｒ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ａｓｐ（ＹＭＤＤ）の残基Ｔｙｒは５３８番の残基となっている。このアミノ酸残基の符番を他のポリメラーゼ（例えば、８４３または８４５アミノ酸長）に適合させることは当業者の能力の範囲内である。
本明細書において使用する用語「天然」または「天然に存在する」は、アミノ酸配列（例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質など）またはヌクレオチド配列（例えば、遺伝子、核酸分子、ポリヌクレオチドなど）に関して用いる場合、人工的に改変されたまたは実験室で人が突然変異させたもの（すなわち、突然変異体）とは異なり、自然界の供給源から発見、単離、入手が可能なアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味する。このような自然界の供給源には、ＨＢＶに感染した、または曝された生物から採取された生体サンプル（例えば、血液、血漿、血清、精液、唾液、組織切片、生検標本など）、培養細胞（例えば、ＨｅｐＧ２．２．１５、ＨｕＨ６−Ｃ１５(Sureau et al., 1986, Cell 47:37; Sells et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84(4): 1005)；ＨｕＨ７．ＴＡ６１またはＨｕＨ７．ＴＡ６２(Sun et al., 2006, J Hepatol. 45(5):636)、組織培養物ならびに組換え材料が含まれる。組換え材料として、限定されるものではないが、ＨＢＶ分離株（例えば、寄託機関で入手可能）、ＨＢＶゲノム、ゲノムＲＮＡもしくはｃＤＮＡライブラリー、ＨＢＶゲノムまたはその断片を含有するベクターまたはこのような要素を含むことが知られている従来技術の任意のベクターが含まれる。
説明のため、「天然型ＨＢＶポリメラーゼ」とは、当技術分野で記載されている天然に存在する任意のＨＢＶ遺伝子型、系統または分離株のＯＲＦ Ｐ（例えば、遺伝子型によって８３２〜８４５個のアミノ酸のポリペプチド）によりコードされているＨＢＶポリメラーゼまたはその断片を意味する。用語「天然」にはまた、特定の遺伝子型に代表的な、従って、一般に特定の遺伝子型の種々のＨＢＶポリメラーゼの配列アラインメントの後に決定されるコンセンサスまたはニアコンセンサス(near consensus)配列に相当するアミノ酸配列を含んでなる、ＨＢＶポリメラーゼポリペプチド／ペプチドも包含する。
本明細書において使用する用語「変異型」は、天然の対応物に対して１以上の突然変異を示すポリペプチドを意味する。説明のため、「変異型ポリメラーゼポリペプチド」とは、本明細書に記載のように人工的に突然変異させた、または実験室で人が変化させた後の、天然型ポリメラーゼに由来するポリメラーゼポリペプチドを意味する。１以上のヌクレオチド／アミノ酸残基の置換、挿入および／または欠失、非天然構成（例えば、外来ポリペプチド／ペプチドとの融合）ならびにこれらの可能性の任意の組合せを含む、任意の突然変異を想定することができる。いくつかの突然変異が企図される場合、連続残基および／または非連続残基を意図することができる。突然変異は、部位特異的突然変異誘発（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｌｅｓ Ｕｌｌｉｓ、ＦｒａｎｃｅのＳｃｕｌｐｔｏｒ（商標）ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発システムを使用）、ＰＣＲ突然変異誘発、ＤＮＡシャッフリングおよび化学合成技術によるもの（例えば、合成核酸分子を得るもの）など、当業者に公知のいくつかの方法によって作出することができる。好ましい実施態様によれば、本発明によって企図される突然変異は、ポリメラーゼ活性および／またはＲＮアーゼＨ活性などの少なくとも１つの酵素活性を破壊する目的では、天然型ＨＢＶポリメラーゼにより示される少なくとも１つの酵素活性に直接的または間接的に関与する１以上のアミノ酸残基（保存的または非保存的）の欠失および／または置換を包含する。本発明に関して、得られる変異型ポリメラーゼポリペプチドは全体として、対応する天然型ＨＢＶポリメラーゼの非突然変異部分と高い程度の同一性（例えば、少なくとも８０％）を保持する。
本発明において所与の酵素活性に関して使用する用語「破壊する(disrupt)」または「disrupting」などのいずれの派生語も、「無効にする」（残存活性が全くない）または「有意に低下させる」（残存活性が天然型ポリメラーゼにより示される活性の２０％未満）を意味する。
用語「同一性」とは、２つのポリペプチド配列またはヌクレオチド配列間のアミノ酸とアミノ酸またはヌクレオチドとヌクレオチドの正確な一致を意味する。２つの配列間の同一性パーセンテージは、最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮した場合に、それらの配列が共通に持つ同一の位置の数の関数である。アミノ酸配列間の同一性パーセンテージを決定するためには、例えば、ＮＣＢＩで利用可能なＢｌａｓｔプログラムまたはＡｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ＳｔｒｕｃｔｕｒｅにおけるＡＬＩＧＮ(Dayhoffed., 1981, Suppl., 3 482-489)などの種々のコンピュータープログラムおよび数学的アルゴリズムが当技術分野で利用可能である。ヌクレオチド配列間の相同性を決定するためのプログラムもまた、専用のデータベース（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ、ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＧＡＰプログラム）で利用可能である。説明のため、本明細書において使用する「少なくとも８０％の配列同一性」とは、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を意味する。
本明細書において使用する用語「単離された」とは、その天然環境から取り出された（すなわち、それが自然状態で会合している少なくとも１つの他の成分から分離されている）タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、プラスミドベクター、ウイルスベクター、または宿主細胞を意味する。
ＨＢＶ配列
限定されるものではないが、ＧｅｎｂａｎｋおよびＰｕｂＭｅｄに記載されているＨＢＶ配列を含め、当技術分野の研究者にとって容易に利用可能な配列を含むいくつかのＨＢＶ配列が、本明細書に記載の実施態様での使用に好適である。説明のため、広範囲の系統解析により、Ｂ型肝炎ウイルスを、高い程度の配列保存を示しながら異なる地理的分布および臨床転帰を示す８つの主要な遺伝子型（Ａ〜Ｈ）に分類するに至っている。また、種々のＨＢＶがＨＢｓＡｇ関連血清学に関して９つの異なるサブタイプ（ａｙｗ１、ａｙｗ２、ａｙｗ３、ａｙｗ４、ａｙｒ、ａｄｗ２、ａｄｗ４、ａｄｒｑ＋およびａｄｑｒ−）に分類されている（Mamum-Al Mahtab et al.による総説, 2008, Hepatobiliary Pancrease Dis Int 5: 457; Schaeffer, 2007, World Gastroenterol. 7: 14参照）。各遺伝子型および血清型は、異なるＨＢＶ系統および分離株を包含する。分離株は、ＨＢＶの特定の供給源（例えば、患者サンプルまたはその他の生物学的ＨＢＶ保有宿主）から単離された特定のウイルスに相当するが、系統は、ゲノム配列に関して違いに極めて近い、異なる分離株を包含する。
遺伝子型Ａの例示的ＨＢＶには、限定されるものではないが、分離株ＨＢ−ＪＩ４４４ＡＦおよび系統ＨＢ−ＪＩ４４４Ａ（受託番号ＡＰ００７２６３）が含まれる。遺伝子型Ｂの例示的ＨＢＶには、限定されるものではないが、クローンｐＪＤＷ２３３（受託番号Ｄ００３２９）、分離株ＨＢＶ／１４６１１（受託番号ＡＦ１２１２４３）、ＨＢＶ−Ｂ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ２８２９１７．１）、ＨＢＶ系統Ｗｈｕｔｊ−３７（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ２９３３３０９．１）、Ｃｈｉｎｅｓｅ ＨＢＶ系統ＧＤＨ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ７６６４６３．１）およびＨＢＶ分離株５７−１サブタイプａｄｗ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５１８５５６．１）が含まれる。遺伝子型Ｃの例示的ＨＢＶには、限定されるものではないが、分離株ＡＨ−１−ＯＮ９８０４２４（受託番号ＡＢ１１３８７９）、系統ＨＣＣ−３−ＴＴ（受託番号ＡＢ１１３８７７）、ＨＢＶ分離株ＳＷＴ３．３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＵ９１６２４１．１）、ＨＢＶ分離株Ｈ８５（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ３０６１３６．１）、ＨＢＶ系統Ｃ１２４８（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＤＱ９７５２７２．１）、ＨＢＶ分離株ＣＨＮ−Ｈ１５５（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＤＱ４７８９０１．１）およびＨＢＶ分離株ＧＺ２８−１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＦ６８８０６２）が含まれる。遺伝子型Ｄの例示的ＨＢＶには、限定されるものではないが、分離株ＫＡＭＣＨＡＴＫＡ２７（受託番号ＡＢ１８８２４３）、ＡＬＴＡＹ１３６（受託番号ＡＢ１８８２４５）およびＹ０７５８７（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｙ０７５８７およびStoll-Becker et al., 1997, J. Virol. 71: 5399）ならびに受託番号ＡＢ２６７０９０として記載されているＨＢＶ分離株が含まれる。遺伝子型Ｅの例示的ＨＢＶには、限定されるものではないが、分離株ＨＢ−ＪＩ４１１Ｆおよび系統ＨＢ−ＪＩ４１１（受託番号ＡＰ００７２６２）が含まれる。遺伝子型Ｆの例示的ＨＢＶには、限定されるものではないが、分離株ＨＢＶ−ＢＬ５９７（受託番号ＡＢ２１４５１６）およびＨＢＶ−ＢＬ５９２（受託番号ＡＢ１６６８５０）が含まれる。遺伝子型Ｇの例示的ＨＢＶには、限定されるものではないが、分離株ＨＢ−ＪＩ４４４ＧＦおよび系統ＨＢ−ＪＩ４４４Ｇ（受託番号ＡＰ００７２６４）が含まれる。遺伝子型Ｈの例示的ＨＢＶには、限定されるものではないが、分離株ＨＢＶ ＳＴ０４０４（受託番号ＡＢ２９８３６２）および分離株ＨＢ−ＪＩ２６０Ｆならびに系統ＨＢ−ＪＩ２６０（受託番号ＡＰ００７２６１）が含まれる。
本発明はこれらの例示的ＨＢＶ配列に限定されないことが意図される。実際に、本発明に従って使用されるＨＢＶポリペプチド／ペプチドのいずれかまたは総てのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、異なるＨＢＶ分離株および遺伝子型間では異なる場合があり、この天然の遺伝的バリエーションも本発明の範囲内に含まれる。さらに、本発明での使用におけるＨＢＶポリペプチド／ペプチドは特定の遺伝子型を代表するものと言え、従って、コンセンサスまたはニアコンセンサス配列に相当するアミノ酸配列を含んでなる。
さらに、ＨＢＶポリペプチド／ペプチドはそれぞれ、用語「ＨＢＶ」に関して上記されたものなど、これまでに同定されているＨＢＶ遺伝子型、系統または分離株に独立に由来し得る。このような構成は、この地域または特定の患者集団に固有のＨＢＶ遺伝子型を使用することにより、より広範なＨＢＶ遺伝子型に対する保護または特定の地域への適応を提供することを可能とする。これに関して、遺伝子型ＡおよびＣは米国で、遺伝子型ＡおよびＤは西欧諸国で、遺伝子型Ｄは地中海盆地で最も流行しており、遺伝子型ＢおよびＣは中国に最も多い。インドからの限られたデータでは、遺伝子型ＡおよびＤがインドで最も流行していることが示唆される。治療する集団および／または地域に応じて適当なＨＢＶ遺伝子型、血清型、系統および／または分離株を選択することは当業者の能力の範囲内である。
好ましい実施態様によれば、本発明での使用におけるＨＢＶポリペプチド／ペプチドは遺伝子型Ｄウイルスに由来し、特にＨＢＶ分離株Ｙ０７５８７が好ましい。
変異型ＨＢＶポリメラーゼ
本発明の変異型ポリメラーゼポリペプチドは、ポリメラーゼ活性を機能的に破壊しかつ天然型ポリメラーゼのポリメラーゼドメインに天然に存在するＹＭＤＤモチーフを少なくとも含む内部欠失を有する突然変異ポリメラーゼドメインを含んでなる。得られた変異型ポリメラーゼポリペプチドにより示されるポリメラーゼ活性の破壊は、当技術分野で周知のアッセイ（例えば、Radziwill et al., 1990, J Virol. 64:613に記載されている内因性ポリメラーゼアッセイ）を用いて評価することができる。
遺伝子型Ｂ、ＣおよびＤの天然型ＨＢＶポリメラーゼのポリメラーゼドメインを包含する一般アミノ酸配列は配列番号１で示され、ここで、７番の残基ＸａａはＴｈｒ（Ｔ）またはＡｌａ（Ａ）であり；１３番の残基ＸａａはＡｓｎ（Ｎ）、Ａｒｇ（Ｒ）またはＨｉｓ（Ｈ）であり；１６番の残基ＸａａはＩｌｅ（Ｉ）またはＴｈｒ（Ｔ）であり；３８番の残基ＸａａはＴｈｒ（Ｔ）またはＡｌａ（Ａ）であり；５３番の残基ＸａａはＳｅｒ（Ｓ）またはＡｓｎ（Ｎ）であり；５４番の残基ＸａａはＴｈｒ（Ｔ）またはＴｙｒ（Ｙ）であり；５５番の残基ＸａａはＨｉｓ（Ｈ）またはＡｒｇ（Ｒ）であり；９１番の残基ＸａａはＩｌｅ（Ｉ）またはＬｅｕ（Ｌ）であり；１０９番の残基ＸａａはＰｒｏ（Ｐ）またはＳｅｒ（Ｓ）であり；１１８番の残基ＸａａはＴｈｒ（Ｔ）またはＡｓｎ（Ｎ）であり；１２１番の残基ＸａａはＡｓｎ（Ｎ）またはＩｌｅ（Ｉ）であり；１２２番の残基ＸａａはＩｌｅ（Ｉ）またはＰｈｅ（Ｆ）であり；１２４番の残基ＸａａはＴｙｒ（Ｙ）またはＡｓｎ（Ｎ）であり；１２７番の残基ＸａａはＧｌｙ（Ｇ）またはＡｒｇ（Ｒ）であり；１３１番の残基ＸａａはＡｓｐ（Ｄ）またはＡｓｎ（Ｎ）であり；１３４番の残基ＸａａはＡｓｐ（Ｄ）またはＡｓｎ（Ｎ）であり；１４５番の残基ＸａａはＬｅｕ（Ｌ）またはＭｅｔ（Ｍ）であり；１４９番の残基ＸａａはＬｙｓ（Ｋ）またはＧｌｎ（Ｑ）であり；１５１番の残基ＸａａはＰｈｅ（Ｆ）またはＴｙｒ（Ｙ）であり；２２１番の残基ＸａａはＰｈｅ（Ｆ）またはＴｙｒ（Ｙ）であり；２２２番の残基ＸａａはＴｈｒ（Ｔ）またはＡｌａ（Ａ）であり；２２３番の残基ＸａａはＳｅｒ（Ｓ）またはＡｌａ（Ａ）であり；２２４番の残基ＸａａはＩｌｅ（Ｉ）またはＶａｌ（Ｖ）であり；２３８番の残基ＸａａはＡｓｎ（Ｎ）またはＨｉｓ（Ｈ）であり；２４８番の残基ＸａａはＡｓｎ（Ｎ）またはＨｉｓ（Ｈ）であり；２５６番の残基ＸａａはＳｅｒ（Ｓ）またはＣｙｓ（Ｃ）であり；２５７番の残基ＸａａはＴｒｐ（Ｗ）またはＴｙｒ（Ｙ）であり；２５９番の残基ＸａａはＴｈｒ（Ｔ）またはＳｅｒ（Ｓ）であり；２６３番の残基ＸａａはＧｌｕ（Ｅ）またはＡｓｐ（Ｄ）であり；２６６番の残基ＸａａはＶａｌ（Ｖ）またはＩｌｅ（Ｉ）であり；２６７番の残基ＸａａはＬｅｕ（Ｌ）またはＧｌｎ（Ｑ）であり；２７１番の残基ＸａａはＧｌｎ（Ｑ）、Ｍｅｔ（Ｍ）またはＧｌｕ（Ｅ）であり；３１７番の残基ＸａａはＳｅｒ（Ｓ）またはＡｌａ（Ａ）であり；かつ、３３２番の残基ＸａａはＣｙｓ（Ｔ）またはＳｅｒ（Ｓ）である。
本発明によれば、本発明の変異型ポリメラーゼポリペプチドに含まれる突然変異ポリメラーゼドメインは、配列番号１の一般ポリメラーゼドメインの２０３番〜２０６番に存在するＹＭＤＤモチーフを少なくとも欠く。
本発明はまた、少なくともこのＹＭＤＤモチーフを含んでなる、少なくとも４個のアミノ酸残基、多くて３０個のアミノ酸残の他の内部欠失も包含する。
本発明による代表的な変異型ポリメラーゼポリペプチドは、少なくとも２０３番のＴｙｒ残基、２０４番のＭｅｔ残基、２０５番のＡｓｐ残基および２０６番のＡｓｐ残基を欠くこと以外は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでなる突然変異ポリメラーゼドメインを含んでなる。
ＹＭＤＤモチーフに加え、内部欠失は天然型ＨＢＶポリメラーゼドメイン内のＹＭＤＤモチーフのＣ末端に存在する隣接ＶＶＬモチーフ（配列番号１の２０７〜２０９番の残基およびアミノ酸８３２個の天然型ポリメラーゼの５４２〜５４４番の残基に相当する）の総てまたは一部も包含することが好ましい。このようなＶＶＬモチーフは実際に、１以上のＨＢＶポリメラーゼ関連エピトープに対する宿主の免疫応答を低下させるまたはサイレンシングするリスクのある「接合(junctional)」エピトープ（例えば、同一直線上に合成された新規エピトープ）の形成に寄与する。
好ましくは、本発明の変異型ポリメラーゼポリペプチドは、少なくとも２０３番のＴｙｒ残基、２０４番のＭｅｔ残基、２０５番のＡｓｐ残基、２０６番のＡｓｐ残基、２０７番のＶａｌ残基、２０８番のＶａｌ残基および２０９番のＬｅｕ残基を欠くこと以外は配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する突然変異ポリメラーゼドメインを含んでなる。
より好ましくは、本発明の変異型ポリメラーゼポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性、有利には少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、いっそうより好ましくは１００％の同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる、あるいは前記アミノ酸配列から本質的になる、あるいはまた前記アミノ酸配列からなるポリメラーゼドメインを含んでなる。いっそうより好ましくは、突然変異ポリメラーゼドメインは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含んでなる。
代わりにまたは組み合わせて、本発明の変異型ポリメラーゼポリペプチドはまた、天然型ＨＢＶポリメラーゼにより天然に示されるＲＮアーゼＨ活性を機能的に破壊する１以上のアミノ酸残基の突然変異を含んでなる突然変異ＲＮアーゼＨドメインも含んでなる。
上述のように、ＲＮアーゼＨ活性に関与する機能的ドメインは、Ｃ末端部分、より詳しくは、天然型８３２アミノ酸長のＨＢＶポリメラーゼの６８０番からＣ末端まで（または天然型８４５アミノ酸長のＨＢＶポリメラーゼの６９３番からＣ末端まで）にマッピングされており、本発明は、ＲＮアーゼＨ活性の破壊と相関がある（すなわち、最終的に天然型ＲＮアーゼＨ活性の２０％未満の弱い残存活性をもたらす）このドメイン内の任意の突然変異を包含する。変異型ポリメラーゼポリペプチドにより示されるＲＮアーゼＨ活性の破壊は、当技術分野で周知のアッセイ（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮアーゼＨ活性アッセイまたはRadziwill et al., 1990, J Virol. 64:613もしくはLee et al., 1997, Biochem. Bioph. Res. Commun. 233(2):401に記載されているＤＮＡ−ＲＮＡタンデム分子分析）を用いて評価することができる。
遺伝子型Ｂ、ＣおよびＤの天然型ＨＢＶポリメラーゼのＲＮアーゼＨドメインを包含する一般アミノ酸配列は配列番号３に示され、ここで、２番の残基ＸａａはＳｅｒ（Ｓ）またはＰｒｏ（Ｐ）であり；１９番の残基ＸａａはＡｌａ（Ａ）またはＶａｌ（Ｖ）であり；２０番の残基ＸａａはＩｌｅ（Ｉ）またはＭｅｔ（Ｍ）であり；３０番の残基ＸａａはＶａｌ（Ｖ）またはＬｅｕ（Ｌ）であり；３１番の残基ＸａａはＡｌａ（Ａ）またはＳｅｒ（Ｓ）であり；５３番の残基ＸａａはＬｙｓ（Ｋ）またはＡｓｎ（Ｎ）であり；５４番の残基ＸａａはＬｅｕ（Ｌ）またはＩｌｅ（Ｉ）であり；５５番の残基ＸａａはＬｅｕ（Ｌ）またはＩｌｅ（Ｉ）であり；９７番の残基ＸａａはＡｌａ（Ａ）またはＴｈｒ（Ｔ）であり；１０８番の残基ＸａａはＴｙｒ（Ｙ）またはＳｅｒ（Ｓ）であり；１１５番の残基ＸａａはＰｒｏ（Ｐ）またはＬｅｕ（Ｌ）であり；１１６番の残基ＸａａはＰｈｅ（Ｆ）またはＴｙｒ（Ｙ）であり；１２８番の残基ＸａａはＶａｌ（Ｖ）またはＡｓｐ（Ｄ）である。
有利には、本発明の変異型ポリメラーゼポリペプチドのＲＮアーゼＨドメインに含まれる１以上の突然変異は、
・配列番号３の、およそ３９番のＧｌｕ残基（Ｅ）からおよそ４６番のＡｌａ（Ａ）残基に及ぶ部分（ｄｅｌ ＥＬＬＡＡＣＦＡ）を少なくとも含む少なくとも８個のアミノ酸、多くて６０個のアミノ酸の欠失；
・配列番号３の１０番のＡｓｐ（Ｄ）残基の、Ｄ以外のアミノ酸での置換；
・配列番号３の９０番のＶａｌ（Ｖ）残基の、Ｖ以外のアミノ酸での置換；
・配列番号３の９７番のＴｈｒ（Ｔ）またはＡｌａ（Ａ）残基の、ＴまたはＡ以外のアミノ酸での置換；
・配列番号３の９８番のＡｓｐ（Ｄ）残基の、Ｄ以外のアミノ酸での置換；および
・それらの任意の組合せ
からなる群から選択される。
適当な組合せ代表例には、限定されるものではないが、（ａ）１０番、９０番、９７番および９８番のアミノ酸残基の置換；（ｂ）ＧＬＬＡＡＣＦＡモチーフを含む８〜６０個のアミノ酸残基の欠失および列挙した位置のいずれかのアミノ酸残基の置換；または（ｃ）列挙した突然変異の総ての組合せが含まれる。
好適には、配列番号３の１０番、９０番、９７番または９８番の置換残基は、個々にＨｉｓ（Ｈ）残基またはＴｙｒ（Ｙ）残基に置き換わり、配列番号３の１０番の残基の、Ｈｉｓ（Ｈ）残基での置換（Ｄ６８９Ｈ）、配列番号３の９０番の残基の、Ｔｙｒ（Ｙ）残基での置換（Ｖ７６９Ｙ）、配列番号３の９７番の残基の、Ｔｙｒ（Ｙ）残基での置換（Ｔ７７６ＹまたはＡ７７６Ｙ）および／または配列番号３の９８番の残基の、Ｈｉｓ（Ｈ）残基での置換（Ｄ７７７Ｈ）が特に好ましい。
好適には、突然変異ＲＮアーゼ Ｈドメインに含まれる欠失は、配列番号３のおよそ３９番のＧｌｕ残基（Ｅ）からおよそ５７番のＴｈｒ（Ｔ）残基に及ぶ少なくとも１９個のアミノ酸残基の部分、好ましくは、配列番号３のおよそ３９番のＧｌｕ残基（Ｅ）からおよそ６３番のＬｅｕ（Ｌ）残基に及ぶ少なくとも２５個のアミノ酸の部分、より好ましくは、配列番号３のおよそ３１番の残基Ｘａａ（ＡまたはＳ）からおよそ６３番のＬｅｕ（Ｌ）残基に及ぶ少なくとも３３個のアミノ酸の部分を含む。
好ましくは、本発明の変異型ポリメラーゼポリペプチドは、（ａ）３１番の残基Ｘａａ（Ｘ）からおよそ６３番のＬｅｕ（Ｌ）残基に及ぶ３３個のアミノ酸残基の部分を欠き、かつ、（ｂ）１０番のＡｓｐ（Ｄ）残基の、Ｈｉｓ（Ｈ）残基での置換（Ｄ６８９Ｈ）；（ｃ）９０番のＶａｌ（Ｖ）残基の、Ｔｙｒ（Ｙ）残基での置換（Ｖ７６９Ｙ）；（ｄ）９７番の残基の、Ｔｙｒ（Ｙ）残基での置換（Ｔ／Ａ７７６Ｙ）；および（ｅ）９８番のＡｓｐ（Ｄ）残基の、Ｈｉｓ（Ｈ）残基での置換（Ｄ７７７Ｈ）を含んでなること以外は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含んでなる突然変異ＲＮアーゼＨドメインを含んでなる。
より好ましくは、本発明の変異型ポリメラーゼポリペプチドは、配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性、有利には少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、いっそうより好ましくは１００％の同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる、あるいは前記アミノ酸配列から本質的になる、あるいはまた前記アミノ酸配列からなる突然変異ＲＮアーゼＨドメインを含んでなる。
いっそうより好ましい実施態様では、本発明の変異型ポリメラーゼポリペプチドは、配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性、有利には少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、いっそうより好ましくは１００％の同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる、あるいは前記アミノ酸配列から本質的になる、あるいはまた前記アミノ酸配列からなる。配列番号５に示されるアミノ酸配列を含んでなる変異型ポリメラーゼポリペプチドがなおいっそうより好ましい。
本発明に関して、本発明の変異型ポリメラーゼポリペプチドは、付加的突然変異を含んでなり得る。しかしながら、免疫原活性に有害であり得る改変、特に、Ｂ、ＣＴＬおよび／またはＴＨエピトープに富んだ部分における改変は避けることが好ましい。
例示的な付加的改変には、Ｎ末端切断が含まれる。特に、天然型ＨＢＶポリメラーゼのまたは配列番号５のＮ末端に通常存在する少なくとも２０個のアミノ酸残基、多くて１００個のアミノ酸残基の切断が適当であり、配列番号５の１番または２番（Ｍｅｔイニシエーター）からおよそ４７番に及ぶ切断が特に好ましい。この改変は、変異型ポリメラーゼポリペプチドを天然型ＨＢＶコアポリペプチドと組み合わせて使用する場合に特に適切であり、これはこのようなＮ末端切断は、これら２つのポリペプチド間の重複部分の低減または削除に寄与するという事実のためである。しかしながら、非末端切断型の変異型ポリメラーゼポリペプチドを下記のようなＣ末端切断型ＨＢＶコアポリペプチドと組み合わせて使用しても同じことが達成できる。
得られた変異型ポリメラーゼポリペプチドは、免疫原性、特に、細胞媒介性免疫応答を刺激する能力を、天然型ポリメラーゼと同等の範囲あるいはまたそれより高く保持することが望ましい。
他のポリペプチドとの組合せ／融合
別の実施態様では、本発明の変異型ポリメラーゼポリペプチドは、１種類以上の付加的ポリペプチドまたはペプチドと組み合わせて使用することができる。
用語「組合せ」および「併用」などの変形形態は、同じ宿主生物に２種類以上の実体（そのうち１つは本発明の対象である）を投与するという行為を意味する。一般に、これらの少なくとも２つの実体は異なる経路で、異なるタイムスケジュールに従って投与することができる。好適な組合せとしては、限定されるものではないが、本明細書に記載の変異型ポリメラーゼポリペプチド（またはそれをコードするベクター）と抗ウイルス薬（ＳＯＣ）および／または付加的ポリペプチドもしくはそのような付加的ポリペプチドをコードするベクターとの組合せが含まれる。このような組合せは、（ａ）混合物（例えば、２種類以上のポリペプチドまたはベクターの混合物）、（ｂ）２以上の実体間の融合物、または（ｃ）特異的発現デザイン（例えば、２シストロン性発現または非依存的発現）を介するものの形態であってよい。例えば、２以上の実体は、同じベクターで、異なる調節エレメント（例えば、異なるプロモーターおよび終結配列）を用いて非依存的に発現させてもよい。この非依存的発現デザインは、プラスミドまたは麻疹ベクターからの発現に特に適合している。あるいは、２以上の実体は同じプロモーターおよび終結配列の制御下、２シストロン様式で発現させてもよいが、同じｍＲＮＡから２以上のシストロンの翻訳を可能とするＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位）などの付加的調節エレメントの使用が必要である。当技術分野では、ポリオウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスおよび脳心筋炎（ＥＭＣＶ）ウイルス（例えば、ＷＯ９５／２４４８５参照）に由来するものなど、ＩＲＥＳの広範な選択肢を利用することができる。２シストロン性デザインは、アデノウイルスベクターなどのクローニング能が比較的限定されているベクターからの発現に特に適合している。
本明細書において使用する用語「融合物」または「融合タンパク質」は、単一のポリペプチド鎖における２以上のポリペプチド／ペプチドの組合せを意味する。好ましくは、融合は、遺伝的手段、すなわち、前記ポリペプチド／ペプチドのそれぞれをコードするヌクレオチド配列をインフレームで融合させることによって行われる。「インフレームで融合させる」とは、融合されたコード配列の発現により、融合されたポリペプチド／ペプチドのそれぞれの間に翻訳ターミネーターを持たない単一のタンパク質が生じることを意味する。融合は直接的であっても（すなわち、間に付加的アミノ酸残基を持たない）またはリンカー（例えば、グリシン、セリン、トレオニン、アスパラギン、アラニンおよび／またはプロリンなどのアミノ酸残基のリピートから構成される３〜３０アミノ酸長のペプチド）を介したものであってもよい。
本発明の変異型ポリメラーゼポリペプチドと組み合わせて使用するための付加的ポリペプチドまたはペプチドは、好ましくは、任意の天然型ＨＢＶポリペプチド、その改変誘導体および／または断片などのＨＢＶゲノムによりコードされているポリペプチドまたはペプチドである。このようなＨＢＶポリペプチドまたはペプチドの代表例には、限定されるものではないが、ＨＢｃ（コア）、ＨＢｓ、Ｘタンパク質およびその任意の免疫原性断片が含まれる。
本発明によれば、前述のように、本発明での使用における付加的ＨＢＶポリペプチドまたはペプチドはいずれも、本発明の変異型ポリメラーゼポリペプチドを作出するＨＢＶ遺伝子型、系統または分離株と異なるまたは同じＨＢＶ遺伝子型、系統または分離株に由来し得る。好ましくは、このような付加的ＨＢＶポリペプチドは遺伝子型Ｄ ＨＢＶ、特に、Ｙ０７５８７分離株に由来する。
好ましい組合せは、本明細書に記載の変異型ポリメラーゼポリペプチドと付加的ポリペプチドの間の融合タンパク質の形態である。このような融合は好ましくは、融合物間にリンカーを持たずに直接的なものである。
コアとの組合せ
本明細書において使用する用語「コアポリペプチド」は、天然型ＨＢＶコア（ＨＢｃ）タンパク質に含まれる少なくとも１００個のアミノ酸残基を保持するポリペプチドを意味する。この用語は、用語「ＨＢＶ」に関して上記に引用されたものなど、自然界のＨＢＶ供給源から発見、単離、入手が可能な任意のＨＢＶ株、分離株または遺伝子型の天然型（すなわち、天然に存在する）コアポリペプチド、ならびにその改変型コアおよび断片を包含する。
本発明での使用におけるＨＢＶコアポリペプチドは、変異型ポリメラーゼポリペプチドを作出するものと同じまたは異なる遺伝子型を有するＨＢＶウイルスに由来し得る。好ましくは、それらは両方とも遺伝子型Ｄウイルス、より詳しくは、Ｙ０７５８７分離株に由来する。コアポリペプチドおよびそれらのコード配列は、コード配列の化学合成（例えば、合成核酸分子を得るもの）または組換え手段（例えば、対応するヌクレオチド配列の部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、ＤＮＡシャッフリング）によるなど、当業者に公知のいくつかの方法によって作出することができる。
本明細書に記載の変異型ポリメラーゼポリペプチドと組み合わせるかまたは融合させた場合に、得られるコアが有意な免疫原性を、好ましくは、天然型コア対応物と同等の範囲またはそれより高く保持する限り、いずれの改変も想定することができる。
好適な改変には、天然型コアポリペプチドのＣ末端にまたはそのＣ末端部分に通常存在する少なくとも１０個のアミノ酸残基、多くて４１個のアミノ酸残基の切断が含まれ、天然型コアポリペプチドの残基１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８または残基１４９からＣ末端（残基１８３）に及ぶ切断が特に好ましい。他の好適な改変には、１以上のアミノ酸残基の内部欠失、特に、外部ループを形成すると推定される残基８０の近傍に位置する領域などの表面露出領域におけるものが含まれる(Argos et al. 1988, EMBO J. 7: 819; Borisova et al., 1993, J. Virol. 67: 3696; Schodel et al., 1992, J. Virol. 66: 106; Yon et al., 1992, J. Gen Virol. 73: 2569;およびPumpens et al., 1995, Intervirology 38: 63)。
好ましい実施態様では、組合せは融合物の形態である。よって、本発明は、本明細書に記載の変異型ポリメラーゼポリペプチドと融合相手を含んでなる融合タンパク質に関する。好ましくは、融合相手はＨＢＶコアポリペプチドであり、Ｃ末端切断された、特に残基１４８で切断されたコアポリペプチドが特に好ましい。
好ましくは、ＨＢＶコアポリペプチドは、本明細書に記載の変異型ポリメラーゼポリペプチドのＮ末端とインフレームで融合されて、イニシエーターＭｅｔで始まり、停止コドンを持たないコアポリペプチド（改変型または天然型）、変異型ポリメラーゼポリペプチド（Ｍｅｔイニシエーターを持たない）および停止コドン、の融合タンパク質となっている。
好ましい融合タンパク質は、配列番号６に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性、有利には少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、いっそうより好ましくは１００％の同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる、あるいは前記アミノ酸配列から本質的になる、あるいはまた前記アミノ酸配列からなる。より好ましくは、本発明の融合タンパク質は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含んでなる。
免疫原性ＨｂｓＡｇドメインとの組合せ
前記実施態様（コアポリペプチドとの組合せ）の代わりにまたはそれと組み合わせて、本発明の変異型ポリメラーゼポリペプチドは、ＨｂｓＡｇまたはその免疫原性断片／ドメインと組み合わせて使用することができる。
本明細書において使用する用語「免疫原性ドメイン」は、天然型ＨＢｓＡｇタンパク質中に通常存在する、Ｔヘルパー（ＴＨ）細胞および／または細胞傷害性Ｔ（ＣＴＬ）細胞に特異的な少なくとも１つのＢ細胞および／またはＴ細胞エピトープを含んでなる、およそ１５〜およそ１００個のアミノ酸残基、好ましくは少なくとも２０個、多くて６０個の連続するアミノ酸を有するポリペプチドを意味する。さらにこのようなエピトープは種々のＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ抗原（例えば、Ａ２、Ａ２４、ＤＲ、ＤＰなど）に限定され得る。好ましくは、本発明で使用する１以上のＨＢｓＡｇ免疫原性ドメインは、ＨＢＶ ｐｒｅＳ１およびｐｒｅＳ２ポリペプチドのいずれの部分も含まない。
１以上の免疫原性ドメインのそれぞれは、本明細書に記載の変異型ポリメラーゼポリペプチド（および最終的にはコアポリペプチド）を作出するＨＢＶウイルスと同じであっても異なっていてもよい、同じまたは異なるＨＢＶウイルスに独立に由来し得る。好ましくは、１以上の免疫原性ドメインは遺伝子型Ｄ ＨＢＶ、特に、Ｙ０７５８７分離株に由来する。
本発明において使用可能な例示的免疫原性ドメインは当技術分野で記載されている（例えば、ＷＯ９３／０３７６４；ＷＯ９４／１９０１１；Desombere et al., 2000, Clin. Exp. Immunol 122: 390; Loirat et al., 2000, J. Immunol. 165: 4748; Schirmbeck et al., 2002, J. Immunol 168: 6253; Depla et al., 2008, J. Virol. 82: 435およびＷＯ２０１１／０１５６５６）。特に好ましい免疫原性ドメインには、ＷＯ２０１１／０１５６５６に記載されているｅｎｖ１およびｅｎｖ２ドメインが含まれる。「ｅｎｖ１」は、天然型ＨＢｓＡｇのおよそ１４番〜およそ５１番の部分に相当し、ｅｎｖ２は、ＨＢｓＡｇのおよそ１６５番〜およそ１９４番の部分に相当する。
好ましい実施態様では、組合せは融合物の形態であり、本発明は、本明細書に記載の変異型ポリメラーゼポリペプチドと１以上のＨＢｓＡｇ免疫原性ドメインとを含んでなる融合タンパク質、または１以上のＨＢｓＡｇ免疫原性ドメインをさらに含んでなる上記に定義される融合タンパク質（本明細書に記載の変異型ポリメラーゼポリペプチドとＨｂｃポリペプチドとを少なくとも含んでなる）に関する。１以上の免疫原性ドメインは融合タンパク質の、Ｎ末端、Ｃ末端および／または内部、例えば、変異型ポリメラーゼポリペプチド内（例えば、突然変異ポリメラーゼおよび／またはＲＮアーゼＨドメイン内の欠失部分の代わりに）またはコアと変異型ポリメラーゼポリペプチドの間に位置することができる。翻訳を媒介する調節エレメント（例えば、融合タンパク質のＮ末端およびＣ末端におけるイニシエーターＭｅｔおよび停止コドン）の必要性および位置を相応に定義することは当業者の能力の範囲内である。
特に注目される融合タンパク質は、本明細書に記載の変異型ポリメラーゼポリペプチドとコアポリペプチドと２つのＨＢｓＡｇ免疫原性ドメインとを含んでなり、突然変異ポリメラーゼドメイン（例えば、ｅｎｖ１）内の内部欠失の代わりに、および／または突然変異ＲＮアーゼＨドメイン（例えば、ｅｎｖ２）内の欠失の代わりに融合された１または２つのＨｂｓＡｇ免疫原性ドメインを含んでなる変異型ポリメラーゼポリペプチド（イニシエーターＭｅｔを含まない）に融合された、そのＮ末端にコアポリペプチド（例えば、天然型１８３残基またはイニシエーターＭｅｔを含む１４８残基を有する末端切断型）を含んでなる融合物が特に好ましい。
この実施態様の好ましい側面において、本発明の融合タンパク質は、配列番号７〜９に示されるアミノ酸配列のいずれかと少なくとも８０％の同一性、有利には少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、いっそうより好ましくは１００％の同一を示すアミノ酸配列を含んでなる、あるいは前記アミノ酸配列から本質的になる、あるいはまた前記アミノ酸配列からなる。特に好ましい実施態様は、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでなる融合タンパク質を対象とする。
本発明に関して、本発明の変異型ポリメラーゼポリペプチドまたは本発明の融合タンパク質は、さらなる構造的特徴をさらに含んでなり得る。
一つの実施態様において、それは、宿主生物におけるその免疫原性を改善することを目的とした付加的化合物（例えば、ペプチドまたはポリペプチド）を含んでなり得る。免疫原性を増強し得るこのような化合物は文献に記載されており、限定されるものではないが、カルレティキュリン(Cheng et al., 2001, J. Clin. Invest. 108: 669)、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）(Chen et al., 2000, Cancer Res. 60: 1035)、ユビキチン(Rodriguez et al., 1997, J. Virol. 71: 8497)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素Ａのトランスロケーションドメイン（ＥＴＡ（ｄＩＩＩ）(Hung et al., 2001 Cancer Res. 61: 3698)などの細菌毒素、ならびにＰａｎ−Ｄｒペプチド(Sidney et al., 1994, Immunity 1: 751)、ｐｓｔＳ１ ＧＣＧエピトープ(Vordermeier et al., 1992, Eur. J. Immunol. 22: 2631)、破傷風トキソイドペプチドＰ２ＴＴ(Panina-Bordignon et al., 1989, Eur. J. Immunol. 19: 2237)およびＰ３０ＴＴ(Demotz et al., 1993, Eur. J. Immunol. 23: 425)、インフルエンザエピトープ(Lamb et al., 1982, Nature 300: 66)およびヘマグルチニン(hemaglutinin)エピトープ(Rothbard et al., 1989, Int. Immunol. 1: 479)などのＴヘルパーエピトープが含まれる。
他の好適な構造的特徴は、本発明の変異型ポリメラーゼポリペプチドまたは融合タンパク質の合成、プロセッシング、安定性および溶解度に有益なもの（例えば、細胞膜への提示を改善するための潜在的切断部位、潜在的グリコシル化部位および／または膜係留を改変することを目的としたもの）である。
シグナルペプチドおよび／またはトランスメンブランペプチドなどの当技術分野で周知の適当な配列を用いることにより、細胞表面において本明細書に記載の変異型ポリメラーゼポリペプチドまたは融合タンパク質の合成を命令することは、免疫応答に有益であり得る。簡単に述べると、シグナルペプチドは一般に膜提示型または分泌型ポリペプチドのＮ末端に存在し、小胞体（ＥＲ）へのそれらの移行を誘導する。シグナルペプチドは通常１５〜３５個の本質的に疎水性のアミノ酸を含んでなり、次にこれらは特異的ＥＲ局在性エンドペプチダーゼによって除去されて成熟ポリペプチドとなる。トランスメンブランペプチドも本来、疎水性が高く、細胞膜内にポリペプチドを係留する働きをする。本発明に関して使用可能なトランスメンブランペプチドおよび／またはシグナルペプチドの選択肢は極めて広い。それらのペプチドは、膜係留型および／または分泌型ポリペプチド（例えば、細胞ポリペプチドまたはウイルスポリペプチド）、例えば、免疫グロブリン、組織プラスミノーゲン活性化因子、インスリン、狂犬病糖タンパク質、ＨＩＶウイルスエンベロープ糖タンパク質または麻疹ウイルスＦタンパク質のものなどから得てもよいし、または合成してもよい。
一つの実施態様において、本発明の変異型ポリメラーゼポリペプチドまたは融合タンパク質は、転写開始コドンのＮ末端下流に挿入されているシグナルペプチドとインフレームで融合されている。別の実施態様では、本発明の変異型ポリメラーゼポリペプチドまたは融合タンパク質は、シグナルペプチド（例えば、そのＮ末端に挿入されている）およびトランスメンブランペプチド（例えば、Ｃ末端、例えば、停止コドンのすぐ上流に挿入されている）とインフレームで融合されている。好ましくは、本発明に関して使用されるシグナルペプチドおよびトランスメンブランペプチドは狂犬病糖タンパク質に由来する（例えば、ＷＯ９９／０３８８５またはＷＯ２００８／１３８６４９参照）。好ましい実施態様は、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性、有利には少なくとも８５％の同一性、特に少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、より好ましくは１００％の同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる、あるいは前記アミノ酸配列から本質的になる、あるいは前記アミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ変異型ポリペプチドおよび融合タンパク質を対象とする。
核酸分子
別の側面において、本発明は、本明細書に記載の変異型ポリメラーゼポリペプチドおよび融合タンパク質をコードする単離された核酸分子を提供する。
本発明の文脈の範囲内で用語「核酸」、「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」および「ヌクレオチド配列」は互換的に使用され、ポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミド、ベクター、ウイルスゲノム、単離されたＤＮＡ、プローブ、プライマーおよびそれらの任意の混合物）もしくはポリリボヌクレオチド（ＲＮＡ）（例えば、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）のいずれか、または混合型ポリリボ−ポリデオキシリボヌクレオチドのいずれの長さのポリマーも定義する。それらは一本鎖または二本鎖、直鎖または環状、天然または合成ポリヌクレオチドを包含する。さらに、ポリヌクレオチドは天然に存在しないヌクレオチドを含んでなってもよく、非クレオチド成分が挿入されていてもよい。
本発明の核酸分子は、当技術分野で利用可能な配列データおよび本明細書に提供されている配列情報を用いて、いずれの供給源から作製することもできる。例えば、ＨＢＶポリメラーゼをコードするＤＮＡ配列および必要であればコアポリペプチドおよびＨＢｓＡｇ免疫原性ドメインは、ＨＢＶを含有する細胞、ｃＤＮＡおよびゲノムライブラリー、それを含むことが知られているウイルスゲノムまたは従来技術のベクターから独立に単離し、その後、好適には従来の分子生物学またはＰＣＲ技術によって連結することができる。あるいは、本発明の核酸分子はまた、化学合成により自動プロセスで作出する（例えば、オーバーラップ合成オリゴヌクレオチドまたは合成遺伝子から組み立てる）こともできる。改変は、化学合成、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、ＤＮＡシャッフリングなどの当業者に公知のいくつかの方法により作出することができる。
特に注目されるのは、
・配列番号１または２に示されるアミノ酸配列を有するポリメラーゼドメインを含んでなる変異型ポリメラーゼポリペプチドをコードする核酸分子；
・配列番号３または４に示されるアミノ酸配列を有するＲＮアーゼＨドメインを含んでなる変異型ポリメラーゼポリペプチドをコードする核酸分子；
・配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、１００％）の同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる変異型ポリメラーゼポリペプチドをコードする核酸分子；または
・配列番号６〜１２のいずれかに示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、１００％）の同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる融合タンパク質をコードする核酸分子
からなる群から選択される核酸分子のいずれかである。
本発明はこれらの例示的ヌクレオチド配列に限定されず、本発明での使用において核酸分子のクローニング、発現、安定性を改善することを目的としたいずれの改変も包含する（例えば、適当な制限部位の導入、所与の宿主細胞における翻訳を最適化するためのヌクレオチド配列の縮重化および／もしくは最適化、ならびに／または核酸分子またはその転写物を不安定化させ得る潜在的に負のエレメントの抑制）。いくつかの改変が企図される場合、それらの改変は連続残基および／または不連続残基を対象とすることができる。本発明により企図される改変は、コードされるポリペプチドおよび融合タンパク質のアミノ酸配列を変化させないサイレント改変、ならびにコードされるポリペプチドおよび融合タンパク質に翻訳される改変を包含する。
一つの実施態様において、本発明の核酸分子は、本発明に関してまたは宿主細胞において使用される核酸分子間の配列相同性を低減するために、全長ヌクレオチド配列またはその一部にわたって縮重化を行うことができる。実際には、核酸配列の、高い程度のヌクレオチド配列同一性を示す部分を縮重化することが望ましく、当業者ならば配列アラインメントによりこのような部分を特定することができる。例えば、ベクターが本明細書に記載の変異型ポリメラーゼポリペプチドをコードする核酸分子およびＨＢＶゲノムのオーバーラップ配列によりコードされる別のＨＢＶポリペプチドをコードする核酸分子を有する場合、生産過程で相同組換え問題を避けるために一方または両方の核酸分子のオーバーラップ部分を縮重化することが有利であり得る。
代わりにまたは組み合わせて、本発明の核酸分子は、特定の宿主細胞または生物において高レベルの発現を提供するために最適化することができる。実際に、所与のアミノ酸をコードするために２つ以上のコドンが利用できる場合には生物のコドン使用パターンは極めて非ランダムであることが見出されており、コドンの使用は宿主が違えば著しく異なっている可能性がある。本発明により包含されるヌクレオチド配列はほとんどがウイルス起源（ＨＢＶ）であるため、それらの配列は細菌、下等または高等真核細胞などの宿主細胞などの効率的発現に不適当なコドン使用パターンを持つ場合がある。一般に、コドンの最適化は、目的の宿主細胞／生物において使用頻度の低いコドンに相当する１以上の「天然」（例えば、ＨＢＶ）コドンを、その目的の宿主細胞／生物でより高頻度で使用されている、同じアミノ酸をコードする１以上のコドンに置き換えることによって行うことができる。発現の増強は部分的置換であっても達成できるので、使用頻度の低いコドンに相当する総ての天然コドンを置換する必要はない。さらに、結果として得られる核酸分子への制限部位の導入に適合させるための、最適化されたコドン使用頻度の厳守から多少の逸脱があってもよい。
さらに、宿主細胞または生物における発現は、希少な非最適化コドンのクラスタリングを防ぎ、かつ／または発現レベルに悪影響を及ぼすと予想される少なくとも部分的に負の配列エレメント（例えば、ＡＴリッチまたはＧＣリッチな配列ストレッチ；不安定な正方向または逆方向反復配列；ＲＮＡ二次構造；ならびに／または内部潜在調節エレメント、例えば、内部ＴＡＴＡボックス、ｃｈｉ部位、リボソーム侵入部位、および／もしくはスプライシングドナー／アクセプター部位）を抑制または改変することを目的としたヌクレオチド配列のさらなる改変を通じて改善することができる。
本発明の特に好ましい実施態様は、配列番号１３〜１７のいずれかに示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性、有利には少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、いっそうより好ましくは１００％の同一性を示すヌクレオチド配列を含んでなる、あるいは前記ヌクレオチド配列から本質的になる、あるいはまた前記ヌクレオチド配列からなる核酸分子に関する。
本発明の別の実施態様は、本発明の核酸分子の断片、例えば、制限エンドヌクレアーゼ断片およびＰＣＲ生成断片に関する。このような断片は、コードされる免疫原性ポリペプチドの免疫原性部分をコードするプローブ、プライマーまたは断片として使用することができる。
ベクター
別の側面において、本発明は、本発明の核酸分子を含んでなるベクターを提供する。
本明細書において使用する用語「ベクター」は、宿主細胞または生物において１以上の核酸分子の送達、複製および／または発現を可能とするのに必要なエレメントを含む、ビヒクル、好ましくは、核酸分子またはウイルス粒子を意味する。この用語は、維持のためのベクター（クローニングベクター）または種々の宿主細胞または生物における発現のためのベクター（発現ベクター）、染色体外ベクター（例えば、マルチコピープラスミド）または組み込みベクター（例えば、宿主細胞ゲノムに組み込み、宿主細胞が複製する際にそれらの核酸分子のさらなるコピーを生産するように設計される）ならびにシャトルベクター（例えば、原核生物宿主および／または真核生物宿主の両方で機能する）およびトランスファーベクター（例えば、ウイルスゲノムに核酸分子を導入するためのもの）を包含する。本発明の目的で、ベクターは、天然に存在する遺伝子源、合成もしくは人工、または天然および人工の遺伝エレメントのいくつかの組合せであり得る。
本発明に関して、用語「ベクター」は、プラスミドおよびウイルスベクターを含むものと広義に理解されるべきである。本明細書において使用する「プラスミドベクター」とは、複製可能なＤＮＡ構築物を意味する。通常、プラスミドベクターは、対応する選択薬の存在下で、プラスミドベクターを有する宿主細胞をそのためにまたはそれに対して選択可能とする選択マーカー遺伝子を含む。種々の正および負の選択マーカー遺伝子が当技術分野で公知である。例として、抗生物質耐性遺伝子が、対応する抗生物質の存在下で宿主細胞を選択可能とする正の選択マーカー遺伝子として使用可能である。
本明細書において使用する用語「ウイルスベクター」は、ウイルスゲノムの少なくとも１つのエレメントを含み、かつ、ウイルス粒子に封入され得る核酸ベクター、またはウイルス粒子を意味する。用語「ウイルス」、「ビリオン」、「ウイルス粒子」および「ウイルスベクター粒子」は、感染性ウイルス粒子の生成を可能とする好適な条件に従って核酸ベクターを適当な細胞または細胞株に形質導入した際に形成されるウイルス粒子を意味して互換的に使用される。本発明に関して、用語「ウイルスベクター」は、核酸ベクター（例えば、ＤＮＡウイルスベクター）ならびに生成されるそのウイルス粒子を含むものと広義に理解されるべきである。用語「感染性」とは、宿主細胞または生物に感染して侵入するウイルスベクターの能力を意味する。ウイルスベクターは複製適格型または複製選択型（例えば、特定の宿主細胞においてより良好にまたは選択的に複製するように操作されている）であってよく、または複製欠陥型もしくは複製障害型となるように遺伝的に無能化することもできる。
本発明における適当なベクターとしては、限定されるものではないが、細菌（例えば、大腸菌(E. coli)、枯草菌(Bacillus subtilis)またはリステリア菌(Listeria)）などの原核生物宿主細胞における発現のためのバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドベクター;酵母（例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロミセス・ポンベ(Saccharomyces pombe)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)）における発現のためのベクター；昆虫細胞系（例えば、Ｓｆ９細胞）における発現のためのバキュロウイルスベクター；植物細胞系における発現のためのウイルスおよびプラスミドベクター（例えば、Ｔｉプラスミド、カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ；タバコモザイクウイルスＴＭＶ）；ならびに高等真核細胞または生物における発現のためのウイルスおよびプラスミドベクターが含まれる。
一般に、このようなベクターは市販されているか（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｒｏｍｅｇａなど）、またはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍｄ．）などの寄託機関から入手可能であるか、または当業者が適用可能なそれらの配列、構成および生産方法を記載している多くの刊行物の対象となっている。
好適なプラスミドベクターの代表例としては、限定されるものではないが、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＶＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｐｇＷｉｚ（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ）が含まれる。
好適なウイルスベクターの代表例は、多様な異なるウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、泡沫状ウイルス、アルファウイルス、水疱性口内炎ウイルスなど）から作製される。上記のように、用語「ウイルスベクター」は、ベクターＤＮＡ、ゲノムＤＮＡならびに生成されるそのウイルス粒子を包含する。
本発明はまた、脂質またはポリマーと複合化してリポソーム、リポプレックスまたはナノ粒子などの粒状構造を形成するベクター（例えば、プラスミドＤＮＡ）も包含する。
一つの実施態様において、本発明のベクターはアデノウイルスベクターである。ベクターは種々のヒトまたは動物アデノウイルス（例えば、イヌ、ヒツジ、サルなど）に由来し得る。いずれの血清型も使用可能である。望ましくは、アデノウイルスベクターは複製欠陥型であり、ヒトＡｄ、より詳しくは希少な血清型のヒトＡｄ、またはチンパンジーＡｄに由来する。ヒトアデノウイルスの代表例としては、亜属Ｃ Ａｄ２ Ａｄ５およびＡｄ６、亜属Ｂ Ａｄ１１、Ａｄ３４およびＡｄ３５、ならびに亜属Ｄ Ａｄ１９、Ａｄ２４、Ａｄ４８およびＡｄ４９が含まれる。チンパンジーＡｄの代表例としては、限定されるものではないが、ＡｄＣｈ３(Peruzzi et al., 2009, Vaccine 27: 1293)、ＡｄＣｈ６３(Dudareva et al., 2009, vaccine 27: 3501)および当技術分野で記載されているもののいずれもが含まれる（例えば、ＷＯ０３／０００２８３；ＷＯ０３／０４６１２４；ＷＯ２００５／０７１０９３；ＷＯ２００９／０７３１０３；ＷＯ２００９／０７３１０４；ＷＯ２００９／１０５０８４；ＷＯ２００９／１３６９７７およびＷＯ２０１０／０８６１８９）。
複製欠陥アデノウイルスベクターは、当技術分野に記載のように、例えばウイルス複製に必須のアデノウイルスゲノムの少なくとも一領域またはその一部の欠失により得ることができ、Ｅ１コード配列（例えば、ＧｅｎｅＢａｎｋに受託番号Ｍ７３２６０として、また、Chroboczek et al., 1992, Virol. 186:280に開示されている５型ヒトアデノウイルスの配列を参照しておよそ４５９番から３５１０番に及ぶ）を含んでなるＥ１領域の欠失が特に好ましい。本発明はまた、アデノウイルスゲノム内に付加的欠失／改変（ＷＯ９４／２８１５２；Lusky et al., 1998, J. Virol 72: 2022に記載されている非必須Ｅ３領域または他の必須Ｅ２、Ｅ４領域の全部または一部）を有するベクターも包含する。
本発明の核酸分子はアデノウイルスゲノムのいずれの位置に挿入することもでき、問題の領域の本来の転写方向に対してセンス配向に配置してもアンチセンス配向に配置してもよい。好ましくは、本発明の核酸分子は、アデノウイルスＥ１領域の代わりに挿入され、ＣＭＶプロモーターの制御下に置かれる。
本発明に関して好適な他のウイルスベクターとしてはポックスウイルスベクターがあり、ポックスウイルス科(Poxviridae)のいずれのメンバーからも得ることができ、カナリア痘、鶏痘またはワクシニアウイルスに由来するポックスウイルスベクターが特に好ましく、最後のものが好ましい。好適なワクシニアウイルスとしては、限定されるものではないが、コペンハーゲン系統(Goebel et al., 1990, Virol. 179: 247; Johnson et al., 1993, Virol. 196: 381)、ワイエス系統、特に、改変アンカラ（ＭＶＡ）系統(Antoine et al., 1998, Virol. 244: 365)が含まれる。組換えポックスウイルスを構築するための一般条件は当技術分野で周知である。本発明の核酸分子は好ましくはポックスウイルスゲノム内の非必須遺伝子座に挿入される。コペンハーゲンワクシニアベクターにおける挿入のためにはチミジンキナーゼ遺伝子が、ＭＶＡベクターにおける挿入のためには欠失ＩＩまたはＩＩＩが特に適している。好ましくは、本発明の核酸分子はＭＶＡベクターの欠失ＩＩＩに挿入され、ワクシニア７．５ＫまたはｐＨ５Ｒプロモーターの制御下に置かれる。
本発明に関して好適な他のウイルスベクターとしてはモルビリウイルスがあり、パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)から得ることができ、麻疹ウイルスが特に好ましい。当技術分野では種々の弱毒系統が利用可能であり(Brandler et al., 2008, CIMID, 31: 271; Singh et al., 1999, J. virol. 73(6): 4823)、例えば、限定されるものではないが、エドモントンＡおよびＢ系統(Griffin et al., 2001, Field's in Virology, 1401-1441)、シュワルツ系統(Schwarz A, 1962, Am J Dis Child, 103: 216)、Ｓ−１９１またはＣ−４７系統(Zhang et al., 2009, J Med Virol. 81 (8): 1477)がある。Ｐ遺伝子とＭ遺伝子の間への挿入が特に適している。
本発明によれば、本発明のベクターに含まれる核酸分子は宿主細胞または生物における発現に好適な形態であり、これは核酸分子が適当な調節配列の制御下に置かれることを意味する。本明細書において使用する、用語「調節エレメント」は、核酸またはその誘導体（すなわち、ｍＲＮＡ）の複製、倍加、転写、スプライシング、翻訳、安定性および／または輸送を含む、所与の宿主細胞または生物における核酸分子の発現を可能とする、それに寄与するまたはそれを調節するいずれのエレメントも意味する。
当業者には、調節配列の選択がベクター自体、宿主細胞、所望の発現レベルなどの要因に依存し得ることが認識されるであろう。プロモーターは特に重要である。本発明に関して、プロモーターは多くのタイプの宿主細胞において核酸分子の発現を命令する構成的なものであっても、またはある特定の宿主細胞に特異的であっても（例えば、肝臓特異的調節配列）、または特定の事象もしくは外的要因（例えば、温度、栄養添加、ホルモンなど）に応答して、またはウイルス周期の相に従って（例えば、後期または前期）調節されてもよい。また、ベクター生産を最適化し、かつ、発現されるポリペプチドの潜在毒性を回避するために、生産工程中に特定の事象または外的要因に応答して抑制されるプロモーターを使用してもよい。
哺乳動物細胞における構成的発現に好適なプロモーターとしては、限定されるものではないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター(Boshart et al., 1985, Cell 41: 521)、ＲＳＶプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、ホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター(Adra et al., 1987, Gene 60: 65)、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）−１のチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターおよびＴ７ポリメラーゼプロモーターが含まれる。ワクシニアウイルスプロモーターはポックスウイルスベクターにおける発現のために特に適合している。代表例としては、限定されるものではないが、ワクシニア７．５Ｋ、Ｈ５Ｒ、１１Ｋ７．５(Erbs et al., 2008, Cancer Gene Ther. 15: 18)、ＴＫ、ｐ２８、ｐ１１およびＫ１Ｌプロモーター、ならびにChakrabarti et al. (1997, Biotechniques 23: 1094)、Hammond et al. (1997, J. Virological Methods 66: 135)およびKumar and Boyle (1990, Virology 179: 151)に記載されているものなどの合成プロモーター、ならびに初期／後期キメラプロモーターが含まれる。麻疹により媒介される発現に好適なプロモーターとしては、限定されるものではないが、麻疹転写単位の発現を命令するいずれのプロモーターも含まれる(Brandler and Tangy, 2008, CIMID 31: 271)。肝臓特異的プロモーターとしては、限定されるものではないが、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ(Luskey, 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 1881)；ステロール調節エレメント１（ＳＲＥ−１；Smith et al., 1990, J. Biol. Chem. 265: 2306）；アルブミン(Pinkert et al., 1987, Genes Dev. 1: 268)；ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）(Eisenberger et al., 1992, Mol. Cell Biol. 12: 1396)；α−１アンチトリプシン(Ciliberto et al., 1985, Cell 41: 531)；ヒトトランスフェリン(Mendelzon et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 5717)；およびＦＩＸ（米国特許第５，８１４，７１６号）遺伝子のプロモーターが含まれる。
当業者ならば、本発明の核酸分子の発現を制御する調節エレメントは、宿主細胞または生物での、転写の適切な開始、調節および／または終結のための付加的エレメント（例えば、ポリＡ転写終結配列）、ｍＲＮＡ輸送のための付加的エレメント（例えば、核局在シグナル配列）、プロセッシングのための付加的エレメント（例えば、スプライシングシグナル）、および安定性のための付加的エレメント（例えば、イントロンならびに非コード５’および３’配列）、翻訳のための付加的エレメント（例えば、イニシエーターＭｅｔ、三分節リーダー配列、ＩＲＥＳリボソーム結合部位、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列など）、および精製工程のための付加的エレメント（例えば、タグ）をさらに含んでよいことを認識するであろう。
本発明の特に好ましい実施態様は、
・Ｅ１領域の代わりに挿入された、ＣＭＶプロモーターなどのプロモーターの制御下に置かれ、かつ、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含んでなる変異型ポリメラーゼポリペプチドまたは配列番号６もしくは配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでなる融合タンパク質をコードする核酸分子を含んでなる、欠陥Ａｄベクター；
・Ｅ１領域の代わりに挿入された、ＣＭＶプロモーターなどのプロモーターの制御下に置かれ、かつ、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５に示されるヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子を含んでなる、欠陥Ａｄベクター；
・Ｅ１領域の代わりに挿入された、ＣＭＶプロモーターなどのプロモーターの制御下に置かれ、かつ、配列番号１６または配列番号１７に示されるヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子を含んでなる複製欠陥Ａｄベクター、特に、欠陥ＡｄＣｈ３；
・７．５ＫプロモーターまたはｐＨ５Ｒプロモーターなどのワクシニアプロモーターの制御下に置かれ、かつ、配列番号５もしくは配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含んでなる変異型ポリメラーゼポリペプチド、または配列番号６、配列番号８もしくは配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含んでなる融合タンパク質をコードする核酸分子を含んでなる、ＭＶＡベクター；および
・７．５ＫプロモーターまたはｐＨ５Ｒプロモーターなどのワクシニアプロモーターの制御下に置かれ、かつ、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５に示されるヌクレオチド配列を含んでなる、核酸分子を含んでなる、ＭＶＡベクター
からなる群から選択されるベクター（またはウイルス粒子）に関する。好ましくは、前記核酸分子はＭＶＡゲノムの欠失ＩＩＩに挿入される。
必要であれば、本発明のベクターは、１以上の導入遺伝子、例えば、ＨＢＶ感染、またはＨＢＶ感染により引き起こされる、もしくはＨＢＶ感染に関連する任意の疾患もしくは病態に対する治療活性または保護活性を改善することを目的に、宿主細胞または生物において本発明の核酸分子とともに発現させる目的遺伝子をさらに含んでなることができる。好適な導入遺伝子としては、限定されるものではないが、サイトカインなどの免疫調節因子および潜在的同時感染生物（例えば、ＨＩＶ、結核マイコバクテリアなど）に由来する他の任意の抗原が含まれる。導入遺伝子が使用される場合、その導入遺伝子は本発明のベクターから発現させることもできるし、または本発明のベクターと同じであっても異なっていてもよい併用のための独立したベクターから発現させることもできる。例えば、本発明の変異型ポリメラーゼポリペプチドまたは融合タンパク質を発現するアデノウイルスと免疫調節因子を発現するアデノウイルスの併用を想定することができる。
好ましい実施態様によれば、本発明のベクターは感染性ウイルス粒子の形態である。一般に、このようなウイルス粒子は、（ａ）本発明のウイルスベクターを好適な細胞株に導入する工程、（ｂ）前記感染性ウイルス粒子の生産を可能とするのに好適な条件下で前記細胞株を培養する工程、（ｃ）生産された感染性ウイルス粒子を前記細胞株の培養物から回収する工程、および（ｄ）所望により回収された前記ウイルス粒子を精製する工程を含んでなるプロセスにより生産される。
ウイルスベクターが欠陥型である場合、これらの粒子は通常、補完細胞株でまたは非機能的ウイルス遺伝子をトランスで供給するヘルパーウイルスの使用を介して生産される。例えば、Ｅ１欠損アデノウイルスベクターの補完に好適な細胞株としては、２９３細胞(Graham et al, 1997, J. Gen. Virol. 36: 59-72)ならびにＨＥＲ−９６およびＰＥＲ−Ｃ６細胞（例えば、Fallaux et al, 1998, Human Gene Ther. 9: 1909-1917;ＷＯ９７／００３２６）またはこれらの細胞株のいずれの誘導体も含まれる。本発明に関しては当技術分野で記載される他のいずれの細胞株も使用することができるが、特に、Ｖｅｒａ細胞、ＨｅＬａ細胞および鳥類細胞など、ヒト用の生成物を生産するために用いられる細胞株はいずれも、ポックスウイルスベクターの増殖に特に好適である。好適な鳥類細胞としては、限定されるものではないが、受精卵から得られるニワトリ胚から調製される初代ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）およびカモ細胞株（例えば、ＷＯ０３／０７６６０１、ＷＯ２００９／００４０１６、ＷＯ２０１０／１３０７５６およびＵＳ２０１１−００８８７２に記載の通り）が含まれる。
感染性ウイルス粒子は培養上清から、および／または溶解後に細胞から回収することができる。感染性ウイルス粒子は、標準的な技術（例えば、ＷＯ９６／２７６７７、ＷＯ９８／００５２４、ＷＯ９８／２２５８８、ＷＯ９８／２６０４８、ＷＯ００／４０７０２、ＥＰ１０１６７００およびＷＯ００／５０５７３に記載されているように、クロマトグラフィー、塩化セシウム勾配での超遠心分離）に従ってさらに精製することができる。
本発明はまた、特定の宿主細胞への優先的標的化を可能とするように改変されたベクターまたはウイルス粒子も包含する。標的化ベクターの特徴は、それらの表面に、細胞特異的マーカー（例えば、ＨＢＶ感染細胞）および組織特異的マーカー（例えば、肝臓特異的マーカー）などの細胞成分および表面露出成分、ならびにウイルス（例えば、ＨＢＶ）抗原を認識してそれと結合することができるリガンドが存在することである。好適なリガンドの例としては、ＨＢＶ抗原ドメインに対する抗体またはその断片が含まれる。標的化は、ウイルスの表面に存在するポリペプチド（例えば、アデノウイルス繊維、ペントン、ｐＩＸまたはワクシニアｐ１４遺伝子産物）にリガンドを遺伝的に挿入することによって行うことができる。
宿主細胞
別の側面において、本発明はまた、本発明の核酸分子またはベクター（またはウイルス粒子）を含んでなる宿主細胞に関する。
本明細書において使用する用語「宿主細胞」は、限定されるものではないが、組織、器官または単離された細胞における特定の構成を考慮して広義に理解されるべきである。このような細胞は、独特の細胞種または培養細胞株、初代細胞および増殖性細胞などの異なる細胞種の群であり得る。本発明に関して、用語「宿主細胞」には、原核細胞、酵母などの下等真核細胞、そして昆虫細胞、植物および哺乳動物（例えば、ヒトまたは非ヒト）細胞などの他の真核細胞、ならびに本発明のベクタを産生することができる細胞（例えば、２９３、ＨＥＲ９６、ＰＥＲＣ．６細胞、Ｖｅｒｏ、ＨｅＬａ、ＣＥＦ、カモ細胞株など）が含まれる。この用語には、本明細書に記載のベクターのレシピエントとなり得る細胞またはレシピエントであった細胞、ならびにこのような細胞の後代が含まれる。宿主細胞は従来の発酵バイオリアクター、フラスコ、およびペトリプレートで培養することができる。培養は所与の宿主細胞に適当な温度、ｐＨおよび酸素含量で行うことができる。本明細書では、本発明での使用におけるポリペプチドおよびベクターの生産に関して知られている原核生物および真核生物宿主細胞および方法を詳細に記載することはしない。
本発明の特定の実施態様によれば、宿主細胞をさらに封入することができる。細胞封入技術は当技術分野で公知である。
本発明のなおさらなる側面は、本発明のベクター（もしくは感染性ウイルス粒子）および／または宿主細胞を用いる本発明の変異型ポリメラーゼポリペプチドまたは融合タンパク質の組換え生産のための方法である。一般に、該方法は、（ａ）ベクターを好適な宿主細胞に導入してトランスフェクト宿主細胞または感染宿主細胞を作出すること、（ｂ）前記トランスフェクト宿主細胞または感染宿主細胞をｉｎ−ｖｉｔｒｏにおいてその宿主細胞の増殖に好適な条件下で培養すること、（ｃ）前記細胞培養物を回収すること、および（ｄ）所望により変異型ポリメラーゼポリペプチドまたは融合タンパク質を回収された細胞および／または培養上清から精製することを含んでなる。
当業者は、適当な宿主細胞（上記のものなど）において変異型ポリメラーゼポリペプチドまたは融合タンパク質を発現させるために当技術分野で利用可能な多くの発現系および宿主細胞にベクターを導入するための方法について知識があると思われる。このような方法としては、限定されるものではないが、マイクロインジェクション、ＣａＰＯ４媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション／リポソーム融合、遺伝子銃、形質導入、ウイルス感染ならびに種々の手段による宿主生物への直接投与が含まれる。本発明のベクターは、宿主細胞への導入を助けるために、ポリ陽イオンポリマー（例えば、キトサン、ポリメタクリレート、ＰＥＩなど）および陽イオン脂質（例えば、現在Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能なＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ、トランスフェクタムリポフェクチン）などのトランスフェクション試薬と併用することができる。
宿主細胞は従来の発酵バイオリアクター、フラスコ、およびペトリプレートで培養することができる。培養は所与の宿主細胞に適当な温度、ｐＨおよび酸素含量で行うことができる。次に、変異型ポリメラーゼポリペプチドまたは融合タンパク質は、硫酸アンモニウム沈殿、酸抽出、ゲル電気泳動；濾過およびクロマトグラフィー法（例えば、逆相、サイズ排除、イオン交換、アフィニティー、疎水性相互作用、ヒドロキシルアパタイト、高速液体クロマトグラフィーなど）を含む周知の精製法により精製することができる。使用する条件および技術は正味電荷、分子量、疎水性、親水性などの要因によって異なり、当業者には自明である。さらに、精製のレベルは意図する使用によって異なる。
組成物
別の側面において、本発明は、本明細書に記載の変異型ポリメラーゼポリペプチドまたは融合タンパク質、核酸分子、ベクター（例えば、感染性ウイルス粒子）、または宿主細胞（本明細書では「有効薬」とも呼ばれる）またはそれらの任意の組合せ（例えば、本明細書に記載の異なるポリペプチドもしくはベクター／ウイルス粒子の組合せ、または異なる遺伝子型の組合せ）を少なくとも含んでなる組成物を提供する。好ましくは、組成物は、治療上有効な量の前記有効薬に薬学上許容可能なビヒクルをさらに含んでなる医薬組成物である。
本明細書において使用する「薬学上許容可能なビヒクル」は、宿主生物、特にヒトにおける投与に適合した担体、溶媒、希釈剤、賦形剤、アジュバント、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、ならびに吸収遅延剤などのいずれか、また総てを含むものとする。
本明細書において使用する「治療上有効な量」は、ＨＢＶ感染に通常関連する１以上の症状、またはＨＢＶ感染により引き起こされる、もしくはＨＢＶ感染に関連する任意の疾患もしくは病態の緩和に重要な用量である。予防的使用を考慮する場合、この用語は、ＨＢＶ感染の確立を防ぐまたは遅延させるのに十分な用量を意味する。「治療用」組成物は、前記ＨＢＶ感染により引き起こされる、または前記ＨＢＶ感染に関連する少なくとも１つの疾患または病態を軽減または改善するという目的で、ＨＢＶにすでに感染している宿主生物に対して、最終的に本明細書に記載の１以上の従来の治療法（例えば、ヌクレオシド、ヌクレオチド類似体による治療および／またはＩＦＮに基づく療法）と組み合わせて設計および投与される。例えば、免疫応答を誘導するための治療上有効量は、免疫系の活性化（例えば、抗ＨＢＶ応答の発達をもたらす）を生じるのに必要な量であり得る。
用語「宿主生物」は一般に、本発明の生成物および方法が必要とされるまたは有益であり得る脊椎動物、特に、哺乳動物種のメンバー、特に、飼育動物、農用動物、競技用動物、およびヒトを含む霊長類、例えば、ＨＢＶに感染していると診断された、またはＨＢＶに感染するリスクのある、従って、ＨＢＶ感染により引き起こされる、またはＨＢＶ感染に関連する疾患または病態を有する疑いのある、またはリスクがある生物を意味する。好ましい実施態様では、宿主生物は、ＨＢＶウイルスに慢性的に感染した、あるいはまたＨＢＶウイルスと別のウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ）に同時感染したヒト患者である。感染するＨＢＶは、本発明での使用における変異型ポリメラーゼポリペプチドまたは他の任意のＨＢＶポリペプチド／ペプチドを作出する任意のＨＢＶと同じ遺伝子型、系統または分離株（例えば、遺伝子型Ｄ）に由来してもよいし、または異なる遺伝子型（例えば、遺伝子型ＢまたはＣ）に由来してもよい。遺伝子型Ｄに基づくワクチン組成物の潜在的交差反応性が発明者らにより最近検討された（米国出願１３／４２３，１９３参照）。膨大なｉｎ ｓｉｌｉｃｏ研究によれば、ＨＢＶポリメラーゼ、コアおよびＥｎｖタンパク質のアミノ酸配列は全体的なタンパク質レベルにおいて、またＴ細胞エピトープレベルにおいても、遺伝子型Ｂ、ＣおよびＤの間で保存性が高いことが強調された。好適な動物モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ免疫誘導により、遺伝子型ＢおよびＣエピトープを認識する交差反応性Ｔ細胞応答を誘導するこの能力が裏付けられた。この研究がＨＬＡ−Ａ２エピトープに限られていたとしても、遺伝子型Ｄ抗原に基づくワクチン組成物が、他のＨＢＶ遺伝子型と交差反応性があるＴ細胞応答を誘導することができるという概念実証を示す。
本発明の組成物は好適には、生理学的ｐＨまたはやや塩基性のｐＨ（例えば、およそｐＨ７〜およそｐＨ９）ヒト用に適当とするために緩衝させる。好適なバッファーとしては、限定されるものではないが、リン酸バッファー（例えば、ＰＢＳ）、重炭酸バッファーおよび／またはＴｒｉｓバッファーが含まれる。
本発明の組成物は、ヒトまたは動物用に適当な希釈剤をさらに含んでなることができる。本発明の組成物は好ましくは、等張、低張または弱高張であり、比較的低いイオン強度を有する。代表例としては、無菌水、生理食塩水（例えば、塩化ナトリウム）、リンゲル溶液、グルコース、トレハロースまたはサッカロース溶液、ハンクス溶液、および他の水性の生理学的平衡塩溶液（例えば、Remington : The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins参照）が含まれる。
本発明の組成物に含まれる薬学上許容可能なビヒクルはまた、製造および冷凍温度（例えば、−７０℃、−２０℃）、冷蔵温度（例えば、４℃）または周囲温度での長期貯蔵（すなわち、少なくとも１か月、好ましくは少なくとも１年間）の条件下でのその安定性の保持を可能としなければならない。この点で、本発明の組成物に特に適合された処方物は、（ａ）１Ｍサッカロース、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、５４ｍｇ／ｌ Ｔｗｅｅｎ ８０、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５（特に有効薬がアデノウイルスベクターである場合）、（ｂ）１０ｍｇ／ｍｌマンニトール、１ｍｇ／ｍｌ ＨＳＡ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．２、および１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ならびに（ｃ）生理食塩水を含む。
例えば、ｐＨ、浸透圧、粘度、明澄性、色、無菌性、安定性、処方物の溶解速度の改変もしくは維持、ヒトもしくは動物生物体での放出もしくは吸収の改変もしくは維持、血液関門を経た輸送の促進、または特定の器官（例えば、肝臓）での浸透を含む望ましい薬学的または薬力学的特性を提供するために、さらなる薬学上許容可能な賦形剤を使用してもよい。
さらに、本発明の組成物は、ヒトにおける全身適用または粘膜適用に好適な１種類以上のアジュバントを含んでもよい。好ましくは、アジュバントは、本発明の組成物に対する免疫、特に、例えば、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）（例えば、ＴＬＲ−７、ＴＬＲ−８およびＴＬＲ−９）を介したＴ細胞性免疫を刺激することができる。有用なアジュバントの代表例としては、限定されるものではないが、ミョウバン；鉱油エマルション、例えば、フロイントの完全および不完全アジュバント（ＩＦＡ）、リポ多糖またはその誘導体(Ribi et al., 1986, Immunology and Immunopharmacology of Bacterial Endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, p407-419)；サポニン、例えば、ＱＳ２１（Sumino et al., 1998, J.Virol. 72: 4931；ＷＯ９８／５６４１５）；イミダゾ−キノリン化合物、例えば、イミキモド(Suader, 2000, J. Am Acad Dermatol. 43: S6)；Ｓ−２７６０９(Smorlesi, 2005, Gene Ther. 12: 1324)およびＷＯ２００７／１４７５２９に記載されているものなどの関連化合物；シトシンリン酸グアノシンオリゴデオキシヌクレオチド、例えば、ＣｐＧ(Chu et al., 1997, J. Exp. Med. 186: 1623; Tritel et al., 2003, J. Immunol. 171: 2358)；ならびに陽イオンペプチド、例えば、ＩＣ−３１(Kritsch et al., 2005, J. Chromatogr Anal. Technol Biomed Life Sci 822: 263)が含まれる。
本発明の組成物は、種々の投与様式に好適である。
本明細書において使用する用語「投与(administration)」（および「administered」などの投与(administration)の任意の形態）は、本明細書に記載の変異型ポリメラーゼポリペプチド、融合タンパク質、核酸分子、ベクターなどの治療薬の、宿主細胞または生物への送達を意味する。宿主生物への直接投与など、いくつかの方法および手段が当技術分野で利用可能である。
直接投与は、全身、局所または粘膜経路により行うことができる。全身投与には、例えば、皮下、皮内、筋肉内、静脈内（例えば、門脈などの肝臓栄養静脈への注射）、腹腔内、腫瘍内、血管内、動脈内注射（例えば、肝動脈注入による）ならびに乱刺が含まれる。注射は従来のシリンジと針、または当技術分野で利用可能な他の任意の適当な装置（例えば、エレクトロポレーション）によって行うことができる。あるいは、本発明の組成物は、経口／食事性、鼻腔内、気管内、肺内、膣内または直腸内経路などの粘膜経路によって投与してもよい。気道内投与は、適当なディスペンサーを用いて、液滴、スプレーまたは乾燥粉末組成物を霧化またはエアゾール化することによって行うことができる。また、局所投与も経皮手段（例えば、パッチなど）を用いて行うことができる。
本発明に関して、組成物は好ましくは、筋肉内、皮下、皮内投与または乱刺用に処方される。
本発明の組成物は、例えば、固体、液体または凍結品などの種々の形態であってよい。固体（例えば、乾燥粉末または凍結乾燥）組成物は、真空乾燥および凍結乾燥を含むプロセスによって得ることができる。粘膜投与では、組成物は経口投与用の胃耐性カプセル剤および顆粒剤、直腸または膣投与用の坐剤として、最終的には、粘膜の孔径を増すのに有用な吸収促進剤と組み合わせて処方することができる。このような吸収促進剤は一般に、デオキシコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、ジメチル−β−シクロデキストリン、ラウリル−１−リソホスファチジルコリンなど、粘膜のリン脂質ドメインと構造的類似性を有する物質である。
適当な用量は、種々のパラメーター、特に、投与様式；用いる組成物；宿主生物の齢、健康状態および体重；症状の性質および程度；併用処置の種類；処置の頻度；および／または予防もしくは治療の必要性の関数として適合させることができる。処置に適当な用量を決定するために必要な計算のさらなる精密化は、慣例的に、関連のある状況に照らして医師により行われる。
一般的な指針としては、ベクターを含んでなる組成物に好適な用量は、用いるベクターおよび定量技術によって、約１０５〜約１０１３ｖｐ（ウイルス粒子）、ｉｕ（感染単位）またはｐｆｕ（プラーク形成単位）で様々である。サンプル中に存在するｖｐ、ｉｕおよびｐｆｕの量を評価するために利用可能な技術は、当技術分野では慣例である。例えば、アデノウイルス粒子の数（ｖｐ）は、通常、Ａ２６０における吸光度の測定またはＨＰＬＣによって求められ、ｉｕ力価は定量的ＤＢＰ免疫蛍光法によって、ｐｆｕは許容細胞の感染後にプラーク数を数えることによって求められる。好ましくは、ｖｐ／ｉｕ比は、ＦＤＡ指針によれば１００未満である。好ましい用量は、本発明のアデノウイルスベクター約１０５〜約１０１２ｖｐを含み、約５×１０８、約１０９、約５×１０９、約１０１０、約５×１０１０ｖｐまたは約１０１１ｖｐの用量が特に好ましい。ワクシニア（ＭＶＡ）に基づく組成物では、約５×１０５〜約１０９ｐｆｕの用量が好ましく、約５×１０６、約１０７、約５×１０７、約１０８または約５×１０８ｐｆｕの用量が特に好ましい。ベクタープラスミドに基づく組成物は、１０μｇ〜２０ｍｇの間、有利には１００μｇ〜２ｍｇの間の用量で投与すればよい。タンパク質組成物は、体重１ｋｇ当たり１０ｎｇ〜２０ｍｇの間の用量の免疫原性ポリペプチドを１回以上投与すればよく、約０．１μｇ〜約２ｍｇの用量が特に好ましい。投与は単回用量で行ってもよいし、または一定の時間間隔の後に１回または数回の繰り返し用量で行ってもよい。
別の特定の実施態様では、本発明の変異型ポリメラーゼポリペプチド、融合タンパク質、核酸分子、ベクター、宿主細胞または組成物は、付加的ポリペプチドもしくはペプチド、またはそのような付加的ポリペプチドもしくはペプチドをコードするベクターと組み合わせて使用することができる。好ましくは、前記付加的ポリペプチドまたはペプチドはＨＢＶ抗原であり、本明細書に記載のＨｂｃポリペプチドおよび／または１以上のＨＢｓ免疫原性ドメインが特に好ましい。前記ＨＢＶポリペプチドまたはペプチドは、ベクター、特に、プラスミドＤＮＡ、アデノウイルス（例えば、Ａｄ５、ＡｄＣｈ３、ＡｄＣｈ６３など）、ポックスウイルス（例えば、ＭＶＡなどのワクシニア）および麻疹ベクターからなる群から選択されるベクターから発現させることができる。従って、本発明はまた、本発明の変異型ポリメラーゼポリペプチドまたは融合タンパク質をコードするベクターと、本明細書に記載のＨＢＶコアおよび／またはＨＢｓ免疫原性ドメインなどの少なくとも１つの付加的ポリペプチド／ペプチドをコードするベクターとの混合物を含んでなる組成物に関する。
本発明の変異型ポリメラーゼポリペプチド、融合タンパク質、核酸分子、ベクター、宿主細胞または組成物は、様々な疾患および病態、特に、ＨＢＶ感染により引き起こされる、またはＨＢＶ感染に関連するものを処置するための方法に使用可能である。従って、本発明はまた、本明細書に記載のモダリティーに従ってＨＢＶ感染、ＨＢＶ関連の疾患および病態、特に、慢性ＨＢＶ感染を治療または予防するために用いられる本発明の変異型ポリメラーゼポリペプチド、融合タンパク質、核酸分子、ベクター、宿主細胞または組成物を包含する。本発明はまた、本明細書に記載のモダリティーに従って、このような有効薬の少なくとも１つを、ＨＢＶ感染（例えば、特に、慢性ＨＢＶ感染）を治療もしくは予防するため、またはＨＢＶ関連の疾患および病態に関連する１以上の症状を緩和するために十分な量で生物に少なくとも１回投与することを含んでなる、それを必要とする生物における治療方法に関する。特定の実施態様では、本発明の有効薬および方法は、ＨＢＶ慢性被験体において通常見られるＨＢＶ特異的免疫寛容を打破するために、本明細書に記載のモダリティーに従って使用することができる。
本明細書において使用する用語「処置(treating)」（および「treatment」などの処置(treating)の任意の形態）は、予防（例えば、ＨＢＶに感染するリスクのある被験体の予防）および／または治療（例えば、ＨＢＶに感染していると診断された被験体）に関する。この処置は、ＨＢＶ慢性感染、ならびに／または肝硬変および肝臓癌を含むＨＢＶ感染患者における肝臓病変を処置するために特に有用である。処置には、本明細書に記載の変異型ポリメラーゼポリペプチドなどの治療薬を、最終的には他のＨＢＶポリペプチドまたは標準治療（ＳＯＣ）（例えば、ヌクレオシドまたはヌクレオチド類似体による処置）と組み合わせて、宿主細胞または生物に外的または内的に投与することを要する。
一般に、本明細書に記載のモダリティーに従って宿主生物に投与すると、本発明の変異型ポリメラーゼポリペプチド、融合タンパク質、核酸分子、ベクター、宿主細胞および／または組成物は、処置された宿主生物にベースライン状態または処置されなかった場合に予測される状態に比べて治療利益を提供する。治療利益は、例えば、処置生物の血液、血漿、または血清において定量されるＨＢＶウイルス量の低下、ならびに／または肝臓酵素活性（例えば、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）および／もしくはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ））のレベルの低下、ならびに／または疾患の安定状態（例えば、肝臓炎症／脂肪症／線維症などのＨＢＶ感染に一般に関連する病態の安定化もしくは軽減）、ならびに／またはＨＢｅＡｇもしくはＨＢｓＡｇなどの血清マーカーのレベル低下（例えば、ＨＢｅもしくはＨＢｓの血清変換）、ならびに／または従来の療法に対する処置生物の応答の改善、ならびに／または処置を受けなかった場合に予測される生存期間に比べての生存期間の延長を含む、医師または他の熟練の医療スタッフにより一般に用いられる、関連の任意の臨床評価により証明することができる。
本発明に関して、治療利益は、一時的（投与中止後１もしくは２か月間）または持続的（数か月もしくは数年）であり得る。臨床状態の自然の推移は被験体ごとに著しく異なり得るので、処置された各生物に見られる治療利益が有意な数の生物で見られる必要はない（例えば、２群の間の統計学的有意差は、テューキー(Tukey)パラメトリック検定、クラスカル・ウォリス(Kruskal-Wallis)検定、マン・ホイットニー(Mann and Whitney)に従うＵ検定、スチューデント(Student)のｔ検定、ウィルコクソン(Wilcoxon)検定などの当技術分野で公知の任意の統計学的検定により決定することができる）。
このような評価は本明細書に記載の投与の前（ベースライン）、および処置中の様々な時点、および処置の中止後少なくとも１２週間行うことができる。一般的な指針として、ウイルス量は、定量的ＰＣＲアッセイまたは当技術分野で認知されている他の任意の方法論（例えば、Ｒｏｃｈｅ Ａｍｐｌｉ Ｐｒｅｐ／Ｃｏｂａｓ ｔａｑｍａｎアッセイ ｖ２．０、ＡｂｂｏｔｔリアルタイムＢ型肝炎ウイルスパフォーマンスアッセイ）を用いて決定することができる。好ましい実施態様では、本発明の変異型ポリメラーゼポリペプチド、融合タンパク質、核酸分子、ベクター、宿主細胞および／または組成物の投与は、ベースラインで測定されたウイルス量に比べて、または対照群（非処置被験体）に比べて少なくとも１ｌｏｇ１０、好ましくは少なくとも１．５ｌｏｇ１０、より好ましくは少なくとも２ｌｏｇ１０の、一時的または持続的ウイルス量の低下をもたらす。本明細書に記載の有効薬の投与は、ベースラインまたは対照群に比べて、正常なＡＬＴ値および／またはＡＳＴ値への少なくとも一時的回復をもたらし得る。肝臓酵素活性のレベルは、医学研究室および病院で慣例的に評価することができる。あるいは、本明細書に記載の有効薬の投与は、ベースラインで測定した血清マーカーレベルに比べてまたは対照群（非処置被験体）に比べて、少なくとも１ｌｏｇ１０、好ましくは少なくとも１．５ｌｏｇ１０、より好ましくは少なくとも２ｌｏｇ１０の、血清マーカーＨＢｅおよび／またはＨＢｓの少なくとも一時的な低下をもたらす。ＨＢＶ血清マーカーのレベルは、医学研究室および病院で慣例的に評価することができ、多数のキットが市販されている（例えば、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｋａにより開発されたイムノアッセイ）。
好ましくは、本発明の変異型ポリメラーゼポリペプチド、融合タンパク質、核酸分子、ベクター、宿主細胞および／または組成物は、処置した生物において免疫応答を惹起または刺激するために使用または投与される。従って、本発明はまた、宿主生物において本発明の変異型ポリメラーゼポリペプチド、融合タンパク質、核酸分子、ベクター、宿主細胞および／または組成物を投与した際にＨＢＶに対する免疫応答を惹起または刺激するための方法を包含する。
惹起または刺激された免疫応答は、特異的（すなわち、ＨＢＶエピトープ／抗原に対する）および／または非特異的（生得的）、体液性および／または細胞性であり得る。本発明に関して、免疫応答は、好ましくは、ＨＢＶポリペプチド／エピトープに対する、Ｔ細胞応答ＣＤ４＋媒介型またはＣＤ８＋媒介型またはその両方である。
本明細書に記載の有効薬の免疫応答惹起能は、当技術分野で標準的な種々の直接的または間接的アッセイを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで評価することができる。試験およびバリデーションは付属の実施例の節にも示されている。
免疫応答の誘導および活性化を評価するために利用可能な技術の全般的説明としては、例えば、Coligan et al. (1992 and 1994, Current Protocols in Immunology ; ed J Wiley & Sons Inc, National Institute of Healthまたは後続版)を参照。体液性応答刺激能は、抗体結合および／または結合における競合によって決定することができる（例えば、Harlow, 1989, Antibodies, Cold Spring Harbor Press参照）。
非特異的免疫の評価は、例えば、ＮＫ／ＮＫＴ細胞の測定（例えば、代表性および活性化のレベル）、ならびに、ＩＦＮ関連サイトカインおよび／またはケモカイン産生カスケード、ＴＬＲおよび生得免疫のその他のマーカーの活性化により行うことができる(Scott-Algara et al., 2010 PLOS One 5(1), e8761; Zhou et al, 2006, Blood 107, 2461-2469; Chan, 2008, Eur. J. Immunol. 38, 2964-2968)。
細胞性免疫の評価は、例えば、慣例のバイオアッセイ（例えば、ＥＬＩＳｐｏｔによるＴ細胞の同定および／または定量、マルチパラメーターフローサイトメトリーまたはＩＣＳ、マルチプレックス技術またはＥＬＩＳＡを用いたサイトカインプロフィール分析）を用いた、ＣＤ４＋ Ｔ細胞およびＣＤ８＋ Ｔ細胞に由来するものを含む活性化Ｔ細胞により産生されるサイトカインの定量によるか、Ｔ細胞の増殖能の決定（例えば、［３Ｈ］チミジン取り込みアッセイによるＴ細胞増殖アッセイ）によるか、感作した被験体における抗原特異的Ｔリンパ球の細胞傷害能をアッセイすることによるか、または適当な動物モデルの免疫誘導により行うことができる。
本発明の変異型ポリメラーゼポリペプチド、融合タンパク質、核酸分子、ベクター、宿主細胞および／または組成物の免疫能はまた動物モデルでさらにバリデーションを行うこともでき、動物モデルに適当な感染因子または腫瘍誘導因子（例えば、ＨＢＶ遺伝子産物を発現するワクシニアウイルスもしくはリステリア菌(Listeria Monocytogenes)）を投与するか、または全長ＨＢＶゲノムをコードするＤＮＡを注射して（例えば、Huan et al., 2010, Proc. Natl. Acad. Sci. 107: 9340に記載）、その感染因子または腫瘍誘導因子の中和、および最終的には、抗ＨＢＶ免疫応答の誘導または増強を反映する、関連の症状に対する部分的耐性を測定することができる。例示的動物モデルとしては、限定されるものではないが、実施例に記載されるＨＬＡ−Ａ２．１トランスジェニックマウス、ならびにChisari et al. (1996, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 206: 149)およびHalverscheid al. (2008, J. Med. Virol. 80: 583)に記載されているものなどのＨＢＶトランスジェニックマウスが含まれる。
前記の使用または方法は、治療上有効な量の前記有効薬の１回以上の投与（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回など）を含んでなり、前記投与は互いに適当な期間をおき、同じ投与経路または異なる投与経路により、同じ部位または異なる部位に行われる。本発明に関しては、筋肉内経路および皮下経路が特に好ましい。ＭＶＡに基づく組成物およびベクターには、互いにおよそ１週間おいた３回の皮下投与が特に好適であり、Ａｄに基づく組成物およびベクターには、１回または２回の筋肉内または皮下投与が特に好適であり、これは互いにおよそ１か月以上おくことができる。最初の一連の投与の後、２か月または数ヶ月後に、抗ＨＢＶ免疫応答を想起させるために同じ有効薬を用いて１回以上の後続投与を行うことができる。
所望により、本発明の方法または使用は、１以上の従来の治療法（例えば、放射線、化学療法および／または手術）と組み合わせて行うことができる。好ましくは、本発明の方法または使用は、ＨＢＶ感染、ＨＢＶ関連疾患および病態を治療または予防するために利用可能な１以上の薬物と組み合わせる。それらの投与は本発明の有効薬の投与の前であっても、同時であっても、後であってもよい。好適な薬物の代表例としては、限定されるものではないが、ポリメラーゼ阻害剤、ＲＮアーゼＨ阻害剤、ヌクレオシド類似体、ヌクレオチド類似体、ＴＬＲアゴニスト、ＩＦＮ、Ｎ−グリコシル化阻害剤、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗ＨＢＶ抗体、免疫調節剤、治療用ワクチン、およびＨＢＶ関連肝臓癌の治療に通常使用される抗腫瘍薬（例えば、アドリアマイシン、アドリアマイシン(adriamicin)とリピオドールまたはソラセニブ(sorasenib)の組合せ）が含まれる。さらに、この有効薬はまた、合成ペプチド、組換え抗原、ＶＬＰ、抗ＨＢＶ体液性応答を惹起するのに特に適しているＨＢＶタンパク質（コア、ｐｒｅＳ１、ＰｒｅＳ２、Ｓおよび／またはポリメラーゼ）をコードするベクターなどの他の治療用ワクチンと組み合わせて使用してもよい。本発明による特に好適な方法または使用は、標準治療、特に、サイトカイン（例えば、ＩＦＮα、ペグ化ＩＦＮａ２ａまたは２ｂ、例えば、Ｐｅｇａｓｙｓ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｐｅｇｉｎｔｒｏｎ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｌｏｕｇｈ）もしくはＩｎｔｒｏｎＡ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｌｏｕｇｈ））による処置および／またはラミブジン、エンテカビル、テルビブジン、アデホビル、ジピボキシルもしくはテノホビルなどのヌクレオチドまたはヌクレオシド類似体（ＮＵＣ）による処置と組み合わせる。ＮＵＣによる処置は部分的な有効性しかなく（１年の処置後で感染消散が見られるのは被験体の３〜５％に過ぎない）、長期間の療法を要する（生涯であり得る）。本発明の有効薬および方法は、許容する免疫範囲をウイルス複製に対する補完的ＮＵＣ作用にまで拡げるので、このような処置の改善（例えば、治療利益を達成するために必要なＮＵＣの用量を低減すること、またはＮＵＣ処置の期間を短縮することによる）または感染消散のパーセンテージの増加（５％を超える）をもたらすと思われる。
特定の実施態様では、本発明の方法または使用は、１以上のプライミング組成物と１以上のブースティング組成物の一連の投与を含んでなるプライムブースト法に従って行うことができる。一般に、プライミング組成物およびブースティング組成物は、少なくとも１つの抗原ドメインを共通に含んでなるまたはコードする、異なるベクターを使用する。さらに、プライミング組成物およびブースティング組成物は、同じ投与経路または異なる投与経路により、同じ部位または異なる部位に投与することができる。例えば、ポリペプチドに基づく組成物は粘膜経路により投与することができ、ベクターに基づく組成物は好ましくは注射、例えば、ＭＶＡベクターの場合には皮下注射、ＤＮＡプラスミドの場合には筋肉内注射、およびアデノウイルスベクターの場合には皮下または筋肉内注射される。
一つの実施態様において、プライミングはＭＶＡベクターで行い、ブースティングはＡｄベクターで行い、本明細書に記載の変異型ポリメラーゼタンパク質または融合タンパク質、例えば、配列番号８に示される融合タンパク質をコードするＭＶＡベクターおよび／またはＡｄベクターが特に好ましい。ＭＶＡベクターを生物に１回以上投与した後に、アデノウイルスベクターを１回以上投与するが、３日〜３か月までの異なる期間おいたＭＶＡベクターの少なくとも３回の皮下投与の後、アデノウイルスベクターの筋肉内または皮下ブースト（例えば、ＭＶＡプライムのおよそ１か月〜１年後）を行うのが特に好ましい。
別の実施態様では、プライミングはプラスミドＤＮＡベクターで行い、ブースティングはＭＶＡベクターで行い、本明細書に記載の変異型ポリメラーゼタンパク質または融合タンパク質、例えば、配列番号８に示される融合タンパク質をコードするプラスミドおよび／またはＭＶＡベクターが特に好ましい。ＤＮＡベクターを生物に１回以上投与した後に、ＭＶＡベクターを１回以上投与するが、２週間から３か月までの異なる期間おいたＤＮＡベクターの少なくとも３回の筋肉内投与の後、ＭＶＡベクターの少なくとも１回の皮下ブースト（例えば、ＤＮＡプライムのおよそ１か月〜１年後）を行うのが特に好ましい。好ましくは、ＤＮＡベクターはエレクトロポレーションにより投与される。
本発明はまた、ＨＢＶ感染またはＨＢＶ関連の疾患もしくは病態の処置に使用するためのパーツキットに関し、前記キットは、本発明の変異型ポリメラーゼポリペプチド、融合タンパク質、核酸分子、ベクター、宿主細胞および／または組成物からなる群から選択される複数の有効薬と、前記複数の有効薬をそれを必要とする生物に投与するための説明書とを含んでなる。より好ましくは、生物はＨＢＶに慢性感染した患者である。
上記に引用した特許、刊行物およびデータベース記載事項の開示は総て、そのような個々の特許、刊行物または記載事項がそれぞれ具体的かつ個々に引用することにより本明細書の一部とされることが示されている場合と同程度に、具体的にそれらの全内容が引用することにより本明細書の一部とされる。
本発明で記載される変異型ポリメラーゼポリペプチド、融合タンパク質および抗原組合せを示す。 ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスをプラスミドｐＴＧ１８１８８（Ｃｏｒｅ−Ｐｏｌ−Ｅｎｖ１−Ｐｏｌ−Ｅｎｖ２−Ｐｏｌ）、ｐＴＧ１８１９４（Ｃｏｒｅ−Ｐｏｌ）またはｐＴＧ１３１３５（エンプティー）で免疫誘導した後に行ったＥｌｉｓｐｏｔ ＩＦＮｇアッセイを示す。結果を、免疫誘導マウスの１０６個の脾臓細胞に対する試験で評価された、各ＨＢＶ ＨＬＡ−Ａ２ペプチドに特異的なＩＦＮｇ産生細胞の頻度に対応する１０６個の細胞に対するスポット数として表す。各バーは、一方または他方のプラスミドを接種し、その参照番号（１．１または２．３など）で示した個々のマウスを表し、同じプラスミドで免疫誘導された全マウスの平均値も各群について表す（グラフに「平均値」として示すバー）。個々のマウスおよび平均値に関して、種々の供試ペプチドに特異的なＩＦＮｇ産生細胞の頻度が積み重ねられている。バーには異なる記号が書き込まれ、各記号は、グラフの凡例により示されるように、ある特定のＨＢＶペプチドに対する応答を表す。 ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスをプラスミドｐＴＧ１８１８８（Ｃｏｒｅ−Ｐ−Ｅ１−Ｐ−Ｅ２−ＰまたはＣｏｒｅ−Ｐｏｌ−Ｅｎｖ１−Ｐｏｌ−Ｅｎｖ２−Ｐｏｌ）、ｐＴＧ１８１９４（Ｃｏｒｅ−Ｐｏｌ）またはｐＴＧ１３１３５（エンプティー）で免疫誘導した後に行ったＩＣＳアッセイを示す。結果を、各ＨＢＶ ＨＬＡ−Ａ２ペプチド（図３Ａ）、またはＨＢＶコア（図３Ｂおよび３Ｃ）、ポリメラーゼ（図３Ｄおよび３Ｅ）ならびにｅｎｖ（図３Ｆ）抗原を包含するペプチドプールに特異的なＩＦＮｇ（単独またはＴＮＦａとの組合せ）を産生するＣＤ８（図３Ａ、３Ｂ、３Ｄおよび３Ｆ）、またはＣＤ４（図３Ｃおよび３Ｅ）Ｔ細胞のパーセンテージとして表す。各バーは、一方または他方のプラスミドを接種し、その参照番号（１．１または２．３など）で示した個々のマウスを表し、同じプラスミドで免疫誘導された全マウスの平均値も各群について表す（グラフに「平均値」として示すバー）。個々のマウスおよび平均値に関して、種々の供試ペプチドに特異的なＣＤ８またはＣＤ４ Ｔ細胞の頻度が積み重ねられている。バーには異なる記号が書き込まれ、各記号は、グラフの凡例により示されるように、ある特定のＨＢＶペプチドに対する応答を表す。 ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスをアデノウイルスＡｄＴＧ１８２０１（Ｃｏｒｅ−Ｐｏｌ−Ｅｎｖ Ａｄ）、ＡｄＴＧ１８２０２（Ｃｏｒｅ−Ｐｏｌ Ａｄ）、ＡｄＴＧ１８２０３（Ｐｏｌ Ａｄ）およびＡｄＴＧ１５１４９（エンプティーＡｄ）で免疫誘導した後に行ったＥｌｉｓｐｏｔ ＩＦＮｇアッセイを示す。結果を、免疫誘導マウスの１０６個の脾臓細胞に対する試験で評価された、対象抗原を包含する各ペプチドプールに特異的なＩＦＮｇ産生細胞の頻度に対応する１０６個の細胞に対するスポット数として表す。各バーは、一方または他方のプラスミドを接種し、その参照番号（１．１または２．３など）で示した個々のマウスを表し、同じプラスミドで免疫誘導された全マウスの平均値も各群について表す（グラフに「平均値」として示すバー）。個々のマウスおよび平均値に関して、種々の供試ペプチドに特異的なＩＦＮｇ産生細胞の頻度が積み重ねられている。バーには異なる記号が書き込まれ、各記号は、グラフの凡例により示されるように、ある特定のＨＢＶペプチドに対する応答を表す。 ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスをＡｄＴＧ１８２０１（Ｃｏｒｅ−Ｐｏｌ−Ｅｎｖ Ａｄ）で免疫誘導した後に行ったＥｌｉｓｐｏｔｓ ＩＦＮｇアッセイを示す。結果を、免疫誘導マウスの１０６個の脾臓細胞に対する試験で評価された、各ＨＢＶ ＨＬＡ−Ａ２エピトープまたは無関連のペプチドに特異的なＩＦＮｇ産生細胞の頻度に対応する１０６個の細胞に対するスポット数として表す。各バーは、ＡｄＴＧ１８２０１を接種した個々のマウス（その参照番号３．１〜３．８で示す）を表し、ＡｄＴＧ１８２０１で免疫誘導されたこれらの全マウスの中央値も表す（グラフに「中央値」として示すバー）。個々のマウスおよび中央値に関して、種々のＨＢＶ ＨＬＡ−Ａ２エピトープに特異的なＩＦＮｇ産生細胞の頻度を積み重ね、無関連のペプチドの存在下で見られたＩＦＮｇ産生細胞の頻度を別のバーで表す（各マウスについて「無関連」としてグラフに示す）。バーには異なる記号が書き込まれ、各記号は、グラフの凡例により示されるように、ある特定のＨＢＶペプチドに対する応答を表す。 ＨＬＡ−Ａ２マウスをＡｄＴＧ１８２０１（Ｃｏｒｅ−Ｐｏｌ−Ｅｎｖ Ａｄ）またはＡｄＴＧ１５１４９（エンプティーＡｄ）で免疫誘導した後に行ったＩＣＳアッセイを示す。結果を、ＰＰ８およびＰＣ１と呼ばれる、それぞれＨＢＶポリメラーゼの一部（アミノ酸７２５〜８３５）およびＨＢＶコアタンパク質の一部（アミノ酸１〜１００）を包含する、２つの選択されたペプチドプールに特異的なＩＦＮｇ単独またはＴＮＦａとの組合せを産生するＣＤ８ Ｔ細胞のパーセンテージとして表す。各バーは、一方または他方のアデノウイルスを接種し、その参照番号（１．１または３．２など）で示した個々のマウスを表し、同じアデノウイルスで免疫誘導された全マウスの中央値も各群について表す（グラフに「中央値」として示すバー）。バーには異なる記号が書き込まれ、各記号は、グラフの凡例により示されるように、検出されたＣＤ８ Ｔ細胞により産生されたサイトカインを表す。 ＨＬＡ−Ａ２マウスをＡｄＴＧ１８２０１（Ｃｏｒｅ−Ｐｏｌ−Ｅｎｖ Ａｄ）またはＡｄＴＧ１５１４９（エンプティーＡｄ）で免疫誘導した後に行ったｉｎ ｖｉｖｏ ＣＴＬアッセイを示す。結果を、ｉｎ ｖｉｖｏ特異的溶解、すなわち、供試したＨＢＶ ＨＬＡ−Ａ２エピトープに特異的な溶解、のパーセンテージとして表す。□または△の記号はそれぞれ個々のマウスを表し、同じアデノウイルスで免疫誘導された全マウスの平均値も各群について表す（グラフに太いバーの記号で表す）。 ＨＢＶトランスジェニックマウスをＡｄＴＧ１８２０１（Ｃｏｒｅ−Ｐｏｌ−Ｅｎｖ Ａｄ）またはＡｄＴＧ１５１４９（エンプティーＡｄ）で免疫誘導した後に行ったＩＣＳアッセイを示す。結果を、ＨＢＶポリメラーゼ（ＶＳＡおよびＮ１３Ｆと呼ばれる２つのペプチドの混合物）由来のエピトープまたはＨＢＶエンベロープ（Ｆ１３Ｌと呼ばれる１ペプチド）由来のエピトープに特異的であり、かつ、接種したマウスの脾臓および肝臓の両方に見られる、ＩＦＮｇおよびＴＮＦａの両方を産生するＣＤ８ Ｔ細胞のパーセンテージとして表す。各バーは、一方または他方のアデノウイルスを接種し、その参照番号（１．１または３．２など）で示した個々のマウスを表し、同じアデノウイルスで免疫誘導された全マウスの中央値も各群について表す（グラフに「中央値」として示すバー）。グラフに示される点線はその試験のカットオフ、すなわち、観測されたＣＤ８ Ｔ細胞のパーセンテージがそれを上回ると陽性免疫応答とみなされる閾値に相当する。 ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスを１０５ｉｕ〜１０９ｉｕの種々の用量のＡｄＴＧ１８２０１（Ｃｏｒｅ−Ｐｏｌ−Ｅｎｖ Ａｄ）で免疫誘導した後に行ったＥｌｉｓｐｏｔｓ ＩＦＮｇアッセイを示す。結果を、免疫誘導マウスの１０６個の脾臓細胞に対する試験で評価した、各ＨＢＶ ＨＬＡ−Ａ２エピトープに特異的な、または無関連のペプチドに特異的な、または培地単独の存在下での、ＩＦＮｇ産生細胞の頻度に対応する１０６個の細胞に対するスポット数として表す。黒いバーまたはドットのバーはそれぞれＡｄＴＧ１８２０１を接種した個々のマウスを表し、ある特定の用量のＡｄＴＧ１８２０１で免疫誘導された全マウスの平均値も表す（斜線のバー）。グラフの凡例により示されるように、異なる用量は異なる色または記号で表す。点線は、材料および方法に記載されるように定義されるカットオフ値を表し、観測されたＴ細胞応答がそれを上回ると陽性とみなされる。 種々の注射計画に従ってＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスをＡｄＴＧ１８２０２（Ｃｏｒｅ−Ｐｏｌ Ａｄ）で免疫誘導した後に行ったＥｌｉｓｐｏｔｓ ＩＦＮｇアッセイを示す。マウスに１回（□）、または１週間間隔で３回の注射（△）もしくは１週間間隔で６回の注射（○）を施して免疫誘導を行った。結果を、免疫誘導マウスの１０６個の脾臓細胞に対する試験で評価した、各ＨＢＶ ＨＬＡ−Ａ２エピトープに特異的な、またはアデノウイルスベクターもしくは無関連のペプチドに特異的な、または培地単独の存在下での、ＩＦＮｇ産生細胞の頻度に対応する１０６個の細胞に対するスポット数として表す。各記号（□、△または○）は、ＡｄＴＧ１８２０２を接種した個々のマウスを表し、試験したスケジュールの１つで、ＡｄＴＧ１８２０２で免疫誘導された全マウスの平均値を黒い太線で表す。点線は、材料および方法に記載されるように定義されるカットオフ値を表し、観測されたＴ細胞応答がそれを上回ると陽性とみなされる。 種々の注射計画に従ってＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスをＡｄＴＧ１８２０２（Ｃｏｒｅ−Ｐｏｌ Ａｄ）で免疫誘導した後に行ったＥｌｉｓｐｏｔｓ ＩＦＮｇアッセイを示す。マウスにＴ細胞応答をモニタリングする２週間前に１回（□で示される群１）またはＴ細胞応答をモニタリングする２０週間前に１回（△で示される群２）、または２か月間隔で２回（○で示される群３）、または４か月間隔で２回（×で示される群４）、または２か月間隔で３回（◇で示される群５）のいずれかで免疫誘導を行った。群２以外の総ての群では、Ｔ細胞応答は最後の注射の２週間後にモニタリングした。結果を、免疫誘導マウスの１０６個の脾臓細胞に対する試験で評価した、各ＨＢＶ ＨＬＡ−Ａ２エピトープもしくは無関連のペプチドに特異的な、または培地単独の存在下での、ＩＦＮｇ産生細胞の頻度に対応する１０６個の細胞に対するスポット数として表す。各記号（□、△、○、×、◇）は、ＡｄＴＧ１８２０２を接種した個々のマウスを表し、試験したスケジュールの１つで、ＡｄＴＧ１８２０２で免疫誘導された全マウスの平均値を黒い太線で表す。点線は、材料および方法に記載されるように定義されるカットオフ値を表し、観測されたＴ細胞応答がそれを上回ると陽性とみなされる。
１．材料および方法
下記の構築（図１参照）を、Maniatis et al. (1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NYまたは後続版)に詳説されている一般的遺伝子操作および分子クローニング技術に従い、または市販のキットを用いる場合には製造者の推奨に従って行う。ＰＣＲ増幅技術は当業者に公知である（例えば、Innis, Gelfand, Sninsky and White, Academic Pressにより出版されているPCR protocols -A guide to methods and applications, 1990参照）。アンピシリン耐性遺伝子を有する組換えプラスミドを、１００μｇ／ｍｌの抗生物質を添加した寒天培地または液体培地の大腸菌Ｃ６００（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で複製する。
ＭＶＡベクター構築物は、Erbs et al. (2008, Cancer gene Ther. 15: 18)に従前に記載されているように、シャトルプラスミドとＭＶＡゲノムの間の相同組換えによって作出する。この「基本」シャトルプラスミドは、多重クローニング部位、欠失ＩＩＩのフランキング配列により挟まれたワクシニアウイルス（ＶＶ）プロモーター、ならびにｐ１１Ｋ７．５ワクシニアプロモーター(Falkner and Moss, 1988)の制御下にある大腸菌キサンチン−グアニンホスホリボシル−トランスフェラーゼ（ＧＰＴ）選択遺伝子を含む。簡単に述べると、ＣＥＦ細胞に、導入遺伝子が挿入されていないゲノムＭＶＡ（ＭＶＡ−ヌル）を感染させ、次に、ＣａＣｌ２沈殿により、ＶＶプロモーターの下流に目的遺伝子がクローニングされたシャトルプラスミドでトランスフェクトした。ＭＶＡ−ヌルとシャトルプラスミドの間で相同組換えが起こり、組換えウイルスを多段階のミコフェノール酸選択により単離した。組換えＭＶＡウイルスをＰＣＲにより制御し、ＣＥＦで増幅させ、ウイルス原株の力価をプラークアッセイによりＣＥＦ上で測定した。
アデノウイルスベクターの構築については、まず、目的の核酸分子を「基本」シャトルプラスミドｐＴＧ１３１３５に挿入することによりアデノウイルスシャトルプラスミドを構築する。一般に、核酸分子は、相同組換えによりベクターゲノムのさらなる作出を可能とするために、アデノウイルス配列（それぞれアデノウイルスヌクレオチド１〜４５４とヌクレオチド３５１３〜５７８１）により挟まれたＣＭＶ駆動発現カセットを含むｐＴＧ１３１３５のＮｈｅIおよびＮｏｔＩ制限部位に挿入する(Chartier et al., 1996, J. Virol. 70:4805)。次に、Ｂｓｔ１１０７ＩおよびＰａｃＩで消化した組換えシャトルベクターとＣｌａＩ消化により線状化したｐＴＧ１５３７５（完全なアデノウイルスゲノムをコードする）との間の相同組換えによりアデノウイルスベクターが得られる。得られたアデノウイルスベクターは、Ｅ３（ヌクレオチド２７８６７〜３０７４３）およびＥ１（ヌクレオチド４５５〜３５１２）が欠失し、Ｅ１領域が、５’から３’の方向に、ＣＭＶ前初期エンハンサー／プロモーター、キメラヒトβ−グロビン／ＩｇＧイントロン（Ｐｒｏｍｅｇａで入手可能なｐＣＩベクターに見られる）、目的の核酸分子およびＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナルを含有する発現カセットで置き換えられている。次に、ＰａｃＩで線状化したウイルスゲノムをＥ１補完細胞株にトランスフェクトすることによりアデノウイルス粒子が得られる。ウイルスの増殖、精製および力価測定は従前に記載されている通りに行う(Erbs et al., 2000, Cancer Res. 60:3813)。
１．１．ベクターの構築および生産
以下に示すベクターは、最終的にコアポリペプチドおよび／またはエンベロープタンパク質の免疫原性ドメインに融合された変異型ポリメラーゼポリペプチドを発現するように操作されたものであった。総てのＨＢＶ株配列はＨＢＶ系統Ｙ０７５８７に由来し、その配列は国際データベース（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｙ０７５８７）および種々の刊行物に記載されている。このベクターは血清型ａｙｗの遺伝子型Ｄウイルスである。
以下の例は、配列番号６に表されるように、末端切断型コアポリペプチド（ａａ１〜１４８）と、２つの内部欠失（５３８番〜５４４番および７１０番〜７４２番）および４つのアミノ酸置換（それぞれＤ６８９Ｈ、Ｖ７６９Ｙ、Ｖ７７６ＹおよびＤ７７７Ｈ）を含んでなる突然変異ポリメラーゼポリペプチド（Ｐｏｌ＊と表記）との融合物、ならびに配列番号８に表されるように、欠失したｐｏｌ領域の代わりに挿入された２つの免疫原性Ｅｎｖドメイン（それぞれＨＢｓタンパク質のアミノ酸１４〜５１およびアミノ酸１６５〜１９４に及ぶＥｎｖ１および）をさらに含んでなるより長い融合物を示す。
１．１．１．末端切断型Ｃｏｒｅ−Ｐｏｌ ＊ −Ｅｎｖ１−Ｅｎｖ２（またはＣｏｒｅ−Ｐｏｌ−Ｅｎｖ１−Ｐｏｌ−Ｅｎｖ２−Ｐｏｌ）融合物を発現するプラスミドおよびアデノウイルスベクターの構築および生産
末端切断型Ｃｏｒｅ−Ｐｏｌ＊−Ｅｎｖ１−Ｅｎｖ２融合タンパク質（アミノ酸配列は配列番号８に示される）をコードする合成遺伝子（配列番号１５に記載の３０２４ヌクレオチド）はＧＥＮＥＡＲＴ（レーゲンスブルク、ドイツ）によって合成された。この合成断片をｐＴＧ１３１３５シャトルプラスミドのＮｈｅＩおよびＮｏｔＩ制限部位に挿入してｐＴＧ１８１８８を得た。次に、Ｂｓｔｌｌ０７ＩおよびＰａｃＩで消化したｐＴＧ１８１８８とＣｌａＩ消化により線状化したｐＴＧ１５３７５との間の相同組換えによりアデノウイルスベクターを得た。得られたアデノウイルスベクターｐＴＧ１８２０１は、Ｅ３およびＥ１が欠失し、Ｅ１領域が、末端切断型ＣＭＶプロモーターにより駆動されるＣｏｒｅ−Ｐｏｌ＊−Ｅｎｖ１−Ｅｎｖ２をコードする合成配列を含有する発現カセットで置き換えられている。ＰａｃＩで線状化したウイルスゲノムをＥ１補完細胞株にトランスフェクトすることによりアデノウイルス粒子（ＡｄＴＧ１８２０１）を得た。
１．１．２．末端切断型Ｃｏｒｅ−Ｐｏｌ ＊ を発現するプラスミドおよびアデノウイルスベクターの構築および生産
末端切断型コア−Ｐｏｌ＊融合タンパク質をコードする合成遺伝子（配列番号１４に記載の２８２０ヌクレオチド）は、ＧＥＮＥＡＲＴ（レーゲンスブルク、ドイツ）によって合成された。この合成断片をｐＴＧ１３１３５シャトルプラスミドのＮｈｅＩおよびＮｏｔＩ制限部位に挿入してｐＴＧ１８１９４を得た。次に、Ｂｓｔ１１０７ＩおよびＰａｃＩで消化したｐＴＧ１８１９４とＣｌａＩ消化により線状化したｐＴＧ１５３７５との間の相同組換えによりアデノウイルスベクターを得た。得られたアデノウイルスベクターｐＴＧ１８２０２は、Ｅ３およびＥ１が欠失し、Ｅ１領域がＣＭＶプロモーターにより駆動される末端切断型Ｃｏｒｅ−Ｐｏｌ＊をコードする合成配列を含有する発現カセットで置き換えられている。ＰａｃＩで線状化したウイルスゲノムをＥ１補完細胞株にトランスフェクトすることによりアデノウイルス粒子（ＡｄＴＧ１８２０２）を得た。
１．１．３．Ｐｏｌ ＊ を発現するプラスミドおよびアデノウイルスベクターの構築および生産
Ｐｏｌ変異型ポリペプチドをコードする合成遺伝子（配列番号１３に記載の２３７９ヌクレオチド）は、ＧＥＮＥＡＲＴ（レーゲンスブルク、ドイツ）によって合成された。この合成断片をｐＴＧ１３１３５シャトルプラスミドのＮｈｅＩおよびＮｏｔＩ制限部位に挿入してｐＴＧ１８１９５を得た。Ｂｓｔ１１０７ＩおよびＰａｃＩで消化したｐＴＧ１８１９５とＣｌａＩ消化により線状化したｐＴＧ１５３７５との間の相同組換えによりアデノウイルスベクターを得た。得られたアデノウイルスベクターｐＴＧ１８２０３は、Ｅ３およびＥ１が欠失し、Ｅ１領域がＣＭＶプロモーターにより駆動されるＰｏｌ＊をコードする合成配列を含有する発現カセットで置き換えられている。ＰａｃＩで線状化したウイルスゲノムをＥ１補完細胞株にトランスフェクトすることによりアデノウイルス粒子ＡｄＴＧ１８２０３）を得た。
１．２．マウスモデルにおける免疫原性の評価
抗原の免疫原性は、ＨＬＡトランスジェニックマウスの免疫誘導の後に、Ｅｌｉｓｐｏｔ ΙΚΝγアッセイおよび細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）によりｉｎ ｖｉｖｏで評価した。
１．２．１ マウスモデル
試験に用いたＨＬＡ−Ａ２．１トランスジェニックマウスは、Pascolo et al. (1997, J, Exp. Med. 185:2043)によって記載されている。これらのマウスはＨ−２Ｄｂおよびネズミβ２−ミクログロブリン遺伝子ノックアウトを有し、ヒトβ２ｍのＣ末端がキメラ重鎖のＮ末端に共有結合されているトランスジェニック単鎖組織適合性クラスＩ分子（ＨＨＤ分子）（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１ α１−α２，Ｈ−２Ｄｂ α３トランスメンブランおよび細胞質内ドメイン）を発現する。７〜１０週齢のマウス（雄および雌）に免疫誘導を行った。マウスの平均体重は２５〜３０ｇ前後である。
試験に用いたＨＢＶトランスジェニックマウスは、Halverscheid et al (2008, J. Med. Virol. 80: 583-590)により記載されており、Reinhold Schirmbeckから厚意により提供されたものである。これらのマウスはＣ５７Ｂ１／６Ｊの遺伝的背景を持ち、ＨＢＶゲノムに関してトランスジェニックである（１４３８番に、ＨＢｓＡｇタンパク質の短鎖型の発現を回避し、ＨＢＶ感染性粒子の形成を阻害する突然変異（ＴからＣ）を有する１．４コピーのＨＢＶゲノム）。１０〜１６週齢のマウス（雄および雌）に免疫誘導を行った。マウスの平均体重は２５〜３０ｇ前後である。
１．２．２．免疫誘導プロトコール
１．２．２．１ ＤＮＡ免疫誘導プロトコール
実施例１．１に示されるプラスミドによりコードされる種々の融合タンパク質の免疫原性を評価するために、ＤＮＡ免疫誘導プロトコールを実施した。免疫誘導に用いたＤＮＡは、内毒素を含まない条件で作製した。マウスに対し、１００μｇ／回の各供試プラスミドを用い、筋肉内経路により前脛骨筋に１５日間隔で２回の免疫誘導を行った。ＤＮＡの免疫原性を適正化するために初回のＤＮＡ注射の前に心臓毒注射を行った。最後のＤＮＡ注射から１５日後に細胞性免疫応答を評価した。
１．２．２．２ アデノウイルス免疫誘導プロトコール
実施例１．１に記載の通りに作製したＡｄベクターによりコードされる種々の融合タンパク質の免疫原性を比較するために、アデノウイルス免疫誘導プロトコールを実施した。マウスに対し、種々の融合タンパク質をコードするアデノウイルス（１０８ｉｕ／マウス／回）を用い、皮下経路により尾の基部に１回の免疫誘導を行った。最後のアデノウイルス注射から１５日後に細胞性免疫応答を評価した。
ＡｄＴＧ１８２０１でも種々の用量のアデノウイルスを評価した。マウスに対し、１０５、１０６、１０７、１０８または１０９ｉｕのＡｄＴＧ１８２０１を用い、皮下経路により尾の基部に１回の免疫誘導を行った。
ＡｄＴＧ１８２０２でも種々の免疫誘導計画を試験し、マウスに、種々の時間間隔で１回、２回、３回または６回の注射を行った。各注射は、１０８ｉｕ／マウスを用い、皮下経路により尾の基部に行った。１週間間隔で１回、３回または６回の注射を並行して比較した。誘導されたＴ細胞応答のモニタリング時の２週間前または２０週間前の１回の注射、２か月または４か月間隔で２回の注射、および２か月間隔で３回の注射も並行して比較した。
１．２．３ ペプチド
ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞刺激に用いたペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２制限エピトープであると記載されているまたは推定される９〜１０アミノ酸の短鎖ペプチドか、または対象抗原の全域を包含するペプチドライブラリーに含まれる１５アミノ酸の長鎖ペプチドのいずれかである。
コアタンパク質、Ｐｏｌタンパク質またはＥｎｖドメインの記載されているまたは推定されるＨＬＡ−Ａ２制限エピトープに対応する短鎖ペプチドは、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ（ベルギー）によって合成され、１００％ＤＭＳＯ（ｓｉｇｍａ，Ｄ２６５０）に１０ｍＭ濃度で溶かした。
コア、Ｐｏｌおよびエンベロープドメイン全体を包含するペプチドライブラリーはＰｒｏＩｍｍｕｎｅ（オックスフォード、イギリス）によって合成された。このコア、Ｐｏｌ、およびＥｎｖライブラリーは、１１個のアミノ酸がオーバーラップする１５マーのペプチドから構成された。各未精製ペプチドを１００％ＤＭＳＯ（ｓｉｇｍａ，Ｄ２６５０）に５０ｍｇ／ｍｌ濃度で溶かした。各ライブラリーについて、各ペプチド２ｍｇ／ｍｌの濃度となるようにペプチドをプールした。
・ＨＢＶコアタンパク質は２１ペプチドと２２ペプチドの２プール（プール１（ＰＣ１）：コア残基１〜１００を包含する２２ペプチド；プール２（ＰＣ２）：コア残基８９〜１８３を包含する２１ペプチド）により包含された。
・ＨＢＶ Ｐｏｌタンパク質は、２４ペプチド（プール１（ＰＰ１）：ａａ４５〜１５１を包含する２４ペプチド；プール２（ＰＰ２）：ａａ１４１〜２５１（ａａ２０５〜２１９のペプチドは、１００％ＤＭＳＯまたはＤＭＳＯ＋Ｔｒｉｓ １００ｍＭ ｐＨ９に不溶であるために除去し；ａａ２２１〜２３５のペプチドは、１００％ＤＭＳＯに不溶であるためにＤＭＳＯ＋Ｔｒｉｓ １００ｍＭ ｐＨ９に溶解させた）を包含する２４ペプチド；プール３（ＰＰ３）：ａａ２４１〜３４７を包含する２４ペプチド；プール４（ＰＰ４）：ａａ３３７〜４４７（ａａ３７３〜３８７のペプチドは１００％ＤＭＳＯまたはＤＭＳＯ＋Ｔｒｉｓ １００ｍＭ ｐＨ９に不溶であるために除去した）を包含する２４ペプチド；プール５（ＰＰ５）：ａａ４３７〜５４３を包含する２４ペプチド；プール６（ＰＰ６）：ａａ５３３〜６３９を包含する２４ペプチド；プール７（ＰＰ７）：ａａ６２９〜７３５を包含する２４ペプチド；プール８（ＰＰ８）：ａａ７２５〜８３５を包含する２４ペプチド）の８プールにより包含された。
・Ｅｎｖドメインは、９ペプチドと１０ペプチドの２プール（プール１（ＰＥ１）：ＨＢｓ残基９〜５９を包含する１０ペプチド；プール２（ＰＥ２）：ＨＢｓ残基１５７〜１９４を包含する９ペプチド）により包含された。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの遺伝的背景を有するＨＢＶトランスジェニックマウスで実施した試験では、Ｃ５７Ｂ１／６Ｊの遺伝的背景を有するマウスにおいて反応性があるとして文献に記載されているまたは従前の試験で特定されたＨＢＶペプチドをｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞刺激に用いた。これらのペプチドは短鎖ペプチド（ポリメラーゼに関してはＶＳＡＡＦＹＨＬＰＬ；配列番号２４）または長鎖ペプチド（ポリメラーゼに関してはＮ１３Ｆと呼ばれるＮＬＮＶＳＩＰＷＴＨＫＶＧＮＦ（配列番号２５）およびエンベロープタンパク質に関してはＦ１３Ｌと呼ばれるＦＬＷＥＷＡＳＡＲＦＳＷＬＳＬ（配列番号２６））のいずれかである。これらのペプチドはＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃ（ベルギー）またはＰｒｏ Ｉｍｍｕｎｅ（オックスフォード、イギリス）によって合成された。各ペプチドは１００％ＤＭＳＯ（ｓｉｇｍａ Ｄ２６５０）に１０ｍＭ濃度で溶かした。これらのペプチドはＩＣＳアッセイの際には１０μＭ濃度で用いた（２種のペプチドの混合物として試験する場合でも）。
１．２．４．ＩＦＮｇ Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ
免疫誘導マウスからの脾細胞を回収し、赤血球を溶解させた（Ｓｉｇｍａ，Ｒ７７５７）。２．１０５細胞／ウェルを、抗マウスＩＦＮγモノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；１０μｇ／ｍｌ，５５１２１６）でコーティングしたＭｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＳＨＡ Ｓ４５１０）にて、１０％ＦＣＳ（ＪＲＨ，１２００３−１００Ｍ）、８０Ｕ／ｍＬペニシリン／８０μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ＰＡＮ，Ｐ０６−０７−１００）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ，２５０３０）、１×非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ，１１１４０）、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ，１５６３０）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ，３１３５０）および５０μＭβ−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ，３１３５０）を添加したＭＥＭ培養培地（Ｇｉｂｃｏ，２２５７１）中、陰性対照としての１０単位／ｍｌの組換えネズミＩＬ２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，２１２−１２）単独の存在下、または
・プラスミドによりコードされるＨＢＶ抗原中に存在する、選択されたＨＬＡ−Ａ２制限ペプチド（コアではＦＬＰ、ＩＬＣ、ＥｎｖではＶＬＱ、ＦＬＧおよびＧＬＳ、ＰｏｌではＳＬＹ（配列番号１８〜２３に記載））または無関連のもの１０μＭ；
・各ペプチド終濃度５μｇ／ｍｌのペプチドプール；
・陽性対照としてのコンカナバリンＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｃ５２７５）５μｇ／ｍｌ
とともに、３反復で４０時間培養した。
ＩＦＮｇ産生Ｔ細胞を、従前に記載されているように(Himoudi et al., 2002, J. Virol. 76:12735)、Ｅｌｉｓｐｏｔ（サイトカイン特異的酵素結合免疫スポット）アッセイによって定量した。陰性対照ウェルにおけるスポットの数（ＩＦＮｇ産生Ｔ細胞に相当する）を、ＨＢＶペプチドを含有する試験ウェルにおいて検出されたスポットの数から差し引いた。結果は３反復のウェルで得られた平均値として示す。見られた応答の確実な試験閾値（すなわちカットオフ）は、１０６細胞に対して報告された、培地単独＋２標準偏差で見られたスポットの平均値に相当する閾値を計算することによって求めた。また、ＣＴＬ Ｅｌｉｓｐｏｔリーダーに関連するテクニカルカットオフは、５０スポット／１０６細胞（リーダーのＣＶ（変動係数）が体系的に２０％未満であった場合を超える値である）として定義した。テクニカルカットオフと、各試験で計算された試験閾値の間の最高値を考慮して、各試験のカットオフ値を定義した。Ｅｌｉｓｐｏｔ応答の統計分析は、マン・ホイットニー検定を用いて行った。０．０５以上のＰ値が有意とみなされる。
１．２．５．細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）アッセイ
各群の各動物からの脾細胞に対してＩＣＳを行った。溶解バッファー（Ｓｉｇｍａ，Ｒ７７５７）で赤血球を溶解させた後、ウェル当たり２×１０６個の細胞を平底９６ウェルプレートにて、完全αＭＥＭ培養培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，２２５７１）中、陰性対照として１０単位／ｍｌのネズミ組換えＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，２１２−１２）単独の存在下、または１０μＭの特異的ＨＢＶペプチドまたは各ペプチド終濃度５μｇ／ｍｌのペプチドのプールまたは１０μＭの無関連のペプチドとともにインキュベートした。ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，５５５０２９）を終濃度１μｌ／ｍｌですぐに加えて５時間置いた。次に、細胞をＶ底９６ウェルプレートに回収し、１％ＦＣＳ−ＰＢＳで洗浄した。染色は、５０μｌの１％ＦＣＳ−ＰＢＳ中、ＣＤ３に対するモノクローナル抗体（ハムスターＭＡｂ抗ＣＤ３ｅ−ＰＥ、１／２００希釈）、ＣＤ８に対するモノクローナル抗体（ラットＭＡｂ抗ＣＤ８ａ−ＡＰＣ、１／６００希釈）およびＣＤ４に対するモノクローナル抗体（ラットＭＡｂ抗ＣＤ４−ＰｅｒＣＰ、１／６００希釈）（総てＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから、それぞれ５５３０６３、５５３０３５および５５３０５２）を用いて室温で１５分間行った。洗浄後、細胞を固定し、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍで透過処理を施し、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ溶液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，５５４７１４）で洗浄した。その後、抗マウスＩＦＮｇ−ＰＥ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，５５４４１２５５７７２４）および抗マウスＴＮＦａ−Ａｌｅｘａ４８８抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，５５７７１９）または抗マウスＩＦＮｇ−ＰＥ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，５５４４１２５５７７２４）を室温で１５分間加え、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈで洗浄した後、細胞を１％ＦＣＳ−ＰＢＳに再懸濁させ、ＦａｃｓＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いてフローサイトメトリーにより分析した。ＣＤ３ｅ＋，Ｄ８ａ＋細胞またはＣＤ３ｅ＋，ＣＤ４＋細胞にゲートをかけ、ＩＦＮｇ＋ＣＤ８＋またはＩＦＮｇ＋ＣＤ４＋ＴまたはＴＮＦａ＋ＣＤ８＋またはＴＮＦａ＋ＣＤ４＋ＴまたはＩＦＮｇ＋ＴＮＦａ＋ＣＤ８＋またはＩＦＮｇ＋ＴＮＦａ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞集団のパーセンテージを求めた。培地単独で得られたパーセンテージをバックグラウンドとみなした。
ＨＢＶトランスジェニックマウスで実施した試験では、各群の各動物からの肝細胞に対してもＩＣＳを行った。マウスを安楽死させた後、肝臓を原位置にて、冷ＰＢＳを用いて肝門脈により、器官が蒼白となるまでか潅流した。肝臓を摘出し、ＰＢＳ＋ＦＣＳ ２％溶液に入れ、小片に刻み、７０μｍのセルストレーナーに穏やかに通した後、冷ＰＢＳ＋２％ＦＣＳ溶液に懸濁させた。遠心分離後、細胞を再び冷ＰＢＳ＋２％ＦＣＳ溶液で洗浄した。新たな遠心分離後、細胞を含有するペレットを１０ｍＬのパーコール溶液に再懸濁させ、室温にて７００ｇで１２分間遠心分離し、再びＰＢＳ＋２％ＦＣＳ溶液で洗浄した。次に、赤血球を脾細胞に関して上記したように溶解させ、その後の総ての工程を、脾細胞に関する上記段落に記載の通りに行った。肝臓では、回収されるＴリンパ球の量が限られるのでウェル当たりの細胞数は可変であり、得られた総ての細胞を、同量の細胞が総てのウェルに割り当てられるように培養したことを注記しておく。
１．２．６ ｉｎ ｖｉｖｏ ＣＴＬアッセイ
ｉｎ ｖｉｖｏ ＣＴＬアッセイは、ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスにおいてFournillier et al. (2007, Vaccine, 25: 7339-53)により記載されているように行った。脾細胞懸濁液を同系マウスの脾臓から得、赤血球を溶解させた後に２０×１０６細胞／ｍＬに調整した。半分の細胞を終濃度１０μＭの目的ＨＢＶペプチド（ＳＬＹ、ＦＬＰまたはＩＬＣ）とともに３７℃で１時間インキュベートし、半分の細胞はパルスを行わずにおいた。次に、５（６）−カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ，Ｃ１１５７）を、パルスを行わなかった細胞には１０μＭ（ＣＦＳＥ−高）で、ＨＢＶペプチドでパルスした細胞には１μＭ（ＣＦＳＥ−低）で１０分間加えた。ＰＢＳで洗浄した後、総ての集団を混合し、計２０×１０６個の細胞を、麻酔したマウスに眼窩静脈叢から注射し、マウスはＡｄＴＧ１８２０１またはＡｄＴＧ１５１４９により事前に（２週間前に）免疫誘導されていた。従って、ＣＦＳＥ−低集団は、接種によって誘導された細胞傷害性Ｔ細胞によって溶解されると思われる特異的標的に相当し、ＣＦＳＥ−高集団は、アッセイのノーマライゼーションを可能とする内部参照であった。２４時間後、レシピエントマウスからの脾細胞をフローサイトメトリーにより分析してＣＦＳＥ標識細胞を検出した。各動物について、ペプチドでパルスした標的とパルスを行わなかった標的との比を算出した（Ｒ＝ＣＦＳＥ−低細胞の数／ＣＦＳＥ−高細胞の数）。各動物の特異的溶解のパーセンテージを下式：溶解率％＝（１−Ｒマウス／Ｒ参照）×１００（式中、Ｒ参照はＣＦＳＥ標識標的の同じ懸濁液を注射した２個体のＨＬＡ−Ａ２で得られた平均Ｒである）によって求めた。応答は、特異的溶解のパーセンテージが１０％より大きければ陽性とみなした。
１．３ 電子顕微鏡によるＡｄＴＧ１８２０１のｉｎ ｖｉｔｒｏ分析
Ａ５４９細胞（ヒト肺腺癌上皮細胞株）に、懸濁液中、培地量を減じた条件下、種々のＭＯＩ（２５〜１００）のＡｄＴＧ１８２０１を感染させ、次いで１６時間、２４時間または４８時間培養した後に分析のために回収した。これらの異なる時点で細胞を回収した後、カコジル酸ナトリウム(sodium cocadylate)バッファー０．２Ｍに２％希釈したグルタルアルデヒドを用いて固定した。次に、細胞を乾燥させ、樹脂ブロックに包埋した後、超薄切片とした。その後、得られた網状組織を酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色し、電子顕微鏡で観察した。
２．結果
２．１．ＤＮＡプラスミドＰＴＧ１８１８８およびｐＴＧ１８１９４により発現されたＨＢＶ融合タンパク質の免疫原性
ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスにおいて、ＤＮＡプラスミドによって発現されたＨＢＶ融合タンパク質の免疫原性を評価した。ｐＴＧ１８１８８（ｔＣｏｒｅ−Ｐｏｌ＊−Ｅｎｖ１−Ｅｎｖ２）もしくはｐＴＧ１８１９４（ｔＣｏｒｅ−Ｐｏｌ＊）または陰性対照としてのｐＴＧ１３１３５（エンプティープラスミド）のいずれかの２回の筋肉内注射の後、特異的Ｔ細胞応答を、ポリメラーゼ、コアもしくはエンベロープドメインに存在する既知のＨＬＡ−Ａ２エピトープおよび／または対象ＨＢＶ抗原を包含するオーバーラップペプチドのプールを用い、Ｅｌｉｓｐｏｔ ＩＦＮｇおよびＩＣＳ（ＩＦＮｇ／ＴＮＦａ）により評価した。
２．１．１．ＥｌｉｓｐｏｔアッセイによるＨＢＶ特異的ＩＦＮγ産生細胞の評価
図２に示されるように、ＨＢＶ融合タンパク質「ｔＣｏｒｅ−Ｐｏｌ＊」をコードするプラスミドｐＴＧ１８１９４で免疫誘導すると、ＨＢＶポリメラーゼ内に位置する（８１６番〜８２４番）ＨＬＡ−Ａ２制限ＳＬＹエピトープ（配列番号２３）に特的なＩＦＮｇ産生細胞が誘導された。また、プラスミドｐＴＧ１８１９４で免疫誘導すると、２つのコアＨＬＡ−Ａ２制限エピトープＦＬＰ（ＨＢＶコアタンパク質内の１８番〜２７番に位置する配列番号１８）およびＩＬＣ（ＨＢＶコアタンパク質内の９９番〜１０８番に位置する配列番号１９）に特異的なＩＦＮｇ産生細胞も高頻度で誘導される結果となった。接種したマウス８個体のうち４個体で陽性応答が見られた。
図２に示されるように、ＨＢＶ融合タンパク質「Ｃｏｒｅ−Ｐｏｌ＊−Ｅｎｖ１−Ｅｎｖ２」をコードするプラスミドｐＴＧ１８１８８も、ｐｏｌ ＨＬＡ−Ａ２エピトープＳＬＹならびに２つのコアＨＬＡ−Ａ２制限エピトープＦＬＰおよびＩＬＣに特異的なＩＦＮｇ産生細胞を誘導した。接種したマウス８個体うち４個体で陽性応答が見られた。さらに、ＨＬＡ−Ａ２ ＧＬＳエピトープ（ＨＢｓＡｇのＥｎｖ２内の１８５番〜１９４番に位置する配列番号２２）に特異的なＩＦＮｇ産生細胞も、接種したマウス１個体で低頻度であったが、検出された。
２．１．２．細胞内染色アッセイによる、誘導されたＨＢＶ特異的ＩＦＮｇ産生Ｔ ＣＤ８＋およびＣＤ４＋細胞の評価
２．１．２．１．ＨＬＡ−Ａ２制限エピトープに特異的なＣＤ８ Ｔ細胞応答
ＩＦＮｇ単独か、またはポリメラーゼ（ＳＬＹ）、コア（ＦＬＰおよびＩＬＣ）およびエンベロープドメイン（ＶＬＱ、ＦＬＧおよびＧＬＳ）中に含まれるＨＬＡ−Ａ２制限エピトープを標的とするＴＮＦａとの組合せかのいずれかを産生するＣＤ８ Ｔ細胞のパーセンテージをＩＣＳアッセイにより評価した。これらの結果をこれらのエピトープに特異的でありかつＩＦＮｇを産生するＣＤ８＋ Ｔ細胞（ＩＦＮｇ単独産生細またはＩＦＮｇおよびＴＮＦａ二重産生細胞の合計）のパーセンテージとして図３Ａに示す。ｐＴＧ１８１９４（ｔＣｏｒｅ−Ｐｏｌ＊を発現する）で免疫誘導した動物８個体のうち４個体で、それぞれコア抗原およびＰｏｌ抗原に位置するＦＬＰ、ＩＬＣおよびＳＬＹ ＨＬＡ−Ａ２制限エピトープに特異的なＩＦＮｇ産生ＣＤ８＋ Ｔ細胞が誘導された。同様に、ｔＣｏｒｅ−Ｐｏｌ＊−Ｅｎｖ１−Ｅｎｖ２）を発現するｐＴＧ１８１８８で免疫誘導した動物８個体のうち４個体でも、ＦＬＰ、ＩＬＣおよびＳＬＹエピトープに特異的なＩＦＮｇ産生Ｔ ＣＤ８＋ Ｔ細胞が誘導された。さらに、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイですでに見られたように、プラスミドｐＴＧ１８１８８で免疫誘導したマウス８個体のうち１個体は、ＩＦＮｇ産生ＣＤ８＋ Ｔ細胞により媒介される、Ｅｎｖ２ドメイン内に位置するＧＬＳ ＨＬＡ−Ａ２制限エピトープに特異的な応答を示した。ｐＴＧ１３１３５での免疫誘導では、予想されたように、特異的応答は誘導されなかった。
２．１．２．２ コアタンパク質、ポリメラーゼタンパク質およびＥｎｖドメインを包含するペプチドのプールに特異的なＣＤＳおよびＣＤ４ Ｔ細胞応答
コアタンパク質を包含するペプチドのプールに特異的な応答
ＩＦＮｇ単独、またはＴＮＦａとの組合せかのいずれかを、コアタンパク質（ＰＣ）を包含するペプチドのプールに応答して産生することができるＣＤ８およびＣＤ４ Ｔ細胞のパーセンテージを、ＩＣＳアッセイにより評価した。これらの結果を、これらのペプチドプールに特異的でありかつＩＦＮｇを産生するＣＤ８＋またはＣＤ４＋ Ｔ細胞（ＩＦＮｇ単独産生細胞またはＩＦＮｇおよびＴＮＦａ二重産生細胞の合計）のパーセンテージとして表す。
図３Ｂに示されるように、コアタンパク質を包含する２つのペプチドプール（ＰＣ１およびＰＣ２）に対して、ＩＦＮｇを産生するＣＤ８＋ Ｔ細胞の陽性のパーセンテージが検出され、ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答は主としてプールコア１のペプチドに集中していた。ｐＴＧ１８１９４またはｐＴＧ１８１８８のいずれかを接種したマウスで見られた反応性ＣＤ８＋ Ｔ細胞のパーセンテージは、両ペプチドプール（１および２）に関して、陰性対照（ｐＴＧ１３１３５）を接種したマウスで見られたパーセンテージとは有意に異なっていた（ｐ＜０．０５、マンホイットニー検定）。
図３Ｃに示されるように、ｐＴＧ１８１９４またはｐＴＧ１８１８８を接種した２つのマウス群において、コアタンパク質を包含する１つのペプチドプール、すなわち、プールコア２に対してもＩＦＮｇを産生するＣＤ４＋ Ｔ細胞の陽性のパーセンテージが検出された。ｐＴＧ１８１８８を接種したマウスで見られた反応性ＣＤ４＋ Ｔ細胞のパーセンテージは、プールコア２に関して、陰性対照（ｐＴＧ１３１３５）を接種したマウスで見られたパーセンテージとは有意に異なっていた（ｐ＜０．０５、マンホイットニー検定）。
ポリメラーゼタンパク質を包含するペプチドのプールに特異的な応答
ＩＦＮｇ単独か、またはＴＮＦａとの組合せかのいずれかを、ポリメラーゼタンパク質を包含するペプチドのプールに応答して産生することができるＣＤ８およびＣＤ４ Ｔ細胞のパーセンテージを、ＩＣＳアッセイにより評価した。これらの結果を、これらのペプチドのプールに特異的でありかつＩＦＮｇを産生するＣＤ８＋またはＣＤ４＋ Ｔ細胞（ＩＦＮｇ単独産生細胞またはＩＦＮｇおよびＴＮＦａ二重産生細胞の合計）のパーセンテージとして表す。
図３Ｄに示されるように、ＩＦＮｇを産生するＣＤ８＋ Ｔ細胞の陽性のパーセンテージが主としてペプチドプールの１つＰＰ８に対して検出された。具体的には、ＰＰ８に関して、ｐＴＧ１８１９４またはｐＴＧ１８１８８のいずれかを接種されたマウスで見られた反応性ＣＤ８＋ Ｔ細胞のパーセンテージは、陰性対照（ｐＴＧ１３１３５）を接種したマウスで見られたパーセンテージとは有意に異なっていた（ｐ＜０．０５、マンホイットニー検定）。ｐＴＧ１８１８８を接種したマウス群の中の１個体は、プール４、プール５およびプール６に対してもＩＦＮｇ産生ＣＤ８＋ Ｔ細胞の陽性のパーセンテージを示したことを注記しておく。
図３Ｅに示されるように、ｐＴＧ１８１９４またはｐＴＧ１８１８８を接種した２つのマウス群において、Ｐｏｌタンパク質を包含する４つのペプチドプール、すなわち、プールＰｏｌ １、プールＰｏｌ ４、プールＰｏｌ ５およびプールＰｏｌ ６に対して、ＩＦＮｇを産生するＣＤ４＋ Ｔ細胞の弱いが陽性のパーセンテージが検出され、各群で試験マウス８個体のうち少なくとも３個体が応答を示した。
エンベロープドメインを包含するペプチドのプールに特異的な応答
ＩＦＮｇ単独か、またはＴＮＦａとの組合せかのいずれかを、エンベロープドメインＥｎｖ１およびＥｎｖ２を包含するペプチドのプールに応答して生産することができるＣＤ８およびＣＤ４ Ｔ細胞のパーセンテージを、ＩＣＳアッセイにより評価した。この試験では特異的ＣＤ４＋ Ｔ細胞応答は検出されなかった。ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答に関する結果を、これらのペプチドプールに特異的でありかつＩＦＮｇを産生するＣＤ８＋ Ｔ細胞（ＩＦＮｇ単独産生細胞またはＩＦＮｇおよびＴＮＦａ二重産生細胞の合計）のパーセンテージとして図３Ｆに示す。具体的には、ＩＦＮｇを産生するＣＤ８＋ Ｔ細胞の、弱いが陽性のパーセンテージが、ｐＴＧ１８１８８を接種した１個体のマウスで、１つのペプチドプール、すなわち、プールＥｎｖ２に対して検出された。
２．２．アデノウイルスＡｄＴＧ１８２０１、ＡｄＴＧ１８２０２およびＡｄＴＧ１８２０３により発現されたＨＢＶ融合タンパク質の免疫原性
２．２．１．オーバーラップペプチドのプールを用いたＥｌｉｓｐｏｔｓ ＩＦＮｇによるＨＢＶ特異的ＩＦＮｇ産生Ｔ細胞の評価
ヒトアデノウイルス５により発現されたＨＢＶ Ｐｏｌ突然変異体および融合タンパク質の免疫原性を、ＡｄＴＧ１８２０１またはＡｄＴＧ１８２０２またはＡｄＴＧ１８２０３またはＡｄＴＧ１５１４９（陰性対照として使用するエンプティーアデノウイルス）のいずれかで免疫誘導したＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスで評価した。アデノウイルスの皮下注射の後に誘導された特異的Ｔ細胞応答を、対象ＨＢＶ抗原、コア（ＰＣ１〜２）、ポリメラーゼ（ＰＰ１〜８）およびＥｎｖ（ＰＥ１〜２）ドメインを包含するオーバーラップペプチドのプールを用いたＥｌｉｓｐｏｔ ＩＦＮｇにより評価した。
図４に示されるように、ＨＢＶ変異型ポリメラーゼポリペプチド単独をコードするＡｄＴＧ１８２０３は、ポリメラーゼペプチドプール４、５、６および８に特異的なＩＦＮｇ産生細胞を誘導することができる。総ての免疫誘導マウスが、主としてポリメラーゼペプチドプール４および８に対して、高頻度のＩＦＮｇ産生細胞を伴って特異的Ｔ細胞応答を示した。
図４に示されるように、ＨＢＶ融合タンパク質「ｔＣｏｒｅ−Ｐｏｌ＊」をコードするＡｄＴＧ１８２０２は、ペプチドプールＰＰ２、ＰＰ３、ＰＰ４、ＰＰ５およびＰＰ８に特異的なＩＦＮｇ産生細胞を誘導し、このポリメラーゼ特異的応答は主としてＰＰ２、ＰＰ３およびＰＰ８に集中していた。また、ＡｄＴＧ１８２０２で免疫誘導すると、２つのコアペプチドプールＰＣ１およびＰＣ２に特異的なＩＦＮｇ産生細胞も高頻度で誘導される結果となり、ＰＣ１を標的とするＴ細胞の頻度がより高かった。接種したマウス５個体のうち５個体で、ポリメラーゼ抗原とコア抗原の両方を標的とする陽性応答が見られた。
図４に示されるように、ＨＢＶ融合タンパク質「Ｃｏｒｅ−Ｐｏｌ＊−Ｅｎｖ１−Ｅｎｖ２」をコードするＡｄＴＧ１８２０１も、免疫原性であることが判明した。より具体的には、ポリメラーゼペプチドプールＰＰ２、ＰＰ３、およびＰＰ８に特異的なＩＦＮｇ産生細胞が総ての接種マウスで誘導されただけでなく、スポットが弱く、応答マウス頻度は低いもののＰＰ４およびＰＰ５に対しても誘導された。また、ＡｄＴＧ１８２０１で免疫誘導すると、総ての接種マウス（５／５）で、２つのコアペプチドプールＰＣ１およびＰＣ２に特異的なＩＦＮｇ産生細胞も高頻度で誘導される結果となった。また、ＡｄＴＧ１８２０１で免疫誘導すると、その応答は弱く、マウス５個体のうち１個体がＰＥ１を標的とする応答を示し、マウス５個体のうち２個体がＰＥ２を標的とする応答を示すというように散発的であったとしても、Ｅｎｖドメインに対しても特異的Ｔ細胞応答を示した。
２．２．２．ＡｄＴＧ１８２０１で免疫誘導した後のＨＬＡ−Ａ２ペプチドを用いたＥｌｉｓｐｏｔｓ ＩＦＮｇによるＨＢＶ特異的ＩＦＮｇ産生Ｔ細胞の評価
ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスにおいて、ＡｄＴＧ１８２０１により発現された１つのＨＢＶ融合タンパク質の免疫原性を評価した。ＡｄＴＧ１８２０１またはＡｄＴＧ１５１４９（陰性対照として用いるエンプティーアデノウイルス）のいずれかの１回の皮下注射により動物を免疫誘導した。特異的Ｔ細胞応答を、ポリメラーゼ（ＳＬＹ）、コア（ＦＬＰおよびＩＬＣ）およびエンベロープ（ＶＬＱおよびＧＬＳ）に含まれるＨＬＡ−Ａ２制限エピトープを用いたＥｌｉｓｐｏｔ ＩＦＮｇにより評価した。
図５に示されるように、ＨＢＶ融合タンパク質「Ｃｏｒｅ−Ｐｏｌ＊−Ｅｎｖ１−Ｅｎｖ２」をコードするＡｄＴＧ１８２０１は、免疫原性であることが判明した。より具体的には、ポリメラーゼＨＬＡ−Ａ２エピトープＳＬＹに特異的なＩＦＮｇ産生細胞は、総てのＡｄＴＧ１８２０１接種マウスに誘導された。同時に、ＡｄＴＧ１８２０１はまた、コアタンパク質ＦＬＰおよびＩＬＣの２つのＨＬＡ−Ａ２エピトープに特異的なＩＦＮｇ産生細胞も高頻度で誘導した。ＡｄＴＧ１８２０１による免疫誘導はまた、処置マウス８個体のうち２個体がＶＬＱペプチドに対する陽性Ｔ細胞応答を示し、処置マウス８個体のうち５個体がＧＬＳＰペプチドに対する陽性Ｔ細胞応答を示すというように、応答マウスの頻度および数は低くとも、Ｅｎｖドメインに対しても特異的Ｔ細胞応答を誘導した。
２．２．３．ＡｄＴＧ１８２０１によるＨＬＡ−Ａ２マウスの免疫誘導後の、選択されたペプチドプールを用いた細胞内染色アッセイによる、ＨＢＶ特異的ＩＦＮｇおよび／またはＴＮＦａ誘導ＣＤ８＋Ｔ細胞の評価
ＩＦＮｇ単独、またはＴＮＦａとの組合せのいずれかを、ポリメラーゼタンパク質の一部（ＰＰ８、アミノ酸７２５〜８３５）およびＨＢＶコアタンパク質の一部（ＰＣ１、アミノ酸１〜１００）を包含する選択されたペプチドプールに応答して産生することができるＣＤ８＋ Ｔ細胞のパーセンテージをＩＣＳアッセイにより評価した。結果を、これらのペプチドプールに特異的でありかつＩＦＮｇ単独およびＩＦＮｇとＴＮＦａの組合せを産生するＣＤ８＋ Ｔ細胞のパーセンテージとして表す。
図６に示されるように、ＡｄＴＧ１８２０１は、特に、ＰＰ８およびＰＣ１プールのペプチドを認識する、ＩＦＮｇ単独ならびにＩＦＮｇとＴＮＦａの組合せの両方を産生する高いパーセンテージのＣＤ８＋ Ｔ細胞を誘導することができる。総ての接種マウスが、高いパーセンテージの、単独産生（ＩＦＮｇ単独）および二重産生（ＩＦＮｇおよびＴＮＦａ）両方の特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞を示した。
別のマウスモデルＣ５７Ｂ１６マウスでも同様の試験を行ったところ、ＡｄＴＧ１８２０１の免疫原性について同様の結果（示されていない）が示されたことを注記しておく。
２．２．４．ＡｄＴＧ１８２０１によるＨＬＡ−Ａ２マウスの免疫誘導後の、ｉｎ ｖｉｖｏ ＣＴＬアッセイを用いたｉｎ ｖｉｖｏ機能的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の誘導に関する評価
細胞溶解活性を示す機能的ＣＤ８ Ｔ細胞をｉｎ ｖｉｖｏにおいて誘導するＡｄＴＧ１８２０１の能力を、ＡｄＴＧ１８２０１またはＡｄＴＧ１５１４９（陰性対照）による免疫誘導後に、誘導されたＩＦＮｇを産生ＣＤ８＋ Ｔ細胞により標的とされることがすでに示されているＨＬＡ−Ａ２エピトープのうちの３つ（ＳＬＹ、ＦＬＰおよびＩＬＣ）を用いて、ＨＬＡ−Ａ２マウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ細胞溶解性（またはＣＴＬ）アッセイにより評価した。
図７に示されるように、ＡｄＴＧ１８２０１は、ポリメラーゼエピトープＳＬＹに対して高いパーセンテージのｉｎ ｖｉｖｏ特異的溶解を誘導することができ、総ての免疫誘導マウスで特異的溶解が検出され、パーセンテージは４２％〜７５％の範囲であった（図７ａ）。また、ＡｄＴＧ１８２０１は、コアタンパク質の２つの供試ＨＬＡ−Ａ２エピトープＦＬＰ（図７ａ）およびＩＬＣ（図７ｂ）に対しても高いパーセンテージのｉｎ ｖｉｖｏ特異的溶解を誘導することができ、パーセンテージはそれぞれ３２％〜６９％および３％〜６４％の範囲であることが示された。ｅｎｖエピトープに対する応答は低レベルではあるが、検出可能であった。
これらのデータは、細胞溶解活性を示しかつＨＢＶポリメラーゼとＨＢＶコアタンパク質の両方を標的とする機能的ＣＤ８＋ Ｔ細胞をｉｎ ｖｉｖｏにおいて誘導するＡｄＴＧ１８２０１の能力を明らかに実証する。
２．２．５．ＡｄＴＧ１８２０１によるおよび免疫誘導後の、ＩＣＳアッセイを用いた、ＨＢＶトランスジェニックマウスにおける機能的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の誘導に関する評価
耐性マウスモデルにおける機能的Ｔ細胞を誘導するＡｄＴＧ１８２０１の能力を、ＨＢＶトランスジェニックマウスにおいて評価した。実際に、これらのマウスはＨＢＶゲノムに関してトランスジェニックであり、従って、ＨＢＶ抗原に対して耐性であり、ＨＢＶ慢性患者に見られる耐性をある程度模倣する。ＨＢＶトランスジェニックマウスは、ＡｄＴＧ１８２０１（１０８ｉｕ）または陰性対照としてのＡｄＴＧ１５１４９の１回の皮下注射により免疫誘導した。誘導されたＴ細胞は、接種マウスの脾臓および肝臓の両方で、ＩＣＳ（ＩＦＮｇおよびＴＮＦａの両方を産生するＣＤ８＋ Ｔ細胞の検出）によりモニタリングした。この特異的モデルでは、Ｃ５７Ｂ１／６Ｊマウスにおいて反応性であることが確認されているペプチドを用いて、誘導されたＴ細胞応答をスクリーニングした：ポリメラーゼに関してはＶＳＡペプチドとＮ１３Ｆペプチドのプール、エンベロープに関してはＦ１３Ｌペプチド。
図８に示されるように、ＩＦＮｇとＴＮＦａの両方を産生する機能的ＣＤ８＋ Ｔ細胞がＡｄＴＧ１８２０１接種マウスの脾臓および肝臓で検出され、両器官において、供試マウス５個体のうち４個体がポリメラーゼに特異的な機能的ＩＦＮｇ／ＴＮＦａ産生ＣＤ８＋ Ｔ細胞を示し、供試マウス５個体のうち２個体がエンベロープに特異的な機能的ＩＦＮｇ／ＴＮＦａ産生ＣＤ８＋ Ｔ細胞を示した。予想されたように、エンプティーＡｄＴＧ１５１４９で免疫誘導したマウスの場合、または刺激に無関連のペプチドを用いた場合では、応答は検出されなかった。
総てを考え合わせると、これらのデータは、ＨＢＶ耐性モデルにおいて、ＲＮアーゼＨ欠陥およびＹＭＤＤ欠失ｐｏｌ突然変異体、ｅｎｖドメインおよびコアを含有する融合タンパク質を発現するウイルスベクターＡｄＴＧ１８２０１の、ＩＦＮｇとＴＮＦａの両方を産生する機能的ＣＤ８＋ Ｔ細胞を誘導する能力を実証する。
２．３ ＡｄＴＧ１８２０１またはＡｄＴＧ１８２０２による免疫誘導の種々の用量および計画に関する評価
２．３．１．アデノウイルス用量評価
ＡｄＴＧ１８２０１により発現されたＨＢＶ融合タンパク質の免疫原性を、ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスにおいて種々の用量で評価した。これらの動物を、１０５ｉｕもしくは１０６ｉｕもしくは１０７ｉｕもしくは１０８ｉｕもしくは１０９ｉｕの用量のＡｄＴＧ１８２０１、または１０９ｉｕのＡｄＴＧ１５１４９（陰性対照として用いるエンプティーアデノウイルス）のいずれかの１回の皮下注射により免疫誘導した。特異的Ｔ細胞応答を、ポリメラーゼ（ＳＬＹ）、コア（ＦＬＰおよびＩＬＣ）およびエンベロープ（ＶＬＱおよびＧＬＳ）に含まれるＨＬＡ−Ａ２制限エピトープを用いたＥｌｉｓｐｏｔ ＩＦＮｇにより評価した。
図９に示されるように、ＨＢＶ融合タンパク質「Ｃｏｒｅ−Ｐｏｌ＊−Ｅｎｖ１−Ｅｎｖ２」をコードするＡｄＴＧ１８２０１は、１０７ｉｕ、１０８ｉｕおよび１０９ｉｕの用量で注射した場合に免疫原性であることが判明した。より具体的には、コア、ポリメラーゼまたはＥｎｖドメインの供試ＨＬＡ−Ａ２エピトープに特異的なＩＦＮｇ産生細胞は、１０５および１０６ｉｕの用量では検出されなかった。２つの供試コアエピトープおよびＰｏｌの供試エピトープを標的とする特異的ＩＦＮｇ産生細胞は、１０７、１０８および１０９ｉｕの用量に関して検出された。用量効果は３つのエピトープ（ＳＬＹ、ＦＬＰおよびＩＬＣ）で見られた。Ｅｎｖドメインの２つのエピトープ（ＶＬＱおよびＧＬＳ）では、ＩＦＮｇ産生細胞の頻度は、１０７および１０８の用量では低いが、１０９ｉｕの用量では頻度が明らかに増加している。
２．３．２．短時間間隔で多回免疫誘導計画の評価
ＡｄＴＧ１８２０２により発現されたＨＢＶ融合タンパク質の１つの免疫原性を、種々の免疫誘導計画に従ってＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスで評価した。ＡｄＴＧ１８２０２を１回または３回（注射１回／週、３週間）または６回（注射１回／週、６週間）のいずれかで投与し、誘導された免疫Ｔ細胞応答を最後の注射から２週間後にＥｌｉｓｐｏｔｓ ＩＦＮｇアッセイにより、ＨＬＡ−Ａ２制限エピトープＳＬＹ（Ｐｏｌ）ならびにＦＬＰおよびＩＬＣ（コア）を用いて評価した。何個体かのマウスには陰性対照としてのエンプティーアデノウイルスで６回の免疫誘導を行った（示されていない）。
図１０に示されるように、融合タンパク質「Ｃｏｒｅ−Ｐｏｌ＊」をコードするＡｄＴＧ１８２０２は、供試計画にかかわらず免疫原性であることが判明した。より詳しくは、培地単独および無関連のペプチドでは特異的Ｔ細胞応答は検出されなかったが、３つの供試ＨＢＶエピトープＳＬＹ、ＦＬＰおよびＩＬＣの存在下では、高く同等の頻度のＩＦＮｇ産生細胞が検出された。検出されたＩＦＮｇ産生Ｔ細胞の頻度は、１回、１週間隔で３回または６回の注射を行ったマウス群の間で同等であると思われ、短時間間隔で多過ぎる免疫回数による、ＩＦＮｇ生産レベルにおけるＴ細胞消耗の様相はなかった。アデノウイルス特異的Ｔ細胞応答は、マウスに６回注射した場合の方が、１回または３回の注射を行った場合よりも高いと思われた。予想されたように、エンプティーアデノウイルスによる免疫誘導後には、ＨＢＶ特異的Ｔ細胞応答は見られなかった。
２．３．３．長時間間隔での多回免疫誘導計画の評価
ＡｄＴＧ１８２０２により発現されＨＢＶ融合タンパク質の１つの免疫原性を、種々の免疫誘導計画に従ってＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスで評価した。ＡｄＴＧ１８２０２を１回（Ｔ細胞応答のモニタリングの２週間前（群１）または２０週間前（群２））または２回（２か月間隔（群３）または４か月間隔（群４）で２回の注射、最後の免疫誘導の２週間後にＴ細胞応答のモニタリング）または３回（２か月間隔（群５）、最後の注射の２週間後にＴ細胞応答のモニタリング）のいずれかで投与した。誘導されたＴ細胞をＥｌｉｓｐｏｔｓ ＩＦＮｇアッセイにより、ＨＬＡ−Ａ２制限エピトープＳＬＹ（Ｐｏｌ）およびＦＬＰおよびＩＬＣ（コア）を用いてモニタリングした。何個体かのマウスには陰性対照としてのエンプティーアデノウイルスで、１回または２か月間隔で３回の免疫誘導を行った（示されていない）。
図１１に示されるように、融合タンパク質「Ｃｏｒｅ−Ｐｏｌ＊」をコードするＡｄＴＧ１８２０２は、供試計画にかかわらず免疫原性であることが判明したが、培地単独または無関連のペプチドの存在下、ＡｄＴＧ１８２０２で免疫誘導を行った後には特異的Ｔ細胞応答は検出されなかった。より詳しくは、群２で見られた特異的Ｔ細胞応答は、１回の免疫誘導の２週間後に群１で見られたものよりも低かったとしても、ＡｄＴＧ１８２０２の１回の注射の後に誘導されたＴ細胞応答は、注射２０週間後になお存在していることを示した。群３および４で見られたＴ細胞応答は、最初の免疫誘導から２か月または４か月後の２回目の免疫誘導が、少なくとも群１で見られた一次免疫応答のレベルで、ＨＢＶエピトープに特異的なＴ細胞応答を想起することができたことを示し、極めてわずかながらＳＬＹエピトープに対してより高かった。２か月間隔で３回の免疫誘導を行ったマウス（群５）でも同様の所見が得られ、２回目および３回目の注射によって誘導されたＴ細胞応答は群１で見られたものと同等のレベルに想起された。予想されたように、エンプティーアデノウイルスによる免疫誘導後には、ＨＢＶ特異的Ｔ細胞応答は見られなかった。
２．４ 電子顕微鏡観察
Ａ５４９細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでＡｄＴＧ１８２０１にＭＯＩ２５、５０または１００で感染させ、感染１６時間後、２４時間後または４８時間後のいずれかに細胞を回収した。次に、回収した細胞を電子顕微鏡による観察用に処理した。
ＡｄＴＧ１８２０１感染細胞の核および細胞質にはいくつかのウイルス様粒子（ＶＬＰ）が見られたが、エンプティーアデノウイルスに感染した細胞にはこれらの構造体は見られなかった。これらのＶＬＰは主として核内に存在していた。一部の細胞には、タンパク質凝集物とＶＬＰの両方が見られた。

Claims (67)

  1. ポリメラーゼ活性を機能的に破壊する内部欠失を有する突然変異ポリメラーゼドメインを含んでなる変異型ポリメラーゼポリペプチドであって、前記内部欠失が、天然型ＨＢＶポリメラーゼのポリメラーゼドメインに天然に存在するＹＭＤＤモチーフを少なくとも含んでなる、変異型ポリメラーゼポリペプチド。
  2. 前記内部欠失が、少なくとも４個のアミノ酸残基、多くて３０個のアミノ酸残基の欠失であり、かつ、少なくともＹＭＤＤモチーフを含んでなる、請求項１に記載の変異型ポリメラーゼポリペプチド。
  3. 前記突然変異ポリメラーゼドメインが、少なくとも２０３番のＴｙｒ残基、２０４番のＭｅｔ残基、２０５番のＡｓｐ残基および２０６番のＡｓｐ残基を欠くこと以外は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１または２に記載の変異型ポリメラーゼポリペプチド。
  4. 前記突然変異ポリメラーゼドメインが、少なくとも２０３番のＴｙｒ残基、２０４番のＭｅｔ残基、２０５番のＡｓｐ残基、２０６番のＡｓｐ残基、２０７番のＶａｌ残基、２０８番のＶａｌ残基および２０９番のＬｅｕ残基を欠くこと以外は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項３に記載の変異型ポリメラーゼポリペプチド。
  5. 前記突然変異ポリメラーゼドメインが、配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる、請求項４に記載の変異型ポリメラーゼポリペプチド。
  6. 前記突然変異ポリメラーゼドメインが、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項５に記載の変異型ポリメラーゼポリペプチド。
  7. 天然型ＨＢＶポリメラーゼにより天然に示されるＲＮアーゼＨ活性を機能的に破壊する１以上のアミノ酸残基の突然変異を含んでなる突然変異ＲＮアーゼＨドメインをさらに含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の変異型ポリメラーゼポリペプチド。
  8. 前記突然変異ＲＮアーゼＨドメインに含まれる１以上の突然変異が、
    ・配列番号３の、およそ３９番のＧｌｕ残基（Ｅ）からおよそ４６番のＡｌａ（Ａ）残基に及ぶ部分を少なくとも含む、少なくとも８個のアミノ酸、多くて６０個のアミノ酸の欠失；
    ・配列番号３の１０番のＡｓｐ（Ｄ）残基の、Ａｓｐ（Ｄ）以外のアミノ酸残基での置換；
    ・配列番号３の９０番のＶａｌ（Ｖ）残基の、Ｖａｌ（Ｖ）以外のアミノ酸での置換；
    ・配列番号３の９７番のＴｈｒ（Ｔ）またはＡｌａ（Ａ）残基の、Ｔｈｒ（Ｔ）またはＡｌａ（Ａ）以外のアミノ酸での置換；
    ・配列番号３の９８番のＡｓｐ（Ｄ）残基の、Ａｓｐ（Ｄ）以外のアミノ酸での置換；および
    ・それらの任意の組合せ
    からなる群から選択される、請求項７に記載の変異型ポリメラーゼポリペプチド。
  9. 配列番号３の前記１０番、９０番、９７番または９８番の置換残基が、Ｈｉｓ（Ｈ）残基またはＴｙｒ（Ｙ）残基に置き換わっている、請求項８に記載の変異型ポリメラーゼポリペプチド。
  10. 前記配列番号３の１０番の残基がＨｉｓ（Ｈ）残基で置換され、前記配列番号３の９０番の残基がＴｙｒ（Ｙ）残基で置換され、前記配列番号３の９７番のの残基がＴｙｒ（Ｙ）残基で置換され、かつ／または前記配列番号３の９８番の残基がＨｉｓ（Ｈ）残基で置換されている、請求項９に記載の変異型ポリメラーゼポリペプチド。
  11. 前記突然変異ＲＮアーゼＨドメインに含まれる欠失が、配列番号３のおよそ３９番のＧｌｕ残基（Ｅ）からおよそ６３番のＬｅｕ（Ｌ）残基に及ぶ少なくとも２５個のアミノ酸の部分、より好ましくは、配列番号３のおよそ３１番のＸａａ残基からおよそ６３番のＬｅｕ（Ｌ）残基に及ぶ少なくとも３３個のアミノ酸の部分を含んでなる、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の変異型ポリメラーゼポリペプチド。
  12. 前記突然変異ＲＮアーゼＨドメインが、（ａ）３１番の残基Ｘａａからおよそ６３番のＬｅｕ（Ｌ）残基に及ぶ３３個のアミノ酸残基の部分を欠き、かつ、（ｂ）１０番のＡｓｐ（Ｄ）残基の、Ｈｉｓ（Ｈ）残基での置換（Ｄ６８９Ｈ）；（ｃ）９０番のＶａｌ（Ｖ）残基の、Ｔｙｒ（Ｙ）残基での置換（Ｖ７６９Ｙ）；（ｄ）９７番の残基の、Ｔｙｒ（Ｙ）残基での置換（Ｔ／Ａ７７６Ｙ）および（ｅ）９８番のＡｓｐ（Ｄ）残基の、Ｈｉｓ（Ｈ）残基での置換（Ｄ７７７Ｈ）を含んでなること以外は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１１に記載の変異型ポリメラーゼポリペプチド。
  13. 配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる突然変異ＲＮアーゼＨドメインを含んでなる、請求項１２に記載の変異型ポリメラーゼポリペプチド。
  14. 配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる、請求項４〜１２のいずれか一項に記載の変異型ポリメラーゼポリペプチド。
  15. 配列番号５に示されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１４に記載の変異型ポリメラーゼポリペプチド。
  16. １種類以上の付加的ポリペプチドまたはペプチドと組み合わせて使用される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の変異型ポリメラーゼポリペプチド。
  17. 前記１種類以上の付加的ポリペプチドまたはペプチドが、ＨＢｃ、ＨＢｓ、Ｘタンパク質およびその免疫原性断片からなる群から選択されるＨＢＶポリペプチドまたはペプチドである、請求項１６に記載の変異型ポリメラーゼポリペプチド。
  18. 前記付加的ＨＢＶポリペプチドまたはペプチドが、Ｙ０７５８７分離株などの遺伝子型Ｄ ＨＢＶに由来する、請求項１７に記載の変異型ポリメラーゼポリペプチド。
  19. 請求項１〜１８のいずれか一項に記載の変異型ポリメラーゼポリペプチドと、ＨＢＶコアポリペプチドとを含んでなる、融合タンパク質。
  20. 前記ＨＢＶコアポリペプチドがＣ末端切断されている、特に、残基１４８または１４９で切断されている、請求項１９に記載の融合タンパク質。
  21. 前記ＨＢＶコアポリペプチドが前記変異型ポリメラーゼポリペプチドのＮ末端とインフレームで融合されている、請求項１９または２０に記載の融合タンパク質。
  22. 配列番号６に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる、請求項２１に記載の融合タンパク質。
  23. 配列番号６に示されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項２２に記載の融合タンパク質。
  24. 請求項１〜１８のいずれか一項に記載の変異型ポリメラーゼポリペプチドと、１以上のＨＢｓＡｇ免疫原性ドメイン、または１以上のＨＢｓＡｇ免疫原性ドメインをさらに含んでなる請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の融合タンパク質とを含んでなる、融合タンパク質。
  25. そのＮ末端に、変異型ポリメラーゼポリペプチドに融合されたコアポリペプチドと、突然変異ポリメラーゼドメイン内の内部欠失の代わりに、および／または突然変異ＲＮアーゼＨドメイン内の欠失の代わりに融合された１または２つのＨｂｓＡｇ免疫原性ドメインとを含んでなる、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  26. 配列番号７〜９のいずれかに示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる、請求項２５に記載の融合タンパク質。
  27. 配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項２６に記載の融合タンパク質。
  28. シグナルペプチドおよびトランスメンブランペプチドとインフレームで融合されている、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の変異型ポリメラーゼポリペプチドおよび請求項１９〜２７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  29. 配列番号１０〜１２のいずれかに示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる、請求項２８に記載の変異型ポリメラーゼポリペプチドおよび融合タンパク質。
  30. 請求項１〜１８および２８〜２９のいずれか一項に記載のポリメラーゼ変異型ポリペプチドまたは請求項１９〜２９のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする、核酸分子。
  31. ・配列番号１または２に示されるアミノ酸配列を有するポリメラーゼドメインを含んでなる変異型ポリメラーゼポリペプチドをコードする核酸分子；
    ・配列番号３または４に示されるアミノ酸配列を有するＲＮアーゼＨドメインを含んでなる変異型ポリメラーゼポリペプチドをコードする核酸分子；
    ・配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる変異型ポリメラーゼポリペプチドをコードする核酸分子；または
    ・配列番号６〜１２のいずれかに示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる融合タンパク質をコードする核酸分子
    からなる群から選択される、請求項３０に記載の核酸分子。
  32. 配列番号１３〜１７のいずれかに示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を示すヌクレオチド配列を含んでなる、請求項３０に記載の核酸分子。
  33. 請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の核酸分子を含んでなる、ベクター。
  34. 高等真核細胞または生物における発現のためのプラスミドまたはウイルスベクターである、請求項３３に記載のベクター。
  35. レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、泡沫状ウイルス、アルファウイルス、または水疱性口内炎ウイルスに由来するウイルスベクターである、請求項３４に記載のベクター。
  36. ヒトまたはチンパンジーアデノウイルスに由来する複製欠陥アデノウイルスベクターである、請求項３５に記載のベクター。
  37. 前記核酸分子がアデノウイルスＥ１領域に挿入され、ＣＭＶプロモーターの制御下に置かれている、請求項３６に記載のベクター。
  38. カナリア痘ウイルス、鶏痘ウイルスまたはワクシニアウイルスに由来するポックスウイルスベクターである、請求項３５に記載のベクター。
  39. 前記ワクシニアウイルスがコペンハーゲン系統、ワイエス系統および改変アンカラ（ＭＶＡ）系統である、請求項３８に記載のベクター。
  40. 前記核酸分子がＭＶＡベクターの欠失ＩＩＩに挿入され、かつ、ワクシニア７．５ＫプロモーターまたはｐＨ５Ｒプロモーターの制御下に置かれている、請求項３９に記載のベクター。
  41. ・Ｅ１領域の代わりに挿入された、ＣＭＶプロモーターなどのプロモーターの制御下に置かれ、かつ、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含んでなる変異型ポリメラーゼポリペプチドまたは配列番号６もしくは配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでなる融合タンパク質をコードする核酸分子を含んでなる、欠陥Ａｄベクター；
    ・Ｅ１領域の代わりに挿入された、ＣＭＶプロモーターなどのプロモーターの制御下に置かれ、かつ、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５に示されるヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子を含んでなる、複製欠陥Ａｄベクター；
    ・Ｅ１領域の代わりに挿入された、ＣＭＶプロモーターなどのプロモーターの制御下に置かれ、かつ、配列番号１６または配列番号１７に示されるヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子を含んでなる複製欠陥Ａｄベクター、特に、欠陥ＡｄＣｈ３；
    ・７．５ＫプロモーターまたはｐＨ５Ｒプロモーターなどのワクシニアプロモーターの制御下に置かれ、かつ、配列番号５もしくは配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含んでなる変異型ポリメラーゼポリペプチド、または配列番号６、配列番号８もしくは配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含んでなる融合タンパク質をコードする核酸分子を含んでなる、ＭＶＡベクター；および
    ・７．５ＫプロモーターまたはｐＨ５Ｒプロモーターなどのワクシニアプロモーターの制御下に置かれ、かつ、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５に示されるヌクレオチド配列を含んでなる、核酸分子を含んでなる、ＭＶＡベクター
    からなる群から選択される、請求項３５〜４０のいずれか一項に記載のベクター。
  42. 感染性ウイルス粒子の形態である、請求項３５〜４１のいずれか一項に記載のベクター。
  43. 請求項４２に記載のベクターを製造する方法であって、前記ウイルスベクターを好適な細胞株に導入する工程、前記感染性ウイルス粒子の生産を可能とするのに好適な条件下で前記細胞株を培養する工程、生産された感染性ウイルス粒子を前記細胞株の培養物から回収する工程、および所望により前記ウイルス粒子を精製する工程を含んでなる、方法。
  44. 請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の核酸分子または請求項３３〜４２のいずれか一項に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。
  45. 請求項１〜１８および２８〜２９のいずれか一項に記載の変異型ポリメラーゼポリペプチド、または請求項１９〜２９のいずれか一項に記載の融合タンパク質の組換え生産のための方法であって、請求項３３〜４２のいずれか一項に記載のベクターを好適な宿主細胞に導入してトランスフェクト宿主細胞または感染宿主細胞を作出する工程、前記トランスフェクト宿主細胞または感染宿主細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてその宿主細胞の増殖に好適な条件下で培養する工程、前記細胞培養物を回収する工程、および所望により生産された変異型ポリメラーゼポリペプチドまたは融合タンパク質を精製する工程を含んでなる、方法。
  46. 請求項１〜１８および２８〜２９のいずれか一項に記載の変異型ポリメラーゼポリペプチド、請求項１９〜２９のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項３３〜４２のいずれか一項に記載のベクター、請求項４４に記載の宿主細胞、またはそれらの任意の組合せを少なくとも含んでなる、組成物。
  47. 薬学上許容可能なビヒクルをさらに含んでなる、請求項４６に記載の組成物。
  48. 筋肉内投与、皮下投与、皮内投与または乱刺用に処方される、請求項４６または４７に記載の組成物。
  49. 約５×１０８、約１０９、約５×１０９、約１０１０、約５×１０１０ｖｐまたは約１０１１ｖｐのアデノウイルスベクターの用量を含んでなる、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の組成物。
  50. 約５×１０６、約１０７、約５×１０７、約１０８、または約５×１０８ｐｆｕのＭＶＡベクターの用量を含んでなる、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の組成物。
  51. ＨＢＶ感染またはＨＢＶ関連疾患および病態の治療または予防に使用するための、請求項１〜１８および２８〜２９のいずれか一項に記載の変異型ポリメラーゼポリペプチド、請求項１９〜２９のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項３３〜４２のいずれか一項に記載のベクター、請求項４４に記載の宿主細胞、または請求項４６〜５０のいずれか一項に記載の組成物。
  52. 慢性ＨＢＶ感染の治療に使用するための、請求項１〜１８および２８〜２９のいずれか一項に記載の変異型ポリメラーゼポリペプチド、請求項１９〜２９のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項３３〜４２のいずれか一項に記載のベクター、請求項４４に記載の宿主細胞、または請求項４６〜５０のいずれか一項に記載の組成物。
  53. 治療される生物における免疫応答の惹起または刺激に使用するための、請求項１〜１８および２８〜２９のいずれか一項に記載の変異型ポリメラーゼポリペプチド、請求項１９〜２９のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項３３〜４２のいずれか一項に記載のベクター、請求項４４に記載の宿主細胞、または請求項４６〜５０のいずれか一項に記載の組成物。
  54. 前記惹起または刺激される免疫応答が特異的および／または非特異的、体液性および／または細胞性である、請求項５３に記載の使用。
  55. 前記免疫応答が、ＨＢＶポリペプチド／エピトープに対するＴ細胞応答ＣＤ４＋媒介性またはＣＤ８＋媒介性またはその両方のものである、請求項５４に記載の使用。
  56. 治療上有効な量の前記変異型ポリメラーゼポリペプチド、融合タンパク質、核酸分子、ベクターまたは組成物の１以上の投与を含んでなる、請求項５１〜５５のいずれか一項に記載の使用。
  57. 前記ベクターがＭＶＡベクターであり、前記使用がおよそ１週間の間隔をあけた３回の皮下投与を含んでなる、請求項５１〜５５のいずれか一項に記載の使用。
  58. 前記ベクターがアデノウイルスベクターであり、前記使用が１回または２回の筋肉内投与または皮下投与を含んでなる、請求項５１〜５５のいずれか一項に記載の使用。
  59. 標準治療と組み合わせて実施される、請求項５１〜５８のいずれか一項に記載の使用。
  60. プライムブースト法に従って実施される、請求項５１〜５９のいずれか一項に記載の使用。
  61. プライミングがＭＶＡベクターで実施され、ブースティングがＡｄベクターで実施される、請求項６０に記載の使用。
  62. 前記ＭＶＡベクターおよび／またはＡｄベクターが配列番号８に示される融合タンパク質をコードする、請求項６１に記載の使用。
  63. ３日から３か月までの異なる期間をおいたＭＶＡベクターの少なくとも３回の皮下投与と、その後のアデノウイルスベクターの筋肉内または皮下ブーストを含んでなる、請求項６１または６２に記載の使用。
  64. プライミングがプラスミドＤＮＡベクターで実施され、ブースティングがＭＶＡベクターで実施される、請求項６０に記載の使用。
  65. 前記プラスミドおよび／またはＡｄベクターが配列番号８に示される融合タンパク質をコードする、請求項６４に記載の使用。
  66. ２週間から３か月までの異なる期間をおいたＤＮＡベクターの少なくとも３回の筋肉内投与と、ＭＶＡベクターの少なくとも１回の皮下ブーストとを含んでなる、請求項６４または６５に記載の使用。
  67. 請求項１〜１８および２８〜２９のいずれか一項に記載の変異型ポリメラーゼポリペプチド、請求項１９〜２９のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項３３〜４２のいずれか一項に記載のベクター、請求項４４に記載の宿主細胞、または請求項４６〜５０のいずれか一項に記載の組成物からなる群から選択される複数の有効薬を含んでなる、被験体におけるＨＢＶ感染の治療または免疫応答の惹起に使用するための、パーツキット。
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