RU2295536C2 - Композиции на основе белка вируса гепатита в и стрессового белка и их применение - Google Patents
Композиции на основе белка вируса гепатита в и стрессового белка и их применение Download PDFInfo
- Publication number
- RU2295536C2 RU2295536C2 RU2003127021/13A RU2003127021A RU2295536C2 RU 2295536 C2 RU2295536 C2 RU 2295536C2 RU 2003127021/13 A RU2003127021/13 A RU 2003127021/13A RU 2003127021 A RU2003127021 A RU 2003127021A RU 2295536 C2 RU2295536 C2 RU 2295536C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- fusion protein
- hbv
- stress
- fusion
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 141
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 128
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 73
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 73
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 54
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 title claims description 130
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 77
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 77
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 41
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 34
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 22
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 9
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 120
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 81
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 80
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 80
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 60
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 51
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 40
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 38
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 claims description 37
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 36
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 33
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 31
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 27
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 26
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 claims description 15
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 14
- 101100507655 Canis lupus familiaris HSPA1 gene Proteins 0.000 claims description 13
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 11
- 102100024341 10 kDa heat shock protein, mitochondrial Human genes 0.000 claims description 10
- 102100038222 60 kDa heat shock protein, mitochondrial Human genes 0.000 claims description 10
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 10
- 241001467552 Mycobacterium bovis BCG Species 0.000 claims description 10
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 10
- 101710154868 60 kDa heat shock protein, mitochondrial Proteins 0.000 claims description 9
- 108010042283 HSP40 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 claims description 9
- 101710122378 10 kDa heat shock protein, mitochondrial Proteins 0.000 claims description 8
- 102100034051 Heat shock protein HSP 90-alpha Human genes 0.000 claims description 6
- 101001016865 Homo sapiens Heat shock protein HSP 90-alpha Proteins 0.000 claims description 6
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 6
- 102000001493 Cyclophilins Human genes 0.000 claims description 5
- 108010068682 Cyclophilins Proteins 0.000 claims description 5
- 102100029721 DnaJ homolog subfamily B member 1 Human genes 0.000 claims description 5
- 102100023737 GrpE protein homolog 1, mitochondrial Human genes 0.000 claims description 5
- 101000829489 Homo sapiens GrpE protein homolog 1, mitochondrial Proteins 0.000 claims description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 claims description 5
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 5
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 claims description 5
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 5
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 claims description 4
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 claims description 4
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 claims description 4
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 claims description 4
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 claims description 4
- 108010027179 Tacrolimus Binding Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 102000018679 Tacrolimus Binding Proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 claims description 4
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 claims description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 4
- 102100021868 Calnexin Human genes 0.000 claims description 3
- 108010056891 Calnexin Proteins 0.000 claims description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 claims description 3
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 claims description 3
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 claims description 2
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 2
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 17
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 abstract description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 abstract 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 120
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 86
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 57
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 54
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 50
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 43
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 43
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 38
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 37
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 31
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 31
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 27
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 26
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 23
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 20
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 18
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 18
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 18
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 18
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 18
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 17
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 16
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 16
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 16
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 15
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 15
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 14
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 14
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 13
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 13
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 12
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 11
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 11
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 11
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 10
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 10
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 10
- 239000000306 component Substances 0.000 description 10
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 10
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 10
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- -1 plasmid DNA Chemical class 0.000 description 10
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 10
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 9
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 9
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 9
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 9
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 9
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 9
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 7
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 6
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 6
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 6
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 6
- 241000186366 Mycobacterium bovis Species 0.000 description 6
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 6
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 6
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 6
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 6
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 6
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 6
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 6
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 6
- JTEGQNOMFQHVDC-NKWVEPMBSA-N lamivudine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1O[C@@H](CO)SC1 JTEGQNOMFQHVDC-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 6
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 6
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 6
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 6
- YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N oxidized gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CSSCC(C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CCC(N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 6
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000004447 HSP40 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 5
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 5
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 5
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 5
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 5
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 5
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 5
- 229960001627 lamivudine Drugs 0.000 description 5
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 5
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 5
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 5
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 4
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 3
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 3
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 241000186362 Mycobacterium leprae Species 0.000 description 3
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 3
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 3
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 3
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 3
- GBBJCSTXCAQSSJ-XQXXSGGOSA-N clevudine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1[C@H](F)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 GBBJCSTXCAQSSJ-XQXXSGGOSA-N 0.000 description 3
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 3
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 3
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 description 2
- 108010082126 Alanine transaminase Proteins 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010059013 Chaperonin 10 Proteins 0.000 description 2
- 108010058432 Chaperonin 60 Proteins 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010036652 HSC70 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000012215 HSC70 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 2
- 101001003102 Homo sapiens Hypoxia up-regulated protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 2
- 102100020755 Hypoxia up-regulated protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 102100040018 Interferon alpha-2 Human genes 0.000 description 2
- 108010079944 Interferon-alpha2b Proteins 0.000 description 2
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 101150043276 Lon gene Proteins 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 2
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 2
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 2
- 101100235786 Rattus norvegicus Lonp1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 2
- IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N Ribavirin Chemical compound N1=C(C(=O)N)N=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- 108010034546 Serratia marcescens nuclease Proteins 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 description 2
- WOZSCQDILHKSGG-UHFFFAOYSA-N adefovir depivoxil Chemical compound N1=CN=C2N(CCOCP(=O)(OCOC(=O)C(C)(C)C)OCOC(=O)C(C)(C)C)C=NC2=C1N WOZSCQDILHKSGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 2
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 2
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 2
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 2
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 2
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 2
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 description 2
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 229960001375 lactose Drugs 0.000 description 2
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229960002160 maltose Drugs 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 229960001855 mannitol Drugs 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 2
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 2
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 229940068965 polysorbates Drugs 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WAAXYLYXYLKHJZ-UHFFFAOYSA-N 1-[3-(1-hydroxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-carbonyl)phenyl]pyrrole-2,5-dione Chemical compound O=C1N(O)C(=O)CC1C(=O)C1=CC=CC(N2C(C=CC2=O)=O)=C1 WAAXYLYXYLKHJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710149439 20 kDa chaperonin, chloroplastic Proteins 0.000 description 1
- CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 4-(4-fluorophenyl)oxane-4-carboxylic acid Chemical compound C=1C=C(F)C=CC=1C1(C(=O)O)CCOCC1 CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- PJQCRTOBRVDYKX-UYMSWOSGSA-N 4-amino-1-[(2s,5r)-2-[fluoro(hydroxy)methyl]-1,3-oxathiolan-5-yl]pyrimidin-2-one Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](C(O)F)SC1 PJQCRTOBRVDYKX-UYMSWOSGSA-N 0.000 description 1
- QBEIABZPRBJOFU-VDTYLAMSSA-N 4-amino-5-fluoro-1-[(2s,5r)-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidin-2-one Chemical compound C1=C(F)C(N)=NC(=O)N1[C@H]1O[C@@H](CO)CC1 QBEIABZPRBJOFU-VDTYLAMSSA-N 0.000 description 1
- WPANETAWYGDRLL-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzenecarboximidamide Chemical compound NC(=N)C1=CC=C(N)C=C1 WPANETAWYGDRLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007566 ATP-Dependent Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010071550 ATP-Dependent Proteases Proteins 0.000 description 1
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 description 1
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 102000006303 Chaperonin 60 Human genes 0.000 description 1
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 1
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 1
- 101710177832 Co-chaperonin GroES Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 description 1
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 1
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 102100029714 DnaJ homolog subfamily B member 2 Human genes 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- XQSPYNMVSIKCOC-NTSWFWBYSA-N Emtricitabine Chemical compound C1=C(F)C(N)=NC(=O)N1[C@H]1O[C@@H](CO)SC1 XQSPYNMVSIKCOC-NTSWFWBYSA-N 0.000 description 1
- 108700041152 Endoplasmic Reticulum Chaperone BiP Proteins 0.000 description 1
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 1
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 description 1
- 239000001856 Ethyl cellulose Substances 0.000 description 1
- ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N Ethyl cellulose Chemical compound CCOCC1OC(OC)C(OCC)C(OCC)C1OC1C(O)C(O)C(OC)C(CO)O1 ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108010069271 FKBP-13 Proteins 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 229940126656 GS-4224 Drugs 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 102000003676 Glucocorticoid Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000079 Glucocorticoid Receptors Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Polymers OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- 108010027814 HSP72 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101150112743 HSPA5 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150043239 HSPA8 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 1
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 1
- 101100387776 Homo sapiens DNAJB1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000866020 Homo sapiens DnaJ homolog subfamily B member 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000827313 Homo sapiens Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP3 Proteins 0.000 description 1
- 101150028525 Hsp83 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150065069 Hsp90b1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 229920002153 Hydroxypropyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 229920001202 Inulin Polymers 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 1
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 1
- 101100110331 Mus musculus Adamtsl2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100400378 Mus musculus Marveld2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 1
- 241000187480 Mycobacterium smegmatis Species 0.000 description 1
- 241000187644 Mycobacterium vaccae Species 0.000 description 1
- FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylacetamide Chemical compound CN(C)C(C)=O FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MBBZMMPHUWSWHV-BDVNFPICSA-N N-methylglucamine Chemical compound CNC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBBZMMPHUWSWHV-BDVNFPICSA-N 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 241000080590 Niso Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102100027913 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP1A Human genes 0.000 description 1
- 102100026408 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP2 Human genes 0.000 description 1
- 102100023846 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP3 Human genes 0.000 description 1
- 102100020739 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP4 Human genes 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 229920002685 Polyoxyl 35CastorOil Polymers 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006010 Protein Disulfide-Isomerase Human genes 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108010012770 Rebetron Proteins 0.000 description 1
- 208000035415 Reinfection Diseases 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 101150077085 TCP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010006877 Tacrolimus Binding Protein 1A Proteins 0.000 description 1
- 108010010427 Thermosomes Proteins 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hy Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)CC(O)[C@]1(CCC(CC14)(C)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MGQIWUQTCOJGJU-UHFFFAOYSA-N [AlH3].Cl Chemical compound [AlH3].Cl MGQIWUQTCOJGJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUGUHTGSMPZQIW-UHFFFAOYSA-N [[4-(4-diazonioiminocyclohexa-2,5-dien-1-ylidene)cyclohexa-2,5-dien-1-ylidene]hydrazinylidene]azanide Chemical compound C1=CC(N=[N+]=[N-])=CC=C1C1=CC=C(N=[N+]=[N-])C=C1 XUGUHTGSMPZQIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 229960001997 adefovir Drugs 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 108010007908 alpha-Crystallins Proteins 0.000 description 1
- 102000007362 alpha-Crystallins Human genes 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 102000001307 androgen receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010080146 androgen receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000001815 biotherapy Methods 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- FUFJGUQYACFECW-UHFFFAOYSA-L calcium hydrogenphosphate Chemical compound [Ca+2].OP([O-])([O-])=O FUFJGUQYACFECW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000004359 castor oil Substances 0.000 description 1
- 229960001777 castor oil Drugs 0.000 description 1
- 235000019438 castor oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 229960005338 clevudine Drugs 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 101150036359 clpB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150096566 clpX gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011340 continuous therapy Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000280 densification Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 235000019700 dicalcium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 229960000366 emtricitabine Drugs 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 238000011013 endotoxin removal Methods 0.000 description 1
- 229960000980 entecavir Drugs 0.000 description 1
- YXPVEXCTPGULBZ-WQYNNSOESA-N entecavir hydrate Chemical compound O.C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)C1=C YXPVEXCTPGULBZ-WQYNNSOESA-N 0.000 description 1
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 229940074057 epivir hbv Drugs 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- 102000015694 estrogen receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038795 estrogen receptors Proteins 0.000 description 1
- 235000019325 ethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001249 ethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 229960004396 famciclovir Drugs 0.000 description 1
- GGXKWVWZWMLJEH-UHFFFAOYSA-N famcyclovir Chemical compound N1=C(N)N=C2N(CCC(COC(=O)C)COC(C)=O)C=NC2=C1 GGXKWVWZWMLJEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LLYJISDUHFXOHK-GOCONZMPSA-N ferroptocide Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]23C[C@@H](C(=O)[C@]2([C@@]1([C@@H](C[C@H]([C@@H]3C)C4=CCN5C(=O)N(C(=O)N5C4)C6=CC=CC=C6)OC(=O)CCl)C)O)O LLYJISDUHFXOHK-GOCONZMPSA-N 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 108010017007 glucose-regulated proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N glycerol triricinoleate Natural products CCCCCC[C@@H](O)CC=CCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCC=CC[C@@H](O)CCCCCC)OC(=O)CCCCCCCC=CC[C@H](O)CCCCCC ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N 0.000 description 1
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000005802 health problem Effects 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000005745 host immune response Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 239000001863 hydroxypropyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010977 hydroxypropyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 210000005007 innate immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229940065638 intron a Drugs 0.000 description 1
- 229940029339 inulin Drugs 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 229960003511 macrogol Drugs 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- WVJKHCGMRZGIJH-UHFFFAOYSA-N methanetriamine Chemical compound NC(N)N WVJKHCGMRZGIJH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- VIKNJXKGJWUCNN-XGXHKTLJSA-N norethisterone Chemical compound O=C1CC[C@@H]2[C@H]3CC[C@](C)([C@](CC4)(O)C#C)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VIKNJXKGJWUCNN-XGXHKTLJSA-N 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- QUANRIQJNFHVEU-UHFFFAOYSA-N oxirane;propane-1,2,3-triol Chemical compound C1CO1.OCC(O)CO QUANRIQJNFHVEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000005426 pharmaceutical component Substances 0.000 description 1
- 239000008024 pharmaceutical diluent Substances 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000008389 polyethoxylated castor oil Substances 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 1
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 1
- 102000003998 progesterone receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000468 progesterone receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 108020003519 protein disulfide isomerase Proteins 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N rapamycin Natural products COCC(O)C(=C/C(C)C(=O)CC(OC(=O)C1CCCCN1C(=O)C(=O)C2(O)OC(CC(OC)C(=CC=CC=CC(C)CC(C)C(=O)C)C)CCC2C)C(C)CC3CCC(O)C(C3)OC)C ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003134 recirculating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000009235 regulation of actin filament depolymerization Effects 0.000 description 1
- 230000009305 regulation of actin filament polymerization Effects 0.000 description 1
- 238000001226 reprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 229960000329 ribavirin Drugs 0.000 description 1
- HZCAHMRRMINHDJ-DBRKOABJSA-N ribavirin Natural products O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1N=CN=C1 HZCAHMRRMINHDJ-DBRKOABJSA-N 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 230000037390 scarring Effects 0.000 description 1
- 238000003345 scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000007727 signaling mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000010572 single replacement reaction Methods 0.000 description 1
- 229960002930 sirolimus Drugs 0.000 description 1
- QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N sirolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000001540 sodium lactate Substances 0.000 description 1
- 235000011088 sodium lactate Nutrition 0.000 description 1
- 229940005581 sodium lactate Drugs 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 108020003113 steroid hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005969 steroid hormone receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 108010067247 tacrolimus binding protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 208000008732 thymoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 229940074410 trehalose Drugs 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/29—Hepatitis virus
- A61K39/292—Serum hepatitis virus, hepatitis B virus, e.g. Australia antigen
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/35—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycobacteriaceae (F)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6043—Heat shock proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
- C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/35—Fusion polypeptide containing a fusion for enhanced stability/folding during expression, e.g. fusions with chaperones or thioredoxin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области иммунотерапии. Предложен белок слияния, включающий стрессовый белок и белок вируса гепатита В (HBV). Белок при введении индивидууму индуцирует или усиливает иммунный ответ против белка HBV. Предложены также нуклеиновые кислоты, кодирующие такой белок, фармацевтическая композиция, векторы и способы получения такого белка. Кроме того, предложены способы индукции или усиления иммунного ответа против белка HBV. Изобретение может быть использовано в медицине. 14 н. и 32 з.п. ф-лы, 17 ил.
Description
Настоящая заявка притязает на приоритет по дате подачи заявки США № 60/266733 (февраль 5, 2001). Содержание заявки № 60/266733 полностью включено в настоящую заявку в качестве ссылки.
Область изобретения
Изобретение относится к области иммунотерапии вируса гепатита B.
Предпосылки изобретения
Вирус гепатита B (HBV) представляет собой нецитопатический ДНК-содержащий вирус, который заражает людей и может привести к двум клиническим исходам. В большинстве случаев клинического инфицирования взрослых (90-95%) вирус исчезает после нескольких недель или месяцев, а у пациента развивается пожизненный иммунитет против повторного инфицирования. Однако в остальных случаях не происходит удаление вируса из тканей, и пациент остается хронически инфицированным. Последствия хронической инфекции являются серьезными: у таких субъектов с высокой вероятностью развивается рубцевание ткани печени (цирроз), а со временем может развиться гепатоцеллюлярная карцинома.
Существует профилактическая вакцина против HBV, и многие развитые страны внедрили программы детской вакцинации для уменьшения общего риска инфицирования. К сожалению, так как заболеваемость и смертность в результате инфицирования HBV происходят в течение десятилетий, воздействие вакцинации не будет, как следует, реализовано до наступления будущего. Действительно, ожидают, что ежегодный процент инфицирования HBV у взрослых снизится менее чем до 5% в течение следующих восьми лет. К 2008 году в Соединенных Штатах ежегодно будет происходить более 150000 новых случаев инфицирования и ожидают даже более в Европе и Японии. Данные субъекты составят огромный резервуар вируса, из которого возникнут от 20000 до 40000 случаев хронического инфицирования в год. Очевидно, что, несмотря на доступность вакцины, хроническая инфекция HBV продолжит оставаться серьезной проблемой для здоровья многих последующих лет.
Современные способы лечения хронического HBV включают альфа, интерферон (IFN-α) и ламивудин. Данные способы лечения оценивают по их способности уменьшать вирусную нагрузку и вызывать сероконверсию или потерю Hbe-антигена, маркера репликации HBV, и вирусемии высокого титра. IFN-α способен элиминировать Hbe, но только примерно у одной трети пациентов, у тех, у которых низка вирусная нагрузка. Лечение является дорогим и связано со значительными нежелательными побочными эффектами. Ламивудин представляет собой противовирусное средство с малой молекулой, которое хорошо переносится при оральном введении. Данное соединение эффективно в уменьшении вирусной нагрузки у пациентов, но относительно мало пациентов отвечают потерей Hbe, а прекращение лечения обычно приводит к увеличению вирусной нагрузки. С другой стороны, непрерывная терапия может привести к селекции устойчивых к ламивудину мутантных вариантов. Совместное лечение IFN-α и ламивудином не показало повышенной эффективности. Очевидно, что успешная иммунотерапия для лечения инфекций HBV является крайне желательной.
Сущность изобретения
В настоящем изобретении представлены композиции, включающие стрессовый белок или его часть и антиген HBV. Данные композиции детально обсуждают ниже. Мы отмечаем здесь, что их компоненты можно получить из различных источников, а их длина и содержание могут варьировать. Например, стрессовый белок может представлять собой белок, который экспрессируется в естественных условиях у любого млекопитающего (например, у человека или других приматов) или у любого другого класса организмов, экспрессирующих стрессовый белок (например, у бактерий или микобактерий); стрессовый белок или антиген HBV может являться полноразмерным, укороченным или удлиненным посредством добавления одного или нескольких аминокислотных остатков; и, в дополнение, содержание стрессового белка или антигена HBV может варьировать (например, стрессовый белок или его часть и антиген HBV могут содержать один или несколько аминокислотных замен). Результатом любого изменения, однако, должна являться композиция, которая может индуцировать или усилить иммунный ответ против HBV у млекопитающих. Предпочтительно, иммунный ответ является по существу достаточным, чтобы пациент, инфицированный HBV, почувствовал улучшение в признаке или симптоме инфекции. Таким образом, антиген включает встречающиеся в природе антигены, а также его фрагменты и другие варианты, которые при введении субъекту (например, посредством описанных здесь способов) индуцируют иммунный ответ на один или несколько эпитопов, представленных во фрагменте или варианте.
Также, в дополнение к полноразмерным или встречающимся в природе стрессовым белкам, композиции по изобретению могут включать фрагменты стрессовых белков, которые представляют собой иммуностимуляторы (например, фрагменты, которые способствуют иммунному ответу на антиген). Стрессовый белок или его фрагмент способствует иммунному ответу тогда, когда иммунный ответ является более значительным или в любом отношении лучшим, чем иммунный ответ, который обычно происходит при введении одного антигена HBV.
Иммунный ответ может представлять собой или гуморальный или клеточный ответ. Например, антигенный фрагмент может содержать один или несколько пептидных антигенов для HLA класса I, как описано здесь. Клеточный иммунный ответ включает в себя антиген-специфические клетки, такие как цитотоксические T-лимфоциты (CTL), а также, возможно, T-хелперные лимфоциты (Th) и клетки врожденной иммунной системы, такие как моноциты, макрофаги, дендритные клетки, натуральные киллерные клетки и γδ-T-клетки. Специалист в данной области легко способен обнаружить или иным образом оценить иммунный ответ, который выражается, например, посредством индукции цитотоксических T-лимфоцитов (см. примеры ниже), клеточным пролиферативным ответом, индукцией цитокинов или комбинацией этих событий.
В конкретном осуществлении, антиген HBV может представлять собой коровый антиген, или его фрагмент, или производное. Производные антигена HBV включают варианты антигена HBV, такие как варианты, содержащие одну или несколько аминокислотных замен (например, консервативные замены аминокислот). Например, вариант антигена HBV может содержать 1-2, 2-5, 5-10, 10-25 или более замещенных аминокислотных остатков. Альтернативно, замены или другие мутации, такие как делеции или укорочения (трункации), могут составлять 1-2, 2-5, 5-10 или 10-25% последовательности полноразмерного антигена HBV. Подобно антигенной части композиции, вариант стрессового белка может содержать одну или несколько аминокислотных замен (например, консервативные замены аминокислот). Например, вариант стрессового белка может содержать 1-2, 2-5, 5-10, 10-25 или более консервативных замен аминокислот. Здесь замены или другие мутации, такие как делеции или укорочения, опять могут составлять 1-2, 2-5, 5-10 или 10-25% последовательности полноразмерного стрессового белка.
Различные комбинации стрессовых белков и антигенов HBV также находятся в объеме изобретения. Например, композиции по изобретению включают композиции, в которых полноразмерный антиген HBV подвергнут слиянию с полноразмерным стрессовым белком; антиген, состоящий из фрагмента или другого варианта антигена HBV, объединен с полноразмерным стрессовым белком; полноразмерный антиген HBV объединен с фрагментом или другим вариантом стрессового белка, и в которых фрагмент или другой вариант антигена HBV объединен с фрагментом или другим вариантом стрессового белка. Конечно, как описано здесь, может присутствовать более чем один каждого из этих компонентов (например, более чем один антиген HBV и более чем один стрессовый белок), а каждый из компонентов может присутствовать в виде полноразмерного белка или его иммунологически активного фрагмента или варианта.
Более того, в любом из описанных здесь воплощений, антиген HBV и стрессовый белок можно объединять любым образом. Например, стрессовый белок и антиген HBV можно представить в форме полипептида слияния (где стрессовый белок и антиген HBV ковалентно связывают во время трансляции слитой открытой рамки считывания). Альтернативно, стрессовый белок и антиген HBV можно связать посредством химической конъюгации после индивидуальной трансляции или синтеза каждого из них. Компоненты можно объединять нековалентно (например, в смеси или более упорядоченной композиции). Термины "полипептид" или "белок" применяют попеременно для описания цепи аминокислотных остатков, исключая случаи, когда из контекста ясно, что подразумевают определенный смысл.
Несмотря на то, что стрессовый белок обсуждается ниже, здесь авторы настоящего изобретения замечают, что стрессовый белок может представлять собой белок теплового шока (Hsp). Более того, Hsp может представлять собой микобактериальный Hsp, такой как Hsp65 (например, Hsp65 из Mycobacterium bovis) или любой представитель семейства белков Hsp из любых видов.
Можно составить композиции по изобретению для введения субъекту различными путями и, необязательно, содержащие адъювант. Дополнительные необязательные компоненты композиции включают фармацевтически приемлемые разбавители, наполнители и носители.
Также изобретение содержит в себе способы лечения инфекций HBV у субъекта (например, у млекопитающего, такого как человек) посредством введения композиции по изобретению субъекту, инфицированному HBV, и способы предотвращения (или уменьшения вероятности) инфицирования субъекта (например, млекопитающего, такого как человек) HBV посредством введения субъекту композиции по изобретению до инфицирования HBV.
Компоненты композиции не обязательно вводить субъекту непосредственно в виде полипептидов. Вместо этого можно вводить нуклеиновую кислоту, кодирующую стрессовый белок, антиген HBV или белок слияния, содержащий один или несколько каждого из них, и белок, антиген или белок слияния будут экспрессироваться у субъекта in vivo. Нуклеиновая кислота может представлять собой часть вирусного вектора, например часть генома вирусного вектора, или ее можно инкапсулировать, например, в липосомы. Альтернативно, нуклеиновую кислоту можно доставлять как голую нуклеиновую кислоту, такую как плазмидная ДНК, находящуюся под контролем регуляторных последовательностей, специфичных для эукариотических клеток или клеток млекопитающих. Способы введения молекул нуклеиновой кислоты хорошо известны в данной области.
Кроме того, изобретение включает применение композиций по изобретению (например, белков слияния, содержащих HBV, кодирующих их молекул нуклеиновой кислоты и содержащих их фармацевтических композиций) для производства лекарственного средства для лечения инфекций вируса гепатита B в соответствии с описанными здесь способами.
Другие возможности или преимущества настоящего изобретения станут ясны из детального описания, чертежей и формулы изобретения. Все цитированные здесь заявки на выдачу патента, патенты и публикации включены полностью посредством ссылки.
Краткое описание чертежей
Фигура 1 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую коровый антиген (HBc) (SEQ ID NO:1) у HBV (подтип adw).
Фигура 2 представляет собой аминокислотную последовательность корового антигена (SEQ ID NO:2) у HBV (подтип adw).
Фигура 3 представляет собой последовательность ДНК конструкции hisHepCorT(149/87S97F), которая кодирует меченный гистидином укороченный коровый антиген HBV (аминокислоты 1-149; SEQ ID NO:3).
Фигура 4 представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую последовательностью ДНК, указанной на фигуре 3 (SEQ ID NO:4).
Фигура 5 представляет собой последовательность ДНК конструкции hisHepCor(97F)Hsp65, которая кодирует меченный гистидином белок слияния, включающий полноразмерный коровый антиген HBV и белок Hsp65 (SEQ ID NO:5)
Фигура 6 представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую последовательностью ДНК, указанной на фигуре 5 (SEQ ID NO:6).
Фигура 7 представляет собой последовательность ДНК конструкции hisHepCorT(149/87S97F)Hsp65, которая кодирует меченный гистидином белок слияния, включающий укороченный (аминокислоты 1-149) коровый антиген HBV, слитый с белком Hsp65 (SEQ ID NO:7).
Фигура 8 представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую последовательностью ДНК, указанной на фигуре 7 (SEQ ID NO:8).
Фигура 9 представляет собой последовательность ДНК конструкции HepCorT(151/97F)Hsp65, которая кодирует белок слияния, включающий укороченный (аминокислоты 1-151) коровый антиген HBV, слитый с белком Hsp65 (SEQ ID NO:9).
Фигура 10 представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую последовательностью ДНК фигуры 9 (SEQ ID NO:10).
Фигура 11 представляет собой последовательность ДНК конструкции HepCor(97F)Hsp65, которая кодирует белок слияния, включающий полноразмерный коровый антиген HBV, слитый с белком Hsp65 (SEQ ID NO:11).
Фигура 12 представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую последовательностью ДНК, указанной на фигуре 11 (SEQ ID NO:12).
Фигура 13 представляет собой график, отображающий активность примирования CTL (корректированный % лизиса в зависимости от соотношения эффектор:цель) у мышей C57BL/6, иммунизированных различными иммуногенами (HepCorT(151/97F)Hsp65, HepCor(97F)Hsp65, HepCorT(151/97F), HepCor(97F) и hisHepCorT(149/87S97F)Hsp65). Результирующую активность CTL оценивали по сравнению с клетками EL4, предварительно импульсно активированных контрольным пептидом MUT-1.52-59.Kb. Контрольным мышам инъецировали плацебо (буфер).Фигура 14 представляет собой график, отображающий активность примирования CTL (корректированный % лизиса в зависимости от соотношения эффектор:цель) у мышей C57BL/6, иммунизированных различными иммуногенами (как на фигуре 13). Результирующую активность CTL оценивали по сравнению с клетками EL4, предварительно импульсно активированных специфичным для антигена HBV пептидом HBc.93-100.Kb. Контрольным мышам инъецировали плацебо (буфер).
Фигура 15 представляет собой график, отображающий активность примирования CTL (корректированный % лизиса в зависимости от соотношения эффектор:цель) у мышей C57BL/6, иммунизированных различными иммуногенами (как на фигуре 13). Результирующую активность CTL оценивали по сравнению с клетками EL4.HBc.1D7, экспрессирующими коровый антиген гепатита B. Контрольным мышам инъецировали плацебо (буфер).
Фигура 16 представляет собой график, отображающий активность примирования CTL (IFN-γ (пкг/мл) в зависимости от соотношения эффектор:цель) у мышей C57BL/6, иммунизированных различными иммуногенами (как на фигуре 13). Способность получающихся в результате CTL секретировать гамма интерферон (IFN-γ) оценивали по сравнению с клетками EL4, культивированными совместно со специфичным для антигена HBV пептидом HBc.93-100.Kb. Контрольным мышам инъецировали плацебо (буфер).
Фигура 17 представляет собой график, отображающий активность примирования CTL (TNF-α (OD410)) у мышей C57BL/6, иммунизированных различными иммуногенами (как на фигуре 13). Способность образовавшихся CTL секретировать фактор некроза опухоли альфа (TNF-α) оценивали по сравнению с клетками EL4, культивированными совместно со специфичным для антигена HBV пептидом HBc.93-100.Kb. Контрольным мышам инъецировали плацебо (буфер).
Детальное описание
Изобретение относится к композициям, содержащим антиген HBV, подходящим для лечения или предотвращения инфекции HBV. Состав композиций может варьировать, как описано здесь, но композиции включают стрессовый белок или его часть (например, фрагмент) или его производное и антиген HBV. Ниже обсуждают различные материалы и процедуры, подходящие для применения в способах по изобретению.
Так как последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие стрессовый белок и белки HBV известны и доступны, конструкции нуклеиновой кислоты, кодирующие их (по одному или как продукт слияния) можно легко получить с использованием способов, регулярно применяемых в данной области. Например, нуклеиновые кислоты, кодирующие стрессовый белок (Hsp), факультативно связанные с антигеном, смотри в WO 89/12455, WO 94/29459, WO 98/23735, WO 99/07860 и ссылках, цитированных в них. Белки слияния можно получать не только посредством рекомбинантных способов, но также посредством конъюгации стрессового белка (например, Hsp) и антигена HBV после трансляции. Способы конъюгации описаны, например, у Hermanson (Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, CA, 1996), Lussow et al. (Eur. J. Immun. 21:2297-2302, 1991) и у Barrios et al. (Eur J. Immun. 22:1365-1372, 1992). Такие способы конъюгации включают применение связывающих средств, таких как глютаральдегида, карбодиимидов и бисдиазобензидина; применение гетеробифункциональных веществ, образующих поперечные связи, таких как сложного эфира M-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимида или использование цистеиновых остатков (которые присутствуют в естественных условиях и/или которые включили рекомбинантным способом) стрессового белка и антигена для содействия формированию межмолекулярных дисульфидных связей.
Для включения в белок слияния или композицию по изобретению подходит любой антиген HBV. Предпочтительный антиген HBV представляет собой коровый антиген HBV или его фрагмент или производное. Для облегчения тестирования антиген HBV необязательно можно модифицировать так, чтобы включать известные рестрицированные по MHC мышиные эпитопы CTL, например, такие как рестрицированные по H-2Kb мышиные эпитопы CTL. Пример такой модификации описан в примерах (например, в штамме HBV adw, остаток 97 представляет собой изолейцин, его замена на фенилаланин приводит к получению рестрицированного по H-2Kb эпитопа CTL). Кроме того, антиген можно модифицировать, так чтобы он включал эпитопы HLA человека более чем из одного подтипа HBV (например, adw, ayw, adr или ayr). Например, единичная замена треонина на валин в позиции 91 корового антигена HBV, показанного на фигуре 2, воспроизведет последовательность известного рестрицированного по HLA-A11 эпитопа CTL, обнаруженного и в подтипе HBV adw и в подтипе HBV adr. Другие производные корового антигена HBV включают укорочения. Такие укорочения включают в качестве неограничивающих примеров укорочения, при которых удаляется весь богатый аргинином C-концевой домен или его часть (аминокислоты HBc от 150 до 185). Подходящие укороченные фрагменты HBc включают фрагменты, состоящие только из первых N-концевых 149 аминокислот или из первых N-концевых 151 аминокислот HBc. В любом случае, подходящий фрагмент антигена HBc (или любого подходящего антигена HBV) в идеале могли бы включать один или несколько B-клеточных или T-клеточных эпитопов (один или несколько B-клеточных эпитопов или один или несколько T-клеточных эпитопов), предпочтительно один или несколько эпитопов CTL. Дополнительно, концевой цистеин корового антигена HBV можно удалить или заменить другой аминокислотой. Можно произвести другие модификации аминокислотной последовательности. Другой пример представляет собой замену якорного остатка известного рестрицированного по HLA эпитопа CTL для усиления активности связывания пептида с молекулой MHC класса I. Хотя данные модифицированные коровые антигены HBV подходят для включения в белки слияния, для получения иммунного ответа на HBV их также можно применять самостоятельно (факультативно сформулированных с адъювантом).
Дополнительные антигены HBV, подходящие для применения по настоящему изобретению, включают коровый антиген HBV, антиген HBV e (HBeAg), белок x (HBx), полипептид полимеразы и белки оболочки HBV S, M и L (Seeger and Mason, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64:51-68, 2000; Ganem and Schneider, Hepadnavirdae: The viruses and their replication. In: Knipe, DM and Howley, PM, eds. Fields Virology, Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins, 2001:2923-2969).
Как описано выше, антиген HBV, стрессовый белок или оба вместе могут содержать одну или несколько аминокислотных замен (например, консервативные замены аминокислот). Данные замены можно, хотя и не обязательно, произвести вместо одного или нескольких предсказанных одного или нескольких несущественных аминокислотных остатков. Термин "консервативная замена аминокислоты" представляет собой замену, в которой один аминокислотный остаток заменяют другим аминокислотным остатком, обладающим схожей боковой цепью. В данной области установлены семейства аминокислотных остатков, обладающие схожими боковыми цепями. Данные семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Независимо от того, рассчитывают ли произвести замену в предсказанном несущественном участке или вносят случайно во всю кодирующую последовательность антигена HBV или стрессового белка (например, посредством насыщающего мутагенеза) или ее часть, получающиеся в результате мутанты можно скринировать на антигенную и иммуностимулирующую активности, соответственно, для определения мутантов, сохраняющих биологическую активность. Вслед за мутагенезом кодируемые белки можно рекомбинантно экспрессировать и определить активность белков.
Антиген HBV можно подвергнуть слиянию или с N-концом или с C-концом стрессового белка, с линкером или промежуточной экзогенной последовательностью или без них. В альтернативном осуществлении два антигена HBV (встречающиеся в естественных условиях или вариант, как описано здесь) можно присоединить к стрессовому белку (один к N-концу, а другой к C-концу стрессового белка; оба к N-концу или оба к C-концу). Дополнительно, один или несколько антигенов HBV (опять, встречающиеся в естественных условиях или их фрагменты, или другие варианты, или из того же или другого белков HBV) можно присоединить или к N-концу или к C-концу стрессового белка или к обоим. Для специалистов в данной области ясно, что можно произвести дополнительные альтернативные расположения, если включить более чем один стрессовый белок.
Стрессовый белок и антиген HBV (или их комбинации, например стрессовый белок и два или несколько антигенов HBV) можно связать посредством химической конъюгации после того, как каждый транслируется и синтезируется индивидуально. Как отмечено выше, компоненты можно также объединять нековалентно (например, в смеси или более упорядоченной композиции). Композиции, содержащие стрессовый белок или его иммуностимуляторные фрагменты, нековалентно объединенные с антигеном HBV, можно получить, как описано в патентах США №№ 6048530, 6017544, 6017540, 6007821, 5985270, 5948646, 5935576, 5837251, 5830464 или 5750119. Также см. патенты США №№ 5997873, 5961979, 6030618, 6139841, 6156302, 6168793 и Международную публикацию № WO 97/06821.
Кроме того, в композицию можно включать более чем один тип вирусного антигена. Например, в дополнение к антигену HBV, композиции по изобретению могут включать (или кодировать; любые описанные здесь белки можно вводить непосредственно или посредством нуклеиновых кислот) антиген другого патогенного организма. Таким образом, в дополнение к антигену HBV, композиции могут включать (или кодировать) антиген гепатита C, антиген вируса простого герпеса (HSV), антиген вируса иммунодефицита человека (HIV), антиген цитомегаловируса (CMV), антиген вируса Эпштейна-Барр (EBV), антиген респираторно-синцитиального вируса (RSV), антиген вируса папилломы человека (HPV), антиген вируса герпеса или их комбинации. Такие же альтернативы, какие были описаны для осуществлений, в которых композиции содержали только HBV в качестве вирусного антигена (например, способ объединения со стрессовым белком, включение полноразмерных, фрагментированных белков или их вариантов; различное количество компонентов и их расположение), подходят для осуществлений, в которых в композиции присутствуют (или ею кодируются), по меньшей мере, один антиген HBV и, по меньшей мере, один другой вирусный антиген.
Неожиданно также обнаружили, что удаление С-концевого богатого аргинином домена из корового антигена приводит к получению полипептида, способного индуцировать иммунный ответ к коровому антигену, конкретно клеточный и/или иммунный ответ посредством CTL. Богатый аргинином домен корового антигена расположен между 150 и 183 аминокислотами корового антигена (Nassal, J. Virol. 66:4107-4116, 1992). Походящие фрагменты корового антигена включают, но не ограничиваются ими, фрагменты без всего данного региона или его части. Например, подходящие фрагменты корового антигена могут содержать первые 149 или 151 аминокислота (или менее чем 149 или 151 аминокислота).
Композиции по изобретению могут факультативно включать адъювант. Пример адъювантов, которые могут быть эффективны, включают в качестве неограничивающих примеров полный адъювант Фрейнда (FCA), неполный адъювант Фрейнда (FIA), SAF, мурамил дипептид (MDP), липополисахарид (LPS), липид A, монофосфорил липид A (MPL), токсин коклюша (PT), стеарилтирозин, γ-инулин, RIBI (содержащий три компонента, выделенных из бактерий), Quil-A, сапонины (QS21), квасцы (гидрохлорид алюминия, фосфат алюминия), фосфат кальция, MF-59, иммуностимуляторные комплексы (ISCOMS), олигонуклеотиды CpG и цитокины (Gupta and Siber, Vaccine 13:1263-1276, 1995; Singh and O'Hagan, Nature Biotechnology 17:1075-1081, 1999).
Подходящий фрагмент или производное антигена HBV в идеале должен содержать, по меньшей мере, один B-клеточный или T-клеточный эпитоп (или оба). В предпочтительном осуществлении, фрагмент или производное должны содержать, по меньшей мере, один эпитоп для CTL.
Изолированы, клонированы и охарактеризованы множество стрессовых белков из разнообразного множества организмов (Mizzen, Biotherapy 10:173-189, 1998). Любой иммуностимулирующий Hsp или его иммуностимулирующий фрагмент подходят для применения в полипептидах слияния и композициях. Например, среди главных детерминант, узнаваемых посредством иммунных ответов хозяев в ответ на инфекцию Mycobacterium tuberculosis и Mycobacterium leprae находятся Hsp70, Hsp60, Hsp20-30 (Hsp с низкой молекулярной массой) и Hsp10 (гомолог GroES). В дополнение обнаружено, что Hsp65 из Bacille Calmette Guerin (BCG), штамма Mycobacterium bovis представляет собой эффективный иммуностимулирующий агент, как описано в примере ниже.
Семейства стрессовых генов и белков для применения по настоящему изобретению хорошо известны в данной области и включают, например, Hsp100-200, Hsp100, Hsp90, Lon, Hsp70, Hsp60, TF55, Hsp40, FKBP, циклофилины, Hsp20-30, ClpP, GrpE, Hsp10, убиквитин, калнексин и дисульфидизомеразы белка. См., например, Macario, Cold Spring Harbor Laboratory Res. 25:59-70, 1995; Parsell et al., Rev. Genet. 27:437-496, 1993 и патент США № 5232833.
Примеры белков Hsp100-200 включают Grp170 (белок регулируемый глюкозой). Grp170 находится в просвете ER и в компартменте, предшествующем аппарату Гольджи, и может играть роль в укладке и сборке иммуноглобулинов.
Примеры белков Hsp100 включают Hsp100 млекопитающих, Hsp104 дрожжей и ClpA, ClpB, ClpC, ClpX и ClpY E. coli.
Примеры белков Hsp90 включают HtpG E. coli, Hsp83 и Hsc83 дрожжей и Hsp90alpha, Hsp90beta и Grp94 (малый gp96) человека. Hsp90 связывает группы белков, которые представляют собой типичные регуляторные молекулы, такие как рецепторы стероидных гормонов (например, рецепторы глюкокортикоидов, эстрогенов, прогестерона и тестостерона), транскрипционные факторы и протеинкиназы, которые играют роль в механизмах передачи сигналов. Белки Hsp90 также участвуют в формировании больших, часто встречающихся комплексов белков, включающих другие стрессовые белки.
Lon представляет собой тетрамерную АТФ-зависимую протеазу, которая разрушает несобственные белки E. coli.
Примеры белков Hsp70 включают Hsp72 и Hsc73 клеток млекопитающих, DnaK бактерий или микобактерий, таких как Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, and Mycobacterium bovis (такие как Bacille Calmette Guerin; указанный здесь выше как Hsp71), DnaK E. coli, дрожжей и других прокариот и BiP и Grp78. Hsp70 способен специфически связывать АТФ, а также развернутые полипептиды и пептиды и принимать участие в укладке и разворачивании, а также в сборке и разрушении комплексов белков.
Примеры белков Hsp60 включают Hsp65 микобактерий. Бактериальный Hsp60 также широко известен как GroEL. Hsp60 формирует большие гомоолигомерные комплексы и, кажется, играет ключевую роль в укладке белка. Гомологи Hsp60 присутствуют в митохондриях и хлоропластах эукариот.
Примеры белков TF55 включают Tcp1, TRiC и термосому. Данные белки обычно встречаются в цитоплазме эукариот и некоторых архебактерий и формируют многочленные кольца, способствующие укладке белка. Также они слабо гомологичны с Hsp60.
Примеры белков Hsp40 включают DnaJ прокариот, таких как E. coli и микобактерии и HSJ1, HDJ1 и Hsp40. В числе других активных веществ клетки Hsp40 играет роль в качестве молекулярного шаперона в укладке белка, обеспечении термоустойчивости и репликации ДНК.
Примеры FKBP включают FKBP12, FKBP13, FKBP25 и FKBP59, Fprl и Nepl. Обычно белки обладают пептидилпропилизомеразной активностью и взаимодействуют с иммуносупрессорами, такими как FK506 и рапамицин. Белки обычно обнаруживают в цитоплазме и эндоплазматическом ретикулуме.
Пример циклофилина включают циклофилины A, B и C. Белки обладают пептидилпропилизомеразной активностью и взаимодействуют с иммуносупрессором циклоспорином A.
Hsp20-30 также называют малый Hsp. Hsp20-30 обычно обнаруживают в больших гомоолигомерных комплексах или, возможно, гетероолигомерных комплексах. Организм или тип клеток может экспрессировать несколько различных типов малых Hsp. Hsp20-30 взаимодействует со структурами цитоскелета и может играть роль в регуляции полимеризации/деполимеризации актина. Hsp20-30 быстро фосфорилируется при стрессе или воздействии на покоящиеся клетки ростовых факторов. Гомологи Hsp20-30 включают альфа-кристаллин.
ClpP представляет собой протеазу E. coli, вовлеченную в деградацию аномальных белков. Гомологи ClpP обнаружены в хлоропластах. ClpP формирует гетероолигомерные комплексы с ClpA.
GrpE представляет собой белок E. coli массой примерно 20 кДа, который вовлечен в поиск поврежденных стрессом белков, а также деградацию поврежденных белков. GrpE играет роль в регуляции экспрессии стрессовых генов у E. coli.Примеры Hsp10 включают GroES and Cpn10. Hsp10 обнаружен у E. coli и в митохондриях и хлоропластах эукариотических клеток. Hsp10 формирует семичленное кольцо, ассоциированное с олигомерами Hsp60. Hsp10 также вовлечен в укладку белков.
Обнаружено, что убиквитин связывает белки в координации с протеолитическим удалением белков посредством АТФ-зависимой цитозольной протеазы.
В дополнение к полноразмерным стрессовым белкам, любые иммуностимулирующие фрагменты или производные могли бы являться пригодными по настоящему изобретению. Иммуностимулирующий фрагмент или производное (например, иммуностимулирующий фрагмент Hsp) представляет собой фрагмент или производное, которые способствуют иммунному ответу на антиген. Фрагмент или производное могут способствовать иммунному ответу рядом способов. Например, фрагмент может индуцировать иммунный ответ, который не мог бы возникнуть иначе, или усиливать иммунный ответ, который мог бы. Описан ряд иммуностимулирующих фрагментов. Подходящие фрагменты включают в качестве неограничивающих примеров (a) 161-370 аминокислоты Hsp70 микобактерий (конкретно, Hsp70 M. tuberculosis) (Huang et al., J. Exp. Med. 191:403-408; 2000, заявка на патент США 09/761534, поданная 16 января 2001 года); (b) АТФазный домен или связывающий пептиды домен Hsp70 микобактерий (конкретно, Hsp70 M. tuberculosis) (Young, заявка США № 09/025178, поданная 25 ноября 1997 года); (c) 280-385 аминокислоты мышиного Hsc70 (основного представителя семейства Hsc70) (Udono et al., Int. Immunol. 13:1233-1242, 2001); (d) 359-610 аминокислоты Hsp70 M. tuberculosis (Wand et al., Immunity 15:971-983, 2001); (e) соответствующие с (a) по (d) регионы гомологов Hsp70 других видов и (f) с 1 по 200 аминокислоты Hsp65 микобактерий (конкретно, Hsp65 M. bovis) (Chu et al., заявка США № 09/613303, поданная 10 июля 2000 года).
Стрессовые белки, пригодные по настоящему изобретению, можно получить из любого подходящего организма, включая в качестве неограниченных примеров грамположительные бактерии, грамотрицательные бактерии, энтеробактерии (например, E. coli), микобактерии (конкретно, M. leprae, M. tuberculosis, M. vaccae, M. smegmatis и M. bovis), дрожжи, дрозофилу и позвоночных (например, птиц, таких как цыплята, или млекопитающих, таких как крысы, мыши или приматы, включая людей).
Для получения терапевтической (например, иммунотерапевтической) композиции, содержащей белок слияния, полипептид можно получать рекомбинантным способом в бактериях, дрожжах, растениях или клетках растений или животных или клетках животных. Например, полипептиды слияния по изобретению можно получать посредством трансформации (трансфекции, трансдукции или инфекции) клеток-хозяев фрагментом ДНК, кодирующим полипептид, в подходящем экспрессирующем носителе. Подходящие экспрессирующие носители включают плазмиды, вирусные частицы и фаги. Для клеток насекомых подходят бакуловирусные экспрессирующие векторы. Целый экспрессирующий носитель или его часть может интегрироваться в геном клетки-хозяина. В некоторых обстоятельствах это желательно для использования индуцибельного экспрессирующего вектора, например, для LACSWITCH® Inducible Expression System (Stratagene; La Jolla, CA).
Специалистам в области молекулярной биологии понятно, что можно применять любую из обширного множества экспрессирующих систем для доставки рекомбинантных полипептидов слияния. Определенная клетка-хозяин и вектор не критичны для изобретения.
Белки и полипептиды можно получать с помощью клеток растений. Для клеток растений подходят вирусные экспрессирующие векторы (например, вирус мозаики цветной капусты и вирус табачной мозаики) и плазмидные экспрессирующие векторы (например, плазмида Ti). Такие клетки и векторы доступны из широкого диапазона источников (например, the American Type Culture Collection, Manassas, VA; также см., например, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1994). Способы трансформации и трансфекции и выбор экспрессирующего носителя зависит от избранной системы-хозяина. Способы трансформации и трансфекции ранее описаны, например, у Ausubel et al. Экспрессирующие носители можно выбрать из экспрессирующих носителей, описанных, например, в Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, Supp. 1987. Клетки-хозяева, содержащие экспрессирующий носитель, можно культивировать в обычной питательной среде, адаптированной как необходимо для активации или репрессии выбранных генов, отбора трансформированных клеток или амплификации выбранных генов.
Когда уместно и выгодно, нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид слияния, может включать сигнальную последовательность для выделения полипептида слияния, например, для облегчения выделения полипептида из культуры клеток. Для эффективной трансляции вставленных последовательностей нуклеиновой кислоты также могут являться необходимыми специфические сигналы инициации. Данные сигналы включают инициирующий кодон ATG и расположенные рядом последовательности. В некоторых случаях необходимо предоставить внешние сигналы контроля трансляции, включая, возможно, инициирующий кодон ATG. Более того, для обеспечения трансляции целой вставки, инициирующий кодон должен находиться в фазе с рамкой считывания желательной кодирующей последовательности. Данные внешние сигналы контроля трансляции и инициирующие кодоны могут быть различного происхождения: и естественного, и синтетического. Эффективность экспрессии можно увеличить посредством включения соответствующих усиливающих транскрипцию или трансляцию элементов (например, которые описаны в Bittner et al., Methods in Enzymol. 153:516, 1987). Дополнительно генную последовательность можно модифицировать для оптимального использования кодонов в соответствующей экспрессирующей системе или, альтернативно, экспрессирующего хозяина можно модифицировать для экспрессии специфических молекул тРНК для содействия экспрессии желательного гена.
Могло бы оказаться полезным, если бы полипептиды слияния растворялись при нормальных физиологических условиях. Также в изобретении представлены способы применения белков слияния (или других конфигураций белков, включая ковалентные и нековалентные комплексы и микстуры), в которых стрессовый белок (или его иммуностимулирующий фрагмент) и антиген HBV подвергнут слиянию (или иначе объединены) с не имеющим к ним отношения третьим белком или полипептидом для создания, по меньшей мере, белка, состоящего из трех частей, или смеси белков. Третий белок может облегчить очистку, обнаружение или растворение белка слияния или другого комплекса или он может обеспечивать некоторые другие функции. Например, для создания белков слияния с lacZ, можно применять экспрессирующий вектор pUR278 (Ruther et al., EMBO J. 2:1791, 1983). Для экспрессии чужеродных полипептидов как белков слияния, содержащих глутатион-S-трансферазу (GST), можно применять векторы pGEX. В общих чертах, такие белки слияния растворимы и их можно легко очистить из лизированных клеток посредством адсорбции на глутатион-агарозных гранулах, с последующей элюцией в присутствии свободного глутатиона. Векторы pGEX сконструированы так, чтобы включать участки расщепления протеазой тромбином или фактором Xa так, чтобы клонированный целевой генный продукт мог высвобождаться от части GST.
Белок слияния или ковалентный комплекс можно очистить с применением антитела, которое специфически связывает часть белка слияния или комплекса. Альтернативно, для очистки можно использовать другие свойства включенного белка (например, связывание металла). Например, система, описанная у Janknecht et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88:8972, 1981), позволяет быструю очистку неденатурированных белков, экспрессирующихся в линиях клеток человека. В данной системе, интересующий ген субклонирован в рекомбинантную плазмиду коровьей оспы так, чтобы открытая рамка считывания гена при трансляции подвергалась слиянию с аминоконцевой меткой, состоящей из шести гистидиновых остатков. Экстракты клеток, зараженных рекомбинантным вирусом коровьей оспы, помещали на колонки с Ni2+ нитрилацетатагарозой, и меченные гистидином белки селективно элюировали буферами, содержащими имидазол. Такую же процедуру можно применять для бактериальных культур.
Альтернативно, третий белок может представлять собой иммуноглобулиновый Fc-домен. Такой белок слияния можно легко выделить с применением аффинной колонки.
Полипептиды слияния, конкретно содержащие короткие антигенные фрагменты, можно получать посредством химического синтеза (например, с помощью способов, описанных в Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., 1984 The Pierce Chemical Co., Rockford, IL).
После выделения полипептид слияния можно, если необходимо, очистить и/или концентрировать при условии, что дальнейшая обработка не уменьшит его способности индуцировать (например, посредством индукции или усиления) иммунный ответ, достаточный для выполнения способов по изобретению. В данной области известно множество способов очистки и концентрации (см., например, Fisher, Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology, Work and Burdon, eds., Elsevier, 1980), включающих ультрацентрифугирование и/или преципитацию (например, посредством сульфата аммония), микрофильтрацию (например, через 0,45 мкм фильтры из ацетата целлюлозы), ультрафильтрацию (например, с применением сортирующей мембраны и рециркулирующей фильтрации), гель-фильтрацию (например, колонки, заполненные сефарозой CL-6B, CL-4B, CL-2B, 6B, 4B или 2B, сефакрилом S-400 или S-300, Superose 6 или Ultrogel A2, A4 или A6; все доступные от Pharmacia Corp.), жидкостную хроматографию для ускоренного разделения белков (FPLC) и высокоэффективную жидкостную хроматографию (HPLC).
Полипептиды в композициях по изобретению могут включать антигенные или иммуностимулирующие детерминанты или целые белки более чем одного стрессового белка и/или более чем одного белка HBV. Факультативно, белки могут включать другие последовательности, к которым необходим иммунный ответ.
Изобретение включает иммунотерапевтические композиции, содержащие, по меньшей мере, один полипептид слияния, как описано здесь, и, факультативно, фармацевтически допустимый носитель, такой как разбавитель, например солевой раствор, фосфатно-солевой буфер или раствор гидрокарбоната (например, 0,24 М NaHCO3). Носители, применяемые в композиции, выбирают на основе способа и пути введения и стандартной фармацевтической практики. Подходящие фармацевтические носители и разбавители, а также необходимые фармацевтические добавки и компоненты для их использования описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences. Адъювант, например холерный токсин, термолабильный энтеротоксин Escherichia coli (LT), липосома или иммуностимулирующий комплекс (1SCOM), также можно включить в иммунотерапевтические композиции.
Композиции можно составлять в виде раствора (подходит для внутримышечного, интрадермального или внутривенного введения), суспензии, суппозитория, таблетки, гранул, порошков, капсулы, мази или крема. Для получения данных композиций можно включать один или несколько фармацевтических носителей. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают растворы (например, вода или физиологический солевой раствор), растворители (например, этанол, полисорбаты или Cremophor EL®), средства для создания изотоничности, консерванты, антиоксиданты, наполнители (например, лактоза, крахмал, кристаллическая целлюлоза, маннит, мальтоза, трегалоза, гидрофосфат кальция, легкий ангидрид кремниевой кислоты или карбонат кальция), связующие вещества (например, крахмал, поливинилпирролидон, гидроксипропилцеллюлоза, этилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза или гуммиарабик), смазочные материалы (например, стеарат магния, тальк или отвержденные масла) или стабилизаторы (например, лактоза, маннит, мальтоза, полисорбаты, макрогели или касторовое масло, отвержденное полиоксиэтиленом). Если необходимо добавляют глицерин, диметилацетамид, лактат натрия, сурфактант, гидроксид натрия, этилендиамин, этаноламин, бикарбонат натрия, аргинин, меглумин или трисаминометан. При необходимости замедленного высвобождения композиции в качестве уплотняющего матрикса можно применять биодеградируемые полимеры, такие как поли-D,L-лактид-когликолид или полигликолид (см., например, патенты США №№ 5417986, 4675381 и 4450150). Как замечено выше, с данными компонентами можно формировать фармацевтические препараты, такие как растворы, таблетки, гранулы или капсулы. Если композиции вводят орально, можно добавлять вкусовые добавки и красители.
Иммунотерапевтические композиции можно вводить подходящим путем, например внутривенно, внутриартериально, местно, посредством инъекции (например, интраперитонеально, интраплеврально, подкожно, внутримышечно), орально, интрадермально, под язык, интраэпидермально, интраназально (например, посредством ингаляции), интрапульмонально или ректально.
Количество вводимой иммунотерапевтической композиции должно зависеть, например, от конкретной композиции стрессового белка/антигена, от того введен ли совместно с композицией адъювант, типа совместно введенного адъюванта, способа и частоты введения и необходимого эффекта (например, предохранение или лечение), что может быть определено специалистом в данной области. В общих чертах, иммунотерапевтические композиции вводят в количествах в диапазоне между 1 мкг и 100 мг на дозу взрослому человеку. Предпочтительно вводят между 50 и 10000 мкг (например, примерно от 100 до 5000 мкг, в частности примерно 500, 1000, 1500 или 2000 мкг) белка слияния. Если совместно с иммунотерапевтическим средством вводят адъюванты, как правило, можно использовать количества в диапазоне между 1 нг и 100 мг на дозу взрослому человеку. При необходимости, что может быть определено специалистом в данной области, введение повторяют. Например, за начальной дозой может следовать одна или более поддерживающих доз через недельные или месячные интервалы. Поддерживающую дозу можно давать с 3 по 12 неделю после первой иммунизации, а вторую поддерживающую дозу можно давать с 3 по 12 неделю после первой поддерживающей дозы, применяя ту же или другую лекарственную форму. Для тестирования иммунного ответа, индуцированного иммунотерапевтическим средством против антигена HBV, включенного в белок слияния у индивида можно получать сыворотки, PBL или PBMC. Способы анализа антител или цитотоксических T-клеток против специфического антигена хорошо известны в данной области. Если необходимо, можно давать дополнительные поддерживающие дозы. Посредством изменения количества полипептида слияния в композиции можно оптимизировать протокол иммунизации для индукции максимального иммунного ответа.
Конечно, полипептиды (самостоятельно или как часть белка слияния) можно доставлять посредством введения нуклеиновой кислоты, такой как вирусный вектор (например, ретровирусный или аденовирусный вектор).
Иммунотерапевтическое средство по изобретению можно также вводить в комбинации с одним или несколькими соединениями или композициями, обладающими активностью против HBV (средство против HBV). Например, пациента вначале можно лечить средством против HBV для уменьшения тяжести инфекции HBV (что измеряют, например, по уменьшению или прекращению циркуляции антигена HBe (индикатор репликации HBV и виремии с высоким титром), появлению антител против HBe, уменьшению или исчезновению ДНК HBV в сыворотке или уменьшению уровней аланинаминотрансферазы (ALT)). Когда достигается подходящее уменьшение, пациенту можно вводить иммунотерапевтическое средство по изобретению. Альтернативно, средство против HBV и иммунотерапевтическое средство можно вводить в основном в одно и то же время (учитывая, что средство против вируса и иммунотерапевтическое средство могут обладать различными путями введения), или иммунотерапевтическое средство можно ввести первым, с последующим лечением средством против вируса. Антивирусные соединения или композиции, подходящие для применения в таких комбинациях с иммунотерапевтическим средством включают в качестве неограничивающих примеров интерферон-α2b (Intron A, Schering Plough), пегилированный интерферон-α2b и нуклеозидные аналоги, такие как ламивудин [(-)-β-L-3'-тиа-2',3'-дидезоксицитидин или 3TC] (Epivir-HBV, Glaxo Welcome) и рибавирин (Rebetron™, ICN Pharmaceuticals). Существует ряд дополнительных экспериментальных возможно подходящих соединений, и они включают: гемтрицитабин (2',3'-дидезокси-5'-фтор-3'-тиацитидин, FTC, ковирацил, Triangle Pharmaceuticals), клевудин (2'-фтор-5-метил-β-L-арабинофуранозилурацил, L-FMAU, Triangle), адефовир (9-2-фосфонилметил)аденин, PMEA, Gilead Sciences), энтекавир (Bristol-Myers Squibb), (-)-бета-D-2,6-диаминопурин диоксолан (DAPD), β-L-2',3'-дидезокси-5-фторцитидин (β-L-FddC), β-L-2',3'-дидегидро-дидезокси-5-фторцитидин (β-L-Fd4C) и фамцикловир.
Полагают, что специалист в данной области без дополнительного совершенствования, базируясь на приведенном выше описании и примерах ниже, может использовать настоящее изобретение в его наиболее полном объеме. Следующий пример следует интерпретировать только в качестве иллюстрации того, как специалист в данной области может выделить и использовать полипептид слияния и, в любом случае, не ограничивает оставшееся описание. Все публикации, цитированные в данном описании, включены сюда посредством ссылки.
Примеры
Пример 1
Конструирование белков слияния корового антигена HBV и Hsp
Основные способы и процедуры получения белков слияния можно найти в WO 94/29459, WO 98/23735, WO 99/07860; там же приведены ссылки.
Ген, кодирующий подтип HBV adw, получали из плазмиды pBR/HBV (приобретена в ATCC, ATCC 45020). Последовательность нуклеотидов, кодирующая полноразмерный белок, приведена на Фигуре 1; последовательность аминокислот полноразмерного белка показана на Фигуре 2.
Ген, кодирующий полноразмерный белок Hsp65 из M. bovis BCG, получали из плазмиды pET65 (см. WO 99/07860).
Для получения белка с использованием описанных исходных материалов и соответствующих праймеров подготовили и клонировали в pET28a (Novagen) следующие конструкции:
1.1 hisHepCorT(149/87S97F): фрагмент ДНК, кодирующий укороченный коровый антиген HBV (аминокислоты с 1 по 149). Конструкция содержит также последовательность из 20 N-концевых аминокислот, содержащих гистидиновую метку. Данная конструкция содержит две аминокислотные замены по сравнению с белком дикого типа: аминокислота в положении 87 заменена с аспарагина на серин, а аминокислота в положении 97 заменена с изолейцина на фенилаланин. Данные замены проводили, чтобы воспроизвести известные эпитопы CTL мыши. Также к C-концу укороченного белка добавили экзогенный аспарагиновый остаток. Последовательность ДНК показана на фигуре 3, кодируемая последовательность аминокислот показана на фигуре 4.
1.2 hisHepCor(97F)Hsp65: ДНК, кодирующая белок слияния, включающий аминокислоты полноразмерного корового белка HBV, слитые с N-концом Hsp65 из M. bovis BCG. Также конструкция содержит последовательность из 20 N-концевых аминокислот, содержащих гистидиновую метку и замену аминокислоты в положении 97 с изолейцина на фенилаланин. Между коровым белком HBV и белком Hsp65 вставили два дополнительных аминокислотных остатка: аспарагин и валин. Последовательность ДНК показана на фигуре 5, кодируемая последовательность аминокислот показана на фигуре 6.
1.3 hisHepCorT(149/87S97F)Hsp65: ДНК, кодирующая белок слияния, содержащий с 1 по 149 аминокислоты корового белка HBV, слитые с N-концом Hsp65 из M. bovis BCG. Конструкция также содержит последовательность из 20 N-концевых аминокислот, содержащих гистидиновую метку, и содержит дополнительный аспарагиновый остаток между коровым белком HBV и белком Hsp65. Последовательность ДНК показана на фигуре 7, кодируемая последовательность аминокислот показана на фигуре 8.
1.4 HepCorT(151/97F)Hsp65: ДНК, кодирующая белок слияния, содержащий с 1 по 151 аминокислоты корового белка HBV, слитые с N-концом Hsp65 из M. bovis BCG (без вставки дополнительных аминокислот между двумя последовательностями). Последовательность корового белка HBV модифицировали следующим образом: в отличие от последовательности дикого типа изолейцин в положении 97 заменяли на фенилаланин. Последовательность ДНК показана на фигуре 9, кодируемая последовательность аминокислот показана на фигуре 10. 1.5 HepCor(97F)Hsp65: ДНК, кодирующая белок слияния, содержащий полноразмерный коровый белок HBV, слитый с N-концом Hsp65 из M. bovis BCG (без вставки дополнительных аминокислот между двумя последовательностями). Как и в предыдущей конструкции, аминокислоту в положении 97 корового белка HBV заменяли с изолейцина на фенилаланин. Последовательность ДНК показана на фигуре 11, кодируемая последовательность аминокислот показана на фигуре 12.
1.6 HepCorT(151/97F). ДНК, кодирующая укороченный коровый антиген HBV (аминокислоты с 1 по 151). Помимо того, что белок adw в данной конструкции укорочен до 151 аминокислоты, в нем присутствует одна замена аминокислоты по сравнению с диким типом, представленным на фигуре 2: аминокислоту в положении 97 заменили с изолейцина на фенилаланин, чтобы воспроизвести известный эпитоп CTL мыши.
1.7 HepCor(97F). ДНК, кодирующая полноразмерный коровый антиген HBV. В данной конструкции присутствует одна аминокислотная замена по сравнению с белком adw дикого типа, представленным на фигуре 2: аминокислоту в положении 97 заменили с изолейцина на фенилаланин, чтобы воспроизвести известный эпитоп CTL мыши.
Дополнительные конструкции можно построить с использованием других стрессовых белков, таких как Hsp70 Mycobacterium tuberculosis.
Молекулу HBc в некоторых случаях модифицировали введением одной или более аминокислотных замен в продукт гена HBc, чтобы воспроизвести известные специфичные для мыши эпитопы CTL. Одну из аминокислотных замен вводили в положении 87, где аспарагин заменяли на серин. Эта замена создавала эпитоп CTL мыши (87SYVNTNMGL95), рестрицированный по H-2Kd (HBc.Kd) (Kuhrober, et al., Int. Immunol. 9:1203-1212, 1997). Вторую аминокислотную замену вводили в положении 97, где изолейцин заменяли на фенилаланин. Эта замена создавала мышиный CTL эпитоп (93MGLKFRQLl00), рестрицированный по H-2Kb (HBc.Kb) (Kuhober et al., J. Immunol. 156:3687-3695, 1996). Фрагмент ДНК, кодирующий 20 аминокислот, содержащих шесть гистидиновых остатков (His-метка), присоединяли к N-концу некоторых конструкций для облегчения очистки. Белки слияния можно легко получить без данных модификаций.
Пример 2
Очистка белка
Использованы следующие сокращения: BCG - Mycobacterium bovis var. Bacille Calmette-Guerin; CV - объем колонки; ET - эндотоксин; EU - эндотоксиновые единицы; IB - тельце или тельца включения; MT - Mycobacterium tuberculosis; и PBS - фосфатно-солевой буфер.
Все конструкции растили в 15 л ферментаторе (Braun ED). Биомассу бактериальных клеток до применения для выделения белка хранили при -70°C.
2.1 Очистка hisHepCorT(149/87S97F)
Лизис клеток: примерно 277 г замороженной клеточной биомассы смешивали с 800 мл лизирующего буфера (30 мМ Tris, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 2 мМ EDTA, 0,2 мМ PMSF, pH 8,5). Затем добавляли лизоцим до 200 мкг/мл и 50 мкл BenzonaseTM. Клетки замораживали в течение ночи при -70°C, затем оттаивали в течение часа, разливали аликвоты в 50 мл центрифужные пробирки, хранили на льду и разрушали ультразвуком посредством BRANSON Sonifier II, оснащенного наконечником размером 0,5 дюйма, в режиме 9, 6 раз по 45 сек.
Клеточные обломки и IB отделяли от супернатанта центрифугированием при 17000 об/мин (Beckman, Avanti J-30, ротор JA30.50) 20 мин при 4°C. Осадок в каждой пробирке ресуспендировали в 25 мл буфера для промывки (30 мМ Tris, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 2% (об/об) Тритон X-100, pH 8,5). После центрифугирования при 22000 об/мин 20 мин при 4°C супернатант удаляли и добавляли 20 мл 8 М мочевины, 30 мМ Tris, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 1 мМ EDTA, 0,2 мМ PMSF, pH 8,5 и инкубировали в течение ночи при 4°C. Супернатант с растворенными IB собирали посредством центрифугирования при 22000 об/мин 30 мин затем разделяли на две порции и замораживали при -70°C.
Ni-хелатная хроматография: 250 мл хелатирующей сефарозы для быстрого протока (Amersham-Pharmacia) набивали в колонку XK50/30 (Amersham-Pharmacia). Смолу промывали по 3 CV каждого из 50 мМ ЭДТА, воды, качества Milli-QTM, 0,5 М NaOH, 2 М NaCl, воды, качества Milli-QTM, 70% (об/об) этанола и воды, качества Milli-QTM. Затем смолу заряжали 200 мМ NiSO4, промывали водой, качества Milli-QTM и уравновешивали 5 CV исходного буфера (6 М гуанидин-HCl, 30 мМ Tris, 2 мМ 2-меркаптоэтанол, 20 мМ имидазол, pH 8,5).
Одну часть образца наносили на колонку со скоростью 5 мл/мин, затем промывали исходным буфером со скоростью 10 мл/мин, пока измеряемое при 280 нм фоновое поглощение не достигало базового уровня. Для удаления ET колонку промывали 5 CV 6 М гуанидина-HCl, 30 мМ Tris, 2 мМ 2-меркаптоэтанола, 20 мМ имидазола, 2% (об/об) Тритона X-100, pH 8,5. Потом колонку промывали 6 М мочевины, 30 мМ Tris, 2 мМ 2-меркаптоэтанола, 20 мМ имидазола, pH 8,5, затем белок элюировали 5 CV градиента от 0 до 500 мМ имидазола в 6 М мочевины, 30 мМ Tris, 2 мМ 2-меркаптоэтанола, 20 мМ имидазола, pH 8,5, со скоростью 5 мл/мин.
Данную стадию хроматографии повторяли для второй части образца, и фракции, содержащие относительно чистый белок, объединяли.
Анионообменная хроматография с использованием Source 15Q: 60 мл смолы Source 15Q (Amersham-Pharmacia) набивали в колонку XK26/40 (Amersham-Pharmacia). Смолу промывали со скоростью 5 мл/мин 2 CV воды, качества Milli-QTM, 3 CV 1 М NaOH, 3 CV воды, качества Milli-QTM, 2 CV NaCl, 2 CV воды, качества Milli-QTM, 2 CV смеси 10% (об/об) уксусной кислоты и 40% (об/об) изопропанола, 2 CV воды, качества Milli-QTM, затем уравновешивали 3 CV исходного буфера (6 М мочевина, 30 мМ Tris, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 1 мМ ЭДТА, pH 8,5).
Объединенный образец, полученный на предыдущей стадии, наносили на колонку со скоростью 0,5 мл/мин, затем промывали исходным буфером со скоростью 6 мл/мин, пока измеряемое при 280 нм фоновое поглощение не достигало базового уровня. Затем колонку промывали 10 CV 2% (об/об) Тритона X-100 в исходном буфере. Белок элюировали 11 CV от 0 до 600 мМ NaCl в исходном буфере.
Данную стадию хроматографии повторяли, и фракции, содержащие относительно чистый белок, объединяли.
Катионообменная хроматография с использованием Source 15S: 50 мл смолы Source 15S (Amersham-Pharmacia) набивали в колонку XK26/40 (Amersham-Pharmacia). Смолу промывали со скоростью 5 мл/мин 2 CV 1 М NaOH, 3 CV воды, качества Milli-QTM, 2 CV NaCl, 2 CV воды, качества Milli-QTM, 2 CV смеси 10% (об/об) уксусной кислоты и 40% (об/об) изопропанола, 2 CV воды, качества Milli-QTM, затем уравновешивали 3 CV исходного буфера (6 М мочевины, 23 мМ ацетата натрия, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 1 мМ ЭДТА, pH 4,8).
Объединенный образец, полученный на предыдущей стадии, наносили на колонку со скоростью 3 мл/мин, затем промывали исходным буфером со скоростью 3 мл/мин, пока измеряемое при 280 нм фоновое поглощение не достигало базового уровня. Белок частично элюировали 15 CV от 0 до 1000 мМ NaCl в исходном буфере, со скоростью 6 мл/мин, для напоминания с 6 М гуанидина-HCl, 30 мМ Tris, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 1 мМ ЭДТА, pH 8,5.
Диализ и приготовление образцов: Впоследствии проводили диализ объединенного образца против следующих растворов, в данном порядке:
1. 4 л 6 М мочевины, 30 мМ Tris-HCl pH 8,5, 10 мМ 2 меркаптоэтанола, 1 мМ ЭДТА, 0,8 М аргинина, в течение ночи при 4°C.
2. 4 л 3 М мочевины, 30 мМ Tris-HCI pH 8,5, 2 мМ 2 меркаптоэтанола, 1 мМ ЭДТА, 25% (масс/об) сахарозы, в течение ночи при 4°C. 3. 2 л 30 мМ Tris-HCl pH 8,5, 4,5 мМ восстановленного глутатиона, 0,5 мМ окисленного глутатиона, 0,8 М аргинина, 25% (масс/об) сахарозы, в течение ночи при 4°C.
4. 2 л 10 мМ PBS pH 7,4, 4,5 мМ восстановленного глутатиона, 0,5 мМ окисленного глутатиона, 25% (масс/об) сахарозы, в течение ночи при 4°C.
5. Повторение стадии 4.
Полагая, что каждую стадию диализа заканчивали при достижении равновесия, конечные концентрации ингредиентов составляли: 10 мМ PBS, 4,5 мМ восстановленного глутатиона, 0,5 мМ окисленного глутатиона, аргинина ≤48 мМ, мочевины ≤25 мМ, 730 мМ или 25% (масс/об) сахарозы.
2.2 Очистка hisHepCorT(149/87S97F)Hsp65
Лизис клеток: 79 г замороженной клеточной биомассы смешивали с 1000 мл лизирующего буфера (30 мМ Tris, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, pH 7,5). Лизат замораживали в течение ночи при -70°C. Затем лизат размораживали, добавляли лизоцим до 200 мкг/мл и инкубировали клетки в течение часа. Добавляли смесь нескольких ингибиторов протеаз (по 40 мг/мл апротинина, лейпептина и пепстатина) и 15 мкл Benzonase™. Лизат подвергали воздействию ультразвука в 250 мл кювете Rosette Cooling Cell (Fisher) с помощью BRANSON Sonifier II, оснащенного наконечником 0,5 дюйма, в режиме 7, 6 раз по 60 сек.
Клеточные осколки и IB отделяли от супернатанта центрифугированием при 23000 об/мин (Beckman, Avanti J-30, ротор JA30.50) в течение 20 мин при 4°C. К супернатанту добавляли гуанидин-HCl до концентрации 6 М, доводя объем до 1400 мл. Образец разделяли на одну фракцию объемом 400 мл и две фракции объемом 500 мл.
Ni-хелатная хроматография: 187 мл хелатирующей сефарозы для быстрого протока (Amersham-Pharmacia) набивали в колонку XK50/30 (Amersham-Pharmacia). Смолу, предварительно регенерированную по рекомендациям производителя, уравновешивали 5 CV исходного буфера (6 М гуанидин-HCl, 50 мМ имидазол, 30 мМ Tris, 1 мМ 2-меркаптоэтанол, pH 7,5).
Образец объемом 400 мл наносили на колонку со скоростью 10 мл/мин, затем промывали исходным буфером, пока измеряемое при 280 нм фоновое поглощение не достигало базового уровня. Для удаления ET колонку промывали 5 CV 6 М гуанидина-HCl, 30 мМ Tris, 1 мМ 2-меркаптоэтанола, 2% (об/об) Тритона X-100, pH 7,5. Затем колонку промывали 8 М мочевиной, 30 мМ Tris, pH 8,5. Затем белок элюировали в градиенте от 0 до 500 мМ имидазола в 8 М мочевине, 30 мМ Tris, 1 мМ 2-меркаптоэтаноле, pH 7,5.
Эту стадию хроматографии повторяли, используя две фракции по 500 мл из предыдущей стадии. Фракции, собранные после всех трех элюций, объединяли.
Анионообменная хроматография с использованием Source 30Q: 167 мл смолы Source 15Q (Amersham-Pharmacia) набивали в колонку XK50/30 (Amersham-Pharmacia). Смолу регенерировали 5 CV 2 М NaCl, 1 М NaOH, воды, качества Milli-QTM, 40% (об/об) изопропанола, 10% (об/об) уксусной кислоты, воды, качества Milli-QTM. Затем колонку уравновешивали 3 CV исходного буфера (6 М мочевины, 30 мМ Tris, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, pH 7,5).
Объединенные фракции, полученные на предыдущей стадии, наносили на колонку со скоростью 10 мл/мин, затем промывали исходным буфером, пока измеряемое при 214 нм, 254 нм и 280 нм фоновое поглощение не достигало базового уровня. Белок элюировали в градиенте от 0 до 500 мМ NaCl в исходном буфере, со скоростью 6 мл/мин. Фракции, содержащие искомый белок, объединяли.
Хроматография с использованием керамического гидроксиапатита: 53 мл керамического гидроксиапатита набивали в колонку XK26/40 (Amersham-Pharmacia), регенерировали 3 CV 1 М NaOH и 0,5 М фосфата натрия, pH 6,8. Затем колонку уравновешивали 6М мочевины, 20 мМ фосфата натрия, pH 6,8.
Объединенные после предыдущей колонки фракции наносили со скоростью 5 мл/мин, затем промывали 6 М мочевиной, 20 мМ фосфатом натрия, pH 6,8, пока измеряемое при 214 нм, 254 нм и 280 нм фоновое поглощение не достигало базового уровня. Примеси связывались на колонке, в то время как hisHepCorT(149/87S97F)Hsp65 оставался в проточной фазе.
Диализ и приготовление образцов: Проток после предыдущей хроматографии объединяли (250 мл) и проводили диализ против следующих растворов, в данном порядке:
1. 4 л 3 М гуанидина-HCl, 10 мМ фосфата натрия, 0,8 М аргинина, 4,5 мМ восстановленного глутатиона, 0,5 мМ окисленного глутатиона, 25% (масс/об) сахарозы, в течение ночи при 4°C.
2. 4 л 10 мМ фосфата натрия, 4,5 мМ восстановленного глутатиона, 0,5 мМ окисленного глутатиона, 25% (масс/об) сахарозы, в течение ночи при 4°C.
3. Повторяли предыдущую стадию. Полагая, что каждую стадию диализа заканчивали при достижении равновесия, конечные концентрации ингредиентов составляли: 10 мМ фосфата натрия, 1,85 мМ мочевины, 4,5 мМ восстановленного глутатиона, 0,5 мМ окисленного глутатиона, 730 мМ или 25% (масс/об) сахарозы.
Гель-фильтрационная хроматография: колонку для гель-фильтрации HiLoad 26/60 Superdex 200 (Amersham-Pharmacia), предварительно набитую производителем, регенерировали 1 М NaOH, затем уравновешивали 10 мМ фосфата натрия, 4,5 мМ восстановленного глутатиона, 0,5 мМ окисленного глутатиона, 25% (масс/об) сахароза, pH 7.4.
Образец после диализа разделяли на три порции (30 мл, 20 мл, 20 мл), по отдельности пропускали через колонку в буфере для уравновешивания со скоростью 1,5 или 2 мл/мин, и объединяли фракции, содержащие белок.
2.3 Очистка HepCorT(151/97F)Hsp65
Лизис клеток: 500 г замороженной клеточной биомассы смешивали с 2500 мл лизирующего буфера (30 мМ Tris, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 2 мМ ЭДТА, 0,1 мМ PMSF, 10 мг/мл апротинин, 10 мг/мл лейпептин, 5 мМ п-аминобензамидин, 0,2 мг/мл лизоцим, pH 7,5), затем, по меньшей мере, два часа замораживали при -70°C.
Замороженную суспензию клеток оттаивали при 37°C, хранили на льду и подвергали обработке ультразвуком (Branson Sonifier 450, наконечник 3/4 дюйма) 4 раза по 1 мин. Лизат центрифугировали при 15000g, растворимую фракцию осветляли при 64000g, и собирали растворенный образец. После добавления 6 М мочевины к растворимой фракции, ее разделяли на три равные порции.
Хроматография с использованием Source 30Q: Колонку XK50/30 (Amersham-Pharmacia), содержащую 190 мл смолы Source 30Q (Amersham-Pharmacia), регенерировали, затем уравновешивали 3 CV исходного буфера (6 М мочевина, 30 мМ Tris, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 1 мМ ЭДТА, pH 7,5).
Одну порцию материала наносили на колонку. Смолу промывали исходным буфером, пока измеряемое при 214 нм, 254 нм и 280 нм фоновое поглощение не достигало базового уровня, затем белок элюировали 5 CV линейного градиента от 0 до 500 мМ NaCl в исходном буфере. Фракции, содержащие HepCor65T(151/97F), объединяли.
Стадию хроматографии повторяли для двух других порций материала. Объемы всех трех порций объединяли и подвергали диализу против 6 М мочевины, 25 мМ ацетата натрия, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 1 мМ ЭДТА, pH 5,5. Затем образец разделяли на две порции.
Хроматография с использованием Source 15S при pH 5,5: Колонку XK26/40 (Amersham-Pharmacia), содержащую 50 мл смолы Source 15S (Amersham-Pharmacia), регенерировали, затем уравновешивали исходным буфером Sl (6 М мочевины, 25 мМ ацетата натрия, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 1 мМ ЭДТА, pH 5,5).
Одну порцию образца после Source 30Q наносили на колонку, промывали a) исходным буфером S1, пока фоновое поглощение при 280 нм не стабилизировалось, b) 10 CV 2% (об/об) Тритона X-100 в исходном буфере S1 и c) исходным буфером S1, пока фоновое поглощение при 280 нм не стабилизировалось. В заключение белок элюировали 18 CV линейного градиента от 0 до 230 мМ NaCl. Оставшийся белок удаляли с колонки на стадии промывки 1 M NaCl.
Стадию хроматографии повторяли для второй порции образца после Source 30Q. Фракции, содержащие HepCor65T(151/97F), объединяли, концентрированной уксусной кислотой доводили pH до 4,8 и разделяли на две порции.
Хроматография с использованием Source 15S при pH 4,8: Колонку Source 15S регенерировали и уравновешивали исходным буфером S2 (6 М мочевина, 25 мМ ацетат натрия, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 1 мМ ЭДТА, pH 4,8).
Одну порцию образца после Source 15S наносили на колонку, промывали a) исходным буфером S2, пока фоновое поглощение при 280 нм не стабилизировалось, b) 10 CV 2% (об/об) Тритона X-100 в исходном буфере S2, и c) исходным буфером S2, пока фоновое поглощение при 280 нм не стабилизировалось.
Белок элюировали 10 CV линейного градиента от 0 до 500 мМ NaCl в исходном буфере S2. Оставшийся белок удаляли с колонки промывкой 2 CV 1 М NaCl и финальной промывкой 3 CV 6 М гуанидина-HCl. Фракции, содержащие HepCorT(151/97F)Hsp65, объединяли.
Хроматография с использованием Source 15S при pH 4,8 - удаление эндотоксина: После диализа объединенных фракций из предыдущей стадии в исходном буфере S2, их наносили повторно на колонку Source 15S.
Колонку Source 15S регенерировали и уравновешивали в исходном буфере S2. Половину образца после Source 15S наносили на колонку, промывали исходным буфером S2, пока фоновое поглощение при 280 нм не стабилизировалось, затем 10 CV 2% (об/об) Тритона X-100 в исходном буфере S2 и снова исходным буфером S2, пока фоновое поглощение при 280 нм не стабилизировалось.
Белок элюировали на стадии промывки 4 CV 1 М NaCl и финальной промывкой 3 CV 6 М гуанидина-HCl. Фракции, содержащие HepCor65T(151/97F), объединяли и проводили три стадии диализа в DPBS, 10% (масс/об) сахарозе.
2.4 Очистка HepCor(97F)Hsp65
Лизис клеток: 200 г замороженной клеточной биомассы смешивали с 600 мл буфера для лизиса (30 мМ Tris, 20 мМ 2-меркаптоэтанол, 5 мМ ЭДТА, 0,1 мМ PMSF, 0,2 мг/мл лизоцим, pH 7,5) и перемешивали при 4°C примерно 30 мин.
Суспензию клеток подвергали воздействию ультразвука (Branson Sonifier 450, наконечник 3/4 дюйма, режим 9) 4 раза по 1 мин. Лизат центрифугировали при 18500g и собирали растворенный образец. Раствор белка осветляли центрифугированием при 108850g 20 мин при 4°C.
Осаждение сульфатом аммония: К осветленному раствору белка добавляли сульфат аммония до 25% насыщения, и осаждали белок при 10000g. Осадок ресуспендировали в буфере для лизиса.
Осаждение уксусной кислотой: Раствор белка осторожно доводили 1 М уксусной кислотой до pH 4,5, а затем перемешивали 20 мин при 4°C. Затем белок осаждали центрифугированием при 10000g 10 мин при 4°C. Осадок белка ресуспендировали в Q-буфере A (6 М мочевины, 30 мМ Tris, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 5 мМ ЭДТА, 0,1 мМ PMSF, pH 8,5).
Высокоэффективная хроматография на Q-сефарозе: Колонку XK50/30 (Amersham Pharmacia), содержащую 150 мл смолы высокоэффективной Q-сефарозы (Amersham-Pharmacia), восстанавливали, затем уравновешивали 3-5 CV Q-буфера A.
Образец наносили на колонку и собирали в проточной фазе. Добавляли 2-меркаптоэтанол до 150 мМ и объем белка инкубировали 1 час при 4°C.
Вторая высокоэффективная хроматография на Q-сефарозе: Колонку, содержащую высокоэффективную Q-сефарозу, регенерировали, затем уравновешивали Q-буфером A.
На колонку наносили проток после первой колонки с Q-сефарозой для быстрого протока и снова собирали проточную фазу. Добавляли 2-меркаптоэтанол до 300 мМ. Добавляли гуанидинхлорид до 6 М. Затем образец белка инкубировали 72 часа при комнатной температуре, после чего фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм.
Гель-фильтрационная хроматография с использованием Superdex 200: Колонку XK50/90 (Amersham Pharmacia), содержащую 1800 мл смолы Superdex 200 (Amersham-Pharmacia), уравновешивали 2 CV буфера GF (6 М мочевины, 30 мМ Tris, 20 мМ 2-меркаптоэтанола, 2 мМ ЭДТА, pH 7,5).
Образец разделяли на 10 равных порций по 70 мл. Затем отдельные порции пропускали через колонку и объединяли фракции, содержащие HepCor(97F)Hsp65.
Высаливающая гель-фильтрационная хроматография на сефадексе 25: колонку XK50/30 (Amersham-Pharmacia), содержащую 300 мл смолы сефадекс 25 (Amersham-Pharmacia) регенерировали, затем уравновешивали буфером GF25 (6 М мочевины, 50 мМ уксусной кислоты, 5 мМ NaOH, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, pH 4,7).
Образец разделяли на порции по 75 мл, после чего обрабатывали. Фракции, содержащие белок, объединяли.
Высокоэффективная хроматография на SP-сефарозе: 275 мл высокоэффективной SP-сефарозы (Amersham-Pharmacia) регенерировали, затем уравновешивали SP-буфером A (6 М мочевины, 50 мМ уксусной кислоты, 5 мМ NaOH, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, pH 4,7).
Объединенный образец, полученный на предыдущей стадии, смешивали со смолой и инкубировали в горизонтальном шейкере 30 мин при комнатной температуре. Затем суспензию набивали в колонку XK50/30 (Amersham-Pharmacia) и промывали 2 CV SP-буфера A. Затем колонку промывали 15 CV 2% (об/об) Тритона X-100 в SP-буфере A. Детергент удаляли промывкой 5 CV SP-буфера A и 2 CV 1 М NaCl в SP-буфере A. Затем белок изократически элюировали 6 М мочевины, 10 мМ Tris, pH 7,5.
Хроматография на медьсодержащей хелатирующей сефарозе для быстрого протока: Колонку XK50/30 (Amersham-Pharmacia), содержащую 180 мл хелатирующей сефарозы для быстрого протока (Amersham Pharmacia), регенерировали, насыщали сульфатом меди, затем уравновешивали 2 CV Cu-буфера A (6 М гуанидингидрохлорида, 30 мМ фосфат натрия, pH 7,0).
Образец наносили на колонку, промывали 3 CV Cu-буфера A, затем 5 CV 2% (об/об) Тритона X-100 в Cu-буфере A и в заключение, 3 CV Cu-буфера A для удаления детергента. Белок элюировали 300 мМ имидазолом в Cu-буфере A. Потом проводили 5 стадий диализа белка в DPBS.
2.5 Очистка HepCorT(151/97F)
Лизис клеток: 425 г замороженной клеточной биомассы смешивали с 2,5 л охлажденного на льду 10 мМ ЭДТА, 100 мМ NaCl, 1 мМ 2-меркаптоэтанола, pH 8,0. После перемешивания клеточной суспензии, клетки осаждали центрифугированием 10 мин при 10500g. Клетки ресуспендировали в 50 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ 2-меркаптоэтанола, 0,2 г/мл лизоцима, pH 8,0, перемешивали и инкубировали на льду 1 час.
Суспензию клеток подвергали воздействию ультразвука (Branson Sonifier 450, наконечник 3/4 дюйма, режим 8) 2 раза по 2 мин. Лизат центрифугировали при 18500g и собирали растворенный образец.
Осаждение сульфатом аммония: К растворимой фракции добавляли сульфат аммония до 25% насыщения, затем осаждали примеси 40 мин при 10000g. К супернатанту дополнительно добавляли сульфат аммония до 35% насыщения. После перемешивания в течение 30 мин белок осаждали центрифугированием при 10000g 30 мин. Осадок ресуспендировали в 1 мМ ЭДТА, 1 мМ 2-меркаптоэтанола, pH 8,0 и осветляли центрифугированием при 76500g 20 мин.
Повторное осаждение сульфатом аммония: После первого осаждения образец растворяли в 1 мМ ЭДТА, 1 мМ 2-меркаптоэтанола, pH 8,0 и подвергали такой же процедуре, как описано выше.
Хроматография на фенилсефарозе для быстрого протока: Колонку XK50/30 (Amersham Pharmacia), содержащую 200 мл фенилсефарозы для быстрого протока (Amersham-Pharmacia) регенерировали, затем уравновешивали 0,85 М сульфата аммония, 20 мМ фосфата натрия, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ 2-меркаптоэтанола, pH 6,8.
К образцу добавляли 1 М фосфат натрия, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ BME, pH 6,8, доводя концентрацию фосфата натрия до 10 мМ и процент насыщения сульфата аммония до 20%.
Половину образца наносили на колонку и промывали буфером для уравновешивания, пока измеряемое при 280 нм фоновое поглощение не достигало базового уровня. Белок элюировали 300 мл обратного линейного градиента до концентрации 20 мМ фосфата натрия, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ 2-меркаптоэтанола, pH 6,8. Фракции, содержащие HepCorT(151/97F), объединяли.
Повторная хроматография на фенилсефарозе для быстрого потока: Колонку регенерировали и уравновешивали 0,85 М сульфата аммония, 20 мМ фосфата натрия, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ 2-меркаптоэтанола, pH 6,8.
Объединенный образец после первой колонки с фенилсефарозой FF разводили буфером для уравновешивания до концентрации белка 2,5 мг/мл. Затем разведенный образец наносили на колонку, промывали буфером для уравновешивания, пока измеряемое при 280 нм фоновое поглощение не достигало базового уровня, и элюировали 300 мл линейного градиента до концентрации 20 мМ фосфата натрия, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ 2-меркаптоэтанола, pH 6,8.
Фракции, содержащие HepCorT(151/97F), объединяли и белок осаждали добавлением сульфата аммония до 35% насыщения с последующим центрифугированием при 12000g в течение 50 мин. Затем осадок снова растворяли в 700 мл 8 М мочевины, 10 мМ ацетата натрия, 30 мМ уксусной кислоты, 25 мМ NaCl, 0,5 мМ ЭДТА, 5 мМ 2-меркаптоэтанола, pH 8,0.
Хроматография на SP-сефарозе для быстрого потока: Колонку XK50/30 (Amersham-Pharmacia), содержащую 180 мл SP-сефарозы для быстрого потока (Amersham-Pharmacia) регенерировали, затем уравновешивали 5 CV 8 М мочевины, 10 мМ ацетата натрия, 30 мМ уксусной кислоты, 25 мМ NaCl, 0,5 мМ ЭДТА, 5 мМ 2-меркаптоэтанола, pH 8,0.
Половину образца наносили на колонку и промывали буфером для уравновешивания, пока измеряемое при 280 нм фоновое поглощение не достигало базового уровня. Белок элюировали 600 мл линейного градиента от буфера для уравновешивания до 10 мМ ацетата натрия, 30 мМ уксусной кислоты, 1 М NaCl, 5 мМ 2-меркаптоэтанола, 0,5 мМ ЭДТА. В заключение, колонку отмывали 6 М гуанидином-HCl, 50 мМ Tris, pH 8,5.
Процедуру повторяли для второй половины образца, затем фракции, содержащие HepCorT, объединяли и подвергали диализу против 6 М мочевины, 20 мМ Tris, pH 8,5, 0,5 мМ ЭДТА, 5 мМ 2-меркаптоэтанола, pH 8,5, и, в заключение, против 6 М мочевины, 20 мМ Tris, 5 мМ 2-меркаптоэтанола, pH 8,5.
Хроматография с использованием Source 30Q: Колонку XK50/30 (Amersham-Pharmacia), содержащую 150 мл смолы Source 30Q (Amersham-Pharmacia), регенерировали, затем уравновешивали 4 CV буфера для уравновешивания (6 М мочевины, 20 мМ Tris, 5 мМ 2-меркаптоэтанола, pH 8,5).
Одну треть образца наносили на колонку, промывали 95% буфера для уравновешивания и 5% буфера для элюции (6 М мочевины, 1 мМ NaCl, 20 мМ Tris, 5 мМ 2-меркаптоэтанола, pH 8,5), затем белок элюировали 1 л линейного градиента до 100% буфера для элюции.
Вторую и третью части образца обрабатывали таким же образом. Фракции, содержащие HepCorT объединяли, затем подвергали диализу против 6 М мочевины, 20 мМ ацетата натрия, 20 мМ уксусной кислоты, 0,5 мМ ЭДТА, 1 мМ 2-меркаптоэтанола, pH 8,0.
Высокоэффективная хроматография на SP-сефарозе: Колонку XK50/30 (Amersham Pharmacia), содержащую 180 мл высокоэффективной SP-сефарозы (Amersham Pharmacia), регенерировали, затем уравновешивали 5 CV 6 М мочевины, 20 мМ ацетата натрия, 20 мМ уксусной кислоты, 0,5 мМ ЭДТА, 1 мМ 2-меркаптоэтанола, pH 8,0.
Половину образца наносили на колонку и промывали буфером для уравновешивания, пока измеряемое при 280 нм фоновое поглощение не достигало базового уровня.
Примеси элюировали двумя линейными градиентами, т.е. от 0 до 1 М NaCl в буфере для уравновешивания, затем линейный градиент до буфера для элюции 2 (6 М мочевины, 40 мМ ацетата натрия, 10 мМ уксусной кислоты, 0,5 мМ ЭДТА, 1 мМ 2-меркаптоэтанола, pH 8,0). Колонку промывали 2% (об/об) Тритона X-100 в буфере для элюции 2, затем 10 CV буфера для элюции для удаления детергента. Затем белок элюировали в градиенте концентрации до 6 M мочевины, 50 мМ Tris, 0,5 мМ ЭДТА, 5 мМ 2-меркаптоэтанола, pH 8.0.
После повторения процедуры для второй половины образца фракции, содержащие HepCorT(151/9F), объединяли и подвергали белок двум стадиям диализа в 5 мМ фосфате натрия, 50 мМ NaCl, 3,1 мМ мочевине, 20% (масс/об) сахарозе, pH 8,5.
2.6 Очистка HepCor(97F)
Лизис клеток: 100 г замороженной клеточной биомассы смешивали с 400 мл охлажденного на льду 5 мМ ЭДТА, 5 мМ 2-меркаптоэтанолом, pH 8,0. После перемешивания суспензии клеток добавляли лизоцим до 0,2 г/мл, суспензию перемешивали и инкубировали во льду 1 час.
Суспензию клеток подвергали воздействию ультразвука (Branson Sonifier 450, наконечник 3/4 дюйма, режим 8) 2 раза по 2 мин, затем добавляли 200 мл охлажденного на льду 20 мМ ацетата натрия, 5 мМ уксусной кислоты, 3 М сульфата аммония и хорошо перемешивали. Суспензию подвергали воздействию ультразвука (Branson Sonifier 450, наконечник 3/4 дюйма, режим 8) 3 мин. В заключение лизат центрифугировали при 18500g и собирали растворенный образец.
Осаждение сульфатом аммония: Растворимую фракцию разводили в 1 л 0,85 М сульфата аммония. При перемешивании медленно добавляли 70 г/л твердого сульфата аммония. После дальнейшего перемешивания в течение 30 мин суспензию центрифугировали при 18500g 60 мин. Потом осадок ресуспендировали в 500 мл 1 мМ ЭДТА, 5 мМ 2-меркаптоэтанола. При перемешивании медленно добавляли 113,4 г/л сульфата аммония и перемешивали еще 30 мин. Белок осаждали центрифугированием при 76500g 20 мин.
Осадок снова растворяли посредством добавления 1 М фосфата натрия, 1 мМ ЭДТА, 5 мМ 2-меркаптоэтанола, сульфата аммония в 20% насыщении до конечной концентрации фосфата натрия 5 мМ.
Хроматография на фенилсефарозе для быстрого потока: Колонку XK50/30 (Amersham Pharmacia), содержащую 200 мл фенилсефарозы для быстрого потока (Amersham-Pharmacia), регенерировали, затем уравновешивали 0,85 М сульфата аммония, 5 мМ фосфата натрия, 1 мМ ЭДТА, 5 мМ 2-меркаптоэтанола, pH 6,8.
Образец наносили на колонку и промывали буфером для уравновешивания, пока измеряемое при 280 нм фоновое поглощение не достигало базового уровня. Белок элюировали ступенчатым градиентом до 6 М мочевины. Фракции, содержащие HepCorT, объединяли, и белок осаждали добавлением сульфата аммония до 32% насыщения. После осаждения белка центрифугированием при 12100g в течение 50 мин, его снова растворяли в 500 мл 8 М мочевины, 5 мМ Tris, 5 мМ 2-меркаптоэтанола, pH 7,5.
Хроматография с использованием Source 30Q: Колонку XK50/30 (Amersham-Pharmacia), содержащую 150 мл смолы Source 30Q (Amersham-Pharmacia), регенерировали, затем уравновешивали 4 CV буфера для уравновешивания (6 М мочевины, 5 мМ Tris, 5 мМ 2-меркаптоэтанола, pH 7,5).
Образец наносили на колонку, промывали буфером для уравновешивания. Белок элюировали в линейном градиенте от буфера для уравновешивания до 6 М мочевины, 1 М NaCl, 5 мМ Tris, 5 мМ 2-меркаптоэтанола, pH 7,5. Фракции, содержащие HepCor(97F), объединяли и разделяли на три порции.
Хроматография на высокоэффективной SP-сефарозе: Колонку XK50/30 (Amersham Pharmacia), содержащую 190 мл высокоэффективной SP-сефарозы (Amersham Pharmacia), регенерировали, затем уравновешивали 5 CV 6 М мочевины, 30 мМ ацетата натрия, 10 мМ уксусной кислоты, 1 мМ ЭДТА, 5 мМ 2-меркаптоэтанола, pH 8,0.
Одну порцию образца наносили на колонку и промывали 20 CV 6 М мочевины, 40 мМ ацетата натрия, 10 мМ уксусной кислоты, 0,5 мМ ЭДТА, 1 мМ 2-меркаптоэтанола, 2% (об/об) Тритона X-100, pH 8,0. Затем для удаления Тритона X-100 колонку промывали 10 CV 6 М мочевины, 40 мМ ацетата натрия, 10 мМ уксусной кислоты, 0,5 мМ ЭДТА, 1 мМ 2-меркаптоэтанола, pH 8,0.
Белок элюировали 600 мл линейного градиента до 6 М мочевины, 20 мМ Tris, 1 М NaCl, 1 мМ 2-меркаптоэтанола, 0,5 мМ ЭДТА, pH 8,5.
Процедуру повторяли с двумя другими порциями материала, затем фракции, содержащие HepCor(97F), объединяли. Затем белок подвергали 5 стадиям диализа в 40 мМ ацетате натрия, 0,05 мМ DTT, pH 6,5.
Пример 3
Примирование активности CTL мышей
Мыши: Мыши C57BL/6 (H-2b) приобретены в Charles River Laboratories (St. Constant, PQ).
Клеточные линии: линия клеток тимомы EL4 (H-2b) получена из ATCC и культивирована в модифицированной по Дульбекко среде Игла, содержащей 10% FBS и 2 мМ L-глутамина (DMEM-10). Клетки EL4.HBc.1D7, экспрессирующие антиген HBc выведены на Stressgen посредством трансфицирования клеток EL4 плазмидой, кодирующей полноразмерный ген HBc и маркер устойчивости к неомицину. Ген полноразмерного антигена HBc клонировали из подтипа HBV adw и модифицировали для кодирования известных последовательностей мышиных рестрицированных по H-2Kb и H-2Kd эпитопов CTL (в белке adw провели 2 замены аминокислот по сравнению с белком дикого типа: аминокислоту в положении 87 изменили с аспарагина на серин, а аминокислоту в положении 97 изменили с изолейцина на фенилаланин. Данные две замены провели для воспроизведения известных мышиных эпитопов CTL). Трансфицированные клетки отбирали в DMEM-10, содержащей 1500 мкг/мл G418 и клонировали посредством ограничивающих разведений для получения клона EL4.HBc.1D7. Экспрессию белка HBc в данной клеточной линии подтверждали посредством анализа вестерн-иммуноблоттинга с использованием антител, специфичных к HBc. Презентацию MHC класса 1 рестрицированного по H-2Kb эпитопа CTL подтверждали посредством лизиса с линией CTL, специфичной к этому эпитопу. Анализ FACS выявил высокий уровень экспрессии MHC класса 1 на трансфицированных клетках, сходный с уровнем экспрессии родительской клеточной линии.
Примирование активности CTL мышей: Мышей иммунизировали (посредством подкожной инъекции либо в заднюю часть шеи либо область между лопатками) буфером или 2,9 нмоль одного из следующих: HepCorT(151/97F)Hsp65, HepCorT(97F)Hsp65, hisHepCorT(149/87S97F)Hsp65, HepCorT(151/97F) или HepCorT(97F). На седьмые сутки после иммунизации мышей подвергли эвтаназии посредством ингаляции CO2 или цервикальной дислокации и изъяли их селезенки. Получили единую клеточную суспензию клеток селезенки в среде для CTL (RPMI-1640, 10% FBS, 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 50 мкМ 2-ME и 45 мкг/мл гентамицина) 30×106 жизнеспособных лимфоидных клеток рестимулировали посредством инкубации при 37°С/5% CO2 в присутствии 1 мкМ пептида HBc.93-100.Kb, MGLKFRQL эпитопа HBc CTL (Kuhober et al., J. Immunol. 156:3687-95, 1996). Данный синтетический пептид (синтезированный Research Genetics, Huntsville, AL), применяемый для рестимуляции, включает мышиный эпитоп CTL рестрицированный по H-2Kb.
Эффекторные клетки собирали после 7 суток и культивировали в круглодонных 96-луночных планшетах для микротитрования вместе с меченными 51Cr целевыми клетками. Контрольные цели EL4 представляли собой клетки, предварительно импульсно активированные несвязанным, рестрицированным по H-2Kb (MUT-1.52-59.Kb) пептидом (см. фигуру 13). Целевые клетки представляли собой клетки EL4, предварительно импульсно активированные или пептидом HBc.93-100.Kb (см. фигуру 14) или EL4.HBc.1D7 (см. фигуру 15). CTL (100 мкл) культивировали с 5×103 или 5×104 целевыми клетками (100 мкл) в различных соотношениях эффектор:целевая клетка (100:1, 33:1 или 11:1). Для определения спонтанного высвобождения метки равное количество целевых клеток культивировали без эффекторных клеток в общем объеме 200 мкл среды для CTL. Общее высвобождение метки определяли посредством добавления 100 мкл Тритона X-100 (2% об/об в воде) к равному количеству целевых клеток. После 4 часов инкубации планшеты для микротитрования центрифугировали при 200g 5 мин и собирали 100 мкл супернатанта культуры. Высвобожденную радиоактивность определяли посредством подсчета сцинцилляций. Корректированный % лизиса рассчитывали по формуле:
Корректированный % лизиса (CL)=100×(CPMtest-CPMspont)/(CPMtotal-CPMspont).
Анализ цитокинов: для подсчета высвобождения гамма интерферона (IFN-γ) и фактора некроза опухоли (TNF-α) из рестимулированных CTL, эффекторные клетки помещали в круглодонные 96-луночные планшеты для микротитрования и культивировали вместе с 1 мкМ пептида HBc.93-100.Kb и целевыми клетками в соотношениях эффектор:цель 100:1, 33:1 или 11:1. Супернатанты собирали после 4 или 24 часов инкубации и анализировали уровень IFN-γ (фигура 16) или TNF-α (фигура 17) посредством сэндвич-ELISA.
Claims (46)
1. Белок слияния, включающий
(i) стрессовый белок или его часть, обладающая иммуностимуляторным действием, и
(ii) белок вируса гепатита В (HBV) или его антигенный фрагмент, где белок слияния при введении индивидууму, индуцирует или усиливает иммунный ответ против белка HBV.
2. Белок слияния по п.1, где белок HBV представляет собой коровый антиген вируса гепатита В (HBV).
3. Белок слияния по п.2, где коровый антиген HBV включает последовательность SEQ ID No:2.
4. Белок слияния по п.2 или 3, где у белка слияния отсутствует C-концевой богатый аргинином домен корового антигена HBV.
5. Белок слияния по любому из пп.2-4, где белок слияния включает аминокислоты 1-149 последовательности SEQ ID No:2.
6. Белок слияния по любому из пп.2-4, где белок слияния включает аминокислоты 1-151 последовательности SEQ ID No:2.
7. Белок слияния по п.1, где белок HBV представляет собой антиген HBV е, белок х, полипептид полимеразы, белок оболочки HBV S, белок оболочки HBV M или белок оболочки HBV L.
8. Белок слияния по любому из пп.1-7, где стрессовый белок представляет собой белок теплового шока.
9. Белок слияния по любому из пп.1-7, где стрессовый белок выбран из Hsp10, Hsp40, Hsp60, Hsp70, Hsp90, Hsp100-200, Hsp100, Lon, TF55, Hsp40, FKBP, циклофилина, Hsp20-30, ClpP, GrpE, убиквитина, калнексина или белка дисульфидизомеразы или члена семейства стрессовых белков с малой молекулярной массой.
10. Белок слияния по любому из пп.1-9, где стрессовый белок представляет собой стрессовый белок микобактерий.
11. Белок слияния по п.10, где стрессовый белок микобактерий представляет собой стрессовый белок M.bovis BCG.
12. Белок слияния по п.10, где стрессовый белок M.bovis BCG представляет собой стрессовый белок Hsp65 M.bovis BCG.
13. Белок слияния по любому из пп.1-12, где стрессовый белок представляет собой стрессовый белок полной длины.
14. Белок слияния по любому из пп.1-13, где белок HBV представляет собой белок HBV полной длины.
15. Белок слияния, включающий
(i) стрессовый белок или его часть, обладающая иммуностимуляторным действием, и
(ii) вариант корового антигена HBV с последовательностью SEQ ID No:2, где вариант содержит аминокислотную последовательность SEQ ID No:2, в которой замещены по меньшей мере один, но не более чем 25 аминокислотных остатков, и белок слияния, при введении индивидууму индуцирует или усиливает иммунный ответ против корового антигена HBV.
16. Белок слияния по п.15, где замещены от 1 до 10 аминокислотных остатков последовательности SEQ ID No:2.
17. Белок слияния по п.15, где замещены от 1 до 5 аминокислотных остатков последовательности SEQ ID No:2.
18. Белок слияния по п.15, где замещены от 1 до 2 аминокислотных остатков последовательности SEQ ID No:2.
19. Белок слияния по любому из пп.15-18, где вариант содержит аминокислотную последовательность SEQ ID No:2, в которой по меньшей мере остаток изолейцина в положении 97 замещен.
20. Белок слияния по п.19, где остаток изолейцина в положении 97 замещен на консервативный аминокислотный остаток.
21. Белок слияния по п.15, где остаток изолейцина в положении 97 замещен на фенилаланин.
22. Белок слияния по любому из пп.15-18, где остаток треонина в положении 91 замещен.
23. Белок слияния по п.22, где остаток треонина в положении 91 замещен на консервативный аминокислотный остаток.
24. Белок слияния по п.22, где остаток треонина в положении 91 замещен на валин.
25. Белок слияния по любому из пп.15-18, где остаток аспарагина в положении 87 замещен.
26. Белок слияния по п.25, где остаток аспарагина в положении 87 замещен на консервативный аминокислотный остаток.
27. Белок слияния по п.25, где остаток аспарагина в положении 87 замещен на серии.
28. Белок слияния по любому из пп.15-27, где стрессовый белок представляет собой белок теплового шока.
29. Белок слияния по любому из пп.15-27, где стрессовый белок выбран из Hsp10, Hsp40, Hsp60, Hsp70, Hsp90, Hsp100-200, Hsp100, Lon, TF55, Hsp40, FKBP, циклофилина, Hsp20-30, ClpP, GrpE, убиквитина, калнексина, или белка дисульфидизомеразы, или члена семейства стрессовых белков с малой молекулярной массой.
30. Белок слияния по любому из пп.15-29, где стрессовый белок представляет собой стрессовый белок микобактерий.
31. Белок слияния по п.30, где стрессовый белок микобактерий представляет собой стрессовый белок M.bevis BCG.
32. Белок слияния по п.30, где стрессовый белок М. bovis BCG представляет собой стрессовый белок Hsp65 M.bovis BCG.
33. Белок слияния по любому из пп.15-32, где стрессовый белок представляет собой стрессовый белок полной длины.
34. Белок слияния по любому из пп.15-33, где белок HBV представляет собой белок HBV полной длины.
35. Белок слияния, включающий последовательность SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:8, SEQ ID No: 10 или SEQ ID No: 12, где белок слияния при введении индивидууму индуцирует или усиливает иммунный ответ против белка HBV.
36. Фармацевтическая композиция, включающая белок слияния по любому из пп.1-35 и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель, где композиция при введении индивидууму индуцирует или усиливает иммунный ответ против белка HBV.
37. Нуклеиновая кислота, включающая последовательность, кодирующую белок слияния по любому из пп.1-35, где белок слияния при введении индивидууму индуцирует или усиливает иммунный ответ против белка HBV.
38. Нуклеиновая кислота, включающая последовательность SEQ ID No:5, SEQ ID No:7, SEQ ID No:9 или SEQ ID No:11, где нуклеиновая кислота кодирует белок слияния, который при введении индивидууму индуцирует или усиливает иммунный ответ против белка HBV.
39. Экспрессирующий вектор, включающий нуклеиновую кислоту по п.37 или 38.
40. Ретровирусный вектор, включающий нуклеиновую кислоту по п.37 или 38.
41. Клетка, включающая экспрессирующий вектор по п.39, где экспрессирующий вектор включает нуклеиновую кислоту, кодирующую белок слияния, который при введении индивидууму индуцирует или усиливает иммунный ответ против белка HBV.
42. Способ получения белка слияния, где способ включает
(a) предоставление клетки, включающей экспрессирующий вектор, включающий нуклеиновую кислоту, которая включает последовательность, кодирующую белок слияния по любому из пп.1-35; и
(b) культивирование клетки в условиях, позволяющих экспрессию нуклеиновой кислоты, кодирующую указанный белок слияния.
43. Способ индукции или усиления иммунного ответа против белка HBV у субъекта, где способ включает введение субъекту эффективного количества белка слияния по любому из пп.1-35.
44. Способ индукции или усиления иммунного ответа против белка HBV у субъекта, где способ включает введение субъекту эффективного количества фармацевтической композиции по п.36.
45. Способ индукции или усиления иммунного ответа против белка HBV у субъекта, где способ включает введение субъекту эффективного количества экспрессирующего вектора по п.39.
46. Способ индукции или усиления иммунного ответа против белка HBV у субъекта, где способ включает введение субъекту эффективного количества ретровирусного вектора по п.40.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US26673301P | 2001-02-05 | 2001-02-05 | |
US60/266,733 | 2001-02-05 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2003127021A RU2003127021A (ru) | 2005-01-20 |
RU2295536C2 true RU2295536C2 (ru) | 2007-03-20 |
Family
ID=23015782
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2003127021/13A RU2295536C2 (ru) | 2001-02-05 | 2002-02-05 | Композиции на основе белка вируса гепатита в и стрессового белка и их применение |
Country Status (16)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US6921534B2 (ru) |
EP (1) | EP1357940A4 (ru) |
JP (1) | JP2005505238A (ru) |
KR (1) | KR20030074787A (ru) |
CN (1) | CN1264572C (ru) |
AU (1) | AU2002247084B2 (ru) |
BR (1) | BR0206995A (ru) |
CA (1) | CA2437503A1 (ru) |
HK (1) | HK1062579A1 (ru) |
IL (2) | IL157251A0 (ru) |
MX (1) | MXPA03006971A (ru) |
NZ (1) | NZ527664A (ru) |
PL (1) | PL373675A1 (ru) |
RU (1) | RU2295536C2 (ru) |
WO (1) | WO2002062959A2 (ru) |
ZA (1) | ZA200306040B (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2585525C2 (ru) * | 2011-06-30 | 2016-05-27 | Грин Кросс Корпорейшн | Эпитоп поверхностного антигена вируса гепатита b и его применение |
RU2625021C2 (ru) * | 2011-07-12 | 2017-07-11 | Трансген Са | Мутантные полимеразы вируса гепатита В |
Families Citing this family (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1107681C (zh) * | 2000-08-11 | 2003-05-07 | 中国科学院微生物研究所 | 乙肝病毒抗原多肽与热休克蛋白的复合物及其应用 |
CN100381463C (zh) * | 2002-09-18 | 2008-04-16 | 中国人民解放军免疫学研究所 | 用于生产治疗用乙型肝炎疫苗或药物的免疫原及其制备方法和用途 |
GB0303507D0 (en) * | 2003-02-14 | 2003-03-19 | Novartis Ag | Organic compounds |
CN1727362B (zh) * | 2004-07-30 | 2010-12-01 | 中国人民解放军第二军医大学 | 癌胚抗原阳性肿瘤治疗性疫苗的制备及应用 |
JP4736413B2 (ja) * | 2004-12-14 | 2011-07-27 | 富士ゼロックス株式会社 | 生体分子保持物及び生体分子の保存方法 |
EP1835933A4 (en) * | 2005-01-04 | 2015-01-07 | Yeda Res & Dev | HSP60, PEPTIDES HSP60 AND T-CELL VACCINES FOR IMMUNOMODULATION |
US20080279878A1 (en) | 2005-03-14 | 2008-11-13 | B.G. Negev Technologies And Applications Ltd. | Compositions of Hsp60 Peptides and Viral Antigens for Vaccination and Diagnosis |
US7622121B2 (en) * | 2005-09-21 | 2009-11-24 | New York University | Heat shock proteins from Mycobacterium leprae and uses thereof |
CN101307310B (zh) * | 2007-05-15 | 2012-08-08 | 康泰生医科技股份有限公司 | 具有提高产率及免疫原性的重组蛋白质表达系统 |
US8088392B2 (en) * | 2007-06-18 | 2012-01-03 | Yunxu Cao | Capsid proteins and uses therefore |
WO2008154867A1 (en) * | 2007-06-18 | 2008-12-24 | Shanghai Zerun-Ankegens Biopharmaceutical Co., Ltd | Material with immunogenicity |
EA202091513A1 (ru) | 2017-12-19 | 2020-09-09 | Янссен Сайенсиз Айрлэнд Анлимитед Компани | Вакцины против вируса гепатита b (hbv) и их применение |
WO2019123252A1 (en) * | 2017-12-19 | 2019-06-27 | Janssen Sciences Ireland Unlimited Company | Hepatitis b virus (hbv) vaccines and uses thereof |
AU2020297008A1 (en) * | 2019-06-18 | 2022-02-17 | Janssen Sciences Ireland Unlimited Company | Combination of hepatitis B virus (HBV) vaccines and HBV-targeting RNAi |
Family Cites Families (64)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4666847A (en) * | 1981-01-16 | 1987-05-19 | Collaborative Research, Inc. | Recombinant DNA means and method |
US4797359A (en) * | 1983-05-10 | 1989-01-10 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Heat shock regulated production of selected and fused proteins in yeast |
US4547368A (en) * | 1983-12-20 | 1985-10-15 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Hepatitis B core antigen vaccine made by recombinant DNA |
GB8404280D0 (en) | 1984-02-17 | 1984-03-21 | Stanford J L | Biological preparations |
IL71683A0 (en) | 1984-04-27 | 1984-09-30 | Yeda Res & Dev | Pharmaceutical compositions for treating arthritis type diseases comprising fractions obtained from mycobacteria |
US4918164A (en) * | 1987-09-10 | 1990-04-17 | Oncogen | Tumor immunotherapy using anti-idiotypic antibodies |
US4784941A (en) * | 1985-04-08 | 1988-11-15 | Genetic Systems Corporation | Expression and diagnostic use of pENV-3 encoded peptides which are immunologically reactive with antibodies to LAV |
US4734362A (en) * | 1986-02-03 | 1988-03-29 | Cambridge Bioscience Corporation | Process for purifying recombinant proteins, and products thereof |
US4906742A (en) | 1986-07-31 | 1990-03-06 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Encoding antigens of M. Leprae |
NL8701163A (nl) | 1986-09-09 | 1988-04-05 | Nederlanden Staat | Gebruik van een peptide voor de bereiding van preparaten voor het verlichten, het behandelen en de diagnose van autoimmuunziekten, in het bijzonder arthritische toestanden, verbindingen die met dit peptide verwant zijn, alsmede farmaceutische en diagnostische preparaten en testkits. |
WO1988005823A2 (en) | 1987-02-02 | 1988-08-11 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Mycobacterium tuberculosis genes encoding protein antigens |
US4952395A (en) | 1987-02-26 | 1990-08-28 | Scripps Clinic And Research Foundation | Mycobacterial recombinants and peptides |
US5504005A (en) | 1987-03-02 | 1996-04-02 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Recombinant mycobacterial vaccine |
US4918166A (en) | 1987-04-10 | 1990-04-17 | Oxford Gene Systems Limited | Particulate hybrid HIV antigens |
US5256767A (en) * | 1987-06-10 | 1993-10-26 | The Immune Response Corporation | Retroviral antigens |
NL8703107A (nl) | 1987-12-22 | 1989-07-17 | Nederlanden Staat | Polypeptiden en derivaten daarvan, alsmede de toepassing daarvan in farmaceutische en diagnostische preparaten. |
US5204259A (en) * | 1988-05-06 | 1993-04-20 | Pharmacia Genetic Engineering, Inc. | Methods and systems for producing HIV antigens |
EP0419569B1 (en) | 1988-06-15 | 1995-09-06 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Stress proteins and uses therefor |
US5114844A (en) | 1989-03-14 | 1992-05-19 | Yeda Research And Development Co., Ltd. | Diagnosis and treatment of insulin dependent diabetes mellitus |
DE69034100T2 (de) | 1989-06-19 | 2004-06-09 | Whitehead Institute For Biomedical Research, Cambridge | Verktorvermittelte genominsertion und expression von dna in bcg |
GB8919321D0 (en) | 1989-08-25 | 1989-10-11 | Univ London | Treatment of chronic inflammatory conditions |
GB9007194D0 (en) | 1990-03-30 | 1990-05-30 | Wellcome Found | Live vaccines |
US5348945A (en) | 1990-04-06 | 1994-09-20 | Wake Forest University | Method of treatment with hsp70 |
DK0556248T3 (da) | 1990-11-08 | 1997-10-27 | Univ London | Mycobacterium som adjuvans til antigener |
GB9024320D0 (en) | 1990-11-08 | 1990-12-19 | Univ London | Treatment of uveitis |
GB2251186A (en) | 1990-12-04 | 1992-07-01 | Randall Neal Gatz | Polypeptide for use in treatment of autoimmune disease |
EP0491077A1 (en) * | 1990-12-19 | 1992-06-24 | Medeva Holdings B.V. | A composition used as a therapeutic agent against chronic viral hepatic diseases |
US6297048B1 (en) * | 1992-02-04 | 2001-10-02 | Chiron Corporation | Hepatitis therapeutics |
IT1262896B (it) | 1992-03-06 | 1996-07-22 | Composti coniugati formati da proteine heat shock (hsp) e oligo-poli- saccaridi, loro uso per la produzione di vaccini. | |
US5580563A (en) | 1992-05-01 | 1996-12-03 | Tam; James P. | Multiple antigen peptide system having adjuvant properties, vaccines prepared therefrom and methods of use thereof |
GB9211736D0 (en) | 1992-06-03 | 1992-07-15 | Univ Cardiff | Allergic treatment |
IL102687A (en) | 1992-07-30 | 1997-06-10 | Yeda Res & Dev | Conjugates of poorly immunogenic antigens and synthetic pepide carriers and vaccines comprising them |
US5736146A (en) | 1992-07-30 | 1998-04-07 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Conjugates of poorly immunogenic antigens and synthetic peptide carriers and vaccines comprising them |
DK0700445T3 (da) | 1993-06-04 | 2002-05-13 | Whitehead Biomedical Inst | Stressproteiner og anvendelser deraf |
WO1995004548A1 (en) * | 1993-08-11 | 1995-02-16 | Jenner Technologies | Prostatic cancer vaccine |
US5750119A (en) | 1994-01-13 | 1998-05-12 | Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Immunotherapeutic stress protein-peptide complexes against cancer |
US5997873A (en) | 1994-01-13 | 1999-12-07 | Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Method of preparation of heat shock protein 70-peptide complexes |
US5961979A (en) | 1994-03-16 | 1999-10-05 | Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Stress protein-peptide complexes as prophylactic and therapeutic vaccines against intracellular pathogens |
IL109790A0 (en) | 1994-05-25 | 1994-08-26 | Yeda Res & Dev | Peptides used as carriers in immunogenic constructs suitable for development of synthetic vaccines |
AU724399B2 (en) | 1995-08-18 | 2000-09-21 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Heat shock protein-based vaccines and immunotherapies |
US5935576A (en) | 1995-09-13 | 1999-08-10 | Fordham University | Compositions and methods for the treatment and prevention of neoplastic diseases using heat shock proteins complexed with exogenous antigens |
US5985270A (en) | 1995-09-13 | 1999-11-16 | Fordham University | Adoptive immunotherapy using macrophages sensitized with heat shock protein-epitope complexes |
US5837251A (en) | 1995-09-13 | 1998-11-17 | Fordham University | Compositions and methods using complexes of heat shock proteins and antigenic molecules for the treatment and prevention of neoplastic diseases |
WO1997026910A2 (de) | 1996-01-27 | 1997-07-31 | Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin | Tumorimpfstoff für die immuntherapie von malignen tumoren |
US6130087A (en) | 1996-10-07 | 2000-10-10 | Fordham University | Methods for generating cytotoxic T cells in vitro |
ES2258796T3 (es) | 1996-11-26 | 2006-09-01 | Stressgen Biotechnologies Corporation | Proteinas de fusion que contienen proteinas de estres para inducir respuestas inmunitarias. |
US6017540A (en) | 1997-02-07 | 2000-01-25 | Fordham University | Prevention and treatment of primary and metastatic neoplastic diseases and infectious diseases with heat shock/stress protein-peptide complexes |
US5830464A (en) | 1997-02-07 | 1998-11-03 | Fordham University | Compositions and methods for the treatment and growth inhibition of cancer using heat shock/stress protein-peptide complexes in combination with adoptive immunotherapy |
WO1998035705A1 (en) | 1997-02-18 | 1998-08-20 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Use of heat shock proteins to deliver moieties into cells |
ES2266652T3 (es) | 1997-08-05 | 2007-03-01 | Stressgen Biotechnologies Corporation | Respuestas inmunologicas contra los antigenos de hpv provocadas por compuestos que contienen un antigeno de hpv y una proteina de stress o un vector de expresion capaz de expresar dichas proteinas. |
US6007821A (en) | 1997-10-16 | 1999-12-28 | Fordham University | Method and compositions for the treatment of autoimmune disease using heat shock proteins |
US5948646A (en) | 1997-12-11 | 1999-09-07 | Fordham University | Methods for preparation of vaccines against cancer comprising heat shock protein-peptide complexes |
NZ506245A (en) * | 1998-02-12 | 2003-08-29 | Immune Complex Corp | Strategically modified hepatitis b core proteins and their derivatives |
US6451316B1 (en) | 1998-10-05 | 2002-09-17 | University Of Conneticut Health Center | Methods for generating antigen-reactive T cells in vitro |
US6475490B1 (en) | 1998-10-19 | 2002-11-05 | Fordham University | Compositions and methods for promoting tissue repair using heat shock proteins |
AU1055599A (en) * | 1998-11-17 | 2000-06-05 | Joo-Sul Kim | Programmable time switch |
CA2378097A1 (en) | 1999-07-08 | 2001-01-18 | Stressgen Biotechnologies Corporation | Induction of a th1-like response in vitro |
WO2001017554A1 (en) | 1999-09-10 | 2001-03-15 | Fordham University | Methods and compositions for the treatment and prevention of graft rejection using heat shock proteins |
US20010034042A1 (en) | 2000-01-20 | 2001-10-25 | Srivastava Pramod K. | Complexes of peptide-binding fragments of heat shock proteins and their use as immunotherapeutic agents |
AU2001229597A1 (en) | 2000-01-21 | 2001-07-31 | University Of Connecticut Health Center | Compositions and methods to treat neurodegenerative disorders |
WO2001053457A2 (en) | 2000-01-21 | 2001-07-26 | University Of Connecticut Health Center | Vaccines against neurodegenerative disorders |
WO2001052890A1 (en) | 2000-01-21 | 2001-07-26 | University Of Connecticut Health Center | Heat shock/stress protein complexes as vaccines against neurodegenerative disorders |
EE200200709A (et) | 2000-06-26 | 2004-08-16 | Stressgen Biotechnologies Corporation | Liitvalku sisaldava kompositsiooni ning seda liitvalku ja liitpolüpeptiidi kodeeriva nukleiinhappe kasutamine |
CN1107681C (zh) | 2000-08-11 | 2003-05-07 | 中国科学院微生物研究所 | 乙肝病毒抗原多肽与热休克蛋白的复合物及其应用 |
-
2002
- 2002-02-05 JP JP2002563296A patent/JP2005505238A/ja active Pending
- 2002-02-05 CA CA002437503A patent/CA2437503A1/en not_active Abandoned
- 2002-02-05 MX MXPA03006971A patent/MXPA03006971A/es active IP Right Grant
- 2002-02-05 EP EP02714842A patent/EP1357940A4/en not_active Ceased
- 2002-02-05 IL IL15725102A patent/IL157251A0/xx unknown
- 2002-02-05 CN CNB028045769A patent/CN1264572C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2002-02-05 US US10/068,059 patent/US6921534B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-02-05 KR KR10-2003-7010313A patent/KR20030074787A/ko not_active Application Discontinuation
- 2002-02-05 WO PCT/US2002/003460 patent/WO2002062959A2/en active Application Filing
- 2002-02-05 NZ NZ527664A patent/NZ527664A/en unknown
- 2002-02-05 AU AU2002247084A patent/AU2002247084B2/en not_active Ceased
- 2002-02-05 BR BR0206995-4A patent/BR0206995A/pt not_active IP Right Cessation
- 2002-02-05 RU RU2003127021/13A patent/RU2295536C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2002-02-05 PL PL02373675A patent/PL373675A1/xx unknown
-
2003
- 2003-08-05 IL IL157251A patent/IL157251A/en not_active IP Right Cessation
- 2003-08-05 ZA ZA200306040A patent/ZA200306040B/xx unknown
-
2004
- 2004-07-22 HK HK04105433A patent/HK1062579A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2004-09-14 US US10/941,049 patent/US20050152917A1/en not_active Abandoned
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
SCHIRMBECK R. et al., «Truncated or chimeric endogenous protein antigens gain immunogenicity for В cells by stress protein-facilitated expression», Eur J Immunol. 1999, May; 29(5): 1740-9. * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2585525C2 (ru) * | 2011-06-30 | 2016-05-27 | Грин Кросс Корпорейшн | Эпитоп поверхностного антигена вируса гепатита b и его применение |
RU2625021C2 (ru) * | 2011-07-12 | 2017-07-11 | Трансген Са | Мутантные полимеразы вируса гепатита В |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US6921534B2 (en) | 2005-07-26 |
NZ527664A (en) | 2006-12-22 |
JP2005505238A (ja) | 2005-02-24 |
AU2002247084B2 (en) | 2007-01-04 |
EP1357940A4 (en) | 2004-03-17 |
ZA200306040B (en) | 2004-11-17 |
BR0206995A (pt) | 2005-08-16 |
MXPA03006971A (es) | 2004-05-05 |
WO2002062959A2 (en) | 2002-08-15 |
US20020155434A1 (en) | 2002-10-24 |
CA2437503A1 (en) | 2002-08-15 |
HK1062579A1 (en) | 2004-11-12 |
CN1491116A (zh) | 2004-04-21 |
WO2002062959A3 (en) | 2003-03-06 |
CN1264572C (zh) | 2006-07-19 |
IL157251A (en) | 2009-05-04 |
KR20030074787A (ko) | 2003-09-19 |
IL157251A0 (en) | 2004-02-19 |
RU2003127021A (ru) | 2005-01-20 |
PL373675A1 (en) | 2005-09-05 |
US20050152917A1 (en) | 2005-07-14 |
EP1357940A2 (en) | 2003-11-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2295536C2 (ru) | Композиции на основе белка вируса гепатита в и стрессового белка и их применение | |
KR100843109B1 (ko) | 사람 유두종 바이러스 항원과 스트레스 단백질을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 조성물에 의해 유도된 사람 유두종 바이러스 항원에 대한 면역 반응 | |
RU2282461C2 (ru) | Лечение инфекции, вызываемой вирусом папилломы человека | |
JP4970435B2 (ja) | フィブロネクチンのedaドメインの使用を基にした剤および方法 | |
AU2002247084A1 (en) | Hepatitis B virus treatment | |
US20100183652A1 (en) | STABILIZED HBc CHIMER PARTICLES AS THERAPEUTIC VACCINE FOR CHRONIC HEPATITIS | |
WO2004075836A9 (en) | STABILIZED HBc CHIMER PARTICLES AS THERAPEUTIC VACCINE FOR CHRONIC HEPATITIS | |
Li et al. | A truncated C-terminal fragment of Mycobacterium tuberculosis HSP70 gene enhanced potency of HBV DNA vaccine | |
Zhang et al. | Generation of chimeric HBc proteins with epitopes in E. coli: formation of virus-like particles and a potent inducer of antigen-specific cytotoxic immune response and anti-tumor effect in vivo | |
US8470372B2 (en) | Material with immunogenicity | |
CN105367662B (zh) | 一种hbv相关的融合蛋白、其制备方法及其应用 | |
AU2005201826B2 (en) | Immune responses against HPV antigens elicited by compositions comprising an HPV antigen and a stress protein or an expression vector capable of expression of these proteins | |
AU779770B2 (en) | Immune responses against HPV antigens elicited by compositions comprising an HPV antigen and a stress protein or an expression vector capable of expression of these proteins | |
EP1336621B1 (en) | Immune responses against HPV antigens elicited by compositions comprising an HPV antigen and a stress protein or an expression vector capable of expression of these proteins |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PC4A | Invention patent assignment |
Effective date: 20070604 |
|
PD4A | Correction of name of patent owner | ||
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20100206 |